JP2023504661A

JP2023504661A - 疾患の処置のための標的化トランスファーｒｎａ

Info

Publication number: JP2023504661A
Application number: JP2022533139A
Authority: JP
Inventors: ハス，デイビッド; スタイン，リアーナ; サリバン，リチャード; ラクシュマナン，アヌパマ; バーレイ，スティーブン
Original assignee: Shape Therapeutics Inc
Current assignee: Shape Therapeutics Inc
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2020-12-01
Publication date: 2023-02-06
Also published as: CN115397983A; WO2021113218A1; EP4069841A1; CA3163514A1; AU2020396868A1

Abstract

疾患を引き起こす未成熟停止コドンを認識するおよびリードスルーする、操作されたｔＲＭＡ分子および操作されたサプレッサーｔＲＮＡ分子をコードするベクターが提供される。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターの医薬製剤は、タンパク質をコードする核酸配列中に存在する未成熟停止コドンによって引き起こされるタンパク質のトランケーションに関連する疾患の処置における使用のために提供される。

Description

相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に取り込まれる、２０１９年１２月２日に出願された米国仮出願第６２／９４２６９０号、２０１９年１２月２日に出願された第６２／９４２６６７号、２０２０年４月１６日に出願された第６３／０１０８５６号、および２０２０年１１月１０日に出願された第６３／１１１８５６号の優先権を主張する。

配列表の参照による取り込み
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、サイズ８６，５０１バイトである、２０２０年１１月３０日作成された、ファイル名５４７６１－７０９＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔとして提供される。配列表の電子形式における情報は、その全体が参照により取り込まれる。

一部の実施形態では、配列番号３～２２または１０３～１２２のいずれか１つの核酸配列と比べて、Ｔループ、Ｔステム、Ｄループ、Ｄステム、可変ループ、アンチコドンステム、またはアンチコドンループに突然変異を含む操作されたｔＲＮＡ変異体を含む組成物が本明細書に開示され、対象への投与の際、操作されたｔＲＮＡ変異体は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含む、トランスフェクトすること；第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない、トランスフェクトすること；ならびに第１のヒト細胞および第２のヒト細胞から放出された蛍光の量を比較することによって適宜決定した場合、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、実質的に全長のポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンの抑制によって、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも１０％の産生を回復させることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３～４８または１２３～１４８のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６と少なくとも７０％同一である配列を含むことができ、配列番号６または１０６の２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９、または７１位に置換を有し得る。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、４位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６位での置換は、Ａへの置換であり得るか、１２位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、２３位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２７位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４０位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、４２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４３位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４４位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４６位での置換は、Ａへの置換であり得るか、４９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、５０位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６４位での置換は、Ａへの置換であり得るか、６５位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ａへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、または７１位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換を除いて、配列番号６または１０６と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号６または１０６に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）で安定性の増加を示し得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４５または１４５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含むことができ、配列番号３または１０３の２、６、１３、１５、２２、２８、３１、３７、３９、４２、４４、５０、６４、６７、７１、または７２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、６位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、１３位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、１５位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３１位での置換は、Ａへの置換であり得るか、３７位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、３９位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、４２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４４位での置換は、Ａへの置換であり得るか、５０位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６４位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、または７２位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換を除いて、配列番号３または１０３と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸荷電効率測定、またはシンテターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定される、配列番号３または１０３において提供される配列を含む比較可能なｔＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を示し得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３２または１３２の配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号５または１０５と少なくとも７０％同一である配列を含むことができ、配列番号５または１０５の７３位に置換を有し得る。一部の実施形態では、７３位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換を除いて、配列番号５または１０５と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、代理測定、半減期測定、アミノ酸荷電効率測定、または合成酵素もしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定される、配列番号５または１０５において提供される配列を含む比較可能なｔＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を示し得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、またはセレノシステインを含むアミノ酸でアシル化することができるか、または非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オパール停止コドン、オーカー停止コドン、またはアンバー停止コドンであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチド、ＦｏｘＧ１ポリペプチド、ＣＤＫＬ５ポリペプチド、ＭＹＨ９ポリペプチド、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチド、またはＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも２０％の産生を回復させることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも４０％の産生を回復させることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも６０％の産生を回復させる能力がある。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも８０％の産生を回復させる能力がある。一部の実施形態では、組成物は、操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター中であり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５由来のキャプシドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異した末端分離部位を有し、末端ヌクレオチドが欠如している逆位末端反復を含み得る。一部の実施形態では、末端ヌクレオチドは、Ａ領域の少なくとも一部、Ｄ領域の少なくとも一部、または両方を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、自己相補的であることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じ操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーをコードすることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なる操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーをコードすることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含むスタッファー配列を含むことができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の１つまたは複数のコピーの３’または５’であり得る。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上のコピーを分離することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドのアミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６、４５３、８（例えば、アイソフォーム２中）、９（例えば、アイソフォーム１中）、８４、８５、８９、９１、１０６、１１１、１１５、１３３、１６２、１６７、１８８、１９０、２１１、２５０、２５３、２６８、３０６、３０９、３４４、３５４、４２０、４５８、４６８、４７１、４７８、または４８４位にＲをコードする突然変異から生じ得る。一部の実施形態では、組成物および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、用量単位形態を含むことができる。一部の実施形態では、組成物または医薬組成物、およびパッケージングまたは容器を含むキットが、本明細書に開示される。一部の実施形態では、組成物または医薬組成物をパッケージングまたは容器と接触させることを含む、キットを製造する方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、それを必要とする対象に組成物を投与することを含む、疾患または障害の処置または予防方法が、本明細書に開示される。

一部の実施形態では、対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを投与すること；および未成熟停止コドンが欠如するｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生することを含む、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、実質的に全長のポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンを通じてリーディングすることができる、それを必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドもしくはその変異体を投与し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部処置することを含む、それを必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法が、本明細書に開示され、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、標的ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；第２のマーカーをコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まなくてもよい；および第１のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量と第２のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量を比較することによって決定されてもよい、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号００３～４８または１０３～１４８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３～４８または１０３～１４８のいずれか１つを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３、６、７、３２、４５、１０３、１０６、１０７、１３２、または１４５のいずれか１つを含むことができる。一部の実施形態では、対象に操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を投与することは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスを投与することを含むことができる。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはレンチウイルスを含むことができる。一部の実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９を含むことができる。一部の実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ５キャプシドを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、突然変異した末端分離部位を有し、末端ヌクレオチドが欠如している逆位末端反復を含み得る。一部の実施形態では、末端ヌクレオチドは、Ａ領域の少なくとも一部、Ｄ領域の少なくとも一部、または両方を含む。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、自己相補的である。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の追加の１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーをコードすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体とは異なる、第２の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーをコードすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含むスタッファー配列を含むことができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の１つまたは複数のコピーの３’または５’であることができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２つ以上のコピーを分離することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、デリバリーシステムにあることができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、または任意のその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物中にある。一部の実施形態では、医薬組成物は、用量単位形態であり得る。一部の実施形態では、対象は、標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンと関連する疾患または状態を有し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の効率で産生し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置することができる。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群、嚢胞性線維症、網膜色素変性症、または難聴を含み得る。一部の実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト動物であり得る。一部の実施形態では、投与は、経口、直腸、非経口、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、眼内、耳、脳室内、大槽内、脳室内、または腹腔内であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群であり得、レット症候群の少なくとも１つの症状が、軽減される。一部の実施形態では、レット症候群の少なくとも１つの症状は、成長遅滞、脳成長遅滞、小頭症、動作もしくは協調の減少もしくは喪失、手の制御の低減、歩行能力の減少、硬直性もしくは痙縮性の動作、話す能力の減少、視力の低下、無関心、反復的な手の動作、普通でない眼球運動、呼吸困難、易刺激性、恐怖、不安、認知障害、けいれん、異常な脳波、脊柱側弯、不整脈、または異常な睡眠パターンを含み得る。一部の実施形態では、１×１０１２～１×１０１５ウイルスゲノムを投与することができる。一部の実施形態では、対象は、およそ１０～３０歳であり得る。一部の実施形態では、組成物は、標的ｍＲＮＡのナンセンス媒介ｍＲＮＡデコイ（ＮＭＤ）を減少させるかまたは阻害することができる。一部の実施形態では、組成物は、ベースラインの標的ｍＲＮＡ測定値と比べて、対象における標的ｍＲＮＡの量を増加させることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドのアミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６、４５３、８（例えば、アイソフォーム２中）、９（例えば、アイソフォーム１中）、８４、８５、８９、９１、１０６、１１１、１１５、１３３、１６２、１６７、１８８、１９０、２１１、２５０、２５３、２６８、３０６、３０９、３４４、３５４、４２０、４５８、４６８、４７１、４７８、または４８４位にＲをコードする突然変異から生じ得る。

本開示の態様は、その対象における疾患または状態を処置する方法を提供することができる。方法は、対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを投与すること；および未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生することを含むことができ、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、実質的に全長のポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンを通じてリーディングすることができ得る。本開示の別の態様は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供することができる。方法は、対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを投与し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置することを含むことができ、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンを認識し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、（ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；（ｂ）第２のマーカーをコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まなくてよい；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量と第２のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、第１のヒト細胞または第２のヒト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり得る。一部の実施形態では、方法は、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の発現を回復させることをさらに含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約３５％の効率で、実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アルギニンでアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２に対応する。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入することができ、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドに対応する配列のアミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６、４５３、８（例えば、アイソフォーム２中）、９（例えば、アイソフォーム１中）、８４、８５、８９、９１、１０６、１１１、１１５、１３３、１６２、１６７、１８８、１９０、２１１、２５０、２５３、２６８、３０６、３０９、３４４、３５４、４２０、４５８、４６８、４７１、４７８、もしくは４８４位、またはそれらの任意の組合せに、ＲからＸを生じることができ、Ｘは、未成熟停止コドンであり得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、アンバー停止コドンであり得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オーカー停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡ前駆体であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を産生することができる。一部の実施形態では、対象はヒトであり得る。一部の実施形態では、対象は、非ヒト動物であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、およそ生誕時～約４０歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、約６月齢～約１５歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、胚または胎児であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、嚢胞性線維症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、網膜色素変性症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、難聴を含み得る。一部の実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することであり得る。一部の実施形態では、投与することは、非経口投与することであり得、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳に投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することであり得る。一部の実施形態では、投与は、大槽内（ＩＣＭ）であり得る。一部の実施形態では、投与は、脳室内（ＩＣＶ）であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＨ９ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、期間中、少なくとも２回行うことができる。一部の実施形態では、期間は、約２４時間であり得る。一部の実施形態では、方法は、疾患または状態を予防する方法であり得、予防は、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドの対象への予防投与を含み得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを、対象に投与することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、ベクターに含まれ得る。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルス（ＬＶ）ベクターを含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、（ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２を含む血清型、または（ｂ）ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－レトロ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＳもしくはＡＡＶ－２ｉ８を含むシュードタイプを有するＡＡＶ由来のものであることができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むか、またはコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することをさらに含み、ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ編集実体を動員し、編集実体は、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触したとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、（ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；（ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または（ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得、ｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アルギニルｔＲＮＡであり得、対象は、０～６歳の年齢のヒトであり得、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を
少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含むことができる。一部の実施形態では、対象は、投与前に、疾患または状態を有するとの診断を受けていてもよい。一部の実施形態では、診断は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）診断検査によって決定することができる。

本開示の別の態様は、組成物を提供する。組成物は、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体；および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含むことができる。本開示の別の態様は、容器において本明細書で述べられる組成物を含むキットを提供する。本開示の別の態様は、対象に、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供し、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３～２２のいずれか１つで提供される参照ｔＲＮＡの配列における１つまたは複数の突然変異を含むことができ、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換して、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生する。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、互いにワトソン・クリック塩基対形成しない操作されたｔＲＮＡ変異体のアクセプターステムまたはアンチコドンステムにおける少なくとも２つのヌクレオチドの、ワトソン・クリック塩基対形成する少なくとも２つのヌクレオチドでの置換を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７２位におけるチミンのシトシンでの置換を含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７２位におけるウラシルのシトシンでの置換を含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２３の配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド２位にシトシンおよびヌクレオチド７１位にグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２４の配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド２位にシトシンおよびヌクレオチド７１位にグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２４の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてグアニンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド６７位においてシトシンで置換されたチミンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてグアニンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド６７位においてシトシンで置換されたウラシルを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１３位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド１３位およびヌクレオチド２２位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１３位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド１３位およびヌクレオチド２２位は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド１５位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド１５位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド３９位においてチミンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２９の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド３９位においてウラシルで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１２９の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド３７位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３０の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド３７位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３０の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３１の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３１の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６４位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３２の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド６４位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号１０３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３２の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてウラシルで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４９位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６５位においてシトシンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド４９位およびヌクレオチド６５位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４９位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６５位においてシトシンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド４９位およびヌクレオチド６５位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてウラシルで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７１位においてシトシンで置換されたチミンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７１位においてシトシンで置換されたウラシルを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１３８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド７１位においてグアニンで置換されたチミンを含むことができ、ヌクレオチド２位およびヌクレオチド７２位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３９の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド７１位においてグアニンで置換されたウラシルを含むことができ、ヌクレオチド２位およびヌクレオチド７２位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔ
ＲＮＡ変異体は、配列番号１３９の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６９位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド４位およびヌクレオチド６９位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４０の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド６９位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド４位およびヌクレオチド６９位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４０の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてチミンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４１の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてウラシルで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４１の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド２３位においてグアニンで置換されたシトシンを含むことができ、ヌクレオチド１２位およびヌクレオチド２３位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４２の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド２３位においてグアニンで置換されたシトシンを含むことができ、ヌクレオチド１２位およびヌクレオチド２３位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４２の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２７位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４３位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２７位およびヌクレオチド４３位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４３の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２７位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド４３位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２７位およびヌクレオチド４３位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４３の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４４の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたウラシルおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４４の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４０位においてシトシンで置換されたチミンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４０位においてシトシンで置換されたウラシルを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４５の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてシトシンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド３９位においてグアニンで置換されたチミンを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてシトシンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド３９位においてグアニンで置換されたウラシルを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４６の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４６位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４６位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１４８の配列を含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）操作されたｔＲＮＡ変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；（ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンを欠き得る同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で産生することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約８０％の効率で産生し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入し、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、操作されたｔＲＮＡ前駆体であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡ変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡ変異体を産生することができる。一部の実施形態では、対象はヒトであり得る。一部の実施形態では、ヒトは、およそ生誕時～約４０歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、約６月齢～約１５歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、胚または胎児であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、嚢胞性線維症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、網膜色素変性症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、難聴を含み得る。一部の実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得る。

一部の実施形態では、投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することであり得る。一部の実施形態では、投与することは、非経口投与することであり得、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳に投与すること、脳室内投与すること、頭蓋内、実質への頭蓋内、または腹腔内投与することであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＨ９ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、期間中、少なくとも２回行うことができる。一部の実施形態では、期間は、約２４時間であり得る。一部の実施形態では、方法は、疾患または状態を予防する方法であり得、予防は、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドの対象への予防投与を含み得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを、対象に投与することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増量剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、または任意のその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むＲＮＡ編集ポリヌクレオチドを含むか、またはコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することをさらに含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員し、編集実体は、ＲＮＡ編集ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触したとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する。一部の実施形態では、編集実体は、（ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；（ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または（ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得、ｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡ変異体は、アルギニルｔＲＮＡであり得、対象は、０～６歳の年齢のヒトであり得、操作されたｔＲＮＡ変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する。一部の実施形態では、操作れたｔＲＮＡ変異体は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド変異体は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含む医薬単位投薬形態に含まれ得る。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するとの診断を受けた。一部の実施形態では、診断は、インビトロ診断検査によって決定された。

