CN100471862C - 抑制hif-1表达的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

新的反义寡核苷酸化合物RX-0047和RX-0149，它们抑制HIF-1的表达并且还在一些癌细胞系中诱导细胞毒性。

Description

抑制HIF-1表达的反义寡核苷酸
发明领域
本发明涉及新的反义寡核苷酸化合物RX-0047和RX-0149，它们抑制人类蛋白质HIF-1的表达并且能在一些癌细胞系中诱导细胞毒性.
发明背景
没有血管为肿瘤细胞提供氧气和营养，肿瘤就不能生长(Blagosklonny，International J.Oncol.，2001 19：257-262).转录因子HIF-1控制哺乳动物细胞中低氧应答，是癌细胞生长的主要调节剂之一.HIF使得细胞能够从低氧幸存并且刺激内皮生长并且在一系列癌症中被上调(Zhong等人，Cancer Res.1999 59：5830-5835).HIF在血管生成和肿瘤发展中的最显著的实例之一是蛋白质VHL的功能丧失，VHL是肿瘤抑制基因，其在多数散发性透明细胞肾癌和VHL基本中突变.因此，HIF-1途径的破坏抑制肿瘤生长，表明HIF-1是潜在的抗癌靶标.HIF-1的抑制是基于机理的抗血管生成途径，因为是HIF-介导的应答驱动肿瘤血管生成.2001年4月24日出版的Semenza的美国专利号6,222,018涉及编码HIF-1的核苷酸序列.在那篇专利中没有公开本发明中公开和申请保护的特定寡核苷酸.
附图简述
图1.RX-0047和RX-0149抑制HIF-1 mRNA在多种癌细胞中的表达.
图2.RX-0047和RX-0149抑制HIF-1蛋白质表达的蛋白质印迹分析.
发明概述
本发明涉及反义寡核苷酸，其靶向编码HIF-1(低氧可诱导的因子1)的核酸，并且调节HIF-1的表达.还提供了抑制细胞中HIF-1表达的方法，该方法包括将细胞与本发明的寡核苷酸化合物和组合物接触.当前描述的寡核苷酸的优点是除了抑制HIF-1的表达，它们还对几种不同的癌细胞系具有细胞毒性效果.本发明的优点可以通过将多种癌细胞系的细胞与反义化合物接触得到，所述反义化合物可以与HIF-1基因上具有如下序列的部位杂交：HIF-1基因的2,772位点5′ttggacactggtggctcatt 3′(Genban# NM001530)(Seq.Id.No.1).尤其优选地为RX-0047，其包含5′aatgagccaccagtgtccaa 3′(Seq.Id.No.2).用与HIF-1基因的1,936位上5′gacttggagatgttagctcc 3′(Seq.Id.No.3)反义的化合物可以得到类似的优点.尤其优选RX-0149，其包含5′ggagctaacatctccaagtc 3′(Seq.Id.No.4).接触在能使寡核苷酸与编码HIF-1的基因杂交的条件下进行.杂交后，细胞产生HIF-1的能力受到抑制，并且癌细胞生存力降低.
发明详述
HIF(低氧可诱导的因子)是关键异二聚体转录因子并且受到低氧的激活.它不仅介导哺乳动物中对低氧的内环境稳定应答，包括红细胞生成、血管生成和糖酵解，还促进肿瘤新血管生成和生长.HIF由两种不同的亚单位HIF-1α和HIF-1β组成，HIF-1β也被称为ARNT(芳基受体核易位体).这两种亚单位属于bHLH(碱性螺旋-环-螺旋)和PAS(Per，ARNT，Sim)家族.这些因子的bHLH结构域负责通过这两个螺旋的二聚体化并且通过它们的基本结构域进行DNA结合.HIF-1α和HIF-2α内的两个单独的结构域负责低氧信号途径.第一种途径是依赖氧的降解(ODD)，其在常氧下受到依赖氧的脯氨酰羟化酶的翻译后修饰(Jaakkola等人，Science，2001，292：468-472).经羟化的脯氨酸促进HIF与VHL(von Hippel-Lindau)泛素连接酶复合体的相互作用，启动快速泛素化和随后通过蛋白酶体的HIF蛋白质破坏.最近的报导表明HIF COOH-末端反式激活结构域(CAD)中的天冬酰胺羟化也通过抑制与p300/CBP共活化剂的相互作用而在蛋白酶体-介导的HIF降解中起重要作用并且减小常氧期间HIF-1的转录活性(Lando等人，Science，2002.295：858-861).因此，天冬酰胺羟化酶与脯氨酰羟化酶一起作为受到细胞中O2水平调节的低氧开关.低氧期间，p42/p44 MAPK活性诱导HIF-1的翻译后磷酸化并且促进HIF-1的转录活性.最近的报导表明除羟基化、泛素化和磷酸化之外，乙酰化在HIF-1稳定性的调节中也起重要作用(Jeong等人，Cell，2002，111：709-720).
低氧时，HIF-1α不被羟基化，因为羟化酶(其活性需要分子氧)没有活性，从而HIF-1α不被pVHL识别并在细胞中积累.然后HIF-1α转移到细胞核中并与组成性存在的HIF-1β亚单位聚合成二聚体(Semenza，Genes & Development，1985，14：1983-1991).然后该二聚体结合靶基因中的低氧应答元件(HRE)，导致基因如促红细胞生成素、VEGF(Forsythe等人，Mol.Cell.Biol.，1996 16：4604-4613)、血小板来源的生长因子-β(PDGF-β)、葡萄糖转运蛋白(GLUT1)和一氧化二氮合成酶(Neckers，J.Natl.Cancer Ins.1999，91：106-107)的反式激活.某些激素和生长因子也导致HIF-1α的水平增加以及某些癌基因和肿瘤抑制基因，如VHL的突变，导致HIF-1α水平增加(Ivan和Kaelin，Current Opinion in Genetics & Development，2001，11：27-34).有趣的是确定羟基化或者其它机制是否与该独立于低氧的HIF活化有关.
使用低氧微环境和应答来进行癌症治疗的一些当前的策略如下：1)依赖低氧的药物或者基因治疗载体；2)抑制HIF稳定性；3)抑制HIF的反式激活和4)VEGF抑制剂.
考虑到HIF转录因子在肿瘤的发展中的关键角色，希望抑制肿瘤发生期间HIF转录因子的作用.然而，还希望尽可能地避免中断该家族在细胞代谢的其他方面的角色.一种方法是鉴定编码在低氧期间高度表达的可能的转录因子的基因，并设计反义寡核苷酸，其用于抑制正确背景中该基因的活性.本发明人已经发现两种反义寡核苷酸既显示出抑制HIF-1基因产生蛋白质的能力的增强的活性，还在许多癌细胞系中诱导细胞毒性.
反义化合物是可以用于将修饰导入活细胞中发现的核酸的工具.术语“反义”指核酸“编码”蛋白质这一概念.即，给定核酸中发现的核苷酸的序列确定将产生什么蛋白质.完整基因的“有义”序列将应答给定刺激产生通常量的正常蛋白质.“有义”寡核苷酸将与正常基因序列杂交，并且将不影响所述蛋白质的量、或者性质.“元义”序列将不产生产物，或者可以产生无功能的产物.例如，如果“无义”密码子或者寡聚体插入基因中，可以产生截短的、无功能蛋白质.“反义”寡核苷酸将与正常基因杂交，但是将产生结构或者量改变的蛋白质。已经发现反义寡聚体，即相对短的反义化合物，可以容易地插入细胞中，在细胞中它们改变基因功能。
反义化合物通常用作研究检测基因功能的试剂，因为它们能够以高度特异性改变基因表达，并且可用于阐明特定基因的功能。例如，反义化合物可用于区分生物途径的多种成员的功能.
