CN111849968A

CN111849968A - 寡核苷酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用

Info

Publication number: CN111849968A
Application number: CN201910364093.9A
Authority: CN
Inventors: 李龙承; 姜武林
Original assignee: Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
Current assignee: Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2020-10-30
Also published as: CN113260702A; EP3964582A1; CO2021015542A2; CA3129976A1; MX2021013361A; KR20220002896A; IL287615A; AU2020265062A1; CN113260702B; WO2020221309A1; EP3964582A4; JP2022530937A; US20220211739A1

Abstract

本发明涉及用于提高HMBS基因表达的小激活核酸分子及其应用。所述小激活核酸分子可以是靶向HMBS基因启动子区的双链或单链RNA分子，包含第一核酸链和第二核酸链。所述第一核酸链和第二核酸链各自含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸结构可以通过例如RNA激活机制促进HMBS基因在细胞中的表达。第一或第二核酸链长度分别为16‑35个核苷酸，并且其中一条核苷酸链与选自靶基因启动子区的靶点存在至少75％的同一性或互补性，另一条链与第一条链存在至少75％的互补性，两条寡核苷酸链的3’端可以具有0‑6个核苷酸的突出。使用针对HMBS基因的小激活核酸分子能够上调HMBS基因和蛋白在细胞中的表达。

Description

寡核苷酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体来讲，涉及基因激活相关的寡聚核酸分子，例如小激活核酸分子，和小激活核酸分子在激活/上调羟甲基胆素合酶(HMBS)基因表达中的应用，以及其在由HMBS表达不足或活性降低而导致的疾病，如急性间歇性卟啉症治疗中的应用。

背景技术

遗传性卟啉病是由血红素生物合成途径(亦称卟啉途径)中特定酶的活性缺乏引起的一系列疾病。卟啉途径的酶缺乏导致血红素产生不足以及卟啉前体和卟啉的积累，而高组织浓度的卟啉前体和卟啉导致组织毒性。

在遗传性卟啉症中，急性间歇性卟啉症(AIP，例如，常染色体显性遗传性AIP)，变异性卟啉症(VP，例如，常染色体显性遗传性VP)，遗传性粪便性卟啉症(嗜铬细胞或HCP，例如常染色体显性HCP)和5'氨基乙酰丙酸(也被称为δ-氨基乙酰丙酸或ALA)脱水酶缺乏性卟啉症(ADP，例如常染色体隐性ADP)被归类为急性肝性卟啉症，表现为可能危及生命的涉及自主神经，外周神经和中枢神经的急性神经系统症状，包括剧烈腹痛、高血压、心动过速、便秘、运动无力、瘫痪和癫痫发作等。如果治疗不当，可能会出现四肢瘫痪，呼吸障碍和死亡。很多能够诱导细胞色素P450的药物、节食和激素水平变化的因素可以通过增加肝脏5'-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)的活性诱发卟啉症的急性发作(Balwani和Desnick，Blood，120：4496-4504,2012)。

AIP，也称为胆色素原脱氨酶(porphobinogen deaminase，PBGD)缺乏症，或羟甲基胆素合酶(hydroxymethylbilane synthase,HMBS)缺乏症，为最常见的急性肝性卟啉症，是由HMBS基因突变引起的常染色体显性遗传病，发病率为每10万人口中有5～10人，其中约有 5-10％的患者有症状。在AIP病人，HMBS基因的一个等位发生突变，引起羟甲基胆素合酶的蛋白表达量减半(单倍剂量不足)而致其酶活性低下，进而导致ALA和PBG(胆色素原)在体内积累及血红素合成不足。

静脉注射氯高铁血红素(hemin)通常用于AIP患者急性发作期间的治疗和预防。氯高铁血红素提供外源血红素以抑制ALAS1的负反馈，从而减少ALA和PBG的产生。虽然患者通常反应良好，但其效果缓慢，通常需要2至4天或更长时间才能将尿ALA和PBG浓度正常化至正常水平。由于静脉注射的氯高铁血红素迅速代谢，通常需要3-4次输注以有效治疗或预防急性发作。此外，重复输注可能导致铁超负荷和静脉炎。目前唯一治愈性的疗法是肝脏移植，但肝移植伴随有显著的并发症和和死亡率，并且肝脏供体来源有限。

鉴于目前治疗方法的缺陷，需要一种更有效、更持久、更快速和安全的替代治疗方法。

本发明提供了利用小激活RNA特异性激活体内HMBS基因表达水平，持久促进细胞产生内源性胆色素原脱氨酶(亦称羟甲基胆素合酶)以恢复其体内正常水平从而有效治疗AIP的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于RNA激活过程的小激活核酸分子，通过激活/ 上调HMBS基因转录，从而提高HMBS蛋白的表达量来治疗由HMBS表达不足或活性降低而导致的疾病，如急性间歇性卟啉症。