本開示の別の態様は、組成物を提供する。組成物は、配列番号３～２２のいずれかに提供される配列に関して、１つまたは複数の突然変異を含む操作されたｔＲＮＡ変異体を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３～配列番号４８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むことができる。本開示の別の態様は、組成物を提供し、組成物は、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３～２２のいずれかに提供される配列を含む参照ｔＲＮＡと比較して、操作されたｔＲＮＡの配列における１つまたは複数の突然変異を含むことができ、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換して、実質的に全長のポリペプチドを産生する。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができ、配列番号６の配列の２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９、または７１位において置換を含むことができる。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、４位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６位での置換は、Ａへの置換であり得るか、１２位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、２３位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２７位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４０位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、４２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４３位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４４位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４６位での置換は、Ａへの置換であり得るか、４９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、５０位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６４位での置換は、Ａへの置換であり得るか、６５位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ａへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、６９位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、または７１位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換（複数可）を除いて、配列番号６の配列に対して同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号６に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができ、配列番号３の２、６、１３、１５、２２、２８、３１、３７、３９、４２、４４、５０、６４、６７、７１、または７２に置換を含むことができる。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、６位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、１３位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、１５位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、３１位での置換は、Ａへの置換であり得るか、３７位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、３９位での置換は、Ｔへの置換であり得るか、４２位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、４４位での置換は、Ａへの置換であり得るか、５０位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、６４位での置換は、Ｇへの置換であり得るか、６７位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得るか、または７２位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換（複数可）を除いて、配列番号３と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸荷電効率測定、またはシンテターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定される、配列番号３において提供される配列を含む比較可能なｔＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を示す。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号５と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができ、配列番号５の７３位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、７３位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換を除いて、配列番号５と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、代理測定、半減期測定、アミノ酸荷電効率測定、または合成酵素もしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定される、配列番号５において提供される配列を含む比較可能なｔＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を示す。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、互いにワトソン・クリック塩基対形成しない操作されたｔＲＮＡ変異体のアクセプターステムまたはアンチコドンステムにおける少なくとも２つのヌクレオチドの、ワトソン・クリック塩基対形成する少なくとも２つのヌクレオチドでの置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド２位にシトシンおよびヌクレオチド７１位にグアニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７２位におけるチミンのシトシンでの置換を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド７１位においてシトシンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド２２位およびヌクレオチド７１位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてグアニンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド６７位においてシトシンで置換されたチミンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１３位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド１３位およびヌクレオチド２２位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド１５位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド３９位においてチミンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド３７位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７３位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号４または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてウラシルで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号１０４または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド６位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４９位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６５位においてシトシンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド４９位およびヌクレオチド６５位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド５０位においてウラシルで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位は、配列番号１０６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７１位においてグアニンで置換されたチミンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド４位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６９位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド４位およびヌクレオチド６９位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌク
レオチド６位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてチミンで置換されたグアニンを含むことができ、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド１２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド２３位においてグアニンで置換されたシトシンを含むことができ、ヌクレオチド１２位およびヌクレオチド２３位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２７位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４３位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２７位およびヌクレオチド４３位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができ、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４０位においてシトシンで置換されたチミンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ヌクレオチド３１位においてシトシンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド３９位においてグアニンで置換されたチミンを含むことができ、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてグアニンで置換されたアデニンを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４６位においてアデニンで置換されたグアニンを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；（ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で産生することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約８０％の効率で産生し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入し、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、操作されたｔＲＮＡ前駆体であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡ変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡ変異体を産生することができる。一部の実施形態では、対象はヒトであり得る。一部の実施形態では、ヒトは、およそ生誕時～約４０歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、約６月齢～約１５歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、胚または胎児であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、嚢胞性線維症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、網膜色素変性症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、難聴を含み得る。一部の実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得る。一部の実施形態では、投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することであり得る。一部の実施形態では、投与することは、非経口投与することであり得、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳に投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＨ９ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、期間中、少なくとも２回行うことができる。一部の実施形態では、期間は、約２４時間であり得る。一部の実施形態では、組成物は、疾患または状態を予防する組成物であり得、予防は、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドの対象への予防投与を含み得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを、対象に投与することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、侵入エンハンサー、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、バイオポリマー、ウイルス粒子、または任意のその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含む組成物を投与することをさらに含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員し、編集実体は、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触したとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する。一部の実施形態では、編集実体は、（ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；（ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または（ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得、ｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡ変異体は、アルギニルｔＲＮＡであり得、対象は、０～６歳の年齢のヒトであり得、操作されたｔＲＮＡ変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する。一部の実施形態では、操作れたｔＲＮＡ変異体は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、単離することができる。本開示の別の態様は、医薬組成物を提供し、医薬組成物は、本明細書で述べられる組成物のいずれか、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含むことができる。本開示の別の態様は、本明細書で述べられる組成物のいずれかを含む、単離された細胞を提供する。本開示の別の態様は、本明細書で述べられる組成物のいずれかを含む、単離された複数の細胞を提供する。本開示の別の態様は、本明細書で述べられる組成物のいずれかの、操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、（例えば、５’から３’の順に）：（ａ）第１のプロモーター；（ｂ）第１の定量カセット；（ｃ）第２のプロモーター；（ｄ）第２の定量カセット；（ｅ）第３のプロモーター；（ｆ）操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子；または（ｇ）検出可能なポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を適宜さらに含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターの５’ＩＴＲ上流およびレポー
ター遺伝子の３’ＩＴＲ下流をさらに含むことができる。一部の実施形態では、本明細書において、検出可能なポリペプチドは、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ－ガラクトシダーゼを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであり得、Ｕ６プロモーターは、適宜メチル化することができるか、またはＵ６プロモーターは、適宜マウスＵ６プロモーターであり得る。一部の実施形態では、本明細書において、第３のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、精製し、単離することができる。

一部の実施形態は、（ａ）本明細書で述べられる組成物のいずれか、本明細書で述べられる医薬組成物、本明細書で述べられる単離された細胞（複数可）、または本明細書で述べられるベクター；および（ｂ）組成物を保存するために設計された容器を含むキットに関する。

本開示の別の態様は、本明細書で述べられるベクターを生成する方法を提供し、方法は、操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、骨格ベクター配列の導入遺伝子に導入することを含む。

本開示の別の態様は、本明細書に記載される医薬組成物を生成する方法を提供し、方法は、操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体に導入することを含む。

それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、対象に、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターを投与することを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができ、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、約１％～約１００％（例えば、少なくとも約８０％）の効率で、実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、効率は、（ａ）操作されたｔＲＮＡをコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；（ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まなくてもよい；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入することができ、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、またはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、操作されたｔＲＮＡ前駆であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡを含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、対象は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、ヒトは、およそ生誕時～約４０歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、約６月齢～約１５歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、胚または胎児であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、嚢胞性線維症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、網膜色素変性症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、難聴を含み得る。一部の実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得る。一部の実施形態では、投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することであり得る。一部の実施形態では、投与することは、非経口投与することであり得、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳に投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＨ９ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、期間中、少なくとも２回行うことができる。一部の実施形態では、期間は、約２４時間であり得る。一部の実施形態では、方法は、疾患または状態を予防する方法であり得、予防は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターの対象への予防投与を含み得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡをコードするベクターを、対象に投与することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡをコードするベクターは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含む組成物を投与することをさらに含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員することができ、編集実体は、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触したとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換することができる。一部の実施形態では、編集実体は、ＡＤＡＲポリペプチドまたはＡＰＯＢＥＣポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含むことができ、ｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードすることができ、停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡは、アルギニルｔＲＮＡであり得、対象は、０～６歳の年齢のヒトであり得、操作されたｔＲＮＡが、対象にＡＡＶベクターとして投与され得るとき、操作されたｔＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができ、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部処置することができる。

それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法もまた、本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、対象に、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターを投与することを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができ、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置する。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入することができ、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、操作されたｔＲＮＡ前駆であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡを含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、対象は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、ヒトは、およそ生誕時～約４０歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、約６月齢～約１５歳の年齢であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、胚または胎児であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、嚢胞性線維症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、網膜色素変性症を含み得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、難聴を含み得る。一部実施形態では、難聴は、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含み得る。一部の実施形態では、停止コドンは、オパール停止コドンであり得る。一部の実施形態では、投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することであり得る。一部の実施形態では、投与することは、非経口投与することであり得、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳に投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＨ９ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、期間中、少なくとも２回行うことができる。一部の実施形態では、期間は、約２４時間であり得る。一部の実施形態では、方法は、疾患または状態を予防する方法であり得、予防は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターの対象への予防投与を含み得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡをコードするベクターを、対象に投与することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡをコードするベクターは、デリバリーシステムに存在することができる。一部の実施形態では、デリバリーシステムは、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含む組成物を投与することをさらに含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むことができ、ポリヌクレオチド配列は、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員することができ、編集実体は、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触したとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換することができる。一部の実施形態では、編集実体は、ＡＤＡＲポリペプチドまたはＡＰＯＢＥＣポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群を含むことができ、ｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードすることができ、停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡは、アルギニルｔＲＮＡであり得、対象は、０～６歳の年齢のヒトであり得、操作されたｔＲＮＡが、対象にＡＡＶベクターとして投与され得るとき、操作されたｔＲＮＡは、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができ、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部処置することができる。

操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクター；および賦形剤、希釈剤、または担体を含むことができる組成物もまた、本明細書に開示される。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約８０％の効率で、実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、効率は、（ａ）操作されたｔＲＮＡをコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；（ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まなくてもよい；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、非標準アミノ酸でアシル化することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ポリペプチド鎖に挿入することができ、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンを欠き得る同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なポリペプチドを産生するのに十分であり得る。一部の実施形態では、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つの未成熟停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、操作されたｔＲＮＡ前駆であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、イントロン配列を含むことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡを含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、第１のヒト細胞または第２のヒト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり得る。一部の実施形態では、組成物は、操作されたｔＲＮＡをコードするベクターを含むことができる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡをコードするベクターは、リポソーム、ナノ粒子、またはウイルス粒子に存在することができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、アルギニルｔＲＮＡであり得、未成熟停止コドンは、オパール停止コドンであり得、操作されたｔＲＮＡは、ベクターに存在し得、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであり得、第１のヒト細胞および第２のヒト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり得る。

容器に本明細書に記載される組成物を含むことができるキットもまた、本明細書に開示される。一部の実施形態は、組成物を容器と接触することを含む、キットを製造する方法を含む。

本開示の追加の態様および利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになり、本開示の単に説明としての実施形態が示され、記載される。認識される通り、本開示は、他および異なる実施形態であり得、そのいくつかの詳細は、全てが本開示から逸脱することなく、様々な明らかな点で修飾することができる。従って、図面および説明は、制限としてではなく、事実上説明としてみなされるべきである。

参照による取り込み
本明細書で述べられる全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたかのように、同じ程度まで本明細書において参照により取り込まれる。参照により取り込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本開示と矛盾する程度まで、本明細書は、任意のこのような矛盾する材料に取って代わり、および／または優先することが意図される。

本発明の新たな特性は、添付の請求の範囲において具体性を伴い記載される。本発明の特性および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される、説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られる。

図１は、一部の実施形態による操作されたｔＲＮＡ抑制因子の１または２つのコピーをコードするプラスミドコンストラクトを模式的に説明する。図２Ａは、ヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造および配列を模式的に説明する。図２Ｂは、一部の実施形態による、抑制因子ｔＲＮＡを操作するための突然変異誘発から除外されたヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造および配列における部位を模式的に説明する。図３Ａは、一部の実施形態による、ｍＲＮＡにおける未成熟オパール停止コドンの抑制のため、「ＴＣＡ」に修飾された「ＣＣＴ」のアンチコドン配列を有するアルギニン（Ａｒｇ）ｔＲＮＡ抑制因子を模式的に説明する。図３Ｂは、一部の実施形態による、ｍＲＮＡにおける未成熟オパール停止コドンの抑制のため、「ＴＣＡ」に修飾された「ＴＣＴ」のアンチコドン配列を有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子を模式的に説明する。図４は、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡ抑制因子およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターをコードするプラスミドベクターで、操作されたＧＦＰ（未成熟オパール停止コドンを含有する）を安定的に発現する細胞をトランスフェクトするワークフローを模式的に説明する。図５Ａは、図５Ｂおよび図６を含む、一部の実施形態によるヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞における操作されたｔＲＮＡ抑制因子活性をスクリーニングするための実験的なワークフローを模式的に説明する。この模式図は、図４で描かれる実験的な機構を時間的に示す。図５Ｂは、一部の実施形態による、安定的に組み換えられたＧＦＰレポーターにおける２つの異なる、Ａｒｇから停止コドンへの突然変異を有する２つのＨＥＫ細胞株における操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制を示す。図５Ｃは、一部の実施形態による、異なるＡｒｇから停止への突然変異を有する２つのＨＥＫ細胞株間の操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制の相関解析を示す。図６は、一部の実施形態による、Ｒ７４ＸまたはＲ９７ＸＡｒｇから停止コドンへの突然変異を有する異なるＨＥＫ細胞株における操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制を示す。図７は、図８～９Ｂを含む、一部の実施形態による、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡ抑制因子分子を評価するための二重のプラスミドスクリーニングシステムのワークフローを模式的に説明する。図８Ａは、一部の実施形態による、図７に示される二重のプラスミドスクリーニングシステムを使用した、２つの異なる、Ａｒｇから停止コドンへの突然変異を含有する操作されたＧＦＰを発現するＨＥＫ細胞における、パーセンテージリードスルー（緑色蛍光を示すｔＲＮＡ／ｍＣｈｅｒｒｙ産生細胞の分画）に関して測定された、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制の代表的な結果を示す。図８Ｂは、一部の実施形態による、図８Ａにおいて使用される、Ａｒｇから停止への突然変異を含有する２つの異なる操作されたＧＦＰレポーター：Ｒ９７４ＸとＲ９７Ｘの間の本明細書に記載される操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制の相関解析を示す。図９Ａは、一部の実施形態による、二重のプラスミドスクリーニングシステムによる、２つの異なる、Ａｒｇから停止への突然変異（Ｒ７４ＸおよびＲ９７Ｘ、Ｘは、オパール停止コドンである）を有するＨＥＫ細胞株における未成熟停止コドン抑制の効率を示す。図９Ｂは、一部の実施形態による、図９Ａにおいて使用される、Ａｒｇから停止への突然変異を含有する２つの異なる操作されたＧＦＰレポーター：Ｒ９７４ＸとＲ９７Ｘの間の本明細書に記載される操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制の相関解析を示す。図１０Ａは、一部の実施形態による、野生型（ＷＴ）ｍＲＮＡ（上部）、４１位にオパール未成熟停止コドン、および７３位にオパール停止コドンをコードするＫ５６２細胞におけるルシフェラーゼの模式ｍＲＮＡを示す。１０Ｂは、一部の実施形態による、破壊されたルシフェラーゼのトランスフェクションプロセスを模式的に説明する。図１０Ｃは、一部の実施形態による、破壊されたルシフェラーゼスクリーニングシステムを使用して、図１０Ａに示される２つの異なる未成熟オパール停止コドンを含有するＫ５６２細胞株における本明細書に記載される操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子の抑制の効率を示す。図１１Ａは、一部の実施形態による、ＷＴｍＲＮＡ（上部）、アミノ酸７４位にオパール未成熟停止コドンおよびアミノ酸９７位にオパール停止コドンをコードするＨＥＫ２９３細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の模式ｍＲＮＡを示す。図１１Ｂは、一部の実施形態による、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟終止コドン（ＰＴＣ）のリードスルーでの細胞のパーセンテージを示す。図１１Ｃは、一部の実施形態による、破壊されたＧＦＰスクリーニングシステムを使用した、２つの、異なるＡｒｇから停止への突然変異を有する細胞における、本明細書に記載される操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟終止コドン（ＰＴＣ）のリードスルーを示す。図１１Ｄは、一部の実施形態による、破壊されたＧＦＰスクリーニングシステムを使用した、２つの、異なるＡｒｇから停止への突然変異を有する細胞における、本明細書に記載される操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子の抑制の効力を示す。図１１Ｅは、一部の実施形態による、ベクターマップを模式的に説明する。図１１Ｆは、図１１Ｂに示される結果を得るために使用された二重のトランスフェクションシステムを模式的に説明する。図１１Ｇは、一部の実施形態による、破壊されていないＧＦＰと比較して、ｍＣｈｅｒｒｙタグを有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子を使用した、破壊されたＧＦＰにおけるオパール停止コドンを抑制するプロセスを模式的に説明する。図１２は、一部の実施形態による、フローサイトメトリーによる、本明細書に記載される異なる操作されたＡｒｇｔＲＮＡ分子の効率レベルの例を示す。図１３は、操作されたｔＲＮＡ分子が有用であり得る、代わりの停止コドンの例を示す。図１４Ａは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡコンストラクトについてのベクター設計を模式的に説明する。図１４Ｂは、一部の実施形態による、一次ニューロンをトランスフェクトするため使用される操作されたｔＲＮＡコンストラクトについてのベクター設計を模式的に説明する。図１５Ａは、一部の実施形態による、停止コドンリードスルーの代表的なウエスタンブロット例を説明する。図１５Ｂは、一部の実施形態による、異なる操作されたｔＲＮＡ停止コドンリードスルーのヒストグラムである。図１６Ａ～１６Ｆは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体で処置されたＲ２５５ＸＲｅｔｔマウスモデル由来のニューロン細胞培養の代表的なフローサイトメトリー結果を示す。同上。同上。同上。同上。同上。図１７Ａ～１７Ｄは、一部の実施形態による、Ｄ４Ｆ３抗体を使用した、代表的なフローサイトメトリーＭｅＣＰ２シグナルを示す。同上。同上。同上。図１７Ｅ～１７Ｈは、一部の実施形態による、ＮｅｕＮ抗体ＭＡＢ３７７を使用した、代表的なフローサイトメトリーＭｅＣＰ２シグナルを示す。同上。図１８Ａは、一部の実施形態による、ＭｅＣＰ２シグナルを有するニューロンのパーセンテージを描くヒストグラムである。図１８Ｂは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を有するレンチウイルスにより形質導入されたニューロンにおける総ＭｅＣＰ２シグナルを描くヒストグラムである。図１９Ａ～１９Ｇは、一部の実施形態による、外来性プロモーターを有する、または有さない、操作されたｔＲＮＡの１つまたは複数のコピーを有する異なるベクター設計を模式的に説明する。図２０Ａは、一部の実施形態による、異なるベクターを使用した、操作されたｔＲＮＡリードスルーを有する細胞の割合を描くグラフである。図２０Ｂは、一部の実施形態による、異なるベクターを使用した、細胞における総操作されたｔＲＮＡリードスルーを描くグラフである。図２１Ａ～２１Ｃは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡの１つまたは複数のコピーの異なるＡＡＶ－９ベクター設計を模式的に説明する。図２２Ａは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡの１つまたは複数のコピーを有する単一鎖のＡＡＶ９ベクターの模式的な例を説明する。図２２Ｂは、一部の実施形態による、操作されたｔＲＮＡの１つまたは複数のコピーを有する自己相補的ＡＡＶ９ベクターの模式的な例を説明する。図２３Ａは、一部の実施形態による、逆位末端反復から異なる距離で置かれた操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を有するＡＡＶ骨格のベクターコンストラクトを模式的に説明する。図２３Ｂ～２３Ｃは、一部の実施形態による、異なる向きで置かれた操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を有するＡＡＶ骨格のベクターコンストラクトを模式的に説明する。同上。図２４は、図２５～図２８において使用されるゲーティングストラテジーを示す。図２５は、配列番号３の０のコピー、１つのコピー、３つのコピー、または６つのコピーを有する自己相補的ＡＡＶ２／９コンストラクトの例となるフローサイトメトリードットプロットを示す。図２６は、配列番号３の０のコピー、１つのコピー、３つのコピー、または６つのコピーを有する単一の標準的かつ自己相補的なＡＡＶ２／９コンストラクトについての細胞生存率のプロットを示す。図２７Ａおよび２７Ｂは、配列番号３の０のコピー、１つのコピー、３つのコピー、または６つのコピーを有する１本鎖のかつ自己相補的なＡＡＶ２／９コンストラクトについての感染性のプロットを示す。同上。図２８Ａおよび２８Ｂは、配列番号３の０のコピー、１つのコピー、３つのコピー、または６つのコピーを有する１本鎖のかつ自己相補的なＡＡＶ２／９コンストラクトについてのＰＴＣリードスルーのプロットを示す。同上。図２９Ａおよび２８Ｂは、ＰＴＣ抑制を示したパーセンテージ細胞（Ａ）、ならびにＣＣＴの２つのコピーまたは３つのコピーをコードし、ｔＲＮＡペイロードを分ける６ｂｐのスペーサー、５００ｂｐのスペーサー、１００ｂｐのスペーサー、２００ｂｐのスペーサー、または５００ｂｐのスペーサーをコードするプラスミドについて抑制されたＰＴＣの総パーセント（Ｂ）のプロットを示す。同上。図３０Ａおよび３０Ｂは、一部の実施形態に従った、それぞれ、ＳＴ２１の％ＧＦＰおよびＧＦＰＭＦＩ％のプロットを示す。同上。図３１は、一部の実施形態による、ｇＲＮＡの編集効率を改善するための代表的なストラテジーを示す。図３２は、一部の実施形態による、代表的なｇＲＮＡ設計を説明する。図３３は、一部の実施形態による、機能アッセイのルシフェラーゼ獲得の例を示す。図３４は、一部の実施形態による、代表的なｇＲＮＡ設計をスクリーニングするための実験の代表的な結果を示す。図３５は、一部の実施形態による、代表的なスクリーニングアッセイ、細胞株、ならびに分析アッセイおよびツールを示す。図３６は、一部の実施形態による、ＡＤＡＲ１ＫＯ細胞株を生成するための代表的なコンストラクトを説明する。図３７は、一部の実施形態による、ＡＤＡＲ１ＫＯ細胞株を生成するための代表的なコンストラクトを説明する。図３８は、一部の実施形態による、ＡＤＡＲ２をＡＤＡＲ１ＫＯ細胞に統合するための模式的なプロセスを説明する。図３９は、一部の実施形態による、テジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）プロセスの模式図を説明する。図４０は、一部の実施形態による、ＰＣＲプライマーおよびプローブセットを設計するためのｄｄＰＣＲを使用した代表的な分析を示す。図４１は、一部の実施形態による、ｇＲＮＡ発現を定量するための代表的なシステムを示す。図４２は、一部の実施形態による、標的細胞へのトランスフェクション後のｇＲＮＡの高い細胞レベルの例を示す。図４３は、一部の実施形態による、ＨＥＫ２９３細胞におけるＲａｂ７ａの編集における代表的なｇＲＮＡコンストラクトおよびそれらの効率を示す。図４４は、一部の実施形態による、ＨＥＫ２９３細胞におけるＲａｂ７ａの編集におけるｇＲＮＡコンストラクトおよびそれらの効率の例を示す。図４５は、一部の実施形態による、ハイスループットスクリーニング方法と共にｇＲＮＡ設計の利用における代表的なアプローチを説明する。図４６は、一部の実施形態による、オパール未成熟突然変異を有する代表的なルシフェラーゼを示す。図４７Ａ～４７Ｅは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むことができる代表的なベクターマップを示す。同上。同上。同上。同上。図４８Ａ～４８Ｂは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むことができる代表的なベクターマップを示す。同上。図４９は、哺乳類ノンセンス介在性減衰の機序の例を示す。

