CN112996913B - 寡聚核酸分子及其应用 - Google Patents

Abstract

提供了用于治疗脊髓性肌萎缩症的小激活核酸分子及其应用。该小激活核酸分子包含正义核酸链和反义核酸链，正义核酸链和反义核酸链分别为长度为16‑35个核苷酸的寡核苷酸链，并且其中一条核苷酸链与选自靶基因SMN2启动子区的靶点存在至少75%的碱基同源性或互补性。也提供了包含小激活核酸分子和可选地药用载体的药物组合物；以及使用该小激活核酸分子或包含小激活核酸分子的药物组合物上调靶基因在细胞中表达及治疗由靶基因表达不足引起的疾病的方法。

Description

寡聚核酸分子及其应用

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体来讲，涉及基因激活相关的寡聚核酸分子及其用途。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种遗传性神经肌肉疾病，表现为进行性的骨骼肌和呼吸肌无力、萎缩，是导致2岁以下儿童死亡的首位遗传疾病。临床上根据发病年龄及病症严重程度分为4种类型，从最重的SMA I型到最轻的SMA IV型(1)。SMA为最常见的儿童期常染色体隐性遗传病之一，在活产婴儿中的发病率为1/11,000，而成人携带者的频率更是高达1/67至1/40(2)，中国人群携带率约为1/42(3)。

SMA是由于SMN1(运动神经元生存蛋白1，survival of motor neuron 1)基因突变引起的，同时SMA患者携带拷贝数不等的高度同源的SMN2基因(4；5)。SMN2和SMN1基因均位于染色体5q13区域，编码同一个被称为运动神经元生存蛋白(survival of motor neuron)(SMN)的蛋白质，与SMN1基因相比，SMN2基因有11个核苷酸位点有别于SMN1，其他序列完全相同。该11个核苷酸中只有一个核苷酸出现于SMN2的蛋白编码区，即7号外显子的第6位核苷酸的C被T替代(C6T)，而该区域为外显子的剪接增强子区。这一替代并不改变蛋白编码序列，但影响SMN2第7号外显子的有效拼接，导致大部分的SMN2的前体信使RNA(pre-mRNA)在拼接时遗漏掉7号外显子，翻译成大量不稳定的突变SMN蛋白(SMNΔ7)和少量正常功能的全长SMN蛋白(5；6)。因此，在SMA病人中，由SMN2产生的少量全长SMN蛋白的功能不足以代偿SMN1突变导致的SMN蛋白缺失。因此，任何能够增加来自SMN2基因的SMN全长蛋白表达的方法将有可能成为治疗SMA的有效方法。

采用小分子化合物或寡核苷酸来改变SMN2基因的剪接，从而增加全长蛋白的表达量，这一剪接调节策略已在动物SMA模型以及临床试验中得到验证(7-11)。其中，反义寡核苷酸Spinraza已于2016年被美国FDA批准为首个用于治疗儿童和成人脊髓性肌萎缩症的小核酸药物。尽管调节pre-mRNA剪接是个有效的治疗策略，但它受到SMN2 pre-mRNA可用量的限制，即如果SMN2 pre-mRNA本身的表达量恒定或者低下，在该药影响下产生的SMN全长蛋白的量也是有限的。另一个提高SMN蛋白水平的策略是提高SMN2的转录水平，进而增加SMN2全长蛋白的表达。有数据表明，小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitor，HDAC抑制剂)通过抑制组蛋白去乙酰化酶能够激活SMN2基因，提高SMN2转录水平，从而产生更多的SMN2 pre-mRNA，在SMA动物模型中也表现出良好的药效(12；13)，但在SMA病人中并未获得临床疗效，可能的原因是，小分子HDAC抑制剂在抑制组蛋白去乙酰化酶后导致很多基因的表达上调而不具备针对SMN2启动子的高特异性和高活性(14；15)。本发明独辟蹊径，提供了一种通过靶向SMN2启动子而高度特异性激活SMN2转录的小激活核酸分子。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于RNA激活过程的小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其通过激活/上调SMN2转录，提高全长SMN蛋白的表达量来治疗由全长SMN蛋白缺乏而导致的疾病或状况，如脊髓性肌萎缩症。

在本发明的一个一方面，提供了小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其激活或者上调细胞中SMN2基因的表达，所述的小激活核酸分子的一条链与SMN2基因的启动子区的长度为16-35个核苷酸的片段具有至少75％以上的同源或互补，启动子区是指包括转录起始位点上游的2000个核苷酸，从而实现所述基因表达的激活或者上调。具体地，所述小激活核酸分子的一条链与SMN2基因启动子中距转录起始位点-1639至-1481的区域(SEQID NO：476)、-1090至-1008的区域(SEQ ID NO：477)、-994至-180区域(SEQ ID NO：478)或-144至-37(SEQ ID NO：479)中的连续16-35个核苷酸长度的片段具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性或互补性。更具体地，所述小激活核酸分子的一条链与选自SEQ ID NO：315-471的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性或互补性。

在本发明中，所述小激活核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链结构核酸分子通过RNA激活机制促进SMN2基因在细胞中的表达。小激活核酸的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小激活核酸的至少一条链具有长度为0-6个核苷酸的3’突出端，优选情况下两条链具有长度为2或3个核苷酸的3’突出端，突出端的核苷酸优选为dT。当正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小激活核酸分子为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小激活核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为16-35个核苷酸，可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的小激活核酸分子的正义链与选自SEQ ID NO：1-157的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性，并且其反义链与选自SEQ ID NO：158-314的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约99％的同源性。具体地，本发明的小激活核酸分子的正义链包括选自SEQ ID NO：1-157的任一核苷酸序列，或者由选自SEQ IDNO：1-157的任一核苷酸序列组成，或者是选自SEQ ID NO：1-157的任一核苷酸序列；本发明的小激活核酸分子的反义链包括选自SEQ ID NO：158-314的任一核苷酸序列，或者由选自SEQ ID NO：158-314的任一核苷酸序列组成，或者是选自SEQ ID NO：158-314的任一核苷酸序列。