反义寡核苷酸可用于选择性阻断致病基因，从而抑制疾病相关蛋白质的产生.某些反义寡核苷酸已经被安全而有效地施用于人类，并且许多临床试验正在进行中。可能寡核苷酸用于治疗细胞、组织、和动物，特别是人类。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者它们的模拟物的寡聚体或者多聚体.该术语包括由天然发生的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸以及具有类似功能的包含非天然发生的部分的寡核苷酸。这些经修饰的或者经取代的寡核苷酸因为具有所希望的性质而通常比天然形式优选，所述所希望的性质为例如，增强的细胞摄入、对核酸靶标的增加的亲和性和存在核碱基时稳定性增加。本发明使用寡聚核苷酸化合物，尤其反义寡核苷酸，它们靶向编码HIF-1的核苷酸的部分，并且调节HIF-1的表达。设计所述寡核苷酸化合物与编码HIF-1的一种和多种核酸特异杂交。一种寡核苷酸RX-0047靶向HIF-1基因上的部位，该部位具有下面的序列：HIF-1基因的2,772位上的5′ttggacactggtggctcatt 3′(Genebank # NM001530)(Seq.Id.No.1)。RX-0047的主链序列与该部位互补。另一种寡核苷酸RX-0149靶向HIF-1基因的编码区，其具有下面的序列：HIF-1基因的1,936位上的5′gacttggagatgttagctcc 3′(Genebank#NM001530)(Seq.Id.No.3)。RX-0149的主链序列与该部位互补。本发明人已经发现包含RX-0047和RX-0149的20聚体(20-mer)所来源的序列上游和下游5或者10个核苷酸的寡聚体表现出对HIF-1 mRNA表达的可测量的抑制。然而，本发明人已经发现，该寡核苷酸对变异性更敏感，并且尽管RX-0149的18聚体(18-mer)表现出对HIF-1 mRNA表达的一定抑制，但是从任一末端的进一步截短导致HIF-1 mRNA表达抑制的大量丧失。包含RX-0047和RX-0149的20聚体所来源的序列上游和下游5或者10个核苷酸的寡聚体表现出对癌细胞增殖的抑制.表现出对HIF-1 mRNA表达的一定抑制的RX-0047和RX-0149的截短形式也表现出对癌细胞增殖的抑制.
靶向特定基因的反义化合物指确定目标核酸序列，并选择该核酸序列内将要修饰的一个和多个位点.一旦确定了靶标位点，选择与该靶标位点足够互补的寡核苷酸，从而其将与该位点特异杂交，即，足够好并且足够特异地杂交以得到所希望的效果.
本文中所用的短语“编码HIF-1的核酸”包括编码HIF-1的DNA、从该DNA转录的RNA(包括前-mRNA)，和从该RNA衍生的DNA.反义寡聚化合物与其靶标核酸的特异杂交干扰该核酸的正常功能.所要干扰的DNA的功能包括复制和转录.所要干扰的RNA的功能包括所有重要的功能，如RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质从该RNA的转录、该RNA的剪接产生一种和多种mRNA种类，和RNA参加或者促进的催化活性.对靶核酸功能的这种干扰的总体效果是调节蛋白质的表达或者产生.在本发明的上下文中，“调节”指基因表达的增加(刺激)或者减小(抑制).为了本发明目的，调节编码HIF-1的基因从而抑制HIF-1的表达.
在本发明的上下文中，“杂交”指互补核苷或者核苷酸碱基之间的氢键，其可以通过Watson-Crick、Hoogsteen或者反转Hoogsteen氢键形成.例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补核碱基，它们通过氢键成对.本文中所用的“互补的”指两个核苷酸之间精确配对的能力.例如，如果寡核苷酸的某个位置上的核苷酸能够与DNA或者RNA分子的相同位置上的核苷酸氢键结合，那么认为该寡核苷酸和DNA或者RNA在该位置相互互补.当寡核苷酸和DNA或者RNA的每个分子中足够数目的相应位置被可以相互氢键结合的核苷酸占据时，该寡核苷酸和DNA或者RNA是互补的.从而，术语“可特异杂交的”和“互补的”用于表明足够程度的互补性或者精确配对，从而在寡核苷酸和DNA或者RNA靶标之间发生稳定而特异的结合.在本领域中理解反义化合物的序列不需要与其将特定杂交的靶标核酸100％互补.当反义化合物与靶DNA或者RNA分子的结合干扰该靶DNA或者RNA的正常功能而导致效用损失时，该反义化合物是可特异杂交的，并且具有足够程度的互补性以避免在特异结合所希望的条件下反义化合物与非靶标序列的非特异结合，所述条件即对于体内测定或者治疗性治疗为在生理条件下，对于体外测定为实施测定的条件下.
尽管反义寡核苷酸是反义化合物的优选形式，但是本发明还包括其他寡聚体反义化合物，包括但不限于如下所述的寡核苷酸模拟物.根据本发明的反义化合物优选包括约10到约30个核碱基.尤其优选的为包含约20个核碱基(即约20个连接的核苷)的反义寡核苷酸.本领域中公知核苷是碱基-糖联合.核苷的碱基部分通常是杂环碱基.两类最常见的这种杂环碱基是嘌呤和嘧啶.核苷酸是还包括共价连接到该核苷的糖部分的磷酸基团的核苷.对于包括呋喃戊糖苷糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或者5’羟基部分.在形成寡核苷酸中，磷酸基团将相互相邻的核苷共价连接形成线性聚合化合物.该线性聚合物结构的各自末端又可以进一步连接形成环状结构，然而，通常优选线性结构.在寡核苷酸结构内，通常将磷酸基团称作形成寡核苷酸的核苷间骨架.RNA和DNA的正常键或者骨架为3’到5’磷酸二酯键.
用于本发明的优选反义化合物的特定实例包括包含经修饰的骨架或者非天然核苷间键的寡核苷酸.如本申请书中定义的，具有经修饰的骨架的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主链中不具有磷原子的那些寡核苷酸.为了本说明书的目的，并且如有时在本领域中参考的，也可以将在它们的核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸认为是寡核苷.
优选的经修饰的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸，包括3’-亚烃基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、亚磷酰胺，包括3’-氨基亚磷酰胺和氨基烷基亚磷酰胺、硫逐亚磷酰胺、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基膦酸三酯，和具有正常3’-5’键的硼烷基磷酸酯，和这些的2’-5’连接的类似物，和具有倒转极性的那些化合物，其中相邻核苷单位对3’-5’到5’-3’或者2’-5’或者5’-2’连接.还包括多种盐、混合盐和游离酸形式.
优选的经修饰的其中不包括磷原子的寡核苷酸主链由短链烷基或者环烷基核苷间键、混合的杂原子或者烷基或者环烷基核苷间键、或者一个或多个短链杂原子或者杂环核苷间键形成.这些主链包括具有吗啉代键(部分从核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；包含烯的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链.
