MX2011000601A - Antagonistas de acido ribonucleico que con dirigidos a oncogen asociado a glioma 2. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos oligoméricos (oligómeros), que son dirigidos a ARNm de GLI2 en una célula, conduciendo a expresión reducida de GLI2; la reducción de expresión GLI2 es benéfica para el tratamiento de ciertos trastornos médicos, tales como trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer.

Description

ANTAGONISTAS DE ACIDO RIBONUCLEICO QUE SON DIRIGIDOS A ONCOGÉN ASOCIADO A GLIOMA 2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención provee compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de GLI2. En particular, esta invención se refiere a compuestos oligoméricos (oligómeros), que son dirigidos a ARNm de GLI2 en una célula, conduciendo a expresión reducida de GLI2. La reducción de expresión GLI2 es benéfica para una gama de trastornos médicos, tal como cáncer.

SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 1 19(e) de la solicitud provisional de E.U.A. con número de serie US 61/081 , 135 presentada el 16 de julio de 2008, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La presente solicitud también reclama prioridad de EP 08104754 presentada el 15 de julio de 2008.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El oncogén asociado a glioma 2 (gli2) es un miembro de los factores de transcripción que contienen dedo de zinc GLI, que están implicados en la determinación del destino de la célula, proliferación y patrón en muchos tipos de células y la mayoría de los órganos. El ARNm de GLI2 humano se sabe que sufre división alternativa para crear variantes de división alternativa. Los ratones transgénicos que sobre-expresan GLI2 en queratinocitos cutáneos desarrollan carcinomas de células básales múltiples, lo que indica un papel de GLI2 en el desarrollo de estos carcinomas.

Los documentos US 6,440,739 y WO03/008545 describen una gama de oligonucleótidos antisentido quiméricos modificados con 2'-metoxietilo que son dirigidos a GLI2, e indican que éstos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con expresión de GLI2. Kim et al. , 2007, Cáncer Res. 67(8) 3583-3593 reportan acerca de oligonucleótidos de antisentido quiméricos modificados con 2'-metoxietilo que se usaron para regular descendentemente de manera específica GLI2 y disminuir la proliferación de células de carcinoma hepatocelulares in vitro.

Existe la necesidad de oligómeros mejorados que son dirigidos a GLI2. Además, existe la necesidad de oligómeros que son dirigidos tanto a GLI 1 como a GLI2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee un oligómero de 10-50 monómeros, tales como 10-30 monómeros, que comprende una secuencia contigua (una primera región) de 10-50 monómeros, tal como 10-30 monómeros, en donde la secuencia contigua (la primera región) es por lo menos 80% (v.gr., 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) idéntica (homologa) a una región correspondiente a un gen o ARNm de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 de mamífero o al complemento de reversa de una región objetivo de un ácido nucleico que codifica un GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 de mamífero, tal como un gen de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero o ARNm, tal como un ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO. 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134, o variantes que ocurren naturalmente de las mismas. Por lo tanto, por ejemplo, el oligómero híbrida a una región de una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1.

La invención provee un oligómero de 10-50 monómeros, tal como 10-30 monómeros, que comprende una secuencia contigua (una primera región) de 10-50 monómeros, tal como 10-30 monómeros, en donde la secuencia contigua (la primera región) es por lo menos 80% (v.gr., 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) idéntica (homologa) a una región correspondiente a un gen o ARNn de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero, o al complemento de reversa de una región objetivo de un ácido nucleico que codifica un GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero, tal como un gen o ARNn de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero, tal como un ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134, o variantes que ocurren naturalmente de las mismas; y en donde por lo menos un monómero en la primera región es un análogo de nucleósido en donde el análogo de nucleósido es un monómero de ácido nucleico bloqueado (LNA). Por lo tanto, por ejemplo, el oligómero híbrida a una región de una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 .

La invención provee un conjugado que comprende el oligómero de conformidad con la invención, y por lo menos una porción no nucleótido o no polinucleótido convenientemente unida al oligómero.

La invención provee una composición farmacéutica que comprende el oligómero o el conjugado de conformidad con la invención, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención provee el oligómero o el conjugado de conformidad con la invención, para usarse como un medicamento, tal como para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe aquí, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer u otro trastorno hiperproliferativo.

La invención provee el uso de un oligómero o el conjugado de conformidad con la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno como se describe aquí, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer.

La invención provee un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno como se describe aquí, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer, el método comprende administrar, v.gr., una cantidad efectiva, un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de conformidad con la invención a un animal que padece o es susceptible a la enfermedad o trastorno (tal como un paciente que padece o es susceptible a la enfermedad o trastorno).

La invención provee un método de inducción de apoptosis en una célula, dicho método comprende poner en contacto la célula con un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de conformidad con la invención en una cantidad suficiente para desencadenar apoptosis, en donde dicha célula está expresando un gen o ARNm de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3.

En una modalidad, la enfermedad o trastorno o condición está asociada con sobreexpresión de gen o ARNm de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3.

La invención provee un método para la inhibición de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 en una célula que está expresando GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3, el método comprende poner en contacto la célula con un oligómero, o un conjugado de conformidad con la invención para afectar la inhibición de expresión de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 (v.gr. , para causar un efecto inhibidor sobre la expresión GLI2) en dicha célula.

La invención también se refiere a oligómeros que son dirigidos tanto a GLI1 como a GLI2, y por lo tanto la invención además provee un método para la inhibición tanto de GLI 1 como de GLI2 en una célula que está expresando GLI1 y GLI2, dicho método comprende poner en contacto la célula con un oligómero, o un conjugado de conformidad con la invención para afectar la inhibición de expresión de GLI1 y GLI2 (v.gr., para causar un efecto inhibidor sobre la expresión de GLI 1 y GLI2) en dicha célula.

La invención provee un oligómero de 10-50 monómeros, que comprende una primera región de 10-50 monómeros contiguos, en donde la secuencia de la primera región es por lo menos 80% idéntica a una región correspondiente a un gen de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero o al complemento de reversa de una región objetivo de un ácido nucleico que codifica uno de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero.

La invención además provee un conjugado que comprende el oligómero de conformidad con la invención, que comprende por lo menos una porción no nucleótido o no polinucleótido ("porción conjugada") covalentemente unida al oligómero de la invención.

La invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden un oligómero o conjugado de la invención, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención además provee un oligómero de conformidad con la invención, para usarse en medicina.

La invención además provee del uso del oligómero de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una o más de las enfermedades referidas aquí, tal como una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de trastorno hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular.

La invención además provee un oligómero de conformidad con la invención, para usarse para el tratamiento de una o más de las enfermedades referidas aqui, tales como una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular.

También se proveen composiciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden un oligómero de la invención. Además se proveen métodos para regular descendentemente la expresión de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 en células o tejidos que comprende poner en contacto dichas células o tejidos, in vitro o in vivo, con una cantidad efectiva de uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones de la invención. Además se proveen métodos para regular descendentemente la expresión de GLI 1 y GLI2 en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos, in vitro o in vivo, con una cantidad efectiva de uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones de la invención.

También se describen métodos de tratamiento de un animal (un animal no humano o un humano) que se sospecha que tiene, o es susceptible a, una enfermedad o condición, asociado con expresión, o sobre-expresión de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 al administrar al animal no humano o humano una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones farmacéuticas de la invención. Además, se proveen métodos para usar oligómeros para la inhibición de expresión de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3, y para tratamiento de enfermedades asociadas con actividad de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3.

La invención provee un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de: trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular, el método comprende administrar una cantidad efectiva de uno o más oligómeros, conjugados o composiciones farmacéuticas de los mismos a un animal que necesita el mismo (tal como un paciente que necesita el mismo).

La invención provee métodos para inhibir (v.gr, al regular descendentemente) la expresión de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 en una célula o un tejido, el método comprende el paso de poner en contacto la célula o tejido, in vitro o in vivo, con una cantidad efectiva de uno o más oligómeros, conjugados, o composiciones farmacéuticas de los mismos, para efectuar regulación descendente de expresión de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3.

La invención provee métodos para inhibir {v.gr., al regular descendentemente) la expresión de GLM y GLI2 en una célula o un tejido, el método comprende el paso de poner en contacto la célula o tejido, in vitro o in vivo, con una cantidad efectiva de uno o más oligómeros, conjugados, o composiciones farmacéuticas de los mismos, para efectuar regulación descendente de expresión de GLI 1 y GLI2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Secuencia de ARNm (ADNc) de GLI2 humano (SEQ ID NO 1 ). número de acceso a GenBank NM 005270.

Figura 2: Secuencia de ARNm (ADNc) de GLI1 humano (SEQ ID NO 2). número de acceso a GenBank NM 005269.

Figura 3: Secuencia de ARNm (ADNc) de GLI3 humano (SEQ ID NO 134). Número de acceso a GenBank NM_000168.

Figura 4: Expresión de ARNm de GLI2 en células DU-145 después de transfección con oligomeros de GLI2. Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 5. Expresión de ARNm de GLI2 en células DU-145 24 hr después de transfección con oligomeros de GLI2. Datos de Q-PCR (PCR cuantitativa) de células DU-145 24 hr después de transfección con Gli2 oligomeros (que se pueden referir como oligos). Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 6. Expresión de ARNm de GLI2 en células 518A2 24 hr después de transfección con oligomeros de GLI2. Datos de Q-PCR de células 518A2 24 hr después de transfección con oligomeros de GLI2. Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas . por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 7. Expresión de ARNm de GLI 1 en células DU-145 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Datos de Q-PCR de células DU-145 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 8. Expresión de ARNm de GLI 1 en células 518A2 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Datos de Q-PCR de células 518A2 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 9. Expresión de ARNm de GLI3 en células 518A2 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Datos de Q-PCR de células 518A2 24 hr después de transfección con oligómeros de GLI2. Los datos han sido normalizados con expresión de ARNm de GAPDH y se comparan con expresión objetivo en simulador (100%). Las células transfectadas por simulador son transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo).

Figura 10. Determinaciones de estabilidad de oligómeros de LNA en plasma de ratón. Los oligómeros de LNA se incubaron con plasma de ratón a 37°C y se tomaron alícuotas a 0, 24, 48 y 120 hr. Los resultados se visualizan por electroforesis de gel usando un gel SDS-PAGE. Un fosforotioato de ADN se usó como oligómero de control positivo que mostró degradación de los oligómeros. La SEQ ID No del oligómero usado es indicada bajo cada gel.

Figura 1 1. Prueba de proliferación en células DU-145. La prueba de MTS se llevó a cabo en células DU-145 usando concentraciones de oligómero finales de 4 nM y 20 nM. El oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 133 es un control desorganizado que se usó como control negativo (control -). El control positivo (control +) es un oligómero que es tóxico in vitro e in vivo - por lo tanto se usa como un control positivo en pruebas de toxicidad. La SEQ ID No del oligómero usado se indica en el encabezado de cada gráfica.

Figuras 12A y 12B - Actividad de ALT/AST en el suero. Un ratón en el grupo dosificado con un oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 120 que es dirigida a GLI2 fue encontrado muerto el día 6, y los animales restantes en este grupo estaban en una condición pobre y fueron sacrificados el día 6. La actividad de ALT en el grupo tratado con el oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO. SEQ ID NO. 120 fue demasiado alta para ser medible. La SEQ ID No del oligómero usado se indica bajo cada barra de la gráfica.

Figura 13. Prueba de caspasa 3/7 en células DU-145. La prueba de caspasa 3/7 se llevó a cabo en células DU-145 usando concentraciones finales de oligómero de 4 nM y 20n M. El control desorganizado se usó como control negativo. Simulación se refiere a control no oligomérico - es decir, el las células transfectadas por simulador fueron transfectadas con el agente de transfección únicamente (control negativo). La SEQ ID No del oligómero usado se indica bajo las barras de la gráfica.

Figura 14. Prueba de caspasa 3/7 en células 518A2. La prueba de caspasa 3/7 se llevó a cabo en células 518A2 usando concentraciones finales de oligómero de 4 nM y 20n M. El control desorganizado se usó como control negativo. Simulación se refiere a control no oligomérico. El oligómero tóxico (TC) es un oligómero que se ha mostrado que es tóxico tanto in vitro y in vivo y se usó como un control positivo. La SEQ ID No del oligómero usado se indica bajo las barras de la gráfica.

Figuras 15A y 15B. Efectos anti-tumorales del oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, 19 ó 75 en modelo de cáncer de próstata PC3. La SEQ ID No del oligómero usado se indica por arriba de las barras de la gráfica. En la leyenda de figura, la SEQ ID NO: relevante precede (pero separado por una coma) la cantidad respectiva. Por lo tanto, y a manera de ejemplo, "3.3 mg/kg" para G2 representa 3 mg/kg de SEQ ID NO: 3.

Figura 16. Inhibición de crecimiento de tumor (TGI) de oligómeros que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 75 en un modelo de cáncer de próstata DU-145. En la clave para las gráficas, "control desorganizado" se refiere a oligómero de control desorganizado para survivina; y "19" se refiere a SEQ ID No 19 (v.gr. "19 30 mg/kg" se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 19).

Figura 17. El estudio de eficacia (inhibición de crecimiento de tumor) de oligómeros que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 75 en modelo de cáncer de próstata PC3. En la clave para las gráficas, "3" se refiere a SEQ ID No 3 (v.gr. "3 30 mg/kg" se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 3); "control desorganizado" se refiere a oligómero de control desorganizado para survivina; "19" se refiere a SEQ ID No 19 (v.gr. " 9 30 mg/kg" se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 19); y "75" se refiere a SEQ ID No 75 (v.gr. "75 10 mg/kg" se refiere a 10 mg/kg de SEQ ID No 75).

Figura 18. El estudio de eficacia (inhibición de crecimiento de tumor) del oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 en modelo de cáncer de próstata PC3. En la clave para la gráfica, " 9" se refiere a SEQ ID No 19, "mpk" se refiere a mg/kg, "IP" se refiere a administración intraperitoneal; "IV" se refiere a administración intravenosa; "q1 x10" se refiere a 10 dosis cada día; "q2x10" se refiere a 10 dosis cada segundo día; y "q3x10" se refiere a 10 dosis cada tercer día; v.gr., "19 3 mpk;IP;q1x10" se refiere a 10 dosis cada día de 3 mg/kg de SEQ ID No 19 por administración intraperitoneal.

Figura 19. El estudio de eficacia (inhibición de crecimiento de tumor) del oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 en modelo de cáncer de colorrectal DLD-1 . En la clave para la gráfica, "19" se refiere a SEQ ID No 19; "mpk" se refiere a mg/kg; "Q3x10" se refiere a 10 dosis cada tercer día; v.gr., "19, 3 mpk; Q3x4" se refiere a 4 dosis cada tercer día de 3 mg/kg de SEQ ID No 19.

Figuras 20A, 20B y 20C. El estudio de eficacia (inhibición de crecimiento de tumor) del oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 en modelo de cáncer de próstata DU-145. En la clave para las gráficas, "3" se refiere a SEQ ID No 3, "19" se refiere a SEQ ID No 19; "75" se refiere a SEQ ID No 75; "IV" se refiere a administración intravenosa; "q3x4" se refiere a 4 dosis cada tercer día; v.gr., "3 3 mg/kg; IV;q3x4" se refiere a 4 dosis cada tercer día de 3 mg/kg de SEQ ID No 3 por administración intravenosa.

Figura 21. Inhibición de crecimiento de tumor (TGI) de oligómeros que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 75 en modelo de cáncer de próstata PC3. En la clave para las gráficas, "3" se refiere a SEQ ID No 3, "19" se refiere a SEQ ID No 19; "75" se refiere a SEQ ID No 75; "iv" se refiere a administración intravenosa; v.gr., "3, 3 mg/kg, iv" se refiere a 3 mg/kg de SEQ ID No 3 por administración intravenosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El oligómero La invención utiliza compuestos oligoméricos (referidos aquí como oligómeros), para usarse en modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero (tal como el ácido nucleico de GLI2 mostrado en SEQ ID NO: 1 ; o el ácido nucleico de GLI2 mostrado en SEQ ID NO: 2; o tal como el ácido nucleico de GLI2 mostrado en SEQ ID NO. 134), y variantes que ocurren naturalmente de dichas moléculas de ácido nucleico. El término "oligómero" en el contexto de la invención, se refiere a una molécula formada por enlaces covalentes de dos o más monómeros (es decir, un oligonucleótido). En algunas modalidades, el oligómero comprende o consiste de 10-50 monómeros covalentemente enlazados, tales como de 10-30 monómeros covalentemente enlazados, tales como 10-24 monómeros covalentemente enlazados, tales como 10-18 monómeros covalentemente enlazados, tales como 10-16 monómeros covalentemente enlazados.

En algunas modalidades, los términos "nucleósido", "nucleótido", "unidad" y "monómero" se usan intercambiablemente. Cabe reconocer que cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos o monómeros, lo que es referido es la secuencia de bases, tal como A, T, G, C o U.

El término "nucleótido", como se usa aquí, se refiere a un glucósido que comprende una porción azúcar, una porción base y un grupo covalentemente enlazado (grupo de enlace) tal como un grupo de enlace internucleótido de fosfato o fosforotioato, y cubre tanto nucleótidos que ocurren naturalmente, tales como ADN o ARN, como nucleótidos que no ocurren naturalmente que comprenden porciones azúcar y/o base modificadas, que son también referidas como "análogos de nucleótido" aquí En la presente, un solo nucleótido (unidad) también puede ser referido como una unidad de monómero o ácido nucleico.

En el campo de bioquímica, el término "nucleósido" es comúnmente usado para referirse a un glucósido que comprende una porción azúcar y una porción base, y por lo tanto se puede usar cuando se refiere a las unidades de "nucleótido", que son covalentemente enlazadas por los enlaces de ¡nternucleótido entre los nucleótidos del oligómero. En el campo de biotecnología, el término "nucleótido" a menudo se usa para referirse a un monómero o unidad de ácido nucleico, y como tal en el contexto de un oligonucleótido puede referirse a la base - tal como la "secuencia de nucleótidos", típicamente se refiere a la secuencia de nucleobase (es decir, la presencia del esqueleto de azúcar y enlaces de internucleósido están implícitos). Asimismo, particularmente en el caso de oligonucleótidos en donde uno o más de los grupos de enlace de internucleósido son modificados, el término "nucleótido" puede referirse a un "nucleósido", por ejemplo, el término "nucleótido" se puede usar, aun cuando especifique la presencia o naturaleza de los enlaces entre los nucleósidos.

El experto en la técnica entenderá que, en el contexto de la presente invención, el nucleótido 5' terminal de un oligonucleótido (oligómero) no comprende un grupo de enlace de ¡nternucleótido 5', aunque puede o no comprender un grupo 5' terminal.

El término "monómero" incluye tanto nucleósidos como desoxinucleósidos (colectivamente, "nucleósidos") que ocurren naturalmente en ácido nucleicos y que no contienen ya sea azúcares modificados o nucleobases modificadas, es decir, compuestos en los cuales un azúcar ribosa o azúcar desoxirribosa es covalentemente unida a una porción de nucleobase (base) no modificada que ocurre naturalmente (es decir, los heterociclos de purina y pirimidina adenina, guanina, citosina, timina o uracilo) y "análogos de nucleósido", que son nucleósidos ya sea que ocurren naturalmente en ácido nucleicos o no ocurren naturalmente en ácidos nucleicos, en donde ya sea la porción azúcar es distinta de un azúcar ribosa o desoxirribosa (tal como azúcares bicíclicos o azúcares modificados 2', tales como azúcares 2' sustituidos), o la porción base es modificada (v.gr., 5-metilcitosina), o ambos.

Un "monómero de ARN" es un nucleósido que contiene un azúcar ribosa y una nucleobase no modificada.

Un "monómero de ADN" es un nucleósido que contiene un azúcar desoxirribosa y una nucleobase no modificada.

Un "monómero de ácido nucleico bloqueado", "monómero bloqueado" o "monómero de LNA" es un análogo de nucleósido que tiene un azúcar bicíclico, como se describe adicionalmente más adelante.

Los términos "correspondiente a" y "corresponde a" se refieren a la comparación entre la secuencia de nucleótido/nucleósido (es decir, la nucleobase o secuencia de bases) del oligómero o secuencia de nucleótido/nucleósido contigua (una primera región) y la secuencia de nucleótido/nucleósido contigua equivalente de una secuencia adicional seleccionada ya sea de i) una sub-secuencia del complemento de reversa del objetivo de ácido nucleico, y/o ii) la secuencia de nucleótidos/nucleósidos provistos aquí. Los análogos de nucleótido/nucleósido son comparados directamente con sus nucleótidos/nucleósidos equivalentes o correspondientes. Una primera región que corresponde a una secuencia adicional bajo i) o ii) típicamente es idéntica a esa secuencia sobre la longitud de la primera región (tal como la secuencia de nucleótido/nucleósido contigua) o, como se describe aquí, en algunas modalidades, puede ser por lo menos 80% homologa a una secuencia correspondiente, tal como por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96% homologa, por lo menos 97% homologa, por lo menos 98% homologa, por lo menos 99% homologa, tal como 00% homologa (idéntica).

Los términos "análogo de nucleósido correspondiente" y "nucleósido correspondiente" indican que la porción de base en el análogo de nucleósido y la porción de base en el nucleósido son idénticas. Por ejemplo, cuando el "nucleósido" contiene un azúcar 2'-desoxirribosa ligado a una adenina, el "análogo de nucleósido correspondiente" contiene, por ejemplo, un azúcar modificado ligado a una porción de base de adenina.

