CN110923234A

CN110923234A - 一种抑制人GLI2基因表达的shRNA构建及其应用

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Publication number: CN110923234A
Application number: CN201911326849.7A
Authority: CN
Inventors: 孙艳; 迟作华; 穆先敏; 李金花; 黄莉霞
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-03-27

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制人胶质瘤相关原癌基因(Glioma‑associated oncogene,GLI2)表达的shRNA及其重组载体。本发明所述的shRNA正义链序列如序列表SEQ NO.2所示，其反义链序列如序列表SEQ NO.3所示。本发明通过功能性实验验证，得到了有效抑制人GLI2基因表达和GLI2信号异常肿瘤细胞生长的shRNA。本发明所述的shRNA及其重组载体可应用于制备降低人GLI2mRNA及蛋白表达试剂，以及制备抑制GLI2信号异常肿瘤生长的药物。

Description

一种抑制人GLI2基因表达的shRNA构建及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抑制人GLI2基因表达，进而可以抑制GLI2水平异常增高的肿瘤生长的shRNA及其重组载体，以及其用于制备抑制肿瘤生长药物的应用。

背景技术

人胶质瘤相关原癌基因(Glioma-associated oncogene,GLI)家族是介导刺猬因子(hedgehog，HH)经典信号通路的关键转录因子家族。HH-GLI信号在早期胚胎发育中决定细胞命运和形态，并且调控着多种成体组织如皮肤、肠、肺、血液和胸腺的自我更新和稳态。GLI家族包括GLI1、GLI2和GLI3，均有5个保守的锌指结构，属于Krupple锌指蛋白家族。GLI1、GLI2和GLI3在HH-GLI信号中的功能既有重叠，又有差异，但均参与了肿瘤发生发展过程。

Gli2信号水平异常升高已被证实与黑色素瘤、肝癌、宫颈癌、基底细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、前列腺癌等肿瘤的恶性增殖和转移有关。GLI2转位至细胞核，促进与肿瘤细胞增殖、细胞周期、迁移和抑制细胞凋亡的相关基因转录，最终导致肿瘤恶性表型。因此，GLI2是一种重要的预后因子，也是黑色素瘤、髓母细胞瘤、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨肉瘤等多种恶性肿瘤的治疗靶点。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是机体内广泛存在的一种双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象，因其可高效特异地阻断体内特定基因的表达导致特异基因沉默而被广泛应用于科学研究和基因治疗。其中，shRNA即小发卡RNA或者短发卡RNA(asmallhairpin RNAor short hairpin RNA，shRNA)是一段具有茎环结构的外源性RNA序列，能够在细胞内加工成siRNA，siRNA进而与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)结合到同源的mRNA上并诱导其降解。shRNA的作用具有严格的靶向性，特异性靶位点的选择具有位置效应，不同的靶位点对同一基因的干扰效率有着很大的差异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效抑制人GLI2基因表达的shRNA及其重组载体，所述人GLI2 shRNA及其重组载体可以抑制GLI2信号异常肿瘤的生长。本发明提供的人GLI2shRNA及其重组载体可用于制备抗GLI2信号异常活化肿瘤的药物，具有较好的市场前景。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供一种抑制人GLI2基因表达的shRNA，靶点序列为SEQ IDNO.1所示的人GLI2基因的mRNA序列(NM_005270.4)第243位至263位核苷酸序列组成的基因序列。

进一步地，所述抑制人GLI2基因表达的shRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述反义链的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示：

SEQ NO.2

CCGGAAGGTACCATTACGAGCCTCACTCGAGTGAGGCTCGTAATGGTACCTTTTTTTG；

SEQ NO.3

AATTCAAAAAAAGGTACCATTACGAGCCTCACTCGAGTGAGGCTCGTAATGGTACCTT。

本发明提供一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体，所述表达载体是由序列SEQ ID NO.2和3所示的shRNA和慢病毒载体构建而成的。所述慢病毒载体为pLKO.1-TRC。

进一步地，本发明提供一种抑制人GLI2基因表达的shRNA及其重组载体构建方法，步骤如下：

(1)根据GenBank数据库中人GLI2基因的mRNA序列以及shRNA的引物设计原则，设计1对针对GLI2基因的shRNA序列，并将设计完成的shRNA的序列送上海英骏生物技术有限公司进行合成，另合成1对阴性对照序列；

(2)将上述设计的GLI2 shRNA、阴性对照(NC)的寡核苷酸常规退火后合成双链，双酶切后连接到pLKO.1-TRC载体上，将连接产物转化大肠杆菌。挑取单菌落进行PCR及测序鉴定，得到阳性克隆和质粒；

(3)将pLKO.1-TRC质粒、NC质粒、GLI2 shRNA质粒转染到GLI2信号异常活化的肝癌细胞系BEL-7402细胞和HepG2细胞中，real-time PCR检测GLI2基因表达。结果显示，pLKO.1-GLI2 shRNA能有效抑制GLI2 mRNA。