在本发明的一个方面，提供了小激活核酸分子，其激活或者上调细胞中HMBS基因的表达，本发明的小激活核酸分子的一条链与HMBS基因的启动子区的长度为16-35个核苷酸的片段具有至少75％以上的同源性或互补性，启动子区是指包括转录起始位点上游的400个核苷酸序列，从而实现所述基因表达的激活或者上调。具体地，本发明的小激活核酸分子的一条链包括与HMBS基因启动子区中的任意连续16-35个核苷酸具有至少75％以上的同源性或互补性的核苷酸序列，其中启动子区是指包括转录起始位点上游的400个核苷酸。在一个具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链包括或选自与HMBS基因启动子上游-395bp至-351 bp的区域(区域1)(tagcctgggcaacatagtgaggccacctccccgctgtctctataa，SEQ ID NO:1)和 -179bp至-1bp的区域(区域2) (tgctgcctatttcaaggttgtagcaaagctaagtttgaacagagcaaaggaagcgccatagaagctgcactacttgct catgtcacagctggggaatggggtggtcgaatggggaggtccactgtcgcaatgttccaattcccgcccagagggagggacctccccttcgagggagggcg,SEQ ID NO:2)中的连续16-35个核苷酸具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或100％的同源性或互补性的核苷酸序列。更具体地，在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99％的同源性或互补性。在一个具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链包括或选自与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或100％的同源性或互补性的核苷酸序列。在更具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链由与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或100％的同源性或互补性的核苷酸序列组成。

在本发明中，本发明的小激活核酸分子包括靶向HMBS基因启动子区的双链小激活核酸分子，包含第一核酸链和第二核酸链，第一核酸链与HMBS基因启动子中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的任一连续16-35个核苷酸具有至少75％的同源性或互补性，第二核酸链与第一核酸链具有至少75％的互补性，第一核酸链和第二核酸链能通过互补形成双链核酸结构，双链核酸结构能够激活HMBS基因在细胞中的表达。

本发明的小激活核酸分子的正义核酸链和反义核酸链可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸链和反义核酸链分别位于两条链上时，小激活核酸分子的至少一条链可以在5’端和3’端的任一端具有突出或悬垂，例如在3’端可以具有长度为0-6个核苷酸的突出。优选地，本发明的小激活核酸分子的两条链都具有突出，更优选地，小激活核酸分子的两条链的3’端均可以具有0-6个核苷酸的突出，最优选地，具有 2-3个核苷酸的3’突出。优选地，突出的核苷酸可以是dT或U，也可以为天然核苷酸突出。本发明中所述的天然核苷酸突出，是指正义核酸片段或反义核酸片段的末端突出的核苷酸与对应的靶点序列的核苷酸相同或互补。

小激活核酸分子也可以包括可形成双链区发夹结构的单链RNA分子。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子是靶向HMBS基因启动子区的单链RNA分子，其中所述小激活核酸分子可形成双链区发夹结构。当正义核酸链和反义核酸链存在于同一条核酸链上时，优选地，小激活核酸分子可以为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构，该双链核酸结构可以通过例如RNA激活机制促进HMBS基因在细胞中的表达。

上述小激活核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度可以分别为16-35个核苷酸，例如，可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34或35个核苷酸。

在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的正义链与选自SEQ ID NO:30-48中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性，并且其反义链与选自SEQ ID NO:49-67的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的正义链包括或者选自与选自 SEQ ID NO:30-48中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的序列，并且其反义链包括或者选自与选自SEQ ID NO:49-67中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约 85％，约90％，约95％，约99％、或约100％的同一性或同源性的序列。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的正义链由与选自SEQ ID NO:30-48中的任一核苷酸序列具有至少 75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的序列组成，并且其反义链由与选自SEQ ID NO:49-67中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％、或约100％的同一性或同源性的序列组成。在具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的链正义链可以是选自SEQ ID NO:30-48的任一核苷酸序列所示的序列，并且其反义链可以是如选自SEQ ID NO:49-67中的任一核苷酸序列所示的序列。

在一个实施方式中，本文所述的小激活核酸分子可以是合成的、体外转录的或者载体表达的。

本文所述的小激活核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以包括至少一种修饰。在一个实施方式中，本文所述的小激活核酸分子中的修饰可以为化学修饰，如在至少一个核苷酸上具有化学修饰。本发明使用的化学修饰可以包括或选自如下修饰中的一种或或多种或其任意组合：

(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰；

(4)所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括但不限于，硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都能稳定小激活核酸分子结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，包括但不限于，2’-氟代修饰、2’-氧甲基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰等。

碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，包括但不限于，5′-溴尿嘧啶修饰、5′- 碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、2,6－二氨基嘌呤修饰等。

这些修饰可以增加小激活核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进小激活核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小激活核酸分子的正义链或反义链的末端引入例如胆固醇等亲脂性基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜及核膜与细胞核内的基因启动子区发生作用。

本发明提供的小激活核酸分子在与细胞接触后可有效激活或上调细胞中HMBS基因的表达，优选情况下表达至少上调10％。

本发明的另一方面还涉及编码本文所述的小激活核酸分子的核酸。在一个实施方式中，所述核酸可以是DNA分子。

在本发明的另一方面，提供了包含上文所述的小激活核酸分子或编码本文所述的小激活核酸分子的核酸的细胞。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子可以是靶向HMBS基因启动子区的双链小激活核酸分子，其包括正义链和反义链。在另一实施方式中，本发明的小激活核酸分子可以是靶向HMBS基因启动子区的单链小激活核酸分子。