Los términos "oligómero", "compuesto oligomérico" y "oligonucleótido" se usan intercambiablemente en el contexto de la invención, y se refieren a una molécula formada por enlace covalente de dos o más monómeros, por ejemplo, por un grupo fosfato (que forma un enlace de fosfodiéster entre nucleósidos) o un grupo fosforotioato (que forma un enlace de fosforotioato entre nucleósidos). El oligómero consiste de, o comprende, 10-50 monómeros, tal como 10-30 monómeros, tal como 10-24 monómeros, tal como 10-18 monómeros, tal como 10-16 monómeros. El oligómero consiste de o comprende una primera región (una secuencia contigua) que, por ejemplo, consiste de 9-30 monómeros contiguos, tal como 9-24 monómeros, tal como 9-8 monómeros, tal como 9-16 monómeros.

En algunas modalidades, los términos "secuencia contigua", "monómeros contiguos" y "región" son intercambiables.

En algunas modalidades, un oligómero comprende nucleósidos, o análogos de nucleósidos, o mezclas de los mismos como se refiere aquí. Un "oligómero LNA" u "oligonucleótido LNA" se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más monómeros de LNA.

Los análogos de nucleósido que son opcionalmente incluidos dentro de oligómeros pueden funcionar de manera similar a nucleósidos correspondientes, o pueden tener funciones mejoradas específicas. Los oligómeros en donde algunos o todos los monómeros son análogos de nucleósido son a menudo preferidos sobre las formas nativas debido a varias propiedades deseables de dichos oligómeros, tales como la capacidad para penetrar una membrana celular, buena resistencia a nucleasas extra- y/o intracelulares y alta afinidad y especificidad para el ácido nucleico objetivo. Los monómeros de LNA son particularmente preferidos, por ejemplo, para conferir una o más de las propiedades antes mencionadas.

En varias modalidades, uno o más análogos de nucleósido presentes dentro del oligómero son "silenciosos" o "equivalentes" en función al nucleósido natural correspondiente, es decir, no tienen efecto funcional sobre la forma en que el oligómero funciona para inhibir expresión de genes objetivos. Dichos análogos de nucleósido "equivalentes" sin embargo son útiles si, por ejemplo, son más fáciles o más baratos de fabricar, o son más estables bajo condiciones de almacenamiento o fabricación, o pueden incorporar una etiqueta o marcador. Típicamente, sin embargo, los análogos tendrán un efecto funcional sobre la forma en la cual el oligómero funciona para inhibir la expresión; por ejemplo, al producir afinidad de unión incrementada a la región objetivo del ácido nucleico objetivo y/o resistencia incrementada a nucleasas, tales como nucleasas intracelulares, y/o facilidad de transporte incrementada hacia el interior de la células.

Por lo tanto, en varias modalidades, los oligómeros de conformidad con la invención comprenden monómeros de nucleósido y por lo menos un monómero análogo de nucleósido, tal como un monómero de LNA, u otros monómeros de análogo de nucleósido.

El término "por lo menos uno" comprende los enteros mayores que o iguales a 1 , tales como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 1 7, 18, 19, 20, etc. En varias modalidades, tal como cuando se refiere a los objetivos de ácido nucleico o proteina de los oligómeros de la invención, el término "por lo menos uno" incluye los términos "por lo menos dos" y "por lo menos tres" y "por lo menos cuatro". Asimismo, en algunas modalidades, el término "por lo menos dos" comprende los términos "por lo menos tres" y "por lo menos cuatro".

En algunas modalidades, el oligómero comprende o consiste de 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 monómeros contiguos en la primera región.

En algunas modalidades, el oligómero comprende o consiste de 10-24 monómeros contiguos, tales como 10-22 monómeros contiguos, tales como 10-18 monómeros contiguos, tales como 10-16 monómeros contiguos, tales como 12-18 monómeros contiguos, tales como 13-17 ó 12-16 monómeros contiguos, tales como 13, 14, 15, 16 ó 24 monómeros contiguos. Cabe entender que cuando se da un intervalo para un oligómero, o longitud de secuencia de nucleótido contigua, incluye las longitudes inferior y superior provistas en el intervalo, por ejemplo de (o entre) 10-30, incluye tanto 10 como 30.

En ciertas modalidades, el oligómero comprende o consiste de 10, 11 , 12, 13 ó 14 monómeros contiguos.

En varias modalidades, el oligómero de conformidad con la invención consiste de no más de 24 monómeros, tal como no más de 22 monómeros, tal como no más de 20 monómeros, tal como no más de 18 monómeros, tal como 15, 16 ó 17 monómeros. En algunas modalidades, el oligómero de la invención comprende menos de 20 monómeros.

En varias modalidades, los oligómeros de la invención no comprenden monómeros de ARN.

En varias modalidades, los oligómeros de conformidad con la invención son moléculas lineales o son lineales como son sintetizadas. El oligómero, en dichas modalidades, es una molécula de cadena sencilla, y típicamente no comprende regiones cortas de, por ejemplo, por lo menos 3, 4 ó 5 monómeros contiguos, que son complementarios a otra región dentro del mismo oligómero de tal manera que el oligómero forma un dúplex interno. En algunas modalidades, el oligómero esencialmente no es de doble cadena, es decir, no es un ARNcs.

En algunas modalidades, el oligómero de la invención consiste de una extensión contigua de monómeros (una primera región), cuya secuencia es identificada por una SEQ ID NO descrita aquí (véase, v.gr. , cuadros 1 -3). En otras modalidades, el oligómero comprende una primera región, la región consiste de una extensión contigua de monómeros de la molécula de ácido nucleico que codifica el objetivo, y una o más regiones adicionales que consisten de por lo menos un monómero adicional. En algunas modalidades, la secuencia de la primera región es identificada por una SEQ ID NO descrita aquí.

Diseño de Gapmer Típicamente, el oligómero de la invención es un gapmer.

Un "gapmer" es un oligómero que comprende una extensión contigua de monómeros capaces de reclutar una ARNasa {v.gr., tal como ARNasaH) como se describe adicionalmente aquí, tal como una región de por lo menos 6 ó 7 monómeros de ADN, referidos aquí como región B. La región B es flanqueada en su extremos 5' y 3' por regiones respectivamente referidas como regiones A y C, cada una de las regiones A y C comprende o consiste de análogos de nucleósido, tales como análogos de nucleósido con afinidad incrementada, tales como 1-6 análogos de nucleósido. La ARNasa es preferiblemente ARNasaH, tal como ARNasa de E. coli o humana. La capacidad de un oligómero para reclutar ARNasaH es determinada cuando el oligómero es formado en un dúplex con una molécula de ARN complementaria (tal como un objetivo de ARNm).

En algunas modalidades, los monómeros que son capaces de reclutar ARNasa son seleccionados del grupo que consiste de monómeros de ADN, alfa-L-monómeros de LNA, monómeros de ADN C4'-alquilados (véase PCT/EP2009/050349 y Vester ef al., Bioorg. Med. Chem. Lert. 18 (2008) 2296 - 2300, incorporada aquí por referencia), y nucleótidos UNA (ácido nucleico no bloqueado) (véase Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 incorporada aquí por referencia). UNA es ácido nucleico no bloqueado, típicamente en donde el enlace C2'-C3' (es decir, el enlace carbono-carbono covalente entre los carbonos C2' y C3') del azúcar ha sido removido, formando un residuo de "azúcar" no bloqueado.

Típicamente, el gapmer comprende regiones, de 5' a 3', A-B-C, u opcionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en donde: la región A (A) consiste de o comprende por lo menos un análogo de nucleósido, tal como por lo menos un monómero de LNA, tal como 1 -6 análogos contiguos de nucleósido, tales como monómeros de LNA, y la región B (B) consiste de o comprende por lo menos cinco monómeros contiguos que son capaces de reclutar ARNasa (cuando se forman en un dúplex con una región objetivo complementaria de la molécula de ARN objetivo, tal como el ARNm objetivo), tal como monómeros de ADN; región C (C) consiste de o comprende por lo menos un análogo de nucleósido, tal como por lo menos un monómero de LNA, tal como 1-6 análogos contiguos de nucleósido, tales como monómeros de LNA; y región D (D), cuando está presente, consiste de o comprende 1 , 2 ó 3 monómeros, tal como monómeros de ADN.

En varias modalidades, la región A consiste de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA, tales como 2-5 análogos de nucleósido, tales como 2-5 monómeros de LNA, tales como 3 ó 4 análogos de nucleósido, tales como 3 ó 4 monómeros de LNA; y/o región C consiste de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA, tales como 2-5 análogos de nucleósido, tales como 2-5 monómeros de LNA, tales como 3 ó 4 análogos de nucleósido, tales como 3 ó 4 monómeros de LNA.

En ciertas modalidades, la región B consiste de o comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 ó 12 monómeros contiguos (v.gr., nucleótidos consecutivos) que son capaces de reclutar ARNasa, tal como ARNasaH, o 6-10, o 7-9 monómeros contiguos, tales como 10 ó 9 ó 8 monómeros contiguos que son capaces de reclutar ARNasa. En ciertas modalidades, la región B consiste de o comprende por lo menos un monómero de ADN, tal como 1-12 monómeros de ADN, preferiblemente 4-12 monómeros de ADN, muy preferiblemente 6-10 monómeros de ADN, tal como 7-10 monómeros de ADN, muy preferiblemente aún 8, 9 ó 10 monómeros de ADN.

En varias modalidades, la región A consiste de 3 ó 4 análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA, la región B consiste de 7, 8, 9 ó 10 monómeros de ADN, y la región C consiste de 3 ó 4 análogos de nucleósido, tal como monómeros de LNA. Dichos diseños incluyen (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3, y además pueden incluir la región D, que puede tener uno o 2 monómeros, tales como monómeros de ADN.

Diseños de gapmer adicionales se describen en el documento WO2004/046160, que es incorporada aquí por referencia.

El documento WO2008/1 13832 (que reclama prioridad de solicitud provisional de E.U.A. 60/977,409) incorporada aquí por referencia, se refiere a oligómeros gapmer de 'iniciadores de oligonucleótidos cortos'. En algunas modalidades, los oligómeros presentados aquí pueden ser dichos gapmers de iniciadores de oligonucleótidos cortos.

En ciertas modalidades, el oligómero consiste de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros, en donde las regiones del oligómero tienen el patrón (5'-3'), A-B-C, u opcionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en donde: la región A consiste de 1 , 2 ó 3 monómeros de análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA; la región B consiste de 7, 8, 9 ó 10 monómeros contiguos que son capaces de reclutar ARNasa, tal como ARNasaH, y la región C consiste de 1 , 2 ó 3 monomeros de análogos de nucleósido, tales como monomeros de LNA. Cuando está presente, la región D consiste de u monómero de ADN sencillo.

En ciertas modalidades, la región A consiste de 1 monómero de LNA. En ciertas modalidades, región A consiste de 2 monomeros de LNA. En ciertas modalidades, la región A consiste de 3 monomeros de LNA En ciertas modalidades, la región C consiste de 1 monómero de LNA. En ciertas modalidades, la región C consiste de 2 monomeros de LNA. En ciertas modalidades, la región C consiste de 3 monomeros de LNA. En ciertas modalidades, la región B consiste de 7 nucleósido monomeros. En ciertas modalidades, la región B consiste de 8 nucleósido monomeros. En ciertas modalidades, la región B consiste de 9 nucleósido monomeros. En ciertas modalidades, la región B consiste de 10 nucleósido monomeros. En ciertas modalidades, la región B comprende 1-10 monomeros de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 monomeros de ADN. En ciertas modalidades, la región B comprende 1 -9 monomeros de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8 monomeros de ADN. En ciertas modalidades, la región B consiste de monomeros de ADN. En ciertas modalidades, la región B comprende por lo menos un monómero de LNA que está en la configuración alfa-L, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 monomeros de LNA en la configuración alfa-L. En ciertas modalidades, la región B comprende por lo menos monómero de LNA un alfa-L-oxi. En ciertas modalidades, todos los monomeros de LNA en la región B que están en la configuración alfa-L son unidades de LNA alfa-L-oxi. En ciertas modalidades, el número de monómeros presente en las regiones A-B-C, respectivamente, son seleccionados del grupo que consiste de (monómeros de análogo de nucleósido - región B - monómeros análogo de nucleósido): 1-8-1 , 1 -8-2, 2-8-1 , 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1 , 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, o; 1 -9-1 , 1-9-2, 2-9-1 , 2- 9- 2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1 , 3-9-3, 4-9-1 , 1-9-4, o; 1 -10-1 , 1 -10-2, 2-10-1 , 2- 10- 2, 1 -10-3, 3-10-1 , 2-10-3, 3-10-2, o 3-10-3. En ciertas modalidades, el número de monómeros presentes en las regiones A-B-C del oligómero de la invención respectivamente se seleccionada del grupo que consiste de: 2-7-1 , 1 -7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, y 4-7-3. En ciertas modalidades, cada una de las regiones A y C consiste de tres monómeros de LNA, y región B consiste de 8 ó 9 ó 10 monómeros de nucleósido, preferiblemente monómeros de ADN. En ciertas modalidades, cada una de las regiones A y C consiste de dos monómeros de LNA, y la región B consiste de 8 ó 9 monómeros de nucleósido, preferiblemente monómeros de ADN.

En varias modalidades, otros diseños de gapmer incluyen aquellos en donde la región A y/o C consiste de 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleósido, tales como monómeros que contienen un azúcar 2'-O-metoxietil-ribosa (2'-MOE) o monómeros que contienen un azúcar 2'-fluoro-deoxirribosa, y la región B consiste de 8, 9, 10, 11 ó 12 nucleósidos, tales como monómeros de ADN, en donde las regiones A-B-C tienen 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 ó 4-12-4 monómeros. Los diseños de gapmer adicionales se describen en el documento WO 2007/14651 1 A2, incorporado aquí por referencia.

Enlaces de internucleósido Los monómeros de los oligómeros descritos aquí son acoplados entre si por grupos de enlace. Adecuadamente, cada monómero es enlazado al monómero adyacente 3' mediante un grupo de enlace.

El experto en la técnica entenderá que, en el contexto de la presente invención, el monómero 5' en el extremo de un oligómero no comprende un grupo de enlace 5', aunque puede o no comprender un grupo terminal 5'.

Los términos "grupo de enlace" y "enlace de internucleósido" significan un grupo capaz de acoplar covalentemente dos monómeros contiguos. Ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato (que forman un fosfodiéster entre monómeros de nucleósido adyacentes) y grupos fosforotioato (que forman un enlace de fosforotioato entre monómeros de nucleósido adyacentes).

Los grupos de enlace adecuados incluyen aquellos listados en el documento WO2007/031091 , por ejemplo en el primer párrafo de la página 34 de WO2007/031091 (incorporada aquí por referencia).

En varias modalidades, se prefiere modificar el grupo de enlace de su fosfodiéster normal a uno que es más resistente al ataque de nucleasa, tal como fosforotioato o boranofosfato - estos dos siendo digeribles por ARNasa H, permitiendo así la inhibición de antisentido mediada por ARNasa de la expresión del gen objetivo.

En algunas modalidades, los grupos de enlace que contienen azufre (S) adecuados como se provee aquí son preferidos. En varias modalidades, los grupos de enlace de fosforotioato son preferidos, particularmente para la región de espacio (B) de los gapmers. En ciertas modalidades, los enlaces de fosforotioato se usan para enlazar juntos los monomeros en las regiones flanqueadoras (A y C). En varias modalidades, los enlaces de fosforotioato se usan para enlazar regiones A o C a la región D, y para enlazar juntos los monomeros dentro de la región D.

En varias modalidades, las regiones A, B y C comprenden grupos de enlace distintos de fosforotioato, tales como enlaces de fosfodiéster, particularmente, por ejemplo cuando el uso de análogos de nucleósido protege a los grupos de enlace dentro de las regiones A y C contra degradación por endo-nucleasa - tal como cuando las regiones A y C comprenden monomeros de LNA.

En varias modalidades, los monomeros adyacentes del oligómero son enlazados unos a otros por medio de grupos fosforotioato.

Se reconoce que la inclusión de enlaces de fosfodiéster, tales como uno o dos enlaces, en un oligómero con un esqueleto de fosforotioato, particularmente con grupos de enlace fosforotioato entre o adyacentes a monomeros de análogo de nucleósido (típicamente en la región A y/o C), puede modificar la biodisponibilidad y/o bio-distribución de un oligómero -véase el documento WO2008/053314, incorporada aquí por referencia.

En algunas modalidades, tal como las modalidades referidas anteriormente, en donde es adecuado y no se indica específicamente, todos los grupos de enlace restantes son ya sea fosfodiéster o fosforotioato, o una mezcla de los mismos.

En algunas modalidades, todos los grupos de enlace de internucleósido son fosforotioato.

Cuando se refiere a secuencias de oligonucleótido gapmer específicas, tales como aquellas provistas aquí, se entenderá que, en varias modalidades, cuando los enlaces son enlaces de fosforotioato, enlaces alternativos, tales como aquellos descritos aquí se pueden usar, por ejemplo se pueden usar enlaces de fosfato (fosfodiéster), particularmente para enlaces entre análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA. Asimismo, en varias modalidades, cuando se refiere a secuencias de oligonucleótidos gapmer especificas, tales como aquellas provistas aquí, cuando uno o más monómeros en la región A o C, tal como los monómeros de LNA, comprenden una base de 5-metilcitosina, otros monómeros en esa región pueden contener bases de citosina no modificadas. Ácido nucleico objetivo Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan intercambiablemente aquí, y se definen como una molécula formada por enlace covalente de dos o más monómeros, como se describió antes. Incluyendo 2 o más monómeros, los "ácidos nucleicos" pueden ser de cualquier longitud, y el término es genérico para "oligómeros", que tienen las longitudes descritas aquí. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" incluyen moléculas de una sola cadena, doble cadena, parcialmente de doble cadena, y circulares.

En algunas modalidades, el término "ácido nucleico objetivo", como se usa aquí, se refiere a ADN o ARN (v.gr., ARNm o pre-ARNm) que codifica un polipéptido GLI2 de mamífero, tal como GLI2 humano, tal como el ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 , y variantes alélicas que ocurren naturalmente de dichos ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, el GLI2 de mamífero es un GLI2 de ratón.

En algunas modalidades, el término "ácido nucleico objetivo", como se usa aquí, se refiere a ADN o ARN (v.gr., ARNm o pre-ARNm) que codifica un polipéptido GLI 1 de mamífero, tal como GLI1 humano, tal como el ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, y variantes alélicas que ocurren naturalmente de dichos ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, el GLI1 de mamífero es un GLI1 de ratón.

En algunas modalidades, el término "ácido nucleico objetivo", como se usa aquí, se refiere a ADN o ARN (v.gr., ARNm o pre-ARNm) que codifica un polipéptido GLI3 de mamífero, tal como GLI3 humano, tal como el ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 134, y variantes alélicas que ocurren naturalmente de dichos ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, el GLI3 de mamífero es un GLI3 de ratón.

En algunas modalidades, por ejemplo cuando se usa en investigación o diagnóstico, el "ácido nucleico objetivo" es un ADNc o un oligonucleótido sintético derivado de los objetivos de ácido nucleico ADN o ARN anteriores. Los oligómeros de conformidad con la invención son típicamente capaces de hibridar al ácido nucleico objetivo.

Los ácidos nucleicos objetivos ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican GLI2 de mamífero que tienen los números de acceso a GenBank mostrados en el siguiente cuadro, junto con sus secuencias de proteina correspondientes: Los ácidos nucleicos objetivos ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican GLI1 de mamífero que tienen los números de acceso a GenBank mostrados en el siguiente cuadro, junto con sus secuencias de proteina correspondientes: Los ácidos nucleicos objetivos ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican GLI3 de mamífero que tienen los números de acceso a GenBank mostrados en el siguiente cuadro, junto con sus secuencias de proteína correspondientes: Se reconoce que los números de acceso a GenBank anteriormente descritos para ácidos nucleicos se refieren a secuencias de ADNc y no a secuencias de ARNm como tales. Las secuencia de un ARNm maduro pueden ser suministradas directamente de la secuencia de ADNc correspondiente al reemplazar las bases de timina (T) por bases de uracilo (U).

El término "variante que ocurre naturalmente del mismo" se refiere a variantes de la secuencia de polipéptido o ácido nucleico de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 que existen naturalmente dentro del grupo taxonómico definido, tal como mamíferos, tales como ratón, mono y preferiblemente humano; preferiblemente GLI2. Típicamente, cuando se refiere a "variantes que ocurren naturalmente" de un polinucléótido GLI2 el término también abarca cualquier variante alélica del ADN genómico que codifica GLI2 que se encuentra en el cromosoma 2 humano; localización 2q14 por translocalización o duplicación cromosómica, y el ARN, tal como ARNm derivado del mismo. Típicamente, cuando se refiere a "variantes que ocurren naturalmente" de un polinucléótido GLI1 , el término también abarca cualquier variante alélica del ADN genómico que codifica GLI 1 que se encuentra en el cromosoma 12 humano, localización 1 2q 13.2-q 13.3 por translocalización o duplicación cromosómica, y el ARN, tal como ARNm derivado del mismo. Típicamente, cuando se refiere a "variantes que ocurren naturalmente" de un polinucleótido GLI3, el término también abarca cualquier variante alélica del ADN genómico que codifica GLI3 que se encuentra en el cromosoma 7 humano; localización 7p13 por translocalización o duplicación cromosómica, y el ARN, tal como ARNm derivado del mismo. Las "variantes que ocurren naturalmente" también pueden incluir variantes derivadas de empalme alternativo de ARNm de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3. Cuando se refiere a una secuencia de polipéptido específica, v.gr. , el término también incluye formas de la proteína que ocurren naturalmente que por lo tanto pueden ser procesadas, v.gr. por modificaciones co- o post-traduccionales, tales como digestión de péptido de señal, digestión proteolítica, glicosilación, etc.

