ES2333794T3 - Oligonucleotidos que inhiben la expresion de hif-1. - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica HIF-1 humano, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del HIF-1 humano.

Description

Oligonucleótidos antisentido que inhiben la expresión de HIF-1.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto oligonucleótido antisentido, RX-0047, que inhibe la expresión de una proteína humana, el HIF-1, e induce asimismo citotoxicidad en diversas líneas celulares cancerosas.
Antecedentes de la invención
Los tumores no pueden crecer sin vasos sanguíneos que suministren a las células cancerosas oxígeno y nutrientes (Blagosklonny, International J. Oncol., 2001, 19: 257-262). El control de la respuesta hipóxica en células de mamíferos mediante el factor de transcripción HIF-1 es uno de los mayores reguladores del crecimiento de células cancerosas. HIF hace que las células puedan sobrevivir a la hipoxia y estimular el crecimiento endotelial, y se regula al alza en un amplio espectro de cánceres (Zhong y otros, Cancer Res. 1999 59: 5830-5835). Uno de los ejemplos más sorprendentes del papel del HIF en la angiogénesis y la progresión tumoral es la pérdida de función de la proteína VHL, que es un gen supresor tumoral que está mutado en la mayoría de carcinomas renales de célula clara esporádicos y en la enfermedad de VHL. En consecuencia, la disrupción de la ruta del HIF-1 inhibe el crecimiento tumoral, señalando el HIF-1 como diana anticancerígena potencial. La inhibición del HIF-1 es una estrategia antiangiogénica basada en mecanismo porque es la respuesta mediada por HIF-1 la que conduce la angiogénesis tumoral. La patente US nº 6.222.018, concedida a Semenza, 24 de abril de 2001, se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican el HIF-1. Los oligonucleótidos específicos dados a conocer y reivindicados en la presente invención no fueron dados a conocer en dicha patente. La publicación de patente WO 00/76497 da a conocer un compuesto de HIF-1 antisentido de longitud completa que inhibe el crecimiento tumoral.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: RX-0047 y RX-0149 inhiben la expresión de ARNm de HIF-1 en diversas células cancerosas;
Figura 2: análisis por Western blot de la inhibición de la expresión de proteína HIF-1 mediante RX-0047 y RX-0149.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido que se dirige a un ácido nucleico que codifica HIF-1 (factor inducible por hipoxia tipo 1), y que modula la expresión de HIF-1. También se da a conocer un procedimiento para inhibir la expresión de HIF-1 en células que comprende poner en contacto dichas células con el oligonucleótido según la presente invención. Una ventaja del oligonucleótido descrito en la presente invención consiste en que, además de inhibir la expresión de HIF-1, presenta un efecto citotóxico sobre diferentes líneas celulares cancerosas. Las ventajas de la presente invención se pueden obtener poniendo en contacto células de diversas líneas celulares cancerosas con un compuesto antisentido que es específicamente hibridizable a un sitio sobre el gen de HIF-1 que presenta la secuencia siguiente: 5' ttggacactggtggctcatt 3' en el sitio 2.772 del gen de HIF-1 (Genebank # NM001530) (SEC ID nº 1). El compuesto antisentido es RX-0047, 5' aatgagccaccagtgtccaa 3' (SEC ID nº 2). El contacto tiene lugar en condiciones que permiten que el oligonucleótido se hibridice con el gen que codifica el HIF-1. Tras la hibridización, se inhibe la capacidad de las células de producir HIF-1 y se reduce la viabilidad de las células cancerosas.
Descripción detallada de la invención
El HIF (factor inducible por hipoxia) es un factor de transcripción heterodimérico clave y se activa por hipoxia. No únicamente media en respuestas homeostáticas que incluyen eritropoyesis, angiogénesis y glicólisis a la hipoxia en mamíferos, sino que también facilita la neovascularización y el crecimiento tumorales. Se compone de 2 subunidades diferentes, HIF-1\alpha y HIF-1\beta, también conocido como ARNT (translocador nuclear del receptor arilo). Estas 2 subunidades pertenecen a la familia bHLH (hélice-bucle-hélice básico) y PAS (Per, ARNT, Sim). El dominio bHLH de estos factores es responsable de la dimerización a través de dos hélices y de que el ADN se enlace a través de su dominio básico. Dos dominios separados dentro de HIF-1\alpha y HIF-2\alpha responden a rutas de señalización de hipoxia. El primero es la degradación dependiente de oxígeno (ODD), que, en normoxia, está sujeta a modificación de traducción por parte de una prolil hidroxilasa dependiente de oxígeno (Jaakkola y otros, Science, 2001, 292: 468-472). La prolina hidroxilada promociona la interacción del HIF con el complejo de ubiquitina ligasa VHL (von Hippel-Lindau), iniciando una rápida ubiquitinación y una subsiguiente destrucción de la proteína HIF a través de proteasomas. Un informe reciente indicó que la hidroxilación de asparagina del dominio de transactivación del terminal COOH (CAD) también tiene un papel importante en la degradación del HIF mediada por proteasa inhibiendo la interacción con el coactivador p300/CBP, y reduce la actividad transcripcional del HIF-1 durante la normoxia (Lando y otros, Science, 2002, 295: 858-861). En consecuencia, en conjunción con la prolil hidroxilasa, la asparagina hidroxilasa actúa como un interruptor hipóxico regulado por el nivel de O_{2} en la célula. Durante la hipoxia, la actividad de p42/p44 MAPK induce la fosforilación post traducción del HIF-1 y favorece la actividad transcripcional del HIF-1. Un informe reciente mostró que, junto con la hidroxilación, ubiquitinación y fosforilación, la acetilación tiene un papel importante en la regulación de la estabilidad del HIF-1 (Jeong y otros, Cell, 2002, 111: 709-720).
Bajo hipoxia, el HIF-1\alpha no se hidroxila porque la hidroxilasa, que requiere dioxígeno para su actividad, es inactiva y, de este modo, el HIF-1\alpha no es reconocido por pVHL y se acumula en la célula. A continuación, el HIF-1\alpha transloca al núcleo y se dimeriza con la subunidad de HIF-1\beta constitutivamente presente (Semenza, Genes & Development, 1985, 14: 1983-1991). A continuación, el dímero se enlaza al elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) en los genes diana, lo que resulta en la transactivación de genes como eritropoyetina, VEGA (Forsythe y otros, Mol. Cell. Biol., 1996, 16: 4604-4613), factor \beta de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-\beta), transportador de glucosa (GLUT1) y óxido nitroso sintetasa (Neckers, J. Natl. Cancer Ins., 1999, 91: 106-107). Algunas hormonas y factores de crecimiento también conducen a niveles más elevados de HIF-1\alpha, así como mutaciones en determinados oncogenes y genes supresores tumorales, por ejemplo VHL, que resulta en un aumento del nivel de HIF-1\alpha (Ivan y Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 2001 11: 27-34). Resultará interesante determinar si la hidroxilación o mecanismos alternativos están implicados en esta activación del HIF independiente de la hipoxia.