本文所述小激活核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的或未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，所述化学修饰为如下修饰中的一种或其组合：

(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。

本发明的化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都能稳定saRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，2’-氧甲基修饰，2’-氧亚乙基甲氧基修饰，2，4’-二硝基苯酚修饰，锁核酸(LNA)，2’-氨基修饰，2’-脱氧修饰。

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，5′-碘尿嘧啶修饰，N-甲基脲嘧啶修饰，2，6-二氨基嘌呤修饰。

这些修饰可以增加所述小激活核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进小激活核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小激活核酸分子的正义链或反义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜及核膜与细胞核内的基因启动子区发生作用。

本发明提供的小激活核酸分子在与细胞接触后可有效激活或上调细胞中SMN2基因的表达，优选情况下表达至少上调10％。

本发明的一个方面提供了编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸。在一个实施方式中，本发明的小核酸分子为小激活RNA(saRNA)分子。在一个实施方式中，所述核酸是DNA分子。

本发明的一个方面提供了包含本发明所述的小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的细胞。在一个实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞，优选地是人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。

本发明的另一方面提供了一种组合物(如药物组合物)，该组合物包含上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸以及(任选地)药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述药学上可接受的载体包括水性载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。在一个实施方案中，所述药学上可接受的载体选自水性载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。在一个实施方式中，所述水性载体可以是，例如，无RNA酶的水，或无RNA酶的缓冲液。所述组合物可以含有1-150nM，例如1-100nM，例如1-50nM，例如1-20nM，例如10-100nM、10-50nM、20-50nM、20-100nM，例如50nM的上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸。

本发明的另一方面涉及上文所述的小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物在制备用于激活/上调SMN2基因在细胞中表达的制剂中的应用。

本发明还涉及激活/上调SMN2基因在细胞中的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用上文所述的小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物。

上述小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物可以被直接导入细胞中，也可以是将编码该小激活核酸分子的核苷酸序列导入细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。该人体是患有由SMN全长蛋白表达减少、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病或症状的患者，并且所述小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含上述小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物被施以足够的量以实现对所述疾病或症状的治疗。具体情况下，所述由SMN全长蛋白量的缺乏、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的症状包括例如脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，所述由SMN全长蛋白表达不足或SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足引发的疾病是脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，本发明所述的脊髓性肌萎缩症包括SMA I型、SMA II型、SMA III型、和SMA IV型。

本发明另一方面提供了一种分离的SMN2基因小激活核酸分子作用位点，该位点具有SMN2基因的启动子区上任意连续的16-35个核苷酸序列，优选情况下，所述作用位点为选自SEQ ID NO：476-479的任一条序列上任意连续16-35个核苷酸序列。具体地，所述作用位点包括或选自SEQ ID NO：315-471的任一核苷酸序列所示的序列。

本发明的另一方面涉及治疗个体中由SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的上文所述的小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在一个实施方案中，所述由SMN全长蛋白表达不足或SMN1基因突变引发的疾病可以包括例如脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，所述由SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病是脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，本发明所述的脊髓性肌萎缩症包括SMA I型、SMA II型、SMA III型、和SMA IV型。

本发明的另一方面涉及本发明的小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸或包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸的组合物在制备用于治疗由SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病或状况的药物中的应用。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在一个实施方案中，所述由SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病可以包括例如脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，所述由SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病是脊髓性肌萎缩症。在一个实施方案中，本发明所述的脊髓性肌萎缩症包括SMA I型、SMA II型、SMA III型、和SMA IV型。

本发明的有益效果

本发明提供的激活/上调SMN2基因表达的小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其能够高效、特异地上调SMN2基因的表达并且增加全长SMN2 mRNA的表达量，同时具有较低的毒副作用，可用于制备治疗与SMN全长蛋白表达不足相关的病症、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病或状况的药物。

附图说明

图1为SMN2基因结构及用于设计小激活核酸分子的长度为2kb的启动子区域和引物设计位点示意图。(A)所示为SMN2基因结构及用于设计saRNA的长度为2kb的启动子区域。(B)为用于扩增SMN2 mRNA的RT-PCR引物设计。SMN F1+SMN R1为高通量筛选所用RT-qPCR引物；SMN F2+SMN R2为用于验证的RT-qPCR引物；SMN-exon6-F+SMN-exon8-R为用于常规RT-PCR的引物。

图2为小激活核酸分子介导的SMN mRNA表达改变。用靶向SMN2基因启动子的980个小激活核酸分子分别转染人胚胎肾细胞HEK293T，72小时后用一步法RT-qPCR分析SMN的mRNA表达。图示为相对于空白对照(Mock)处理980个小激活核酸分子引起的SMN表达改变从最高到最低排序。

图3为小激活核酸分子在SMN2启动子上的热点区域。靶向SMN2启动子的980个小激活核酸分子分别转染HEK293T细胞，72小时后用一步法RT-qPCR分析SMN mRNA表达。图示为相对于空白对照(Mock)处理的每个小激活核酸分子所致的SMN表达改变按照该小激活核酸分子在SMN2启动子上的靶点位置从-1949到-37排序。图示还包括4个热点区域(H1～H4，长方形框)的分布。上方的数字表示热点区域的界限(相对于SMN2转录起始位点)。

图4为随机选择的50个saRNA在HEK293T细胞中激活SMN基因表达的定量分析。用所示saRNA(n＝50，终浓度为20nM)转染HEK293T细胞。72小时后收集细胞用Qiagen Rneasy试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统对SMN进行qPCR扩增，同时扩增HPRT1和TBP基因并以其几何平均值作为内参。v轴为每个saRNA处理样本所致的SMN mRNA表达改变在用内参基因矫正后相对于空白对照(Mock)处理的改变值。dsCon2和siSMN2-1分别为无关序列双链RNA对照及SMN2小干扰RNA对照。

