CN117295819A - 用于抑制补体组分3表达的组合物和方法 - Google Patents

用于抑制补体组分3表达的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了用于靶向补体组分3(C3)mRNA的含有有义链和反义链的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。该RNAi寡核苷酸可用于抑制细胞中的C3表达、水平和/或活性。此外，本文描述了用于使用寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)来预防或治疗由补体途径激活或失调介导的疾病、病症或病状的方法。

Description

用于抑制补体组分3表达的组合物和方法
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表以创建于2021年4月20日的名为50694-093WO3_Sequence_Listing_4_18_22_ST25_FINAL的文件的形式提供，其大小为77,827字节。电子格式的序列表中的信息通过援引以其全文并入本文。
背景技术
补体系统在免疫复合物的清除和对感染因子、外源抗原、被病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫应答中起重要作用。补体由一组超过50种形成先天免疫系统的一部分的蛋白质组成。补体系统用于保护身体免受微生物感染并起到维持组织止血的作用。补体是紧密调节的酶促级联，可通过以下三种途径之一激活：经典途径，其中抗体复合物触发激活；替代途径，其通过称为“空转(tickover)”的过程以低水平组成性激活，并且其可通过细菌病原体或受损的组织表面扩增；或凝集素途径，其通过在某些微生物(包括某些细菌、真菌和病毒)上发现的甘露糖残基引发。补体途径的不受控制的激活或不足的调节会导致全身性炎症、细胞损伤和组织损害。因此，补体途径与许多不同疾病的发病机制有关。补体途径活性的抑制或调节已被认为是一种有前景的治疗策略。可用于这些疾病的治疗选项的数量是有限的。因此，开发治疗与补体途径激活或失调相关的疾病的创新策略是显著未满足的需求。
无论哪种补体途径启动该过程，补体激活都会在级联中的补体组分3(C3)处汇合。C3蛋白是驱动几种关键生物过程的核心，这些生物过程包括：补体激活，病原体、免疫复合物和受损细胞的调理和去除，以及体液免疫和T细胞适应性免疫应答的调节。
C3是补体系统中不可或缺的蛋白质，其有助于启动补体途径级联。通过经典途径、替代途径或凝集素途径的C3激活导致C3切割成分裂产物C3a和C3b。C3a是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的强效过敏毒素和趋化诱导剂。C3b在替代途径中参与C3转化酶的形成，并在所有三种补体途径中参与C5转化酶的形成，这进而推动补体级联进一步激活下游末端补体。C5切割导致形成C5a(也是一种强效趋化驱动剂和过敏毒素)和C5b(其与补体蛋白C6、7、8和9在病原体或组织表面上快速组装成孔形成复合物C5b-9)。因此，C3可能是抑制或沉默的理想靶标，以便选择性抑制补体途径，作为用于治疗与补体途径激活或失调相关的疾病的方法。
发明内容
本文描述了靶向已知在补体途径激活中起作用的补体组分(C3)的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，包括有义和反义链寡核苷酸)。RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐(例如，其钠盐)可用于治疗患有与补体途径激活或失调相关的疾病的患者。
在一个方面，本披露内容提供了一种用于降低补体组分3(C3)表达的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，该寡核苷酸包含有义链和反义链，其中该有义链和该反义链形成双链体区域。该反义链包含与SEQ ID NO:13或14的C3 mRNA靶序列的互补区域，并且该互补区域的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，该有义链的长度为15至50个核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个核苷酸)。在一些实施例中，该有义链的长度为18至36个核苷酸(例如，长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36个核苷酸)。在一些实施例中，该反义链的长度为15至30个核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸)。在一些实施例中，该反义链的长度为22个核苷酸，并且该反义链和该有义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为至少20个核苷酸的双链体区域。在一些实施例中，该有义链的长度为36个核苷酸，并且该反义链和该有义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为至少20个核苷酸的双链体区域。在一些实施例中，互补区域的长度为至少19个连续核苷酸，任选地长度为至少20个核苷酸。
在一些实施例中，该有义链的3'端包含如S1-L-S2所示的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L形成长度为3-5个核苷酸的S1与S2之间的环。在一些实施例中，L是三环(triloop)或四环(tetraloop)。在一些实施例中，L是四环。在一些实施例中，该四环包含SEQ ID NO:8的核酸序列。在一些实施例中，S1和S2的长度为1-10个核苷酸，其中任选地，S1和S2具有相同的长度。在一些实施例中，S1和S2的长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。在一些实施例中，S1和S2长度为6个核苷酸。在一些实施例中，茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施例中，茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性(例如，与SEQ ID NO:7具有至少95％、96％、97％、98％、99％和100％同一性)的核酸序列。在一些实施例中，茎环区域包含SEQ ID NO:7。在一些实施例中，茎环包含相对于SEQ ID NO:7具有至多1、2或3个取代、插入或缺失的核酸。
在一些实施例中，该反义链包含长度为一个或多个核苷酸的3'突出端序列。在一些实施例中，该反义链包含至少2个连接的核苷酸的3'突出端。在一些实施例中，该3'突出端序列的长度为2个核苷酸，其中任选地，该3'突出端序列为GG。
在一些实施例中，有义链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在一些实施例中，反义链包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。在一些实施例中，该有义链和反义链包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：(a)分别为SEQ ID NO:1和3，和(b)分别为SEQ ID NO:4和6。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:37中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:38中所示的核苷酸序列，如化合物A所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQID NO:39中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:40中所示的核苷酸序列，如化合物B所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:41中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:42中所示的核苷酸序列，如化合物C所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:43中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列，如化合物D所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:46中所示的核苷酸序列，如化合物E所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:47中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列，如化合物F所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:49中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:50中所示的核苷酸序列，如化合物G所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ ID NO:51中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQID NO:52中所示的核苷酸序列，如化合物H所示。在一些实施例中，该有义链包含SEQ IDNO:53中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含SEQ ID NO:54中所示的核苷酸序列，如化合物I所示。
本文提供了一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含有义链和反义链，其中该有义链具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列，并且该反义链具有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，该有义链与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)的序列同一性，并且该反义链与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6中的至少一者具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施例中，该有义链具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核酸序列，并且该反义链具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的核酸序列。在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。在其他实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。
在一些实施例中，该反义链与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。
在一个实施例中，该有义链包含与该反义链不互补的茎环区域和与该反义链基本上互补的双链体区域。在另一个实施例中，该双链体区域包含20至22个核苷的长度。
在其他实施例中，该茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)同一性的核酸序列。在一些实施例中，该茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％和99％)同一性的核酸序列。在一些实施例中，茎环区域包含SEQ ID NO:7。
在一些实施例中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐在反义链的5'端的第一位置处包含尿苷。在一些实施例中，该尿苷包含磷酸酯类似物。在一些实施例中，该磷酸酯类似物是4'-O-单甲基膦酸酯。在一些实施例中，包含该磷酸酯类似物的尿苷包括以下结构：
在一些实施例中，该寡核苷酸包含至少一个(例如，至少2、5、10、15、20、30和40个)经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸包含20至50个经修饰的核苷酸(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个经修饰的寡核苷酸)。在一些实施例中，该寡核苷酸包含20至40个(例如，25至40个、30至40个、35至40个、30至35个、25至35个、20至25个、21至30个和31至40个)经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的所有核苷酸都被修饰。在一些实施例中，至少一个(例如，至少2、5、10、15、20、30和40个)经修饰的核苷酸包含2'修饰。在一些实施例中，2'-修饰是2'-氟或2'-O-甲基，其中任选地，2'-氟修饰是2'-氟脱氧核糖核苷和/或2'-O-甲基修饰是2'-O-甲基核糖核苷。
在一个实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含40至50个(例如，41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个)2'-O-甲基修饰，其中任选地，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含40至50个(例如，41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个)2'-O-甲基核糖核苷。在一个实施例中，该有义链的核苷酸1-7、11-27和31-36中的至少一个(例如，至少2个、至少5个、至少10个、至少20个和至少30个)核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在一个实施例中，该有义链的核苷酸1-7、11-27和31-36中的10至30个(例如，12至28个、12至24个、12至20个、12至16个、16至30个、20至30个和24至30个)核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在一个实施例中，该有义链的核苷酸1-7、12-27和31-36中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在一些实施例中，该有义链的核苷酸1、2、4-7、11、14-16、18-27和31-36中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、9、11、13、15、17、18和20-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。
在另一个实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含5至15个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14和15个)2'-氟修饰，诸如2'-氟脱氧核糖核苷。在一些实施例中，该有义链的核苷酸3、8、9、10、11、12、13和17中的至少一个(例如，至少2、3、4、5、6或7个)核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟(诸如2'-氟脱氧核糖核苷)修饰。在另一个实施例中，该有义链的核苷酸3、8、9、10、11、12、13和17中的2至4个核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟(诸如2'-氟脱氧核糖核苷)修饰。在另一个实施例中，该有义链的核苷酸8、9、10和11中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟(诸如2'-氟脱氧核糖核苷)修饰。
在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含至少一个(例如，至少2个、至少5个、至少10个、至少20个和至少30个)经修饰的核苷酸间键合。在一些实施例中，该至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐在有义链的核苷酸1与2之间以及反义链的核苷酸1与2之间、2与3之间、20与21之间和21与22之间具有硫代磷酸酯键合。
在一个实施例中，该有义链与该反义链之间没有核苷酸间键合。
在一些实施例中，寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体缀合。在一些实施例中，每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。在一些实施例中，每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施例中，GalNAc部分是一价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包括与该有义链缀合的一至五个2'-O-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施例中，茎环的L的至多4个核苷酸缀合至一价GalNAc部分。在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐包含一至五个(例如，2、3、4和5个)缀合至该有义链的GalNAc部分。在一些实施例中，至少一个(例如，至少2个或至少3个)GalNAc部分缀合至该有义链的环区域(SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，在该有义链上的核苷酸位置28-30处的核苷酸中的一个或多个与一价GalNAc部分缀合。在一些实施例中，在该有义链上的位置28-30处的核苷酸中的每一个与一价GalNAc部分缀合。
在一些实施例中，在该有义链上的位置28-30处的核苷酸包括以下结构：
Z表示键、点击化学手柄或长度为1至20个且包括端值的连续共价键合原子的接头，其选自由以下各项组成的组：取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基以及它们的组合；并且X为O、S或N。在一些实施例中，Z为缩醛接头。在一些实施例中，X为O。在一些实施例中，在该有义链上的位置28-30处的核苷酸包括以下结构：
在一些实施例中，在该有义链上的位置28-30处的核苷酸包括以下结构：
在一个实施例中，该反义链的长度为13至27个(例如，13至25个、13至22个、13至20个、13至18个、13至15个、15至27个、18至27个、20至27个、22至27个和25至27个)核苷酸。在一个实施例中，该反义链的长度为22个核苷酸。
在另一个实施例中，该有义链的长度为20至50个(例如，22至50个、25至50个、30至50个、35至50个、40至50个、45至50个、20至45个、20至40个、20至35个、20至30个、20至25个、20至22个)核苷酸。在一个实施例中，该有义链的长度为30至40个(例如，31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个)核苷酸。
在一些实施例中，该有义链与该反义链形成双链体。在一些实施例中，双链体结构包含该有义链的全部或一部分与该反义链的全部或一部分之间的双链体。在一些实施例中，互补区域的长度为20至30个(例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个)核苷酸。在一些实施例中，该反义链和/或该有义链包含至少2个(例如，至少3个、至少4个或至少5个)连接的核苷酸的3'突出端。在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐是双链核糖核酸(dsRNA)。在一些实施例中，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐是单链核糖核酸。
在一些实施例中，RNA寡核苷酸包含药学上可接受的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。
在另一个方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的任一种寡核苷酸(例如，任何RNAi寡核苷酸，或其药学上可接受的盐)以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在另一个方面，本披露提供了一种载体，该载体编码本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐的至少一条链。
在另一个方面，本披露提供了一种载体，该载体编码本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐的至少一条链，该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐具有SEQ ID NO:33-36中任一个的DNA序列。
在另一个方面，本披露提供了一种细胞，该细胞包含本文所述的载体或本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本披露提供了一种细胞，该细胞包含本文所述的载体或本文所述的任何寡核苷酸(例如，任何RNAi寡核苷酸，或其药学上可接受的盐)。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗由补体途径激活或失调介导的疾病的方法，该方法包括使受试者的细胞与本文所述的任何寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)、本文所述的药物组合物、本文所述的载体或本文所述的细胞接触。在一些实施例中，使该细胞接触足以获得C3的mRNA转录物的降解的时间。在一些实施例中，该细胞中C3的表达降低。在一些实施例中，该细胞中C3的转录减少。在一些实施例中，该细胞中C3的水平和/或活性降低。在一些实施例中，C3的水平和/或活性相对于未施用本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞的受试者的细胞中C3的水平和/或活性降低10％至100％(例如，降低10％至90％、10％至80％、10％至70％、10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％和90％至100％)。在一些实施例中，C3的水平和/或活性相对于未施用本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞的受试者的细胞中C3的水平和/或活性降低50％至99％(例如，50％至90％、50％至80％、50％至70％、50％至60％、60％至99％、70％至99％、80％至99％和90％至99％)。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。
在另一个方面，本披露提供了一种用于降低细胞、细胞群或受试者中的C3表达的方法，该方法包括以下步骤：i)使该细胞或该细胞群与本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物或载体接触；或ii)向该受试者施用本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、本文所述的药物组合物或载体。在一些实施例中，降低C3表达包括降低C3 mRNA的量或水平、C3蛋白的量或水平或两者。在一些实施例中，C3mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者相对于未施用本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞的受试者的细胞中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者降低10％至100％(例如，降低10％至90％、10％至80％、10％至70％、10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％和90％至100％)。
在一些实施例中，C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者相对于未施用本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞的受试者的细胞中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者降低50％至99％(例如，50％至90％、50％至80％、50％至70％、50％至60％、60％至99％、70％至99％、80％至99％和90％至99％)。
在一些实施例中，该受试者被鉴定为患有由补体途径激活或失调(例如，替代补体途径、经典补体途径和/或凝集素途径的失调)介导或与其相关的疾病。在一些实施例中，由补体途径激活或失调介导或与其相关的疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。在一些实施例中，该受试者被鉴定为患有抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR。
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)的方法，该方法包括使受试者的细胞与本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞接触。在一些实施例中，本文所述的任一种RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞用于在预防或治疗有需要的受试者的抗体介导的排斥(AMR)诸如慢性AMR(cAMR)中使用。
在一些实施例中，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞被配制用于每日、每周、每月或每年施用。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞被配制用于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻腔、舌下、鞘内和皮内施用。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、载体或细胞被配制用于皮下施用。
在一个实施例中，该寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐)或其组合物被配制用于每日、每周、每月或每年施用。在一个实施例中，该寡核苷酸被配制用于皮下、静脉内、肌内、口服、鼻腔、舌下、鞘内和皮内施用。在一个实施例中，该寡核苷酸被配制用于皮下施用。在一个实施例中，该寡核苷酸被配制用于以约0.1mg/kg至约150mg/kg的剂量施用。(例如，0.1mg/kg至125mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至75mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至25mg/kg、0.1mg/kg至15mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至150mg/kg、25mg/kg至150mg/kg以及50mg/kg至150mg/kg)。在一个实施例中，该寡核苷酸被配制用于以约0.5mg/kg至约15mg/kg(例如，0.5mg/kg至13mg/kg、0.5mg/kg至10mg/kg、0.5mg/kg至5mg/kg、0.5mg/kg至1mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、5mg/kg至15mg/kg以及10mg/kg至15mg/kg)的剂量施用。
在一些实施例中，该寡核苷酸被配制用于与一种或多种额外的治疗剂组合施用。
在另一个方面，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，或其药学上可接受的盐)、本文所述的药物组合物、本文所述的载体或本文所述的细胞。
在另一个方面，本披露提供了本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，或其药学上可接受的盐)、本文所述的药物组合物、本文所述的载体或本文所述的细胞，用于在预防或治疗由补体途径激活或失调(例如，替代、经典和/或凝集素途径的激活或失调)介导或与其相关的疾病中使用。
在另一个方面，本披露提供了本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，或其药学上可接受的盐)、药物组合物、组合物、载体或细胞，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐、药物组合物、组合物、载体或细胞被施用或被配制用于皮下施用。
附图说明
图1A示出了化合物A的反义链的化学结构。
图1B示出了化合物A的有义链的化学结构。
图1C-1和图1C-2示出了化合物A的RNAi寡核苷酸的化学结构。
图1D示出了化合物A的有义链和反义链的核酸序列。
图1E示出了化合物A的双链寡核苷酸的示意图。
图2A-1和图2A-2示出了化合物B的有义链和反义链的化学结构。
图2B示出了化合物B的有义链和反义链的核酸序列。
图3A是示出在HepG2细胞中完成的体外筛选的结果的图，该体外筛选测量用1nM量的各种寡核苷酸处理细胞后剩余的C3 mRNA的百分比。
图3B是示出在HepG2细胞中完成的体外筛选的结果的图，该体外筛选测量用0.1nM和1nM量的各种寡核苷酸处理细胞后剩余的C3 mRNA的百分比。
图4A是化合物A-I的RNAi寡核苷酸的示意图。
图4B是示出水动力注射后化合物A、B和C在表达人C3 cDNA的CD-1小鼠中的体内筛选结果的图。与磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照组相比，在施用单个皮下剂量的1mg/kg化合物A，B和C后四天，肝脏中人C3 mRNA百分比的RT-qPCR测量结果。
图4C是示出水动力注射后化合物A、D、E、F、G、H和I在表达人C3 cDNA的CD-1小鼠中的体内筛选结果的图。与PBS对照组相比，在施用单个皮下剂量的0.5mg/kg化合物A、D、E、F、G、H和I后四天，肝脏中人C3 mRNA百分比的RT-qPCR测量结果。
图5是示出与作为对照施用的PBS相比，在给药前、用单剂量的4mg/kg化合物A、化合物B或化合物C-I中的任一种治疗后28天和56天，食蟹猴(cynomolgus macaques)肝脏中C3 mRNA百分比的测量结果的图。
图6A是示出与作为对照施用的PBS相比，在第0天、第28天、第56天和第84天用1mg/kg或2mg/kg化合物A或化合物B治疗后食蟹猴肝脏中C3 mRNA百分比的测量结果的图。
图6B是示出与作为对照施用的PBS相比，在用1mg/kg或2mg/kg化合物A或化合物B治疗后食蟹猴血清中C3百分比的测量结果的图。
图7是示出在单剂量的2mg/kg化合物A或化合物B后28天，以食蟹猴肝脏中的C3mRNA测量的化合物A和化合物B的近似ED50的图。
图8是示出在第0天、第28天、第56天和第84天用2mg/kg化合物A或化合物B治疗后食蟹猴血清中补体活性(AP)百分比的图，如通过基于ELISA的功能测定所测量的。以与对照组相同的多剂量方案施用PBS。
图9是示出在第0天、第28天、第56天和第84天用1mg/kg或2mg/kg化合物A治疗后食蟹猴血清中裂解百分比的图，如通过兔红细胞溶血法所测量的。以与对照组相同的多剂量方案施用PBS。
图10A是示出与作为对照施用的PBS相比，在施用单个皮下剂量的0.5mg/kg、1mg/kg和6mg/kg化合物J后，CD-1小鼠肝脏中C3 mRNA百分比的RT-qPCR测量结果的图。对肝脏敲低水平进行70天的跟踪，并在每个时间点处死5只小鼠用于测量。
图10B是示出与作为对照施用的PBS相比，在施用单个皮下剂量的0.5mg/kg、1mg/kg和6mg/kg化合物J后70天内，CD-1小鼠血清中C3循环蛋白百分比的ELISA测定测量结果的图。
图11是示出在672小时的时段内施用单个皮下剂量的6mg/kg化合物J的CD-1小鼠的血浆、肝、肾和脾组织中siRNA暴露量的茎环-qPCR测量结果的图。在每个时间点处死五只小鼠用于测量。
图12A是示出与作为对照施用的PBS相比，在第0天、第14天、第28天和第42天施用4剂1mg/kg或6mg/kg化合物J后70天内，CD-1小鼠肝脏中C3 mRNA百分比的RT-qPCR测量结果的图。
图12B是示出在第0天、第14天、第28天和第42天施用4剂1mg/kg或6mg/kg化合物J后70天内，CD-1小鼠中C3血清蛋白的ELISA测定测量结果的图。将C3水平计算为相对于PBS对照组(n＝5/时间点)测量的C3血清水平的百分比。
图13A是示出在第0天、第14天、第28天和第42天给药4剂1mg/kg化合物J的CD-1小鼠的肝组织中化合物J的浓度的茎环-qPCR测量结果的图。
图13B是示出在第0天、第14天、第28天和第42天给药4剂1mg/kg化合物J的CD-1小鼠的血清中化合物J的浓度的茎环-qPCR测量结果的图。
图14是一组图像，其示出了荧光标签与C3和备解素的原位杂交，用于监测与作为对照的原初C57BL/6小鼠和年龄匹配的经PBS治疗的NZB/W F1相比，在21至37周龄期间每月用0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg的化合物J治疗(持续18周)的NZB/W F1小鼠的肾脏中的肾小球补体沉积。
图15A是示出在21周龄时每月接受皮下剂量的0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J并在29周龄时终止后，NZB/W F1小鼠的肝脏中C3 mRNA的百分比的图(n＝10/时间点)。
图15B是示出在21周龄时每月接受皮下剂量的0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J并在29周龄时终止后，NZB/W F1小鼠的C3血清蛋白的百分比的图(n＝10/时间点)。
图16A是示出从21周龄开始已经用0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J皮下给药的29周龄NZB/W F1小鼠中通过IgG捕获测量循环免疫复合物的450nm处测量的吸光度的图。
图16B是示出从21周龄开始每月给药0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J的37周龄NZB/W F1小鼠中通过C1q捕获测量循环免疫复合物的450nm处测量的吸光度的图。
图17是一组图像，其示出了荧光标签与C3和备解素的原位杂交，用于监测与PBS对照组相比，在8至16周龄期间每两周用皮下剂量的6mg/kg化合物J治疗的MRL/Ipr小鼠的肾小球上的补体沉积。
图18是一组图像，其示出了荧光标签与C3和备解素的原位杂交，用于监测与PBS对照组相比，在4至8月龄期间每月用0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J治疗(持续4个月)的CFH-/-小鼠的肾脏中的肾小球补体沉积。最后一次给药后4周收集肾脏并进行成像。
图19是示出与作为对照组的施用PBS的CFH-/-小鼠相比，在4至8月龄期间每月用0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J治疗(持续4个月)的CFH-/-小鼠的肝脏中C3 mRNA百分比的RT-qPCR测量结果的图。
图20A是示出来自胶原抗体诱导的关节炎模型的后爪的临床评分的图，在该模型中，在第0天诱导关节炎并在第3天施用LPS加强剂，然后在第-7天、第0天和第7天用3剂1mg/kg或6mg/kg剂量的化合物J进行预防性治疗。PBS治疗的CAIA动物用作对照组。
图20B是示出来自胶原抗体诱导的关节炎模型的后爪的临床评分的图，在该模型中，在第0天诱导关节炎并在第3天施用LPS加强剂，然后在疾病诱导后的第5天用单剂1mg/kg或6mg/kg剂量的化合物J进行治疗性治疗。PBS治疗的CAIA动物用作对照组。
图21A是CAIA小鼠模型第11天的后爪炎症的一组图像，在该模型中，在第0天施用胶原抗体诱导关节炎，并在第3天施用LPS加强剂，然后在第-7天、第0天和第7天用3剂6mg/kg剂量的化合物J进行预防性治疗。PBS治疗的CAIA动物用作对照组。
图21B是CAIA小鼠模型第13天的后爪炎症的一组图像，在该模型中，在第0天施用胶原抗体诱导关节炎，并在第3天施用LPS加强剂，然后在疾病诱导后的第5天用单个6mg/kg剂量的化合物J进行治疗性治疗。PBS治疗的CAIA动物用作对照组。
图22A是H&E染色的一组图像，其证明在第-7天、第0天和第7天用3剂6mg/kg剂量的化合物J进行预防性治疗后，后爪的单核细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作炎症的阴性和阳性对照。
图22B是H&E染色的一组图像，其证明在CAIA诱导的关节炎小鼠模型中在疾病诱导后的第5天用单个6mg/kg剂量的化合物J进行治疗性治疗后，后爪的单核细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作炎症的阴性和阳性对照。
图23是番红O染色和H&E染色的一组图像，前者证明在第-7天、第0天和第7天用3剂6mg/kg化合物J对动物进行预防性治疗后，CAIA诱导的关节炎模型的膝关节中软骨侵蚀和血管翳形成的预防，后者证明单核细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图24A是H&E染色的一组图像，其证明在疾病诱导后的第5天用单剂6mg/kg化合物J对动物进行治疗性治疗后，CAIA诱导的关节炎模型的膝关节中单核细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图24B是番红O染色的一组图像，其证明在疾病诱导后的第5天用单剂6mg/kg化合物J对动物进行治疗性治疗后，CAIA诱导的关节炎模型的膝关节中软骨侵蚀和血管翳形成的预防。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图25是CAIA诱导的关节炎动物的后爪的淋巴细胞(CD45+)染色的一组图像，其证明在疾病诱导后的第5天用单剂6mg/kg化合物J进行治疗性治疗后，免疫细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图26是CAIA诱导的关节炎动物的后爪的中性粒细胞和巨噬细胞(CD11b+)染色的一组图像，其证明在疾病诱导后的第5天用单剂6mg/kg化合物J进行治疗性治疗后，免疫细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图27是CAIA诱导的关节炎动物的后爪的巨噬细胞(F4/80+)染色的一组图像，其证明在疾病诱导后的第5天用单剂6mg/kg化合物J进行治疗性治疗后，免疫细胞浸润减少。原初和PBS治疗的CAIA动物分别用作阴性和阳性对照。
图28是荧光标签与C3 mRNA(红色)原位杂交的一组图像，用于监测在疾病诱导后的第5天用单个6mg/kg剂量的化合物J进行治疗性治疗后，CAIA诱导的动物的局部补体表达和后爪的CD45+细胞(绿色-淋巴细胞)浸润。
图29是示出来自使用MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的2个实验的平均临床评分的图，其中在第0天诱导疾病并在第0天和第1天接受2个剂量的百日咳毒素，然后从疾病诱导后的第7天开始用5次每周剂量的6mg/kg剂量的化合物J进行治疗性治疗。将PBS治疗的EAE动物用作疾病阳性对照，并将C3缺陷型(C3-/-)用作C3表达的阴性对照。
图30是与原初PBS治疗的EAE小鼠(疾病对照)和C3缺陷型小鼠MOG诱导的EAE相比，在5次每周剂量的6mg/kg化合物J后，MOG诱导的EAE小鼠的Luxol快速蓝脊髓染色的一组代表性图像。
图31A是示出与原初PBS治疗的EAE小鼠(阳性对照)、原初C3缺陷型小鼠(C3-/-)和C3缺陷型小鼠MOG诱导的EAE(阴性对照)相比，在5次每周剂量的6mg/kg化合物J后，MOG诱导的EAE小鼠中肝脏C3 mRNA的量的图。
图31B是示出与原初PBS治疗的EAE小鼠(疾病阳性对照)、原初C3缺陷型小鼠(C3-/-)和C3缺陷型小鼠MOG诱导的EAE(C3表达的阴性对照)相比，在5次每周剂量的6mg/kg化合物J后，MOG诱导的EAE小鼠中血清C3的量的图。
