CN102159712A

CN102159712A - 靶向gli2的rna拮抗剂

Info

Publication number: CN102159712A
Application number: CN2009801358849A
Authority: CN
Inventors: 马杰·赫德贾恩
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2011-08-17
Also published as: KR20110031976A; CA2730641A1; TW201016222A; WO2010007522A1; JP2011527901A; IL210650A0; WO2010007522A8; EA201170191A1; US20110124709A1; MX2011000601A; EP2310506A1; AU2009272365A1

Abstract

本发明涉及寡聚物化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向GLI2 mRNA，导致GLI2表达减少。GLI2表达减少有利于治疗某些医学病症，如高增生性病症，如癌症。

Description

靶向GLI2的RNA拮抗剂

发明领域

本发明提供用于调节GLI2的表达的化合物、组合物和方法。特别是，本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向GLI2 mRNA，导致GLI2的表达减少。GLI2表达的减少对一系列医学病症，如癌症有利。

相关案件

本申请在35 U.S.C.§119(e)的条件下要求2008年7月16日提交的美国临时申请序列号US 61/081,135的利益，其公开以其整体在此引入作为参考。本申请还要求2008年7月15日提交的EP 08104754的优先权。

背景技术

神经胶质瘤-相关的癌基因2(Gli2)为含GLI锌指的转录因子的成员，这些转录因子在许多细胞类型和大多数器官中涉及细胞命运的决定、增殖和式样形成。已知人GL2 mRNA经历可变剪接以产生可变剪接变体。在皮肤角质形成细胞中过表达GL2的转基因小鼠发生多发性基底细胞癌，表明GL2在这些癌的发生中的作用。

US 6,440,739和WO 03/008545公开了一系列靶向GLI2的2’-甲氧乙基-修饰的嵌合的反义寡核苷酸，且表明这些物质可用于治疗与GLI2表达相关的疾病。Kim等人，2007，Cancer Res.67(8)3583-3593报道了2’-甲氧乙基-修饰的嵌合的反义寡核苷酸，其用于特异性下调GLI2和降低肝细胞癌细胞体外增殖。

需要改善的靶向GLI2的寡聚物。而且，需要靶向GLI1和GLI2两者的寡聚物。

发明内容

本发明提供10-50个单体，如10-30个单体的寡聚物，其包含10-50个单体，如10-30个单体的连续序列(第一区)，其中该连续序列(第一区)至少80％(例如，85％，90％，95％，98％，或99％)等同(同源)于对应于哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA的区域或编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA，如具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体。因此，例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO：1中所示序列的单链核酸分子的区域。

本发明提供10-50个单体，如10-30个单体的寡聚物，其包含10-50个单体，如10-30个单体的连续序列(第一区)，其中该连续序列(第一区)至少80％(例如，85％，90％，95％，98％，或99％)等同(同源)于对应于哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA的区域，或编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA，如具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体；且其中第一区中的至少一个单体为核苷类似物，其中该核苷类似物为锁核酸(LNA)单体。因此，例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO：1中所示序列的单链核酸分子的区域。

本发明提供缀合物，其包含根据本发明的寡聚物，和共价连接至所述寡聚物的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。

本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的寡聚物或缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。

本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，其用作药物，如用于治疗本文公开的疾病或医学病症，如高增生性病症，如癌症或其它高增生性病症。

本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物在制备用于治疗本文公开的疾病或病症，如高增生性疾病，如癌症的药物中的用途。

本发明提供治疗本文公开的疾病或病症，如高增生性病症，如癌症的方法，该方法包括向患有或易患疾病或病症的动物(如患有或易患疾病或病症的患者)给药，例如有效量的，根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。

本发明提供在细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括将细胞与以足以引发凋亡的量的根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触，其中所述细胞表达GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA。

在一个实施方案中，该疾病或病症或状况与GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或mRNA的过表达相关。

本发明提供在表达GLI2和/或GLI1和/或GLI3的细胞中抑制GLI2和/或GLI1和/或GLI3的方法，该方法包括将细胞与根据本发明的寡聚物或缀合物接触以在所述细胞中实现GLI2和/或GLI1和/或GLI3表达的抑制(例如引起对GLI2表达的抑制作用)。

本发明还涉及靶向GLI1和GLI2两者的寡聚物，因此本发明进一步提供在表达GLI1和GLI2的细胞中抑制GLI1和GLI2两者的方法，所述方法包括将细胞与根据本发明的寡聚物或缀合物接触以在所述细胞中抑制GLI1和GLI2两者的表达(例如对GLI1和GLI2两者的表达引起抑制作用)。

本发明提供10-50个单体的寡聚物，其包含10-50个连续单体的第一区，其中第一区的序列至少80％等同于相应于哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因的区域或编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列。

本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，其包含至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分(“缀合的部分”)共价连接至本发明的寡聚物。

本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚物或缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。

本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于医药。

本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文涉及的一种或多种疾病，如选自高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的疾病的药物中的用途。

本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于治疗本文涉及的一种或多种疾病，如选自高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的疾病。

还提供包含本发明的寡聚物的药物和其它组合物。还提供在细胞或组织中下调GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达的方法，其包括将所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物接触。还提供下调GLI1和GLI2在细胞或组织中表达的方法，其包括将所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物接触。

还公开了治疗疑似患有或易患与GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达或过表达相关的疾病或状况的动物(非人动物或人)的方法，其通过向非人动物或人给药治疗或预防上有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或药物组合物。而且，提供了使用寡聚物抑制GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达，和治疗与GLI2和/或GLI1和/或GLI3的活性相关的疾病的方法。

本发明提供用于治疗选自以下的疾病的方法：高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌，该方法包括向需要的动物(如需要的患者)给药有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物。

本发明提供在细胞或组织中抑制(例如，通过下调)GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达的方法，该方法包括在体外或体内将细胞或组织与有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物接触的步骤，以实现GLI2和/或GLI1和/或GLI3表达的下调。

本发明提供在细胞或组织中抑制(例如，通过下调)GLI1和GLI2的表达的方法，该方法包括将细胞或组织在体外或体内与有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物接触的步骤，以实现GLI1和GLI2的表达的下调。

附图简述

图1：人GLI2 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 1)。GenBank登记号NM_005270。

图2：人GLI1 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 2)。GenBank登记号NM_005269。

图3：人GLI3 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 134)。GenBank登记号NM_000168。

图4：用GLI2寡聚物转染后DU-145细胞中的GLI2 mRNA表达。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图5.用GLI2寡聚物转染后24小时DU-145细胞中的GLI2 mRNA表达。Q-PCR(定量PCR)数据源自用GLI2寡聚物(其可称为寡聚物(oligos))转染后24小时的DU-145细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图6.用GLI2寡聚物转染后24小时518A2细胞中的GLI2 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后24小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图7.用GLI2寡聚物转染后24小时DU-145细胞中的GLI1 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后24小时的DU-145细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图8.用GLI2寡聚物转染后24小时518A2细胞中的Gli1 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后24小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图9.用GLI2寡聚物转染后24小时518A2细胞中的GLI3 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后24小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100％)对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。

图10.小鼠血浆中LNA寡聚物的稳定性测定。该LNA寡聚物在37℃与小鼠血浆温育，且在0，24，48和120h采取等分部分。结果通过凝胶电泳使用SDS-PAGE凝胶显影。DNA硫代磷酸酯用作显示寡聚物降解的阳性对照寡聚物。使用的寡聚物的SEQ ID No在各凝胶下指示。

图11.DU-145细胞中的增殖测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在DU-145细胞中进行MTS测试。具有SEQ ID NO：133中所述序列的寡聚物为用作阴性对照(-ve)的乱序对照。阳性对照(+ve)为在体外和体内都有毒的寡聚物-因此其用作毒性测试中的阳性对照。使用的寡聚物的SEQ ID No在各图的顶部指示。

图12A和B-血清中的ALT/AST活性。发现给药具有SEQ ID NO：120所述序列靶向GLI2的寡聚物的组中一只小鼠在第6天死亡，且该组中剩余动物状态较差且在第6天处死。用具有SEQ ID NO：SEQ ID NO：120所述序列的寡聚物处理的组中的ALT活性太高而不能测量。使用的寡聚物的SEQID No在图中各柱下指示。

图13.DU-145细胞中的Caspase 3/7测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在DU-145细胞中进行Caspase3/7测试。乱序对照用作阴性对照。模拟品是指无寡聚物对照-即该模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。使用的寡聚物的SEQ ID No在图中的柱下指示。

图14.518A2细胞中的Caspase3/7测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在518A2细胞中进行Caspase3/7测试。乱序对照用作阴性对照。模拟品是指无寡聚物对照。毒性寡聚物(TC)为在体外和体内都显示毒性且用作阳性对照的寡聚物。使用的寡聚物的SEQ ID No在图中的柱下指示。

图15a和15b.具有SEQ ID NO：3，19或75中所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的抗肿瘤作用。使用的寡聚物的SEQ ID No在图中的柱上指示。在该图例中，相关SEQ ID NO：在各自量之前(但被逗点隔开)。因此，且作为实例，G2的“3,3mg/kg”表示3mg/kg的SEQ ID NO：3。

图16.具有SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：75所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的肿瘤生长抑制(TGI)。在该图的注释中，“乱序对照”是指存活蛋白的乱序对照寡聚物；且“19”是指SEQ ID No 19(例如“1930mg/kg”是指30mg/kg的SEQ ID No 19)。

图17.具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：75所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3(例如“330mg/kg”是指30mg/kg的SEQ ID No3)；“乱序对照”是指存活蛋白的乱序对照寡聚物；“19”是指SEQ ID No 19(例如“19 30mg/kg”是指30mg/kg的SEQ ID No 19)；且“75”是指SEQ ID No 75(例如“75 10mg/kg”是指10mg/kg的SEQ ID No 75)。

图18.具有SEQ ID NO：19所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“19”是指SEQ ID No 19，“mpk”是指mg/kg，“IP”是指腹膜内给药；“IV”是指静脉内给药；“q1x10”是指每天10剂；“q2x10”是指每两天10剂；且“q3x10”是指每三天10剂；例如“193mpk；IP；q1x10”是指每天通过腹膜内给药的10剂3mg/kg的SEQ ID No 19。

图19.具有SEQ ID NO：19中所述序列的寡聚物在DLD-1结肠直肠癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“19”是指SEQ ID No19；“mpk”是指mg/kg；“Q3x10”是指每三天10剂；例如“19；3mpk；Q3x4”是指每三天4剂3mg/kg的SEQ ID No 19。

图20a，b和c.具有SEQ ID NO：19中所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3，“19”是指SEQ ID No 19；“75”是指SEQ ID No 75；“IV”是指静脉内给药；“q3x4”是指每三天4剂；例如“3 3mg/kg；IV；q3x4”是指每三天静脉内给药4剂的3mg/kg的SEQ ID No 3。

图21.具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：75所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的肿瘤生长抑制(TGI)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3，“19”是指SEQ ID No 19；“75”是指SEQ ID No 75；“iv”是指静脉内给药；例如“3，3mg/kg，iv”是指静脉内给药3mg/kg的SEQ ID No 3。

发明详述

寡聚物

本发明使用寡聚化合物(本文称为寡聚物)，用以调节编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3(如SEQ ID NO：1中所示的GLI2核酸；或SEQ ID NO：2中所示的GLI2核酸；或如SEQ ID NO：134中所示的GLI2核酸)的核酸分子，和该核酸分子的天然存在的变体的功能。术语“寡聚物”在本发明的情况下是指共价连接两个或更多个单体形成的分子(即寡核苷酸)。在一些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：10-50个共价连接的单体，如10-30个共价连接的单体，如10-24个共价连接的单体，如10-18个共价连接的单体，如10-16个共价连接的单体。

在一些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、”单元”和“单体”可互换使用。应认识到当提到核苷酸或单体的序列时，所指的为碱基，如A，T，G，C或U的序列。

如本文所述，术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团(连接基)如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸，如DNA或RNA，和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，其在本文也称为“核苷酸类似物”。在此，单核苷酸(单元)也可称为单体或核酸单元。

在生物化学领域，术语“核苷”通常用来表示包含糖部分和碱基部分的糖苷，且因此当涉及“核苷酸”单元时可使用，该“核苷酸”单元通过寡聚物的核苷酸之间的核苷酸间连接共价连接。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用来表示核酸单体或单元，且因此在寡核苷酸的情况下可表示碱基-如“核苷酸序列”，通常是指核碱基序列(即暗示存在糖主链和核苷间连接)。同样，特别是在寡核苷酸的情况下(其中一个或多个核苷间连接基被修饰)，术语“核苷酸”可表示“核苷”，例如术语“核苷酸”即使当指定核苷之间的连接的存在或性质时也可使用。

本领域技术人员应理解，在本发明的范围内，寡核苷酸(寡聚物)的5’端核苷酸不包括5’核苷酸间连接基，尽管其可能包括或可能不包括5’末端基。

术语“单体”包括核苷和脱氧核苷两者(统称为，“核苷”)，其天然存在于核酸中且不包含修饰的糖或修饰的核碱基，即，其中核糖或脱氧核糖共价连接至天然存在的、未修饰的核碱基(碱基)部分(即，嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶)的化合物，以及“核苷类似物”，其为天然存在于核酸中或不天然存在于核酸中的核苷，其中糖部分不为核糖或脱氧核糖(如双环糖或2’修饰的糖，如2’取代的糖)，或碱基部分被修饰(例如，5-甲基胞嘧啶)，或两者。

“RNA单体”为包含核糖和未修饰的核碱基的核苷。

“DNA单体”为包含脱氧核糖和未修饰的核碱基的核苷。

“锁核酸单体”、“锁单体”或“LNA单体”为具有双环糖的核苷类似物，如下文进一步描述的。

术语″对应于″和″相应于″是指寡聚物或连续核苷酸/核苷序列(第一区)的核苷酸/核苷序列(即核碱基或碱基序列)与另一序列的等效(equivalent)连续核苷酸/核苷序列的比较，所述另一序列选自i)核酸靶的反向互补序列的子序列，和/或ii)本文提供的核苷酸/核苷的序列。核苷酸/核苷类似物直接与它们的等效或对应核苷酸/核苷比较。在i)或ii)下对应于另一序列的第一区通常在第一区(如连续核苷酸/核苷序列)的长度上等同于该序列，或如本文所述，在一些实施方案中，可至少80％同源于对应序列，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，如100％同源(相同)。

术语“对应核苷类似物”和“对应核苷”表明核苷类似物中的碱基部分和核苷中的碱基部分相同。例如，当“核苷”包含连接至腺嘌呤的2’-脱氧核糖时，该“对应核苷类似物”包含，例如，连接至腺嘌呤碱基部分的修饰的糖。

术语“寡聚物”、“寡聚化合物”和“寡核苷酸”可在本发明中互换使用，且是指通过例如磷酸酯基(在核苷之间形成磷酸二酯连接)或硫代磷酸酯基(在核苷之间形成硫代磷酸酯连接)共价连接两个或更多个单体形成的分子。该寡聚物由以下组成或包含以下：10-50个单体，如10-30个单体，如10-24个单体，如10-18个单体，如10-16个单体。该寡聚物由第一区(连续序列)组成或包含第一区(连续序列)，该第一区(连续序列)，例如，由9-30个连续单体，如9-24个单体，如9-18个单体，如9-16个单体组成。