在本发明的另一方面，提供了包含上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸的试剂盒。

本发明的另一方面涉及上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸在制备用于在细胞中激活/上调HMBS基因表达的药物中的应用。

本发明的另一方面涉及上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸、本发明的细胞在制备用于治疗对象中由HMBS表达不足或活性降低而导致的疾病的药物中的应用。在一个实施方式中，由HMBS表达不足或活性降低而导致的疾病可以包括遗传性卟啉症。遗传性卟啉症可以包括例如急性间歇性卟啉症。

本发明的另一方面涉及上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸、本发明的细胞在制备用于治疗对象中的急性间歇性卟啉症的药物中的应用。

本发明的另一方面还涉及治疗对象中由HMBS表达不足或活性降低而导致的疾病的方法，包括给对象施用上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸或本发明所述的细胞。

本发明的另一方面还涉及治疗对象中的急性间歇性卟啉症的方法，包括给对象施用上文所述的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸、或本发明所述的细胞。

本发明还涉及在细胞中激活/上调HMBS基因的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用上文所述的小激活核酸分子或编码本文所述的小激活核酸分子的核酸。

本发明的小激活核酸分子可以被直接导入细胞中，也可以是将编码该小激活核酸分子的核酸序列导入细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以分离自哺乳动物体内，如人体中。该人体可以是患有由HMBS蛋白表达减少引发的症状的患者。本文所述的小激活核酸分子可以被施以足够的量以实现对由HMBS蛋白表达减少引发的症状的治疗。具体情况下，所述由HMBS蛋白量的缺乏引发的症状包括或选自急性间歇性卟啉症。

本发明另一方面提供了一种分离的HMBS基因小激活核酸分子作用位点，该位点具有HMBS 基因的启动子区上任意连续的16-35个核苷酸序列，优选情况下，所述作用位点为选自SEQ ID NO:1-2的任一条序列上任意连续16-35个核苷酸序列。具体地，所述作用位点如选自SEQ ID NO:11-29的任一核苷酸序列所示。

本发明的有益效果

本发明提供的能够激活/上调HMBS基因表达的小激活核酸分子，能够持久地激活HMBS基因，因而高效、特异地上调或恢复HMBS基因和蛋白的表达和酶的活性，并同时具有较低的毒副作用，可用于制备激活/上调细胞中HMBS基因和蛋白表达的药物或制剂。

附图说明

图1为HMBS基因启动子示意图。图中区域1和区域2为设计小核酸分子使用的靶序列区域。TSS为转录起始位点。

图2为小核酸分子介导的HMBS mRNA表达改变。靶向HMBS启动子靶点区的180个小核酸分子分别转染人肝细胞癌Huh7细胞，转染浓度为10nM，72小时后收集细胞用一步法RT-PCR 分析HMBS mRNA表达。图示为相对于对照处理(mock)的HMBS表达改变从最高到最低排序。

图3为小核酸分子介导的HMBS mRNA表达改变。靶向HMBS启动子的180个小核酸分子分别转染Huh7细胞，转染浓度为10nM，72小时后收集细胞用一步法RT-PCR分析HMBSmRNA 表达。图示为相对于对照处理(mock)的HMBS表达改变按照它们在HMBS基因启动子上的位置从最上游到到转录起始位点排序。Activator：激活性小核酸分子，Silencers:抑制性小核酸分子，Nonfunctional:无功能性小核酸分子。

图4为候选saRNA(small activating RNA)在不同肝脏细胞中激活HMBS基因mRNA表达。用所示saRNA(n＝13,终浓度为20nM)分别转染人肝细胞癌Huh7、HepG2和人胚胎肝细胞CCC-HEL-1。72小时后收集细胞用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统对HMBS基因进行qPCR扩增，同时扩增HPRT1和TBP基因作为内参。Mock、dsCon2(正义链5’-ACUACUGAGUGACAGUAGATT-3’(SEQ ID NO：68)，反义链5’ -UCUACUGUCACUCAGUAGUTT-3’(SEQ ID NO：69)和siHMBS(正义链：5’-CCUGUUUACCAAGGAGCUUTT-3’(SEQ ID No：3),反义链：5’-AAGCUCCUUGGUAAACAGGTT-3’(SEQID No：4))分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。

图5为候选saRNA在不同肝脏细胞中激活HMBS蛋白表达。用所示saRNA(终浓度为20nM) 转染人肝细胞癌HepG2细胞。72小时后收集细胞进行蛋白印迹分析，用抗人HMBS抗体检测 HMBS蛋白表达量，同时检测微管蛋白(Tubulin)作为蛋白上样量准确性控制。Mock、dsCon2 和siHMBS分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。(A)蛋白印迹膜的扫描图。(B)用ImageJ软件对A图的条带进行定量分析，得出每种处理的HMBS条带强度与Mock处理的的相对值。

