JP6336755B2 - ポリコームに関連する非コードｒｎａ - Google Patents

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Description

連邦支援の研究または開発
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＲＯ１−ＧＭ−０９０２７８のもとで政府の支援によって為された。政府は本発明に特定の権利を有する。
関連出願
本出願は、それぞれ参照によってその全体が本明細書に組込まれる２０１０年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４１２，８６２号、２０１０年１２月２０日に出願された同第６１／４２５，１７４号および２０１１年７月２８日に出願された同第６１／５１２，７５４号の優先権を主張する。
技術分野
本発明は、遺伝子発現を調節する長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、およびそれを使用してまたはそれらに結合する阻害性核酸を使用して遺伝子発現を調節する方法に関する。
哺乳類ゲノムのわずか１〜２％がタンパク質をコードするが、７０〜９０％が転写活性を持つことがトランスクリプトーム解析により示唆されている（Carninci et al., 2005; Kapranov et al., 2007; Mercer et al., 2009）。１００ｎｔから１００ｋｂ超に至るまで、これらの転写物は機能が大部分不明であり、遺伝子内または遺伝子間を起源とする可能性が有り、保存されており、発生上調節されている可能性が有る（Kapranov et al., 2007; Guttman et al., 2009）。最近の発見は、これらの転写物のサブセットがエピジェネティックな調節に決定的な役割を担うことを示している。例えば、ヒトＨＯＸ−Ｄ遺伝子座の遺伝子は、連鎖していないＨＯＸ−Ｃ遺伝子座によって生成されるＨＯＴＡＩＲ ＲＮＡによってトランスに調節され（Rinn et al., 2007）、Ｘ染色体の不活化の間に、Ｔｓｉｘ、ＲｅｐＡおよびＸｉｓｔのＲＮＡはシスにてクロマチン修飾因子を標的として染色体全体のサイレンシングを制御する（Zhao et al., 2008）。興味深いことに、４つのＲＮＡはすべて、ヒストンＨ３−リシン２７のトリメチル化（Ｈ３−Ｋ２７ｍｅ3）を触媒する複合体であるポリコーム抑制複合体2（ＰＲＣ２）に結合し、それを調節する（Schwartz and Pirrotta, 2008）。これらの所見は、長鎖非コードＲＮＡがゲノムにおける特定の対立遺伝子またはユニークな位置にクロマチン修飾因子をターゲットするのに理想的であるという考えを裏付けている（Lee, 2009) (Lee, 2010）。
ＲＮＡ介在性リクルートはポリコームタンパク質にとって特に魅力的である。ホメオティック調節因子としてショウジョウバエで最初に特定されたのだが、ポリコームタンパク質はハエから哺乳類にわたって保存され、発生の多くの局面を制御する（Ringrose and Paro, 2004; Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006; Schuettengruber et al., 2007; Pietersen and van Lohuizen, 2008; Schwartz and Pirrotta, 2008）。哺乳類のＰＲＣ２は、４つのコアサブユニットであるＥｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＲｂＡｐ４８および触媒性Ｅｚｈ２を含有する。ヒトでは、異常なＰＲＣ２の発現は癌および疾患に関連する（Sparmann and van Lohuizen, 2006; Bernardi and Pandolfi, 2007; Miremadi et al., 2007; Rajasekhar and Begemann, 2007; Simon and Lange, 2008）。健康におけるポリコームの役割の認識が増しているにもかかわらず、そのインビボでの調節はほとんど分かっていない。ハエでは、ポリコーム複合体は、ポリコーム応答エレメント（ＰＲＥ）への結合に役立つＺｅｓｔｅ、Ｐｉｐｓｑｕｅａｋ（ＰＳＱ）またはＰｈｏのような配列特異的なＤＮＡ結合因子を含有する（Ringrose and Paro, 2004; Schwartz and Pirrotta, 2008）。それに対して哺乳類のポリコーム複合体はそのようなサブユニットを含有するとは考えられていない。従って、ＰＲＥ様のエレメント（Sing et al., 2009; Woo et al., 2010）およびＪａｒｉｄ２が結合を促進する可能性が有るが、何千ものゲノムの位置へのリクルートのメカニズムはほとんど理解されないままである（Li et al.; Pasini et al.; Peng et al., 2009; Shen et al., 2009）。興味深いことに、幾つかのＰＲＣ２サブユニットは、潜在的なＲＮＡ結合モチーフ（Denisenko et al., 1998; Bernstein and Allis, 2005; Bernstein et al., 2006b）、すなわち、Ｘ不活化については、Ｔｓｉｘ／ＲｅｐＡ／Ｘｉｓｔ ＲＮＡとＰＲＣ２の間の仮定された機能的相互作用（Zhao et al., 2008）によって、そして、ＨＯＸ調節については、ＨＯＴＡＩＲとＰＲＣ２（Rinn et al., 2007）によって裏付けられる可能性を有する。最近の研究はまた、ＰＲＣ２の調節因子の候補として５０〜２００ｎｔの幾つかの短鎖ＲＮＡを特定した（Kanhere et al., 2010）。ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ１）の制御にもＲＮＡが関与し得る（Yap et al., 2010）。
その遍在性にもかかわらず、多数の長鎖非コードＲＮＡの構造および機能は大部分性状分析されていないままである。最近の研究は、いくつかの長鎖非コードＲＮＡが、クロマチンのリモデリングおよび腫瘍の抑制においてエピジェネティックな調節因子／ＲＮＡ補因子としての機能を有することを示唆している。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを用いたノックダウン法はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および細胞質に局在するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（４〜６）の機能解析において不可欠な要素となっているが、これらの方法は、場合によっては、核に局在する長鎖非コードＲＮＡにとってあまり一貫して有効ではないと報告されている（Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004)）。
本明細書で「ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）‐シークエンシング」と呼ばれる方法を用いて胚性幹細胞にてポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）が相互作用する９，０００超のＲＮＡのゲノム全体のプール（本明細書では「ＰＲＣ２トランスクリプトーム」と呼ぶ）を特定した。トランスクリプトームには、アンチセンス転写物、遺伝子間転写物およびプロモーター関連転写物、ならびに多数の注釈が付けられていないＲＮＡが含まれる。インプリント領域、癌遺伝子および腫瘍抑制因子の遺伝子座および幹細胞関連の二価のドメインの中で多数の転写物が生じる。いくつかはＥｚｈ２サブユニットを介した直接的なＲＮＡ／タンパク質の相互作用の証拠が提供される。これらのＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡに特異的に結合する阻害性オリゴヌクレオチドが、おそらくＰＲＣ２関連抑制を阻害することによって、様々な別々の、独立した例で遺伝子発現を上手く増加させることができるという証拠が提供される。Ｇｔｌ２ ＲＮＡは交互にインプリントされたＤｌｋ１コーディング遺伝子にＰＲＣ２を指し向けるＰＲＣ２補因子として特定された。従って、ポリコームタンパク質は、ＲＮＡのゲノム全体のファミリーと相互作用し、そのうちのいくつかはヒトの疾患の生体マーカーおよび治療標的として使用され得る。
１つの態様において、本発明は、細胞核性リボ核酸（ｎＲＮＡ）のプールに相補的である複数の有効なｃＤＮＡを調製する方法を提供する。その方法は、細胞核性リボ核酸を含む試料、例えば、核の溶解物を含む、例えば、核タンパク質に結合するｎＲＮＡを含む試料を提供すること；細胞核性リボ核酸に結合することが知られている、または疑われている核タンパク質と特異的に結合する作用因子、例えば、抗体と試料を、その作用因子とそのタンパク質の間で複合体を形成するのに十分な条件下で接触させること；その複合体を単離すること；ｃＤＮＡの最初の集団を提供するためにｎＲＮＡに相補的であるＤＮＡを合成すること；必要に応じてストランド特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うこと；長さが少なくとも約２０ヌクレオチド（ｎｔ）の、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００または２５０ｎｔである精製したｃＤＮＡの集団を得るために、ｃＤＮＡの最初の集団を精製すること；精製したｃＤＮＡの集団の少なくとも一部または実質的にすべての配列を決定すること；基準ゲノムに対してリードを並べ、アラインしたもののみを保持すること；例えば、（１）候補転写物が、１００万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）単位で最小リード密度を有する（例えば、所望の閾値を上回る）、および（２）候補転写物が、好適な対照ライブラリー（例えば、ＩｇＧプルダウンライブラリーまたはタンパク質−ヌルプルダウンライブラリー）と比較して野生型ライブラリーにて濃縮される；という２つの基準に基づいて信頼の高いｃＤＮＡ配列を選択すること；それによって複数のｃＤＮＡを調製することを含む。
細胞核性リボ核酸に結合することが分っているまたは疑われる核タンパク質の一部の例には、Ｅｚｈ２(Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6; Khalil et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 14;106(28):11667-72. Epub 2009 Jul 1)；Ｇ９ａ(Nagano et al., Science. 2008 Dec 12;322(5908):1717-20. Epub 2008 Nov 6)；およびＣｂｘ７(Yap et al., Mol Cell. 2010 Jun 11 ; 38(5) :662-74.)が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞核性リボ核酸（ｎＲＮＡ）のプールに相補的である複数の検証されたｃＤＮＡを調製する方法を含む。その方法は、細胞核性リボ核酸を含む試料、例えば、核の溶解物を含む試料、例えば、核タンパク質に結合するｎＲＮＡを含む試料を提供すること；細胞核性リボ核酸と結合することが知られている、または疑われている核タンパク質、例えば、Ｅｚｈ２、Ｇ９ａまたはＣｂｘ７に特異的に結合する作用因子、例えば、抗体と試料を、例えば、ｎＲＮＡがタンパク質に結合したままでいるような、その作用因子とそのタンパク質の間で複合体を形成するのに十分な条件下で接触させること；複合体を単離すること；ｃＤＮＡの最初の集団を提供するためにｎＲＮＡに相補的であるＤＮＡを合成すること；所望により、ストランド特異的なプライマーを用いてｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うこと；長さが少なくとも約２０ヌクレオチド（ｎｔ）の、例えば、長さが少なくとも２５、５０、１００、１５０または２００ｎｔである精製したｃＤＮＡの集団を得るために、ｃＤＮＡの最初の集団を精製すること；精製したｃＤＮＡの集団の少なくとも一部または実質的にすべての配列決定を行うこと；信頼性の高い配列を基準ゲノムと比較し、基準ゲノムの配列に対して高い程度の同一性、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％の同一性を有する、または１０、５、２または１より少ないミスマッチを有する配列を選択すること；および（ｉ）所望の閾値を超える１００万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）を有し、（ｉｉ）対照ライブラリー（タンパク質−ヌルライブラリーまたは並行して行われるＩｇＧプルダウンから作製されるライブラリー）と比較して、濃縮されるｃＤＮＡを選択すること；それによってｃＤＮＡのライブラリーを調製することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法を用いて対象タンパク質に関連するトランスクリプトームに対応するライブラリーを調製する。
いくつかの実施形態において、作用因子は抗体であり、複合体を単離することは複合体を免疫沈降させることを含む。いくつかの実施形態において、ストランド特異的なアダプターを用いてｃＤＮＡを合成する。
いくつかの実施形態において、前記方法はさらにｃＤＮＡの実質的にすべてを配列決定することを含む。
別の態様において、本発明は、請求項１〜４の方法によって調製される細胞核性リボ核酸（ｎＲＮＡ）のプールに相補的であるｃＤＮＡのライブラリーを特徴とする。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡのそれぞれは、基材（例えば、マイクロアレイ）上の個々にアドレス指定可能なビーズまたは領域に連結される。
別の態様において、本発明は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）に結合するＲＮＡ、例えば、配列番号１〜１９３，０４９に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸を特徴とする。本発明の理論に束縛されるものではないが、これらの阻害性核酸は、特定の染色体座位へのＰＲＣ２のリクルートを妨害することによってＰＲＣ２の結合および機能を妨害することができる。例えば、本明細書のデータは、ｌｎｃＲＮＡを特異的に結合するように設計された阻害性核酸の単回投与がｌｎｃＲＮＡだけでなく、ｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２も結合クロマチンから安定して移動させることができることを示す。移動の後、完全に補完的なＰＲＣ２は２４時間まで回復しない。本明細書で提供されるデータはまた、ＰＲＣ２の推定上のｌｎｃＲＮＡ結合部位は、保存された一次配列モチーフを示さず、他のｌｎｃＲＮＡとのＰＲＣ２の相互作用を一般的に破壊することなく、単一のｌｎｃＲＮＡとのＰＲＣ２の相互作用を妨害する特定の阻害性核酸の設計を可能にする。さらに、本明細書で提供されるデータはまた、ｌｎｃＲＮＡはシス方式でＰＲＣ２をリクルートすることができ、そのｌｎｃＲＮＡが転写される特定の染色体座位にてまたはその近傍にて遺伝子発現を抑制し、したがって、ＰＲＣ２の機能を阻害し、特定の標的遺伝子の発現を上昇させる阻害性核酸を設計するのを可能にすることを裏付けている。
いくつかの実施形態において、その発現がＰＲＣ２結合ＲＮＡによって調節される遺伝子を意味する、「ＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子」（例えば、以下の表１〜８で述べるようなインターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）の発現を調節する方法に使用するために阻害性核酸が提供される。「ＰＲＣ２結合ＲＮＡ」または「ＰＲＣ２と結合するＲＮＡ」という用語は「ＰＲＣ２関連ＲＮＡ」および「ＰＲＣ２相互作用ＲＮＡ」と互換的に使用され、ＰＲＣ２複合体に直接または間接的に結合するｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ転写物またはその領域（例えば、以下で記載されるようなピーク）を指す。そのような結合は、ＰＲＣ２複合体の成分、例えば、Ｅｚｈ２に対する抗体を用いる免疫沈降法によって決定され得る。配列番号１〜１９３，０４９は、本明細書で記載されるＲＩＰ‐シークエンシング法を用いてＰＲＣ２を結合することが実験的に決定された部分を含有するマウスのＲＮＡ配列、またはこれらのマウスのＲＮＡ配列に対応するヒトのＲＮＡ配列を表す。
遺伝子発現を調節するそのような方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施され得る。表８はＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子を示し；ＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号が遺伝子名と同じ行に示される。いくつかの実施形態において、疾患、例えば、表９で述べられる疾患の部類を治療する方法で使用するために阻害性核酸が提供される。治療には、ＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を（上方または下方のいずれかに）調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方調節することを含む。阻害性核酸は、非経口投与用の無菌組成物として製剤化され得る。本記載を通して、化合物の使用に対するどのような言及も、疾患の治療に使用される医薬組成物または医薬品の調製でのその化合物の使用を考慮すると理解される。従って、１つの非限定例として、本発明のこの態様は、ＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を増加させることを含む疾患の治療における用途のため、医薬品の調製にそのような阻害性核酸を使用することを含む。
本発明に従って治療され得る疾患、障害または状態には、循環器系障害、代謝性障害、炎症性障害、骨の障害、神経性または神経変性障害、肺障害、肝臓障害、腎臓障害、尿生殖器障害、骨の障害、癌および／またはタンパク質欠損障害が挙げられる。疾患の部類の例が表９に示される。
関連する態様において、本発明は、遺伝子発現を調節する阻害性核酸を調製する方法であって、ＰＲＣ２に結合するとして特定されているＲＮＡ配列、所望により、表１〜８または配列番号１〜１９３，０４９のいずれかのＲＮＡに特異的に結合する、またはそれに対して相補的である、長さが５〜４０塩基の間の阻害性核酸を合成する工程を含む前記方法を特色とする。本発明のこの態様は、所望により、本明細書で記載されるＲＩＰ‐シークエンシング法を介してＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列を特定する工程をさらに含む。
本発明のさらなる態様において、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）に結合するＲＮＡに特異的に結合する阻害性核酸を調製する方法が提供され、その方法は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列、任意で表１〜８または配列番号１〜１９３，０４９のいずれかのＲＮＡに特異的に結合する長さ５〜４０塩基の間で、所望により、一本鎖の阻害性核酸を設計するおよび／または合成する工程を含む。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸を合成する前に、方法はさらにＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡはＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することを含む方法によって特定されている。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＰＲＣ２に結合する前記ＲＮＡ配列における５〜４０塩基の間の連続する配列に対して少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、設計されたおよび／または合成された阻害性核酸の配列は、ＰＲＣ２に結合する前記ＲＮＡ配列またはその一部に基づき、前記一部は５〜４０の連続塩基対の長さを有する。
いくつかの実施形態において、設計されたおよび／または合成された阻害性核酸の配列は、ＰＲＣ２に結合する前記ＲＮＡ配列に対して相補的である、またはその一部に相補的である核酸配列に基づき、前記一部は５〜４０の連続塩基対の長さを有する。
設計されたおよび／または合成された阻害性核酸は、それが結合するもしくは標的とする、または結合するもしくは標的とすることを意図するＲＮＡ配列の一部に対して少なくとも８０％相補性（任意で、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つにて相補性で）であり得る。いくつかの実施形態において、それは、標的ＲＮＡ配列またはその相補体それぞれの一部と比較して１、２または３の塩基ミスマッチを含有し得る。いくつかの実施形態において、それは、１５塩基について３までのミスマッチ、または１０塩基について２までのミスマッチを有し得る。
ＰＲＣ２に結合する阻害性核酸またはＲＮＡ配列の一部は、少なくとも８〜４０または１０〜５０または５〜５０の塩基のうちの１つの長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の塩基を有し得る。前記阻害性核酸が、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列、ＰＲＣ２に結合する前記ＲＮＡ配列に相補的である核酸配列またはそのような配列の一部に基づく場合、それは、その配列についての情報、例えば、公的に利用可能な科学出版物または配列データベースに含有される配列情報を含み得る記録形態または電子形態で利用可能な配列情報に基づき得る。
設計および／または合成がそのような配列情報によって記載される核酸に対して相補的である配列の設計および／または合成を含む場合、当業者は、例えば、その分野で共通する一般的な知識の一部を形成するワトソン／クリックの塩基対形成規則の理解を介して相補性の配列を容易に決定することができる。
上述の方法では、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することを含む方法によってＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することができる、もしくは得ることができる、または、特定した、もしくは得た。
そのような方法は以下の工程、すなわち、細胞核性リボ核酸を含有する試料を提供すること、ＰＲＣ２またはそのサブユニットに特異的に結合する作用因子に試料を接触させて、試料において作用因子とタンパク質の間で複合体が形成できるようにすること、複合体を区分化すること、複合体に存在する核酸に対して相補的である核酸を合成することを含み得る。
必要に応じて、方法はさらに合成された核酸を増幅する工程、および／または核酸（または増幅された核酸）を精製する工程、および／またはそのように得られた核酸の配列決定を行う工程、および／またはそのように得られた核酸を選別し／解析して確率の高いＰＲＣ２（またはそのサブユニット）と相互作用する転写物を特定する工程を含み得る。
一実施形態において、方法は、本明細書で記載されるＲip‐シークエンシング法を含む。
上記によれば、いくつかの実施形態において、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡは、ＰＲＣ２を結合することが分っているものであってもよく、例えば、ＲＮＡの配列および／またはＰＲＣ２を結合するその能力に関する情報は、その情報に基づかれる阻害性核酸の設計および／または合成を可能にする記録形態または電子形態で一般に公開されている。従って、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡは、既知の配列情報から選択され、阻害性核酸の設計および／または合成について情報を提供するのに使用され得る。
他の実施形態において、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡは、設計および／または合成の方法の一部としてＰＲＣ２と結合するものとして特定され得る。
好ましい実施形態において、阻害性核酸の設計および／または合成には、当業者に既知の技法による出発物質からの核酸の製造が関与し、その際、合成はポリコーム抑制複合体２に結合することが分っているとして選択されているＲＮＡ（またはその一部）の配列に基づき得る。
阻害性核酸の設計および／または合成の方法は、
ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列を特定する、および／または選択する工程；
ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列の一部を特定する、および／または選択する工程：
ＰＲＣ２またはその一部に結合するＲＮＡ配列に対して所望の程度の配列同一性または相補性を有する核酸配列を設計する工程；
設計した配列に核酸を合成する工程；
合成した核酸を少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または賦形剤と混合して医薬組成物または医薬品を形成する工程
の１以上を含み得る。
そのように設計されたおよび／または合成された阻害性核酸は本明細書で記載されるような遺伝子発現を調節する方法において有用であり得る。
従って、阻害性核酸を調製する方法は、疾患の治療で使用するための医薬組成物または医薬品の製造にて使用するためである方法であり得、その際任意で、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を調節することが治療に含まれる。
さらに別の態様において、本発明は、表１、２、３、６および／または７、または表８、または、ここには添付されていないが、その全体が参照によって本明細書に組込まれる２０１０年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号の別表Ｉにて参照される配列、または、たとえば別表Ｉで示されるような、少なくとも２０ｎｔを含むその断片を含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離される核酸は合成ものである。
さらなる態様において、本発明は、細胞における癌遺伝子の発現を低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法には、表６で参照される長鎖非コードＲＮＡもしくはそのＰＲＣ２結合断片、または表６で参照されるｌｎｃＲＮＡもしくはそのＰＲＣ２結合断片に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相同である核酸配列に細胞を接触させることが含まれる。ＰＲＣ２と結合するｌｎｃＲＮＡの能力を保持する、マウスのｌｎｃＲＮＡまたはヒトのｌｎｃＲＮＡを含むオルソログｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２結合断片が考えられている。いくつかの実施形態において、癌遺伝子はｃ−ｍｙｃである。いくつかの実施形態において、長鎖非コードＲＮＡはＰｖｔ１である。
さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類、例えば、ヒトにおいて腫瘍抑制因子の発現を上昇させる方法を特徴とする。方法には、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトのＰＲＣ２と相互作用するｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、および／または表２の増殖抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、１００）の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも９０％、（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一である関連する天然に存在するｌｎｃＲＮＡを、腫瘍抑制因子の発現を上昇させるのに有効な量で哺乳類に投与することが含まれる。従って、マウスのｌｎｃＲＮＡに対応するヒトのオルソログｌｎｃＲＮＡを決定する方法の１つは、マウスの配列の少なくとも１５核酸塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００）に対して少なくとも９０％同一である対応するヒト配列を特定することである。
追加の態様において、本発明は、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトのＰＲＣ２と相互作用するｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、および／または表２の増殖抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、５０、７０、１００）の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも９０％、（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一である関連する天然に存在するｌｎｃＲＮＡを、腫瘍増殖を抑制するまたは阻害するのに有効な量で哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類、例えば、癌のヒトにおいて腫瘍の増殖を抑制するまたは阻害する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するもしくは相補的である阻害性核酸、または表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、および／または表２の増殖抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡ、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、５０、７０、１００）の核酸塩基にわたってオルソログであるもしくは少なくとも９０％、（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一である関連する天然に存在するｌｎｃＲＮＡを、治療上有効な量で哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類、例えば、癌のヒトを治療する方法を特徴とする。
いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、標的核酸の少なくとも一部とハイブリッドを形成し、その機能を調節するオリゴマー塩基化合物またはオリゴヌクレオチド模倣体である。いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は一本鎖または二本鎖である。様々な例となる阻害性核酸が当該技術で既知であり、記載されている。いくつかの例では、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物である。「ＬＮＡ分子」という用語は、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含む分子を指すので、ＬＮＡ分子は１以上のロックされたヌクレオチド（立体構造上拘束された）および１以上のロックされないヌクレオチドを有し得ることが理解される。「ＬＮＡ」という用語には、相補性ＲＮＡへの高い結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、免疫刺激の欠如、および迅速な動態という所望の特性を保持する制約付きの糖を含むヌクレオチドが含まれることも理解される。例となる制約付きの糖には以下に列記されるものが挙げられる。同様に、「ＰＮＡ分子」という用語は少なくとも１つのＰＮＡ修飾を含み、そのような分子は非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を含み得ることが理解される。
いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの修飾（例えば、修飾された塩基、または修飾された糖部分を伴う）、修飾されたヌクレオシド間結合および／またはそれらの組み合わせを含む。従って、阻害性核酸は、修飾されたヌクレオシドおよび結合、ならびに天然のヌクレオシドおよび結合を含むことができる。ハイブリッドまたはギャップマーを含むそのようなキメラ阻害性核酸の例は以下に記載される。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、修飾された糖部分、および／または修飾されたヌクレオシド間結合、および／または修飾されたヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含む１以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド間結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸三エステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルまたはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の糖部分、２’−メトキシ修飾の糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾の糖部分、または二環式糖部分を含む。修飾の他の例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）（任意で２’−Ｆ修飾を伴う）、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ホスホルアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、エチレン架橋の核酸（ＥＮＡ）（任意で２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋を伴う）、および二環式核酸（ＢＮＡ）が挙げられる。さらなる他の例は以下で記載される、および／または当該技術で既知である。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は長さ５〜４０塩基（例えば、１2〜３０、１２〜２８、１２〜２５）である。阻害性核酸は長さ１０〜５０または５〜５０塩基であってもよい。例えば、阻害性核酸は長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基のうちのいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は二本鎖であり、一方の末端または双方の末端でオーバーハング（任意で長さ２〜６の塩基）を含む。他の実施形態において、阻害性核酸は二本鎖であり、平滑末端である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０塩基もしくは３０もしくは４０までの塩基に対して少なくとも８０％または９０％相補的である配列を含む、もしくはそれから成る、または標的ＲＮＡの１０、１５、２０、２５または３０塩基にわたって３までのミスマッチ（例えば、１まで、または２までのミスマッチ）を有する塩基配列を含む。
従って、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも１０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも１５、もしくは１５〜３０もしくは１５〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２０、もしくは２０〜３０もしくは２０〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２５、もしくは２５〜３０もしくは２５〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも３０、もしくは３０〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。さらに、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも１０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも１５、もしくは１５〜３０もしくは１５〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２０、もしくは２０〜３０もしくは２０〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２５、もしくは２５〜３０もしくは２５〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも３０、もしくは３０〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも５、１０または１５の連続塩基に対して完全に相補性ある塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。
相補性は、上で言及したように、相補性の塩基の対形成におけるミスマッチの数という点でも参照することができる。従って、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０の連続塩基にわたって３までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの１５の連続塩基にわたって３までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの２０の連続塩基にわたって３までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの２５の連続塩基にわたって３までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの３０の連続塩基にわたって３までのミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０の連続塩基にわたって２までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの１５の連続塩基にわたって２までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの２０の連続塩基にわたって２までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの２５の連続塩基にわたって２までのミスマッチを有する、または標的ＲＮＡの３０の連続塩基にわたって２までのミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０、１５、２０、２５または３０の連続塩基にわたって１のミスマッチを有する塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。
従って、いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的ｌｎｃＲＮＡの少なくとも５〜４０塩基（任意で１０、１５、２０、２５または３０塩基のうちの１つ、または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基のうちの１つ）の連続配列に対して少なくとも８０％の相補性（任意で少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相補性）である塩基配列を含む、長さ約５〜４０、または１０〜５０または５〜５０塩基配列を含み、またはそれから成る。従って、いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的ｌｎｃＲＮＡに対して配列で完全に相補的である同じ長さのアンチセンス核酸の塩基の連続配列に対して８０％の同一性（任意で少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有する少なくとも５〜４０または５〜５０または１０〜５０の塩基（任意で１０、１５、２０、２５または３０塩基のうちの１つまたは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基のうちの１つ）の配列を含み得る、またはそれから成り得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸の配列は、標的ｌｎｃＲＮＡの１０、１５、２０、２５または３０塩基（任意で１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のうちの１つ）にわたる標的ｌｎｃＲＮＡ配列と比べて相補性の塩基対形成において１、２または３のミスマッチを含有し得る。
いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、長さ５〜４０または１０〜５０塩基（例えば、長さ１２〜３０、１２〜２８、１２〜２５、５〜２５または１０〜２５の塩基）であり、１５塩基にわたる相補性の塩基対形成において３までのミスマッチ、または１０塩基にわたって２までのミスマッチを有する塩基配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロまたはインビボ、例えば、対象における癌細胞、例えば、腫瘍細胞である。他の実施形態において、細胞は、阻害性核酸、ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡ、またはその断片と生体外で接触させて、多能性を高め、分化を高め、または幹細胞の特定の細胞種、例えば、神経、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、筋肉、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、神経内分泌、網膜、網膜色素上皮、膵臓のαおよびβ細胞、造血系細胞、軟骨細胞、骨細胞および／または血液細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、赤血球、血小板等）への分化を誘導する幹細胞である。
いくつかの実施形態において、遺伝子はＮｋｘ２−１（Ｔｉｔｆ１としても知られる）である。いくつかの実施形態において、Ｎｋｘ２−１に対する長鎖非コード（アンチセンス）ＲＮＡは、ＡＫ１４３００を含むＮｋｘ２−１プロモーター；またはＮＲ＿００３３６７．１とおそらく重複しておよそ５７，６３６，１００〜５７，６３８，６５０の塩基対でマウスの第１２染色体上にある。ヒトでは、類似のアンチセンス転写物は、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子座に存在する（ヒト遺伝子ＢＸ１６１４９６；Ｃｈｒ１４：ヒトのゲノムアセンブリバージョンＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９におけるｂｐ３６，９８８，５２１−３６，９９１，７２２と、一致しないまでも、重複する）。Ｎｋｘ２−１は、腫瘍抑制因子および癌遺伝子の両方である。早い段階では、Ｎｋｘ２−１は腫瘍を形成するために必要とされ、後になってその発現が失われ、その喪失が予後不良に相関する。そのため、Ｎｋｘ２−１を標的とするｌｎｃＲＮＡは少なくとも２つの用途を有する。すなわち、そのｌｎｃＲＮＡは、投与されてそれ自体が癌の形成を阻止することができ、または後になってその発現を低下させてＮＫＸ２−１の発現を上げることができる。ヒトでは、ＮＫＸ２−１は、肺腺癌にて増幅され、変異することが多く、肺の腫瘍形成と直接関連付けられている。それは癌発生の初期においては癌原遺伝子として説明されるが、同時にその発現の喪失は最終的に予後不良に関連する。従って、いくつかの実施形態において、プロモーターに関連するアンチセンス転写物を対象、例えば、癌、例えば、肺腺癌の対象に投与し、および／または腫瘍細胞に導入し、それによって、増幅したＮＫＸ２−１を発現した患者にてＮＫＸ２−１の発現を低下させる。或いは、ＮＫＸ２−１の発現を喪失している予後不良の対象（例えば、癌、例えば、肺腺癌の対象）にて、ＬＮＡ分子のような阻害性ＲＮＡを導入してＰＲＣ２と相互作用するアンチセンス転写物と拮抗させ、ＮＫＸ２−１遺伝子の発現を再開させる。
追加の態様において、本発明は幹細胞の多能性を高める方法を提供する。方法は、表３にあるような長鎖非コードＲＮＡもしくはそのＰＲＣ２結合断片、表３にあるようなｌｎｃＲＮＡ配列もしくはそのＰＲＣ２結合断片に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同である核酸配列に細胞を接触させることを含む。マウスのｌｎｃＲＮＡ、またはヒトｌｎｃＲＮＡを含むオルソログｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２結合断片は前述の方法で企図される。
さらなる態様において、本発明は、幹細胞の分化を高める方法を特徴とするが、該方法は、表３および表４にあるような長鎖非コードＲＮＡに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸に細胞を接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、幹細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞はｉＰＳ細胞または成体幹細胞である。
追加の態様において、本発明は、非経口投与のための、表１、２、６もしくは７もしくは８のｌｎｃＲＮＡ（の少なくとも5、１０、１５、２０、２５または３０塩基、または３０もしくは４０までの塩基）に特異的に結合するもしくはそれに対して少なくとも９０％相補的である阻害性核酸、または表１、２、６もしくは７もしくは８のｌｎｃＲＮＡの少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、１００）核酸塩基に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である関連する天然に存在するｌｎｃＲＮＡを含む無菌組成物を提供する。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、および一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ化合物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ誘導の遺伝子活性化（ＲＮＡａ）および低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）から成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド結合、修飾されたヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含む１以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸三エステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルまたはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の糖部分、２’−メトキシ修飾の糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾の糖部分、または二環式糖部分を含む。修飾の他の例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）（任意で２’−Ｆ修飾を伴う）、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ホスホルアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、エチレン架橋の核酸（ＥＮＡ）（任意で２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋を伴う）、および二環式核酸（ＢＮＡ）が挙げられる。さらなる他の例は以下で記載されるおよび／または当該技術で既知である。
以下で要約される配列表に示されるＲＮＡのいずれのＰＲＣ２結合断片も考えられている。いくつかの態様において、断片はＰＲＣ２をリクルートし、ＰＲＣ２活性を高め得るが、それによって遺伝子発現を抑制する一方で、他の例では、断片はＰＲＣ２上のｌｎｃＲＮＡ結合部位を覆い隠すことによってＰＲＣ２活性を妨害し得る。特に、本発明は、以下のＲＮＡ断片を使用して、表９で示す（「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれか）部類のいずれかに記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するために表１〜８で示す遺伝子のいずれかの発現を調節することを特徴とする。
さらに、以下で要約される配列表、配列番号１〜１９３，０４９で示すＲＮＡのいずれかに特異的に結合する阻害性核酸も考えられている。特に、本発明は、表９で示す（表８の「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれか）部類のいずれかに記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するために表１〜８で示す遺伝子のいずれかの発現を上方調節するためのこれらの阻害性核酸の使用を特徴とし；いずれの部類において一緒に群分けされた一連の遺伝子の上方調節も考えられている。そのような阻害性核酸が、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現を約５０％（すなわち、正常の１５０％または１．５倍）または約２倍〜約５倍高めたという証拠も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、発現が、約１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍、または前述の数のいずれかの間の範囲に高められ得ることが考えられている。他の実験では、高められたｍＲＮＡ発現は、高められたタンパク質発現と相関することが示されている。
配列表における配列の要約を以下に示す。
配列番号は、ＰＲＣ２（すなわち、阻害性核酸が指し向けられるＲＮＡ）に会合する（結合する）ＲＮＡを指す。（ａ）表に記載された基準遺伝子、（ｂ）これらの遺伝子を標的とする（の発現を調節する）Ｐｒｃ２結合転写物またはピーク（すなわち、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡのさらに小さい領域）、および（ｃ）ＰＲＣ２結合転写物またはピークに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸のそれぞれは、以下の表９における番号によって表されるこれらの部類のうちのいずれか１つに好都合に群分けされ得る。
疾患は、部類番号１１、１４、１５、１７、２１、２４、２６、４２、４４、４９、５８、６９、８２、１０３、１１９、１２０、１２６、１４３、１６３、１６７、１７２、１７７、１８２、１８３、１８４、１８７、１９１、１９６、２００、２０３、２０４、２１２、３００〜３２３のうちのいずれか１つ、または４００〜６４３のうちのいずれか１つによって指し示される。
他の機能的な群は、部類番号１０、１２、１３、１６、１８、１９、２０、２２、２３、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、または２１８よって指し示される。
部類
番号 名称
１０ アクチン細胞骨格組織化
１１ 急性骨髄性白血病
１２ 接着接合
１３ 脂肪サイトカインのシグナル伝達経路
１４ 加齢
１５ アルツハイマー病
１６ アミノ糖およびヌクレオチド糖の代謝
１７ 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
１８ 血管新生
１９ アポトーシス
２０ アルギニンおよびプロリンの代謝
２１ 催不整脈性右心室心筋症（ＡＲＶＣ）
２２ 軸索誘導
２３ Ｂ細胞受容体のシグナル伝達経路
２４ 基底細胞癌（部類６４４にも該当）
２５ 基底転写因子
２６ 膀胱癌（部類６４４にも該当）
２７ 血液凝固
２８ 血管の発生
２９ 骨の発達
３０ カルシウムのシグナル伝達経路
３１ 心筋収縮
３２ カチオンチャンネル活性
３３ 細胞接着
３４ 細胞周期 (cell cycle)
３５ 細胞周期 (Cell cycle)
３６ 細胞運動
３７ 細胞表面受容体に連鎖したシグナル伝達
３８ ストレスに対する細胞応答
３９ チャンネル活性
４０ ケモカインのシグナル伝達経路
４１ コレステロールの代謝過程
４２ 慢性骨髄性白血病
４３ クエン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）
４４ 結腸直腸癌
４５ 補体および凝固のカスケード
４６ サイトカイン活性
４７ 細胞骨格タンパク質結合
４８ 細胞質ゾル
４９ 拡張型心筋症
５０ ＤＮＡ結合
５１ ＤＮＡ修復
５２ ＤＮＡ複製
５３ ＤＮＡ複製
５４ 薬剤代謝
５５ 胎児性形態形成
５６ エンドサイトーシス (endocytosis)
５７ エンドサイトーシス (Endocytosis)
５８ 子宮内膜癌
５９ 小胞体
６０ ＥｒｂＢのシグナル伝達経路
６１ 細胞外領域
６２ 眼の発生
６３ 脂肪酸の代謝
６４ フルクトースおよびマンノースの代謝
６５ Ｇタンパク質結合受容体タンパク質のシグナル伝達経路
６６ 配偶子の生成
６７ ギャップ接合
６８ ｍｉＲＮＡによる遺伝子のサイレンシング
６９ 神経膠腫
７０ グルコースの代謝過程
７１ 解糖／糖新生
７２ ゴルジ装置
７３ 増殖因子の活性
７４ ＧＴＰ分解酵素の調節因子活性
７５ 心臓の発生