Diversas estrategias actuales para las terapias anticáncer que aprovechan el microentorno y la respuesta hipóxicos son: 1) fármacos o vectores de terapia génica dependientes de hipoxia, 2) inhibición de la estabilidad de HIF, 3) inhibición de la transactivación por HIF, y 4) inhibidores de VEGA.
Dado el papel clave del factor de transcripción HIF en el desarrollo de cánceres, sería deseable inhibir su actividad durante la oncogénesis. Sin embargo, también sería deseable, hasta donde sea posible, evitar la interrupción de los papeles de la familia en otros aspectos del metabolismo celular. Un enfoque puede consistir en identificar el gen que codifica un factor de transcripción probable que es altamente expresado durante la hipoxia, y diseñar un oligonucleótido antisentido que puede ser utilizado para inhibir la actividad de dicho gen en el contexto adecuado. En el contexto de la presente invención se han descubierto que dos oligonucleótidos antisentido exhiben una capacidad aumentada de inhibir la producción de proteína mediante el gen de HIF-1, y además inducen citotoxicidad en una variedad de líneas celulares cancerosas.
Un compuesto antisentido es una herramienta que puede ser utilizada con el fin de introducir modificaciones en los ácidos nucleicos que se encuentran en las células vivas. El término "antisentido" se refiere al concepto de que los ácidos nucleicos "codifican" proteínas. Es decir, la secuencia de nucleótidos en contra de un determinado ácido nucleico determina, entre otras cosas, qué proteína se producirá. Una secuencia "sentido" para un gen completo dará lugar a una proteína normal en la cantidad habitual, como respuesta a un determinado estímulo. Un oligonucleótido "sentido" se hibridizará con una secuencia génica normal, y no afectará a la cantidad o a las propiedades de la proteína. Una secuencia "no sentido" no dará lugar a un producto, o puede dar lugar a un producto no funcional. Por ejemplo, si un codón u oligómero "no sentido" se inserta en un gen, puede resultar una proteína truncada no funcional. Un oligonucleótido "antisentido" se hibridizará con un gen normal, pero dará lugar a una proteína alterada con respecto a su estructura o a su cantidad. Se ha descubierto que los oligómeros antisentido, es decir compuestos antisentido relativamente cortos, se pueden insertar fácilmente en las células, en las que modifican las funciones escénicas.
Los compuestos antisentido se utilizan habitualmente como reactivos para investigación, para la exploración de las funciones génicas, ya que son capaces de modificar la expresión génica con una especificidad exquisita, y se pueden utilizar para elucidar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido se pueden utilizar, por ejemplo, para distinguir entre funciones de diversos miembros de una ruta biológica.
Los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para bloquear selectivamente los genes causantes de enfermedades, inhibiendo así la producción de proteínas asociadas a enfermedades. Algunos oligonucleótidos antisentido han sido administrados de forma segura y efectiva a humanos, y actualmente se están llevando a cabo diversos ensayos clínicos. Resulta así posible utilizar oligonucleótidos para tratar células, tejidos y animales, especialmente humanos. En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), o a miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por bases nucleicas de procedencia natural, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (esqueleto) con funciones de procedencia no natural que funcionan de forma similar. A menudo, dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos resultan preferidos las formas nativas, ya que las propiedades deseables, tales como, por ejemplo, una solución celular aumentada, una afinidad aumentada por una diana de ácido nucleico y una estabilidad aumentada en presencia de bases nucleicas. La presente invención utiliza un compuesto nucleótido oligomérico, particularmente un oligonucleótido antisentido, que se dirige a una parte de un ácido nucleico que codifica el HIF-1, y que modula la expresión del HIF-1. El compuesto oligonucleótido se diseña de tal modo que se hibridice específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican el HIF-1. Un oligonucleótido, el RX-0047, se dirige a un sitio sobre el gen del HIF-1 que presenta la siguiente secuencia: 5' ttggacactggtggctcatt 3' del sitio 2.772 del gen del HIF-1 (Genebank # NM001530) (SEC ID nº 1). La secuencia del esqueleto de RX-0047 es complementaria a este sitio. Los inventores han descubierto que los oligómeros que comprenden 5 ó 10 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo de la secuencia en la que se derivó el 20-ímero de RX-0047 mostraron una inhibición medible de la expresión de ARNm de HIF-1. Los oligómeros que comprenden 5 ó 10 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo de la secuencia en la que se derivó del 20-ímero de RX-0047 demostró una inhibición de la proliferación de las células cancerígenas. Las versiones truncadas del RX-0047 que mostraban alguna inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1 también mostraron una inhibición de la proliferación de células cancerosas.
Dirigir un compuesto antisentido a un gen particular significa identificar la secuencia del ácido nucleico de interés y seleccionar uno o más sitios dentro de la secuencia de ácido nucleico que se pretende modificar. Una vez identificado el sitio diana, se selecciona un oligonucleótido suficientemente complementario al sitio diana, de tal modo que el mismo se hibridizará específicamente al sitio, es decir, se hibridizará suficientemente bien y con una especificidad suficiente con el fin de dar lugar al efecto deseado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico que codifica HIF-1" comprende ADN que codifica HIF-1, ARN (incluyendo pre-ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN. La hibridización específica de un compuesto oligomérico antisentido con su ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico. Las funciones de ADN que se interfieren incluyen la replicación y la transcripción. Las funciones de ARN con las que se interfieren incluyen todas las funciones vitales, tales como, por ejemplo, translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, traducción de la proteína a partir del ARN, splicing del ARN con el fin de obtener una o más especies de ARNm y actividad catalítica que puede estar incluida en el ARN o facilitada por el mismo. El efecto global de dicha interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión, o producción, de una proteína. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa un incremento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. Para los objetivos de la presente invención, el gen que codifica el HIF-1 se modula de tal modo que se inhibe la expresión de HIF-1.
En el contexto de la presente invención, "hibridizar" significa enlazar mediante puente de hidrógeno, lo que puede tener lugar a través de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre nucleótidos complementarios o bases de nucleótidos. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nucleicas complementarias que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complementario" se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido es capaz de unirse por enlaces de hidrógeno a un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupados por nucleótidos que se pueden unir mediante enlace de hidrógeno entre sí. De este modo, "específicamente hibridizable" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o apareamiento preciso, de tal modo que se produce un enlazamiento estable y específico entre el oligonucleótido y la diana de ADN o ARN. Resulta evidente en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no tiene que ser 100% complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridizable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando el enlazamiento del compuesto a la molécula de ADN o ARN interfiere con la función normal del ADN o ARN diana, provocando una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar el enlazamiento no específico del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea un enlazamiento específico, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se llevan a cabo los ensayos.
