KR101069521B1

KR101069521B1 - Ｈｉｆ-1 유전자 발현을 저해하는 안티센스올리고뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR101069521B1
Application number: KR1020057013673A
Authority: KR
Inventors: 희정 윤; 링준 마오; 영복 이; 창-호 안; 샤오밍 쟝
Original assignee: 렉산 팔마큐티칼스, 인크.
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2011-09-30
Also published as: DE602004022921D1; EP1601325A2; CN1809583A; BRPI0407070A; CA2513398C; EP1601325A4; ATE441710T1; US20040152655A1; KR20050103476A; CN100471862C; US7205283B2; ES2333794T3; EP1601325B1; CA2513398A1

Abstract

본 발명에 따른 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물, RX-0047과 RX-0149는 여러 암 세포주에서 HIF-1의 발현을 저해하고 세포독성 효과를 유도한다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드

Description

ＨＩＦ-1 유전자 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드{ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES TO INHIBIT THE EXPRESSION OF HIF-1}

발명의 분야

본 발명은 사람 단백질 HIF-1의 발현을 저해하고 여러 암 세포주에서 세포독성 효과를 유도하는 새로운 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물, RX-0047과 RX-0149에 관한다.

발명의 배경

종양은 암 세포에 산소와 영양을 공급하는 혈관이 없으면 성장할 수 없다(Blagosklonny, International J. Oncol., 2001, 19: 257-262). 포유동물 세포에서 유전자 전사 인자인 HIF-1에 의한 저산소 반응의 조절은 암세포 성장에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. HIF-1은 세포가 저산소에서 생존할 수 있게 하고 혈관의 내피세포(endothelial cell) 성장을 자극하며 여러 가지 암에서 발현이 증가된다(Zhong et al., Cancer Res., 1999, 59: 5830-5835). 혈관형성 (angiogenesis)과 종양 성장 과정에서 HIF의 역할의 전형적인 예는 가장 빈번하게 발병하는 투명 세포형 신장암(clear-cell renal carcinoma) 및 VHL 질환에서 돌연변이되는 종양 성장억제 유전자중 하나인 VHL의 기능 상실이다. 따라서, HIF-1 경 로의 차단은 종양 성장을 저해할 수 있고, 이런 이유로 HIF-1은 중요한 항암 목표가 된다. HIF-1의 저해 기전은 종양의 혈관형성을 유도하는 HIF-1 중재된 반응을 차단하는 방법을 이용한다. 미국 특허 No., 6,222,018(Semenza, April 24, 2001)에서는 HIF-1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한다. 본 발명에서 개시되고 청구된 특정 올리고뉴클레오타이드는 상기 특허에서 발표되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 HIF-1(저산소증-유도 인자 1)을 인코딩하는 핵산을 목표로 하고 HIF-1의 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한다. 또한, 세포 내에서 HIF-1 발현을 저해하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 화합물과 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계로 구성된다. 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 장점은 HIF-1의 발현 저해뿐만 아니라 여러 상이한 암 세포주에 대한 세포독성에 있다. 본 발명의 장점은 HIF-1 유전자의 2,772 위치에서 아래 서열: 5' ttggacactggtggctcatt 3'(Genebank # NM001530)(Seq. Id. No. 1)을 보유하는 HIF-1 유전자의 특정 부위에 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물과 다양한 암 세포주의 세포를 접촉시켜 달성할 수 있다. 특히, 5' aatgagccaccagtgtccaa 3'(Seq. Id. No. 2)을 포함하는 RX-0047이 바람직하다. 유사한 장점은 HIF-1 유전자의 1,936 위치에서 아래의 서열: 5' gacttggagatgttagctcc 3'(Genebank # NM001530)(Seq. Id. No. 3)에 안티센스인 화합물로 달성할 수 있다. 특히, 5' ggagctaacatctccaagtc 3'(Seq. Id. No. 4)을 포함하는 RX-0149가 바람직하다. 이런 접촉은 올리고뉴클레오타이드가 HIF-1을 인코 딩하는 유전자와 혼성화되는 조건하에 진행된다. 혼성화이후, HIF-1을 합성하는 이들 세포의 능력이 저해되고 암 세포 생존능이 감소된다.

도 1. RX-0047과 RX-0149는 여러 암세포에서 HIF-1 mRNA 발현을 저해한다.

도 2. RX-0047과 RX-0149에 의한 HIF-1 단백질 발현 저해의 Western blot 분석 결과.

HIF는 이형이합체(heterodimer)로 구성되고 저산소 상태에서 활성화되는 주 유 전사 인자이다. 상기 유전자는 포유동물에서 저산소 상태에서 체내 항상성을 유지하는 반응, 예를 들면, 적혈구생성, 혈관생성, 해당작용에 관여할 뿐만 아니라 종양의 신생혈관생성과 성장을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 이는 2개의 소단위, HIF-1α 및 ARNT(Aryl Receptor Nuclear Translocator)로 알려진 있는 HIF-1β로 구성된다. 이들 두 소단위는 bHLH(basic helix-loop-helix)와 PAS(Per, ARNT, Sim) 족(family)에 속한다. 이들 인자의 bHLH 도메인은 2개의 나선(helix)을 통한 이합체형성 및 이들의 염기성 도메인을 통한 DNA 결합에 관여한다. HIF-1α와 HIF-2α의 개별 도메인은 저산소 신호전달 경로에 반응한다. 일차적인 반응은 정상 산소 상태에서 산소-의존성 프롤린 수산화효소에 의한 번역후 수식(post-translational modification)에 기인한 산소-의존성 분해(ODD)이다(Jaakkola et al., Science, 2001, 292: 468-472). 수산화된 프롤린은 HIF가 VHL(von Hippel-Lindau) 유비퀴틴(ubiquitin) 연결효소 복합체와 상호작용하도록 촉진하여 급속한 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 이에 따른 프로테오좀(proteosome)에서 HIF 단백질 분해를 유도한다. 최근 연구에 의하면, HIF의 CAD(c-말단 전이활성 도메인)의 아스파라긴 수산화는 p300/CBP 보조활성인자와의 상호작용을 저해함으로써 프로테오좀-매개된 HIF 분해에 중요한 역할을 하고, 정상 산소 상태에서 HIF-1의 전사 활성을 감소시킨다(Lando et al., Science, 2002, 295: 858-861). 따라서, 아스파라긴 수산화효소는 프롤린 수산화효소와 함께, 세포내에 산소(O₂) 수준에 의해 조절되는 저산소 스위치로서 작용한다. 저산소 상태에서 p42/p44 MAPK 활성은 HIF-1의 번역후 인산화(post-translational phosphorylation)를 유도하고, HIF-1의 유전자 전사활성을 상승시킨다. 최근의 연구 논문을 보면, 수산화, 유비퀴틴화, 인산화와 함께 아세틸화가 HIF-1 안정성의 조절에서 중요한 역할을 한다(Jeong et al., Cell, 2002, 111: 709-720).

활성을 위하여 이산소(dioxygen)를 필요로 하는 수산화효소가 저산소 상태에서 불활성화되기 때문에 HIF-1α가 수산화되지 못하는데, 이로 인하여 HIF-1α는 pVHL에 의해 인지되지 못하고 세포내에 축적된다. 이후, HIF-1α는 핵으로 전좌되고, 본질적으로 존재하는 HIF-1β 아단위와 이합체를 형성한다(Semenza, Genes & Development, 1985, 14: 1983-1991). 그 다음, 상기 이합체는 목표 유전자에서 저산소 반응 요소(HRE)에 결합하여 여러 유전자, 예를 들면, 적혈구조혈인자(erythropoitin), VEGF(Forsythe et al., Mol. Cell. Biol., 1996, 16: 4604-4613), 혈소판-유래된 성장 인자-β(PDGF-β), 글루코오스 트랜스포터(GLUT1), 산화질소 합성효소(Neckers, J. Natl. Cancer Ins., 1999, 91: 106-107)의 전이활성화(transactivation)를 유도한다. 특정 호르몬과 성장인자 역시 HIF-1α의 수준을 증가시키고, 특정 종양유전자와 종양-억제 유전자, 예를 들면, VHL에서 돌연변이도 HIF-1α 수준을 증가시킨다(Ivan and Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 2001, 11: 27-34). 수산화 또는 대안적 방법이 저산소와 무관한 HIF 활성화에 관여하는 지를 연구하는 것은 흥미있는 과제이다.