在其他优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间键，即主链都被新的基团取代.碱基单位被保留以便与适宜的核酸靶标化合物杂交.一种这样的寡聚化合物是已经表现出优良的杂交性质的寡核苷酸模拟物，其被称为肽核酸(PNA).在PNA化合物中，用包含酰胺的主链，尤其氨基乙基甘氨酸主链置换寡核苷酸的糖主链，核碱基得到保留并且直接或者间接结合主链的酰胺部分的氮杂氮原子.
本发明的最优选的实施方案是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，尤其-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或者MMI主链]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主链以-O-P-O-CH2-给出].还优选具有吗啉代基主链结构的寡核苷酸.
修饰的寡核苷酸也可以包含一种或多种取代的糖部分.优选的寡核苷酸在2’位包含下列之一：OH；F；O-，S-，或N-烷基；O-，S-，或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基可以是取代或者未取代的C1到C10烷基或者C2到C10链烯基和炔基.尤其优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1到约10.其他优选的寡核苷酸在2’位包含下列之一：C1到C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或者O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团、或者改善寡核苷酸药物动力学性质的基团，和具有相似性质的其他取代基.优选的修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也叫做2’-O-(2-甲氧基乙基)或者2’-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基.进一步优选的修饰包括2’-二甲氨基氧乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基团也称为2’-DMAOE，如下面的实施例所述.其他优选的修饰包括2-甲氧基(2’-O-CH3)、2-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F).类似的修饰也可以在寡核苷酸的其他位置上进行，尤其在3’-末端核苷酸上糖的3’位，或者2’-5’-连接的寡核苷酸中和5’-末端核苷酸的5’位.寡核苷酸还可以是糖模拟物，如环丁基部分代替呋喃戊糖基糖.寡核苷酸还可以包括核碱基(在文献中通常简称为“碱基”)修饰或者取代.本文中所用的“未修饰的”或者“天然“核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U).修饰的核碱基包括其他合成的和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素，尤其5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤和3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤.某些核碱基尤其可用于增加本发明的寡聚体化合物的结合亲和性.这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、已经表明5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃，是本发明优选的碱基取代，当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时尤其优选.
本发明的寡核苷酸的另一修饰包括化学连接寡核苷酸的一个或多个部分或者缀合物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或者细胞摄取.这些部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂肪族链，例如，癸二酸或者十一烷基残基，磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或者三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸脂，多胺或者聚乙二醇链，或者金刚烷乙酸、棕榈基部分，或者十八胺或者己基氨基-羰基-氧胆固醇部分.
给定化合物中所有位置不必都被统一修饰，实际上多于一个的上面提到的修饰可以掺入单一化合物或者甚至寡核苷酸内的单个核苷.本发明还包括反义化合物，其是嵌合化合物.在本发明的背景中“嵌合”反义化合物或者“嵌合体”是反义化合物，尤其寡核苷酸，它们包含两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单位组成，即，对于寡核苷酸，单体单位为核苷酸.这些寡核苷酸通常包含至少一个区域，其中该寡核苷酸被修饰从而赋予该寡核苷酸对核酸酶降解的更大抗性、更强的细胞摄取，和/或对靶核酸的更大结合亲和性.该寡核苷酸的额外区域可作为能够切割RNA：DNA或者RNA：RNA杂种分子的酶的底物.作为实例，RNA酶H是切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶.因此，RNA酶H的激活导致切割RNA靶标，从而极大地增强寡核苷酸抑制基因表达的效率.因此，与杂交相同靶标区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时，用较短的寡核苷酸通常可以得到相当的结果.RNA靶标的切割可以常规地通过凝胶电泳检测，如果必要，可以联合本领域中公知的核酸杂交技术.
本发明的嵌合反义化合物可以形成两种或者多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上文描述的寡核苷酸模拟物的复合结构.这些化合物在本领域中已经被称作杂合体或者gapmer.
通过众所周知的固相合成技术可以方便而常规地合成根据本发明使用的反义化合物.用于这种合成的设备由若干销售商出售，这些销售商包括例如，Applied Biosystems(Foster City，CA).可以额外或者备选地使用本领域中公知的用于这种合成的任何其他方法.使用相似的技术制备寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的.
本发明的反义化合物在体外合成并且不包括生物来源，或者经设计用于指导反义分子的体内合成的基因载体构建体的反义组合物.本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物，例如脂质体，受体靶分子，以及口腔的、直肠的，局部的或其它制剂混合、包裹，缀合或发生其它关联，以便辅助摄取，分布和/或吸收.
本发明的反义化合物包括任何药学上可接受的盐、酯、或者这些酯的盐，或者任何其他化合物，其当施用于包括人的动物时，能够提供(直接或者间接)生物活性代谢物或者其残基.因此，例如，本公开还涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐，这些前药的药学上可接受的盐，和其他生物等价物.
术语“前药”指以无活性形式制备的治疗剂，其在身体或者身体的细胞内通过内源酶或者其他化学物质和/或条件的作用转化成活性形式(即，药物).具体地，将本发明的寡核苷酸的前药形式制备为SATE[(S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物.
术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保持亲本化合物的所希望的生物学活性并且不赋予其不希望的毒理学作用的盐.
对于寡核苷酸，药学上可接受的盐的优选实例包括但不限于(a)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)与无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸，例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸酸、萘磺酸、甲磺酸、对-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸、等等形成的盐，和(d)由基本阴离子，如氯、溴和碘形成的盐.
通过将有效量反义化合物加入适宜的药学上可接受的稀释剂或者载体中可以将本发明化合物用于药物组合物中.本发明的反义化合物和方法还可用以预防，例如，防止或者延迟感染、炎症或者肿瘤形成.
本发明的反义化合物可用于研究和诊断，因为这些化合物与编码HIF-1的核酸杂交，使得易于构建能利用该事实的三明治或者其他测定法.通过本领域中公知的方法可以检测本发明的反义寡核苷酸与编码HIF-1的核酸的杂交.这些方法包括将酶缀合到该寡核苷酸，放射标记该寡核苷酸，或者任何其他适宜的检测方法.还可以制备使用这些方法检测样品中HIF-1水平的试剂盒.
本发明还包括包含本发明的反义化合物的药物组合物和制剂.本发明的药物组合物可以以多种方法施用，取决于是否希望局部或者全身性治疗和所要治疗的部位.施用可以是局部的(包括经眼的和经粘膜，包括阴道和直肠递送)、经肺，例如，通过吸入或者吹入粉剂或者气溶胶，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、经口或者肠胃外.肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或者肌内注射或者输液；或者颅内，例如，鞘内或者室内施用.认为具有至少一种2’-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸尤其可用于经口施用.
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、膏剂、洗剂、乳剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂和粉剂.常规药物载体、水性、粉剂或者油性基质、增稠剂等等可以是必要的或者所希望的.
用于经口施用的组合物和制剂包括粉剂或者粒剂、水或者非水性介质中的悬浮剂或者溶液剂、胶囊剂、囊剂或者片剂.增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者结合剂也可以是需要的.
用于肠胃外、鞘内或者室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水性溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他适宜的添加剂，如，但不限于，渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或者赋形剂.