El compuesto antisentido de acuerdo con la presente invención comprende 20 bases nucleicas (es decir, 20 nucleósidos enlazados). Tal como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base nucleica y azúcar. Habitualmente, la parte de base nucleica del nucleósido es una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para los nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar enlazado al resto hidroxilo 2', 3' ó 5' del azúcar. Al formar oligonucleótidos, los grupos fosfato enlazan covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí con el fin de formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de dicha estructura polimérica lineal se pueden unir adicionalmente con el fin de formar una estructura circular; sin embargo, en general, resultan preferidas las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura del oligonucleótido, habitualmente los grupos fosfato se consideran formadores del esqueleto internucleósido del oligonucleótido. El enlace o esqueleto normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos, útiles en la presente invención, incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleósido no naturales. Tal como se define en la presente especificación, los oligonucleótidos que presentan esqueletos modificados incluyen los que presentan un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no presentan ningún átomo de fósforo en el esqueleto. En el contexto de la presente memoria, y tal como se refiere a veces en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no presentan ningún átomo de fósforo en su esqueleto internucleósido también pueden ser considerados oligonucleósidos.
Los esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, aminoalquilfosforotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos con enlaces normales 3'-5', análogos de los mismos enlazados 2'-5', y los que presentan polaridad invertida, en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósido están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Los esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos que no incluyen ningún átomo de fósforo presentan esqueletos formados por enlaces internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósido mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los mismos incluyen los que presentan enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que presentan componentes mixtos de N, O, S y CH_{2}.
Las formas de realización más preferidas de la presente invención son oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos heteroatómicos, y en particular -CH_{2}-NH-O-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2}- [conocido como metileno (metilimino) o esqueleto MMI], -CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2}- y -O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}- [en el que el esqueleto nativo de fosfodiéster se representa como -O-P-O-CH_{2}-]. También resultan preferidos los oligonucleótidos con estructuras de esqueletos de morfolino.
Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo sustituido o no sustituido C_{1} a C_{10} o alquenilo y alquinilo C_{2} a C_{10}. Son particularmente preferentes O[(CH_{2})_{n}O]_{m}
CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH_{2})_{n}CH_{3}, O (CH_{2})_{n}ONH_{2}, y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, en los que n y m están comprendidos entre 1 y aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2': alquilo inferior C_{1} a C_{10}, alquilo inferior substituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO_{2}CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituido, un grupo separador de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros substituyentes con propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}OCH_{3}, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin y otros, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, también conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos siguientes. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi(2'-O-CH_{3}), 2'-aminopropoxi(2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden llevar a cabo modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar del nucleótido terminal 3' o en oligonucleótidos enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden presentar miméticos de azúcar, tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de bases nucleicas (frecuentemente designadas simplemente "bases" en la técnica). Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones bases nucleicas "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citocinas (C) y uracilo (U). Las bases nucleicas modificadas incluyen otras bases nucleicas sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Determinadas bases nucleicas son particularmente útiles con el fin de aumentar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos según la presente invención. Dichas bases nucleicas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 substituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha puesto de manifiesto que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de duplex de ácido nucleico en 0,6-1,2ºC, y constituyen actualmente sustituciones de bases preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo.
Otra modificación de los oligonucleótidos según la presente invención implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligonucleótido. Dichos grupos incluyen, sin limitarse a los mismos, restos lipídicos, tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una cadena de poliamina o polietilenglicol, o ácido adamantanoacético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol.
No es necesario que todas las posiciones de un determinado compuesto estén modificadas uniformemente, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente se pueden incorporar en un compuesto individual o incluso en un nucleósido individual dentro de un oligonucleótido. También se describen en la presente memoria compuestos antisentido que son oligonucleótidos quiméricos o "quimeras", que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una de ellas constituida, por lo menos por una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Típicamente, estos oligonucleótidos contienen, por lo menos, una región en la que el oligonucleótido se modifica de tal modo que confiere al oligonucleótido una mayor resistencia a la degradación por nucleasa, una mayor absorción celular y/o una mayor afinidad de enlace para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como substrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A título de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que extiende la hebra de ARN de un duplex ARN:ADN. En consecuencia, la activación de la RNasa H resulta en la escisión del ARN diana, incrementándose así en gran medida la eficacia de la inhibición de oligonucleótido de expresión génica. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridizan la misma región diana. La escisión del ARN diana se puede detectar rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas asociadas de hibridización de ácidos nucleicos conocidas en la técnica.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótido, tal como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se han designado en la técnica híbridos o gapmer.
El compuesto antisentido utilizado de acuerdo con la presente invención se puede preparar conveniente y rutinariamente mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo necesario para dicha síntesis está comercializado por diversos suministradores, por ejemplo Applied Biosystems (Foster City, CA). Se puede utilizar adicional o alternativamente cualquier otro medio conocido en la técnica para dicha síntesis. Es bien conocido el hecho de utilizar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados.
El compuesto antisentido según la presente invención se sintetiza in vitro y no incluye composiciones antisentido de origen biológico, o constructos de vectores genéticos diseñados para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido. El compuesto según la presente invención también se puede mezclar, encapsular, conjugar o asociar de cualquier otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, tales como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, con el fin de facilitar la ingestión, distribución y/o absorción.
El compuesto antisentido según la presente invención incluye sales farmacéuticamente aceptables, ésteres o sales de dichos ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. Correspondientemente, por ejemplo, la presente memoria se refiere también a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos según la presente invención, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes.
El término "profármaco" se refiere a un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en forma activa (es decir, en un fármaco) dentro del cuerpo o las células por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones. Particularmente, se preparan versiones profármaco de los oligonucleótidos según la presente invención como derivados SATO [(S-acetil-2-tioetil)fosfato].
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos según la presente invención, es decir, sales que mantienen la actividad biológica deseada del compuesto matriz y no le confieren efectos tóxicos no deseados.
Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse a los mismos, (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición ácida formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido poligalacturónico, ácido naftalendisulfónico, y similares; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales, tales como cloruro, bromuro y yoduro.
Los compuestos según la presente invención se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto antisentido a un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. La utilización de los compuestos antisentido y procedimientos según la presente invención también pueden resultar útiles profilácticamente, por ejemplo, con el fin de prevenir o retrasar una infección, una inflamación o la formación de un tumor, por ejemplo.