현재의 암 치료 전략 중에서 저산소 미세환경과 반응을 이용하는 여러 가지 전략은 아래와 같다: 1) 저산소-의존성 약물이나 유전자-치료 벡터, 2) HIF 안정성의 저해, 3) HIF에 의한 전이활성화의 저해, 4) VEGF 저해제.

암의 생성에서 HIF 전사 인자의 중요성에 비추어, 종양형성동안 이런 인자를 저해하는 것이 중요하다. 하지만, 다른 세포 대사에서 이런 계통의 역할을 가능한 교란하지 않는 것 또한 중요하다. 한가지 방법은 저산소 상태에서 고도로 발현되는 가능 전사 인자를 인코딩하는 유전자를 확인하고, 상기 유전자의 활성을 긍정적으로 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 고안하는 것이다. 본 발명자들은 2가지 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 HIF-1 유전자에 의한 단백질의 생산을 저해하는 강화된 능력을 보이고, 여러 종류의 암 세포주에서 세포독성 효과를 유도한다는 것을 확인하였다.

안티센스 화합물은 살아있는 세포에서 발견되는 핵산에 변형을 도입할 수 있는 도구로 이용된다. “안티센스”는 핵산이 단백질을 “인코딩”한다는 개념에 기초한다. 다시 말하면, 일정한 핵산에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열이 어떤 단백질이 만들어지는 가를 결정한다. 전체 유전자에 대한 “센스” 서열은 세포 내의 자극에 반응하여 통상적인 양으로 단백질을 만든다. “센스” 올리고뉴클레오타이드는 정상적인 유전자 서열과 혼성화되기는 하지만 단백질의 양이나 성질에 영향을 주지는 않는다. “난센스” 서열은 단백질을 합성하지 못하거나 기능이 없는 단백질을 만든다. 가령, “난센스” 코돈이나 올리고머가 유전자에 삽입되면, 절두되거나 기능이 없는 단백질이 생성된다. “안티센스” 올리고뉴클레오타이드는 정상적인 유전자와 혼성화되고 구조나 양이 변화된 단백질을 산출한다. 안티센스 올리고머, 다시 말하면, 상대적으로 길이가 짧은 안티센스 화합물은 세포 내에 쉽게 들어가 유전자의 기능을 변화시키는 것으로 알려져 있다.

안티센스 화합물은 유전자 기능의 탐구를 위한 연구 시약으로 사용되고 있는데, 그 이유는 이들이 매우 특이적인 성질로 유전자 발현을 변화시키고, 특정 유전자의 기능을 설명하는데 이용될 수 있기 때문이다. 또한, 안티센스 화합물은 예로써 여러 가지 생물 경로의 기능을 구별하는데 이용될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 병을 일으키는 유전자를 선택적으로 차단하여 병을 일으키는 단백질의 생성을 저해하는데 이용될 수 있다. 일부 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인체에 안전하게 효과적으로 투여되었고, 현재 이를 이용한 여러 임상 시험이 진행되고 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 세포, 조직, 동물, 특히 인체를 치료하는데 이용할 수 있다. 본 발명에서, “올리고뉴클레오타이드”는 RNA(리보핵산), DNA(디옥시리보핵산), 또는 이들의 유사물(mimetics)의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 상기 용어는 자연에서 발생하는 핵염기(nucleobase), 당, 공유 인터뉴클레오사이드(internucleoside)(골격) 결합으로 구성되는 올리고뉴클레오타이드 및 유사하게 기능하는 비-자연 발생 부분을 보유하는 올리고뉴클레오타이드를 포괄한다. 이런 변형되거나 치환된 올리고뉴클레오타이드는 바람직한 특성, 예를 들면, 강화된 세포내 흡수력, 핵산 목표에 대한 강화된 친화력, 핵염기의 존재에서 증가된 안정성으로 인하여 자연에 존재하는 형태보다 종종 선호된다. 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 화합물, 특히 HIF-1을 인코딩하는 핵산의 일부를 목표로 하고 HIF-1의 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한다. 상기 올리고뉴클레오타이드 화합물은 HIF-1을 인코딩하는 하나이상의 핵산과 특이적으로 혼성화되도록 설계된다. 한가지 올리고뉴클레오타이드, RX-0047은 HIF-1 유전자의 2,772 위치에서 아래 서열: 5' ttggacactggtggctcatt 3'(Genebank # NM001530)(Seq. Id. No. 1)을 보유하는 HIF-1 유전자의 특정 부위를 목표로 한다. RX-0047의 골격 서열은 상기 부위에 상보적인 서열이다. 다른 올리고뉴클레오타이드, RX-0149는 HIF-1 유전자의 1,936 위치에서 아래의 서열: 5' gacttggagatgttagctcc 3'(Genebank # NM001530)(Seq. Id. No. 3)을 보유하는 HIF-1 유전자의 코딩 영역에서 특정 부위를 목표로 한다. RX-0149의 골격에 대한 서열은 상기 부위에 상보적인 서열이다. 본 발명자들은 RX-0047과 RX-0149의 20-mer이 유래된 서열로부터 상류와 하류의 5개 또는 10개 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고머가 HIF-1 mRNA 발현의 측정가능한 저해를 보인다는 것을 확인하였다. 하지만, 본 발명자들은 상기 올리고뉴클레오타이드가 변이성(variability)에 더욱 민감하고, RX-0149의 18-mer이 HIF-1 mRNA 발현의 일부 저해를 보이긴 하지만 한쪽 말단으로부터 추가적인 절두가 HIF-1 mRNA 발현 저해의 실질적인 상실을 유발한다는 것을 확인하였다. RX-0047과 RX-0149의 20-mer이 유래된 서열로부터 상류와 하류의 5개 또는 10개 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고머는 암 세포 증식의 저해를 나타냈다. HIF-1 mRNA 발현의 일부 저해를 보이는 RX-0047과 RX-0149의 절두된 이형 역시 암 세포 증식의 저해를 보였다.

안티센스 화합물로 특정 유전자를 목표한다는 것은 원하는 염기 서열을 찾고, 상기 핵산 서열내에서 변형된 하나이상의 부위를 선택하는 것이다. 목표로 하는 부위가 결정되면, 목표로 하는 부위와 충분히 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 선택함으로써 상기 올리고뉴클레오타이드가 목표 부위에 특이적으로 혼성화되도록 하여 원하는 효과를 유도한다.

본 명세서에서, “HIF-1을 인코딩하는 핵산”은 HIF-1을 인코딩하는 DNA, 이런 DNA로부터 전사된 RNA(프리-mRNA 포함), 이런 RNA로부터 유도된 cDNA를 포괄한다. 목표로 하는 핵산과 안티센스 올리고 화합물의 특이적인 혼성화는 핵산의 정상적인 기능을 방해한다. 방해되는 DNA의 기능에는 복제와 전사 과정이 포함된다. 방해되는 RNA의 기능에는 생명 유지에 필수적인 기능, 예를 들면, RNA의 단백질 번역 부위로의 전위, RNA로부터 단백질의 번역, 하나이상의 mRNA 종을 산출하는 RNA 절단접합 과정, RNA에 의해 촉진되는 촉매 활성 과정이 포함된다. 목표로 하는 핵산 기능에서 이런 저해 효과는 단백질의 발현이나 생성의 조정이다. 본원에서, “조정”은 유전자 발현 정도의 증가(촉진) 또는 감소(저해)를 의미한다. 이를 위하여, HIF-1을 인코딩하는 유전자는 HIF-1의 발현이 저해되도록 조정된다.