本发明的药物组合物包括，但不限于，溶液剂、乳剂、和含有脂质体的制剂.这些组合物可以从多种组分产生，这些组分包括，但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体.
实施例
下面的实施例阐明本发明的多个方面的实施.它们不限制本发明或者所附权利要求.
实施例1-癌细胞系的生长
用于确定寡核苷酸化合物的效果的癌细胞从下面的来源得到：来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)的人OVCAR-3(卵巢)，MCF-7(乳腺，依赖激素的)，HeLa(子宫颈)，PC3(前列腺)，HepG2(肝脏)，和A549(肺)，HT-29(结肠)，PANC-1(胰脏)，Caki-1(肾)；来源于Riken Cell Bank(日本)的U251(脑)；德国微生物和细胞培养物中心(DSMZ)(德国)MKN-45(胃)；来自美国国家癌症研究所(Bethesda，MD)UMRC2(肾)和Lox IMVI(黑素瘤).除了UMRC2、Caki-1和PANC-1之外，所有细胞系都生长在补加10％胎牛血清(FBS)，1mM丙酮酸钠，10mMHEPES和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(P/S)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中.UMRC2、Caki-1和PANC-1细胞保持在补加10％胎牛血清、10mMHEPES和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(“DMEM”，Invitrogen)中.所有细胞都生长在37℃下湿润5％ CO2中.
实施例2-寡核苷酸的合成
选择称作可读框(“ORF”)的人HIF-1α基因编码区和3’非翻译区(“3’UTR”)中发现的多种核苷酸作为靶标，并合成相应的互补寡核苷酸.合成期间修饰每种寡核苷酸的主链以便在核苷酸之间(除了3’和5’末端之外)导入硫代磷酸酯键，从而得到反义寡核苷酸.
使用Applied Biosystems，Foster City，CA(＂ABI＂)的8909Expedite DNA合成仪合成HIF-1α的编码区中的寡核苷酸.使用关于相应磷酸二酯寡核苷酸相同的方式进行硫代磷酸酯的合成，只是标准氧化瓶由乙腈中的0.2M 3H-1，2苯并二硫醇(benzodithiole)-3-酮1，1二氧化物以逐步硫杂化亚磷酸酯键.从可控孔度玻璃柱切割并在浓氨水中去封闭后，将寡核苷酸化合物在氨水存在下在55℃下过夜加热.将上清液转移到新管中并通过Speedvac plus和UVS400 UniversalVacuum System(Thermo Savant，Holbrook，NY)蒸发氨水.用75mM NaOAc，pH7.2和2.5体积乙醇沉淀寡核苷酸并用乙醇洗涤一次.将寡核苷酸溶于水中并通过紫外分光光度计测量寡核苷酸浓度.
实施例3-转染
转染前一天，将细胞胰蛋白酶处理，计数，并铺平板.将2.5×105个细胞铺在6孔板中的每个孔中，从而这些细胞在转染当天达到50-90％汇合.用于转染实验的所有试剂和培养基都来自Invitrogen(Carlsbad，CA).在无菌管中制备下面的溶液：溶液A：对于每次转染，将2μl(0.5μg)DNA、100μl无血清的培养基(“Opti-MEM”)和3μl PLUS试剂的混合物在室温孵育15分钟.溶液B：对于每次转染，2.5μl Lipofectamine试剂和100μl元血清培养基(Opti-MEM)的混合物.将溶液A和B合并并在室温孵育15分钟.为了转染，用2ml无血清的培养基或者PBS洗涤细胞一次并向每孔加入800μl无血清培养基(Opti-MEM).向每孔加入所合并的溶液A和B并轻微混合.随后，细胞在37℃孵育3小时，将培养基用常规培养基代替并孵育所指定的时间.对于标准LIPOFECTAMINE 2000方案(其用于RT-PCR和细胞毒性实验)，在100μl生长培养基中转染前一天将细胞铺在96孔板中.对于每孔，将寡核苷酸样品在25μl OPTI-MEM血清减少的培养基中稀释.单独将LIPOFECTAMINE 2000试剂在25μl OPTI-MEM中室温下稀释5分钟.将寡核苷酸和试剂混合并在室温下孵育20分钟以允许复合物形成，然后将复合物直接加入到生长培养基中的细胞并轻轻混合.随后，细胞在37℃孵育4小时，然后用常规培养基替换所述培养基并孵育所指定的时间.
实施例4-通过反义寡核苷酸抑制HIF-1α mRNA表达
然后试验反义寡核苷酸下调、或者抑制编码HIF-1α的mRNA的表达的能力.通过RT-PCR分析测量用反义寡核苷酸转染的细胞中HIF-1α的mRNA的表达水平.转染后2小时时(改变培养基)采集样品，分离RNA并将其进行RT-PCR分析.
用实验寡核苷酸转染6孔板上的UMRC2细胞(2.5×105个细胞/孔)并用转染的细胞分离总RNA.使用RNA-STAT试剂盒(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，根据供应商手册[也参见Chomczynski，P.和Sacchi，N，Anal.Biochem.162：156-159(1987)]分离总RNA.简言之，从两个6孔板除去培养基并加入共0.5mlRNA-STAT溶液，并通过吸液混合数次，并转移到eppendorf管中.向管中加入0.1ml氯仿，并剧烈摇动该管15秒，然后在室温下孵育3分钟后以14,000rpm在4℃下离心15分钟.将顶层转移到新管中并加入0.3ml异丙醇并且在室温下孵育10分钟.随后，以14,000rpm离心RNA沉淀10分钟.所得沉淀用70％乙醇洗涤，快速干燥，并用20μl水重构.通过分光光度计确定RNA浓度.用M-MLV酶试剂盒(Invitrogen)实施RT反应.5μg总RNA用于合成20μl RT反应中的cDNA.通过将总RNA、寡聚dT(0.5mg)和dNTP(0.5mM)混合物在65℃孵育5分钟并在冰上快速冷却合成第一条链cDNA.将第一条链缓冲液、7.4mM DTT和1μl M-MLV反转录酶(200单位)加入上面的反应混合物并在37℃孵育50分钟，然后在70℃下酶失活15分钟.通过PCR测量RT反应合成的HIF-1cDNA，该测量使用SapphireRCR混合物(SuperBio Inc.，Seoul，韩国)和适宜的引物.对于HIF-1α mRNA检测，引物为5′GCACAGGCCACATTCACG 3′(Seq.Id No.5)和5′TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA 3′(Seq.IdNo.6).β-肌动蛋白用作PCR内对照.β-肌动蛋白的引物为5′CCCATGCCATCCTGCGTCTG 3′(Seq.Id.No.7)和5′ACGGAGTACTTGCGCTCAG 3′(Seq.Id.No.8).在1.5％琼脂糖凝胶上通过电泳分析PCR产物.
最初共筛选了124种寡核苷酸，来自优选的4种核苷酸的结果在下面的表1中显示.再次检验每种寡核苷酸以证实mRNA表达水平的下调.一式两份地进行每种反应.