图5为SMN基因mRNA表达和DdeI限制性内切酶消化鉴定SMN PCR产物示意图。(A)SMN1基因与SMN2基因差异示意图。由于SMN2基因第8号外显子存在一个G→A的变异，而产生了一个Ddel的酶切位点。用引物SMN-exon6-F和SMN-exon8-R扩增cDNA得到(B)全长SMN产物(507bp)和/或外显子7跳跃缺失(SMN2Δ7)的产物(453bp)(C)。为了鉴别该两种产物的来源，将PCR产物用DdeI酶消化后凝胶电泳。来自全长SMN1产物不能被消化，来自全长SMN2的产物被消化成392bp和115bp(B)，而SMN2Δ7产物则会被消化成338bp和115bp的产物(C)。

图6为随机选择的50个saRNA在HEK293T细胞中增加全长SMN2 mRNA表达的电泳结果。用所示saRNA(n＝50，终浓度为20nM)转染HEK293T细胞。对照处理包括空白对照(Mock)、dsCon2、siSMN2-1及载体介导的过表达(SMN-vector)(分别为条带51、52、53和54)。72小时后收集细胞用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后进行常规RT-PCR扩增，同时扩增HPRT1作为内参。SMN基因扩增产物用Dde I消化后进行凝胶电泳，并对条带亮度进行定量。HPRT1扩增产物直接进行凝胶电泳。(A)为SMN基因扩增产物在DdeI消化后的凝胶电泳图；(B)为HPRT1扩增产物的凝胶电泳图；(C)中列出了(A)和(B)中条带的样本名称。FL：全长扩增产物；SMN2Δ7：外显子7跳跃缺失产物，SMN2部分(partial)：SMN2特异消化片段。黑色箭头标记为能够增加SMN2全长产物与外显子7跳跃缺失产物比值的saRNA。

图7为随机选择的50个saRNA特异性增加总SMN2 mRNA表达及增加全长SMN2表达。对图6中的电泳条带进行亮度定量分析，得出SMN2 mRNA的总表达量的改变(A)，及SMN2全长mRNA表达量与SMN2Δ7表达量的比值的改变(B)，数值为用内参基因HPRT1的条带亮度矫正后进一步用空白对照(Mock)处理的值进行归一化处理。

图8为saRNA激活SMN表达及增加全长SMN2 mRNA与蛋白表达的剂效关系。选取2个SMN2 saRNA(RAG6-281和RAG6-550)用所示浓度(1nM，10nM，20nM，50nM，100nM)分别转染HEK293T细胞72小时。收集细胞提取总RNA后进行逆转录以及游离蛋白质进行Western印迹分析。(A)用RT-qPCR方法检测的SMN总mRNA相对表达水平。同时扩增TBP与HPRT1并用二者的几何平均值作为内参。(B)常规RT-PCR扩增MSN mRNA，对扩增产物用DdeI消化后进行凝胶电泳。同时扩增HPRT1作为内参基因，扩增产物直接进行凝胶电泳。电泳图下方的数值(SMN2FL/Δ7)代表SMN2全长与SMN2Δ7比值相对于空白对照(Mock)处理的比值的改变量。(C)免疫印迹分析检测SMN蛋白表达，同时检测α/β微管蛋白(tubulin)作为内参蛋白。M：空白转染对照；C：dsCon2无关序列双链RNA对照；FL：全长扩增产物；SMN2Δ7：外显子7跳跃缺失产物。

图9为新生乳鼠基因组Smn1的PCR鉴定结果。来源为Smn1^+/-，SMN2^-/-与Smn1^-/-，SMN2^+/+的基因缺陷小鼠交配繁殖新生乳鼠，新生乳鼠通过基因组PCR鉴定Smn1为纯合缺失或杂合。Smn1纯合缺陷小鼠(SMA I型小鼠)的基因型为Smn1^-/-，SMN2^+/-。Smn1杂合小鼠(正常对照组)的基因型为Smn1^+/-，SMN2^+/-。SMA I型小鼠PCR条带为160bp；Smn1杂合小鼠(Het)PCR条带为160bp和180bp。

图10显示了SMN2-saRNA给药后SMA I型小鼠的运动能力。将获得的新生小鼠分为四组，分别为正常对照组鼠(Het)、SMA I型对照组鼠(未治疗)、in vivo-jetPEI包载SMN2-saRNA RAG6-539(DS06-0013B，1mg/mL)组和HKP包载SMN2-saRNA RAG6-538(DS06-0002B，2mg/mL)组。新生小鼠出生后第1天通过侧脑室注射(ICV)给药，在给药后的第7或8天通过翻转反射实验(扶正时间(rightingtime)测试)检测SMA I型小鼠的运动能力。

具体实施方式

在本发明中，相关术语采用如下定义：

如本文所用的术语“互补”是指两条寡核苷酸链彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的寡核苷酸链中的核苷酸之间通过氢键形成。互补寡核苷酸链可以Watson-Crick方式碱基配对(例如，A-T，A-U，C-G)，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen型或者反向Hoogsteen型碱基配对)进行碱基配对。

互补包括完全互补和不完全互补两种情况。完全互补或100％互补是指双链寡核苷酸分子的双链区中来自第一条寡核苷酸链的每个核苷酸可以与第二条寡核苷酸链相应位置的核苷酸形成氢键而没有“错配”的情况。不完全互补是指两条链的核苷酸单元不能全部互相氢键结合的情况。例如，对于两条双链区为20个核苷酸长度的寡核苷酸链，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出10％的互补性。在同一实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出90％的互补性。实质互补是指至少约75％，约79％，约80％，约85％，约90％，约95％或99％的互补。

如本文所用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物，并且包括但不限于DNA，RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链分子，包括规则地和不规则地交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸链，以及这些种类的寡核苷酸的修饰和以及天然存在的或非天然存在的骨架。本发明中所述的用于激活靶基因转录的寡核苷酸为小激活核酸分子。