图32A是示出施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴血浆中化合物A的平均浓度与时间(小时)的关系的图。
图32B是示出施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴肝脏中化合物A的平均浓度与时间(小时)的关系的图。
图33是示出与盐水(对照)相比，通过SC或IV注射单剂3mg/kg化合物A后，食蟹猴肝脏中C3 mRNA表达的平均百分比(±SD)的图。
图34是示出与盐水(对照)相比，施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴血清中C3蛋白的平均表达(±SD)的图。
图35是示出与盐水(对照)相比，施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴中补体C3经典途径活性的图。
图36是示出与盐水(对照)相比，施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴中补体C3凝集素途径活性的图。
图37是示出与盐水(对照)相比，施用单个IV或SC剂量的3mg/kg化合物A后，食蟹猴中补体C3替代途径活性的图。
定义
如本文所用，术语“约”和“大约”是指为所述值的±10％并且任选地为所述值的±5％，或更任选地为所述值的±2％的量。
如本文所用，“施用”是指向受试者提供药物制剂的任何方法。本文所述的寡核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法施用。用于施用寡核苷酸的合适方法可以包括例如口服、注射(例如，静脉内、腹膜内、肌内、玻璃体内和皮下)、滴注制剂等。施用寡核苷酸的方法可以包括皮下施用。如本文所述制备的寡核苷酸可以多种形式施用，这取决于待治疗的病症和受试者的年龄、状况和体重，如本领域已知的。制剂可以预防性地施用；也就是说，施用以降低发展疾病或病状的可能性。
如本文所用，“降低C3的水平和/或活性的药剂”是指本文披露的任何寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其可用于(例如，施用)降低细胞或受试者中(诸如受试者的细胞或血清中)C3的水平或表达。“降低C3的水平”、“降低C3的表达”和“降低C3的转录”意指降低细胞或受试者中C3 mRNA和/或C3蛋白的水平、降低其表达或降低其转录，例如，通过向该细胞或受试者施用RNAi寡核苷酸(诸如本文所述的那些)。C3 mRNA和/或C3蛋白的水平可以使用本领域已知的任何方法测量(例如，通过测量细胞或受试者中C3 mRNA的水平或C3蛋白的水平)。与治疗前相比或相对于未经治疗的受试者(例如，患有与补体激活或失调(例如，C3的激活或失调)相关的疾病或病症的受试者)或相对于对照受试者(例如，健康受试者(例如，没有与补体激活或失调(例如，C3的激活或失调)相关的疾病或病症的受试者))中C3 mRNA或C3蛋白的水平，降低可以是细胞或受试者中C3 mRNA和/或C3蛋白的水平、表达或转录降低约5％或更多(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％)。C3可以是任何C3(诸如例如小鼠C3、大鼠C3、猴C3或人C3)，以及C3的变体或突变体。因此，在基因操纵的细胞、细胞群或生物体的上下文中，C3可以是野生型C3、突变型C3或转基因C3。“降低C3的活性”还意指降低与C3相关的活性水平(例如，通过降低与由补体途径激活或失调介导的疾病相关的补体途径的激活)。C3的活性可降低约5％或更多(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％)。C3的活性水平可以使用本领域已知的任何方法测量。相对于未用本文披露的RNAi寡核苷酸治疗的细胞或受试者，降低可以是C3 mRNA和/或C3蛋白的水平、表达或转录降低至少约5％或更多(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％)。C3 mRNA和/或C3蛋白的水平、表达或转录的这种降低可以持续至少一天或更长时间(例如，至少2天、3天、4天、5天、10天、15天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天或更长时间)。降低可以是经治疗的受试者(例如，人类受试者)的血液中C3蛋白的量降低至少75-175mg/dL(例如，75-100mg/dL、75-125mg/L、75-150mg/dL、150mg/dL-175mg/dL、125-175mg/dL和100-175mg/dL)。
术语“替代核苷”或“替代核苷酸”是指具有替代糖或替代核碱基的核苷，诸如本文所述的那些。替代核苷可以包括这样的核苷，其中通过将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶来修饰核碱基部分，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自以下的“替代核碱基”：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑基-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿苷、5-溴尿苷、5-噻唑基-尿苷、2-硫代-尿苷、假尿苷、1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。替代核苷还可以包括其中糖部分被修饰的核苷；例如，2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基胞嘧啶、2'-O-甲基尿苷、2-氟-脱氧腺苷、2-氟-脱氧鸟苷、2-氟-脱氧胞苷和2-氟-脱氧尿苷。
具有替代尿嘧啶的示例性核碱基包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-ara-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-ara-尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
具有替代胞嘧啶的示例性核碱基包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘代-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布林(zebularine)、5-氮杂-泽布林、5-甲基-泽布林、5-氮杂-2-硫代-泽布林、2-硫代-泽布林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖氨酸(k2C)、α-硫代-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-ara-胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-ara-胞苷。
具有替代腺嘌呤的示例性核碱基包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯代-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯代-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-ara-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-ara-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
具有替代鸟嘌呤的示例性核碱基包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2'-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2, 7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2'-F-ara-鸟苷和2'-F-鸟苷。
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有等同功能的替代核碱基。
如本文所用，术语“反义”是指与基因、初级转录物或加工后的mRNA(例如，C3的序列(例如，SEQ ID NO:12))的全部或一部分充分互补以干扰内源性基因(例如，C3)的表达的寡核苷酸。
术语“反义链”和“向导链”是指RNAi寡核苷酸(例如，dsRNA)的链，其包含与靶序列(例如，C3 mRNA(例如，SEQ ID NO:12))基本上互补的区域。
在一个数字或一系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包括的所有随后的数字或整数，如从上下文清楚的。例如，核酸分子中的核苷酸数目必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子的至少10个核苷酸”是指10-21个核苷酸的范围，诸如例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸，具有指定的性质。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用，术语“减弱”意指减少或有效地停止。作为非限制性实例，本文提供的一种或多种治疗可减少或有效停止受试者中由补体途径激活或失调(例如，C3激活或失调)介导的疾病的发作或进展。这种减弱可以通过例如与补体途径激活或失调相关的疾病(诸如例如，一种或多种与本文披露的补体途径激活或失调相关的疾病)的一个或多个方面(例如，症状、组织特性以及细胞、炎性或免疫活性等)的降低来举例说明。
术语“cDNA”是指与mRNA序列DNA等同的核酸序列(即，具有被胸苷取代的尿苷)。通常，术语cDNA和mRNA可关于特定基因(例如，C3基因)互换使用，因为本领域技术人员将理解，除了尿苷被解读为胸苷外，cDNA序列与mRNA序列相同。
如本文所用，术语“C3”和“互补组分3”是指编码互补组分3的蛋白质或基因。术语“C3”是指野生型C3蛋白的天然变体，诸如与NCBI参考号：NP_000055.2或SEQ ID NO:11中所示的野生型人C3的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％同一性或更高)的蛋白质。术语“C3”还指野生型C3多核苷酸的天然变体，诸如与NCBI参考号：NM_000064.4或SEQID NO:12中所示的野生型人C3的核酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％同一性或更高)的多核苷酸。
如本文所用，“组合疗法”或“与...组合施用”意指向受试者施用两种(或更多种)不同的药剂或治疗，作为针对特定疾病或病状的既定治疗方案的一部分。治疗方案限定了每种药剂的剂量和施用周期，使得单独药剂对受试者的作用重叠。在一些实施例中，两种或更多种药剂的递送是同时的或并行的，并且药剂可以是共同配制的。在一些实施例中，两种或更多种药剂不是共同配制的并且作为规定方案的一部分以顺序方式施用。在一些实施例中，组合施用两种或更多种药剂或治疗使得症状或与病症相关的其他参数的减少大于单独递送一种药剂或治疗或在不存在另一种药剂或治疗的情况下将观察到的减少。两种治疗的作用可以是部分加性的、完全加性的或大于加性的(例如，协同的)。可以通过任何适当的途径来实现每个治疗剂的顺序施用或基本上同时施用，这些途径包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内途径和通过粘膜组织的直接吸收。治疗剂可通过相同途径或通过不同途径施用。例如，组合的第一治疗剂可通过静脉内注射施用，而组合的第二治疗剂可口服施用。
如本文所用，术语“补体途径激活或失调”是指补体途径(包括经典途径、替代途径和凝集素途径)提供针对病原体的宿主防御和清除免疫复合物和受损细胞以及进行免疫调节的能力的任何异常。补体途径激活或失调可能发生在流体相中和细胞表面处，并可能导致补体激活过度或调节不足，两者均引起组织损伤。
如本文所用，“互补的”当用于描述与第二核苷酸或核苷序列相关的第一核苷酸或核苷序列时，是指包含第一核苷酸或核苷序列的寡核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员所理解的。此类条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃，持续12-16小时，随后洗涤(参见例如，“Molecular Cloning:Alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社])。可以应用其他条件，诸如生物体内可能遇到的生理相关条件。本领域技术人员将能够根据杂交核苷酸或核苷的最终应用来确定最适于测试两个序列的互补性的一组条件。如本文所用，“互补”序列还可以包括非沃森-克里克碱基对和/或由非天然和替代核苷酸或核苷形成的碱基对或完全由它们形成，只要满足上述关于它们的杂交能力的要求。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。如本文所描述的，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)内或寡核苷酸与靶序列之间的互补序列包括包含第一核苷酸或核苷序列的寡核苷酸与包含第二核苷酸或核苷序列的寡核苷酸在一个或两个核苷酸或核苷序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可称为彼此“完全互补”。当第一序列被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交后形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配碱基对，形成至多30个碱基对的双链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，通过RISC途径降低表达。“基本上互补”还可以指与感兴趣的mRNA(例如，编码C3的mRNA)的连续部分基本上互补的寡核苷酸。例如，如果序列与编码C3的mRNA的不间断部分基本上互补，则寡核苷酸与C3 mRNA的至少一部分互补。然而，当两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，就互补性的确定而言，这些突出端不应被视为错配。例如，包含一个长度为22个连接的核苷的寡核苷酸和另一个长度为20个核苷的寡核苷酸的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可被称为“完全互补的”，以用于本文所述的目的，即使它们具有不同的长度。
如本文所用，“互补寡核苷酸”是能够根据标准沃森-克里克互补规则进行碱基配对的那些。具体地，嘌呤将与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对的组合(G:C)，并且在DNA的情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA的情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)。应当理解，即使两个寡核苷酸彼此不完全互补，它们也可以彼此杂交，条件是每个寡核苷酸具有至少一个与另一个基本上互补的区域。
如本文所用，短语“使细胞与寡核苷酸接触”包括通过本领域已知的方法使细胞与寡核苷酸，诸如单链寡核苷酸或双链寡核苷酸(例如，形成双链体的单链RNA或双链RNA)接触。使细胞与寡核苷酸接触包括使细胞在体外与寡核苷酸接触或使细胞在体内与寡核苷酸接触。接触可以直接或间接进行。因此，例如，执行该方法的个体可以将寡核苷酸与细胞物理进行物理接触，或者替代性地，可以将RNAi寡核苷酸置于允许或导致其随后与细胞接触的环境中。在体外接触细胞可以例如通过将细胞与寡核苷酸一起温育来进行。在体内接触细胞可以例如通过以下方式进行：将寡核苷酸注射到细胞所在的组织中或其附近，或将RNAi寡核苷酸注射到另一区域(例如，血流或皮下空间)中，使得药剂随后将到达待接触的细胞所在的组织。例如，寡核苷酸可以包含和/或偶联至将寡核苷酸引导至感兴趣的位点的配体，或者可以整合至将寡核苷酸递送至感兴趣的靶位点的载体(例如，病毒载体)中。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与寡核苷酸接触并随后移植到受试者中。
术语“连续核碱基区域”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域(例如，RNAi寡核苷酸的反义链)。该术语在本文中可以与术语“连续核苷酸序列”或“连续核碱基序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸都存在于连续的核苷酸或核苷区域中。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续的核苷酸区域并且可以任选地包含另外的核苷酸或核苷。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或不互补。存在于连续的核苷酸区域的核苷酸之间的核苷间键合可以包括硫代磷酸酯核苷间键合。另外，连续的核苷酸区域可以包括一个或多个糖修饰的核苷。
如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比在其戊糖的2'位置处具有替代羟基的氢的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是具有除2'位置之外的原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代。
如本文所用，术语“疾病”是指身体功能、系统或器官的中断、停止或病症。感兴趣的疾病或病症包括将受益于用本文所述的靶向C3的寡核苷酸(例如，形成本文所述的双链体的单链或双链RNA构建体)进行治疗(诸如通过本文所述的治疗方法)的那些疾病或病症。可使用本文所述的组合物和方法治疗的由补体途径激活或失调介导或与其相关的疾病或病症的非限制性实例包括，例如，皮肤病、神经系统病症、肾病、紧急护理(acute care)、风湿病、肺病、皮肤病、血液病和眼科病症，诸如例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。
如本文所用，关于核酸(例如，寡核苷酸)的术语“双链体”是指通过两个反平行核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。
如本文所用，降低C3(例如，在细胞或受试者中)的水平和/或活性的药剂(例如，本文所述的RNAi寡核苷酸)的术语“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当向受试者(包括人)施用时足以实现有益或所需的结果(包括临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其所应用的上下文。例如，在治疗与补体途径激活或失调相关的疾病的上下文中，与在不施用降低C3的水平和/或活性的药剂的情况下所获得的反应相比，降低C3的水平和/或活性的药剂的量足以实现治疗反应。将与这种量对应的本文所述的降低C3的水平和/或活性的给定药剂的量将根据各种因素(诸如给定药剂、药物配制品、施用途径、疾病或病症的类型、受试者的身份(例如，年龄、性别和/或体重)或被治疗的宿主等)而变化，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。此外，如本文所用，本披露的降低C3的水平和/或活性的药剂的“治疗有效量”是与对照相比在受试者中产生有益或所需的结果的量。如本文所定义的，本披露的降低C3的水平和/或活性的药剂的治疗有效量可由普通技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。
如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含在组合物中以例如提供或有助于所需稠度或稳定作用的非治疗剂。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别表示分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸，但除了核糖和脱氧核糖之外，还可以包含替代糖部分。还应当理解，术语“核苷酸”还可以指替代核苷酸，如下文进一步详述的，或替代物置换部分。技术人员很清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分置换，而基本上不改变包含带有这种置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本披露中表征的寡核苷酸的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别用鸟嘌呤和尿嘧啶置换，以与靶mRNA形成G-U Wobble碱基配对。含有此类置换部分的序列适用于本披露中表征的组合物和方法。
如本文所用，术语“抑制剂”是指降低蛋白质(例如，C3)的水平和/或活性的任何药剂。抑制剂的非限制性实例包括寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，例如，dsRNA、siRNA或shRNA)。如本文所用，术语“降低”可与“沉默”、“下调”、“抑制”和其他类似术语互换使用，并包括降低5％或更多(例如，10％、15％、25％、35％、50％、75％和100％)的任何水平。在健康人的血清中发现的C3蛋白的典型水平为约75-175mg/dL(例如，75-100mg/dL、75-125mg/L、75-150mg/dL、150mg/dL-175mg/dL、125-175mg/dL和100-175mg/dL)。
“水平”意指蛋白质或编码该蛋白质的mRNA(例如，C3)的水平或活性，任选地与参考相比。该参考可以是任何有用的参考，如本文所定义的。蛋白质的“降低的水平”或“增加的水平”分别是指与参考相比，蛋白质水平的降低或增加(例如与参考相比，例如，降低或增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多；例如与参考相比，降低或增加大于约10％、约15％、约20％、约50％、约75％、约100％或约200％；例如与参考相比，降低或增加小于约0.01倍、约0.02倍、约0.1倍、约0.3倍、约0.5倍、约0.8倍或更少；或者例如与参考相比，降低或增加大于约1.2倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.8倍、约2.0倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.5倍、约5.0倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更多)。蛋白质或mRNA的水平可以质量/体积(例如，g/dL、mg/mL、μg/mL、ng/mL)或相对于样品中总蛋白质或mRNA的百分比表示。
如本文所用，术语“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其两侧为彼此充分互补的核酸的两个反平行区域，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中或在细胞中)，位于未配对区域两侧的两个反平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸间键合”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键合相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键合。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键合。通常，经修饰的核苷酸间键合赋予存在经修饰的核苷酸间键合的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以提高热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸具有一个或多个与相应参考核苷酸缀合的化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予存在经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以提高热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
“带切口的四环结构”是RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于存在分开的有义(过客)链和反义(向导)链，其中有义链具有与反义链的互补区域，并且其中至少一条链，通常是有义链，具有四环，该四环被配置成稳定在该至少一条链中形成的相邻茎区域。带切口的四环结构引起有义链和反义链的核苷酸发生单个断裂，使得它们不再在该位点通过共价键合连接。
术语“核碱基”和“碱基”包括存在于在核酸杂交中形成氢键的核苷和核苷酸中的嘌呤(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分。在本披露的上下文中，术语核碱基还涵盖可以不同于天然存在的核碱基但在核酸杂交过程中是功能性的替代核碱基。在本文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及替代核碱基。此类变体在例如Hirao等人(Accountsof Chemical Research[化学研究评述],第45卷:第2055页,2012)和Bergstrom(CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.[核酸化学实验室指南增刊]37 1.4.1,2009)中进行了描述。
术语“核苷”是指具有核碱基和糖部分的寡核苷酸的单体单元。核苷可包括天然存在的那些以及替代核苷，诸如本文所述的那些。核苷的核碱基可以是天然存在的核碱基或替代核碱基。类似地，核苷的糖部分可以是天然存在的糖或替代糖。
如本文所用，“核苷酸”是指包含核苷和核苷间键合的寡核苷酸的单体单元。核苷间键合可以包括或不包括磷酸酯键合。类似地，“连接的核苷”可以通过或不通过磷酸酯键合连接。许多“替代核苷间键合”是本领域已知的，包括但不限于磷酸酯键合、硫代磷酸酯键合和硼代磷酸酯键合。替代核苷包括双环核苷(BNA)(例如，锁定核苷(LNA)和限制乙基(cEt)核苷)、肽核苷(PNA)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和天然核苷的磷酸酯主链的其他变体，包括本文所述的那些。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指短核酸，例如，长度小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、dicer底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施例中，寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
如本文所用，术语“突出端”是指由延伸超过互补链末端的一条链或区域产生的末端非碱基配对核苷酸，该一条链或区域与该互补链形成双链体。在一些实施例中，突出端包含从寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的5'末端或3'末端处的双链体区域延伸的一个或多个未配对核苷酸。在某些实施例中，突出端是寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的反义链或有义链上的3'或5'突出端。
如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指基于对治疗疾病或病症的需要鉴定受试者，该疾病或病症诸如为由补体失调(例如，与C3相关的失调，诸如一种或所有补体途径(例如，替代途径、经典途径和/或凝集素途径)的失调)介导的疾病。例如，基于本领域技术人员(例如，医师)的早期诊断，受试者可被鉴定为需要治疗疾病或病症(例如，与本文披露的补体途径激活或失调相关的疾病或病症)。
关于参考寡核苷酸或多肽序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考寡核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。用于确定百分比核酸或氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较计算机程序BLAST生成百分比序列同一性值。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B的百分比序列同一性(其替代性地表述为给定核酸或氨基酸序列A与给定核酸或氨基酸序列B具有一定的百分比序列同一性)计算如下：
100乘以(分数X/Y)
其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序(例如,BLAST)评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中的核酸总数。应当理解，当核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度时，A与B的百分比序列同一性将不等于B与A的百分比序列同一性。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物之外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)，并且具有对患者基本上无毒和无炎的性质。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(磷酸氢钙)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”意指本文所述的任何化合物中的化合物的任何药学上可接受的盐。例如，本文所述的任何化合物的药学上可接受的盐包括在合理的医学判断范围内的那些，其适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应，并且与合理的益处/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，药学上可接受的盐描述于以下文献中：Berge等人,J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]66:1-19,1977以及Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐：性质、选择和用途],(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编辑),Wiley-VCH[威利-VCH出版社],2008。盐可以在本文所述化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或通过使游离碱基团与合适的有机酸反应单独制备。本文所述的化合物可以具有可电离基团，以便能够制备为药学上可接受的盐。这些盐可以是涉及无机酸或有机酸的酸加成盐，或者在本文所述化合物的酸性形式的情况下，这些盐可以由无机碱或有机碱制备。通常，化合物作为药学上可接受的盐制备或使用，这些药学上可接受的盐作为药学上可接受的酸或碱的加成产物制备。合适的药学上可接受的酸和碱以及制备合适的盐的方法是本领域熟知的。盐可以由药学上可接受的无毒酸和碱(包括无机和有机酸和碱)制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有本文所述的化合物(例如，RNAi寡核苷酸)的组合物，其与药学上可接受的赋形剂一起配制，并且任选地在政府管理机构批准下制造或销售，作为用于治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分。药物组合物可以被配制成例如用于皮下施用、用于静脉内施用(例如，作为不含微粒栓子的无菌溶液并且在适合于静脉内使用的溶剂体系中)；用于鞘内注射；用于脑室内注射；用于实质内注射；用于以单位剂量形式(例如，片剂、胶囊、囊片、胶囊锭或糖浆)口服施用；用于局部施用(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；或任何其他药学上可接受的配制品。
如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间性质的化学部分。在一些实施例中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处代替5'-磷酸酯，其通常易于酶促去除。在一些实施例中，5'磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键合。磷酸酯类似物的实例包括5'膦酸酯，诸如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施例中，寡核苷酸在5'-末端核苷酸处的糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的实例是氧甲基膦酸酯(其中氧甲基的氧原子与糖部分结合(例如，在其4'-碳处))或其类似物。参见例如US2019/0177729，其中每一者的涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文。已经针对寡核苷酸的5'末端开发了其他修饰(参见例如，WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等人(2015),NucleicAcids Res.[核酸研究],43(6):2993-3011，这些文献中的每一篇中涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文)。
如本文所用，术语“探针”是指能够选择性结合特定序列的任何分子，例如，核酸分子，诸如mRNA。探针可以使用本领域熟知且常规的方法合成或衍生自适当的生物制剂。探针可以专门设计用于标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
如本文所用，术语基因的“降低的表达”是指与适当的参考细胞或受试者相比，细胞或受试者中由基因编码的RNA转录物或蛋白质的量的降低和/或基因活性的量的降低。例如，与未用RNAi寡核苷酸(例如，具有与C3 mRNA序列互补的反义链的寡核苷酸)处理的细胞相比，用RNAi寡核苷酸处理细胞的作用可导致RNA转录物的量、蛋白质和/或活性(例如，由C3基因编码)降低。类似地，如本文所用，“降低表达”是指导致基因(例如，C3)表达降低的作用。如本文所描述的，表达的降低可以通过C3血清浓度的降低(例如，相对于例如未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞)来评估。替代性地，表达的降低可以通过C3 mRNA的转录和/或翻译水平的降低(例如，相对于例如未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞，降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％或60％或更多，诸如降低1％-60％或更多)来评估。
“参考”是指用于比较蛋白质或mRNA水平或活性的任何有用的参考。参考可以是用于比较目的的任何样品、标准品、标准曲线或水平。参考可以是正常参考样品或参考标准品或水平。“参考样品”可以是例如对照，例如预定的阴性对照值，诸如“正常对照”或取自同一受试者的先前样品；来自正常健康受试者的样品，诸如正常细胞或正常组织；来自未患有疾病的受试者的样品(例如，细胞或组织)；来自被诊断患有疾病但尚未用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；来自已经用本文所述的化合物治疗的受试者的样品；或已知正常浓度的纯化的寡核苷酸或蛋白质(例如，本文所述的任一种)的样品。“参考标准品或水平”是指源自参考样品的值或数字。“正常对照值”是指示非疾病状态的预定值，例如健康对照受试者中预期的值。通常，正常对照值表示为范围(“介于X与Y之间”)、高阈值(“不高于X”)或低阈值(“不低于X”)。具有特定生物标志物的正常对照值内的测量值的受试者通常被称为该生物标志物的“在正常限度内”。正常参考标准品或水平可以是源自未患有疾病或病症(例如，与补体途径激活或失调相关的疾病或病症)的正常受试者的值或数字；已经用本文所述的化合物治疗的受试者。在优选的实施例中，参考样品、标准品或水平通过以下标准中的至少一项与受试者样品匹配：年龄、体重、性别、疾病阶段和总体健康状况。在正常参考范围内的纯化的寡核苷酸或蛋白质(例如，本文所述的任一种)的水平的标准曲线也可用作参考。
如本文所用，术语“互补区域”是指寡核苷酸的反义链上与基因、初级转录物，序列(例如，靶序列，例如C3核苷酸序列)或加工后的mRNA的全部或一部分基本上互补以便干扰内源性基因(例如，C3)的表达的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以在分子的内部或末端区域。通常，最容忍的错配处于末端区域中，例如，在寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的5'-末端和/或3'-末端的5、4、3或2个核苷酸内。
如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2'位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸是具有除2'位置之外的原子的一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代。
如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(向导)的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于切割靶mRNA，或(b)具有单个反义链的单链寡核苷酸，其中反义链(或该反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶用于切割靶mRNA。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸包括含有如本文所定义的术语的核苷的环区域，诸如茎环。RNAi寡核苷酸包括例如dsRNA、siRNA和shRNA，它们通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。RNAi寡核苷酸通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。RNAi寡核苷酸降低细胞中C3的表达，该细胞例如受试者诸如哺乳动物受试者中的细胞。通常，RNAi寡核苷酸的大多数核苷是核糖核苷，但如本文详细描述的，每条链或两条链也可以包含一个或多个非核糖核苷，例如，脱氧核糖核苷和/或替代核苷。RNAi寡核苷酸基本上呈双链体形式。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成的。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价连接的核酸链的反平行核苷酸序列之间形成。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，通过发夹)以提供碱基配对在一起的互补反平行核苷酸序列的单条核酸链形成。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸包含两条彼此完全双链化的共价分离的核酸链。然而，在一些实施例中，RNAi寡核苷酸包含两条共价分离的核酸链，它们部分双链化，例如，在一端或两端具有突出端。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸包含部分互补的反平行核苷酸序列，并且因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或末端错配。
如本文所用，术语“有义链”和“过客链”是指RNAi寡核苷酸的包含与反义链的区域基本上互补的区域的链。有义链的与反义链的区域互补的区域与靶基因(例如，C3基因)的一部分至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％)相同。例如，有义链可具有与SEQ ID NO:12的一部分至少85％相同的区域，例如，至少10至36个核苷酸，诸如例如，10至31个核苷酸、10至26个核苷酸、10至20个核苷酸或10至15个核苷酸的长度。