图6为ALA转化分析得出的单位(mg)蛋白的PPIX荧光强度。用所示的saRNA转染人胚胎肝细胞CCC-HEL-1，48小时后向细胞加入ALA底物，在加入前(0h)和加入后24小时(24h)收集细胞分析PPIX的荧光强度，同时裂解细胞测定蛋白浓度。Mock、dsCon2和siHMBS 分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。

具体实施方式

在本发明中，相关术语采用如下定义：

如本文所用的术语“互补”是指两条寡核苷酸链彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的寡核苷酸链中的核苷酸之间通过氢键形成。互补寡核苷酸链可以沃森-克里克 (Watson-Crick)方式碱基配对(例如，A-T，A-U，C-G)，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen型或者反向Hoogsteen型碱基配对)进行碱基配对。

互补包括完全互补和不完全互补两种情况。完全互补或100％互补是指双链寡核苷酸分子的双链区中来自第一条寡核苷酸链的每个核苷酸可以与第二条寡核苷酸链相应位置的核苷酸形成氢键而没有“错配”的情况。不完全互补是指两条链的核苷酸单元不能全部互相氢键结合的情况。例如，对于两条双链区为20个核苷酸长度的寡核苷酸链，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出10％的互补性。在同一实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出90％的互补性。实质互补是指至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的互补。

如本文所用的术语“寡核苷酸”或“小核酸分子”是指核苷酸的聚合物，包括但不限于 DNA、RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链分子，包括规则地和不规则地交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸链，以及这些种类的寡核苷酸的修饰和以及天然存在的或非天然存在的骨架。本发明中所述的用于激活靶基因转录的寡核苷酸为小激活核酸分子。

如本文所用的术语“寡核苷酸链”和“寡核苷酸序列”可互换地使用，是指35个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)。在本发明中，寡核苷酸链的长度可以是16至35个核苷酸的任一长度。

如本文所用，术语“第一核酸链”可以是正义链也可以是反义链，小激活RNA的正义链是指小激活RNA双链体中含与靶基因的启动子DNA序列的编码链具有同一性的核酸链，反义链是指小激活RNA双链体中与正义链互补的核酸链。

如本文所用，术语“第二核酸链”也可以是正义链或者反义链。当第一寡核酸链为正义链时，第二寡核酸链为反义链，当第一寡核酸链为反义链时，第二寡核酸链为正义链。

如本文所用的术语“基因”是指编码一条多肽链或转录一条功能RNA所需的全部核苷酸序列。“基因”可以是对于宿主细胞而言内源的或完全或部分重组的基因(例如，由于引入编码启动子的外源寡核苷酸和编码序列或将邻近内源编码序列的异源启动子导入宿主细胞)。例如，术语“基因”包括可以由外显子和内含子组成的核酸序列。编码蛋白质的序列是，例如，包含在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框中的外显子内的序列，如本文所用，“基因”可以指包括例如基因调控序列例如启动子，增强子和本领域已知的控制另一基因的转录，表达或活性的所有其他序列，无论另一基因是否包含编码序列或非编码序列。在一种情况下，例如，“基因”可以用于描述包含调控序列例如启动子或增强子的功能性核酸。重组基因的表达可以通过一种或多种异源调节序列来控制。

如本文所用的术语“靶基因”可以是天然存在于生物体中的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外和/或瞬时或稳定转染或掺入细胞和/或其染色质。靶基因可以为蛋白质编码基因，也可为非蛋白编码基因(例如微小RNA基因、长链非编码RNA基因)。靶基因通常含有启动子序列，设计与启动子序列具有同一性(也称同源性)的小激活核酸分子可以实现对靶基因的正向调控，表现为靶基因表达的上调。“靶基因启动子序列”是指靶基因的非编码序列，在本发明中涉及“与靶基因启动子序列互补”中靶基因启动子序列是指该序列的编码链，亦称非模板链，即为与该基因编码序列为同一序列的核酸序列。“靶点序列”是指靶基因启动子序列中小激活核酸分子的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸与之同源或互补的序列片段。

如本文所用，术语“正义链”、“正义寡核苷酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的正义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中含与靶基因的启动子序列的编码链具有同一性的第一核酸链。

如本文所用，术语“反义链”、“反义寡核苷酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的反义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中与正义寡核苷酸链互补的第二核酸链。

如本文所用的术语“编码链”是指靶基因中不能进行转录的那一条DNA链，该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致(在RNA中是以U取代了DNA中的T)。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的编码链是指与靶基因DNA编码链在同一条DNA链上的启动子序列。

如本文所用的术语“模板链”是指靶基因的双链DNA中与编码链互补的另一条链，可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补(A-U，G-C)。在转录过程中，RNA 聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3'→5'方向移动，按照5'→3'方向催化RNA的合成。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的模板链是指与靶基因DNA模板链在同一条DNA 链上的启动子序列。

如本文所用的术语“启动子”是指通过与蛋白质编码或RNA编码核酸序列在位置上关联而对它们的转录发挥调控作用的序列。通常，真核基因启动子包含100～5,000个碱基对，尽管此长度范围并不意味着限制本文所用的术语“启动子”。虽然启动子序列一般位于蛋白质编码或者RNA编码序列的5'端，但启动子序列也可存在于外显子及内含子序列中。