７６ ヘッジホッグシグナル伝達経路
７７ 造血系細胞系列
７８ 造血
７９ 造血系またはリンパ系臓器の発生
８０ ヒストン修飾
８１ ハンチントン病
８２ 肥大型心筋症（ＨＣＭ）
８３ 免疫応答
８４ 免疫系の発達
８５ 炎症反応
８６ インスリンのシグナル伝達経路
８７ 細胞内のシグナル伝達カスケード
８８ イオンチャンネルの活性
８９ イオン輸送
９０ Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路
９１ 学習または記憶
９２ 白血球活性化
９３ 白血球の経内皮移動
９４ 四肢の発達
９５ 運動器官の挙動
９６ 長期の強化
９７ 肺の発生
９８ リソソーム (lysosome)
９９ リソソーム (Lysosome)
１００ ＭＡＰＫのシグナル伝達経路
１０１ ＭＡＰＫＫＫのカスケード
１０２ メラニン形成
１０３ 黒色腫
１０４ ミスマッチ修復
１０５ ミトコンドリア
１０６ ミトコンドリアの組織化
１０７ ｍＴＯＲのシグナル伝達経路
１０８ 筋肉組織の発達
１０９ 非コードＲＮＡの代謝過程
１１０ ニューロンの発生
１１１ 神経栄養因子のシグナル伝達経路
１１２ 非小細胞肺癌（部類６４４にも該当）
１１３ ノッチのシグナル伝達経路
１１４ 核小体
１１５ 卵母細胞の減数分裂
１１６ 酸化還元
１１７ 酸化的リン酸化
１１８ ｐ５３のシグナル伝達経路
１１９ 膵臓癌（部類６４４にも該当）
１２０ パーキンソン病
１２１ 癌における経路（部類６４４にも該当）
１２２ ホスファターゼ活性
１２３ リンタンパク質ホスファターゼ活性
１２４ 細胞性生合成過程の正の調節
１２５ ＰＰＡＲのシグナル伝達経路
１２６ 前立腺癌（部類６４４にも該当）
１２７ プロテアソーム
１２８ タンパク質アミノ酸の脱リン酸化
１２９ タンパク質の折り畳み
１３０ タンパク質キナーゼ活性
１３１ タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ活性
１３２ プリン代謝
１３３ ピリミジン代謝
１３４ Ｒａｓタンパク質のシグナル伝達
１３５ アクチン細胞骨格の調節
１３６ 自食作用の調節
１３７ 細胞死の調節（部類６４４にも該当）
１３８ 細胞増殖の調節（部類６４４にも該当）
１３９ 細胞の大きさの調節
１４０ タンパク質のユビキチン化の調節
１４１ Ｒａｓタンパク質のシグナル伝達の調節
１４２ 転写の調節
１４３ 腎細胞癌（部類６４４にも該当）
１４４ 低酸素に対する応答
１４５ ステロイドホルモンの刺激に対する応答
１４６ ウイルスに対する応答
１４７ リボソーム
１４８ ＲＮＡの分解
１４９ ＲＮＡのプロセシング
１５０ エステル交換反応を介したＲＮＡのスプライシング
１５１ 分泌
１５２ 骨格系の発達
１５３ 骨格系の形態形成
１５４ 小細胞肺癌（部類６４４にも該当）
１５５ 低分子のＧＴＰ分解酵素調節因子の活性
１５６ 精子形成
１５７ スフィンゴ脂質の代謝
１５８ スプライセオソーム (spliceosome)
１５９ スプライセオソーム (Spliceosome)
１６０ 幹細胞の分化
１６１ ステロイドの生合成
１６２ シナプス
１６３ 全身性エリテマトーデス
１６４ Ｔ細胞活性化
１６５ Ｔ細胞受容体のシグナル伝達経路
１６６ ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路
１６７ 甲状腺癌（部類６４４にも該当）
１６８ トール様受容体のシグナル伝達経路
１６９ 転写活性化因子の活性
１７０ 転写因子の活性
１７１ 翻訳
１７２ ＩＩ型糖尿病
１７３ ユビキチン介在性のタンパク質分解
１７４ 血管平滑筋の収縮
１７５ 血管系の発生
１７６ ＶＥＧＦのシグナル伝達経路
１７７ ウイルス性心筋炎
１７８ Ｗｎｔのシグナル伝達経路
１７９ アミノ酸の生合成
１８０ ａｎｋの反復
１８１ ブロモドメイン
１８２ 心筋症
１８３ 白内障
１８４ シャルコー・マリー・ツース病
１８５ サイトカイン
１８６ サイトカイン受容体
１８７ 難聴
１８８ 疾患の変異
１８９ ｅｇｆ様ドメイン
１９０ エンドソーム
１９１ 癲癇
１９２ 糖タンパク質
１９３ 増殖因子
１９４ 増殖因子の結合
１９５ 増殖因子受容体
１９６ 魚鱗癬
１９７ 免疫グロブリンドメイン
１９８ イオンチャンネル
１９９ ロイシンリッチ反復
２００ 大脳白質萎縮症
２０１ メチル化
２０２ メチルトランスフェラーゼ
２０３ 神経変性
２０４ 神経症
２０５ 核
２０６ 肥満
２０７ タンパク質ホスファターゼ
２０８ タンパク質ホスファターゼ阻害因子
２０９ 癌遺伝子（癌原遺伝子を含む）（部類６４４にも該当）
２１０ 分泌される
２１１ セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼ
２１２ 全身性エリテマトーデス
２１３ 膜貫通
２１４ 膜貫通タンパク質
２１５ 腫瘍抑制因子（部類６４４にも該当）
２１６ チロシンタンパク質キナーゼ
２１７ ｕｂｌ抱合経路
２１８ ｗｄ反復
３００ 膀胱癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０１ 白血病において下方調節（部類６４４にも該当）
３０２ 脳腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
３０３ 乳癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０４ 子宮頸癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０５ 結腸癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０６ 食道癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０７ 胃癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０８ 頭頸部癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３０９ 腎臓癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１０ 肝臓癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１１ 肺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１２ リンパ腫において下方調節（部類６４４にも該当）
３１３ 黒色腫において下方調節（部類６４４にも該当）
３１４ 多発性骨髄腫において下方調節（部類６４４にも該当）
３１５ 卵巣癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１６ 膵臓癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１７ 前立腺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３１８ 肉腫において下方調節（部類６４４にも該当）
３１９ 非黒色腫の皮膚癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３２０ 部類６４４にもある子宮癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３２１ 中皮腫において下方調節（部類６４４にも該当）
３２２ 副腎癌において下方調節（部類６４４にも該当）
３２３ 副甲状腺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
４００ 腎臓の明細胞肉腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４０１ 急性の肺損傷において上方調節
４０２ 急性巨核芽球性白血病において上方調節（部類６４４にも該当）
４０３ 急性骨髄性白血病において上方調節（部類６４４にも該当）
４０４ 詳細不明の急性膵炎において上方調節
４０５ 食道の腺癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４０６ 肺の腺癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４０７ 小腸の腺腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４０８ アデノウイルス感染において上方調節
４０９ 脳炎を伴ったＡＩＤＳにおいて上方調節
４１０ アルコール中毒症において上方調節
４１１ アレキサンダー病において上方調節
４１２ α−１アンチトリプシン欠乏症において上方調節
４１３ アルツハイマー病において上方調節
４１４ 退形成性乏突起星細胞腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４１５ アンドロゲン不感症症候群において上方調節
４１６ 星状細胞腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４１７ 筋肉萎縮において上方調節
４１８ 自己免疫性肝炎において上方調節
４１９ 細菌感染において上方調節
４２０ バレット食道において上方調節
４２１ 小腸のその場での癌腫において上方調節（部類６４４ｅにも該当）
４２２ 心筋症において上方調節
４２３ 慢性肉芽腫性疾患において上方調節
４２４ 慢性リンパ性白血病において上方調節
４２５ 慢性閉塞性気道疾患において上方調節
４２６ 慢性多関節性若年性関節リウマチにおいて上方調節
４２７ 肝硬変において上方調節
４２８ コカイン依存症において上方調節
４２９ 複雑齲歯において上方調節
４３０ クローン病において上方調節
４３１ 非代償性心不全において上方調節
４３２ 脱水において上方調節
４３３ 拡張型心筋症において上方調節
４３４ ウイルス性心筋炎に続発する拡張型心筋症において上方調節
４３５ 表皮増殖において上方調節
４３６ 中枢神経系の大腸菌感染において上方調節
４３７ 本態性血小板血症において上方調節
４３８ 過度の労作による消耗において上方調節
４３９ 家族性低リン酸血症性骨疾患において上方調節
４４０ 骨折において上方調節
４４１ 大腿骨の骨折において上方調節
４４２ 汎虚血性心筋機能障害において上方調節
４４３ 膠芽腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４４４ ハマン・リッチ症候群において上方調節
４４５ ヘリコバクターピロリによる消化管の感染において上方調節
４４６ Ｃ型肝炎において上方調節
４４７ ＨＩＶ感染において上方調節
４４８ ハンチントン病において上方調節
４４９ 高コレステロール血症において上方調節
４５０ 肥大において上方調節
４５１ 特発性血小板減少性紫斑病において上方調節
４５２ 腸炎エルシニアによる感染において上方調節
４５３ 無精子症による不妊において上方調節
４５４ 心臓の損傷において上方調節
４５５ ＩＳＭ−皮膚のその場での黒色腫において上方調節
４５６ レーバーの黒内障において上方調節
４５７ 肝癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４５８ 黄斑変性症において上方調節
４５９ 悪性リンパ腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４６０ 子宮頸部の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６１ 十二指腸の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６２ 前立腺の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６３ 胃の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６４ 精巣の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６５ 結腸の悪性腫瘍において上方調節（部類６４４にも該当）
４６６ 多発性良性色素細胞性母斑において上方調節
４６７ 糖尿病性神経症において上方調節
４６８ 非インスリン依存性糖尿病において上方調節
４６９ 栄養欠乏において上方調節
４７０ 閉塞性睡眠時無呼吸症において上方調節
４７１ 乏突起膠腫において上方調節（部類６４４にも該当）
４７２ 甲状腺乳頭癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４７３ パーキンソン病において上方調節
４７４ ブタの腎症において上方調節
４７５ 前子癇において上方調節
４７６ 原発性心筋症において上方調節
４７７ 原発性開放隅角緑内障において上方調節
４７８ 原発性肺形成不全において上方調節
４７９ シュードモナス感染において上方調節
４８０ 肺気腫において上方調節
４８１ 肺高血圧症において上方調節
４８２ ＩＩ型糖尿病に関連する腎障害において上方調節
４８３ 腎損傷において上方調節
４８４ 網膜色素変性症において上方調節
４８５ 関節リウマチにおいて上方調節
４８６ 有棘細胞癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４８７ 肺の有棘細胞癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４８８ 癲癇重積症において上方調節
４８９ 全身性感染において上方調節
４９０ 血小板減少症において上方調節
４９１ 胸腺癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４９２ 移行上皮癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４９３ その場での移行上皮癌において上方調節（部類６４４にも該当）
４９４ 潰瘍性大腸炎において上方調節
４９５ 子宮筋腫において上方調節
４９６ 人工呼吸器関連の肺損傷において上方調節
４９７ 心室肥大において上方調節
４９８ 心室肥大（［左］）において上方調節
４９９ ビタミンＡ欠乏症において上方調節
５００ 腎臓の明細胞肉腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５０１ 急性肺損傷において下方調節
５０２ 急性巨核芽球性白血病において下方調節（部類６４４にも該当）
５０３ 急性骨髄性白血病において下方調節（部類６４４にも該当）
５０４ 詳細不明の急性膵炎において下方調節
５０５ 食道の腺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５０６ 肺の腺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５０７ 小腸の腺腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５０８ アデノウイルス感染において下方調節
５０９ 脳炎を伴ったＡＩＤＳにおいて下方調節
５１０ アルコール中毒症において下方調節
５１１ アレキサンダー病において下方調節
５１２ α−１アンチトリプシン欠乏症において下方調節
５１３ アルツハイマー病において下方調節
５１４ 退形成性乏突起星細胞腫において下方調節
５１５ アンドロゲン不感症症候群において下方調節
５１６ 星状細胞腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５１７ 筋肉の委縮において下方調節
５１８ 自己免疫性肝炎において下方調節
５１９ 細菌感染において下方調節
５２０ バレット食道において下方調節
５２１ 小腸のその場での癌腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５２２ 心筋症において下方調節
５２３ 慢性肉芽腫性疾患において下方調節
５２４ 慢性リンパ性白血病において下方調節
５２５ 慢性閉塞性気道疾患において下方調節
５２６ 慢性多関節性若年性関節リウマチにおいて下方調節
５２７ 肝硬変において下方調節
５２８ コカイン依存症において下方調節
５２９ 複雑齲歯において下方調節
５３０ クローン病において下方調節
５３１ 非代償性心不全において下方調節
５３２ 脱水において下方調節
５３３ 拡張型心筋症において下方調節
５３４ ウイルス性心筋炎に続発する拡張型心筋症において下方調節
５３５ 表皮増殖において下方調節
５３６ 中枢神経系の大腸菌感染において下方調節
５３７ 本態性血小板血症において下方調節
５３８ 過度の労作による消耗において下方調節
５３９ 家族性低リン酸血症性骨疾患において下方調節
５４０ 骨折において下方調節
５４１ 大腿骨の骨折において下方調節
５４２ 汎虚血性心筋機能障害において下方調節
５４３ 膠芽腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５４４ ハマン・リッチ症候群において下方調節
５４５ ヘリコバクターピロリによる消化管の感染において下方調節
５４６ Ｃ型肝炎において下方調節
５４７ ＨＩＶ感染において下方調節
５４８ ハンチントン病において下方調節
５４９ 高コレステロール血症において下方調節
５５０ 肥大において下方調節
５５１ 特発性血小板減少性紫斑病において下方調節
５５２ 腸炎エルシニアによる感染において下方調節
５５３ 無精子症による不妊において下方調節
５５４ 心臓の損傷において下方調節
５５５ ＩＳＭ−皮膚のその場での黒色腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５５６ レーバーの黒内障において下方調節
５５７ 肝癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５５８ 黄斑変性症において下方調節
５５９ 悪性リンパ腫において下方調節（部類６４４にも該当）
５６０ 子宮頸部の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６１ 十二指腸の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６２ 前立腺の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６３ 胃の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６４ 精巣の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６５ 結腸の悪性腫瘍において下方調節（部類６４４にも該当）
５６６ 多発性良性色素細胞性母斑において下方調節
５６７ 糖尿病性神経症において下方調節
５６８ 非インスリン依存性糖尿病において下方調節
５６９ 栄養欠乏において下方調節
５７０ 閉塞性睡眠時無呼吸症において下方調節
５７１ 乏突起膠腫において下方調節
５７２ 甲状腺乳頭癌において下方調節
５７３ パーキンソン病において下方調節
５７４ ブタの腎症において下方調節
５７５ 前子癇において下方調節
５７６ 原発性心筋症において下方調節
５７７ 原発性開放隅角緑内障において下方調節
５７８ 原発性肺形成不全において下方調節
５７９ シュードモナス感染において下方調節
５８０ 肺気腫において下方調節
５８１ 肺高血圧症において下方調節
５８２ ＩＩ型糖尿病に関連する腎障害において下方調節
５８３ 腎損傷において下方調節
５８４ 網膜色素変性症において下方調節
５８５ 関節リウマチにおいて下方調節
５８６ 有棘細胞癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５８７ 肺の有棘細胞癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５８８ 癲癇重積症において下方調節
５８９ 全身性感染において下方調節
５９０ 血小板減少症において下方調節
５９１ 胸腺癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５９２ 移行上皮癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５９３ その場での移行上皮癌において下方調節（部類６４４にも該当）
５９４ 潰瘍性大腸炎において下方調節
５９５ 子宮筋腫において下方調節
５９６ 人工呼吸器関連の肺損傷において下方調節
５９７ 心室肥大において下方調節
５９８ 心室肥大（［左］）において下方調節
５９９ ビタミンＡ欠乏症において下方調節
６００ 骨疾患に関連する
６０１ 癌疾患に関連する（部類６４４にも該当）
６０２ 循環器疾患に関連する
６０３ 結合組織障害疾患に関連する
６０４ 皮膚病に関連する
６０５ 発達障害に関連する
６０６ 耳、鼻、喉の疾患に関連する
６０７ 内分泌疾患に関連する
６０８ 消化器疾患に関連する
６０９ 血液疾患に関連する
６１０ 免疫疾患に関連する
６１１ 代謝性疾患に関連する
６１２ 多発性疾患に関連する
６１３ 筋肉疾患に関連する
６１４ 神経疾患に関連する
６１５ 栄養性疾患に関連する
６１６ 眼科疾患に関連する
６１７ 他の疾患に関連する
６１８ 精神疾患に関連する
６１９ 腎臓疾患に関連する
６２０ 呼吸器疾患に関連する
６２１ 骨格疾患に関連する
６２２ 骨疾患で低下する
６２３ 癌疾患で低下する（部類６４４にも該当）
６２４ 循環器疾患で低下する
６２５ 結合組織障害疾患で低下する
６２６ 皮膚疾患で低下する
６２７ 発達障害で低下する
６２８ 耳、鼻、喉の疾患で低下する
６２９ 内分泌疾患で低下する
６３０ 消化器疾患で低下する
６３１ 血液疾患で低下する
６３２ 免疫疾患で低下する
６３３ 代謝性疾患で低下する
６３４ 多発性疾患で低下する
６３５ 筋肉疾患で低下する
６３６ 神経疾患で低下する
６３７ 栄養性疾患で低下する
６３８ 眼科疾患で低下する
６３９ 他の疾患で低下する
６４０ 精神疾患で低下する
６４１ 腎臓疾患で低下する
６４２ 呼吸器疾患で低下する
６４３ 骨格疾患で低下する
６４４ 癌に関与する
従って、様々な態様において、本発明は、表で示される部類の１つ以上の範囲内に入る基準遺伝子の群の発現を調節し、（各基準遺伝子に関連する疾患を示す）表９で示される部類の任意の１つ以上における対応する疾患、障害または状態を治療するための、表１〜８のいずれかのＲＮＡ配列のいずれかに特異的に結合する阻害性核酸を特徴とする。
別の態様において、本発明はまた、「逆鎖」の列または「同鎖」の列のいずれかで表８にて示される配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６または１９１０８７（ヒトのピーク）、または配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３または１９１０８８（マウスのピーク）のＲＮＡ配列のいずれかに特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸も特徴とする。いくつかの実施形態において、ＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子（例えば、以下の表１〜８で示されるインターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）の発現を調節する方法における使用のために阻害性核酸が提供される。そのような方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。いくつかの実施形態において、例えば、以下の表９で記載されるような疾患を治療する方法で使用するために阻害性核酸が提供される。治療には、ＰＲＣ２結合ＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を（上方または下方のいずれかに）調節すること、好ましくは遺伝子発現を上方調節することが関与する。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は非経口投与用に無菌組成物として製剤化される。これらのＲＮＡ配列が標的とする基準遺伝子は表８で示され、表９における部類１〜６４３に従って群分けされている。従って、１つの態様において、本発明は、部類１〜６４３のうちのいずれか１つにおけるＲＮＡ配列、転写物またはピークのいずれかの群に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸の群を記載する。特に、本発明は、表９で示される部類のいずれか（例えば、部類番号１１、１４、１５、１７、２１、２４、２６、４２、４４、４９、５８、６９、８２、１０３、１１９、１２０、１２６、１４３、１６３、１６７、１７２、１７７、１８２、１８３、１８４、１８７、１９１、１９６、２００、２０３、２０４、２１２、３００〜３２３、および／または４００〜６４３のうちのいずれか１以上）に記載される疾患、障害、状態または関連を治療するのに使用するための、表８で示される基準遺伝子のいずれかの発現を上方調節するためのそのような阻害性核酸の使用を特徴とする。
非限定例として、部類４５（補体と凝固のカスケード）には、ＴＦＰＩ、Ｆ２、Ｆ２Ｒ、ＣＤ４６、ＰＲＯＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、Ａ２Ｍ、Ｃ１Ｓ、Ｃ３ＡＲ１、ＢＤＫＲＢ１、Ｃ１Ｒ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＢＤＫＲＢ２、Ｆ５、Ｃ８Ｇ、ＴＨＢＤ、および／またはＰＬＡＵ（それぞれ遺伝子ＩＤ７０３５、２１４７、２１４９、４１７９、５６２７、５０５４、２、７１６、７１９、６２３、７１５、７１０、６２４、２１５３、７３３、７０５６、および５３２８）から成る群から選択される基準遺伝子が含まれる。次いで、ＴＦＰＩ、Ｆ２、Ｆ２Ｒ、ＣＤ４６、ＰＲＯＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、Ａ２Ｍ、Ｃ１Ｓ、Ｃ３ＡＲ１、ＢＤＫＲＢ１、Ｃ１Ｒ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＢＤＫＲＢ２、Ｆ５、Ｃ８Ｇ、ＴＨＢＤ、および／またはＰＬＡＵのそれぞれは、表８の適用可能な列で示される配列番号を有するＰＲＣ２結合ＲＮＡによって標的とされる。例えば、ＴＦＰＩの配列番号には、表８に従って１３２４５［Ｆ］、１５５２２８［Ｆ］、１５５２２９［Ｆ］、１５５２３０［Ｆ］、１５５２３１［Ｆ］、１５５２３２［Ｆ］、１５５２３３［Ｆ］、１５５２３４［Ｆ］、１５５２３５［Ｆ］、１５５２３６［Ｆ］、１５５２３７［Ｆ］、１５５２３８［Ｆ］、１５５２３９［Ｆ］、１５５２４０［Ｆ］、１５５２４１［Ｆ］、１５５２４２［Ｆ］、１５５２４３［Ｆ］、１５５２４４［Ｆ］、１５５２４５［Ｆ］、１５５２４６［Ｆ］、１５５２４７［Ｆ］、１５５２４８［Ｆ］、１５５２４９［Ｆ］、１５５２５０［Ｆ］、１５５２５１［Ｆ］、１５５２５２［Ｆ］、１５５２５５［Ｆ］、１５５２５６［Ｆ］、１３２４５［６６９１２］、１５５２３７［−８０６］、８７９［Ｆ］、６８７０９［Ｆ］、６８７１０［Ｆ］、６８７１１［Ｆ］、６８７１２［Ｆ］、６８７１３［Ｆ］、６８７１４［Ｆ］、６８７１５［Ｆ］、６８７１６［Ｆ］、６８７１７［Ｆ］、６８７１８［Ｆ］、６８７１９［Ｆ］、６８７２０［Ｆ］、６８７２１［Ｆ］、６８７２２［Ｆ］、６８７２３［Ｆ］、６８７２４［Ｆ］、６８７２５［Ｆ］、６８７２６［Ｆ］、６８７２７［Ｆ］、６８７２８［Ｆ］、６８７２９［Ｆ］、６８７３０［Ｆ］、６８７３１［Ｆ］、６８７３２［Ｆ］、６８７３３［Ｆ］、６８７３４［Ｆ］、６８７３５［Ｆ］、６８７３６［Ｆ］、６８７３７［Ｆ］、６８７３８［Ｆ］、６８７３９［Ｆ］、６８７４０［Ｆ］、６８７４１［Ｆ］、６８７４２［Ｆ］、６８７４３［Ｆ］、６８７４４［Ｆ］、６８７４５［Ｆ］、６８７４６［Ｆ］、６８７４７［Ｆ］、６８７４８［Ｆ］、６８７４９［Ｆ］、および／または６８７１３［−２４５］が含まれる。標的となる基準遺伝子ＴＦＰＩ、Ｆ２、Ｆ２Ｒ、ＣＤ４６、ＰＲＯＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、Ａ２Ｍ、Ｃ１Ｓ、Ｃ３ＡＲ１、ＢＤＫＲＢ１、Ｃ１Ｒ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＢＤＫＲＢ２、Ｆ５、Ｃ８Ｇ、ＴＨＢＤ、および／またはＰＬＡＵとして表８に列記されるこれらの配列番号のうちのいずれか１つに特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸から成る群から選択される阻害性核酸の群が、部類４５（補体と凝固のカスケード）の疾患を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図されるが、治療には、基準遺伝子ＴＦＰＩ、Ｆ２、Ｆ２Ｒ、ＣＤ４６、ＰＲＯＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、Ａ２Ｍ、Ｃ１Ｓ、Ｃ３ＡＲ１、ＢＤＫＲＢ１、Ｃ１Ｒ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＢＤＫＲＢ２、Ｆ５、Ｃ８Ｇ、ＴＨＢＤ、および／またはＰＬＡＵのいずれかの調節が関与する。同様に、部類６４３（「骨格疾患で低下する」）における遺伝子に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸が、骨格疾患を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図される。部類６４４（癌に含まれる）の一部でもある部類における遺伝子に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸が、癌を治療することにおける使用を含むが、これらに限定されない本明細書で記載される組成物および方法のいずれかにおける使用について企図される。
様々な態様において、本発明はさらに、互いに近傍の、例えば、互いに１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１ｋｂまたは２ｋｂの範囲内である染色体座標に対応し、好ましくは（ｉ）表９における同一基準遺伝子または（ｉｉ）表９における同一ＵＣＳＣ転写物に関連する１以上のピーク間でのＲＮＡ配列に結合する阻害性核酸を特徴とする。例えば、本発明は、配列番号１〜２１５８２または１９１０８９〜１９３０４９のＲＮＡ転写物のいずれかの、長さ約２０００、約１７５０、約１５００または約１２５０ヌクレオチド、または好ましくは長さ約１０００、約７５０、約５００、約４００、約３００ヌクレオチド、または長さ約２００、約１５０もしくは約１００の断片に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸を特徴とし、その際、ＲＮＡの断片は、配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６または１９１０８７（ヒトのピーク）または配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３または１９１０８８（マウスのピーク）のいずれか、または本明細書に添付はされないが、その全体が参照によって本明細書に組込まれる米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号の別表ＩのｃＤＮＡ配列のいずれかの逆相補配列内での少なくとも５つの連続するヌクレオチドのストレッチを含む。例となる実施形態において、ＲＮＡの断片は、配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６または１９１０８７（ヒトのピーク）または配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３または１９１０８８（マウスのピーク）のいずれか、または２０１０年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２５，１７４号の別表ＩのｃＤＮＡ配列のいずれかの逆相補配列内での少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は、例えば、長さ約５〜４０塩基、または１０〜５０塩基、または５〜５０塩基である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（すなわち、配列番号１〜１９３，０４９のいずれか）の例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０塩基、または３０もしくは４０までの塩基に対して少なくとも８０％または９０％相補的である配列を含むまたはそれから成り、または標的ＲＮＡの１０、１５、２０、２５もしくは３０塩基にわたって３までのミスマッチ（例えば、１までの、または２までのミスマッチ）を伴った塩基配列を含む。
従って、上で言及したように、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも１０、もしくは１０〜３０、もしくは１０〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも１５、もしくは１５〜３０、もしくは１５〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２０、もしくは２０〜３０、もしくは２０〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２５、もしくは２５〜３０、もしくは２５〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも３０、もしくは３０〜４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも４０の連続塩基に対して少なくとも８０％相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。さらに、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも５、もしくは５〜３０、もしくは５〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも１０、もしくは１０〜３０、もしくは１０〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも１５、もしくは１５〜３０、もしくは１５〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２０、もしくは２０〜３０、もしくは２０〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも２５、もしくは２５〜３０、もしくは２５〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも３０、もしくは３０〜４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である、または標的ＲＮＡの少なくとも４０の連続塩基に対して少なくとも９０％相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの少なくとも５、１０、または１５の連続塩基に対して完全に相補的である塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。幾つかの追加の非相補性の塩基が含まれ得ることが理解される。記載された塩基のそのような配列を含む阻害性核酸は他の非相補性の塩基も含み得ることが理解される。例えば、阻害性核酸は、全長２０塩基であり得るが、標的ＲＮＡの１５塩基に対して完全に相補的である１５塩基部分を含むことができる。同様に、阻害性核酸は、全長２０塩基であり得るが、標的ＲＮＡの１５塩基に対して少なくとも８０％相補的である１５塩基部分を含むことができる。
相補性は、上で言及したように、相補性の塩基対形成におけるミスマッチの数という点でも参照することができる。従って、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０の連続塩基にわたって３までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの１５の連続塩基にわたって３までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの２０の連続塩基にわたって３までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの２５の連続塩基にわたって３までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの３０の連続塩基にわたって３までのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０の連続塩基にわたって２までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの１５の連続塩基にわたって２までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの２０の連続塩基にわたって２までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの２５の連続塩基にわたって２までのミスマッチ、または標的ＲＮＡの３０の連続塩基にわたって２までのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。同様に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡの１０、１５、２０、２５、または３０の連続塩基にわたって１つのミスマッチを伴った塩基配列を含むことができ、またはそれから成ることができる。
本明細書（例えば、要約、詳細な説明、または実施形態の実施例にて）で記載される阻害性核酸またはそれを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は任意で、（ａ）作製され、実際に開示される（すなわち、特定の化学物質、一本鎖または二本鎖、特定の修飾および特定の塩基配列）、以下の配列番号で示される特定の阻害性核酸の１以上；および／または（ｂ）（ａ）の阻害性核酸の１以上の塩基配列；および／または（ｃ）（ａ）の１以上の阻害性核酸と同じＲＮＡの特定の部分（連続塩基のストレッチ）に特異的に結合するまたはそれに対して相補的である阻害性核酸の群を除外し得、それらは以下の出版物の１つ以上で開示されるとおりである：
標的ＨＯＴＡＩＲ ＲＮＡ（Ｒｉｎｎら、２００７）、Ｔｓｉｘ、ＲｅｐＡまたはＸｉｓｔ ＲＮＡ（（Ｚｈａｏら、２００８）配列番号１９４２０６〜１９４２１０］、または（Ｓａｒｍａら、２０１０）［配列番号１９４２１７〜１９４２２６］または（Ｚｈａｏら、２０１０）［配列番号１９４２２７〜１９４２２８］または（Ｐｒａｓａｎａｔｈら、２００５）［配列番号１９４２１３〜１９４２１６］または（Ｓｈａｍｏｖｓｋｙら、２００６）［配列番号１９４２１２］または（Ｍａｒｉｎｅｒら、２００８）［配列番号１９４２１１］または（Ｓｕｎｗｏｏら、２００８）または（Ｂｅｒｎａｒｄら、２０１０）［配列番号１９４２２９］として；或いはＰＲＣ２調節因子として特定される５０〜２００ｎｔのターゲティング短鎖ＲＮＡ（Ｋａｎｈｅｒｅら、２０１０）；または（Ｋｕｗａｂａｒａら、米国特許出願公開第２００５／０２２６８４８号）［配列番号１９４２３０〜１９４２３１］または（Ｌｉら、米国特許出願公開第２０１０／０２１０７０７号）［配列番号１９４２３２〜１９４２６７］または（Ｃｏｒｅｙら，７，７０９，４５６）［配列番号１９４２６８〜１９４２８５］または（Ｍａｔｔｉｃｋら，国際公開第ＷＯ２００９／１２４３４１号）または（Ｃｏｒｅｙら、米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号）［配列番号１９４２８６〜１９４３０５］、または（Ｗａｈｌｓｔｅｄｔら、米国特許出願公開第２００９／０２５８９２５号）［配列番号１９３１４０〜１９３２０６］、またはＢＡＣＥ：米国特許出願公開第２００９／０２５８９２５号［配列番号１９３１４０〜１９３２０６］；ＡｐｏＡ１：米国特許出願公開第２０１０／０１０５７６０号／欧州特許第２３５２８３号［配列番号１９３２０７〜１９３３７９］，Ｐ７３，ｐ５３，ＰＴＥＮ，国際公開第ＷＯ２０１０／０６５７８７Ａ２号／欧州特許２３７０５８２号［配列番号１９３３８０〜１９３４２５］；ＳＩＲＴ１：国際公開第ＷＯ２０１０／０６５６６２Ａ２号／欧州特許第０９８３１０６８号［配列番号１９３４２６〜１９３４７２］；ＶＥＧＦ：国際公開第ＷＯ２０１０／０６５６７１Ａ２号／欧州特許第２３７０５８１号［配列番号１９３４７３〜１９３４８３］；ＥＰＯ：国際公開第ＷＯ２０１０／０６５７９２Ａ２号／欧州特許第０９８３１１５２号［配列番号１９３４８４〜１９３４９２］；ＢＤＮＦ：国際公開第ＷＯ２０１０／０９３９０４号［配列番号１９３４９３〜１９３５０３］，ＤＬＫ１：国際公開第ＷＯ２０１０／１０７７４０号［配列番号１９３５０４〜１９３５１０］；ＮＲＦ２／ＮＦＥ２Ｌ２：国際公開第ＷＯ２０１０／１０７７３３号［配列番号１９３５１１〜１９３５１８］；
ＧＤＮＦ：国際公開第ＷＯ２０１０／０９３９０６号［配列番号１９３５１９〜１９３５５６］；ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｏｃｔ３Ａ／Ｂ，「再プログラム因子」：国際公開第ＷＯ２０１０／１３５３２９号［配列番号１９３５５７〜１９３５７３］；ジストロフィン：国際公開第ＷＯ２０１０／１２９８６１号［配列番号１９３５７４〜１９３６０５］；ＡＢＣＡ１，ＬＣＡＴ，ＬＲＰ１，ＡｐｏＥ，ＬＤＬＲ，ＡｐｏＡ１：国際公開第ＷＯ２０１０／１２９７９９号［配列番号１９３６０６〜１９３８８４］；ＨｇＦ：国際公開第ＷＯ２０１０／１２７１９５号［配列番号１９３８８５〜１９３８８９］；ＴＴＰ／Ｚｆｐ３６：国際公開第ＷＯ２０１０／１２９７４６号［配列番号１９３８９０〜１９３９０４］；ＴＦＥ３，ＩＲＳ２：国際公開第ＷＯ２０１０／１３５６９５号［配列番号１９３９０５〜１９３９１９］；ＲＩＧ１，ＭＤＡ５，ＩＦＮＡ１：国際公開第ＷＯ２０１０／１３８８０６号［配列番号１９３９２０〜１９３９５８］；ＰＯＮ１：国際公開第ＷＯ２０１０／１４８０６５号［配列番号１９３９５９〜１９３９６５］；コラーゲン：国際公開第ＷＯ／２０１０／１４８０５０号［配列番号１９３９６６〜１９３９９８］；Ｄｙｒｋ１Ａ，Ｄｓｃｒ１，「ダウン症候群遺伝子」：国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１６７４号［配列番号１９３９９９〜１９４０２２］；ＴＮＦＲ２：国際公開第ＷＯ／２０１０／１５１６７１号［配列番号１９４０２３〜１９４０２９］；インスリン：国際公開第ＷＯ／２０１１／０１７５１６号［配列番号１９４０３０〜１９４０３９］；ＡＤＩＰＯＱ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０１９８１５号［配列番号１９４０４０〜１９４０６４］；ＣＨＩＰ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０２２６０６号［配列番号１９４０６５〜１９４０７４］；ＡＢＣＢ１：国際公開第ＷＯ／２０１１／０２５８６２号［配列番号１９４０７５〜１９４０８２］；ＮＥＵＲＯＤ１，ＥＵＲＯＤ１，ＨＮＦ４Ａ，ＭＡＦＡ，ＰＤＸ，ＫＸ６，「膵臓発生遺伝子」：国際公開第ＷＯ／２０１１／０８５０６６号［配列番号１９４０８３〜１９４１１５］；ＭＢＴＰＳ１：国際公開第ＷＯ／２０１１／０８４４５５号［配列番号１９４１１６〜１９４１１９］；ＳＨＢＧ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０８５３４７号［配列番号１９４１２０〜１９４１３３］；ＩＲＦ８：国際公開第ＷＯ／２０１１／０８２４０９号［配列番号１９４１３４〜１９４１３７］；ＵＣＰ２：国際公開第ＷＯ／２０１１／０７９２６３号［配列番号１９４１３８〜１９４１４８］；ＨＧＦ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０７９２６１号［配列番号１９４１４９〜１９４１５６］；ＧＨ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０３８２０５号［配列番号１９４１５７〜１９４１６１］；ＩＱＧＡＰ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０３１４８２号［配列番号１９４１６２〜１９４１６６］；ＮＲＦ１：国際公開第ＷＯ／２０１１／０９０７４０号［配列番号１９４１６７〜１９４１７２］；Ｐ６３：国際公開第ＷＯ／２０１１／０９０７４１号［配列番号１９４１７３〜１９４１７６］；ＲＮＡｓｅＨ１：国際公開第ＷＯ／２０１１／０９１３９０号［配列番号１９４１７７〜１９４１８４］；ＡＬＯＸ１２Ｂ：国際公開第ＷＯ／２０１１／０９７５８２号［配列番号１９４１８５〜１９４１８９］；ＰＹＣＲ１：国際公開第ＷＯ／２０１１／１０３５２８号［配列番号１９４１９０〜１９４１９３］；ＣＳＦ３：国際公開第ＷＯ／２０１１／１２３７４５号［配列番号１９４１９４〜１９４１９８］；ＦＧＦ２１：国際公開第ＷＯ／２０１１／１２７３３７号［配列番号１９４１９９〜１９４２０５］として（上述のものはその全体が参照によって本明細書に組込まれる）。いくつかのまたは任意の実施形態において、本発明から任意で除外されるのは、以下の領域のうちの１以上に特異的に結合する、またはそれに対して相補的である阻害性核酸である：
配列番号１９３２０８のヌクレオチド１〜９３２；配列番号１９３３８６のヌクレオチド１〜１６７５；配列番号１９３３８７のヌクレオチド１〜５１８；配列番号１９３３８８のヌクレオチド１〜７５９；配列番号１９３３８９のヌクレオチド１〜２５８９２；配列番号１９３３９０のヌクレオチド１〜２７９；配列番号１９３３９１のヌクレオチド１〜１９８２；配列番号１９３３９２のヌクレオチド１〜７８９；配列番号１９３３９３のヌクレオチド１〜４６７；配列番号１９３４２７のヌクレオチド１〜１０２８；配列番号１９３４２８のヌクレオチド１〜４２９；配列番号１９３４２９のヌクレオチド１〜１５６；配列番号１９３４３０のヌクレオチド１〜５９３；配列番号１９３４７５のヌクレオチド１〜６４３；配列番号１９３４７６のヌクレオチド１〜５１３；配列番号１９３４８６のヌクレオチド１〜１５６；配列番号１９３４９４のヌクレオチド１〜３１７５；配列番号１９３５０６のヌクレオチド１〜１３４７；配列番号１９３５１３のヌクレオチド１〜５８０８；配列番号１９３５２０のヌクレオチド１〜２３７；配列番号１９３５２１のヌクレオチド１〜１２４６；配列番号１９３５２２ヌクレオチド１〜６８４；配列番号１９３５５３のヌクレオチド１〜４００；配列番号１９３５５４のヌクレオチド１〜６１９；配列番号１９３５５５のヌクレオチド１〜８１３；配列番号１９３５６０のヌクレオチド１〜９９３；配列番号１９３５６０のヌクレオチド１〜４０１；配列番号１９３５６１のヌクレオチド１〜４９３；配列番号１９３５６２のヌクレオチド１〜４１８；配列番号１９３５７６のヌクレオチド１〜３７８；配列番号１９３５７７のヌクレオチド１〜２９４；配列番号１９３５７８のヌクレオチド１〜６８６；配列番号１９３５７９のヌクレオチド１〜４８０；配列番号１９３５８０のヌクレオチド１〜５０１；配列番号１９３６１３のヌクレオチド１〜１２９９；配列番号１９３６１４のヌクレオチド１〜９１８；配列番号１９３６１５のヌクレオチド１〜１５５０；配列番号１９３６１６のヌクレオチド１〜３２９；配列番号１９３６１７のヌクレオチド１〜１８２６；配列番号１９３６１８のヌクレオチド１〜５３６；配列番号１９３６１９ヌクレオチド１〜５５１；配列番号１９３６２０ヌクレオチド１〜６７２；配列番号１９３６２１のヌクレオチド１〜６１６；配列番号１９３６２２のヌクレオチド１〜４７１；配列番号１９３６２３ヌクレオチド１〜７０７；配列番号１９３６２４のヌクレオチド１〜７４１；配列番号１９３６２５のヌクレオチド１〜３４６；配列番号１９３６２６のヌクレオチド１〜８６７；配列番号１９３６２７のヌクレオチド１〜５６３；配列番号１９３８９２のヌクレオチド１〜９７０；配列番号１９３８９３のヌクレオチド１〜１１１７；配列番号１９３８９４のヌクレオチド１〜２９７；配列番号１９３９０７のヌクレオチド１〜４９７；配列番号１９３９２３のヌクレオチド１〜１２６７；配列番号１９３９２４のヌクレオチド１〜５８６；
配列番号１９３９２５ヌクレオチド１〜７４１；配列番号１９３９２６のヌクレオチド１〜２５１；配列番号１９３９２７のヌクレオチド１〜６８１；配列番号１９３９２８のヌクレオチド１〜５８０；配列番号１９３９６０ヌクレオチド１〜５３４；配列番号１９３９６９のヌクレオチド１〜３８７；配列番号１９３９７０のヌクレオチド１〜５６１；配列番号１９３９７１のヌクレオチド１〜３３５；配列番号１９３９７２のヌクレオチド１〜６１３；配列番号１９３９７３のヌクレオチド１〜１７７；配列番号１９３９７４のヌクレオチド１〜２８５；配列番号１９４００１のヌクレオチド１〜３８１４；配列番号１９４００２のヌクレオチド１〜６３３；配列番号１９４００３のヌクレオチド１〜４９７；配列番号１９４００４のヌクレオチド１〜５４５；配列番号１９４３０６のヌクレオチド１〜４１３；配列番号１９４３０７のヌクレオチド１〜４１３；配列番号１９４３０８のヌクレオチド１〜３３４；配列番号１９４３０９のヌクレオチド１〜５８２；配列番号１９４３１０のヌクレオチド１〜４１６；配列番号１９４３１１のヌクレオチド１〜３５９１；配列番号１９４３１２のヌクレオチド１〜８７５；配列番号１９４３１３のヌクレオチド１〜１９４；配列番号１９４３１４のヌクレオチド１〜２０７４；配列番号１９４３１５のヌクレオチド１〜１２３７；配列番号１９４３１６のヌクレオチド１〜４０５０；配列番号１９４３１７のヌクレオチド１〜１３３４；配列番号１９４３１８のヌクレオチド１〜１２３５；配列番号１９４３１９のヌクレオチド１〜１７，９６４；
配列番号１９４３２０のヌクレオチド１〜５０，００３；配列番号１９４３２１のヌクレオチド１〜４８６；配列番号１９４３２２のヌクレオチド１〜４９４；配列番号１９４３２３のヌクレオチド１〜１９９２；配列番号１９４３２４のヌクレオチド１〜１７６７；配列番号１９４３２５のヌクレオチド１〜１２４０；配列番号１９４３２６のヌクレオチド１〜３０１６；配列番号１９４３２７のヌクレオチド１〜１６０９；配列番号１９４３２８のヌクレオチド１〜３１２；配列番号１９４３２９のヌクレオチド１〜２４３；配列番号１９４３３０のヌクレオチド１〜８０２；配列番号１９４３３１のヌクレオチド１〜５１４；配列番号１９４３３２のヌクレオチド１〜９３６；配列番号１９４３３３のヌクレオチド１〜１０７５；配列番号１９４３３４のヌクレオチド１〜８２３；配列番号１９４３３５のヌクレオチド１〜９７９；配列番号１９４３３６のヌクレオチド１〜９７９；配列番号１９４３３７のヌクレオチド１〜２８８；配列番号１９４３３８のヌクレオチド１〜４３７；配列番号１９４３３９のヌクレオチド１〜２７８；配列番号１９４３４０のヌクレオチド１〜４３６；配列番号１９４３４１のヌクレオチド１〜１１４０；配列番号１９４３４２のヌクレオチド１〜２０８２；配列番号１９４３４３のヌクレオチド１〜３８０；配列番号１９４３４４のヌクレオチド１〜７４２；配列番号１９４３４５のヌクレオチド１〜４２４６。
いくつかのまたは任意の実施形態において、表３のマウスのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表３のヒトのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表４のマウスのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表４のヒトのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表５のマウスのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。いくつかのまたは任意の実施形態において、表５のヒトのＲＮＡ配列の１以上が除外され得る。
本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は遺伝子発現を上方調節し、タンパク質をコードする基準遺伝子と同じ鎖から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡに特異的に結合し得る、またはそれと特異的にハイブリッド形成し得る、またはそれに対して相補的であり得る。阻害性核酸は、基準遺伝子（ｒｅｆＧｅｎｅ）のタンパク質をコードするセンス鎖のイントロン、エクソン、イントロン／エクソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、または翻訳終止領域の範囲内を起源とするまたはそれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合し得る。
本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は遺伝子発現を上方調節し、タンパク質をコードする基準遺伝子に比べて反対側の鎖（アンチセンス鎖）から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡに特異的に結合し得る、またはそれと特異的にハイブリッド形成し得る、またはそれに対して相補的であり得る。
本明細書に記載される阻害性核酸は修飾され得る、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾されたヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含み得る。加えて、阻害性核酸は、１以上の以下の特性を示すことができる、すなわち、標的ＲＮＡの実質的な切断または分解を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断または分解を引き起こさない；ＲＮＡ分解酵素Ｈの経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；いかなるアルゴノートファミリータンパク質をもリクルートしない；ダイサーによって切断されない；選択的スプライシングに介在しない；免疫刺激性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；修飾されていないオリゴヌクレオチドに比べて改善された細胞取り込みを有する；細胞または哺乳類にとって毒性ではない；改善されたエンドソームの出口を有し得る；ＰＲＣ２、好ましくはＥｚｈ２であるが、任意でＳｕｚ１２、Ｅｅｄ、ＲｂＡｐ４６／４８サブユニットまたは例えば、Ｊａｒｉｄ２のようなアクセサリ分子とのｌｎｃＲＮＡの相互作用に干渉する；Ｈ３−リシン２７のメチル化を低下させるおよび／または遺伝子発現を上方調節する。