En ciertas modalidades, los oligómeros descritos aquí se unen a una región del ácido nucleico objetivo (la "región objetivo") ya sea por apareamiento de bases de Watson-Crick, enlace de hidrógeno de Hoogsteen, o enlace de hidrógeno de Hoogsteen revertido, entre los monómeros del oligómero y monómeros del ácido nucleico objetivo. Dicho enlace también se refiere como "hibridación." A menos que se indique otra cosa, el enlace es por apareamiento de bases complementarias de Watson-Crick (es decir, adenina con timina (ADN) o uracilo (ARN), y guanina con citosina), y el oligómero se une a la región objetivo porque la secuencia del oligómero es idéntica a, o parcialmente idéntica a, la secuencia del complemento de reversa de la región objetivo; para los propósitos de la presente, se dice que el oligómero es "complementario" o "parcialmente complementario" a la región objetivo, y el porcentaje de "complementariedad" de la secuencia de oligómero a la de la región objetivo es el porcentaje de "identidad" (homología) al complemento de reversa de la secuencia de la región objetivo.

Los términos "complemento de reversa", "complementario de reversa" y "complementariedad de reversa", como se usa aqui, son intercambiable con los términos "complemento", "complementario" y "complementariedad".

A menos que se haga claro por el contexto, la "región objetivo" en la presente será la región del ácido nucleico objetivo que tiene la secuencia que se alinea mejor con el complemento de reversa de la secuencia del oligómero especificado (o región de la misma), usando el programa y parámetros de alineación descritos aquí más adelante.

Para determinar el grado de "complementariedad" entre oligómeros de la invención (o regiones de los mismos) y la región objetivo del ácido nucleico que codifica GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero, tal como aquellos descritos aqui, el grado de "complementariedad" (también, "homología" o "identidad") se expresa como el porcentaje de identidad (o porcentaje de homología) entre la secuencia del oligómero (o región del mismo) y la secuencia de la región objetivo (o el complemento de reversa de la región objetivo) que se alinea mejor con el mismo. El porcentaje se calcula al contar el número de bases alineadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividiendo entre el número total de monómeros contiguos en el oligómero, y multiplicando por 100. En dicha comparación, si existen espacios, es preferible que dichos espacios sean simplemente discordancias más que áreas en donde el número de monómeros dentro del espacio difiere entre el oligómero de la invención y la región objetivo.

Como se usa aquí, los términos "homologa" y "homología" son intercambiables son los términos "identidad" e "idéntica".

Las alineaciones de aminoácidos y polinucleótidos, el porcentaje de identidad de secuencia, y grado de complementariedad se puede determinar para propósitos de la invención usando el algoritmo ClustalW usando valores estándares: véase http://www.ebi.ac.uk/emboss/ aliqn/index.html, Método: EMBOSS::agua (local): Espacio abierto = 10.0, Espacio extendido = 0.5, usando Blosum 62 (proteina), o DNAfull para secuencias de nucleótido/nucleobase.

Como se entenderá, dependiendo del contexto, "discordancia" se refiere a una no identidad en secuencia (como, por ejemplo, entre la secuencia de nucleobase de un oligómero y el complemento de reversa de la región objetivo a la cual se une; como por ejemplo, entre la secuencia de bases de dos ácido nucleicos que codifican GLI2 alineados), o a no complementariedad en secuencia (como, por ejemplo, entre un oligómero y la región objetivo a la cual se une).

En algunas modalidades, los oligómeros de conformidad con la invención son capaces de inhibir (tal como, por regular descendentemente) la expresión de uno o más genes objetivo de GLI2 en una célula que está expresando, o es capaz de expresar (es decir, al aliviar represión de GLI2 del gen objetivo de GLI2 en una célula) un gen objetivo de GLI2.

Los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI2, pueden hibridar a cualquier sitio a lo largo del ácido nucleico ARNm objetivo, tal como el lider no traducido 5', exones, intrones y cola no traducida 3'. Sin embargo, se prefiere que los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI2 hibriden la forma de ARNm madura del ácido nucleico objetivo.

Los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI1 , pueden hibridar a cualquier sitio a lo largo del ácido nucleico de ARNm objetivo, tal como el líder 5' no traducido, exons, intrones y cola 3' no traducida. Sin embargo, se prefiere que los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI1 hibriden a la forma de ARNm madura del ácido nucleico objetivo.

Los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI3, pueden hibridar a cualquier sitio a lo largo del ácido nucleico ARNm específico, tal como el líder no traducido 5', exones, intrones y cola no traducida 3'. Sin embargo, se prefiere que los oligómeros que son dirigidos a ARNm de GLI3 hibriden a la forma de ARNm madura del ácido nucleico objetivo.

En algunas modalidades, los oligómeros de conformidad con la invención no son dirigidos a ARNm de GLI3.

Adecuadamente, el oligómero de la invención o conjugado del mismo es capaz de regular descendentemente (v.gr., reducir o remover) la expresión del gen GLI2. En varias modalidades, el oligómero (o conjugado) de la invención puede efectuar la inhibición de GLI2, típicamente en una célula de mamífero, tal como una célula humana. En ciertas modalidades, los oligómeros de la invención, o conjugados de los mismos, se unen al ácido nucleico objetivo y afectan la inhibición de expresión del ARNm de GLI2 de por lo menos 10% o 20% comparado con el nivel de expresión en ausencia de los oligómero(s) o conjugado(s), muy preferiblemente de por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel de expresión de GLI2 en ausencia del oligómero(s) o conjugado(s).

Adecuadamente, el oligómero de la invención o conjugado del mismo es capaz de regular descendentemente (v.gr., reducir o remover) la expresión del gen GLI1. En varias modalidades, el oligómero (o conjugado) de la invención puede efectuar la inhibición de GLI 1 , típicamente en una célula de mamífero, tal como una célula humana. En ciertas modalidades, los oligómeros de la invención, o conjugados de los mismos, se unen al ácido nucleico objetivo y afectan la inhibición de expresión de ARNm de GLI 1 de por lo menos 10% o 20% comparado con el nivel de expresión en ausencia del oligómero(s) o conjugado(s), muy preferiblemente de por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% en comparación con el nivel de expresión de GLI 1 en ausencia del oligómero(s) o conjugado(s).

Adecuadamente, el oligómero de la invención o conjugado del mismo es capaz de regular descendentemente (v.gr., reducir o remover) la expresión del gen GLI3. En varias modalidades, el oligómero (o conjugado) de la invención puede efectuar la inhibición de GLI3, típicamente en una célula de mamífero, tal como una célula humana. En ciertas modalidades, los oligómeros de la invención, o conjugados de los mismos, se unen al ácido nucleico objetivo y afectan la inhibición de expresión de ARNm de GLI3 de por lo menos 10% o 20% comparado con el nivel de expresión en ausencia del oligómero(s) o conjugado(s), muy preferiblemente de por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel de expresión de GLI3 en ausencia del oligómero(s) o conjugado(s).

En algunas modalidades, dicha inhibición se ve cuando se usa de aproximadamente 0.04 nM a aproximadamente 25 nM, tal como de aproximadamente 0.8 nM a aproximadamente 20 nM del oligómero o conjugado. Como se ilustra en la presente, el tipo de célula es, en algunas modalidades, una célula humana, tal como una célula cancerosa, tal como una célula de cáncer colorrectal humana, una célula de glioma humana, una célula de carcinoma hepatocelular humana, una célula de melanoma humana, una célula de cáncer de mama humana, una célula de cáncer de pulmón humana o una célula de cáncer de próstata humana (v.gr. , in vitro - células transfectadas). La concentración de oligómero usada es, en algunas modalidades, 5 nM. La concentración de oligómero usada es, en algunas modalidades 25 nM. La concentración de oligómero usada es, en algunas modalidades 1 nM. Cabe notar que la concentración de oligómero usada para tratar la célula es en varias modalidades típicas realizada en una prueba de célula in vitro, usando transfección (Lipofecton), como se ilustra en los ejemplos. En ausencia de un agente de transfección, la concentración de oligómero requerida para obtener la regulación descendente del objetivo es típicamente de 1 µ? a 25 µ?, tal como 5 µ?.

En varias modalidades, la inhibición de ARNm es menor que 100% (es decir, menor que inhibición completa de expresión), tal como menor que 98% de inhibición, menor que 95% de inhibición, menor que 90% de inhibición, menor que 80% de inhibición, tal como menor que 70% de inhibición. En varias modalidades, la modulación de expresión de gen se puede determinar midiendo los niveles de proteína, v.gr., por métodos tales como SDS-PAGE seguido por Western blotting usando anticuerpos adecuados producidos contra la proteína objetivo. Alternativamente, la modulación de niveles de expresión se puede determinar midiendo los niveles de ARNm, v.gr., por Northern blotting o RT-PCR cuantitativa. Cuando se mide mediante los niveles de ARNm, el nivel de regulación descendente cuando se usa una dosis apropiada, tal como de aproximadamente 0.04 nM a aproximadamente 25 nM, tal como de aproximadamente 0.8 nM a aproximadamente 20 nM es, en varias modalidades, típicamente a un nivel de 10-20% de los niveles normales en ausencia del oligómero, conjugado o composición de la invención.

La invención por lo tanto provee un método para regular descendentemente o inhibir la expresión de proteína GLI2 y/o ARNm en una célula que está expresando proteína GLI2 y/o. ARNm, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del oligómero o conjugado de conformidad con la invención para regular descendentemente o inhibir la expresión de la proteina GLI2 y/o ARNm en la célula.

La invención provee un método para regular descendentemente o inhibir la expresión de proteina GLI 1 y/o ARNm en una célula que está expresando proteina GLI1 y/o ARNm, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del oligómero o conjugado de conformidad con la invención para regular descendentemente o inhibir la expresión de la proteína GLI1 y/o ARNm en la célula.

La invención provee un método para regular descendentemente o inhibir la expresión de proteína GLI3 y/o ARNm en una célula que está expresando proteína GLI3 y/o ARNm, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del oligómero o conjugado de conformidad con la invención para regular descendentemente o inhibir la expresión de la proteina GLI3 y/o ARNm en la célula.

Adecuadamente la célula es una célula de mamífero, tal como una célula humana. El contacto puede ocurrir, en algunas modalidades, in vitro. El contacto puede ocurrir, en algunas modalidades, in vivo.

Los oligómeros con la secuencia de nucleobases mostrada en SEQ ID NO 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 85, 86 (todos los motivos de secuencia) y SEQ ID NO 91 , 92 y 93 (designaciones) y SEQ ID NO 1 12, 1 13 y 14 (compuestos) son dirigidos tanto a GLI1 como a GLI2.

La invención provee un método para la preparación de oligómeros para el tratamiento de trastorno hiperproliferativos, tales como cáncer, o para la regulación descendente de GLI1 y GLI2 (y opcionalmente GLI3) en una célula que está expresando tanto GLI1 como GLI2 (y opcionalmente GLI3), dicho método comprende seleccionar una región de homología entre las secuencias de ARNm de GLI1 y GLI2 humanas, proveer un oligómero con una secuencia de nucleobases que es el complemento de reversa de dicha región de homología, y preparar un oligómero de conformidad con la invención, en donde las secuencias de nucleobases del oligómero no tiene más de 1 ó 2 discordancias a la región correspondiente de cualquiera del ARNm objetivo de GLI1 o GLI2. La región de homología por lo tanto puede comprender 1 ó 2 discordancias con la región correspondiente de las secuencias de ARNm de GLI 1 y/o GLI2, preferiblemente 1 o incluso ninguna discordancia. La región de homología puede ser tan larga como el oligómero de la invención. En algunos aspectos, dicho método además puede comprender la selección de una región de homología, en donde dicha región tiene por lo menos 2, tal como por lo menos tres o por lo menos cuatro discordancias con la región correspondiente del ARNm de GLI3. Alternativamente, dicho método además puede comprender la selección de una región de homología, en donde dicha región tiene no más de 2, tal como 1 o incluso ninguna discordancia con la región correspondiente del ARNm de GLI3.

En ciertas modalidades, las regiones objetivo de SEQ ID NO: 1 incluyen aquellas regiones que tienen secuencias que son una concordancia perfecta entre GLI 1 humana y GLI2 humana - o una subsecuencia de las mismas - tal como una región objetivo seleccionada del grupo que consiste de las siguientes regiones de la transcripción de ARNm de GLI2 humana, cuya secuencia se expone en SEQ ID NO 1 : 1 ) nucleótidos 909-926, 2) nucleótidos 933-948, 3) nucleótidos 1542-1555, 4) nucleótidos 1568-1586, 5) nucleótidos 1647-1663, 6) nucleótidos 1695-1708, 7) nucleótidos 1789-1809, y 8) nucleótidos 1839-1855.

En algunas modalidades, la región objetivos de SEQ ID NO: 1 incluyen aquellas regiones que tienen secuencias que son una concordancia perfecta entre GLI1 humana y GLI2 humana - o una subsecuencia de las mismas.

En varias modalidades, la región objetivos de SEQ ID NO: 1 incluyen aquellas regiones que tienen secuencias que son una concordancia perfecta entre GLI1 humana, GLI2 humana y GLI3 humana - o una subsecuencia de las mismas.

Se prefiere que los oligómeros de la invención no dirijan exones 1 -5 (es decir, nucleótidos 1-831 de SEQ ID NO: 1 ) debido a variantes de empalme alternativas de GLI2, que ocurren en los primeros cinco exones. Por lo tanto, en algunas modalidades, la región objetivo se encuentra dentro de la región del nucleótido 832 al nucleótido más hacia 3' de SEQ ID NO: 1. Típicamente, los oligómeros no son dirigidos a la cola de poliA de los ARNm objetivos.

En algunas modalidades los oligómeros de la invención tienen una secuencia de nucleobases que es 100% complementaria a la región correspondiente del ARNm de GLI2, y comprenden no más de 2, tal como 1 o ninguna discordancia con la región correspondiente del ARNm de GLI 1 objetivo.

En dichas modalidades, en algunos aspectos, las secuencias de nucleobases del oligómero comprenden 0, 1 ó 2 discordancias cuando se compara con las secuencias de nucleobases de la región objetivo mejor alineada del ARNm de GLI3, o en otros aspectos pueden comprender por lo menos 2, tal como 3, 4 ó 5 discordancias cuando se comparan con las secuencias de nucleobases de la región objetivo mejor alineada del ARNm de GLI3.

Adecuadamente, se considera que los oligómeros tienen una secuencia de bases con no más de 2 discordancias, tal como no más de 1 discordancia, o ninguna discordancia, cuando se compara con las secuencias de bases de las regiones objetivo mejor alineadas de SEQ ID NO: 1 (GLI2 humana) y SEQ ID NO: 2 (GLI1 humana).

En algunas modalidades, el oligómero de la invención tiene una secuencia contigua de nucleobases que tiene 0, 1 ó 2 discordancias cuando se compara con la secuencia del complemento de reversa de la región objetivo mejor alineada de SEQ ID NO 1 , tal como 1 o ninguna discordancia, y por lo menos 1 o por lo menos 2 o por lo menos 3 discordancias cuando se compara con la secuencia del complemento de reversa de la región objetivo mejor alineada de SEQ ID NO 2.

En algunas modalidades, el oligómero de la invención tiene una secuencia contigua de nucleobases que tiene 0, 1 ó 2 discordancias cuando se compara con la secuencia del complemento de reversa de la región objetivo mejor alineada de SEQ ID NO 134, tal como 1 o ninguna discordancia, y por lo menos 1 o por lo menos 2 o por lo menos 3 discordancias cuando se compara con la secuencia del complemento de reversa de la región objetivo mejor alineada de SEQ ID NO 2.

Secuencias de oliqómero En algunas modalidades, los oligómeros de la invención tienen secuencias que son idénticas a un oligómero que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3 a 90.

Además se proveen ácidos nucleicos objetivo {v.gr., ADN o ARNm que codifica GLI2) que contienen las regiones objetivo que son (completamente o perfectamente) complementarias o parcialmente-complementarias a uno o más de los oligómeros de la invención. En ciertas modalidades, los oligómeros se unen a variantes de regiones objetivo GLI2, tales como variantes alélicas (tales como ARNm derivado del gen GLI2 presente en el cromosoma 2 humano; localización 2q14). En ciertas modalidades, los oligómeros se unen a variantes de regiones objetivo de GLI1 , tales como variantes alélicas (tales como ARNm derivado del gen GLI 1 presente en el cromosoma 12 humano; localización 12q13.2-q13.3). En ciertas modalidades, los oligómeros se unen a variantes de regiones objetivoo de GLI3, tales como variantes alélicas (tal como ARNm derivado del gen GLI3 presente en el cromosoma 17 humano; localización 7p13). En algunas modalidades, una variante de una región objetivo GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 tiene por lo menos 60%, muy preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente por lo menos 80%, muy preferiblemente por lo menos 85%, muy preferiblemente por lo menos 90%, muy preferiblemente por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% de identidad de secuencia a la región objetivo que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134. Por lo tanto, en otras modalidades, los oligómeros de la invención tienen secuencias que difieren en 1 , 2 ó 3 bases cuando se comparan con un oligómero con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3 a 90. Típicamente, un oligómero de la invención que se une a una variante de una región objetivo de GLI2 es capaz de inhibir (v.gr. , al regular descendentemente) GLI2. Típicamente, un oligómero de la invención que se une a una variante de una región objetivo de GLI 1 es capaz de inhibir (v.gr., regular descendentemente) GLI1 . Típicamente, un oligómero de la invención que se une a una variante de una región objetivo de GLI3 es capaz de inhibir (v.gr., regular descendentemente) GLI3.

En otras modalidades, los oligómeros de la invención son oligómeros de LNA, por ejemplo, aquellos oligómeros que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: 91 a 132. En varias modalidades, los oligómeros de la invención son inhibidores potentes de ARNm de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 y expresión de proteína. En algunas modalidades, la frase "inhibidor potente" se refiere a un oligómero con una CI50 menor que 5 nM como se determina por la prueba de transfección de lipofectamina del ejemplo 5. En algunas modalidades, la CI50 es menor que 4 nM, tal como menor que 2 nM.

En varias modalidades, los oligómeros de la invención son oligómeros de LNA que tienen la secuencias de SEQ ID NO: 1 18 o SEQ ID NO: 132.

En varias modalidades, el oligómero comprende o consiste de una primera región que tiene una secuencia de bases que es idéntica o parcialmente idéntica a la secuencia del complemento de reversa de una región objetivo en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134. En varias modalidades, el oligómero comprende o consiste de una primera región que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3 a 90.

En ciertas modalidades, el oligómero comprende o consiste de una primera región que tiene una secuencia de bases que es completamente complementaria (perfectamente complementaria) a la secuencia de una región objetivo de un ácido nucleico que codifica uno de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 de mamífero.

En algunas modalidades, el oligómero incluye 1 , 2, 3 ó 4 (o más) discordancias en comparación con la región objetivo mejor alineada de un ácido nucleico objetiv de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 o, y aún se une suficientemente a la región objetivo para efectuar la inhibición de ARNm de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 o expresión de proteina. El efecto desestabilizador de discordancias en dúplex unido por hidrógeno de Watson-Crick, por ejemplo, puede ser compensado por la longitud incrementada del oligómero y/o un número incrementado de análogos de nucleósido, tales como monómeros de LNA, presente dentro del oligómero.

En varias modalidades, la secuencia de bases del oligómero comprende no más de 3, tal como no más de 2 discordancias comparado con la secuencia de bases de la región objetivo mejor alineada de, por ejemplo, un ácido nucleico objetivo que codifica GLI2 o GLI1 o GLI3 de mamífero.

En algunas modalidades, la secuencia de bases del oligómero comprende no más de una sola discordancia cuando se compara con la secuencia de bases de la región objetivo mejor alineada de un ácido nucleico que codifica una GLI2 de mamífero.

En varias modalidades, la secuencia de bases del oligómero de la invención, o de una primera región de la misma, es preferiblemente por lo menos 80% idéntica a un oligómero que tiene una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 3-90, tal como por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% idéntica, tal como 100% idéntica.

En ciertas modalidades, la secuencia de bases del oligómero de la invención o de una primera región de la misma es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de bases del complemento de reversa de una región objetivo presente en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134, tal como por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96% idéntica, por lo menos 97% idéntica, por lo menos 98% idéntica, por lo menos 99% idéntica, tal como 100% idéntica.

En varias modalidades, la secuencia de bases del oligómero de la invención, o de una primera región de la misma, es preferiblemente por lo menos 80% complementaria a una región objetivo de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134, tal como por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96% complementaria, por lo menos 97% complementaria, por lo menos 98% complementaria, por lo menos 99% complementaria, tal como 100% complementaria (perfectamente complementaria).