如本文所用的术语“转录起始位点”是指在基因的模板链上标志转录起始的核苷酸。转录起始位点可出现于启动子区的模板链上。一个基因可以有多于一个的转录起始位点。

如本文所用的术语“同一性”或“同源性”是指小激活RNA的其中一条寡核苷酸链(正义链或者反义链)与靶基因的启动子序列的某一区域的编码链或者模板链存在的相似性。在本文中，所述“同一性”或“同源性”可以是至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％。

如本文所用的术语“突出”、“overhang”、“悬垂”可互换地使用，是指寡核苷酸链末端 (5'或3')非碱基配对核苷酸，其是由延伸超出双链寡核苷酸内的其中一条链的另一条链产生的。延伸超出双链体3'和/或5'端的单链区域被称为突出。

如本文所用，术语“基因激活”或“激活基因”或“基因上调”或“上调基因”可互换地使用，是指通过测量基因转录水平、mRNA水平、蛋白水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平、或其在细胞或生物系统中的活性或状态来测定某一核酸转录、翻译或表达或活性的增加。这些活动或状态可以直接或间接的测定。此外，“基因激活”、“激活基因”、“基因上调”、“上调基因”是指与核酸序列相关的活性增加，而不管发生这种激活的机制如何，例如其作为调节序列发挥调控作用、被转录成RNA，被翻译为蛋白质并增加蛋白质的表达。优选情况下本发明提供的小激活RNA分子能够上调基因或蛋白质表达或活性增加至少10％。

如本文所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”、“小激活核酸分子”可互换地使用，是指能够促进基因表达的核酸分子，并且可以由包含与靶基因的非编码核酸序列(例如启动子、增强子等)具有序列同源性或同一性的核苷酸序列的第一核酸片段(反义链，也称反义寡核苷酸链)和包含与第一核酸片段互补的核苷酸序列的第二核酸片段(正义链，也称有义链或正义寡核苷酸链)组成，其中所述第一核酸片段和第二核酸片段形成双链体。小激活核酸分子也可以由合成的或者载体表达的可形成双链区发夹结构的单链RNA分子组成，其中第一区域包含与基因的启动子靶序列具有序列同一性的核苷酸序列，第二区域包含的核苷酸序列与第一区域互补。小激活核酸分子的双链体区域长度通常为约10至约50个碱基对、约12个至约 48个碱基对、约14个至约46个碱基对、约16个至约44个碱基对、约18个至约42个碱基对、约20个至约40个碱基对、约22个至约38个碱基对、约24个至约36个碱基对、约26 个至约34个碱基对、约28个至约32个碱基对、通常约10个、约15个、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，术语“saRNA”、“小激活RNA”和“小激活核酸分子”还含有除核糖核苷酸部分之外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。

如本文所用，术语“热点”是指长度至少为30bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少30％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.2倍或以上。

如本文所用，术语“合成”是指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成RNA的方式，例如化学合成、体外转录、载体表达等。

本发明通过RNA激活方式上调HMBS基因的表达，通过增加HMBS蛋白的表达量来促进血红素的生成。本发明中HMBS基因有时也称为靶基因。

本发明提供的小激活核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。

小激活核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成。

一般来说，化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐及退火。

例如，本发明所述寡聚核酸分子化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核酸分子的合成

在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1微摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19 ≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有寡聚核酸分子的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/ 氨水溶液(体积比为1：3)，然后密封，置于25-70℃温箱中，孵育2-30小时，过滤含有寡聚核酸分子的固相支持物的溶液并收集滤液，用双蒸水淋洗固相支持物2次(每次1毫升)并收集滤液，合并收集洗脱液，在真空条件下干燥1-12小时。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升正丁醇，高速离心收集沉淀即得到saRNA单链的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的saRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过高压液相色谱反相C18柱进行分离，得到纯化的寡聚核酸分子单链产物。

(4)脱盐及退火

用体积排阻凝胶过滤法去除盐份，将正义链和反义链的寡聚核糖核酸单链按相同摩尔比混合在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，得到含有寡聚核酸分子的溶液。

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1靶向HMBS启动子的小激活核酸分子的设计与合成

从UCSC基因组数据库(genome.ucsc.edu)获得HMBS基因从转录起始位点(TSS)到上游-400bp的正义启动子序列。以HMBS 400bp的启动子序列为模板，从TSS上游-400bp处开始选定大小为19bp的靶点。然后对靶点序列进行过滤处理，保留靶点序列的标准为：1)GC含量在35％至65％之间；2)不含有5个或者多于5个的连续同一核苷酸；3)不含多于3 个的二核苷酸重复序列；4)不含多于3个的三核苷酸重复序列。过滤后，剩余180个靶点序列作为候选进入筛选过程。基于这些候选序列，化学合成相应的双链寡聚核酸分子。其中，该实验中使用的双链寡聚核酸分子的正义和反义链的长度均为21个核苷酸，所述双链寡聚核酸分子的第一核糖核酸链(正义链)的5’区域的19个核苷酸与启动子靶点序列具有100％的同一性，其3’末端含有TT序列；第二核糖核酸链的5’区域的19个核苷酸与第一核糖核酸链序列互补，其3’末端含有TT序列。将前述寡聚核酸分子的两条链以同等量的摩尔数混合，退火后形成双链寡聚核酸分子。