本明細書に記載される阻害性核酸またはそれらを設計するもしくは合成する方法のいくつかのまたは任意の実施形態において、阻害性核酸は任意で、Ｋｕｗａｂａｒａらの米国特許出願公開第２００５／０２２６８４８号またはＬｉらの米国特許出願公開第２０１０／０２１０７０７号またはＣｏｒｅｙらの米国特許第７，７０９，４５６号またはＭａｔｔｉｃｋらの国際公開第ＷＯ２００９／１２４３４１号に記載されるようなプロモーター領域のＤＮＡを結合するもの、またはＣｏｒｅｙらの米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号に記載されるような３’ＵＴＲ領域のＤＮＡを結合するものを除外し得る。
ＲＮＡと相互作用して遺伝子発現を調節するように設計される阻害性核酸は、標的ＤＮＡを結合するように設計されるもの（例えば、ＲＮＡが転写される根底にあるゲノムＤＮＡ配列に対して相補的である）とは区別される塩基配列のサブセットである。
本明細書に記載されるのはまた、従来のノックダウン法にあまり従わないＲＮＡのサブクラスである核の長鎖非コードＲＮＡを標的とするロックド核酸（ＬＮＡ）分子の使用方法である（Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004); Khalil et al., PNAS 106(28)11675-11680 (2009)）。本明細書で記載されるように、ＬＮＡ分子は、同族の結合配列（すなわち、同族の結合相手）、例えば、染色体またはＰＲＣ２から速い動態でｌｎｃＲＮＡを外すのに使用することができる。
従って、１つの態様において、本発明は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）に対して相補的であるか、またはそれに特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）を提供する。
別の態様において、本発明は、その同族の結合相手から長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を解離させる（例えば、結合を破壊するまたは結合親和性を低下させる）方法を特徴とする。方法には、ｌｎｃＲＮＡに対して相補的であるか、またはそれに特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）にｌｎｃＲＮＡを接触させることが含まれる。
いくつかの実施形態において、ｌｎｃＲＮＡは、高分子遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉ非コードＲＮＡ）、プロモーターに関連する短鎖ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、内在性のアンチセンスＲＮＡ、またはクロマチン修飾因子、例えば、ポリコーム複合体、例えば、ポリコーム抑制複合体２と結合するＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ｌｎｃＲＮＡは核に局在する。
いくつかの実施形態において、ＬＮＡ分子は、既知のＲＮＡ局在化モチーフを含むｌｎｃＲＮＡの領域に対して相補的である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＡ分子は、少なくとも１つのロックされない分子を含む。そのようなＬＮＡ分子は１以上のロックされたヌクレオチドおよび１以上のロックされないヌクレオチドを有し得る。用語「ＬＮＡ」には、相補性ＲＮＡへの高い親和性、ヌクレアーゼ耐性、免疫刺激の欠如、および速い動態という所望の特性を保持する制約付きの糖を含むヌクレオチドが含まれる。例となる制約付きの糖には以下に列記されるものが挙げられる。
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で使用するために方法および材料が本明細書に記載されるが；当該技術で既知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は例示説明のためにすぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許、配列、データベース登録項目および他の参照はすべて、その全体が参照によって本明細書に組込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
コンパクトディスク上に提示される配列表への参照
本出願は配列表を含有するコンパクトディスクを含む。配列表は以下のようにコンパクトディスクで特定される。
配列表の全体が参照により本明細書に組込まれる。
図面の説明
図１Ａ〜１Ｋは、本明細書において記載されるようなＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）‐シークエンシング方法とパイロットライブラリーの解析の１つの実施形態を示す図である。 図１Ａは代表的なＲＩＰ‐シークエンシング概略図である。 図１Ｂは、野生型（ＷＴ）ＥＳ細胞およびＥｚｈ２−／−ＥＳ細胞におけるＥｚｈ２タンパク質のウェスタンブロット分析（右のパネル）と等量を負荷したことを示すクマシー染色（左のパネル）の結果を示す一対の画像である。 図１Ｃは、ＲＮＡ免疫沈降産物のサイズ選別のための調製用アガロースゲルの結果を示す画像である。 図１Ｄは、等価の数の細胞（列２）、図７に示される基準を用いて選別した後のリード（列３）、および重複配列および反復配列を除去した後の別個のリード（列４）についてのＷＴライブラリーと対照ライブラリーのパイロットライブラリーの統計を示す表である。 図１Ｅは、オリジナルのＷＴライブラリーに対する対比較での表示のライブラリーの相関係数（ＣＣ）を表す表である。
図１Ｆは、ゲノム中の示されたコピー数を有するエレメントに対して対応するＷＴリードの累積頻度を示す線グラフである。 図１Ｇは、ＷＴライブラリーでの様々な反復物の相対頻度を示す円グラフである。ゲノム当たり１０回より多く繰り返したエレメントは全てのリードの２０％未満を占めた。単純反復配列は８５．７１４％を占め、そして、ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥ、ＬＴＲ、低複雑性反復配列およびサテライトは、それぞれ、４．８８１％、４．１３０％、２．６３６％、２．４８７％および０．００２％（グラフには示されない）に相当した。 図１Ｈは別個のＷＴパイロットリードのマウスＸ染色体に対するアラインメントを示すグラフである。ユニークエレメントと反復配列の両方についての１００ｋｂのウインドウ毎のリード数をセントロメア（ＣＥＮ）から遠位テロメア（ＴＥＬＯ）までプロットしてある。１００キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「ｎ」箇所に対応するリードが各位置でｎ分の１リードとして数えられるようにリードを正規化した。Ｃｈｒ：染色体、濃灰色：フォワード鎖、明灰色：リバース鎖。 図１Ｉは、パイロットＷＴリードを記載するＸ染色体不活性化センターを拡大したものを示すグラフである。Ｅｚｈ２−／−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が３以下のリードが示されている。＊：非コードＲＮＡ。 図１Ｊは一対のグラフを示す。上のグラフは別個のＷＴパイロットリードのマウス１２番染色体に対するアラインメントを示す。ユニークエレメントと反復配列の両方についての１００ｋｂのウインドウ毎のリード数をセントロメア（ＣＥＮ）から遠位テロメア（ＴＥＬＯ）までプロットしてある。１００キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「ｎ」箇所に対応するリードが各位置でｎ分の１リードとして数えられるようにリードを正規化した。Ｃｈｒ：染色体、濃灰色：フォワード鎖、明灰色：リバース鎖。下のグラフは、パイロットＷＴリードを記載するインプリントドメインを拡大したものを示す。Ｅｚｈ２−／−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が３以下のリードが示されている。＊：非コードＲＮＡ。
図１Ｋは一対のグラフを示す。左のグラフは別個のＷＴパイロットリードのマウス１２番染色体に対するアラインメントを示す。ユニークエレメントと反復配列の両方についての１００ｋｂのウインドウ毎のリード数をセントロメア（ＣＥＮ）から遠位テロメア（ＴＥＬＯ）までプロットしてある。１００キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「ｎ」箇所に対応するリードが各位置でｎ分の１リードとして数えられるようにリードを正規化した。Ｃｈｒ：染色体、濃灰色：フォワード鎖、明灰色：リバース鎖。右のグラフは、パイロットＷＴリードを記載するインプリントドメインを拡大したものを示す。Ｅｚｈ２−／−ライブラリーではこれらのリードが失われている。頻度が３以下のリードが示されている。＊：非コードＲＮＡ。 図１Ｌは、各遺伝的部類中の（３回以上の頻度を有する）リードの数を示す表である。括弧は、各部類に属する別個のリードのパーセントを示す（例えば、非コードＲＮＡに対応するリードは５０．７％）。 図１Ｍは、３回以上の頻度でリードがヒットした転写単位の数を示す表である。各部類の転写物の総数は列２に示されている。括弧はＰＲＣ２トランスクリプトームにおける各部類のパーセント表示を示す（例えば、ＰＲＣ２トランスクリプトームでは既知のＳｕｚ１２ドメインについて１３．７％が相当する）。
図２Ａ〜２Ｄは、ＰＲＣ２トランスクリプトームを捕捉するためのより大規模のシークエンシングに関連するデータを示す。 図２Ａは、ＵＣＳＣの連結したトランスクリプトームデータベース由来の３９，００３転写物を野生型ライブラリー（ｘ軸）およびヌルライブラリー（ｙ軸）におけるそれらのＲＰＫＭ値により示す散布図である。ＷＴライブラリーにもヌルライブラリーにも表されないＵＣＳＣ転写物は（０、０）にプロットされる。統計ソフトＲの機能であるｓｍｏｏｔｈＳｃａｔｔｅｒにより平滑化を行った。濃い色合いは、グラフ上の所与の点でのより高い遺伝子密度に対応する。３：１ＷＴ／ヌル濃縮線とｘ＝０．４閾値が灰色の点線として示される。「ＰＲＣ２トランスクリプトーム」と記されたプールの中で、３：１以上のＲＰＫＭ濃縮と０．４以上のＷＴ ＲＰＫＭという基準に合う転写物が強陽性とみなされ、赤色で示される。カットオフ値よりも下にある転写物はバックグランドとみなされ、オレンジ色で示される。Ｔｓｉｘは、示される（ｘ、ｙ）座標を有する図の外側（矢印）にある。 図２ＢはＰＲＣ２トランスクリプトームの特徴を示す表である。括弧中の数は各部類の遺伝子の総数を示す（例えば、７９３腫瘍抑制遺伝子のうち３２５遺伝子がＰＲＣ２トランスクリプトーム中に見出される）。 図２ＣはＸ染色体不活性化センターのより高い分解能での解析の結果を示すグラフである。別個のリードが、２００ｂｐのウインドウをｘ軸上にスライドし、それらの表出をｙ軸上にプロットすることにより平滑化された。 図２Ｄはメタジーン解析の結果を示すグラフである。ＰＲＣ２トランスクリプトームに由来する別個のリードが転写開始点（ＴＳＳ）からの距離の関数としてプロットされている。
図２Ｅは、ＷＴ（左）ライブラリーおよびＥｚｈ２‐／‐（右）ライブラリーについての、ＴＳＳからの距離の関数としてプロットされたリード全ての頻度を示す一対のグラフである。ｘ軸は、ＵＣＳＣ ｒｅｆＧｅｎｅデータベースから獲得した遺伝子全てのプロモーター領域を示し、ＴＳＳに対する塩基対（ｂｐ）単位の座標を有する。フォワード鎖のリードは青色で示され、リバース鎖は赤色で示される。矢印はＴＳＳ近傍の濃縮を示す。 図２Ｆは、ＷＴ試料、Ｅｚｈ２‐／‐試料およびＩｇＧ試料についての、ＴＳＳからの距離の関数としてプロットされた（重複配列が除去された）別個のリードを示す３つのグラフのセットである。矢印はＴＳＳ近傍の濃縮を示す。
図３Ａ〜ＢはＮｅｓｐ／Ｇｎａｓ（Ａ）インプリントクラスターおよびＤｌｋ１／Ｇｔｌ２（Ｂ）インプリントクラスターについてのリード密度プロットである。別個のリードが、２００ｂｐまたは２ｋｂのウインドウをｘ軸上にスライドし、それらの表出をｙ軸上にプロットすることにより平滑化された。＊、非コードＲＮＡ。Ｃｈｒ：染色体、濃灰色：フォワード鎖、明灰色：リバース鎖。Ｅｚｈ２−／−ライブラリーではこれらのリードが失われている。 同上
未変性ＲＮＡ免疫沈降／ｑＲＴ‐ＰＣＲとＵＶ架橋ＲＮＡ免疫沈降による確認。 図４Ａは、抗Ｅｚｈ２抗体プルダウンおよびＩｇＧプルダウンを比較するためのｑＲＴ‐ＰＣＲの結果を示す９つの棒グラフのセットである。実験は、３セットを２〜３回繰り返して行われた。エラーバー＝１標準偏差（ＳＤ）。スチューデントの両側ｔ検定を用いてＰを計算した。アスタリスク：検出不可能なレベル。 図４Ｂは、野生型ＥＳ細胞とヌルＥＳ細胞の未変性抗Ｅｚｈ２抗体によるＲＮＡ免疫沈降後のｑＲＴ‐ＰＣＲの結果をそれぞれＩｇＧによるＲＮＡ免疫沈降での数値に対して正規化して示す８つの棒グラフのセットである。Ｘｉｓｔ、Ｇｔｌ２‐ａｓおよびＦｏｘｎ２‐ａｓについての数値はグラフ外であった。実験は、３セットを２〜４回繰り返して行われた。１ＳＤが示されている。スチューデントの関連２群両側ｔ検定を用いてＰが計算されている。アスタリスク：検出不可能なＲＮＡレベル。 図４Ｃは、未変性ＲＮＡ免疫沈降のＵＶ架橋ＲＮＡ免疫沈降による確認の結果を示す７つの棒グラフのセットである。各実験は、３セットを２〜４回繰り返して行われ、ＩｇＧプルダウンに対して正規化され、そして、ｔ検定（Ｐ）を用いてＥｚｈ２−／−対照の実験と比較された。１ＳＤが示されている。 図４Ｄは、表示のＲＮＡ種についてのノーザンブロット分析の結果を示す画像である。 図４Ｅは、リボヌクレアーゼ前処理がある未変性ＲＮＡ免疫沈降とそれに続くｑＲＴ‐ＰＣＲ定量の結果を示す画像である。
図５Ａ〜ＦはＲＮＡとＰＲＣ２の間の直接的相互作用を示す生化学的分析の結果を示す。 図５ＡはヒトＰＲＣ２とサブユニットのクマシー染色されたゲルを示す画像である。様々な移動度は各タンパク質のＦｌａｇタグ型と非タグ型を反映する。 図５Ｂは、二重ステムループ構造として、ＷＴ型および変異体（Ｍｕｔ）型のＲｅｐＡ（配列番号１９３１１８および１９３１１９）とＨｅｓ１（配列番号１９３１２０および１９３１２１）を示す概略図である。 図５Ｃは、精製したＰＲＣ２複合体と末端標識したプローブを用いるＲＮＡ ＥＭＳＡの結果を示す画像である。負の対照：ＲｅｐＡ以外のＸｉｓｔに由来するＲＮＡ配列であるＤｓＩおよびＤｓＩＩ。二重のシフトは複数のＰＲＣ２サブ複合体の存在を示している。 図５Ｄは、精製したＰＲＣ２サブユニットを用いるＲＮＡ ＥＭＳＡの結果を示す画像である。複数のレーンが同じゲルで泳動されたが、各パネルの間で１つのレーンを切り出したため、画像では切り離された。 図５Ｅは、０．１〜１．０ｍｇのＥＺＨ２に対する１〜２５ｆｍｏｌのＨｅｓ１‐ａｓ ＲＮＡプローブのタイトレーションの結果を示す画像である。 図５Ｆは、精製したＰＲＣ２と等モル負荷された表示のＲＮＡプローブを用いるＲＮＡプルダウンアッセイの結果を示す４つの画像のセットである。免疫沈降画分の２５％、通過画分の１０％およびインプットＲＮＡの１０％が示されている。
図６Ａ〜Ｅは、Ｇｔｌ２がターゲティングＰＲＣ２によりＤｌｋ１を制御することを示す。 図６Ａは、Ｄｌｋ１‐Ｇｔｌ２ならびにｓｈＲＮＡおよびＲＮＡ免疫沈降とクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）で用いられたプライマーペアの位置のマップである。点線は、転写物がさらに伸長し得ることを示す。 図６Ｂは、Ｇｔｌ２のノックダウン（ＫＤ）（各グラフの左棒）またはスクランブルＫＤ（右棒）の後のＧｔｌ２、Ｄｌｋ１およびＧｔｌ２‐ａｓのＲＮＡレベルのｑＲＴ‐ＰＣＲを示す３つの棒グラフのセットである。ノックダウン細胞のプールを用いている。ＲＮＡレベルはＧａｐｄｈのレベルに対して正規化され、スクランブルノックダウン対照（Ｓｃｒ）でのレベルに対して比較されている。実験は、３セットを２回繰り返して行われた。１ＳＤが示されている。Ｇｔｌ２ ＫＤとＳｃｒ ＫＤの間でスチューデントの両側ｔ検定を用いてＰが計算されている。 図６ＣはＫＤ細胞におけるＰＲＣ２の結合についてのｑＣｈＩＰの結果を示す一対の棒グラフである。抗Ｅｚｈ２抗体（上）および抗Ｋ２７トリメチル化ヒストンＨ３抗体（下）を用いて、通常のウサギＩｇＧを対照として用いてＣｈＩＰを行った。ｑＰＣＲレベルはインプットＤＮＡのパーセンテージとして表されている。ＤＭＲ、メチル化可変領域。ＩＣＲ、インプリント制御領域。１ＳＤが示されている。Ｇｔｌ２ ＫＤとＳｃｒ ＫＤの間でスチューデントの両側ｔ検定を用いてＰが計算されている。 図６Ｄは、Ｇｔｌ２‐ＫＤクローンとＳｃｒ‐ＫＤクローンでのＥｚｈ２のｍＲＮＡレベルのｑＲＴ‐ＰＣＲを示す棒グラフである。 図６Ｅは、Ｅｚｈ２−／−細胞とＷＴ細胞でのＧｔｌ２発現に対するＤｌｋ１発現のｑＲＴ‐ＰＣＲを示す棒グラフである。１ＳＤが示されている。
図７Ａ〜Ｃは試験試料および対照試料でのＲＩＰ‐シークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析を示す。 図７Ａは試験試料および対照試料でのＲＩＰ‐シークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析を説明するフローチャートである。 図７Ｂは、リボヌクレアーゼＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）およびリボヌクレアーゼＶ１（０．００１Ｕ／ｍＬ）でのＲＮＡ免疫沈降産物の処理が（四角で囲まれた）２００〜２，０００ヌクレオチドの範囲のサイズの産物を破壊することを示す画像であり、プルダウンされた物質がＲＮＡであったことを示唆する。２００ヌクレオチド未満の範囲にあるバンドはＰＣＲプライマーダイマーである。 図７Ｃはメタジーン解析の結果、すなわち、（同じスケールにプロットされた）ＷＴパイロット試料、Ｅｚｈ２−／−パイロット試料およびＩｇＧパイロット試料についてのＴＳＳからの距離の関数としてプロットされた別個のリードの数を示す３つのグラフのセットである。
図８Ａ〜Ｃは重複配列を除去してプロットした野生型トランスクリプトームについての染色体イデオグラムを示す。野生型トランスクリプトームにおける重複配列を除去した後のパイロットリード全てのマウスゲノムに対するアラインメントが示される。ユニークエレメントと反復配列の両方についての１００ｋｂのウインドウ毎のリード数をセントロメア（ＣＥＮ）から遠位テロメア（ＴＥＬＯ）まで距離（ｂｐ単位）の関数としてプロットしてある。１００キロベースのウインドウはオーバーラップせず、そして、連続的である。「ｎ」箇所に対応するリードが各位置でｎ分の１リードとして数えられるようにリードを正規化し、そして、免疫沈降試料と比較して非常に減少した対照ライブラリーの複雑性を説明するためにさらに正規化した。Ｃｈｒ：染色体。暗灰色：フォワード鎖、明灰色：リバース鎖。 同上 同上
図９Ａ〜Ｃは重複配列を除去してプロットしたＥｚｈ２−／−対照ライブラリーについての染色体イデオグラムを示す。図８の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。 同上 同上 図１０Ａ〜Ｃは重複配列を除去してプロットしたＩｇＧ対照ライブラリーについての染色体イデオグラムを示す。図８の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。 同上 同上 図１１Ａ〜Ｃは重複配列を除去してプロットした野生型の技術的反復についての染色体イデオグラムを示す。図８の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。 同上 同上
図１２Ａ〜Ｃ図１１Ａ〜Ｃは重複配列を除去してプロットした野生型の生物学的反復についての染色体イデオグラムを示す。図８の凡例に説明されるように解析を行った。野生型ライブラリーについてのグラフと同じスケールでグラフがプロットされていることに留意すること。 同上 同上 図１３は、ｃ‐Ｍｙｃ癌遺伝子（棒）の周辺の領域を示すプロットを表す。 図１４は、（Ｔｉｔｆ１としても知られる）Ｎｋｘ２‐１遺伝子の周辺の領域を示すプロットを表す。
図１５Ａ〜Ｃは、ＸｉｓｔのリピートＣを標的とするＬＮＡ分子が不活性型Ｘ染色体（Ｘｉ）上のＸｉｓｔ ＲＮＡの局在を消失させることを示す。 図１５Ａは１４種のタンデムマウスリピートＣ（配列番号１９３１２２〜１９３１３５）のアラインメントである。保存されたヌクレオチドがアスタリスクで示される。ＬＮＡ分子により標的とされる領域は線により示される。 図１５ＢはＬＮＡ分子のヌクレオフェクション後の表示の時点でのＸｉｓｔ ＲＮＡのＦＩＳＨの結果の定量を示す一対のグラフである。ＬＮＡ‐Ｃ１についての結果が示されているが、ＬＮＡ‐Ｃ２も同様の結果をもたらす。 図１５Ｃは、ＬＮＡ分子により標的とされるマウスとヒトのリピートＣ領域（左）（配列番号１９３１３６〜１９３１３９）のアラインメントを示す。
図１６は、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの排除にはＰＲＣ２の局在の消失が伴い、そして、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの回復はＸｉｓｔの近傍で最初に起こることを示す。棒グラフは、ＧａｐｄｈのＲＮＡに対して正規化された、ＸｉｓｔレベルのリアルタイムｑＲＴ‐ＰＣＲ分析の結果を示す。 図１７Ａ〜Ｃは、リピートＣの周辺の広範なドメインがＸｉｓｔの局在に必要であることを示す。 図１７ＡはＸｉｓｔのエクソン／イントロン構造と利用したＬＮＡ分子の位置の概略マップである。 図１７Ｂは、Ｇａｐｄｈの量に対して正規化された、ＸｉｓｔレベルのｑＲＴ‐ＰＣＲの結果を示す棒グラフである。 図１７ＣはＥｚｈ２抗体を用いるウェスタンブロットの画像である。負荷対照（loading control）としてアクチンを用いている。
図１８Ａ〜Ｄは、ＬＮＡ分子のヌクレオフェクション後のＥｚｈ２の回復はＸｉに沿って一様であるが動態が遅いことを示す。 図１８ＡはＸ染色体上の遺伝子の概略図である。 図１８Ｂは、Ｘ染色体上の遺伝子でのＥｚｈ２のＣｈＩＰ分析を示す棒グラフである。 図１８Ｃは、ＬＮＡ分子のヌクレオフェクション後のＥｚｈ２のＣｈＩＰ分析を示す一対の棒グラフである。アスタリスク：スチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５。 図１８Ｄは常染色体上のＥｎ１プロモーターでのＥｚｈ２濃縮のＣｈＩＰ分析を示す棒グラフである。
表１：ＰＲＣ２トランスクリプトームによってヒットするインプリント領域
ＰＲＣ２トランスクリプトームのインプリント遺伝子座標（geneimprint.comにおいてオンラインにより入手可能）との積集合。ＰＲＣ２結合転写物によって標的とされるマウスインプリント遺伝子（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）が列１に示される。列１はまたマウスインプリント遺伝子の染色体鎖を示す（「＋」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインはＰＲＣ２結合転写物がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す）。ＰＲＣ２結合転写物のｍｍ９における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖から転写されるのか（プラス鎖ヒット）、またはボトム鎖から転写されるのか（マイナス鎖ヒット）示す「＋」サインまたは「−」サインが列２に示される。列３はマウスＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列２のマウスの染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列４は、メイン州のバー・ハーバーにあるジャクソン・ラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース（ＭＧＤ）、ワールド・ワイド・ウェッブ(www.informatics.jax.org)、から得た、列１のマウスインプリント遺伝子に対応するヒト遺伝子の名前を示す。列２のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒが、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列５に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列６は予想されるヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列５のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。ＰＲＣ２相互作用転写物が列１のインプリント基準遺伝子と比較して反対の鎖から転写されるとき、そのことは、ＰＲＣ２相互作用性ＲＮＡが基準インプリント遺伝子に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖（「逆鎖」）であることを意味している。ＰＲＣ２結合転写物は必ずしも基準インプリント遺伝子そのものではなく、位置についてオーバーラップする別個の転写物であることに留意すること。
表２：ＰＲＣ２トランスクリプトーム
マウスＥＳ細胞においてＰＲＣ２と結合する９，７８８転写物が示される。ＷＴライブラリーにおけるリードをマップするために、連結型ＵＣＳＣトランスクリプトームが使用された。リードがヒットしたＵＣＳＣ転写物は列１に示される（「ＭＴＲ」は連結された遺伝子の名前である）。列２はＵＣＳＣ転写物の染色体鎖を示す（「＋」サインはトップ鎖またはプラス鎖を示し、「−」サインはボトム鎖またはマイナス鎖を示す）。ＰＲＣ２結合転写物のｍｍ９における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖から転写されるのか（プラス鎖ヒット）、またはボトム鎖から転写されるのか（マイナス鎖ヒット）示す「＋」サインまたは「−」サインが列３に示される。０．４以上のＲＰＫＭ値が「ヒット」とみなされた。列４はマウスＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列３のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列３のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒが、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列５に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列６は予想されるヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列５のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた。重複遺伝子の方向に関わらず、リードがマッチする染色体鎖に基づいてリードのアラインメントが報告されている。基準転写物の反対の鎖に対する単一のヒットは、ＰＲＣ２結合ＲＮＡが基準転写物に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖（「逆鎖」）であることを意味している。列２のマウスＰＲＣ２結合転写物によって、方向に関わらず、標的とされるどのオーバーラップしているｒｅｆＧｅｎｅ（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）も列７に示される。
表３：二価ドメイン（bivalent domain）と関連のＰＲＣ２相互作用転写物
ＰＲＣ２トランスクリプトームのＥＳ細胞の二価ドメイン（bivalent domain）との積集合。この解析のために、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら（２００７年）のｍｍ８座標がｍｍ９に変換された。列１は、鎖の方向に関わらず列２のＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる、オーバーラップするｒｅｆＧｅｎｅ（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を示す。ＰＲＣ２結合転写物の染色体座標（ｍｍ９）、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖（プラス鎖）から転写されるのか、またはボトム鎖（マイナス鎖）から転写されるのか示す「＋」サインまたは「−」サインが列２に示される。列３はマウスＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列２のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列２のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた）が、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列４に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列５は予想されるヒトＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列３のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。
表４：ＰＲＣ２結合部位と関連のＰＲＣ２相互作用転写物
ＰＲＣ２トランスクリプトームとＥＳ細胞中の既知のＳｕｚ１２結合部位との積集合。Ｂｏｙｅｒら（２００６年）のｍｍ８座標がｍｍ９に変換された。列１は、鎖の方向に関わらず列２のＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる、オーバーラップするｒｅｆＧｅｎｅ（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を示す。ＰＲＣ２結合転写物の染色体座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖（プラス鎖）から転写されるのか、またはボトム鎖（マイナス鎖）から転写されるのか示す「＋」サインまたは「−」サインが列２に示される。列３はマウスＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列２のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列２のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた）が、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列４に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列５は予想される対応するヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列４のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。
表５：ＰＲＣ２トランスクリプトームと交わりを持つ長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）ドメイン
ＰＲＣ２トランスクリプトームのマウス長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）ドメイン (Guttman et al., 2009)との積集合。ｍｍ６からｍｍ９への直接的ＬｉｆｔＯｖｅｒがないので、座標がｍｍ６からｍｍ８へ、その後、ｍｍ９へ変換された。長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）ドメインのどちらかの鎖に対してヒットが生じうる。ＰＲＣ２結合転写物の染色体座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖（プラス鎖）から転写されるのか、またはボトム鎖（マイナス鎖）から転写されるのか示す「＋」サインまたは「−」サインが列１に示される。列２はマウスＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列１のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列１のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた）が、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列３に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列４は予想される対応するヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列３のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列１のマウスＰＲＣ２結合転写物によって、方向に関わらず、標的とされるオーバーラップしているｒｅｆＧｅｎｅ（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）は列５に示される。
表６：癌遺伝子座内でのＰＲＣ２トランスクリプトームへのヒット
ＰＲＣ２トランスクリプトームの既知の癌遺伝子座 (cbio.mskcc.org/CancerGenesにおいてオンラインにより入手可能)との積集合。この解析のために、最初にｒｅｆＧｅｎｅ中の当該の名前の遺伝子を有する同鎖および同染色体上の座標をマージし、次に、大文字の使用を顧慮せずに、癌遺伝子の同一の名前をｒｅｆＧｅｎｅ中の遺伝子の名前とインターセクトすることにより、ヒト癌遺伝子座がマウス座標にマップされた。列１は、ＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる列６のヒト癌遺伝子に対応するマウス遺伝子の名前を示す。メイン州のバー・ハーバーにあるジャクソン・ラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース（ＭＧＤ）（www.informatics.jax.org）から対応するマウスとヒトの遺伝子の名前を獲得した。列１はまたマウス癌遺伝子の染色体鎖を示す（「＋」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインは遺伝子がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す）。ＰＲＣ２結合転写物のｍｍ９における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖（プラス鎖）から転写されるのか、またはボトム鎖（マイナス鎖）から転写されるのか示す「＋」サインまたは「−」サインが列２に示される。列３はマウスＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列２のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列２のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた）が、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列４に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列５は予想される対応するヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列４のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列６は、列２のマウスＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる各マウス癌遺伝子のヒトｒｅｆＧｅｎｅ名（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を示す。ＰＲＣ２結合転写物がｒｅｆＧｅｎｅと反対の鎖にあるとき、それは、ＰＲＣ２相互作用性ＲＮＡが基準癌遺伝子に対して相補的である、または方向についてアンチセンス鎖（「逆鎖」）であることを意味している。ＰＲＣ２相互作用転写物は必ずしもｒｅｆＧｅｎｅそのものである必要はなく、位置についてｒｅｆＧｅｎｅとオーバーラップする別個の転写物であることに留意すること。癌遺伝子と関連がある癌は列７に示されている。
表７：腫瘍抑制遺伝子座内でのＰＲＣ２トランスクリプトームへのヒット
ＰＲＣ２トランスクリプトームの既知の腫瘍抑制遺伝子座 (cbio.mskcc.org/CancerGenesにおいてオンラインにより入手可能）との積集合。この解析のために、ヒト腫瘍抑制遺伝子座が表６の癌遺伝子と同じ方法でマウス座標にマップされた。その表は表６の凡例において説明されているように構成されている。列１は、ＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる列６のヒト腫瘍抑制遺伝子に対応するマウス腫瘍抑制遺伝子を示す。メイン州のバー・ハーバーにあるジャクソン・ラボラトリーのマウスゲノムインフォマティクス内のマウスゲノムデータベース（ＭＧＤ）（www.informatics.jax.org）から対応するマウスとヒトの遺伝子の名前を獲得した。列１はまたマウス腫瘍抑制遺伝子の染色体鎖を示す（「＋」サインは遺伝子がトップ鎖またはプラス鎖から転写されることを示し、「−」サインは遺伝子がボトム鎖またはマイナス鎖から転写されることを示す）。ＰＲＣ２結合転写物のｍｍ９における染色体位置座標とヌクレオチド座標、ならびにＰＲＣ２結合転写物がトップ鎖（プラス鎖）から転写されるのか、またはボトム鎖（マイナス鎖）から転写されるのか示す「＋」サインまたは「−」サインが列２に示される。列３はマウスＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列２のマウス染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列２のマウス染色体座標のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＬｉｆｔＯｖｅｒ解析のために５０％保存が用いられた）が、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、列４に現れるオルソロガスなヒト染色体座標を作成した。マウスゲノムからヒトゲノムへ非常に保存された、または相同な領域をマップすることによりさらなるヒト染色体座標が作成された。列５は予想される対応するヒトＰＲＣ２結合転写物の配列番号を示す（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、列４のヒト染色体座標および染色体鎖から転写されるヌクレオチド配列）。列６は、列２のマウスＰＲＣ２結合転写物によって標的とされる各腫瘍抑制遺伝子のヒトｒｅｆＧｅｎｅ名（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を示す。
表８：ＰＲＣ２トランスクリプトームと別表Ｉにおいてリードを重ね合わせることにより作成されたピークの標的遺伝子との積集合
別表Ｉにおける配列リード（実施例１〜２に従ってｃＤＮＡをシーケンシングすることにより得られた）はＲＮＡ免疫沈降法の間に内在性のヌクレアーゼから保護された領域を表し、したがって、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡの領域を表す。上記のように、別表Ｉは２０１０年１２月２０日に提出された米国特許仮出願第６１／４２５，１７４号に現れ、本明細書に添付されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＷＴとヌルで３：１に濃縮され、そして、０．４という最小ＲＰＫＭ値を示す、別表Ｉのこれらの配列リードが重ねあわされて、本明細書において「ピーク」と称される配列のより長い連続領域が作成される。マウスのピークの対応するヌクレオチド配列（ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される）が配列表中に配列番号２１５８３〜１２４４３６、または配列番号１９０７１７〜１９０９３３または配列番号１９１０８８として現れる。これらのマウスピークのマウス染色体座標および染色体鎖のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒが、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、オルソロガスなヒト染色体座標を作成した。それぞれ対応するヒトピークＲＮＡ配列（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、ヒト染色体座標と染色体鎖のヌクレオチド配列）は配列表中に配列番号１２４４３７〜１９０７１６または配列番号１９０９３４〜１９１０８６または配列番号１９１０８７として現れる。
ＰＲＣ２結合ＲＮＡによって標的とされる遺伝子（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を同定するために、ＮＣＢＩのｒｅｆＧｅｎｅデータベースに由来する公知の遺伝子とこれらのヒトでのピークとヒトＰＲＣ２トランスクリプトーム（すなわち、表１〜７に記載されたＰＲＣ２結合転写物のヒト配列）をインターセクトした。同様に、ＰＲＣ２結合ＲＮＡによって標的とされる遺伝子（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を同定するために、ＮＣＢＩのｒｅｆＧｅｎｅデータベースに由来する公知の遺伝子と表１〜７のマウスでのピークとマウスＰＲＣ２トランスクリプトームをインターセクトした。
列１および２は、（ａ）ヒトＰＲＣ２結合転写物、（ｂ）ＰＲＣ２結合ＲＮＡ内のヒトピーク配列、（ｃ）マウスＰＲＣ２結合転写物、および（ｄ）ＰＲＣ２結合ＲＮＡ内のマウスピーク配列の全ての配列の配列番号を示すが、それらは列３に示されるＮＣＢＩ遺伝子（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子である）を標的とする。列３はＮＣＢＩ遺伝子の名前と唯一のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号（米国国立医学図書館、国立生物工学情報センター；第１９章、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：遺伝子のディレクトリー、 www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)を示す。ヒト遺伝子の名前は全て大文字として現れるが、マウス遺伝子の名前は最初の１文字のみが大文字で現れる。
列１は、基準ＮＣＢＩ遺伝子と同じ鎖から転写される「同鎖」ＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子が染色体のマイナス鎖から転写される場合、ＰＲＣ２結合ＲＮＡもまたマイナス鎖から転写される）。列２は、基準ＮＣＢＩ遺伝子と比較して反対の鎖、またはアンチセンス鎖から転写される「逆鎖」ＰＲＣ２結合ＲＮＡの配列番号を示す。配列番号１から２１５８２まで、または配列番号１９１０８９から１９２９７２までは転写物を表すが、配列番号２１５８３から１９１０８８まではピークを表す。
列１および２において、（ａ）転写物座標またはピーク座標と（ｂ）ＮＣＢＩ遺伝子座標の間の重複程度が角括弧中に現れている。正の数は２つの間でオーバーラップするヌクレオチドの数を示し、そして、負の数は２つの間でのギャップのサイズ（すなわち、２つの間で離れているヌクレオチドの数）を表す。ピークについて、角括弧内の「Ｆ」は、ピーク座標が遺伝子座標と完全に重なることを示す。転写物について、角括弧内の「Ｆ」は、転写物座標が遺伝子座標と完全に重なること、またはその逆を示す。
表９：ＰＲＣ２結合ＲＮＡの部類、ＲＮＡによって標的とされる遺伝子、および疾患の治療における使用法
列１はＮＣＢＩ遺伝子の名前と唯一の遺伝子ＩＤを示す。列２は、遺伝子の機能的グループおよびこれらの遺伝子に関係があり、そして、それらの発現を調節することにより治療され得る疾患、障害または病気の部類である。列３はＮＣＢＩ由来の遺伝子の説明である。
その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１２月２０日に提出された米国特許仮出願第６１／４２５，１７４号の別表Ｉは完全なＲＩＰ‐シークエンシングデータセットの表であり、そのデータセット中のリードの全てを示す。別表Ｉは本明細書に添付されてはいない。別表Ｉにおける配列リードはイルミナＧＡ‐ＩＩゲノムアナライザーから直接由来するものであり、ＰＲＣ２結合転写物の逆相補鎖の方向である。別表Ｉは、バイオインフォマティクスの選別がアダプター／プライマーダイマー、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ホモポリマ、未確定性ヌクレオチドを有するリード、および短縮型リード（１５ヌクレオチド未満）を除去した後のリード全ての選別済みサブセットである。
詳細な説明
本明細書に記載のＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）‐シークエンシング技術が、ＰＲＣ２複合体と結合する長鎖転写物（＞２００ｎｔ）のゲノムワイドなプールを捕捉するために直接または間接的に使用された。本明細書に記載のＰＲＣ２トランスクリプトームは、マウストランスクリプトーム全体の実際の大きさに応じて、おそらくマウスの発現した配列の５〜２５％を占める、マウスＥＳ細胞内の約１００００のＲＮＡからなる。トランスクリプトームの特性は、今後、バイオマーカーおよび治療標的として使用され得る、数十のインプリント遺伝子座、数百の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子座および多数の幹細胞関連ドメインを含む、医学的に重要な標的のクラスを特定している。マウスＰＲＣ２−転写物の全てではないにしても多くはヒトエピゲノムの直接の対応物を有する。
本明細書に実証されるように、少なくともＲＮＡのサブセットはインビボでポリコームタンパク質と相互作用し、多くの場合、相互作用するサブユニットはＥｚｈ２である。最近の研究では、Ｓｕｚ１２もＲＮＡと相互作用することが示されている（Kanhere et al., 2010）。細菌性とバキュロウイルスにより生成されたサブユニットとの間の違いは、結合特性の効果を有する転写後修飾物を生じることである。しかし、ＰＲＣ２の多数のサブユニットをＲＮＡにより制御することができ（特に、ともに核酸結合モチーフを有する、Ｅｚｈ２およびＳｕｚ１２）、これにより、ＰＲＣ２サブユニット間の結合、クロマチンのＰＲＣ２の結合親和性および／またはＥｚｈ２触媒速度を調節することができる。このシナリオは、ポリコームを制御するＲＮＡにより可能性のある機構の数を増幅する。本試験は、ＲＩＰ‐シークエンシングに、特にＰＲＣ２複合体の一部として使用されるおとりであるＥｚｈ２の何千ものＲＮＡ補因子を示唆する。本発明者らの知る限り、Ｅｚｈ２は、標識されたＥｚｈ２を使用する生化学的精製としてポリコーム複合体に存在するのみであり、ポリコーム関連ポリペプチドのみを特定し（Li et al., 2010）、ＰＲＣ２の他のサブユニットをノックアウトすることによりＥｚｈ２の急速な分解を生じる（Pasini et al., 2004; Montgomery et al., 2005; Schoeftner et al., 2006）。
シスおよびトランスの機構はともに、ＰＲＣ２トランスクリプトームのＲＮＡにより使用され得る。ＨＯＴＡＩＲがトランスで作用することが前提であったが（Rinn et al., 2007; Gupta et al.）、トランスクリプトームの多くのアンチセンス転写物は、Ｔｓｉｘなどの多くがシスで重複または結合されたコード遺伝子座にＰＲＣ２を指向することにより機能し得ることが示唆されている。本明細書において、シスでＨ３Ｋ２７トリメチル化を指向するＤｌｋ１遺伝子座にＰＲＣ２と結合し、標的とする結合ＲＮＡであるＧｔｌ２の例を挙げる。
本明細書に挙げる証拠により、ＲＮＡ補因子がポリコーム制御の一般的特徴であり、ＰＲＣ２トランスクリプトームのＲＮＡを標的とする本明細書の記載の抑制性核酸が恐らくＰＲＣ２関連抑制を阻害することにより遺伝子発現を上方制御することに成功することができることが実証されている。アンチセンス鎖の配向または同鎖の配向のいずれかにおいて、およびＰＲＣ２結合ＲＮＡの配置から１ｋｂ以上伸長する場合に、シスで遺伝子を制御することができる。ＲＮＡによる制御は、ポリコームタンパク質に特異的である必要はない。ＲＩＰ‐シークエンシング技術を利用し、他のクロマチン修飾因子のＲＮＡ補因子を特定することができ、異なる細胞型は発達プロフィールと一致した個別のトランスクリプトームを有する。ＰＲＣ２などのクロマチン修飾因子は幹細胞の多能性を維持する中心的な役割を果たし、癌において、制御ＲＮＡのゲノムワイドなプロフィールが疾患の診断および処置を求める中で貴重な手助けとなるだろう。
ＲＩＰ‐シークエンシング、長鎖非コードＲＮＡを生成する方法
本明細書において、ｌｎｃＲＮＡのライブラリーを生成する方法について記載する。このような方法を使用して、ＰＲＣ２複合体のＥｚｈ２部分と結合するＲＮＡを特定したが、他のＰＲＣ２サブユニットまたは関連のタンパク質との接触は排除されていない。いくつかの実施形態において、このような方法は、図１Ａに示されるステップを含み、当業者であれば、他の技法と示されるものと置き換えることができることが理解されるだろう。
いくつかの実施形態において、その方法には、細胞核性リボ核酸（「ｎＲＮＡ」）を含む試料、例えば核溶解物を含む、例えば核タンパク質に結合するｎＲＮＡを含む試料を得、試料と物質、例えば細胞核性リボ核酸に結合すると知られており、または疑われる核タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを含む。細胞核性リボ核酸に結合すると知られており、または疑われる核タンパク質のいくつかの例として、Ｅｚｈ２（Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6; Khalil et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 14;106(28):11667-72. Epub 2009 Jul 1）、Ｇ９ａ（Nagano et al., Science. 2008 Dec 12;322(5908):1717-20. Epub 2008 Nov 6）およびＣｂｘ７（Yap et al., Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):662-74）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、物質とタンパク質との間で複合体を形成するために十分な条件下で適用され、以下の一部または全てを含む：複合体の単離、ｎＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡの初期集団を得、必要であれば、鎖特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡの初期集団を精製し、長さが少なくとも２０ヌクレオチド（ｎｔ）であるｃＤＮＡの精製集団を得、そして、精製したｃＤＮＡの集団のハイスループットシークエンシングを行う。ホモポリマーのリードが選別され、ミトコンドリアゲノムおよびリボソームＲＮＡとアラインするリードを次の分析全てから除外する。基準ゲノムに１以下のミスマッチでアラインするリードを保持し、ミトコンドリアゲノムおよびリボソームＲＮＡにアラインするリードであるホモポリマーは除外する。次いで、可能性の高いＰＲＣ２相互作用転写物を２つの基準、すなわち（１）候補転写物がＲＰＫＭに関して（百万のリード毎のキロベース当たりのリード数）で最小リード量を有し、および／または（２）候補転写物が適切な対照ライブラリー（例えば、タンパク質−ヌルライブラリーまたは並行して行われたＩｇＧプルダウンから作製されたライブラリー）に対して野生型ライブラリーにおいて増加されることに基づき分類する。
一般に、ＲＩＰ‐シークエンシングライブラリーを構築するため、細胞核を調製し、デオキシリボヌクレアーゼで処理し、対照ＩｇＧ反応を並行して行うとともに、対象のクロマチン関連因子に対して指向された抗体とインキュベーションする。次いでＲＮＡタンパク質複合体をアガロースビーズ、磁性ビーズまたは溶液中もしくは固体マトリクス上の任意の他のプラットフォーム（例えば、カラム、マイクロ流体デバイス）を用いて免疫沈降させる。標準的な技法を使用してＲＮＡを抽出する。全てのＲＮＡ（ポリＡ ＲＮＡだけではない）を捕捉し、鎖情報を保存するため、非対称なプライマーを使用し、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを生成し、この場合、ファーストストランドｃDＮＡを作製する第１アダプター（アダプター１）は３’末端にランダムマルチマー配列（例えば、ランダムヘキサマー）を含有する。逆転写酵素を使用して、ファーストストランドを作製する。別個の第２アダプター（アダプター２）を使用してセカンドストランドを作製する。一例は以下の通りである：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを使用する場合、非テンプレートＣＣＣ３’オーバーハングを追加し、次いで、その非テンプレートＣＣＣオーバーハングにアニーリングするＧＧＧを３’末端に含む第２アダプターにハイブリダイズするようにそれを使うことができる。セカンドストランドを作製する他の方法と置き換えることができる。次いで、アダプター１およびアダプター２に特異的なプライマーペアを使用するＰＣＲを行ってｃＤＮＡを合成し、ハイスループットシークエンシングの標準的な方法により生成物の配列を決定した。シークエンシングの前に、（例えば、ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの）ゲル電気泳動または例えば、マイクロ流体デバイスもしくは標準的な生化学用カラムでの精製などの他の精製方法による分離後に所望のサイズのＲＮＡまたはｃＤＮＡを切り出すサイズ選択ステップを（所望の場合）組み込むことができる。
ｌｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡライブラリー
本発明は、本明細書に記載の個々のｌｎｃＲＮＡならびに本明細書に記載の方法により生成されたｌｎｃＲＮＡのライブラリーを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーは溶液中に存在し、または凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、ライブラリーは基材に結合している。例えば、この場合、ライブラリーの各メンバーは個々のアドレス指定可能なメンバー、例えばアレイ（例えば、マイクロアレイ）上の個々の領域またはビーズに結合している。非コードであるが、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡ転写物は、適切な位置でタンパク質コード基準遺伝子（例えば、発現がシスで調節される遺伝子）と重複する個別の転写物である場合にタンパク質コード塩基配列を含むことができる。
一実施形態において、ｌｎｃＲＮＡは、本明細書において例えば表２、３、４または５に示されるｌｎｃＲＮＡ配列の全長またはその少なくとも２０ｎｔを含む断片（例えば、少なくともその２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｎｔ、例えば全長ｌｎｃＲＮＡの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％以上）に少なくとも約８５％以上相同または同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、本明細書に示されるｌｎｃＲＮＡ配列に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡ配列に少なくとも約８５％相同または同一であり、例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一であるが、その断片またはリピートＡなどのより多く保存される領域において、その領域外の配列同一性は低い。
マウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析およびシンテニー位置のＵＣＳＣゲノムブラウザにおける分析は、ヒトゲノムに類似の転写物の存在を示す。この方法およびＬｉｆｔＯｖｅｒ鎖は一般にKent et al., Proc. Nat’l Acad. Sci., 100(20) 11484-11489 (2003)に記載されている。マウスの転写物とヒトの転写物との間の地理的類似性および配列類似性について考慮すると、同様な数のＰＲＣ２−相互作用転写物がヒト系において生じていると思われる。例えば、以下に記載のＰｖｔ１転写物はヒトにおいて十分に保存されている。ヒトＰＶＴ１もまた、ＭＹＣ遺伝子の近くに生じ、同様な発現プロファイルを有する。形質細胞腫において、ヒトＰＶＴ１が分断されることが多く、バーキットリンパ腫においても分断され得る。マウスＧｔｌ２およびＸｉｓｔもヒト系（ＧＴＬ２／ＭＥＧ３およびＸＩＳＴ）において十分に保存されている。従って、データは、マウスＰＲＣ２−転写物の全てではないにしても多くがヒトエピゲノムにおいて直接の対応物を有することを示唆する。他の種のこのような直接の対応物を本明細書において「オルソロガス」と称する。
ｌｎｃＲＮＡは、総合的ヌクレオチド同一性のレベルでは高度に保存されていないが機能的に保存され得る。例えば、マウスＸｉｓｔは、スライディング２１ｂｐウインドウを使用し、ヒトＸＩＳＴとの全体のヌクレオチド同一性が７６％のみ、または６０％のみの全体の配列同一性を示す。しかし、リピートＡなどの特定の機能ドメイン内において、保存の程度は異なる哺乳類動物種の間で７０％超であり得る。リピートＡの重要なモチーフは、繰り返しにより形成された二次構造である。それ故、ＰＲＣ２と相互作用するｌｎｃＲＮＡは、全体の保存において同様に低い可能性があるが、それでもなお、ＲＮＡの特定のドメイン内の二次構造に保存され、それによりＰＲＣ２のリクルートに関し、機能的保存を示す。
配列間の相同性および配列同一性（これらの用語は本明細書において同じ意味で使用される）の算出は以下のように行われる。
２つの核酸配列の同一性の割合を決定するため、配列は最適な比較のためにアラインされる（例えば、ギャップを第１および第２のアミノ酸の１つまたは両方に導入し、または最適アラインメントの核酸配列および非相同配列を比較のため無視することができる）。比較のためにアラインされた基準配列の長さは、基準配列の少なくとも８０％の長さであり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置の各ヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドにより占められている場合、次いでその位置の分子は同一である（本明細書で使用される核酸の「同一性」は、核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列間の同一性の割合（％）は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮しながら、各配列により共有される同一の位置の数の関数である。
本発明の目的として、配列の比較および２つの配列間の同一性の割合の決定を、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４およびフレームシフトギャップペナルティが５のブロッサム６２スコアリングマトリクスを使用して達成することができる。
ＰＲＣ２トランスクリプトームにおいて本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡの可能性がある使用法がいくつかある：ＲＮＡ自体またはアンタゴｍｉＲおよびこれらに対して設計された小分子を利用してポリコーム標的遺伝子の発現を（上方または下方のいずれかに）調節することができる。
ＬＮＡ分子による長鎖ｎｃＲＮＡの標的化に関するものを含む様々な関連の態様において、長鎖ｎｃＲＮＡには、長さが６０ｎｔよりも長い、例えば１００ｎｔよりも長い、例えば２００ｎｔよりも長く、長さが１００アミノ酸よりも長いプラス鎖のオープン・リーディング・フレームを持たず、実験証拠によりｌｎｃＲＮＡとして特定され、そして、既知の（低分子の）機能的ＲＮＡクラス（リボソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡおよび低分子核／核小体ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない）から区別される内在性細胞性ＲＮＡが含まれ得る。例えば、Lipovich et al., “MacroRNA underdogs in a microRNA world: Evolutionary, regulatory, and biomedical significance of mammalian long non-protein-coding RNA” Biochimica et Biophysica Acta (2010) doi:10.1016/j.bbagrm.2010.10.001; Ponting et al., Cell 136(4):629-641 (2009), Jia et al., RNA 16 (8) (2010) 1478-1487, Dinger et al., Nucleic Acids Res. 37 1685 (2009) D122-D126（データベースの号）およびそれらに引用された参考文献を参照のこと。ｌｎｃＲＮＡは、長鎖ＲＮＡ、大分子ＲＮＡ、マクロＲＮＡ、遺伝子間ＲＮＡおよび非コード転写物とも呼ばれている。
本明細書に記載の方法を使用して、核局在性ｌｎｃＲＮＡを標的とすることができる。ｌｎｃＲＮＡの既知のクラスとして、大分子の遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ、例えば、Guttman et al., Nature. 2009 Mar 12;458(7235):223-7. Epub 2009 Feb 1（これは哺乳類動物における１０００以上の例の高度に保存された非コードＲＮＡについて記載されている）;およびKhalil et al., PNAS 106(28)11675-11680 (2009)を参照のこと）、プロモーター関連短鎖ＲＮＡ（ＰＡＳＲ、例えば、Seila et al., Science. 2008 Dec 19;322(5909):1849-51. Epub 2008 Dec 4; Kanhere et al., Molecular Cell 38, 675-688, (2010)を参照のこと）、内在性アンチセンスＲＮＡ（例えば、Numata et al., BMC Genomics. 10:392 (2009); Okada et al., Hum Mol Genet. 17(11):1631-40 (2008); Numata et al., Gene 392(1-2):134-141 (2007);およびRosok and Sioud, Nat Biotechnol. 22(1):104-8 (2004)を参照のこと）およびＰＲＣ２およびＬＳＤ１などのクロマチン修飾因子と結合するＲＮＡ（例えば、Tsai et al., Science. 2010 Aug 6;329(5992):689-93. Epub 2010 Jul 8; and Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6を参照のこと）が挙げられる。
ｌｎｃＲＮＡの例として、ＸＩＳＴ、ＴＳＩＸ、ＭＡＬＡＴ１、ＲＮＣＲ２およびＨＯＴＡＩＲが挙げられる。１７０００以上の長鎖ヒトｎｃＲＮＡの配列が、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウェブサイトのＮＣｏｄｅ（商標）Ｌｏｎｇ ｎｃＲＮＡデータベースにおいて見出され得る。さらなる長鎖ｎｃＲＮＡは、例えば、既刊参考文献のマニュアル、マウス機能アノテーション（ＦＡＮＴＯＭ３）プロジェクト、ヒト完全長ｃＤＮＡアノテーション共同研究（Ｈ−Ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎａｌ）プロジェクト、コンピュータパイプラインを使用したマウスおよびヒトのｃＤＮＡおよびＥＳＴデータベースによるアンチセンスｎｃＲＮＡ（Zhang et al., Nucl. Acids Res. 35 (suppl 1): D156-D161 (2006); Engstrom et al., PLoS Genet. 2:e47 (2006)）、ｓｎｏＲＮＡ−ＬＢＭＥ−ｄｂであるＲＮＡｚ由来のヒトｓｎｏＲＮＡおよびｓｃａＲＮＡ（Washietl et al. 2005）、非コードＲＮＡ探索（Torarinsson, et al. 2006）およびＥｖｏＦｏｌｄ（Pedersen et al. 2006）を使用して特定することができる。
遺伝子発現の調節方法
遺伝子治療またはエピジェネティック治療のために細胞、例えば、癌細胞、幹細胞または他の正常な細胞種で遺伝子の発現を調節するため、本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡと長さが少なくとも２０ｎｔのその断片、および抑制性核酸およびそれらを標的とする（例えば、それらに相補的な）小分子を使用することができる。細胞は、（エクスビボを含む）インビトロまたはインビボ（例えば、癌、例えば腫瘍を有する対象において）であってよい。
本明細書に記載の方法を、癌遺伝子および細胞、例えば癌細胞の腫瘍抑制因子の発現を調節するために使用することができる。例えば、細胞の癌遺伝子の発現を低下させるため、その方法は、表６に記載の癌遺伝子、表１のインプリント遺伝子および／または表２の他の成長促進遺伝子を制御する、長鎖非コードＲＮＡおよびそのＰＲＣ２結合断片を細胞に導入することを含む。
別の例として、細胞の腫瘍抑制因子の発現を増加させるため、前記方法は、表７に記載の腫瘍抑制因子を標的とする長鎖非コードＲＮＡ、表１のインプリント遺伝子および／または表２の他の成長抑制遺伝子（例えば、癌を有する対象、例えば肺腺癌患者のＮｋｘ２−１またはＴｉｔｆ−１）に特異的に結合し、または相補的な抑制性核酸または小分子を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、表１に記載のインプリント遺伝子を標的とする長鎖非コードＲＮＡに特定的に結合し、または相補的な抑制性核酸を細胞に導入することを含む。「特異的に」結合する核酸は、おもに標的ｌｎｃＲＮＡまたは関連ｌｎｃＲＮＡに結合し、ｌｎｃＲＮＡの制御機能を阻害するが、他の非標的ＲＮＡの機能は阻害しない。従って、核酸相互作用の特異性とは、そのハイブリダイゼーション能力よりむしろその機能（例えば、遺伝子発現のＰＲＣ２関連抑制を阻害）を指す。抑制性核酸は、他の制御タンパク質の結合に干渉せず、非特定的結合したＲＮＡの分解を生ずることなく、ゲノムの他の部位または他のｍＲＮＡに非特異的に結合し得る。従って、この非特異的結合は、他の非標的ＲＮＡの機能に大きく影響することなく、重度の有害作用も生じない。
これらの方法を使用して、ｌｎｃＲＮＡ（例えば、癌促進癌遺伝子またはインプリント遺伝子を阻害するｌｎｃＲＮＡ）を含む（例えば、本明細書に記載の）組成物またはそのＰＲＣ２−結合断片および／または長鎖非コードＲＮＡに結合する抑制性核酸（例えば、表２の腫瘍抑制因子または癌抑制インプリント遺伝子および／または他の成長抑制遺伝子を阻害するｌｎｃＲＮＡに結合する抑制性核酸）を対象に投与することにより、対象の癌を処置することができる。癌に関与する遺伝子および癌の分類の例を表９に示す。細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例として、癌、例えば癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、例えば白血病がある。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓由来の腫瘍を含むがそれらに限定されない無数の原発性腫瘍型から生じ得る。
本明細書で使用される場合、処置することは、疾患の危険のある患者の疾患の兆候または症状の発生を減少させ、または予防する（もしくはその危険を減少させる）ことを意味する「予防処置」および疾患と診断された患者の疾患の兆候または症状を減少させ、疾患の進行を遅らせ、疾患の重症度を低下させることを意味する「治療処置」を含む。癌に関して、処置することは、腫瘍細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞死または致死を増加させ、腫瘍細胞増殖または転移の速度を阻害し、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍数を減少させ、転移数を減少させ、１年または５年生存率を増加させることを含む。
本明細書で使用する用語「癌」、「過剰増殖」および「新生物」は、自律的な増殖の能力、すなわち、急速に細胞増殖が急増することを特徴とする異常状態または症状を有する細胞を指す。過剰増殖および新生物疾患の状態は、病的、すなわち疾患状態を特徴づけまたは構成するとして分類され得るか、または非病的、すなわち正常からの逸脱であるが、疾患状態と関連しないとして分類され得る。この用語は、組織病理学的種類または非侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌の増殖または癌遺伝子の過程、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織または器官を含むことを意味する。「病的な過剰増殖」細胞は、悪性腫瘍増殖により特徴づけられる疾患状態に生じる。非病的過剰増殖細胞の例として、創傷修復に関連した細胞の増殖を含む。
用語「癌」または「新生物」は様々な器官系の悪性腫瘍を含み、例えば、肺を冒すもの（例えば、小細胞癌、非小細胞癌、扁平上皮癌、腺癌）、乳癌、甲状腺癌、リンパ種、胃腸癌、尿生殖路癌、腎臓癌、膀胱癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍ならびに悪性腫瘍を含む腺癌、例えば、ほとんどの結腸癌、結直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道癌等である。
用語「癌」は当分野で認識されており、呼吸器系癌、胃腸管系癌、尿生殖路癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態において、疾患は腎臓癌または黒色腫である。癌の例として、子宮頚部、肺、前立腺、乳房、頭頚部、結腸および卵巣の組織から形成されるものがある。この用語は癌肉腫を含み、例えば癌性および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織由来の癌または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成することを指す。
用語「肉腫」は当分野で認識されており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
増殖性障害のさらなる例として、造血新生物障害がある。本明細書で使用される「造血新生物障害」という用語は、造血細胞由来の過形成／新生物性細胞を含み、例えば、骨髄、リンパ球または赤血球系またはその前駆体細胞から生じる疾患を含む。好ましくは、疾患は、分化不良の急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。骨髄性障害のさらなる例として、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられるが、それらに限定されず（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97に概説）、リンパ球悪性腫瘍は、Ｂ細胞系ＡＬＬおよびＴ細胞系ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）を含むがそれらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態は、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／成人Ｔ細胞リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリードステルンベルグ病を含むが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して処置することができる特定の癌を例えば表６または９に挙げ、乳房、肺、前立腺、中枢神経系（例えば、神経膠腫）、唾液腺、前立腺、卵巣の癌および白血病（例えば、ＡＬＬ、ＣＭＬまたはＡＭＬ）を含むがそれらに限定されない。これらの遺伝子と特定の癌の関連は当技術分野で知られており、例えばFutreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4;177-83（参照により本明細書に組み込まれており、例えば表１を参照のこと）;およびＣＯＳＭＩＣ（癌における体細胞突然変異カタログ）データベースおよびウェブサイト、Bamford et al., Br J Cancer. 2004;91;355-8に記載されており、さらにForbes et al., Curr Protoc Hum Genet. 2008;Chapter 10;Unit 10.11ならびにＣＯＳＭＩＣデータベース、例えばｖ．５０（２０１０年１１月３０日）を参照のこと。例えば、表６または９の任意の特定の種類の癌の参照は、他の種類の癌、すなわち、一般の癌の患者が処置され得ることを意味することが理解される。
さらに、本明細書に記載の方法を、幹細胞の多能性を調節する（例えば、強化または低下させる）ために、かつ内胚葉、中胚葉、外胚葉および発達派生物を生成する特定の分化経路に幹細胞を下方に指向させるために使用することができる。多能性を増加、維持または強化するため、方法は、表３に記載の長鎖非コードＲＮＡに特異的に結合し、または相補的な抑制性核酸を細胞に導入することを含む。幹細胞の多能性を低下させ、または分化を強化するため、方法は、表３に記載の長鎖非コードＲＮＡを細胞に導入することを含む。本明細書に記載の方法に有用な幹細胞は、成人幹細胞（例えば、対象、例えば処置される対象の内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉または血液から得た成人幹細胞）；胎盤または臍帯から得られた胚性幹細胞または幹細胞；始原細胞（例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉または血液由来の始原細胞）；および人工多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、組成物、例えば、表１、２、３、６もしくは７または表８に記載の、本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡに相補的な抑制性核酸を含む殺菌組成物を投与することを含む。本明細書に記載の方法の実施に使用される抑制性核酸はｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含むが、それらに限定されないアンチセンスＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、修飾された核酸ポリマー（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子）である。
抑制性核酸は、ヒトを含む動物の疾患状態の処置における治療成分として使用されている。抑制性核酸は、細胞、組織および動物、特にヒトの処置のための処置方法に有用であるよう構成されることができる有用な治療モダリティーであり得る。
治療剤として、癌を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従ってｌｎｃＲＮＡまたは抑制性核酸を投与することにより処置する。例えば、非限定的な一例において、方法は、本明細書に記載の治療有効量のｌｎｃＲＮＡまたは抑制性核酸を、処置を必要とする動物に投与するステップを含む。
抑制性核酸
本方法および組成物に有用な抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などの一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、修飾塩基を含む分子、ロックド核酸分子（ＬＮＡ分子）、アンタゴｍｉＲ、ペプチド核酸分子（ＰＮＡ分子）および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、かつその機能を調節する他のオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチド模倣物を含む。いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾系を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小分子一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導性遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）あるいはその組み合わせを含む。例えば、国際公開第WO ２０１００４０１１２号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、１０〜５０、１３〜５０または１３〜３０ヌクレオチドの長さである。当業者であれば、これが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さまたはその任意の範囲のアンチセンス（相補性）部分を有するオリゴヌクレオチドを具体化することが理解されるだろう。非相補性塩基をこのような抑制性核酸に含むことができ、例えば、３０ヌクレオチドの長さの抑制性核酸は標的化ＲＮＡに相補的である１５塩基の一部を有し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１５ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスまたはオリゴヌクレオチド化合物は１２または１３〜３０ヌクレオチドの長さである。当業者であれば、これが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さのアンチセンス（相補性）部分を有する抑制性核酸を具体化することが理解されるだろう。
好ましくは、抑制性核酸は、修飾糖部分および／または修飾ヌクレオシド間結合および／または修飾ヌクレオチドおよび／またはその組み合わせを含む１つ以上の修飾物を含む。所与のオリゴヌクレオチドの全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に本明細書に記載の２つ以上の修飾物を一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内でも組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、２つ以上の化学的に個別の領域を含有し、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドからなるキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に１つ以上の有益な性質（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細胞への取り込みの増加、標的の結合親和性の増加）を与える修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域およびＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素のための基質である領域を含有する。本発明のキメラ抑制性核酸を、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、上記のオリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合体構造として形成することができる。このような化合物はまた、当技術分野においてハイブリッドまたはガンパーとして呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５０１３８３０号、同第５１４９７９７号、同第５２２０００７号、同第５２５６７７５号、同第５３６６８７８号、同第５４０３７１１号、同第５４９１１３３号、同第５５６５３５０号、同第５６２３０６５号、同第５６５２３５５号、同第５６５２３５６号および同第５７００９２２号を含むがそれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、糖の２’位で修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、ＲＮＡ修飾物は、ピリミジンのリボースに２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル修飾物、ＲＮＡの３’末端に非塩基性残基または逆位塩基を含む。このような修飾物は、日常的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドに比べＴｍが高い（すなわち、標的結合親和性が高い）ことが示されている。
多くのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾物が、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、天然のオリゴデオキシヌクレオチドに比べヌクレアーゼ消化に対してより耐性にさせ、これらの修飾オリゴが未修飾のオリゴヌクレオチドに比べより長時間無傷のまま残ることが示されている。修飾オリゴヌクレオチドの特定の例として、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合あるいは短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環糖間結合を含むものがある。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するもの、特にＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格を有するものであり、ここで、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨとして表される）；アミド骨格（De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374を参照のこと）；モルホリノ骨格構造（Summerton and Weller,米国特許第５，０３４，５０６号を参照のこと）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格と置き換えられ、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する、Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497を参照のこと）。リン含有結合には、正常な３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホンネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、およびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合する、逆転した極性を有するものが含まれるが、それらに限定されない。米国特許第３６８７８０８号、同第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号および同第５６２５０５０号を参照のこと。
モルホリノ系オリゴマー化合物は、Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510); Genesis, volume 30, issue 3, 2001; Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214; Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596;および１９９１年６月２３日に交付された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。いくつかの実施形態において、モルホリノ系オリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（例えば、それらの開示は、全体を参照により本明細書に組み込まれる、Iverson, Curr. Opin. Mol. Ther., 3:235-238, 2001;およびWang et al., J. Gene Med., 12:354-364, 2010に記載）である。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602に記載されている。
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド結合あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものを含みむ。それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５０３４５０６号、同第５１６６３１５号、同第５１８５４４４号、同第５２１４１３４号、同第５２１６１４１号、同第５２３５０３３号、同第５２６４５６２号、同第５２６４５６４号、同第５４０５９３８号、同第５４３４２５７号、同第５４６６６７７号、同第５４７０９６７号、同第５４８９６７７号、同第５５４１３０７号、同第５５６１２２５号、同第５５９６０８６号、同第５６０２２４０号、同第５６１０２８９号、同第５６０２２４０号、同第５６０８０４６号、同第５６１０２８９号、同第５６１８７０４号、同第５６２３０７０号、同第５６６３３１２号、同第５６３３３６０号、同第５６７７４３７号および同第５６７７４３９号を参照のこと。
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、アラビノヌクレオチドまたは修飾アラビノヌクレオチド残基系またはこれらから構成されるオリゴヌクレオチドを含むことが知られている。アラビノヌクレオシドはリボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位の立体構造においてのみ異なる。いくつかの実施形態において、２’−アラビノ修飾物は、２’−Ｆアラビノである。いくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）である（例えば、これらの開示は、全体を参照により本明細書に組み込まれる、Lon et al., Biochem., 41:3457-3467, 2002およびMin et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:2651-2654, 2002に記載。）。同様の修飾が、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオシドの糖の３’位または２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおよび５’末端ヌクレオチドの５’位になされ得る。
ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９９／６７３７８号は、相補的メッセンジャーＲＮＡへの会合を介して遺伝子発現の配列特異的抑制を向上させるアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマーおよびその類似体を開示している。
他の好ましい修飾物は、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を含む（例えば、それらの開示は全体を参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第WO ２００５／０４２７７７号、Morita et al., Nucleic Acid Res., Suppl 1:241-242, 2001; Surono et al., Hum. Gene Ther., 15:749-757, 2004; Koizumi, Curr. Opin. Mol. Ther., 8:144-149, 2006およびHorie et al., Nucleic Acids Symp. Ser (Oxf), 49:171-172, 2005）。好ましいＥＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸を含むが、それだけに限定されない。
ＬＮＡの例は、国際公開第WO/２００８／０４３７５３号に記載され、以下の式の化合物を含む。
式中、ＸおよびＹは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−または−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−からなる群から選択され、Ｒは水素およびＣ１−４アルキルから選択され、ＺおよびＺ＊は独立してヌクレオシド間結合、末端基または保護基から選択され、Ｂは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、非対称基はいずれかの配向でも見出すことができる。
好ましくは本発明のオリゴマーで使用されるＬＮＡは、以下の式のいずれかにおいて少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む。
式中、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ（ＲＨ）であり、ＺおよびＺ＊は独立してヌクレオシド間結合、末端基または保護基から選択され、Ｂは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは水素およびＣ１−４アルキルから選択される。
好ましくは、本発明の、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物で使用されるロックド核酸（ＬＮＡ）はＰＣＴ出願第ＤＫ２００６／０００５１２号のスキーム２に示される式のいずれかにおいてロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
好ましくは、本発明のオリゴマーで使用されるＬＮＡは、−0−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−0−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−0−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、式中、ＲＨは、水素およびＣ１−４アルキルから選択される。
特に好ましいＬＮＡ単位をスキーム２に示す。
スキーム２
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式のＸまたはＹのうちの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡはβ−Ｄおよびα−Ｌ−立体構造の両方であることができる。
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式のＸまたはＹのうちの少なくとも１つが−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択されるロックドヌクレオチドを含み、式中、Ｒは水素およびＣ１−４アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡはβ−Ｄおよびα−Ｌ−立体構造の両方であることができる。
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式のＸまたはＹのうちの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡはβ−Ｄおよびα−Ｌ−立体構造の両方であることができる。
「ｅｎａ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式のＹが−ＣＨ２−Ｏ−であるロックドヌクレオチドを含む（式中、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は塩基Ｂに対して２’位に結合する）。
ＬＮＡをさらに以下に詳述する。
１つ以上の置換糖部分を、例えば２’位に以下の１つを含めることができる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、式中、ｎは１〜約１０であり、Ｃi〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基および類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾物は、２’−メトキシエトキシ［２’−0−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる）］（Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）を含む。他の好ましい修飾物は、２’−メトキシ（２’−0−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。類似の修飾もオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位でなされ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基に代わり、シクロブチルなどの糖模倣体を有し得る。
抑制性核酸はまた、追加して、または代替的にヌクレオ塩基（当技術分野において多くの場合、単に「塩基」と呼ばれる）修飾物または置換物を含み得る。本明細書で使用される「未修飾」または「天然の」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸に稀にまたは一時的にのみ見出されるヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシチジンとも呼ばれ、当技術分野において、多くの場合、５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ、イソシトシン、プソイドイソシトシンならびに合成ヌクレオ塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンおよび２，６−ジアミノプリンまたは他のジアミノプリンを含む。例えば、Kornberg, “DNA Replication,” W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77;およびGebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res., 15:4513 (1987)を参照のこと。イノシンなどの、当技術分野で知られている「ユニバーサル」塩基も含むことができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、０．６〜１．２<0>Cだけ核酸の二重鎖安定性を増大させることが示され（Sanghvi, in Crooke, and Lebleu, eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、現在好ましい塩基置換物である。
所与のオリゴヌクレオチドは全て位置で均一に修飾される必要はなく、事実上、本明細書に記載の修飾の２つ以上が単一のオリゴヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内にさえも組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位の、糖とヌクレオシド間結合はともに、すなわち、骨格は新規の基に置き換えられる。塩基単位を適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持する。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体であるそのようなオリゴマー化合物の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。ヌクレオ塩基が保持され、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号を含むが、それらに限定されない。さらに、ＰＮＡ化合物の教示は、Nielsen et al, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
抑制性核酸はまた、１つ以上のヌクレオ塩基（当技術分野において、多くの場合、単に「塩基」と呼ばれる）修飾物または置換物を含むことができる。本明細書で使用される「未修飾」または「天然の」ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、他の合成および天然のヌクレオ塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルクアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
さらに、ヌクレオ塩基は、米国特許第３６８７８０８号に開示されているもの、“The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering”, pages 858-859, Kroschwitz, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition, 1991, 30, page 613によって開示されているものおよびにSanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications,” pages 289- 302, Crooke, and Lebleu, eds., CRC Press, 1993よって開示されているものを含む。これらのヌクレオ塩基のうちのある特定のものは、特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増大に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンを含み、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換物は、０．６〜１．２<0>Cだけ核酸の二重鎖安定性を増大させることが示され（Sanghvi, et al., eds,“Antisense Research and Applications,” CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、現在、さらにより具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾物と組み合わせる場合に好ましい塩基置換物である。修飾ヌクレオ塩基は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３６８７８０８号ならびに同第４８４５２０５号、同第５１３０３０２号、同第５１３４０６６号、同第５１７５２７３号、同第５３６７０６６号、同第５４３２２７２号、同第５４５７１８７号、同第５４５９２５５号、同第５４８４９０８号、同第５５０２１７７号、同第５５２５７１１号、同第５５５２５４０号、同第５５８７４６９号、同第５５９６０９１号、同第５６１４６１７号、同第５７５０６９２号および同第５６８１９４１号に記載されている。
いくつかの実施形態において、抑制性核酸はオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞の取り込みを強化する１つ以上の部分または複合体に化学結合する。例えば、同じまたは異なる種類の１つ以上の抑制性核酸は互いに複合体化することができ、または抑制性核酸は、細胞の種類または組織の種類の特異性が強化された標的とする部分と複合体化することができる。
このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49- 54）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−リン酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）または酢酸アダマンタン（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔ−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）を含むがそれらに限定されない。さらに、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４８２８９７９号、同第４９４８８８２号、同第５２１８１０５号、同第５５２５４６５号、同第５５４１３１３号、同第５５４５７３０号、同第５５５２５３８号、同第５５７８７１７号、同第５５８０７３１号、同第５５８０７３１号、同第５５９１５８４号、同第５１０９１２４号、同第５１１８８０２号、同第５１３８０４５号、同第５４１４０７７号、同第５４８６６０３号、同第５５１２４３９号、同第５５７８７１８号、同第５６０８０４６号、同第４５８７０４４号、同第４６０５７３５号、同第４６６７０２５号、同第４７６２７７９号、同第４７８９７３７号、同第４８２４９４１号、同第４８３５２６３号、同第４８７６３３５号、同第４９０４５８２号、同第４９５８０１３号、同第５０８２８３０号、同第５１１２９６３号、同第５２１４１３６号、同第５０８２８３０号、同第５１１２９６３号、同第５２１４１３６号、同第５２４５０２２号、同第５２５４４６９号、同第５２５８５０６号、同第５２６２５３６号、同第５２７２２５０号、同第５２９２８７３号、同第５３１７０９８号、同第５３７１２４１号、同第５３９１７２３号、同第５４１６２０３号、同第５４５１４６３号、同第５５１０４７５号、同第５５１２６６７号、同第５５１４７８５号、同第５５６５５５２号、同第５５６７８１０号、同第５５７４１４２号、同第５５８５４８１号、同第５５８７３７１号、同第５５９５７２６号、同第５５９７６９６号、同第５５９９９２３号、同第５５９９９２８号および同第５６８８９４１号を参照のこと。
これらの部分または複合体は、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合する結合基を含むことができる。本発明の結合基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を強化する基およびオリゴマーの薬物動態特性を強化する基を含む。典型的な結合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、ヨウ酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料を含む。本発明の文脈において、薬力学特性を強化する基は、標的核酸の取り込みを改善し、分解に対する耐性を強化し、および／または配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において、薬物動態特性を強化する基は、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基を含む。代表的な結合基は、参照により本明細書に組み込まれる、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号および米国特許第６２８７８６０号に開示されている。
結合部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−リン酸、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖または酢酸アダマンタン、パルミチル部分またはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むがそれらに限定されない。例えば、米国特許第４８２８９７９号、同第４９４８８８２号、同第５２１８１０５号、同第５５２５４６５号、同第５５４１３１３号、同第５５４５７３０号、同第５５５２５３８号、同第５５７８７１７号、同第５５８０７３１号、同第５５８０７３１号、同第５５９１５８４号、同第５１０９１２４号、同第５１１８８０２号、同第５１３８０４５号、同第５４１４０７７号、同第５４８６６０３号、同第５５１２４３９号、同第５５７８７１８号、同第５６０８０４６号、同第４５８７０４４号、同第４６０５７３５号、同第４６６７０２５号、同第４７６２７７９号、同第４７８９７３７号、同第４８２４９４１号、同第４８３５２６３号、同第４８７６３３５号、同第４９０４５８２号、同第４９５８０１３号、同第５０８２８３０号、同第５１１２９６３号、同第５２１４１３６号、同第５０８２８３０号、同第５１１２９６３号、同第５２１４１３６号、同第５２４５０２２号、同第５２５４４６９号、同第５２５８５０６号、同第５２６２５３６号、同第５２７２２５０号、同第５２９２８７３号、同第５３１７０９８号、同第５３７１２４１号、同第５３９１７２３号、同第５４１６２０３号、同第５４５１４６３号、同第５５１０４７５号、同第５５１２６６７号、同第５５１４７８５号、同第５５６５５５２号、同第５５６７８１０号、同第５５７４１４２号、同第５５８５４８１号、同第５５８７３７１号、同第５５９５７２６号、同第５５９７６９６号、同第５５９９９２３号、同第５５９９９２８および同第５６８８９４１号を参照のこと。
本方法において有用な抑制性核酸は、標的ｌｎｃＲＮＡと十分に相補的であり、例えば、所望の効果を得るため十分にハイブリダイズし、十分な生物学的官能特異性を有する。「相補的」は、天然または非天然由来の（例えば、上記のように修飾された）塩基（ヌクレオシド）またはその類似体を含む２つの配列間の塩基スタッキングおよび特異的水素結合を介して対合する能力を指す。例えば、抑制性核酸の一つの位置の塩基がｌｎｃＲＮＡの対応する位置で塩基と水素結合することができるならば、その塩基はその位置で互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は必要としない。上記のように、抑制性核酸は、ユニバーサル塩基または水素結合にプラスまたはマイナスに寄与することがない不活性非塩基性スペーサーを含むことができる。塩基対合は、規範的なワトソン−クリック塩基対合および非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合およびフーグスティーン塩基対合）をともに含むことができる。相補的塩基対合について、アデノシン型塩基（Ａ）はチミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）はグアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であり、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴにハイブリダイズすることができ、かつ相補的である考えられることが理解される。Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493およびLoakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043。イノシン（Ｉ）はまた、当技術分野においてユニバーサル塩基であると考えられており、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的である考えられる。Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267を参照のこと。