タンパク質における突然変異を導く未成熟停止コドンは、レット症候群などの、重篤な神経発生の障害に関係する。未成熟停止コドンを含有するｍＲＮＡ分子の翻訳は、切断されたポリペプチドまたはタンパク質を産生するための翻訳プロセスの未成熟終結を引き起こし得る。本明細書において使用される場合、「未成熟停止コドン」は、「未成熟終止コドン」（ＰＴＣ）と互換的に使用することができる。特に、小児における神経発生に重要なタンパク質の意図されないトランケーションは、重篤かつ人生を変える疾患または障害を引き起こし得る。

ＭＥＣＰ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４２０４）によってコードされる、タンパク質メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）は、ニューロンの機能に重要であり得、ニューロン間の結合の維持において役割を果たすことができる。加えて、ＭｅＣＰ２は、正常な脳機能をもたらすタンパク質をコードする多くの遺伝子の制御因子であり得る。レット症候群は、ＭＥＣＰ２遺伝子における未成熟停止コドンを含む、ＭｅＣＰ２における機能を喪失する突然変異によって引き起こされ得る。健康な個体において、ＭｅＣＰ２タンパク質は、配列番号４９に関して、または配列番号５０に関して、アミノ酸１６８、１８６、１９８、２５５、２７０、２９４および４５３位にアルギニン（Ａｒｇ）を含有することができる。レット症候群の患者において、アミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６および４５３位でのＭｅＣＰ２タンパク質の翻訳の未成熟な終結を引き起こす、ＭｅＣＰ２タンパク質における突然変異は、ＭｅＣＰ２の機能の喪失を引き起こし、レットを引き起こす突然変異の２５％より多くを合わせて占める。ＭＥＣＰ２におけるアルギニン（Ａｒｇ）は、Ｒ８（アイソフォーム２についてのみ）、Ｒ９（アイソフォーム１についてのみ）、Ｒ８４、Ｒ８５、Ｒ８９、Ｒ９１、Ｒ１０６、Ｒ１１１、Ｒ１１５、Ｒ１３３、Ｒ１６２、Ｒ１６７、Ｒ１８８、Ｒ１９０、Ｒ２１１、Ｒ２５０、Ｒ２５３、Ｒ２６８、Ｒ３０６、Ｒ３０９、Ｒ３４４、Ｒ３５４、Ｒ４２０、Ｒ４５８、Ｒ４６８、Ｒ４７１、Ｒ４７８、およびＲ４８４位においても見られる。本開示は、Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０Ｘ、Ｒ２９４Ｘ、Ｒ１９８Ｘ、Ｒ１８６Ｘ、Ｒ４５３Ｘ、Ｒ８Ｘ（アイソフォーム２中）、Ｒ９Ｘ（アイソフォーム１中）、Ｒ８４Ｘ、Ｒ８５Ｘ、Ｒ８９Ｘ、Ｒ９１Ｘ、Ｒ１０６Ｘ、Ｒ１１１Ｘ、Ｒ１１５Ｘ、Ｒ１３３Ｘ、Ｒ１６２Ｘ、Ｒ１６７Ｘ、Ｒ１８８Ｘ、Ｒ１９０Ｘ、Ｒ２１１Ｘ、Ｒ２５０Ｘ、Ｒ２５３Ｘ、Ｒ２６８Ｘ、Ｒ３０６Ｘ、Ｒ３０９Ｘ、Ｒ３４４Ｘ、Ｒ３５４Ｘ、Ｒ４２０Ｘ、Ｒ４５８Ｘ、Ｒ４６８Ｘ、Ｒ４７１Ｘ、Ｒ４７８Ｘ、Ｒ４８４Ｘ、またはそれらの任意の組合せのいずれか１つを含む、ＭｅＣＰ２タンパク質における任意の位置に存在し得る未成熟停止コドンの未成熟停止コドンリードスルーすることができる、操作されたｔＲＮＡおよび操作されたｔＲＮＡ変異体を提供する。進行した神経障害を有する大人のＭｅＣＰ２欠損マウスにおけるＭｅＣＰ２再活性化は、疾患を強く逆転させ得ることが、示されている。

ＭｅＣＰ２タンパク質の第１の異性体のタンパク質配列の例は、配列番号４９のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、ＭｅＣＰ２タンパク質は、ＭｅＣＰ２の第１の異性体を含むことができる。ＭＥＣＰ２タンパク質の第２の異性体のタンパク質配列の例は、配列番号５０のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、ＭｅＣＰ２タンパク質は、ＭｅＣＰ２の第２の異性体を含むことができる。

鋳型メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における未成熟停止コドンのリードスルーを可能にするために未成熟停止コドンを抑制する操作されたトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子が、本明細書において提供される。これらは、「操作されたｔＲＮＡ抑制因子分子」または「操作されたｔＲＮＡ抑制因子」としても言及される。本明細書において使用される場合、「抑制」および「リードスルー」は、本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡおよびその変異体の活性を言及するために互換的に使用することができる。ある場合では、ウイルスベクターである、本開示の操作されたｔＲＮＡ分子をコードするベクターがまた提供される。操作されたｔＲＮＡ分子または操作されたｔＲＮＡ分子をコードするベクターは、インビボでの、操作されたｔＲＮＡ分子の標的細胞または組織へのウイルス粒子介在性デリバリーのため、ウイルスにパッケージングすることができる。ある場合では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることができる。操作されたｔＲＮＡ分子（複数可）または操作されたｔＲＮＡ分子（複数可）をコードするベクター（複数可）を含む、本明細書に記載される組成物は、対象へのデリバリーのため、ＡＡＶ（ＩＶ／ＣＮＳ）ベクターを利用することができる。ＡＡＶベクターデリバリーは、単一の用量で長期の恩恵を達成することができ、マルチプレックス標的化の機会をもたらすことができる。方法は、ＣＮＳ／ＩＶ投薬を用いた、中枢神経指向性および体内分布を促進することができるＡＡＶ血清型を同定することを含むことができる。本開示の操作されたｔＲＮＡは、未成熟停止コドンの認識のための操作されたアンチコドンを含むことができる。操作されたｔＲＮＡ構造の１つまたは複数の領域を安定化するか、または改善することができる、それらの親の操作されたｔＲＮＡ配列と比べて、突然変異を有する、操作されたｔＲＮＡ変異体もまた、本明細書において提供される。例えば、本開示の操作されたｔＲＮＡ変異体は、アクセプターステム、Ｄループ、Ｄステム、Ｔループ、Ｔステム、可変ループ、アンチコドンステム、アンチコドンループ、またはそれらの任意の組合せにおける突然変異を有することができる。複数の操作されたｔＲＮＡ抑制因子ペイロード、ＧＦＰもしくはｍＣｈｅｒｒｙなどのマーカー、スタッファー配列、またはそれらの任意の組合せのパッケージングを含む、ウイルスベクターにおける操作されたｔＲＮＡ抑制因子分子のパッケージングのための、様々なコンストラクトもまた、本明細書に開示される。

ウイルスにパッケージングされてもよい操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡもしくは操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするベクターをデリバリーする方法が、本明細書において提供される。ある場合では、操作されたｔＲＮＡもしくは操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくは操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするベクターのデリバリーは、本明細書に記載される疾患、状態、または障害（例えば、レット症候群）を処置するのに有効であり得る。

Ｉ．組成物
操作されたｔＲＮＡ分子、操作されたｔＲＮＡ変異体、操作されたｔＲＮＡ前駆体分子、操作されたｔＲＮＡ前駆体変異体、または操作されたｔＲＮＡ、操作されたｔＲＮＡ前駆体分子、操作されたｔＲＮＡ変異体、もしくは操作されたｔＲＮＡ前駆体変異体をコードするベクターを含む組成物が、本明細書に開示される。本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、例えば、正しい（例えば、疾患を引き起こさない）アミノ酸を成長しているペプチドに加えることによって、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができる。「未成熟」停止コドンは、存在するとき、野生型対応物と比べて、ポリペプチドの意図されないトランケーションをもたらす停止コドンを指すことができる。停止コドンリードスルーまたは未成熟停止コドンリードスルー（ＰＴＣ）としても知られる、このようなトランケーションは、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、約１％～約１００％の効率で、実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。ある場合では、効率は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９５％、または９９％であり得る。ある場合では、効率は、少なくとも約１％～約１０％、５％～約２０％、１０％～約３５％、２５％～約５０％、４０％～約７０％、６０％～約８０％、７５％～約９０％または約８５％～約１００％であり得る。

ある場合では、未成熟終結コドン（ＰＴＣ）リードスルーの効率は、ＰＴＣリードスルーのインビボ効率を含むことができる。ある場合では、ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、疾患または状態を少なくとも一部処置することによって決定することができる。例えば、ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、聴く能力を少なくとも一部改善すること、見る能力を少なくとも一部改善すること、運動能力、認知能力またはそれらの任意の組合せを少なくとも一部改善することによって測定することができる。ある場合では、ＰＴＣリードスルーの効率は、（ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドン（これは、（例えば、「破壊された」ＧＦＰ）として本明細書において言及することができる）を含むことができる；（ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および（ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定される、ＰＴＣ抑制リードスルーのインビトロ効率などの、ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率を含むことができる。ある場合では、緑色蛍光タンパク質は、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含むことができる。ある場合では、未成熟停止コドンは、同じ停止コドン、または異なる停止コドンであり得る。

ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約１％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約１０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約２０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約３０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約４０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約５０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約６０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約７０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約７５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約８０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約８５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約９０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約９５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約２０％～約４０％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約２０％～６０％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビボ効率は、約１０％～７０％であり得る。

ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約１％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約１０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約２０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約３０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約４０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約５０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約６０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約７０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約７５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約８０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約８５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約９０％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約９５％～１００％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約２０％～約４０％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約２０％～６０％であり得る。ＰＴＣリードスルーのインビトロ効率は、約１０％～７０％であり得る。

一部の実施形態は、ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのフラグメントを含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのフラグメントを少なくとも含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、全長ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｍＲＮＡによってコードすることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドのフラグメントは、未成熟停止コドンを有するｍＲＮＡによってコードすることができる。一部の実施形態では、全長ポリペプチドは、未成熟停止コドンを有さないｍＲＮＡによってコードすることができる。

本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、本明細書に開示される通り、未成熟停止コドンリードスルーすることができる。例えば、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＡｒｇからオパール停止コドンへの突然変異の未成熟停止コドンリードスルーすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ１６８Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ２５５Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ２７０Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ２９４Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ１９８Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡおよびその変異体は、ＭＥＣＰ２遺伝子におけるＲ４５３Ｘ突然変異の未成熟停止コドンリードスルーを可能にすることができる。

一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＭｅＣＰ２に対応する。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、標準的なアミノ酸でアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、非標準アミノ酸でアシル化することができる。非標準アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、Ｏ－メチルチロシン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、３－ヨードチロシン、ビフェニルアラニン、２－アミノカプリル酸、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン、ｏ－ニトロベンジルシステイン、ｏ－ニトロベンジルセリン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルセリン、ｏ－ニトロベンジルリジン、ダンシルアラニン、アセチルリジン、メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、２－アミノデカン酸、Ｃｂｚ－リジン、Ｂｏｃ－リジン、またはアリルオキシカルボニルリジンを含むことができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、表１に提供される、選択されたアミノ酸でアシル化することができる。

表１. アミノ酸、1文字および3文字コード

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、アルギニンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ヒスチジンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、グリシンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、アラニンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、バリンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ロイシンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、イソロイシンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、メチオニンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、フェニルアラニンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、トリプトファンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロリンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、セリンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、スレオニンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、システインでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、チロシンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、アスパラギンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、グルタミンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、アスパラギン酸でアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、グルタミン酸でアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ピロリジンでアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、セレノシステインでアシル化することができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡであり得る。

本開示は、特定のハイブリッドｔＲＮＡまたは直交性ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンターゼ対を取り込むことを企図する。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、他の種由来のデザイナーｔＲＮＡ（２つの異なる天然に存在するｔＲＮＡから作製されたハイブリッドｔＲＮＡなど）または直交性ｔＲＮＡを含むことができる。ある場合では、合成またはキメラ直交性ｔＲＮＡ－ｔＲＮＡシンターゼ対を使用するか、または含むことができる。ある場合では、天然に存在するｔＲＮＡシンターゼと相互作用することができる合成ｔＲＮＡが、含まれるか、または使用される。ある場合では、ピロールリジルｔＲＮＡまたはセレノシスチルｔＲＮＡは、非標準アミノ酸を操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体に取り込むための遺伝子コード拡大において使用することができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、リジン－ｔＲＮＡ、アルギニン－ｔＲＮＡ、ヒスチジン－ｔＲＮＡ、グリシン－ｔＲＮＡ、アラニン－ｔＲＮＡ、バリン－ｔＲＮＡ、ロイシン－ｔＲＮＡ、イソロイシン－ｔＲＮＡ、メチオニン－ｔＲＮＡ、フェニルアラニン－ｔＲＮＡ、トリプトファニン－ｔＲＮＡ、プロリン－ｔＲＮＡ、セリン－ｔＲＮＡ、スレオニン－ｔＲＮＡ、システイニン－ｔＲＮＡ、チロシン－ｔＲＮＡ、アスパラギニン－ｔＲＮＡ、グルタミニン－ｔＲＮＡ、アスパルティン－ｔＲＮＡ、またはグルタミン－ｔＲＮＡであり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ヒトｔＲＮＡに由来することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、非ヒトｔＲＮＡに由来することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、ヒトｔＲＮＡに直交性であり得るｔＲＮＡに由来することができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体を認識することができ、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体をアミノ酸でアシル化することができる、アミノ－アシルシンターゼによってアシル化することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、操作されたｔＲＮＡ前駆体または操作されたｔＲＮＡ前駆体変異体であり得る。このような操作されたプレｔＲＮＡまたはその変異体は、イントロン配列を含むことができる。ある場合では、イントロン配列をスプライシングして、成熟な操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を産生することができる。ある場合では、イントロン配列は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含有する細胞内でスプライシングすることができる。ある場合では、イントロン配列がスプライシングされると、成熟な操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換することができる。ある場合では、イントロンを有する操作されたｔＲＮＡ前駆体またはその変異体は、イントロンを有さない操作されたｔＲＮＡ前駆体またはその変異体と比較して、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈の形質転換においてより効率的であり得る。効率は、イントロンを有する操作された抑制因子ｔＲＮＡ前駆体またはその変異体をコードするベクターを、操作された抑制因子ｔＲＮＡ前駆体またはその変異体が認識する未成熟停止コドンを含む初代細胞株に形質転換すること、および未成熟停止コドンリードスルーのレベルを、イントロンを有さない操作された抑制因子ｔＲＮＡ前駆体またはその変異体をコードするベクターで形質転換されている別の同等の細胞に対して比較することによって、測定することができる。ある場合では、全長タンパク質の量の決定を使用して、未成熟停止コドンリードスルーを測定することができる。