El compuesto antisentido según la presente invención resulta útil para investigación y diagnóstico, dado que dicho compuesto se hibridiza con ácidos nucleicos que codifican HIF-1, permitiendo un diseño fácil de ensayo de sandwich y otros ensayos con el fin de aprovechar este hecho. La hibridización del oligonucleótido antisentido según la presente invención con un ácido nucleico que codifica HIF-1 se puede detectar mediante medios conocidos en la técnica. Dichos medios incluyen la conjugación de una enzima al oligonucleótido, la radiomarcación del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se puede preparar kits que utilicen dichos medios de detección con el fin de detectar el nivel de HIF-1 en una muestra.
La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen el compuesto antisentido según la presente invención. Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se pueden administrar por diversas vías, en función de si se desea un tratamiento local o sistémico, y de la zona que se pretende tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo administración oftálmica y a membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles (incluyendo administración mediante nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. Se considera que los oligonucleótidos con, por lo menos, una modificación 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración
oral.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, pulverulentas o aceitosas, espesantes y similares.
Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, bolsitas o comprimidos. Pueden resultar deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, dispersantes o aglutinantes.
Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, como por ejemplo, aunque sin limitarse a los mismos, mejoradores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención incluyen, sin limitarse a las mismas, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Dichas composiciones se pueden generar a partir de una gran variedad de componentes que incluyen, sin limitarse a los mismos, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de diversos aspectos de la presente invención. Dichos ejemplos no pretenden limitar la invención ni las reivindicaciones siguientes.
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Ejemplo 1 Crecimiento de líneas celulares cancerígenas
Se obtuvieron células cancerosas utilizadas para determinar el efecto de compuestos oligonucleótidos a partir de las siguientes fuentes: Ovcar-3 humano (ovario), MCF-7 (pecho, dependiente de hormonas), HeLa (cérvix), PC3 (próstata), HepG2 (hígado), y A549 (pulmón), HT-29 (colon), PANC-1 (páncreas), Caki-1 (riñón) a través de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA); U251 (cerebro), a través del banco Riken Cell (Japón); MKN-45 (estómago) a través de la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) (Alemania); UMRC2 (riñón) y Lox IMVI (melanoma) a través del Instituto Nacional del Cáncer de los EE.UU. (Betesda, MD). Todas las líneas celulares, excepto UMRC2, Caki-1 y PANC-1, se cultivaron en medio RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal ("FBS"), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES y 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina ("P/S"). Las células UMRC2, Caki-1 y PANC-1 se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM", Invitrogen) suplementado con 10% de FBS, P/S, 10 mM de HEPES y 2 mM de L-glutamina. Todas las células se incubaron a 37ºC bajo 5% de CO_{2} humidificado.
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Ejemplo 2 Síntesis de oligonucleótidos
Diversas secuencias de nucleótidos que se encuentran en la región de codificación genética de HIF-1\alpha humano conocida como marco abierto de lectura ("ORF") y región 3' no traducida ("3' UTR") se seleccionaron como dianas y se sintetizaron los correspondientes oligonucleótidos complementarios. El esqueleto de cada oligonucleótido se modificó durante la síntesis con el fin de introducir enlaces fosforotioato entre nucleótidos, excepto en los extremos 3' y 5', de tal modo que se obtuvo un oligonucleótido antisentido.
Los oligonucleótidos localizados en la región de codificación de HIF-1\alpha se sintetizaron utilizando un sintetizador 8909 Expedito ADN de Applied Biosystems, Foster City, CA ("ABI"). La síntesis de fosforotioatos se llevó a cabo del mismo modo que para los correspondientes oligonucleótidos fosfodiéster, excepto que el recipiente estándar de oxidación se sustituyó por 0,2 M de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona 1,1-dióxido en acetonitrilo para la tiación escalonada de los enlaces fosfito. Tras la escisión de la columna de vidrio de poro controlado y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado, el compuesto oligonucleótido se calentó en presencia de hidróxido de amonio a 55ºC durante una noche. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y el hidróxido de amonio se evaporó mediante Speedvac plus y UVS400 Universal Vacuum System (Thermo Savant, Holbrook, NY). El oligonucleótido se precipitó con 75 mM de NaOAc, pH 7,2 y 2,5 volúmenes de alcohol etílico, y se lavó una vez con alcohol etílico. El oligonucleótido se disolvió en agua y la concentración de oligonucleótidos se midió mediante un espectrofotómetro de UV.
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Ejemplo 3 Transfección
El día antes de la transfección, las células se tripsinizaron, se contaron y se colocaron en una placa. En placas de 6 pocillos, en cada pocillo se colocaron 2,5 x 10^{5} células de tal modo que alcanzaran un 50-90% de confluencia el día de la transfección. Todos los reactivos y medios utilizados para el experimento de transfección se obtuvieron a través de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se prepararon las siguientes soluciones en tubos estériles: Solución A: para cada transfección, se incubó una mezcla de 2 \mul (0,5 \mug) de ADN, 100 \mul de medio libre de suero ("Opti-MEM") y 3 \mul de reactivo PLUS a temperatura ambiente durante 15 minutos. Solución B: para cada transfección, una mezcla de 2,5 \mul de reactivo Lipofectamina y 100 \mul de medio libre de suero (Opti-MEM). Las soluciones A y B se combinaron e incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para la transfección, las células se lavaron una vez con 2 ml de medio libre de suero o PBS y se añadieron 800 \mul de medio libre de suero (Opti-MEM) a cada pocillo. La solución combinada de A y B se añadió a cada pocillo y se mezcló suavemente. A continuación, las células se incubaron durante 3 horas a 37ºC, el medio se sustituyó por medio normal y se incubó durante el tiempo indicado. Para el protocolo estándar LIPOFECTAMINA 2000, que se utilizó para RT-PCR y experimentos de citotoxicidad, las células se colocaron en placas de 96 pocillos el día antes de la transfección en 100 \mul de medio de cultivo. Para cada pocillo, se diluyó una muestra de oligonucleótido en 25 \mul de medio de suero reducido OPTI-MEM. Separadamente, se diluyó el reactivo LIPOFECTAMINA 2000 (1:50) en 25 \mul de OPTI-MEM durante 5 minutos a temperatura ambiente. El oligonucleótido y el reactivo se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos con el fin de permitir la formación de complejo, y a continuación dicho complejo se añadió directamente a las células en su medio de cultivo, y se mezcló suavemente. A continuación, las células se incubaron durante 4 horas a 37ºC, el medio se sustituyó por medio normal y se incubó durante el tiempo indicado.