いくつかの実施形態において、抑制性核酸がハイブリダイズする標的ｌｎｃＲＮＡの位置は、タンパク質結合パートナーが結合する標的領域として定義される。これらの領域を別表Ｉにおいて提出したデータを総括し、データセットに強化された領域を特定することにより特定することができ、これらの領域はタンパク質結合配列を含む可能性が高い。ピークと呼ばれる、このような領域の特定を以下の実施例８に記載する。日常的な方法を使用して、十分な特異性を有するこの配列に結合する抑制性核酸を設計することができる。いくつかの実施形態において、方法は、当技術分野で公知のバイオインフォマティクス方法を使用し、２次構造、例えば１、２以上のステムループ構造またはプソイドノットの領域を特定すること、および抑制性核酸を用いて標的とするこれらの領域を選択することを含む。
特定の例示的標的セグメントの特定の配列が本明細書に記載されるが、当業者であれば、これらが本発明の範囲内で特定の実施形態を例示説明し、記載することに役立つ役割を果たしていることを認識するだろう。さらなる標的セグメントが、本開示の点を見て、当業者により容易に特定可能である。タンパク質結合領域内の少なくとも５連続ヌクレオチドの伸長を含む５〜５００ヌクレオチドの長さの標的セグメントまたはその真隣が十分に標的に適していると考えられる。標的セグメントは、タンパク質結合領域の１つの５’末端から少なくとも５連続ヌクレオチドを含む配列を含むことができる（残りのヌクレオチドは、結合セグメントの５’末端のすぐ上流で開始され、抑制性核酸が約５〜約１００ヌクレオチドを含有するまで継続する同じＲＮＡを連続的に伸長する）。同様に、好ましい標的セグメントは、例次説明となる好ましい標的セグメントの１つの３’末端から少なくとも５連続ヌクレオチドを含むＲＮＡ配列により表される（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３’末端のすぐ下流で開始され、抑制性核酸が約５〜約１００ヌクレオチドを含有するまで継続する同じｌｎｃＲＮＡを連続的に伸長する）。本明細書に挙げる配列を使用する当業者であれば、過度の実験を行うことなく、相補的な抑制性核酸を用いて標的とするさらに好ましいタンパク質結合領域を特定することができるだろう。
本開示の文脈において、ハイブリダイゼーションは、塩基スタッキングおよび水素結合を意味し、これは相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対となる相補的ヌクレオ塩基である。当技術分野で使用される場合、相補的は、２つのヌクレオチド間の正確に対合する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができるならば、抑制性核酸およびｌｎｃＲＮＡはその位置で互いに相補的であるとみなされる。抑制性核酸およびｌｎｃＲＮＡは、塩基を介して互いに水素結合することができるヌクレオチドにより、それぞれの分子の対応する位置が十分な数を占める場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズする」および「相補的」は抑制性核酸とｌｎｃＲＮＡ標的との間で安定した特異的結合が生じるといった、十分な相補性または正確な対合の程度を示すために使用される用語である。例えば、抑制性核酸のある位置の塩基が対応するｌｎｃＲＮＡの位置の塩基と水素結合することができる場合、塩基はその位置で互いに相補的であると考えられる。１００％の相補性は必要としない。
当技術分野において、相補的核酸配列が特異的にハイブリダイズするその標的核酸のものと１００％相補的である必要はないことが理解される。本方法の目的の相補的な核酸配列は、標的ｌｎｃＲＮＡ分子への配列の結合が標的ｌｎｃＲＮＡの正常な機能と干渉し、活性の損失を生じる場合（例えば、ＰＲＣ２関連の抑制が阻害され、その結果、遺伝子発現が上方制御される）に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、非特異的結合の回避が望まれる条件下、例えば、インビボのアッセイまたは治療的処置の場合およびインビトロのアッセイの場合の生理学的条件下、アッセイを適切なストリンジェンシー条件下で行う条件下において、非標的ｌｎｃＲＮＡ配列への配列の非特異的結合を回避するための十分な相補的な程度となる。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ ＮａＣlおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満およびより好ましくは約２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であるだろう。低ストリンジェントのハイブリダイゼーションは、有機溶剤、例えばホルムアミドの非存在下において得ることができ、一方で高ストリンジェントのハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミドおよびより好ましくは約５０％ホルムアミドの存在下において得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃および最も好ましくは少なくとも約４２℃を含むだろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤の濃度、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および担体ＤＮＡの選択または除外などの様々な追加のパラメーターは当業者に公知である。様々なストリンジェントのレベルは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることにより達成される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、３０℃にて７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳにおいて生じる。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、３７℃にて、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において生じる。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、４２℃にて、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいて生じる。これらの条件に有用な変動は当業者に容易に明らかであるだろう。
ほとんどの用途において、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもストリンジェントの程度において異なるだろう。洗浄ストリンジェント条件は、塩濃度によりおよび温度により定義され得る。上記のように、洗浄ストリンジェントの程度は、塩濃度の減少によりまたは温度の上昇により増大させることができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約１５ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも４２℃およびさらにより好ましくは少なくとも約６８℃を含む。好ましい実施形態において、洗浄ステップは、２５℃にて３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで生じる。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、４２℃にて１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで生じる。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、６８℃にて１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで生じる。これらの条件のさらなる変動は、当業者に容易に明らかである。ハイブリダイゼーション技法は、当業者に公知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
一般に、本明細書に記載の方法に有用な抑制性核酸は、標的核酸内の標的領域に少なくとも８０％配列相補性、例えば、ｌｎｃＲＮＡ内の標的領域に９０％、９５％または１００％配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２０ヌクレオ塩基のうち１８は相補的であり、それ故、標的領域に特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表す。標的核酸の領域を有する抑制性核酸の相補性％は、基本的な局所的アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）を使用して日常的に決定することができる（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。ｌｎｃＲＮＡにハイブリダイズする本発明のアンチセンスおよび他の化合物は日常的な実験を介して特定される。一般に、抑制性核酸は、標的の特異性を保持する、すなわち、目的の標的以外の転写物に直接結合せず、またはその発現レベルに直接重要な影響を与えないかのいずれかである必要がある。
対応する標的特異的な機能的生物学的影響を有する標的特異的な効果は、抑制性核酸が多くの非標的ＲＮＡに非特異的な結合を示す場合でも可能である。例えば、ｌｎｃＲＮＡに完全に相補的な短鎖８塩基の長鎖抑制性核酸は、ゲノム中の何百もの配列に対して複数の１００％の一致を有し得るが、それでも、標的特異的な効果、例えばＰＲＣ２活性の阻害を介した特定の標的遺伝子の上方制御を生じ得る。８塩基の抑制性核酸は、高度の特異性およびオフターゲット効果を減少をもってエキソンスキッピングを防止することが報告されている。Singh et al., RNA Biol., 2009; 6(3): 341-350を参照のこと。８塩基の抑制性核酸は、有意なオフターゲット効果無しでｍｉＲＮＡ活性と干渉することが報告されている。Obad et al., Nature Genetics, 2011; 43: 371-378を参照のこと。
抑制性核酸に関するさらなる開示については、米国特許第２０１０／０３１７７１８号（アンチセンスオリゴ）、；米国特許第２０１０／０２４９０５２号（二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ））；米国特許第２００９／０１８１９１４号および米国特許第２０１０／０２３４４５１号（ＬＮＡ分子）；米国特許第２００７／０１９１２９４号（ｓｉＲＮＡ類似体）；米国特許第２００８／０２４９０３９号（修飾ｓｉＲＮＡ）；および国際公開第WO ２０１０／１２９７４６号および国際公開第WO ２０１０／０４０１１２号（抑制性核酸）を参照されたい。
アンチセンス
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に転写、翻訳またはスプライシングのレベルにて、標的に結合し、発現を停止させることにより、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の発現を遮断するよう設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロでｌｎｃＲＮＡにストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするよう設計された相補的核酸配列であり、インビボでＰＲＣ２の活性を阻害することが期待される。従って、標的に十分相補的である、すなわち、十分にハイブリダイズし、十分な生物学的機能的特異性を有して、所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。
ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む修飾塩基
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に使用される抑制性核酸は、１つ以上の修飾結合または塩基を含む。修飾塩基は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、［α］−Ｌ−ＬＮＡを含むロックド核酸分子の一部である。ＬＮＡは、リボ核酸類似体を含み、ここで、リボース環は、２’酸素と４’炭素との間のメチレン架橋、すなわち、少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含有するオリゴヌクレオチド、すなわち、１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチドにより「ロック」されている。ＬＮＡ塩基は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するが、ロックド立体構造は、塩基対反応の速度および安定性を増大させる（Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004)）。ＬＮＡはまた、ＤＮＡと比較するとＲＮＡの塩基対に対する増加した親和性も有する。これらの特性が、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および比較ゲノムハイブリダイゼーションのプローブとして、ｍｉＲＮＡのノックダウンツールとして、およびｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、例えば本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＬＮＡを特に有用なものとする。
修飾塩基／ＬＮＡ分子は、各鎖において１０〜３０、例えば、１２〜２４、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む分子を含むことができ、ここで、鎖の１つがｌｎｃＲＮＡの標的領域に対して実質的に同一、例えば少なくとも８０％（以上、例えば８５％、９０％、９５％または１００％）同一であり、例えば、３、２、１または０個のミスマッチヌクレオチドを有する。修飾塩基／ＬＮＡ分子は当技術分野で公知の方法を使用して化学合成することができる。
修飾塩基／ＬＮＡ分子を当技術分野で知られている任意の方法を使用して設計することができ、多くのアルゴリズムが知られており、市販されている（例えば、インターネットにおいて、例えばｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍにて）。例えば、You et al., Nuc. Acids. Res. 34:e60 (2006); McTigue et al., Biochemistry 43:5388-405 (2004); and Levin et al., Nuc. Acids. Res. 34:e142 (2006)を参照のこと。例えば、アンチセンスオリゴを設計するため使用されるものと類似の「遺伝子歩行」法を使用して、修飾塩基／ＬＮＡ分子の阻害活性を最適化することができ、例えば、標的ｌｎｃＲＮＡの長さにわたる、１０〜３０ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製後、活性を試験することができる。任意で、例えば５〜１０ヌクレオチド以上のギャップをＬＮＡの間に残し、合成および試験のオリゴヌクレオチドの数を減らすことができる。ＧＣ量は、約３０〜６０％が好ましい。修飾塩基／ＬＮＡ分子を設計するための一般的なガイドラインは、当技術分野において公知であり、例えば、ＬＮＡ配列は他のＬＮＡ配列と非常に密接に結合するため、ＬＮＡ分子内で有意な相補性を回避することが好ましい。３つ以上のＧまたはＣあるいは４つ以上のＬＮＡ残基を隣接して行うことは、可能な場合（例えば、非常に短い（例えば約９〜１０ｎｔ）オリゴヌクレオチドでは可能ではない）は回避すべきである。いくつかの実施形態において、ＬＮＡはキシロ−ＬＮＡである。
いくつかの実施形態において、修飾塩基／ＬＮＡ分子を、ｌｎｃＲＮＡの特異的領域を標的とするよう設計することができる。例えば、特異的機能的領域、例えば公知のＲＮＡ局在モチーフを含む領域（すなわち、ｌｎｃＲＮＡが作用する標的核酸と相補的な領域）または既知のタンパク質結合領域を含む領域、例えばポリコーム（例えば、Ｈ３Ｋ２７メチラーゼＥＺＨ２、ＳＵＺ１２およびＥＥＤからなるポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２））あるいはＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴ複合体結合領域（例えばTsai et al., Science. 2010 Aug 6;329(5992):689-93. Epub 2010 Jul 8; and Zhao et al., Science. 2008 Oct 31;322(5902):750-6を参照のこと）を標的とすることができる。Sarma et al., “Locked nucleic acids (LNAs) reveal sequence requirements and kinetics of Xist RNA localization to the X chromosome.” PNAS、印刷前の出版、２０１０年１２月６日, doi:10.1073/pnas.1009785107。あるいは、または、加えて、高度に保存された領域を、例えば霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウス）などの異なる種由来の配列をアラインすることにより特定される領域を標的とすることができ、高度の同一性を有する領域を探索することができる。同一性％を基本的な局所的アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を使用して、例えばデフォルトパラメーターを使用して日常的に決定することができる。
さらなるＬＮＡ分子に関する情報については、米国特許第６２６８４９０号、同第６７３４２９１号、同第６７７０７４８号、同第６７９４４９９号、同第７０３４１３３号、同第７０５３２０７号、同第７０６０８０９号、同第７０８４１２５号および同第７５７２５８２号ならびに米国特許付与前公報第２０１００２６７０１８号、同第２０１００２６１１７５号および同第２０１０００３５９６８号; Koshkin et al. Tetrahedron 54, 3607-3630 (1998); Obika et al. Tetrahedron Lett. 39, 5401-5404 (1998); Jepsen et al., Oligonucleotides 14:130-146 (2004); Kauppinen et al., Drug Disc. Today 2(3):287-290 (2005); and Ponting et al., Cell 136(4):629-641 (2009)およびその中に引用されている参照文献を参照のこと。
関連の態様において、本開示は、速度の速いシス作用で細胞核性長鎖ｎｃＲＮＡを取り除くＬＮＡ分子の能力（例えば、本明細書に記載の２、５、１０秒から６０分までの染色体からのＲＮＡ／ＰＲＣ２の解離）、つまりこれまでに可能ではなかった方法において長鎖ｎｃＲＮＡの機能の修飾および試験を可能にする特性を示す。モデルとして１７ｋｂのＸｉｓt ＲＮＡを使用して、本発明者らは、転写物を特異的に標的とするよう設計されたＬＮＡ分子が、不活性Ｘ染色体からの極めて迅速なＲＮＡの排除を導くことを示した。興味深いことに、ＲＮＡは取り除かれるが、転写物の安定性は影響されなかった。異なるＸｉｓｔ領域を標的化することにより、局在ドメインの特定を可能にし、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）がＸｉｓｔとともに排除させられることを示す。従って、ＰＲＣ２は、クロマチンを最初に標的とすることと、それとの安定した会合の両方においてＲＮＡに依存する。ＲＮＡ再局在の時間経過分析は、ＸｉｓｔおよびＰＲＣ２が同時にＸに沿って拡大するが、２４時間で飽和レベルに達することがないことを示唆し、必要な場合、クロマチンの再プログラムする好機を提供する。
１７ｋｂ ＲＮＡ内の小領域を標的とすることにより、そのような劇的な効果をもたらすことができることは注目に値することである。その迅速な効果は、Ｘｉｓｔ ＲＮＡ‐タンパク質複合体がリピートＣを介して不活性型Ｘ染色体（Ｘｉ）クロマチンに固定され得ることを示唆する。あるいは、リピートＣへのＬＮＡ分子の結合がＲＮＡ構造を変化させ、リモート固定ドメインを干渉する可能性がある。速い動態でＲＮＡ排除が起こる一方、回復期間が延長される。完全なもや状のＸｉｓｔは８時間以内に復元するが、完全なＰＲＣ２の補完物は最大２４時間の間回復されない。Ｘ染色体不活性化（ＸＣＩ）が拡大する間、前記ＲＮＡの合成は律速段階ではなく、むしろ、律速段階はＰＲＣ２などの関連のサイレンシングタンパク質のリクルートであることをこのことは意味する。Ｘｉｓｔの迅速な排除および回復の遅い動態によって、ＰＲＣ２のパターンに対するＸｉｓtの拡大パターンを調査するための絶好の機会が提供された。回復相の間の時間経過分析は、Ｘｉｓt ＲＮＡが最初にＸｉｓｔ遺伝子座付近に最も強く結合するが、同時にＸｉ染色体の残りに拡大することを示す。同様に、ＰＲＣ２は、Ｘ染色体全体を通して同期してリクルートされる。興味深いことに、Ｘｉｓｔの被覆が８時間の時点まで完了せず、ＰＲＣ２の結合が２４時間の時点までピークに達しないので、ＸｉｓｔレベルもＰＲＣ２レベルもすぐには飽和に達しない。まとめると、この分析は、染色体ワイドなサイレンシングの確立が比較的ゆっくりとしている可能性があることを意味する。
本明細書において示されるように、ＬＮＡ分子を、長鎖核ｎｃＲＮＡを操作し、その分析を助けることができる貴重なツールとして使用することができる。ＬＮＡ分子に基づくシステムにより提供される利点は、相対的にコストが低く、送達が容易であり、作用が迅速であることである。他の抑制性核酸がより長鎖時間の後に効果を示し得るが、ＬＮＡ分子は、より迅速であり、例えば、比較的早期の活性の開始、新たなｌｎｃＲＮＡの合成後の回復期間後は完全に可逆的であり、そして、実質的なまたは実質的に完全なＲＮＡ切断またはＲＮＡ分解を引き起こすことなく生じる効果を示す。１つ以上のこれらの設計特性は、本発明の抑制性核酸の所望の特性であり得る。さらに、ＬＮＡ分子は、より長鎖の核転写物内のドメインの系統的な標的を可能とする。ＰＮＡ系システムは早くに記載されていたが、Ｘｉ染色体への効果は、２４時間後にしか現れなかった（１３）。ＬＮＡ技術が長鎖非コードＲＮＡの機能的分析のためのハイスループットスクリーンを可能にし、さらに治療的用途のためインビボでクロマチン状態を操作する新たなツールを提供する。
様々な関連の態様において、本明細書に記載の方法は、例えばインビトロまたはインビボで特異的ｌｎｃＲＮＡの機能をプローブするための検索ツールとしてなど、多くの用途においてｌｎｃＲＮＡを標的とするためＬＮＡ分子を使用することを含む。方法は、１つ以上の所望のＲＮＡを選択すること、ｌｎｃＲＮＡを標的とする１つ以上のＬＮＡ分子を設計すること、設計されたＬＮＡ分子を提供すること、および細胞または動物にＬＮＡ分子を投与することを含む。方法は、場合により、ｌｎｃＲＮＡの領域を選択することおよびｌｎｃＲＮＡのその領域を標的とする１つ以上のＬＮＡ分子を設計することを含むことができる。
異常なインプリント遺伝子の発現は、ＱＴ延長症候群、ベックウィズ‐ヴィーデマン症候群、プラダー・ウィリー症候群およびアンジェルマン症候群ならびに行動障害および発癌などのいくつかの疾患に関与することが示されている（例えば、Falls et al., Am. J. Pathol. 154:635-647 (1999); Lalande, Annu Rev Genet 30:173-195 (1996); Hall Annu Rev Med. 48:35-44 (1997)を参照のこと）。ＬＮＡ分子を作製し、このようなインプリント疾患を処置することができる。一例として、ＱＴ延長症候群は、Ｋｃｎｑ１によりコードされるＫ＋ゲートカルシウムチャンネルにより生じ得る。この遺伝子は、そのアンチセンス対応物である長鎖非コードＲＮＡのＫｃｎｑ１ｏｔ１により制御される（Pandey et al., Mol Cell. 2008 Oct 24;32(2):232-46）。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１が異常に発現するときに疾患が生じる。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１を下方制御するＬＮＡ分子を作製し、それによりＫｃｎｑ１の発現を復元することができる。別の例として、ＬＮＡ分子は、ポリコーム複合体クロマチン修飾因子のｌｎｃＲＮＡ補因子を阻害し、インプリント欠損を反転させることができる。
商業的な観点および臨床的な観点から、約１〜２４時間の時点が、エピジェネティクス的リプログラミングの機会を定義する可能性がある。ＬＮＡ系の利点は、それが素早く作用し、限定された半減期を有し、それ故、ＬＮＡの分解によって可逆的であること、同時に、それが、その間にエピジェネティクス的操作を行うことができる個別の時間枠を提供することである。細胞核性長鎖ｎｃＲＮＡを標的とすることにより、治療目的のためにその下にある座位を変化させるのに十分長い間、調節性ＲＮＡおよび結合タンパク質を一時的に排除することによって培養中または生体内の細胞のクロマチン状態を操作するために、ＬＮＡ分子または類似のポリマー、例えば、キシロ‐ＬＮＡを活用することができる。特に、ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡに特異的に結合し、または相補的であるＬＮＡ分子または類似のポリマーは特定の染色体座位へのＰＲＣ２のリクルートを遺伝子特異的に防ぐことができる。
ＬＮＡ分子はまた、限定されないが、癌、神経障害、感染、炎症および筋強直性ジストロフィーなどの他のヒト疾患を処置するため、インビボで投与され得る。例えば、成長促進性または発癌性長鎖細胞核性ｎｃＲＮＡの生物学的活性を下方制御するためにＬＮＡ分枝を腫瘍細胞に送達し得る（例えば、転移に関連したｌｎｃＲＮＡであり、多くの場合癌において上方制御されるＧｔｌ２またはＭＡＬＡＴ１(Luo et al., Hepatology. 44(4):1012-24 (2006)）。腫瘍抑制因子を下方制御する抑制性ｌｎｃＲＮＡも、再発現を促進するためＬＮＡ分子により標的され得る。例えば、ＩＮＫ４ｂ／ＡＲＦ／ＩＮＫ４ａ腫瘍抑制因子の遺伝子座の発現は、ＰＲＣ１およびＰＲＣ２を含むポリコーム群のタンパク質によって制御され、アンチセンス非コードＲＮＡであるＡＮＲＩＬにより抑制される（Yap et al., Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):662-74）。ＩＮＫ４ｂ／ＡＲＦ／ＩＮＫ４ａ腫瘍抑制因子の再発現を促進するためにＬＮＡ分子よってＡＮＲＩＬが標的とされ得る。いくつかのｌｎｃＲＮＡは、癌遺伝子の陽性調節因子であり得る。このような「活性化ｌｎｃＲＮＡ」が最近説明されている（例えば、Ｊｐｘ (Tian et al., Cell. 143(3):390-403 (2010)およびその他(Orom et al., Cell. 143(1):46-58 (2010)）。それ故、癌遺伝子を下方制御するためこれらの活性化ｌｎｃＲＮＡにＬＮＡ分子を指し向けることができる。また、炎症反応または免疫反応を調節する調節性ｌｎｃＲＮＡを下方制御するため炎症細胞にＬＮＡ分子を送達することもできる（例えば、LincRNA-Cox2, Guttman et al., Nature. 458(7235):223-7. Epub 2009 Feb 1 (2009)を参照のこと）。
さらに他の関連の態様において、（例えば、エピジェネティクス性の変化の結果としての）遺伝子発現の変化に関連した症状の動物モデルまたは細胞モデルを作製するために、本明細書に記載のｌｎｃＲＮＡを標的とするＬＮＡ分子を使用することができる。
例えば、Ｘ染色体の変化が女性生殖器の癌にしばしば認められていることが、約半世紀前に最初に認められた。およそ７０％の乳癌は、不活性型Ｘ染色体（Ｘｉ）の細胞学的特徴である「バール小体」を欠き、代わりに２つ以上の活性型Ｘ染色体（Ｘａ）を保有する。ＸＸＹ男性（クラインフェルター症候群）はＢＲＣＡ１バックグランドで乳癌の危険が２０〜５０倍増加するので、さらなるＸ染色体は男性においても危険因子である。Ｘ染色体はまた、多くの癌遺伝子を保有することが知られている。過剰なＸａは、予後不良に相関し、生殖器癌だけでなく、男女両性の白血病、リンパ腫および生殖細胞腫瘍における最も一般的な細胞学的異常の１つとして存在する。例えば、Liao et al., Cancer Invest 21, 641-58 (2003); Spatz et al., Nat Rev Cancer 4, 617-29 (2004); Barr et al., Proc Can Cancer Conf 2, 3-16 (1957); Borah et al., J Surg Oncol 13, 1-7 (1980); Camargo and Wang, Hum Genet 55, 81-5 (1980); Dutrillaux et al., Int J Cancer 38, 475-9 (1986); Ghosh and ShahCancer Genet Cytogenet 4, 269-74 (1981); Ghosh and Shah, Med Hypotheses 7, 1099-104 (1981); Ghosh et al., Acta Cytol 27, 202-3 (1983); Huang et al., Mol Cancer Ther 1, 769-76 (2002); Kawakami et al., Lancet 363, 40-2 (2004); Kawakami et al., J Urol 169, 1546-52 (2003); Kawakami et al., Oncogene 23, 6163-9 (2004); Moore and Barr, Br J Cancer 9, 246-52 (1955); Moore and Barr, Br J Cancer 11, 384-90 (1957); Moore et al., J Exp Zool 135, 101-25 (1957); Rosen et al., Ann Clin Lab Sci 7, 491-9 (1977); Sirchia et al., Cancer Res 65, 2139-46 (2005); Tavares, Lancet 268, 948-9 (1955); Tavares, Medico (Porto) 12, 97-100 (1961); Tavares, Acta Cytol 6, 90-4 (1962); Wang et al., Cancer Genet Cytogenet 46, 271-80 (1990);およびGanesan et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70, 93-7 (2005)を参照のこと。
小児の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のおよそ６０％も過剰なＸ染色体を示す。慢性好中球性白血病では、Ｘ染色体の増加が唯一の明確な異常である場合もあり、そして、急性転化の進行に関連する（例えば、Heinonen and Mahlamaki, Cancer Genet Cytogenet 87, 123-6 (1996); Heinonen et al., Med Pediatr Oncol 32, 360-5 (1999);およびYamamoto et al., Cancer Genet Cytogenet 134, 84-7 (2002)を参照のこと）。これらの観察は、今のところ、相関的なだけであるが、まとめると、Ｘ染色体が発癌に加担し得ることを示唆する。それ故、Ｘｉｓｔは腫瘍抑制因子であり得る。雌雄マウスの特定の系列でＸｉｓｔを削除後に得た予備データにより、Ｂ細胞増殖の増加がマウスのサブセットで起こる（対照では起こらない、ｎ＝９）ことが示されている。理論に束縛されることを望まないが、１つの考えられる機序として、細胞でのＸｉｓｔの欠如がＸ染色体の再活性化またはＸａ染色体の二倍化につながり、細胞内にＸａＸａ状態が生じる。結果として生じるＸ染色体上の癌遺伝子の発現の増加が前癌状態およびさらなるエピジェネティクス性／遺伝的変化の蓄積（例えば、後に癌になる、ゲノムワイドな変化）を誘発する。従って、Ｘｉｓｔは腫瘍抑制因子であり得る。
細胞または組織でおよび発生的に特異的な方法でＸＩＳＴを除去するためにＸＩＳＴ−ＬＮＡ、例えば本明細書に記載のＸＩＳＴ ＬＮＡを使用することにより、特定の癌（例えば、当技術分野で公知であり、Ｘ染色体の変化に関連している上記の癌）の動物モデルを作製することができる。
本明細書に記載の方法はまた、例えば、上記のような異常なインプリント遺伝子の発現と関連する他の症状の動物モデルまたは細胞モデルの作製に有用であり得る。
様々な関連の態様において、本明細書に記載の結果は、例えば、生体外でクロマチン状態をリプログラミングするために一時的にクロマチンを破壊するため、長鎖ｎｃＲＮＡを標的とするＬＮＡ分子の利用を実証している。ＬＮＡ分子は数時間安定してＲＮＡを排除し、クロマチンはその後、数時間再構築されないため、ＬＮＡ分子は、例えば、幹細胞治療の前のｈｉＰＳおよびｈＥＳＣのリプログラミングのため、生体外で特定の座位のエピジェネティクス性状態を操作する絶好の機会をつくる。例えば、Ｇｔｌ２は、ＤＬＫ１の発現を制御し、これはｉＰＳ細胞の多能性を調節する。低Ｇｔｌ２および高ＤＬＫ１は、ヒトｉＰＳ細胞の多能性および安定性の増加と相関している。従って、Ｇｔｌ２を標的とするＬＮＡ分子を使用して、ｉＰＳ細胞の分化を阻害し、多能性および安定性を増加させることができる。
全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６１／４１２８６２号も参照のこと。
アンタゴｍｉＲ
いくつかの実施形態において、抑制性核酸はアンタゴｍｉＲである。アンタゴｍｉＲは、ｌｎｃＲＮＡを標的とすることができる化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、本明細書に記載の方法で使用するアンタゴｍｉＲは約１２〜２５ヌクレオチド、好ましくは約１５〜２３ヌクレオチドのｌｎｃＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするのに充分相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉＲは、例えば３’末端にコレステロール部分を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉＲは、リボヌクレアーゼ保護ならびに組織取込および細胞取込の向上などの薬理学的特性のために様々な修飾を有する。例えば、上記のアンチセンスオリゴの修飾に加え、アンタゴｍｉＲは、糖および／またはホスホロチオエート骨格の１つ以上の完全または部分２’−Ｏ−メチル化を有することができる。ホスホロチオエート修飾は、リボヌクレアーゼまたは他のヌクレアーゼ活性に対する保護を提供し、その親油性は組織の取り込み強化に寄与する。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉＲは６つのホスホロチオエート骨格修飾を含むことができ、２つのホスホロチオエートは５’末端に位置し、４つは３’末端に位置するが、ホスホロチオエート修飾の他のパターンも通常使用され、有効である。例えば、Krutzfeldt et al., Nature 438, 685-689 (2005); Czech, N Engl J Med 2006; 354:1194-1195 (2006); Robertson et al., Silence. 1:10 (2010); Marquez and McCaffrey, Hum Gene Ther. 19(1):27-38 (2008); van Rooij et al., Circ Res. 103(9):919-928 (2008);およびLiu et al., Int. J. Mol. Sci. 9:978-999 (2008)を参照のこと。Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄら（２００５）は、「アンタゴｍｉＲ」と名付けた化学操作したオリゴヌクレオチドについて記載し、これは、マウスの内在性ｍｉＲＮＡの効率のよい特定のサイレンサーであることが報告されている。
一般に、アンタゴｍｉＲの設計は、分子内に存在する修飾された糖に起因して、標的ＲＮＡの分解を回避する。未修飾の糖の連続したストリングの存在によりリボヌクレアーゼＨリクルートおよび酵素活性が支持される。従って、典型的に、アンタゴｍｉＲの設計は、末端に修飾糖（例えば、ＬＮＡ）を含有し、または天然のリボースまたはデオキシリボースヌクレオ塩基を散在させる塩基を含む。
本発明に有用なアンタゴｍｉＲを、アンタゴｍｉＲを作製するヌクレオチドの長さまたは数において修飾することもできる。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉＲは、標的に特異性を保持する必要があり、すなわち、目的の標的以外の転写物に直接結合してはならず、またはその発現レベルに直接重要な影響を及ぼしてはならない。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉＲは、顕著な望ましくない生物学的効果を生成しない非特異的結合を示し得、例えば、アンタゴｍｉＲは、非標的転写物の発現レベルもしくは制御タンパク質または制御ＲＮＡとの関連に影響しない。
ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ｌｎｃＲＮＡに相補的である抑制性核酸配列は低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）または低分子ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）を含むがそれらに限定されない干渉ＲＮＡであることができる。干渉ＲＮＡを構築する方法は、当技術分野において周知である。例えば、干渉ＲＮＡは、２つの個別のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、一方の鎖がセンス鎖であり、もう一方アンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は自己相補性であり（すなわち、各鎖が一方の鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、その結果、アンチセンス鎖およびセンス鎖は二重または二本鎖構造を形成する）、アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉ＲＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、自己相補的であるセンスおよびアンチセンス領域は、核酸系または非核酸系リンカーを用いて結合される。干渉ＲＮＡは二重、非対称二重、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであることができ、自己相補的であるセンスおよびアンチセンス領域を有することができ、この場合、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。干渉は、２つ以上ループ構造を有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよく、自己相補的であるセンスおよびアンチセンス領域を含む幹細胞であってよく、この場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロのいずれかで処理され、ＲＮＡ干渉を介在することができる活性ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡをコードする領域は、センス領域、アンチセンス領域およびループ領域を有する自己相補的ＲＮＡ分子をコードする。そのようなＲＮＡ分子は、望んだように発現すると「ヘアピン」構造を形成し、そして、本明細書において「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。ループ領域は一般に、約２〜約１０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ループ領域は約６〜約９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス領域およびアンチセンス領域は、約１５〜約２０ヌクレオチドの長さである。転写後プロセッシングの後、リボヌクレアーゼＩＩＩファミリーのメンバーである酵素Ｄｉｃｅｒが介在する切断事象によって、低分子ヘアピンＲＮＡがｓｉＲＮＡに変換される。ｓｉＲＮＡはそこで、相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することができる。詳細は、Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002); Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002); Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002); Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002); Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002); Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002)を参照のこと。
ｓｉＲＮＡにより誘導された標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的核酸の一部と同一のヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡは阻害に好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との間の１００％配列同一性は、本発明の実施に必要とされない。したがって、本発明は、遺伝突然変異、株間多型または進化的多様化により予期され得る配列多様性を許容することができるという利点を有する。例えば、標的配列に対して挿入、削除および単一点突然変異を有するｓｉＲＮＡも、阻害に有効であることがわかっている。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列が阻害に有効であり得る。一般に、ｓｉＲＮＡは標的に対する特異性を保持する必要があり、すなわち、目的の標的以外の転写物に直接結合してはならず、またはその発現レベルに直接重要な影響を与えてはならない。
リボザイム
いくつかの実施形態において、抑制性核酸はリボザイムである。トランス切断酵素性核酸分子も使用することができ、ヒト疾患の治療剤として効果が期待されている（Usman & McSwiggen, 1995 Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen and Marr, 1995 J. Med. Chem. 38, 2023-2037）。細胞性ＲＮＡのバックグラウンド内で特異的ｌｎｃＲＮＡ標的を切断するように、酵素性核酸分子を設計することができる。このような切断事象がｌｎｃＲＮＡを機能できないものとする。
一般に、ＲＮＡ切断活性を有する酵素性核酸は、最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するよう作用する分子の酵素部分に近接して保持される酵素性核酸の標的結合部分を介して起きる。従って、酵素性核酸は相補的塩基対合を介して標的ＲＮＡを最初に認識し、次いでそれに結合し、正確な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、そのコードされるタンパク質の合成を指揮する能力を破壊する。酵素性核酸は、そのＲＮＡ標的に結合してそれを切断した後、そのＲＮＡから放出され、別の標的を探索し、新たな標的に繰り返し結合し、切断することができる。
インビトロ選択（進化）方法などのいくつかの手法（Orgel, 1979, Proc. R. Soc. London, B 205, 435）を使用して、ホスホジエステル結合およびアミド結合の切断およびライゲーションなどの様々な反応を触媒することができる新たな核酸触媒を進化させている（Joyce, 1989, Gene, 82, 83-87; Beaudry et al., 1992, Science 257, 635-641; Joyce, 1992, Scientific American 267, 90-97; Breaker et al, 1994, TIBTECH 12, 268; Bartel et al, 1993, Science 261 :1411-1418; Szostak, 1993, TIBS 17, 89-93; Kumar et al, 1995, FASEB J., 9, 1183; Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech., 1, 442）。触媒活性に最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現を制御するためにＲＮＡ−切断リボザイムを使用する任意の方法に非常に寄与している。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムは、飽和（１０ＭＭ）濃度のＭｇ２＋補因子の存在下において約１／分の触媒速度（ｋｃａｔ）で機能する。人工的な「ＲＮＡリガーゼ」リボザイムは、約１００／分の速度で対応する自己修飾反応を触媒することが示されている。さらに、ＤＮＡで作られた基質結合腕を有する特定の改変型ハンマーヘッドリボザイムは、１００／分に近い多数の回転率でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。
抑制性核酸の作製および使用
本明細書に記載の方法を実施するために使用される核酸配列は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそのハイブリッドであろうとなかろうと、様々な供給源から単離され、遺伝的に操作され、増幅され、および／または組換え技術により発現／生成されることができる。所望により、本発明の核酸配列を送達ベクターに挿入し、そのベクター内の転写単位から発現させることができる。組換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであることができる。ベクターコンストラクトの作製は、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. (1997)) and “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)に記載されているように、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製およびＤＮＡシークエンシングの標準的技法を含むがそれらに限定されない当技術分野で周知の任意の適切な遺伝的操作技法を使用して達成されることができる。
好ましくは、本発明の抑制性核酸は化学的に合成される。本発明を実施するために使用される核酸配列を、例えばAdams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859;米国特許第４４５８０６６号；国際公開第ＷＯ／２００８／０４３７５３号および国際公開第ＷＯ／２００８／０４９０８５号ならびにその中に引用されている参照文献に記載の公知の化学合成技法によりインビトロで合成することができる。
本発明の核酸配列を、ヌクレオチド修飾などの修飾の組み込みなどにより核酸分解に対して安定化させることができる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’または３’末端で少なくとも一次、二次または三次ヌクレオチド間結合でホスホチオエートを含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含むことができる。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含むことができ、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド全てが２’−Ｏ−メチル−修飾を含む。いくつかの実施形態において、核酸は「ロック」され、すなわち、リボース環が２’−Ｏ原子および４’−C原子を結合するメチレン架橋により「ロック」されている核酸類似体を含む（例えば、Kaupinnen et al., Drug Disc. Today 2(3):287-290 (2005); Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 120(50):13252-13253 (1998)を参照のこと）。さらなる修飾について、米国特許第２０１００００４３２０号、米国特許第２００９０２９８９１６号および米国特許第２００９０１４３３２６号を参照のこと。
本明細書に記載の修飾化学物質または抑制性核酸の形式のいずれをも互いに組み合わせ、１、２、３、４、５、またはそれ以上の異なる種類の修飾を同じ分子内に含むことができる。
本発明を実施するために使用される核酸の操作方法、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用して標識するランダムプライマー）、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどは、科学および特許文献に十分記載されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual 3d ed. (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (John Wiley & Sons, Inc., New York 2010); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照のこと。
医薬組成物
本明細書に記載の方法は、ｌｎｃＲＮＡを標的とするよう設計された抑制性核酸配列を含む医薬組成物および製剤の投与を含むことができる。
いくつかの実施形態において、組成物を薬学的に許容される担体と共に製剤される。医薬組成物および製剤を、腸管外、局所、経口または局所投与、例えば、エアロゾルまたは経皮により投与することができる。医薬組成物を任意の方法で製剤することができ、症状または疾患および病気の程度、各患者の一般的医学状態、得られた好ましい投与方法などに応じて、様々な単位剤形で投与することができる。医薬の製剤および投与の技法の詳細は、科学文献および特許文献にかなり記載されており、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照のこと。
抑制性核酸を単独または医薬製剤（組成物）の成分として投与することができる。ヒトまたは家畜用医薬品に使用するための任意の簡便な方法での投与のために化合物を製剤することができる。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムならびに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香料および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤も組成物に含むことができる。
本発明の組成物の製剤には、皮内、吸入、経口／鼻腔、局所、腸管外、直腸および／または膣内投与に適切なものが含まれる。製剤は単位剤形の形態で簡便に提供されてよく、そして、薬学分野において公知の任意の方法により調製されることができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分（例えば、本発明の核酸配列）の量は、処置される宿主、皮内投与または吸入などの特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、抗原特異的Ｔ細胞反応または体液性応答などの治療効果をもたらす化合物の量である。
医薬品の製造分野で公知の任意の方法に従って、本発明の医薬製剤を調製することができる。このような薬剤は甘味剤、香料、着色剤および防腐剤を含有することができる。製剤を、製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。製剤は、１つ以上の希釈剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤などを含むことができ、液体、粉末、乳液、凍結粉末、スプレー、クリーム、ローション、除放性製剤、錠剤、ピル、ゲル、パッチ、インプラントなどの形態で提供され得る。
当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して適当および適切な用量で経口投与のための医薬製剤を製剤することができる。このような担体が、、患者の摂取に適した、錠剤、ピル、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、トローチ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などのような単位剤形に医薬品が製剤されることを可能にする。所望により、適切なその他の化合物を添加した後に、場合により、結果生じる混合物を粉砕し、そして、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣丸のコアを得て、経口使用のための医薬製剤を固体賦形剤として製剤することができる。適切な固体賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロースおよびアラビアガムおよびトラガカントガムなどのガムならびに例えばゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質を含む。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加することができる。押し出し型カプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および任意で安定化剤と混合した活性薬剤を含有することができる。軟性カプセルにおいて、活性薬剤を適切な液体、例えば、脂肪油、液状パラフィンまたはポリエチレングリコール液に、安定化剤を含み、または含まずに溶解または懸濁させることができる。