表1.HIF-1α mRNA表达的抑制
 
Rexahn# 区域 靶标部位<sup>＊</sup> 5’-序列-3’ Seq.Id.No.     ％抑制
RX-0047 3′UTR 2772 aatgagccaccagtgtccaa 2 54
RX-0073 3′UTR 3195 attgtgcaattgtggctacc 9 28
RX-0149 编码区 1936 ggagctaacatctccaagtc 4 57
RX-0158 编码区 2217 gtgatgatgtggcactagta 10 40
＊Genbank# NM001530
RX-0047、RX-0073、RX-0149和RX-0158是发明人设计的新序列.选择它们作为对照中发现的两个区域，根据用于对照的试验，HIF-1α基因的3’UTR和ORF区域都显示出对于那一区域的最高％抑制.使用此处描述的试验，所有新序列都显示出比对照增加的％抑制.然而，发现％抑制不与细胞毒性相关，如实施例6中所讨论.随后，选择显示出HIF-1 mRNA表述的高％抑制和UMRC2细胞中细胞毒性的两种寡核苷酸在12种其他癌细胞系中试验.所试验的核苷酸列表如下面的表2中所示.
表2.HIF-1S-寡核苷酸列表
 
ID 5′-序列-3′ 起始 长度 序列#
RX-0001 ctccatggtgaatcggtccc 251 20 11
RX-0002 gccggcgccctccatggtga 260 20 12
RX-0028 ctcaggtggcttgtcagggc 48 20 13
RX-0029 ctcgtgagactagagagaag 111 20 14
RX-0030 aagtccagaggtgggggtgc 145 20 15
RX-0031 gagatctggctgcatctc 331 18 16
RX-0032 gaactcacattatgtggaag 398 20 17
RX-0033 cacagaggccttatcaagat 422 20 18
RX-0034 tagctgatggtaagcctcat 442 20 19
RX-0035 ccagcatccagaagtttcct 472 20 20
RX-0036 catcttcaatatccaaatca 492 20 21
RX-0037 attcatctgtgctttcatgt 512 20 22
RX-0038 catgtcaccatcatctgtga 572 20 23
RX-0039 gtatttgttcacattatcag 602 20 24
RX-0040 cactgtgtccagttagttca 639 20 25
RX-0041 catggtcacatggatgagta 669 20 26
RX-0042 taagcatttctctcatttcc 690 20 27
RX-0043 ttcacaaggccatttctgtg 712 20 28
RX-0044 ttagggtacacttcattctg 771 20 29
RX-0045 tatgttcatagttcttcctc 797 20 30
RX-0046 ataccttccatgttgcagac 819 20 31
RX-0047 aatgagccaccagtgtccaa 2772 20 2
RX-0048 ataaatagactgctttaggt 2782 20 32
RX-0049 cagtattgtagccaggcttc 2832 20 33
RX-0050 ttgaactaaccaagtttgtg 2852 20 34
RX-0051 gctgtctgtgatccagcatt 2928 20 35
RX-0052 atgctactgcaatgcaatgg 2976 20 36
RX-0053 aaaggttactgccttcttac 3091 20 37
RX-0054 tcaactgcctatgatcatga 3113 20 38
RX-0055 gtactgctggcaaagcatta 3173 20 39
RX-0056 attccatgagtaactgctgg 3233 20 40
RX-0057 gattaacaatgtcatgttcc 3320 20 41
RX-0058 ataataaaccatacagcatt 3358 20 42
 
ID 5′-序列-3′ 起始 长度 序列#
RX-0059 tattatgtaaatggctttac 3386 20 43
RX-0060 ttctagatatatgcatatct 3411 20 44
RX-0061 atcagatgatttctctgaat 3463 20 45
RX-0062 aacttccacaactacatagg 3523 20 46
RX-0063 gtttaatatcagttacacaa 3543 20 47
RX-0064 tataccaacagggtaggcag 3582 20 48
RX-0065 ctgccttgtataggagcatt 2671 20 49
RX-0066 caccctgcagtaggtttctg 2691 20 50
RX-0067 taacttgatccaaagctctg 2721 20 51
RX-0068 aaaattagatgtagaaaata 2811 20 52
RX-0089 agtagaaaggggatcaaaaa 2872 20 53
RX-0070 aaagagcattaatgtaaatt 2893 20 54
RX-0071 ccaaaaaactgagaaaatga 2848 20 55
RX-0072 aaattatattggcatcttct 3069 20 56
RX-0073 attgtgcaattgtggctacc 3195 20 9
RX-0074 atttcttcttaaaaactagt 3271 20 57
RX-0075 ggtttaacaatttcataggc 3299 20 58
RX-0076 ccaaataaatgccacatacc 3431 20 59
RX-0077 tttgagctggcaaagtgact 3491 20 60
RX-0078 tcttgtttacagtctgctca 3611 20 61
RX-0079 atgcttctaaaattactcaa 3751 20 62
RX-0080 aacaagatatttactgtgac 3791 20 63
RX-0081 cagttagtgttagatccaacc 3857 20 64
RX-0082 ataaaaaggtgcatttttta 3001 20 65
RX-0083 ccctagccaaaaataaataa 3021 20 66
RX-0084 attcgaaaaagggataaact 3041 20 67
RX-0085 aaaaggtgtaaaaatttttc 3131 20 68
RX-0086 atttatgtaaaatgtgaaaa 3151 20 69
RX-0087 aattttgctaagaatgcatg 3641 20 70
RX-0088 agcaaattaacatactaggc 3661 20 71
RX-0089 aaatcaaacattgtattttg 3681 20 72
RX-0090 taatagcgacaaagtgcata 3701 20 73
RX-0091 ctacatgaaaaaaaggatgt 3721 20 74
RX-0092 aactatatattcctaaaata 3771 20 75
RX-0117 tgaatgtggcctgtgcagtg 841 20 76
RX-0118 tgaggttggttactgttggt 871 20 77
RX-0119 cagcaccaagcaggtcatag 911 20 78
RX-0120 tcttctggctcatatcccat 1051 20 79
RX-0121 ttggtcagatgatcagagtc 1111 20 80
RX-0122 tgtcctgtggtgacttgtcc 1156 20 81
RX-0123 acccagacatatccacctct 1195 20 82
RX-0124 tggttgagaattcttggtgt 1241 20 83
RX-0125 ttcacacatacaatgcactg 1261 20 84
RX-0126 tgctgaataataccactcac 1288 20 85
RX-0127 aggacacattctgtttgttg 1327 20 86
RX-0128 ttcatatctgaagattcaac 1354 20 87
RX-0129 tcaactttggtgaatagctg 1381 20 88
RX-0130 ggctacttgtatcttctgat 1401 20 89
RX-0131 catcaggttccttcttaagt 1431 20 90
 
ID 5′-序列-3′ 起始 长度 序列#
RX-0132 gctggggccagcaaagttaa 1453 20 91
RX-0133 agatatgattgtgtctccag 1475 20 92
RX-0134 ctggtcatcagtttctgtgt 1514 20 93
RX-0135 aatggtacttcctcaagttg 1534 20 94
RX-0136 atttatattctgtaattttt 1586 20 95