본원에서, “혼성화”는 상보적 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 염기 간에 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소결합을 의미한다. 가령, 아데닌과 타이민은 수소결합의 형성을 통하여 쌍을 이루는 상보적 핵염기이다. 본 명세서에서 “상보적”은 두 뉴클레오타이드 간에 정확한 대합(pairing)을 의미한다. 가령, 올리고뉴클레오타이드의 특정 위치에서 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA 분자의 동일한 위치에서 뉴클레오타이드와 수소결합을 할 수 있을 경우에, 상기 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA는 상기 위치에서 서로 상보적으로 간주된다. 각 분자에서 충분한 숫자의 상응하는 위치가 서로 수소결합될 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우에 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA는 서로 상보적이다. 따라서, “특이적으로 혼성화되는” 및 “상보적”이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA 목표 간에 안정적이고 특이적인 결합을 가능하게 하는 충분한 상보성 또는 정확한 대합을 지시하는데 이용된다. 안티센스 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되는 목표 핵산의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다. 안티센스 화합물은 상기 화합물이 목표하는 DNA 또는 RNA 분자에 결합하여 이들 목표 DNA 또는 RNA의 정상 기능을 방해하고 효용을 소멸시키며, 특이적인 결합이 요구되는 조건, 다시 말하면, 생체내 검정(in vivo assays) 또는 약물 치료의 경우에 생리적 조건하에; 시험관내 검정(in vitro assays)의 경우에 이런 조사가 실행되는 조건하에 비-목표 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 만큼 충분한 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화된다.

본원에서 안티센스 화합물로서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 가장 바람직하긴 하지만, 아래에서 설명하는 다른 올리고뉴클레오타이드 유사물 역시 바람직하다. 적절하게는, 본 발명에 따른 안티센스 화합물은 대략 10~30개 핵염기를 포함한다. 특히 적절하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 대략 20개 핵염기(즉, 대략 20개의 연결된 뉴클레오사이드)를 포함한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 뉴클레오사이드는 염기와 당의 조합이다. 뉴클레오사이드의 염기 부분은 정상적으로 헤테로환형 염기이다. 가장 일반적인 헤테로환형 염기는 퓨린과 피리미딘이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유 결합된 인산염 기를 추가로 보유하는 뉴클레오사이드이다. 펜토푸라노실 당을 보유하는 뉴클레오사이드에서, 인산염 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 부분에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 형성할 때, 인산염 기는 인접 뉴클레오사이드를 공유 결합시켜 선형 폴리머 화합물을 만든다. 일반적으로, 열린 선형 구조가 바람직하지만, 이런 선형 폴리머 구조의 개별 말단이 접합되어 원형 구조를 이루기도 한다. 올리고뉴클레오타이드 구조내에서 인산염 기는 올리고뉴클레오타이드의 인터뉴클레오사이드 골격을 형성한다. RNA와 DNA의 정상적인 연결 또는 골격은 3'에서 5' 포스포디에스테르 연결이다.

본 발명에 유용한 안티센스 화합물의 전형적인 예는 변형된 골격 또는 자연에 없는 인터뉴클레오사이드 연결을 보유하는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에 규정된 바에 의하면, 변형된 골격을 보유하는 올리고뉴클레오타이드에는 골격에 인산 원자를 포함하는 것과 골격에 인산 원자를 포함하지 않는 것이 있다. 본 규정에 따라, 인터뉴클레오사이드 골격에 인산 원자를 보유하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드 역시 올리고뉴클레오사이드로 간주될 수 있다.

변형된 올리고뉴클레오타이드 골격의 예로는 포스포로티오에이트; 키랄성 포스포로 티오에이트; 포스포로디티오에이트; 포스포트리에스터; 아미노알킬포스포트리에스터; 메틸 포스포네이트 및 3'-알킬렌 포스포네이트와 키랄성 포스포네이트를 비롯한 다른 알킬 포스포네이트; 포스피네이트; 3'-아미노 포스포라미데이트와 아미노알킬포스포라미데이트를 비롯한 포스포라미데이트; 티오노포스포라미데이트; 티오노알킬포스포네이트; 티오노알킬포스포트리에스터; 정상적인 3'-5' 연결을 보유하는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체, 뉴클레오사이드 단위의 인접된 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 결합되는 반전된 극성을 보유하는 이들의 유사체를 들 수 있다. 여러 가지 염, 혼합된 염, 유리 산 형태 역시 포함된다.

인산 원자를 보유하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격은 짧은 사슬 알킬이나 사이클로알킬 인터뉴클레오사이드 연결, 혼합된 헤테로원자와 알킬이나 사이클로 알킬 인터뉴클레오사이드 연결, 또는 하나이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환형 인터뉴클레오사이드 연결에 의해 형성된다. 이들의 예로는 모르폴리노 연결(뉴클레오사이드의 당 부분에서 형성됨); 실록산 골격; 설피드; 설폭사이드와 설폰 골격; 포름아세틸과 티오포름아세틸 골격; 메틸렌포름아세틸과 티오포름아세틸 골격; 알켄-보유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌 이미노와 메틸렌 하이드라지노 골격; 설포네이트와 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 혼합된 질소(N), 산소(O), 황(S), 메틸(CH₂) 구성요소를 보유하는 골격을 가진 것을 들 수 있다.

다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드 유사체에서, 당과 인터뉴클레오사이드연결, 다시 말하면, 뉴클레오타이드 단위의 골격은 새로운 그룹으로 치환된다. 염기 단위는 적절한 핵산 목표 화합물과의 혼성화를 위하여 계속 유지된다. 이런 올리고머 화합물인 우수한 혼성화 특성을 보이는 올리고뉴클레오타이드 유사물은 펩타이드 핵산(PNA)이다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 아마이드-보유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 치환된다. 핵염기는 유지되고, 골격의 아미드 부분의 aza 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.

본 발명의 가장 바람직한 구체예는 포스포로티오에이트 골격을 보유하는 올리고뉴클레오타이드 및 헤테로원자 골격, 특히 -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-, -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-[여기서, 고유 포스포디에스터 골격은 -O-P-O-CH₂-로 표시된다]를 보유하는 올리고뉴클레오사이드이다. 모르폴리노 골격 구조를 보유한 올리고뉴클레오타이드 역시 바람직하다.

변형된 올리고뉴클레오타이드는 하나이상의 치환된 당을 보유할 수도 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-알킬-O-알킬 중에서 하나를 포함하고, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂ 내지 C₁₀ 알케닐과 알키닐이다. 특히, O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂가 바람직하고, 여기서 n과 m은 1 내지 10이다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 C₁ 내지 C₁₀저급 알킬; 치환된 저급 알킬; 알카릴; 아르알킬; O-알카릴이나 O-아르알킬; SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 인터컬레이터(intercalator), 올리고뉴클레오타이드의 약역학적 성질을 향상시키는 작용기, 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 성질을 향상시키는 작용기, 유사한 성질을 갖는 다른 치환체 중에서 하나를 포함한다. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), 즉 알콕시알콕시 작용기이다. 다른 바람직한 변형은 아래 실시예에 기술된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH₂)₂ON(CH₃)₂ 작용기(2'-DMAOE)이다. 다른 바람직한 변형으로는 2'-메톡시(2'-O-CH₃), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂), 2'-플루오르(2'-F)를 들 수 있다. 유사한 변형은 올리고뉴클레오타이드의 다른 위치, 특히, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드에서 5' 위치에서 만들 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 당 유사물, 예를 들면, 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸을 보유할 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 핵염기(당분야에서 “염기”) 변형이나 치환을 보유할 수도 있다. 본 명세서에서 “변형되지 않은” 또는 “자연” 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A)과 구아닌(G) 및 피리미딘 염기인 타이민(T), 사이토신(C), 우라실(U)이다. 변형된 핵염기로는 다른 합성이나 자연 핵염기, 예를 들면, 5-메틸사이토신(5-Me-C), 5-하이드록시메틸사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸이나 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필이나 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오타이민, 2-티오사이토신, 5-할로우라실과 사이토신, 5-프로피닐 우라실과 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신과 타이민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실, 다른 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 다른 5-치환된 우라실과 사이토신, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌을 들 수 있다. 특정 핵염기는 본 발명에 따른 올리고 화합물의 결합 친화력을 향상시키는데 특히 유용하다. 이들에는 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐사이토신, 5-메틸사이토신을 비롯한 N-2, N-6 ,O-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸사이토신 치환은 이중 핵산의 안정성을 0.6-1.2℃ 정도 상승시키는 것으로 알려져 있으며, 이런 치환은 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과의 병행에 적합한 염기 치환이다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포내 분포, 세포내 흡수를 증진시키는 하나이상의 부분 또는 공액체를 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 과정을 수반한다. 이런 부분에는 콜레스테롤; 콜릭산; 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올; 티오콜레스테롤; 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기; 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트; 폴리아민이나 폴리에틸렌 글리콜 사슬; 아다만탄 아세트산; 팔미틸; 또는 옥타데실아민이나 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤과 같은 지질 성분이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