术语“siRNA”和“短干扰RNA”(也称为“小干扰RNA”)是指长度为约10-50个核苷酸的RNA药剂，任选地RNAi药剂，这些链任选地具有包含例如1、2或3个突出连接的核苷的突出末端，其能够指导或介导RNA干扰。天然存在的siRNA通过细胞的RNAi机制(例如，Dicer或其同源物)从较长的dsRNA分子(例如，长度>25个连接的核苷)产生。
如本文所用，术语“链”是指通过核苷酸间键合(例如，磷酸二酯键合、硫代磷酸酯键合)连接在一起的单个连续核苷酸序列。在一些实施例中，链具有两个自由端，例如，5'端和3'端。
如本文所用，术语“受试者”是指可以施用根据本披露的组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括任何动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)。受试者可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将来会接受治疗、或是因特定疾病或病状而接受过训练有素的专业人员护理的人或动物。
“糖”或“糖部分”包括具有呋喃糖环的天然存在的糖。糖还包括“替代糖”，定义为能够替代核苷的呋喃糖环的结构。在某些实施例中，替代糖是非呋喃糖(或4'-取代的呋喃糖)环或环体系或开放体系。此类结构包括相对于天然呋喃糖环(诸如六元环)的简单变化，或者可能更复杂，如在肽核酸中使用的非环体系的情况。替代糖还可以包括糖替代物，其中呋喃糖环已被另一个环体系(诸如，例如，吗啉代或己糖醇环体系)替代。可用于制备具有基序的寡核苷酸的糖部分包括但不限于β-D-核糖、β-D-2'-脱氧核糖、取代糖(诸如2'、5'和双取代糖)、4'-S-糖(诸如4'-S-核糖、4'-S-2'-脱氧核糖和4'-S-2'-取代核糖)、双环替代糖(诸如2'-O-CH2-4'或2'-O-(CH2)2-4'桥接核糖衍生的双环糖)和糖替代物(诸如当核糖环已被吗啉代或己糖醇环体系替代时)。在每个位置处使用的杂环碱基和核苷间键合的类型是可变的，并且不是决定基序的因素。在大多数具有替代糖部分的核苷中，通常保持杂环核碱基以允许杂交。
如本文所用，术语“茎环”是指寡核苷酸的一个区域，其中当一个区域在5'至3'方向上读取并且另一个区域在3'至5'方向上读取时，两个区域具有互补核苷酸序列，并且两个区域之间的核苷酸形成不配对的环。茎环区域也可称为发夹或发夹环。
如本文所用，术语“链”是指包含连接的核苷链的寡核苷酸。“包含核碱基序列的链”是指包含连接的核苷链的寡核苷酸，该连接的核苷链通过使用标准核碱基命名法指代的序列来描述。
如本文所用，术语“合成的”是指人工合成的(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))或以其他方式不是源自正常产生分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。
如本文所用，术语“靶标”或“靶向”是指能够特异性结合至C3基因或编码C3基因产物的C3 mRNA的寡核苷酸。例如，它是指能够通过本领域技术人员已知的方法(例如，在反义和RNA干扰领域)抑制所述基因或所述mRNA(例如，通过降低由该基因或mRNA编码的蛋白质的水平)的寡核苷酸。
如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性地结合感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如，受体)并且可与另一种物质缀合以将另一种物质靶向感兴趣的组织或细胞的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。例如，在一些实施例中，靶向配体可以与寡核苷酸或包含寡核苷酸的载体(例如，病毒载体)缀合，用于将寡核苷酸靶向感兴趣的特定组织或细胞。在一些实施例中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在一些实施例中，靶向配体当与寡核苷酸或载体缀合时，通过选择性结合细胞表面上表达的受体和细胞对包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化，促进寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施例中，靶向配体通过接头与寡核苷酸缀合，该接头在细胞内化之后或期间被切割，使得寡核苷酸从细胞中的靶向配体释放。
如本文所用，术语“四环”是指增加由核苷酸侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。当相邻茎双链体的解链温度(Tm)升高高于平均的预期相邻茎双链体的Tm时，从由随机选择的核苷酸序列组成的具有可比长度的一组环中可检测到稳定性的增加。例如，四环可赋予包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹在10mM NaHPO4中至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。在一些实施例中，四环可通过堆叠相互作用稳定相邻茎双链体中的碱基对。此外，四环中的核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆积相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人,Nature[自然]1990年8月16日；346(6285):680-2；Heus和Pardi,Science[科学]1991年7月12日；253(5016):191-4)。在一些实施例中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施例中，四环包含三、四、五或六个核苷酸或由三、四、五或六个核苷酸组成，这些核苷酸可以被修饰或不被修饰(例如，其可以与或不与靶向部分缀合)。在一个实施例中，四环由四个核苷酸组成。任何核苷酸都可用于四环，并且此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可以如以下文献中所述使用：Cornish-Bowden(1985)Nucl.Acids Res.[核酸研究]13:3021-3030。例如，字母“N”可用于表示任何碱基可以位于该位置，字母“R”可用于表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以位于该位置，而“B”可用于表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以位于该位置。四环的实例包括环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环。(Woese等人,Proc Natl Acad SciUSA.[美国国家科学院院刊]1990年11月；87(21):8467-71；Antao等人,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]1991年11月11日；19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、d(GNRA))家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见例如：Nakano等人Biochemistry[生物化学],41(48),14281-14292,2002.SHINJI等人Nippon Kagakkai Koen Yokoshu第78卷；第2期；第731页(2000)，其相关披露内容通过援引并入本文。在一些实施例中，四环包含在带切口的四环结构内。
“治疗有效量”或“预防有效量”是指产生所需的局部或全身效应(例如，治疗由补体途径激活或失调引起的疾病的一种或多种症状)的本披露的寡核苷酸组合物(例如，RNAi寡核苷酸，诸如dsRNA)的量(以单一剂量或以多剂量施用)。本披露的方法中所采用的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以以足以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比的量施用。
如本文所用，术语“治疗”是指为有需要的受试者提供护理的行为，例如，通过向受试者施用治疗剂(例如，本文所述的寡核苷酸)，目的是相对于现有病状(例如，疾病、病症)改善受试者的健康和/或福祉，或预防或降低病状发生的可能性。在一些实施例中，治疗涉及降低受试者经历的病状(例如，疾病、病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重性。在一些实施例中，本文所述的核酸或寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)用于控制补体途径病症(诸如例如，一种或多种与本文披露的补体途径激活或失调相关的疾病)的细胞和临床表现。
具体实施方式
本文描述了靶向已知在补体途径激活中起作用的补体组分(C3)的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，包括有义和反义链寡核苷酸)及其药学上可接受的盐。可以施用寡核苷酸以降低细胞(例如，肝细胞)中C3的水平和/或活性。例如，寡核苷酸可以在体内施用并且可以被细胞(例如，肝细胞；诸如通过结合至唾液酸糖蛋白受体(ASGPR))内化。细胞内化后，寡核苷酸可被RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合并靶向C3 mRNA，从而启动C3 mRNA的降解并阻断其翻译。
由补体失调介导的疾病通常是补体过度活性的结果。本文描述了用于通过施用本文所述的降低C3表达水平的寡核苷酸来治疗由补体途径激活或失调介导或与其相关的疾病的方法。可通过本文所述的寡核苷酸和组合物治疗的由补体途径激活或失调介导或与其相关的病症的实例包括，例如，皮肤病、神经系统病症、肾病、紧急护理(acute care)、风湿病、肺病、皮肤病、血液病和眼科病症，诸如例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。
本文所述的组合物和方法的特征在于包含有义链和反义链的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其与C3基因的区域具有实质上的序列同一性。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可用于调节补体途径活性，例如通过降低细胞(例如，肝细胞)中C3的水平和/或活性，该细胞诸如为有需要的受试者(例如，人)中的细胞。该总体设计靶向补体途径的C3，并保持替代、经典和凝集素途径中的其他途径的激活(保护)不变。因此，本披露的特征在于用于治疗由补体途径激活或失调介导的疾病或病症(例如，由C3的激活或失调介导的疾病或病症)的组合物和方法。
补体组分3靶序列
本文提供了可用于实现治疗益处的基于寡核苷酸的C3表达抑制剂。通过对C3mRNA的检查(参见例如实例3)以及体外和体内测试，已发现C3 mRNA的序列可用作靶向序列，因为它们可经受基于寡核苷酸的抑制。例如，C3靶序列可以包含SEQ ID No:13或14中所示的序列或可以由该序列组成，该序列分别对应于具有参考序列NM_0.000064.4(SEQ ID NO:12)的智人补体C3的核苷酸4121-4141和780-798。这些C3序列可以分别是化合物A和化合物B的靶序列，以及本文所述的与其具有高达85％序列同一性的其变体。化合物A和B(以及本文所述的其变体)也可以有效地靶向分别具有参考序列XM_015122636.2和XM_005587719.2的恒河猴(Rhesus macaque)和食蟹猴(Cynomolgus macaques)补体C3。此外，C3靶序列可以包含SEQ ID NO:31中任一个所示的序列或可以由该序列组成，该序列对应于具有参考序列NM_009778.3(SEQ ID NO:32)的小家鼠(mus musculus)补体C3的核苷酸2903-2922，这些核苷酸可以是化合物J的靶标(例如，具有SEQ ID NO:15的有义序列和SEQ ID NO:16的反义序列的RNAi寡核苷酸)。化合物J也可以靶向具有参考序列NM_016994.2的褐家鼠(Rattusnorvegicus)补体C3。可以使用RNAi寡核苷酸(诸如本文所述的dsRNA药剂)靶向C3 mRNA的这些区域，以抑制C3 mRNA表达和随后的C3蛋白表达。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)药剂的反义链可以被设计成具有与C3 mRNA的互补区域(例如，在C3 mRNA的靶序列内)，以靶向细胞中的mRNA并抑制其表达。互补区域通常具有合适的长度和碱基含量，以促进寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或其链退火至C3 mRNA，从而抑制其转录。互补区域的长度可以是至少11个，例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个核苷酸。例如，本文提供的寡核苷酸可具有长度在12至30个(例如，12至30个、12至22个、15至25个、17至21个、18至27个、19至27个或15至30个)核苷酸的范围内的与C3mRNA的互补区域。因此，本文提供的寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的与C3的互补区域。在一些情况下，本文提供的寡核苷酸可具有长度为19个核苷酸的与C3mRNA的互补区域。在某些实施例中，寡核苷酸的互补区域(例如，RNAi寡核苷酸的反义链)可以与SEQ ID NO:12中所示序列的长度为20个核苷酸的连续核苷酸序列互补。
在某些情况下，本披露的RNAi寡核苷酸可包含与SEQ ID NO:12中所示的序列至少部分互补的互补区域(例如，在RNAi寡核苷酸的反义链上)。例如，本文披露的寡核苷酸可包含与SEQ ID NO:12中所示的序列完全互补的互补区域(例如，在RNAi寡核苷酸的反义链上)。寡核苷酸的互补区域(例如，在RNAi寡核苷酸的反义链上)可以与SEQ ID NO:12中所示序列的长度在12至20个(例如，12至20个、12至18个、12至16个、12至14个、14至20个、14至18个、14至16个、16至20个、16至18个或18至20个)核苷酸的范围内的连续核苷酸序列互补。在一些实施例中，寡核苷酸的互补区域(例如，在RNAi寡核苷酸的反义链上)可以与SEQ IDNO:12中所示序列的长度为19个核苷酸的连续核苷酸序列互补。在某些实施例中，寡核苷酸的互补区域(例如，RNAi寡核苷酸的反义链)可以与SEQ ID NO:12中所示序列的长度为20个核苷酸的连续核苷酸序列互补。
与SEQ ID NO:12中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区域可以跨越反义链全长的一部分。例如，与SEQ ID NO:12中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区域可以跨越反义链全长的至少85％(例如，至少86％、至少90％、至少95％和至少99％)。在某些实施例中，与SEQ ID NO:12中所示的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区域可以跨越反义链的全长。
与C3 mRNA的互补区域与C3 mRNA的对应序列相比可具有一个或多个错配。例如，寡核苷酸(例如，长度为20至50个核苷酸的寡核苷酸，诸如长度为20-25个核苷酸(例如，长度为22个核苷酸)的寡核苷酸)上的互补区域可具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个错配，条件是其在适当的杂交条件下保持与C3 mRNA形成互补碱基对的能力。替代性地，寡核苷酸上的互补区域可具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，条件是其在适当的杂交条件下保持与C3 mRNA形成互补碱基对的能力。如果在互补区域中存在多于一个错配，则错配可连续定位(例如，一行中2、3、4或5个)或散布在整个互补区域中，条件是寡核苷酸在适当的杂交条件下保持与C3 mRNA形成互补碱基对的能力。例如，RNAi寡核苷酸可以包含有义寡核苷酸，该有义寡核苷酸具有SEQ ID NO:4的序列及其相对于SEQ ID NO:12的对应C3序列具有至多1、2、3、4或5个错配的变体，或SEQ ID NO:6的对应反义序列及其相对于SEQ ID NO:4的序列具有至多1、2、3、4或5个错配的变体。
寡核苷酸类型
在本披露的方法中存在可用于靶向C3的寡核苷酸的多种结构，包括RNAi、反义miRNA、shRNA等。本文或其他地方描述的任何结构可用作框架，以掺入或靶向本文所述的序列(例如，C3的热点序列，诸如SEQ ID NO:13或14的那些序列)。
本文所述的组合物是寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其编码靶向C3 mRNA(例如，SEQ ID NO:12)的抑制性构建体(例如，编码该抑制性构建体的核酸载体)。用于降低C3表达的寡核苷酸可在dicer参与的上游或下游参与RNA干扰(RNAi)途径。例如，已经开发了长度为19-25个核苷酸并且具有有义链或反义链(具有介于1和5个核苷酸之间的3'突出端)中的至少一种的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)(参见例如美国专利号8,372,968，其通过援引并入本文)。还开发了被dicer加工以产生活性RNAi产物的更长的寡核苷酸(参见例如美国专利号8,883,996，其通过援引并入本文)。此外，已经产生了延长的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中反义链和有义链中的任一条或两条的5'或3'端中的任一者或两者延伸超过双链体靶向区域，使得有义链或反义链包括热力学稳定的四环结构(参见例如美国专利号8,513,207和8,927,705，以及WO 2010033225，这些寡核苷酸的披露内容通过援引并入本文)。此类结构可以包括在分子的5'和3'端中的一者或两者上的单链延伸，以及RNAi延伸。
另外地或替代性地，本文提供的寡核苷酸可以被设计成参与dicer参与的下游的RNA干扰途径，即在dicer切割之后。此类寡核苷酸可以具有在有义链的3'端处包含1、2或3个核苷酸的突出端。此类寡核苷酸(诸如siRNA)可以包括与靶RNA(例如，SEQ ID NO:13和14)反义的22个核苷酸的向导链和互补的乘客链，其中两条链退火以形成20个bp的双链体和在3'端的任一端或两端的2个核苷酸突出端。也可以使用较长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的向导链和21个核苷酸的乘客链的寡核苷酸，其中在乘客链的3'-端和向导链的5'-端上有一个钝端，并且在乘客链的5'-端和向导链的3'-端的分子的左侧上有两个核苷酸3'-向导链突出端。在此类分子中，有一个21个碱基对的双链体区域(参见美国专利号9,012,138、9,012,621和9,193,753，其关于较长的寡核苷酸的披露内容通过援引并入本文)。
如本文所披露的寡核苷酸可包含长度均在17至26个(例如，17至26个、20至25个或21-23个)核苷酸范围内的有义链和反义链。例如，本文披露的寡核苷酸可包含长度均在19-22个核苷酸范围内的有义链和反义链。有义链和反义链的长度也可以相等。替代性地，寡核苷酸可包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链任一者上或有义链和反义链两者上有一个3'-突出端。例如，有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3'突出端的长度可以是1或2个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸具有22个核苷酸的反义链和20个核苷酸的有义链，其中在分子的“右”侧(即，在乘客链的3'-端和向导链的5'-端)有一个钝端，并且在分子的“左”侧(即，在乘客链的5'-端和向导链的3'-端)有两个核苷酸3'-向导链突出端。在此类分子中，可以存在例如20个碱基对的双链体区域。
用于本文披露的组合物和方法的其他寡核苷酸设计包括，例如，16聚体siRNA(参见例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology.[化学和生物学中的核酸]Blackburn(编辑),Royal Society of Chemistry[英国皇家化学学会],2006)、shRNA(例如，具有19个bp或更短的茎；参见例如，Moore等人Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]2010；629:141-158)、钝性siRNA(例如，长度为19个bp；参见：例如，Kraynack和Baker,RNA第12卷,第163-176页(2006))、不对称siRNA(aiRNA；参见例如，Sun等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]26,1379–1382(2008))、不对称较短双链体siRNA(参见例如，Chang等人,Mol Ther.[分子治疗]2009年4月；17(4):725-32)、叉状siRNA(参见例如，Hohjoh,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报],第557卷,第1-3期；2004年1月,第193-198页)、单链siRNA(Elsner；NatureBiotechnology[自然生物技术]30,1063(2012))、哑铃形环状siRNA(参见例如，Abe等人JAm Chem Soc[美国化学会志]129:15108-15109(2007))和小内部分段干扰RNA(siRNA；参见例如.，Bramsen等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]2007年9月；35(17):5886–5897)。前述参考文献中的每一篇中的相关披露内容通过援引以其全文并入本文。可用于一些实施例中以降低或抑制C3表达的寡核苷酸结构的另外的非限制性实例是微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见Hamilton等人,Embo J.[欧洲分子生物学组织会刊],2002,21(17):4671-4679；另参见美国专利申请公开号2009/0099115)。
寡核苷酸
用于通过RNAi途径靶向C3表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以是单链或双链核糖核酸(dsRNA)。此外，有义链和反义链可以不是共价连接的；例如，寡核苷酸可以在有义链与反义链之间切口。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以是药学上可接受的盐的形式。例如，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以是钠盐的形式。
前述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)序列表示为可以在细胞内合成的RNA序列；然而，这些序列也可以表示为可以并入本披露的载体中的相应DNA(例如，cDNA)。本领域技术人员将理解，除了用胸苷取代尿苷之外，cDNA序列与mRNA序列等同，并且可用于本文的相同目的，即，生成用于抑制C3 mRNA表达的反义寡核苷酸。在DNA的情况下，含有反义核酸的多核苷酸是DNA序列。DNA序列可以对应于化合物A或化合物B的反义链，并且可以分别具有SEQID NO:34或SEQ ID NO:35的多核苷酸序列，或者可以与其具有至少85％或更高的序列同一性。DNA序列可以对应于化合物A或化合物B的有义链，并且可以分别具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35的多核苷酸序列，或者可以与其具有至少85％或更高的序列同一性。在RNA载体的情况下，转基因盒掺入了本文所述的反义DNA序列的RNA等同物。
在某些实施例中，有义链可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，有义链可以包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸序列，如化合物B的情况。在其他实施例中，有义链可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，有义链可以包含SEQID NO:1的寡核苷酸序列，如化合物A的情况。
在一些实施例中，反义链可以包含与SEQ ID NO:6具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。在其他实施例中，反义链可以包含与SEQ ID NO:3具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，反义链可以包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列，如化合物B的情况，和/或反义链可以包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸序列，如化合物A的情况。
此外，有义链可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:6具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列的反义链，如图2B中的化合物B所示。
另外，有义链可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:3具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。此外，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸序列的反义链，如图1D和1E中的化合物A所示。本文提供的寡核苷酸可以包含具有SEQ ID NO:1、2、4和5中任一个所示的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:3和6的互补序列的反义链。
此外，有义链可以包含SEQ ID NO:37的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含SEQID NO:38的寡核苷酸序列，如下所示。
有义链(SEQ ID NO:37)：
5'mA-S-mU-mC-mA-mA-mC-mU-fC-fA-fC-fC-mU-mG-mU-mA-mA-mU-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3'
杂交至：
反义链(SEQ ID NO:38)：
5'[Me膦酸酯-4O-mU]-S-fU-S-fU-fA-fU-mU-fA-mC-mA-fG-mG-mU-mG-fA-mG-mU-mU-mG-mA-mU-S-mG-S-mG 3'
其中mX是2'-O-甲基核糖核苷酸，fX是2'-氟-脱氧核糖核苷酸，[ademA-GalNAc]是2'-O-GalNAc修饰的腺苷，[Me膦酸酯-4O-mU]是4'-O-单甲基亚膦酸酯-2'-O-甲基尿苷，“-”表示磷酸二酯键合，并且“-S-”表示硫代磷酸酯键合，如图1E中所示。在一些实施例中，反义链可以是SEQ ID NO:38的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。在一些实施例中，有义链可以是SEQ ID NO:37的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。
此外，有义链可以包含与SEQ ID NO:1具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQID NO:3具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物A所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:6具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物B所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:17具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:18具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物C所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:20具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物D所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:21具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:22具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物E所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:22的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:23具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:24具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物F所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:23的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:24的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:25具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQID NO:26具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物G所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:25的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:26的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:27具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:28具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物H所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:27的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:28的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ ID NO:29具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:30具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，如化合物I所示，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:29的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ ID NO:30的寡核苷酸序列的反义链。有义链可以包含与SEQ IDNO:15具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列，并且反义链可以包含与SEQ ID NO:16具有至少85％(例如，至少87％、至少90％、至少95％、至少97％和至少99％)序列同一性的寡核苷酸序列。例如，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有包含SEQ ID NO:15的寡核苷酸序列的有义链和包含SEQ IDNO:16的寡核苷酸序列的反义链，如化合物J所示。有关有义链和反义链对的实例，参见表1。
表1：靶向C3 mRNA的RNAi寡核苷酸
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括在有义链与反义链之间的双链体区域。在有义链与反义链之间形成的双链体的长度可以为10至30个核苷酸(例如，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸)。因此，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度可以为15至25个核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个核苷酸)。在一些实施例中，双链体区域的长度可以为20个核苷酸。
有义链上与反义链形成双链体的区域可以具有与SEQ ID NO:2和5中任一个的寡核苷酸序列至少85％相同(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的核苷酸序列。例如，有义链上与反义链形成双链体的区域可以具有SEQ ID NO:2和5中任一个的寡核苷酸序列。
此外，在有义链与反义链之间形成的双链体可以不跨越有义链和/或反义链的全长。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以包含长于22个核苷酸的有义链(例如，长度为23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)，诸如36个核苷酸的有义链，以及长度为18-36个核苷酸的反义链，诸如22个核苷酸的反义链。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的长度使得当被dicer酶作用时，结果是被引入成熟RISC中的反义链。
本文提供的寡核苷酸可以具有一个5'端，其与另一个5'端相比在热力学上不太稳定。本文提供的寡核苷酸可以是不对称寡核苷酸，其包含在有义链的3'端的平端和在反义链的3'端的突出端。反义链上的3'突出端长度可以为1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。例如，反义链上的3'突出端的长度可以为两个核苷酸。通常，用于RNAi的寡核苷酸在反义(向导)链的3'端上具有双核苷酸突出端；然而，其他突出端也是可能的。在其他实施例中，3'突出端可以具有1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。在一些情况下，寡核苷酸可以在5'端具有突出端。突出端可以为5'突出端，其包括1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。
反义链的3'端上的两个末端核苷酸可以被修饰。在某些实施例中。反义链的3'端上的两个末端核苷酸可以与靶C3 mRNA互补。替代性地，反义链的3'端上的两个末端核苷酸可以不与靶C3 mRNA互补。在一些实施例中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸可以是GG。通常，寡核苷酸的每个3'端上的两个末端GG核苷酸中的一个或两个与靶标不互补。
在有义链与反义链之间的互补性中可以存在一个或多个(例如，1、2、3、4、5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在多于一个错配，则它们可以连续定位(例如，连续2、3或更多个)，或散布在整个互补区域。例如，有义链的3'端可以含有一个或多个错配。因此，可以在有义链的3'端处引入两个错配。寡核苷酸有义链3'端处的区段的碱基错配或不稳定可能通过促进dicer的加工而提高RNAi中合成双链体的效力。
应当理解，在一些实施例中，在描述寡核苷酸或其他核酸的结构时可以参考序列表中提供的序列。在此类实施例中，与指定序列相比，实际的寡核苷酸或其他核酸可以具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键合和/或一个或多个其他修饰，同时保留与指定序列基本上相同或相似的互补性质。
反义链
寡核苷酸的反义链可称为向导链。例如，如果反义链可以与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并结合Argonaute蛋白，或者与一种或多种类似因子接合或结合，并指导靶基因的沉默，则可以将其称为向导链。
在某些实施例中，反义链在长度上比有义链具有更少的核苷酸。在一些实例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可具有包含长度为10至40个核苷酸(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个核苷酸)的反义链。因此，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可具有包含长度为15至30个核苷酸(例如，15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸)的反义链。例如，反义链可以包含20至25个核苷酸(例如，20、21、22、23、24和25个核苷酸)长度。在某些实施例中，反义链的长度可以是22个核苷酸。
本文披露的寡核苷酸可以包含反义链，该反义链包含与SEQ ID NO:12的序列互补的长度为12至22个核苷酸(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22个核苷酸)的连续序列。例如，寡核苷酸可以包含反义链，该反义链包含长度为15至21个核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20和21个核苷酸)的连续序列，该连续序列与SEQ ID NO:12的序列互补。在一些实施例中，寡核苷酸可以包含反义链，该反义链具有与SEQ ID NO:12的序列互补的长度为19个核苷酸的连续序列。
本文披露的寡核苷酸可以包含具有SEQ ID NO:3或6中任一个的序列的反义链。在一些实施例中，本文披露的寡核苷酸可以包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的反义链，如图2B中所示的化合物B。在一些实施例中，反义链可以是SEQ ID NO:6的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。SEQ ID NO:6可具有如图1B所示的化学结构。替代性地，反义链可以具有SEQID NO:3的序列，如图1D和1E所示的化合物A。在一些实施例中，反义链可以是SEQ ID NO:3的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。
另外，反义链的5'端的第一位置可以是尿苷。尿苷可以包括磷酸酯类似物；例如，尿苷可以是4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷。
有义链
寡核苷酸的有义链可称为乘客链。在某些实施例中，乘客链在长度上比向导链具有更多数目的核苷酸。在一些实例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可具有包含长度为10至45个核苷酸(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45个核苷酸)的有义链。因此，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可具有包含长度为20至50个核苷酸(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个核苷酸)的有义链。在某些实施例中，有义链的长度可以是20个核苷酸。在其他实施例中，有义链的长度可以是36个核苷酸。