在一些实施方案中，术语“连续序列”、“连续单体”和“区域”可互换。

在一些实施方案中，寡聚物包含本文所述的核苷、或核苷类似物、或其混合物。“LNA寡聚物”或“LNA寡核苷酸”是指包含一个或多个LNA单体的寡核苷酸。

任选包含在寡聚物中的核苷类似物可类似于对应核苷起作用，或可具有特定改善的功能。其中一些或所有单体为核苷类似物的寡聚物通常优于天然形式，因为该寡聚物的一些理想特性，如穿透细胞膜的能力，对细胞外和/或细胞内核酸酶良好的抗性和对核酸靶的高亲和力和特异性。LNA单体是特别优选的，例如，用于给予一种或多种上述性质。

在多种实施方案中，寡聚物中存在的一种或多种核苷类似物在功能上“沉默(silent)”或“等效(equivalent)”于对应天然核苷，即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影响。如果例如，它们更容易制备或制备更廉价，或对储存或制备条件更稳定，或可掺入标签或标记，这种“等效”核苷类似物还是可以使用的。然而，通常，该类似物将对寡聚物抑制表达的作用方式有功能上的影响；例如通过产生增加的对靶核酸的靶区的结合亲和力和/或增加的对核酸酶如细胞内核酸酶的抗性、和/或更方便性地转运至细胞。

因此，在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物包含核苷单体和至少一种核苷类似物单体，如LNA单体，或其它核苷类似物单体。

术语“至少一种(个)”包含大于或等于1的整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20等等。在多种实施方案中，如当涉及本发明的寡聚物的核酸或蛋白质靶，术语“至少一种(个)”包括术语“至少二种(个)”和“至少三种(个)”和“至少四”种(个)。同样，在一些实施方案中，术语“至少二种(个)”包括术语“至少三种(个)”和“至少四种(个)”。

在一些实施方案中，该寡聚物在第一区包含以下或由以下组成：9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个连续单体。

在一些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：10-24个连续单体，如10-22个连续单体，如10-18个连续单体，如10-16个连续单体，如12-18个连续单体，如13-17或12-16个连续单体，如13，14，15，16或24个连续单体。应理解当对寡聚物或连续核苷酸序列长度给予一个范围，其包括在该范围内提供的上限和下限长度，例如从10-30(或10-30之间)，包括10和30。

在某些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：10，11，12，13，或14个连续单体。

在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由不超过24个单体组成，如不超过22个单体，如不超过20个单体，如不超过18个单体，如15，16或17个单体。在一些实施方案中，本发明的寡聚物包含少于20个单体。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物不包含RNA单体。

在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物为直链分子或合成为直链分子。该寡聚物，在该实施方案中，为单链分子，且通常不包含例如，至少3，4或5个连续单体的短区，该短区与相同寡聚物内的另一区互补，使得寡聚物形成内部双链体。在一些实施方案中，该寡聚物基本上不为双链的，即，不为siRNA。

在一些实施方案中，本发明的寡聚物由单体(第一区)的连续段(contiguous stretch)组成，其序列通过本文公开的SEQ ID NO辨别(参见，例如，表1-3)。在其它实施方案中，该寡聚物包含第一区，该区由编码靶的核酸分子的单体的连续段和一个或多个由至少一个其他单体组成的其它区组成。在一些实施方案中，第一区的序列通过本文公开的SEQ ID NO辨别。

缺口聚物设计

通常，本发明的寡聚物为缺口聚物。

“缺口聚物”是包含一段连续的单体的寡聚物，该单体能募集RNA酶(如RNA酶H)，其在以下进一步详述，如至少6或7个DNA单体的区域，在本文称为B区。B区的5’和3’端的两个侧翼为分别称为A区和C区的区域，A区和C区的每一个包含核苷类似物或由核苷类似物组成，如增强亲和力的核苷类似物，如1-6个核苷类似物。该RNA酶优选为RNA酶H，如大肠杆菌或人RNA酶H。当寡聚物与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时测定寡聚物募集RNA酶H的能力。

在一些实施方案中，能募集RNA酶的单体选自DNA单体，α-L-LNA单体，C4’烷基化DNA单体(参见PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，在此引入作为参考)，和UNA(未锁核酸)核苷酸(参见Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039在此引入作为参考)。UNA为未锁核酸，通常其中糖的C2’-C3’键(即C2’和C3’碳之间的共价碳-碳键)已被去除，形成未锁的“糖”残基。

通常，该缺口聚物包含下式的区域(5’至3’)：A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其中：A区(A)由以下组成或包含以下：至少一个核苷类似物，如至少一个LNA单体，如1-6个连续核苷类似物，如LNA单体，且B区由以下组成或包含以下：至少5个能募集RNA酶(当与靶RNA分子的互补靶区，如mRNA靶形成双链体时)的连续单体，如DNA单体；C区(C)由以下组成或包含以下：至少一个核苷类似物，如至少一个LNA单体，如1-6个连续核苷类似物，如LNA单体；且D区(D)，当存在时由以下组成或包含以下：1，2或3个单体，如DNA单体。

在多种实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷类似物，如LNA单体，如2-5个核苷类似物，如2-5个LNA单体，如3或4个核苷类似物，如3或4个LNA单体组成；和/或C区由1，2，3，4，5或6个核苷类似物，如LNA单体，如2-5个核苷类似物，如2-5个LNA单体，如3或4个核苷类似物，如3或4个LNA单体组成。

在某些实施方案中，B区由以下组成或包含以下：5，6，7，8，9，10，11或12个能募集RNA酶如RNA酶H的连续单体(例如连续核苷酸)，或6-10，或7-9个连续单体，如10或9或8个能募集RNA酶的连续单体。在某些实施方案中，B区由以下组成或包含以下：至少一个DNA单体，如1-12个DNA单体，优选4-12个DNA单体，更优选6-10个DNA单体，如7-10个DNA单体，最优选8，9或10个DNA单体。

在多种实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA单体)组成，B区由7，8，9或10个DNA单体组成，且C区由3或4个核苷类似物(如LNA单体)组成。这些设计包括(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3，3-7-4，4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个单体，如DNA单体。

其他缺口聚物设计公开于WO2004/046160，其在此引入作为参考。

WO2008/113832(其要求美国临时申请60/977,409的优先权)在此引入作为参考，是指‘短聚物(shortmer)’缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中，本文提供的寡聚物可为该短聚物缺口聚物。

在某些实施方案中，该寡聚物由10，11，12，13，14，15或16个单体组成，其中该寡聚物的区域具有图式(5’-3’)，A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其中：A区由1，2或3个核苷类似物单体(如LNA单体)组成；B由7，8，9或10个连续单体组成，其能募集RNA酶，如RNA酶H；且C区由1，2或3个核苷类似物单体(如LNA单体)组成。当存在时，D区由单一DNA单体组成。

在某些实施方案中，A区由1个LNA单体组成。在某些实施方案中，A区由2个LNA单体组成。在某些实施方案中，A区由3个LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由1个LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由2个LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由3个LNA单体组成。在某些实施方案中，B区由7个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区由8个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区由9个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区由10个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区包括1-10个DNA单体，如2，3，4，5，6，7，8或9个DNA单体。在某些实施方案中，B区包括1-9个DNA单体，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单体。在某些实施方案中，B区由DNA单体组成。在某些实施方案中，B区包括至少一个LNA单体，其为α-L构型，如α-L-构型的2，3，4，5，6，7，8，9或10个LNA单体。在某些实施方案中，B区包括至少一个α-L-氧基LNA单体。在某些实施方案中，在B区为α-L-构型的所有LNA单体为α-L-氧基LNA单元。在某些实施方案中，A-B-C区存在的单体数量分别选自(核苷类似物单体-B区-核苷类似物单体)：1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1-9-3，3-9-1，3-9-3，4-9-1，1-9-4，或；1-10-1，1-10-2，2-10-1，2-10-2，1-10-3，3-10-1，2-10-3，3-10-2，或3-10-3。在某些实施方案中，本发明的寡聚物的A-B-C区中存在的单体数量分别选自：2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4和4-7-3。在某些实施方案中，A和C区中的每一个由3个LNA单体组成，且B区由8或9或10个核苷单体，优选DNA单体组成。在某些实施方案中，A和C区中的每一个由两个LNA单体组成，且B区由8或9个核苷单体，优选DNA单体组成。

在多种实施方案中，其它缺口聚物设计包括以下那些：其中A和/或C由3，4，5或6个核苷类似物组成，该核苷类似物如包含2’-O-甲氧乙基-核糖(2’-MOE)的单体或包含2’-氟-脱氧核糖的单体，且B区由8，9，10，11或12个核苷，如DNA单体组成，其中区域A-B-C具有3-9-3，3-10-3，5-10-5或4-12-4单体。其他缺口聚物设计公开于WO 2007/146511A2，在此引入作为参考。

核苷间连接

本文所述的寡聚物的单体通过连接基偶联在一起。适当地，各单体通过连接基连接至3’邻接单体。

具有本领域普通技术的人员应理解，在本发明的范围内，在寡聚物末端处的5’单体不包含5’连接基，尽管其可能或可能不包含5’末端基。

术语″连接基″和“核苷间连接”是指能将两个连续单体共价偶联在一起的基团。具体的和优选的实例包括磷酸酯基(phosphate group)(在相邻核苷单体之间形成磷酸二酯)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate group)(在相邻核苷单体之间形成硫代磷酸酯连接)。

合适的连接基包括WO2007/031091所列的那些，例如在WO2007/031091第34页第一段(在此引入作为参考)。

在多种实施方案中，优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶侵袭更有抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-这两个可被RNA酶H裂解，从而允许RNA酶-介导的靶基因表达的反义抑制。

在一些实施方案中，本文提供的合适的含硫(S)连接基是优选的。在多种实施方案中，优选硫代磷酸酯连接基，特别对于缺口聚物的缺口区域(gap region)(B)。在某些实施方案中，使用硫代磷酸酯连接在侧翼区(A和C)中将单体连接在一起。在多种实施方案中，使用硫代磷酸酯连接将A或C区连接至D区，且用于在D区内将单体连接在一起。

在多种实施方案中，A、B和C区，包含除了硫代磷酸酯之外的连接基，如磷酸二酯连接，特别是，例如当使用核苷类似物保护A和C区中的连接基避免内切核酸酶降解-如当A和C区包含LNA单体。

在多种实施方案中，寡聚物的邻接单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。

已认可将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，掺入具有硫代磷酸酯主链的寡聚物，特别是在核苷类似物单体之间或附近具有硫代磷酸酯连接基的寡聚物(典型在A区和/或C区中)，可修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布-参见WO2008/053314，在此引入作为参考。

在一些实施方案中，如以上涉及的实施方案，其适合且不特别指示，所有剩余的连接基为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。

在一些实施方案中所有核苷间连接基为硫代磷酸酯。

当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，应理解，在多种实施方案中，当连接为硫代磷酸酯连接时，可使用替代连接，如本文公开的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别是对于核苷类似物，如LNA单体之间的连接。同样，在多种实施方案中，当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，当A或C区中的一个或多个单体，如LNA单体，包含5-甲基胞嘧啶碱基，该区域中的其它单体可包含未修饰的胞嘧啶碱基。

靶核酸

术语“核酸”和“多核苷酸”在此可互换使用，并定义为通过共价连接两个或更多个单体形成的分子，如上所述。“核酸”可为任何长度，包括2个或更多个单体，且该术语的上位概念为“寡聚物”，其具有本文所述的长度。术语“核酸”和“多核苷酸”包括单链、双链，部分双链，和环状分子。

在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLI2多肽，如人GLI2的DNA或RNA(例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO：1所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLI2为小鼠GLI2。

在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLI1多肽，如人GLI1的DNA或RNA(例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO：2中所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLI1为小鼠GLI1。

在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLI3多肽，如人GLI3的DNA或RNA(例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO：134所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLI3为小鼠GLI3。

在一些实施方案中，例如当在研究或诊断中使用时，该“靶核酸”为由上述DNA或RNA核酸靶衍生的cDNA或合成寡核苷酸。根据本发明的寡聚物通常能杂交至靶核酸。

示例性靶核酸包括具有下表所示GenBank登记号的编码哺乳动物GLI2的核酸，以及它们相应的蛋白质序列：

示例性靶核酸包括具有下表所示GenBank登记号的编码哺乳动物GLI1的核酸，以及它们相应的蛋白质序列：

示例性靶核酸包括具有下表所示GenBank登记号的编码哺乳动物GLI3的核酸，以及它们相应的蛋白质序列：

已认可以上公开的核酸的GenBank登记号是指cDNA序列而不是指mRNA序列本身。成熟mRNA的序列可直接从相应的cDNA序列(其中胸腺嘧啶碱基(T)被尿嘧啶碱基(U)代替)衍生。

术语“其天然存在的变体”是指GLI2和/或GLI1和/或GLI3多肽或核酸序列的变体，其天然存在于限定的分类群中，如哺乳动物，如小鼠，猴，且优选人；优选GLI2。通常，当涉及GLI2多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还包括任何编码GLI2的基因组DNA(其通过染色体易位或复制存在于人染色体2；位置2q14)和RNA(如其衍生的mRNA)的等位变体。通常，当涉及GLI1多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还包括任何编码GLI1的基因组DNA(其通过染色体易位或复制存在于人染色体12；位置12q13.2-q13.3)和RNA(如其衍生的mRNA)的等位变体。通常，当涉及GLI3多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还包括任何编码GLI3的基因组DNA(其通过染色体易位或复制存在于人染色体7；位置7p13)和RNA(如其衍生的mRNA)的等位变体。“天然存在的变体”还可包括选择性剪接GLI2和/或GLI1和/或GLI3 mRNA得到的变体。当涉及具体多肽序列，例如，该术语还包括蛋白质的天然存在的形式，因此其可进行加工，例如通过共翻译-或翻译后修饰，如信号肽裂解、蛋白酶剪切、糖基化等。

在某些实施方案中，本文所述的寡聚物通过在寡聚物的单体和靶核酸的单体之间的Watson-Crick碱基配对、Hoogsteen氢键合或反向Hoogsteen氢键合结合至靶核酸的区域(“靶区”)。该结合也称为“杂交”。除非另有所述，结合是通过互补碱基的Watson-Crick配对(即，腺嘌呤与胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)，和鸟嘌呤与胞嘧啶)，且寡聚物结合至靶区是因为寡聚物的序列等同于，或部分等同于，靶区的反向互补序列的序列；出于本文的目的，认为寡聚物“互补”或“部分互补”于靶区，且寡聚物序列相对靶区的序列的“互补性”的百分比为相对靶区的序列的反向互补序列的百分比“同一性”(同源性)。