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Ejemplo 4 Inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1\alpha mediante oligonucleótidos antisentido
A continuación, se analizó la capacidad de los oligonucleótidos antisentido de regular a la baja, o inhibir, la expresión de ARNm que codifica HIF-1\alpha. El nivel de expresión de ARNm de HIF-1\alpha en células transfectadas con los oligonucleótidos antisentido se midió por análisis RT-PCR. Las muestras se extrajeron 2 horas tras la transfección (cambio de medio), el ARN se aisló y se sometió a análisis RT-PCR.
Las células UMRC2 (2,5 x 10^{5} células por pocillo) en una placa de 6 pocillos se transfectaron con los oligonucleótidos experimentales, y las células transfectadas se utilizaron para aislar el ARN total. Se aisló el ARN total utilizando un kit ARN-STAT (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX), según el manual del fabricante [véase también Chomczynski, P. y Sacchi, N en Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)]. Brevemente, se extrajeron los medios de las dos placas de 6 pocillos y se añadieron 0,5 ml de solución ARN-START y se mezcló pipeteando diversas veces, y se transfirió a un tubo Eppendorf. Se añadieron 0,1 ml de cloroformo al tubo, y dicho tubo se agitó enérgicamente durante 15 segundos, y a continuación se incubó durante 3 minutos a temperatura ambiente antes de la centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. La capa superior se transfirió a un tubo nuevo y se añadieron 0,3 ml de isopropanol, y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, el precipitado de ARN se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos. La lenteja resultante se lavó con etanol al 70%, se secó brevemente y se reconstituyó con 20 \mul de agua. La concentración de ARN se determinó mediante un espectrofotómetro. Se llevó a cabo una reacción a temperatura ambiente utilizando un kit enzimático M-MLV (Invitrogen). Se utilizaron 5 \mug de ARN total para sintetizar ADNc en 20 \mul de reacción a temperatura ambiente. Se sintetizó ADNc de primera hebra incubando ARN total, mezcla de oligo dT (0,5 mg) y dNTP (0,5 mM) a 65ºC durante 5 minutos y enfriando rápidamente en hielo. Se añadieron tampón de primera hebra, 7,4 mM de DTT y 1 \mul de M-MLV transcriptasa inversa (200 unidades) a la mezcla de reacción anterior y se incubó a 37ºC durante 50 minutos, y la inactivación enzimática se prosiguió a 70ºC durante 15 minutos. El ADNc de HIF-1 sintetizado por reacción a temperatura ambiente se sintetizó por PCR utilizando mezcla Sapphire RCR (SuperBio Inc., Seúl, Corea) con primers apropiados. Para la detección de ARNm de HIF-1\alpha, los primers 5' GCACAGGCCACATTCACG 3' (SEC ID nº 5) y 5' TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA 3' (Seq. Id No. 6). Se utilizó beta-actina como control PCR interno. Los primers para beta-actina fueron 5' CCCATGCCATCCTGCGTCTG 3' (SEC ID nº 7) y 5' ACGGAGTACTTGCGCTCAG 3' (SEC ID nº 8). Los productos PCR se analizaron en 1,5% de gel de agarosa por electroforesis.
Inicialmente, se analizaron un total de 124 oligonucleótidos, y los resultados de los cuatro preferidos se muestran en la siguiente tabla 1. Cada oligonucleótido se analizó de nuevo con el fin de confirmar la regulación a la baja del nivel de expresión de ARNm. Cada reacción se llevó a cabo por duplicado.
TABLA 1 Expresión de ARNm de HIF-1\alpha inhibida
1 
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RX-0047, RX-0073, RX-0149 y RX-0158 son nuevas secuencias diseñadas por los inventores. Dichas secuencias fueron seleccionadas como representativas de dos regiones que se encuentran en las regiones de referencia, 3' UTR y ORF del gen HIF-1\alpha, que exhiben ambas el mayor % de inhibición para esa región de acuerdo con el ensayo utilizado en esa referencia. Todas las nuevas secuencias exhibieron un % de inhibición mejorado con respecto a la referencia, utilizando el ensayo descrito en el presente documento. Sin embargo, se puso de manifiesto que el % de inhibición no se correlacionaba con la citotoxicidad, tal como se describe en el ejemplo 6. A continuación, dos oligonucleótidos que exhibieron un % de inhibición de expresión de ARNm de HIF-1 y citotoxicidad en células UMRC2 se seleccionaron para llevar a cabo ensayos en otras 12 líneas celulares cancerosas. En la siguiente tabla 2 se muestra una lista de los nucleótidos sometidos ensayo.
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TABLA 2 Lista de S-oligonucleótidos HIF-1
2
TABLA 2 (continuación)
3
TABLA 2 (continuación)
4
TABLA 2 (continuación)
5 
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La figura 1 muestra la regulación a la baja del nivel de ARNm de HIF-1 en 13 líneas celulares cancerosas (UMRC2, OVCAR-3, MKN-45, A549, PC3, U251, Lox IMVI, HeLa, HepG2, HT-29, Caki-1, PANC-1 y MCF-7) tras la transfección con 0,3 \muM de RX-0047 y RX-0149. Se observó una elevada regulación a la baja del nivel de HIF-1 en las líneas celulares UMRC2, PANC-1, OVCAR-3, MCF-7, Lox IMVI, A549 y PC3, una regulación a la baja moderada del nivel en las células HT-29 y Caki-1, y una baja regulación a la baja del nivel en HeLa, HepG2, MKN-45, y U251. Tal como se muestra en la figura 1, el nivel de regulación a la baja de la expresión de ARNm de HIF-1 por RX-0047 y RX-0149 fue similar, excepto que las células tratadas con RX-0047 mostraron un nivel ligeramente más alto de regulación a la baja que las tratadas con RX-0149 en algunas líneas celulares.