En algunas modalidades el oligómero (o una primera región del mismo) tiene una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 10, 19, 35, 59 y 75, o es seleccionada del grupo que consiste de por lo menos 9 o 10 monómeros contiguos de SEQ ID NOs: 3, 10, 19, 35, 59 y 75. En otras modalidades, la secuencia del oligómero de la invención o una primera región del mismo comprende una, dos o tres porciones de base que difieren (v.gr., son discordancias) de aquellas en oligómeros que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 3, 10, 19, 35, 59 y 75, o las secuencias de por lo menos 9 ó 10 monómeros contiguos de los mismos, cuando se alinean de manera óptima con la secuencia seleccionada o región de la misma.

En algunas modalidades, el término "primera región", como se usa aquí, se refiere a una porción (sub-secuencia) de un oligómero. Por ejemplo, el monómero 16 que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 es una subsecuencia del monómero 24 que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 87, es decir, el oligómero que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 87 comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19.

En algunas modalidades el oligómero (o una primera región del mismo) tiene una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 85 a 90, o las secuencias de por lo menos 9 ó 10 monómeros contiguos de la misma. En otras modalidades, la secuencia del oligómero (o una primera región del mismo) comprende una, dos o tres porciones de base que difieren de aquellas en oligómeros que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 85 a 90, o la secuencias de por lo menos 9 o 10 monómeros contiguos de las mismas, cuando se alinean de manera óptima con la secuencia seleccionada o región de la misma.

En varias modalidades, los oligómeros comprenden una región de 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos, tal como 12-16, que tiene una secuencia de bases idénticamente presente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos 3, 10, 19, 35, 59 y 75. En otras modalidades, los oligómeros incluyen una región que comprende una, dos o tres porciones de base que difieren de aquellas en oligómeros que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 3, 10, 19, 35, 59 y 75.

En algunas modalidades la primera región consiste de 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29 monómeros contiguos, tales como 9-22, tales como 12 -24, tales como 12 -22, tales como 12-18, tales como 12-16 monómeros. Adecuadamente, en algunas modalidades, la primera región es de la misma longitud que el oligómero de la invención.

En algunas modalidades, el oligómero comprende monómeros adicionales en los extremos 5' y/o 3' de la primera región, tal como, independientemente, 1 , 2, 3, 4 ó 5 monómeros adicionales en el extremo 5' y/o el extremo 3' del oligómero, que son no complementarios a la región objetivo. En varias modalidades, el oligómero de la invención comprende una primera región que es complementaria al objetivo, que es flanqueado 5' y/o 3' por monómeros adicionales que son complementarios a la región objetivo. En algunas modalidades, los monómeros monómeros 5' ó 3' adicionales son nucleósidos, tales como monómeros de ADN o ARN. En varias modalidades, los monómeros 5' ó 3' representan la región D como se refiere en el contexto de oligómeros de gapmer en la presente.

En algunas modalidades, el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 85, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 3, 4, 5, 6, 7 0 8.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 86, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 10, 1 1 , 12, 13, 14 ó 15.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 87, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32 ó 33.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 88, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 89, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72 ó 73.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nudeobases de conformidad con SEQ ID NO: 90, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo, tales como SEQ ID NOs 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 ó 84.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nudeobases de conformidad con SEQ ID NO: 9, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nudeobases de conformidad con SEQ ID NO: 16, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 1 2, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nudeobases de conformidad con SEQ ID NO: 17, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 1 2, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monomeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 18, o por lo menos 9 monomeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ?· 16 monomeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monomeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 34, o por lo menos 9 monomeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monomeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monomeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 35, o por lo menos 9 monomeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monomeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monomeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 50, o por lo menos 9 monomeros contiguos del mismo, tales como 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monomeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monomeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 51 , o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 52, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 53, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 54, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 55, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 56, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 57, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 58, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 59, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 74, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

En algunas modalidades el oligómero de conformidad con la invención consiste de o comprende monómeros contiguos (una primera región) que tienen una secuencia de nucleobases de conformidad con SEQ ID NO: 75, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo, tales como 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos del mismo.

Nucleósidos y análogos de nucleósidos En algunas modalidades, los términos "análogo de nucleósido" y "análogo de nucleótido" se usan intercambiablemente.

En varias modalidades, por lo menos uno de los monómeros presentes en el oligómero es un análogo de nucleósido que contiene una base modificada, tal como una base seleccionada de 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, 2-cloro-6-aminopurina, xantina e hipoxantina.

En varias modalidades, por lo menos uno de los monómeros presentes en el oligómero es un análogo de nucleósido que comprende un azúcar modificado.

En algunas modalidades, el enlace entre por lo menos 2 monómeros contiguos del oligómero es otro distinto de un enlace de fosfodiéster.

En ciertas modalidades, el oligómero incluye por lo menos un monómero que tiene una base modificada, por lo menos un monómero (que puede ser el mismo monómero) que tiene un azúcar modificado, y por lo menos un enlace de inter-monómero que no ocurre naturalmente.

Ejemplos específicos de análogos de nucleósido se describen en v.gr., Freier y Altmann; Nucí. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinión in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, y en el esquema 1 (en el cual algunos análogos de nucleósido se muestran como nucleótidos).

ESQUEMA 1 Boranofostalos El oligómero por lo tanto puede comprender o consistir de una simple secuencia de nucleosidos que ocurren naturalmente - preferiblemente monómeros de ADN, pero también posiblemente monómeros de ARN, o una combinación de nucleosidos y uno o más análogos de nucleósido. En algunas modalidades, dichos análogos de nucleósido adecuadamente incrementan la afinidad del oligómero para la región objetivo del ácido nucleico objetivo.

Ejemplos de análogos de nucleósido adecuados y preferidos se describen en el documento WO2007/031091 , o son referenciados aquí.

En algunas modalidades, el análogo de nucleósido comprende una porción azúcar modificada para proveer un grupo 2'-sustituyente, tal como azúcares 2 -O-alquil-ribosa, azúcares 2'-amino-desoxirribosa y azúcares 2'-fluoro-desoxirribosa.

En algunas modalidades, el análogo de nucleósido comprende un azúcar biciclico (LNA), que incrementa la afinidad de unión y también puede proveer alguna resistencia a la nucleasa incrementada. En varias modalidades, el monómero de LNA se selecciona de oxi-LNA (tal como beta-D-oxi-LNA, y alfa-L-oxi-LNA), y/o amino-LNA (tal como beta-D-amino-LNA y alfa-L-amino-LNA) y/o tio-LNA (tal como beta-D-tio-LNA y alfa-L-tio-LNA) y/o ENA (tal como beta-D-ENA y alfa-L-ENA). En ciertas modalidades, los monómeros de LNA sin beta-D-oxi-LNA. Los monómeros de LNA se describen adicionalmente más adelante.

En varias modalidades, la incorporación de análogos de nucleósido incrementadotes de afinidad en el oligómero, tal como monómeros de LNA o monómeros que contienen azúcares 2'-sustituidos, o la incorporación de grupos de enlace modificados provee resistencia a nucleasa incrementada. En varias modalidades, la incorporación de análogos de nucleósido de incremento de afinidad permite que el tamaño del oligómero sea reducido, y también reduce el tamaño del oligómero que se une específicamente a una región objetivo de una secuencia objetivo.

En algunas modalidades, el oligómero comprende por lo menos 1 análogo de nucleósido. En algunas modalidades, el oligómero comprende por lo menos 2 análogos de nucleósido. En algunas modalidades, el oligómero comprende de 3 a 8 análogos de nucleósido, v.gr. 6 ó 7 análogos de nucleósido. En varias modalidades, por lo menos uno de los análogos de nucleósido es un monómero ácido nucleico bloqueado (LNA); por ejemplo por lo menos 3 o por lo menos 4, o por lo menos 5, o por lo menos 6, o por lo menos 7, o 8, análogos de nucleósido son monómeros de LNA. En algunas modalidades, todos los análogos de nucleósido son monómeros de LNA.

Se reconocerá que cuando se refiere a una secuencia de base de oligómero preferida, en ciertas modalidades, los oligómeros comprenden un análogo de nucleósido correspondiente, tal como un monómero de LNA correspondiente u otro análogo de nucleósido correspondiente, que aumenta la estabilidad del dúplex (Tm) del dúplex de oligómero/región objetivo (es decir, a nálogos de nucleósido que incrementan la afinidad).

En varias modalidades, cualesquiera discordancias (es decir, no complementariedades) entre la secuencia de bases del oligómero y la secuencia de bases de la región objetivo, si están presentes, están preferiblemente localizadas en otras regiones distintas a las regiones del oligómero que contienen análogos de nucleosido incrementadotes de afinidad (v.gr., regiones A o C), tales como dentro de la región B como se refiere aquí, y/o dentro de la región D como se refiere aquí, y/o en regiones que consisten de monómeros de ADN, y/o en regiones que son 5' ó 3' a la región del oligómero que es complementaria a la región objetivo.

En algunas modalidades, los análogos de nucleosido presentes dentro del oligómero de la invención (tal como en las regiones A y C mencionadas aquí) son independientemente seleccionadas de, por ejemplo: monómeros que contienen azúcares de 2' 0-alquil-ribosa, monómeros que contienen azúcares 2'-amino-desoxirribosa, monómeros que contienen azúcares 2'-fluoro-desoxirribosa, monómeros de LNA, monómeros que contienen azúcares arabinosa ("ANA monómeros"), monómeros que contienen azúcares 2'-fluoro-arabinosa, monómeros que contienen azúcares d-arabino-hexitol ("HNA monómeros"), monómeros de intercalación como se define en Christensen (2002) Nucí. Acids. Res. 30: 4918-4925, incorporada aquí por referencia, y azúcares 2 -O-metoxietil-ribosa (2'MOE) En algunas modalidades, sólo hay uno de los tipos anteriores de análogos de nucleosido presentes en el oligómero de la invención, o región de la misma.

En ciertas modalidades, los análogos de nucleosido contienen azúcares 2'MOE, 2'-fluoro-desoxirribosa, o azúcares de LNA y, como tal, el oligómero de la invención puede comprender análogos de nucleosido que son independientemente seleccionados de estos tres tipos. En ciertas modalidades de oligómero que contienen análogos de nucleósido, por lo menos uno de dichos análogos de nucleósido contiene un azúcar 2'-MOE-ribosa, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 análogos de nucleósido que contienen azúcares 2'-MOE-ribosa. En algunas modalidades, por lo menos un análogo de nucleósido contiene un azúcar 2'-fluoro-desoxirribosa, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 análogos de nucleósido que contienen azúcares de nucleótidos de 2'-fluoro-ADN.

En varias modalidades, el oligómero de conformidad con la invención comprende por lo menos un monómero de ácido nucleico bloqueado (LNA), tal como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8 monómeros de LNA, tales como 3-7 ó 4 a 8 monómeros de LNA, o 3, 4, 5, 6 o 7 monómeros de LNA. En varias modalidades, todos los análogos de nucleósido son monómeros de LNA. En ciertas modalidades, el oligómero comprende tanto monómeros de beta-D-oxi-LNA como uno o más de los siguientes monómeros de LNA: monómeros de tio-LNA, monómeros de amino-LNA, monómeros de oxi-LNA, y/o monómeros ENA en cualquiera de las configuraciones beta-D o alfa-L, o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, las porciones de base de citosina de todos los monómeros de LNA en el oligómero son 5-metilcitosinas. En ciertas modalidades de la invención, el oligómero comprende tanto monómeros de LNA como de ADN. Típicamente, el total combinado de LNA y monómeros de ADN es 10-25, preferiblemente 10-24, preferiblemente 10-20, preferiblemente 10-18, muy preferiblemente aún 12-16.

En algunas modalidades de la invención, el oligómero o región de la misma consiste de por lo menos un monómero de LNA, y los monómeros restantes son monómeros de ADN. En ciertas modalidades, el oligómero comprende sólo monómeros de LNA y nucleósidos (tales como monómeros de ARN o ADN, muy preferiblemente aún monómeros de ADN) opcionalmente con grupos de enlace modificados tales como fosforotioato.

En varias modalidades, por lo menos uno de los análogos de nucleósido presentes en el oligómero tiene una base modificada seleccionada del grupo que consiste de 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.

LNA El término "LNA" o "monómero de LNA" se refiere a un análogo de nucleósido bicíclico, conocido como "ácido nucleico bloqueado". Cuando se usa en el contexto de un "oligonucleótido de LNA", el LNA se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más de dichos análogos de nucleósido biciclicos. Los nucleósidos de LNA se caracterizan por la presencia de un grupo enlazador (tal como un puente) entre C2' y C4' del anillo de azúcar ribosa para formar un sistema bicíclico - por ejemplo entre los grupos R4' y R2' como se describe más adelante.

El LNA usado en los compuestos de oligonucleótido (oligómeros) de la invención preferiblemente tiene la estructura de la fórmula general I Fórmula 1 en donde para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S; en donde X se selecciona de -O-, -S-, -N(RN )- y -C(R6R6")-, muy preferiblemente -O-; B se selecciona de hidrógeno, opcionalmente alcoxi de C 1.4-sustituido, opcionalmente alquilo de C -4 sustituido, opcionalmente aciloxi de C 1-4 sustituido, nucleobases que incluyen nucleobases que ocurren naturalmente y análogos de nucleobases, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelatadores, grupos reporteros y ligandos; preferiblemente, B es una nucleobase o análogo de nucleobase; P designa un enlace de internucleósido a un monómero adyacente, o un grupo 5'-terminal, dicho enlace de internucleósido o grupo 5'-terminal incluyendo opcionalmente el sustituyente R5 o igualmente aplicable al sustituyente R5'; P* designa un enlace de internucleósido a un monómero adyacente, o un grupo 3'-terminal; R4* y R2* juntos forman un grupo enlazador bivalente, tal como, por ejemplo, un birradical que consiste de 1 -4 grupos/átomos cada uno independientemente seleccionado de -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, y >C=Z, en donde Z se selecciona de -O-, -S-, y -N(Ra)-, y Ra y Rb son cada uno independientemente seleccionado de hidrógeno, alquilo de CM2 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1-12 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo de C2-12, alqueniloxi de C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo de Ci.12l alquilcarbonilo de C M2, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(Ci-6-alquil)amino, carbamoilo, mono- y di(Ci.6-alquil)-amino-carbonilo, amino-alquilo de Ci-6-aminocarbonilo, mono- y di(alquilo de Ci-6)amino-alquilo de Ci-6-aminocarbonilo, alquilo de Ci_6-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi de Ci.6l sulfono, alquilsulfoniloxi de ^.6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de Ci.G, halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquimicamente activos, grupos quelatadores, grupos reporteros y ligandos, en donde cada arilo y heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido y en donde dos sustituyentes geminal Ra y R juntos pueden formar un metilene (=CH2) opcionalmente sustituido, en donde para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S, y; Cada uno de los dos sustituyentes Rr, R2, R3, R5, R5*, R6 y R6" es independientemente seleccionado de hidrógeno, alquilo de d.12 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1-12, alcoxialquilo de C2.12, alqueniloxi de C2.12, carboxi, alcoxicarbonilo de alquilcarbonilo de C1.12, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquilo de Ci.6)amino, carbamoilo, mono- y d¡(alquilo de ^.6)-3G????-carbonilo, amino-alquilo de C 1 6-aminocarbonilo, mono- y di(alquilo de C 1. 6)amino-alquilo de Ci.6-aminocarbonilo, alquilo de C^e-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi de C1.6, sulfono, alquilsulfoniloxi de C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de C^, halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquimicamente activos, grupos quelatadores, grupos reporteros y ligandos, en donde cada arilo y heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido y en donde dos sustituyentes gemínales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, o metileno opcionalmente sustituido; en donde RN se selecciona de hidrógeno y alquilo de C -4, y en donde dos sustituyentes adyacentes (no gemínales) pueden designar un enlace adicional que da por resultado un doble enlace; y sales básicas y sales ácidas de adición de los mismos. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S.

En donde las definiciones usadas aquí se refieren a alquilo de C -4 sustituido, alquilo de C i-6 sustituido, alquilo de C1.12 sustituido, alquenilo de C2-12 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-12 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C -12 sustituido, alcoxi de C^ sustituido, alcoxi de Ci-4 sustituido, aciloxi de Ci-4 sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, metileno sustituido, acilo sustituido, aminoalquilo de Ci.6 sustituido o amida sustituida, sustituyentes adecuados preferiblemente incluyen uno o más grupos R9, en donde cada R9 es independientemente seleccionado de halógeno, alquilo de d.6, alquilo de C -6 sustituido, alquenilo de C2.6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, CN, OJ f SJ1 , NJ^z, N3, COOJL C(=X)JI , C(=X)NJ1J2, CN, 0-?(=0) ^2, 0-C(=X)J! , NJ1C(=NH)NJ1J2 y NJ1C(=X)NJ1J2 en donde X es O o S; y cada un de J! y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de Ci-6, alquilo de Ci-6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, aminoalquilo de C^, aminoalquilo de C1-6 sustituido y un grupo protector. Preferiblemente, cada uno de R9 es independientemente seleccionado de halógeno, alquilo de C1 -6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, CN, OJL SJI, J!J2, N3, COOJ1 , O-C(=X)J1, NJ1C(=NH)NJ1J2 y NJ1C(=X)NJ1J2 en donde X es O o S; y cada uno de J1 y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de Ci-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, aminoalquilo de Ci^ y un grupo protector. Los grupos protectores adecuados se describen en "Protective Groups in Organic Synthesis" de Theodora W Greene y Peter G M Wuts, 3a. edición (John Wiley & Sons, 1999).

En algunas modalidades, R4' y R2' juntos forman un grupo enlazador seleccionado de C(RARb)-C(RARB)-, C(RARb)-0-, C(RARB)-NRA-, C(RARb)-S-, y C(RARb)-C(RARB)-O-, en donde RA y RB son como se definió antes. En algunas modalidades, Ra y Rb son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno y alquilo de C1.6, y son muy preferiblemente cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno y metilo.

En algunas modalidades, R , R2, R3, R5, R5' son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci-6, alquilo de C1.6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C -6, alcoxi de C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de C1.6 y aminoalquilo de Ci-6 sustituido. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación o S.

En algunas modalidades preferidas, R1 ", R2, R3, R5, R5' son todos hidrógeno.

En algunas modalidades, Rr, R2, R3 son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de alquilo de sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de Ci.6, alcoxi de C -6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de Ci_6 y aminoalquilo de C1-6 sustituido. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S.

En algunas modalidades preferidas, R1 , R2, R3 son todos hidrógeno.

En algunas modalidades, R5 y R5' son cada uno independientemente seleccionados de H, -CH3, -CH2-CH3,- CH2-0-CH3, y -CH=CH2. Preferiblemente, en algunas modalidades, ya sea R5 o R5 es hidrógeno, y el otro grupo (R5 o R5 respectivamente) se selecciona de alquilo de CT.5, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo de C1-6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido y acilo sustituido (-C(=0)-); en donde cada grupo sustituido es mono o poli sustituido con grupos sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, alquilo de Ci.6, alquilo de C1-6 sustituido, alquenilo de C2.6, alquenilo de C2.6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, OJ-i , SJ-i , ?? 2, N3, COOJ 1 , CN, 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 y N(H)C(=X)N(H)J2 en donde X es O o S; y cada uno de J1 y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de C1-6, alquilo de C1-6 sustituido, alquenilo de C2.6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, aminoalquilo de C1.6, aminoalquilo de C1-6 sustituido y un grupo protector. En algunas modalidades ya sea R5 o R5 es sustituido alquilo de C1 -6. En algunas modalidades ya sea R5 o R5 es metileno sustituido, en donde los grupos sustituyente preferidos incluyen uno o más grupos independientemente seleccionados de F, NJi J2, N3, CN, OJ T , SJL 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ 1J2 y N(H)C(0)N(H)Ü2. En algunas modalidades cada uno de J1 y J2 es independientemente H o alquilo de C1.6. En algunas modalidades, ya sea R5 o R5 es metilo, etilo o metoximetilo. En algunas modalidades, ya sea R5 o R5* es metilo. En algunas modalidades, ya sea R5 o R5" es etilenilo. En algunas modalidades, ya sea R5 o R5 es acilo sustituido. En algunas modalidades, ya sea R5 o R5 es Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S. Ejemplos de dichos nucleótidos biciclicos 5' modificados se describen en el documento WO 2007/134181 , que es incorporado aquí por referencia en su totalidad.

En algunas modalidades B es una nucleobase, incluyendo análogos de nucleobase y nucleobases que ocurren naturalmente, tales como una purina o pirimidina, o una purina sustituida o pirimidina sustituida, o una nucleobase seleccionada de adenina, citosina, timina, adenina, uracilo, y/o una nucleobase modificada o sustituida, tal como 5-tiazolo-uracilo, 2-tio-uracilo, 5-propinil-uracilo, 2'tio-timina, 5-metilcitosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina y 2,6-diaminopurina.