本文使用的术语“反向互补序列(reverse complement)”，“反向互补”和“反向互补性”可与术语“补体”，“互补”和“互补性”相互替换。

除非本文另有清楚描述，本文的“靶区”将为具有与指定寡聚物(或其区域)的序列的反向互补序列配比(aligns)最好的序列的靶核酸的区域，使用本文所述的配比程序(alignment program)和参数。

在确定本发明的寡聚物(或其区域)和编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3的核酸的靶区之间的“互补性”程度中，如本文公开的那些，“互补性”(也称为，“同源性”或“同一性”)的程度表示为寡聚物的序列(或其区域)和与其最佳配比靶区(或靶区的反向互补序列)的序列之间的百分比同一性(或百分比同源性)。该百分比通过以下计算，计数在2个序列之间相同的配比的碱基的数量，除以寡聚物中连续单体的总数，并乘以100。在该比较中，如果存在缺口，优选该缺口仅为错配而不是其中缺口中单体数量在本发明的寡聚物和靶区之间有差异的区域。

如本文所述，术语“同源的”和“同源性”与术语“同一性”和“等同”可互换。

出于本发明的目的，氨基酸和多核苷酸配比、百分比序列同一性和互补的程度可使用ClustalW算法使用标准设置确定：参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html，方法：EMBOSS::水(局部)：缺口产生(Gap Open)＝10.0，缺口延伸(Gap extend)＝0.5，使用Blosum 62(蛋白质)，或用于核苷酸/核碱基序列的DNAfull。

应理解，根据上下文，“错配”是指序列中的非同一性(例如，在寡聚物的核碱基序列和其结合的靶区的反向互补序列之间；例如，在两个配比的编码GLI2的核酸的碱基序列之间)，或指序列中的非互补性(例如，在寡聚物和与其结合的靶区之间)。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物能抑制(如，通过下调)表达或能表达(即通过缓解GLI2靶基因在细胞中的GLI2抑制)GLI2靶基因的细胞中一个或多个GLI2靶基因的表达。

靶向GLI2 mRNA的寡聚物，可杂交至沿着靶mRNA核酸的任何位点，如5′未翻译的前导序列(leader)、外显子、内含子和3′未翻译的尾。然而，优选靶向GLI2 mRNA的寡聚物杂交至靶核酸的成熟mRNA形式。

靶向GLI1 mRNA的寡聚物，可杂交至沿着靶mRNA核酸的任何位点，如5′未翻译的前导序列(leader)、外显子、内含子和3′未翻译的尾。然而，优选靶向GLI1 mRNA的寡聚物杂交至靶核酸的成熟mRNA形式。

靶向GLI3 mRNA的寡聚物，可杂交至沿着靶mRNA核酸的任何位点，如5′未翻译的前导序列(leader)、外显子、内含子和3′未翻译的尾。然而，优选靶向GLI3 mRNA的寡聚物杂交至靶核酸的成熟mRNA形式。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物不靶向GLI3 mRNA。

适当地，本发明的寡聚物或其缀合物能下调(例如减少或去除)GLI2基因的表达。在多种实施方案中，本发明的寡聚物(或缀合物)可实现GLI2的抑制，通常在哺乳动物细胞，如人细胞中。在某些实施方案中，本发明的寡聚物，或其缀合物，结合至靶核酸且与寡聚物或缀合物不存在的情况下的表达水平相比实现对GLI2 mRNA的表达至少10％或20％的抑制，更优选与寡聚物或缀合物不存在的情况下的GLI2表达水平相比实现至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的抑制。

适当地，本发明的寡聚物或其缀合物能下调(例如减少或去除)GLI1基因的表达。在多种实施方案中，本发明的寡聚物(或缀合物)可实现GLI1的抑制，通常在哺乳动物细胞，如人细胞中。在某些实施方案中，本发明的寡聚物，或其缀合物，结合至靶核酸且与寡聚物或缀合物不存在的情况下的表达水平相比实现对GLI1 mRNA的表达至少10％或20％的抑制，更优选与寡聚物或缀合物不存在的情况下的GLI1表达水平相比实现至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的抑制。

适当地，本发明的寡聚物或其缀合物能下调(例如减少或去除)GLI3基因的表达。在多种实施方案中，本发明的寡聚物(或缀合物)可实现GLI3的抑制，通常在哺乳动物细胞，如人细胞中。在某些实施方案中，本发明的寡聚物，或其缀合物，结合至靶核酸且与寡聚物或缀合物不存在的情况下的表达水平相比实现对GLI3 mRNA的表达至少10％或20％的抑制，更优选与寡聚物或缀合物不存在的情况下的GLI3表达水平相比实现至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的抑制。

在一些实施方案中，当使用约0.04nM至约25nM，如约0.8nM至约20nM的寡聚物或缀合物时观察到该抑制。如本文所述，该细胞类型在一些实施方案中，为人细胞，如癌细胞，如人结肠直肠癌细胞，人神经胶质瘤细胞，人肝细胞癌细胞，人黑素瘤细胞，人乳腺癌细胞，人肺癌细胞或人前列腺癌细胞(例如体外-转染的细胞)。使用的寡聚物浓度在一些实施方案中为5nM。使用的寡聚物浓度在一些实施方案中为25nM。使用的寡聚物浓度在一些实施方案中为1nM。应注意用于治疗细胞的寡聚物的浓度在体外细胞测试中进行的不同典型实施方案中，使用转染(Lipofecton)，如实施例所述。在不存在转染剂的情况下，实现下调靶物所需的寡聚物浓度通常为1至25μM，如5μM。

在多种实施方案中，mRNA表达的抑制小于100％(即，小于表达的完全抑制)，如小于98％抑制，小于95％抑制，小于90％抑制，小于80％抑制，如小于70％抑制。在多种实施方案中，基因表达的调节可通过测定蛋白质水平确定，例如通过方法如SDS-PAGE，然后使用针对靶蛋白质产生的合适抗体进行蛋白质印迹。或者，表达水平的调节，可通过测量mRNA水平而确定，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR。当使用合适剂量如约0.04nM至约25nM，如约0.8nM至约20nM通过mRNA水平测量时，下调的水平在多种实施方案中通常达到本发明的寡聚物、缀合物或组合物不存在时的正常水平的10-20％的水平。

因此本发明提供下调或抑制GLI2蛋白和/或mRNA在表达GLI2蛋白和/或mRNA的细胞中表达的方法，所述方法包括将所述细胞接触有效量的本发明的寡聚物或缀合物以下调或抑制GLI2蛋白和/或mRNA在所述细胞中的表达。

本发明提供下调或抑制GLI1蛋白和/或mRNA在表达GLI1蛋白和/或mRNA的细胞中表达的方法，所述方法包括将所述细胞接触有效量的本发明的寡聚物或缀合物以下调或抑制GLI1蛋白和/或mRNA在所述细胞中的表达。

本发明提供下调或抑制GLI3蛋白和/或mRNA在表达GLI3蛋白和/或mRNA的细胞中表达的方法，所述方法包括将所述细胞接触有效量的本发明的寡聚物或缀合物以下调或抑制GLI3蛋白和/或mRNA在所述细胞中的表达。

适合地，该细胞为哺乳动物细胞如人细胞。在一些实施方案中，接触可发生于体外。在一些实施方案中，接触可发生于体内。

具有SEQ ID NO 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，85，86(所有序列基序)以及SEQ ID NO 91，92和93(设计)以及SEQ ID NO 112，113和114(化合物)所示核碱基序列的寡聚物靶向GLI1和GLI2两者。

本发明提供用于制备在表达GLI1和GLI2两者(且任选GLI3)的细胞中治疗高增生性病症，如癌症，或下调GLI1和GLI2(且任选GLI3)的寡聚物的方法，所述方法包括选择在人GLI1和GLI2 mRNA序列之间同源性的区域，提供具有为所述同源性区域的反向互补序列的核碱基序列的寡聚物，和制备根据本发明的寡聚物，其中寡聚物的核碱基序列相对GLI1或GLI2mRNA靶的对应区具有不超过1或2个错配。因此同源性的区域相对GLI1和/或GLI2 mRNA序列的对应区可包含1或2个错配，优选1个或甚至无错配。同源性的区域可与本发明的寡聚物一样长。在一些方面，所述方法可进一步包括选择同源性的区域，其中所述区域与GLI3 mRNA的对应区相比具有至少2个，如至少3个或至少4个错配。或者，所述方法可进一步包括选择同源性的区域，其中所述区域与GLI3 mRNA的对应区相比具有不超过2个，如1个或甚至无错配。

在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的靶区包括具有在人GLI1和人GLI2之间为完美匹配的序列-或其子序列的那些区域-如选自由人GLI2 mRNA转录物(其序列示于SEQ ID NO 1)的以下区域组成的组的靶区：1)核苷酸909-926，2)核苷酸933-948，3)核苷酸1542-1555，4)核苷酸1568-1586，5)核苷酸1647-1663，6)核苷酸1695-1708，7)核苷酸1789-1809，和8)核苷酸1839-1855。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的靶区包括具有在人GLI1和人GLI2之间为完美匹配的序列-或其子序列的那些区域。

在多种实施方案中，SEQ ID NO：1的靶区包括具有在人GLI1，人GLI2和人GLI3之间为完美匹配的序列-或其子序列的那些区域。

由于GLI2的可变剪接变体，优选本发明的寡聚物不靶向外显子1-5(即SEQ ID NO：1的核苷酸1-831)，该GLI2的可变剪接变体出现在开始5个外显子。因此，在一些实施方案中，发现该靶区在SEQ ID NO：1的核苷酸832至最3’端的核苷酸的区域内。通常寡聚物不靶向mRNA靶的polyA尾部。

在一些实施方案中本发明的寡聚物具有100％互补于GLI2 mRNA的对应区的核碱基序列，且相对GLI1 mRNA靶的对应区包含不超过2个，如1个错配或无错配。

在该实施方案中，在一些方面，当与GLI3 mRNA的最佳配比的靶区的核碱基序列相比时寡聚物的核碱基序列包含0，1或2个错配，或在其它方面当与GLI3 mRNA的最佳配比的靶区的核碱基序列相比时可包含至少2，如3，4或5个错配。

适当地，当与SEQ ID NO：1(人GLI2)和SEQ ID NO：2(人GLI1)的最佳配比的靶区的碱基序列相比时，认为寡聚物具有不超过2个错配，如不超过1个错配，或无错配的碱基序列。

在一些实施方案中本发明的寡聚物具有连续核碱基序列，当与SEQ ID NO 1的最佳配比的靶区的反向互补序列的序列相比时其具有0，1或2个错配，如1个或无错配，且当与SEQ ID NO 2的最佳配比的靶区的反向互补序列的序列相比时至少1或至少2或至少3个错配。

在一些实施方案中本发明的寡聚物具有连续核碱基序列，当与SEQ ID NO 134的最佳配比的靶区的反向互补序列的序列相比时其具有0，1或2个错配，如1个或无错配，且当与SEQ ID NO 2的最佳配比的靶区的反向互补序列的序列相比时至少1或至少2或至少3个错配。

寡聚物序列

在一些实施方案中，本发明的寡聚物具有与具有选自SEQ ID NOs：3至90的序列的寡聚物等同的序列。

本发明还提供靶核酸(例如，编码GLI2的DNA或mRNA)，其包含(完全或完美)互补或部分互补于本发明的一种或多种寡聚物的靶区。在某些实施方案中，该寡聚物结合至GLI2靶区的变体，如等位变体(如衍生自人染色体2；位置2q14上存在的GLI2基因的mRNA)。在某些实施方案中，该寡聚物结合至GLI1靶区的变体，如等位变体(如衍生自人染色体12；位置12q13.2-q13.3上存在的GLI1基因的mRNA)。在某些实施方案中，该寡聚物结合至GLI3靶区的变体，如等位变体(如衍生自人染色体17；位置7p13上存在的GLI3基因的mRNA)。在一些实施方案中，GLI2和/或GLI1和/或GLI3靶区的变体与具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中所述序列的靶区具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％序列同一性。因此，在其它实施方案中，当与具有选自SEQ ID NOs：3至90的序列寡聚物相比时本发明的寡聚物具有不同之处在于1，2或3个碱基的序列。通常，结合至GLI2靶区的变体的本发明的寡聚物能抑制(例如，通过下调)GLI2。通常，结合至GLI1靶区的变体的本发明的寡聚物能抑制(例如，通过下调)GLI1。通常，结合至GLI3靶区的变体的本发明的寡聚物能抑制(例如，通过下调)GLI3。

在其它实施方案中，本发明的寡聚物为LNA寡聚物，例如，具有SEQ ID NOs：91至132中所示序列的那些寡聚物。在多种实施方案中，本发明的寡聚物为GLI2和/或GLI1和/或GLI3 mRNA和蛋白质表达的有效的抑制剂。在一些实施方案中，短语“有效的抑制剂”是指具有通过实施例5的LipofectAMINE转染测试测定的IC50小于5nM的寡聚物。在一些实施方案中，IC50小于4nM，如小于2nM。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物为具有SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：132的序列的LNA寡聚物。

在多种实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：具有等同于或部分等同于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中的靶区的反向互补序列的序列的碱基序列的第一区。在多种实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：具有选自SEQ ID NOS：3至90的序列的第一区。

在某些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成：具有完全互补(完美互补)于编码哺乳动物GLI2和/或GLI1和/或GLI3的核酸的靶区的序列的碱基序列的第一区。

在一些实施方案中，与GLI2和/或GLI1和/或GLI3靶核酸的最佳配比的靶区相比该寡聚物包括1，2，3，或4(或更多)个错配，且仍足以结合至靶区以实现GLI2和/或GLI1和/或GLI3 mRNA或蛋白质表达的抑制。错配对于Watson-Crick氢-键合的双链体的去稳定作用，可例如通过寡聚物增加的长度和/或寡聚物中存在的核苷类似物，如LNA单体的增加的数量而补偿。

在多种实施方案中，相比例如，编码哺乳动物GLI2或GLI1或GLI3的靶核酸的最佳配比的靶区的碱基序列，该寡聚物碱基序列包含不超过3个，如不超过2个错配。

在一些实施方案中，当与编码哺乳动物GLI2的核酸的最佳配比的靶区的碱基序列相比，该寡聚物碱基序列包含不超过一个错配。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物(或其第一区)的碱基序列优选至少80％等同于具有选自SEQ ID NOS：3-90的碱基序列的寡聚物，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％等同，如100％等同。

在某些实施方案中，本发明的寡聚物(或其第一区)的碱基序列至少80％等同于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中存在的靶区的反向互补序列的碱基序列，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％等同，至少97％等同，至少98％等同，至少99％等同，如100％等同。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物(或其第一区)的碱基序列，优选至少80％互补于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134的靶区，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％互补，至少97％互补，至少98％互补，至少99％互补，如100％互补(完美互补)。

在一些实施方案中该寡聚物(或其第一区)具有选自SEQ ID NOs：3，10，19，35，59和75的碱基序列，或选自SEQ ID NOs：3，10，19，35，59和75的至少9或10个连续单体。在其它实施方案中，本发明的寡聚物或其第一区的序列包含一个、两个或三个碱基部分，其不同(例如为错配)于具有SEQ ID NOs：3，10，19，35，59和75的序列的寡聚物，或其至少9或10个连续单体的序列中的那些，当与所选的序列或其区域最佳配比时。