水性懸濁液は、例えば、水性皮内注射用の水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して活性剤（例えば、本発明の核酸配列）を含有することができる。このような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアガムなどの懸濁剤、および天然のホスファチド（例えば、レクチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散剤または湿潤剤を含む。水性懸濁液は、１つ以上の防腐剤、例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料および１つ以上の甘味剤、例えば、スクロース、アスパルテームまたはサッカリンも含有することができる。製剤をモル浸透圧濃度について調節することができる。
いくつかの実施形態において、油系医薬品を本発明の核酸配列の投与のために使用する。落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油または液状パラフィンなどの鉱物油あるいはそれらの混合物に活性剤を懸濁させることにより油系懸濁液を製剤することができる。例えば、経口投与された疎水性医薬化合物のバイオアベラビリティを向上させ、個体間および個体内の多様性を減少させるために精油または精油成分を使用することが記載されている米国特許第５７１６９２８号を参照のこと（さらに米国特許第５８５８４０１号を参照のこと）。油懸濁液は、ミツロウ、硬性パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤を添加し、飲みやすい経口製剤を提供することができる。これらの製剤を、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することにより保存することができる。注射可能な油ベヒクルの例として、Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102を参照のこと。
医薬製剤は、水中油型乳液の形態であってもよい。油相は、上記の植物油または鉱物油あるいはこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、天然由来のガム、例えばアカシアガムおよびトラガカントガム、天然由来のホスファチド、例えば大豆レクチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエートおよびこれらの部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む。乳液はまた、シロップおよびエリキシル剤の製剤などで、甘味剤および香料を含有することができる。このような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤または着色剤を含有することができる。代替の実施形態において、本発明のこれらの注射可能な水中油型乳液は、パラフィン油、ソルビタンモノオレエート、エトキシレート化ソルビタンモノオレエートおよび／またはエトキシレート化ソルビタントリオレエートを含む。
医薬化合物はまた、座剤、吹送、粉末およびエアロゾル製剤を含む鼻腔内、眼内および膣内経路により投与することができる。（例えば、ステロイド吸入剤の例として、Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111を参照のこと）。座剤製剤を、薬剤を、通常の温度では固体であるが、体温では液状となるため、体内で溶融してその薬剤を放出する、適切な非刺激賦形剤と混合することにより調製することができる。このような材料はココアバターおよびポリエチレングリコールである。
いくつかの実施形態において、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、乳液、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料、粉末およびエアロゾルとして製剤された医薬化合物を、局所経路により経皮送達することができる。
いくつかの実施形態において、医薬化合物は体内に徐放のためのミクロスフィアとして送達することもできる。例えば、ミクロスフィアを皮下にゆっくり放出する薬剤の皮内注射を介して投与することができ、Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645を参照し、生分解性および注射可能なゲル製剤として、例えばGao (1995) Pharm. Res. 12:857-863 (1995)を参照し、または経口投与のためのミクロスフィアとして例えばEyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674を参照のこと。
いくつかの実施形態において、医薬化合物は、例えば静脈内（ＩＶ）投与または体腔または器官の内腔への投与により腸管外投与することができる。これらの製剤は、薬学的に許容される担体に溶解した活性剤の溶液を含むことができる。使用されることができる許容されるベヒクルおよび溶剤は、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムである。さらに、滅菌不揮発性油を溶剤または懸濁媒体として使用することができる。この目的のため、任意の無刺激不揮発性油を合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めて使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、同様に注射液の製剤に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質は含有していない。これらの製剤は、従来の既知の滅菌技法により滅菌され得る。製剤は、適切な生理学的条件に必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。これらの製剤の活性剤の濃度は広範囲に変化し得、おもに、選択された特定の投与様式および患者の必要性に従い、液量、粘度、体重などに基づき選択されるだろう。ＩＶ投与のために、製剤は、滅菌注射製剤、例えば滅菌注射水溶液または油性懸濁液であってよい。この懸濁液を、これらの適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して製剤することができる。滅菌注射製剤は非毒性の腸管外に許容される希釈剤または溶剤の懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。投与は、ボーラスまたは連続注入によりなされ得る（例えば、特定の期間、血管に実質的に中断せずに導入）。
いくつかの実施形態において、医薬化合物および製剤を凍結乾燥させることができる。抑制性核酸を含む安定した凍結乾燥製剤を、本発明の製剤および増量剤、例えばマンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびスクロースまたはその混合物を含む溶液を凍結乾燥させることにより作製することができる。安定した凍結乾燥製剤を調製するための方法は、約２．５ｍｇ／ｍＬタンパク質、約１５ｍｇ／ｍＬスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌおよび５．５以上であるが６．５未満のｐＨを有するクエン酸ナトリウム緩衝剤の溶液を凍結乾燥することを含む。例えば、米国特許第２００４００２８６７０号を参照のこと。
組成物および製剤を、リポソームを使用することにより送達することができる。リポソームを使用することにより、特に、リポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを担持し、またはそうでなければ、好ましくは特定の器官に指向される場合、インビボで標的細胞に活性剤の送達に焦点をあてることができる。例えば、米国特許第６０６３４００号、同第６００７８３９号; Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13:293-306; Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587を参照のこと。本発明で使用される用語「リポソーム」は２層または複数の２層に配置された両親媒性脂質からなるベシクルを意味する。リポソームは、親油性材料および送達される組成物を含有する水性の内部から形成される膜を有する単層または多層ベシクルである。陽イオン性リポソームは、正に荷電されたリポソームであり、負に荷電されたＤＮＡ分子と相互作用し、安定した複合体を形成すると考えられる。ｐＨ感受性であり、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉すると考えられる。陽イオン性および非陽イオン性リポソームは両方とも、ＤＮＡを細胞に送達するために使用されている。
リポソームはまた、「立体的に安定した」リポソーム、すなわち、１つ以上の特別な脂質を含むリポソームを含むことができる。リポソームに組み込まれる場合、これらの特別な脂質は、そのような特別な脂質が欠如しているリポソームに比して強化された循環寿命を有するリポソームを生じる。立体的に安定したリポソームの例として、リポソームのベヒクル形成脂質部分の一部が１つ以上の糖脂質を含み、または１つ以上の親水性のポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されるものである。リポソームおよびその使用はさらに米国特許第６２８７８６０号に記載されている。
本発明の製剤を予防および／または治療処置のために投与することができる。いくつかの実施形態において、治療用途のため、組成物を、トリグリセリド濃度を低下させる必要があるか、または本明細書に記載の障害の危険があり、または本明細書に記載の障害を有する対象に、治療有効量と呼ばれ得る、障害またはその合併症の臨床徴候を治癒、軽減または部分的に停止するために十分な量で投与する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物を対象のトリグリセリドの血清濃度を低下させるために十分な量で投与する。
これを達成するために十分な医薬組成物の量は、治療有効用量である。この使用に有効な投与計画および量、すなわち、投与方法は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重症度、患者の健康の一般状態、患者の身体状態、年齢などを含む様々な因子に依存するだろう。患者の投与方法を算出する際、投与様式も考慮される。
投与計画は、当技術分野で周知の薬物動態パラメーター、すなわち、活性剤の吸収速度、バイオアベラビリティ、代謝、クリアランスなども考慮する（例えば、Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617; Groning (1996) Pharmazie 51:337-341; Fotherby (1996) Contraception 54:59-69; Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144-1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照のこと）。最新技術は、臨床医が各個人の患者の投与方法、処置される活性剤および疾患または状態を決定することを可能にする。医薬品として使用される類似の組成物のために提供されるガイドラインをガイダンスとして使用し、投与計画、すなわち、本発明の方法を実施するために投与される投与の予定および用量レベルが正確かつ適切であることを決定することができる。
製剤の単回または複数回投与は、例えば、患者により必要とされ、忍容される用量および頻度、各投与後に生成される治療効果の程度および量（例えば、腫瘍の大きさまたは増殖）などに応じてなされ得る。製剤は、状態、疾患または症状を有効に処置、予防または軽減するために十分な量の活性剤を提供すべきである。
代替の実施形態において、経口投与のための医薬製剤は、１日量が約１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日またはそれ以上である。経口投与とは対照的に、低用量を血流に、体腔に、または器官の内腔に注入して使用することができる。大幅に高用量を、局所または経口投与あるいは粉末、噴霧または吸入により投与する場合に使用することができる。腸管外または非腸管外投与可能な製剤を調製する実際の方法は、当業者によく知られており、または明らかであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005などの刊行物により詳細に記載されている。
様々な試験は、相補的核酸配列を使用する成功した哺乳類動物の投与について報告している。例えば、Esau C., et al., (2006) Cell Metabolism, 3(2):87-98は４週間、週２回１２．５〜７５ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−１２２アンチセンスオリゴヌクレオチドの腹腔内投与を用いた正常なマウスの投与について報告した。マウスは、処置の終わりに健常および正常に見え、体重の減少または食餌摂取の低下はなかった。血漿トランスアミナーゼ濃度は、ｍｉＲ−１２２ＡＳＯの７５ｍｇ／ｋｇ用量を除いて全ての用量で正常範囲（ＡＳＴ３／４４５、ＡＬＴ３／４３５）であり、ＡＬＴおよびＡＳＴ濃度の非常に軽度の増加が示された。５０ｍｇ／ｋｇが効果的、非毒性用量である結果となった。Kruetzfeldt J., et al., (2005) Nature 438, 685-689による別の試験は、総用量８０、１６０または２４０ｍｇ／体重ｋｇを使用してマウスのｍｉＲ−１２２をサイレンシングするためアンタゴｍｉＲを注入した。最も高い用量でｍｉＲ−１２２シグナルが完全に消失した。さらに別の試験において、ｍｉＲ−１２２をサイレンシングするため霊長類にロックド核酸分子（「ＬＮＡ分子」）を適用することに成功した。Elmen J., et al., (2008) Nature 452, 896-899は、ｍｉＲ−１２２の効果的なサイレンシングが霊長類で１０ｍｇ／ｋｇＬＮＡアンチｍｉＲの３回の投与により達成され、試験動物においてＬＮＡ関連毒性または組織病理学的変化についてのいかなる徴候もなく、総血漿中コレステロールの持続的および可逆的減少を生じることを報告している。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、他の薬剤または医薬品、例えばコレステロールホメオスタシスを提供するための組成物と共投与することを含むことができる。例えば、抑制性核酸は本明細書に記載の障害の処置または危険を減少させるための薬剤と共投与することができる。
以下の実施例において本発明がさらに説明されるが、それらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
材料と方法
次の材料と方法が以下に示される実施例１〜７において用いられた。
ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング
１０７個の野生型１６．７ＥＳ細胞(Lee and Lu, 1999)およびＥｚｈ２−／−ＥＳ細胞(Shen et al., 2008)を使用してＲＮＡ免疫沈降(Zhao et al., 2008) を行った。ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングライブラリーを構築するために、細胞核を単離し、核溶解液を調製し、４００Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅで処理し、そして、抗Ｅｚｈ２抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）または対照ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。プロテインＡアガロースビーズを使用してＲＮＡ‐タンパク質複合体を免疫沈降し、そして、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。鎖の情報を保護するために、ライブラリーの構築のためにテンプレート・スイッチングを用いた(Cloonan et al., 2008)。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるファーストストランドｃＤＮＡ合成のために２０〜１５０ｎｇのＲＮＡとアダプター１（５’‐ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮ‐３’；配列番号１９３０５０）を使用した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩは、非鋳型ＣＣＣ３’オーバーハングを付加するが、それらはアダプター２‐ＧＧＧテンプレート・スイッチプライマー（５’‐ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧ‐３’；配列番号１９３０５１）にハイブリダイズするために使用された。ファーストストランドｃＤＮＡ合成では、試料はアダプター１と２０℃で１０分間、続いて３７℃で１０分間、そして、４２℃で４５分間インキュベートされた。次に、変性されたテンプレート・スイッチプライマーが添加され、そして、各チューブを４２℃で３０分間、続いて７５℃で１５分間インキュベートした。生じたｃＤＮＡをフォワードイルミナプライマー（５’‐ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ‐３’；配列番号１９３０５２）およびリバースイルミナプライマー（５’‐ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ‐３’；配列番号１９３０５３）により増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）によりＰＣＲを次のように行った：９８℃で３０秒、［９８℃で１０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒］を２０〜２４サイクル、そして、７２°Ｃで５分間。サイズ選別のために３％のＮｕＳｉｅｖｅゲルにＰＣＲ産物を負荷し、そして、２００〜１，２００ｂｐの産物を切り取り、ＱＩＡＥＸ ＩＩアガロースゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。逆転写無しの試料は全般的に産物を生じなかった。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによりＤＮＡの濃度を定量した。マサチューセッツ総合病院（ＭＧＨ）の分子生物学部門のシークエンシング・コア施設がイルミナＧＡＩＩで５〜１０ｍｌの２〜２０ｎＭのｃＤＮＡ試料をシークエンシングした。
バイオインフォマティクス解析
完全なＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングのデータセットはＧＥＯを介してシリーズＧＳＥ１７０６４によりアクセス可能である。後述の場合を除き、自作のＣ＋＋プログラムを使用して全ての解析を行った。イルミナパイプラインを使用して画像処理とベースコーリングを実行した。クロスマッチにより３’アダプター配列を検出し、そして、５塩基以上のマッチを整え、ホモポリマーリードが選別され、そして、ミトコンドリアゲノムおよびリボソーマルＲＮＡにマッチするリードがその後の解析全てから排除された。次に、ｓｈｏｒｔＱｕｅｒｙＬｏｏｋｕｐ (Batzoglou et al., 2002)を使用して残りの配列がｍｍ９マウス基準ゲノムにアラインされた。１以下の誤差を有するアラインメントが保持された。ライブラリー構築とシークエンシングによってＰＲＣ２結合ＲＮＡの逆鎖から配列が作成されるので、さらなる解析全てにおいて、我々は各リードを、それが逆相補されたかのように扱った。オリジナルの抗Ｅｚｈ２ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングライブラリーをその技術的反復物および生物学的反復物と、ならびにまたＥｚｈ２−／−対照細胞株のＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングと比較する相関係数を決定ために、我々は２つの試料の間での遺伝子当たりのリード数を比較し、そして、各ペアについては、我々は、各ｒｅｆＧｅｎｅにマップされたリード数の間のピアソン相関を計算した。すなわち、各試料について、我々は、各ｒｅｆＧｅｎｅにマップされたリードのカウントについてのベクトルを作成し、そして、全てのペアのベクトル間でピアソン相関を計算した。
ｍｍ９（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）における反復配列の位置をＵＣＳＣゲノムブラウザデータベース(Kent et al., The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006; Fujita et al., “The UCSC Genome Browser database: update 2011.” Nucleic Acids Res. 2010 Oct 18) から得た。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータの座標をリードアラインメントの座標とインターセクトすることによりＰＲＣ２トランスクリプトームリードのこれらのリピートとのオーバーラップを得た。ＵＣＳＣトランスクリプトームは全般的な参照物として使用された(hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/transcriptome.txt.gz においてオンラインにより入手可能）。非重複的な別個の転写領域のセットを得るために、我々はスタート座標によりＵＣＳＣトランスクリプトーム転写物をソーティングし、そして、同鎖上のオーバーラップする転写物をマージした（連結型ＵＣＳＣトランスクリプトーム：総計３９，００３転写物）。次に、ＰＲＣ２トランスクリプトーム中に存在するＵＣＳＣ転写物の数を決定するために我々はリードアラインメント座標をマージされたＵＣＳＣ転写物の座標とインターセクトした。転写物へのヒットはＲＰＫＭ単位に変換されたが、その場合、リードカウントは１／（ｎ×Ｋ×Ｍ）であり、ｎはゲノム中のアラインメントの数、Ｋは１，０００で除算した転写物の長さ、そして、Ｍは１，０００，０００で除算したｍｍ９に対応するリードのみを含むシークエンシングの深度である(Mortazavi et al., 2008)。この正規化は様々な長さの転写物の間の比較、および様々なシークエンシングの深度の試料間の比較を考慮している。プロモーターマップを作成するために、プロモーター領域は（ｒｅｆＧｅｎｅカタログ、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得た）ＴＳＳに対して−１０，０００〜＋２０００塩基と定義された。１０アラインメントという制限を緩和したことを例外として、我々はプロモーター領域とオーバーラップするリードカウントをプロットした。図１Ｈと図７〜１２の染色体のアラインメントについて、リード数は各染色体上の非重複的で連続的な１００ｋｂのウインドウ全てについて計算された。ｎ箇所に対応するリードが各位置でｎ分の１リードとして数えられるようにリードを正規化した。Ｒで記述した自作のスクリプトを使用してグラフをプロットした。表３〜７を作成するために、ＷＴ試料とＥｚｈ２−／−試料での全ての転写物についての各鎖でのＲＰＫＭスコアを比較することにより濃縮された全ての転写物のリストが見いだされた。次に、それらの座標を対象の特徴の座標とインターセクトした。ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９マウスアッセンブリーに無い特徴の座標がＵＣＳＣのＬｉｆｔＯｖｅｒユーティリティーを用いてそれらの座標に変換された（ｌｉｆｔＯｖｅｒユーティリティーは効果的に１つのゲノムを別のゲノムにマップし、同じ種の歴代のアッセンブリー間での、または２つの別個の種の間での対象の領域の急速な同定を可能にする。genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOverにおいてオンラインにより入手可能）。座標が変換可能であった特徴のみが示されている。
ＲＮＡ免疫沈降／ｑＲＴ‐ＰＣＲ
説明されているように(Zhao et al., 2008)、５μｌのウサギ抗マウスＥｚｈ２抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）または通常のウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して妥当性確認用のＲＮＡ免疫沈降を実行した。ＲＮＡ免疫沈降に続いてＩＣＹＣＬＥＲ ＩＱ（商標）リアルタイム検出システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いる定量的ストランド特異的ＲＴ‐ＰＣＲを行った。遺伝子特異的ＰＣＲプライマーペアは以下の通りである：
Malat-1:フォワードプライマー 5’-GCCTTTTGTCACCTCACT-3’；配列番号１９３０５４
リバースプライマー 5’-CAAACTCACTGCAAGGTCTC-3’；配列番号１９３０５５
Malat1-as:フォワードプライマー 5’-TACTGGGTCTGGATTCTCTG-3’；配列番号１９３０５６
リバースプライマー 5’-CAGTTCCGTGGTCTTTAGTG-3’；配列番号１９３０５７
Foxn2-as:フォワードプライマー 5’-GGCTATGCTCATGCTGTAAC；配列番号１９３０５８
リバースプライマー 5’-GTTACTGGCATCTTTCTCACA-3’；配列番号１９３０５９
Ly6e-as:フォワードプライマー 5’-CCACACCGAGATTGAGATTG-3’；配列番号１９３０６０
リバースプライマー 5’-GCCAGGAGAAAGACCATTAC-3’；配列番号１９３０６１
Bgn-as:フォワードプライマー 5’-TGTGAACCCTTTCCTGGA-3’；配列番号１９３０６２
リバースプライマー 5’-CTTCACAGGTCTCTAGCCA-3’；配列番号１９３０６３
Gtl2:フォワードプライマー 5’- CGAGGACTTCACGCACAAC -3’；配列番号１９３０６４
リバースプライマー 5’- TTACAGTTGGAGGGTCCTGG -3’；配列番号１９３０６５
Gtl2-as:フォワードプライマー 5’-CACCCTGAACATCCAACA-3’；配列番号１９３０６６
リバースプライマー 5’-CATCTGCTTTTCCTACCTGG-3’ ；配列番号１９３０６７
Hapa1-upstream:フォワードプライマー 5’-GGTCCAAAATCGGCAGT-3’；配列番号１９３０６８
リバースプライマー 5’-GTCCTCAAATCCCTACCAGA-3’；配列番号１９３０６９
Htr6-downstream:フォワードプライマー 5’-ACACGGTCGTGAAGCTAGGTA-3’；配列番号１９３０７０
リバースプライマー 5’-CAGTTGGAGTAGGCCATTCCC-3’；配列番号１９３０７１
Nespas/TR019501:フォワードプライマー 5’-AGATGAGTCCAGGTGCTT-3’；配列番号１９３０７２
リバースプライマー 5’-CAAGTCCAGAGTAGCCAAC-3’；配列番号１９３０７３
Ｘｉｓｔ‐Ｆｏｒｗａｒｄ３Ｆ５プライマーとＸｉｓｔ‐Ｒｅｖｅｒｓｅ２Ｒプライマーは説明されている(Zhao et al., 2008)。ストランド特異的ｃＤＮＡ合成については、リバースプライマーが使用され、ＳＹＢＲグリーン（ＢｉｏＲａｄ）を用いてｑＰＣＲが行われ、そして、閾値交点（Ｃｔ）が記録された。各値はインプットＲＮＡレベルに対して正規化された。
ノーザンブロット分析
５μｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡを１６．７ＥＳ細胞から単離し、ホルムアルデヒド含有０．８％アガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ‐ＸＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブロットし、そして、Ｕｌｔｒａｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して４２℃でプローブにハイブリダイズした。ＳＴＲＩＰ‐ＥＺ ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してプローブを作製したが、それらは
Malat1-AS-F、5’-TGGGCTATTTTTCCTTACTGG-3’；配列番号１９３０７４
Malat1-AS-R、5’-GAGTCCCTTTGCTGTGCTG-3’；配列番号１９３０７５
(Gtl2) Meg3-F、5’-GCGATAAAGGAAGACACATGC-3’；配列番号１９３０７６
Meg3-R、5’-CCACTCCTTACTGGCTGCTC-3’；配列番号１９３０７７
Meg3 ds-F3、5’- ATGAAGTCCATGGTGACAGAC-3’；配列番号１９３０７８
Meg3 ds-R2、5’-ACGCTCTCGCATACACAATG-3’；配列番号１９３０７９
Rtl1-F、5’-GTTGGGGATGAAGATGTCGT-3’；配列番号１９３０８０
Rtl1-R、5’-GAGGCACAAGGGAAAATGAC-3’；配列番号１９３０８１
Nespas ds-F、5’-TGGACTTGCTACCCAAAAGG-3’；配列番号１９３０８２
Nespas ds-R、5’-CGATGTTGCCCAGTTATCAG-3’；配列番号１９３０８３
Bgn-AS-F、5’-CAACTGACCTCATAAGCAGCAC-3’；配列番号１９３０８４
Bgn-AS-R、5’-AGGCTGCTTTCTGCTTCACA-3’；配列番号１９３０８５
Htr6 up-F、5’-ATACTGAAGTGCCCGGAGTG-3’；配列番号１９３０８６
Htr6 up-R、5’-CAGGGGACAGACATCAGTGAG-3’；配列番号１９３０８７
を使用してゲノムＤＮＡから増幅された。
ＵＶ架橋ＲＮＡ免疫沈降
ＲＴ‐ＰＣＲ用に全長ＲＮＡを保護するためにＲＮＡの単離前にリボヌクレアーゼ処理によりＲＮＡ‐タンパク質複合体中の転写物をトリミングしなかったことを例外として、説明されているように(Ule et al., 2005)ＵＶ架橋ＩＰを実行した。２５４ｎｍ、４００ｍＪ／ｃｍ２（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲを使用）のＵＶをマウスＥＳ細胞に照射し、超音波破砕処理によりＲＳＢ‐ＴＲＩＴＯＮ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５μｇ／ｍＬ ジギトニン、０．５％トリトンＸ‐１００）に細胞核を溶解した。サケ精子ＤＮＡ／タンパク質アガロースビーズを４℃で１時間用いて核溶解液を前清澄処理し、そして、抗体と一晩インキュベートした。次に、プロテインＡＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡ／抗体複合体を沈殿させ、最初に低強度緩衝液（１×ＰＢＳ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ］、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、０．５％ＮＰ‐４０）で洗浄し、次に高強度高塩濃度緩衝液（５×ＰＢＳ［７５０ｍＭ ＮａＣｌ］、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、０．５％ＮＰ‐４０）で二回洗浄し、そして、プロテアーゼＫで処理した。トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、そして、上記のようにＲＴ‐ｑＰＣＲを行った。
ヒトＰＲＣ２成分の発現と精製
ヒトＰＲＣ２サブユニットの発現のために、ｐＦａｓｔＢａｃ１中のＮ末端ＦＬＡＧタグ化ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２をＳｆ９細胞で発現させた (Francis et al., 2001)。ＰＲＣ２複合体全体の発現のため、ＦＬＡＧタグ化ＥＺＨ２はタグを着けていないＳＵＺ１２、ＥＥＤおよびＲＢＡＰ４８と共発現した。ＢＣ３００緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、３００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、および完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中での４回の凍結融解サイクルにより抽出物を作製し、そして、４時間Ｍ２ビーズに結合させ、そして、ＢＣ２０００で洗浄した後に０．４ｍｇ／ｍｌのｆｌａｇペプチドを有するＢＣ３００中で溶出を行った。ＥＺＨ２とＰＲＣ２を１００ｍＭ ＫＣｌに調節し、そして、ＨｉＴｒａｐヘパリンＦＦ１ｍｌカラムに負荷し、そして、１００〜１０００ｍＭ ＫＣｌの濃度勾配を用いて溶出した。Ａｍｉｃｏｎウルトラ１０ｋＤａ ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してピーク画分を濃縮し、そして、ＢＣ３００で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムに負荷した。ピーク画分を回収し、濃縮した。ＳＵＺ１２については、ｆｌａｇ溶出画分を濃縮し、そして、ＢＣ３００で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに負荷した。
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
以前に説明されたように(Zhao et al., 2008) ＲＮＡ‐ＥＭＳＡを実行した。３０ヌクレオチドのＨｅｓ‐１プローブ（アンチセンス方向にＴＳＳから約２７０ｂｐ下流）をゲルシフト用に使用した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して［γ‐３３ｐ］ＡＴＰでＲＮＡプローブを放射標識した。精製したＰＲＣ２タンパク質（１μｇ）を標識したプローブと４℃で１時間インキュベートした。０．５×ＴＢＥ中の４％非変性ポリアクリルアミドゲルでＲＮＡ-タンパク質複合体を２５０Ｖ、４℃で１時間分離した。ゲルを乾燥させ、そして、コダックのＢｉｏＭａｘフィルムに露光させた。
ＲＮＡプルダウンアッセイ
我々は、ＲｅｐＡ、Ｘｉｓｔエクソン１および短縮型Ｇｔｌ２のＰＣＲ産物用のフォワードプライマーにＴ７プロモーター配列を組み込んだ。全長型Ｇｔｌ２はｐＹＸ‐ＡＳＣに、そして、ＸｉｓｔＥ１はｐＥＦ１／Ｖ５／ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。具体的なプライマー配列は、
RepA-F: TAATACGACTCACTATAGGGAGAcccatcggggccacggatacctgtgtgtcc；配列番号１９３０８８
RepA-R: taataggtgaggtttcaatgatttacatcg；配列番号１９３０８９
Truncated-Gtl2-F: TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCTGAGACACTGACCATGTGCCCAGTGCACC；配列番号１９３０９０
Truncated-Gtl2-R: CGTCGTGGGTGGAGTCCTCGCGCTGGGCTTCC；配列番号１９３０９１
Xist E1-F: atgctctgtgtcctctatcaga；配列番号１９３０９２
Xist E1-R: gaagtcagtatggagggggt；配列番号１９３０９３
であった。
次に、Ｍｅｇａ Ｓｃｒｉｐｔ Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮＡを転写し、トリゾールを使用して精製し、そして、二次構造形成を促進するためにゆっくりと冷却した。プルダウンアッセイのために、３μｇのＦｌａｇ‐ＰＲＣ２またはＦｌａｇ‐ＧＦＰと２０ＵのＲＮＡｓｉｎが追加された５ｐｍｏｌのＲＮＡを氷上で３０分間インキュベートした。１０μｌのｆｌａｇビーズを添加し、そして、ローテーター上で４℃で１時間インキュベートした。１５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５％ＮＰ４０と１ｍＭのＰＭＳＦを含有する２００μｌの緩衝液で３回ビーズを洗浄した。３５μｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を添加することによりＲＮＡ‐タンパク質複合体をｆｌａｇビーズから溶出した。１０分の１量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を添加して溶離液を中和し、そして、ゲル電気泳動により分析した。
ノックダウン解析とｑＲＴ‐ＰＣＲ
ｓｈＲＮＡオリゴをＭＩＳＳＩＯＮ ｐＬＫＯ．１‐ｐｕｒｏ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）ベクターにクローン化し、そして、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により野生型マウスＥＳ細胞に形質移入した。ピューロマイシン選別の１０日後に細胞を回収し、そして、ＲＮＡノックダウンを確認するためにｑＲＴ‐ＰＣＲを行った。対応するスクランブル配列（ＭＩＳＳＩＯＮ非ターゲットｓｈＲＮＡ）を対照（Ｓｃｒ）として使用した。Ｇｔｌ２用のｓｈＲＮＡオリゴ：（トップ鎖） 5’- CCG GGC AAG TGA GAG GAC ACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG CTT TTT G -3’；配列番号１９３０９４、（ボトム鎖） 5’- AAT TCA AAA AGC AAG TGA GAG GAC ACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG C -3’；配列番号１９３０９５。Ｇｔｌ２ ＲＮＡとＧｔｌ２‐ａｓ ＲＮＡ用のｑＰＣＲプライマーは上記のとおりである。Ｄｌｋ１ ＲＮＡ用のプライマー：（フォワード） 5’- ACG GGA AAT TCT GCG AAA TA -3’；配列番号１９３０９６（リバース） 5’- CTT TCC AGA GAA CCC AGG TG -3’；配列番号１９３０９７。別のＧｔｌ２ｓｈＲＮＡをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖ２ＭＭ＿９７９２９）より購入した。このｓｈＲＮＡを用いるノックダウン後のＥｚｈ２レベルをｑＰＣＲ（Zhaoetal., 2008）により試験した。複数のクローンを試験した後に、我々は、Ｇｔｌ２は初期の継代クローンでノックダウンされ得るが（５０〜７０％）、ノックダウンクローンは長期の培養での位置が困難であると結論した。
ＤＮＡ ＣｈＩＰおよびリアルタイムＰＣＲ
説明されるように(Zhao et al., 2008)ＣｈＩＰを実行した。５μｌの抗Ｅｚｈ２抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ ３９１０３)、通常のウサギＩｇＧ（Ｕｐｓｔａｔｅ１２‐３７０）および抗Ｋ２７トリメチル化ヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を各ＩＰに使用した。Ｇｔｌ２‐近位ＤＭＲについてｐｒＧｔｌ２Ｆ／ｐｒＧｔｌ２Ｒを用いて、Ｇｔｌ２‐遠位ＤＭＲについてＤＭＲ‐Ｆ／ＤＭＲ‐Ｒを用いて、Ｄｌｋ１プロモーターについてｐｒＤｌｋ１Ｆ／ｐｒＤｌｋ１Ｒを用いて、そして、ＧａｐｄｈプロモーターについてｐｒＧＡＰＤＨ‐Ｆ／ｐｒＧＡＰＤＨ‐Ｒを用いてＣｈＩＰ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲを行った。プライマー配列は次の通りである。
proximal-DMR、5’- CATTACCACAGGGACCCCATTTT；配列番号１９３０９８
proximal-DMR、5’- GATACGGGGAATTTGGCATTGTT；配列番号１９３０９９
prDlk1F、5’- CTGTCTGCATTTGACGGTGAAC；配列番号１９３１００
prDlk1R、5’- CTCCTCTCGCAGGTACCACAGT；配列番号１９３１０１
distal-DMR-F、5’- GCCGTAAAGATGACCACA；配列番号１９３１０２
distal-DMR-R、5’- GGAGAAACCCCTAAGCTGTA；配列番号１９３１０３
prGAPDH-F、5’- AGCATCCCTAGACCCGTACAGT；配列番号１９３１０４
prGAPDH-R、5’- GGGTTCCTATAAATACGGACTGC；配列番号１９３１０５
prActin-F、5’- GCA GGC CTA GTA ACC GAG ACA；配列番号１９３１０６
prActin-R、5’- AGT TTT GGC GAT GGG TGC T；配列番号１９３１０７
次の材料と方法が以下に示される実施例１０〜１５において使用された。
ＬＮＡヌクレオフェクション
２×１０６個のＳＶ４０Ｔ形質転換ＭＥＦ細胞を１００μｌのＭｅｆヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。Ｃｙ３標識化ＬＮＡ分子を２μＭの終濃度まで添加した。Ｔ‐２０プログラムを用いて細胞を形質移入した。細胞に２ｍｌの培地を添加し、そして、１００μｌのこの懸濁液を各時点でゼラチンコードした１０ウェルスライドにプレーティングした。Ｅｘｉｑｏｎソフトウェア（exiqon.comで入手可能）を使用してＬＮＡ配列を設計した。標的親和性（Ｔｍ）を最大化する一方、自己ハイブリダイゼーションスコアを最小化するために修飾型ＬＮＡ塩基を戦略的に導入した。ＬＮＡ分子配列（５’から３’へ）は次の通りであった。
LNA-Scr、GTGTAACACGTCTATACGCCCA；配列番号１９３１０８
LNA-C1、CACTGCATTTTAGCA；配列番号１９３１０９
LNA-C2、AAGTCAGTATGGAG；配列番号１９３１１０
LNA-B、AGGGGCTGGGGCTGG；配列番号１９３１１１
LNA-E、ATAGACACACAAAGCA；配列番号１９３１１２
LNA-F、AAAGCCCGCCAA；配列番号１９３１１３
LNA-4978、GCTAAATGCACACAGGG；配列番号１９３１１４
LNA-5205、CAGTGCAGAGGTTTTT；配列番号１９３１１５
LNA-726、TGCAATAACTCACAAAACCA；配列番号１９３１１６
LNA-3’、ACCCACCCATCCACCCACCC；配列番号１９３１１７
リアルタイムＰＣＲ
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ヌクレオフェクション後に総ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキットを使用して逆転写反応を実行し、そして、ｉｃｙｃｌｅｒ ＳＹＢＲグリーン化学（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してｃＤＮＡ試料に対してリアルタイムＰＣＲを実行した。
ＣｈＩＰ
ヌクレオフェクション後の様々な時点で細胞を１％ホルムアルデヒド溶液中で固定した。グリシンを０．１２５Ｍまで添加することにより固定を停止させ、そして、以前に説明されたように（２８）、ＣｈＩＰを実行し、そして、ｑＰＣＲにより定量を行った。
抗体
様々なエピトープに対する抗体を次のように購入した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ ３９５３５。Ｅｚｈ２、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ ３９６３９およびＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ６１２６６６。免疫染色には、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体は１：１００希釈で使用され、Ｅｚｈ２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）は１：５００希釈で使用された。Ａｌｅｘａ‐Ｆｌｕｏｒ二次抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ウェスタンブロットには、Ｅｚｈ２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）は１：２０００希釈で使用された。アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ２０６６）は１：５０００希釈で使用された。
ＤＮＡ ＦＩＳＨ、ＲＮＡ ＦＩＳＨおよび免疫染色
細胞はゼラチンコートしたガラススライド上で培養されるか、サイトスピンにかけられた。ＲＮＡ ＦＩＳＨ、ＤＮＡ ＦＩＳＨ、連続ＲＮＡ‐ＤＮＡ ＦＩＳＨ、免疫染色および免疫ＦＩＳＨは説明された（２４）ように実行された。ニックトランスレーションしたｐＳｘ９‐３プローブかＸｉｓｔリボプローブカクテルを使用してＸｉｓｔ ＲＮＡ ＦＩＳＨを実行した。Ｘｉｓｔ ＤＮＡ ＦＩＳＨのプローブとしてｐＳｘ９‐３を使用した。中期染色体スプレッドのために、コルヒチンを細胞に１時間添加した。細胞をトリプシン処理し、そして、３ｍｌの０．０５６Ｍ ＫＣｌに室温で３０分間再懸濁し、遠心分離してメタノール：酢酸（３：１）固定液中に再懸濁した。何回か固定液を変えた後に細胞を冷却したスライドガラスに滴下し、ＲＮＡ ＦＩＳＨまたはＤＮＡ ＦＩＳＨの処理を行った。
実施例１．ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングによるＰＲＣ２トランスクリプトームの収集
以前、未変性ＲＮＡ免疫沈降（ＲＮＡ免疫沈降）によりＲｅｐＡ、ＸｉｓｔおよびＴｓｉｘがＰＲＣ２相互作用性ＲＮＡとして特定された(Zhao et al., 2008)。今回、我々は、未変性ＲＮＡ免疫沈降 (Zhao et al., 2008)とＲＮＡシークエンシング (Cloonan et al., 2008)を組み合わせることにより（この方法は本明細書において「ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング」と称される。例示的な図１Ａを参照のこと）、ＰＲＣ２に結合したゲノムワイドなプールを収集する方法を開発した。抗Ｅｚｈ２抗体により免疫沈降した核ＲＮＡをマウスＥＳ細胞(Lee and Lu, 1999)とＥｚｈ２−／−対照 (Shen et al., 2008)から単離し（図１Ｂ）、ストランド特異的アダプターを使用してｃＤＮＡを作製し、そして、２００〜１，２００ヌクレオチドのｃＤＮＡを精製し、そして、イルミナ・シークエンシングにかけた（図１Ｃ）。
パイロット実験では、我々は１０７個のＥＳ細胞に対してＲＮＡ免疫沈降を行い、そして、抗Ｅｚｈ２プルダウンの特異性を評価するためにいくつかの対照ＲＮＡ免疫沈降を実験に含めた。野生型プルダウンならびにその技術的反復および生物学的反復では、抗Ｅｚｈ２抗体は１０７個のＥＳ細胞から７０〜１７０ｎｇのＲＮＡを沈殿し、そして、２００ヌクレオチドより大きいｃＤＮＡのスメアを生じた（図１Ｃ、図７Ａ）。リボヌクレアーゼでの処理によりこの範囲のサイズの産物が除去され（図７Ｂ）、そして逆転写無しの試料は産物を生じなかった。これらのことは、免疫沈降した物質が実際にＲＮＡであったことを示唆する。Ｅｚｈ２−／−プルダウンのとき（約１４ｎｇ）とＩｇＧにより野生型細胞が免疫沈降したとき（約２４ｎｇ）は、存在するＲＮＡが約１０倍少なかった。モックＲＮＡ免疫沈降対照（細胞無し）に対する５００倍の濃縮もまた観察された。２００ヌクレオチドより大きいサイズの範囲について、対照ＲＮＡ免疫沈降（ヌル細胞、ＩｇＧプルダウン、モック）ではＲＮＡがさらに少なく、これらの試料ではアダプターダイマーおよびプライマーダイマーがもっぱらであった。我々は、アダプター／プライマーダイマー、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、１８ヌクレオチド未満または未確定のヌクレオチドを有するリード、および１５塩基を越えるホモポリマー鎖を計算により除去した（図７）。同等の数の細胞からでは、対照ＲＮＡ免疫沈降ではリードが著しく少なかった（図７Ｄ）。野生型ライブラリーでは、２３１，８８０〜１２０万リードが選別の後に残った。対照的に、対照ではわずかに４，８８８〜７３，６９１リードが残った（図１Ｄ、列２および３）。対照での転写物の圧倒的多数は疑わしいものであった（アダプター／プライマーダイマー、ホモポリマーなど）。したがって、野生型ＲＮＡ免疫沈降は、対照ＲＮＡ免疫沈降と比較して、かなりのＲＮＡ濃縮とより高度のＲＮＡの複雑性を示した。
野生型ライブラリーでの全てのリードのおよそ半分が３回以上現れた。潜在的なＰＣＲによる人為産物を回避するために重複配列を除去した後でさえ、野生型ライブラリーは３０１，４２７個の別個のリードを含有し（技術的反復および生物学的反復では、それぞれ、９８，７０４個および８７，１２８個）、一方、対照試料は１，０５０個（ＩｇＧ）および１７，４２４個（ヌル）（図１Ｄ）を生じるのみであった。野生型ライブラリーは互いに非常に類似しており、相関係数（ＣＣ）は、Ｅｚｈ２−／−対照およびＩｇＧ対照に対して、それぞれ、比較したときの０．２７〜０．０１と比較して、０．７１〜０．９０であった（図１Ｅ）。ゲノム当たり１０コピーより多い反復配列に対応するリードは全野生型リードの２０％未満を占め（図１Ｆ）、単純リピートは最も一般的であり、８５．７１４％を占めたが、ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥおよびＬＴＲは相対的に過小評価された（図１Ｇ）。１０以下のアラインメントを有するリードが大部分なので、我々はこれ以降これらのリードの解析に焦点を当てる（１０以下のカットオフはコピー数のゲノム重複が少ない遺伝子を保持する）。
我々は、次に、別個のリードを染色体の位置の関数としてプロットすることによりそれらのゲノム上の分布を調査した（図８〜１２）。ＰＲＣ２結合ＲＮＡは野生型ライブラリーでは全ての染色体上に存在することがアラインメントにより示された。ＩｇＧ対照とＥｚｈ２−／−対照についてのアラインメントではほとんどリードが示されず、単発的なリードが示された。したがって、我々のＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングは、ＰＲＣ２トランスクリプトームについて特異的で再現性が有るプロファイルをもたらした。多数の野生型リードはＸ染色体にヒットし（図１Ｈ）、そして、我々の正の対照、すなわち、Ｔｓｉｘ ＲＮＡ、ＲｅｐＡ ＲＮＡおよびＸｉｓｔ ＲＮＡはそれぞれ数十回現れることがＸ染色体不活性化センターの拡大物により示された（図１Ｉ）。我々のＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング検出の高感受性はＲｅｐＡとＸｉｓｔの表示によって示唆されたが、それらは総計でＥＳ細胞あたり１０コピー未満の割合で発現する (Zhao et al., 2008)。一方、Ｘ染色体不活性化センターの他の非コードＲＮＡ内にヒットは存在しなかった。したがって、ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング技術は感受性が高く、且つ、特異的であった。
実施例２．ＰＲＣ２トランスクリプトーム
飽和的な包括度を得るために、我々はシークエンシングを拡大し、オリジナルの野生型試料について３１９０万リード、およびその生物学的反復については３６４０万リードを得た。図７Ａに示されるように重複配列を除去、選別にかけた後に、それぞれのライブラリーについて、１，０３０，７０８個および８５２，６３５個の、アラインメントが１０回以下の別個のリードが残った。その後、以降の解析のためにこれらのリードをパイロット野生型リードと組合せ（これ以降は、ＷＴライブラリー）、そして、Ｅｚｈ２−／−ライブラリーを対照として使用して全ての解析を行った。
転写物を「ＰＲＣ２トランスクリプトーム」のメンバーであると呼ぶための閾値を決定するために、我々は、真正のＰＲＣ２相互作用転写物であればバックグラウンドよりも高いリード密度を有するであろうという原則に基づき、（ｉ）転写物毎の別個のリードの数、および真正の陽性であればＷＴで濃縮されるであろうことを理由に、（ｉｉ）ＷＴライブラリーとヌルライブラリーの間での相対的表出に基づきストラテジーを設計した。我々は、遺伝子の長さとシークエンシングの深度を正規化する方法として「１００万リード当たりのキロベースあたりのリード数」（ＲＰＫＭ） (Mortazavi et al., 2008)を使用して遺伝子的表出を計算し、次に、ＵＣＳＣ連結型トランスクリプトーム中の３９，００３転写物全てをそれらのＷＴ ＲＰＫＭ値（ｘ軸）とそれらのヌル ＲＰＫＭ値（ｙ軸）により散布図にマップした（図２Ａ）。両方のライブラリーで０表出または０に近い表出を有する転写物は大多数のデータポイントを占めた［（０、０）での青色のもや］。非０のｘ‐値と０のｙ‐値を有する転写物はＷＴプルダウンのみで現れた集団を示す（図２Ａ、ｙ＝０線）。