如本文所用的术语“寡核苷酸链”和“寡核苷酸序列”可互换，是指35个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)。在本发明中，寡核苷酸链的长度可以是16至35个核苷酸的任一长度。

如本文所用的术语“基因”是指编码一条多肽链或转录一条功能RNA所需的全部核苷酸序列。“基因”可以是对于宿主细胞而言内源的或完全或部分重组的基因(例如，由于引入编码启动子的外源寡核苷酸和编码序列或将邻近内源编码序列的异源启动子导入宿主细胞)。例如，术语“基因”包括可以由外显子和内含子组成的核酸序列。编码蛋白质的序列是，例如，包含在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框中的外显子内的序列，如本文所用，“基因”可以指包括例如基因调控序列例如启动子，增强子和本领域已知的控制另一基因的转录，表达或活性的所有其他序列，无论另一基因是否包含编码序列或非编码序列。在一种情况下，例如，“基因”可以用于描述包含调控序列例如启动子或增强子的功能性核酸。重组基因的表达可以通过一种或多种异源调节序列来控制。

如本文所用的术语“靶基因”可以是天然存在于生物体中的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外和/或瞬时或稳定转染或掺入细胞和/或其染色质。靶基因可以为蛋白质编码基因，也可为非蛋白编码基因(例如微小RNA基因、长链非编码RNA基因)。靶基因通常含有启动子序列，设计与启动子序列具有同一性(也称同源性)的小激活核酸分子可以实现对靶基因的正向调控，表现为靶基因表达的上调。“靶基因启动子序列”是指靶基因的非编码序列，在本发明中涉及“与靶基因启动子序列互补”中靶基因启动子序列是指该序列的编码链，亦称非模板链，即为与该基因编码序列为同一序列的核酸序列。“靶点序列”是指靶基因启动子序列中小激活核酸分子的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸与之同源或互补的序列片段。

如本文所用，术语“正义链”、“正义寡核苷酸链”可互换，小激活核酸分子的正义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中含与靶基因的启动子序列的编码链具有同一性的第一核酸链。

如本文所用，术语“反义链”、“反义寡核苷酸链”可互换，小激活核酸分子的反义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中与正义寡核苷酸链互补的第二核酸链。

如本文所用的术语“编码链”是指靶基因中不能进行转录的那一条DNA链，该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致(在RNA中是以U取代了DNA中的T)。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的编码链是指与靶基因DNA编码链在同一条DNA链上的启动子序列。

如本文所用的术语“模板链”是指靶基因的双链DNA中与编码链互补的另一条链，可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补(A-U，G-C)。在转录过程中，RNA聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3′→5′方向移动，按照5′→3′方向催化RNA的合成。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的模板链是指与靶基因DNA模板链在同一条DNA链上的启动子序列。

如本文所用的术语“启动子”是指通过与蛋白质编码或RNA编码核酸序列在位置上关联而对它们的转录发挥调控作用的序列。通常，真核基因启动子包含100～5,000个碱基对，尽管此长度范围并不意味着限制本文所用的术语“启动子”。虽然启动子序列一般位于蛋白质编码或者RNA编码序列的5′端，但启动子序列也可存在于外显子及内含子序列中。

如本文所用的术语“转录起始位点”是指在基因的模板链上标志转录起始的核苷酸。转录起始位点可出现于启动子区的模板链上。一个基因可以有多于一个的转录起始位点。

如本文所用的术语“同一性”或“同源性”是指小激活RNA的其中一条寡核苷酸链(正义链或者反义链)与靶基因的启动子序列的某一区域的编码链或者模板链存在的相似性。在本文中，所述“同一性”或“同源性”可以是至少约75％，约79％，约80％，约85％，约90％，约95％或99％。

如本文所用的术语“突出”、“overhang”、“悬垂”可互换，是指寡核苷酸链末端(5′或3′)非碱基配对核苷酸，其是由延伸超出双链寡核苷酸内的其中一条链的另一条链产生的。延伸超出双链体3′和/或5′端的单链区域被称为突出。

如本文所用，术语“基因激活”或“激活基因”或“基因上调”或“上调基因”可互换，是指通过测量基因转录水平、mRNA水平、蛋白水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平、或其在细胞或生物系统中的活性或状态来测定某一核酸转录、翻译或表达或活性的增加。这些活动或状态可以直接或间接的测定。此外，“基因激活”、“激活基因”、“基因上调”、“上调基因”是指与核酸序列相关的活性增加，而不管发生这种激活的机制如何，例如其作为调节序列发挥调控作用、被转录成RNA，被翻译为蛋白质并增加蛋白质的表达。

如本文所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”、“小激活核酸分子”可互换，是指能够促进基因表达的核酸分子，并且可以由包含与靶基因的非编码核酸序列(例如启动子、增强子等)具有序列同一性的核苷酸序列的第一核酸片段(反义链，也称反义寡核苷酸链)和包含与第一核酸片段互补的核苷酸序列的第二核酸片段(正义链，也称有义链或正义寡核苷酸链)组成，其中所述第一核酸片段和第二核酸片段形成双链体。小激活核酸分子也可以由合成的或者载体表达的可形成双链区发夹结构的单链RNA分子组成，其中第一区域包含与基因的启动子靶序列具有序列同一性的核苷酸序列，第二区域包含的核苷酸序列与第一区域互补。小激活核酸分子的双链体区域长度通常为约10至约50个碱基对、约12个至约48个碱基对、约14个至约46个碱基对、约16个至约44个碱基对、约18个至约42个碱基对、约20个至约40个碱基对、约22个至约38个碱基对、约24个至约36个碱基对、约26个至约34个碱基对、约28个至约32个碱基对、通常约10个、约15个、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，术语“saRNA”、“小激活RNA”和“小激活核酸分子”还含有除核糖核苷酸部分之外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。

如本文所用，术语“热点”是指长度至少为30bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少30％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.2倍或以上。

如本文所用，术语“合成”是指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成RNA的方式，例如化学合成、体外转录、载体表达等。