在一些实施方案中，本文使用的术语“第一区”是指寡聚物的部分(子序列)。例如，具有SEQ ID NO：19中所述序列的16单体为具有SEQ ID NO：87中所述序列的24单体的子序列，即，具有SEQ ID NO：87中所述序列的寡聚物包括SEQ ID NO：19中所述的序列。

在一些实施方案中该寡聚物(或其第一区)具有选自SEQ ID NOs：85至90的碱基序列，或其至少9或10个连续单体的序列。在其它实施方案中，寡聚物(或其第一区)的序列包含一个、两个或三个不同于具有SEQ ID NOs：85至90的序列的寡聚物或其至少9或10个连续单体的序列中的那些的碱基部分，当与所选的序列或其区域最佳配比时。

在多种实施方案中，该寡聚物包含9，10，11，12，13，14，15或16个连续单体的区域，如12-16个，具有同样存在于选自SEQ ID No 3，10，19，35，59和75的序列中的碱基序列。在其它实施方案中，该寡聚物包括含一个、两个或三个碱基部分的区域，该区域不同于具有SEQ ID NOs：3，10，19，35，59和75的序列的寡聚物中的那些。

在一些实施方案中该第一区由9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，或29个连续单体，如9-22，如12-24，如12-22，如12-18，如12-16个单体组成。适当地，在一些实施方案中，该第一区与本发明的寡聚物长度相同。

在一些实施方案中该寡聚物在第一区的5’和/或3’端包含另外的单体，如，独立地，在寡聚物的5’端和/或3’端包含1，2，3，4或5个另外的单体，其与靶区不互补。在多种实施方案中，本发明的寡聚物包含互补于靶的第一区，其5’和/或3’的侧翼为互补于靶区的另外的单体。在一些实施方案中该另外的5’或3’单体为核苷，如DNA或RNA单体。在多种实施方案中，该5’或3’单体表示本文的缺口聚物的情况下涉及的D区。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：85的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 3，4，5，6，7，或8。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：86的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 10，11，12，13，14或15。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：87的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32或33。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：88的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48或49。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：89的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72或73。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：90的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体，如SEQ ID NOs 76，77，78，79，80，81，82，83，或84。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：9的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：16的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：17的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：18的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：34的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：35的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：50的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：51的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：52的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：53的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：54的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：55的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：56的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：57的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：58的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：59的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：74的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下组成或包含以下：具有根据SEQ ID NO：75的核碱基序列的连续单体(第一区)，或其至少9个连续单体如其10，11，12，13，14，15或16个连续单体。

核苷和核苷类似物

在一些实施方案中，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可互换使用。

在多种实施方案中，寡聚物中存在的至少一个单体为包含修饰的碱基的核苷类似物，如选自5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤，2-氯-6-氨基嘌呤，黄嘌呤和次黄嘌呤的碱基。

在多种实施方案中，寡聚物中存在的至少一个单体为包含修饰的糖的核苷类似物。

在一些实施方案中，寡聚物的至少2个连续单体之间的连接不为磷酸二酯连接。

在某些实施方案中，该寡聚物包含至少一个具有修饰的碱基的单体，至少一个具有修饰的糖的单体(其可为相同的单体)，和至少一个非天然存在的单体间连接。

核苷类似物的具体实例描述于例如Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，和示例1(其中一些核苷类似物以核苷酸显示)

示例1

因此该寡聚物可包含以下序列或由以下序列组成：天然存在的核苷酸的简单序列-优选DNA单体，但也可能为RNA单体，或核苷和一种或多种核苷类似物的组合。在一些实施方案中，该核苷类似物适当地增强寡聚物对靶核酸靶区的亲和力。

合适的和优选的核苷类似物的实例描述于WO2007/031091，或在此引用。

在一些实施方案中，该核苷类似物包含修饰的糖部分以提供2’-取代基，如2’-O-烷基-核糖，2’-氨基-脱氧核糖和2’-氟-脱氧核糖。

在一些实施方案中，该核苷类似物包含双环糖(LNA)，其增强结合亲和力且也可提供一些增加的核酸酶抗性。在多种实施方案中，该LNA单体选自氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧基-LNA)，和/或氨基-LNA(如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫基-LNA(如β-D-硫基-LNA和α-L-硫基-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。在某些实施方案中，该LNA单体为β-D-氧基-LNA。LNA单体在以下进一步描述。

在多种实施方案中，在寡聚物中掺入增强亲和力的核苷类似物，如LNA单体或含2’-取代的糖的单体，或掺入修饰的连接基提供增加的核酸酶抗性。在多种实施方案中，掺入增强亲和力的核苷类似物使得寡聚物的大小降低，且还降低特异结合至靶序列的靶区的寡聚物的大小。

在一些实施方案中，该寡聚物包含至少1个核苷类似物。在一些实施方案中，该寡聚物包含至少2个核苷类似物。在一些实施方案中，该寡聚物包含3-8个核苷类似物，例如6或7个核苷类似物。在多种实施方案中，至少一个核苷类似物为锁核酸(LNA)单体；例如至少3或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或8个核苷类似物为LNA单体。在一些实施方案中，所有核苷类似物为LNA单体。

应认识到当涉及优选的寡聚物碱基序列，在某些实施方案中，该寡聚物包含对应核苷类似物，如对应LNA单体或其它对应核苷类似物，其增加寡聚物/靶区双链体的双链体稳定性(T_m)(即增强亲和力的核苷类似物)。

在多种实施方案中，在寡聚物的碱基序列和靶区的碱基序列之间的任何错配(即，非-互补)，如果存在的话，优选位于除包含增强亲和力的核苷类似物的寡聚物的区域(例如，A或C区)之外的区域，如在本文所述的B区内，和/或在本文所述的D区内，和/或在由DNA单体组成的区域内，和/或在互补于靶区的寡聚物区域的5’或3’的区域内。

在一些实施方案中本发明的寡聚物(如本文所述的A和C区中)存在的核苷类似物独立地选自，例如：含2’-O-烷基-核糖的单体，含2’-氨基-脱氧核糖的单体，含2’-氟-脱氧核糖的单体，LNA单体，含阿拉伯糖的单体(“ANA单体”)，含2’-氟-阿拉伯糖的单体，含d-阿拉伯糖-己糖醇糖的单体(“HNA单体”)，Christensen(2002)Nucl.Acids.Res.30：4918-4925中定义的嵌入单体，在此引入作为参考，和2’-O-甲氧乙基-核糖(2’MOE)糖。在一些实施方案中，仅有一种以上类型的核苷类似物存在于本发明的寡聚物，或其区域中。

在某些实施方案中，该核苷类似物包含2’MOE糖，2’-氟-脱氧核糖，或LNA糖，且因此本发明的寡聚物可包含独立地选自这三种类型的核苷类似物。在某些包含核苷类似物的寡聚物实施方案中，所述核苷类似物中的至少一个包含2’-MOE-核糖，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷类似物包含2’-MOE-核糖。在一些实施方案中，至少一个核苷类似物包含2’-氟-脱氧核糖，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷类似物包含2’-氟-DNA核苷酸糖。

在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物包含至少一个锁核酸(LNA)单体，如1，2，3，4，5，6，7，或8个LNA单体，如3-7或4至8个LNA单体，或3，4，5，6或7个LNA单体。在多种实施方案中，所有核苷类似物为LNA单体。在某些实施方案中，该寡聚物包含β-D-氧基-LNA单体和以下LNA单体中的一种或多种：硫基-LNA单体，氨基-LNA单体，氧基-LNA单体，和/或β-D或α-L构型的ENA单体，或其组合。在某些实施方案中，寡聚物中所有LNA单体的胞嘧啶碱基部分为5-甲基胞嘧啶。在本发明某些实施方案中，该寡聚物包含LNA和DNA单体两者。通常，LNA和DNA单体总数为10-25，优选10-24，优选10-20，优选10-18，还更优选12-16。在本发明-些实施方案中，该寡聚物或其区域由至少一种LNA单体组成，且剩余的单体为DNA单体。在某些实施方案中，该寡聚物仅包含LNA单体和核苷(如RNA或DNA单体，最优选DNA单体)，其任选具有修饰的连接基如硫代磷酸酯。

在多种实施方案中，寡聚物中存在的至少一个核苷类似物具有修饰的碱基，其选自5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。

LNA

术语“LNA”或“LNA单体”是指双环核苷类似物，已知为“锁核酸”。当在“LNA寡核苷酸”的环境下使用时，LNA是指包含一个或多个该双环核苷类似物的寡核苷酸。LNA核苷的特征为核糖环的C2’和C4’之间存在连接基(如桥连)以形成双环体系-例如下文所述的R^4*和R^2*基之间。

本发明的寡核苷酸化合物(寡聚物)中使用的LNA优选具有通式I的结构

式1

其中对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向；

其中X选自-O-，-S-，-N(R^N*)-和-C(R⁶R^6*)-，更优选-O-；

B选自氢，任选取代的C_1-4-烷氧基，任选取代的C_1-4-烷基，任选取代的C_1-4-酰基氧基，核碱基(包括天然存在的和核碱基类似物)，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基，和配体；优选地，B为核碱基或核碱基类似物；

P表示与邻接单体的核苷间连接，或5′-末端基团，该核苷间连接或5′-末端基团任选包括取代基R⁵或等同适用取代基R^5*；

P*表示与邻接单体的核苷间连接，或3′-末端基；

R^4*和R^2*一起形成二价连接基，例如，由1-4个各自独立选自下列的基团/原子组成的二价基团(biradical)：-C(R^aR^b)-，-C(R^a)＝C(R^b)-，-C(R^a)＝N-，-O-，-Si(R^a)₂-，-S-，-SO₂-，-N(R^a)-，和＞C＝Z，其中Z选自-O-，-S-和-N(R^a)-，且R^a和R^b各自独立地选自氢，任选取代的C_1-12-烷基，任选取代的C_2-12-烯基，任选取代的C_2-12-炔基，羟基，任选取代的C_1-12-烷氧基，C_2-12-烷氧基烷基，C_2-12-烯基氧基，羧基，C_1-12-烷氧基羰基，C_1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C_1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，C_1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C_1-6-烷酰基氧基，磺基，C_1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基，C_1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基，和配体，其中各芳基和杂芳基可被任选取代且其中两个成对的取代基R^a和R^b一起可形成任选取代的亚甲基(＝CH₂)，其中对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向，和；

取代基R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*，R⁶和R^6*各自独立地选自氢，任选取代的C_1-12-烷基，任选取代的C_2-12-烯基，任选取代的C_2-12-炔基，羟基，C_1-12-烷氧基，C_2-12-烷氧基烷基，C_2-12-烯基氧基，羧基，C_1-12-烷氧基羰基，C_1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C_1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，C_1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C_1-6-烷酰基氧基，磺基(sulphono)，C_1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基(sulphanyl)，C_1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基，和配体，其中各芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代，硫代，亚氨基，或任选取代的亚甲基；其中R^N选自氢和C_1-4-烷基，且其中两个相邻的(非成对的)取代基可表示另一键，导致形成双键；及其碱性盐和酸加成盐。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。

当本文使用的定义涉及取代的C_1-4-烷基，取代的C_1-6烷基，取代的C_1-12-烷基，取代的C_2-12-烯基，取代的C_2-6烯基，取代的C_2-12-炔基，取代的C_2-6炔基，取代的C_1-12-烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，取代的C_1-4-烷氧基，取代的C_1-4-酰基氧基，取代的芳基，取代的杂芳基，取代的亚甲基，取代的酰基，取代的C_1-6氨基烷基或取代的酰胺，合适的取代基优选包括一个或多个R^g基团，其中各R^g独立地选自卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，CN，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，COOJ₁，C(＝X)J₁，C(＝X)NJ₁J₂，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，O-C(＝X)J₁，NJ₁C(＝NH)NJ₁J₂和NJ₁C(＝X)NJ₁J₂其中X为O或S；且J₁和J₂各自独立地选自H，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6氨基烷基，取代的C_1-6氨基烷基和保护基。优选地，各R^g独立地选自卤素，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，CN，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，COOJ₁，C(＝X)J₁，C(＝X)NJ₁J₂，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，O-C(＝X)J₁，NJ₁C(＝NH)NJ₁J₂和NJ₁C(＝X)NJ₁J₂，其中X为O或S；且J₁和J₂各自独立地选自H，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_1-6氨基烷基和保护基。合适的保护基描述于Theodora W Greene和Peter G M Wuts的“Protective Groups in Organic Synthesis″，3rd版(John Wiley & Sons，1999)。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*一起形成选自以下的连接基C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-，C(R^aR^b)-O-，C(R^aR^b)-NR^a-，C(R^aR^b)-S-和C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-O-，，其中R^a和R^b如上定义。在一些实施方案中，R^a和R^b各自独立地选自氢和C_1-6烷基，且更更优选各自独立选自氢和甲基。

在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向.

在一些优选的实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*都为氢。

在一些实施方案中，R^1*，R²，R³各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。

在一些优选的实施方案中，R^1*，R²，R³都为氢。

在一些实施方案中，R⁵和R^5*各自独立地选自H，-CH₃，-CH₂-CH₃，-CH₂-O-CH₃和-CH＝CH₂。优选地，在一些实施方案中，R⁵或R^5*为氢，且其它基团(分别为R⁵或R^5*)选自C_1-5烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_1-6烷基，取代的C_2-6烯基，取代的C_2-6炔基和取代的酰基(-C(＝O)-)；其中各取代的基团被独立选自以下的取代基单或多取代：卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，COOJ₁，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂和N(H)C(＝X)N(H)J₂其中X为O或S；且J₁和J₂各自独立地选自H，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6氨基烷基，取代的C_1-6氨基烷基和保护基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为取代的C_1-6烷基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为取代的亚甲基，其中优选的取代基包括一个或多个独立选自以下的基团：F，NJ₁J₂，N₃，CN，OJ₁，SJ₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂和N(H)C(O)N(H)J₂。在一些实施方案中J₁和J₂各自独立地为H或C_1-6烷基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为甲基，乙基或甲氧基甲基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为甲基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为乙烯基(ethylenyl)。在一些实施方案中R⁵或R^5*为取代的酰基。在一些实施方案中R⁵或R^5*为C(＝O)NJ₁J₂。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。该5’修饰的双环核苷酸的实例公开于WO 2007/134181，其以其整体在此引入作为参考。

在一些实施方案中B为核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，如嘌呤或嘧啶，或取代的嘌呤或取代的嘧啶，或选自以下的核碱基：腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，尿嘧啶，和/或修饰的或取代的核碱基，如5-噻唑并-尿嘧啶，2-硫基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，2’硫基-胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-噻唑并(thiozolo)-胞嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*一起形成选自以下的连接基-C(R^aR^b)-O-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-O-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-O-，-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-，-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-，C(R^a)＝C(R^b)-C(R^cR^d)-，-C(R^aR^b)-N(R^c)-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-N(R^e)-，-C(R^aR^b)-N(R^c)-O-，-C(R^aR^b)-S-和-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-S-，其中R^a，R^b，R^c，R^d，R^e和R^f各自独立地选自氢，任选取代的C_1-12-烷基，任选取代的C_2-12-烯基，任选取代的C_2-12-炔基，羟基，C_1-12-烷氧基，C_2-12-烷氧基烷基，C_2-12-烯基氧基，羧基，C_1-12-烷氧基羰基，C_1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C_1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，C_1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C_1-6-烷酰基氧基，磺基，C_1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基，C_1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基，和配体，其中各芳基和杂芳基可被任选取代且其中两个成对的取代基R^a和R^b一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH₂)。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向.