操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、目的のアミノ酸をコードするコドンの代わりに、停止コドンと塩基対形成するアンチコドン配列を用いて操作することができる。例えば、アルギニン（目的のアミノ酸）が、正常であり得る（例えば、疾患を引き起こさない）、成長するポリペプチドにおける位置の未成熟停止コドンを標的化する操作されたｔＲＮＡまたはその変異体。ある場合では、未成熟停止コドンと塩基対形成するアンチコドン配列を有する操作されたＡｒｇｔＲＮＡまたはその変異体は、停止コドンと塩基対形成することができ、Ａｒｇが負荷された操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、Ａｒｇを成長するポリペプチド分子に付加することを可能にし、これにより、未成熟停止コドンのリードスルーに影響することができる。

本開示の操作されたｔＲＮＡｓまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、アンバー停止コドン（ＵＡＧ）、オーカー停止コドン（ＵＡＡ）、もしくはオパール停止コドン（ＵＧＡ）、またはその組合せを認識し、抑制するよう操作することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アンバー停止コドン（ＵＡＧ）のリードスルーを抑制するよう操作することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、オーカー停止コドン（ＵＡＡ）のリードスルーを抑制するよう操作することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、オパール停止コドン（ＵＧＡ）のリードスルーを抑制するよう操作することができる。ある場合では、本開示は、アンバー停止コドン、オーカー停止コドン、およびオパール停止コドンの１つより多くを認識し、抑制することができる、複数の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の組成物を提供する（図１３）。アンバー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アルギニン（Ａｒｇ）ｔＲＮＡイソデコーダーを含むことができる。アンバー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、グルタミン（Ｇｌｎ）ｔＲＮＡイソデコーダーを含むことができる（図１３）。オーカー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アルギニン（Ａｒｇ）ｔＲＮＡイソデコーダーを含むことができる。オーカー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、グルタミン（Ｇｌｎ）ｔＲＮＡイソデコーダーを含むことができる（図１３）。一部の実施形態では、アンバー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、天然に存在するＧｌｎｔＲＮＡイソデコーダーに対して約７０％～約１００％の配列類似性を有することができる。一部の実施形態では、オーカー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、天然に存在するＧｌｎｔＲＮＡイソデコーダーに対して約７０％～約１００％の配列類似性を有することができる。一部の実施形態では、アンバー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、天然に存在するＡｒｇｔＲＮＡイソデコーダーに対して約７０％～約１００％の配列類似性を有することができる。一部の実施形態では、オーカー停止コドンを認識し、抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、天然に存在するＡｒｇｔＲＮＡイソデコーダーに対して約７０％～約１００％の配列類似性を有することができる。

本明細書に記載される停止コドンのいずれか１つと塩基対形成するよう構成されるアンチコドンを有する操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、本明細書に記載されるアミノ酸（標準または非標準）のいずれか１つを負荷することができる。図２Ａは、ヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造を説明する。図２Ｂは、本明細書に開示される操作ｔＲＮＡを生成するために突然変異誘発から除外されたヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造および配列における部位を説明する。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体によって標的化されるｍＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの未成熟停止コドンを含むことができる。従って、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、１つまたは複数の未成熟停止コドンのリードスルーを生じ、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させることは、疾患または状態を少なくとも一部、処置することを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＰＴＣリードスルーの約３０％～約９９％を回復させることができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＰＴＣリードスルーの約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約６５％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約６５％、約４５％～約７０％、約４５％～約７５％、約４５％～約８０％、約４５％～約８５％、約４５％～約９０％、約４５％～約９５％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、または約９０％～約９５％を回復させることができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＰＴＣリードスルーの約４０％を少なくとも回復させることができる。ある場合では、２つ以上の停止コドンは、同じ停止コドンであり得る。ある場合では、２つ以上の停止コドンは、異なる停止コドンであり得る。ある場合では、標的ｍＲＮＡが、同じ停止コドンである２つ以上の停止コドンを含有するとき、１つのタイプの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を使用して、全長ポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、標的ｍＲＮＡが、異なる停止コドンである２つ以上の停止コドンを含有するとき、１つより多くのタイプの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を使用して、全長ポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、標的ｍＲＮＡのノンセンス介在性減衰を低減するか、または防ぐことができる。

本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡを修飾して、操作されたｔＲＮＡ変異体を産生することができる。例えば、本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡは、参照ｔＲＮＡと比べて、修飾することができる。ある場合では、修飾は、ヌクレオチドの挿入または置換などの、操作されたｔＲＮＡの配列における突然変異であり得る。ある場合では、突然変異され得る配列は、ＤＮＡ配列、ｔＲＮＡ配列またはｔＲＮＡ前駆体配列であり得る。ある場合では、修飾は、操作されたｔＲＮＡの配列におけるヌクレオチドの化学修飾であり得る。化学修飾は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含むことができる。

参照ｔＲＮＡは、操作されたｔＲＮＡが、１つより多くの突然変異を有するように、野生型ｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡであり得る。これに関して、野生型ｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡは、「骨格」または「親」ｔＲＮＡとして言及することができる。

突然変異は、アクセプターステム、アンチコドンステム、Ｄループ、Ｄステム、およびＴループ、Ｔステム、または本開示の操作されたｔＲＮＡ変異体を産生するための可変領域もしくはループを含むが、これらに限定されない、操作されたｔＲＮＡの任意の領域において成すことができる。例えば、ワトソン・クリック塩基対形成を増加させるための、アクセプターステムおよびアンチコドンステムにおけるヌクレオチドの置換は、操作されたｔＲＮＡのアクセプターおよびアンチコドンステムを安定化することができる。本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡへの突然変異の非限定的な例が、表２に提供される。

表２. 操作されたtRNA変異体を産生するための操作されたtRNAの代表的な突然変異

*N>N'は、Nが、N'に置換され得ることを意味する。N>N'に先行する数字は、操作されたtRNAをコードするDNA配列に関して、ヌクレオチド位置を示す。

チミン（「Ｔ」）は、ＤＮＡの文脈でのみ存在することができ、ｔＲＮＡ配列に関するとき、ウラシル（「Ｕ」）に言及することは理解されるべきである。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体が、本明細書に開示される。操作されたｔＲＮＡ変異体は、Ｔループ、Ｔステム、Ｄループ、Ｄステム、可変ループ、アンチコドンステム、またはアンチコドンループにおける突然変異を含むことができる。突然変異は、配列番号３～２２または１０３～１２２のいずれか１つの核酸配列と比べてであり得る。一部の実施形態では、突然変異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の突然変異、または前述の数の突然変異のいずれか２つによって定義される範囲の突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、または１３個以下、１４個以下、または１５個以下の突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔループ、Ｔステム、Ｄループ、Ｄステム、可変ループ、アンチコドンステム、アンチコドンループ、またはその組合せにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、可変ループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、アンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、アンチコドンループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＴループおよびＴステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＴループおよびＤループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＴループおよびＤステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔループおよび可変ループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔループおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔループおよびアンチコドンループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＴステムおよびＤループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＴステムおよびＤステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔステムおよび可変ループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｔステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、ＤループおよびＤステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄループおよび可変ループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄループおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄループおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄループおよび可変ループにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｄステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、アンチコドンステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、突然変異は、アンチコドンステムおよびアンチコドンステムにおける突然変異を含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３に関して、７２Ｃ、２Ｇ、７１Ｃ、６Ｇ、６７Ｃ、６４Ｇ、１３Ｃ、２２Ｇ、１５Ｇ、２８Ｃ、４２Ｇ、３１Ａ、３９Ｔ、３７Ｇ、４４Ａ、もしくは５０Ｃ、またはそれらの任意の組合せを含むことができる操作されたｔＲＮＡ変異体の変異体であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、７２Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、７１Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６７Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６４Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、１３Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２２Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡは、１５Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２８Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４２Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、３１Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、３９Ｔを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、３７Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４４Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、５０Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３に対して約７０％～約１００％の配列同一性を有することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３、２４、２５、２５、２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体の１つを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３、２４、２５、２５、２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体に対して約７０％～約１００％の配列同一性を有することができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６の配列と比べて、２Ｃ、６Ｔ、６５Ｃ、７１Ｇ、７１Ｃ、６Ａ、２３Ｇ、２８Ｃ、６７Ａ、５０Ｔ、４Ｃ、６７Ｔ、２７Ｃ、４２Ｇ、４９Ｇ、６４Ａ、６９Ｇ、１２Ｃ、４３Ｇ、４０Ｃ、３１Ｃ、３９Ｇ、４４Ｇもしくは４６Ａ、またはそれらの任意の組合せを含む操作されたｔＲＮＡＴＣＴ１の変異体であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６Ｔを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６５Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、７１Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４６Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、７１Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２３Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２８Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６７Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、５０Ｔを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６７Ｔを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、２７Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４２Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４９Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６４Ａを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、６９Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、１２Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４３Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４０Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、３１Ｃを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、３９Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、４４Ｇを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６の配列に対して約７０％～約１００％の配列同一性を有することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３５～４８の配列のうちの１つを含む。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３、配列番号３２、配列番号６、または配列番号４５から選択される配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３、配列番号３２、配列番号６、または配列番号４５、ならびに配列番号１および２を含む。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号４５を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３５～４８の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体のいずれかに対して約７０％～約１００％の配列同一性を有することができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３５～４８の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体のいずれかと比較して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有することができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上のアミノ酸置換を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下のアミノ酸置換を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、アンチコドンにおける置換を含まない。ある場合では、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体が、表３において提供され得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体に、配列番号１の配列を含む５’末端配列および／または配列番号２の配列を含む３’末端配列が隣接することができる。一部の実施形態では、５’末端配列は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体のリーダー配列であり得る。一部の実施形態では、３’末端配列は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体のポリ－Ｔ終結シグナルおよびトレーラー配列であり得る。

表３. tRNA配列

一部の実施形態は、ＤＮＡ配列（例えば、配列番号１～４８のいずれか）を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、類似のＲＮＡ配列（例えば、配列番号１０１～１４８のいずれか）と互換可能であり得る。一部の実施形態は、ＲＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、類似のＤＮＡ配列で互換可能であり得る。一部の実施形態では、ＵおよびＴは、本明細書において提供される配列において互換することができる。一部の実施形態は、表３において提供されるＤＮＡ配列などのＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、表３における対応するＲＮＡ配列などの、本明細書において提供される類似のＲＮＡ配列と互換可能であり得る。一部の実施形態は、表３において提供されるＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、表３における対応するＤＮＡ配列などの、本明細書において提供される類似のＤＮＡ配列と互換可能であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡは、表３において提供されるＤＮＡ配列を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡは、表３において提供されるＲＮＡ配列を有する。一般的に、ＵおよびＴは、配列間で互換されることができ、依然として、本明細書に記載される方法および組成物に有用であり得る。操作されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ配列を記載する一部の実施形態は、表３におけるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ配列を記載する一部の実施形態は、表３におけるＤＮＡ配列を含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ配列を記載する一部の実施形態は、表３におけるＲＮＡ配列を含むことができる。ある場合では、配列番号１～４８のいずれかへの言及は、配列番号１０１～１４８内の対応する配列への言及を含むことができるか、または逆も真なりであり得る。ある場合では、表３のＤＮＡ配列を含む操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体に対して本明細書でなされる言及は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＲＮＡ配列を含むｔＲＮＡを含むことができる。

一部の実施形態では、Ａは、アデノシンを含む核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、Ａは、リボースまたはデオキシリボース、およびアデノシンを含むヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、Ａは、リン酸塩、リボースまたはデオキシリボース、およびアデノシンを含むヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、Ｔは、チミンを含む核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、Ｔは、リボースまたはデオキシリボース、およびチミンを含むヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、Ｔは、リン酸塩、リボースまたはデオキシリボース、およびチミンを含むヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、Ｕは、ウラシルを含む核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、Ｕは、リボースまたはデオキシリボース、およびウラシルを含むヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、Ｕは、リン酸塩、リボースまたはデオキシリボース、およびウラシルを含むヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、Ｃは、シトシンを含む核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、Ｃは、リボースまたはデオキシリボース、およびシトシンを含むヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、Ｃは、リン酸塩、リボースまたはデオキシリボース、およびシトシンを含むヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、Ｇは、グアニンを含む核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、Ｇは、リボースまたはデオキシリボース、およびグアニンを含むヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、Ｇは、リン酸塩、リボースまたはデオキシリボース、およびグアニンを含むヌクレオチドであり得る。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の配列のいずれかに対して、約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、約７０％～約８０％、８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、多くて約９９％、９８％、９７％、６９％、５９％、９４％、９３％、９２％、９１％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％以下であり得る。例えば、配列番号４の配列を含む操作されたｔＲＮＡは、配列番号３に対して約９８．６％の配列同一性を有することができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される、配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、または１２２の配列のいずれかに対して、約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、または１２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、約７０％～約８０％、８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、または１２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、または１２２の配列のいずれかの間の配列同一性は、多くて約９９％、９８％、９７％、６９％、５９％、９４％、９３％、９２％、９１％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％以下であり得る。例えば、配列番号１０４の配列を含む操作されたｔＲＮＡは、配列番号１０３に対して約９８．６％の配列同一性を有することができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される、配列番号３、４、５、または６の配列のいずれかに対して、約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、または６の配列のいずれかの間の配列同一性は、約７０％～約８０％、８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、または６の配列のいずれかの間の配列同一性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり得る。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、４、５、または６の配列のいずれかの間の配列同一性は、多くて約９９％、９８％、９７％、６９％、５９％、９４％、９３％、９２％、９１％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％以下であり得る。例えば、配列番号３５の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６の配列に対して約９７％の配列同一性を含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３、６、７、３２、または４５の配列のいずれかと約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡと配列番号３、６、７、３２、または４５の配列のいずれかとの間の配列同一性は、約７０％～約８０％、８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％であり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、本明細書に開示される操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列に対して約７０％～約１００％の同一性を有する配列を含むことができる（例えば、表３で開示される配列を含む）。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、１００％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、７５％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、８０％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、８５％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９０％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９１％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９２％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９３％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９４％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９５％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９６％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９７％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９８％以下の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列と比較して、９９％以下の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。ｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、表３の配列であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１を含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１または１０１、および配列番号３～４８のいずれかを含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１または１０１、および配列番号１０３～１４８のいずれかを含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２を含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２に加えて、配列番号３～４８のいずれかを含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１０２に加えて、配列番号１０３～１４８のいずれかを含むことができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１、配列番号３～４８のいずれか、および配列番号２を含むか、またはからなることができる。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１０１、配列番号１０３～１４８のいずれか、および配列番号１０２を含むか、またはからなることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号２８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異
体配列は、配列番号２９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号３９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号４８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０４含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１０９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１１９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１２９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３８を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１３９を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４０を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４１を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４２を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４３を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４４を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４５を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４６を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４７を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列は、配列番号１４８を含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号１０３の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３または１０３の配列と比較して１００％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものである。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３または１０３のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号１３２の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号３２または１３２の配列と比較して１００％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号３２または１３２のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号１０６の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号６または１０６の配列と比較して１００％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号６または１０６のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号１４５の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号４５または１４５の配列と比較して１００％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号４５または１４５のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号１０７の配列に対して約７０％～約９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも７５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９１％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９２％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９３％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９４％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、配列番号７または１０７の配列と比較して１００％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの範囲（例えば、長さの７０～１００％）にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの７０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの７５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの８０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの８５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの９０％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの９５％の範囲にわたるものであり得る。一部の実施形態では、％同一性は、配列番号７または１０７のヌクレオチドの長さの１００％の範囲にわたるものであり得る。

本明細書に記載される修飾を含む操作されたｔＲＮＡ変異体は、ある場合では、対応する親ｔＲＮＡと比較して、改善された抑制効率を示すことができる。ある場合では、抑制効率は、対応する親ｔＲＮＡについての抑制効率より約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％以上であり得る。ある場合では、抑制効率は、対応する親ｔＲＮＡについての抑制効率より約１％～約３０％、約２％～約２９％、約３％～約２８％、約４％～約２７％、約５％～約２６％、約６％～約２５％、約７％～約２４％、約８％～約２３％、約９％～約２２％、約１０％～約２１％、約１１％～約２０％、約１２％～約１９％、約１３％～約１８％、約１４％～約１７％、または約１５％～約１６％以上であり得る。

ある場合では、本明細書に記載される修飾を含む操作されたｔＲＮＡ変異体は、対応する親ｔＲＮＡの安定性と比較して、より良好な安定性を示すことができる。Ｃ－Ｇ結合は、Ａ－Ｔ結合または非ワトソン・クリック結合より強力であり得るため、Ａ－Ｔまたは非ワトソン・クリックの代わりに、塩基対をＣ－Ｇに変更することは、操作されたｔＲＮＡに対する安定化効果を少なくとも有することができる。安定性は、例えば、熱力学的安定性または操作されたｔＲＮＡの分解からの遮蔽に関して、異なる方法で測定することができる。塩基対をＧ－Ｃ結合に変更することは、熱力学的ならびに分解遮蔽を少なくとももたらすことができ、それ故、操作されたｔＲＮＡを分解から安定化することを測定する案は現在ない。