주어진 화합물에서 모든 위치가 동일하게 변형될 필요는 없고, 상기한 변형중 한가지이상이 단일 화합물, 또는 올리고뉴클레오타이드 내에서 단일 뉴클레오사이드에 통합될 수 있다. 본 발명은 키메라 화합물인 안티센스 화합물 역시 포괄한다. 본원에서, “키메라” 안티센스 화합물은 적어도 하나의 단량체 단위, 다시 말하면, 올리고뉴클레오타이드 화합물의 경우에 뉴클레오타이드로 각각 구성되는 두개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 보유하는 안티센스 화합물, 특히 뉴클레오타이드를 의미한다. 전형적으로, 이들 올리고뉴클레오타이드는 적어도 한 영역이 변형되어 뉴클레아제 분해에 저항력이 상승하고 세포내 흡수력이 증가하며 목표로 하는 핵산에 대한 친화력이 상승한다. 올리고뉴클레오타이드의 다른 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소의 기질로서 기능할 수 있다. 가령, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 이런 이유로, RNase H가 활성화되면 RNA 목표가 절단되어 유전자 발현을 저해하는 올리고뉴클레오타이드의 효능이 현저하게 강화된다. 결과적으로, 키메라 올리고뉴클레오타이드를 이용하면 동일 목표 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 디옥시올리고뉴클레오타이드보다 작은 크기의 올리고뉴클레오타이드로 필적하는 결과를 달성할 수 있다. RNA 목표의 절단은 통상적으로 전기영동에 의해 쉽게 확인할 수 있고, 필요한 경우 당분야에 공지된 연관된 핵산 혼성화 기술로 확인할 수 있다.

본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기한 바와 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 변형된 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 유사물의 복합 구조로 형성될 수 있다. 이런 화합물은 당분야에서 하이브리드 또는 갭머(gapmer)라고 한다.

본 발명에 이용된 안티센스 화합물은 널리 공지된 고형상(solid phase) 합성 방법을 통하여 용이하게 만들 수 있다. 이런 합성을 위한 기구는 Applied Biosystems(Foster City, CA)를 비롯한 여러 업체에서 구입할 수 있다. 이런 합성을 위하여 당분야에 공지된 다른 방법을 부가적으로 또는 대안으로 이용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유사체와 같은 올리고뉴클레오타이드를 제조하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 안티센스 화합물은 in vitro에서 합성되고 생물학적 근원의 안티센스 조성물, 또는 안티센스 분자의 생체내 합성을 위하여 설계된 유전자 벡터 구조체를 포함하지 않는다. 본 발명의 화합물은 흡수와 분포를 보조하기 위하여 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 리포솜; 수용체 표적된 분자; 경구, 직장, 국부 또는 다른 제제에 혼합되거나 피포되거나 공액되거나 또는 결합될 수도 있다.

본 발명의 안티센스 화합물에는 제약학적으로 수용가능한 염; 에스터 또는 이런 에스터의 염; 또는 사람을 비롯한 동물에 투입직후에 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔류물을 제공(직접적으로 또는 간접적으로)할 수 있는 임의의 다른 화합물이 포함된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 프로드러그와 제약학적으로 수용가능한 염; 이런 프로드러그의 제약학적으로 수용가능한 염; 다른 생물등가물 역시 포괄한다.

“프로드러그”는 내인성 효소 또는 다른 화학물질 및/또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조된 치료제를 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 프로드러그(prodrug) 이형은 SATE[(S-아세틸-2-티오에틸)포스페이트] 유도체로 제조된다.

“제약학적으로 수용가능한 염”은 본 발명에 따른 화합물의 생리적, 약학적으로 수용되는 염, 다시 말하면, 모체 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 그대로 보존하면서 원치않는 독성 효과를 나타내지 않는 염을 의미한다.

올리고뉴클레오타이드의 제약학적으로 수용가능한 염의 바람직한 예에는 a) 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘과 같은 양이온 또는 스페르민, 스페르미딘과 같은 폴리아민으로 형성된 염, b) 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산 등의 무기산으로 형성된 산 첨가염; c) 초산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 구연산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메타설폰산, P-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산과 같은 유기산으로 형성된 염; d) 클로린, 브롬, 요오드와 같은 음이온으로 형성된 염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명에서 얻어진 화합물은 효과량의 안티센스 화합물을 제약학적으로 적합하고 수용가능한 희석제 또는 담체에 첨가함으로써 제약학적 조성물에 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 화합물과 방법의 이용 역시 예방학적으로 유용하다, 다시 말하면, 예로써 감염, 염증 또는 종양 형성을 예방하거나 지연하는데 유용하다.

본 발명의 안티센스 화합물은 연구와 진단에 유용한데, 그 이유는 이들 화합물이 HIF-1을 인코딩하는 핵산에 혼성화되고 이런 사실에 기반하는 샌드위치 조사 및 다른 조사를 용이하게 하기 때문이다. HIF-1을 인코딩하는 핵산과 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼성화는 당분야에 공지된 수단으로 용이하게 확인할 수 있다. 이런 수단은 올리고뉴클레오타이드에 효소의 공액, 올리고뉴클레오타이드의 방사선라벨링(radiolabeling) 또는 임의의 다른 적합한 검출 수단이다. 이런 검출 수단을 이용하여 샘플에서 HIF-1 수준을 검출하는 키트 역시 만들 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 안티센스 화합물을 함유하는 제약학적 조성물과 제제를 포괄한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료의 여부 및 치료되는 부위에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국부(안구 조직 및 질과 직장을 비롯한 점막 전달 포함); 네뷸라이져에 의한 분말이나 에어로졸의 폐 흡입이나 취입; 기관내, 비강내, 표피, 경피, 입이나 장관외를 통하여 달성할 수 있다. 장관외 투여에는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사/주입; 또는 두개내, 예를 들면, 척수강내, 또는 심실내 투여 등이 포함된다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸로 변형된 올리고뉴클레오타이드는 경구 투여에 특히 적합할 것으로 생각된다.

국소 투여용 제약학적 조성물이나 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점안약, 좌약, 스프레이, 용액, 분말 등이 포함된다. 통상적인 제약학적 담체, 수용액, 분말, 오일베이스, 농후제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.

경구 투여용 조성물과 제제에는 분말이나 과립, 물이나 비-수성 매체에 녹인 현탁액이나 용액, 캡슐, 향가루, 정제 등이 포함된다. 농후제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직하다.

장관외, 척수강내, 심실내 투여용 조성물이나 제제에는 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예를 들면, 침투 강화제, 담체 화합물, 다른 제약학적으로 수용가능한 담체나 부형제를 함유하는 무균 수용액이 포함된다.

본 발명의 제약학적 조성물에는 용액, 에멀젼, 리포좀-함유 제제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 조성물은 방향 액체, 자가-유화형 고체, 자가-유화형 반고체 등을 비롯한 다양한 성분으로부터 만들어질 수 있다.