En algunas modalidades, R4* y R2" juntos forman un grupo enlazador seleccionado de -C(RaRb)-0-, -C(RaRb)-C(RcRd)-0-, -C(RaR )-C(RcRd)-C(ReRf)-0-, -C(RaR )-0-C(RcRd)-, -C(RaRb)-0-C(RcRd)-0-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaR )-N(Rc)-, -C(RaR )-C(RcRd)- N(Re)-, -C(RaR )-N(Rc)-0-, -C(RaRb)-S- y -C(RaRb)-C(RcRd)-S-, en donde Ra, Rb, Rc, Rd, Re, y Rf son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo de Ci- 2 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C M2, alcoxíalquilo de C2-12, alqueniloxi de C2-i2, carboxi, alcoxicarbonilo de C1-12, alquilcarbonilo de Ci.12l formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquilo de C^amino, carbamoilo, mono- y di(alquilo de C!^-amino-carbonilo, amino-alquilo de C1-6- aminocarbonilo, mono- y di(alquilo de ^.ejamino-alquilo de C1-6-aminocarbonilo, alquilo de Ci-6-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi de C1.6, sulfono, alquilsulfoniloxi de C^, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de C1.6, halógeno, intercaladotes de ADN, grupos fotoquimicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelatadores, grupos reporteros y ligandos, en donde cada arilo y heteroarilo pueden ser opcionalmente sustituidos y en donde dos sustituyentes gemínales Ra y Rb juntos pueden designar opcionalmente metileno sustituido (=CH2). Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S.

En algunas modalidades R4' y R2 juntos designan un grupo enlazador seleccionado de -CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-0-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-0-CH2-0-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-0-, -CH2-0-CH2-, -CH(CH3)-0-, -CH(CH2-0-CH3)-0-, -CH2-CH2- y -CH=CH-. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S.

En algunas modalidades, R4* y R2 juntos forman un grupo enlazador C(RaRb)-IM(Rc)-0-, en donde Ra y Rb son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci-6, alquilo de Ci-6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2.6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de d-6, alcoxi de C1.6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de C1-6 y aminoalquilo de C1.6 sustituido, muy preferiblemente Ra y Rb are hidrógeno, y; en donde Rc se selecciona de hidrógeno, halógeno, alquilo de C^, alquilo de C1.6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2.6 sustituido, alcoxi de C^, alcoxi de C1.6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de Ci-6, aminoalquilo de C -6 sustituido, y muy preferiblemente Rc es hidrógeno.

En algunas modalidades, R4* y R2' juntos forman un grupo enlazador C(RaRb)-O-C(RcRd) -O-, en donde Ra, Rb, Rc, y Rd son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci.6, alquilo de C1 -6 sustituido, alquenilo de C2.6) alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C1-6, alcoxi de sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de C1-6 aminoalquilo de Ci_6 sustituido, y muy preferiblemente Ra, Rb, Rc, y Rd son hidrógeno.

En algunas modalidades, R4" y R2* forman un grupo enlazador -CH(Z)-0-, en donde Z se selecciona de alquilo de C1-6l alquenilo de C2-6, alquinilo de C2.6, alquilo de d-6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, acilo, sustituido acilo, amida sustituida, tiol y tiol sustituida; y en donde cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos independientemente seleccionados de halógeno, oxo, hidroxilo, OJi, NJ^, SJL N3, y CN, en donde cada uno de Ji, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo de C1 -6, y X es O, S o N^. En algunas modalidades Z es alquilo de 0^6 o alquilo de sustituido C1.6. En algunas modalidades Z es metilo. En algunas modalidades, Z es alquilo de C-i -e sustituido. En algunas modalidades dicho grupo sustituyente es alcoxi de C^. En algunas modalidades Z es CH3OCH2- Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S. Ejemplos de dichos nucleótidos bicíclicos se describen en US 7,399,845 que es incorporada aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, R1', R2, R3, R5, R5* son todos hidrógeno En algunas modalidades, R1 ', R2, R3 " son hidrógeno, y uno o ambos de R5, R5" pueden ser otros distintos de hidrógeno como se refirió antes y en el documento WO 2007/134181 .

En algunas modalidades, R4 y R2 juntos forman un grupo enlazador que comprende un grupo amino sustituido, por ejemplo, R4" y R2* juntos forman un grupo enlazador que consiste de, o comprende, el grupo -CH2-N( Rc)-, en donde Rc es alquiloxi de Ci_12. En algunas modalidades R4 y R2" juntos forman un grupo enlazador -Cq3q4-NOR-, en donde q3 y q son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de C1-6, alquilo de 01 -6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C1-6, alcoxi de Ci.6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de Ci-6 y aminoalquilo de C -6 sustituido; en donde gada grupo sustituido es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, OJi, SJ^ NJ1J2, COOJ!, CN, O-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=NH)N J 2 y N(H)C(=X=N(H)J2 en donde X es O o S; y cada uno de y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de Ci.6, alquenilo de C2.6, alquinilo de C2-6, aminoalquilo de C^ y un grupo protector. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S. Ejemplos de dichos nucleótidos biciclicos se describen en el documento WO2008/150729 que es incorporado aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, Rr, R2, R3, R5, R5 son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci_6, alquilo de Ci.6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de d-6, alcoxi de Ci_6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de Ci_6 y aminoalquilo de Ci_6 sustituido. En algunas modalidades, R1 , R2, R3, R5, R5" son todos hidrógeno. En algunas modalidades, R1 , R2, R3 son todos hidrógeno y uno o ambos de R5, R5 pueden ser otros distintos de hidrógeno como se refirió antes y en el documento WO 2007/134181. En algunas modalidades, R4" y R2" juntos forman un grupo enlazador C(RaRb)-0-, en donde Ra y Rb son cada uno independientemente seleccionados de halógeno, alquilo de C1-12, alquilo de C1.12 sustituido, alquenilo de C2-12, alquenilo de C2-12 sustituido, alquinilo de C2-12, alquinilo de C2-12 sustituido, alcoxi de CM 2, alcoxi de C1-12 sustituido, OJ1 SJi , SOJ1 , SO2J1, l O-0(=0)?«?2. N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=0)NJ1J2 y N(H)C(=S)NJ1J2; o Ra y Rb juntos son =C(q3)(q4); q3 y q4 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo de C1-C12 o alquilo de C C12 sustituido; cada grupo sustituido es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes independientemente seleccionado de halógeno, alquilo de Ci.6, alquilo de C 1 -6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6-alquinilo de C2-6 sustituido, OJ, , SJi , C(=0)J 0-C(=0)NJ1J2, N(H)C(=0)NJ1J2 y N(H)C(=S)NJ1J2; cada uno de J, y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de C1 -6, alquilo de Ci_6 sustituido, alquenilo de C2.6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2.6 sustituido, aminoalquilo de Ci_6 y aminoalquilo de C 1.6 sustituido y un grupo protector. Dichos compuestos se describen en el documento WO2009/006478, incorporado aquí en su totalidad por referencia.

En algunas modalidades, R4" y R2' forman un grupo enlazador -Q-, en donde Q es C(qi)(q2)C(q3)(q4). C(q i)=C(q3), C[=C(q i)(q2)]-C(q3)(q4) o ! , q2, q3, q4 son cada uno independientemente seleccionados de H, halógeno, alquilo de C M2, alquilo de C M 2 sustituido, alquenilo de C2-i2, alcoxi de C 1-12 sustituido, OJi , SJi , SOJ^ SO^, NJ^, N3, CN, N(H)C(=O)NJ1J2 y N(H)C(=S)NJ1J2; cada uno de Ji y J2 es independientemente seleccionado de H, alquilo de C1-6, alquenilo de C2.6, alquinilo de C2-6, aminoalquilo de C 1.6 y un grupo protector; y, opcionalmente en donde cuando Q es C(qi)(q2)(q3)(q4) y uno de q3 o q4 es CH3 entonces por lo menos uno del otro de q3 o q4 o uno de q-? y q2 es otro distinto de H. En algunas modalidades, R1 , R2, R3, R5, R5" son todos hidrógeno. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S. Ejemplos de dichos nucleótidos bicíclicos se describen en el documento WO2008/154401 que es incorporado aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, R1 ', R2, R3, R5, R5" son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci.6l alquilo de C1 -6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C1.6, alcoxi de C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo de C1 -6 y aminoalquilo de Ci_6 sustituido. En algunas modalidades, R , R2, R3, R5, R5 son todos hidrógeno. En algunas modalidades, R , R2, R3 son todos hidrógeno y uno o ambos de R5, R5 pueden ser otros distintos de hidrógeno como se refirió antes y en el documento WO 2007/134181 o WO2009/067647 (análogos de ácidos nucleicos alfa-L-biciclicos).

En algunas modalidades preferidas, el monómero de LNA presente en los compuestos de oligonucleótido de la invención preferiblemente tiene la estructura de la fórmula general II: en donde Y se selecciona de -O-, -CH20-, -S-, -NH-, N(Re) y -CH2-; Z y Z* son cada uno independientemente seleccionados de un enlace de internucleósido, RH, un grupo terminal y un grupo protector; B constituye una porción de base de nucleótido natural o non-natural (nucleobase), y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo de C1-4; Ra, Rb R°, Rd y Re son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno, opcionalmente sustituido alquilo de CM2 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1.12, alcoxialquilo de C2-12, alqueniloxi de C2.i2, carboxi, alcoxicarbonilo de CM2, alquilcarbonilo de C1.12, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquilo de Ci_6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquilo de C 1 -6)-amino-carbonilo, amino-alquilo de CLe-aminocarbonilo, mono- y di(alquilo de Ci-6)amino-alquilo de C^e-aminocarbonilo, alquilo de d^-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi de Ci-6, sulfono, alquilsulfoniloxi de C1 -6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de C-i-6, halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelatadores, grupos reporteros y ligandos, en donde cada arilo y heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido y en donde dos sustituyentes gemínales R3 y R juntos pueden designar metileno opcionalmente sustituido (=CH2); y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo de Ci-4. En algunas modalidades preferidas, R3, Rb Rc, Rd y Re son cada uno independientemente seleccionados de hidrógeno y alquilo de Ci 6l muy preferiblemente metilo. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar ya sea en orientación R o S, por ejemplo, dos isómeros estereoquimicos ilustrativos incluyen las isoformas beta-D y alfa-L, que pueden ser ilustradas como sigue: Unidades de LNA ilustrativas especificas se muestran a continuación (en el esquema 2): ESQUEMA 2 ß-D-amino-LNA El término "tio-LNA" comprende un nucleósido bloqueado en el cual Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S-. Tio-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "amino-LNA" comprende un nucleósido bloqueado en el cual Y en la fórmula general anterior se selecciona de -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, y -CH2-N(R)- en donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo de ^ .4.

Amino-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "oxi-LNA" comprende un nucleósido bloqueado en el cual Y en la fórmula general anterior representa -O-. Oxi-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "ENA" comprende un nucleósido bloqueado en el cual Y en la fórmula general anterior es -CH2-O- (en donde el átomo de oxígeno de -CH2-O- está unido a la posición 2' en relación con la base B). Re es hidrógeno o metilo.

En algunas modalidades ilustrativas, LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA, en particular beta-D-oxi-LNA.

Reclutamiento de ARNasa H En algunas modalidades, un oligómero funciona por medio de degradación por no mediada por ARNasa de un ARNm objetivo, tal como por impedimento histérico de traducción, u otros mecanismos; sin embargo, en varias modalidades, los oligómeros de la invención son capaces de reclutar una o más enzimas o complejos de ARNasa, tales como endo-ribonucleasa (ARNasa), tal como RNasa H.

Típicamente, el oligómero, comprende una región de por lo menos 6, tal como por lo menos 7 monómeros contiguos, tal como por lo menos 8 o por lo menos 9 monómeros contiguos, incluyendo 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16 monómeros contiguos que, cuando forman un dúplex con la región objetivo del ARN objetivo, es capaz de reclutar ARNasa. La región del oligómero que es capaz de reclutar ARNasa puede ser región B, como se refiere en el contexto de un gapmer como se describe aquí. En algunas modalidades, la región del oligómero que es capaz de reclutar ARNasa, tal como región B, consiste de 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 1 5, 16, 17, 18, 19 ó 20 monómeros.

El documento EP 1 222 309 provee métodos in vitro para determinar actividad de ARNasaH, que se puede usar para determinar la capacidad de los oligómeros de la invención para reclutar ARNasa H. Un oligómero se considera capaz de reclutar ARNasaH si, cuando se pone en contacto con la región complementaria del ARN objetivo, tiene una velocidad inicial, como se mide en pmol/l/min, de por lo menos 1 %, tal como por lo menos 5%, tal como por lo menos 10% o más de 20% de la velocidad inicial determinada usando un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de bases pero que contiene sólo monómeros de ADN, sin substituciones 2', con grupos de enlace de fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleótido, usando la metodología provista por los ejemplos 91-95 de EP 1 222 309, incorporada aquí por referencia.

En algunas modalidades, un oligómero se considera esencialmente incapaz de reclutar ARNasa H si, cuando se pone en contacto con la región complementaría objetivo del ARN objetivo, y ARNasa H, la velocidad inicial de ARNasaH, como se mide en pmol/l/min, es menor que 1 %, tal como menor que 5%, tal como menor que 10% o menor que 20% de la velocidad inicial determinada usando un oligonucleotido que tiene la misma secuencia de bases pero que contiene sólo monómeros de ADN, sin substituciones 2', con grupos de enlace de fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleotido, usando la metodología provista por los ejemplos 91 -95 de EP 1 222 309.

En otras modalidades, un oligómero se considera capaz de reclutar ARNasaH si, cuando se pone en contacto con la región complementaria del ARN objetivo, y ARNasa H, la velocidad inicial de ARNasaH, como se mide en pmol/l/min, es por lo menos 20%, tal como por lo menos 40%, tal como por lo menos 60%, tal como por lo menos 80% de la velocidad inicial determinada usando un oligonucleotido que tiene la misma secuencia de bases pero que contiene sólo monómeros de ADN, sin substituciones 2', con grupos de enlace de fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleotido, usando la metodología provista por los ejemplos 91-95 de EP 1 222 309.

Típicamente, la región del oligómero que forma el dúplex con la región complementaria objetivo del ARN objetivo y es capaz de reclutar ARNasa contiene monómeros de ADN y opcionalmente monómeros de LNA y forma un dúplex similar a ADN/ARN con la región objetivo. Los monómeros de LNA están preferiblemente en la configuración alfa-L, siendo particularmente preferida la alfa-L-oxi LNA.

En varias modalidades, el oligómero de la invención comprende tanto nucleósidos como análogos de nucleósido, y está en forma de un gapmer, un headmer o un mixmer.

Un "headmer" se define como un oligómero que comprende una región X y una región Y que es contiguo al mismo, con el monómero más hacia 5' de la región Y enlazado al monómero más hacia 3' de la región X. La región X comprende un tramo contiguo de análogos de nucleósido no reclutadores de ARNasa y la región Y comprende un tramo contiguo (tal como por lo menos 7 monómeros contiguos) de monómeros de ADN o monómeros de análogo de nucleósido reconocibles y digeribles por la ARNasa.

Un "tailmer" se define como un oligómero que comprende una región X y una región Y que es contiguo al mismo, con el monómero más hacia 5' de la región Y enlazado al monómero más hacia 3' de la región X. La región X comprende un tramo contiguo (tal como por lo menos 7 monómeros contiguos) de monómeros de ADN o monómeros de análogo de nucleósido reconocibles y digeribles por la ARNasa, y la región Y comprende un tramo contiguo de análogos de nucleósido no reclutadores de ARNasa.

Otros oligómeros "quiméricos", llamados "mixmers", consisten de una composición alternante de (i) monómeros de ADN o monómeros de análogo de nucleósido reconocibles y digeribles por la ARNasa, y (ii) monómeros de análogo de nucleósido de nucleósido no reclutadores de ARNasa.

En algunas modalidades, además de incrementar la afinidad del oligómero para la región objetivo, algunos análogos de nucleósido también median la unión y digestión de ARNasa (v.gr., ARNasaH). Puesto que los a-L- monómeros de LNA recluían actividad de ARNasaH a una cierta extensión, en algunas modalidades, las regiones de espacio {v.gr. , la región B como se refiere aqui) de oligómeros que contienen a-L-monómeros de LNA consisten de algunos monómeros reconocibles y digeribles por la ARNasaH, y más flexibilidad en la construcción del mixmer es introducida.

Conjugados En el contexto de esta descripción, el término "conjugado" indica un compuesto formado por la unión covalente ("conjugación") de un oligómero como se describe aquí, a una o más porciones que como tales no son ácidos nucleicos o monómeros ("porciones conjugadas"). Ejemplos de dichas porciones conjugadas incluyen compuestos macromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácido graso, residuos de azúcar, glicoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Típicamente, las proteínas pueden ser anticuerpos para una proteína objetivo. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol.

Por consiguiente, aquí se proveen conjugados que comprenden un oligómero como se describe aquí, y por lo menos una porción conjugada que no es un ácido nucleico o monómero, covalentemente unida a dicho oligómero. Por lo tanto, en ciertas modalidades en donde el oligómero de la invención consiste de monómeros contiguos que tienen una secuencia especificada de bases, como se describe aquí, el conjugado también puede comprender por lo menos una porción conjugada que está convenientemente unida al oligómero.

En varias modalidades de la invención, el oligómero es conjugado a una porción que incrementa la absorción celular de compuestos oligoméricos. El documento WO2007/031091 provee ligandos y conjugados (porciones) adecuados, que son incorporados aquí por referencia.

En varias modalidades, la conjugación (a una porción conjugada) puede incrementar la actividad, distribución celular o absorción celular del oligómero de la invención. Dichas porciones incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, polipéptidos, porciones de lípido tales como una porción colesterol, ácido cólico, un tioéter, v.gr., hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, v.gr., residuos dodecandiol o undecilo, un fosfolipido, v.gr., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1 ,2-di-o-hexadecil-rac-glicero-3-h-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, un ácido acético de adamantano, una porción palmitilo, una porción octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

En ciertas modalidades, los oligómeros de la invención son conjugados a sustancias de fármaco activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco de sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

En ciertas modalidades la porción conjugada es un esterol, tal como colesterol.

En varias modalidades, la porción conjugada comprende o consiste de un polímero positivamente cargado, tal como un péptido positivamente cargado de, por ejemplo 1 -50, tal como 2-20 tal como 3-10 residuos de aminoácido en longitud, y/o óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol - véase el documento WO 2008/034123, incorporado aquí por referencia. Adecuadamente, el polímero positivamente cargado, tal como un óxido de polialquileno puede ser unido al oligómero de la invención mediante un enlazador tal como el enlazador liberable descrito en el documento WO 2008/034123.

A manera de ejemplo, las siguientes porciones se pueden usar en los conjugados de la invención: n^¾-0^o^^^o^w-^^^°-?- 5'-OLIGÓMERO-3' o—i1— o- 5'-OLIGÓMERO-3' Oliqómeros activados El término "oligómero activado," como se usa aquí, se refiere a un oligómero de la invención que es covalentemente enlazado (es decir, funcíonalizado) a por lo menos una porción funcional que permite el enlace covalente del oligómero a una o más porciones conjugadas, es decir, porciones que como tales no son ácido nucleicos o monómeros, para formar los conjugados descritos aquí. Típicamente, una porción funcional comprenderá un grupo químico que es capaz de unirse covalentemente al oligómero mediante, v.gr., un grupo 3'-hidroxilo o el grupo NH2 exocíclico de la base adenina, un espaciador que es preferiblemente hidrofílico y un grupo terminal que es capaz de unirse a un porción conjugada (v.gr., un grupo amino, sulfhidrilo o hidroxilo). En algunas modalidades, este grupo terminal no es protegido, v.gr., es un grupo NH2. En otras modalidades, el grupo terminal es protegido, por ejemplo, por cualquier grupo protector adecuado tal como aquellos descritos en "Protective Groups in Organic Synthesis" de Theodora W. Greene y Peter G. M. Wuts, 3a. edición (John Wiley & Sons, 1999). Ejemplos de grupos protectores adecuados incluyen ésteres tales como éster de acetato, grupos araiquilo tales como bencilo, difenilmetil, o trifenilmetil, y tetrahidropiranilo. Ejemplos de grupos protectores de amino incluyen bencilo, alfa-metilbencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, ter- butoxicarbonilo, y grupos acilo tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo.

En algunas modalidades, la porción funcional es auto-digerible. , En otras modalidades, la porción funcional es biodegradable. Véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 7,087,229, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, los oligómeros de la invención son activados (es decir, funcionalizados) en el extremo 5' para permitir unión covalente de la porción conjugada al extremo 5' del oligómero. En otras modalidades, los oligómeros de la invención pueden ser funcionalizados en el extremo 3'. En otras modalidades más, los oligómeros de la invención pueden ser funcionalizados a lo largo del esqueleto o sobre la porción base heterociclica. En otras modalidades adicionales, los oligómeros de la invención can be funcionalizados a más de una posición independientemente seleccionada del extremo 5', el extremo 3', el exqueleto y la base En algunas modalidades, los oligómero activados de la invención son sintetizados al incorporar durante la síntesis uno o más monómeros que son covalentemente unidos a una porción funcional. En otras modalidades, los oligómeros activados de la invención son sintetizados con monómeros que pueden no haber sido funcionalizados, y el oligómero es funcionalizado al completarse la síntesis.

En algunas modalidades, los oligómeros son funcionalizados con un éster impedido que contiene un enlazador de aminoalquilo, en donde la porción alquilo tiene la fórmula (CH2)W, en donde w es un entero que varía de 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 6, en donde la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena recta o cadena ramificada, y en donde el grupo funcional es unido al oligómero mediante un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)WNH).