RX-0137 ggtaatggagacattgccaa 1606 20 96
RX-0138 gtgcagggtcagcactactt 1653 20 97
RX-0139 taatgcaacttcttgattga 1673 20 98
RX-0140 ctctggatttggttctaatt 1694 20 99
RX-0141 gtaaaagaaagttccagtga 1714 20 100
RX-0142 tgtctgatcctgaatctggg 1739 20 101
RX-0143 actttgtctagtgcttccat 1772 20 102
RX-0144 ggactattaggctcaggtga 1792 20 103
RX-0145 gaccatatcactatccacat 1829 20 104
RX-0146 ccaattccaacttgaattca 1851 20 105
RX-0147 gttctttgcttctgtgtctt 1889 20 106
RX-0148 taaatctgtgtcctgagtag 1918 20 107
RX-0149 ggagctaacatctccaagtc 1938 20 4
RX-0150 tgctttctaatggtgacaac 2001 20 108
RX-0151 aactgtgctttgaggacttg 2042 20 109
RX-0152 tgagtctgctggaatactgt 2062 20 110
RX-0153 ttagcagtaggttcttgtat 2083 20 111
RX-0154 ttaattcatcagtggtggca 2118 20 112
RX-0155 atattttaatgtcttccata 2157 20 113
RX-0158 aggagatggagatgcaatca 2177 20 114
RX-0157 ptttctttatgtatgtgggt 2197 20 115
RX-0158 gtgatgatgtggcactagta 2217 20 10
RX-0159 actttgagtatctctatatg 2237 20 116
RX-0160 ctctgtttggtgaggctgtc 2258 20 117
RX-0161 ctgtctgttctatgacttcct 2286 20 118
RX-0162 tagggcttcttggatgagat 2310 20 119
RX-0163 ttcctcaggaactgtagttc 2357 20 120
RX-0164 attctgcaaagctagtatct 2390 20 121
RX-0165 agtgaaccatcatgttccat 2428 20 122
RX-0166 tccaattcctactgcttgaa 2440 20 123
RX-0167 tctggctgctgtaataatgt 2470 20 124
RX-0168 tgatgtagtagctgcatgat 2492 20 125
RX-0169 tagatttgcatccttttaca 2528 20 126
RX-0170 cagtctacatgctaaatcag 2591 20 127
RX-0171 tcatccattgattgccccag 2611 20 128
RX-0172 tcagctgtggtaatccactt 2631 20 129
RX-0173 aacttcacaatcataactgg 2651 20 130
图1显示了用0.3μM RX-0047和RX-0149转染后13种癌细胞系(UMRC2、OVCAR-3、MKN-45、A549、PC3、U251、Lox IMVI、HeLa、HepG2、HT-29、Caki-1、PANC-1和MCF-7)中HIF-1mRNA水平的下调.在UMRC2、PANC-1、OVCAR-3、MCF-7、LoxIMVI、A549和PC3细胞系中观察到HIF-1的高水平下调，在HT-29和Caki-1细胞中观察到适度水平的下调，在HeLa、HepG2、MKN-45、和U251中观察到低水平下调.如图1中所示，RX-0047和RX-0149对HIF-1mRNA表达的下调的水平是相似的，只是在一些细胞系中，RX-0047处理的细胞显示出比RX-0149稍高的下调水平.
实施例5-HIF-1蛋白质水平的蛋白质印迹分析
用浓度为0.3μM优选的RX-0047和RX-0149寡核苷酸如实施例3描述的转染多种癌细胞系.在转染后24小时之前6小时用离子螯合剂—deferroxiamine以终浓度100μM处理细胞.对于核提取物制备，使用下面的方法.对于10cm培养皿，用含有0.1mm NaVO4(2×6ml)的冰冷PBS温和地洗涤细胞，将其重悬浮在含有0.1mM NaVO4的冰冷却的PBS中并以2000转/分钟离心5分钟.将沉淀重悬浮在0.3-0.5mlCE缓冲液，pH7.6(10mM HEPES，60mMKCl，1mM EDTA，1mMDTT，1mM PMSF，1x蛋白酶抑制剂混合物和0.1mM NaVO4)，该缓冲液含有0.5％ NP40，允许细胞在冰上膨胀5分钟.将制备物以2000转/分钟离心5分钟.从沉淀除去细胞质提取物并将其转移到新管中.用0.5ml不含NP40的CE缓冲液轻轻洗涤细胞核.如上以2,000转/分钟离心细胞核5分钟.将50μl NE缓冲液，pH8.o(20mM Tris-HCl，420mM NaCl，1.5mMMgCl2，0.2mM EDTA，1mM PMSF，25％甘油，0.1mM NaVO4，和1x蛋白酶抑制剂混合物)加入核沉淀中并涡旋处理以重悬浮该沉淀.将提取物在冰上孵育40分钟，定期涡旋以重悬该沉淀，并且将CE和ME级分以最大速度离心15分钟以沉淀任何细胞核.将上清液转移到新管(可溶的核级分)并在-70℃保存.用BCA蛋白质测定试剂(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)测量蛋白质浓度.用粗细胞提取物通过SDS-PAGE并随后使用抗-HIF1抗体(Transduction Labs，Lexington，KY)实施蛋白质印迹分析确定HIF-1蛋白质表达.抗β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology)用作内对照.结果在图2中显示.RX-0047和RX-0149都显示出在所有细胞系中HIF-1蛋白质表达的或多或少的抑制.
实施例6-细胞的细胞毒性试验
用人癌细胞系检验实验寡核苷酸的细胞的细胞毒性.用硫罗丹明B(＂SRB＂)方法[Skehan等人，J.National Cancer Institute，82：1107-1112(1990)]评估RX-寡核苷酸转染后细胞的存活.
将细胞置于96孔板上并在第二天用所述寡核苷酸转染.孵育72小时后，用硫罗丹明B对存活细胞染色并使用微量培养板读出器测量.简言之，将1,000-10,000个细胞置于96孔板的每孔中并用实验寡核苷酸使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染.孵育4小时后，除去转染剂并向每孔加入新鲜培养基.孵育72小时后，除去培养基.将细胞用10％三氟乙酸(“TCA”)固定，4℃下孵育1小时，并用自来水洗涤4次.随后，将细胞用1％乙酸中的0.4％硫罗丹明B染色，用1％乙酸洗涤4次，再次空气干燥.在10mM Tris溶液中搅拌5分钟后，用Benchmark Plus微量培养板读出器(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)在530nm下读出样品的光密度.
将表现出HIF-1 mRNA下调的实验化合物用于试验它们对UMRC2细胞存活力的影响.下面的oligo化合物：RX-0047、RX-0073、RX-0149和RX-0158用于细胞毒性试验.RX-0047和RX-0149与试验的其他寡核苷酸相比表现出最强的细胞毒性作用.有趣的是，RX-0118和RX-0121是已经显示出对mRNA的分别74和45％抑制的新的寡核苷酸，但是它们没有显示出和RX-0047和RX-0149一样大的细胞毒性.因此，mRNA抑制试验不与细胞毒性相关.
从mRNA抑制研究得到的两种最好的候选者RX-0047和RX-0149用于筛选针对多种癌细胞系的细胞毒性.RX-0047在下面的人癌细胞系中降低了细胞存活力：PC3(前列腺)、U251(脑)、HeLa(宫颈)、OVCAR-3(卵巢)、LoxIMVI(黑素瘤)、HepG2(肝脏)、MCF-7(乳腺)、UMRC2(肾)、MKN-45(胃)、PANC-1(胰腺)、HT-29(结肠)、Caki-1(肾)和A549(肺).在所试验的不同的细胞系中，RX-0047的细胞毒性随着RX-0047的浓度增加而增加.0.1μM RX-0047在所试验的所有13种细胞系中导致50％以上的细胞死亡.RX-0149得到类似结果.RX-0149再次在所有细胞系中表现出细胞毒性，该细胞毒性在不同细胞系中随着浓度不同程度地增加，在PC3，U251、HeLa、OVCAR-3、LoxIMVI、MCF-7、MKN-45、A549、Caki-1和UMRC2中0.1μM RX-0149导致50％以上的细胞死亡.但是PANC-1、HT-29和HepG2中50％以上的细胞在0.1μM时幸存下来.