아래의 실시예들은 본 발명의 여러 측면을 설명한다. 하지만, 이들 실시예는 본원 발명을 한정하지 않는다.

실시예 1: 암 세포주의 성장

올리고뉴클레오타이드 화합물의 효과를 측정하는데 이용되는 암세포는 아래의 공급원으로부터 구입하였다: 사람 OVCAR-3(난소), MCF-7(유방, 호르몬-의존성), HeLa(경부), PC3(전립선), HepG2(간), A549(폐), Caki-1(신장), HT-29(직장), PANC-1(췌장)세포는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA); U251 (뇌)은 Riken(일본); MKN-45(위)는 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Culture)(독일); UMRC2(신장)와 Lox IMVI(흑색종)은 NCI(United States National Cancer institute, Bethesda, MD). UMRC2, Caki-1, PANC-1을 제외한 모든 세포주는 10% 소 태아 혈청(“FBS”), 1 mM 소디움 피루베이트, 10 mM HEPES, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(“P/S”)으로 보충된 RPMI1640 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 성장시켰다. UMRC2, Caki-1, PANC-1 세포는 10% FBS, P/S, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagles's medium)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 유지시켰다. 모든 세포는 가습된 5% CO₂하에 37℃에서 배양하였다.

실시예 2: 올리고뉴클레오타이드의 합성

개방 해독틀(“ORF”)로 알려진 사람 HIF-1α 유전자 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(“3' UTR”)에서 발견된 다양한 뉴클레오타이드 서열은 목표로서 선별하고, 이들에 상응하는 상보적인 뉴클레오타이드를 합성하였다. 각 올리고뉴클레오타이드의 골격은 3'와 5' 말단을 제외하고 합성동안 변형하여 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 도입하고 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생성하 였다.

HIF-1α의 코딩 영역에 위치된 올리고뉴클레오타이드는 ABI(Applied Biosystems, Foster City, CA)의 8909 Expedite DNA 합성기로 합성하였다. 포스포로티오에이트 합성은 아인산염 연결의 단계적 티에이션(thiation)을 위하여 아세토나이트릴에 녹인 0.2 M 3H-1,2-벤조디티올레-3-원 1,1-디옥사이드로 표준 산화 용액을 대체한 점을 제외하고, 상응하는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드에서와 동일한 방식으로 실행하였다. 올리고뉴클레오타이드 화합물은 조절된 세공 유리 칼럼으로부터 절단 및 농축된 수산화암모늄에서 디블록킹(deblocking)이후, 수산화암모늄의 존재하에 55℃에서 하룻밤동안 가열하였다. 상층액은 새 튜브로 이전하고 수산화암모늄을 Speedvac plus 및 UVS400 Universal Vacuum System(Thermo Savant, Holbrook, NY)으로 증발시켰다. 올리고뉴클레오타이드는 75 mM NaOAc, pH 7.2 및 2.5 볼룸(volume)의 에틸알코올로 침전시키고 에틸알코올로 1회 세척하였다. 올리고뉴클레오타이드는 물에 용해시키고 올리고뉴클레오타이드 농도를 UV 분광계로 측정하였다.

실시예 3: 트랜스펙션

트랜스펙션 전날, 세포는 트립신으로 처리하고 세포수를 계산하며 도말하였다. 6 웰-평판의 각 웰에 2.5x10⁵ 세포를 도말하여 트랜스펙션 당일에 세포의 포화 정도가 50-90%가 되도록 하였다. 트랜스펙션 실험에 사용된 모든 시제와 배지는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. 아래의 용액을 무균 튜브에 준비하였 다: 용액 A: 각 트랜스펙션을 위하여, 2 ㎕(0.5 ㎍)의 DNA, 100 ㎕의 혈청없는 배지(“Opti-MEM”), 3 ㎕의 PLUS 시제의 혼합물은 상온에서 15분간 배양하였다. 용액 B: 각 트랜스펙션을 위하여, 2.5 ㎕의 리포펙타민 시제와 100 ㎕의 혈청없는 배지(Opti-MEM)의 혼합물. 용액 A와 B는 합치고 상온에서 15분동안 배양하였다. 트랜스펙션을 위하여, 세포는 2 ㎖의 혈청없는 배지 또는 PBS로 1회 세척하고 800 ㎕의 혈청없는 배지(Opti-MEM)를 각 웰에 첨가하였다. 합쳐진 용액 A와 B를 각 웰에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 이후, 세포는 37℃에서 3 시간동안 배양하고, 배지는 정상 배지로 교체하고 지정된 시간동안 배양을 계속하였다. RT-PCR 및 세포독성 실험에 이용되는 표준 리포펙타민 2000 프로토콜을 위하여, 세포는 트랜스펙션 하루전에 96-웰 평판에서 100 ㎕ 성장 배지에 도말하였다. 각 웰에서, 올리고뉴클레오타이드 샘플은 25 ㎕ OPTI-MEM 감소된 혈청 배지에서 희석하였다. 별도로, 리포펙타민 2000 시제는 실온에서 5분동안 25 ㎕ OPTI-MEM에서 희석(1:50)하였다. 올리고뉴클레오타이드와 시제는 혼합하고 실온에서 20분동안 배양하여 혼합물을 형성하고, 이후 혼합물은 성장 배지에 담긴 세포에 직접 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 이후, 세포는 37℃에서 4시간동안 배양하고, 배지는 정상 배지로 교체하고 지정된 시간동안 배양하였다.

실시예 4: 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 HIF-1α mRNA 발현의 저해

안티센스 올리고뉴클레오타이드가 HIF-1α을 인코딩하는 mRNA의 발현을 하향-조절 또는 저해하는지를 검사하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션된 세포에서 HIF-1α mRNA의 발현 수준을 RT-PCR 분석법으로 측정하였다. 시료 는 트랜스펙션이후 2시간(배지 교체) 시점에 채취하고 RNA를 분리하며 RT-PCR로 분석하였다.

6-웰 평판에서 UMRC2 세포(웰당 2.5 x 10⁵ 세포)는 실험 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포는 전체 RNA를 분리하는데 이용하였다. 전체 RNA는 공급업자의 매뉴얼에 따라 RNA-STAT 키트(TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX)를 이용하여 분리하였다[참조: Chomczynski, P. and Sacchi, N in Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)]. 간단히 설명하면, 2개의 6-웰 평판에서 배지를 제거하고 0.5 ㎖의 RNA-STAT 용액을 첨가하며 수회 피펫팅(pipetting)으로 혼합하고 에펜돌프 튜브에 이전하였다. 0.1 ㎖의 클로르포름을 튜브에 첨가하고, 튜브는 15초간 세게 흔들고, 이후 실온에서 3분간 배양하고 4℃에서 14,000 rpm으로 15분동안 원심 분리하였다. 상층은 새 튜브로 이전하고 0.3 ㎖의 이소프로판올을 첨가하며 상온에서 10분동안 배양하였다. 후속으로, RNA 침전물은 14,000 rpm으로 10분동안 원심 분리하였다. 생성 펠렛은 70% 에탄올로 세척하고 짧게 건조하며 20 ㎕ 물로 재구성하였다. RNA 농도는 분광계로 결정하였다. RT 반응은 M-MLV 효소 키트(Invitrogen)를 이용하여 실행하였다. 5 ㎍의 전체 RNA를 이용하여 20 ㎕ RT 반응에서 cDNA를 합성하였다. 제 1 가닥 cDNA는 전체 RNA, 올리고 dT(0.5 ㎎), dNTP(0.5 mM)의 혼합물을 65℃에서 5분간 배양하고 얼음 위에서 급속 냉각시켜 합성하였다. 이후, 제 1 가닥 완충액, 7.4 mM DTT, 1 ㎕ M-MLV 역전사효소(200 unit)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 37℃에서 50분간 배양하며, 후속으로 70℃에 서 15분간 효소 불활성화를 수행하였다. RT 반응으로 합성된 HIF-1 cDNA는 적합한 프라이머와 함께 Sapphire RCR mix(SuperBio Inc., Seoul, Korea)를 이용한 PCR 반응으로 측정하였다. HIF-1α mRNA 검출을 위하여 프라이머, 5' GCACAGGCCACATTCACG 3'(Seq. Id No. 5)과 5'TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA 3'(Seq. Id No. 6)을 이용하고, 베타 액틴은 내부 PCR 대조로 이용하였다. 베타 액틴에 대한 프라이머로는 5' CCCATGCCATCCTGCGTCTG 3'(Seq. Id. No. 7)과 5'ACGGAGTACTTGCGCTCAG 3'(Seq. Id. NO. 8)을 이용하였다. PCR 생성물은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분석하였다.