寡核苷酸可以具有有义链，该有义链包含相对于SEQ ID NO:12的序列的长度为7至36个核苷酸(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36个核苷酸)的连续序列。因此，有义链可以包含SEQ IDNO:12的长度为10至30个核苷酸(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸)的连续序列。在一些实施例中，本文披露的寡核苷酸可以包含有义链，该有义链包含相对于SEQ ID NO:12的序列长度为19个核苷酸的连续核苷酸序列。
有义链可以在其3'-端包含茎环。在一些实施例中，有义链在其5'端包含茎环。包含茎环的有义链的长度可以在10至50个核苷酸的范围内(例如，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个核苷酸)。因此，包含茎环的有义链的长度可以在20至40个核苷酸的范围内(例如，长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个核苷酸)。例如，包含茎环的有义链的长度可以为36个核苷酸。
此外，有义链上的茎环区域可以与其自身形成双链体区域。包含在茎环中的双链体区域的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。例如，包含在茎环中的双链体区域的长度可以为6个核苷酸。茎环可以为RNAi寡核苷酸提供针对降解(例如，酶促降解)的保护并且可以促进用于递送至靶细胞的靶向特性。例如，环可以提供添加的核苷酸，在其上可以进行修饰而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施例中，本文提供了寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3'-端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为至多10个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。因此，S1与S2之间的环的长度可以为4个核苷酸，从而形成四环，如本文所述。在一些实施例中，S1区域的长度为6个核苷酸，S2区域的长度为6个核苷酸，并且L区域为4个核苷酸的四环。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链可以包含茎环区域和与反义链形成双链体的区域。茎环区域可以包含与SEQ ID NO:7的寡核苷酸序列至少85％相同(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、9％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的核苷酸序列。在一些实施例中，茎环区域具有SEQ ID NO:7的寡核苷酸序列。
茎环的环(L)可以是四环(例如，在带切口的四环结构内)。茎环的环可以具有SEQID NO:8的核苷酸序列。四环可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸以及它们的组合。通常，茎环的环具有4至5个核苷酸。然而，在一些实施例中，茎环的环可以包含3至6个核苷酸。例如，茎环的环可以包含3、4、5或6个核苷酸。茎环的环可以包含鸟苷和腺苷核酸残基的组合。
本文披露的寡核苷酸可以包含具有SEQ ID NO:1、2、4和5中任一个的多核苷酸序列的有义链序列。有义链可以具有SEQ ID NO:4的序列，如图2B中所示的化合物B。SEQ IDNO:4可具有如图1A所示的化学结构。在一些实施例中，有义链可以是SEQ ID NO:4的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。替代性地，有义链可以具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，如图1D和1E所示的化合物A。在一些实施例中，有义链可以是SEQ ID NO:1的药学上可接受的盐(例如，钠盐)。
寡核苷酸修饰
寡核苷酸可以通过各种方式进行修饰，以提高或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、抗核酸酶降解能力、免疫原性、碱基配对性质、RNA分布和细胞吸收以及与治疗或研究用途相关的其他特征，参见Bramsen等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],2009,37,2867-2881；Bramsen等人,Frontiers in Genetics[遗传学前沿],3(2012):1-22)。因此，在一些实施例中，本披露的寡核苷酸可以包含一个或多个合适的修饰。经修饰的核苷酸可以在其碱基或核碱基、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸酯基团上具有修饰。
寡核苷酸上修饰的数目和这些核苷酸修饰的位置可能影响寡核苷酸的性质。例如，寡核苷酸可以通过将它们与脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体缀合或将它们包含在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载剂中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不被LNP或类似载剂保护时，至少一些核苷酸被修饰可能是有利的。因此，在本文提供的任何寡核苷酸的某些实施例中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸被修饰。在某些实施例中，超过一半的核苷酸被修饰。在其他实施例中，少于一半的核苷酸被修饰。通常，在裸露递送的情况下，每个糖都在2'-位置处被修饰。这些修饰可以是可逆的或不可逆的。如本文所披露的寡核苷酸可以具有足以产生所需特性(例如，防止酶促降解、体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的经修饰的核苷酸的数目和类型。
糖修饰
经修饰的糖，在本文中也称为糖类似物，包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中一个或多个修饰发生在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置。经修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，诸如存在于锁核酸(“LNA”)(参见Koshkin等人(1998),Tetrahedron[四面体]54,3607-3630)、解锁核酸(“UNA”)(参见Snead等人(2013),Molecular Therapy–NucleicAcids[分子疗法—核酸],2,e103)和桥接核酸(“BNA”)(参见Imanishi和Obika(2002),TheRoyal Society of Chemistry,Chem.Commun.[英国皇家化学学会化学通讯],1653-1659)中的那些。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika的涉及糖修饰的披露内容通过援引并入本文。
糖处的核苷酸修饰可以包括2'-修饰。2'-修饰可以为2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸。通常，修饰是2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些实施例中，修饰是2'-氟和/或2'-O-甲基。在一些实施例中，2'-氟修饰是2'-氟脱氧核糖核苷和/或2'-O-甲基修饰是2'-O-甲基核糖核苷。糖处的修饰可以包括糖环的修饰，其可以具有糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2'-氧连接至糖的1'-碳或4'-碳，或2'-氧通过亚乙基或亚甲基桥连接至1'-碳或4'-碳。在某些实施例中，经修饰的核苷酸可以具有缺少2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施例中，经修饰的核苷酸可以具有硫醇基团，例如，在糖的4'位置。
本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以包含至少一个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。例如，寡核苷酸的有义链可以包含至少一个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。此外，例如，寡核苷酸的反义链可以包含至少一个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在某些实施例中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以含有20至50个(例如，20至30个、24至30个、28至30个、30至40个、34至40个、38至44个、44至50个和48至50个)经修饰的核苷酸。
寡核苷酸有义链的所有核苷酸都可以被修饰。此外，寡核苷酸反义链的所有核苷酸都可以被修饰。在一些实施例中，包含有义链和反义链的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的所有核苷酸都被修饰。经修饰的核苷酸可以是2'-修饰(例如，2'-氟或2'-O-甲基)。对核苷酸的2'-修饰可以是2'-氟和/或2'-O-甲基，其中任选地2'-氟修饰是2'-氟脱氧核糖核苷和/或2'-O-甲基修饰是2'-O-甲基核糖核苷。
本披露提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。包含有义链和反义链的寡核苷酸可以包含40至50个(例如，41、2、43、44、45、46、47、48和49个)2'-O-甲基修饰。经修饰的寡核苷酸可以包含具有SEQ ID NO:1或4的核苷酸序列的有义链和具有SEQ ID NO:3或6的核苷酸序列的反义链(例如，RNAi寡核苷酸可以具有SEQ ID NO:4的有义链和SEQ ID NO:6的反义链，或者RNAi寡核苷酸可以具有SEQ ID NO:1的有义链和SEQ ID NO:3的反义链)。在一些实施例中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的一个或多个位置和/或反义链的位置1、6、8、9、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21和22中的一个或多个位置用2'-O-甲基修饰的核苷(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在一些实施例中，有义链的位置1、2、3、4、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的所有位置和反义链的位置1、6、8、9、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21和22中的所有位置用2'-O-甲基修饰的核苷(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在其他实施例中，有义链的位置1、2、4、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的一个或多个位置和/或反义链的位置1、6、9、11、13、15、17、18、20、21和22中的一个或多个位置用2'-O-甲基修饰的核苷(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。在某些实施例中，有义链的位置1、2、4、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的所有位置和/或反义链的位置1、6、9、11、13、15、17、18、20、21和22中的所有位置用2'-O-甲基修饰的核苷(诸如2'-O-甲基核糖核苷)修饰。
包含有义链和反义链的寡核苷酸可以具有5至15个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13和14个)2'-氟修饰。对于这些寡核苷酸，有义链的位置8、9、10、11、12、13和17中的一个或多个位置和/或反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19中的一个或多个位置可以用2'-氟修饰的核苷修饰。例如，有义链的位置8、9、10和11中的所有位置和/或反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的所有位置可以用2'-氟修饰的核苷修饰。在其他实施例中，有义链的位置3、8、10、12、13和17中的一个或多个位置和/或反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个位置可以被修饰。在另一个实例中，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的所有位置和/或反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的所有位置可以用2'-氟修饰的核苷修饰。
对于包含具有SEQ ID NO:1的序列的有义链和具有SEQ ID NO:3的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1-7、12-27和31-36中的一个或多个位置和/或反义链的位置1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个位置可以用2'-O-甲基修饰的核苷修饰。此外，有义链的位置1-7、12-27和31-36中的所有位置和/或反义链的位置1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个位置可以用2'-O-甲基修饰的核苷修饰。对于带有具有SEQ ID NO:1的序列的有义链和具有SEQ ID NO:3的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置8-11中的一个或多个位置和反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个位置可以用2'-氟修饰的核苷修饰。因此，有义链的位置8-11中的全部和反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的全部可以用2'-氟修饰的核苷修饰。
例如，对于带有具有SEQ ID NO:1的序列的有义链和具有SEQ ID NO:3的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1-7、12-27和31-36中的所有位置和/或反义链的位置1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个位置可以用2'-O-甲基修饰的核苷修饰；并且有义链的位置8-11中的所有位置和反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的所有位置可以用2'-氟修饰，其中有义链的化学结构示于图1A中，反义链示于图1B中，并且RNAi寡核苷酸示于图1C-1和图1C-2中。
对于包含具有SEQ ID NO:4的序列的有义链和具有SEQ ID NO:6的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1、2、4、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的一个或多个位置和/或反义链的位置1、6、9、11、13、15、17、18、20、21和22中的一个或多个位置可以用2'-O-甲基修饰。在一些实施例中，有义链的位置1、2、4、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的所有位置和反义链的位置1、6、9、11、13、15、17、18、20、21和22中的所有位置可以用2'-O-甲基修饰。另外，对于带有具有SEQ ID NO:4的序列的有义链和具有SEQ ID NO:6的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的一个或多个位置和/或反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个位置可以用2'-氟修饰。在一些实施例中，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的所有位置和反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的所有位置用2'-氟修饰。例如，对于具有包含SEQ ID NO:4的序列的有义链和具有SEQ ID NO:6的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1、2、4、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36中的所有位置和反义链的位置1、6、9、11、13、15、17、18、20、21和22中的所有位置可以用2'-O-甲基修饰；并且有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的所有位置和反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的所有位置可以用2'-氟修饰；有义链和反义链的化学结构如示于2A-1和图2A-2中。
在一些实施例中，末端3'-端基团(例如，3'-羟基)可以用磷酸酯基团或其他基团修饰，这些磷酸酯基团或其他基团可用于例如连接接头、衔接子或标记或用于将寡核苷酸直接连接至另一个核酸。
5'末端磷酸酯
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的5'-末端磷酸酯基团可以增强与Argonaute 2的相互作用。在某些实施例中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在反义链的5'端的第一位置处包含尿苷。然而，具有5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能容易被磷酸酶或其他酶降解，这会限制它们在体内的生物利用度。在一些实施例中，寡核苷酸包括对这种降解具有抗性的5'磷酸酯的类似物。因此，反义链的5'端处的尿苷可以包括磷酸酯类似物。磷酸酯类似物可以是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。此外，寡核苷酸链的5'端可连接至模拟天然5'-磷酸酯基团的静电和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见，Prakash等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]2015年3月31日；43(6):2993–3011，该文献中涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文)。已经开发出许多可以连接至5'端的磷酸酯模拟物(参见美国专利号8,927,513，其涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文)。已经针对寡核苷酸的5'端开发了其他修饰(参见WO 2011/133871，其涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文)。在某些实施例中，羟基可以连接至寡核苷酸的5'端。
寡核苷酸可以在糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物，称为“4'-磷酸酯类似物”。参见例如WO 2018/045317，其涉及磷酸酯类似物的内容通过援引并入本文。本文提供的寡核苷酸可以在5'-末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施例中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯(其中氧甲基的氧原子与糖部分结合(例如，在其4'-碳处))或其类似物。在其他实施例中，4'-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸盐或氨甲基膦酸盐，其中硫代甲基的硫原子或氨甲基的氮原子结合糖部分或其类似物的4'-碳。在某些实施例中，4'-磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯。在一些实施例中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基团。在某些实施例中，烷基是CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。在一些实施例中，R是CH3。在一些实施例中，4'-磷酸酯类似物是5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧。在一些实施例中，4'-磷酸酯类似物是4'-(甲氧基膦酸甲酯)。在一些实施例中，磷酸酯类似物是4'-O-单甲基膦酸酯类似物。
在一些实施例中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物是甲氧基膦酸酯(MOP)。连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物可以是5'单甲基保护的MOP。在一些实施例中，可以例如在反义链的第一位置处使用包含磷酸酯类似物的以下尿苷核苷酸：
该经修饰的核苷酸称为[Me膦酸酯-4O-mU]或5'-甲氧基膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。5'-甲氧基膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷可以是反义链5'端的第一核苷酸。例如，位于SEQ ID NO:3或6的5'端的第一个核苷酸可以是5'-甲氧基、膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。
经修饰的核苷间键合
寡核苷酸中的磷酸酯修饰或取代可以产生包含至少一个(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少5个或至少6个)经修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。本文披露的寡核苷酸中的任一种可以包含1至10个(例如，1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2个)经修饰的核苷酸间键合。例如，本文披露的寡核苷酸中的任一种可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键合。在一些实施例中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以包含5个经修饰的核苷酸间键合。例如，寡核苷酸的有义链可以包含1个经修饰的核苷酸间键合，并且反义链可以包含4个经修饰的核苷酸间键合。
经修饰的核苷酸间键合可以是二硫代磷酸酯键合、硫代磷酸酯键合、磷酸三酯键合、硫代烷基膦酸酯键合、硫代烷基磷酸三酯键合、亚磷酰胺键合、膦酸酯键合或硼酸磷酸酯键合。如本文所披露的寡核苷酸中的任一种的至少一个经修饰的核苷酸间键合可以是硫代磷酸酯键合。在某些实施例中，寡核苷酸的所有经修饰的核苷酸间键合可以是硫代磷酸酯键合。
本文所述的寡核苷酸可以在以下中的一个或多个之间具有硫代磷酸酯键合：有义链的位置1与2之间、反义链的位置1与2之间、反义链的位置2与3之间、反义链的位置20与21之间以及反义链的位置21与22之间。例如，寡核苷酸的有义链可以在有义链的位置1与2之间、反义链的位置1与2之间、反义链的位置2与3之间、反义链的位置20与21之间以及反义链的位置21与22之间具有硫代磷酸酯键合。因此，具有SEQ ID NO:1或4的序列的有义链可以在位置1与2之间具有硫代磷酸酯键合，并且具有SEQ ID NO:3或6的序列的反义链可以在位置1与2之间、2与3之间、20与21之间以及21与22之间具有硫代磷酸酯键合。
碱基修饰
本文提供的寡核苷酸可具有一个或多个经修饰的核碱基。经修饰的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)可以在核苷酸糖部分的1'位置处连接。经修饰的核碱基可以是含氮碱基。在某些实施例中，经修饰的核碱基可以含有氮原子。参见美国公布的专利申请号2008/0274462，该专利申请中涉及经修饰的核碱基的内容通过援引并入本文。经修饰的核苷酸还可以包含通用碱基。然而，在某些实施例中，经修饰的核苷酸可以不含核碱基(例如，无碱基)。
在一些实施例中，通用碱基是位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置的杂环部分，该杂环部分当存在于双链体中时，可以定位在多于一种类型的碱基对面而不显著改变双链体的结构。在一些实施例中，与和靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸或多核苷酸)相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体具有比与互补核酸形成的双链体低的Tm。然而，在一些实施例中，与通用碱基已被碱基取代生成单错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体具有比与包含错配碱基的核酸形成的双链体更高的Tm。通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见US2007/0254362；Van Aerschot等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]1995年11月11日；23(21):4363-70；Loakes等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]1995年7月11日；23(13):2361-6；Loakes等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]1994年10月11日；22(20):4039-43。前述文献中的每一篇的涉及碱基修饰的披露内容通过援引并入本文)。
可逆修饰
虽然可以在到达靶细胞之前进行某些修饰以保护寡核苷酸免受体内环境的影响，但是在寡核苷酸到达靶细胞的胞质溶胶后，这些修饰会降低寡核苷酸的效力或活性。可以进行可逆修饰，使得分子在细胞外保留期望的性质，然后在进入细胞的胞质环境时将其去除。可逆修饰可以例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内的化学条件(例如，通过细胞内谷胱甘肽的还原)去除。
经可逆修饰的核苷酸可以包含谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子可以用环状二硫化物部分化学修饰，以掩盖由核苷酸间二磷酸键合产生的负电荷，并改善细胞摄取和核酸酶抗性。参见最初转让给特拉维萨疗法公司(Traversa Therapeutics,Inc.)(“Traversa”)的US2011/0294869；转让给索斯替斯生物制剂公司(Solstice Biologics,Ltd.)(“Solstice”)的PCT公布号WO 2015/188197；Meade等人,Nature Biotechnology[自然生物技术],2014,32:1256-1263(“Meade”)；转让给默克公司(Merck Sharp&Dohme Corp)的PCT公布号WO 2014/088920，其中每一者的针对此类修饰的披露内容通过援引并入。核苷酸间二磷酸酯键合的可逆修饰被设计成通过胞质溶胶(例如，谷胱甘肽)的还原环境在细胞内切割。早期的实例包括据报道可在细胞内切割的中和性磷酸三酯修饰(参见Dellinger等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2003,125:940-950)。
这种可逆修饰允许在体内施用期间进行保护(例如，穿过血液和/或细胞的溶酶体/内体隔室)，其中寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他恶劣的环境条件(例如，pH)。当释放到与细胞外空间相比谷胱甘肽水平更高的细胞的胞质溶胶中时，修饰被逆转，并且结果是切割的寡核苷酸。与使用不可逆化学修饰可用的选项相比，使用可逆的谷胱甘肽敏感部分，可以将空间更大的化学基团引入感兴趣的寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在胞质溶胶中被去除，因此不应干扰细胞胞质溶胶内寡核苷酸的生物活性。因此，这些较大的化学基团可以被设计成赋予核苷酸或寡核苷酸各种优势，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。谷胱甘肽敏感部分的结构可以被工程化以改变其释放的动力学。
在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分连接至核苷酸的糖。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分连接至经修饰的核苷酸的糖的2'碳。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的5'-碳处，例如当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的3'-碳处，例如当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基。参见例如，美国公开申请号2019/0177355，其相关披露内容通过援引并入本文。
靶向配体
可能需要将本披露的寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官(例如，肝脏细胞)。这种策略可能有助于避免在其他器官中产生不良影响，或者可能避免寡核苷酸过度地损失到对寡核苷酸无益的细胞、组织或器官。因此，在一些实施例中，本文披露的寡核苷酸可以被修饰以促进特定组织、细胞或器官的靶向，例如，以促进将寡核苷酸递送至肝脏。在某些实施例中，本文披露的寡核苷酸可以被修饰以促进将寡核苷酸递送至肝脏的肝细胞。寡核苷酸可以包括与一种或多种靶向配体缀合的核苷酸。
靶向配体可以包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或一部分蛋白质(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施例中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤血管系统或胶质瘤细胞的RGD肽、用于靶向肿瘤血管系统或气孔的CREKA肽、转移、乳铁蛋白、或用于靶向CNS血管系统上表达的转铁蛋白受体的适体、或用于靶向胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在一些实施例中，靶向配体是一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
寡核苷酸的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸可以各自与单独的靶向配体缀合。在一些情况下，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。靶向配体可以在有义链或反义链的任一端与2至4个核苷酸缀合(例如，配体与有义链或反义链的5'或3'端上的2至4个核苷酸突出端或延伸缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以在有义链的5'或3'端处包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可以单独地与靶向配体缀合。在一些实施例中，寡核苷酸在有义链的3'端包含茎环，并且茎环的3个核苷酸单独地与靶向配体缀合。
在一些实施例中，令人期望的是，将降低C3表达的寡核苷酸靶向受试者肝脏的肝细胞。任何合适的肝细胞靶向部分均可用于此目的。
GalNAc是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力配体，主要在肝细胞的正弦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基(脱唾液酸糖蛋白)的循环糖蛋白的结合、内化和随后的清除中起主要作用。GalNAc部分与本披露的寡核苷酸的间接或直接缀合可用于将这些寡核苷酸靶向在这些肝细胞上表达的ASGPR。
例如，本披露的寡核苷酸可以直接或间接与一价GalNAc缀合。寡核苷酸可以直接或间接与多于一个(例如，2、3、4或更多个)一价GalNAc缀合，并且通常与3或4个一价GalNAc部分缀合。GalNAc部分可存在于本文所述的寡核苷酸的环区域内。GalNAc部分可用于将本披露的寡核苷酸靶向肝细胞上的ASGPR；此时，GalNAc缀合的寡核苷酸可以被内化并整合到称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的细胞内RNAi机制中。该复合物内的RISC Argonaute-2(Argo-2)蛋白将寡核苷酸双链体的反义链靶向其互补C3 mRNA并启动其降解，从而阻断靶标的翻译。
在一些实施例中，茎环的环(L)的2至4个核苷酸各自与单独的GalNAc部分缀合。在一些实施例中，寡核苷酸的茎环的三个核苷酸可以直接或间接与三个单独的一价GalNAc部分缀合。在一些实施例中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。
本文所述的寡核苷酸可以包含连接至鸟嘌呤核碱基的一价GalNAc(称为[ademG-GalNAc])，或2'-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下所示：
另外地或替代性地，本文的寡核苷酸可以包含连接至腺嘌呤核碱基的一价GalNAc(称为[ademA-GalNAc])，或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示。
下文示出了这样的缀合的实例，对于从5'至3'包含核苷酸序列GAAA(SEQ ID NO:8)(L＝接头，X＝杂原子)的环，示出了茎连接点。这样的环可以存在于例如图1A所示分子的核苷酸位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链的连接点。/>
适当的方法或化学(例如，点击化学)可用于将靶向配体连接至核苷酸。可以使用点击接头将靶向配体与核苷酸缀合。此外，基于缩醛的接头可用于将靶向配体与本文所述的寡核苷酸中的任一个的核苷酸缀合。基于缩醛的接头例如在2016年6月23日公开的国际专利申请公开号WO 2016/100401 A1中进行了披露，并且其涉及此类接头的内容通过援引并入本文。接头可以是不稳定接头。然而，在其他实施例中，接头是稳定的(非不稳定的)。
以下示出了从5'至3'包含核苷酸GAAA(SEQ ID NO:8)的四环的实例，其中使用缩醛接头将四(4)个GalNAc部分连接至环的核苷酸。这样的环可以存在于本文披露的寡核苷酸中(参见，例如，具有SEQ ID NO:1和4的序列的寡核苷酸的位置27-30)。在化学式中，是与寡核苷酸链的连接点。/>
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四环的有义链，其中三(3)个GalNAc部分与包含该四环的核苷酸缀合，并且其中每个GalNAc部分与一(1)个核苷酸缀合。在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四环的有义链，该四环包含GalNAc-缀合的核苷酸，其中该四环包括以下结构：
其中：
Z表示键、点击化学手柄或长度为1至20个且包括端值的连续共价键合原子的接头，其选自由以下各项组成的组：取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基以及它们的组合；并且
X为O、S或N。
在另一个实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有四环的有义链，该四环包含缀合至核苷酸的三(3)个GalNAc部分，其中该四环包括以下结构：
在一些实施例中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之间提供双链体延伸(例如，长度为至多3、4、5或6个碱基对)。在一些实施例中，靶向配体(例如，GalNAc部分)与寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)之间的双链体延伸的长度为6个碱基对。
配制品
已经开发了多种配制品以促进寡核苷酸的使用。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取或为配制品中的寡核苷酸提供另一种有益性质的配制品将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施例中，本文提供了包含降低C3表达的寡核苷酸(例如，单链或双链寡核苷酸)的组合物。此类组合物可以适当地配制，使得当施用于受试者时，无论是进入靶细胞的直接环境还是全身施用，都有足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低C3表达。多种合适的寡核苷酸配制品中的任一种可用于递送本文所披露的用于减少C3的寡核苷酸。在一些实施例中，将寡核苷酸、药物组合物、载体或细胞配制在缓冲溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构、载体和衣壳)中。
如本文所披露的配制品可以包含赋形剂。赋形剂可以赋予组合物改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或活性成分的治疗增强。赋形剂可以是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、三羟甲基氨基甲烷或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施例中，可以将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如，向受试者施用)前制成溶液。因此，包含本文所述的寡核苷酸中的任一种的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如，葡聚糖、聚蔗糖或明胶)。
包含寡核苷酸的药物组合物可以被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如皮下、静脉内、皮内、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用(例如，皮下施用)。
适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(新泽西州帕西帕尼的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。在许多情况下，任选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多醇(诸如甘露醇和山梨醇)和氯化钠。无菌可注射溶液可通过将所需量的寡核苷酸根据需要引入具有上文列举的一种成分或成分的组合的选定溶剂中，然后过滤灭菌来制备。
在一些实施例中，包含寡核苷酸的药物组合物包含无菌水(或注射用水(WFI))。在一些实施例中，包含寡核苷酸的药物组合物包含PBS。
在一些实施例中，包含寡核苷酸的药物组合物包括无防腐剂的无菌WFI溶液。在一些实施例中，药物组合物的pH为约7.2(例如，pH 7.2)。在一些实施例中，如果需要，可以滴定0.1N NaOH或0.1N HCl以将溶液的pH调节至7.2的目标。在一些实施例中，RNAi寡核苷酸的游离酸形式在药物组合物中的浓度为约160mg/mL(例如，160mg/mL)。在一些实施例中可使用WFI，以使游离酸形式的总浓度达到约160mg/mL。在一些实施例中，在2-mL玻璃小瓶中的目标填充体积为约1.3mL。在一些实施例中，预期将溶液作为其施用途径皮下给予患者。
在一些实施例中，组合物可以含有至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，用于降低C3表达的寡核苷酸)，尽管活性成分的百分比可介于总组合物的重量或体积的约1％与约80％或更多之间。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑的因素将被制备此类药物配制品的本领域技术人员考虑，并且因此，可能需要多种剂量和治疗方案。