实施例7-RX-0047和RX-0149寡核苷酸的细胞毒性的IC50测量
对试验寡核苷酸筛选相对有效剂量.用浓度为0.01μM到1μM的RX-0047或RX-0149转染13种不同的癌细胞系，转染72小时后，将细胞用硫罗丹明B染色并使用Bio-Rad微量培养板读出器(Bio-RadLaboratories)计数存活细胞.用KaleidaGraph软件(SynergySoftware，Reading，PA)程序计算IC50值，或者杀死半数细胞所需的药物浓度.
表3
Figure C200480003233D00221
为了比较，注意到UMRC2的IC50对于RX-0047为8nM，对于RX-0149为17nM.在U251、OVCAR-3、和A549中观察到细胞毒性作用的相似水平.
实施例8：序列变异性
为了确定是否需要RX-0047和RX-0149的完整20聚体主链来下调HIF-1 mRNA表达，合成18-、16-、14-和10-聚体寡核苷酸并分析它们对mRNA表达和细胞毒性的效果.RT-PCR分析数据表明RX-0047的18聚体形式表现出对HIF-1 mRNA表达的一定抑制.而16-、14-和10聚体形式表现出对HIF-1 mRNA表达的稍弱的抑制.这表明RX-0047的序列截短到16-、14-和10-聚体对HIF-1 mRNA表达的所希望的抑制具有一定效果.对于RX-0149，RX-0149的18-和16-聚体形式表现出和RX-0149的20聚体形式对HIF-1 mRNA表达的相似的抑制.然而，当将该序列截短到RX-0149的14-和10聚体形式时，抑制变得不明显.这表明对于RX-0047，18-和16-聚体形式和20-聚体形式一样有效.对于RX-0149，需要20聚体全长序列实现对HIF-1mRNA表达的最大抑制.
与上面的数据联合，我们观察到含有RX-0047的20聚体所来源的序列的上游和下游的5或10个核苷酸的寡聚体显示出对HIF-1mRNA表达的可测量的抑制.
用含有RX-0047的20聚体所来源的序列的上游和下游的5或10个核苷酸的相同寡聚体在UMRC2细胞系中试验细胞毒性.所有4种经修饰寡聚体都表现出与RX-0047的20聚体相当的细胞毒性作用，这与RT-PCR数据吻合.上述RX-0047和RX-0149的截短形式也表现出和在RT-PCR分析中观察到的类似的癌细胞增殖的抑制模式.
实施例9：体外异种移植研究
为了观察肿瘤生长的抑制，使用当前发明的化合物之一RX-0047在动物模型中进行裸鼠的体外异种移植研究.A549人肺癌细胞系生长在Dulbecco改良的Eagle氏培养基和补加10％ cosmic牛血清(HyClone，Logan，UT)的培养基199的4:1混合物中生长.细胞保持在在37℃ 5％ CO2中.
将标记基因萤光素酶导入肿瘤细胞.利用下面的方法.使用含有萤光素酶基因和G418/neo选择标记的慢病毒载体感染细胞.在病毒上清液的存在下将细胞孵育24小时.感染后更换培养基，并在感染后3-4天开始G418选择.用发光计证实萤光素酶阳性细胞.
免疫缺陷小鼠(Nu/Nu；Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)保持在University of Texas Southwestern MedicalCenter的动物资源中心(ARC)的无病原条件下，并根据ARC和IACUC指导处理.
对于A549肺癌异种移植模型，将细胞(4×106个细胞)皮下注射到每只小鼠的两个侧腹中.通过Alzet泵系统施用受试物品14天.将Alzet微渗透泵(Alza，Palo Alto，CA)皮下(sc)植入10g小鼠和腹膜内植入20g小鼠中.泵动速度保持在0.25μl/小时(±0.05μl/小时)，连续灌输14天.在填充和处理泵和手术移植期间使用无菌技术.
对于A549肺癌转移模型，对小鼠进行γ-照射并通过尾静脉静脉内导入1×106个细胞.按照ARC/IACUC指导，每周用基于萤光素酶的生物发光成像对动物成像.将小鼠基于阴性结果(3-4个月后)终止或者每周成像直到肿瘤负担超过宿主动物正常体重的10％(对于成年小鼠，肿瘤直径1-2cm).
表4显示了基于萤光素酶的生物发光作为肿瘤生长的指示剂，对对照和用RX-0047处理的A549人肺癌异种移植物皮下移植的无胸腺裸鼠的检测.RX-0047处理后1周，与对照小鼠相比，观察到肿瘤大小减小3倍.RX-0047处理后2周，观察到肿瘤大小减小2倍.这表明RX-0047是肿瘤异种移植模型中的有效抗肿瘤剂.
表4
 
处理 rlu<sup>＊</sup>(处理后1周) rlu<sup>＊</sup>(处理后2周)
对照 2.0×10<sup>8</sup> 3.8×10<sup>8</sup>
RX-0047，30mg/kg/天 5.8×10<sup>7</sup> 1.7×10<sup>8</sup>
rlu＊＝相对光单位
在A549转移模型中，每天用RX-0047腹膜内剂量(60mg/kg/天处理9天，然后30mg/kg/天再处理5天)处理动物.14天的RX-0047腹膜内施用后在第2和3周进行转移肿瘤的成像.如表5中所示，用RX-0047处理后2周，没有检测到肺转移，而在对照组中观察到肺转移.RX-0047处理后3周，肺转移与对照组相比减小了60倍.这表明RX-0047是肺转移的潜在的强抑制剂.