实施例2靶向HMBS启动子的saRNA的筛选

(1)细胞培养和转染

人肝癌细胞系Huh7、HepG2培养在DMEM培养基(Gibco)中。人胚胎肝细胞CCC-HEL-1培养在RPMI-1640培养基(Gibco)中所有培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich) 和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％CO₂，37℃条件下培养。依照制造商的说明，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以10nM(除非另有说明)浓度以逆转染的方式转染双链寡聚核酸分子。

(2)一步法RT-qPCR

转染结束后，弃掉培养基，每孔加入150μl PBS清洗一次，弃掉PBS，每孔加入50 μl细胞裂解液，室温孵育5分钟。每孔取1μl细胞裂解物使用一步法TB Green^TM PrimeScrip^TMRT-PCR试剂盒II(Takara,RR086A)在

480系统(Roche) 上进行qPCR分析，每个样本重复3个复孔扩增，PCR反应条件见下表1。

表1.PCR反应制备

反应条件为：阶段1，反转录反应：42℃，5分钟；95℃ 10秒；阶段2，PCR反应： 95℃5秒，60℃ 20秒，扩增45个循环。以HPRT1及TBP为内参基因。HMBS、HPRT1及 TBP所用PCR引物见表1，其中HMBS用HMBS F1/R1引物对扩增。

表2.qRT-PCR分析的引物序列

为了计算某个saRNA转染样本的HMBS(目的基因)的相对于对照处理(Mock)的表达值 (E_rel)，用公式1代入目的基因及2个内参基因的Ct值计算。

E_rel＝2^(CtTm-CtTs)/((2^{(CtR1m-CtR1s)}*2^{(CtR2m-CtR2s)})^(1/2)) (公式1)

其中，CtTm为来自Mock样本的目的基因的Ct值，CtTs为来自saRNA处理样本的目的基因的Ct值，CtR1m为来自Mock处理样本的内参基因1的Ct值,CtR1s为来自saRNA处理样本的内参基因1的Ct值,CtR2m为来自Mock处理样本的内参基因2的Ct值,CtR2s为来自saRNA处理样本的内参基因2的Ct值。

(3)功能性saRNA筛选

为了获得能够激活HMBS转录的saRNA，用上述180个双链寡聚核酸分子分别转染Huh7 细胞，转染浓度为10nM，72小时后以如上所述相同的方法，裂解细胞并进行一步法RT-qPCR 分析得到每个saRNA处理样本的HMBS基因的相对(与Mock处理比较)表达值。结果表明，有19个saRNA显示出激活活性。这些具有激活活性的双链寡聚核酸分子被称为激活性saRNA。

图2和图3进一步显示了HMBS saRNA的活性分布和saRNA介导的HMBS mRNA表达改变情况。

实施例3 saRNA在不同细胞系中促进HMBS基因表达

用表4所示saRNA(n＝13,终浓度为20nM)按照实施例2中描述的方法分别转染人肝细胞癌Huh7、HepG2和人胚胎肝细胞CCC-HEL-1)，转染72小时后，收集细胞用QiagenRNeasy 试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统对HMBS基因进行qPCR扩增，同时扩增 HPRT1和TBP基因作为内参。Mock、dsCon2和siHMBS分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。按照实施例2中描述的方法对PCR结果进行分析，结果如图4所示，候选saRNA在不同细胞系中均能促进HMBS基因的mRNA表达水平，

实施例4 saRNA促进HMBS蛋白表达

用图5所示saRNA(终浓度为20nM)逆向转染人肝细胞癌HepG2，72小时后收集细胞，使用适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(1×RIPA缓冲液,Cell Signaling Technology)裂解。BCA法进行蛋白质定量，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至0.45μm的PVDF膜。所用一抗为：兔单克隆抗HMBS(Abcam,ab129092),α/β-微管蛋白抗体(Cell SignalingTechnology,2148s)对印迹进行检测；二抗用抗兔IgG,HRP-连接的抗体(Cell SignalingTechnology)。用Image Lab(BIO-RAD,Chemistry Doc^tm MP Imaging System)扫膜检测信号。如图5所示，候选saRNA增加HepG2细胞中HMBS蛋白表达量接近2倍，部分蛋白表达量被提高至2.5倍。激活性saRNA对肝脏细胞中HMBS蛋白表达的激活效应效果显著。