尽管许多实施例涉及本文披露的寡核苷酸中的任一种的肝脏靶向递送，但也预期靶向其他组织。
药物使用
本文披露了用于向细胞或受试者递送有效量的本文披露的任一种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以用于降低该细胞或受试者中C3的表达的方法。
可以使用任何适当的核酸递送方法将本文披露的寡核苷酸引入患有由补体途径激活或失调(例如，C3的激活或失调)介导的疾病或病症的受试者的细胞中。例如，可以通过注射含有寡核苷酸的溶液、被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击、将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液或在寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔来将寡核苷酸递送到细胞。
可以使用具有阳离子脂质的寡核苷酸的配制品来促进寡核苷酸转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质，诸如脂质体(lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(生命科技公司(LifeTechnologies))、NC388(科罗拉多州博尔德的核酶制药公司(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.))或FuGene 6(罗氏公司(Roche))，所有这些都可以根据制造商的说明书使用。
因此，在一些实施例中，配制品包含脂质纳米颗粒。在一些实施例中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制，用于施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，Remington:THE SCIENCEAND PRACTICE OF PHARMACY[雷明顿：药学科学与实践],第22版,Pharmaceutical Press[药学出版社],2013)。
本文披露的寡核苷酸的有效细胞内浓度还可以通过编码该寡核苷酸的多核苷酸的稳定表达(例如，通过整合到哺乳动物细胞的核基因组或线粒体基因组中)或通过在与多核苷酸(例如，编码该寡核苷酸的质粒或其他载体(例如，病毒载体))接触的细胞中的暂时表达来实现。表达载体的实例在例如WO 1994/011026中进行了披露并且通过援引并入本文。用于本文所述的组合物和方法中的表达载体含有降低C3表达的寡核苷酸序列以及例如用于表达这些药剂和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的额外序列元件。表达载体可以是病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
还可以使用用于将寡核苷酸递送至细胞的其他方法，诸如脂质介导的载体转运、化学介导的转运、阳离子脂质体转染(诸如磷酸钙)和载体(包括寡核苷酸)。用于递送本文所述的寡核苷酸的载体可以是病毒载体，诸如逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)、腺病毒载体(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)和腺相关病毒载体(AAV)(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10)。
在一些实例中，本文所述的寡核苷酸可以按转基因的形式递送，该转基因被工程化以在细胞中表达寡核苷酸(例如，其有义链和反义链)。可以使用如上所述的载体例如病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)递送转基因。在一些实施例中，可以将转基因直接注射到受试者中，例如，在作用源处或附近(例如，在肝脏内或附近)或在血流内。
C3抑制
在施用时，本披露的寡核苷酸能够结合并抑制C3 mRNA的表达。对C3基因表达的抑制可通过以下来证明：与第二细胞或细胞组相比，第一细胞或细胞组(此类细胞可以存在于例如来源于(例如，获自)受试者的样品中)所表达的mRNA的量减少，使得C3基因的表达被抑制，在该第一细胞或细胞组中，C3基因被转录并且该细胞已经过处理(例如，通过使一个或多个细胞与本披露的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)接触，或通过将本披露的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)施用于存在或曾经存在该细胞的受试者)，该第二细胞或细胞组与第一细胞或细胞组基本上相同但尚未经过这种处理(未用寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)处理或未用靶向感兴趣的基因的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)处理的对照细胞)。可以使用本领域技术人员熟知的技术(诸如RT-qPCR)来测量靶mRNA的水平。抑制程度可以表示为：
C3基因表达水平的变化可根据与C3基因表达功能性相关的参数(例如，C3蛋白表达、C3蛋白活性或C3信号传导途径)的降低来评估。可以在表达C3的任何细胞(来自表达构建体的内源性细胞或异源性细胞)中，并且可以通过本领域已知的任何测定来确定C3基因沉默。
抑制C3 mRNA的结果可通过评价细胞或受试者的一种或多种性质的适当测定或通过评价指示C3表达的分子(例如，RNA、蛋白质)的生物化学技术来确认。本文提供的寡核苷酸降低C3表达水平的程度通过将表达水平与适当的对照(例如，未递送寡核苷酸或已递送阴性对照的细胞或细胞群中C3 mRNA表达的水平)进行比较来评价。C3 mRNA表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次测量对照水平。预定水平或值可以采用多种形式，包括单个截止值，诸如中位数或平均值。例如，预定水平或值可以是或约为75-175mg/dL的C3蛋白水平，其对应于通常在健康受试者血清中发现的C3蛋白水平。
可以例如通过检测转录的多核苷酸或其部分(例如，mRNA)来确定样品中C3mRNA表达的水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，这些技术包括例如使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAZOLTM B；生物起源公司(Biogenesis))、RNEASYTM RNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXGENETM(瑞士的普瑞安纳蒂斯公司(PreAnalytix,Switzerland))。还可以使用实时PCR(RT-PCR)确定样品中的C3mRNA。例如，RNA可以通过使用TissueLyser II(凯杰公司)在QIAzo裂解试剂中均质化组织样品并根据制造商的说明书使用技术(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))纯化来提取。然后可以使用高容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司)来制备cDNA。在CFX384实时PCR检测系统(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories))上使用C3和管家对照的特异性引物和探针进行PCR，并使用BioRad CFX Maestro软件估计Ct值；在/>中计算表达水平并在Prism(GraphPad)中绘制。用于RT-PCR的引物描述于表2中。
表2.用于RT-PCR的引物
利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核运行测定、RT-PCR、RNA酶保护测定、Northern印迹、原位杂交和微阵列分析。可以使用PCT公开WO2012/177906中描述的方法检测循环mRNA，其全部内容通过援引并入本文。还可以使用核酸探针确定感兴趣的基因的表达水平。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，包括但不限于Northern或Southern分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。确定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可以与感兴趣的基因的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。可以将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移至膜，诸如硝酸纤维素。也可以将探针固定在固体表面上并且例如在阵列中使mRNA与探针接触。本领域已知的mRNA检测方法可适用于确定感兴趣的基因的mRNA水平。
用于确定样品中感兴趣的基因的表达水平的替代方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利号4,683,202中所示的实验实施例)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:189-193)、自我持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology[生物技术]6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域公知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本披露的一些方面，通过定量荧光RT-PCR(即，TAQMANTM系统)或DUAL-萤光素酶测定来确定感兴趣的基因(例如，C3)的表达水平。
可以使用膜印迹(诸如用于杂交分析诸如Northern、Southern、点等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固体载体)来监测感兴趣的基因的mRNA的表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，这些美国专利通过援引并入本文。基因表达水平的确定还可以包括在溶液中使用核酸探针。
使用上述测定法，可以基于C3 mRNA减少的量确定用本文所述的寡核苷酸进行治疗的有效性。与治疗前受试者中C3 mRNA的适当对照水平或C3水平相比，C3mRNA水平的降低可以是降低至1％或更低、5％或更低、10％或更低、15％或更低、20％或更低、25％或更低、30％或更低、35％或更低、40％或更低、45％或更低、50％或更低、55％或更低、60％或更低、70％或更低、80％或更低、或90％或更低。适当的对照水平可以是未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群中C3 mRNA表达的水平。在一些实施例中，在一段有限的时间之后评估根据本文披露的方法向细胞递送寡核苷酸的效果。例如，可在将寡核苷酸引入细胞后至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80天时分析细胞中C3 mRNA的水平。
此外，抑制C3基因可导致C3蛋白表达的抑制，这可通过细胞或细胞组所表达的C3蛋白的水平(例如，来源于受试者的样品中表达的蛋白质的水平)的降低来证明。如上所述，为了评估mRNA抑制，经处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比。
抑制C3蛋白表达的结果可通过评价细胞或受试者的一种或多种性质的适当测定或通过评价指示C3蛋白表达的分子的生物化学技术来确认。本文提供的寡核苷酸降低C3蛋白表达水平的程度通过将表达水平与适当的对照(例如，未递送寡核苷酸或已递送阴性对照的细胞或细胞群中C3蛋白表达的水平)进行比较来评价。C3蛋白表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次测量对照水平，诸如被确定在正常范围内(例如，血清中75-175mg/dL)的C3蛋白的量。预定水平或值可以采用多种形式，包括单个截止值，诸如中位数或平均值。
通过C3基因的表达产生的C3蛋白的水平可以使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定。此类方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、Western印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。此类测定也可用于检测指示由感兴趣的基因产生的蛋白质的存在或复制的蛋白质。另外，上述测定可用于报告导致蛋白质功能的恢复或变化的感兴趣的mRNA序列的变化，从而为受试者提供治疗效果和益处、治疗受试者的病症和/或减少受试者病症的症状。
使用上述测定法，可以基于C3蛋白减少的量确定用本文所述的寡核苷酸进行治疗的有效性。与C3的适当对照水平(例如，约75-175mg/dL)相比，C3蛋白水平的降低可以是降低至1％或更低、5％或更低、10％或更低、15％或更低、20％或更低、25％或更低、30％或更低、35％或更低、40％或更低、45％或更低、50％或更低、55％或更低、60％或更低、70％或更低、80％或更低、或90％或更低。适当的对照水平可以是未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群中C33表达的水平。可以在一段有限的时间之后评估根据本文披露的方法向细胞递送寡核苷酸的效果。例如，可在将寡核苷酸引入细胞后至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天或十四天时分析细胞中C3的水平。可以确定C3的水平以评估是否需要对受试者进行再次治疗。例如，如果C3的水平增加至治疗前水平(或为治疗前水平的至少约20％或更多(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的水平)，则受试者可能需要再次治疗。
此外，使用本文所述的方法抑制C3基因可导致被鉴定为患有由补体途径激活或失调介导的疾病的受试者的细胞中C3 mRNA的转录减少。本文提供的方法可用于任何适当的细胞类型(例如，表达C3的细胞，诸如肝细胞)。在一些实施例中，细胞是从受试者获得的原代细胞，并且该原代细胞可能经历了有限次传代，使得细胞基本上保持其天然表型性质。在一些实施例中，寡核苷酸被递送至的细胞是离体或体外的(即，可以被递送至培养物中的细胞或细胞所驻留的有机体)。在具体的实施例中，提供了用于向细胞递送有效量的本文披露的寡核苷酸以降低肝细胞中C3单独表达的方法。
本文披露的寡核苷酸的有效量可以确定为导致由补体途径激活或失调介导的疾病或病症(诸如本文所述的疾病或病症之一)的症状减少的寡核苷酸的量。由补体途径激活或失调介导的疾病或病症的症状的减少可以是减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，例如，如使用本领域技术人员已知的临床评估所确定的。由补体途径激活或失调介导的疾病或病症的症状减轻的量可用于确定受试者是否需要用本文所述的寡核苷酸、药物组合物、载体或细胞再次治疗。用于确定由补体途径激活或失调介导的疾病的减少的测定的实例包括但不限于测量和/或定量循环C3蛋白、功能测定(例如，测定和溶血测定)。对C3(或C3切割产物)沉积的定量可以通过IHC或免疫荧光进行；以及通过特定的疾病生物标志物进行。
此外，可以使用任何适当的核酸递送将本文所述的包含作为双链体多肽的有义链和反义链的寡核苷酸引入受试者的细胞。可以通过注射含有寡核苷酸的溶液、被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击、将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液或在寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔来将双链体寡核苷酸递送到细胞。也可以使用脂质介导的载体转运、化学介导的转运、阳离子脂质体转染(诸如磷酸钙)和编码单链寡核苷酸的核酸的载体将双链体寡核苷酸递送到细胞。用于递送双链体寡核苷酸的载体可以是病毒载体，诸如逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)、腺病毒载体(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)和腺相关病毒载体(AAV)(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。
治疗方法
此外，本文披露了用于通过施用本文所述的组合物(例如，寡核苷酸、编码该寡核苷酸的载体、含有该载体的细胞、和药物组合物)在受试者中治疗由补体途径激活或失调介导的疾病(包括例如一种或多种与本文披露的补体途径激活或失调相关的疾病)的方法。该方法可以包括通过施用本文所述的RNAi寡核苷酸的药学上可接受的盐(例如，钠盐)来治疗受试者的由补体途径激活或失调介导的疾病。本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，即，能够产生期望的治疗结果(例如，C3表达的敲低)的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗由补体途径激活或失调(例如，C3的激活或失调)介导的疾病或病症的量。用于任一个受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的大小、身体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用的时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。这种治疗可例如用于减缓、停止或预防由补体途径激活或调节失调介导的任何类型的疾病或病症，并且可预防性或治疗性地施用。可以在检测到或出现由补体途径激活或失调介导的疾病或病症的特征性症状之前施用预防性药剂，从而预防疾病或病症，或替代性地，延迟疾病或病症的进展。可以通过例如本领域已知的诊断或预后测定之一或其组合来鉴定具有患由补体途径激活或失调介导的疾病的风险的受试者。
本文披露的组合物可以使用任何标准方法向受试者施用。例如，本文披露的任一种组合物可以肠内(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、通过胃造口术或直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内注射)、局部(例如，经皮、吸入、通过滴眼剂或通过粘膜)或通过直接注射到目标器官(例如，受试者的肝脏)中施用。通常，本文披露的寡核苷酸被静脉内或皮下施用。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于所施用的特定组合物、受试者、由正在治疗的补体途径激活或失调介导的特定疾病或病症、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、受试者的年龄、体重、性别、正在治疗的疾病的严重程度、受试者的饮食和受试者的排泄速率。
患有由补体途径激活或失调介导的疾病或病症的受试者可以例如每年(例如，每12个月一次)、每半年(例如，每六个月一次)、每季度(例如，每三个月一次)、每两个月(例如，每两个月一次)、每月或每周施用本文所述的寡核苷酸。在其他情况下，可以每周、每两周或每三周施用寡核苷酸。在某些实施例中，可以每天施用寡核苷酸。
待治疗由补体途径激活或失调介导的疾病的受试者可以是人或非人灵长类动物或另一哺乳动物受试者(例如，人)。可以用本文所述的寡核苷酸治疗的其他示例性受试者包括饲养的动物，诸如狗和猫；牲畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
剂量
本披露的组合物(例如，如本文所述的包含RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐的组合物)的剂量可以根据许多因素而变化，诸如化合物的药效学性质、施用方式、接受者的年龄、健康状况和体重、症状的性质和程度、治疗的频率和/或同时治疗的类型(如果有的话)以及待治疗的受试者中化合物的清除率。本领域技术人员可以基于上述因素确定适当的剂量。
本披露的寡核苷酸或其药学上可接受的盐可以按有效产生以下一种或多种(例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种)情况的量和时间施用：(a)受试者细胞中C3蛋白的表达降低；(b)受试者细胞中C3的转录减少；(c)受试者细胞中C3蛋白的水平降低；(d)受试者细胞中C3蛋白的活性降低；和/或(e)由补体途径激活或失调介导的疾病或病症的一种或多种症状减少。
因此，本披露涉及一种用于在有需要的受试者中治疗由补体途径激活或失调介导的疾病的方法，其中该方法包括施用有效量的所描述的寡核苷酸，该寡核苷酸特异性结合至C3 mRNA并抑制受试者中C3蛋白的表达。例如，本披露内容提供了一种在有需要的受试者中治疗由补体途径激活或失调介导的疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文披露的寡核苷酸、药物组合物、载体或细胞。
待利用所披露的方法和组合物治疗的由补体途径激活或失调介导的疾病可以是例如，一种或多种与本文披露的补体途径激活或失调相关的疾病。
由补体途径激活或失调介导的疾病的治疗可以通过施用抑制C3 mRNA的表达和/或翻译(例如，C3蛋白的表达)的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，诸如本文所述的那些)来实现。
所披露的组合物可以按本领域技术人员确定为合适的量施用。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸可最初以合适的剂量施用，该剂量可根据临床反应按需要调节。
在一些情况下，寡核苷酸或其药学上可接受的盐以0.01-100mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-5mg/kg、5-20mg/kg、20-50mg/kg、50-100mg/kg)受试者体重的剂量施用。在某些情况下，寡核苷酸以0.01mg/kg-50mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-5mg/kg、5-10mg/kg、10-20mg/kg、20-30mg/kg、30-40mg/kg、40-50mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.01mg/kg-20mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-5mg/kg、5-10mg/kg、10-15mg/kg、15-20mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.01mg/kg-15mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-2mg/kg、2-5mg/kg、5-8mg/kg、8-10mg/kg、10-12mg/kg、12-15mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.01mg/kg-10mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-2mg/kg、2-5mg/kg、5-8mg/kg、8-10mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.01mg/kg-5mg/kg(例如，0.01-1mg/kg、1-2mg/kg、2-3mg/kg、3-4mg/kg、4-5mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.1mg/kg-20mg/kg(0.1-1mg/kg、1-5mg/kg、5-10mg/kg、10-15mg/kg和15-20mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.1mg/kg-10mg/kg(例如，0.1-1mg/kg、1-2mg/kg、2-5mg/kg、5-7mg/kg和7-10mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以0.1mg/kg-5mg/kg(例如，0.1-1mg/kg、2-3mg/kg、3-4mg/kg和4-5mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以1mg/kg-50mg/kg(例如，1-10mg/kg、10-20mg/kg、20-30mg/kg、30-40mg/kg和40-50mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以1mg/kg-20mg/kg(例如，1-5mg/kg、5-10mg/kg、10-15mg/kg和15-20mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以1mg/kg-10mg/kg(例如，1-2mg/kg、2-5mg/kg、5-7mg/kg和7-10mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以1mg/kg-5mg/kg(例如，1-2mg/kg、2-3mg/kg、3-4mg/kg和4-5mg/kg)受试者体重的浓度施用。在其他情况下，寡核苷酸以30mg/kg-300mg/kg(例如，30-200mg/kg、30-100mg/kg、30-50mg/kg、50-300mg/kg、100-300mg/kg、200-300mg/kg和250-300mg/kg)的浓度施用。
在某些实施例中，寡核苷酸以小于10mg/kg(例如，9mg/kg或更小、8mg/kg或更小、7mg/kg或更小、6mg/kg或更小、5mg/kg或更小、4mg/kg或更小、3mg/kg或更小、2mg/kg或更小、1mg/kg或更小)受试者体重的剂量施用。在其他实施例中，寡核苷酸以约10mg/kg或更小的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约9mg/kg或更小(例如，8.9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、5mg/kg、3mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在其他实施例中，寡核苷酸以约8mg/kg或更小(例如，7.9mg/kg、7mg/kg、5mg/kg、3mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约7mg/kg或更小(例如，6.9mg/kg、6mg/kg、4mg/kg、2mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以约6mg/kg或更小(例如，5.9mg/kg、5mg/kg、3mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约5mg/kg或更小(例如，4.9mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约4mg/kg或更小(例如，3.9mg/kg、3mg/kg、2mg/kg和1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约3mg/kg或更小(例如，2.9mg/kg、2.5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约2mg/kg或更小(例如，1.9mg/kg、1.5mg/kg、1mg/kg和0.5mg/kg或更小)的剂量施用。在另一个实施例中，寡核苷酸以约1mg/kg或更小(例如，0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg和0.1mg/kg或更小)的剂量施用。
在另一个实施例中，寡核苷酸以约0.1-10mg/kg、约0.2-10mg/kg、约0.3-10mg/kg、约0.4-10mg/kg、约0.5-10mg/kg、约1-10mg/kg、约2-10mg/kg、约3-10mg/kg、约4-10mg/kg、约5-10mg/kg、约6-10mg/kg、约7-10mg/kg、约8-10mg/kg或约9mg/kg受试者体重的剂量施用。
在其他情况下，组合物(例如，包含本文所述的RNAi寡核苷酸的组合物)的剂量是预防或治疗有效量。在一些情况下，以每个受试者105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝(GC)的剂量施用病毒载体(例如，rAAV载体)。在一些实施例中，以105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个GC/kg(受试者的总重量)的剂量施用rAAV。
任选地，所披露的寡核苷酸可以作为适于递送至受试者的药学上可接受的组合物的一部分来施用，如本文所述。所披露的药剂以足以提供所需剂量和/或引起治疗有益效果的量包含在这些组合物中，如本领域技术人员可以容易地确定的。
本文所述披露的组合物可以按足以治疗受试者或实现上述结果之一(例如，受试者的一种或多种疾病症状的减少)的量(例如，有效量)和时间施用。所披露的组合物可以施用一次或多于一次。所披露的组合物可以每天施用一次、每天两次、每天三次、每两天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每年两次或每年一次。治疗可以是不连续的(例如，注射)或连续的(例如，通过植入物或输液泵的治疗)。根据用于治疗的组合物和施用途径，可以在施用本披露的组合物之后1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间评估受试者的治疗功效。受试者可以被治疗一段不连续的时间(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)或直至疾病或病状得到缓解，或者治疗可以是慢性的，这取决于所治疗的疾病或病状的严重程度和性质(例如，对于受试者的生命)。例如，如果最初或随后的治疗轮次没有引起治疗益处，则可以给予被诊断患有PNH并用本文披露的组合物治疗的受试者一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)额外的治疗，该治疗益处包括减少与PNH相关的任一种症状，诸如疲劳、虚弱、呼吸短促、容易瘀伤或出血、复发性感染、严重头痛、血凝块和难以控制出血，或降低受试者的细胞或血清中的C3mRNA或C3蛋白水平。
试剂盒
本披露的特征还在于试剂盒，这些试剂盒包含(a)药物组合物，该药物组合物包含本文所述的降低细胞或受试者中C3的水平和/或活性的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)药剂、或其药学上可接受的盐，以及任选地，药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。试剂盒可以含有编码本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的载体或包含编码本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的载体的细胞。试剂盒还可以包含包装插页，该包装插页具有执行本文所述的任何方法的说明书。在一些实施例中，该试剂盒包含(a)药物组合物，该药物组合物包含本文所述的降低细胞或受试者中C3的水平和/或活性的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)药剂；(b)额外的治疗剂；以及(c)包装插页，该包装插页具有用于执行本文所述的任何方法的说明书。
实例
以下实例仅意图作为说明，并不意图以任何方式限制本披露。
实例1：RNAi寡核苷酸的制备
寡核苷酸合成和纯化
在本实例和前述实例中描述的RNAi寡核苷酸使用本文所述的方法化学合成。通常，RNAi寡核苷酸使用如针对19-23聚体siRNA所述的固相寡核苷酸合成方法来合成(参见，例如，Scaringe等人(1990)Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:5433-5441和Usman等人(1987)J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]109:7845-7845；另参见美国专利号5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158)，以及使用已知的亚磷酰胺合成(参见，例如Hughes和Ellington(2017)ColdSpring Harb Perspect Biol.[冷泉港生物学展望]9(1):a023812；Beaucage S.L.,Caruthers M.H.,Studies on Nucleotide Chemistry V:DeoxynucleosidePhosphoramidites—A New Class of Key Intermediates for DeoxypolynucleotideSynthesis[核苷酸化学研究V：脱氧核苷亚磷酰胺—一类新的用于脱氧多核苷酸合成的关键中间体],Tetrahedron Lett.[四面体]1981；22:1859–1862.doi:10.1016/S0040-4039(01)90461-7)。
将具有19聚体核心序列的RNAi寡核苷酸格式化成具有25聚体有义链和27聚体反义链的构建体，以允许由RNAi机制处理。19聚体核心序列与C3 mRNA中的区域互补。
根据标准方法(爱荷华州克拉尔维尔的集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies；Coralville,IA))合成单个RNA链并纯化HPLC。例如，使用固相亚磷酰胺化学合成RNA寡核苷酸，在NAP-5柱(纽约州皮斯卡塔韦的阿默舍姆法玛西亚生物科技公司(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway,NJ))上使用标准技术进行脱保护和脱盐(Damha和Olgivie(1993)Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]20:81-114；Wincott等人(1995)Nucleic Acids Res.[核酸研究]23:2677-2684)。使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；阿默舍姆法玛西亚生物技术公司)上使用15min步进线性梯度纯化低聚物。梯度从90:10缓冲液A:B到52:48缓冲液A:B变化，其中缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，并且缓冲液B为100mM Tris pH 8.5，1M NaCl。在260nm处监测样品并收集对应于全长寡核苷酸物种的峰、合并、在NAP-5柱上脱盐并冻干。
通过在Beckman PACE 5000(加利福尼亚州富勒顿的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Inc.；Fullerton,CA))上的毛细管电泳(CE)测定每种低聚物的纯度。CE毛细管的内径为100μm，并含有ssDNA 100R凝胶(贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter))。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注入毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并在260nm处通过UV吸光度检测。变性三-硼酸盐-7M-尿素运行缓冲液购自贝克曼库尔特公司。获得至少90％纯度(如CE所评估的)的寡核苷酸，用于下文所述的实验。在VOYAGER-DETM BIOSPECTROMETRYTM工作站(加利福尼亚州福斯特的应用生物系统公司(Applied Biosystems；Foster City,CA))上使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MALDI-TOF)，按照制造商推荐的方案验证化合物的身份。获得所有低聚物的相对分子量，通常在预期分子量的0.2％内。
双链体的制备
将单链RNA低聚物重悬(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES、pH7.5组成的双链体缓冲液中。将互补有义链和反义链以相等摩尔量混合，以得到例如50μM双链体的最终溶液。将样品在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃保持5'，并在使用前冷却至室温。将RNAi寡核苷酸储存在-20℃下。将单链RNA寡聚物在-80℃下冻干储存或在无核酸酶的水中储存。
实例2：C3-靶向性RNAi寡核苷酸的生成
对C3 mRNA靶序列的鉴定
补体是紧密调节的酶促级联，其可以通过几种不同的途径激活，包括补体经典途径(CCP)，在该途径中，抗体复合物触发激活。无论哪种途径启动该过程，补体激活都会在级联中的C3处汇合。一旦激活，C3就会被切割以形成效应物分子C3a和C3b，从而导致炎症、C3b在组织中的沉积，以及末端补体激活和进一步的组织损伤。
为了生成针对C3表达的RNAi寡核苷酸抑制剂，使用基于计算机的算法在计算上鉴定适于测定RNAi途径对C3表达的抑制的C3 mRNA靶序列。制备了超过300个RNAi寡核苷酸向导(反义)链序列，其各自具有与人C3 mRNA的合适C3靶序列的互补区域(参见表3)，并在体外测定C3表达抑制。从这些RNAi寡核苷酸中选择九个寡核苷酸的子集(见表4)用于进一步研究。该算法鉴定的九个向导序列的子集也与猴C3 mRNA的对应C3靶序列(SEQ ID NO:67；表3)互补。预计包含与具有核苷酸序列相似性的同源C3 mRNA靶序列的互补区域的C3 RNAi寡核苷酸具有靶向同源C3 mRNA的能力。
表3：人和猴C3 mRNA的序列
物种 参考序列号 SEQ ID NO
人(Hs) NM_000064.4 12
食蟹猴(Mf) XM_005587719.2 67
实例3：对在体外抑制C3表达的RNAi寡核苷酸的鉴定
使用基于细胞的体外测定来测量如实例1和2中所述生成的RNAi寡核苷酸(格式化为dsiRNA寡核苷酸)对于降低C3 mRNA的活性。简言之，将表达内源性C3的HepG2人肝细胞用1nM的RNAi寡核苷酸(图3A)或用图3A中筛选的两种不同浓度(0.1和1nM)的RNAi寡核苷酸的子集(图3B)转染，如多孔细胞培养板的单独孔中所示。转染后将细胞维持24小时，然后使用基于的qPCR测定来确定来自经转染细胞的C3 mRNA水平。使用两种RT-qPCR测定(3'测定和5'测定)确定mRNA水平，如分别通过HEX和FAM探针所测量的。基于通过RT-qPCR确定的对C3 mRNA水平的抑制，选择RNAi寡核苷酸候选物的子集用于进一步的体内分析。
实例4：在表达人C3 cDNA的小鼠(HDI小鼠)中对RNAi寡核苷酸的筛选
在表达人C3 cDNA的小鼠中筛选来自实例3的RNAi寡核苷酸候选物(或“化合物”)的子集。向用表达人C3 cDNA的载体转染的CD-1小鼠施用单个皮下剂量的0.5或1mg/kg所选化合物(化合物A-I)。4天后处死动物，以评价来自肝匀浆的人C3 mRNA水平，如使用特异性探针通过RT-qPCR所确定的。选择在经转染小鼠中显示出至少50％敲低效力的化合物，用于在食蟹猴中测试。9个化合物的子集(即，化合物A、B、C、D、E、F、G、H和I)的体内筛选结果描绘于图4B和4C中，并且其对应的有义链和反义链汇总于表4中和图4A中。数据表示为相对于PBS处理的小鼠，肝脏中剩余的C3 mRNA的百分比。
表4.化合物A-I的有义和反义链的汇总
实例5：在食蟹猴中对RNAi寡核苷酸的筛选
在以4mg/kg单次皮下施用化合物A-I后，在食蟹猴(NHP)中测试在小鼠筛选期间预选的如实例4、表4和图4A中所述的所有化合物A至I的C3 mRNA沉默持续时间。在给药前和注射后第28天和第56天收集所有测试动物(n＝5/化合物)的肝活检样品。如图5所示，如通过RT-qPCR所确定的，与归一化的基线水平和时间匹配的PBS对照相比，大多数测试化合物的肝脏C3 mRNA水平降低至少50％。基于单次施用后食蟹猴肝脏中C3 mRNA的敲低水平，选择两种先导化合物(化合物A和B)用于在多剂量研究中测试。