一部の実施形態は、配列番号３～２２のいずれかに提供される配列に関して、１つまたは複数の突然変異を含む操作されたｔＲＮＡ変異体を含む組成物を含む。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号２３～配列番号４８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むことができる。一部の実施形態は、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる組成物を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３～２２のいずれかに提供される配列を含む参照ｔＲＮＡと比較して、操作されたｔＲＮＡの配列において１つまたは複数の突然変異を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換して、実質的に全長のポリペプチドを産生することができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも７５％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも８０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも８５％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも９０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６と少なくとも９５％同一であり得る配列を含むことができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６の配列の、２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９、または７１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号１０６の配列の２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９、または７１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または０６の６位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の１２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の２３位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の２７位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の２８位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の３１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の３９位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４０位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４３位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４４位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４６位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の４９位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の５０位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の６４位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の６５位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の６７位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の６９位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号６または１０６の７１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では。一部の実施形態では、４位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、６位での置換は、Ｔへの置換であり得る。一部の実施形態では、６位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、１２位での置換は、Ｃへのものであり得る。一部の実施形態では、２３位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、２７位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、３１位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、３９位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、４０位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、４２位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、４３位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、４４位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、４６位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、４９位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、５０位での置換は、Ｔへの置換であり得る。一部の実施形態では、６４位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、６５位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、６７位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、６７位での置換は、Ｔへの置換であり得る。一部の実施形態では、６９位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、７１位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換（複数可）を除いて、配列番号６または１０６と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号６に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示すことができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも７５％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも８０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも８５％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも９０％同一であり得る配列を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３と少なくとも９５％同一であり得る配列を含むことができる。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の２、６、１３、１５、２２、２８、３１、３７、３９、４２、４４、５０、６４、６７、７１、または７２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の６位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の１３位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の１５位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の２２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の２８位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の３１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の３７位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の３９位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の４２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の４４位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の５０位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の６４位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の６７位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の７１位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号３または１０３の７２位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、２位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、６位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、１３位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、１５位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、２２位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、２８位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、３１位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、３７位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、３９位での置換は、Ｔへの置換であり得る。一部の実施形態では、４２位での置換は、Ｇへのものであり得る。一部の実施形態では、４４位での置換は、Ａへの置換であり得る。一部の実施形態では、５０位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、６４位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、６７位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、７１位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、７２位での置換は、Ｃへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含む。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換（複数可）を除いて、配列番号３または配列番号１０３と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号３または配列番号１０３に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、配列番号５と少なくとも７０％同一であり得る配列を含むことができ、配列番号５の７３位に置換を含むことができる。一部の実施形態では、７３位での置換は、Ｇへの置換であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、複数の置換を含むことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体の配列は、置換を除いて、配列番号５と同一であり得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、代理測定、半減期測定、アミノ酸荷電効率測定、または合成酵素もしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定される、配列番号５において提供される配列を含む同等なｔＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を示すことができる。

一部の実施形態では、安定性の増加を示す操作されたｔＲＮＡ変異体を含む組成物が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、安定性の増加は、増加した熱力学的安定性を含むことができる。

追加のＲＮＡ編集システム
一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を使用した停止コドンリードスルーは、核酸編集技術によって達成することができる。例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓベースのシステムを使用して、ｍＲＮＡをコードする遺伝子を編集して、未成熟停止コドンを除去することができる。ある場合では、ＲＮＡ編集システムを使用して、ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを直接編集することができる。

ＲＮＡ編集システムは、（ｉ）動員領域および／または（ｉｉ）標的化領域を含むことができる操作されたポリヌクレオチド配列を含むことができる。このようなポリヌクレオチド配列は、例えば、動員領域の少なくとも一部を介して、ＲＮＡ編集実体を動員することができる。ある場合では、ＲＮＡ編集システムは、動員領域を含まなくてもよい。編集実体は、操作されたポリヌクレオチド配列および標的ｍＲＮＡと接触されたとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換することができる。

本明細書に記載されるＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む、ＡＤＡＲ（ＡＤＡＲ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０３によってコードされる）などの、２本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼを含むことができる。編集実体は、ＡＰＯＢＥＣサブユニットＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２００３１５）、Ｂ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９５８２）、Ｃ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２７３５０）、Ｄ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４０５６４）、Ｈ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１６４６６８）などの、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵素（ＡＰＯＢＥＣ）を含むことができる。ＲＮＡ編集実体は、内在性であり得る。ＲＮＡ編集実体は、ＲＮＡ編集システムの一部として外因性にデリバリーすることができる。

ある場合では、未成熟停止コドンのセンスコドンへの変更は、未成熟停止コドンのセンスコドンへの編集の効率で行うことができる。ＲＮＡ編集の効率は、ポリペプチドをコードする未成熟停止コドンを含む２つの同等の細胞または細胞株の全長ポリペプチドの量を比較することによって決定することができる。１つの細胞または細胞株は、ＲＮＡ編集システムを含むことができ、一方、他の細胞または細胞株は、ＲＮＡ編集システムを有さなくてもよい。２つの細胞間の全長ポリペプチドの量の比較を決定することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接または間接的に導入すること（例えば、トランスフェクトすること）、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチド（例えば、動員領域および／または標的化領域を有するポリヌクレオチド）を初代細胞株に直接または間接的に導入すること（例えば、トランスフェクトすること）、ならびに（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを配列決定することを含む、インビトロアッセイにおいて決定することができる。ある場合では、標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすることは、標的ＲＮＡをコードするプラスミドを初代細胞株にトランスフェクトすることを含むことができる。ある場合では、操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクトすることは、操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を初代細胞株にトランスフェクトすることを含むことができる。ある場合では、標的ＲＮＡが、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換されることを含むことができた後、配列決定は、標的ＲＮＡのサンガー配列決定を含むことができる。

ある場合では、ＲＮＡ編集の効率は、ＲＮＡ編集のインビボ効率を含むことができる。ある場合では、ＲＮＡ編集のインビボ効率は、疾患または状態を少なくとも一部処置することによって決定することができる。例えば、ＲＮＡ編集のインビボ効率は、聴く能力を少なくとも一部改善すること、見る能力を少なくとも一部改善すること、運動能力、認知能力またはそれらの任意の組合せを少なくとも一部改善することによって測定することができる。ある場合では、ＲＮＡ編集の効率は、ＲＮＡ編集のインビトロ効率を含むことができる。

ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約１％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約１０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約２０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約３０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約４０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約５０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約６０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約７０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約７５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約８０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約８５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約９０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約９５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約２０％～約４０％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約２０％～６０％であり得る。ＲＮＡ編集のインビボ効率は、約１０％～７０％であり得る。

ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約１％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約１０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約２０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約３０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約４０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約５０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約６０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約７０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約７５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約８０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約８５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約９０％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約９５％～１００％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約２０％～約４０％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約２０％～６０％であり得る。ＲＮＡ編集のインビトロ効率は、約１０％～７０％であり得る。

操作されたｔＲＮＡおよびその変異体ならびにｔＲＮＡ前駆体をコードするベクター
一部の実施形態では、ベクターは、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡ前駆体もしくはその変異体をコードすることができる。一部の実施形態では、組成物は、ベクターを含むことができる。ある場合では、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡ前駆体もしくはその変異体をコードするベクターは、対象に投与することができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、ベクターは、２本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡなどの、ＤＮＡを含むことができる。ベクターは、ＲＮＡを含むことができる。ベクターは、組換えベクターを含むことができる。ある場合では、ベクターは、天然に存在するベクターから修飾することができる。ベクターは、２本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡなどの、ＤＮＡを含むことができる。ベクターは、ＲＮＡを含むことができる。ある場合では、ＲＮＡは、塩基修飾を含むことができる。ベクターは、組換えベクターを含むことができる。ベクターは、天然に存在するベクターから修飾することができるベクターであり得る。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部を含むことができる。任意のベクターを利用することができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、ベクターは、ＡＡＶベクターを含むことができる。ベクターを修飾して、修飾されたＶＰ１タンパク質（例えば、ＶＰ１タンパク質を含むよう修飾されたＡＡＶベクター）を含むことができる。態様では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）において見られる実質的に類似のキャプシド配列および構造からなり得る。しかしながら、ｒＡＡＶは、ＡＡＶタンパク質－コード配列が実質的に欠けており、それらの場所で設計された、対象ポリペプチドなどの、治療遺伝子発現カセットを有するゲノムをキャプシド形成する。ある場合では、ウイルス起源の配列は、ＩＴＲであり得、ベクター産生中に、ゲノム複製およびパッケージングをガイドする必要があり得る。適当なＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型または血清型の組合せから選択することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのいずれか１つであり得る。ある場合では、ベクターは、その天然の指向性に基づき、選択することができる。ある場合では、ベクター血清型は、血液脳関門を通過するその能力に基づき、選択することができる。ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０は、血液脳関門を通過して、ニューロンおよびグリアを形質導入することが示されている。態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり得る。ある場合では、ＡＡＶベクターは、少なくとも２つの血清型のキメラであり得る。態様では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ２およびＡＡＶ５であり得る。ある場合では、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のｒｅｐおよびＩＴＲ配列ならびにＡＡＶ５由来のｃａｐ配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補的であることができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、逆位末端反復を含むことができる。他の場合では、ＡＡＶベクターは、自己相補的逆位末端反復（ｓｃＩＴＲ）配列を含むことができる。ある場合では、ｒｅｐ、ｃａｐ、およびＩＴＲ配列は混合され、本明細書において提供される異なるＡＡＶ血清型の全てと一致し得る。ある場合では、適当なＡＡＶベクターは、例えば、キャプシドまたはｒｅｐタンパク質における修飾を包含するようさらに修飾することができる。修飾はまた、欠損、挿入、突然変異、およびその組合せを含むことができる。ある場合では、ベクターに対する修飾を、免疫原性を低減するよう行って、反復投与を可能にすることができる。ある場合では、反復投与が、免疫原性を低減し、および／または除去するために行い得るとき、利用することができるベクターの血清型は、変更することができる。

ベクターを利用して、核酸をデリバリーすることができる。ベクターは、２本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡなどの、ＤＮＡを含むことができる。ベクターは、ＲＮＡを含むことができる。ある場合では、ＲＮＡは、塩基修飾を含むことができる。ベクターは、組み換えベクターを含むことができる。ベクターは、天然に存在するベクターから修飾することができるベクターであり得る。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部を含むことができる。任意のベクターを利用することができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、ベクターは、ＡＡＶベクターを含むことができる。ベクターは、１本鎖骨格（例えば、図２２Ａに示されるウイルス骨格）を含むことができる。ある場合では、ベクターは、自己相補的領域（例えば、図２２Ｂに示されるウイルス骨格）を含むことができる骨格を含むことができる。ベクターを修飾して、修飾されたＶＰ１タンパク質（例えば、ＶＰ１タンパク質を含むよう修飾されたＡＡＶベクター）を含むことができる。態様では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）において見られる実質的に類似のキャプシド配列および構造からなり得る。しかしながら、ｒＡＡＶは、ＡＡＶタンパク質－コード配列が実質的に欠けており、それらの場所で設計された、対象ポリペプチドなどの、治療遺伝子発現カセットを有するゲノムをキャプシド形成する。ある場合では、ウイルス起源の配列は、ＩＴＲであり得、ベクター産生中に、ゲノム複製およびパッケージングをガイドする必要があり得る。適当なＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型または血清型の組合せから選択することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのいずれか１つであり得る。ある場合では、ベクターは、その天然の指向性に基づき、選択することができる。ある場合では、ベクター血清型は、血液脳関門を通過するその能力に基づき、選択することができる。ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０は、血液脳関門を通過して、ニューロンおよびグリアを形質導入することが示されている。態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり得る。ある場合では、ＡＡＶベクターは、少なくとも２つの血清型のキメラであり得る。態様では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ２およびＡＡＶ５であり得る。ある場合では、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のｒｅｐおよびＩＴＲ配列ならびにＡＡＶ５由来のｃａｐ配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補的であることができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、逆位末端反復を含むことができる。他の場合では、ＡＡＶベクターは、自己相補的逆位末端反復（ｓｃＩＴＲ）配列を含むことができる。ある場合では、ｒｅｐ、ｃａｐ、およびＩＴＲ配列は混合され、本明細書において提供される異なるＡＡＶ血清型の全てと一致し得る。ある場合では、適当なＡＡＶベクターは、例えば、キャプシドまたはｒｅｐタンパク質における修飾を包含するようさらに修飾することができる。修飾はまた、欠損、挿入、突然変異、およびその組合せを含むことができる。ある場合では、ベクターに対する修飾を、免疫原性を低減するよう行って、反復投与を可能にすることができる。ある場合では、反復投与が、免疫原性を低減し、および／または除去するために行い得るとき、利用することができるベクターの血清型は、変更することができる。

ある場合では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２を含む血清型、またはＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－レトロ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＳもしくはＡＡＶ－２ｉ８を含むシュードタイプを有するＡＡＶ由来のものであることができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含むことができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。ある場合では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターであり得る。

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム１つ当たり操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２～６つのコピーを含むことができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、操作されたｔＲＮＡ、操作されたｔＲＮＡ変異体、またはその組合せを含むことができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム１つ当たり１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、または２～１０のコピーを含むことができる。ある場合では、ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム１つ当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のコピーを含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム１つ当たり１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０のコピーを含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするベクター、または両方は、デリバリーシステムに存在することができる。ある場合では、デリバリーシステムは、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、またはそれらの任意の組合せに存在し得る。ある場合では、ベクターは、ポリペプチドコート内部に存在し得る。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、操作されたｔＲＮＡ前駆体もしくはその変異体、または両方は、医薬組成物などの組成物において含まれ得る。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするベクター、操作されたｔＲＮＡ前駆体もしくはその変異体をコードするベクター、またはそれらの任意の組合せは、医薬組成物などの組成物において含まれ得る。ある場合では、組成物は、賦形剤、希釈剤または担体を含むことができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、単位用量形態または複数用量形態であることができる。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、単位用量形態であることができる。本明細書で使用される、単位用量形態は、ヒトまたは非ヒト対象（例えば、動物）への投与に適した物理的離散単位を指すことができる。ある場合では、単位用量形態は、個別にパッケージングすることができる。それぞれの単位用量は、医薬担体、希釈剤、賦形剤、またはそれらの任意の組合せと関連して所望の治療効果を生じるのに十分であり得る、予め決定された量の有効成分（複数可）を含有することができる。単位用量形態の例は、アンプル、シリンジ、および個別にパッケージングされた錠剤およびカプセル剤を含むことができる。ある場合では、単位用量形態は、使い捨てのシリンジにおいて含まれることができる。ある場合では、単位投薬形態は、その分画または倍数において投与されることができる。複数用量形態は、単一容器にパッケージングされた、複数の同一の単位用量形態であることができ、分離した単位用量形態において投与されることができる。複数用量形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含み得る。ある場合では、複数用量形態は、同じ医薬的に活性な薬剤を含むことができる。ある場合では、複数用量形態は、異なる医薬的に活性な薬剤を含むことができる。

本明細書に記載される組成物は、賦形剤を含むことができる。賦形剤は、幹細胞に加えることができるか、またはその供給源由来の幹細胞と同時に単離することができる。賦形剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはそれらの任意の組合せなどの、凍結保存剤を含むことができる。賦形剤は、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組合せなどの、凍結保存剤を含むことができる。賦形剤は、ｐＨ剤（例えば、組成物の成分の酸化もしくは分解を最小にするため）、安定化剤（例えば、組成物の成分の修飾もしくは分解を防ぐため）、緩衝化剤（例えば、温度安定性を増強するため）、可溶化剤（例えば、タンパク質溶解性を増加させるため）、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、酸化防止剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート８０、リン酸ナトリウム、スクロース、二リン酸ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート２０、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、ＨＣｌ、エデト酸２ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート８０、エチルアルコール、水、テプレノン、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。賦形剤は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association (1986)に記載される賦形剤であり得る。

本明細書に記載される組成物は、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどの、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性な、天然に生じるか、または天然に生じない担体を含むことができる。ある場合では、担体は、薬学的に許容される担体を含むことができる。担体はまた、医薬賦形剤ならびに添加剤であるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ならびに炭水化物（例えば、単糖、ジ－、トリ－、テトラ－オリゴ糖、およびオリゴ糖を含む、糖；アルジトール、アルドリン酸（ａｌｄｏｌｉｃａｃｉｄ）、エステル化糖などの誘導体化糖；ならびに多糖または糖ポリマー）を含み、１～９９．９９重量％または体積％を単独または組合せで含む、単独または組合せで存在することができる。代表的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどの血清アルブミンを含む。緩衝化能で機能することもできる、代表的なアミノ酸成分、抗体成分、または両方は、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを含む。本テクノロジーの範囲内の炭水化物賦形剤もまた、含むことができ、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの、二糖；ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの、多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールなどの、アルジトールを含むが、これらに限定されない。

組成物は、希釈剤を含むことができる。希釈剤の非限定的な例は、水、グリセロール、メタノール、エタノール、および他の類似の生体適合性希釈剤を含むことができる。ある場合では、希釈剤は、酢酸、クエン酸、マレイン酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸、または類似物などの水性酸であり得る。他の場合では、希釈剤は、炭酸カルシウムなどの炭酸アルカリ金属；リン酸カルシウムなどのリン酸アルカリ金属；硫酸カルシウムなどの硫酸アルカリ金属；セルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロースなどのセルロース誘導体；酸化マグネシウム、デキストリン、フルクトース、デキストロース、パルミトステアリン酸グリセリン、ラクチトール、コリン、ラクトース、マルトース、マンニトール、シメチコン、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、タルク、キシリトールならびに／あるいはその無水物、水和物および／もしくは薬学的に許容される誘導体、またはその組合せを含む群から選択することができる。

ある場合では、本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載される疾患または状態を予防するために投与することができる。例えば、本明細書に記載される組成物を予防的に投与して、疾患または状態の発生率を予防することができる。予防は、疾患または状態の１つまたは複数の症状の出現、発生、または発生率を少なくとも一部、低減することができる。