在一些实施方案中R^4*和R^2*一起表示选自以下的连接基：-CH₂-O-，-CH₂-S-，-CH₂-NH-，-CH₂-N(CH₃)-，-CH₂-CH₂-O-，-CH₂-CH(CH₃)-，-CH₂-CH₂-S-，-CH₂-CH₂-NH-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-，-CH＝CH-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-O-，-CH₂-NH-O-，-CH₂-N(CH₃)-O-，-CH₂-O-CH₂-，-CH(CH₃)-O-，-CH(CH₂-O-CH₃)-O-，-CH₂-CH₂-和-CH＝CH-。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*一起形成连接基C(R^aR^b)-N(R^c)-O-，其中R^a和R^b各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基，更优选R^a和R^b为氢，且；其中R^c选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基，取代的C_1-6氨基烷基，且更优选R^c为氢。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*一起形成连接基C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-，其中R^a，R^b，R^c和R^d各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基，取代的C_1-6氨基烷基，且更优选R^a，R^b，R^c和R^d为氢。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*形成连接基-CH(Z)-O-，其中Z选自C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_1-6烷基，取代的C_2-6烯基，取代的C_2-6炔基，酰基，取代的酰基，取代的酰胺，巯基和取代的巯基；且其中该取代的基团的每一个独立地被任选保护的独立选自以下的取代基单或多取代：卤素，氧代，羟基，OJ₁，NJ₁J₂，SJ₁，N₃，OC(＝X)J₁，OC(＝X)NJ₁J₂，NJ³C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中J₁，J₂和J₃各自独立地为H或C_1-6烷基，且X为O，S或NJ₁。在一些实施方案中Z为C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基。在一些实施方案中Z为甲基。在一些实施方案中Z为取代的C_1-6烷基。在一些实施方案中所述取代基为C_1-6烷氧基。在一些实施方案中Z为CH₃OCH₂-。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。该双环核苷酸的实例公开于US 7,399,845，其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*都为氢。在一些实施方案中，R^1*，R²，R^3*为氢，且R⁵，R^5*中的一个或两个可不为氢，如以上和WO 2007/134181中所述。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*一起形成包含取代的氨基的连接基，例如，R^4*和R^2*一起形成由基团-CH₂-N(R^c)-组成或包含基团-CH₂-N(R^c)-的连接基，其中R^c为C_1-12烷基氧基。在一些实施方案中R^4*和R^2*一起形成连接基-Cq₃q₄-NOR-，其中q₃和q₄各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基；其中各取代的基团独立地被独立选自以下的取代基单或多取代：卤素，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，COOJ₁，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)N J₁J₂和N(H)C(＝X＝N(H)J₂其中X为O或S；且J₁和J₂各自独立地选自H，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_1-6氨基烷基和保护基。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。该双环核苷酸的实例公开于WO2008/150729，其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*都为氢。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³都为氢且R⁵，R^5*中的一个或两个可不为氢，如以上和WO 2007/134181中所述。在一些实施方案中R^4*和R^2*一起形成连接基C(R^aR^b)-O-，其中R^a和R^b各自独立地选自卤素，C₁-C₁₂烷基，取代的C₁-C₁₂烷基，C₂-C₁₂烯基，取代的C₂-C₁₂烯基，C₂-C₁₂炔基，取代的C₂-C₁₂炔基，C₁-C₁₂烷氧基，取代的C₁-C₁₂烷氧基，OJ₁ SJ₁，SOJ₁，SO₂J₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)NJ₁J₂，C(＝O)J₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂和N(H)C(＝S)NJ₁J₂；或R^a和R^b一起为＝C(q₃)(q₄)；q₃和q₄各自独立地为H，卤素，C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；各取代的基团独立地被独立选自以下的取代基单或多取代：卤素，C₁-C₆烷基，取代的C₁-C₆烷基，C₂-C₆烯基，取代的C₂-C₆烯基，C₂-C₆炔基，取代的C₂-C₆炔基，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)NJ₁J₂，C(＝O)J₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂和N(H)C(＝S)NJ₁J₂；J₁和J₂各自独立地选自H，C₁-C₆烷基，取代的C₁-C₆烷基，C₂-C₆烯基，取代的C₂-C₆烯基，C₂-C₆炔基，取代的C₂-C₆炔基，C₁-C₆氨基烷基，取代的C₁-C₆氨基烷基和保护基。该化合物公开于WO2009/006478，在此以其整体引入作为参考。

在一些实施方案中，R^4*和R^2*形成连接基-Q-，其中Q为C(q₁)(q₂)C(q₃)(q₄)，C(q₁)＝C(q₃)，C[＝C(q₁)(q₂)]-C(q₃)(q₄)或C(q₁)(q₂)-C[＝C(q₃)(q₄)]；q₁，q₂，q₃，q₄各自独立地选自H，卤素，C_1-12烷基，取代的C_1-12烷基，C_2-12烯基，取代的C_1-12烷氧基，OJ₁，SJ₁，SOJ₁，SO₂J₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)-NJ₁J₂，C(＝O)J₁，-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂和N(H)C(＝S)NJ₁J₂；J₁和J₂各自独立地选自H，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_1-6氨基烷基和保护基；且，任选地，其中当Q为C(q₁)(q₂)(q₃)(q₄)且q₃或q₄之一为CH₃时，则q₃或q₄的至少另一个或q₁和q₂的一个不为H。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*都为氢。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。该双环核苷酸的实例公开于WO2008/154401其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*各自独立地选自氢，卤素，C_1-6烷基，取代的C_1-6烷基，C_2-6烯基，取代的C_2-6烯基，C_2-6炔基，取代的C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，取代的C_1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1-6氨基烷基和取代的C_1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*都为氢。在一些实施方案中，R^1*，R²，R³都为氢且R⁵、R^5*的一个或两个可不为氢，如以上和WO 2007/134181或WO2009/067647(α-L-双环核酸类似物)所述。

在一些优选实施方案中，本发明的寡核苷酸化合物中存在的LNA单体优选具有通式II的结构：

式II

其中Y选自-O-，-CH₂O-，-S-，-NH-，N(R^e)和-CH₂-；Z和Z^*各自独立地选自核苷间连接、R^H、末端基和保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分(核碱基)，且R^H选自氢和C_1-4-烷基；R^a，R^b，R^c，R^d和R^c各自独立地选自氢，任选取代的C_1-12-烷基，任选取代的C_2-12-烯基，任选取代的C_2-12-炔基，羟基，C_1-12-烷氧基，C_2-12-烷氧基烷基，C_2-12-烯基氧基，羧基，C_1-12-烷氧基羰基，C_1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C_1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基，C_1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C_1-6-烷酰基氧基，磺基(sulphono)，C_1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基，C_1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基，和配体，其中各芳基和杂芳基可被任选取代且其中两个成对的取代基R^a和R^b一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH₂)；且R^H选自氢和C_1-4-烷基。在一些优选实施方案中，R^a，R^b R^c，R^d和R^e各自独立地选自氢和C_1-6烷基，更优选甲基。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向，例如，两种示例性立体化学异构体包括β-D和α-L亚型，其可如下阐述：

具体的示例性LNA单元示于以下(在示例2中)：

β-D-氧基-LNA α-L-氧基-LNA

β-D-硫基-LNA β-D-ENA

β-D-氨基-LNA

示例2

术语″硫基-LNA″包括其中上述通式中的Y选自S或-CH₂-S-的锁核苷。硫基-LNA可为β-D和α-L-构型两者。

术语″氨基-LNA″包括其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH₂-N(H)-和-CH₂-N(R)-，其中R选自氢和C_1-4-烷基的锁核苷。氨基-LNA可为β-D和α-L-构型两者。

术语″氧基-LNA″包括其中上述通式中的Y表示-O-的锁核苷。氧基-LNA可为β-D和α-L-构型两者。

术语″ENA″包括其中上述通式中的Y为-CH₂-O-(其中-CH₂-O-的氧原子连接至相对碱基B的2’-位)的锁核苷。R^e为氢或甲基。

在一些示例性实施方案中，LNA选自β-D-氧基-LNA，α-L-氧基-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫基-LNA，特别是β-D-氧基-LNA。

RNA酶H募集

在一些实施方案中，寡聚物通过非RNA酶介导的靶mRNA的降解起作用，如通过翻译的位阻，或其它机制，然而，在多种实施方案中，本发明的寡聚物能募集一种或多种RNA酶类酶或复合物，如核糖核酸内切酶(RNA酶)，如RNA酶H。

通常，该寡聚物包含至少6个，如至少7个连续单体的区域，如至少8或至少9个连续单体，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续单体，当其与靶RNA的靶区形成双链体时能募集RNA酶。能募集RNA酶的寡聚物的区域可为本文所述的缺口聚物(gapmer)涉及的B区。在一些实施方案中，能募集RNA酶的寡聚物的区域，如B区，由9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个单体组成。

EP 1 222 309提供了体外测定RNA酶H活性的方法，其可用于测定本发明的寡聚物募集RNA酶H的能力。使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当与RNA靶的互补区接触时，其具有的初始速率(以pmol/l/min测量)，为使用如下寡核苷酸测定的初始速率的至少1％，如至少5％，如至少10％或大于20％，则认为该寡聚物能募集RNA酶H，所述寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含DNA单体，没有2’取代，且在所述寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基，EP 1 222 309在此引入作为参考。

在一些实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当与RNA靶的互补靶区和RNA酶H接触时，该RNA酶H初始速率(以pmol/l/min测量)，少于使用如下寡核苷酸测定的初始速率的1％，如少于5％，如少于10％或少于20％，则认为该寡聚物基本不能募集RNA酶H，所述寡核苷酸具有相同碱基序列，但仅含DNA单体，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基。

在其它实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当与RNA靶的互补靶区和RNA酶H接触时，该RNA酶H初始速率(以pmol/l/min测量)，为使用如下寡核苷酸测定的初始速率的至少20％，如至少40％，如至少60％，如至少80％，则认为该寡聚物能募集RNA酶H，所述寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含DNA单体，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基。

通常，与靶RNA的互补靶区形成双链体且能募集RNA酶的寡聚物的区域，包含DNA单体且任选包含LNA单体，且与该靶区形成DNA/RNA-状双链体。该LNA单体优选为α-L构型，特别优选为α-L-氧基LNA。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物包括核苷和核苷类似物，且为缺口聚物(gapmer)、头聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。

“头聚物”定义为如下寡聚物，其包含区域X和与其邻接的区域Y，且区域Y的5’-端(5’-most)单体连接至区域X的3’-端单体。区域X包含非-RNA酶募集核苷类似物的连续段且区域Y包含可由RNA酶识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体的连续段(如至少7个连续单体)。

“尾聚物(tailmer)”定义为如下寡聚物，其包含区域X和与其邻接的区域Y，且区域Y的5’-端单体连接至区域X的3’-端单体。区域X包含可由RNA酶识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体的连续段(如至少7个连续单体)，且区域Y包含非-RNA酶募集核苷类似物的连续段。

其它“嵌合的(chimeric)”寡聚物，称为“混合聚物”，由(i)可由RNA酶识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体，和(ii)非-RNA酶募集核苷类似物单体的交替组合组成。

在一些实施方案中，除了增强寡聚物对靶区的亲和力，一些核苷类似物还介导RNA酶(例如，RNA酶H)结合和裂解。因为α-L-LNA单体募集RNA酶H活性达一定程度，在一些实施方案中，含α-L-LNA单体的寡聚物的缺口区域(例如，本文涉及的B区)由较少的可由RNA酶H识别和裂解的单体组成，且混合聚物构造中被引入更多的柔性。

缀合物

在本发明中，术语″缀合物″是指通过将本文所述的寡聚物共价连接(“缀合”)至一种或多种本身不为核酸或单体的部分(“缀合的部分”)而形成的化合物。该缀合的部分的实例包括大分子化合物如蛋白质，脂肪酸链，糖残基，糖蛋白，聚合物，或其组合。典型蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。

因此，本文提供缀合物，其包含本文所述的寡聚物，和至少一个不为核酸或单体的缀合的部分(共价连接至所述寡聚物)。因此，在某些实施方案中，当本发明的寡聚物由具有碱基的特定序列的连续单体组成时，如本文所述，该缀合物还可包含至少一个共价连接至寡聚物的缀合的部分。

在本发明多种实施方案中，该寡聚物缀合至增加寡聚化合物的细胞摄取的部分。WO2007/031091提供了合适的配体和缀合物(部分)，其在此引入作为参考。

在多种实施方案中，缀合(至缀合的部分)可增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分包括，但不限于，抗体，多肽，脂质部分如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫醇(tritylthiol)，硫胆固醇，脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1，2-二-o-十六烷基-rac-甘油基-3-h-膦酸酯三乙基铵，聚胺或聚乙二醇链，金刚烷乙酸，棕榈基部分，十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。

在某些实施方案中，本发明的寡聚物缀合至活性药物物质，例如，阿司匹林、布洛芬、磺胺药物、抗糖尿病药、抗细菌剂或抗生素。

在某些实施方案中，该缀合的部分为固醇，如胆固醇。

在多种实施方案中，该缀合的部分包含以下或由以下组成：带正电荷的聚合物，例如长度为1-50，如2-20如3-10个氨基酸残基的带正电荷的肽，和/或聚环氧烷如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇-参见WO 2008/034123，在此引入作为参考。适当地，该带正电荷的聚合物，如聚环氧烷可通过连接基如WO 2008/034123描述的可释放的连接基连接至本发明的寡聚物。

作为实例，以下部分可在本发明的缀合物中使用：

活化的寡聚物

本文所用的术语“活化的寡聚物”，是指共价连接(即，官能化)至至少一种官能部分(functional moiety)的本发明的寡聚物，该官能部分允许寡聚物共价连接至一种或多种缀合的部分(即本身不为核酸或单体的部分)，以形成本文描述的缀合物。典型地，官能部分将包含能通过以下共价连接至寡聚物的化学基团：例如，腺嘌呤碱基的3’-羟基或环外NH₂基，优选亲水性的间隔基(spacer)和能结合至缀合的部分的末端基团(例如，氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，这种末端基团未被保护，例如，为NH₂基团。在其它实施方案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora W Greene和Peter G M Wuts，第三版(John Wiley & Sons，1999)的“Protective Groups in Organic Synthesis″的那些保护基。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯基甲基，或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二苯基甲基，三苯基甲基，苄氧羰基，叔丁氧羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。