化合物A和B选自单剂量研究，用于在多剂量NHP研究中进一步评估。食蟹猴在第0天、第28天、第56天和第84天皮下给药1mg/kg或2mg/kg，共4剂。在给药前和初始治疗后第28天、第56天和第112天收集肝活检，以通过RT-qPCR评价肝脏C3 mRNA水平(图6A)。在给药前、初次给药后第1天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天、第84天、第98天和第112天收集血清样品，以通过C3 ELISA试剂盒评价C3蛋白水平(图6B)，通过AP测定(图8)和通过兔红细胞溶血法(图9)评价补体活性。将PBS处理的动物用作来自C3肝脏mRNA、C3血清蛋白和功能测定的对照。用化合物A或B对食蟹猴进行多次治疗导致肝脏中C3 mRNA沉默的持续时间延长，血清中循环C3显著减少，替代途径补体活性降低>95％，以及在多次施用化合物A和B后在溶血测定中完全抑制兔红细胞的裂解，分别如图6A、6B、8和9中所描绘。
通过结合单剂量和多剂量NHP研究的第28天结果来计算化合物A和B的效力。化合物A的近似ED50(0.65mg/kg)和化合物B的近似ED50(0.55mg/Kg)是根据为这两种化合物生成的剂量反应曲线计算得出的(图7)。
实例6：化合物J对CD-1小鼠中C3表达的药代动力学和药效学研究
用化合物J(化合物A的鼠替代物)治疗CD-1小鼠，以评估作为化合物J施用的结果的小鼠中肝脏C3 mRNA敲低的百分比和血清C3蛋白水平。使用RT-qPCR测量作为化合物J施用的结果的肝脏C3 mRNA的敲低百分比。使用小鼠C3 ELISA测定来测量血清中C3的量。小鼠接受单个皮下剂量的0.5mg/kg、1mg/kg或6mg/kg化合物J。化合物J的单次施用显示出肝脏C3 mRNA的剂量依赖性肝脏C3 mRNA敲低百分比，其中来自接受6mg/kg剂量的动物(n＝5只小鼠/时间点)的肝脏中C3mRNA减少大于90％。如图10A所示，6mg/Kg剂量后，mRNA敲低的最低点为3-14天。在研究过程中测量CD-1小鼠的血清中C3蛋白的百分比，并相应地抑制(图10B)。
在接受该剂量后672小时内，使用茎环-qPCR测量施用单个皮下剂量的6mg/kg化合物J的CD-1小鼠的血浆、肝、肾和脾组织中化合物J的量(图11)。药代动力学分析表明，化合物J的最高暴露在肝中，其次是脾、肾和血浆中(图11)。
在70天期间进行的多剂量研究中，使用RT-qPCR测量C3 mRNA百分比，并且通过小鼠C3 ELISA测定来测量血清中C3蛋白的量，其中CD-1小鼠在第0天、第14天、第28天和第42天接受四剂1mg/kg或6mg/kg化合物J，分别如图12A和12B中所示。此方案分别导致～75％和>95％的肝C3 mRNA和血清蛋白水平的敲低。在首次给药后第3天、第14天、第17天、第28天、第31天、第42天、第45天、第56天和第70天进行肝活检和血清收集。使用茎环qPCR(SL-qPCR)从肝活检和血浆样品中分析化合物J在4剂1mg/kg后的肝脏和血浆浓度，分别如图13A和13B所示。将PBS处理的CD-1小鼠用作C3肝脏mRNA和C3血清蛋白水平的对照。
此项多剂量研究表明，化合物J(化合物A的鼠替代物)显示出在70天的过程中持续的肝脏C3 mRNA的剂量依赖性敲低。循环C3蛋白水平的降低对应于在肝脏中观察到的C3mRNA的减少。另外，来自给药动物的化合物J的血浆和肝脏浓度显示，在每两周给药一次(1mg/kg)的情况下，没有化合物J的累积(分别为图13A和13B)。
实例7：化合物J对狼疮肾炎模型NZB/W F1小鼠中C3表达的作用
使用NZB/W F1狼疮小鼠模型测试化合物J在疾病模型中的机制证明。从21周龄开始每4周对NZB/W F1动物皮下施用0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg剂量的化合物J(n＝10/组)。将PBS治疗的动物用作阴性对照，并将CD1-小鼠的肾脏用作非疾病对照。在37周龄时，通过对来自化合物J治疗的动物和PBS对照动物的肾脏进行免疫荧光成像来评估C3和备解素肾小球沉积(图14)。在29周龄时，使用RT-qPCR测量肝脏C3 mRNA的百分比(图15A)，并且对于化合物J的每个剂量水平，使用小鼠C3 ELISA测定(图15B)定量血清中C3蛋白的量。在用化合物J进行多剂量治疗后，从化合物J治疗的动物中观察到C3和备解素肾小球沉积的剂量依赖性减少。用化合物J对NZB/W F1小鼠进行多剂量治疗显示出在16周的过程中持续的肝脏C3mRNA的剂量依赖性敲低。循环C3蛋白水平的降低(图15A)对应于在肝脏中观察到的C3mRNA的减少(图15B)。
在用化合物J治疗8周和16周后，分别在29周龄和37周龄时收集血清样品，以通过ELISA测定来测量循环IgG免疫复合物(CIC)(图16A和图16B)。在用化合物J进行多剂量治疗后，与从PBS治疗的对照组中观察到的CIC水平相比，C3表达的肝脏敲低并未增加循环免疫复合物的水平。
实例8：化合物J对狼疮肾炎模型MRL/lpr小鼠中C3表达的作用
使用MRL/Ipr狼疮小鼠模型并用化合物J进行治疗。小鼠接受多剂的6mg/kg化合物J。图17示出了用多剂的6mg/kg化合物J治疗的MRL/lpr小鼠的肾脏中C3肾小球沉积的减少。从在8至16周龄期间每两周用皮下剂量的6mg/kg化合物J治疗的动物的肾脏样品中还观察到备解素沉积的减少，如图17所示。
实例9：化合物J对补体失调模型Cfh-/-小鼠中C3表达的作用
在4月龄至8月龄期间，对缺乏补体因子H的小鼠(Cfh-/-)施用四次每月剂量的0.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg化合物J。在最后一次给药化合物J后4周收集所有治疗组的肾脏，并进行免疫荧光分析，以将CFH-/-治疗的动物的肾小球中的C3和备解素沉积可视化。图18示出了用多个增加剂量的化合物J治疗的CFH-/-小鼠的肾脏中C3肾小球沉积的剂量依赖性减少。如图18所示，从在16至32周龄期间每四周用皮下剂量的化合物J治疗的动物的肾脏样品中还观察到备解素沉积的减少。使用RT-qPCR测量肝脏C3 mRNA的百分比(图19)。治疗消除了肾脏中的C3和备解素沉积。此外，用化合物J进行治疗还使这些小鼠中的血清C5水平归一化(C5消耗是该模型中补体失调的标志)。
实例10：化合物J对CAIA诱导的关节炎小鼠模型中C3表达的作用
使用胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)诱导的关节炎小鼠模型研究化合物J在治疗与关节炎相关的症状中的作用，该模型是类风湿性关节炎的简单模型。CAIA诱导的关节炎小鼠模型是通过在第0天向小鼠施用胶原抗体，然后在第3天施用LPS加强剂而产生的。化合物J在预防性研究和治疗性研究中进行了测试。在第-7天向动物给药3或6mg/kg化合物J，用于预防性研究(图20A)，或在第5天疾病发作后给药，用于治疗性研究(图20B)。在第10天目测分析后爪炎症，并且预防性和治疗性研究的结果分别示于图21A和21B中。用化合物J进行预防性治疗防止了后爪肿胀，后爪肿胀是该模型的特征性标志(图21A)。与PBS治疗的对照动物相比，用化合物J进行治疗性治疗在单次给药后完全恢复了临床疾病表现(图21B)。
对后爪和膝盖的活检进行苏木精和曙红(H&E)染色，并且该染色显示出用单剂6mg/kg化合物J治疗的小鼠中局部单核细胞浸润的减少，无论是用3个剂量进行预防性治疗(图22A)还是用单个剂量进行治疗性治疗(分别为图22B和24A)。另外，分别如图25、26和27所示，对活检样品进行淋巴细胞(CD45阳性细胞)、白细胞(CD11b阳性细胞)和巨噬细胞(F4/80阳性细胞)标志物染色，以显示出作为用6mg/kg化合物J进行治疗性治疗的结果的局部炎症的减少。还用番红O对活检样品进行染色，以将CAIA诱导的关节炎小鼠模型的膝盖中的软骨可视化。当进行预防性治疗(图23)或治疗性治疗(图24B)时，与PBS治疗的小鼠相比，用6mg/kg化合物J治疗的动物显示出软骨侵蚀的显著减少。对活检样品进行使用与C3和CD45mRNA的原位杂交的实验，以便评估在用和不用6mg/kg化合物J治疗的CAIA诱导的关节炎小鼠的局部炎症位点处的补体表达，如图28所示。与作为对照组的PBS治疗的动物相比，用化合物J对C3进行肝脏敲低减少了淋巴细胞(CD45阳性细胞)的浸润和用化合物J进行治疗性治疗的局部C3 mRNA表达。
实例11：化合物J对多发性硬化症小鼠模型中C3表达的作用。
将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型(一种广泛用于研究神经炎症和脱髓鞘的免疫介导机制的模型)用6mg/kg剂量的化合物J进行预防性治疗(n＝2个实验)。分别使用RT-qPCR和小鼠C3 ELISA测定评估用化合物J治疗后的肝脏C3 mRNA水平以及血清中的C3蛋白，如图31A和31B所示。同样地，评估与用PBS治疗的C3缺陷型小鼠和MOG诱导的EAE C3缺陷型小鼠品系相比，用化合物J治疗后剩余的C3mRNA的百分比以及用6mg/kg剂量的化合物J治疗后MOG诱导的EAE小鼠的血清中C3的量。在所进行的两个实验中，用化合物J对C3进行肝脏敲低降低了疾病的严重程度(图29)。用化合物J治疗进行肝脏敲低所观察到的严重程度的降低与C3缺陷型动物中的临床观察相似(全基因敲除)。
还从用化合物J治疗的MOG诱导的EAE小鼠获得腰椎脊髓样品。如图30所示，对脊髓样品进行Luxol快速蓝染色以及H&E染色，以便将髓鞘形成以及单核细胞浸润可视化。如图30所示，比较用6mg/kg化合物J、PBS治疗的疾病动物与C3-缺陷型小鼠之间的Luxol快速蓝脊髓样品。用化合物J治疗的MOG诱导的动物显示出脱髓鞘的减少和免疫细胞浸润的预防，这类似于在MOD诱导的EAE C3缺陷型小鼠中观察到的水平。
在蛋白脂质蛋白(PLP)诱导的EAE模型中观察到类似的结果。C3 siRNA治疗降低了疾病严重程度，但不足以防止复发，复发是该动物模型的特征。
实例12：小鼠吸收、分布、代谢和排泄(ADME)研究
在施用PBS(n＝18)或通过单次皮下(SC)注射施用3、10或100mg/kg化合物A(n＝39/队列)，或通过单次静脉内(IV)注射施用3mg/kg化合物A(n＝36)的雄性CD-1小鼠中进行药代动力学和生物分布研究。基于3mg/kg IV与SC剂量后AUClast的比较，生物利用度约为18％。然而，3mg/kg IV队列与SC队列之间的肝脏暴露相似。与3mg/kg剂量组相比，10mg/kg组的血浆暴露大致按剂量比例方式增加，而100mg/kg组的血浆暴露则大于剂量比例方式。与3mg/kg剂量组相比，基于Cmax和AUClast的肝脏暴露在10mg/kg下大致按剂量比例方式增加，而在100mg/kg下则小于剂量比例方式，这表明肝脏的分布过程达到饱和。肝脏中的消除半衰期为2.1-4天。
实例13：化合物A的血小板激活
对用化合物A刺激的人全血中血小板激活的评估并未诱导血小板激活。用PBS或10、100、200或300μg/mL化合物A刺激全血样品(5名男性和5名女性供体)。
实例14：化合物A在食蟹猴中的耐受性
在原初雄性和雌性食蟹猴的研究中评价化合物A给药的耐受性。在第0天(n＝6/队列)向动物施用SC剂量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(n＝12)或1.5mg/kg(低)或3mg/kg(高)剂量水平的化合物A，并且在第21天进行肝活检，以确定肝C3敲低水平。基于该分析，将第28天、第56天和第84天的给药水平调节至3mg/kg(对于低剂量)或6mg/kg(对于高剂量)，以分别设法使C3 mRNA敲低为约75％和90％。在第-21天、第-7天、第-3天、第0天、第28天、第56天和第112天收集血液样品，并在研究前、第56天和尸检时进行总共28种病原体的病毒、细菌和寄生虫测试，以通过血清学和血液或粪便PCR监测潜伏病毒和/或感染的潜在再激活。由临床病理学家进行终末尸检评估，以确定潜在感染证据。还对血清中的循环C3蛋白水平以及CBC、凝血、临床化学和尿液分析进行了中期测量。在用低或高剂量的化合物A给药后第49天，分别达到约75％或80％的肝C3 mRNA敲低，其中循环C3蛋白水平降低约80％。当终止研究时，肝C3 mRNA和C3蛋白水平的这些降低在到第112天评价的所有时间点都是持续的。尸检时没有肉眼或显微镜发现，也没有计划外死亡。体重、肝功能测试、血细胞计数、血液化学和脂质代谢参数不受长期化合物A治疗的影响，并且与用PBS给药的队列相比，在经治疗的猴中不存在病原性寄生虫、细菌或病毒感染增加的证据。
实例15：化合物J在CD-1和NZB/W F1小鼠中的耐受性
在CD-1和NZB/W F1小鼠中评价长期化合物J给药的耐受性。向CD-1小鼠施用总共4个每月SC剂量的PBS或化合物J(1或100mg/kg)，在最后一次给药后一个月处死，并由设盲病理学家评价病毒或细菌感染和组织学变化的证据。未观察到治疗相关的组织病理学变化或感染增加。类似地，每4周向NZB/W F1小鼠施用1或6mg/kg化合物J，从28至40周龄，在44周龄时终末处死，或从24至36周龄，在40周龄时终末处死。通过对一组病毒、细菌病原体和寄生虫进行血清学和PCR测试，没有检测到感染增加的证据，并且由对治疗组不知情的兽医病理学家评价的终末尸检并未鉴定出任何治疗相关的变化。
实例16：化合物A在食蟹猴中的安全药理学研究
在食蟹猴的皮下安全性药理学研究中评价化合物A。每7天对四只动物施用一次PBS或增加单剂量的化合物A(30、100和300mg/kg剂量水平)，其中对于每个给药时机使用相同的四只动物。本研究期间进行了安全性药理学评估，包括心血管(例如，ECG、血压、心率等)、呼吸(呼吸频率)和神经系统(功能性观察组合试验)终点评估以及临床评估。在任何剂量水平下均未观察到心血管或呼吸效应。在30或100mg/kg化合物A下没有观察到神经系统效应。在300mg/kg下，在给药后4和24小时，在3只动物中注意到轻微至轻度震颤(四肢或全身)的临床观察结果。在300mg/kg下观察到的神经系统观察结果被认为是不良的。因此，将未观察到不良效应水平(NOAEL)确定为100mg/kg。另外，包括体外微核测定和体外细菌回复突变测定在内的遗传毒理学评估分别对诱导微核和诱变活性呈阴性。
实例17：化合物A在食蟹猴中的PK/PD研究
在食蟹猴中进行单剂量PK/PD研究。动物在第0天接受SC剂量的PBS(对照)或单个SC或IV剂量的3mg/kg化合物A(每组n＝5)。评价血浆、尿液和组织中的化合物A浓度。在第2天、第35天、第70天、第112天、第158天和第252天进行肝活检，以评价肝脏C3 mRNA水平(主要药效学标志物)。循环C3蛋白水平和补体功能活性是在整个研究中评估的额外的PD标志物。
使用具有荧光检测的合格的基于杂交的阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC-FD)确定血浆、肝脏和尿液中化合物A的浓度。使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测量猴肝脏中补体组分3(C3)mRNA表达的降低。使用ELISA测量猴血清中的C3蛋白，并使用测定来测量补体功能活性(经典途径、甘露糖结合凝集素途径(MBL)和替代途径)。
使用化合物A随时间推移的血浆浓度生成个体动物的非区室PK曲线(组平均值绘制于图32A中)。对于所有动物，SC施用后的血浆Tmax范围为1-6小时，并且IV施用的Tmax为0.25小时(收集的第一个时间点)。化合物A的血浆浓度以双相方式降低，与IV途径相比，SC途径具有较慢的分布阶段。双相降低表示最初的快速分布阶段，主要是肝脏，随后是较慢的消除阶段。SC组中的5只动物中有1只报告了血浆半衰期(2.51小时)，并且IV组中的5只动物中有2只报告了血浆半衰期(平均值＝1.21小时)。未报告剩余动物的半衰期，因为未满足终末期速率常数的验收标准。相对于基于AUClast的IV剂量，SC剂量的化合物A的生物利用度为约28.5％。
使用化合物A随时间推移的肝脏浓度生成个体动物的非区室PK曲线(组平均值绘制于图32B中)。计算SC组和IV组中所有5只动物的肝脏半衰期，并且范围分别为13-20天和20-33天。
使用每只动物在各收集时间间隔内在尿液中排泄的化合物A的总量来计算总药物排泄和药物排泄百分比。SC组和IV组的化合物A的平均尿排泄分别为4.3％和4.8％。
在单次SC或IV施用3mg/kg化合物A后，在第2天(仅SC)观察到猴肝脏中C3 mRNA表达的降低，并且在给药后第35天达到最大减少(对于两种给药途径均为约70％)(图33)。观察到C3 mRNA表达随时间推移逐渐恢复，到第114天恢复至接近基线水平。对于两种施用途径，这种恢复一直维持到第252天。
在单次3mg/kg SC施用化合物A后，从第7天至第70天观察到血清C3蛋白的减少(图34)。在给药后28天，血清中的最大平均C3蛋白水平降低54.7％，并到第168天恢复至给药前水平。相对于对照，在施用单次3mg/kg IV剂量的化合物A的动物中不存在血清C3蛋白水平的降低。
相对于对照，SC组或IV组对经典补体没有影响(图35)。在第14天、第28天和第35天，相对于SC组中的对照，凝集素和替代途径的功能降低。凝集素途径的功能在所有三天中最低限度地降低(约13％)(图36)，而替代途径的功能在第14天、第28天和第35天分别降低87％、85％和73％(图37)。凝集素途径的途径功能到第70天恢复至基线水平，并且替代途径的途径功能到第168天恢复至基线水平。
在单次3mg/kg SC施用化合物A后，在第35天最大mRNA减少为70％，在第28天C3蛋白的最大减少为54.7％，并且在第14天替代途径活性的最大减少为≥87％。mRNA表达到第168天恢复至基线水平，C3蛋白表达到第28天恢复至基线，并且替代途径功能到第168天恢复。
实例18：CD-1小鼠和食蟹猴中的毒理学研究
进行小鼠的6个月毒理学研究和食蟹猴的9个月毒理学研究。选择这些研究中的剂量水平范围以实现超过预期最高临床剂量的预期暴露的至少10倍的暴露倍数。
在鼠类研究中，评价在CD-1小鼠中重复给药(每4周；7剂)SC施用PBS或化合物A(30、100或300mg/kg)的潜在毒性，并评价8周恢复期后任何发现的潜在可逆性。在研究的给药部分期间评价每个给药队列的十只雄性和10只雌性小鼠，并且在恢复期期间维持6只雄性和6只雌性小鼠。此外，在子研究(n＝111)中确定化合物A的毒代动力学特性。以30、100或300mg/kg的水平给药的化合物A耐受性良好，没有出现与化合物A相关的死亡或不良发现。临床病理学发现包括在第171天丙氨酸转氨酶最低限度地增加和甘油三酯最低限度地减少，在恢复期结束时完全或部分可逆性明显。与化合物A相关的非不良显微镜发现包括：在终末安乐死时肝脏出现轻微或轻度混合细胞炎症，肝细胞核细胞肥大，有丝分裂增加和卵圆形细胞增生，其中在恢复期安乐死时仍存在轻微或轻度有丝分裂增加和肝细胞核细胞肥大。基于这些结果，NOAEL被认为是300mg/kg，这对应于在第169天雄性和雌性分别为760,000和543,000hr*ng/mL的平均AUClast值和160000和96400ng/mL的平均Cmax值。
在猴类研究中，评价化合物A的重复SC给药(每4周0、30、100、300mg/kg，总共10个剂量)的潜在毒性，以及在8周恢复期后任何作用的可逆性、持久性或延迟发生。在主要给药研究的每个剂量队列中包括四只雄性和4只雌性猴，并在2个月的恢复期中包括2只雄性和2只雌性。此外，确定化合物A的毒代动力学和PD特性。持续9个月对食蟹猴重复SC施用化合物A是良好耐受的。化合物A的重复剂量施用在以下参数中未产生与试验品相关的变化：临床观察、神经系统检查、眼科检查、体重、定性食物消耗、血液学、临床化学、尿液分析、细胞因子(即，MCP-1、TNF-α、IL-8、IL-1RA、G-CSF、IFN-γ，IL-1β和IP-1)，补体因子Bb和C3a、大体病理学或研究给药阶段期间的器官重量。此外，本研究期间没有早期死亡，所有动物均存活至计划的尸检。在≥100mg/kg/剂量下，发生与化合物A相关的纤维蛋白原的非不良增加。在≥30mg/kg/剂量下，在肝脏以及多种其他组织中存在非不良显微镜发现(空泡化/粒状巨噬细胞)。基于观察到的发现，将NOAEL确定为300mg/kg/剂量，其中相关的AUClast为1330000hr*ng/mL并且Cmax为70900ng/mL(雄性和雌性合计，第253天)。
包括体外微核测定和体外细菌回复突变测定在内的遗传毒理学评估分别对诱变活性和诱导微核呈阴性。
基于全部数据，NOAEL被认为是300mg/kg。在每周增加剂量的研究中注意到的神经系统临床体征(例如，震颤)在每月给药的为期9个月的猴毒理学研究中没有注意到。
实例19：化合物B对AMR模型食蟹猴中C3表达的作用
在接受肾同种异体移植物的四只致敏食蟹猴中进行药理学研究。在该研究中，动物在总共4个月内每4周接受一次SC剂量的化合物B。
实例20：人体剂量范围研究
在健康志愿者中进行单次递增剂量(SAD)研究，并在患有补体驱动疾病的患者中进行多次递增剂量(MAD)队列研究，用于首次人体(FIH)临床研究。健康志愿者和患者在接受化合物A之前接受抗A、C、W、Y和B型脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)以及B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的预防性疫苗接种。
实例21：用化合物A治疗人多发性硬化症
用含有化合物A的药物组合物(例如，以约0.01mg/kg-50mg/kg受试者体重的剂量)治疗患有多发性硬化症的受试者。以约每周一次的频率向受试者施用组合物，例如通过皮下注射，持续约12个月或更长的时间段(例如，直到症状消退或稳定)。大约每月一次，由临床医师评价受试者的症状和血清C3水平以评估化合物A的功效。使用血清样品定量受试者的血清C3并且可以将其与在施用化合物A之前在受试者的血清中发现的C3蛋白的量或相对于C3蛋白的对照量或存在于来自正常受试者(例如，无疾病的受试者)的血清样品中的C3蛋白的量进行比较。如果与用化合物A治疗前血清中C3蛋白的量相比，血清中C3蛋白的量减少，即，减少至少10％，则确定用化合物A进行治疗是有效的。另外，可由临床医师评估与多发性硬化症相关的受试者症状，诸如视力模糊、言语不清、头晕、刺痛、缺乏协调和步态不稳，以评价与施用化合物A之前受试者经历的症状相比和/或与安慰剂对照受试者相比，受试者所经历的任何或所有症状是否有所减少。
实例22：用化合物A治疗人关节炎
用含有化合物A的药物化合物(例如，以约1.5mg/kg的剂量)治疗被诊断为患有关节炎的受试者。以约每月一次的频率向受试者施用组合物，例如通过皮下注射，持续约6个月或更长的时间段(例如，直到症状消退或稳定)。每一个月或两个月由临床医师评价受试者(例如，通过评估受试者的症状和/或血清C3水平)，以评估化合物A的功效。使用来自受试者的血清样品定量受试者的血清C3，并将其与在施用化合物A之前在受试者的血清中发现的C3蛋白的量或相对于C3蛋白的对照量或存在于来自正常受试者(例如，无疾病的受试者)的血清样品中的C3蛋白的量进行比较，和/或与存在于来自安慰剂治疗的患者的血清样品中的C3蛋白的量进行比较。如果与用化合物A治疗前血清中C3蛋白的量相比，血清中C3蛋白的量减少至少10％，则确定用化合物A进行治疗是有效的。另外，可由临床医师评估与关节炎相关的受试者症状，包括疼痛、僵硬、肿胀、发红和活动范围减小，以评价与施用化合物A之前受试者经历的症状相比，受试者所经历的任何或所有症状是否有所减少。
实例23.C3评估测定
如本文所描述的，可以使用包括血浆或组织中化合物A的评估、补体功能活性分析、循环C3、C3 mRNA表达水平的评估和药代动力学测定在内的各种测定来表征化合物A对C3水平的影响。
化合物A的药代动力学测定
测量小鼠和猴的血浆中化合物A或化合物J的浓度。将血浆样品(空白、未知物、标准品和QC样品)酶促处理，然后与具有与化合物A或化合物J的反义链互补的序列的肽核酸(PNA)探针杂交。将样品注入配备有荧光检测器的高效液相色谱(HPLC)中。使用DNAPACTMPA200分析柱在Shimadzu Prominence系统上使用梯度系统进行色谱分离。荧光检测器监测从436nm(激发)到484nm(发射)的信号。为了检查代谢物的保留时间，制备并注入个体和混合物的参考样品。成功地分离了化合物A及其预期代谢物的峰。使用线性回归分别对猴或鼠血浆中的化合物A或化合物J进行定量。该测定用于例如上文描述的实例6、12和17中。
补体功能活性测定(CCP、CAP、CLP)
使用补体系统筛选测定来评估补体经典途径(CCP)、CAP和补体凝集素途径活性，其中使用对新抗原具有特异性的标记抗体来检测由于补体激活而产生的人末端补体复合物(C5b-9)复合物。该测定还能够检测食蟹猴C5b-9。产生的新抗原的量与各个途径的功能活性水平成正比。测定微量滴定条中的孔涂覆有经典、替代或凝集素途径的特定激活剂。将猴血清样品在含有阻断剂的稀释剂中稀释，该阻断剂确保只有相应的途径被激活。洗涤孔，并用针对表达的新抗原的特异性碱性磷酸酶标记的抗体检测C5b-9。补体激活的量与通过405nm处的吸光度测量的颜色强度相关。测试试剂盒中提供的阳性对照的值被定义为100％补体激活。所有测量值均表示为补体活性百分比(％)，确定如下：
[(样品–阴性对照)/(阳性对照–阴性对照)]*100
该测定用于例如上文实例17中。
循环C3蛋白水平
使用被设计用于定量测量人血清中的补体C3浓度的人补体C3酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(目录号Ab108823，英国剑桥的艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))评价食蟹猴循环C3蛋白水平。由于该试剂盒与猴C3存在交叉反应性，因此该试剂盒也用于确定食蟹猴血清样品中的循环C3蛋白。将补体C3特异性抗体预包被到96孔板上并封闭。向孔中添加标准品或测试样品，随后添加补体C3特异性生物素化检测抗体，随后添加洗涤缓冲液。添加链霉亲和素-过氧化物酶缀合物，并用洗涤缓冲液去除未结合的缀合物。使用四甲基联苯胺(TMB)使链霉亲和素-过氧化物酶酶促反应可视化。TMB被链霉亲和素-过氧化物酶氧化，产生蓝色产物，该蓝色产物在添加酸性终止溶液后变为黄色。黄色着色的密度与板中捕获的补体C3的量成正比。通过校准标准品产生的曲线拟合回归程序确定样品的反算浓度。该测定用于例如上文实例14和17中。
C3 mRNA表达水平
使用多重相对定量实时逆转录酶PCR测定来确定食蟹猴肝脏样品中C3 mRNA表达的评估。从冷冻的肝脏组织中分离出mRNA，然后进行mRNA定量并转录成互补DNA(cDNA)。将cDNA用作qPCR反应的模板以测量C3 mRNA水平，相对于肽基-脯氨酰基顺反异构酶B(PPIB)进行归一化。将治疗组中C3 mRNA的程度计算为相对于未治疗组或给药前组的表达百分比(相对于PPIB mRNA水平归一化)，其中将对照组中的C3 mRNA表达设定为100％。
药代动力学测定
使用HPLC-FD分析方法测量人血浆中化合物A的浓度。将血浆样品(空白、未知物、标准品和质量控制[QC]样品)用蛋白酶K进行酶促处理，然后与具有与化合物A的反义链互补的序列的PNA探针杂交。将样品注入配备有荧光检测器的HPLC中。使用DNAPACTM PA200分析柱在Shimadzu Prominence系统上使用梯度系统进行色谱分离。荧光检测器监测从436nm(激发)到484nm(发射)的信号。基于化合物A的潜在代谢物的保留时间调节和确定LC梯度条件。为了评价代谢物的保留时间，制备并注入个体和混合物的参考样品。分离化合物A和代谢物的峰。使用线性回归进行人血浆中化合物A的定量。
抗药抗体测定
人血清中化合物A的抗药抗体(ADA)测定正在开发中，并且计划使用电化学发光(ECL)桥接测定进行。阳性对照(PC)产生自针对免疫原性混合物免疫的兔，该混合物由钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合的化合物A和对应于经修饰的化合物A序列的各种长度的KLH缀合型寡核苷酸组成。将在环境室温下对PC、阴性对照(NC)和研究样品进行酸解离步骤，然后添加到含有TRIS、生物素-化合物A和钌标记的化合物A的板中，使得能够在标记的化合物A与存在于样品中的化合物A抗体之间形成桥接复合物。温育后，NC、PC和研究样品将被转移到链霉亲和素包被的板上，并在黑暗中温育1小时，在此期间药物结合至捕获ADA桥接复合物的板。然后洗涤板，并添加Meso Scale读取缓冲液，以生成与样品中存在的ADA的量成正比的ECL信号。在评价临床样品之前，将对ADA测定进行验证。
其他实施例
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过援引并入本文，其程度如同具体且单独地指示每个独立出版物或专利申请通过援引并入一般。虽然本文描述了特定实施例，但是本领域技术人员将理解，涵盖了进一步的修改和实施例，包括总体上遵循本文所述的原理并且包含对本披露的以下偏离的变化、用途或改编，这些偏离在本领域内的已知或惯常实践范围内并且可以应用于此前所阐述的基本特征。
序列表
<110> 阿雷克森制药公司（Alexion Pharmaceuticals, Inc.）
<120> 用于抑制补体组分3表达的组合物和方法
<130> 50694-093WO3
<150> US 63/177,254
<151> 2021-04-20
<160> 67
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 36
<212> RNA
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aucaacucac cuguaauaaa gcagccgaaa ggcugc 36
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uuuauuacag gugaguugau gg 22
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<210> 11
<211> 1663
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
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Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn
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Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp
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Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly
50 55 60
Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr
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Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe
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Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe
100 105 110
Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly
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Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr
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Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly
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Arg Thr Val Met Val Asn Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys
165 170 175
Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser
180 185 190
Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala
195 200 205
Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val
210 215 220
Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu
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Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile
260 265 270
Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu
275 280 285
Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg
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Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val
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Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Met Val Gln Ala Glu Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro
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Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met
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Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala
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Tyr Arg Val Pro Val Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu
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Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser
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Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser
420 425 430
Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr
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Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu
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Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp
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Arg Ala His Glu Ala Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn
485 490 495
Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln
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Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val
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Gly Ser Leu Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val
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Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg
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Val Val Leu Val Ala Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys
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Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp
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Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser
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Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln
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Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser
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Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys
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Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys
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Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg
725 730 735
Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp
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Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro
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Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn
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Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr
785 790 795 800
Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys
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Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp
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Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg
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Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val
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Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg
865 870 875 880
Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val
885 890 895
Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val
900 905 910
Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser
915 920 925
Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val
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Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu
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Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser
965 970 975
Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu
980 985 990
Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser
995 1000 1005
Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile
1010 1015 1020
Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly
1025 1030 1035
Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr
1040 1045 1050
Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala
1055 1060 1065
Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val
1070 1075 1080
Lys Val Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln
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Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys
1100 1105 1110
Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu
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Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu
1130 1135 1140
Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys
1145 1150 1155
Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly
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Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr
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Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly Arg Leu Lys
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Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn
1205 1210 1215
Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr
1220 1225 1230
Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe
1235 1240 1245
Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala
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Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn
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Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr
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His Arg Ile His Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu
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Thr Lys Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly
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Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys
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Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr
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Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala
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Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro
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Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr
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Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr
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Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys
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Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile Gln
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Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser
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<210> 12
<211> 5231
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
actcctcccc atcctctccc tctgtccctc tgtccctctg accctgcact gtcccagcac 60
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gaccatggtg ctggaggccc acgacgcgca aggggatgtt ccagtcactg ttactgtcca 240
cgacttccca ggcaaaaaac tagtgctgtc cagtgagaag actgtgctga cccctgccac 300
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ccctggctcc acagttctct atcggatctt caccgtcaac cacaagctgc tacccgtggg 540
ccggacggtc atggtcaaca ttgagaaccc ggaaggcatc ccggtcaagc aggactcctt 600
gtcttctcag aaccagcttg gcgtcttgcc cttgtcttgg gacattccgg aactcgtcaa 660
catgggccag tggaagatcc gagcctacta tgaaaactca ccacagcagg tcttctccac 720
tgagtttgag gtgaaggagt acgtgctgcc cagtttcgag gtcatagtgg agcctacaga 780
gaaattctac tacatctata acgagaaggg cctggaggtc accatcaccg ccaggttcct 840
ctacgggaag aaagtggagg gaactgcctt tgtcatcttc gggatccagg atggcgaaca 900
gaggatttcc ctgcctgaat ccctcaagcg cattccgatt gaggatggct cgggggaggt 960
tgtgctgagc cggaaggtac tgctggacgg ggtgcagaac ccccgagcag aagacctggt 1020
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acccaagtac ttcaaaccag gaatgccctt tgacctcatg gtgttcgtga cgaaccctga 1200
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ccgcgcccac gaggccaaga tccgctacta cacctacctg atcatgaaca agggcaggct 1560
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ctacgtggtc aaggtcttct ctctggctgt caacctcatc gccatcgact cccaagtcct 3360
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gcaggtcaac agcctgccag gcagcatcac taaagcagga gacttccttg aagccaacta 3600
catgaaccta cagagatcct acactgtggc cattgctggc tatgctctgg cccagatggg 3660
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ggaggaccct ggtaagcagc tctacaacgt ggaggccaca tcctatgccc tcttggccct 3780
actgcagcta aaagactttg actttgtgcc tcccgtcgtg cgttggctca atgaacagag 3840
atactacggt ggtggctatg gctctaccca ggccaccttc atggtgttcc aagccttggc 3900
tcaataccaa aaggacgccc ctgaccacca ggaactgaac cttgatgtgt ccctccaact 3960
gcccagccgc agctccaaga tcacccaccg tatccactgg gaatctgcca gcctcctgcg 4020
atcagaagag accaaggaaa atgagggttt cacagtcaca gctgaaggaa aaggccaagg 4080
caccttgtcg gtggtgacaa tgtaccatgc taaggccaaa gatcaactca cctgtaataa 4140
attcgacctc aaggtcacca taaaaccagc accggaaaca gaaaagaggc ctcaggatgc 4200
caagaacact atgatccttg agatctgtac caggtaccgg ggagaccagg atgccactat 4260
gtctatattg gacatatcca tgatgactgg ctttgctcca gacacagatg acctgaagca 4320
gctggccaat ggtgttgaca gatacatctc caagtatgag ctggacaaag ccttctccga 4380
taggaacacc ctcatcatct acctggacaa ggtctcacac tctgaggatg actgtctagc 4440
tttcaaagtt caccaatact ttaatgtaga gcttatccag cctggagcag tcaaggtcta 4500
cgcctattac aacctggagg aaagctgtac ccggttctac catccggaaa aggaggatgg 4560
aaagctgaac aagctctgcc gtgatgaact gtgccgctgt gctgaggaga attgcttcat 4620
acaaaagtcg gatgacaagg tcaccctgga agaacggctg gacaaggcct gtgagccagg 4680
agtggactat gtgtacaaga cccgactggt caaggttcag ctgtccaatg actttgacga 4740
gtacatcatg gccattgagc agaccatcaa gtcaggctcg gatgaggtgc aggttggaca 4800
gcagcgcacg ttcatcagcc ccatcaagtg cagagaagcc ctgaagctgg aggagaagaa 4860
acactacctc atgtggggtc tctcctccga tttctgggga gagaagccca acctcagcta 4920
catcatcggg aaggacactt gggtggagca ctggcccgag gaggacgaat gccaagacga 4980
agagaaccag aaacaatgcc aggacctcgg cgccttcacc gagagcatgg ttgtctttgg 5040
gtgccccaac tgaccacacc cccattcccc cactccagat aaagcttcag ttatatctca 5100
cgtgtctgga gttctttgcc aagagggaga ggctgaaatc cccagccgcc tcacctgcag 5160
ctcagctcca tcctacttga aacctcacct gttcccaccg cattttctcc tggcgttcgc 5220
ctgctagtgt g 5231
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
atcaactcac ctgtaataaa 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
agaaattcta ctacatcta 19
<210> 15
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
aggaaugaga aucaacaaaa agcagccgaa aggcugc 37
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
uuuuguugau ucucauuccu g 21
<210> 17
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
cagcuaaaag acuuugacua gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
uagucaaagu cuuuuagcug gg 22
<210> 19
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
gcuaaaagac uuugacuuua gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
uaaagucaaa gucuuuuagc gg 22
<210> 21
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
cucaaugaac agagauacua gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
uaguaucucu guucauugag gg 22
<210> 23
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
ucaacucacc uguaauaaaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
uuuuauuaca ggugaguuga gg 22
<210> 25
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
ugaggagaau ugcuucauaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
uuaugaagca auucuccuca gg 22
<210> 27
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
ggagaauugc uucauacaaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
uuuguaugaa gcaauucucc gg 22
<210> 29
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
agauaaagcu ucaguuauaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
uuauaacuga agcuuuaucu gg 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
aggaatgaga atcaacaaaa 20
<210> 32
<211> 5139
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 32
agagaggaga gccatataaa gagccagcgg ctacagcccc agctcgcctc tgcccacccc 60
tgccccttac cccttcattc cttccacctt tttccttcac tatgggacca gcttcagggt 120
cccagctact agtgctactg ctgctgttgg ccagctcccc attagctctg gggatcccca 180
tgtattccat cattactccc aatgtcctac ggctggagag cgaagagacc atcgtactgg 240
aggcccacga tgctcagggt gacatcccag tcacagtcac tgtgcaagac ttcctaaaga 300
ggcaagtgct gaccagtgag aagacagtgt tgacaggagc cagtggacat ctgagaagcg 360
tctccatcaa gattccagcc agtaaggaat tcaactcaga taaggagggg cacaagtacg 420
tgacagtggt ggcaaacttc ggggaaacgg tggtggagaa agcagtgatg gtaagcttcc 480
agagtgggta cctcttcatc cagacagaca agaccatcta cacccctggc tccactgtct 540
tatatcggat cttcactgtg gacaacaacc tactgcccgt gggcaagaca gtcgtcatcc 600
tcattgagac ccccgatggc attcctgtca agagagacat tctgtcttcc aacaaccaac 660
acggcatctt gcctttgtct tggaacattc ctgaactggt caacatgggg cagtggaaga 720
tccgagcctt ttacgaacat gcgccgaagc agatcttctc cgcagagttt gaggtgaagg 780
aatacgtgct gcccagtttt gaggtccggg tggagcccac agagacattt tattacatcg 840
atgacccaaa tggcctggaa gtttccatca tagccaagtt cctgtacggg aaaaacgtgg 900
acgggacagc cttcgtgatt tttggggtcc aggatggcga taagaagatt tctctggccc 960
actccctcac gcgcgtagtg attgaggatg gtgtggggga tgcagtgctg acccggaagg 1020
tgctgatgga gggggtacgg ccttccaacg ccgacgccct ggtggggaag tccctgtatg 1080
tctccgtcac tgtcatcctg cactcaggta gtgacatggt agaggcagag cgcagtggga 1140
tcccgattgt cacttccccg taccagatcc acttcaccaa gacacccaaa ttcttcaagc 1200
cagccatgcc ctttgacctc atggtgttcg tgaccaaccc cgatggctct ccggccagca 1260
aagtgctggt ggtcactcag ggatctaatg caaaggctct cacccaagat gatggcgtgg 1320
ccaagctaag catcaacaca cccaacagcc gccaacccct gaccatcaca gtccgcacca 1380
agaaggacac tctcccagaa tcacggcagg ccaccaagac aatggaggcc catccctaca 1440
gcactatgca caactccaac aactacctac acttgtcagt gtcacgaatg gagctcaagc 1500
cgggggacaa cctcaatgtc aacttccacc tgcgcacaga cccaggccat gaggccaaga 1560
tccgatacta cacctacctg gttatgaaca aggggaagct cctgaaggca ggccgccagg 1620
ttcgggagcc tggccaggac ctggtggtct tgtccctgcc catcactcca gagtttattc 1680
cttcatttcg cctggtggct tactacaccc tgattggagc tagtggccag agggaggtgg 1740
tggctgactc tgtgtgggtg gatgtgaagg attcctgtat tggcacgctg gtggtgaagg 1800
gtgacccaag agataaccat ctcgcacctg ggcaacaaac gacactcagg attgaaggaa 1860
accagggggc ccgagtgggg ctagtggctg tggacaaggg agtgtttgtg ctgaacaaga 1920
agaacaaact cacacagagc aagatctggg atgtggtaga gaaggcagac attggctgca 1980
ccccaggcag tgggaagaac tatgctggtg tcttcatgga tgcaggcctg gccttcaaga 2040
caagccaagg actgcagact gaacagagag cagatcttga gtgcaccaag ccagcagccc 2100
gccgccgtcg ctcagtacag ttgatggaaa gaaggatgga caaagctggt cagtacactg 2160
acaagggtct tcggaagtgt tgtgaggatg gtatgcggga tatccctatg agatacagct 2220
gccagcgccg ggcacgcctc atcacccagg gcgagaactg cataaaggcc ttcatagact 2280
gctgcaacca catcaccaag ctgcgtgaac aacacagaag agaccacgtg ctgggcctgg 2340
ccaggagtga attggaggaa gacataattc cagaagaaga tattatctct agaagccact 2400
tcccacagag ctggttgtgg accatagaag agttgaaaga accagagaaa aatggaatct 2460
ctacgaaggt catgaacatc tttctcaaag attccatcac cacctgggag attctggcag 2520
tgagcttgtc agacaagaaa gggatctgtg tggcagaccc ctatgagatc agagtgatgc 2580
aggacttctt cattgacctg cggctgccct actctgtagt gcgcaacgaa caggtggaga 2640
tcagagctgt gctcttcaac taccgtgaac aggaggaact taaggtgagg gtggaactgt 2700
tgcataatcc agccttctgc agcatggcca ccgccaagaa tcgctacttc cagaccatca 2760
aaatccctcc caagtcctcg gtggctgtac cgtatgtcat tgtccccttg aagatcggcc 2820
aacaagaggt ggaggtcaag gctgctgtct tcaatcactt catcagtgat ggtgtcaaga 2880
agacactgaa ggtcgtgcca gaaggaatga gaatcaacaa aactgtggcc atccatacac 2940
tggacccaga gaagctcggt caagggggag tgcagaaggt ggatgtgcct gccgcagacc 3000
ttagcgacca agtgccagac acagactctg agaccagaat tatcctgcaa gggagcccgg 3060
tggttcagat ggctgaagat gctgtggacg gggagcggct gaaacacctg atcgtgaccc 3120
ccgcaggctg tggggaacag aacatgattg gcatgacacc aacagtcatt gcggtacact 3180
acctggacca gaccgaacag tgggagaagt tcggcataga gaagaggcaa gaggccctgg 3240
agctcatcaa gaaagggtac acccagcagc tggccttcaa acagcccagc tctgcctatg 3300
ctgccttcaa caaccggccc cccagcacct ggctgacagc ctacgtggtc aaggtcttct 3360
ctctagctgc caacctcatc gccatcgact ctcacgtcct gtgtggggct gttaaatggt 3420
tgattctgga gaaacagaag ccggatggtg tctttcagga ggatgggccc gtgattcacc 3480
aagaaatgat tggtggcttc cggaacgcca aggaggcaga tgtgtcactc acagccttcg 3540
tcctcatcgc actgcaggaa gccagggaca tctgtgaggg gcaggtcaat agccttcctg 3600
ggagcatcaa caaggcaggg gagtatattg aagccagtta catgaacctg cagagaccat 3660
acacagtggc cattgctggg tatgccctgg ccctgatgaa caaactggag gaaccttacc 3720
tcggcaagtt tctgaacaca gccaaagatc ggaaccgctg ggaggagcct gaccagcagc 3780
tctacaacgt agaggccaca tcctacgccc tcctggccct gctgctgctg aaagactttg 3840
actctgtgcc ccctgtagtg cgctggctca atgagcaaag atactacgga ggcggctatg 3900
gctccaccca ggctaccttc atggtattcc aagccttggc ccaatatcaa acagatgtcc 3960
ctgaccataa ggacttgaac atggatgtgt ccttccacct ccccagccgt agctctgcaa 4020
ccacgtttcg cctgctctgg gaaaatggca acctcctgcg atcggaagag accaagcaaa 4080
atgaggcctt ctctctaaca gccaaaggaa aaggccgagg cacattgtcg gtggtggcag 4140
tgtatcatgc caaactcaaa agcaaagtca cctgcaagaa gtttgacctc agggtcagca 4200
taagaccagc ccctgagaca gccaagaagc ccgaggaagc caagaatacc atgttccttg 4260
aaatctgcac caagtacttg ggagatgtgg acgccactat gtccatcctg gacatctcca 4320
tgatgactgg ctttgctcca gacacaaagg acctggaact gctggcctct ggagtagata 4380
gatacatctc caagtacgag atgaacaaag ccttctccaa caagaacacc ctcatcatct 4440
acctagaaaa gatttcacac accgaagaag actgcctgac cttcaaagtt caccagtact 4500
ttaatgtggg acttatccag cccgggtcgg tcaaggtcta ctcctattac aacctcgagg 4560
aatcatgcac ccggttctat catccagaga aggacgatgg gatgctcagc aagctgtgcc 4620
acagtgaaat gtgccggtgt gctgaagaga actgcttcat gcaacagtca caggagaaga 4680
tcaacctgaa tgtccggcta gacaaggctt gtgagcccgg agtcgactat gtgtacaaga 4740
ccgagctaac caacatagag ctgttggatg attttgatga gtacaccatg accatccagc 4800
aggtcatcaa gtcaggctca gatgaggtgc aggcagggca gcaacgcaag ttcatcagcc 4860
acatcaagtg cagaaacgcc ctgaagctgc agaaagggaa gaagtacctc atgtggggcc 4920
tctcctctga cctctgggga gaaaagccca acaccagcta catcattggg aaggacacgt 4980
gggtggagca ctggcctgag gcagaagaat gccaggatca gaagtaccag aaacagtgcg 5040
aagaacttgg ggcattcaca gaatctatgg tggtttatgg ttgtcccaac tgactacagc 5100
ccagccctct aataaagctt cagttgtatt tcacccatc 5139
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
atcaactcac ctgtaataaa gcagccgaaa ggctgc 36
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
tttattacag gtgagttgat gg 22
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
agaaattcta ctacatctaa gcagccgaaa ggctgc 36
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
ttagatgtag tagaatttct gg 22
<210> 37
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基腺苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (4)..(5)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-氟胞苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 2'-氟胞苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(20)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (25)..(26)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(30)
<223> 2'氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(32)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (33)..(33)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (34)..(34)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (35)..(35)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (36)..(36)
<223> cm
<400> 37
aucaacucac cuguaauaaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'甲氧基, 膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-氟尿苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-氟尿苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-氟鸟苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (16)..(17)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基鸟苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> gm
<400> 38
uuuauuacag gugaguugau gg 22
<210> 39
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基胞苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基鸟苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> gm
<400> 52
uuuguaugaa gcaauucucc gg 22
<210> 53
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基腺苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (5)..(7)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-氟鸟苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-氟胞苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 2'-氟尿苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(20)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (25)..(26)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (28)..(30)
<223> 2'氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (31)..(32)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (33)..(33)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (34)..(34)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (35)..(35)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (36)..(36)
<223> cm
<400> 53
agauaaagcu ucaguuauaa gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 54
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'甲氧基,膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟尿苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-氟胞苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-氟腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟尿苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> um
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基鸟苷硫代磷酸酯
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> gm
<400> 54
uuauaacuga agcuuuaucu gg 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
aatgaggcct tctctctaac a 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
acttcttgca ggtgactttg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
caaactttgc tttccctggt 20
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
caacaaagtc tggcctgtat c 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