本发明通过RNA激活方式上调SMN2基因的表达，通过增加全长SMN蛋白的表达量来治疗相关疾病，尤其是脊髓型肌萎缩症。本发明中SMN2基因有时也称为靶基因。

本发明提供的小激活核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。

所述小激活核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐及退火。

例如，本发明所述saRNA化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成

在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1微摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有saRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/氨水溶液(体积比为1∶3)，然后密封，置于25-70℃温箱中，孵育2-30小时，过滤含有saRNA的固相支持物的溶液并收集滤液，用双蒸水淋洗固相支持物2次(每次1毫升)并收集滤液，合并收集洗脱液，在真空条件下干燥1-12小时。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升正丁醇，高速离心收集沉淀即得到saRNA单链的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的saRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过高压液相色谱反相C18柱进行分离，得到纯化的saRNA单链产物。

(4)脱盐及退火

用体积排阻凝胶过滤法去除盐份，将正义链和反义链的寡聚核糖核酸单链按相同摩尔比混合在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，得到含有saRNA的溶液。

本研究发现，将上述saRNA导入细胞后，能够有效提高全长SMN2 mRNA和蛋白的表达。

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一靶向SMN2启动子的小激活核酸分子设计与合成

从UCSC基因组数据库(genome.ucsc.edu)获得SMN2基因从转录起始位点(TSS)到上游-2000bp的正义启动子序列。

为了筛选能够激活SMN2基因表达的功能性小激活RNA(saRNA)，以长度为2000bp的SMN2的启动子序列为模板(图1)，从TSS上游-2000bp处开始选定大小为19bp的靶点，通过每次移动1bp的方式，向TSS位点移动，获得总共1982个靶点序列。然后对靶点序列进行过滤处理，保留靶点序列的标准为：1)GC含量在35％～65％之间；2)不含有5个或者多于5个的连续同一核苷酸；3)不含多于3个的二核苷酸重复序列；4)不含多于3个的三核苷酸重复序列。过滤后，剩余980个靶点序列作为候选进入筛选过程。基于这些候选序列，化学合成相应的双链小激活RNA。其中，该实验中使用的双链小激活RNA的正义和反义链的长度均为21个核苷酸，所述双链saRNA的第一核糖核酸链(正义链)的5’区域的19个核苷酸与启动子靶点序列具有100％的同一性，其3’末端含有dTdT序列；第二核糖核酸链的5’区域的19个核苷酸与第一核糖核酸链序列互补，其3’末端含有dTdT序列。将前述双链saRNA的两条链以同等量的摩尔数混合，退火后形成双链saRNA。

实施例二靶向SMN2启动子的saRNA的高通量筛选

(1)细胞培养和转染

人胚胎肾细胞系HEK293T(

CRL-3216^TM)培养在DMEM培养基(Gibco)中；所有培养基均含有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％CO2，37℃条件下培养。HEK293T细胞以每孔5000个细胞接种在96孔板中，每孔使用0.3μl RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)以10nM的终浓度(除非另有说明)反向转染单个saRNA到HEK293T细胞中，转染持续时间为72小时。对照处理包括空白对照(Mock)、非特异性寡核苷酸双链体(dsCon2，正义链5’-ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]-3’(SEQ ID NO：472)，反义链5’-UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO：473))、SMN2小干扰RNA(siMSN2-1，正义链5’-GGGAUGAUACAGCACUGAU[dT][dT]-3’(SEQ ID NO：474)，反义链5’AUCAGUGCUGUAUCAUCCC[dT][dT]-3’(SEQ ID NO：475))，其中，空白对照(Mock)处理为省略核酸的转染处理。

(2)一步法RT-qPCR

转染结束后，弃掉培养基，每孔加入150μl PBS清洗一次，弃掉PBS，每孔加入100μl细胞裂解液(Power

Green Cells-to-Ct^TMKit，Life Technologies)，室温孵育5分钟。每孔取0.5μl细胞裂解液使用One Step TB Green^TM PrimeScrip^TM RT-PCR kit II(Takara，RR086A)以及Bravo Automated Liquid Handling Platform(Agilent)在RocheLightcycler 480进行qPCR分析，每个样本重复3个复孔扩增，PCR反应条件见表1。

表1.PCR反应制备

反应条件为阶段1反转录反应：42℃，5分钟；95℃10秒；阶段2PCR反应：95℃5秒，60℃20秒，扩增45个循环。以HPRT1及TBP为内参基因。SMN、HPRT1及TBP所用PCR引物见下表4，其中SMN用SMNF1/R1引物对扩增。

为了计算某个saRNA转染样本的SMN2(目的基因)的相对于对照处理(Mock)的表达值(E_rel)，用公式1代入目的基因及2个内参基因的Ct值计算。

E_rel＝2^(CtTm-CtTs)/((2^{(CtR1m-CtR1s)}*2^{(CtR2m-CtR2s)})^(1/2)) (公式1)

其中，CtTm为来自Mock样本的目的基因的Ct值，CtTs为来自saRNA处理样本的目的基因的Ct值，CtR1m为来自空白对照(Mock)处理样本的内参基因1的Ct值，CtR1s为来自saRNA处理样本的内参基因1的Ct值，CtR2m为来自Mock处理样本的内参基因2的Ct值，CtR2s为来自saRNA处理样本的内参基因2的Ct值。

(3)功能性saRNA筛选

为了获得能够激活SMN2转录的saRNA，用上述980个saRNA分别转染HEK293T细胞，转染浓度为10nM，72小时后裂解细胞进行一步法RT-qPCR分析得到每个saRNA处理样本的SMN2基因的相对(与空白对照(Mock)处理比较)表达值。如表2所示，分别有157个(16.02％)和416个(42.45％)saRNA显示出激活和抑制活性，407个(41.53％)saRNA对SMN2的表达不产生明显影响。激活的最大幅度为1.82倍，最大抑制幅度为0.33倍。这些具有激活活性的saRNA被称为功能性小激活核酸分子。其活性靶点序列、正义序列、反义序列以及SMN相对表达数据显示于表3。