총 124개의 올리고뉴클레오타이드가 처음 선별되었는데, 이들 중에서 선호되는 4가지 올리고뉴클레오타이드의 결과를 아래의 표 1에 나타낸다. 각 올리고뉴클레오타이드를 재검하여 mRNA 발현 수준의 하향-조절을 확증하였다. 각 반응은 이중으로 실행하였다.

RX-0047, RX-0073, RX-0149, RX-0158은 본 발명자들에 의해 설계된 새로운 서열이다. 이들 서열이 선택된 이유는 기존 문헌에서 확인된 2가지 영역, HIF-1α 유전자의 ORF와 3' UTR 영역을 대표하고, 상기 문헌에서 이용된 검사에서 상기 영역에 가장 높은 저해%를 보였기 때문이다. 이들 새로운 올리고뉴클레오타이드 모두 강화된 저해%를 보여다. 하지만, 저해%는 하기 실시예 6에 기술된 바와 같이 세포독성 효과와 무관한 것으로 밝혀졌다. 후속으로, UMRC2 세포에서 HIF-1 mRNA 발현의 높은 저해% 및 세포독성 효과를 보이는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 선별하고, 12가지 다른 암 세포주를 상대로 시험하였다. 검사된 뉴클레오타이드 목록은 아래의 표 2에서 도시한다.

도 1에서는 0.3 μM RX-0047과 RX-0149로 트랜스펙션이후, 13개의 암 세포주: UMRC2, OVCAR-3, MKN-45, A549, PC3, U251, Lox IMVI, HeLa, HepG2, HT-29, Caki-1, PANC-1, MCF-7에서 HIF-1 mRNA 수준의 하향-조절을 보여준다. UMRC2, PANC-1, OVCAR-3, MCF-7, Lox IMVI, A549, PC-3 세포주에서 높은 수준의 HIF-1 하향-조절이 관찰되었고, HT-29와 Caki-1 세포에서 중간 수준의 하향-조절이 관찰되었고, HeLa, HepG2, MKN-45, U251에서 낮은 수준의 하향-조절이 관찰되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, RX-0047과 RX-0149에 의한 HIF-1 mRNA 발현의 하향-조절 수준은 몇몇 세포주에서 RX-0047-처리된 세포가 RX-0149-처리된 세포보다 약간 높은 수준의 하향-조절을 보인 점을 제외하고 유사하게 나타났다.

실시예 5: HIF-1 단백질 수준의 측정을 위한 웨스턴 블랏(Western blot)

실시예 3에서 상기한 바와 같이, 0.3 μM 농도의 RX-0047과 RX-0149 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 다양한 암 세포주를 트랜스펙션시켰다. 24시간 트랜스펙션의 6시간 전에, 세포는 100 μM 최종 농도로 철-킬레이터, 데페록시아민(deferroxiamine)으로 처리하였다. 핵 추출액을 준비하기 위하여 다음의 방법을 이용하였다. 10㎝ 용기에서, 세포는 0.1 mM NaVO₄를 함유하는 냉각된 PBS(2x6 ㎖)로 부드럽게 씻고 0.1 mM NaVO₄를 함유하는 1 ㎖의 냉각된 PBS로 재부유시키며 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 펠렛은 0.5% NP40이 존재하는 0.3-0.5 ㎖의 CE 완충액, pH 7.6(10 mM HEPES, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1x 프로테아제 저해제, 0.1 mM NaVO₄)에 재부유시키고, 세포는 얼음위에서 5분간 팽창시켰다. 트랜스펙션이후 24시간 시점에, 세포는 분해 완충액(25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 프로테아제 저해제)에 재부유시켰다. 제조물은 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포질 추출액은 펠렛에서 분리하고 새 튜브에 옮겼다. 핵은 NP40이 없는 0.5 ㎖의 CE 완충액으로 부드럽게 씻고 2,000 rpm에서 5분간 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 50 ㎕ NE 완충액, pH 8.0(20 mM Tris-HCl, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 25% 글리세롤, 0.1 mM NaVO₄, 1x 프로테아제 저해제)을 핵 펠렛에 첨가하고 교반하여 상기 펠렛을 재부유시켰다. 추출액은 얼음위에서 40분간 배양하고 주기적으로 교반하여 펠렛을 재부유시키고, CE와 NE 분획물은 15분간 최대 속도로 회전시켜 임의의 핵을 펠렛팅(pelleting)하였다. 상층액은 새 튜브(가용성 핵 분획물)에 이전하고 -70℃에서 보관하였다. BCA 단백질 검사 시제(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 가공되지 않은 세포 추출물은 SDS-PAGE 및 항-HIF-1 항체(Transduction Labs, Lexington, Ky)를 이용한 후속의 웨스턴 분석으로 HIF-1 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 항-베타-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology)는 내부 대조로 이용하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, RX-0047과 RX-0149는 모든 세포주에서 다소의 HIF-1 단백질 발현 저해를 보였다.

실시예 6: 세포독성 검사

실험 올리고뉴클레오타이드의 세포독성 효과를 검사하기 위하여 사람 암 세포주를 이용하였다. RX-올리고뉴클레오타이드 트랜스펙션이후, 설포로다민 B(“SRB”) 방법[Skehan et al., J. National Cancer Institute, 82: 1107-1112 (1990)]을 이용하여 세포 생존율을 사정하였다.

세포는 96-웰 평판에 도말하고, 다음날 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션(transfection)시켰다. 72시간 배양이후, 생존 세포는 설포로다민 B로 염색하고 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기로 측정하였다. 간단히 설명하면, 96-웰 평판에서 각 웰에 1,000-10,000개의 세포를 도말하고 리포펙타민 2000 시제(Invitrogen)를 이용하여 실험 올리고머로 트랜스펙션시켰다. 4시간 배양이후, 트랜스펙션 시제를 제거하고 각 웰에 새로운 배지를 첨가하였다. 72시간 배양이후, 배지를 제거하였다. 세포는 10% 트리클로로아세트산(“TCA”)로 고정시키고 4℃에서 1시간동안 배양하며 수돗물로 4회 세척하였다. 후속으로, 세포는 1% 초산에 녹인 0.4% 설포로다민 B로 30분간 염색하고 1% 초산으로 4회 세척하며 자연 건조시켰다. 10 mM Tris 용액에서 5분간 교반한 이후, 시료의 흡광도를 530 nm에서 Benchmark Plus Microplate 판독기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 측정하였다.