(4)将pLKO.1-TRC质粒、NC质粒、GLI2 shRNA质粒转染到GLI2信号异常活化的肝癌细胞系BEL-7402细胞、HepG2细胞和宫颈癌细胞系HeLa细胞中，CCK8检测细胞增殖。结果显示，pLKO.1-GLI2 shRNA能有效抑制BEL-7402细胞、HepG2细胞和宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖。

优选地，所述shRNA及其重组载体可用于制备降低人GLI2 mRNA试剂。

优选地，所述shRNA及其重组载体可用于制备抑制人GLI2蛋白表达试剂。

优选地，所述shRNA及其重组载体可用于制备抑制GLI2信号异常肿瘤生长的药物。所述肿瘤是经典HH信号通路异常激活的肿瘤，包括GLI2信号异常的黑色素瘤、基底细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、肝癌。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述抑制人GLI2基因表达的shRNA及其重组载体能有效抑制人GLI2基因在mRNA及蛋白水平的表达，进而抑制GLI2信号异常活化肿瘤细胞的生长。本发明为制备治疗GLI2信号异常活化肿瘤的药物制备提供了一种新方法，可促进GLI2异常激活肿瘤新药的开发，同时可用于人GLI2基因在恶性肿瘤发病中的作用和机理研究。

附图说明

图1为real-time PCR检测GLI2 mRNA在正常肝细胞系L02、正常人外周血单个核细胞(pheripheral blood mononuclear cells，PBMC)、肝癌细胞系BEL-7402、HepG2细胞和人宫颈癌细胞系HeLa细胞中表达水平。

图2为real-time PCR检测pLKO.1-GLI2 shRNA转染BEL-7402细胞、HepG2细胞和HeLa细胞后对3种肿瘤细胞株GLI2 mRNA表达的抑制。其中，PLKO.1-TRC组为转染PLKO.1-TRC空质粒组；PLKO.1-NC shRNA组为转染PLKO.1-NC shRNA质粒组；PLKO.1-GLI2-shRNA组为转染GLI2 shRNA质粒组。

图3为pLKO.1-GLI2 shRNA抑制BEL-7402细胞、HepG2细胞和HeLa细胞生长。图3A为形态学观察GLI2 shRNA对BEL-7402细胞、HepG2细胞和HeLa细胞生长的抑制作用。图3B、3C、3D分别为CCK8检测GLI2 shRNA转染后对BEL-7402细胞、HepG2细胞和HeLa细胞生长的抑制作用。其中，PLKO.1-TRC组为转染PLKO.1-TRC空质粒组；PLKO.1-NCshRNA组为转染NC shRNA质粒组；PLKO.1-GLI2 shRNA组为转染GLI2 shRNA质粒。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图进一步解释本发明，但实施例不对本发明的保护范围构成任何形式的限制。以下实施例中除作特殊说明外，均为本领域常规试剂。

具体实施例

(1)根据GenBank数据库中人GLI2基因的mRNA序列(NM_005270.4)以及shRNA的引物设计原则，采用clontech siRNA设计软件设计1对针对GLI2基因的干扰序列，并将设计完成的shRNA的序列送上海英骏生物技术有限公司进行合成，另合成了1对无干扰效果的阴性对照序列(NC shRNA)。

(2)将上述设计的GLI2 shRNA、NC shRNA的寡核苷酸常规退火后合成双链。AgeⅠ和Eco RⅠ双酶切以上退火产物和载体pLKO.1-TRC。胶回收试剂盒回收正确的DNA片段，随后进行连接反应。反应体系(10μl)：载体片段50ng，目的片段50ng，T4连接酶1μl，余用去离子水补足。16℃反应1hr。将连接产物转化大肠杆菌株STBL3，涂板，氨苄青霉素筛选。挑取单菌落测序鉴定(上海英骏生物技术有限公司)，得到阳性克隆和质粒。

(3)转染前24hr接种7×10⁵个HEK-293T细胞于6cm培养皿，无抗生素的完全培养基(DMEM+10％FBS)5％CO₂，37℃培养过夜。将构建好的pLKO.1-GLI2 shRNA质粒(1μg)(阴性对照组和空白对照组分别加入等量pLKO.1-NC-shRNA质粒和pLKO.1-TRC质粒)和包装质粒psPAX2(5μg)、pMD2.G(6.5μg)质粒加到OPTI-MEM培养基里面(共20μl)，充分混匀。另取一EP管加入6μl

和74μl OPTI-MEM，反复吹打混匀后加入质粒混合液中，充分混匀。室温静置20min。逐滴加入汇合度为80％的HEK-293T细胞，5％CO₂，37℃培养过夜。第2天小心换液，5％CO₂，37℃培养24hr后收集病毒上清保存于4℃冰箱，并加入完全培养基，5％CO₂，37℃继续培养。24hr后收集上清，2000rpm离心5min，吸取上清，与之前收集的病毒混匀，20000rpm离心2hr，弃上清，沉淀用PBS重悬后分装到EP管中，-80℃保存。