实施例5 saRNA促进HMBS酶活性

AIP是血红素合成途径上第3个酶羟甲基胆素合成酶(HMBS)缺陷或是活性不足导致δ- 氨基乙酰丙酸(ALA)和PBG(胆色素原)在体内积累而血红素合成不足引发的一种疾病。ALA 是一种简单的内源性5碳化学物质，参与体内血红素的生物合成。作为血红素的前体物，ALA 在ALA脱水酶等一系列酶的作用下，在线粒体内生成具有强光敏作用的原卟啉IX(Proto-porphyrin IX，缩写为PPIX)，PPIX与Fe离子结合生成血红素，为血红素生物合成的最后一步中间体。正常情况下，血红素生物合成途径受到机体负反馈调节，即ALA的合成受细胞内血红素含量调控，所以体内不会有过多的ALA蓄积。当给予过量的外源性ALA时，上述调节机制被打乱，机体产生过量的PPIX。因此可以通过检测PPIX的荧光强度的强弱间接反映HMBS的活性强弱以及血红素的生物合成量(Sassa等,J Exp Med 1975；142:722-731， Divaris等，Am J Pathol 1990；136:891–897，Kennedy等，J Photochem Photobiol1992；14:275–292)。这种检测方法称为ALA转变分析。

在6孔板中接种人胚胎肝细胞CCC-HEL-1(2×10⁵细胞/孔)使用RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad,CA)按照生产商说明书提供的逆转法转染图6所示saRNA至细胞，终浓度为20nM，转染后第48小时用1mM的ALA处理细胞0小时(基线)和24小时。转染后第三天收集细胞于1.5ml的离心管中，取出样品的一部分用300μl 1N 1:1MeOH-PCA在冰上裂解细胞 10分钟，10000g 4℃离心10分钟后取100μl上清液加入到黑色96孔板，使用多功能酶标仪(TECAN Infintie M200PRO)在400nM激发光和660nM发射光检测荧光强度。样品的另一部分用1×RIPA裂解液(Cell Signaling Technology)裂解细胞随后用BCA法检测蛋白浓度。最后用荧光强度/蛋白浓度对数据进行归一化处理。

根据图6所示，与Mock和dsCon2对照组相比，转染激活性saRNA的细胞中单位蛋白浓度对应的荧光强度明显增加，说明saRNA导致的HMBS基因激活提高了HMBS酶的活性并最终促进了血红素的合成。

综合上述结果，发明人通过高通量筛选靶向HMBS基因启动子的saRNA，发现了多个能够显著激活HMBS基因表达的saRNA。这些saRNA通过上调HMBS基因和蛋白的表达，促进血红素生成。这些结果明确提示用靶向HMBS基因启动子的saRNA将是一种很有前景的治疗AIP的策略。

序列表

<110> 中美瑞康核酸技术（南通）研究院有限公司

<120> 寡核苷酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用

<130> 20190421

<160> 67

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tagcctgggc aacatagtga ggccacctcc ccgctgtctc tataa 45

<210> 2

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgctgcctat ttcaaggttg tagcaaagct aagtttgaac agagcaaagg aagcgccata 60

gaagctgcac tacttgctca tgtcacagct ggggaatggg gtggtcgaat ggggaggtcc 120

actgtcgcaa tgttccaatt cccgcccaga gggagggacc tccccttcga gggagggcg 179

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccuguuuacc aaggagcuut t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 4

aagcuccuug guaaacaggt t 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acagctatga aggatgggca a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atcttcatgc tgggcaggga 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atggacagga ctgaacgtct t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tccagcaggt cagcaaagaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ataatcccaa gcggtttgct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ctgccagtct ggactgttct 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccatagaagc tgcactact 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgccatagaa gctgcacta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

catagtgagg ccacctccc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ccacctcccc gctgtctct 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tgctgcctat ttcaaggtt 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cctccccttc gagggaggg 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

agagggaggg acctcccct 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ctccccttcg agggagggc 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

caacatagtg aggccacct 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gccacctccc cgctgtctc 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ctggggaatg gggtggtcg 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

tcaaggttgt agcaaagct 19

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gtggtcgaat ggggaggtc 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

acctccccgc tgtctctat 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agctaagttt gaacagagc 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

atagtgaggc cacctcccc 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

tcacagctgg ggaatgggg 19

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gggaatgggg tggtcgaat 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gccatagaag ctgcactac 19