核酸が、本明細書に開示される。核酸は、図４６Ａ～４６Ｆまたは配列番号５２～５６のいずれかに記載されるプラスミドまたはベクターを含むことができる。核酸は、本明細書に記載されるＡＡＶなどのウイルスベクター内でデリバリーされるか、または封入されることができる。このような核酸のいずれかのいくつかのバージョンは、本明細書に記載される方法で使用することができる。例えば、核酸を含むＡＡＶは、投与することができる。

ガイドＲＮＡ
ガイドＲＮＡ設計
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの操作されたポリヌクレオチドが、本明細書に開示される。本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、ｇＲＮＡの製造または使用、例えば、ｇＲＮＡのそれを必要とする対象への投与を含む。

ｇＲＮＡの編集効率およびｇＲＮＡの編集効率を改善するための代表的なストラテジーに影響し得る様々なパラメーターが、図３１に示される。複数の操作されたｇＲＮＡは、例えば、ｇＲＮＡガイド長を変更すること、ｇＲＮＡにおけるバルジを導入すること（例えば、ｇＲＮＡにおいてＡ／Ｃミスマッチを入れること）、またはｇＲＮＡにおいてＧＬＵＲＤドメインを入れることによって、設計され、スクリーニングされることができる。代表的なｇＲＮＡ設計が、図３２に示される。

メディアムスループットスクリーニングアッセイを使用して、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｔＲＮＡ（例えば、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体）をスクリーニングすることができる。メディアムスループットスクリーニングは、機能獲得（例えば、ルシフェラーゼ獲得のシグナル）アッセイを含むことができる。図３３は、開始コドンが、下流ルシフェラーゼの産生を増加させることができるｔ－ＲＮＡを使用して、開始コドンを誤翻訳することによって減弱される、ルシフェラーゼ獲得の機能アッセイの例を示す。図３４は、代表的なｇＲＮＡ設計をスクリーニングするために行われた実験のいくつかの結果を示す。

動員配列が不存在である場合などの、ある場合では、操作されたポリヌクレオチドは、対象ＲＮＡ編集実体（例えば、ＡＤＡＲ）と関連して、標的ＲＮＡの編集を促進し、および／または対象標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節することができ得る。これは、構造特性を通じて達成することができる。構造特性は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化ＲＮＡ、化学修飾、またはそれらの任意の組合せのいずれか１つを含むことができる。態様では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質、例えば、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。本開示のｄｓＲＮＡ基質に存在し得る、いくつかの構造特性のうちの１つに対応し得る特性が、本明細書に記載される。特性の例は、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（非標的化ドメインを含む動員ヘアピンもしくはヘアピン）を含むことができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５０種の特性を有することができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０種の特性を有することができる。

本明細書に開示される、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質において２種以上の特性を含むことができる。

２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに形成することができる。本明細書に開示される、ミスマッチは、ｄｓＲＮＡ内の標的ＲＮＡにおける反対のヌクレオチドに対形成されない、ガイドＲＮＡにおけるヌクレオチドを指すことができる。ミスマッチは、塩基対形成しないか、相補的でなく、または両方でない、任意の２つのヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチであり得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡにおけるＡの反対の、本開示の操作されたガイドＲＮＡにおけるＣを含むことができる。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡにおけるＣの反対の、本開示の操作されたガイドＲＮＡにおけるＡを含むことができる。実施形態では、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡにおけるＧの反対の、本開示の操作されたガイドＲＮＡにおけるＧを含むことができる。一部の実施形態では、編集部位の５’に位置するミスマッチは、編集されるべき標的Ａの塩基フリッピングを促進することができる。ミスマッチはまた、配列特異性を与えるのを助けることができる。実施形態では、ミスマッチは、Ｇ／Ｇミスマッチを含むことができる。実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含むことができ、Ａは、標的ＲＮＡにあり、Ｃは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列にある。別の実施形態では、Ａ／ＣミスマッチにおけるＡは、対象ＲＮＡ編集実体によって編集される標的ＲＮＡにおけるヌクレオチドの塩基であり得る。

態様では、構造特性は、独立して、操作されたポリヌクレオチドにおいて形成することができる。他の場合では、構造特性は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡに結合したとき、形成することができる。構造特性はまた、操作されたポリヌクレオチドが、ペプチド、ヌクレオチド、または小分子などの他の分子と関連するとき、形成することができる。ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドの構造特性は、標的ＲＮＡと独立して、形成することができ、その構造は、標的ＲＮＡ領域との操作されたポリペプチドハイブリダイゼーションの結果として変更することができる。ある特定の実施形態では、構造特性は、操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡと関連したとき、存在する。

ある場合では、構造特性は、ヘアピンであり得るか、または含むことができる。ある場合では、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインが欠如し得る。他の場合では、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインまたは１つより多くのヘアピンドメインを含有することができる。ヘアピンは、ポリヌクレオチド中のどこにでも位置することができる。本明細書に開示される、ヘアピンは、ＲＮＡ二本鎖であり得、単一のＲＮＡ鎖自体をフォールディングして、ＲＮＡ二本鎖を形成することを含むことができる。単一のＲＮＡ鎖は、互いのフォールディング領域塩基対の上流および下流のヌクレオチド配列を有するため、それ自体がフォールディングされ得る。ヘアピンは、二本鎖構造全体の１０～５００ヌクレオチド長を有することができる。ヘアピンのステム－ループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかに存在することができる。本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１～１０のヘアピンを有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１つのヘアピンを有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、２つのヘアピンを有する。本明細書に開示される、ヘアピンは、動員ヘアピンまたはヘアピンまたは非動員ヘアピンを指すことができる。ヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチド内のどこにでも位置することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチドの３’末端に、本開示の操作されたポリヌクレオチドの５’末端に、もしくは本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内、またはそれらの任意の組合せに存在する。

一部の態様では、構造特性は、本明細書に開示される動員ヘアピンを含むことができる。動員ヘアピンは、ＡＤＡＲなどの、ＲＮＡ編集実体を動員することができる。一部の実施形態では、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインを含むことができる。

なお別の態様では、構造特性は、非動員ヘアピンを含むことができる。本明細書に開示される非動員ヘアピンは、操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの局在化を改善する機能性を示すことができる。一部の実施形態では、非動員ヘアピンは、核内繋留を改善する。一部の実施形態では、非動員ヘアピンは、Ｕ７ｓｎＲＮＡ由来のヘアピンを含むことができる。

別の態様では、構造特性は、ゆらぎ塩基を含むことができる。ゆらぎ塩基対は、弱く対形成する２つの塩基を指すことができる。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指すことができる。

本開示のヘアピンは、任意の長さのものであり得る。態様では、ヘアピンは、約５～２００以上のヌクレオチドであり得る。ある場合では、ヘアピンは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、または４００以上のヌクレオチドを含むことができる。他の場合では、ヘアピンはまた、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１１０、５～１２０、５～１３０、５～１４０、５～１５０、５～１６０、５～１７０、５～１８０、５～１９０、５～２００、５～２１０、５～２２０、５～２３０、５～２４０、５～２５０、５～２６０、５～２７０、５～２８０、５～２９０、５～３００、５～３１０、５～３２０、５～３３０、５～３４０、５～３５０、５～３６０、５～３７０、５～３８０、５～３９０、または５～４００ヌクレオチドを含むことができる。ヘアピンは、ヌクレオチドループによって分けられた２本鎖のハイブリダイズしたＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡモチーフ／構造にハイブリダイズするために、それ自体に対する十分な相補性を有するＲＮＡの単一鎖から形成される構造特性であることができる。

ある場合では、構造特性は、バルジであり得る。バルジは、標的鎖と操作されたポリヌクレオチド鎖の間に単一（意図的な）核酸ミスマッチを含むことができる。他の場合では、塩基のミスマッチした伸長であるバルジ領域が、ハイブリダイズした相補的ｄｓＲＮＡ領域を有する両側で隣接する場合、鎖間の１つより多くの連続ミスマッチは、バルジを構成する。バルジは、ポリヌクレオチドの任意の位置に位置することができる。ある場合では、バルジは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルから約３０～約７０ヌクレオチドに位置することができる。

一部の実施形態では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。本明細書に開示される、バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の形成の際に、形成される構造を指すことができ、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドは、反対鎖上のそれらの位置の対応物に相補的ではない。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の２次または３次構造を変更することができる。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１～４ヌクレオチドを有することができる。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、２つのバルジを有することができる。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、３つのバルジを有することができる。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、４つのバルジを有することができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質におけるバルジの存在は、標的ＲＮＡにおける標的Ａを選択的に編集し、非標的のオフターゲット編集を低減するために、ＡＤＡＲを位置付けることができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質におけるバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員することができる。本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ基質におけるバルジは、他のＲＮＡ編集実体などの、他のタンパク質を動員することができる。一部の実施形態では、編集部位の５’に位置するバルジは、編集されるべき標的Ａの塩基フリッピングを促進することができる。バルジはまた、配列特異性を与えるのを助けることができる。バルジは、標的Ａの選択的編集を生じる向きでそれを構成することによって、ＡＤＡＲ編集を指示することを助けることができる。

一部の態様では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。バルジは、対称バルジまたは非対称バルジであり得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれか上の１～４つの関与するヌクレオチドによって形成することができる。ある場合では、対称バルジは、同じ数のヌクレオチドが、バルジの各側に存在するとき、形成することができる。対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２～４ヌクレオチドを有することができる。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側上に同じ数のヌクレオチドを有することができる。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の２つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の３つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の４つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。

ある場合では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。バルジは、対称バルジまたは非対称バルジであり得る。ある場合では、非対称バルジは、異なる数のヌクレオチドが、バルジの各側に存在するとき、形成することができる。非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれか上の１～４つの関与するヌクレオチドによって形成することができる。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側および標的ＲＮＡ側上に異なる数のヌクレオチドを有することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の０ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の０ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の１つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の０のヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の０ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の０のヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の０ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の０のヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の０ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の１つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の１つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の１つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の２ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の２つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の２ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の３つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の３ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側上の４つのヌクレオチドによって形成することができる。ある場合では、構造特性は、ループである。

態様では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。本明細書に開示される、内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の形成の際に形成される構造を指すことができ、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドは、反対の鎖上のそれらの位置の対応物に相補的ではなく、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側または操作されたポリヌクレオチド側上のいずれかの内部ループの１つの側は、５つより多くのヌクレオチドを含むことができる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。編集部位の近くに存在する内部ループは、編集されるべき標的ＲＮＡにおける標的Ａの塩基フリッピングを助けることができる。ある場合では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。ある場合では、対称内部ループは、同じ数のヌクレオチドが、内部ループの各側に存在するとき、形成することができる。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側上に同じ数のヌクレオチドを有することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側上の１０つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。

態様では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に形成することができる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであり得る。ある場合では、非対称内部ループは、異なる数のヌクレオチドが、内部ループの各側に存在するとき、形成することができる。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側上に異なる数のヌクレオチドを有することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の５つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の６つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の７つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の８つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の８つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の９つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の１０のヌクレオチド内部ループによって形成することができる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側上の９つのヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側上の１０のヌクレオチドによって形成することができる。

バルジまたはループを含む構造特性は、任意のサイズのものであることができる。ある場合では、バルジまたはループは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基を少なくとも含むことができる。ある場合では、バルジまたはループは、合計約１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、または２０～３０塩基を少なくとも含むことができる。

ある場合では、構造特性は、構造化モチーフである。本明細書に開示される、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質において２種以上の構造特性を含むことができる。構造化モチーフは、正確な位置（複数可）においてＡＤＡＲ編集のための理想的な基質を生じるための、上記の請求項におけるなどの、構造特性の任意の組合せを含むことができる。これらの構造モチーフを人工的に操作して、ＡＤＡＲ編集を最大にすることができ、および／またはこれらの構造モチーフをモデル化して、公知のＡＤＡＲ基質を再現することができる。

ある場合では、構造特性は、少なくとも一部の環状化のポリヌクレオチドを含むことができる。ある場合では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、環状化されるか、または環状の配置にあることができる。一部の態様では、少なくとも一部の環状のポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルが欠如し得る。

ガイドＲＮＡスクリーニングおよび定量
複数のスクリーニングアッセイ、細胞株、および分析ツールを開発して、ｇＲＮＡまたはｔＲＮＡを含む様々なコンストラクトの効率をスクリーニングするか、または分析した。図３５は、代表的なスクリーニングアッセイ、細胞株、ならびに分析アッセイおよびツールを示す。ノックアウト（ＫＯ）細胞株が生成された。ある場合では、ＫＯ細胞株は、ＡＤＡＲ１を欠き得る。ある場合では、ＫＯ細胞株は、ＡＤＡＲ２が欠如する。ＡＤＡＲ１ＫＯ細胞株を生成するための欠損した領域および代表的なＡＤＡＲ１ＫＯ細胞株におけるタンパク質発現分析の例は、図３６に示される。ＡＤＡＲ２ＫＯ細胞株を生成するための欠損した領域および代表的なＡＤＡＲ２ＫＯ細胞株におけるｍＲＮＡレベルの例は、図３７に示される。ある場合では、ＡＤＡＲ１は、ＡＤＡＲ２ＫＯ細胞株に安定的に組換えることができる。ある場合では、ＡＤＡＲ２は、ＡＤＡＲ１ＫＯ細胞株に安定的に組換えることができる（例えば、図３８）。

ある場合では、テジタル液滴ＰＣＲを使用して、遺伝子発現、スプライス変異体、ｇＲＮＡ、編集の程度、変異体のコピー数などを定量する。テジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）プロセスの模式が、図３９に描かれる。ＰＣＲプライマーおよびプローブセットを設計するために使用されたｄｄＰＣＲを使用した代表的な分析が、図４０に示される。ある場合では、ｇＲＮＡの細胞発現は、例えば、ｄｄＰＣＲを使用することによって、アッセイを使用して定量される（ｇＲＮＡ^Ｑ）。ｄｄＰＣＲアッセイを設計して、ｇＲＮＡの末端（例えば、３’末端または５’末端）に位置し得る普遍的なタグを使用して、ｇＲＮＡの細胞発現を定量することができる（例えば、図４１）。図４２は、標的細胞へのトランスフェクション後のｇＲＮＡの高い細胞レベルの例を示す。ｇＲＮＡの細胞発現レベルの定量を使用して、細胞におけるＲＮＡ編集を分析することができる（例えば、ｇＲＮＡと編集効率の間の関係を確立する）。

ある場合では、ヘアピン構造をｇＲＮＡにおいて導入して、安定性を増加させる。代表的なｇＲＮＡコンストラクトおよびＨＥＫ２９３細胞におけるＲａｂ７ａの編集におけるそれらの効率は、図４３に示される。データは、Ｕ６＋２７ループのｇＲＮＡへの添加は、ＡＤＡＲ２の存在下での編集効率を増加させることができることを示唆する。ｇＲＮＡコンストラクトの他の例およびＨＥＫ２９３細胞におけるＲａｂ７ａの編集におけるそれらの効率は、図４４に示される。

ある場合では、合理的および半合理的なｇＲＮＡ設計は、ハイスループットスクリーニングと組み合わされる。図４５は、ハイスループットスクリーニング方法を用いたｇＲＮＡ設計の利用における代表的なアプローチを説明する。

ＩＩ．方法
デリバリー方法
ある場合では、本明細書に記載される組成物（例えば、医薬組成物）を投与して、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするベクターの、生物学的作用の所望の部位へのデリバリーを可能にすることができる。例えば、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする核酸は、ウイルスベクターに含まれることができ、静脈内投与によって投与されることができる。処置または療法を必要とする範囲への本明細書に開示される投与は、制限することを目的としないが、例えば、経口投与、局所投与、静脈内投与、吸入投与、またはそれらの任意の組合せによって達成することができる。一部の実施形態では、デリバリーは、注射、カテーテル法、胃瘻造設管投与、骨内投与、点眼、脳室内投与、耳投与、経皮投与、経口投与、直腸投与、鼻投与、膣内投与、空洞内投与、経尿道投与、舌下投与、頭蓋内注射、実質への頭蓋内注射、大槽内（ＩＣＭ）、脳室内（ＩＣＶ）またはその組合せを含むことができる。デリバリーは、身体の罹患した組織または領域への直接適用を含むことができる。ある場合では、局所投与は、ローション、溶液、エマルジョン、クリーム、バーム、オイル、ペースト、スティック、エアロゾル、泡沫、ゼリー、泡沫、マスク、パッド、粉末、固体、チンキ、バター、パッチ、ゲル、スプレー、点滴、液体製剤、皮膚などの、表面の外部表面への軟膏を投与することを含むことができる。一部の実施形態では、投与は、注射を含むことができる。一部の実施形態では、デリバリーは、注射を含むことができる。デリバリーは、くも膜下腔内注射、脳室内注射、または大槽内注射を含むことができる。本明細書において提供される組成物は、任意の方法によって投与することができる。投与の方法は、動脈内注射、大槽内注射、筋内注射、実質内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、くも膜下腔内注射、静脈注射、脳室内注射、定位注射、皮下注射、硬膜外、またはそれらの任意の組合せによるものであり得る。デリバリーは、非経口投与を含むことができる。非経口投与の例は、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することを含むことができる。ある場合では、デリバリーは、装置由来であり得る。ある場合では、デリバリーは、ポンプ、注入ポンプ、またはその組合せによって投与することができる。一部の実施形態では、デリバリーは、浣腸、点眼、鼻スプレー、またはそれらの任意の組合せによるものであり得る。ある場合では、対象は、監督の不存在下で組成物を投与することができる。ある場合では、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護師、医師のアシスタント、用務員、ホスピス労働者など）の監督下で組成物を投与することができる。一部の実施形態では、医療専門家は、組成物を投与することができる。