表2.SMN2 saRNA的高通量筛选结果统计

表4.RT-qPCR分析的引物序列

图2进一步展示了SMN2 saRNA从高度激活到高度抑制的活性分布。同时，对980个saRNA的活性按照其在SMN2启动子上的位置排列，很明显地看到功能性saRNA的分布呈现聚集现象，即在有些启动子区域，激活性saRNA聚集在特定的“热点(hot spot)”区域(图3)。如图3所示，在启动子的-1639至-1481的区域(H1)、-1090至-1008的区域(H2)、-994至-180的区域(H3)和-144至-37的区域(H4)分别出现4个热点区域，表现为激活性saRNA的高度聚集。该分析结果表明激活性saRNA在启动子上并非随机分布，而是存在特定的热点区域。

热点H1(-1639至-1481)序列(SEQ ID NO：476)：

热点H2(-1090至-1008)序列(SEQ ID NO：477)：

热点H3(-994至-180)序列(SEQ ID NO：478)：

热点H4(-144至-37)序列(SEQ ID NO：479)：

实施例三能够激活SMN基因的功能性saRNA的进一步筛选和验证

为了进一步筛选和验证能够激活SMN基因的功能性saRNA，基于高通量筛选结果，申请人从157个具有激活活性的saRNA中随机选择50个saRNA进一步验证saRNA在HEK293T、HS27和NHDF细胞中对SMN基因表达的激活效果。用表5所示saRNA(n＝50，终浓度为20nM)分别转染HEK293T细胞、HS27细胞和NHDF细胞，细胞培养如实施例二所述。72小时后收集细胞用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统对SMN进行qPCR扩增，同时扩增HPRT1和TBP基因并以其几何平均值作为内参。图4显示了saRNA在HEK293T中对SMN基因表达的激活效果，表5中显示了saRNA在HS27和NHDF细胞中对SMN基因表达的激活效果。从这些结果可以看出，所验证的saRNA在不同细胞中对SMN基因表达均具有不同程度的激活作用，最高可激活19倍。

表5随机选择用于验证的50个saRNA

实施例四RT-PCR及酶切法检测SMN2的表达

由于SMN2基因与SMN1基因的高度相似性，上述所用RT-qPCR引物不足以区分SMN2与SMN1的mRNA序列。为了特异性检测SMN2 mRNA在saRNA处理后的表达改变，以及SMN2第7号外显子在mRNA前体拼接成成熟mRNA的过程中是否被剪切，用引物对SMN-exon6-F和SMN-exon8-R扩增来自saRNA处理细胞的cDNA，然后用DdeI酶消化PCR产物，对消化产物进行凝胶电泳后通过特定条带的亮度来判断SMN2基因的全长及有外显子7缺失(SMN2Δ7)的mRNA表达水平。具体方法如下：HEK293T细胞以2～3×10⁵细胞/孔接种在6孔板中，以10nM的终浓度反向转染寡核苷酸双链体saRNA。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)，按照其说明书提取细胞总RNA。使用含有gDNA Eraser(Takara，Shlga，日本)的PrimeScript RT试剂盒将RNA(1μg)反转录为cDNA，所用RT-PCR引物为SMN-exon6-F和SMN-exon8-R。采用Takara(RR010A)试剂进行普通PCR扩增所得cDNA，反应条件为：98℃10秒，60℃15秒，72℃32秒扩增28个循环具体见表6。PCR完成后将PCR产物用DdeI进行酶切用于区分SMN1和SMN2，随后将酶切产物用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，每个PCR产物或者酶切消化条带强度用Image Lab(BIO-RAD，Chemistry Doc^tmMP成像系统)进行分析，以Takara 100bp DNA梯状条带(3407A)的500bp条带(5μl加载量含有～150ng DNA)为参考标准然后用空白对照(Mock)进行归一化，酶切体系及条件见表7。以HPRT1为内参基因，所用引物序列列于表4。

本实施例中所用的SMN2过表达载体构建及转染过程如下：

从HEK293T细胞提取细胞总RNA，用OligodT引物进行逆转录获得cDNA，用PCR克隆引物cSMN2-F2(TAAGCA GGATCC ATG GCG ATG AGC AGC GGC GGC(SEQ ID NO：490))及cSMN2-R2(TAAGCA GAATTC TTA ATT TAA GGA ATG TGA GCA(SEQ ID NO：491))扩增SMN2全长ORF获得PCR产物。产物用BamHI和EcoRI酶消化。用同样的酶消化pcDNA3.1质粒(Invitrogen)。用T4连接酶连接消化的质粒与PCR产物。用连接反应产物转染感受态细胞DH5α，过夜培养扩增细胞后用Qiagen Miniprep试剂盒提取质粒。所得质粒(1μg)用Lipofectamine 3000(Invitrogen)转染进入HEK293T，72小时后收集细胞，提取总RNA，进行RT-PCR及酶切实验。

表6 RT-PCR体系及条件

表7 DdeI酶切反应体系及反应条件

内切体系组分(NEB，R0175L)	体积(μl)
		限制性内切酶DdeI	1
cDNA	8
		10×NEB缓冲液	1
总反应体积	10
		孵育温度	37℃
孵育时间	1h

根据图6和图7A所示，与空白对照(Mock)和对照寡核苷酸双链体(dsCON2)处理(条带51-52)相比，所有saRNA处理的细胞均展现出SMN2基因的总mRNA表达量明显增加，最高达2.49倍。同时，大部分(28个，56％)saRNA导致了SMN2基因的全长mRNA与外显子7缺失的mRNA表达之比值增加(图6黑色箭头所示，图7B)。