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Ejemplo 5 Análisis Western blot de niveles proteínicos de HIF-1
Se transfectaron diversas líneas celulares cancerosas tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 3, con los oligonucleótidos preferidos RX-0047 y RX-0149 a una concentración de 0,3 \muM. Las células se trataron con un quelante de hierro, deferroxiamina, a 100 \muM de concentración final, 6 horas antes de la postransfección de 24 horas. Para la preparación de extracto nuclear, se utilizó el siguiente procedimiento. Para un plato de 10 cm, las células se lavaron suavemente con PBS gélido que contenía 0,1 mM de NaVO_{4} (2 x 6 ml), se resuspendió con 1 ml de PBS gélido con 0,1 mM de NaVO_{4} y se centrifugó a 2.000 rpm durante 5 minutos. La lenteja se resuspendió en 0,3-0,5 ml de tampón CE, pH 7,6 (10 mM de HEPES, 60 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 1 mM de PMSF, 1x cóctel inhibidor de proteasa y 0,1 mM de NaVO_{4}) con 0,5% de NP40 y las células se dejaron hinchar sobre hielo durante 5 minutos. La preparación se centrifugó a 2.000 rpm durante 5 minutos. El extracto citoplásmico se extrajo a partir de la lenteja y se transfirió a un tubo nuevo. Los núcleos se lavaron suavemente con 0,5 ml de tampón CE sin NP40. Los núcleos se centrifugaron, como anteriormente, a 2.000 rpm durante 5 minutos. Se añadieron 50 \mul de tampón NE, pH 8,0 (20 mM de Tris-HCl, 420 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 25% de glicerol, 0,1 mM de NaVO_{4}, y 1x cóctel inhibidor de proteasa) a la lenteja nuclear y se homogeneizó por agitación con el fin de resuspender la lenteja. El extracto se incubó en hielo durante 40 minutos con una homogeneización por agitación periódica con el fin de resuspender la lenteja y las fracciones CE y NE se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 minutos con el fin de convertir en lenteja todos los núcleos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo (fracción nuclear soluble) y se almacenó a -70ºC. Se utilizó reactivo de ensayo proteínico BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) con el fin de medir la concentración de proteína. Los extractos celulares crudos se utilizaron para determinar la expresión de proteína HIF-1 mediante SDS-PAGE y subsiguiente análisis Western utilizando un anticuerpo anti-HIF-1 (Transduction Labs, Lexington, KY). Se utilizó anticuerpo anti-beta-actina (Santa Cruz Biotechnology) como control interno. Los resultados se muestran en la figura 2. Rx-0047 y RX-0149 demostraron inhibición de la expresión de proteína HIF-1 en un mayor o menor grado en todas las líneas celulares.
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Ejemplo 6 Ensayo de citotoxicidad celular
Se utilizaron líneas celulares cancerosas humanas con el fin de analizar la citotoxicidad celular de oligonucleótidos experimentales. Se utilizó el procedimiento de sulforhodamina B ("SRB") [Skehan y otros, J. National Cancer Institute, 82: 1107-1112 (1990)] para determinar la supervivencia celular tras la transfección de oligonucleótidos RX.
Las células se dispusieron en una placa de 96 pocillos y se transfectaron con los oligonucleótidos al día siguiente. Tras un período de 72 horas de incubación, las células supervivientes se tiñeron con sulforhodamina B y se midieron utilizando un lector de microplaca. Brevemente, 1.000-10.000 células se colocaron en cada pocillo en una placa de 96 pocillos y se transfectaron con oligómeros experimentales utilizando reactivo lipofectamina 2000 (Invitrogen). Tras 4 horas de incubación, se eliminó el agente de transfección y se añadieron los medios frescos a cada pocillo. Tras 72 horas de incubación, se extrajeron los medios. Las células se fijaron con 10% de ácido tricloroacético ("TCA"), se incubaron durante 1 hora a 4ºC y se lavaron 4 veces con agua corriente. A continuación, las células se tiñeron con 0,4% de sulforhodamina B en 1% de ácido acético durante 30 minutos, se lavaron 4 veces con 1% de ácido acético y se secaron en aire de nuevo. Tras 5 minutos de agitación en solución 10 mM Tris, se llevó a cabo una lectura de densidad óptica de las muestras a 530 nm utilizando un lector Benchmark Plus Microplate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Los compuestos experimentales que mostraban regulación a la baja de ARNm de HIF-1 se utilizaron con el fin de analizar su efecto sobre la viabilidad celular de UMRC2. Se utilizaron los siguientes compuestos oligo, RX-0047, RX-0073, RX-0149 y RX-0158, para el ensayo de citotoxicidad. RX-0047 y RX-0149 mostraron el efecto citotóxico celular más potente en comparación con los otros oligonucleótidos analizados. De forma interesante, RX-0118 y RX-0121, nuevos oligonucleótidos que habían exhibido un 74 y un 45% de inhibición de ARN respectivamente, no mostraron tanta citotoxicidad como RX-0047 y RX-0149. En consecuencia, el ensayo para la inhibición de ARNm no se correlacionó con la citotoxicidad.
Se analizó en los dos mejores candidatos a partir de los estudios de inhibición de ARNm, RX-0047 y RX-0149, la citotoxicidad frente a diversas líneas celulares cancerosas. RX-0047 redujo la viabilidad celular en las siguientes líneas celulares cancerosas humanas: PC3 (próstata), U251 (cerebro), HeLa (cérvix), OVCAR-3 (ovario), Lox IMVI (melanoma), HepG2 (hígado), MCF-7 (pecho), UMRC2 (riñón), MKN-45 (estómago), PANC-1 (páncreas), HT-29 (colon), Caki-1 (riñón) y A549 (pulmón). La citotoxicidad celular de RX-0047 aumentó con la concentración de RX-0047 en diferentes líneas celulares analizadas. 0,1 \muM de RX-0047 provocó más del 50% de muerte celular en las 13 líneas celulares analizadas. Se obtuvieron resultados similares para RX-0149. Nuevamente, se puso de manifiesto citotoxicidad de RX-0149 en todas las líneas celulares, y la misma aumentó con la concentración en diversos grados entre las diferentes líneas celulares. 0,1 \muM de RX-0149 en PC3, U251, HeLa, OVCAR-3, Lox IMVI, MCF-7, MKN-45, A549, Caki-1 y UMRC2 provocaron más del 50% de muerte celular. Pero más del 50% de células en PANC-1, HT-29 y HepG2 sobrevivieron a 0,1 \muM.
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Ejemplo 7 Medición de IC_{50} de citotoxicidad celular para los oligonucleótidos RX-0047 y RX-0149
Se analizaron los oligonucleótidos experimentales para la dosificación eficaz relativa. Se transfectaron trece líneas celulares cancerosas diferentes con RX-0047 ó RX-0149 a concentraciones comprendidas entre 0,01 \muM y 1 \muM, y tras 72 horas postransfección, las células se tiñeron con sulforhodamina B y el número de células supervivientes se contó utilizando un lector de microplaca Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). El valor de IC_{50}, o la concentración de fármaco necesaria para eliminar la mitad de las células, se calculó utilizando el software KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA). Los resultados se indican en la siguiente tabla 3.
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TABLA 3
6
A efectos comparativos, se indica que la IC_{50} para UMRC2 es 8 nM para RX-0047 y 17 nM RX-0149. Se observaron niveles similares de efecto citotóxico en las líneas celulares U251, OVCAR-3, y A549.