在一些实施方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能部分为生物可降解的。参见例如，美国专利号7,087,229，其以其整体在此引入作为参考。

在一些实施方案中，本发明的寡聚物在5’端活化(即，官能化)以使缀合的部分共价连接至寡聚物的5’端。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在3’端官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在多于一个位置官能化，所述位置独立地选自5’端、3’端、主链和碱基。

在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物使用未被官能化的单体合成，且该寡聚物在合成完成后官能化。

在一些实施方案中，该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯(hindered ester)官能化，其中该烷基部分具有式(CH₂)_w，其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中该官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH₂)_wNH)连接至寡聚物。

在其它实施方案中，该寡聚物使用含(CH₂)w-巯基(SH)连接基的位阻酯官能化，其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中该官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH₂)_wSH)连接至寡聚物。在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合(通过二硫键的形成)。

上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通过本领域已知的任何方法合成，且特别是通过公开于PCT公开号WO 2008/034122和其实施例中的方法，其以其整体在此引入作为参考。

共价连接至至少一种(个)官能部分的活化的寡聚物可通过任何现有技术已知的方法合成，且特别地，通过美国专利公开号2004/0235773中公开的方法，其以其整体在此引入作为参考，和Zhao等人(2007)J.Controlled Release119：143-152的方法；和Zhao等人(2005)Bioconjugate Chem.16：758-766的方法。

在其它实施方案中，本发明的寡聚物通过使用官能化试剂(functionalizing reagent)向寡聚物引入巯基、氨基或羟基而官能化，该官能化试剂基本上如美国专利号4,962,029和4,914,210中所述，即，为基本上链状的试剂，其在一端具有亚磷酰胺(phosphoramidite)通过亲水性间隔基链连接至相对的端，该相对的端包含保护的或未保护的巯基、氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂偶合至寡聚物的5’-羟基。在其它实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂偶合至3’-羟基。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有官能化试剂偶合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方案中，本发明的寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化，如美国专利号4,962,029和4,914,210中所述，以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡聚物的方法公开于美国专利号4,962,029和4,914,210。

在一些实施方案中，固相结合的寡聚物的5’-端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过Diels-Alder环加成反应而缀合。

在多种实施方案中，将含2’-糖修饰的单体，如2’-氨基甲酸酯取代的糖或2′-(O-戊基-N-苯二甲酰亚氨基)-脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物的糖的共价连接。在其它实施方案中，一个或多个单体的2′-位具有含氨基的连接基的寡聚物使用以下试剂制备：例如，5′-二甲氧基三苯甲基-2′-O-(e-苯二甲酰亚氨基氨基戊基)-2′-脱氧腺苷-3′-N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见，例如，Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。

在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在核碱基上(包括在N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位上)具有含胺的官能部分。在多个实施方案中，该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。

一些官能部分是可商购的，例如，异双官能(heterobifunctional)和同双官能(homobifunctional)连接部分可购自Pierce Co.(Rockford，Ill.)。其它可商购的连接基为5′-氨基-修饰体(Modifier)C6和3′-氨基-修饰体试剂，均可购自Glen Research Corporation(Sterling，Va.)。5′-氨基-修饰体C6也可作为Aminolink-2购自ABI(Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)，且3′-氨基-修饰体也可购自Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto，Calif.)。

组合物

在多种实施方案中，本发明的寡聚物用于药物制剂和组合物。合适地，该组合物包含药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。WO2007/031091提供了合适和优选的药学可接受的稀释剂、载体和佐剂-其在此引入作为参考。合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合，前药制剂也提供于WO2007/031091-其也在此引入作为参考。关于配制和给药的技术的详情也可参考最新版的″REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES″(Maack Publishing Co，Easton Pa.)。

在一些实施方案中，本发明的寡聚物共价连接至缀合的部分以辅助递送寡聚物跨过细胞膜。辅助递送寡聚物跨过细胞膜的缀合的部分的实例为亲脂部分，如胆固醇。在多种实施方案中，本发明的寡聚物与形成脂质体的脂质制剂一起配制，如LipofectAMINE 2000或LipofectAMINE RNAiMAX，其都可购自Invitrogen。在一些实施方案中，本发明的寡聚物与一种或多种脂质状非天然存在的小分子(“lipidoids”)的混合物一起配制。lipidoids的文库可通过常规合成化学方法合成，且可评估lipidoids的各种量和组合以研发一种运载体，其用于通过所选的给药途径有效递送特定尺寸的寡聚物至靶向的组织。合适的lipidoid文库和组合物可参见，例如Akinc等人(2008)Nature Biotechnol.，可获自http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/abs/ nbt1402.html，其在此引入作为参考。

如本文所述，术语″药学可接受的盐″是指保持本文鉴别的寡聚物的所需生物活性且显示可接受水平的不希望有的毒性作用的盐。这些盐的非限制性实例可以是与有机氨基酸形成的，以及与金属阳离子形成的碱加成盐，该金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等，或与由氨形成的阳离子，N，N′-二苄基乙二胺，D-葡糖胺，四乙基铵，或乙二胺形成的碱加成盐；或(c)(a)和(b)的组合；例如，鞣酸锌盐等。

在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物除了本发明的寡聚物或缀合物外还包含其它活性成分，包括用于治疗高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的活性剂。

在一些实施方案中，该另外的活性剂为紫杉醇(Narita等人，Clin.Cancer.Res.2008 Sept 15：14(18)：5769。

在一个实施方案中，本发明提供组合治疗，其特征在于该治疗包括给药根据本发明的药物组合物，和另外的活性剂(例如紫杉醇)，其在某些实施方案中在给药本发明的药物组合物之前、之中或之后给药。

本发明还提供多部分试剂盒，其中第一部分包含至少一种根据本发明的寡聚物、缀合物和/或药物组合物且另一部分包含一种或多种用于治疗高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的活性剂(例如紫杉醇)。因此可以想到该多部分试剂盒可用于治疗方法，如本文所述，其中该方法包括同时或相继给药第一部分和另一部分。

应用

本文使用的术语“治疗”是指治疗存在的疾病(例如，下文涉及的疾病或病症)，或预防疾病(即，预防两者)。因此应认识到，在某些实施方案中，“治疗”包括预防。

在多种实施方案中，本发明的寡聚物可用作研究试剂，用于例如，诊断、治疗和预防。

在一些实施方案中，该寡聚物可用于研究目的以特异抑制细胞和实验动物中GLI2和/或GLI1和/或GLI3蛋白的表达(通常通过降解或抑制GLI2和/或GLI1和/或GLI3 mRNA从而防止蛋白质形成)，从而促进该靶的功能分析或评估其作为治疗干预的靶的有用性。

在某些实施方案中，该寡聚物可在诊断中用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似技术检测和/或定量细胞和组织中的GLI2和/或GLI1和/或GLI3表达。

在不同治疗实施方案中，疑患疾病或病症的非人动物或人(其可通过调节GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达治疗)通过给药本发明的有效量的寡聚物而治疗。本文进一步提供了治疗哺乳动物的方法，如治疗人，其疑患疾病或状况或易患疾病或状况，该疾病或状况与GLI2和/或GLI1和/或GLI3的表达相关，该方法通过给药治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物。

在某些实施方案中，本发明还提供本发明所述的寡聚物或缀合物在制备用于治疗本文涉及的疾病的药物中的用途，或提供治疗本文所述的疾病的方法。

在多种实施方案中，本发明还提供治疗本文涉及的疾病的方法，所述方法包括向需要的动物(如需要的患者)给药本文所述的根据本发明的寡聚物，和/或根据本发明的缀合物，和/或根据本发明的药物组合物。

如实施例所述，本发明的寡聚物可用于在表达靶核酸的细胞，如哺乳动物细胞，如人细胞中诱导凋亡，-在这点上本发明进一步提供在细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括将表达GLI2和/或GLI1和/或GLI3的细胞与足以诱导凋亡的量的本发明的寡聚物或缀合物或药物组合物接触的步骤。凋亡可在体内或体外引发。适当地，该寡聚物以在所述细胞中有效引发凋亡的量添加。在一些实施方案中该细胞为癌细胞。

医药适应症

在某些治疗实施方案中，待治疗的疾病为高增生性病症(例如，癌症)，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，黑素瘤或肝细胞癌。在多种实施方案中，根据本发明的这些疾病或状况的治疗可与一种或多种其它抗癌治疗，如放射治疗、化学治疗或免疫治疗组合。

在多种实施方案中，该疾病或病症与GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或与蛋白质产物与GLI2和/或GLI1和/或GLI3相关或相互作用的基因的突变相关。因此，在多种实施方案中，靶mRNA为GLI2和/或GLI1和/或GLI3序列的突变形式，例如，其包括一个或多个单点突变或三核苷酸重复序列(triplet repeats)。

在多种实施方案中，该疾病或病症与异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3相关。

本文使用的术语“异常”是指与不具有本文所述的疾病、病症或状况的动物细胞中的表达水平相比细胞中GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因的过度表达(例如上调)。

在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物、缀合物或组合物可用于治疗与GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因的过度表达(例如上调)相关的状况。

在其它实施方案中，该疾病或病症与异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3的突变形式相关。

本文使用的术语“突变”和“突变形式”是指SEQ ID NO：1中所示GLI2核酸的变体；和/或SEQ ID NO：2中所示GLI1核酸的变体；和/或SEQ ID NO：134中所示GLI3核酸的变体。所述变体可与本文涉及的疾病、病症或状况相关。在一些实施方案中，本文使用的术语“变体”是指具有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134的不同的碱基序列的核苷酸序列，所述不同在于一个或多个核苷酸添加和/或取代和/或缺失。在一些实施方案中该变体与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134具有至少80％，85％，90％或95％序列同源性(同一性)。在相同或不同实施方案中，该变体在整个SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134上具有不超过60个添加的核苷酸和/或取代的核苷酸和/或缺失的核苷酸；如不超过30个添加的核苷酸和/或取代的核苷酸和/或缺失的核苷酸；如在整个SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134上不超过15个添加的核苷酸和/或取代的核苷酸和/或缺失的核苷酸。

在多种实施方案中，本发明涉及调节GLI2靶基因(即通过GLI2调节的基因)的基因产物的表达的方法。GLI2靶基因的实例包括GLI1和PTCH1。在一些实施方案中，GLI2靶基因的调节导致靶基因的表达或活性增加。在其它实施方案中，GLI2靶基因的调节导致靶基因的表达或活性降低。

本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文所述的任何和所有状况的药物中的用途。

在多种实施方案中，本发明涉及治疗患有或易患与异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3 mRNA或蛋白质相关的状况的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物给药治疗有效量的本发明的寡聚物，或其缀合物，其包含一个或多个LNA单体。

本发明一个感兴趣的方面涉及本文定义的寡聚物(化合物)或本文定义的缀合物在制备用于治疗上文公开的病症的药物中的用途。

在多种实施方案中，本发明包括预防或治疗疾病的方法，其包括向需要该治疗的非人动物或人给药治疗有效量的根据本发明的寡聚物或其缀合物。

在某些实施方案中，本发明的LNA寡聚物或其缀合物，短期给药而不是连续给药。

在本发明某些实施方案中，该寡聚物(化合物)连接至缀合的部分，例如，以增加寡聚物的细胞摄取。在一个实施方案中该缀合的部分为固醇，如胆固醇。

在多种实施方案中，本发明涉及治疗异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3的方法，该方法包括向需要该治疗的动物(如患者)给药本发明的寡聚物，或其缀合物或药物组合物，且任选进一步包括给药其它化学治疗剂。在一些实施方案中，该化学治疗剂缀合至寡聚物，存在于药物组合物中，或以单独制剂给药。

本发明还涉及本文定义的寡聚物、组合物或缀合物，其用作药物。

本发明进一步涉及本文定义的寡聚物、组合物或缀合物在制备用于治疗异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3或GLI2和/或GLI1和/或GLI3的突变体形式的表达(如等位变体，如与本文涉及的疾病之一相关的那些)的药物中的用途。

而且，在多种实施方案中，本发明涉及治疗患有选自高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的疾病或状况的动物(如患者)的方法，该方法包括向需要的动物(如患者)给药本文定义的药物组合物的步骤。

在某些实施方案中，本发明的方法用于治疗或预防异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3引起的疾病。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗异常水平的GLI2和/或GLI1和/或GLI3的方法，所述方法包括向需要的动物(如患者)给药本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。

而且，本发明涉及治疗患有如本文所述的那些的疾病或状况的动物(如人)的方法。

需要治疗的动物(如患者)为患有或可能患有疾病或病症的动物(如患者)。

合适的动物包括人和非人动物。

在一些实施方案中，该动物为哺乳动物。实例包括人、啮齿类(如大鼠和小鼠)、兔、灵长类、非人灵长类(如黑猩猩和猴)、马、牛、羊、猪、狗和猫。

合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前体药物制剂还提供在WO2007/031091中-其在此引入作为参考。

本发明还提供包含本文所述的寡聚物或缀合物，和药物可接受的稀释剂、载体或佐剂的药物组合物。WO2007/031091提供合适的和优选的药物可接受的稀释剂、载体和佐剂-其在此引入作为参考。

实施方案

本发明以下实施方案可与本文所述的其它实施方案组合使用。

1.长度为10-30个核苷酸的寡聚物，其包含总共10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列至少80％同源于对应于哺乳动物GLI2基因的区域或mRNA的反向互补序列，如SEQ ID NO：1，或其天然存在的变体。

2.根据实施方案1的寡聚物，其中该连续核苷酸序列至少80％同源于对应于SEQ ID NO：3-90任何的区域。

3.根据实施方案1或2的寡聚物，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1的对应区的反向互补序列相比不包含错配或包含不超过1个或2个错配。

4.根据实施方案1-3任一项的寡聚物，其中所述连续核苷酸序列相对人GLI1(SEQ ID NO 1)和GLI2(SEQ ID NO 2)mRNA序列的反向互补序列的对应区不包含错配或包含不超过1或2个错配。

5.根据实施方案1-4任一项的寡聚物，其中寡聚物的核苷酸序列由连续核苷酸序列组成。

6.根据实施方案1-5任一项的寡聚物，其中该连续核苷酸序列的长度为10-18个核苷酸。

7.根据实施方案1-6任一项的寡聚物，其中该连续核苷酸序列包括核苷酸类似物。

8.根据实施方案7的寡聚物，其中该核苷酸类似物为糖修饰的核苷酸，如选自以下的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，和2’-氟-DNA单元。

9.根据实施方案8的寡聚物，其中该核苷酸类似物为LNA。

10.根据实施方案7-9任一项的寡聚物，其为缺口聚物。

11.根据实施方案1-10任一项的寡聚物，其在表达GLI2基因或mRNA的细胞中抑制GLI2基因或mRNA的表达。

12.缀合物，其包含根据实施方案1-11任一项的寡聚物，和至少一个共价连接至所述寡聚物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。

13.药物组合物，其包含根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或根据实施方案12的缀合物，和药物可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。

14.根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或根据实施方案12的缀合物，其用作药物，如用于治疗高增生性病症，如癌症。

15.根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或实施方案12定义的缀合物在制备用于治疗高增生性病症，如癌症的药物中的用途。