实施例五saRNA激活SMN表达及增加全长SMN2 mRNA和蛋白表达的量效关系研究

为了确定saRNA处理与SMN激活的剂量-效应关系，选取2个saRNA(RAG6-281和RAG6-550)以不同的浓度(1nM，10nM，20nM，50nM，100nM)分别转染HEK293T细胞，72小时后收集细胞提取RNA和蛋白，RNA样本通过反转录获得cDNA，然后分别进行RT-qPCR及常规RT-PCR扩增后DdeI酶切分析；对于蛋白质样本，用SMN特异性抗体进行蛋白质印迹分析，检测SMN蛋白表达水平。具体步骤如下：收集细胞，用细胞裂解液(1×RIPA缓冲液，Cell SignalingTechnology(CST)，Danvers，MA，USA，#9806)裂解。裂解液里加蛋白酶抑制剂(Sigma，Lot#126M4015v)。BCA法定量蛋白质样品，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完成后将蛋白样品转移到0.45μm的PVDF膜。用小鼠单克隆抗SMN(CST，#12976)或兔多克隆抗α/β-tubulin(微管蛋白)抗体(CST，#2148)对印迹进行检测，二抗分别用抗小鼠IgG，HRP-连接的抗体(CST，#7076)或抗兔IgG，HRP-连接的抗体(CST，#7074)。用Image Lab扫膜检测信号。

如图8A所示，RAG6-281和RAG6-550在转染浓度为1nM即能显著激活SMN mRNA表达达到1.5倍以上，在浓度为50nM时，它们对SMN的激活效果达到顶峰，分别上调SMN表达达到2.38和2.16倍，而浓度达到100nM时，SMN的表达并没有进一步增加。同时，申请人对这些cDNA样本进行常规PCR扩增后用DdeI酶消化，对消化产物进行凝胶电泳。结果提示RAG6-281及RAG6-550均上调了SMN1及SMN2的mRNA表达，与RT-qPCR的结果一致。通过定量分析SMN2全长条带与SMN2Δ7条带的比率，发现RAG6-281及RAG6-550在所有浓度均显著增加了SMN2全长mRNA的表达(图8B)。与空白对照(Mock)处理比较，RAG6-281在1，10，20，50和100nM的转染浓度分别增加SMN2全长mRNA与SMN2Δ7mRNA的比率为1.9，2.39，2.41，2.39和2.1倍；而RAG6-550在同样浓度增加SMN2全长mRNA与SMN2Δ7mRNA的比率分别为1.52，1.99，1.91，2.3和1.7倍。二者引起的改变在转染浓度从1nM到50nM范围内均表现出剂量依赖性(图8B)。进一步蛋白质印迹分析SMN蛋白表达的改变与SMN RT-qPCR的结果高度一致，表现为RAG6-281和RAG6-550均以浓度依赖的方式，显著上调SMN全长蛋白的表达(图8C)。但未能够检测到第7号外显子缺乏的SMN蛋白质(SMN2Δ7)条带，原因可能是SMN2Δ7蛋白质高度不稳定而不能被蛋白质印迹法检出，与以前文献报道的结果一致(Hua et al，PLoS Biol 2007；5(4)e73)。

实施例六.SMA I型小鼠体内验证saRNA对其运动能力的改善效果

(1)SMA I型小鼠模型的繁殖及鉴定

通过来源为Smn1^+/-，SMN2^-/-与Smn1^-/-，SMN2^+/+的基因缺陷小鼠交配以繁殖新生乳鼠(由北京瑞希罕见病基因治疗技术研究所提供)，新生乳鼠通过基因组PCR鉴定Smn1为纯合缺失或杂合，具体鉴定结果见图9。Smn1纯合缺陷小鼠(SMA I型小鼠)的基因型为Smn1^-/-，SMN2^+/-。Smn1杂合小鼠(正常对照组)的基因型为Smn1^+/-，SMN2^+/-。

(2)制备体内jetPEI和HKP包载的寡核苷酸

制备体内jetPEI制剂：将SMN2-saRNA RAG6-539(DS06-0013B)溶解于无RNase水(Invitrogen，2063810)中制成5mg/mL的储备液。取5μL DS06-0013B与12.5μL 10％葡萄糖溶液(Polyplus-transfection，G181106)和3.5μL无RNase水温和混匀，制备成DS06-0013B工作液。将该工作液加入到4μL体内-jetPEI(Polyplus-transfection，26031A1C)混匀，室温孵育15分钟，终浓度为1mg/mL。

制备HKP制剂：将SMN2-saRNA RAG6-538(DS06-0002B)溶解于无RNase水中制成4mg/mL的储备液。取HKP(苏州圣诺生物医药技术有限公司，AKF271/042-79-11)于无RNase水中溶解，制成16mg/mL的储备液。将7.5μL HKP储备液与7.5μL DS06-0002B储备液快速混合，室温放置30分钟，终浓度为2mg/mL。

(3)SMA I型小鼠侧脑室注射体内jetPEI和HKP包载的寡核苷酸

将获得的新生小鼠分为四组，分别为正常对照组鼠(Het)、SMA I型对照组鼠(未治疗)、体内jetPEI包载SMN2-saRNA(DS06-0013B，1mg/mL)组和HKP包载SMN2-saRNA(DS06-0002B，2mg/mL)组。在新生小鼠出生的第1天通过侧脑室注射(ICV)给药，注射体积为5μL，具体的给药途径、注射体积及给药时间点见表8。

表8.saRNA给药及对照组设置

(4)检测SMA I型小鼠的运动能力

在给药后的第7或8天通过翻转反射实验检测SMA I型小鼠的运动能力。具体实验简述如下：将保持正常站立姿势的小鼠完全反转放置，使其背部接触实验台面，四肢朝上，然后松开手开始计算小鼠完全恢复正常姿势的时间，时间记录单位为秒(s)，这个时间即为翻转反射时间(Righting-reflex time)或扶正时间。小鼠在60秒内仍然不能翻转至正常姿势则记录扶正时间为＞60秒。扶正时间反应了小鼠的运动能力，扶正时间越短，小鼠的运动能力越好，具体的小鼠扶正时间见表9。