En otras modalidades, los oligómeros son funcionalizados con un éster impedido que contiene un enlazador de (CH2)w-sulfhidrilo (SH), en donde w es un entero que varia de 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 6, en donde la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena recta o cadena ramificada, y en donde el grupo funcional unido aloligómero mediante un grupo éster (-0-C(0)-(CH2)wSH). En algunas modalidades, oligonucleótidos activados con sulfhidrilo son conjugados con porciones de polímero tales como polietilenglicol o péptidos (mediante la formación de un enlace de disulfuro).

Los oligómeros activados que contienen ésteres impedidos como se describió antes pueden ser sintetizados por cualquier método conocido en la técnica, y en particular, por métodos descritos en la publicación del PCT No. WO 2008/034122 y los ejemplos en la misma, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad.

Los oligómeros activados covalentemente enlazados a por lo menos una porción funcional pueden ser sintetizados por cualquier método conocidos en la técnica, y en particular, por métodos descritos en la publicación de patente de E.U.A. No. 2004/0235773, que es incorporada aqui por referencia en su totalidad, y en Zhao et al. (2007) J. Controlled Reléase 1 19: 143-152; y Zhao et al. (2005) Bioconjugado Chem. 16:758-766.

En otras modalidades adicionales, los oligómeros de la invención son funcionalizados al introducir sulfhidrilo, grupos amino o hidroxilo en el oligómero por medio de un reactivo funcionalizante sustancialmente como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,962,029 y 4,914,210, es decir, un reactivo sustancialmente lineal que tiene una fosforamidita en un extremo enlazada a través de una cadena de espaciador hidrofilico al extremo opuesto que comprende un grupo sulfhidrilo, amino o hidroxilo protegido o no protegido. Dichos reactivos principalmente reaccionan con grupos hidroxilo del oligómero. En algunas modalidades, dichos oligómeros activados tienen un reactivo funcionalizante acoplado a un grupo 5'-hidroxilo del oligómero. En otras modalidades, los oligómeros activados tienen un reactivo funcionalizante acoplado a un grupo 3'-hidroxilo. En otras modalidades adicionales, los oligómeros activados de la invención tienen un reactivo funcionalizante acoplado a un grupo hidroxilo en el esqueleto del oligómero. En otras modalidades adicionales, el oligómero de la invención es functionalizado con más de uno de los reactivos funcionalizantes como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,962,029 y 4,914,210, incorporadas aquí por referencia en su totalidad. Los métodos de síntesis de dichos reactivos funcionalizantes y que los incorporan en monómeros u oligómeros se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,962,029 y 4,914,210.

En algunas modalidades, el 5'-terminal de un oligómero unido a fase sólida es funcionalizado con un derivado de dienil fosforamidita, seguido por conjugación del oligómero no protegido con, v.gr., un aminoácido o péptido mediante una reacción de cicloadición de Diels-Alder.

En varias modalidades, la incorporación de monómeros que contienen modificaciones de 2'-azúcar, tales como un azúcar 2'-carbamato sustituido o un azúcar de 2'-(O-pentil-N-ftalimido)-desoxirribosa en el oligómero facilita la unión covalente de porciones conjugadas a los azúcares del oligómero. En otras modalidades, un oligómero con un enlazador que contiene amino en la posición 2' de uno o más monómeros se prepara usando un reactivo tal como, por ejemplo, 5'-dimetoxitritil-2'-0-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-deoxiadenosin-3'-N,N-diisopropil-cianoetoxifosforamidita. Véase, v.gr., Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991 , 34, 7171.

En modalidades adicionales, los oligómeros de la invención tienen porciones funcionales que contienen amina en la nucleobase, incluyendo en los grupos amino de N6 purina, en el exociclico N2 de guanina, o en las posiciones N4 o 5 de citosina. En varias modalidades, dicha funcionalización se puede lograr al usar un reactivo comercial que es ya funcionalizado en la síntesis de oligómero.

Algunas porciones funcionales están comercialmente disponibles, por ejemplo, porciones enlazadoras heterobifuncionales y homobifuncionales están disponibles de Pierce Co. (Rockford, III ). Otros grupos enlazadores comercialmente disponibles son reactivos 5'-amino-modificador C6 y 3' amino-modificador, ambos disponibles de Glen Research Corporación (Sterling, Va.). 5'-amino-modificador C6 también está disponible de ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) como aminoenlace-2, y 3'-amino-modificador también está disponible de Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.).

Composiciones En varias modalidades, el oligómero de la invención se usa en formulaciones y composiciones farmacéuticas. Adecuadamente, dichas composiciones comprenden un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El documento WO2007/031091 provee diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados y preferidos - que son incorporados aquí por referencia. Las dosis, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas de dosis, combinaciones adecuadas con otros agentes terapéuticos, formulaciones de pro-fármaco también se proveen en WO2007/031091 - que también son incorporados aquí por referencia. Detalles sobre las técnicas para formulación y administración también se pueden encontrar en la última edición de "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Maack Publishing Co, Easton Pa.).

En algunas modalidades, un oligómero de la invención es covalentemente enlazado a una porción conjugada para ayudar a suministrar el oligómero a través de las membranas celulares. Un ejemplo de una porción conjugada que ayuda a suministrar el oligómero a través de las membranas celulares es una porción lipofílica, tal como colesterol. En varias modalidades, un oligómero de la invención es formulado con formulaciones de lipido que forman liposomas, tales como Lipofectamine 2000 o Lipofectamine RNAiMAX, ambas de las cuales están comercialmente disponibles de Invitrogen. En algunas modalidades, los oligómeros de la invención son formulados con una mezcla de una o más moléculas que no ocurren naturalmente similares a lipidos ("lipidoides"). Genotecas de lipidoides pueden ser sintetizadas por métodos de química sintética convencionales y varias cantidades y combinaciones de lipidoides se pueden probar a fin de desarrollar un vehículo para el suministro efectivo de un oligómero de un tamaño particular al tejido objetivo por la vía de administración escogida. Genotecas y composiciones de lipidoides adecuadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Akinc et al. (2008) Nature Biotechnol., disponible en http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ ncurrent/abs/nbt1402.html, que es incorporada aquí por referencia.

Como se usa aquí, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que retienen la actividad biológica deseada de los oligómeros aquí identificados y presentan niveles aceptables de efectos tóxicos no deseables. Ejemplos no limitantes de dichas sales se pueden formar con aminoácidos orgánicos y sales básicas de adición formadas con cationes de metal tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado a partir de amoniaco, ?,?'-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b)¡ v.gr., una sal de tanato de zinc o similar.

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención comprenden otros ingredientes activos además de un oligómero o conjugado de la invención, incluyendo agentes activos útiles para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular.

En algunas modalidades, el agente activo adicional es paclitaxel (Narita et al., Clin. Cáncer. Res. 2008 Sept 15: 14(18): 5769.

En una modalidad, la invención provee una terapia combinada, caracterizada porque la terapia comprende administrar la composición farmacéutica de conformidad con la invención, y un agente activo adicional (v.gr., paclitaxel), que en ciertas modalidades se administran antes, durante o después de la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención.

La invención también provee un kit de partes en donde una primera parte comprende por lo menos un oligómero, conjugado y/o la composición farmacéutica de conformidad con la invención y una parte adicional comprende uno o más agentes activos (v.gr. , paclitaxel) útiles para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular. Por lo tanto, se contempla que el kit de partes se puede usar en un método de tratamiento, como se refiere aquí, en donde el método comprende administrar tanto la primera parte como la parte posterior, ya sea simultáneamente o una después de la otra.

Aplicaciones El término "tratamiento", como se usa aquí, se refiere tanto a tratamiento de una enfermedad existente (v.gr., una enfermedad o trastorno como se refiere aquí más adelante), o prevención de una enfermedad, es decir, profilaxis. Por lo tanto, se reconocerá que, en ciertas modalidades, "tratamiento" incluye profilaxis.

En varias modalidades, los oligómeros de la invención se pueden utilizar como reactivos de investigación, por ejemplo, para diagnóstico, terapéutica y profilaxis.

En algunas modalidades, dichos oligómeros se pueden usar para propósitos de investigación para inhibir específicamente la expresión de proteina GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 (típicamente por degradación o inhibición del ARNm de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 y previniendo asi la formación de proteina) en células y animales experimentales, facilitando asi el análisis funcional del objetivo o una evaluación de su utilidad como un objetivo para intervención terapéutica.

En ciertas modalidades, los oligómeros se pueden usar en diagnóstico para detectar y/o para cuantificar la expresión de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 en células y tejidos por técnicas de Northern blotting, hibridación Ínsita o similares.

En varias modalidades terapéuticas, un animal no humano o un humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que se puede tratar al modular la expresión de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 se trata administrando una cantidad efectiva un oligómero de conformidad con esta invención. Además se proveen métodos de tratamiento de un mamífero, tal como tratar a un humano, que se sospecha que tiene o es susceptible de una enfermedad o condición, asociada con expresión de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3 al administrar una cantidad terapéuticamente o profilácticamente de uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones de la invención.

En ciertas modalidades, la invención también provee el uso de los oligómeros o conjugados de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno como se refiere aquí, o para un método del tratamiento de un trastorno como se refiere aquí.

En varias modalidades, la invención también provee un método para tratar un trastorno como se refiere aquí, el método comprende administrar un oligómero de conformidad con la invención como se describe aquí, y/o un conjugado de conformidad con la invención, y/o una composición farmacéutica de conformidad con la invención a un animal que necesita la misma (tal como un paciente que necesita la misma).

Como se ilustra en los ejemplos, el oligómero de la invención se puede usar para inducir apoptosis en una célula,, tal como una célula de mamífero, tal como una célula humana, que está expresando el ácido nucleico objetivo(s) - a este respecto la invención además provee un método para inducir apoptosis en una célula, el método comprende el paso de poner en contacto la célula, que está expresando GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3, con un oligómero o conjugado o composición farmacéutica de la invención en una cantidad suficiente para inducir apoptosis. La apoptosis puede ser desencadenada in vivo o in vitro. Adecuadamente el oligómero se añade en una cantidad efectiva para desencadenar apoptosis en dicha célula. En algunas modalidades la célula es una célula cancerosa.

Indicaciones médicas En ciertas modalidades terapéuticas, el trastorno que ha de ser tratado es un trastorno hiperproliferativo (v.gr., cáncer), tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma o carcinoma hepatocelular. En varias modalidades, el tratamiento de dicha enfermedad o condición de conformidad con la invención se puede i combinar con uno o más de otros tratamientos anti cancerosos, tales como radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia.

En varias modalidades, la enfermedad o trastorno está asociada con una mutación del gen GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 o un gene cuyo producto de proteina está asociado con o interactúa con GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3. Por lo tanto, en varias modalidades, el ARNm objetivo es una forma mutada de la secuencia de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3, por ejemplo, comprende una o más mutaciones puntuales sencillas o repeticiones triplicadas.

En varias modalidades, la enfermedad o trastorno está asociada con niveles anormales de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3.

El término "anormal", como se usa aquí, se refiere a sobre-expresión (v.gr., regulación ascendente) del gen GLI2 y/o GLM y/o GLI3 en una célula comparado con el nivel de expresión en una célula de un animal que no tiene una enfermedad, trastorno o condición mencionada aquí.

En algunas modalidades, un oligómero, un conjugado o una composición de conformidad con la invención se puede usar para el tratamiento de condiciones asociadas con sobre-expresión (v.gr., regulación ascendente) del gen GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3.

En otras modalidades, la enfermedad o trastorno está asociada con niveles anormales de una forma mutada de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3.

Los términos "mutación" y "forma mutada", como se usa aquí, se refiere a una variante de ácido nucleico de GLI2 mostrado en SEQ ID NO: 1 ; y/o a una variante de ácido nucleico de GLM mostrado en SEQ ID NO: 2; y/o a una variante de ácido nucleico de GLI3 mostrado en SEQ ID NO: 134. Dicha variante puede estar asociada con una enfermedad, trastorno o condición como se refiere aquí. En algunas modalidades, el término "variante", como se usa aquí, se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia de bases que difiere de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134 por una o más adiciones y/o sustituciones y/o deleciones de nucleótido. En algunas modalidades, la variante tiene por lo menos 80%, 85%, 90% o 95% de secuencia homología (identidad) con SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134. En la misma o diferente modalidad, la variante tiene no más de 60 nucleótidos adicionales y/o nucleótidos sustituidos y/o nucleótidos deletados sobre la totalidad de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO. 2 y/o SEQ ID NO: 134; tal como no más de 30 nucleótidos adicionales y/o nucleótidos sustituidos y/o nucleótidos deletados; tal como no más de 15 nucleótidos adicionales y/o nucleótidos sustituidos y/o nucleótidos deletados sobre la totalidad de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134.

En varias modalidades, la invención se refiere a métodos de modulación de la expresión del producto de gen de un gen objetivo de GLI2, es decir, un gen que es regulado por GLI2. Ejemplos de genes objetivos de GLI2 incluyen GLI 1 y PTCH1 . En algunas modalidades, la modulación de un gen objetivo de GLI2 da por resultado la expresión o actividad incrementada del gen objetivo. En otras modalidades, la modulación de un gen objetivo de GLI2 da por resultado la expresión o actividad disminuida del gen objetivo.

La invención además proveen el uso de un oligómero de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualesquiera y todas las condiciones descritas aquí.

En varias modalidades, la invención está dirigida a un método de tratamiento de un mamifero que padece o es susceptible de una condición asociada con niveles anormales de ARNm o proteina de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3, que comprende administrar al mamifero una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligómero de la invención, o un conjugado del mismo, que comprende uno o más monómeros de LNA.

Un aspecto interesante de la invención está dirigido al uso de un oligómero (compuesto) como se define aquí o un conjugado como se define aquí para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una condición como se describe aquí anteriormente.

En varias modalidades, la invención abarca un método para prevenir o tratar una enfermedad que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligómero de conformidad con la invención, o un conjugado del mismo, a un animal no humano o un humano que necesita dicha terapia.

En ciertas modalidades, los oligómeros de LNA de la invención, o conjugados de los mismos, se administran durante un período corto y no continuamente.

En ciertas modalidades de la invención, el oligómero (compuesto) es enlazado a una porción conjugada, por ejemplo, a fin de incrementar la absorción celular del oligómero. En una modalidad, la porción conjugada es un esterol, tal como colesterol.

En varias modalidades, la invención está dirigida a un método para tratar niveles anormales de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3, el método comprende administrar un oligómero de la invención, o un conjugado o una composición farmacéutica del mismo, a un animal (tal como un paciente) que necesita dicho tratamiento, y opcionalmente que comprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es conjugado al oligómero, está presente en la composición farmacéutica, o se administra en una formulación separada.

La invención también se refiere a un oligómero, una composición o un conjugado como se define aquí para usarse como un medicamento.

La invención además se refiere al uso de un oligómero, composición o un conjugado como se define aquí para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de niveles anormales de GLI2 y/o GLM y/o GLI3 o expresión de formas mutantes de GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3 (tal como variantes alélicas, tal como aquellas asociadas con una de las enfermedades referidas aquí).

Más aún, en varias modalidades, la invención se refiere a un método de tratamiento de un animal (tal como un paciente) que padece una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, tal como cáncer de próstata, glioma, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón o carcinoma hepatocelular, el método comprende el paso de administrar una composición farmacéutica como se define aquí al animal (tal como un paciente) que necesita el mismo.

En ciertas modalidades, los métodos de la invención se utilizan para el tratamiento o profilaxis contra enfermedades causadas por niveles anormales de GLI2 y/o GLI 1 y/o GLI3.

En algunas modalidades, la invención está dirigida a un método para tratar niveles anormales of GLI2 y/o GLI1 y/o GLI3, dicho método comprende administrar un oligómero de la invención, o un conjugado de la invención o una composición farmacéutica de la invención a un animal (tal como un paciente) que necesita el mismo.

Más aún, la invención se refiere a un método de tratamiento de un animal (tal como un humano) que padece una enfermedad o condición tal como aquellas referidas aquí.

Un animal (tal como un paciente) que necesita tratamiento es un animal (tal como un paciente) que padece o probablemente padece la enfermedad o trastorno.

Los animales adecuados incluyen humanos y animales no humanos.

En algunas modalidades, el animal es un mamífero. Ejemplos incluyen humanos, roedores (tales como ratas y ratones), conejos, primates, primates no humanos (tales como chimpancés y monos), caballos, ganado vacuno, ovejas, cerdos, perros y gatos.

Dosis, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas de dosis, combinaciones con otros agentes terapéuticos, formulaciones de profármaco adecuadas también se proveen en el documento WO2007/031091 - que es incorporado aquí por referencia.

La invención también provee una composición farmacéutica que comprende un oligómero o un conjugado como se describe aquí, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El documento WO2007/031091 provee diluyentes, vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables - que son incorporados aquí por referencia.

Modalidades Las siguientes modalidades de la invención se pueden usar en combinación con las otras modalidades descritas aquí. 1. Un oligómero de entre 10-30 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de entre 10-30 nucleótidos, en donde dicha secuencia de nucleótidos contigua es por lo menos 80% homologa a una región correspondiente a un gen de GLI2 de mamífero o el complemento de reversa de un ARNm, tal como SEQ ID NO: 1 o una variante que ocurre naturalmente del mismo. 2. El oligómero de conformidad con la modalidad 1 , en donde la secuencia de nucleótidos contigua es por lo menos 80% homologa a una región correspondiente a cualquiera de SEQ ID NO: 3-90. 3. El oligómero de conformidad con la modalidad 1 ó 2, en donde la secuencia de nucleótidos contigua no comprende discordancias o no más de una o dos discordancias con el complemento de reversa de la región correspondiente de SEQ ID NO 1 . 4. Un oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 -3, en donde dicha secuencia de nucleótidos contigua no comprende no discordancias o comprende no más de 1 ó 2 discordancias a una región correspondiente del complemento de reversa tanto de la secuencian de ARNm de GLI 1 (SEQ ID NO 1 ) como la secuencia de ARNm de GLI2 (SEQ ID NO 2) humanas. 5. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-4, en donde la secuencia de nucleótidos del oligómero consiste de la secuencia de nucleótidos contigua. 6. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la secuencia de nucleótidos contigua es entre 10-1 8 nucleótidos de longitud. 7. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-6, en donde la secuencia de nucleótidos contigua comprende análogos de nucleótido. 8. El oligómero de conformidad con la modalidad 7, en donde los análogos de nucleótido son nucleótidos modificados por azúcar, tales como nucleótidos modificados por azúcar seleccionados del grupo que consiste de: unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA); unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-OMe-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, y unidades de 2'- fluoro-ADN. 9. El oligómero de conformidad con la modalidad 8, en donde los análogos de nucleótido son LNA. 10. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 7-9 que es un gapmer. 1 1. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-10, que inhibe la expresión del gen o ARNm de GLI2 en una célula que está expresando gene o ARNm de GLI2. 12. Un conjugado que comprende el oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-1 1 , y por lo menos una porción no nucleótido o no polinucleótido covalentemente unida al oligómero. 13. Una composición farmacéutica que comprende el oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-1 1 , o el conjugado de conformidad con la modalidad 12, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 14. El oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-1 1 , o el conjugado de conformidad con la modalidad 12, para usarse como un medicamento, tal como para el tratamiento de trastorno hiperproliferativos, tal como cáncer. 15. El use de un oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 -1 1 , o un conjugado como se define en modalidad 12, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer. 16. Un método de tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, dicho método comprende administrar un oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-11 , o un conjugado de conformidad con la modalidad 12, o una composición farmacéutica de conformidad con la modalidad 13, a un paciente que padece, o susceptible de sufrir trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer. 17. Un método para la inhibición de GLI2 en una célula que está expresando GLI2, dicho método comprende administrar un oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-1 1 , o un conjugado de conformidad con la modalidad 12 a la célula para inhibir GLI2 en dicha célula. 18. Un método de inducción de apoptosis en una célula que está expresando GLI2, dicho método comprende el paso de administrar un oligómero de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 -1 1 , o un conjugado de conformidad con la modalidad 12, o una composición farmacéutica de conformidad con la modalidad 13, a la célula en una cantidad suficiente para desencadenar apoptosis.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Síntesis de monómero El monómero de bloques de construcción de LNA y derivados prepararon siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en los mismos - véase WO07/031081 y las referencias citadas en la misma.

EJEMPLO 2 Síntesis de oligonucleótido Los oligonucleótidos (oligómeros) fueron sintetizados de conformidad con el método descrito en el documento WO07/031081. El cuadro 1 muestra ejemplos de motivos de oligonucleótido de antisentido y de la invención.

EJEMPLO 3 Diseño de los oligonucleótidos De conformidad con la invención, una series de oligonucleótidos (oligómeros) se diseñaron para ser dirigidos a diferentes regiones del ARNm de GLI2 humano usando la secuencia publicada con número de acceso a GenBank NM_005270, presentada aquí como SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, los oligonucleótidos también se diseñaron para ser dirigidos a ARNm de GLI1 usando la secuencia publicada con número de acceso a GenBank NM 005269 presentada aquí como SEQ ID NO: 2 y/o para ser dirigidos a ARNm de GLI3 usando la secuencia publicada con número de acceso a GenBank NM 000168 presentada aquí como SEQ ID NO: 134.