<210> 30

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 30

ccauagaagc ugcacuacut t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 31

cgccauagaa gcugcacuat t 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 32

cauagugagg ccaccuccct t 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 33

ccaccucccc gcugucucut t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 34

ugcugccuau uucaagguut t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 35

ccuccccuuc gagggagggt t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 36

agagggaggg accuccccut t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 37

cuccccuucg agggagggct t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 38

caacauagug aggccaccut t 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 39

gccaccuccc cgcugucuct t 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 40

cuggggaaug ggguggucgt t 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 41

ucaagguugu agcaaagcut t 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 42

guggucgaau ggggagguct t 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 43

accuccccgc ugucucuaut t 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 44

agcuaaguuu gaacagagct t 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 45

auagugaggc caccucccct t 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 46

ucacagcugg ggaauggggt t 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 47

gggaaugggg uggucgaaut t 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 48

gccauagaag cugcacuact t 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 49

aguagugcag cuucuauggt t 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 50

uagugcagcu ucuauggcgt t 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 51

gggagguggc cucacuaugt t 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 52

agagacagcg gggagguggt t 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 53

aaccuugaaa uaggcagcat t 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 54

cccucccucg aaggggaggt t 21

<210> 55

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 55

aggggagguc ccucccucut t 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 56

gcccucccuc gaaggggagt t 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 57

agguggccuc acuauguugt t 21

<210> 58

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 58

gagacagcgg ggagguggct t 21

<210> 59

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 59

cgaccacccc auuccccagt t 21

<210> 60

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 60

agcuuugcua caaccuugat t 21

<210> 61

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 61

gaccucccca uucgaccact t 21

<210> 62

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 62

auagagacag cggggaggut t 21

<210> 63

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 63

gcucuguuca aacuuagcut t 21

<210> 64

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 64

ggggaggugg ccucacuaut t 21

<210> 65

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 65

ccccauuccc cagcugugat t 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 66

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<210> 67

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 67

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<210> 68

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 68

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<210> 69

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成

<400> 69

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Claims

1.一种小激活核酸分子，包含第一核酸链和第二核酸链，其中第一核酸链与HMBS基因启动子中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的任一连续16-35个核苷酸具有至少75％的同源性或互补性，第二核酸链与第一核酸链具有至少75％的互补性，第一核酸链和第二核酸链能通过互补形成双链核酸结构，双链核酸结构能够激活HMBS基因在细胞中的表达。

2.根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链存在于两条不同的核酸链上。

3.根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其中所述第一核酸链和第二核酸链存在于同一条核酸链上，优选地，为发夹型单链核酸分子，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链的互补区域形成双链核酸结构。

4.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其中所述小激活核酸分子的至少一条链在3’端具有0至6个核苷酸的突出。

5.根据权利要求4所述的小激活核酸分子，其中，所述小激活核酸分子的两条链在3’端具有0至6个核苷酸的突出，优选地具有2-3个核苷酸的突出。

6.根据权利要求1-5任一项所述的小激活核酸分子，其中所述第一核酸链和第二核酸链的长度分别为16至35个核苷酸。

7.根据权利要求1-6所述的小激活核酸分子，其中，所述小激活核酸分子的一条链包括，或者由与选自SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:29的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性或互补性的序列组成。

8.根据权利要求1-7所述的小激活核酸分子，其中，所述第一链与选自SEQ ID NO:30-48中的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性，并且所述第二链与选自SEQ ID NO:49-67的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性。

9.权利要求1-8所述的小激活核酸分子，其中，所述第一链包括或选自SEQ ID NO:30-48的任一核苷酸序列所示的序列，并且所述第二链包括或选自SEQ ID NO:49-67的任一核苷酸序列所示的序列。

10.根据权利要求1-9任一项所述的小激活核酸分子，其中所述小激活核酸分子包括至少一个修饰，优选地，所述修饰为化学修饰。

11.根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰包括或选自如下修饰中的一种或多种：

(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰；

12.根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰包括或选自如下修饰中的一种或多种：2’-氟代修饰、2’-氧甲基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰、5′-溴尿嘧啶修饰、5′-碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、2,6－二氨基嘌呤修饰、硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。

13.编码权利要求1-9任一项所述的小激活核酸分子的核酸。

14.权利要求13所述的核酸，其中所述核酸是DNA分子。

15.包含权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子或权利要求13或14所述的核酸的细胞。

16.试剂盒，其包含权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子、权利要求13或14所述的核酸、或权利要求15所述的细胞。

17.权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子，其激活/上调HMBS基因表达至少10％。

18.权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子或权利要求13或14所述的核酸在制备用于在细胞中激活/上调HMBS基因表达的制剂中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其中所述的小激活核酸分子被直接导入所述细胞中。

20.根据权利要求18所述的应用，其中所述小激活核酸分子是在权利要求13或14所述的核酸导入所述细胞后在细胞内产生的。

21.根据权利要求18-20任一项所述的应用，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

22.根据权利要求21所述的应用，其中所述细胞是人类细胞。

23.根据权利要求22所述的应用，其中所述细胞存在于人体中。

24.一种分离的HMBS基因小激活核酸分子靶位点，其中所述靶位点包括或由选自SEQID NO:1-2的任一条序列上的任意连续16-35个核苷酸序列组成。

25.根据权利要求24所述的小激活核酸分子靶位点，其中所述靶位点包括或选自SEQID NO:11-29的任一核苷酸序列所示的序列。

26.在细胞中激活/上调HMBS基因的表达的方法，包括给所述细胞施用权利要求1-12中任一项所述的小激活核酸分子或权利要求13或14所述的核酸。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的小激活核酸分子被直接导入所述细胞中。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的小激活核酸分子是在权利要求13或14所述的核酸导入所述细胞后在细胞内产生的。

29.根据权利要求26-28任一项所述的方法，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的细胞是人类细胞。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的细胞存在于人体中。

32.包含权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子、权利要求13或14所述的核酸或权利要求15所述的细胞在制备用于治疗对象中的急性间歇性卟啉症的药物中的应用。