ある場合では、投与は、経口摂取であり得る。ある場合では、デリバリーは、カプセル剤または錠剤であり得る。経口摂取デリバリーは、お茶、エリキシル剤、食品、飲料、飲み物、シロップ、液体、ジェル、カプセル、錠剤、油、チンキ、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、食品は、医療用の食品であり得る。ある場合では、カプセル剤は、ヒドロキシメチルセルロースを含むことができる。一部の実施形態では、カプセル剤は、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、カプセル剤は、コーティング、例えば、腸内コーティングを含むことができる。一部の実施形態では、カプセル剤は、ヒプロメロースカプセル剤などのベジタリアン製品またはビーガン製品を含むことができる。一部の実施形態では、デリバリーは、吸入器、散布器、噴霧器、気化器、またはその組合せによる吸入を含むことができる。

ある場合では、組成物は、単一単位用量または分割単位用量として投与／適用することができる。ある場合では、本明細書に記載される組成物は、第１の時間ポイントおよび第２の時間ポイントで投与することができる。ある場合では、第１の投与が、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日、２日、４日、７日、２週間、４週間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１年以上の投与時間の差で、他の投与の前に投与することができるように、組成物は、投与することができる。

本明細書に開示される組成物の投与または適用は、少なくとも約少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００日の連続または非連続の日数の処置持続時間行うことができる。ある場合では、処置持続時間は、約１～約３０日間、約２～約３０日間、約３～約３０日間、約４～約３０日間、約５～約３０日間、約６～約３０日間、約７～約３０日間、約８～約３０日間、約９～約３０日間、約１０～約３０日間、約１１～約３０日間、約１２～約３０日間、約１３～約３０日間、約１４～約３０日間、約１５～約３０日間、約１６～約３０日間、約１７～約３０日間、約１８～約３０日間、約１９～約３０日間、約２０～約３０日間、約２１～約３０日間、約２２～約３０日間、約２３～約３０日間、約２４～約３０日間、約２５～約３０日間、約２６～約３０日間、約２７～約３０日間、約２８～約３０日間、または約２９～約３０日間であり得る。

本明細書に開示される組成物の投与または適用は、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約６年間、少なくとも約７年間、少なくとも約８年間、少なくとも約９年間、少なくとも約１０年間、少なくとも約１５年間、少なくとも約２０年間以上の処置持続時間行うことができる。投与は、対象の生涯の間１カ月に１回または１年に１回などの、対象の生涯に渡り繰り返し行うことができる。投与は、少なくとも約１年間、５年間、１０年間、１５年間、２０年間、２５年間、３０年間以上の間、１カ月に１回または１年に１回などの、対象の人生の実質的な部分に渡り繰り返し行うことができる。

本明細書に開示される組成物の投与または適用は、１日に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４回行うことができる。ある場合では、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１回行うことができる。ある場合では、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、１カ月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０回投与することができる。

ある場合では、対象は、疾患の診断を受けていてもよい。ある場合では、対象は、疾患の診断を受けていなくてもよい。診断は、１つまたは複数の症状、またはそれらの任意の組合せに基づく臨床診断である、血液検査を含むことができる。診断（血液検査など）は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける突然変異（例えば、未成熟停止コドン）の存在または不存在を確かにすることができる。ある場合では、診断検査は、対象由来の生物学的試料を配列決定（例えば、サンガーの配列決定または合成による配列決定）することを含むことができる。ｍＲＮＡの一部における突然変異の存在または不存在は、複数の突然変異（約１～約２００個の突然変異など）を含むことができる。臨床診断は、１つまたは複数の症状に基づくことができる。症状は、失語症、手の意図的な使用の喪失、不随意な手の運動、運動性の喪失、歩行障害、筋緊張の喪失、けいれん、脊柱側弯、睡眠障害、成長速度の遅延、呼吸の問題、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、症状は、聴力の喪失、会話および音の消音、単語の理解が困難、一定の聴覚が困難、視力喪失、視野欠損、視野の混濁、霧視、目の不快またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、症状は、咳、痰を伴う咳、息切れ、脂肪便、脂っこい便、不妊、体重減少、塩っぽい皮膚、呼吸困難またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターの使用が、本明細書に開示される。ウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡを含むウイルスゲノムを含むことができる。ウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡ変異体を含むウイルスゲノムを含むことができる。ウイルスベクターは、本明細書に記載されるコンストラクトを含むウイルスゲノムを含むことができる。ある場合では、方法は、ウイルスベクターを投与することを含むことができる。

一部の実施形態では、少なくとも１×１０^３ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^４ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^５ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^６ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^７ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^８ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^９ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１０ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１１ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１２ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１３ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１４ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１５ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１６ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１７ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１８ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^１９ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、少なくとも１×１０^２０ウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^３以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^４以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^５以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^６以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^７以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^８以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^９以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１０以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１１以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１２以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１３以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１４以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１５以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１６以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１７以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１８以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１９以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^２０以下のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１２～１×１０^１５のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１１～１×１０^１６のウイルスゲノムが、投与される。一部の実施形態では、１×１０^１０～１×１０^１７のウイルスゲノムが、投与される。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含む組成物が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体を含む組成物が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物を含むことができる。医薬組成物は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含むことができる。医薬組成物は、操作されたｔＲＮＡ変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含むことができる。医薬組成物は、用量単位形態であり得る。

処置方法
疾患、障害または状態を処置する方法が、本明細書において提供される。疾患、障害または状態を予防する方法が、本明細書において提供される。疾患もしくは障害の処置方法、または疾患もしくは障害の予防方法が、本明細書において提供される。

所望のアミノ酸の代わりに、未成熟停止コドンをコードするｍＲＮＡ配列における突然変異と関連し得る疾患、障害または状態を処置する方法が、本明細書において提供される。ある場合では、停止コドンは、オパール（ＴＧＡ；ＵＧＡ）、オーカー（ＴＡＡ；ＵＡＡ）、またはアンバー（ＴＡＧ；ＵＡＧ）停止コドンであり得る。ある場合では、ｍＲＮＡ配列における疾患を引き起こす突然変異は、Ａｒｇ（例えば、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、またはＡＡＧ）をコードするコドンの場所に、オパール停止コドン（ＴＧＡ；ＵＧＡ）を含むことができる。ある場合では、ｍＲＮＡ配列における疾患を引き起こす突然変異は、グルタミン（例えば、ＣＣＡ、ＣＡＧ）をコードするコドンの場所に、オーカー（ＴＡＡ；ＵＡＡ）またはオーカー（ＴＡＧ；ＵＡＧ）停止コドンを含むことができる。ある場合では、未成熟停止コドンは、切断されたバージョンのポリペプチドまたはタンパク質をもたらす。ある場合では、疾患、障害、または状態は、増加したレベルの切断されたバージョンのポリペプチド、または減少したレベルの実質的に全長のポリペプチドによって引き起こされ得る。

例えば、レット症候群は、ＭｅＣＰ２のポリペプチド配列におけるＡｒｇから停止への突然変異により引き起こされ得る。健康な個体において、ＭｅＣＰ２タンパク質は、配列番号４９に関して、または配列番号５０に関して、アミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６および４５３位にアルギニン（Ａｒｇ）を含有する。レット症候群の患者において、アミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６および４５３位でのＭｅＣＰ２タンパク質の翻訳の未成熟な終結を引き起こす、ＭｅＣＰ２タンパク質における突然変異は、ＭｅＣＰ２の機能の喪失を引き起こし、レットを引き起こす突然変異の２５％より多くを合わせて占める。ＭＥＣＰ２におけるアルギニン（Ａｒｇ）は、Ｒ８（アイソフォーム２についてのみ）、Ｒ９（アイソフォーム１についてのみ）、Ｒ８４、Ｒ８５、Ｒ８９、Ｒ９１、Ｒ１０６、Ｒ１１１、Ｒ１１５、Ｒ１３３、Ｒ１６２、Ｒ１６７、Ｒ１８８、Ｒ１９０、Ｒ２１１、Ｒ２５０、Ｒ２５３、Ｒ２６８、Ｒ３０６、Ｒ３０９、Ｒ３４４、Ｒ３５４、Ｒ４２０、Ｒ４５８、Ｒ４６８、Ｒ４７１、Ｒ４７８、およびＲ４８４位においても見られる。本開示は、Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０Ｘ、Ｒ２９４Ｘ、Ｒ１９８Ｘ、Ｒ１８６Ｘ、Ｒ４５３Ｘ、Ｒ８Ｘ（アイソフォーム２中）、Ｒ９Ｘ（アイソフォーム１中）、Ｒ８４Ｘ、Ｒ８５Ｘ、Ｒ８９Ｘ、Ｒ９１Ｘ、Ｒ１０６Ｘ、Ｒ１１１Ｘ、Ｒ１１５Ｘ、Ｒ１３３Ｘ、Ｒ１６２Ｘ、Ｒ１６７Ｘ、Ｒ１８８Ｘ、Ｒ１９０Ｘ、Ｒ２１１Ｘ、Ｒ２５０Ｘ、Ｒ２５３Ｘ、Ｒ２６８Ｘ、Ｒ３０６Ｘ、Ｒ３０９Ｘ、Ｒ３４４Ｘ、Ｒ３５４Ｘ、Ｒ４２０Ｘ、Ｒ４５８Ｘ、Ｒ４６８Ｘ、Ｒ４７１Ｘ、Ｒ４７８Ｘ、Ｒ４８４Ｘ、またはそれらの任意の組合せのいずれか１つを含む、ＭｅＣＰ２タンパク質における任意の位置に存在し得る未成熟停止コドンの未成熟停止コドンリードスルーすることができる、操作されたｔＲＮＡおよび操作されたｔＲＮＡ変異体を提供する。ある場合では、対象におけるレット症候群は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することによって処置することができ、組成物は、疾患を引き起こす未成熟停止コドン（例えば、ＵＧＡ）と塩基対形成するアンチコドン配列を有する操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含むことができる。翻訳中、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、Ａｒｇが負荷され得、成長するＭｅＣＰ２ポリペプチドに移動され、これにより、対象におけるＭｅＣＰ２発現を少なくとも実質的に回復させることができる。ある場合では、実質的に保存されたＭｅＣＰ２ポリペプチドは、ＷＴＭｅＣＰ２タンパク質と比較して、機能的であり得る。ある場合では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを回復させることは、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも１０％より高い有効性で、本明細書に記載される組成物によって行うことができる。

ある場合では、ｍＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの未成熟停止コドンを含むことができる。従って、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、未成熟停止コドンのリードスルーを生じ、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させ、疾患または状態を少なくとも一部、処置することができる。ある場合では、妊娠中のメス対象は、本明細書に記載される組成物を投与することができる。妊娠中のメス対象は、妊娠の１つまたは複数の段階で組成物を投与することができる。メス対象は、出生前期中の妊娠が生じる前に、組成物を投与することができる。ある場合では、妊娠中のメス対象内の胚または胎児は、本明細書に記載される組成物を投与することができる。ある場合では、胚は、インビトロの設定において本明細書に記載される組成物を投与することができる。

疾患または状態は、レット症候群、自閉症、ウエスト症候群、レノックス・ガストー症候群、てんかん性脳症（ＥＥＰ）、ピット・ホプキンス症候群、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、疾患または状態は、嚢胞性線維症、難聴（例えば、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、常染色体優性１１難聴）網膜色素変性症またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、疾患または状態は、テイ・サックス病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、アッシャー症候群、ウォルマン病、肝疾患（アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症）、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。疾患または状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼の障害（例えば、眼の疾患）、癌、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。疾患または状態は、嚢胞性線維症、白皮症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性大腸腺腫症、ポリープ症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、ＩおよびＩＩ型筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連癌、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次線毛病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異などの、プロトロンビン突然変異関連障害、肺高血圧、網膜色素変性症、サンドホフ病、複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、Ｘ関連免疫不全、様々な形態の癌（例えば、ＢＲＣＡ１および２関連乳癌ならびに卵巣癌）を含むことができる。疾患または状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、皮膚癌、シュタルガルト病、シャルコー・マリー・トゥース病、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。疾患または状態は、筋ジストロフィーを含むことができる。筋ジストロフィーは、筋緊張性、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位型、エメリー・ドレイフス型、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。疾患または状態は、慢性疼痛などの、疼痛を含むことができる。疼痛は、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、またはその組合せを含むことができる。侵害受容性疼痛は、内臓疼痛、体性疼痛、またはその組合せを含み得る。

ある場合では、疾患または状態は、レット症候群であり得る。レット症候群は、広範な関連障害を含み得る。レット症候群は、非定型レット症候群を含み得る。レット症候群は、肢帯型変異体、ザッペッラ型変異体、ハンフェルド型変異体またはそれらの任意の組合せを含み得る。疾患または状態は、ＭＥＣＰ２、ＣＤＫＬ５、ＦＯＸＧ１、ＳＴＸＢＰ１、ＴＣＦ４、ＳＣＮ２Ａ、ＷＤＲ４５、ＭＥＦ２Ｃ、またはそれらの任意の組合せにおける１つまたは複数の突然変異によって引き起こされる、任意の数の疾患を含み得る。一部の実施形態では、レット症候群は、ＭｅＣＰ２、ＦｏｘＧ１、またはＣＤＫＬ５などのポリペプチドをコードするｍＲＮＡに存在する未成熟停止コドンによって引き起こされ得る。例えば、レット症候群に罹患している対象は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ１６８Ｘ、Ｒ２２５Ｘ、Ｒ２７０Ｘ、Ｒ２９４Ｘ、Ｒ１９８Ｘ、またはＲ４５３Ｘ突然変異を有し得、Ｘは、未成熟停止コドンであり得る。従って、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、停止コドンに応答して、アミノ酸を新生ＭｅＣＰ２ポリペプチドに挿入し、これにより、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、少なくとも一部、回復させることは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体で処置されていない対象と比較して、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体で処置された対象における全長ＭｅＣＰ２ポリペプチドの量を決定することによって測定することができる。ある場合では、レット症候群に罹患している対象は、ＣＤＫＬ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ５９Ｘ、Ｒ１３４Ｘ、Ｒ５５０Ｘ、Ｒ５５９Ｘ、Ｒ９５２Ｘ、Ｒ９７０Ｘ、Ｑ１１８Ｘ、Ｑ３４７Ｘ、Ｑ４５９Ｘ、Ｑ４６４Ｘ、Ｑ６５２Ｘ、Ｑ８０５Ｘ、Ｑ８３２Ｘ、Ｑ８３４Ｘ、Ｑ８６５Ｘ、またはＱ９０２Ｘ突然変異を有し得、Ｘは、未成熟停止コドンであり得る。ある場合では、レット症候群に罹患している対象は、ＦＯＸＧ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＱ４６Ｘ、Ｑ８６Ｘ、またはＱ１９６Ｘ突然変異を有し得、Ｘは、未成熟停止コドンであり得る。従って、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、停止コドンに応答して、アミノ酸を新生ＣＤＫＬ５またはＦＯＸＧ１ポリペプチドに挿入し、これにより、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、少なくとも一部、回復させることは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体で処置されていない対象と比較して、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体で処置された対象における全長ポリペプチドの量を決定することによって測定することができる。

ある場合では、ポリペプチドは、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含む。ある場合では、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＦｏｘＧ１ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、停止コドンに応答して、アミノ酸を新生ＦｏｘＧ１ポリペプチドに挿入し、これにより、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、ＦｏｘＧ１における未成熟停止コドンは、Ｑ４６Ｘ、Ｑ８６Ｘ、またはＱ１９６Ｘにあり得、Ｘは、停止コドン突然変異を表す。

一部の実施形態では、レット症候群の少なくとも１つの症状が、軽減される。例えば、レット症候群の症状に関連する測定値は、ベースラインの測定値との比較において、改善され得る。レット症候群の症状の例は、成長遅滞、脳成長遅滞、小頭症、動作もしくは協調の減少もしくは喪失、手の制御の低減、歩行能力の減少、硬直性もしくは痙縮性の動作、話す能力の減少、視力の低下、無関心、反復的な手の動作、普通でない眼球運動、呼吸困難、易刺激性、恐怖、不安、認知障害、けいれん、異常な脳波、脊柱側弯、不整脈、または異常な睡眠パターンを含み得る。

一部の実施形態では、疾患または状態は、レット症候群であり、レット症候群の少なくとも１つの症状が、軽減される。ある場合では、レット症候群の症状は、本明細書において提供される操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体を使用して、停止コドンを通じてリードすることによって、軽減することができる。ある場合では、レット症候群の症状は、停止コドンを通じて、時間のほぼ５％、時間のほぼ１０％、時間のほぼ１５％、時間のほぼ２０％、または時間のほぼ２５％をリードすることによって軽減されることができる。ある場合では、レット症候群の症状は、停止コドンを通じて、時間の少なくとも５％、時間の少なくとも１０％、時間の少なくとも１５％、時間の少なくとも２０％、または時間の少なくとも２５％をリードすることによって軽減されることができる。

ある場合では、ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含む。ある場合では、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ＣＤＫＬ５ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、停止コドンに応答して、アミノ酸を新生ＣＤＫＬ５ポリペプチドに挿入し、これにより、実質的に全長のポリペプチドを少なくとも一部、回復させることができる。ある場合では、ＣＤＫＬ５における未成熟停止コドンは、Ｒ５９Ｘ、Ｒ１３４Ｘ、Ｒ５５０Ｘ、Ｒ５５９Ｘ、Ｒ９５２Ｘ、Ｒ９７０Ｘ、Ｑ１１８Ｘ、Ｑ３４７Ｘ、Ｑ４５９Ｘ、Ｑ４６４Ｘ、Ｑ６５２Ｘ、Ｑ８０５Ｘ、Ｑ８３２Ｘ、Ｑ８３４Ｘ、Ｑ８６５Ｘ、またはＱ９０２Ｘであり得、Ｘは、停止コドン突然変異を表す。

ある場合では、疾患または状態は、難聴であり得る。難聴のいくつかの形態は、ＭＹＨ９、ＣＯＬ１１Ａ２、またはＭＹＯ７ＡなどのポリペプチドをコードするｍＲＮＡに存在する未成熟停止コドンの存在によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、常染色体優性１７形態の難聴は、ＭＹＨ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ１９３３Ｘ突然変異から生じ得る。一部の実施形態では、常染色体優性１３形態の難聴は、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ８４５Ｘ突然変異から生じ得る。一部の実施形態では、常染色体優性１１形態の難聴は、ＭＹＯ７ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ６６６Ｘ突然変異から生じ得る。