CUADRO 1 Secuencias de oligonucleótido de antisentido de la invención.

Las SEQ ID NOs. 3-84 y SEQ ID NOs: 85-90 (mostradas en el cuadro 2) son secuencias de motivo oligo (oligómeros) diseñadas para ser dirigiidas a ARNm de GLI2 humano y opcionalmente ARNm de GLI1 humano y opcionalmente ARNm de GLI3 humano. (100% de homología de secuencia con ARNm de GLI1 es indicada - véase "Gli1 compl.").

SEQ ID Longitud Sitio objetivo (Gli1 Secuencia (5'-3') NO (bases) GLI2 compl.) SEQ ID ACCAGCATGTACTG 1647-1660 100(%) 14 NO: 3 SEQ ID ACCAGCATGTACT 13 100(%) NO: 4 SEQ ID CCAGCATGTACTG 13 100(%) NO: 5 SEQ ID ACCAGCATGTAC 12 100(%) NO. 6 SEQ ID CCAGCATGTACT 12 100(%) NO: 7 SEQ ID CAGCATGTACTG 12 100(%) NO: 8 SEQ ID AACGTGCACTTGTG 14 1695-1708 100(%) NO: 9 SEQ ID TTCTGGTGCTTGGC 14 1839-1852 100(%) NO: 10 SEQ ID TTCTGGTGCTTGG 13 100(%) NO: 1 1 SEQ ID TCTGGTGCTTGGC 13 100(%) NO: 12 SEQ ID TTCTGGTGCTTG 12 100(%) NO: 13 SEQ ID TCTGGTGCTTGG 12 100(%) NO: 14 SEQ ID CTGGTGCTTGGC 12 100(%) NO: 15 SEQ ID GTGAAGGCTGGGCTGA 16 1030-1045 NO: 16 SEQ ID TCTGCTTGTTCTGGTT 16 1242-1257 NO: 17 SEQ ID CCTGCTTACAGTCATC 16 1458-1473 NO: 18 SEQ ID CTCCTTGGTGCAGTCT 16 1514-1529 NO: 19 SEQ ID CTCCTTGGTGCAGTC 15 NO: 20 SEQ ID TCCTTGGTGCAGTCT 15 NO: 21 SEQ ID CTCCTTGGTGCAGT 14 NO: 22 SEQ ID TCCTTGGTGCAGTC 14 NO: 23 SEQ ID CCTTGGTGCAGTCT 14 NO: 24 SEQ ID CTCCTTGGTGCAG 13 NO: 25 SEQ ID TCCTTGGTGCAGT 13 NO: 26 SEQ ID CCTTGGTGCAGTC 13 NO: 27 SEQ ID CTTGGTGCAGTCT 13 NO: 28 SEQ ID CTCCTTGGTGCA 12 NO: 29 SEQ ID TCCTTGGTGCAG 12 NO: 30 SEQ ID CCTTGGTGCAGT 12 NO: 31 SEQ ID CTTGGTGCAGTC 12 NO: 32 SEQ ID TTGGTGCAGTCT 12 NO: 33 SEQ ID GTGTGTCTTCAGGTTC 16 1742-1757 NO: 34 SEQ ID CGCAGGTGTGTCTTCA 16 1747-1762 NO: 35 SEQ ID CGCAGGTGTGTCTTC 15 NO: 36 SEQ ID GCAGGTGTGTCTTCA 15 NO: 37 SEQ ID CGCAGGTGTGTCTT 14 NO: 38 SEQ ID GCAGGTGTGTCTTC 14 NO: 39 SEQ ID CAGGTGTGTCTTCA 14 NO: 40 SEQ ID CGCAGGTGTGTCT 13 NO: 41 SEQ ID GCAGGTGTGTCTT 13 NO: 42 SEQ ID CAGGTGTGTCTTC 13 NO: 43 SEQ ID AGGTGTGTCTTCA 13 NO. 44 SEQ ID CGCAGGTGTGTC 12 NO. 45 SEQ ID GCAGGTGTGTCT 12 NO: 46 SEQ ID CAGGTGTGTCTT 12 NO: 47 SEQ ID AGGTGTGTCTTC 12 NO: 48 SEQ ID GGTGTGTCTTCA 12 NO: 49 SEQ ID GCAGA I G I AGGG M I C 16 1871-1886 NO. 50 SEQ ID GCCACTGTCATTGTTG 16 2213-2228 NO: 51 SEQ ID CCAGGGCTGAGGTGTC 16 2301-2316 NO: 52 SEQ ID GAGGCAGCTTGGTGTT 16 2451-2466 NO: 53 SEQ ID TGCTGGTGGAGCTGTC 16 2607-2622 NO: 54 SEQ ID GTGAGGTTGAGCAGCC 16 2818-2833 NO: 55 SEQ ID GCCGCACAGGGTCGCT 16 3096-3111 NO: 56 SEQ ID ATGTAGTTTACCCTGG 16 3838-3853 NO: 57 SEQ ID CCATGAAGCCAGGCTG 16 4230-4245 NO: 58 SEQ ID TACATGTGGATCTGGC 16 4534-4549 NO: 59 SEQ ID TACATGTGGATCTGG 15 NO: 60 SEQ ID ACATGTGGATCTGGC 15 NO: 61 SEQ ID TACATGTGGATCTG 14 NO: 62 SEQ ID ACATGTGGATCTGG 14 NO: 63 SEQ ID CATGTGGATCTGGC 14 NO: 64 SEQ ID TACATGTGGATCT 13 NO: 65 SEQ ID ACATGTGGATCTG 13 NO: 66 SEQ ID CATGTGGATCTGG 13 NO: 67 SEQ ID ATGTGGATCTGGC 13 NO: 68 SEQ ID TACATGTGGATC 12 NO: 69 SEQ ID ACATGTGGATCT 12 NO: 70 SEQ ID CATGTGGATCTG 12 NO: 71 SEQ ID ATGTGGATCTGG 12 NO: 72 SEQ ID TGTGGATCTGGC 12 NO: 73 SEQ ID GCCATGTTGCTGATGC 16 4864-4879 NO: 74 SEQ ID TCAGATTCAAACCCA 15 5330-5344 NO: 75 SEQ ID TCAGATTCAAACCC 14 NO: 76 SEQ ID CAGATTCAAACCCA 14 NO: 77 SEQ ID TCAGATTCAAACC 13 NO: 78 SEQ ID CAGATTCAAACCC 13 NO: 79 SEQ ID AGATTCAAACCCA 13 NO: 80 SEQ ID TCAGATTCAAAC 12 NO: 81 SEQ ID CAGATTCAAACC 12 NO: 82 SEQ ID AGATTCAAACCC 12 NO. 83 SEQ ID GATTCAAACCCA 12 NO: 84 CUADRO 2 Muestra los motivos de secuencia de 24 meros a partir de los cuales los oligómeros de la invención pueden ser diseñados - las negrillas representan motivos de secuencia de oligómero como se muestra en el cuadro 1.

CUADRO 3 Diseños de oligonucleótidos de la invención. En las SEQ ID NOs: 91-1 1 1 las letras mayúsculas indican unidades análogas (monómeros) de nucleotido (nucleósido), tales como aquellas descritas aquí, tales como unidades LNA. Las letras minúsculas representan monómeros de nucleótido (ADN). En algunas modalidades, los enlaces de internucleósido entre nucleótidos son todos fosforotioato. En algunas modalidades, todas la bases (residuos) citosina en monómeros de LNA son 5-metilcitosina.

EJEMPLO 4 Modelo in vitro: Cultivo de células El efecto de oligonucleótidos de antisentido sobre la expresión de ácido nucleico objetivo se puede probar en cualquiera de una variedad de tipos de células siempre que el ácido nucleico objetivo está presente a niveles medibles. El objetivo se puede expresar endógenamente o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico objetivo. El nivel de expresión de ácido nucleico objetivo puede ser rutinariamente determinado usando, por ejemplo, análisis de Northern blot, PCR de tiempo real, pruebas de protección de ribonucleasa. Los siguientes tipos de células se proveen para propósitos ilustrativos, pero otros tipos de células se pueden usar rutinariamente, siempre que el objetivo es expresado en el tipo de célula escogido. Las células se cultivaron en el medio apropiado como se describe más adelante y se mantiene a 37°C a 95-98% de humedad y 5% de C02. Las células se hicieron pasar rutinariamente 2-3 veces a la semana.

DU-145: La línea de células de cáncer de próstata humanas DU-145 se cultivó en un medio RPMI 1640 con glutamax I (Gibco # 61870-010) que contenia 10% de suero de bovino fetal (Biochrom 19357-5010) y 25 pg/ml Gentamicin (25 pg/ml) (Sigma # G1397). 518A2: La línea de células de cáncer de melanoma humanas 518A2 se cultivó en MEM de Dulbecco (Sigma # D5671 ), que contenia 10% de suero de bovino fetal (Biochrom 19357-5010), 2 mM de Glutamax I (Gibco #35050-038) y 25 g/ml Gentamicina (Sigma # G1397).

EJEMPLO 5 Modelo in vitro: Tratamiento con oligonucleótido de antisentido Las células se trataron con un oligómero (oligonucleótido) usando la formulación de liposoma catiónico LipofectAMINE 2000 (Gibco) como vehículo de transfección. Las células se sembraron en placas de cultivo de células de 6 pozos (NUNC) y se trataron cuando era 75-90% confluente. Las concentraciones del oligonucleótido usadas variaron de 0.8 nM a 20 nM de la concentración final La formulación de complejos de oligonucleótido-lípido se llevaron a cabo esencialmente como lo describe el fabricante usando OptiMEM libre de suero(Gibco) y una concentración final de lípidos de 5 g/mL LipofectAMINE 2000. Las células se incubaron a 37°C durante 4 horas y el tratamiento se detuvo por remoción de medio de cultivo que contenia oligonucleótido. Las células se lavaron y el medio que contenia suero se añadió. Después del tratamiento de oligonucleótido, se dejó que las células se recuperarán 20 horas antes de que fueran cosechadas para análisis de ARN.

EJEMPLO 6 Modelo in vitro: Extracción de ARN y síntesis de ADNc Para aislamiento de ARN de las lineas de células, el mini kit de RNeasy (Qiagen cat. no. 74104) se usó de conformidad con el protocolo provisto por el fabricante. La síntesis de la primera cadena se llevó a cabo usando reactivos de transcriptasa inversa de Ambion de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Para cada muestra, 0.5 pg de ARN total se ajustó a (10.8 µ?) con H2O libre de ARNasa y se mezcló con 2 pl de decámeros aleatorios (50 µ?) y 4 µ? de mezcla de dNTP (2.5 mM de cada dNTP) y se calentó a 70°C durante 3 min después de lo cual las muestras se enfriaron rápidamente sobre hielo. Después de enfriar las muestras sobre hielo, 2 µ? de 10x Buffer RT, 1 µ? de trasncriptasa inversa MMLV (100 U/µ?) y 0.25 µ? de inhibidor de ARNasa (10 U/µ?) se añadió a cada muestra, seguido por incubación a 42°C durante 60 min, la inactivación con calor de la enzima a 95°C durante 10 min y después la muestra se enfrió a 4°C.

EJEMPLO 7 Modelo in vitro: Análisis de inhibición de oligonucleótido de expresión de GLI2 por PCR de tiempo real La modulación de antisentido de expresión de ARNm de GLI2 se puede probar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de GLI2 se pueden cuantificar, v.gr., por análisis de Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR), o PCR de tiempo real. La PCR de tiempo real cuantitativa es actualmente preferida. El análisis de ARN se puede llevar a cabo sobre ARN celular total o ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN y análisis de ARN tales como análisis de Northern blot es rutina en la técnica y se enseña, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons. La PCR cuantitativa de tiempo real se puede lograr convenientemente usando el sistema de detección de PCR de tiempo real multi-color comercialmente disponible, disponible de Applied Biosystem.

Análisis de PCR cuantitativo de tiempo real de niveles de ARNm de GLI2 El contenido de ARNm de GLI2 humano en las muestras fue cuantificado usando el reactivo GLI2 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent humano (Applied Biosystems cat. no. Hs00257977_m1) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

El contenido de ARNm de GLI 1 humano (también referida aqui como GN1 ) en las muestras se cuantificó usando el reactivo GH1 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent humano (Applied Biosystems cat. no. Hs00171790_m1 ) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARNm de gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) se usó como un control endógeno para normalizar cualquier varianza en la preparación de muestra.

El contenido de ARNm de GAPDH humano en las muestras se cuantificó usando el reactivo GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent humano (Applied Biosystems cat. no. 4310884E) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

La PCR cuantitativa de tiempo real es una técnica bien conocida en el campo y se enseña por ejemplo en Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

PCR de tiempo real El ADNc de la síntesis de la primera cadena realizado como se describe en el ejemplo 6 se diluyó 2-20 veces, y se analizó por PCR cuantitativa de tiempo real usando Taqman 7500 FAST de Applied Biosystems. Los iniciadores y sonda se mezclaron con mezcla maestra de 2 x Taqman Fast Universal PCR (2x) (Applied Biosystems Cat.# 4364103) y añadida a 4 µ? de ADNc a un volumen final de 10 µ?. Cada muestra se analizó por triplicado. Se generaron curvas estándares al probar diluciones de 2 veces de un ADNc que había sido preparado sobre material purificado a partir de una línea de células que expresan el ARN de interés. Se usó H20 estéril en lugar de ADNc para el control sin plantilla. El programa de PCR: 95°C durante 30 segundos, seguido por 40 ciclos de 95°C, 3 segundos, 60°C, 30 segundos. Las cantidades relativas de secuencia de ARNm objetivo se determinaron a partir del ciclo de umbral calculado usando el software Applied Biosystems Fast System SDS Versión 1.3.1.21.

EJEMPLO 8 Análisis in vitro: Inhibición de antisentido de expresión de GLI2 humano por oligonucleótidos Los oligonucleótidos se evaluaron para su potencial para disminuir la expresión de ARNm de GLI2 a concentraciones de 0.8, 4 y 20 nM en células DU-145 y células 518A2 (véanse figuras 4, 5 y 6). Los datos se presentan en el cuadro 4 como porcentaje de regulación descendente de ARNm de GLI2 en relación con células transfectadas por simulador a 4 nM. Las células transfectadas por simulador fueron transfectadas con un control desorganizado (un control negativo). Dicho control desorganizado es un oligómero, tal como el oligómero que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No: 133, que no tiene complementariedad con la secuencia objetivo. Las letras minúsculas representan unidades de ADN, las letras mayúsculas en negrillas representan LNA tal como unidades ß-D-oxi-LNA. Todas las bases citosina en los monómeros de LNA son 5-metilcitosina. El subíndice "s" representa enlace de fosforotioato.

CUADRO 4 Como se muestra en el cuadro 4, todos los oligonucleótidos probados que son dirigidos a la expresión de ARNm de GLI2 proveyeron una inhibición de por lo menos 30% a la dosis baja de 4 nM. SEQ ID NO 1 13, 1 17, 1 19, 122, 123, 130 y 131 todas dieron por lo menos 50% de inhibición a la dosis baja de 4 nM, y SEQ ID NO 1 12, 1 14, 1 15, 1 16, 1 18, 120, 121 , 126, 128, 129 y 132 todas dieron por lo menos 70% de inhibición a la dosis de 4 nM.

Los oligómeros (también referidos aquí como oligos) que tienen la secuencia mostrada como SEQ ID NO 1 17, 1 19, 122, 123, 130, 131 , 1 12, 1 14, 1 5, 1 16, 1 18, 120, 121 , 126, 128, 129 y 132 todos dieron por lo menos 60% de inhibición a una dosis de 4 nM, y por lo tanto, en algunas modalidades, son preferidos, así como oligonucleótidos basados en las secuencias de oligómero de antisentido ilustradas, por ejemplo variando la longitud (más corta o más larga) y/o contenido de nucleobase (v.gr., el tipo y/o proporción de unidades análogas), que también proveen buena inhibición de expresión de ARNm de GLI2.

EJEMPLO 9 Análisis in vitro: Inhibición de antisentido de expresión de GLÍ1 humana y expresión de GLI3 E humana por oligonucleótidos Los oligonucleótidos fueron evaluados para su potencial para disminuir ARNm de GLI1 a concentraciones de 0.8, 4 y 20 nM en células DU-145 y células 518A2 (véanse figuras 7 y 8).

Los oligonucleótidos fueron evaluados para su potencial para disminuir ARNm de GLI3 a concentraciones de 0.8, 4 y 20 nM en células 518A2 (véase figura 9).

EJEMPLO 10 Inducción de apoptosis por oligonucleótidos de LNA Células 518A2 se sembraron en placas de cultivo de 6 pozos (NUNC) el día antes de la transfección a una densidad de 1.5 x 105 células/pozo y células DU-145 a una densidad de 2.8 x 105 células/pozo. Las células se trataron con oligonucleótido usando la formulación de liposoma catiónico LipofectAMINE 2000 (Gibco) como vehículo de transfección cuando era 75-90% confluente. Las concentraciones de oligómero usadas fueron 4 nM y 20 nM (concentración final en el pozo). La formulación de complejos de oligómero-lípido se llevaron a cabo esencialmente como lo describe el fabricante usando OptiMEM libre de suero (Gibco) y una concentración final de lipido de 5 pg/mL de LipofectAMINE 2000. Las células se incubaron a 37°C durante 4 horas y el tratamiento se detuvo al remover el medio que contenía oligómero. Después de lavar con Optimem, 300 µ? de tripsina se añadió a cada pozo hasta que las células se desprendieron de los pozos. La tripsina fue inactivada al añadir 3 mi de cultivo medio de cultivo HUH7 al pozo y una suspensión de células individuales se hizo al pipetear suavemente la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo. El oligo desorganizado (oligómero) SEQ ID NO: 133 se usó como control.

Después de esto, 100 µ? de la suspensión de células se añadió a cada pozo de una placa de 96 pozos blanca de Nunc (cat #136101 ) (se prepararon cuatro placas, para medición en diferentes puntos de tiempo). Las placas se incubaron después a 37°C, 95% de humedad y 5% de CO2 hasta que las pruebas se llevaron a cabo.

Prueba de caspasa: La actividad de caspasas especificas de apoptosis 3 y 7 se midió usando una prueba de sustrato de Caspase-Glo 3/7 luminogénica (Cat#G8091 de Promega). La placa que había de ser analizada se equilibró a temperatura ambiente durante 15 min. El regulador de pH de Caspase-Glo ® 3/7 se mezcló con el sustrato de Caspase-Glo ® 3/7 a una solución de trabajo de Caspase-Glo ® que se equilibró a temperatura ambiente. Después, 100 pl de la solución de trabajo de Caspase-Glo ® se añadió cuidadosamente al medio en cada pozo de la placa de 96 pozos (es importante evitar burbujas y contaminación entre los pozos). La placa se agitó cuidadosamente durante 1 min, después de lo cual se incubó a temperatura ambiente durante 1 hr, protegida de la luz. La actividad de la caspasa se midió como unidades de luz relativas por segundo (RLU/s) en un instrumento Luminoscan Ascent (Thermo Labsystems). Los datos se correlacionaron y se graficaron en relación con un valor promedio de las muestras de simulador, que se fijaron a 1. Véanse figuras 13 y 14.

EJEMPLO 11 Inhibición in vitro de proliferación usando oligonucleótidos de LNA Células 518A2 fueron transfectadas y cosechadas en una suspensión de células individuales como se describe en el ejemplo 10 (inducción de apoptosis). SEQ ID NO: 133 sirvió como un control desorganizado. Después de esto, 100 µ? de la suspensión de células se añadió a cada pozo de una placa de 96 pozos ("Orange Scientific") para prueba de MTS (se prepararon cuatro placas, para medición en diferentes puntos de tiempo). Las placas se incubaron después a 37°C, 95% de humedad y 5% de CO2 hasta que las pruebas se llevaron a cabo.

Medición de la proliferación de células viables (prueba de MTS) Para la prueba de proliferación, 10 µ? de una solución acuosa para prueba de proliferación celular CelITiter 96® (Promega, G3582) se añadió al medio de cada pozo de la placa de 96 pozos, la placa se agitó cuidadosamente, y se incubó a 37°C, 95% de humedad y 5% de CO2 durante 1 hr antes de la medición. La absorbancia se midió a 490 nm en un espectrofotómetro y el fondo para la prueba se sustrajo de los pozos que contenían sólo medio. La absorbancia a 490 nm es proporcional al número de células viables y se gráfico contra el time para células transfectadas por simulador y para células transfectadas con oligómero. Véase figura 11.

EJEMPLO 12 Preparación de un conjugado de SEQ ID NO: 112, 114, 118, 120. 130 y 132 y polietilenglicol Un oligómero es funcionalizado en el 5' terminal al unir un grupo aminoalquilo, tal como hexan-1 -amina bloqueada con un grupo bloqueador tal como Fmoc al grupo 5' fosfato del oligómero usando química de fosforamidita de rutina, oxidando el compuesto resultante, desprotegiéndolo y purificándolo para lograr el oligómero funcionalizado (un oligómero activado) que tiene la fórmula (I): 5'-OLIGÓMERO-3' —OH (i) El término oligómero en la fórmula (I) o (III) se refiere a un oligómero de la invención - tal como un oligómero seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 12, 1 14, 1 18, 120, 130 y 132.