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Ejemplo 8 Variabilidad de secuencia
Con el fin de determinar si el esqueleto 20-ímero completo de RX-0047 y RX-0149 es necesario para regular a la baja la expresión de ARNm de HIF-1, se sintetizaron oligonucleótidos 18-, 16-, 14-, y 10-ímeros y se analizaron sus efectos sobre la expresión de ARNm y su citotoxicidad. Los datos de análisis RT-PCR indicaron que la versión 18-ímero de RX-0047 mostraba cierta inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1. En cambio, las versiones 16- y 14- y 10-ímero mostraron una inhibición menos fuerte de la expresión de ARNm de HIF-1. Este hecho sugiere que la truncación de secuencia de RX-0047 hasta 16-, 14- y 10-ímero tuvo cierto efecto sobre la inhibición deseada de expresión de ARNm de HIF-1. Para RX-0149, las versiones 18- y 16-ímero de RX-0149 mostraron una inhibición similar de la expresión de ARNm de HIF-1 a la versión 20-ímero de RX-0149. Sin embargo, cuando la secuencia se truncó a las versiones 14-, y 10-ímero de RX-0149, la inhibición se volvió insignificante. Este hecho indica que para RX-0047, las versiones 18- y 16-ímero funcionaban también tan eficientemente como la versión 20-ímero. Para RX-0149, se requiere la secuencia de 20-ímero de longitud completa con el fin de alcanzar la máxima inhibición de la expresión de ARNm de HIF-1.
De acuerdo con los datos anteriores, los inventores hemos descubierto que los oligómeros que comprenden 5 ó 10 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo de la secuencia en la que se derivó el 20-ímero de RX-0047 mostraron una inhibición medible de la expresión de ARNm de HIF-1.
La citotoxicidad se analizó utilizando los mismos oligómeros, que comprendían 5 ó 10 nucleótidos corriente arriba y corriente abajo de la secuencia en la que se derivó el 20-ímero de RX-0047 en la línea celular UMRC2. Los 4 oligómeros modificados mostraron efectos citotóxicos comparables al 20-ímero de RX-0047, hecho consistente con los datos de RT-PCR. Las versiones truncadas de RX-0047 y RX-0149 descritas anteriormente también mostraron un patrón similar de inhibición de proliferación de células cancerosas, tal como se observó en el análisis RT-PCR.
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Ejemplo 9 Estudio ex vivo de xenotransplante
Con el fin de observar la iniciación del crecimiento de tumores utilizando uno de los compuestos inventados en la presente invención, el RX-0047, en modelos animales, se llevó a cabo un estudio de xenotransplante ex vivo de ratones inmunodeficientes. La línea celular de cáncer de pulmón humana A549 se cultivó en una mezcla 4:1 de medio Eagle modificado por Dulbecco y medio 199 suplementado con 10% de suero de ternera cósmica (HyClona, Logan, UT). Las células se mantuvieron a 37ºC bajo 5% de CO_{2}.
Se introdujo un gen marcador, luciferasa, en las células tumorales. Se utilizaron los siguientes procedimientos. Se infectaron las células con luciferasa utilizando un vector lentiviral que contenía el gen de luciferasa y un marcador de selección G418/neo. Las células se incubaron durante 24 horas en presencia de sobrenadante viral. El medio se cambió tras la infección, y la selección G418 se inició 3-4 días tras la infección. Las células positivas a luciferasa se confirmaron utilizando un luminómetro.
Los ratones inmunodeficientes (Nu/Nu; Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos dentro del centro de recursos animales (ARC) del University of Texas Southwestern Medical Center y se trataron de acuerdo con las directrices de ARC y IACUC.
Para el modelo de xenotransplante de cáncer de pulmón A549, se inyectaron células (4 x 10^{6} células) subcutáneamente en los dos costados de cada ratón. Se administraron los artículos de ensayo durante 14 días a través de un sistema de bomba Alzet. Se implantaron bombas microosmóticas Alzet (Alza, Palo Alto, CA) subcutáneamente (sc) para ratones de 10 g y por vía intraperitoneal (IP) para ratones de 20 g. La velocidad de bombeo se mantuvo a 0,25 \mul/h (0,05 \mul/h) con infusión continua durante 14 días. Se utilizó técnica estéril durante el rellenado y el manejo de la bomba y la implantación quirúrgica.
Para modelo de metástasis de cáncer de pulmón A549, los ratones se irradiaron y se introdujeron 1 x 10^{6} células por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Se obtuvieron imágenes de los animales utilizando bioluminiscencia basada en luciferasa semanalmente. Los ratones fueron sacrificados sobre la base de resultados negativos (tras 3-4 meses) o se obtuvieron imágenes de los mismos semanalmente hasta que la masa tumoral sobrepasaba el 10% del peso corporal normal del animal huésped (1-2 cm de diámetro para un ratón adulto) según directrices de ARC/IACUC.
La tabla 4 muestra la medición de bioluminiscencia basada en luciferasa como indicador del crecimiento tumoral en el control y en ratones inmunodeficientes implantados sc atímicos tratados con RX-0047 con xenotrasplantes de carcinoma de pulmón humano A549. Una semana después del tratamiento con RX-0047, se observó una reducción de un tercio en el tamaño del tumor en comparación con los animales de control. Dos semanas después del tratamiento con RX-0047, se observó una reducción de una mitad en el tamaño del tumor. Este hecho indica que el RX-0047 es un potente agente antitumoral en el modelo de xenotransplante tumoral.
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TABLA 4
7
En el modelo de metástasis A549, los animales se trataron con dosis diarias IP de RX-0047 (60 mg/kg/día durante 9 días seguido de 30 mg/kg/día durante 5 días adicionales). La toma de imágenes del tumor metastásico se lleva a cabo 2 y 3 semanas tras una administración IP de 14 días de RX-0047. Tal como se muestra en la tabla 5, 2 semanas tras el tratamiento con RX-0047, la metástasis pulmonar no se detectó, mientras que dicha metástasis pulmonar en el grupo de control sí se observó. Tres semanas tras el tratamiento con RX-0047, la metástasis pulmonar decreció en un factor de 60 con respecto al grupo de control. Este hecho indica que el RX-0047 es potencialmente un fuerte inhibidor de la metástasis pulmonar.