表9.扶正时间测试

图10所示为SMN2-saRNA给药后SMA I型小鼠的运动能力。如表9中小鼠的扶正时间所示，正常对照组鼠(Het)的扶正时间均至2秒之内，而SMA I型对照组鼠(未治疗)扶正时间均大于12秒，有2只完全失去运动能力(扶正时间＞60秒)。经RAG6-538(DS06-0002B-H组)和DS06-0013B(DS06-0013B-J组)治疗的两组小鼠的扶正时间接近正常鼠，尤其是DS06-0002B-H组。与SMA I型对照组鼠比较，DS06-0002B-H组小鼠的扶正时间缩短了近10倍，DS06-0013B-J组小鼠的扶正时间缩短了2.5倍(表9，图10)。上述结果显示，在SMN2-saRNA给药后，SMA I型小鼠的运动能力可明显改善。这提示saRNA治疗能够延缓疾病发生时间。

综合上述结果，申请人通过高通量筛选靶向SMN启动子的saRNA，发现了多个能够显著激活SMN基因表达的saRNA。这些saRNA不仅以剂量依赖方式上调SMN2基因的表达，而且显著增加细胞内全长SMN2蛋白与SMN2A7蛋白的比例。同时体内实验证明，本发明的saRNA可明显改善SMA I型小鼠的运动能力。这些结果明确提示用靶向MSN2启动子的saRNA在转录水平激活SMN2转录来增加全长SMN蛋白的表达是具有很好前景的治疗SMA的策略。

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Claims (38)

1.一种小激活核酸分子，所述小激活核酸分子的一条链与SMN2基因启动子中距转录起始位点-1639至-1481的区域(SEQ ID NO: 476）、-1090至-1008的区域(SEQ ID NO: 477）、-994至-180的区域(SEQ ID NO: 478）或-144至-37(SEQ ID NO: 479）的区域中的任一长度为19个核苷酸的连续片段相同或互补，所述小激活核酸分子能够激活/上调SMN2基因的表达。

2.根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于包含正义核酸链和反义核酸链，所述正义核酸链和所述反义核酸链含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够激活SMN2基因在细胞中的表达。

3.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其中所述正义核酸链和反义核酸链存在于两条不同的核酸链上。

4.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其中所述正义核酸链和反义核酸链存在于同一条核酸链上，其中正义核酸链和反义核酸链的互补区域形成双链核酸结构。

5.根据权利要求4所述的小激活核酸分子，其为发夹型单链核酸分子。

6.根据权利要求3所述的小激活核酸分子，其特征在于至少一条链具有长度为0至6个核苷酸的3’突出端。

7.根据权利要求6所述的小激活核酸分子，其特征在于两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3’突出端。

8.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其特征在于正义核酸链和反义核酸链的长度分别为19至35个核苷酸。

9.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其特征在于正义核酸链和反义核酸链的长度分别为19个核苷酸。

10.根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于所述小激活核酸分子的一条链与选自SEQ ID NO:315-471的任一核苷酸序列相同或互补。

11.根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其特征在于其正义核酸链包括选自SEQ IDNO:1-157的任一核苷酸序列；或其正义核酸链选自SEQ ID NO:1-157的任一核苷酸序列，并且其反义核酸链包括选自SEQ ID NO:158-314的任一核苷酸序列；或其反义核酸链选自SEQID NO:158-314的任一核苷酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的小激活核酸分子，其中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸。

13.根据权利要求12所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

（1）对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

（2）对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；

（3）对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。

14.编码权利要求1-11中任一项所述的小激活核酸分子的核酸。

15.根据权利要求14所述的核酸，其特征在于所述核酸是DNA分子。

16.包含权利要求1-13中任一项所述的小激活核酸分子或权利要求14或15所述的核酸的细胞。

17.包含权利要求1-13中任一项所述的小激活核酸分子或权利要求14或15所述的核酸，和任选地药学上可接受的载体的组合物。

18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体包括或选自水性载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。

19.根据权利要求17或18所述的组合物，其中所述组合物含有1-150 nM的所述小激活核酸分子。

20.权利要求1-13中任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14-15中任一项所述的核酸、或权利要求17-19中任一项所述的组合物在制备用于治疗个体中由SMN蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的疾病或状况的药物中的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，其中所述疾病或状况包括遗传性神经肌肉疾病。

22.根据权利要求21所述的应用，其中所述疾病或状况是脊髓性肌萎缩症。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的应用，其中所述个体是哺乳动物。

24.根据权利要求23所述的应用，其中所述个体是人。

25.权利要求1-13的任一项的小激活核酸分子、权利要求14-15中任一项所述的核酸、或权利要求17-19中任一项所述的组合物在制备用于激活/上调SMN2基因在细胞中表达的制剂中的应用。

26.根据权利要求25所述的应用，其中所述的小激活核酸分子、所述的核酸、或所述的组合物被直接导入所述细胞中。

27.根据权利要求26所述的应用，其中所述的小激活核酸分子是在编码该小激活核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生的。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的应用，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。

29.根据权利要求28所述的应用，其中所述的细胞是人类细胞。

30.根据权利要求28所述的应用，其中所述的细胞存在于人体中。

31.根据权利要求30所述的应用，其中所述的人体是患有由SMN蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失或全长蛋白表达不足、和/或SMN2全长蛋白表达不足引发的症状的患者，并且所述小激活核酸分子、所述核酸、或所述组合物被施用有效剂量以实现对所述症状的治疗。

32.根据权利要求31所述的应用，其中所述由SMN全长蛋白表达缺乏引发的症状包括遗传性神经肌肉疾病。

33.根据权利要求32所述的应用，其中所述由SMN全长蛋白表达缺乏引发的症状是脊髓性肌萎缩症。

34.激活/上调SMN2基因在细胞中的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用权利要求1-13中任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14-15中任一项所述的核酸、或权利要求17-19中任一项所述的组合物，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的的方法。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的小激活核酸分子、所述的核酸、或所述的组合物被直接导入所述细胞中。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的小激活核酸分子是在编码该小激活核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生的。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的细胞是人类细胞。

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