Una solución de PEG activado, tal como el que se muestra en la fórmula (II): en donde la porción PEG tiene un peso molecular promedio de 12,000, y el compuesto de la fórmula (I) en regulador de pH PBS es agitado a temperatura ambiente durante 12 horas. La solución de reacción es extraída tres veces con cloruro de metileno y las capas orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio y se filtran y el solvente es evaporado bajo presión reducida. El residuo se disuelve en agua destilada doble y se carga en una columna de intercambio de aniones. El enlazador de PEG sin reaccionar se eluye con agua y el producto se eluye con solución de NH4HC03. Las fracciones que contienen producto puro se ponen en acervo y se liofilizan para dar el conjugado de la fórmula (III): 5'-OLlGÓMERO-3' — 0H (III) en donde el oligómero (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 12, 1 14, 1 8, 1 20, 130 y 132) es unido a un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio de 12,000 mediante un enlazador liberable.

EJEMPLO 13 Determinación de CI50 en células DU-145 y 518A2 con respecto a expresión de ARNm Gli1, Gl¡2 y Gl¡3 Véanse los ejemplos 4-9 para detalles experimentales.

Valores de Cl50 para los diferentes oligómeros de GLI2 con respecto a la expresión de ARNm de GLI2 se determinaron en células DU-145 y células 518A2. Las células fueron transfectadas con oligómeros en concentraciones que variaban de 0.04 nM a 20 nM de concentración final. La expresión ARNm de GLI2 (también referido aquí como Gli2) se determinó 24 hr después de la transfección por qPCR (PCR cuantitativa). Los resultados se muestran en las figuras 4, 5 y 6. Todos los oligómeros mostraron regulación descendente potente de ARNm de GLI2 24 hr después de la transfección, con CI50:s por abajo de 4 nM en ambas líneas celulares.

Los valores de Cl50 para los diferentes oligómeros de GLI2 con respecto a la expresión de ARNm de GLI1 se determinaron en células DU-145 y células 518A2. Las células fueron transfectadas con oligómeros en concentraciones que variaban de 0.04 nM a 20 nM de concentración final. La expresión ARNm de GLI1 se determinó 24 hr después de la transfección por qPCR. Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8. Los oligómeros biespecíficos de GLI2, SEQ ID NO 1 12 y 1 14, mostraron regulación descendente potente de GLI1 con CI50:s por abajo de 4 nM tanto en DU-145 como en células 518A2 cuando se analizaron 24 hr después de la transfección. Además, SEQ ID NO 120 mostró disminución de GLI1 (expresión reducida de ARNm de Gli1 ) en ambas lineas celulares, con la disminución más potente encontrada en células DU-145. SEQ ID NO 120 sólo tiene 1 discordancia para GLI 1 , la cual es probable que se la razón de la disminución observada de GLI1 con este oligómero. Por el contrario, SEQ ID NO 130 pareció inducir la expresión de GLM a las concentraciones de 10 nM y 20 nM tanto en células DU-145 como en células 518A2.

La expresión de GLI3 (también referida aquí como Gli3) se investigó en células 518A2 después de transfección con los oligómeros de GLI2. La expresión no se analizó en células DU-145, ya que estas células expresan niveles muy bajos de ARNm de GLI3 (bajo el límite de detección para qPCR). Todos los oligómeros habían sido designados con por lo menos dos discordancias para GLI3, como fue deseable para evitar la dirección de GLI3 con los oligómeros. Los resultados se muestran en la figura 9. Los resultados mostraron que SEQ ID NO 1 14 mostró disminución potente de expresión de ARNm de GLI3, con una CI50 por abajo de 4 nM. SEQ ID NO 1 18 y SEQ ID NO 120 mostraron regulación descendente de GLI3 con CI50:s por arriba de 20 nM (118) o entre 10-20 nM (120), mientras que los oligómeros restantes no tuvieron o o tuvieron sólo un efecto ligero sobre la expresión de ARNm de GLI3 a las concentraciones más altas.

EJEMPLO 14 Estabilidad de los oligómeros de GLI2 en el plasma El plasma de ratón (litio-heparina-plasma de ratones BomTac:NMRI, recolectado el 14-09-05, Taconic Europe) fue descongelado y puesto en alícuotas en tubos con 45 µ? de plasma/tubo. Posteriormente, 5 µ? de oligómero (200 µ?) se añadieron a 45 µ? de plasma a una concentración final de 20 µ?. Después de mezclado uniforme, las muestras se incubaron a 37°C durante 0-120 hr. A diferentes puntos de tiempo (0 hr, 24 hr, 48 hr y 120 hr) las muestras se recolectaron y la reacción se extinguió mediante congelamiento súbito de las muestras en nitrógeno liquido. Para análisis, las muestras se añadieron para cargar regulador de pH y se analizaron por electroforesis sobre gel de secuenciación de PAGE bajo condiciones desnaturalizantes.

Los resultados de la prueba de estabilidad del plasma demostró que los oligómeros fueron muy estables. Todos los oligómeros mostraron estabilidad in-vitro por lo que más de 90% de compuesto activo quedó después de 24 hr cuando se incubó con plasma de ratón a 37°C hr. Para oligómeros que tienen secuencias mostradas como SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 132, que tienen un residuo A en el extremo 3', una banda de N-1 débil pudo ser detectada empezando después de 24 hr de incubación, aunque no se pudo detectar degradación para ninguno de los otros oligómeros. Anteriormente hemos observado que los oligómeros con un residuo A en el extremo 3' muestran bandas de N-1 débiles después de incubación en el plasma, que probablemente se debe a depuración. Los resultados se muestran en la figura 10.

EJEMPLO 15 Determinación de Tm de los oligómeros GLI2 La temperatura de fusión de los dúplex de oligómero LNA/ARN se determinó usando un sistema de espectrometría de UV con software correspondiente (Perkin Elmer, Fremont, E.U.A.). El oligómero LNA y sus ARN complementarios se añadieron en concentraciones finales de 1.5 µ? al regulador de pH-Tm (200 nM de NaCI, 0.2 nM de EDTA, 20 mM de NaP, pH 7.0). La formación dúplex se preparó calentando las muestras a 95°C durante 3 min seguido por enfriamiento a temperatura ambiente durante 30 min.

Los valores de temperatura de fusión (Tm) se midieron en un espectrómetro Lambda 25 UV/VIS (Perkin Elmer) y los datos se recolectaron y se analizaron usando el software TempLab (Perkin Elmer). El instrumento se programó para calentar la muestra dúplex de oligómero de 20-95°C y posteriormente enfriando la muestra a 25°C. Durante este procedimiento, se registró la absorbancia a 260 nm. Las curvas de fusión se usaron para calcular los valores de Tm (cuadro 5).

CUADRO 5 Tm de tos oligómeros de LNA contra ARN complementario como se determina por espectrofotometría de UV Todos los oligómeros de GLI2 tuvieron una Tm por arriba de 60X contra su ARN complementario.

EJEMPLO 16 Prueba de proliferación en células DU-145 y 518A2 Prueba de MTS: Para la prueba de proliferación, 10 µ? de una solución acuosa para prueba de proliferación celular CelITiter 96® (Promega, G3582) se añadió al medio de cada pozo de la placa de 96 pozos, la placa se agitó cuidadosamente, y se incubó a 37X, 95% de humedad y 5% de CO2 durante 1 hr antes de la medición. La absorbancia se midió a 490 nm en un espectrofotometro y el fondo para la prueba se sustrajo de los pozos que contenían sólo medio.

La proliferación después de transfección con oligómeros de GLI2 se investigó en células DU-145 y 518A2 usando una prueba de MTS. La proliferación se analizó a 5 hr, 24 hr, 48 hr y 72h después de la transfección. Los resultados mostraron que todos los oligómeros de GLI2 excepto para el oligómero que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 130 mostraron inhibición de proliferación potente y dependiente de la dosis tanto en las células DU-145 como en las células 518A2, mientras que el control negativo no tuvo efecto sobre la proliferación celular. Los oligómeros más potentes en la inhibición de proliferación fueron oligómeros que tenían secuencias mostradas como SEQ ID NOs. 114, 118 y 120. Se realizaron cuatro determinaciones selectivas independientes, y los datos de la determinación selectiva que es el mejor representativo de la actividad promedio de los diferentes oligómeros se presenta (figura 1 1).

EJEMPLO 17 Análisis in vivo: Determinación de ALT y AST en hígado de ratón después de administración in vivo (i.v.) de oliqonucleótidos Gli Ratones NMRI hembras recibieron inyección i.v. de oligonucleótidos que tenían las secuencias mostradas como SEQ ID NOs: 1 12, 1 14, 118, 120 y 132 el día 0, 3, 6 y 9 a una dosis de 10 mg/kg. Los animales fueron sacrificados 24 hr después de la última dosis. Los niveles de ALT y AST se determinaron en el suero de la sangre, libre de glóbulos rojos, obtenidos de los ratones durante el sacrificio. La actividad de alanina- aminotransferasa (ALT) y aspartato-aminotransferasa (AST) en suero de ratón se determinó usando una prueba de ALT enzimática (ABX Pentra A1 A01627 (ALT) o A1 1A01629 (AST), Horiba ABX Diagnostics, Francia) de conformidad con las instrucciones del fabricante pero ajustado a formato de 96 pozos. En breve, muestras de suero se diluyeron 2.5 veces con H20 y se probaron por duplicado. Después de la adición de 50 µ? de muestra diluida o estándar (multical de ABX Pentra, A1 1A01652) a cada pozo, 200 µ? de mezcla de reactivo ALT a 37°C se añadió a cada pozo. Se realizaron mediciones cinéticas a 340 nm y 37°C durante 5 min con un intervalo de 30s. Los datos se correlacionaron con la curva estándar diluida 2 veces y los resultados se presentaron como actividad de ALT en U/L.

Los resultados se muestran en las figuras 12A y 12B.

EJEMPLO 18 Efectos anti-tumorales de oliqonucleótidos anti-GLI en modelos animales Para todos los estudios de xenoinjertos, a los ratones se implantaron tumores subcutáneamente. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100-200 mm3 (o el tamaño indicado), a los ratones se inyectaron LNA-oligonucleótidos a las dosis y programa indicados.

Los ratones que tenían tumor PC3 (un modelo de cáncer de próstata) fueron tratados con 3, 30, y 100 mg/kg de oligómeros de LNA que tenían las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 75 (intravenosa (IV); 4 dosis cada tercer día (q3d x 4)). Al final del estudio, los tumores se cosecharon, y los niveles de ARNm de GLI y ARNm de PTCH1 humanos y de ratón se probaron usando sondas especificas ya sea para ARNm humanos o de ratón. Un control positivo (de células transfectadas con un oligonucleótido GLI2 de antisentido -SEQ ID NO: 10) se incluyó en el estudio, que produjo resultados de regulación descendente como se esperaba. El tratamiento con oligómeros que tienen la secuencias expuestas en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 75 o SEQ ID NO: 3 no dio por resultado disminución de ARNm de GLI1 , GLI3 o Ptchl humano (no se muestran datos). Sin embargo, como se muestra en la figura 15A, un grado de modulación descendente de ARNm de GLI2 en células epiteliales tumorales se observó bajo el tratamiento con oligómeros que tenían SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 75, aunque no se pudo establecer relación de dosis-respuesta.

De manera interesante, ARNm de GLI1 , GLI2 y Ptchl de ratón fueron descendentemente modulados de manera significativa por todos los 3 oligómeros, aunque no se pudo establecer relación de dosis-respuesta (véase figura 15A - estroma de tumor PC3). Puesto que GLI1 (bajo el control de GLI2) es un factor de transcripción directamente relacionado con la vía hedgehog, los resultados sugieren que las células estromáticas son probablemente afectadas por el tratamiento de oligonucleótidos de antisentido dirigidos a ARNms GLI. GLI2 controla los niveles de GLI1 y Ptchl . Por lo tanto, la inhibición de GLI2 conducirá a la regulación descendente de GLI 1 y Ptch1 .

En las figuras 15A y 15B: G 1 se refiere a solución salina; G2 se refiere a 3 mg/kg de SEQ ID No 3; G3 se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 3; G4 se refiere a 3 mg/kg de SEQ ID No 19; G5 se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 19; G6 se refiere a 100 mg/kg de SEQ ID No 19; G7 se refiere a 3 mg/kg de SEQ ID No 75; G8 se refiere a 30 mg/kg de SEQ ID No 75; G9 se refiere a 100 mg/kg de SEQ ID No 75; C se refiere al control in vitro 518A- una linea de células de melanoma; T se refiere al control in vitro 10 nM de 4478 (Gli2 antisentido (SEQ ID NO 10). El término RQ% se refiere a porcentaje de cantidad relativa; el término KD se refiere a disminución; el término AN09017 se refiere al número de estudio usado por el experimentador; el término "mpk" se refiere a mg/kg.

Un estudio de mini-toxicología (minitox) previo mostró evidencia de inhibición de crecimiento de tumor (TGI) (figura 16J. En este estudio, la eficacia de oligómeros que tiene las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 3 (no se muestran datos), SEQ ID NO: 19 (véase figura 16), o SEQ ID NO: 75 (véase figura 16) se probaron a dosis múltiples (0.3-30 mg/kg; 10 dosis cada tercer día (q3d x10)) en un modelo de cáncer de próstata DU- 45. Los compuestos no mostraron TGI robusta, como lo sugieren los experimentos de minitoxicologia. Hubo una tendencia para que la dosis de 3 mg/kg tuviera un mejor rendimiento que otros niveles de dosis, por lo menos para los oligómeros que tenían la secuencias expuestas SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 75.

Se condujo un estudio de eficacia en un modelo de cáncer de próstata PC3 de xenoinjerto. Los oligonucleótidos que tenían secuencias como se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 75 se dieron q3d x10 (10 dosis cada tercer día) a 3-30 mg/kg. Para el día 28 (último día con supervivencia cerca de 100% entra la mayoría de los grupos), la TGI más grande de cualesquiera tratamientos se vio para el tratamiento con el oligómero que tenia la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 (54%) y con el oligómero que tenía la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (34%), ambas a 3 mg/kg (véase la figura 17). La variación grande en respuesta se observó en cualquier grupo particular. De manera interesante, el tratamiento con el oligómero que tenía la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 a 3 mg/kg dio por resultado la mejor TGI.

En este estudio, el oligómero que tenía la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 se administró (3 mg/kg, IV) en un estudio de eficacia completo contra xenoinjertos de PC3 (un modelo de cáncer de próstata). El estudio también comparó rutas de dosificación ip (intraperitoneal) e iv (intravenosa). Una TGI moderada con la mejor respuesta sobre el programa de q1 d (dosis diaria) (29% TGI) se observó (véase la figura 18). La administración del oligómero por vía intravenosa o intraperitoneal (en un programa q3d - dosis cada tercer día) dio por resultado eficacia similar. Este estudio indícat que el oligómero de antisentido GLI puede ser efectivo en el tratamiento de cáncer de próstata. El término "mpk" en la figura 18 significa "mg/kg".

El modelo de cáncer colorrectal DLD-1 es un modelo de cáncer de colon resistente a ciclopamina (Yauch et al Nature 2008, 455: 406-410). Una mutación en exón 1 1 del gen Smo está presente en esta línea de células cancerosas. Sin embargo, la vía hedgehog está aún activada. El modelo no responde a inhibidores de Smo (v.gr., ciclopamina) in vitro o in vivo. Además, se ha mostrado que la dosis de DLD-1 no secreta el ligando hedgehog. Debido a la ausencia de ligando y/o mutaciones Smo, el modelo probablemente no responde a ciclopamina o sus análogos, y por lo tanto es un buen modelo para probar terapias alternativas, tales como terapia de antisentido de GLI2. La inhibición de crecimiento se ha demostrado previamente con un oligonucleótido que contiene azúcar MOE (Kim et al, 2007 CANCER RES. 67(8) 3583 -3593).

El efecto del oligómero que tenía la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19 se probó a dos niveles de dosis (3 y 30 mg/kg, 6 dosis intravenosas cada tercer día (q3dx6(iv))) en un modelo de cáncer colorrectal DLD-1 . Los resultados (panel superior de la figura 19) demuestran que el tratamiento de los animales con 3 mg/kg inyectado cada dos semanas dio por resultado una TGI de 23%. No se obtuvo efecto al nivel de dosis de 30 mg/kg. El estudio se repitió para confirmar los resultados de TGI. Alentados por estos resultados preliminares, un estudio de eficacia se llevó a cabo en el mismo modelo con dosis administradas a 3 mg/kg, 10 dosis cada tercer día (q3dx10), iv. Después de la 4a dosis, un cohorte fue sacrificado y las muestras de tumor e hígado se recolectaron para análisis de disminución de ARNm de GLI 1 /GLI2. Los animales restantes fueron monitoreados para TGI. En este estudio, no se observó TGI (panel inferior de la figura 19). Se requirieron estudios de eficacia adicionales.

Xenoinjertos de tumor DU-145 (un modelo de cáncer de próstata) se trataron con un oligómero que tenia la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 75, o SEQ ID NO: 3 a varias dosis como se indica. Se observó buena inhibición de crecimiento antitumor (modelo DU145) para todos los tres compuestos (figuras 20A-20C). Sin embargo, hubo una falta de respuesta a la dosis. La dosis más efectiva de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 75 fue 3 mg/kg (3 dosis cada tercer día (q3d x 3)) Las figuras 20A-20C se refieren a q3d x 4 (4 dosis cada tercer día).

Un estudio de inhibición de crecimiento tumoral se llevó a cabo con los oligómeros que tenían SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 75 en el modelo de cáncer de próstata PC3 (10 dosis cada tercer día (q3d x10)) (n.b. n=3). Debido a la cantidad limitada de los compuestos, cada grupo contenía 3 ratones. Efectos antitumorales buenos a excelentes se observaron con todos los tres compuestos (véase la figura 21), aunque se observó avance tumoral con compuestos que tenían las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 75. Puesto que una alta dosis de algunos de estos compuestos pareció no tener efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral en el primer experimento, los animales que tenían tumor fueron tratados nuevamente el día 41 con 30 mg/kg de oligómeros de antisentido que tenían las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 75 para determinar si el efecto fue reproducible. SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 75 mostraron estancamiento tumoral.

Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema de la invención descritos serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y esencia de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades preferidas específicas, cabe entender que la invención como se reivindica no debe ser limitada inadecuadamente a dichas modalidades especificas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvios para los expertos en bioquímica y biología molecular o campos relacionados se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1 - Un oligómero de entre 10-30 monómeros de longitud que comprende una primera región de secuencia contigua de un total de entre 10-30 monómeros, en donde dicha secuencia contigua es por lo menos 80% idéntica a una región correspondiente a un gen GLI2 de mamífero o el complemento de reversa de una región objetivo de un ácido nucleico que codifica un GLI2 de mamífero, tal como un gen o ARNm de GLI2 de mamífero, tal como un ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 134, o una variante que ocurre naturalmente del mismo. 2 - El oligómero de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia contigua es por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, homologa a una región correspondiente a cualquiera de SEQ ID NO:. 19, 3-18 y 20-90. 3.- El oligómero de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque la secuencia contigua no comprende discordancias o comprende no más de una o dos discordancias con el complemento de reversa de la región correspondiente de SEQ ID NO 1 , SEQ I D NO 2 o SEQ ID NO 1 34. 4 - El oligómero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la secuencia contigua es entre 9-18 nucleótidos de longitud. 5 - El oligómero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque la secuencia contigua comprende análogos de nucleósido. 6. - El oligómero de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque los análogos de nucleósido son nucleósidos modificados por azúcar, tal como nucleósidos modificados por azúcar seleccionados del grupo que consiste de: unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA); unidades 2'-O-alquilo-ARN, unidades 2'-OMe-ARN, unidades 2'-amino-ADN, y unidades 2'-fluoro-ADN; preferiblemente los análogos de nucleósido son LNA. 7. - El oligómero de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado además porque es un gapmer. 8.- El oligómero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque inhibe la expresión de gen o ARNm de GLI2 en una célula que está expresando gen o ARNm de GLI2; preferiblemente dicho oligómero se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 12, 1 14, 1 18, 120, 130 y 132; muy preferiblemente dicho oligómero es SEQ ID No 1 18 o SEQ ID No 132. 9.- Un conjugado que comprende el oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y por lo menos una porción no nucleótido o no polinucleótido covalentemente unido a dicho oligómero. 10 - Una composición farmacéutica que comprende el oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el conjugado de la reivindicación 9, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 1 1 . El oligómero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el conjugado de conformidad con la reivindicación 9, para usarse como un medicamento, para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer. 12 - El uso de un oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un conjugado como se define en la reivindicación 9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer. 13 - El uso de un oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un conjugado de la reivindicación 9, o una composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastorno hiperproliferativos, tales como cáncer, en un animal que padece, o es susceptible a padecer los mismos. 14 - Un método in vitro para la inhibición de GLI2 en una célula que está expresando GLI2, dicho método comprende administrar un oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un conjugado de la reivindicación 9 a dicha célula para inhibir GLI2 en dicha célula. 15 - Un método in vitro de inducción de apoptosis en una célula que está expresando GLI2, dicho método comprende el paso de administrar un oligómero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un conjugado de la reivindicación 9, o una composición farmacéutica de la reivindicación dicha célula en una cantidad suficiente para desencadenar apoptosis.