我々は、対照転写物を校正点として使用することにより最小密度を確証した。Ｘｉｓｔ／ＲｅｐＡは４．１９というＲＰＫＭを収めたが、これは、１００万あたり１２６個の別個のリードを意味する。Ｔｓｉｘのスコアは１０．３５であり、Ｂｓｎ‐ｐａｓｒ（約３００ヌクレオチドのＢｓｎプロモーター関連転写物(Kanhere et al., 2010))のスコアは０．９５であった。インプリントアンチセンス転写物であるＫｃｎｑ１ｏｔ１はＰＲＣ２と相互作用すると主張されているが、直接的に相互作用するかどうかは分かっていない (Pandey et al., 2008)。Ｋｃｎｑ１ｏｔ１のスコアは１．１７であった。負の対照について、我々は、ＷＴライブラリーには演繹的に存在しないであろう転写物を用いた。例えば、Ｈｏｔａｉｒは尾部の組織のみで発生後期に発現する(Rinn et al., 2007)。それのスコアは０．２５であったが、これは１００万あたり１つだけの表出を意味する。他の２つのプロモーター関連ＲＮＡであるＨｅｙ１‐ｐａｓｒとＰａｘ３‐ｐａｓｒ (Kanhere et al., 2010)は２００ヌクレオチド未満であり、我々のサイズ選別計画から漏れた。それらのスコアは、それぞれ、０．２８と０．１１であったが、これらは１００万当たりはるかに１未満の別個のリードを示唆する。ＰＲＣ２相互作用性であると期待されない細胞質に局在するタンパク質をコードするｍＲＮＡもまた低いＲＰＫＭを示した［Ｉｎｓｌ６：０．２７、Ｃｃｄｃ８：０．２２］。我々はこれらの低い表出をバックグラウンドとみなす。校正点に基づいて、我々は最小ＲＰＫＭをｘ＝０．４０に設定したが、それは正の対照と負の対照の値の間にある。
適切な濃縮閾値を決定するために、我々は、同じキャリブレーターについてＷＴ／ヌルＲＰＫＭ比を調査した。Ｘｉｓｔ／ＲｅｐＡのスコアは４．１８／０であったが、これはＷＴライブラリーでの数百から数千の表出を意味するが、ヌルライブラリーでは表出がなかったことを意味する。Ｔｓｉｘのスコアは１０．３５／３．２７であり、Ｂｓｎ‐ｐａｓｒのスコアは０．９５／０であり、そして、Ｋｃｎｑ１ｏｔ１のスコアは１．１７／０であった。負の対照のスコアは低い比率であったが、Ｐａｘ３‐ｐａｓｒのスコアは０．１１／０．２６であり、Ｈｅｙ１‐ｐａｓｒのスコアは０．２８／０であり、Ｈｏｔａｉｒのスコアは０．２５／０であり、Ｉｎｓｌ６のスコアは０．２７／３．０９であり、そして、Ｃｃｄｃ８のスコアは０．２２／５．０４であった。これに基づき、我々は濃縮カットオフを３：１に設定した。転写物の包括についての基準の組合せ［ＲＰＫＭ（ＷＴ）=０．４、ＲＰＫＭ（ＷＴ）／ＲＰＫＭ（ヌル）=３．０］が、確立した対照のセットを使用するＷＴライブラリーとヌルライブラリーの間の直接比較に基づき、偽陽性を排除し、そして、バックグラウンドを控除すると期待される。
これらの基準により、我々はＰＲＣ２トランスクリプトームを９，７８８ＲＮＡと推定した（表２）。連結型ＵＣＳＣトランスクリプトーム（３９，００３転写物）中の約４，４４６転写物が我々のＰＲＣ２トランスクリプトームに含まれた（図２Ｂ）。別の３，１０６ＵＣＳＣ転写物にヒットがあったが、リバース鎖上のみであり、このことは、以前に注釈がついていなかった３，１０６アンチセンスＲＮＡの存在を示す。約１，１１８ＵＣＳＣ転写物に両方向でヒットがあったが、これは、２，２３６個のさらなる別個の転写物の存在を意味する。リードの１９％がＵＣＳＣデータベースでヒットしなかった。これらの「オーファンリード」は、トランスクリプトームが他の新規の転写物を含み得ることを示唆する。したがって、９，７８８はＥＳ細胞における実際のＰＲＣ２トランスクリプトームでの下限を表す。総マウストランスクリプトームは４０，０００から２００，０００のあたりと考えられているので、ＰＲＣ２トランスクリプトームは、総トランスクリプトームの実際のサイズに応じて、全マウス転写物の５〜２５％を含む。
実施例３．エピジェネティクス的特徴
我々は具体的なエピジェネティクス的特徴を調査した（図２Ｂ、表Ｉ、３〜７）。興味深いことに、Ｅｚｈ２フットプリント候補と一致する領域である (Zhao et al., 2008)、Ｘｉｓｔ内のＲｅｐＡ領域とＴｓｉｘの３’末端が多数回現れた（図２Ｃ）。メタジーン解析において、我々は、リード数を距離の関数としてプロットすることにより転写開始部位（ＴＳＳ）に対する転写物の関係を求めた（図２Ｄ）。フォワード鎖では、−２．０〜＋０．００１ｋｂで濃縮が観察された。リバース鎖では、−０．５〜＋０．１ｋｂでピークが認められた。バックグラウンドを越えて濃縮が生じた（ヌル、ＩｇＧ対照）（図７Ｃ）。プロモーターでの短い転写物の存在(Kapranov et al., 2007; Core et al., 2008; Seila et al., 2008; Taft et al., 2009)、ＰＲＣ２のプロモーター近傍での優先的な占有(Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006; Schwartz et al., 2006; Ku et al., 2008)、およびＰＲＣ２に結合するいくつかのＴＳＳ関連ＲＮＡの特定(Kanhere et al., 2010)を考慮すると、ＴＳＳとの関連は顕著である。
次に、我々は、ＰＲＣ２トランスクリプトームのどれくらいがＥＳ細胞においてＰＲＣ２結合部位 (Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006) および二価ドメイン（bivalent domain）(Bernstein et al., 2006a; Mikkelsen et al., 2007; Ku et al., 2008)と交わりを持つのか求めた。顕著なことに、２，７０４箇所の二価ドメイン（bivalent domain）のうちの５６２箇所（２１％）および１，８００箇所のＳｕｚ１２結合部位のうちの３３０箇所（１８％）に少なくとも１つのＲＮＡとのヒットがあったが（図２Ｂ、表３、４）、これは、結合部位と対照幹細胞運命のサブセットにおいてＲＮＡがポリコーム複合体のリクルートまたは保持に関与し得るという可能性を示唆する。我々のトランスクリプトームと交わりを持たない部位は他の機序を用いてＰＲＣ２をリクルートする可能性がある。
我々はまた、「長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）」と称される一群の遺伝子間非コードＲＮＡ(Guttman et al., 2009)との重複の程度を求めた。２，１２７個のマウス長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）を我々の９，７８８個の転写物とインターセクトすることにより２１６個の重複が明らかになったが（図２Ｂ、表５）、これは、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）がＰＲＣ２トランスクリプトームの約２％を占めることを示す。ヒト長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）のうち、２６０個がＰＲＣ２と結合する可能性を持ち得る (Khalil et al., 2009)。２６０個のヒト長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）が我々のＰＲＣ２トランスクリプトーム中の２１６個のマウス長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）と重複するか問うために、我々はＬｉｆｔＯｖｅｒ（genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOverにおいてワールド・ワイド・ウェッブにて入手可能）によりマウスにおけるシンテニー座標をマップしたが、２つのサブセット間で認識可能な相同性は見出さなかった。したがって、我々のトランスクリプトームはＰＲＣ２相互作用性ＲＮＡの大きくて別個のセットを表す。
ポリコームタンパク質の誤制御はしばしば癌と関連があるので、我々はＰＲＣ２相互作用性ＲＮＡを癌遺伝子座および腫瘍抑制遺伝子座とインターセクトした (Sparmann and van Lohuizen, 2006; Bernardi and Pandolfi, 2007; Miremadi et al., 2007; Rajasekhar and Begemann, 2007; Simon and Lange, 2008)。興味深いことに、４４１癌遺伝子と７９３腫瘍抑制遺伝子のうち（cbio.mskcc.org/CancerGenesにおいてワールド・ワイド・ウェッブにて入手可能）、それぞれ、１８２遺伝子（４１％）と３２５遺伝子（４１％）でどちらかの方向の少なくとも１つのＰＲＣ２相互作用転写物があり（図２Ｂ、表６、７）、このことは、ＲＮＡが癌におけるポリコームのリクルートの誤制御に役割を果たすことを示唆している。顕著な例にはｃ‐Ｍｙｃ、Ｂｒｃａ１、Ｋｌｆ４およびＤｎｍｔ１が含まれる。
結局、Ｘ染色体不活化のように、ゲノムインプリンティングはシスに制御されているに違いない。インプリント遺伝子は、親特異的発現を規定するシス作用性「インプリント制御領域」（ＩＣＲ）によって制御される(Edwards and Ferguson-Smith, 2007; Thorvaldsen and Bartolomei, 2007)。興味深いことに、ＩＣＲは一般的に長鎖の転写物と関連があるが(Williamson et al., 2006; Pandey et al., 2008; Wan and Bartolomei, 2008)、その多くがＰＲＣ２トランスクリプトーム中に見出された（図２Ｂ、表２）。それらにはＨ１９、Ｇｔｌ２、Ｋｃｎｑ１ｏｔ１およびＮｅｓｐａｓが含まれる。複数のヒットがＮｅｓｐａｓ ＲＮＡ／ＴＲ０１９５０１にあったが（図３Ａ）、主要ＩＣＲからのアンチセンスＲＮＡがＮｅｓｐ／Ｇｎａｓクラスターを調節すると考えられている (Coombes et al., 2003; Williamson et al., 2006)。また、Ｇｔｌ２で繰り返しヒットがあったが（図３Ｂ）、その座位は、アンチ‐Ｒｔｌ１およびＧｔｌ２のアンチセンス相対物（ここではＧｔｌ２‐ａｓと称される）と共にＤｌｋ１のインプリンティングを制御すると考えられている (Edwards et al., 2008)。ＩＣＲ関連長鎖転写物内でのヒットは、ＲＮＡがＰＲＣ２をターゲティングすることによりインプリント化クラスターを調節し得ることを示唆する。
実施例４．ＲＮＡ‐ＰＲＣ２相互作用の検証
我々は次に、ＲＮＡ‐タンパク質相互作用をいくつかのアプローチにより検証した。第１に、我々はＲＮＡ免疫沈降‐ｑＰＣＲを行い、候補ＲＮＡがＩｇＧプルダウンと比較して抗Ｅｚｈ２プルダウンにおいて著しく濃縮されていることを見出した（図４Ａ）。インプリント化Ｇｔｌ２、そのアンチセンス相対物であるＧｔｌ２‐ａｓ／Ｒｔｌ１およびＮｅｓｐａｓ／ＴＲ０１９５０１について強力な陽性プルダウンが観察された。Ｈｓｐａ１ａ‐ａｓ（Ｈｓｐ７０に対するアンチセンス）、Ｍａｌａｔ‐１‐ａｓ（Ｍａｌａｔ‐１に対するアンチセンス）、Ｂｇｎ‐ａｓ（Ｂｇｎに対するアンチセンス）、Ｌｙ６ｅ‐ａｓ（リンパ球抗原６複合体座Ｅに対するアンチセンス）、Ｆｏｘｎ２‐ａｓ（Ｆｏｘｎ２に対するアンチセンス）およびＨｔｒ６セロトニン受容体の上流にあるＲＮＡを含む、疾患関連の座位に関連する、多数の以前は知られていなかったアンチセンス転写物またはＲＮＡもまた濃縮された。第２に、我々は、抗Ｅｚｈ２抗体によってプルダウンされたＲＮＡの量をＷＴのＥＳ細胞とＥｚｈ２−／−ＥＳ細胞の間で比較した（図４Ｂ）。全ての場合において、ＲＮＡは顕著にもＷＴでより濃縮された。対照的に、負の対照であるＭａｌａｔ‐１センス転写物では濃縮は示されなかった。第３に、我々は、ＲＮＡを０オングストロームに近い距離にあるタンパク質に架橋するＵＶの能力に基づく、ＲＮＡ‐タンパク質相互作用をインビボで試験する別の方法であるＵＶ架橋‐ＲＮＡ免疫沈降(Ule et al., 2005)を行った。短い範囲でのみ架橋が生じ、そして、超音波破砕処理と高塩濃度洗浄を用いて複合体が単離されるので、この方法は直接的ＲＮＡ‐タンパク質相互作用をよりよく検出し、そして、ＲＮＡ単離中の再会合人為産物を回避することができる。この方法を用いて、候補ＲＮＡの濃縮が同様に観察された（図４Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングの特異性を裏付け、そして、ＲＮＡとＥｚｈ２間の直接的相互作用を示唆する。
ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングで特定された転写物の半分近くが以前には注釈が付けられていなかった（図２Ｂ）。それらの存在を検証するために、我々はノーザン分析を行い、そして、ＥＳ細胞における別個の転写物を見出した（図４Ｄ）。抗Ｅｚｈ２抗体によって沈殿した核酸の性質を確認するために、我々は、異なる基質特異性を有するリボヌクレアーゼを用いて核抽出液を前処理した。一本鎖特異的リボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩ）および二本鎖特異的リボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＶ１）での消化によりＲＮＡプルダウンが消失したが、（ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する）リボヌクレアーゼＨとデオキシリボヌクレアーゼＩでの消化は何の効果も無かった（図４Ｅ）。したがって、ＰＲＣ２との複合体中のＲＮＡは一本鎖と二本鎖の特徴を有する。
実施例５．ＲＮＡのＰＲＣ２への直接的結合
我々は次に、精製した組換えヒトＰＲＣ２サブユニットであるＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２およびＲＢＡＰ４８を用いるインビトロ生化学的解析により、ＲＮＡがＰＲＣ２に直接結合するのかという問題に取り扱った（図５Ａ）。Ｈｅｓ１（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の転写因子(Axelson, 2004))の新しく特定されたアンチセンスＲＮＡは、ＲｅｐＡでも見られるモチーフである (Zhao et al., 2008)二重ステムループ構造を含む（図５Ｂ）。ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において、２８ヌクレオチドのＲｅｐＡプローブと３０ヌクレオチドのＨｅｓ１‐ａｓプローブの両方がＰＲＣ２によってシフトしたが、Ｘｉｓｔの他の領域に由来するＲＮＡ（ＤｓＩ、ＤｓＩＩ）はシフトしなかった。ステムループ構造の変異によりＰＲＣ２の結合が減少した。ＰＲＣ２のどのサブユニットがＨｅｓ１‐ａｓに結合するのか決定するために、我々は具体的なサブユニットを用いてＥＭＳＡを実行した（図５Ａ、Ｄ、Ｅ）。ＥＺＨ２は野生型Ｈｅｓ１‐ａｓ ＲＮＡを強くシフトしたが、変異型Ｈｅｓ１‐ａｓ ＲＮＡではシフトしなかった。一方、ＳＵＺ１２もＥＥＤもＨｅｓ１‐ａｓをシフトしなかった。ＰＲＣ２全体が使用されたとき、ＲＮＡ‐タンパク質のシフトは常により離散的であったが、これは、他のサブユニットが相互作用安定化することを示唆する。これらの結果は、Ｈｅｓ１‐ａｓ ＲＮＡがＰＲＣ２と直接的および特異的に相互作用すること、およびＥｚｈ２がＲＮＡ結合サブユニットであることを示す。
我々はまたＧｔｌ２ ＲＮＡを調査した。Ｇｔｌ２は１．７〜４．３ｋｂでありＥＭＳＡにより試験するには大きすぎるので、我々はＲＮＡプルダウンアッセイを実行した（図５Ｆ）。我々はＧｔｌ２、短縮型（５’末端から１．０ｋｂ）、ＲｅｐＡおよびＸｉｓｔエクソン１（負の対照）をインビトロで転写し、そして、Ｆｌａｇ‐ＰＲＣ２またはＦｌａｇ‐ＧＦＰタンパク質を使用するプルダウンアッセイで等モル量のそれぞれのＲＮＡを試験した。ＰＲＣ２プルダウンにおいて、全長型および短縮型のＧｔｌ２ＲＮＡの両方が一貫して濃縮された。ＲｅｐＡＲＮＡもまた濃縮されたが、Ｘｉｓｔエクソン１は濃縮されなかった。Ｇｔｌ２ＲＮＡ、多分、その近位の１．０ｋｂがＰＲＣ２に直接的および特異的に結合することがこれらの結果により示された。
実施例６．Ｇｔｌ２‐ＰＲＣ２相互作用がＤｌｋ１‐Ｇｔｌ２で遺伝子発現を調節する
ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシングが新しい機能の発見に成功したか調べるために、我々は、ヒツジでのＣａｌｌｉｐｙｇｅ（臀部過成長）、マウスでの成長調節不全、およびヒトでの癌 (Edwards et al., 2008; Takahashi et al., 2009)に関連するインプリント病座位であるＤｌｋ１‐Ｇｔｌ２でのＧｔｌ２‐ＰＲＣ２相互作用に焦点を当てた。母親由来の染色体から発現するＧｔｌ２はＩＣＲと関係があり（図６Ａ）、そして、父親由来の染色体から発現するＤｌｋ１を調節すると主張されているが(Lin et al., 2003; Takahashi et al., 2009)、現在の所、作用機序は不明である。Ｇｔｌ２転写物それ自体がＤｌｋ１を調節するのか判定するために、我々はＥＳ細胞でＧｔｌ２をノックダウンして、Ｄｌｋ１の２倍の発現増加を観察したが、これは、Ｄｌｋ１が一対立遺伝子の発現から二対立遺伝子の発現に変化したという考えに合う（図６Ｂ）。Ｇｔｌ２‐ａｓもまた発現増加した。ｓｈＲＮＡは転写後にＲＮＡを分解のために標的とするので、Ｇｔｌ２はＲＮＡとして機能することがこれらの実験により示される。
ＲＮＡがＰＲＣ２をＤｌｋ１に誘引することにより機能するのかという問題を取り扱うために、我々は抗Ｅｚｈ２抗体および抗Ｋ２７トリメチル化ヒストンＨ３抗体を使用する定量的クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った。実際には、Ｇｔｌ２ ＲＮＡがノックダウンされると、我々はＤｌｋ１プロモーターへのＥｚｈ２のリクルートの２倍の低下およびシス領域でのヒストンＨ３‐Ｋ２７トリメチル化の同程度の低下を検出したが（図６Ｃ）、これはＤｌｋ１の発現の上昇と一致する（図６Ｂ）。我々はまた、Ｇｔｌ２の近位にあるＩＣＲのメチル化可変領域（ＤＭＲ）でのＥｚｈ２のリクルートとヒストンＨ３‐Ｋ２７トリメチル化の低下に気づいたが、遠位ＤＭＲ（図６Ｃ）では影響が少ないことが分かった。遠位ＤＭＲは遺伝学的にＧｔｌ２の上流にあるので (Lin et al., 2003; Takahashi et al., 2009)、我々はＧｔｌ２による調節を予期しなかった。Ｇａｐｄｈ対照およびアクチン対照はＧｔｌ２のノックダウン後に顕著な減少を示さず、そして、Ｄｌｋ１へのＥｚｈ２のリクルートの低下はＧｔｌ２ノックダウン細胞において全般的に低下したＥｚｈ２レベルの結果ではなかった（図６Ｄ）。Ｇｔｌ２が実際にＰＲＣ２をＤｌｋ１に誘引することにより機能することをこれらのデータは示す。さらなる裏付けとしては、Ｅｚｈ２の消失により、Ｇｔｌ２レベルに相対的なＤｌｋ１の発現が約３倍上昇し（図６Ｅ）、表現型がＧｔｌ２ノックダウンの表現型と似ることになった。直接的Ｇｔｌ２‐ＰＲＣ２相互作用（図５）およびＧｔｌ２がノックダウンされたときのＤｌｋ１でのＥｚｈ２／ヒストンＨ３‐Ｋ２７トリメチル化の消失（図６）を考慮して、Ｇｔｌ２‐ＰＲＣ２相互作用がシスでＤｌｋ１にＰＲＣ２をターゲティングすることによりＤｌｋ１を調節すると我々は結論している。
実施例７．癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の長鎖非コードＲＮＡによる調節
本明細書中、先に記載されたように、ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング方法の適用が、ＰＲＣ２トランスクリプトームに結合する長鎖非コードＲＮＡ転写物のゲノムワイドのプールを作成した。別個のリードを染色体位置の関数としてプロットすることにより、同定された転写物のゲノム上の分布が調査された。結果として、癌遺伝子と腫瘍抑制遺伝子の両方を調節する長鎖非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡが特定された。図１３は、ｃ‐Ｍｙｃ癌遺伝子（赤色の棒）の周囲の領域を示すプロットを図示する。ｃ‐Ｍｙｃ癌遺伝子の周囲のリードの拡大図がＰＲＣ２結合の印象的なピークを示す（染色体座標６１，８７０，０００での背の高い赤色のピーク）。このｌｎｃＲＮＡはＰｖｔ１であることがさらなる解析により明らかになった（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１２００２．１（マウス）、またはＮＲ＿００３３６７．１（ヒト））。Ｐｖｔ１はバーキットリンパ腫のいくつかの症例において、ならびに形質細胞腫において（例えば、別の染色体からの転座によって）破壊されることが当技術分野において知られている。したがって、Ｐｖｔ１は、その発現を抑制するためにｃ‐ＭｙｃにＰＲＣ２をターゲティングすることにより作用する可能性がある。したがって、Ｐｖｔ１またはその断片の外来性投与が様々な癌の原因となるＰｖｔ１の機能欠損表現型を救済できるであろう。
図１４は、Ｎｋｘ２‐１遺伝子（Ｔｉｔｆ１としても知られる；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０７９６６８．２（ヒトｍＲＮＡ）およびＮＭ＿００１１４６１９８．１（マウスｍＲＮＡ）；ゲノム配列はＮＣ＿００００１４．８（ヒト）、ＮＴ＿０２６４３７．１２、ＮＣ＿００００７８．５（マウス）またはＮＣ＿００００７８．５（マウス）である）の周囲の領域を示すプロットを図示する。ヒトでは、ＮＫＸ２‐１は肺腺癌においてしばしば増幅または変異し、そして、肺癌形成に直接関連付けられている。それは初期癌発生を推進する癌原遺伝子と説明されるが、しかし同時に、その発現の消失が最終的には予後不良と関連する。したがって、患者においてＮＫＸ２‐１発現を調節するためにその調節エレメントを使用することができるかもしれないので、ＮＫＸ２‐１の調節は特に関心が高い。プロットの円で囲った領域は、マウスの（Ｔｉｔｆ１としても知られる）Ｎｋｘ２‐１遺伝子内のアンチセンスｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２の位置を表す。ヒットのパターンと密度に基づくと、アンチセンスＲＮＡは、マウスゲノムアッセンブリー・バージョンＮＣＢＩ３７／ｍｍ９の（Ｎｋｘ２‐１のプロモーターとＡＫ１４３００を含むようである）マウス１２番染色体の５７，６３６，１００〜５７，６３８，２５０ｂｐの間隔（配列番号１９１０８８）内にある。Ｎｋｘ２‐１の５’末端にあるＲＮＡ種は、Ｎｋｘ２‐１プロモーターとオーバーラップし、そして、二価ドメイン内にあるプロモーター関連アンチセンス転写物である。先に記したように、マウスとヒトのＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（例えば、ＰＶＴ１、ＸＩＳＴ、ＧＴＬ２）についてさえもよく保存されている。マウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析とシンテニー位置についてのＵＣＳＣゲノムブラウザでの解析により、ヒトＮＫＸ２‐１／ＴＩＴＦ１座（ヒト遺伝子ＢＸ１６１４９６；ヒトゲノムアッセンブリー・バージョンＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９の１４番染色体：３６，９８８，５２１〜３６，９９１，７２２ｂｐ（配列番号１９１０８７）と一致しないとしてもオーバーラップする可能性がある）について、同様の非コードアンチセンスプロモーター関連転写物の存在が示される。遺伝子構造の類似性と上流ＲＮＡ配列の存在がＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて明らかである。ヒト座位の制御がマウスでのそれと同様であり得ることがこれらの点より示唆される。
このアンチセンス転写物のレベルが調節されてＮＫＸ２‐１の発現に影響を与えることができる。プロモーター結合アンチセンス転写物が、ＮＫＸ２‐１の発現を低下させるために、増幅したＮＫＸ２‐１の発現を有する対象、例えば、肺腺癌の患者に投与されるか、および／または、腫瘍細胞に導入される。あるいは、ＮＫＸ２‐１の発現が消失した予後不良の患者において、ＮＫＸ２‐１アンチセンスｌｎｃＲＮＡ内の領域に特異的に結合するＬＮＡ分子などの阻害性ＲＮＡが導入され、それがＰＲＣ２相互作用アンチセンス転写物と拮抗し、そして、ＮＫＸ２-１遺伝子の発現を再開させる。
実施例８．別表ＩからのＰＲＣ２結合ピークの特定
いくつかの、または任意の実施形態において、タンパク質結合パートナー（例えば、ＰＲＣ２）が結合するＲＮＡの領域は、阻害性核酸がハイブリダイズするように設計された、その標的ｌｎｃＲＮＡ上の代表的な位置のうちの１つである。例えば、別表Ｉ中のデータを再吟味し、そして、データセット中で濃縮されている領域を特定することによりこれらの領域を特定することができる。これらの領域はＰＲＣ２結合配列を含む可能性がある。
別表Ｉにおける配列リードはイルミナＧＡ‐ＩＩゲノムアナライザーから直接由来するものであり、ＰＲＣ２結合転写物の逆相補鎖の方向である。別表Ｉは、バイオインフォマティクスの選別がアダプター／プライマダイマー、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ホモポリマ、未確定性ヌクレオチドを有するリード、および短縮型リード（１５ヌクレオチド未満）を除去した後のリード全ての選別済みサブセットである。それらは、上記の実施例１に記載されるＲＮＡ免疫沈降とその後のＲＮＡ精製工程（ＲＮＡ免疫沈降‐シークエンシング方法）の間に内在性ヌクレアーゼから最もよく保護された領域を表す可能性があり、したがって、ＰＲＣ２または結合タンパク質もしくは複合体に結合するＲＮＡの候補領域を表す。ＷＴとヌルの間で３：１に濃縮され［ＲＰＫＭ（ＷＴ）／ＲＰＫＭ（ヌル）=３．０］、そして、０．４という最小ＲＰＫＭ値を有する転写物に対応して、リードが別表Ｉから抽出された。次に、我々はリードの連続パイルアップ（ピーク）を用いてＰＲＣ２結合転写物の領域を特定し、そして、それらをＲＮＡ内のＰＲＣ２の候補接触領域とみなす。
別表Ｉにおける配列リードは、ブロード研究所のＡｒａｃｈｎｅアライナーのＳｈｏｒｔＱｕｅｒｙＬｏｏｋｕｐを用いて基準ゲノムに対する配列包括度を作成するために使用されたが、それは基準ゲノムのｋマー（Ｋ＝１２）の辞書の作成、および、ゲノム中のマッチするｋマーの位置に基づくリードの候補位置に対する局所的Ｓｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントの実行に基づく。前記アライナーはマルチプル・プレイスメントを実行する。最良のアラインメントは多くとも１誤差を有することが可能であり、そして、最良のアラインメントの誤差数と１まで異なるアラインメントもまた許容される。包括度は、リードがアラインする位置の数で除算することにより正規化される（例えば、１つのリードが４か所にアラインする場合、その４か所の塩基のそれぞれに０．２５が加えられる）。
標的ピークを得るために、次の方法論が使用された。トランスクリプトームの野生型の包括度がＥｚｈ２−／−トランスクリプトームの包括度の少なくとも３倍濃縮されており、そして、少なくとも０．４の最小ＲＰＫＭ包括度を有する領域の塩基レベルのマウス（ｍｍ９）包括度ファイルが出発点として働く。その包括度はストランド特異的である。次に、１００ｂｐ長の非重複的連続ウインドウにおいて、ピーク値とそれらの位置が決定される。次に、ピーク位置は、ウインドウのエッジにあり、より大きいピークの側にあると判断されるピークについて補正される。それらのピークはより大きいピークの先端に移動される。次に、重複したピーク位置が除去される。平坦域にあるピーク位置は平坦域の中央に移動される。次に、σ＝５．０であるＧａｕｓｓカーネル
を用いて包括度が平滑化される。次に、平滑化した包括度が最大包括度の３分の１以下であるように最も近位の位置をピークに置くことによりピーク幅が決定される。ピーク間の中央点でそれらの間に境界を置くことにより、互いに重なり合う隣接するピークが分離される。
次に、位置、幅、最大振幅、およびピークの幅の下にある未平滑化包括度の合計と共にピークが表に出力される。ｍｍ９におけるマウスピークの対応するヌクレオチド配列（ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される）は配列表に配列番号２１５８３〜１２４４３６または配列番号１９０７１７〜１９０９３３として現れる。これらのマウスピークのマウス染色体座標および染色体鎖のマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒが、本明細書において記載されるようにＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて実行されて、オルソロガスなヒト染色体座標を作成した。この処理とＬｉｆｔＯｖｅｒチェーンは Kent et al., Proc. Nat’l Acad. Sci., 100(20) 11484-11489 (2003)に全般的に記載されている。各マウスピークのマウス座標（ｍｍ９）が対応するヒト（ｈｇ１９）座標に変換されたとき、マッチが起きたときはいつでも、５０、６５、７５および９５のマッピングパーセンテージにより基本的に同一の位置および長さの結果がもたらされた。結果として、５０％のマッピングパラメータを使用した。
対応するヒトピークＲＮＡ配列（すなわち、ＴをＵで置換することによりＲＮＡに変換される、ヒト染色体座標と染色体鎖のヌクレオチド配列）はそれぞれ配列表に配列番号１２４４３７〜１９０７１６または配列番号１９０９３４〜１９１０８６として現れる。ＰＲＣ２結合ＲＮＡによって標的とされる遺伝子（すなわち、インターセクティング遺伝子またはニアバイ遺伝子）を同定するために、これらのヒトピークとヒトＰＲＣ２トランスクリプトーム（すなわち、表１〜７において言及されるＰＲＣ２結合転写物のヒト配列）をＮＣＢＩデータベースに由来する既知の遺伝子とインターセクトした。
表８はマウスピークおよびヒトピークの注釈と各ピークに近い、または各ピークとインターセクトした遺伝子の名前を示す。ヒト遺伝子（１番目に記載される）またはマウス遺伝子（２番目に記載される）と関連する唯一のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤが遺伝子名に隣接する括弧の中に表される。ピーク座標と遺伝子座標の間のオーバーラップの程度が角括弧の中に表される。正の数は２つの間でオーバーラップするヌクレオチドの数を示し、そして、負の数は２つの間でのサイズのギャップ（すなわち、２つの間で離れているヌクレオチドの数）を表す。ピークについて、角括弧内の「Ｆ」は、ピーク座標が遺伝子座標と完全に重なることを示す。ピークについて、角括弧内の「Ｆ」は、転写物座標が遺伝子座標と完全に重なること、またはその逆を示す。ＲＮＡ転写物またはピークは「逆鎖」列中の基準遺伝子に対して「アンチセンス」であるが、ＲＮＡ転写物またはピークは「同鎖」列中の基準遺伝子と同じ「センス」方向である。
平均的なピークは、阻害性核酸の最初の設計に良好なサイズである、約４０〜６０塩基であることがバイオインフォマティクス分析により示される。表２のマウストランスクリプトームにおいて１００，０００を超えるピークが特定された。これらのピークのそれぞれは、別表Ｉに由来するオーバーラップする逆相補リードの断片に対応するので、別表Ｉの逆相補リードによって完全に表される。センス方向でもアンチセンス方向でも、コーディング遺伝子内のどの位置でもピークを見出すことができる。プロモーター／５’ＵＴＲ領域、イントロン、内部エクソンおよび３’ＵＴＲなどにピークを見出すこともできる。ＰＲＣ２相互作用転写物はタンパク質コードｍＲＮＡではなく、別個の転写物またはｍＲＮＡ配列とオーバーラップする転写物であることが解析により強く示唆される。多くがそれまで記載がない新規のＲＮＡである。
充分な特異性を持って標的の位置または断片に結合するか、所望の効果をもたらすように標的ＲＮＡに対して充分に相補的である阻害性核酸を設計するために日常の方法を用いることができる。いくつかの実施形態において、前記方法には二次構造、例えば、１つ、２つ、またはそれ以上のステムループ構造またはシュードノットの領域を特定するための当技術分野において公知のバイオインフォマティクス方法を用いること、および阻害性核酸を用いてターゲティングするための領域を選択することが含まれる。
ピーク内の少なくとも５連続ヌクレオチドを含むかそれに直に隣接する、５〜５００ヌクレオチドの長さ、または約５〜約１００ヌクレオチドの長さのさらなる標的断片が同様にターゲティングに適切であると考えられる。
実施例９．ｍＲＮＡ発現の発現増加に対する阻害性オリゴヌクレオチドのインビトロでの効果
Ａ．ＡｐｏＥ
ＡｐｏＥの発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように阻害性オリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドは１６塩基未満の長さであり、非修飾型ＤＮＡと複数のロックド核酸修飾型塩基を含み、全てチオリン酸エステル結合によって連結された。以下に簡単に述べるように形質移入とデータ解析を行った。
デオキシリボヌクレアーゼ工程を省いてＰｒｏｍｅｇａ ＳＶ９６全ＲＮＡ単離システムを使用してＨｅｐ３Ｂ細胞からＲＮＡを収集した。別のパイロット実験で５０ｎｇのＲＮＡが逆転写酵素反応に充分な鋳型である判断された。Ｈｅｐ３Ｂ細胞から収集されたＲＮＡが正規化され、５０ｎｇのＲＮＡが各逆転写反応に投入された。この限界に達するには非常に希釈されていた少数の試料については、最大限の投入量が付加された。次に、定量的ＰＣＲ評価を完結した。
先に概説したように、定量的ＰＣＲによりベースラインレベルのＡｐｏＥ ｍＲＮＡの発現を決定した。恒常的に発現している様々なハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡについてもベースラインレベルを決定した。ＡｐｏＥ ｍＲＮＡとおよそ同じレベルのベースライン発現を有する「対照」ハウスキーピング遺伝子がＡｐｏＥとの比較目的のために選択された。
２４ウェルプレートの各ウェルに５００μＬ当たり２５，０００細胞の密度でＨｅｐ３Ｂ細胞を蒔き、そして、リポフェクタミンおよび阻害性オリゴヌクレオチドを用いて形質移入を行った。対照ウェルはリポフェクタミンのみを含んだ。形質移入後４８時間で、約２００μＬの細胞培養上清をＥＬＩＳＡ用に−８０℃で保存した。形質移入後４８時間で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞からＲＮＡを収集し、そして、先に概説したように定量的ＰＣＲを行った。対照（リポフェクタミンのみ）の存在下でのｍＲＮＡレベルに対して阻害性オリゴヌクレオチドが存在下でのｍＲＮＡレベルを正規化することにより各阻害性オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＥ ｍＲＮＡ発現の誘導率が決定された。「対照」ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現の上昇と並べてこれを比較した。
試験した総計２６オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１５０５０に対して相補的であった。これらの２６オリゴヌクレオチドのうち、７オリゴヌクレオチドが、「対照」ハウスキーピング遺伝子と比較したＡｐｏＥ ｍＲＮＡレベルの増加により示されるように、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてａｐｏＥの発現を増加させた。
ヒト近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を使用して上記の方法を繰り返した。表２の配列番号１５０５０に対して相補的な２６オリゴヌクレオチドのうち、５オリゴヌクレオチドが腎臓細胞において、「対照」ハウスキーピング遺伝子と比較して、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡレベルを増加させた。レベルはベースライン発現に対して約１．５〜約５倍増加した。
さらに、ａｐｏＥに関連する表８のピークに対して相補的である１１オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドがａｐｏＥの発現を増加させた。
わずか８ヌクレオチド長の阻害性オリゴヌクレオチドが遺伝子発現を増加させることが示された。
Ｂ．Ｎｋｘ２‐１
Ｎｋｘ２‐１の発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計された阻害性オリゴヌクレオチドについて、上記の実施例９Ａに記載されるように実験を繰り返した。試験した総計１３オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１７０４０に対して相補的であった。これらの１３オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドが、ベースラインと比較したＮｋｘ２‐１ ｍＲＮＡ発現の上昇により示されるように、Ｎｋｘ２‐１の発現を増加させたが、「対照」ハウスキーピング遺伝子はＮｋｘ２‐１と、低いレベルの本来の発現のため、つき合わせることができなかった。さらに、Ｎｋｘ２‐１に関連する表８のピークに対して相補的である９オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドがＮｋｘ２‐１の発現を増加させた。
Ｃ．Ｂｒｃａ１
Ｂｒｃａ１の発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計された阻害性オリゴヌクレオチドについて、上記の実施例９Ａに記載されるように実験を繰り返した。試験した総計３０オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１９２，３０９および配列番号１９２，９６５に対して相補的であった。これらの３０オリゴヌクレオチドのうち、５オリゴヌクレオチドがＢｒｃａ１の発現を増加させた。これらの３０オリゴヌクレオチドのうち、１３オリゴヌクレオチドがまた、Ｂｒｃａ１に関連する表８のピークに対して相補的であった。これらのピークに対して相補的な１３オリゴヌクレオチドのうち、２オリゴヌクレオチドがＢｒｃａ１の発現を増加させた。レベルはベースライン発現に対して約２〜約３倍増加した。
Ｄ．Ｓｍａｄ７
Ｓｍａｄ７の発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計された阻害性オリゴヌクレオチドについて、以下を例外として上記の実施例９Ａに記載されるように実験を繰り返した。腎臓細胞株ＲＰＴＥＣをＨｅｐＢ３の代わりに使用した。試験した総計２８オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１８６０２に対して相補的であった。これらの２８オリゴヌクレオチドのうち、４オリゴヌクレオチドがＳｍａｄ７の発現を増加させた。さらに、Ｓｍａｄ７に関連する表８のピークに対して相補的である２８オリゴヌクレオチドのうち、４オリゴヌクレオチドがＳｍａｄ７の発現を増加させた。
Ｅ．ＳｉｒＴ６
ＳｉｒＴ６の発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計された阻害性オリゴヌクレオチドについて、上記の実施例９Ａに記載されるように実験を繰り返した。試験した総計２５オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１９２，１８２に対して相補的であった。これらの２５オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドがＳｉｒＴ６の発現を増加させた。試験した総計２オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１３０，６９４に対して相補的であった。これらの２オリゴヌクレオチドのうち、１オリゴヌクレオチドがＳｉｒＴ６の発現を増加させた。試験した総計２オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１３０，６９５に対して相補的であった。これらの２オリゴヌクレオチドのうち、どちらもＳｉｒＴ６の発現を増加させなかった。レベルはベースライン発現に対して２〜６倍増加した。さらに、ＳｉｒＴ６に関連する表８のピークに対して相補的である６オリゴヌクレオチドのうち、１オリゴヌクレオチドがＳｉｒＴ６の発現を増加させた。
Ｆ．Ｓｅｒｐｉｎｆ１
Ｓｅｒｐｉｎｆ１の発現を増加させるために表８に示されるようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計された阻害性オリゴヌクレオチドについて、上記の実施例９Ａに記載されるように実験を繰り返した。試験した総計３８オリゴヌクレオチドが表２の配列番号１６６９８および配列番号１６６９９に対して相補的であった。これらの３８オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドがＳｅｒｐｉｎＦ１の発現を増加させた。レベルはベースライン発現に対して１．２〜２倍増加した。さらに、Ｓｅｒｐｉｎｆ１に関連する表８のピークに対して相補的である３２オリゴヌクレオチドのうち、３オリゴヌクレオチドがＳｅｒｐｉｎＦ１の発現を増加させた。
実施例１０．ＸｉｓｔリピートＣを標的とするＬＮＡ分子がＸｉ染色体からＸｉｓｔ ＲＮＡを急速に排除する
Ｇｅｎｅｉｏｕｓ (Drummond et al., (2010) Geneious v5.1、 geneious.comにおいてインターネットにより入手可能）を使用してリピートＣをアラインさせ、そして、高い程度のリピート間保存性を有する２つの領域に対するＬＮＡ分子を合成した（図１５Ａ）。第１のＬＮＡ分子は１４リピートすべてに保存性を示し（ＬＮＡ‐Ｃ１）、そして、第２のＬＮＡ分子は１４リピートのうちの１３リピートに保存性を示した（ＬＮＡ‐Ｃ２）（図１５Ａ）。形質転換したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）にＬＮＡ分子を別々にヌクレオフェクトし、そして、その細胞をスライドクラス上に接着させ、そして、ヌクレオフェクション後の０分（ヌクレオフェクション直後）と８時間の間の様々な時点で細胞をインサイチュで固定した。Ｘｉｓｔ ＲＮＡへの効果を調査するため、Ｘｉｓｔ特異的プローブを使用してＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実行した。（ＭＥＦ細胞は形質転換のため四倍体である。各四倍体細胞は２本のＸａ染色体と２本のＸｉ染色体を有する）。スクランブルＬＮＡ分子（ＬＮＡ‐Ｓｃｒ）で形質移入した対照では、強固なＸｉｓｔのもやが全ての時点で８０〜９０％の細胞で見られた（図１５Ｃ）。興味深いことに、ＬＮＡ‐Ｃ１かＬＮＡ-Ｃ２のどちらかの導入によりＸｉ染色体からのＸｉｓｔ ＲＮＡの急速な消失がもたらされた（図１５Ｂ；ＬＮＡ‐Ｃ１が示される。ＬＮＡ‐Ｃ１およびＬＮＡ‐Ｃ２について同様の結果である。）。０時点でさえ（ＬＮＡ導入直後、数秒から数分の間に固定された細胞）、約１０％の核がほぐれたＸｉｓｔ ＲＮＡのクラスターを示し、そのクラスターはぼんやりとして拡散しているように見えた（図１５Ｃ、最も薄い灰色の棒）（ｎ＝１４９）。完全なＸｉｓｔのもやを有する核のパーセンテージは最初の１時間の間減少し続け、６０分で最小に達した（２１％、ｎ＝１９０）。これらの発見は、ＬＮＡ分子が導入されて直ぐにＸｉｓｔのクロマチンへの結合を乱したことを示す。しかしながら、未分化の胚性幹（ＥＳ）細胞に見られる新生転写物に典型的なＸｉｓｔ ＲＮＡのピンポイントが３時間で見えたので（図１５Ｃ、最も濃い灰色の棒）（１時間の時点では１８％、ｎ＝１９０；３時間の時点では３６％、ｎ＝１２３）、Ｘｉ染色体からのＸｉｓｔの消失は一過性のものであった。Ｘｉｓｔのもやの完全な回復はヌクレオフェクション後８〜２４時間まで見られなかった（８時間で８１％、ｎ＝１１７）。
次の実験は、細胞が培養中に分化するとき、ＸＣＩを再び繰り返す、確立された生体外モデルであるマウスＥＳ細胞において同様の効果をＬＮＡ分子が持つかどうかという問題を扱った。未分化状態では、野生型雌性ＥＳ細胞は、ＲＮＡ ＦＩＳＨによってピンポイントシグナルとして認められる低レベルのＸｉｓｔ ＲＮＡを発現する。分化誘導第６日までに、約４０％の細胞で、通常、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの発現があるであろう。第６日にＥＳ細胞がＬＮＡ‐Ｃ１でヌクレオフェクトされたとき、Ｘｉｓｔの排除が急速に起き、１時間で最大に達し、そして、８時間までに回復した。したがって、ＬＮＡ分子はＥＳ細胞ならびに体細胞で有効であった。これらの結果は、同じＸｉｓｔの領域に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡでヌクレオフェクトされたＭＥＦから得られた結果と鋭く契約と結んだ。ｓｉＲＮＡもｓｈＲＮＡも１、３または２４時間での時点ではＸｉｓｔの消失をもたらさず、４８時間の時点でのみＸｉｓｔのもやの部分的な減少が起きた（１時間で８３％、ｎ＝８４；２４時間で８０％、ｎ＝１０６）。したがって、複数の細胞種でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの作用よりもずっと速い、非常に速い動態でＸｉｓｔなどの長鎖細胞核性非コードＲＮＡを効率的に標的とするために、ＬＮＡ分子を使用することができる。
ＬＮＡ分子の特異性を試験するために、リピートＣ ＬＮＡ分子でヒト２９３細胞をヌクレオフェクトした。マウスとヒトのＸｉｓｔ／ＸＩＳＴ間の配列比較により、ＬＮＡ‐Ｃ１により標的とされる領域は１５ヌクレオチド中１０ヌクレオチドが保存されており、ＬＮＡ‐Ｃ２については１４ヌクレオチド中１０ヌクレオチドが保存されていることが明らかになった（図１５Ｃ）。ヒト細胞でのスクランブルＬＮＡ分子のヌクレオフェクションに続くＸＩＳＴ ＲＮＡ ＦＩＳＨによりほぼ全ての細胞で２つの正常なＸＩＳＴのもやが示された（９２％、ｎ＝１０８）。同様に、ＬＮＡ‐Ｃ１かＬＮＡＣ‐２のどちらかでのヌクレオフェクションではＸＩＳＴのもやが変化しなかった（ＬＮＡ‐Ｃ１、８９％、ｎ＝１２６；ＬＮＡ‐Ｃ２、８５％、ｎ＝１３９）。したがって、マウスリピートＣのＬＮＡ分子はヒトＸＩＳＴの局在に影響せず、これは、それらが種特異的に機能することを示唆する。ヒトリピートＣがヒトＸＩＳＴを排除することができるか判定するために、我々はヒトリピートＣに対して相補的なＬＮＡ分子を２９３細胞にヌクレオフェクトしたが、ＸＩＳＴのもやの消失を観察することはなかった（１時間で９１％、ｎ＝１０３；３時間で８７％、ｎ＝９５、そして、８時間で９２％、ｎ＝８５）。この発見は、リピートＣはヒトにおいて役割を果たすかもしれないが、ＲＮＡの局在化に別のヒトの要素が機能することを示している。マウスのリピートＣは１４回存在するが、ヒトのリピートは１回のみ存在する（８、９）。
実施例１１．Ｘｉｓｔ ＲＮＡは転写物を不安定化することなく排除される
いくつかの機序でＸｉｓｔの消失を説明できるであろう。ＬＮＡ分子は相補領域にアニールし、そして、分解のためにＸｉｓｔを標的とし得るだろう。あるいは、ＬＮＡ分子に対するハイブリダイゼーションが転写物の安定性に影響することなくＸｉ染色体からＸｉｓｔ ＲＮＡを排除することができるのであろう。これらの可能性を区別するために、様々な時点でｑＲＴ‐ＰＣＲによりＧａｄｐｈレベル（対照）に相対的なＸｉｓｔレベルを定量した。Ｘｉｓｔのもやがもはや見えなかった１時間の時点では、Ｘｉｓｔレベルはスクランブル対照で見られるレベルに匹敵していた（図１６）。３時間および８時間の時点でさえ、Ｘｉｓｔレベルはあまり変化しなかった。これらの結果により、Ｘｉｓｔの排除はＲＮＡを完全に分解することなく起きることが示された。したがって、ＬＮＡ分子は、ＲＮＡの安定性を変化させるというよりもＸｉｓｔのクロマチンとの相互作用を妨害することにより機能する。
Ｘｉｓｔの急速な排除と回復のゆっくりとした動態によって、Ｘｉｓｔの局在化の機序に関する未だ解答されていない問題を調査する機会が提供された。Ｘｉ染色体上のＸｉｓｔの再出現は排除されたＸｉｓｔ分子の再局在化によるのか、それとも新しく合成されたＲＮＡのコーティングによるのか問うために、我々はＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害剤であるアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下でタイムコース解析を実行した。細胞でのＸｉｓｔの半減期は約４〜６時間であることが以前の研究により示されている（１４〜１６）。０〜８時間のＡｃｔＤでの細胞処理がこの時間枠の間、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの新規の合成を妨げ、それ故、Ｘｉｓｔのもやの再出現は排除されたＲＮＡのＸｉ染色体への再局在を意味するということが論理的に考えられた。ＬＮＡ分子が細胞に導入され、次に、ＡｃｔＤを含む培地中でその細胞が回復するに任せた。スクランブル対照では、ＡｃｔＤを用いない全ての時点でＸｉｓｔのもやが明らかに認められた。ＡｃｔＤを用いると、Ｘｉｓｔのもやは１時間と３時間の時点では明白であったが、８時間までに消失した。これは４〜６時間の半減期と一致する。ＬＮＡ‐Ｃ１またはＬＮＡ‐Ｃ２処理試料がＡｃｔＤ無しで回復するに任され、Ｘｉｓｔのピンポイントが３時間で認められ、そして、８時間の時点までにＸｉｓｔのもやが復元された。しかしながら、ＡｃｔＤを用いると、Ｘｉｓｔのもやは、全体的にも部分的にも、決して復元しなかった。したがって、Ｘｉ染色体からのＬＮＡ分子介在性排除の後のＸｉｓｔの回復は新規のＲＮＡ合成によるものであり、排除された転写物の再局在によらない。
実施例１２．Ｘｉｓｔ ＲＮＡは最初にＸ染色体不活性化センター近傍で局在化する
急速な排除とゆっくりとした回復をさらに利用して、Ｘｉｓｔは小刻みに広がるのか、それともＸｉ染色体上に一度に局在するのかという長きにわたる問題を問うた。１つの仮説は、コーティングはＸｉｓｔ遺伝子座近傍で始まり、Ｘ（１７）に局在するブースターエレメントを介して染色体の両端に向かって進行するというものである。あるいは、局所的な拡散を促進するであろう複数のＸ連鎖シーディング点を介してコーティングが一度に起こり得る。３〜８時間の回復の期間で中期染色体でのＸｉｓｔの局在が解析された。スクランブルＬＮＡ分子で処理された細胞では、Ｘｉｓｔ ＲＮＡで覆われた全ての中期染色体はこれまでの研究（１８〜２０）に記載される不均一パターンと類似のバンドパターンを示した。対照的に、ＬＮＡ‐Ｃ１処理細胞は中間のパターンをもたらした。１時間の時点では、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの被覆を示す中期染色体はなかった（０％、ｎ＝４１）。間期の細胞でピンポイントとしてＸｉｓｔ ＲＮＡを見ることができた３時間の時点では、中期染色体の真ん中にある１本の明るいバンドとＸ染色体上のどこかにある少数の非常にかすかなバンドの組合せが主なパターンであった（５２％、ｎ＝４６）。Ｘｉｓｔ ＲＮＡは最初は局所的に結合するということをこの結果は示唆した。高い強度のＲＮＡバンドがＸｉｓｔ領域に局在するのかどうか判定するために、Ｘｉｓｔ ＲＮＡ ＦＩＳＨが非変性細胞核に対して行われ、続いて変性とＸｉｓｔプローブへのハイブリダイゼーションが行われた。実際に、３時間の段階での限局性のＲＮＡバンドはＸｉｓｔ領域と共存した。５時間の時点では、中程度のコーティングと強度を見ることができた（６８％、ｎ＝３８）。８時間の時点では、対照細胞に典型的な染色体全体のペインティングパターンが主なパターンであった（７８％、ｎ＝３８）。対照では、中間のパターンはいずれの時にも観察されなかった。これらの発見は、Ｘｉｓｔ ＲＮＡが、ＦＩＳＨ技術の時間的および空間的解像度の範囲で、最初、近くに結合するが同時にＸｉ染色体の残りの部分に拡がるように見えることを示す。
実施例１３．Ｘｉｓｔ ＲＮＡの排除はＰＲＣ２の局在の消失を伴う
Ｘｉ染色体に結合するポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）のパターンが、そのＥｚｈ２サブユニットがリシン２７でのヒストンＨ３のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を触媒するので、特に興味深い。ＥＳ細胞でのＸｉｓｔの欠失が細胞分化の間のＰＲＣ２のリクルートを不可能にし、そして、ＭＥＦ細胞でのＸｉｓｔの条件的欠失がＸｉ染色体上のＰＲＣ２の消失をもたらすので（２１〜２４）、ＰＲＣ２がＸｉ染色体にＸｉｓｔ依存的に局在することがいくつかの研究により示されている。しかしながら、ＰＲＣ２がＸ染色体にリクルートされ、そして、Ｘ染色体から消失する動態は分かっていない。Ｘｉｓｔ ＲＮＡはＰＲＣ２を直接リクルートするので（１２）、ＬＮＡ分子介在性のＸｉｓｔの排除がＰＲＣ２の即時の消失をもたらすか、ＬＮＡ分子の送達後にＭＥＦでＥｚｈ２を免疫染色することにより問うた。リピートＣのＬＮＡ分子で処理すると、Ｅｚｈ２が急速に消失した。ＸｉｓｔとＰＲＣ２の消失の間にはほぼ完ぺきな一致が存在した。１時間と３時間の時点で、Ｘｉｓｔが消失した細胞核ではＥｚｈ２のフォーカスは決して観察されず、逆に、Ｘｉｓｔのもやが復元した細胞核では常に観察された。Ｘｉ染色体上でのＥｚｈ２の消失はＥｚｈ２タンパク質の代謝回転によるものであった（下記のウェスタン分析を参照のこと）。しかしながら、１〜８時間の時間枠内で、ＰＲＣ２の一過的な排除は明らかなＨ３Ｋ２７ｍｅ３の消失には至らない。したがって、Ｘｉ染色体へのＰＲＣ２の局在は、最初のターゲティングとＸＣＩが確立した後の安定的な結合の両方について、絶対的にＸｉｓｔ ＲＮＡに依存するが、ＸｉｓｔとＰＲＣ２が排除されるとき、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークは短い期間では安定している。
これを考慮して、ＬＮＡがジーンサイレンシングに影響するかどうかを問うた。Ｘｉｓｔの排除が最大になる３時間の時点で、ＸｉｓｔとＸＣＩを受ける２つのＸ連鎖遺伝子であるＰｇｋ１かＨｐｒｔのどちらかについてＲＮＡ ＦＩＳＨを実行した。対照ヌクレオフェクト（ＬＮＡ‐Ｓｃｒ）細胞では、ＸｉｓｔのもやがＸｉ染色体から観察され、新生Ｐｇｋ１転写物または新生Ｈｐｒｔ転写物がＸａ染色体から観察された。対照の７９％（ｎ＝３９）およびＬＮＡ‐Ｃ１処理細胞の８０％（ｎ＝３６）でＰｇｋ１転写物の２つのフォーカスがなお見られ、そして、対照の８４％（ｎ＝４４）およびＬＮＡ‐Ｃ１処理細胞の７９％（ｎ＝３５）でＨｐｒｔ ＲＮＡの２つのフォーカスが見られるように、ＬＮＡ‐Ｃ１とＬＮＡ‐４９７８でのヌクレオフェクションは発現パターンを変えなかった。Ｐｇｋ１転写物またはＨｐｒｔ転写物の４つのフォーカスは決して見られなかった。したがって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の保持と一貫して、ＸｉｓｔおよびＰＲＣ２の一過的な消失によってサイレンシングは乱されなかった。
実施例１４．リピートＣの周辺の広いドメインがＸｉｓｔの局在に必要である