HIF-1 mRNA의 하향-조절을 보인 실험 화합물을 이용하여 UMRC2의 세포 생존능에 대한 이들의 효과를 측정하였다. 아래의 올리고 화합물, RX-0047, RX-0073, RX-0149, RX-0158을 사용하여 세포 독성실험을 수행하였다. 검사된 다른 올리고에 비하여 RX-0047과 RX-0149가 가장 강력한 세포독성 효과를 보였다. 흥미롭게도, 각각 mRNA의 74%와 45% 저해 효과를 보인 RX-0118과 RX-0121은 RX-0047과 RX-0149 만큼의 세포독성을 보이지 않았다. 이런 이유로, mRNA 저해 결과는 세포독성 효과와 일치하지 않았다.

mRNA 저해 연구로부터 가장 유효한 2가지 후보 화합물, RX-0047과 RX-0149는 여러 다양한 암 세포주에 대한 세포독성 효과를 측정하였다. RX-0047은 아래의 사람 암 세포주: PC3(전립선), U251(뇌), HeLa(경부), OVCAR-3(난소), Lox IMVI(흑색종), HepG2(간), MCF-7(유방), UMRC2(신장), MKN-45(위), PANC-1(췌장), HT-29(직장), Caki-1(신장), A549(폐)에서 세포 생존능을 감소시켰다. 검사된 상이한 세포주에서 RX-0047의 세포독성 효과는 농도에 비례하여 증가하였다. RX-0047은 0.1 μM 농도에서, 검사된 13개 세포주 모두에서 50% 이상의 세포 사멸을 유도하였다. RX-0149에서 유사한 효과가 달성되었다. 다시 말하면, RX-0149는 모든 세포주에서 세포독성 효과를 보이는데, 이런 효과는 서로 다른 세포주에서 농도에 비례하여 가변적으로 증가하였다. 0.1 μM 농도의 RX-0149는 PC3, U251, HeLa, OVCAR-3, Lox IMVI, MCF-7, MKN-45, A549, Caki-1, UMRC2에서 50% 이상의 세포 사멸을 유도하였다. 하지만, PANC-1, HT-29, HepG2에서는 0.1 μM 농도에서 50% 이상의 세포가 생존하였다.

실시예 7: RX-0047과 RX-0149 올리고뉴클레오타이드에 대한 세포독성의 IC ₅₀ 측정

실험 올리고뉴클레오타이드는 세포독성의 상대적 효과량을 조사하였다. 13개의 상이한 암 세포주는 0.01 μM 내지 1 μM 농도의 RX-0047 또는 RX-0149로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션이후 72시간 시점에 세포를 설포로다민 B로 염색하며, 생존 세포수를 Bio-Rad Microplate 판독기(Bio-Rad Laboratories)로 측정하였다. IC₅₀수치, 또는 50%의 세포를 사멸시키는데 필요한 약물 농도는 KaleidaGraph Software(Synergy Software, Reading, PA)를 이용하여 산정하고, 이의 결과는 아래의 표 3에 나타낸다.

비교를 위하여, UMRC2에 대한 IC₅₀ 수치는 RX-0047에서 8 nM이고, RX-0149에서 17 nM이다. 유사한 수준의 세포독성 효과가 U251, OVCAR-3, A549 세포주에서 관찰되었다.

실시예 8: 서열 변이성

RX-0047과 RX-0149의 전체 20-mer 골격이 HIF-1 mRNA 발현을 하향-조절하는데 필요한 지를 확인하기 위하여, 18-, 16-, 14-, 10-mer 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 mRNA 발현과 세포독성에 대한 이들의 효과를 분석하였다. RT-PCR 분석 데이터에서, RX-0047의 18-mer 이형은 HIF-1 mRNA 발현의 상당한 저해를 보이는 것으로 나타났다. 반면에, 16-, 14-, 10-mer 이형은 다소 약하게 HIF-1 mRNA 발현을 저해하는 것으로 나타났다. 이는 RX-0047의 16-, 14-, 10-mer로의 서열 절두가 HIF-1 mRNA 발현 저해에 어느 정도 영향을 미친다는 것을 의미한다. RX-0149의 경우, 18-과 16-mer 이형은 20-mer 이형과 유사하게 HIF-1 mRNA 발현을 저해하였다. 하지만, RX-0149 서열이 14-와 10-mer 이형으로 절단되면, 저해 효과가 미미하였다. 이는 RX-0047의 경우, 18-과 16-mer 이형이 20-mer 이형과 유사하게 작용한다는 것을 암시한다. RX-0149의 경우, HIF-1 mRNA 발현의 최대 저해를 위하여 20-mer 전장 서열이 요구된다.

상기 데이터와 관련하여, 20-mer의 RX-0047이 유래된 서열로부터 상류 또는 하류의 5개 또는 10개 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고머는 HIF-1 mRNA 발현을 상당히 저해하는 것으로 관찰되었다.

20-mer의 RX-0047이 유래된 서열로부터 상류 또는 하류의 5개 또는 10개 뉴클레오타이드를 포함하는 동일한 올리고머를 이용하여 UMRC2 세포주에서 세포독성 효과를 측정하였다. 4개의 변형된 올리고머 모두 20-mer의 RX-0047에 필적하는 세포독성 효과를 보였는데, 이는 RT-PCR 데이터와 일치한다. 상기한 RX-0047과 RX-0149의 절두된 이형 역시 RT-PCR 분석에서 관찰된 바와 같이, 암세포 증식의 유사한 저해 패턴을 보였다.

실시예 9: Ex Vivo 이종이식 연구

동물모델에서 본 발명에 따른 화합물중 하나인 RX-0047을 이용하여 종양의 성장 저해를 확인하기 위하여, 누드 생쥐의 ex vivo 이종이식 연구를 실행하였다. 사람의 폐에서 얻은 A549 암 세포주는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 및 10% Cosmic 소 혈청(HyClone, Logan, UT)으로 보충된 199 배지의 4:1 혼합물에서 성장시켰다. 이들 세포는 37℃, 5% CO₂에 유지시켰다.

표지로 사용되는 루시페라제 유전자를 종양 세포에 도입시켰다. 다음의 방법을 이용하였다. 세포는 루시페라제 유전자와 G418/neo 선별 표지를 보유한 렌티바이러스 벡터를 이용하여 루시페라제로 감염시켰다. 세포는 바이러스 상등액과 함께 24시간 동안 배양하였다. 감염이후 배지를 교체하고, 감염이후 3-4일 시점에 G418 선별을 시작하였다. 루시페라제-양성 세포는 발광계(luminometer)를 이용하여 확인하였다.

면역이 결핍된 생쥐(Nu/Nu; Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN)는 University of Texas Southwestern Medical Center의 Animal Resources Center(ARC)에서 병원균이 없는 상태로 유지하였고, ARC와 IACUC 지침에 따라 처리하였다.

A549 폐암 이종이식 모델에서, 암세포(4 x 10⁶)는 각 생쥐의 옆구리 피하에 주입하였다. 실험 화합물은 Alzet 펌프 시스템을 통하여 14일 동안 투여하였다. Alzet 마이크로-삼투압 펌프(Alza, Palo Alto, CA)는 10g 생쥐의 경우 피하(sc)에, 20g 생쥐의 경우 복강내(IP) 이식하였다. 펌프 속도는 0.25 ㎕/hr(± 0.05 ㎕/hr)로 유지하고, 14일 동안 주입을 계속하였다. 펌프의 충전과 취급 및 외과적 이식에서 무균 기술을 이용하였다.

A549 폐암 전이모델에서, 생쥐는 γ-선으로 조사하고 꼬리정맥을 통하여 1 x 10⁶세포를 정맥내 주입하였다. 생쥐는 부정적인 결과가 나왔을 때(3-4개월후) 희생시키거나 ARC/IACUC 지침에 따라 종양으로 인한 부담이 숙주 동물의 정상 체량의 10%(성체 생쥐에서 1-2cm 직경)를 초과할 때까지 매주 영상을 측정하였다. 동물은 루시페라제-기초한 발광 영상법(luciferase-based bioluminescence imaging)을 이용하여 매주 영상을 측정하였다.

표 4에서는 A549 사람 폐암종 이종이식편으로 피하 이식된 무흉선 누드 생쥐에 대조와 RX-0047을 처리한 이후 종양 성장의 지표로서 루시페라제-기초한 발광 결과를 보여준다. RX-0047 처리 1주후, 종양 크기가 대조 동물에 비하여 3배 정도 감소하였다. RX-0047 처리 2주후, 종양 크기가 2배 정도 감소하였다. 이는 RX-0047이 종양 이종이식 모델에서 강력한 항암제로서 사용될 수 있음을 시사한다.