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TABLA 5
8
<110> Yoon, Heejeong
\hskip1cm Ahn, Chang Ho
\hskip1cm Lee, Young Bok
\hskip1cm Mao, Lingjun
\hskip1cm Jiang, Xiaoming
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<120> oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de HTF-1
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<130> REX 7034
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<160> 130
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<170> Versión de patente en 3.1
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 1
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ttggacactg gtggctcatt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
aatgagccac cagtgtccaa 
\hfill
20 
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 3
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gacttggaga tgttagctcc 
\hfill
20 
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\newpage
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggagctaaca tctccaagtc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 5
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gcacaggcca cattcacg 
\hfill
18 
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<210> 6
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
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tgaagattca accggtttaa gga 
\hfill
23 
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 7
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cccatgccat cctgcgtctg 
\hfill
20 
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<210> 8
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 8
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acggagtact tgcgctcag 
\hfill
19 
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<210> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 9
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attgtgcaat tgtggctacc 
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20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 10
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gtgatgatgt ggcactagta 
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20 
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<210> 11
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 11
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ctccatggtg aatcggtccc 
\hfill
20 
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<210> 12
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 12
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gccggcgccc tccatggtga 
\hfill
20 
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<210> 13
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 13
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ctcaggtggc ttgtcagggc 
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20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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ctcgtgagac tagagagaag 
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20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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aagtccagag gtgggggtgc 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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gagatctggc tgcatctc 
\hfill
18 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 18
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cacagaggcc ttatcaagat 
\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 19
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tagctgatgg taagcctcat 
\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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ccagcatcca gaagtttcct 
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<223> oligonucleótido antisentido
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catcttcaat atccaaatca 
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<223> oligonucleótido antisentido
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attcatctgt gctttcatgt 
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catgtcacca tcatctgtga 
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gtatttgttc acattatcag 
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<223> oligonucleótido antisentido
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cactgtgtcc agttagttca 
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ttagggtaca cttcattctg 
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\hfill
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<223> oligonucleótido antisentido
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<223> oligonucleótido antisentido
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cagtattgta gccaggcttc 
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<223> oligonucleótido antisentido
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ttgaactaac caagtttgtg 
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hfill
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hfill
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<223> oligonucleótido antisentido
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tcaactgcct atgatcatga 
\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtactgctgg caaagcatta 
\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattaacaat gtcatgttcc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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ataataaacc atacagcatt 
\hfill
20 
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<210> 43
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<211> 20
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tattatgtaa atggctttac 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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ttctagatat atgcatatct 
\hfill
20 
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<210> 45
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
atcagatgat ttctctgaat 
\hfill
20 
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<210> 46
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
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aacttccaca actacatagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 47
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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gtttaatatc agttacacaa 
\hfill
20 
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tataccaaca gggtaggcag 
\hfill
20 
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\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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aaaattagat gtagaaaata 
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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ccaaaaaact gagaaaatga 
\hfill
20 
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\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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atttcttctt aaaaactagt 
\hfill
20 
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\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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ccaaataaat gccacatacc 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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tttgagctgg caaagtgact 
\hfill
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tcttgtttac agtctgctca 
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20 
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atgcttctaa aattactcaa 
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20 
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\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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ccctagccaa aaataaataa 
\hfill
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attcgaaaaa gggataaact 
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20 
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\hskip-.1em\dddseqskip
agcaaattaa catactaggc 
\hfill
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aaatcaaaca ttgtattttg 
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taatagcgac aaagtgcata 
\hfill
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ctacatgaaa aaaaggatgt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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aactatatat tcctaaaata 
\hfill
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20 
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\hfill
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tcaactttgg tgaatagctg 
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ggctacttgt atcttctgat 
\hfill
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agatatgatt gtgtctccag 
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ggtaatggag acattgccaa 
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gtgcagggtc agcactactt 
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ctctggattt ggttctaatt 
\hfill
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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gtaaaagaaa gttccagtga 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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tgtctgatcc tgaatctggg 
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<212> ADN
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<223> oligonucleótido antisentido
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actttgtcta gtgcttccat 
\hfill
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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ggactattag gctcaggtga 
\hfill
20 
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gaccatatca ctatccacat 
\hfill
20 
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 105
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ccaattccaa cttgaattca 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido antisentido
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gttctttgct tctgtgtctt 
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20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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<223> oligonucleótido antisentido
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tgctttctaa tggtgacaac 
\hfill
20 
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\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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tgagtctgct ggaatactgt 
\hfill
20 
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ttagcagtag gttcttgtat 
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20 
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ttaattcatc agtggtggca 
\hfill
20 
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\hfill
20 
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\hfill
20 
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\hfill
20 
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\hskip-.1em\dddseqskip
actttgagta tctctatatg 
\hfill
20 
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<212> ADN
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\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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ctgtctgttc tatgactcct 
\hfill
20 
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<211> 20
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\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcctcagga actgtagttc 
\hfill
20 
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<210> 121
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<212> ADN
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attctgcaaa gctagtatct 
\hfill
20 
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<210> 122
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<211> 20
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
20 
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<210> 123
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<211> 20
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tccaattcct actgcttgaa 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctggctgct gtaataatgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
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\hskip-.1em\dddseqskip
tagatttgca tccttttaca 
\hfill
20 
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 127
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\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tcatccattg attgccccag 
\hfill
20 
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<210> 129
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<211> 20
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tcagctgtgg taatccactt 
\hfill
20 
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<210> 130
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacttcacaa tcataactgg 
\hfill
20

Claims (11)

1. Oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica HIF-1 humano, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del HIF-1 humano.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido.
3. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 2, que presenta por lo menos un enlace internucleósido modificado que es un enlace fosforotioato.
4. Procedimiento de tratamiento de células o tejidos humanos in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido según la reivindicación 1.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que se inhibe la expresión de HIF-1.
6. Procedimiento de tratamiento de una célula cancerosa in vitro que comprende la etapa que consiste en introducir en la célula un oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, que hibrida el HIF-1 humano.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se induce la citotoxicidad.
8. Oligonucleótido según la reivindicación 1, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico de un humano o un animal mediante terapia.
9. Utilización de un compuesto según la reivindicación 1 en la preparación de una composición para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico de un animal o un humano mediante terapia.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el procedimiento de tratamiento es el tratamiento del cáncer.
11. Oligonucleótido según la reivindicación 1, para su utilización en el tratamiento del cáncer.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US20070218551A1 (en) * 2003-10-02 2007-09-20 Chuan-Yuan Li Novel Sirna-Based Approach to Target the Hif-Alpha Factor for Gene Therapy
US7618947B2 (en) * 2004-08-25 2009-11-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of HIF-1 beta expression
WO2008070616A2 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 University Of Utah Research Foundation METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO HIF-1α
US20080318241A1 (en) * 2007-06-18 2008-12-25 The Regents Of The University Of Michigan Methods and Systems for Detecting Antiangiogenesis
BR112012027547B1 (pt) 2010-04-29 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina
WO2012082765A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 The United State Of America. As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Methods for decreasing body weight and treating diabetes
WO2013177419A2 (en) 2012-05-23 2013-11-28 The Ohio State University Lipid nanoparticle compositions and methods of making and methods of using the same
WO2018160772A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Method of treating obesity, insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease including non-alcoholic steatohepatitis

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5882914A (en) 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
DE60027719T2 (de) * 1999-06-14 2007-04-26 Cancer Research Technology Ltd. Krebstherapie
AU2002231223A1 (en) * 2000-10-26 2002-05-06 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for treating hematologic malignancies and multiple drug resistance
PT2264172T (pt) * 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression

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