表5
 
处理 rlu<sup>＊</sup>(处理后2周) rlu<sup>＊</sup>(处理后3周)
对照 1.9×10<sup>7</sup> 7.7×10<sup>7</sup>
RX-0047 0 1.3×10<sup>6</sup>
rlu＊＝相对光单位
<110>Yoon，Heejeong
  Ahn，Chang-Ho
  Lee，Young Bok
  Mao，Lingjun
  Jiang，Xiaoming
<120>抑制HIF-1表达的反义寡核苷酸
<130>REX 7034
<160>130
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>1
ttggacactg gtggctcatt               20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>2
aatgagccac cagtgtccaa                20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>3
gacttggaga tgttagctcc                20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>4
ggagctaaca tctccaagtc                20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
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<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
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<210>7
<211>20
<212>DNA
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<220>
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<400>7
cccatgccat cctgcgtctg                 20
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>8
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<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>9
attgtgcaat tgtggctacc                  20
<210>10
<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>10
gtgatgatgt ggcactagta                  20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>11
ctccatggtg aatcggtccc                 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>12
gccggcgccc tccatggtga                 20
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<211>20
<212>DNA
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<223>反义寡核苷酸
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ctcaggtggc ttgtcagggc                 20
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<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>反义寡核苷酸
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<211>20
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<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
<400>16
gagatctggc tgcatctc                 18
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>17
gaactcacat tatgtggaag               20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>18
cacagaggcc ttatcaagat               20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>19
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<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>20
ccagcatcca gaagtttcct               20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>反义寡核苷酸
<400>21
catcttcaat atccaaatca               20
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<211>20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>23
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<211>20
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<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>24
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<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>25
cactgtgtcc agttagttca               20
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<211>20
<212>DNA
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<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
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ttagggtaca cttcattctg            20
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<223>反义寡核苷酸
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ataaatagac tgctttaggt              20
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cagtattgta gccaggcttc               20
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<211>20
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<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>34
ttgaactaac caagtttgtg             20
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<220>
<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
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atgctactgc aatgcaatgg               20
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<223>反义寡核苷酸
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<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>38
tcaactgcct atgatcatga                20
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<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>39
gtactgctgg caaagcatta                20
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<220>
<223>反义寡核苷酸
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<223>反义寡核苷酸
<400>43
tattatgtaa atggctttac               20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>44
ttctagatat atgcatatct               20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>45
atcagatgat ttctctgaat             20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>46
aacttccaca actacatagg             20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>47
gtttaatatcagttacacaa              20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>48
tataccaaca gggtaggcag             20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>49
ctgccttgta taggagcatt             20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>50
caccctgcag taggtttctg             20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>51
taacttgatc caaagctctg             20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>52
aaaattagat gtagaaaata             20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>53
agtagaaagg ggatcaaaaa            20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>54
aaagagcatt aatgtaaatt            20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>55
ccaaaaaact gagaaaatga             20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>56
aaattatatt ggcatcttct            20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>57
atttcttctt aaaaactagt           20
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>58
ggtttaacaa tttcataggc           20
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>59
ccaaataaat gccacatacc            20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>60
tttgagctgg caaagtgact           20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>61
tcttgtttac agtctgctca           20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>62
atgcttctaa aattactcaa           20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>63
aacaagatat ttactgtgac           20
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>64
cagttagtgt tagatccaac c            21
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>65
ataaaaaggt gcatttttta              20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>66
ccctagccaa aaataaataa              20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>67
attcgaaaaa gggataaact              20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>68
aaaaggtgta aaaatttttc              20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>69
atttatgtaa aatgtgaaaa               20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>70
aattttgcta agaatgcatg              20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>71
agcaaattaa catactaggc              20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>72
aaatcaaaca ttgtattttg              20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>73
taatagcgac aaagtgcata              20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>74
ctacatgaaa aaaaggatgt              20
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>75
aactatatat tcctaaaata              20
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>76
tgaatgtggc ctgtgcagtg              20
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>77
tgaggttggt tactgttggt              20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>78
cagcaccaag caggtcatag              20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>79
tcttctggct catatcccat              20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>80
ttggtcagat gatcagagtc              20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>81
tgtcctgtgg tgacttgtcc              20
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>82
acccagacat atccacctct              20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>83
tggttgagaa ttcttggtgt              20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>84
ttcacacata caatgcactg              20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>85
tgctgaataa taccactcac              20
>210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>86
aggacacatt ctgtttgttg              20
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>87
ttcatatctg aagattcaac              20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>88
tcaactttgg tgaatagctg              20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>89
ggctacttgt atcttctgat              20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>90
catcaggttc cttcttaagt              20
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>91
gctggggcca gcaaagttaa              20
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>92
agatatgatt gtgtctccag              20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>93
ctggtcatca gtttctgtgt              20
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>94
aatggtactt cctcaagttg              20
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>95
atttatattc tgtaattttt              20
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>96
ggtaatggag acattgccaa              20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>97
gtgcagggtc agcactactt              20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>98
taatgcaact tcttgattga              20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>99
ctctggattt ggttctaatt              20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>100
gtaaaagaaa gttccagtga              20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>101
tgtctgatcc tgaatctggg              20
<210>102
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>102
actttgtcta gtgcttccat              20
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>103
ggactattag gctcaggtga              20
<210>104
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>104
gaccatatca ctatccacat              20
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>105
ccaattccaa cttgaattca              20
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>106
gttctttgct tctgtgtctt              20
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>107
taaatctgtg tcctgagtag              20
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>108
tgctttctaa tggtgacaac              20
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>109
aactgtgctt tgaggacttg              20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>110
tgagtctgct ggaatactgt              20
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>111
ttagcagtag gttcttgtat              20
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>112
ttaattcatc agtggtggca              20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>113
atattttaat gtcttccata        20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>114
aggagatgga gatgcaatca        20
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>115
gtttctttat gtatgtgggt        20
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>116
actttgagta tctctatatg                   20
<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>117
ctctgtttgg tgaggctgtc                   20
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>118
ctgtctgttc tatgactcct                   20
<210>119
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>119
tagggcttct tggatgagat                   20
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>120
ttcctcagga actgtagttc                   20
<210>121
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>121
attctgcaaa gctagtatct                   20
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>122
agtgaaccat catgttccat                   20
<210>123
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>123
tccaattcct actgcttgaa                   20
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>124
tctggctgct gtaataatgt                   20
<210>125
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>125
tgatgtagta gctgcatgat                   20
<210>126
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>126
tagatttgca tccttttaca                   20
<210>127
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>127
cagtctacat gctaaatcag                   20
<210>128
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>128
tcatccattg attgccccag                   20
<210>129
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>129
tcagctgtgg taatccactt                   20
<210>130
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>130
aacttcacaa tcataactgg                   20

Claims (10)

1.一种序列为Seq.Id.No.2：5′aatgagccaccagtgtccaa 3′的寡核苷酸化合物，其靶向编码人HIF-1的核酸分子，且所述寡核苷酸化合物抑制人HIF-1的表达。
2.权利要求1的化合物，其中该化合物是反义寡核苷酸。
3.权利要求2的反义寡核苷酸，其具有至少一个是硫代磷酸酯键的经修饰的核苷酸间键。
4.权利要求1的化合物在制备用于抑制HIF-1在人细胞或者组织中表达的方法中所用试剂中的用途，该方法包括将所述细胞或者组织与权利要求1的化合物接触的步骤。
5.权利要求1所述的化合物在制备用于在癌细胞中诱导细胞毒性的方法中所用的试剂中的用途，其中，所述的寡核苷酸与人HIF-1序列杂交，该方法包括向所述细胞中导入所述寡核苷酸的步骤。
6.一种序列为Seq.Id.No.4：5′ggagctaacatctccaagtc 3′的寡核苷酸化合物，其靶向编码HIF-1的核酸分子，且该化合物抑制人HIF-1的表达。
7.权利要求6的化合物，其中该化合物是反义寡核苷酸。
8.权利要求7的反义寡核苷酸，其具有至少一个是硫代磷酸酯键的经修饰的核苷酸间键。
9.权利要求6的化合物在制备用于抑制HIF-1在人细胞或者组织中表达的方法中所用试剂中的用途，该方法包括将所述细胞或者组织与权利要求6的化合物接触的步骤.
10.权利要求6所述的化合物在制备用于在癌细胞中诱导细胞毒性的方法中所用的试剂中的用途，所述的寡核苷酸与人HIF-1序列杂交，该方法包括向所述细胞中导入所述寡核苷酸的步骤。
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