(5)接种对数生长期的人肝癌细胞株BEL-7402细胞、HepG2细胞和人宫颈癌细胞株HeLa细胞至6孔板，无抗生素的完全培养基(DMEM+10％FBS)，5％CO₂，37℃培养过夜。待细胞汇合度达80％，取适量慢病毒与polybrene(终浓度8ug/ml)加入PBS混匀，逐滴加入肿瘤细胞，5％CO₂，37℃培养过夜。重复感染细胞1次。24h后换液，5％CO₂，37℃继续培养24hr。Trizol法提取细胞总RNA。RT试剂盒(SYBR GREEN染料法)合成cDNA第一链。荧光定量PCR(SYBR GREEN染料法)分别检测：1.正常肝细胞系L02、正常人PBMC、人肝癌细胞株BEL-7402细胞、HepG2细胞和人宫颈癌细胞株HeLa细胞表达GLI2 mRNA水平。2.实验组(感染pLKO.1-Gli2 shRNA质粒病毒)、阴性对照组(感染pLKO.1-NC shRNA质粒病毒)和空白对照组(感染pLKO.1-TRC质粒病毒)GLI2基因表达水平。人β-actin基因作为内参。上述步骤均按说明书步骤进行。结果显示，2株人肝癌细胞株及HeLa细胞株表达GLI2 mRNA水平均显著高于正常人肝细胞系和正常人PBMC表达水平(见图1)。设计的shRNA序列可以有效抑制GLI2 mRNA表达。转染后48hr，pLKO.1-GLI2 shRNA组GLI2mRNA水平较pLKO.1-NC shRNA阴性对照组均显著下降(pLKO.1-GLI2 shRNA对BEL-7402细胞、HepG2细胞、HeLa细胞GLI2 mRNA表达的抑制率分别为63.1％和68.5％、86.8％)(见图2)。

(6)CCK8法检测GLI2 shRNA对人肝癌BEL-7402、HepG2细胞和人宫颈癌HeLa细胞生长的影响。接种对数生长期细胞于96孔板(3×10³个/孔)，待细胞汇合度达80％左右进行转染，转染方法与步骤(3)相同。同时设置阴性对照组和空白对照组，每组3个复孔。转染后24hr更换培养基。分别于转染后24hr、48hr、72hr加入CCK8，继续孵育4hr。光学显微镜下观察细胞形态学变化，结果显示转染空质粒及NC-shRNA质粒组细胞贴壁良好，形态未发生明显改变。转染GLI2 shRNA质粒组的BEL-7402细胞、HepG2细胞和HeLa细胞中部分细胞形态变圆，漂浮于培养上清(见图3A)。酶标仪检测各孔450nm波长处的吸光值(OD)，各组吸光值的均值表示细胞生长水平。分别计算pLKO.1-GLI2 shRNA转染组细胞、pLKO.1-NC shRNA转染组细胞相对于pLKO.1-TRC转染组细胞的细胞活力水平。实验结果显示，pLKO.1-GLI2 shRNA转染后24hr开始，实验组细胞生长水平较阴性对照组和空白对照组显著下降(见图3B、3C、3D)。pLKO.1-GLI2 shRNA对HeLa细胞增殖抑制水平最为明显。

实验表明，本发明中的GLI2-shRNA序列起到了有效抑制人GLI2基因表达的作用，敲除效率高，而且可以抑制GLI2-异常活化的肿瘤细胞的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东药科大学

<120> 一种抑制人GLI2基因表达的shRNA构建及其应用

<130> YG19100200IA001

<141> 2019-12-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

aaggtaccat tacgagcctc a 21

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

ccggaaggta ccattacgag cctcactcga gtgaggctcg taatggtacc tttttttg 58

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

aattcaaaaa aaggtaccat tacgagcctc actcgagtga ggctcgtaat ggtacctt 58

Claims

1.一种抑制人GLI2基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的靶点序列为SEQ IDNO.1所示的人GLI2基因的mRNA序列(NM_005270.4)第243位至263位核苷酸组成的基因序列。

2.根据权利要求1所述的抑制人GLI2基因表达的shRNA，其特征在于，包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示，所述反义链的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示。

3.一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体，其特征在于，所述表达载体是由序列SEQ ID NO.2和3所示的shRNA和慢病毒载体构建而成的。

4.根据权利要求3所述的抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pLKO.1-TRC。

5.根据权利要求3所述的抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建步骤为：

(1)分别合成SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列；

(2)将步骤(1)中合成的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列退火杂交形成双链DNA；

(3)将步骤(2)得到的双链DNA与载体相连，得到所述RNA干扰表达载体。

6.根据权利要求3所述的一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体在制备降低人GLI2mRNA试剂中的应用。

7.根据权利要求3所述的一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体在制备抑制人GLI2蛋白表达试剂中的应用。

8.根据权利要求3所述的一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体在制备抑制GLI2信号异常肿瘤生长的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体在制备抑制GLI2信号异常肿瘤生长的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤是经典HH信号通路异常激活的肿瘤。

10.根据权利要求9所述的一种抑制人GLI2基因表达的RNA干扰表达载体在制备抑制GLI2信号异常肿瘤生长的药物中的应用，其特征在于，所述经典HH信号通路异常激活的肿瘤包括GLI2信号异常的黑色素瘤、基底细胞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、肝癌。