16.治疗高增生性病症，如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有高增生性病症，如癌症的患者给药根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或根据实施方案12的缀合物，或根据实施方案13的药物组合物。

17.在表达GLI2的细胞中抑制GLI2的方法，所述方法包括向所述细胞给药根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或根据实施方案12的缀合物以在所述细胞中抑制GLI2。

18.在表达GLI2的细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括向所述细胞给药足以引发凋亡的量的根据实施方案1-11任一项的寡聚物，或根据实施方案12的缀合物，或根据实施方案13的药物组合物的步骤。

实施例

实施例1：单体合成

该LNA单体构件(building blocks)和衍生物按照公开的方法和其中引用的文献制备-参见WO07/031081和其中引用的文献。

实施例2：寡核苷酸合成

寡核苷酸(寡聚物)根据描述于WO07/031081的方法合成。表1显示本发明的反义寡核苷酸基序的实例。

实施例3：寡核苷酸的设计

根据本发明，使用公开的序列GenBank登记号NM 005270(本文以SEQ ID NO：1提供)设计一系列寡核苷酸(寡聚物)靶向人GLI2 mRNA的不同区域。在一些实施方案中该寡核苷酸还使用公开的序列GenBank登记号NM_005269(本文以SEQ ID NO：2提供)设计为靶向GLI1 mRNA和/或使用公开的序列GenBank登记号NM_000168(本文以SEQ ID NO：134提供)靶向GLI3 mRNA。

表1：本发明的反义寡核苷酸序列。SEQ ID NOs：3-84和SEQ ID NOs：85-90(示于表2)为设计为靶向人GLI2 mRNA和任选人GLI1 mRNA和任选人GLI3 mRNA的寡聚物(oligo)基序序列(寡聚物)。(指示与GLI1 mRNA 100％序列同源性-参见“Compl Gli1”)。

表2显示24聚物(24mer)序列基序，从该基序可设计本发明的寡聚物-粗体形式表示表1所示的寡聚物序列基序。

表3：本发明的寡核苷酸设计。在SEQ ID NOs：91-111中，大写字母表示核苷酸(核苷)类似物单元(单体)，如本文公开的那些，如LNA单元。小写字母表示核苷酸(DNA)单体。在一些实施方案中，核苷酸之间的核苷间连接都为硫代磷酸酯。在一些实施方案中，LNA单体中的所有胞嘧啶碱基(残基)为5-甲基胞嘧啶。

序列(5′-3′)
		ACCagcatgtaCTG	SEQ ID NO：91
AACgtgcacttGTG	SEQ ID NO：92
		TTCtggtgcttGGC	SEQ ID NO：93
GTGaaggctgggcTGA	SEQ ID NO：94
		TCTgcttgttctgGTT	SEQ ID NO：95
CCTgcttacagtcATC	SEQ ID NO：96
		CTCcttggtgcagTCT	SEQ ID NO：97

序列(5′-3′)
		GTGtgtcttcaggTTC	SEQ ID NO：98
CGCaggtgtgtctTCA	SEQ ID NO：99
		GCAgatgtagggtTTC	SEQ ID NO：100
GCCactgtcattgTTG	SEQ ID NO：101
		CCAgggctgaggtGTC	SEQ ID NO：102
GAGgcagcttggtGTT	SEQ ID NO：103
		TGCtggtggagctGTC	SEQ ID NO：104
GTGaggttgagcaGCC	SEQ ID NO：105
		GCCgcacagggtcGCT	SEQ ID NO：106
ATGtagtttacccTGG	SEQ ID NO：107
		CCAtgaagccaggCTG	SEQ ID NO：108
TACatgtggatctGGC	SEQ ID NO：109
		GCCatgttgctgaTGC	SEQ ID NO：110
TCAgattcaaacCCA	SEQ ID NO：111

实施例4：体外模型：细胞培养

反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试，条件是该靶核酸以可检测的水平存在。该靶可内源性表达或通过对编码所述靶核酸的核酸进行瞬时转染或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用，例如，RNA印迹分析、实时PCR、核糖核酸酶保护测试而确定。为了例示，提供以下细胞类型，但可常规使用其它细胞类型，条件是该靶在所选的细胞类型中表达。细胞如下所述在合适的培养基中培养，并保持在37℃和95-98％湿度和5％ CO₂下。细胞每周常规传代2-3次。

DU-145：人前列腺癌细胞系DU-145在具有Glutamax I(Gibco #61870-010)的含10％胎牛血清(Biochrom 19357-5010)和25μg/ml庆大霉素(25μg/ml)(Sigma # G1397)的RPMI 1640培养基中培养。

518A2：人黑素瘤癌细胞系518A2在含10％胎牛血清(Biochrom19357-5010)，2mM Glutamax I(Gibco #35050-038)和25μg/ml庆大霉素(Sigma # G1397)的Dulbecco`s MEM(Sigma # D5671)中培养。

实施例5：体外模型：用反义寡核苷酸处理

将细胞用寡聚物(寡核苷酸)处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000(Gibco)作为转染载体。将细胞接种于6-孔细胞培养板(NUNC)并当铺满75-90％时进行处理。使用的寡核苷酸浓度范围为0.8nM至20nM终浓度。寡核苷酸-脂质复合物的配制基本上按照制造商的说明进行，其使用无血清OptiMEM(Gibco)且最终脂质浓度为5μg/mL的LipofectAMINE 2000。将细胞在37℃温育4小时且通过去除含寡核苷酸的培养基终止处理。清洗细胞且添加含血清的培养基。寡核苷酸处理后，使细胞恢复20小时，然后将其收集用于RNA分析。

实施例6：体外模型：RNA的提取和cDNA合成

为从细胞系分离RNA，根据制造商提供的方案使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen目录号74104)。根据制造商的说明使用Ambion的逆转录酶试剂(Reverse Transcriptase reagents)进行第一链合成。

对于每种样品用无RNA酶的H₂O将0.5μg总RNA调节至(10.8μl)，并与2μl随机的十聚物(random decamers)(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM每dNTP)混合，且加热至70℃保持3分钟，然后将样品在冰上快速冷却。样品在冰上冷却后，将2μl 10x缓冲液RT，1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)添加至各样品中，然后在42℃温育60分钟，在95℃将酶热灭活10分钟，然后将样品冷却至4℃。

实施例7：体外模型：通过实时PCR分析GLI2表达的寡核苷酸抑制

GLI2 mRNA表达的反义调节可在多种本领域已知的方式中测试。例如，GLI2 mRNA水平可通过例如，RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR定量。实时定量的PCR目前是优选的。RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。RNA分离的方法和RNA分析方法如RNA印迹分析是本领域中常规的，且在例如John Wiley和Sons的Current Protocols in Molecular Biology中教导。实时定量(PCR)可方便地使用可商购的可获自Applied Biosystem的Multi-Color Real Time PCR Detection System而实现。

GLI2 mRNA水平的实时定量PCR分析

样品中人GLI2 mRNA的含量使用人GLI2 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems目录号Hs00257977_m1)根据制造商的说明定量。

人GLI1(在此也称为Gli1)mRNA在样品中的含量使用人Gli1 ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems目录号Hs00171790_m1)根据制造商的说明定量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的量用作内源性对照用于标准化样品制剂中的任何变量。

人GAPDH mRNA在样品中的含量使用人GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems目录号4310884E)根据制造商的说明定量。

实时定量的PCR是本领域公知的技术，且在例如Heid等人Real time quantitative PCR，Genome Research(1996)，6：986-994中教导。

实时PCR

将源自第一链合成的cDNA(按实施例6中的描述进行)稀释2-20倍，且通过实时定量PCR使用Applied Biosystems的Taqman 7500 FAST分析。将引物和探针与2 x Taqman Fast Universal PCR主混合物(master mix)(2x)(Applied Biosystems Cat.# 4364103)混合，并添加至4μl cDNA至最终体积为10μl。各样品一式三份进行分析。通过测试2倍稀释的cDNA得到标准曲线，该cDNA用从表达感兴趣的RNA的细胞系纯化的物质制备。使用无菌H₂O代替cDNA用于无模板对照。PCR程序：95℃保持30秒，然后进行40个循环，95℃，3秒，60℃，30秒。靶mRNA序列的相对量使用Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21从计算的阈值循环确定。

实施例8：体外分析：通过寡核苷酸反义抑制人GLI2表达

评估寡核苷酸在DU-145细胞和518A2细胞中以浓度0.8、4和20nM敲低GLI2 mRNA表达的潜能(参见图4，5和6)。数据以相对于4nM的模拟品(mock)转染的细胞的GLI2 mRNA的下调百分比示于表4。模拟品转染的细胞用乱序(scrambled)对照(阴性对照)转染。所述乱序对照为寡聚物，如具有SEQ ID No：133所示序列的寡聚物，其与靶序列不具有互补性。小写字母表示DNA单元，粗体的大写字母表示LNA如β-D-氧基-LNA单元。LNA单体中的所有胞嘧啶碱基为5-甲基胞嘧啶。下标“s”表示硫代磷酸酯连接。

表4

如表4所示，所有靶向GLI2 mRNA表达的测试的寡核苷酸在4nM的低剂量提供至少30％的抑制。SEQ ID NO 113，117，119，122，123，130和131在4nM的低剂量都给予至少50％的抑制，且SEQ ID NO 112，114，115，116，118，120，121，126，128，129和132在4nM剂量都给予至少70％的抑制。

具有SEQ ID NO 117，119，122，123，130，131，112，114，115，116，118，120，121，126，128，129和132所示序列的寡聚物(在此也称为寡聚物(oligos))在4nM剂量都给予至少60％抑制，且因此，在一些实施方案中是优选的，同样优选的为基于所示反义寡聚物序列的寡核苷酸，例如改变长度(更短或更长)和/或核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)，其也提供对GLI2 mRNA表达的良好抑制。

实施例9：体外分析：通过寡核苷酸反义抑制人GLI1表达和人GLI3表达

评估寡核苷酸在DU-145细胞和518A2细胞中以浓度0.8、4和20nM敲低GLI1 mRNA的潜能(参见图7和8)。

评估寡核苷酸在518A2细胞中以浓度0.8、4和20nM敲低GLI3 mRNA的潜能(参见图9)。

实施例10：通过LNA寡核苷酸进行的凋亡诱导

在转染前一天以1.5x10⁵细胞/孔的密度将518A2细胞接种于6-孔培养板(NUNC)并以2.8x10⁵细胞/孔的密度将DU-145细胞接种于6-孔培养板(NUNC)。当75-90％汇合时将细胞用寡核苷酸处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000(Gibco)作为转染载体。使用的寡聚物浓度为4nM和20nM(孔中终浓度)。寡聚物-脂质复合物的配制基本上按照制造商的描述使用无血清OptiMEM(Gibco)和5μg/mL LipofectAMINE 2000的最终脂质浓度进行。细胞在37℃温育4小时，且通过去除含寡聚物的培养基终止。用Optimem洗涤后，将300μl胰蛋白酶添加至各孔直到细胞从孔分开。通过向孔添加3ml HUH7培养基灭活胰蛋白酶，且通过缓慢上下吹吸细胞悬浮液而制备单一细胞悬浮液。乱序的寡聚物(oligo)(寡聚物)SEQ ID NO：133用作对照。

然后，将100μl细胞悬浮液添加至Nunc的白色96-孔板的各孔(目录号136101)(制备4块板，用于在不同时间点测量)。然后将板在37℃，95％湿度和5％ CO₂温育直到进行测试。

Caspase(胱天蛋白酶)测试：凋亡特异性的Caspase 3和7的活性使用产生荧光的(luminogenic)Caspase-Glo 3/7-底物测试(Cat#G8091，来自Promega)测定。待分析的板平衡至室温保持15分钟。将luminogenic-

3/7缓冲液与luminogenic-

3/7底物混合成平衡至室温的luminogenic-

工作溶液。然后，将100μl luminogenic-

工作溶液小心添加至96-孔板各孔的培养基中(重要地是避免起泡和孔之间的污染)。将板小心摇动1分钟，然后将其在室温温育1h，避光。在Luminoscan Ascent仪器(Thermo Labsystems)中将luminogenic活性测量为每秒的相对光单位(Relative Light Units per second)(RLU/s)。使数据关联且相对模拟品样品的平均值(其设定为1)绘图。参见图13和14。

实施例11：使用LNA寡核苷酸对增殖的体外抑制

518A2细胞如实施例10所述转染且收集至单一细胞悬浮液中(凋亡诱导)。SEQ ID NO：133用作乱序对照。之后，将100μl细胞悬浮液添加至96-孔板(”Orange Scientific”)的各孔用于MTS测试(制备4块板，用于在不同时间点测量)。然后将板在37℃，95％湿度和5％ CO₂温育直到进行测试。

测量增殖活细胞(MTS测试)

对于增殖测试，将10μl CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，G3582)添加至96-孔板各孔的培养基中，小心摇动板，且测量前在37℃，95％湿度和5％ CO₂下温育1小时。在分光光度计中在490nm测量吸光度，且从仅含培养基的孔减去该测试的背景。490nm处的吸光度与活细胞的数量成比例，且对模拟品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞随时间绘图。参见图11。

实施例12：制备SEQ ID NO：112，114，118，120，130和132和聚乙二醇的缀合物

通过使用常规亚磷酰胺化学品(phosphoramidite chemistry)将氨基烷基连接至寡聚物的5’磷酸基从而将寡聚物在5’端官能化，该氨基烷基如具有阻断基(如Fmoc)的己-1-胺，氧化所得化合物，将其脱保护且纯化以得到官能化的式(I)的寡聚物(活化的寡聚物)：

式(I)或(III)中的术语寡聚物是指本发明的寡聚物-如选自以下的寡聚物：SEQ ID NO：112，114，118，120，130和132。

活化的PEG，如式(II)所示物质：

其中该PEG部分的平均分子量为12,000，和式(I)化合物在PBS缓冲液中的溶液在室温搅拌12小时。将该反应溶液用二氯甲烷萃取三次且将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤且使溶剂在减压下蒸发。将残余物溶于双蒸水并加载至阴离子交换柱上。未反应的PEG连接基用水洗脱且产物用NH₄HCO₃溶液洗脱。汇集含纯产物的级分并冻干以得到式(III)的缀合物：

其中该寡聚物(例如，SEQ ID NO：112，114，118，120，130和132)通过可释放的连接基连接至平均分子量为12,000的PEG聚合物。

实施例13：在DU-145和518A2细胞中关于Gli1，Gli2和Gli3 mRNA表达的IC50测定

实验细节参见实施例4-9。

在DU-145细胞和518A2细胞中测定对不同GLI2寡聚物关于GLI2mRNA表达的IC₅₀值。该细胞用浓度范围为0.04nM至20nM终浓度的寡聚物转染。通过qPCR(定量PCR)在转染之后24小时测定GLI2(在本文也称为Gli2)mRNA表达。结果示于图4，5和6。所有寡聚物在转染之后24小时显示GLI2 mRNA有效的下调，且IC50在两种细胞系均低于4nM。