次の実験でＸｉｓｔ内の他の保存的リピートを調べた。リピートＡはＰＲＣ２のターゲティングに必須であることが既に示されているので、リピートＢ、ＥおよびＦに実験の焦点を当て、そして、いずれかのリピートを個々に、または、組み合わせてターゲティングしてもＸｉｓｔの局在は影響を受けないことを見出した（図１７Ａ）。ＬＮＡ‐７２６（リピートＡとＦの間）、ＬＮＡ‐４９７８およびＬＮＡ‐５２０５（リピートＣとＤの間）およびＬＮＡ‐３’（Ｘｉｓｔの遠位末端）（図１７Ａ）を含む、Ｘｉｓｔのユニークな保存的領域もまた試験した。リピートＣの２８０ｂｐ下流に位置する１５ヌクレオチドのエレメントに対応するＬＮＡ‐４９７８を例外として、Ｘｉｓｔの局在に影響するものはなかった。ＬＮＡ‐４９７８はＬＮＡ‐Ｃ１／Ｃ２に類似する効果をもたらしたが、そのよりゆっくりとした動態という点で異なった。１時間の時点では、Ｘｉｓｔのもやはなお認められたが、ぼんやりとして拡散しているように見えた（７８％、ｎ＝１２５）。３時間の時点ではもやの数は最小になった（２５％、ｎ＝１５８）。８時間の時点では、Ｘｉｓｔは小さいピンポイントとして認められた（３９％、ｎ＝１２３）。２４時間の時点まで回復は完了しなかった。リピートＣのＬＮＡ分子については、Ｘｉｓｔの消失は、ｑＲＴ‐ＰＣＲにより判定されたように、ＲＮＡの代謝回転によるものではなく（図１７Ｂ）、そして、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に影響することなく、または、Ｅｚｈ２タンパク質レベルを変えることなくＥｚｈ２が排除される（図１７Ｃ）。したがって、Ｘｉｓｔのクロマチンへの局在にはリピートＣとそのリピートの直下のユニークな領域の両方を包含する広い領域が関与する。
２つのモチーフが協働するか判定するために、ＭＥＦにＬＮＡ‐４９７８とＬＮＡ‐Ｃ１を別々に、または一緒にヌクレオフェクトした。予想通り、ＬＮＡ‐Ｃ１のみでの処理の結果、１時間までにＸｉｓｔ ＲＮＡが消失し、そして、３時間の時点で回復が始まり、ＬＮＡ‐４９７８での処理は、それぞれ、３時間と８時間の時点での消失と回復を示した。両方のＬＮＡ分子での処理はＸｉｓｔ消失のウィンドウを拡張した。Ｘｉｓｔ ＲＮＡとＥｚｈ２の消失が（ＬＮＡ‐Ｃ１のみの場合のように）１時間までに観察され、そして、回復は（ＬＮＡ‐４９７８のみの場合のように）８時間の時点まで始まらなかった。したがって、Ｘｉｓｔ消失の時間窓を拡張すること以外に効果が増大されることはなかったので、ＬＮＡ分子の効果は、相乗的ではなく、相加的であった。
実施例１５．ＬＮＡ分子ヌクレオフェクション後のＥｚｈ２の回復はゆっくりとしているが、Ｘｉ染色体に沿って均一である
最後に、回復期でのＸｉｓｔ ＲＮＡの小刻みの再局在化の直ぐ後にＸｉ染色体へのＥｚｈ２の再ターゲティングが続くのかどうか問うた。ＰＲＣ２は全般的にプロモーターの近傍に結合するので（２５、２６）、Ｘ染色体上の遺伝子のプロモーターでのＥｚｈ２の局在が定量的クロマチン免疫沈降により解析された（ｑＣｈＩＰ）（図１８Ａ）。雌性細胞は２本のＸ染色体を持ち、そして、抗体によりプルダウンされるＥｚｈ２エピトープは理論的にはＸａ染色体かＸｉ染色体に由来し得るが、ほとんどのＥｚｈ２とＨ３Ｋ２７ｍｅ３はＸｉ染色体に結合しているということを示す証拠がある（２１〜２４）。実際、Ｅｚｈ２はＸｉ染色体上のサイレンシングを受ける遺伝子（例えば、Ｘｍｒ、Ｐｇｋ１）のプロモーターで濃縮されたが、ＸＣＩを免れる遺伝子（例えば、Ｊａｒｉｄ１ｃ）のプロモーターでは濃縮されなかった（図１８Ｂ）。次に、ＬＮＡ‐Ｃ１でＭＥＦ細胞をヌクレオフェクトし、そして、１時間と２４時間の間で抗Ｅｚｈ２抗体を用いてｑＣｈＩＰを実行した。１時間の時点では、試験した標的遺伝子プロモーター全てでＥｚｈ２レベルがバックグラウンドレベルにまで劇的に低下したが（図１８Ｃ）、これは、Ｘｉ染色体でのＸｉｓｔの排除のすぐ後にプロモーター結合Ｅｚｈ２の消失が続いたことを示す。３時間および８時間の時点では、全ての遺伝子にわたってＥｚｈ２レベルが徐々に、均一に増加し、８時間の時点までに多くの遺伝子でＥｚｈ２が飽和量に達したように見えた。０時間の時点で最高レベルのＥｚｈ２を有するプロモーターでは（図１８Ｂ）、Ｅｚｈ２レベルは２４時間まで完全には回復しなかった（図１８Ｃ）。したがって、ＣｈＩＰプルダウン物の起源は、ほぼ独占的ではないにしても、主にＸｉ染色体であると予想された。対照的に、公知の常染色体上のＰＲＣ２の標的であるＥｎ１対照（２７）でのＥｚｈ２レベルはあまり変化しなかった（図１８Ｄ）。したがって、Ｅｚｈ２レベルはＸｉ染色体全体を通じて同様の動態で増減する。１時間と８時間の間でのＸｉｓｔ ＲＮＡとＥｚｈ２の結合の消失は、その間に新しいエピジェネティック状態を達成するために細胞が再プログラム化され得るであろう好機を提供する。
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実施形態の例
本明細書に記載の実施形態の例として、以下を含むがそれらに限定されない。
１．細胞核性リボ核酸（ｎＲＮＡ）のプールに相補的な複数の有効なｃＤＮＡを調製する方法であって、
細胞核性リボ核酸を含む試料、例えば、核タンパク質に結合するｎＲＮＡを含む核溶解物を含む試料を提供し、
試料と、物質、例えば、ｎＲＮＡがタンパク質に結合したままといった、物質とタンパク質との間で複合体を形成するために十分な条件下において、例えばＥｚｈ２、Ｇ９ａまたはＣｂｘ７の細胞核性リボ核酸に結合することが知られ、または疑われる核タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させ、
複合体を単離し、
ｎＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡの初期の集団を提供し、
任意で、鎖特異的プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、
ｃＤＮＡの初期集団を精製し、例えば、長さが少なくとも２５、５０、１００、１５０または２００ｎｔなどの長さが少なくとも約２０ヌクレオチド（ｎｔ）であるｃＤＮＡの精製集団を得、
ｃＤＮＡの精製集団の少なくとも一部または実質的に全てを配列決定し、
信頼性の高い配列と基準ゲノムを比較し、基準ゲノムの配列に対して高い同一性を有する、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％同一性を有する、または１０、５、２または１より少ないミスマッチを有する配列を選択し、
（ｉ）所望の閾値以上の百万のリード毎のキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）および（ｉｉ）対照ライブラリー（例えば、タンパク質−ヌルライブラリーまたはパラレルに行われたＩｇＧプルダウンから作製されたライブラリー）と比較した場合増加しているこれらのｃＤＮＡを選択し、
それによりｃＤＮＡのライブラリーを調製することを含む方法。
２．物質が抗体であり、複合体を単離することは、複合体を免疫沈降させることを含む、実施形態１の方法。
３．ｃＤＮＡが鎖特異的アダプターを使用して合成される、実施形態１の方法。
４．さらに実質的に全てのｃＤＮＡの配列決定を含む、実施形態１の方法。
５．実施形態１〜４の方法により調製された細胞核性リボ核酸（ｎＲＮＡ）のプールに相補的なｃＤＮＡのライブラリー。
６．ｃＤＮＡのそれぞれが個々に処理可能なビーズまたは基質上の領域に結合する、実施形態５のライブラリー。
７．表１、２、３、６および／または７に参照される配列を含む単離核酸またはその少なくとも２０ｎｔを含む断片。
８．細胞と、長鎖非コードＲＮＡもしくは表６に参照されるそのＰＲＣ２結合断片またはｌｎｃＲＮＡ配列に約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列あるいは表６に参照されるそのＰＲＣ２−結合断片を接触させることを含む、細胞の癌遺伝子の発現を減少させる方法。
９．癌遺伝子がｃ−ｍｙｃである、実施形態８の方法。
１０．長鎖非コードＲＮＡがＰｖｔ１である、実施形態９の方法。
１１．哺乳類動物に、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトｌｎｃＲＮＡに特異的に結合する抑制性核酸、もしくは表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡおよび／または表２の成長抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡあるいはオルソロガスであり、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、１００）ヌクレオ塩基に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である関連の天然由来のｌｎｃＲＮＡを、腫瘍抑制因子発現を増加させるために有効な量で投与することを含む、腫瘍抑制因子発現を増加させることを、それを必要とする哺乳類動物、例えばヒトにおいて行う方法。
１２．哺乳類動物に、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトｌｎｃＲＮＡに特異的に結合する抑制性核酸、もしくは表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡおよび／または表２の成長抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡあるいはオルソロガスであり、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、５０、７０、１００）ヌクレオ塩基に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である関連の天然由来のｌｎｃＲＮＡを、腫瘍増殖を抑制または阻害させるために有効な量で投与することを含む、癌を有する哺乳類動物、例えばヒトの腫瘍増殖を阻害または抑制する方法。
１３．哺乳類動物に、表７の腫瘍抑制因子遺伝子座に対応するヒトｌｎｃＲＮＡに特異的に結合する抑制性核酸、もしくは表１のインプリント遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡおよび／または表２の成長抑制遺伝子に対応するヒトｌｎｃＲＮＡあるいはオルソロガスであり、またはその少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、５０、７０、１００）ヌクレオ塩基に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である関連の天然由来のｌｎｃＲＮＡを、治療有効量で投与することを含む、癌を有する哺乳類動物、例えばヒトを処置する方法。
１４．抑制性核酸が一本鎖または二本鎖である、実施形態１１〜１３のいずれかの方法。
１５．抑制性核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡ、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである、実施形態１１〜１４のいずれかの方法。
１６．抑制性核酸が５〜４０塩基（例えば、１２〜３０、１２〜２８、１２〜２５）の長さである、実施形態１１〜１５のいずれかの方法。
１７．抑制性核酸が二本鎖であり、１つまたは両方の末端にオーバーハング（場合により、２〜６塩基の長さ）を含む、実施形態１４の方法。
１８．抑制性核酸が少なくとも８０％または９０％相補的な塩基配列（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０塩基または最大３０または４０）を含み、または１０、１５、２０、２５または３０塩基に対して最大３のミスマッチ（例えば、最大１または最大２のミスマッチ）を有する塩基配列を含む、実施形態１〜１７のいずれかの方法。
１９．細胞がインビトロまたはインビボ、例えば、対象の癌細胞、例えば腫瘍細胞である、実施形態８〜１８の方法。
２０．遺伝子がＮｋｘ２−１である、実施形態８〜１９の方法。
２１．長鎖非コードＲＮＡが、マウスゲノムアセンブリバージョンＮＣＢＩ３７／ｍｍ９（配列番号１９１０８８）のｂｐ５７６３６１００〜５７６３８２５０のマウス染色体１２またはヒトゲノムアセンブリバージョンＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９（配列番号１９１０８７）のｂｐ３６９８８５２１〜３６９９１７２２の染色体１４のヒトＮＫＸ２−１遺伝子座にある、実施形態２０の方法。
２２．細胞と、長鎖非コーディングＲＮＡもしくは表３に参照されるそのＰＲＣ２結合断片またはｌｎｃＲＮＡ配列に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同である核酸配列あるいは表３に参照されるそのＰＲＣ２結合断片を接触させることを含む、幹細胞の多様性を強化する方法。
２３．細胞と、表３に参照される長鎖非コードＲＮＡに特異的に結合する抑制性核酸を接触させることを含む、幹細胞の分化を強化する方法。
２４．幹細胞が胚性幹細胞である、実施形態２２または２３の方法。
２５．幹細胞がｉＰＳ細胞である、実施形態２２または２３の方法。
２６．腸管外投与のために、表１、２、６または７のｌｎｃＲＮＡ（の少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０塩基または最大３０もしくは４０塩基）に特異的に結合し、または少なくとも９０％相補的である抑制性核酸または表１、２、６または７のｌｎｃＲＮＡの少なくとも１５（例えば、少なくとも２０、２１、２５、３０、１００）ヌクレオ塩基に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である関連の天然由来のｌｎｃＲＮＡを含む滅菌組成物。
２７．抑制性核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物からなる群から選択される、実施形態２６の組成物。
２８．ＲＮＡｉ化合物が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ−誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）および低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）からなる群から選択される、実施形態２６の組成物。
２９．アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態２６の組成物。
３０．抑制性核酸が修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、修飾ヌクレオチドおよび／またはその組み合わせを含む１つ以上の修飾物を含む、実施形態２６〜２９のいずれかの組成物。
３１．修飾ヌクレオシド間結合がアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド酸、カルボキシメチルエステルまたはその組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３０の組成物。
３２．修飾糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分または二環性糖部分を含む、実施形態３０の組成物。
実施形態のさらなる他の例は以下を含むがそれらに限定されない。
１Ａ．長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）に相補的であり、特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）分子。
これらの実施形態に関して、ｌｎｃＲＮＡは、６０ｎｔ以上の長さ、例えば１００ｎｔ以上、例えば２００ｎｔ以上である内在性細胞ＲＮＡを含み、１００アミノ酸以上の長さのプラス鎖オープン・リーディング・フレームがなく、実験的証拠によりｌｎｃＲＮＡとして同定され、既知の（より小さな）機能的ＲＮＡクラス（リボソーム、転写因子および小核／核小体ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むがそれらに限定されない）と区別される。例えば、Lipovich et al., “MacroRNA underdogs in a microRNA world: Evolutionary, regulatory, and biomedical significance of mammalian long non-protein-coding RNA” Biochimica et Biophysica Acta (2010) doi:10.1016/j.bbagrm.2010.10.001; Ponting et al., Cell 136(4):629-641 (2009), Jia et al., RNA 16 (8) (2010) 1478-1487, Dinger et al., Nucleic Acids Res. 37 1685 (2009) D122-D126 （データベースの号）; およびその中に引用されている参照文献を参照のこと。ｌｎｃＲＮＡは長鎖ＲＮＡ、大分子ＲＮＡ、マクロＲＮＡ、遺伝子間ＲＮＡおよび非コード転写物とも呼ばれている。
２Ａ．ｌｎｃＲＮＡが大分子、遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、プロモーター関連短鎖ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、内在性アンチセンスＲＮＡまたはクロマチン修飾因子、例えばポリコーム複合体、例えばポリコーム抑制複合体２と結合するＲＮＡである、実施形態１Ａの分子。
３Ａ．ｌｎｃＲＮＡが核に局在する、実施形態１Ａの分子。
４Ａ．ＬＮＡ分子が公知のＲＮＡ局在モチーフを含むｌｎｃＲＮＡの領域に相補的である、実施形態１Ａの分子。
５Ａ．ＬＮＡが少なくとも１つのノンロックドヌクレオチドを含む、実施形態１Ａの方法。
６Ａ．ｌｎｃＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡに相補的であり、特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）分子を接触させることを含む、その同族結合配列から長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を解離する方法。
７Ａ．ｌｎｃＲＮＡと、ｌｎｃＲＮＡに相補的であり、特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）分子を接触させることを含む、その同族結合配列への長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の結合を減少させる方法。
８Ａ．ｌｎｃＲＮＡが大分子、遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、プロモーター関連短鎖ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、内在性アンチセンスＲＮＡまたはクロマチン修飾因子に結合するＲＮＡである、実施形態６Ａまたは７Ａの方法。
９Ａ．ｌｎｃＲＮＡが核に局在する、実施形態６Ａまたは７Ａの方法。
１０Ａ．ＬＮＡ分子が既知のＲＮＡ局在モチーフを含むｌｎｃＲＮＡの領域に相補的である、実施形態６Ａまたは７Ａの方法。
１１Ａ．ＬＮＡが少なくとも１つのノンロックドヌクレオチドを含む、実施形態６Ａまたは７Ａの方法。
実施形態のさらに他の例は以下を含むがそれらに限定されない。
１Ｂ．疾患の処置に使用のための、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）に結合することが知られるＲＮＡ、任意で配列番号１７０４０のＲＮＡまたは表１〜８のいずれかのＲＮＡあるいは配列番号１〜１９３０４９のいずれかのＲＮＡと特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸であって、処置はＲＮＡにより標的とされる遺伝の発現を調節することを含み、５〜４０塩基の長さであり、滅菌組成物として製剤される、抑制性核酸。
２Ｂ．５〜４０塩基の長さの抑制性核酸、任意でＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列に特異的に結合する一本鎖、任意で配列番号１７０４０のＲＮＡもしくは表１〜８のいずれかのＲＮＡまたは配列番号１〜１９３０４９のいずれかのＲＮＡを設計し、および／または合成するステップを含む、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）に結合することが知られているＲＮＡに特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を調製するプロセス。
３Ｂ．抑制性核酸を設計し、および／または合成する前に、さらにＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することを含む、実施形態２Ｂのプロセス。
４Ｂ．ＲＮＡがＰＲＣ２に結合するＲＮＡを特定することを含む方法により同定されている、実施形態２Ｂのプロセス。
５Ｂ．設計され、および／または合成された抑制性核酸の配列が、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列またはその一部に基づき、一部が１５〜１００連続塩基対の長さを有する、実施形態２Ｂのプロセス。
６Ｂ．設計され、および／または合成された抑制性核酸の配列が、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列に相補的であり、またはその一部に相補的である核酸配列に基づき、一部が５〜４０連続塩基対の長さを有する、実施形態２Ｂのプロセス。
７Ｂ．抑制性核酸が、疾患の処置に使用される医薬組成物または医薬品の製造に使用され、任意で、処置がＰＲＣ２に結合するＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、実施形態２Ｂ〜６Ｂのうちのいずれか１つのプロセス。
８Ｂ．配列番号１〜１９３０４９のうちのいずれか１つのＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することができる抑制性核酸を含む滅菌組成物。
９Ｂ．抑制性核酸が配列番号１〜１９３０４９のうちのいずれか１つのＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、処置がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、疾患の処置に使用のための抑制性核酸。
１０Ｂ．哺乳類動物に、配列番号１〜１９３０４９のうちのいずれか１つのＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的ある抑制性核酸を、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節するために有効な量で投与することを含む、遺伝子発現を調節する方法。
１１Ｂ．抑制性核酸が表１〜７の、例えば配列番号１〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、処置がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、疾患の処置に使用のための抑制性核酸。
１２Ｂ．抑制性核酸が表１〜７の、例えば配列番号１〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、ヒトＲＮＡ配列が（ａ）マウスからヒトゲノムまでの高度に保存された領域のマッピングによりまたはマウスからヒトゲノムまでのシンテニー位置のマッピング、例えばマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析により得ることができ、または（ｂ）マウスＲＮＡ配列に対して少なくとも１５塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０または１００塩基）に対して少なくとも９０％同一であり、処置がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、疾患の処置に使用のための抑制性核酸。
１３Ｂ．ヒトＲＮＡ配列が表１〜７の、例えば配列番号１２６０４〜２１５８２または１９１０８９〜１９３０４９に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つである、実施形態１２Ｂの抑制性核酸。
１４Ｂ．哺乳類動物に、表１〜７の、例えば配列番号１〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的ある抑制性核酸を、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節するために有効な量で投与することを含む、遺伝子の発現を調節する方法。
１５Ｂ．哺乳類動物に、表１〜７の、例えば配列番号１〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節するために有効な量で投与することを含む、遺伝子の発現を調節する方法であって、ヒトＲＮＡ配列が（ａ）マウスからヒトゲノムまでの高度に保存された領域のマッピングによりまたはマウスからヒトゲノムまでのシンテニー位置のマッピング、例えばマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析により得ることができ、または（ｂ）マウスＲＮＡ配列に対して少なくとも１５塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０または１００塩基）に対して少なくとも９０％同一である方法。
１６Ｂ．ヒトＲＮＡ配列が表１〜７の、例えば配列番号１２６０４〜２１５８２または１９１０８９〜１９３０４９に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つである、実施形態１５Ｂの方法。
１７Ｂ．例えば配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６あるいは１９１０８７に記載のヒトピークのいずれかのヒトＲＮＡ配列または例えば配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３あるいは１９１０８８に記載のマウスピークのいずれかのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することができる、抑制性核酸を含む滅菌組成物。
１８Ｂ．例えば配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６あるいは１９１０８７に記載のヒトピークのいずれかのヒトＲＮＡ配列または例えば配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３あるいは１９１０８８に記載のマウスピークのいずれかのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的であり、処置がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、疾患の処置に使用のための抑制性核酸。
１９Ｂ．哺乳類動物に、例えば配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６あるいは１９１０８７に記載のヒトピークのいずれかのマウスＲＮＡ配列または例えば配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３あるいは１９１０８８に記載のマウスピークのいずれかのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節するために有効な量で投与することを含む、遺伝子の発現を調節する方法。
２０Ｂ．場合により疾患の処置に使用される、配列番号１〜２１５８２または１９１０８９〜１９３０４９のＲＮＡのいずれかの断片に特異的に結合し、または相補的であり、断片が約２０００、１７５０、１５００、１２５０、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００または約１００塩基の長さである（または任意のこれらの数の任意の範囲）、約５〜５０塩基の長さの抑制性核酸であって、ＲＮＡの断片が例えば配列番号１２４４３７〜１９０７１６または１９０９３４〜１９１０８６あるいは１９１０８７に記載のヒトピークのいずれかの範囲または例えば配列番号２１５８３〜１２４４３６または１９０７１７〜１９０９３３あるいは１９１０８８に記載のマウスピークのいずれかの範囲の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０連続塩基の伸長と重なりかつ含み、処置がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節することを含む、抑制性核酸。
２１Ｂ．哺乳類動物に、実施形態２０Ｂの抑制性核酸を、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を調節するために有効な量で投与することを含む、遺伝子の発現を調節する方法。
２２Ｂ．調節が遺伝子発現を上方制御し、任意で、ＲＮＡにより標的とされる遺伝子が表８に記載の遺伝子の群から選択され、ＲＮＡ配列が表８に示される遺伝子を標的とするＲＮＡの配列番号から選択される、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、方法、組成物または方法。
２３Ｂ．表１、２、６または７の、例えば配列番号１〜９８３６または１２０５３〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を含む滅菌組成物。
２４Ｂ．表１、２、６または７の、例えば配列番号１〜９８３６または１２０５３〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を含む滅菌組成物。
２５Ｂ．（ａ）ヒトＲＮＡ配列がマウスからヒトゲノムまでの高度に保存された領域のマッピングによりまたはマウスからヒトゲノムまでのシンテニー位置のマッピング、例えばマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析により得ることができ、または（ｂ）そのヒトＲＮＡ配列がマウスＲＮＡ配列に対して少なくとも１５塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０または１００塩基）に対して少なくとも９０％同一である、実施形態２４Ｂの滅菌組成物。
２６Ｂ．ヒトＲＮＡ配列が表１、２、６または７の、例えば配列番号１２６０４〜１９２３６もしくは２１１９５〜２１５８２または１９１０８９〜１９２８８５あるいは１９２９８０〜１９３０４９に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つである、実施形態２４Ｂの滅菌組成物。
２７Ｂ．腸管外投与のためである、先行する実施形態のいずれかの滅菌組成物。
２８Ｂ．抑制性核酸がＲＮＡにより標的とされる遺伝子の発現を上方制御することができる、先行する実施形態のいずれかの滅菌組成物。
２９Ｂ．腫瘍抑制因子の発現を増加させる方法で使用のための、腫瘍増殖を阻害または抑制する方法で使用のための、または癌を処置する方法で使用のための組成物であって、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を含み、腫瘍抑制因子の発現を増加させる方法で使用のための、腫瘍増殖を阻害または抑制する方法で使用のための、または癌を処置する方法で使用のための組成物。
３０Ｂ．腫瘍抑制因子の発現を増加させる方法で使用のための、腫瘍増殖を阻害または抑制する方法で使用のための、または癌を処置する方法で使用のための組成物であって、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列にオルソロガスなヒトＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を含む組成物。
３１Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、腫瘍抑制因子の発現を増加させるために有効な量で投与することを含む、腫瘍抑制因子の発現を増加させることを、それを必要とする哺乳類動物において行う方法。
３２Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、腫瘍抑制因子の発現を増加させるために有効な量で投与することを含む、腫瘍抑制因子の発現を増加させることを、それを必要とする哺乳類動物において行う方法。
３３Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、腫瘍増殖を抑制し、または阻害するために有効な量で投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、または抑制することを、それを必要とする哺乳類動物において行う方法。
３４Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、腫瘍増殖を抑制し、または阻害するために有効な量で投与することを含む、哺乳類動物の腫瘍増殖を阻害し、または抑制するすることを、それを必要とする哺乳類動物において行う方法。
３５Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、治療有効量で投与することを含む、癌を有する哺乳類動物を処置する方法。
３６Ｂ．哺乳類動物に、表１または７の、例えば配列番号１〜４９または１２２６８〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列と特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を、治療有効量で投与することを含む、癌を有する哺乳類動物を処置する方法。
３７Ｂ．（ａ）ヒトＲＮＡ配列がマウスからヒトゲノムまでの高度に保存された領域のマッピングによりまたはマウスからヒトゲノムまでのシンテニー位置のマッピング、例えばマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析により得ることができ、または（ｂ）ヒトＲＮＡ配列がマウスＲＮＡ配列に対して少なくとも１５塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０または１００塩基）に対して少なくとも９０％同一である、実施形態２９Ｂ〜３６Ｂのいずれかの組成物または方法。
３８Ｂ．ヒトＲＮＡ配列が表１または７の、例えば配列番号１２６０４〜１２６３２もしくは２１３３８〜２１５８２または１９２８７４〜１９２８８５あるいは１９３００７〜１９３０４９に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つである、実施形態２９Ｂ〜３６Ｂのいずれかの組成物または方法。
３９Ｂ．細胞と、表３の、例えば配列番号９８３７〜１０９６０に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を接触させることを含む、幹細胞、任意で胚性幹細胞および場合によりｉＰＳ細胞の分化を強化する方法。
４０Ｂ．細胞と、表３の、例えば配列番号９８３７〜１０９６０に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列に対応するヒトＲＮＡ配列に特異的に結合し、または相補的である抑制性核酸を接触させることを含む、幹細胞、任意で胚性幹細胞および場合によりｉＰＳ細胞の分化を強化する方法。
４１Ｂ．（ａ）ヒトＲＮＡ配列がマウスからヒトゲノムまでの高度に保存された領域のマッピングによりまたはマウスからヒトゲノムまでのシンテニー位置のマッピング、例えばマウス対ヒトＬｉｆｔＯｖｅｒ解析により得ることができ、または（ｂ）ヒトＲＮＡ配列がマウスＲＮＡ配列に対して少なくとも１５塩基（または少なくとも２０、２１、２５、３０または１００塩基）に対して少なくとも９０％同一である、実施形態４０Ｂの方法。
４２Ｂ．対応するヒトＲＮＡ配列が表３の、例えば配列番号１９２３７〜２０３２４または１９２８８６〜１９２９０６に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つである、実施形態４０Ｂの方法。
４３Ｂ．任意で、幹細胞を特定の細胞型、任意で神経、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、筋肉、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、神経内分泌、網膜、網膜色素上皮、膵臓αまたはβ細胞、造血細胞、軟骨細胞、骨細胞、血液細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、赤血球または血小板に分化させるため、エクスビボで行われる実施形態３９Ｂ〜４２Ｂのいずれかの方法。
４４Ｂ．抑制性核酸が５〜４０塩基の長さ（任意で１２〜３０、１２〜２８または１２〜２５塩基の長さ）である、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
４５Ｂ．抑制性核酸が１０〜５０塩基の長さである、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
４６Ｂ．抑制性核酸が、例えば少なくとも５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０または５〜４０、１０〜４０、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０または３０〜４０塩基のＲＮＡ配列に少なくとも８０％または９０％相補的な（完全に相補的を含む）塩基配列を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。相補性は、例えば、５〜３０個の連続塩基など、連続的な塩基に対して決定されると理解される。
４７Ｂ．抑制性核酸が、少なくとも１０塩基のＲＮＡ配列に少なくとも９０％相補的な塩基配列を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
４８Ｂ．抑制性核酸が、１０、１５、２０、２５または３０塩基のＲＮＡ配列に対する相補的な塩基対合において最大３のミスマッチ（例えば最大１または最大２のミスマッチ）を有する塩基配列を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
４９Ｂ．抑制性核酸が、少なくとも１０塩基のＲＮＡ配列に少なくとも８０％相補的な塩基配列を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５０Ｂ．抑制性核酸が、１５塩基のＲＮＡ配列に対して最大３のミスマッチを有する塩基配列を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５１Ｂ．抑制性核酸が一本鎖である、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５２Ｂ．抑制性核酸が二本鎖である、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５３Ｂ．抑制性核酸が、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、修飾ヌクレオチドおよび／またはその組み合わせを含む１つ以上の修飾を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５４Ｂ．抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５５Ｂ．抑制性核酸が、二本鎖であり、１つまたは両方の末端にオーバーハング（場合により２〜６塩基の長さ）を含む、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５６Ｂ．抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子一本鎖ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５７Ｂ．ＲＮＡｉ化合物が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）および低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）からなる群から選択される、実施形態５６Ｂの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５８Ｂ．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態５４Ｂまたは５６Ｂの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
５９Ｂ．修飾ヌクレオシド間結合が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド酸、カルボキシメチルエステルまたはその組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態５３Ｂの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
６０Ｂ．修飾糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分または二環性糖部分を含む、実施形態５３Ｂの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
６１Ｂ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＦＡＮＡ、ＥＮＡまたはモルホリノ修飾物を含む、実施形態５３Ｂの抑制性核酸、プロセス、組成物または方法。
６２Ｂ．表１〜７の、例えば配列番号１〜１２６０３に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列またはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片である単離された核酸を含む滅菌組成物。
６３Ｂ．表１〜７の、例えば配列番号１２６０４〜２１５８２または１９１０８９〜１９３０４９に記載のヒトＲＮＡのうちのいずれか１つのヒトＲＮＡ配列またはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片である単離された核酸を含む滅菌組成物。
６４Ｂ．表６の、例えば配列番号１２０５３〜１２２６７に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列または任意で配列番号２１１９５〜２１３３７または１９２９８０〜１９３００６のうちのいずれか１つのヌクレオ塩基配列を有する対応するヒトＲＮＡ配列あるいはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片を含む癌遺伝子の発現を減少させる方法に使用のためのＲＮＡ。
６５Ｂ．細胞と、表６の、例えば配列番号１２０５３〜１２２６７に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列または任意で配列番号２１１９５〜２１３３７または１９２９８０〜１９３００６（表６参照）のうちのいずれか１つのヌクレオ塩基配列を有する対応するヒトＲＮＡ配列あるいはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片を接触させることを含む、細胞の癌遺伝子の発現を減少させる方法。
６６Ｂ．表３の、例えば配列番号９８３７〜１０９６０に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列または任意で配列番号１９２３７〜２０３２４または１９２８８６〜１９２９０６（表３参照）のうちのいずれか１つのヌクレオ塩基配列を有する対応するヒトＲＮＡ配列あるいはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片を含む、幹細胞、任意で胚性幹細胞、および任意でｉＰＳ細胞の多能性を強化する方法で使用のためのＲＮＡ。
６７Ｂ．細胞と、表３の、例えば配列番号９８３７〜１０９６０に記載のマウスＲＮＡのうちのいずれか１つのマウスＲＮＡ配列または任意で配列番号１９２３７〜２０３２４または１９２８８６〜１９２９０６（表３参照）のうちのいずれか１つのヌクレオ塩基配列を有する対応するヒトＲＮＡ配列あるいはＰＲＣ２結合活性を保持する少なくとも２０塩基の長さのその断片を接触させることを含む、幹細胞、任意で胚性幹細胞、および任意でｉＰＳ細胞の多能性を強化する方法。
６８Ｂ．クロマチン修飾因子に結合するｌｎｃＲＮＡに相補的であり、特異的に結合するＬＮＡ分子。
６９Ｂ．クロマチン修飾因子がポリコーム抑制複合体２である、実施形態６８ＢのＬＮＡ分子。
７０Ｂ．ｌｎｃＲＮＡとｌｎｃＲＮＡに相補的であり、特異的に結合するロックド核酸（ＬＮＡ）分子を接触させることを含む、同族結合配列、例えばＰＲＣ２または染色体への長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の結合を減少させる方法。
７１Ｂ．大分子、遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、プロモーター関連短鎖ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、内在性アンチセンスＲＮＡまたはクロマチン修飾因子、例えば、ポリコーム複合体、例えば、ポリコーム抑制複合体２に結合するＲＮＡであるｌｎｃＲＮＡに相補的であり、かつ特異的に結合するＬＮＡ分子。
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、上記の説明は図示することを目的とし、本発明の範囲を制限せず、その範囲は、添付の特許請求の範囲により限定されることが理解される。他の態様、利点および変更は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (22)

  1. ヒトまたはマウスにおいて標的遺伝子の発現を上方調節する方法における使用のための核酸の製造方法であって、該方法は、
    （ａ）該標的遺伝子の発現を抑制するＰＲＣ２結合長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を同定する工程、ここでＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡは標的遺伝子の染色体座位から転写され、および、
    （ｂ）１５〜４０塩基長の一本鎖の核酸を設計および合成する工程を含み、ここで、該核酸の少なくとも１つのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、該核酸は、ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２結合領域の少なくとも８塩基の連続する配列に対して相補的である塩基配列を含み、ＰＲＣ２結合領域は、Ｅｚｈ２に対する抗体を用いる免疫沈降法の間に内在性のヌクレアーゼから保護されたヌクレオチド配列を有する、前記製造方法。
  2. インビトロでヒトまたはマウスの細胞における標的遺伝子の発現を上方調節する方法であって、該方法は、細胞を、１５〜４０ヌクレオチドの長さを有し、該標的遺伝子の発現を抑制するＰＲＣ２結合長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２結合領域の少なくとも８塩基の連続する配列に対して相補的である塩基配列を含む一本鎖の核酸と接触させることを含み、ここで、該核酸の少なくとも１つのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡは標的遺伝子の染色体座位から転写され、ＰＲＣ２結合領域は、Ｅｚｈ２に対する抗体を用いる免疫沈降法の間に内在性のヌクレアーゼから保護されたヌクレオチド配列を有する、前記方法。
  3. ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡが、標的遺伝子を含有するゲノム領域における該標的遺伝子と同じ鎖から転写される、請求項１に記載の方法。
  4. ｌｎｃＲＮＡが、標的遺伝子とは反対の鎖から転写される、請求項１に記載の方法。
  5. 標的遺伝子がタンパク質コード遺伝子である、請求項１、３および４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 修飾ヌクレオチドが、２’−修飾ヌクレオチドである、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ２’−修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）または２’−Ｏ原子および４’−Ｃ原子を結合するメチレン架橋を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 核酸が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド酸、カルボキシメチルエステルまたはその組み合わせのうちの少なくとも１つから選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 核酸が、
    （ｉ）標的遺伝子のエクソン、イントロン、イントロン／エクソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、または翻訳終止領域の範囲内を起源とするまたはそれと重複するｌｎｃＲＮＡの領域、または
    （ｉｉ）ステムループ構造を形成するｌｎｃＲＮＡの領域におけるＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡ
    に対して相補的である、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 核酸が、標的ＲＮＡの実質的な切断または分解を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断または分解を引き起こさない；ＲＮＡ分解酵素Ｈの経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；いかなるアルゴノートファミリータンパク質をもリクルートしない；ダイサーによって切断されない；選択的スプライシングに介在しない；免疫刺激性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；非修飾核酸に比べて改善された細胞取り込みを有する；細胞または哺乳類にとって毒性ではない；改善されたエンドソームの出口を有する；ＰＲＣ２とのｌｎｃＲＮＡの相互作用に干渉する；および／またはＨ３−リシン２７のメチル化を低下させる、請求項１および３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 核酸が、ＰＲＣ２の、Ｅｚｈ２、Ｓｕｚ１２、ＥｅｄまたはＲｂＡｐ４６／４８サブユニットまたはＪａｒｉｄ２とのｌｎｃＲＮＡの相互作用に干渉する、請求項１１に記載の方法。
  13. ＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡが、標的遺伝子を含有するゲノム領域における該標的遺伝子と同じ鎖から転写される、請求項２に記載の方法。
  14. ｌｎｃＲＮＡが、標的遺伝子とは反対の鎖から転写される、請求項２に記載の方法。
  15. 標的遺伝子がタンパク質コード遺伝子である、請求項２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 修飾ヌクレオチドが、２’−修飾ヌクレオチドである、請求項２および１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ２’−修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）または２’−Ｏ原子および４’−Ｃ原子を結合するメチレン架橋を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 核酸が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２および１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド酸、カルボキシメチルエステルまたはその組み合わせのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 核酸が、
    （ｉ）標的遺伝子のエクソン、イントロン、イントロン／エクソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、または翻訳終止領域の範囲内を起源とするまたはそれと重複するｌｎｃＲＮＡの領域、または
    （ｉｉ）ステムループ構造を形成するｌｎｃＲＮＡの領域におけるＰＲＣ２結合ｌｎｃＲＮＡ
    に対して相補的である、請求項２および１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 核酸が、標的ＲＮＡの実質的な切断または分解を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断または分解を引き起こさない；ＲＮＡ分解酵素Ｈの経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；いかなるアルゴノートファミリータンパク質をもリクルートしない；ダイサーによって切断されない；選択的スプライシングに介在しない；免疫刺激性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；非修飾核酸に比べて改善された細胞取り込みを有する；細胞または哺乳類にとって毒性ではない；改善されたエンドソームの出口を有する；ＰＲＣ２とのｌｎｃＲＮＡの相互作用に干渉する；および／またはＨ３−リシン２７のメチル化を低下させる、請求項２および１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 核酸が、ＰＲＣ２の、Ｅｚｈ２、Ｓｕｚ１２、ＥｅｄまたはＲｂＡｐ４６／４８サブユニットまたはＪａｒｉｄ２とのｌｎｃＲＮＡの相互作用に干渉する、請求項２１に記載の方法。
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