ccaaactcag catcaacaca c 21
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
ctgcatggtc ctggtagc 18
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
gccaaagatc aactcacctg ta 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
agacatagtg gcatcctggt 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
aatgaactgc aggacgagg 19
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
aggtgagatg acaggagatc c 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
ctttccttgg tcaggcagta t 21
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
caacacttcg tggagtcctt 20
<210> 67
<211> 5126
<212> DNA
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 67
aaagccaact ccagcagtca ctgctcactc ctccccatcc tctccctctg tccctctgtc 60
cctctgaccc tgcactgtcc cagcaccatg ggactcacct caggtcccag cctgctgctc 120
ctgctactaa tccacctccc cctggctctg gggactccca tgtactctat gatcacccca 180
aacgtcttgc ggctggagag tgaggagacc gtggtgctgg aggcccatga cgcgaatggg 240
gatgttccgg tcactgtcac tgtccacgac ttcccaggca aaaaactggt gctgtccagt 300
gagaagaccg tgctgacccc tgccaccagc cacatgggca gcgtcaccat caggatccca 360
gccaacaagg agttcaagtc agaaaagggg cacaacaagt tcgtgactgt gcaggccacc 420
ttcggggccc aagtggtgga gaaggtggta ctggtcagcc ttcagagcgg gtacctcttc 480
atccagacag acaagaccat ctacacccct ggctccacag ttctctgtcg gatcttcacc 540
gtcaaccaca agctgctacc cgtgggccgg acggtcgtgg tcaacattga gaacccggac 600
ggcatcccgg tcaagcagga ctccttgtct tctcagaacc aatttggcat cttgcccttg 660
tcttgggaca ttccggaact cgtcaacatg ggccagtgga agatccgagc ctactatgaa 720
aattcgccgc aacaggtctt ctccactgag tttgaggtga aggagtacgt gctgcccagt 780
ttcgaggtca tagtggagcc tacagagaaa ttctactaca tctataacca gaagggcctg 840
gaggtcacca tcaccgccag gttcctctat ggaaagaaag tggagggaac tgcctttgtc 900
atcttcggga tccaggatgg cgagcagagg atttccctgc ctgaatccct caagcgcatc 960
cagattgagg atggctcagg agacgccgtg ctgagccgga aggtactgct ggacggggtg 1020
cagaatcccc gaccggaaga cctagtgggg aagtccttgt atgtgtctgt caccgttatc 1080
ctgcactcag gcagtgacat ggtgcaggcg gagcgcagcg ggatccccat cgtgacctct 1140
ccctaccaga tccacttcac caagacgccc aagtacttca aaccaggaat gccctttgac 1200
ctcatggtgt tcgtgacgaa ccccgatggc tctccagcct accgagtccc cgtggcagtc 1260
cagggcgagg acgctgtgca gtctctaacc cagggagacg gcgtggccaa actcagcatc 1320
aacacacacc ccagccagaa gcccttgagc atcacggtgc gcacgaagaa gcgggagctc 1380
tcggaggcgg agcaggctac caggaccatg gaggctcagc cctacagcac cgtgggcaac 1440
tccaacaatt acctgcatct ctcagtgcca cgtgcagagc tcagacctgg ggagaccctc 1500
aacgtcaact tcctcctgcg aatggaccgc acccaggagg ccaagatccg ctactacacc 1560
tacctgatta tgaacaaagg caagctgttg aaggtgggac gccaggtgcg agagcctggc 1620
caggacctgg tggtgctgcc cctgtccatc accaccgact tcatcccttc cttccgcctg 1680
gtggcctact acacgctgat cggcgccaac ggccagaggg aagtggtggc cgactccgtg 1740
tgggtggacg tcaaggactc ttgcgtgggc tcgctggtgg taaaaagcgg ccagtcagaa 1800
gacaggcagc ctttacccgg gcagcagatg accctgaaga tagagggtga ccacggggcc 1860
cgggtgggac tggtggctgt ggacaagggc gtgtttgtgc tgaataagaa gaacaagctg 1920
acgcagagta agatctggga cgtggtggag aaggcagaca tcggctgcac cccaggcagt 1980
gggaaggatt acgctggtgt cttctcggat gcaggcctga cctttgcgag cagcagtggc 2040
cagcagacgg cccagagggc agaacttcag tgcccacagc cagccgcccg ccgacgccgt 2100
tccgtgcagc tcgcggagaa gagaatggac aaagttggtc agtaccccaa ggagctgcgc 2160
aagtgctgcg agcacggtat gcgggagaac cccatgaggt tctcatgcca gcgccggacc 2220
cgttacatca ccctggacga ggcgtgcaag aaggccttcc tggactgctg caactacatc 2280
accgagctgc ggcggcagca cgcgcgggcc agtcacctgg gcctggccag gagtaacctg 2340
gatgaggaca tcatcgcaga agagaacatc gtttcccgaa gtgagttccc agagagttgg 2400
ctgtggaaga ttgaagagtt gaaagaggca ccgaaaaacg gaatctccac gaagctcatg 2460
aatatatttt tgaaagactc catcaccacg tgggagattc tggccgtgag cttgtcagac 2520
aagaaaggga tctgtgtggc agaccccttc gaggtcacag taatgcagga cttcttcatc 2580
gacctgcggc taccctactc tgttgttcga aacgagcagg tggaaatccg agctgttctc 2640
tacaattacc ggcagaacca agagctcaag gtgagggtgg aactactcca caatccagcc 2700
ttctgcagcc tggccaccgc caagaggcgt caccagcaga ccgtaaccat cccccccaag 2760
tcctcgctgt ccgttcctta tgtcatcgtg cccctaaaga ccggccagca ggaagtggaa 2820
gtcaaggctg ccgtctacca ttttttcatc agtgacggtg tcaggaagtc cctgaaggtc 2880
gtgccggaag gaatcagaat gaacaaaact gtggctgttc gcacgctgga tccagaacgc 2940
ctgggccagg aaggagtgca gagagaggac gtcccacctg cagacctcag tgaccaagtc 3000
ccggacaccg agtctgagac cagaattctc ctgcaaggga ccccggtggc ccagatgaca 3060
gaggatgcca tcgatgcgga acggctgaag cacctcatcg tgaccccctc gggctgcgga 3120
gaacagaaca tgatcaccat gacgcccaca gtcatcgctg tgcattacct ggatgaaacg 3180
gaacagtggg agaagttcgg cccggagaag cggcaggggg ccttggagct catcaagaag 3240
gggtacaccc agcagctggc cttcagacaa cccagctctg cctttgcggc cttcctgaac 3300
cgggcaccca gcacctggct gaccgcctac gtggtcaagg tcttctctct ggctgtcaac 3360
ctcattgcca tcgactccca ggtcctctgc ggggctgtta aatggctgat cctggagaag 3420
cagaagcccg acggggtctt ccaggaggat gcgcccgtga tacatcaaga aatgactggt 3480
ggattccgga acaccaacga gaaagacatg gccctcacgg cctttgttct catctcgctg 3540
caagaggcta aagagatttg cgaggagcag gtcaacagcc tgcccggcag catcactaaa 3600
gcaggagact tccttgaagc caactacatg aacctacaga gatcctacac tgtggccatc 3660
gctgcctatg ccctggccca gatgggcagg ctgaagggac ctcttctcaa caaatttctg 3720
accacagcca aagataagaa ccgctgggag gagcctggtc agcagctcta caatgtggag 3780
gccacatcct atgccctctt ggccctactg cagctaaaag actttgactt tgtgcctccc 3840
gtcgtgcgtt ggctcaatga acagagatac tacggtggtg gctatggctc tacccaggcc 3900
accttcatgg tgttccaagc cttggctcaa taccaaaagg atgtccctga tcacaaggaa 3960
ctgaacctgg atgtgtccct ccaactgccc agtcgcagct ccaagatcat ccaccgtatc 4020
cactgggaat ctgccagcct cctgcgatca gaagagacca aggaaaatga gggtttcaca 4080
gtcacagctg aaggaaaagg ccaaggcacc ttgtcggtag tgacaatgta ccatgctaag 4140
gccaaaggtc aactcacctg taataaattc gacctcaagg tcaccataaa accagcaccg 4200
gaaacagaaa agaggcctca ggatgccaag aacactatga tccttgagat ctgtaccagg 4260
taccggggag accaggatgc cactatgtct atactggaca tatccatgat gactggcttc 4320
gttccagaca cagatgacct caagcagctg gcaaacggcg ttgacagata catctccaag 4380
tatgagctgg acaaagcctt ctccgatagg aacaccctca tcatctacct ggacaaggtc 4440
tcacactctg aggatgactg tatagctttc aaagttcacc aatattttaa tgtagagctt 4500
atccagcctg gtgcagtcaa ggtctacgcc tattacaacc tggcggaaag ctgtacccgg 4560
ttctaccacc cagaaaagga ggatggaaag ctgaacaagc tctgtcgtga tgagctgtgc 4620
cgctgtgctg aggagaattg cttcatacaa aagttggatg acaaagtcac cctggaagaa 4680
cggctggaca aggcctgtga gccaggagtg gactatgtgt acaagacccg actggtcaag 4740
gcccagctgt ccaatgactt tgacgagtac atcatggcca ttgagcagat catcaagtca 4800
ggctcggatg aggtgcaggt tggacaacag cgcacgttca tcagccccat caagtgcagg 4860
gaagccctga agctggagga gaggaaacac tacctcatgt ggggtctctc ctccgatttc 4920
tggggagaga aacccaatct cagctacatc atcgggaagg acacctgggt ggagcactgg 4980
cccgaggagg acgaatgcca agatgaagag aaccagaaac aatgccagga cctcggcacc 5040
ttcactgaga acatggttgt ctttgggtgc cccaactgac cacaccccca ttcccccact 5100
cccaataaag cttcagttat atttca 5126

Claims (93)

1.一种用于降低补体组分C3(C3)表达的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，该寡核苷酸包含有义链和反义链，其中该有义链和该反义链形成双链体区域，其中该反义链包含与SEQ ID NO:13或14的C3 mRNA靶序列的互补区域，并且其中该互补区域的长度为至少15个连续核苷酸。
2.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的长度为15至50个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的长度为18至36个核苷酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链的长度为15至30个核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链的长度为22个核苷酸，并且其中该反义链和该有义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为至少20个核苷酸的双链体区域。
6.如权利要求1-5中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的长度为36个核苷酸，并且其中该反义链和该有义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为至少20个核苷酸的双链体区域。
7.如权利要求1-6中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该互补区域的长度为至少19个连续核苷酸，任选地长度为至少20个核苷酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的3'端包含如S1-L-S2所示的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。
9.如权利要求8所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中L是三环或四环。
10.如权利要求9所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中L是四环。
11.如权利要求10所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该四环包含SEQID NO:8的核酸序列。
12.如权利要求8-11中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该S1和S2的长度为1-10个核苷酸，其中任选地，S1和S2具有相同的长度。
13.如权利要求12所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中S1和S2的长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。
14.如权利要求13所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中S1和S2的长度为6个核苷酸。
15.如权利要求8-14中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的核酸序列。
16.如权利要求15所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该茎环区域包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸序列。
17.如权利要求16所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该茎环区域包含SEQ ID NO:7。
18.如权利要求8-16中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该茎环包含相对于SEQ ID NO:7具有至多1、2或3个取代、插入或缺失的核酸。
19.如权利要求1-17中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链包含长度为一个或多个核苷酸的3'突出端序列。
20.如权利要求19所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链包含至少2个连接的核苷酸的3'突出端。
21.如权利要求20所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该3'突出端序列的长度为2个核苷酸，其中任选地该3'突出端序列为GG。
22.如权利要求1-21中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
23.如权利要求22所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸包含20至50个经修饰的核苷酸。
24.如权利要求22或23所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸的所有核苷酸都被修饰。
25.如权利要求22-24中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该经修饰的核苷酸包含2'-修饰。
26.如权利要求25所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该2'-修饰是选自2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸的修饰。
27.如权利要求26所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该2'-修饰是2'-氟或2'-O-甲基，其中任选地该2'-氟修饰是2'-氟脱氧核糖核苷和/或该2'-O-甲基修饰是2'-O-甲基核糖核苷。
28.如权利要求27所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该RNAi寡核苷酸包含40至50个2'-O-甲基修饰，其中任选地该RNAi寡核苷酸包含40至50个2'-O-甲基核糖核苷。
29.如权利要求28所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸1-7、11-27和31-36中的至少一个核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基诸如2'-O-甲基核糖核苷修饰。
30.如权利要求29所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸1-7、11-27和31-36中的10至30个核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基诸如2'-O-甲基核糖核苷修饰。
31.如权利要求29所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸1-7、12-27和31-36中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基诸如2'-O-甲基核糖核苷修饰。
32.如权利要求29所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸1、2、4-7、11、14-16、18-27和31-36中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸1、6、9、11、13、15、17、18和20-22中的一个或多个或所有核苷酸用2'-O-甲基诸如2'-O-甲基核糖核苷修饰。
33.如权利要求28-32中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸包含5至15个2'-氟修饰，诸如用2'-氟脱氧核糖核苷修饰。
34.如权利要求28所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸3、8、9、10、11、12、13和17中的至少一个核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟诸如2'-氟脱氧核糖核苷修饰。
35.如权利要求34所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸3、8、9、10、11、12、13和17中的2至4个核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟诸如2'-氟脱氧核糖核苷修饰。
36.如权利要求34所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸8、9、10和11中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟诸如2'-氟脱氧核糖核苷修饰。
37.如权利要求34所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链的核苷酸3、8-10、12、13和17中的所有核苷酸以及该反义链的核苷酸2-5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个或所有核苷酸用2'-氟诸如2'-氟脱氧核糖核苷修饰。
38.如权利要求1-37中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。
39.如权利要求38所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该至少一个经修饰的核苷酸间键合为硫代磷酸酯键合。
40.如权利要求39所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该RNAi寡核苷酸在该有义链的核苷酸1与2之间以及该反义链的核苷酸1与2之间、2与3之间、20与21之间和21与22之间具有硫代磷酸酯键合。
41.如权利要求1-40中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链与该反义链之间不存在核苷酸间键合。
42.如权利要求1-41中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
43.如权利要求1-41中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该RNAi寡核苷酸在该反义链的5'端的第一位置处包含尿苷。
44.如权利要求43所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该尿苷包含磷酸酯类似物。
45.如权利要求42-44中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该磷酸酯类似物为4'-O-单甲基膦酸酯。
46.如权利要求44所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中包含该磷酸酯类似物的该尿苷包括以下结构：
47.如权利要求1-46中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体缀合。
48.如权利要求47所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
49.如权利要求47或48所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
50.如权利要求49所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该GalNAc部分为一价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
51.如权利要求8-50中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该RNAi寡核苷酸包含与该有义链缀合的一至五个2'-O-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
52.如权利要求51所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该茎环的L的至多4个核苷酸与一价GalNAc部分缀合。
53.如权利要求52所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在该有义链上的核苷酸位置28-30处的这些核苷酸中的一个或多个与一价GalNAc部分缀合。
54.如权利要求53所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在该有义链上的位置28-30处的这些核苷酸中的每一个与一价GalNAc部分缀合。
55.如权利要求54所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在该有义链上的位置28-30处的这些核苷酸包括以下结构：
其中：
Z表示键、点击化学手柄或长度为1至20个且包括端值的连续共价键合原子的接头，其选自由以下各项组成的组：取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基以及它们的组合；并且
X为O、S或N。
56.如权利要求55所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中Z为缩醛接头。
57.如权利要求55或56中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中X为O。
58.如权利要求54所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中在该有义链上的位置28-30处的这些核苷酸包括以下结构：
59.如权利要求1-58中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，该有义链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
60.如权利要求1-59中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该反义链包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
61.如权利要求1-60中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链和反义链包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1和3，以及
(b)分别为SEQ ID NO:4和6。
62.如权利要求1-60中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链包含如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含如SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。
63.如权利要求1-60中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链包含如SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含如SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列。
64.如权利要求1-61中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链包含如SEQ ID NO:37中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含如SEQ ID NO:38中所示的核苷酸序列。
65.如权利要求1-61中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中该有义链包含如SEQ ID NO:39中所示的核苷酸序列，并且该反义链包含如SEQ ID NO:40中所示的核苷酸序列。
66.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
67.一种治疗由补体途径激活或失调介导的疾病的方法，该方法包括使受试者的细胞与如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或如权利要求66所述的药物组合物或其药学上可接受的盐接触。
68.如权利要求67所述的方法，其中使该细胞接触足以获得C3的mRNA转录物的降解的时间。
69.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中该细胞中C3的表达降低。
70.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中该细胞中C3的转录减少。
71.如权利要求67所述的方法，其中该细胞中C3的水平和/或活性降低。
72.如权利要求67所述的方法，其中C3的水平和/或活性相对于未施用如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或如权利要求66所述的药物组合物的受试者的细胞中C3的水平和/或活性降低10％至100％。
73.如权利要求72所述的方法，其中C3的水平和/或活性相对于未施用如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物的受试者的细胞中C3的水平和/或活性降低50％至99％。
74.如权利要求67-73中任一项所述的方法，其中该受试者是哺乳动物。
75.如权利要求74所述的方法，其中该受试者是人。
76.如权利要求67-75中任一项所述的方法，其中该受试者被鉴定为患有由补体途径激活或失调介导的疾病、病症或病状。
77.如权利要求67-76中任一项所述的方法，其中由补体途径激活或失调介导的该疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。
78.如权利要求67-77中任一项所述的方法，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或该药物组合物被配制用于每日、每周、每月或每年施用。
79.如权利要求67-78中任一项所述的方法，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或该药物组合物被配制用于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻腔、舌下、鞘内和皮内施用。
80.如权利要求79所述的方法，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或该药物组合物被配制用于皮下施用。
81.如权利要求67-80中任一项所述的方法，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或该药物组合物被配制用于以约0.1mg/kg至约150mg/kg的剂量施用。
82.一种用于降低细胞、细胞群或受试者中的C3表达的方法，该方法包括以下步骤：
i)使该细胞或该细胞群与如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物接触；或者
ii)向该受试者施用如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物。
83.如权利要求82所述的方法，其中降低C3表达包括降低C3 mRNA的量或水平、C3蛋白的量或水平或两者。
84.如权利要求83所述的方法，其中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者相对于未施用如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物的受试者的细胞中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者降低10％至100％。
85.如权利要求83或84所述的方法，其中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者相对于未施用如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物的受试者的细胞中C3 mRNA的水平、C3蛋白的水平或两者降低50％至99％。
86.如权利要求82-85中任一项所述的方法，其中该受试者患有由补体途径激活或失调介导的疾病、病症或病状。
87.如权利要求86所述的方法，其中由补体途径激活或失调介导的该疾病、病症或病状选自由以下各项组成的组：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)，诸如慢性AMR(cAMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。
88.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1-66中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或如权利要求66所述的药物组合物。
89.如权利要求1-65中任一项所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或如权利要求66所述的药物组合物，用于在预防或治疗有需要的受试者的由补体途径激活或失调介导的疾病、病症或病状中使用。
90.如权利要求89所述的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或药物组合物，用于在预防或治疗有需要的受试者的以下疾病中使用：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、IgA肾病、狼疮肾炎、C3肾小球病(C3G)、皮肌炎/自身免疫性肌炎、系统性硬化症、脱髓鞘性多发性神经病变、天疱疮、膜性肾病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、黏膜类天疱疮、ANCA血管炎、低补体血症性荨麻疹血管炎、免疫复合物性小血管炎、皮肤小血管炎、自身免疫性坏死性肌病、移植器官的排斥，诸如肾、肝、心脏或肺移植排斥，包括抗体介导的排斥(AMR)、抗磷脂(aPL)Ab综合征、肾小球肾炎、哮喘、致密物沉积病(DDD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、严重难治性RA、费尔蒂综合征、多发性硬化症(MS)、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤、缺血再灌注损伤、先兆子痫、急性肾损伤中的移植物功能延迟恢复(DGF-AKI)、心肺转流相关性急性肾损伤、缺氧缺血性脑病、透析诱导的血栓形成、大动脉炎、复发性多软骨炎、急性/预防性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、β地中海贫血、干细胞移植相关性血栓性微血管病、胆道闭锁、炎症性肝病、白塞氏病、缺血性中风、脑出血、硬皮病、硬皮病肾危象、硬皮病相关间质性肺病(SSc-ILD)、镰状细胞病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、化疗诱导的外周神经病变(CIPN)、糖尿病神经病变、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、地图样萎缩、肺动脉高压、难治性严重哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化(IPF)、慢性肺同种异体移植功能障碍、囊性纤维化中的肺病、化脓性汗腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、强直性脊柱炎、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)(预防)、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、骨质疏松症(预防)、骨关节炎、高风险玻璃膜疣、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、透析诱导的补体激活、坏疽性脓皮病、慢性心力衰竭、自身免疫性心肌炎、鼻息肉病、急性和慢性胰腺炎、动脉粥样硬化、嗜酸性食管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞增多综合征、伤口愈合和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。
91.如权利要求89或90所述使用的RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或药物组合物，其中该RNAi寡核苷酸或其药学上可接受的盐或药物组合物经皮下施用。
92.如权利要求1-66中任一项所述的RNA寡核苷酸，其中该RNA寡核苷酸包含药学上可接受的盐。
93.如权利要求92所述的RNA寡核苷酸，其中该药学上可接受的盐是钠盐。
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