在DU-145细胞和518A2细胞中测定不同GLI2寡聚物关于GLI1 mRNA表达的IC₅₀值。该细胞用浓度范围为0.04nM至20nM终浓度的寡聚物转染。通过qPCR在转染之后24小时测定GLI1 mRNA表达。结果示于图7和8。该双特异性GLI2寡聚物，SEQ ID NO 112和114，显示GLI1有效的下调，且当转染之后24小时分析时在DU-145和518A2两种细胞中IC50：s都低于4nM。此外，SEQ ID NO 120显示在两种细胞系中敲低GLI1(减少的Gli1mRNA表达)，且于DU-145细胞中发现最有效的敲低。SEQ ID NO 120相对GLI1仅具有1个错配，其很可能是使用该寡聚物观察到的GLI1敲低的原因。相反，SEQ ID NO 130似乎在浓度10nM和20nM在DU-145和518A2两种细胞中诱导GLI1表达。

在用GLI2寡聚物转染后在518A2细胞中研究GLI3(在本文也称为Gli3)的表达。在DU-145细胞中没有分析该表达，因为这些细胞表达非常低水平的GLI3 mRNA(在qPCR的检测极限之下)。所有寡聚物已被设计为相对GLI3具有至少2个错配，因为其需要避免寡聚物靶向GLI3。结果示于图9。该结果显示SEQ ID NO 114显示GLI3 mRNA表达的有效的敲低，且IC50低于4nM。SEQ ID NO 118和SEQ ID NO 120显示GLI3下调，且IC50：s高于20nM(118)或介于10-20nM之间(120)，同时剩余的寡聚物在最高浓度对GLI3mRNA表达没有或仅有很小影响。

实施例14：GLI2寡聚物的血浆稳定性

将小鼠血浆(源自BomTac：NMRI小鼠的肝素锂血浆，收集于14-09-05，Taconic Europe)解冻且等分至管中，45μl血浆/管。然后，将5μl寡聚物(200μM)添加至该45μl血浆中使得终浓度为20μM。充分混合后，将样品在37℃温育0-120小时。在不同时间点(0h，24h，48h和120h)收集样品，且通过在液氮中快速冷冻样品而淬灭反应。为了分析，将样品添加至加样缓冲液且通过电泳在PAGE-测序凝胶上在变性条件下分析。

血浆稳定性测试的结果证实该寡聚物非常稳定。所有寡聚物显示体外稳定性，其中当用小鼠血浆在37℃温育时多于90％的活性化合物在24小时后保留。对于具有SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：132所示序列的寡聚物，其在3’-端具有A-残基，在24h温育后开始可检测到弱N-1带，而对任何其它寡聚物不能检测到降解。我们之前观察到在3′-端具有A-残基的寡聚物在血浆中温育后显示弱的N-1带，其很可能是由于脱嘌呤作用。结果示于图10。

实施例15：GLl2寡聚物的T_m测定

LNA寡聚物/RNA双链体的解链温度使用UV-光谱测定系统和相应的软件(Perkin Elmer，Fremont，USA)确定。向T_m-缓冲液(200nM NaCl，0.2nM EDTA，20mM NaP，pH 7.0)以终浓度1.5μM添加该LNA寡聚物及其互补RNA。通过将样品加热至95℃保持3分钟然后在室温冷却30分钟而得到双链体形成。

解链温度(T_m)值用Lambda 25 UV/VIS分光计(Perkin Elmer)测量，且收集数据并使用TempLab软件(Perkin Elmer)分析。使仪器按程序工作以将寡聚物双链体样品从20加热至95℃，之后将样品冷却至25℃。在该过程中记录260nm处的吸光度。使用解链曲线计算T_m值(表5)。

表5.UV-分光光度法测定的对抗互补RNA的LNA寡聚物的Tm。

SEQ ID NO	Tm
		112	63.8℃
114	72.2℃
		118	72.9℃
120	70.5℃
		130	65.0℃
132	60.7℃

所有GLI2寡聚物相对它们的互补RNA具有高于60℃的T_m。

实施例16：DU-145和518A2细胞中的增殖测试

MTS测试：对于增殖测试，将10μl CellTiter

AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，G3582)添加至96-孔板各孔的培养基中，小心摇动板，并在37℃，95％湿度和5％ CO₂温育1小时，然后测量。在分光光度计中在490nm测量吸光度且从仅含培养基的孔减去用于该测试的背景。

使用MTS测试在DU-145和518A2细胞中研究用GLI2寡聚物转染后的增殖。在转染后5h，24h，48h和72h分析增殖。结果显示，除了具有SEQID NO：130所示序列的寡聚物，所有GLI2寡聚物都显示在DU-145和518A2两种细胞中对增殖有效且剂量依赖性的抑制，而阴性对照对细胞增殖没有作用。抑制增殖最有效的寡聚物为具有SEQ ID NOs：114，118和120所示序列的寡聚物。进行4个独立筛选，且提供作为不同寡聚物的平均活性的最佳代表的筛选数据(图11)。

实施例17：体内分析：体内(i.v.)给药GLI寡核苷酸后小鼠肝中的ALT和AST测定。

雌性NMRI小鼠以10mg/kg的剂量在第0，3，6和9天静脉内注射具有SEQ ID NOs：112，114，118，120和132所示序列的寡核苷酸。最后一次给药之后24小时处死动物。ALT和AST水平在处死时在从小鼠获得的不含红细胞的血清中测定。丙氨酸-氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸-氨基转移酶(AST)在小鼠血清中的活性根据制造商的说明，但调节至96-孔模式使用酶ALT测试(ABX Pentra A11A01627(ALT)或A11A01629(AST)，Horiba ABX Diagnostics，France)测定。简言之，血清样品用H₂O稀释2.5倍且一式二份测试。向各孔添加50μl稀释样品或标准品(mutical，来自ABX Pentra，A11A01652)后，将200μl 37℃的ALT试剂混合物添加至各孔。动力学测量在340nm和37℃进行5分钟，间隔为30秒。将数据与2-倍稀释的标准曲线相互关联且结果表示为ALT活性(U/L)。

结果示于图12A和B。

实施例18动物模型中抗GLI寡核苷酸的抗肿瘤作用

对于所有异种移植研究，为小鼠皮下植入肿瘤。当肿瘤达到约100-200mm³(或指示的尺寸)时，将小鼠以指示的剂量和方案注射LNA-寡核苷酸。

负荷PC3肿瘤的小鼠(前列腺癌模型)用3、30和100mg/kg的具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：75所述序列的LNA寡聚物(静脉内(IV)处理；每三天4剂(q3d x 4))。在研究结束时，采集肿瘤，且人和小鼠GLI mRNA和PTCH1 mRNA水平使用对人或小鼠mRNAs的特异性的探针测试。在研究中包括阳性对照(源自用GLI2反义寡核苷酸-SEQ ID NO：10转染的细胞)，其如预期产生下调结果。用具有SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：3所述序列的寡聚物处理没有导致敲低人GLI1、GLI3或Ptch1 mRNA(数据未显示)。然而，如图15a所示，用具有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：75的寡聚物处理时观察到肿瘤上皮细胞中GLI2 mRNA一定程度的下调，尽管不能建立剂量-响应的关系。

有趣地是，GLI1，GLI2和Ptch1的小鼠mRNA显著被所有3种寡聚物下调，尽管不能建立剂量-响应的关系(参见图15b-PC3肿瘤基质)。因为GLI1(在GLI2的控制下)为直接与hedgehog途径相关的转录因子，该结果表明基质细胞可能受靶向GLI mRNAs的反义寡核苷酸的处理的影响。GLI2控制GLI1和Ptch1的水平。因此，抑制GLI2将导致下调GLI1和Ptch1。

在图15中：G1是指盐水；G2是指3mg/kg的SEQ ID No 3；G3是指30mg/kg的SEQ ID No 3；G4是指3mg/kg的SEQ ID No 19；G5是指30mg/kg的SEQ ID No 19；G6是指100mg/kg的SEQ ID No 19；G7是指3mg/kg的SEQ ID No 75；G8是指30mg/kg的SEQ ID No 75；G9是指100mg/kg的SEQ ID No75；C是指体外对照518A-黑素瘤细胞系；T是指体外对照10nM的4478(Gli2反义(SEQ ID NO 10)。术语RQ％是指相对量百分数(percentage relative quantity)；术语KD是指敲低(knock down)；术语AN09017是指该实验者使用的研究号；术语“mpk”是指mg/kg。

先前的微型-毒理学(minitox)研究显示肿瘤生长抑制(TGI)的证据(图16)。在该研究中，在DU-145前列腺癌模型中，以多剂量(0.3-30mg/kg；每三天10剂(q3d x10))测试具有SEQ ID NO：3(数据未显示)，SEQ ID NO：19(参见图16)，或SEQ ID NO：75(参见图16)所示序列的寡聚物的功效。该化合物未能显示强力的TGI，如微型毒理学实验所表明。至少对于具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：75所述序列的寡聚物，3mg/kg剂量有比其它剂量水平表现得更好的趋势。

在PC3异种移植前列腺癌模型中进行功效研究。具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：75所示序列的寡核苷酸以3-30mg/kg给药q3d x10(每三天10剂)。在第28天(在大多数组中存活率接近100％的最后一天)，对用具有SEQ ID NO：19(54％)所述序列的寡聚物和用具有SEQ ID NO：3(34％)所述序列的寡聚物(均以3mg/kg)进行的处理观察到任意处理中最大的TGI(参见图17)。在任何具体组中观察到大的响应变化。有趣的是，用具有SEQ ID NO：19所述序列的寡聚物以3mg/kg处理导致最佳TGI。

在该研究中，具有SEQ ID NO：19所述序列的寡聚物在全功效研究中给药(3mg/kg，IV)对抗PC3异种移植物(前列腺癌模型)。该研究还与ip(腹膜内)和iv(静脉内)给药途径比较。观察到在q1d(每天给药)方案中具有最佳响应的适中TGI(29％ TGI)(参见图18)。通过静脉内或腹膜内途径(在q3d方案-每三天给药)给药寡聚物导致类似功效。该研究表明GLI反义寡聚物可有效治疗前列腺癌。图18中的术语“mpk”是指“mg/kg”。

DLD-1结肠直肠癌模型为抗环王巴明(cyclopamine-resisitant)的结肠癌模型(Yauch等人Nature 2008，455：406-410)。Smo基因的外显子11中的突变存在于该癌细胞系。虽然如此，hedgehog途径仍被激活。该模型对Smo抑制剂(例如，环王巴明)体外或体内不响应。而且，已显示DLD-1不分泌hedgehog配体。因为不存在配体和/或Smo突变，该模型不太可能对环王巴明或其类似物响应，且因此是测试替代治疗，如GLI2反义治疗的良好模型。之前已用具有含MOE糖的寡核苷酸证明了生长抑制(Kim等人，2007CANCER RES.67(8)3583-3593.)。

具有SEQ ID NO：19所述序列的寡聚物的作用在DLD-1结肠直肠癌模型中以两个剂量水平(3和30mg/kg，每三天6个静脉内剂量(q3dx6(iv)))检测。结果(图19的上图)证实以每周两次(biweekly)注射3mg/kg处理动物导致TGI为23％。在30mg/kg剂量水平没有获得效果。重复该研究以证实该TGI结果。在这些初步结果的促进下，功效研究在相同模型中进行，使用3mg/kg的给药剂量，每三天10剂(q3dx10)，静脉内给药。第4剂之后，处死一群小鼠且收集肿瘤和肝样品用于GLI1/GLI2 mRNA敲低分析。监测剩余动物的TGI。在该研究中，没有观察到TGI(图19的下图)。需要另外的功效研究。

将DU-145肿瘤异种移植(前列腺癌模型)用具有SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：3所述序列的寡聚物以所示的不同剂量处理。所有三种化合物都观察到良好的抗肿瘤生长抑制(DU145模型)(图20a-c)。然而，缺少剂量响应。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：75的最有效剂量为3mg/kg(每三天3剂(q3d x 3))。图20是指q3d x 4(每三天4剂)。

用具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：75的寡聚物在PC3前列腺癌模型中进行肿瘤生长抑制研究(每三天10剂(q3d x10))(n.b.n＝3)。由于化合物有限的量，各组包含3只小鼠。所有三种化合物观察到良好至优异的抗肿瘤作用(参见图21)，尽管用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：75所述序列的化合物检测到消退的肿瘤(tumor breakthrough)。因为在第一实验中高剂量的这些化合物中的一些似乎对肿瘤生长没有抑制作用，将负荷肿瘤的动物在第41天用30mg/kg具有SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：75所述序列的反义寡聚物重复处理以确定该作用是否是重现性的。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：75显示肿瘤停滞。

上述说明书提及的所有出版物在此引入作为参考。本发明所述方法和体系的各种修改和改变将对本领域技术人员是明显的，其不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明已经关于优选实施方案进行了描述，应理解要求保护的本发明应不应限定于该具体实施方案。事实上，预期用于实施本发明的所述方式的各种修改(其对生物化学和分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的)是在以下权利要求的范围内。

Claims

1.长度为10-30个单体的寡聚物，其包含总共10-30个单体的连续序列的第一区，其中所述连续序列至少80％等同于对应于哺乳动物GLI2基因的区域或编码哺乳动物GLI2的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2基因或mRNA，如具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体。

2.根据权利要求1的寡聚物，其中所述连续序列至少80％，优选至少90％与对应于SEQ ID NO：19，3-18和20-90的任何的区域同源。

3.根据权利要求1或2的寡聚物，其中所述连续序列与SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 134的对应区的反向互补序列相比不包含错配或包含不超过1个或2个错配。

4.根据权利要求1至3任一项的寡聚物，其中该连续序列的长度为9-18个核苷酸。

5.根据权利要求1至4任一项的寡聚物，其中该连续序列包括核苷类似物。

6.根据权利要求5的寡聚物，其中该核苷类似物为糖修饰的核苷，如选自以下的糖修饰的核苷：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元；优选该核苷类似物为LNA。

7.根据权利要求5或6的寡聚物，其为缺口聚物。

8.根据权利要求1至7任一项的寡聚物，其在表达GLI2基因或mRNA的细胞中抑制GLI2基因或mRNA的表达；优选所述寡聚物选自SEQ ID NO：112，114，118，120，130和132；更优选所述寡聚物为SEQ ID No 118或SEQ ID No 132。

9.缀合物，其包含根据权利要求1至8任一项的寡聚物，和至少一种共价连接至所述寡聚物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。

10.药物组合物，其包含根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。

11.根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，其用作药物，如用于治疗高增生性病症，如癌症。

12.根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或权利要求9限定的缀合物在制备用于治疗高增生性病症，如癌症的药物中的用途。

13.治疗高增生性病症，如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有高增生性病症，如癌症的动物给药根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，或根据权利要求10的药物组合物。

14.在表达GLI2的细胞中抑制GLI2的方法，所述方法包括向所述细胞给药根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物以在所述细胞中抑制GLI2。

15.在表达GLI2的细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括向所述细胞给药足以引发凋亡的量的根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，或根据权利要求10的药物组合物的步骤。