처리	rlu ^* (처리 1주후)	rlu ^* (처리 2주후)
대조	2.0x 10⁸	3.8 x 10⁸
RX-0047, 30 ㎎/kg/day	5.8 x 10⁷	1.7 x 10⁸

rlu^* = 상대적 발광 단위

A549 전이 모델에서, 동물은 RX-0047의 매일 IP 투여(처음 9일동안 60 ㎎/㎏/day, 이후 5일동안 30 ㎎/㎏/day)로 처리하였다. 전이 종양의 영상 측정은 RX-0047의 14일간 IP 투여이후 2주와 3주 시점에 수행하였다. 표 5에서 도시된 바와 같이, RX-0047 처리 2주후, 처리군에서는 폐 전이가 관찰되지 않은 반면 대조군에서는 폐 전이가 관찰되었다. RX-0047 처리 3주후, 처리군에서 폐 전이가 대조군에 비하여 60배 감소하였다. 이는 RX-0047이 폐 전이의 강력한 저해제임을 시사한다.

처리	rlu ^* (처리 2주후)	rlu ^* (처리 3주후)
대조	1.9 x 10⁷	7.7 x 10⁷
RX-0047	0	1.3 x 10⁶

rlu^* = (상대적 발광 단위)

SEQUENCE LISTING <110> Yoon, Heejeong Ahn, Chang-Ho Lee, Young Bok Mao, Lingjun Jiang, Xiaoming <120> Antisense Oligonucleotides that inhibit expression of HIF-1 <130> REX 7034 <160> 130 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 1 ttggacactg gtggctcatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 2 aatgagccac cagtgtccaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 3 gacttggaga tgttagctcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 4 ggagctaaca tctccaagtc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 gcacaggcca cattcacg 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 6 tgaagattca accggtttaa gga 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 7 cccatgccat cctgcgtctg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 8 acggagtact tgcgctcag 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 9 attgtgcaat tgtggctacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 10 gtgatgatgt ggcactagta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 11 ctccatggtg aatcggtccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 12 gccggcgccc tccatggtga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense ologonucleotide <400> 13 ctcaggtggc ttgtcagggc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 14 ctcgtgagac tagagagaag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 15 aagtccagag gtgggggtgc 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 16 gagatctggc tgcatctc 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 17 gaactcacat tatgtggaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 18 cacagaggcc ttatcaagat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 19 tagctgatgg taagcctcat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 20 ccagcatcca gaagtttcct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 21 catcttcaat atccaaatca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 22 attcatctgt gctttcatgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 23 catgtcacca tcatctgtga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 24 gtatttgttc acattatcag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 25 cactgtgtcc agttagttca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 26 catggtcaca tggatgagta 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 27 taagcatttc tctcatttcc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 28 ttcacaaggc catttctgtg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 29 ttagggtaca cttcattctg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 30 tatgttcata gttcttcctc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 31 ataccttcca tgttgcagac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 32 ataaatagac tgctttaggt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 33 cagtattgta gccaggcttc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 34 ttgaactaac caagtttgtg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 35 gctgtctgtg atccagcatt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 36 atgctactgc aatgcaatgg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 37 aaaggttact gccttcttac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 38 tcaactgcct atgatcatga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 39 gtactgctgg caaagcatta 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 40 attccatgag taactgctgg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 41 gattaacaat gtcatgttcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 42 ataataaacc atacagcatt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 43 tattatgtaa atggctttac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 44 ttctagatat atgcatatct 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 45 atcagatgat ttctctgaat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 46 aacttccaca actacatagg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 47 gtttaatatc agttacacaa 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 48 tataccaaca gggtaggcag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 49 ctgccttgta taggagcatt 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 50 caccctgcag taggtttctg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 51 taacttgatc caaagctctg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 52 aaaattagat gtagaaaata 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 53 agtagaaagg ggatcaaaaa 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 54 aaagagcatt aatgtaaatt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 55 ccaaaaaact gagaaaatga 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 56 aaattatatt ggcatcttct 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 57 atttcttctt aaaaactagt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 58 ggtttaacaa tttcataggc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 59 ccaaataaat gccacatacc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 60 tttgagctgg caaagtgact 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 61 tcttgtttac agtctgctca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 62 atgcttctaa aattactcaa 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 63 aacaagatat ttactgtgac 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 64 cagttagtgt tagatccaac c 21 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 65 ataaaaaggt gcatttttta 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 66 ccctagccaa aaataaataa 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 67 attcgaaaaa gggataaact 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 68 aaaaggtgta aaaatttttc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 69 atttatgtaa aatgtgaaaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 70 aattttgcta agaatgcatg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 71 agcaaattaa catactaggc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 72 aaatcaaaca ttgtattttg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 73 taatagcgac aaagtgcata 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 74 ctacatgaaa aaaaggatgt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 75 aactatatat tcctaaaata 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 76 tgaatgtggc ctgtgcagtg 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 77 tgaggttggt tactgttggt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 78 cagcaccaag caggtcatag 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 79 tcttctggct catatcccat 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 80 ttggtcagat gatcagagtc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 81 tgtcctgtgg tgacttgtcc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 82 acccagacat atccacctct 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 83 tggttgagaa ttcttggtgt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 84 ttcacacata caatgcactg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 85 tgctgaataa taccactcac 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 86 aggacacatt ctgtttgttg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 87 ttcatatctg aagattcaac 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 88 tcaactttgg tgaatagctg 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 89 ggctacttgt atcttctgat 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 90 catcaggttc cttcttaagt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 91 gctggggcca gcaaagttaa 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 92 agatatgatt gtgtctccag 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 93 ctggtcatca gtttctgtgt 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 94 aatggtactt cctcaagttg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 95 atttatattc tgtaattttt 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 96 ggtaatggag acattgccaa 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 97 gtgcagggtc agcactactt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 98 taatgcaact tcttgattga 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 99 ctctggattt ggttctaatt 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 100 gtaaaagaaa gttccagtga 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 101 tgtctgatcc tgaatctggg 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 102 actttgtcta gtgcttccat 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 103 ggactattag gctcaggtga 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 104 gaccatatca ctatccacat 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 105 ccaattccaa cttgaattca 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 106 gttctttgct tctgtgtctt 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 107 taaatctgtg tcctgagtag 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 108 tgctttctaa tggtgacaac 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 109 aactgtgctt tgaggacttg 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 110 tgagtctgct ggaatactgt 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 111 ttagcagtag gttcttgtat 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 112 ttaattcatc agtggtggca 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 113 atattttaat gtcttccata 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 114 aggagatgga gatgcaatca 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 115 gtttctttat gtatgtgggt 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 116 actttgagta tctctatatg 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 117 ctctgtttgg tgaggctgtc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 118 ctgtctgttc tatgactcct 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 119 tagggcttct tggatgagat 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 120 ttcctcagga actgtagttc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 121 attctgcaaa gctagtatct 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 122 agtgaaccat catgttccat 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 123 tccaattcct actgcttgaa 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 124 tctggctgct gtaataatgt 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 125 tgatgtagta gctgcatgat 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 126 tagatttgca tccttttaca 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 127 cagtctacat gctaaatcag 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 128 tcatccattg attgccccag 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 129 tcagctgtgg taatccactt 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 130 aacttcacaa tcataactgg 20

Claims

서열번호 2번의 5' aatgagccaccagtgtccaa 3'로 구성되고, 사람 HIF-1을 인코딩하는 핵산 분자를 목표로 하며, 사람 HIF-1의 발현을 저해하는 RX-0047 화합물.
서열번호 4번의 5' ggagctaacatctccaagtc 3'로 구성되고, 사람 HIF-1을 인코딩하는 핵산 분자를 목표로 하며, 사람 HIF-1의 발현을 저해하는 RX-0149 화합물.
제 1항 또는 2항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 3항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합인 하나이상의 변형된 인터뉴클레오사이드 결합(internucleoside linkage)을 보유하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항 또는 2항의 화합물 및 제약학적으로 수용가능한 희석제 또는 담체를 함유하고, 암 세포를 저해하는 제약학적 조성물.
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