ある場合では、疾患または状態は、アッシャー症候群であり得る。アッシャー症候群ＩＢ型などのいくつかの形態のアッシャー症候群は、ＭＹＯ７Ａ突然変異と関連し得る。アッシャー症候群は、混合性難聴および盲目と関連し得る。ＭＹＯ７Ａは、アクチン結合分子モーターであり得るミオシンをコードすることができるミオシンＶＩＩＡをコードする。ある場合では、突然変異は、Ｃ６２８Ｘ突然変異、Ｒ１８６１Ｘ突然変異、または両方を含むことができる。ある場合では、突然変異は、Ａ２６Ｅ突然変異、Ｐ１３２Ｌ突然変異、Ｒ２４１Ｇ突然変異、Ｌ３６６Ｐ突然変異、Ｉ１０４５Ｔ突然変異、Ｌ１８６３Ｐ突然変異、Ｇ１２１８Ｒ突然変異、Ｒ１２４０Ｑ突然変異、Ａ１４９２Ｖ突然変異、Ａ２２０４Ｐ突然変異またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

ある場合では、疾患または状態は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに存在する未成熟停止コドンの存在によって引き起こされる嚢胞性線維症であり得る。ある場合では、疾患または状態は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに存在する未成熟停止コドンの存在によって引き起こされる網膜色素変性症であり得る。

処置は、対象に、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を投与することを含むことができる。処置は、併用療法の対象への投与を含むことができる。ある場合では、併用療法は、癌処置（例えば、放射線療法、化学療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、免疫療法、ホルモン療法、凍結融解壊死治療）を含むことができる。ある場合では、併用療法は、外科手術、抗生物質、抗ウイルス薬、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、併用療法は、粘液希釈、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）モジュレーター療法、肺移植、気管支拡張剤、気道クリアランス、抗炎症医薬、噴霧器処置、経口膵酵素、便軟化剤を含むことができる。ある場合では、併用療法は、エレクサカフトール（ｅｌｅｘａｃａｆｔｏｒ）、アイバカフトールおよびテザカフトール、ルマカフトール、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、併用療法は、理学療法、水治療法、作業療法、言語療法、給餌補助、抗てんかん薬、抗逆流薬、レボカルニチンまたはそれらの任意の組合せを含むことができる。併用療法は、外科手術、ステロイド療法、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、併用療法は、視力喪失（例えば、眼鏡、もしくは矯正眼科手術）を修復することを助けるか、または聴力消失（例えば、補聴器）を処置することを助けることができる。ある場合では、併用療法は、ＲＮＡまたはＤＮＡ編集テクノロジーを含むことができる。処置は、疾患または状態を治癒することを含み得る。処置は、疾患または状態の１つまたは複数の症状を実質的に低減することを含み得る。

一部の実施形態では、対象への操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の投与を含む方法が、本明細書において開示される。一部の実施形態は、対象への操作されたｔＲＮＡ変異体の投与を含む。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含むことができる；第２のマーカーをコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まなくてもよい；および第１のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量と第２のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量を比較することによって決定されてもよい、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生する。

診断方法
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患もしくは状態の存在もしくは不存在を同定すること、疾患もしくは状態を処置すること、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。方法は、必要とする対象に、薬学的に許容される量の、本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡまたはその変異体などの組成物または化合物を投与することを含むことできる。

一部の実施形態では、対象は、投与前に、疾患または状態を有すると診断されているか、または含むことができる。一部の実施形態では、診断は、インビトロ診断検査によって決定されるか、または含むことができる。一部の実施形態では、処置は、診断の際に、提供されることができる。

ナンセンス媒介減衰の阻害
一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡのノンセンス介在性減衰（ＮＭＤ）を抑制する。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ＮＭＤを抑制する。操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体によるＮＭＤのこのような抑制は、本明細書に記載される方法のいずれかに含まれ得る。一部の実施形態は、細胞を操作されたｔＲＮＡ、またはその変異体と接触させることを含む、ＮＭＤを阻害する方法を含むことができる。一部の実施形態では、接触は、細胞における標的ｍＲＮＡのＮＭＤの予防または減少をもたらすことができる。一部の実施形態では、接触は、ベースラインの測定値と比べて、細胞における標的ｍＲＮＡ測定値における増加をもたらすことができる。一部の実施形態は、それを必要とする対象に、操作されたｔＲＮＡ、またはその変異体を投与することを含む、ＮＭＤを阻害する方法を含むことができる。一部の実施形態では、投与は、対象における標的ｍＲＮＡのＮＭＤの予防または減少をもたらすことができる。一部の実施形態では、投与は、ベースラインの測定値と比べて、対象における標的ｍＲＮＡ測定値における増加をもたらすことができる。標的ｍＲＮＡ測定値における増加は、対象から採取された第１の試料におけるベースラインの標的ｍＲＮＡ測定値と比べた、対象から採取された第１の試料におけるものであり得る。第１のおよび／または第２の試料は、本明細書に記載される組織または体液試料を含むことができる。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、標的ｍＲＮＡのＮＭＤを、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％、または前述のパーセンテージのいずれか２つの範囲で減少させることができる。ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、標的ｍＲＮＡのＮＭＤを、少なくとも約１％～約１０％、５％～約２０％、１０％～約３５％、２５％～約５０％、４０％～約７０％、６０％～約８０％、７５％～約９０％または約８５％～約１００％減少することができる。

ＮＭＤは、ある場合では、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を含有するｍＲＮＡを分解する品質管理経路であり得る。エクソンとエクソンの接合は、ｍＲＮＡがＮＭＤの標的とされるかどうかを決定するため特徴付けられる。ｍＲＮＡのスプライシング中に、エクソン接合複合体（ＥＪＣ）は、エクソンとエクソンの接合の上流に２０～２４ヌクレオチドを形成することができる。ＥＪＣは、翻訳の第２ラウンド中に置換されるまで、スプライシング後に、ｍＲＮＡに結合したままであり得る。ＰＴＣが存在しない場合、ＥＪＣは、翻訳中に、取り除かれることができ、これにより、ｍＲＮＡ抵抗性をＮＭＤによる分解に付与する。ＰＴＣが、ＥＪＣの上流の少なくとも５０ヌクレオチドに存在する場合、リボソームは、停止し、ＥＪＣは、ｍＲＮＡと安定的に関連したままであり得る。この複合体は、両方がＮＭＤに関与し得る、核原形質シャトル因子、およびＵｐｆ３を動員することができる異種性タンパク質組成物、核周囲タンパク質を有する動的構造であり得る。Ｕｐｆ１などのＲＮＡ依存性ヘリカーゼは、翻訳放出因子によってｍＲＮＡに動員され、終結したリボソームと下流のＥＪＣを架橋して、ｍＲＮＡの減衰を誘導し得る活性なＮＭＤ複合体を形成することができる。この分解は、キャップ除去、続いて５’から３’への減衰およびデアデニレーション、続いて３’から５’への減衰を含むことができる。ＰＴＣリードスルーの場合、終結複合体とＥＪＣの間の架橋は、ある場合では、形成することができず、リボソームは、ＥＪＣタンパク質複合体を突然変異体転写物から脱離することができ、もはやＮＭＤの標的ではあり得ない。これは、停止コドンリードスルーが、どのように、ＮＭＤを弱め、ｍＲＮＡを安定化することができるかを説明するのを助けることができる。操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、本明細書に記載されるＮＭＤのこれらの態様のいずれかと干渉することができる。

ＰＴＣ抑制は、（１）翻訳の継続および／または（２）最終のＥＪＣのｍＲＮＡからの解離を可能にすることによって、ＮＭＤを阻害することができる（例えば、図４９－Keeling and Bedwell, Wiley Interdiscip Rev RNA (2011)から適用、を参照のこと）。

ＰＴＣ／ナンセンス突然変異を含有する標的ｍＲＮＡの、抑制因子ｔＲＮＡによるＰＴＣ抑制およびリードスルーは、ＮＭＤ経路を回避し、標的ｍＲＮＡのレベルを安定化／増加させる方法のうちの１つであり得る。例えば、抑制因子ｔＲＮＡのウルリッヒ病線維芽細胞へのトランスフェクションは、標的ｍＲＮＡの上方制御をもたらすことが示されたことを含むことができるSako et al, NASS (2006)。

本明細書に記載される抑制因子ｔＲＮＡを用いたＰＴＣリードスルーは、標的ｍＲＮＡのノンセンス介在性減衰（ＮＭＤ）を阻害することができる。これは、標的ｍＲＮＡの細胞内レベルを増加させることができる。標的ｍＲＮＡにおけるＰＴＣの続く抑制は、全長機能的タンパク質を産生することができる。

製造方法
本明細書に記載される操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチド、または医薬組成物を生成する方法が、本明細書において提供される。方法は、本明細書に開示される態様を含むことができる。ある場合では、複数のプロモーター、１つまたは複数の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする遺伝子配列を含むことができるベクターが、産生され得る。ベクターは、第１のプロモーター（例えば、ｈＵ６、またはｍＵ６プロモーター）、第２のプロモーター（例えば、ｈＵ６、またはｍＵ６プロモーター）、第３のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、および検出可能なポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含むことができる。ポリヌクレオチドは、プロモーターの上流に５’ＩＴＲを含むことができる。ある場合では、ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子下流に３’ＩＴＲを含むことができる。ある場合では、レポーター遺伝子は、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ－ガラクトシダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。第１のプロモーターまたは第２のプロモーターは、Ｕ６プロモーター（例えば、ヒトＵ６（ｈＵ６））を含むことができる。Ｕ６プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターまたはマウスＵ６プロモーターであり得る。Ｕ６プロモーターは、メチル化されることができる。第３のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。ある場合では、ベクターは、精製または単離によって産生することができる。ある場合では、プロモーターは、Ｕ７プロモーターであり得る。ある場合では、プロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターであり得る。

パッケージング
本開示は、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体、プロモーター、スタッファー配列、およびそれらの任意の組合せをパッケージングするウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の１つまたは複数のコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２つのコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の３つのコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の４つのコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の６つのコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の６つのコピーより多くをパッケージングすることができる。本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の１～２００、１～１００、５０～１００、２０～４０、１０～５０、または１～７０のコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の少なくとも１、１０、２０、３０、４０、５０、７０、１００、２００、３００、４００以上のコピーをパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の多くても約４００、３００、２００、１００、７０、５０、４０、３０、２０、１０、２つ以下のコピーをパッケージングすることができる。

１つまたは複数の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、プラスミド、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、または任意の他のベクターシステムを含むが、これらに限定されない、ベクターにおいてパッケージングされることができる。本明細書に開示されるベクターはまた、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙなどの、マーカーまたはレポーター遺伝子をコードすることができる。本明細書に開示されるベクターはまた、ヒトＵ６（ｈＵ６）などの、上流外来性プロモーターをコードすることができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、マーカー、および／またはスタッファー配列は、外来性プロモーター（例えば、マウスＵ６（ｍＵ６）またはヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター）の制御下にある、ウイルスベクターにおいてパッケージングされる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ抑制因子もしくはその変異体、マーカー、および／またはスタッファー配列は、外来性プロモーターを含まないウイルスベクターにおいてパッケージングされる。ある場合では、ベクターは、複数のプロモーター、１つまたは複数の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする遺伝子配列を含むことができる。ベクターは、第１のプロモーター（例えば、ｈＵ６、またはｍＵ６プロモーター）、第２のプロモーター（例えば、ｈＵ６、またはｍＵ６プロモーター）、第３のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、および検出可能なポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含むことができる。ポリヌクレオチドは、プロモーターの上流に５’ＩＴＲを含むことができる。ある場合では、ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子下流に３’ＩＴＲを含むことができる。ある場合では、レポーター遺伝子は、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ－ガラクトシダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。第１のプロモーターまたは第２のプロモーターは、Ｕ６プロモーター（例えば、ヒトＵ６（ｈＵ６））を含むことができる。Ｕ６プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターまたはマウスＵ６プロモーターであり得る。Ｕ６プロモーターは、メチル化されることができる。第３のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。ある場合では、ベクターは、精製し、単離することができる。

本開示のベクターをまたスタッファー配列にパッケージングして、デリバリーされるべきゲノム全体をパッケージングするウイルス粒子の良好な産生を確かにすることができる。例えば、天然に存在するスタッファー配列（例えば、イチゴまたはラムダファージ由来のＤＮＡ）が、ベクターにおいて含まれ得る。一部の実施形態では、スタッファー配列は、完全な合成配列であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、１～６つの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体およびスタッファー配列をパッケージングする。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、外来性ｈＵ６プロモーター、１～６つの操作されたｔＲＮＡおよびスタッファー配列をパッケージングする。スペーサー配列は、スタッファー配列または充填剤配列を含むことができる。スペーサー配列、スタッファー配列、または充填剤配列は、一部の実施形態では、互換的に言及され得る。ある場合では、ベクターは、ＩＴＲから異なる距離で、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の配列を置くことができる１つまたは複数のスペーサー配列を含むことができる。スペーサー配列は、６ヌクレオチド（ｎｔ）長の配列を含むことができる。スペーサー配列は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、１０００ヌクレオチドまたは本明細書で述べられるヌクレオチドの２つの数のいずれかの間にある任意の数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、スペース配列は、約１０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１００ｎｔ～約５００ｎｔ、約５０～約６００ｎｔ、または約２００ｎｔ～約１０００ｎｔを含むことができる。ある場合では、スペーサー配列は、６未満のｎｔまたは１０００を超えるｎｔを含むことができる。ある場合では、スペーサー配列は、スタッファー配列を含むことができる。スタッファー配列は、約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、または約３００ヌクレオチド長であり得る。スタッファー配列は、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ヌクレオチド長、または前述の数のいずれか２つを含む長さの範囲のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、スタッファー配列は、なくとも２５のヌクレオチド、少なくとも５０のヌクレオチド、少なくとも１００のヌクレオチド、少なくとも１５０のヌクレオチド、少なくとも２００のヌクレオチド、少なくとも２５０のヌクレオチド、または少なくとも３００のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、少なくとも約５０のヌクレオチド、少なくとも約１００のヌクレオチド、少なくとも約１５０のヌクレオチド、または少なくとも約２００のヌクレオチドである。一部の実施形態では、スタッファー配列は、少なくとも２５０のヌクレオチド、少なくとも３００のヌクレオチド、少なくとも３５０のヌクレオチド、少なくとも４００のヌクレオチド、少なくとも４５０のヌクレオチド、または少なくとも５００のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、２５以下のヌクレオチド、５０以下のヌクレオチド、１００以下のヌクレオチド、１５０以下のヌクレオチド、２００以下のヌクレオチド、２５０以下のヌクレオチド、または３００以下のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、約５０以下のヌクレオチド、約１００以下のヌクレオチド、約１５０以下のヌクレオチド、または約２００以下のヌクレオチドである。一部の実施形態では、スタッファー配列は、２５０以下のヌクレオチド、３００以下のヌクレオチド、３５０以下のヌクレオチド、４００以下のヌクレオチド、４５０以下のヌクレオチド、または５００以下のヌクレオチドを含むことができる。

一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の１つまたは複数のコピーの５’にある。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の１つまたは複数のコピーの３’にある。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上のコピーを分離する。一部の実施形態では、複数のスタッファー配列は、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の複数コピーを分離する。例えば、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドは、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体の第１のコピー、続いて第１のスタッファー配列、続いて操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体の第２のコピー、続いて第２のスタッファー配列、続いて操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体の第３のコピー（５’から３’の向きで）を含むことができる。操作されたｔＲＮＡもしくは操作されたｔＲＮＡ変異体の第１のコピーの５’に、または操作されたｔＲＮＡもしくは操作されたｔＲＮＡ変異体の第３のコピーの３’に１つまたは複数のスタッファー配列が存在し得る。

配列番号５７は、充填剤配列を含むポリヌクレオチドの例を含む。一部の実施形態は、配列番号５７と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、もしくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはそのフラグメント（例えば、本明細書において提供されるスペーサー配列のいずれかを含むフラグメント）を含む。一部の実施形態では、配列番号５７のフラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００以上のヌクレオチド長、または前述の数のいずれか２つによって定義される範囲のヌクレオチドである。

ある場合では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体のＩＴＲからの距離を変更することは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の停止コドンリードスルーの効率を増加させることができる。ある場合では、ベクターコンストラクトにおける操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の配列の向きは、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の停止コドンリードスルーの効率に影響し得る。ある場合では、ベクターは、異なる向きで置かれたベクターにおいて１つまたは複数の操作されたｔＲＮＡ配列または操作されたｔＲＮＡ変異体配列を含むことができる。

ＩＩＩ．キット
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される組成物および容器を含むことができる。例えば、キットは、医薬組成物を含むことができ、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ベクター）、または両方を含むことができる。ある場合では、容器は、プラスチック、ガラス、金属、またはそれらの任意の組合せであり得る。ある場合では、キットは、それを必要とする対象への投与についての指示書などの、使用についての指示書を含むことができる。

ある場合では、本明細書に記載される組成物を含むパッケージングされた製品は、正しくラベルを付され得る。ある場合では、本明細書に記載される医薬組成物は、優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）およびラベリング規則に従い製造され得る。ある場合では、本明細書に開示される医薬組成物は、無菌であり得る。

一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含むキットが、本明細書に開示される。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡ変異体を含むキットが、本明細書において開示される。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される医薬組成物（例えば、適宜、用量単位形態にある操作されたｔＲＮＡまたはその変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤）を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、パッケージングまたは容器を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、パッケージングを含むことができる。一部の実施形態では、キットは、容器を含むことができる。

一部の実施形態は、キットを製造する方法に関する。方法は、組成物をパッケージングまたは容器と接触させることを含むことができる。方法は、組成物をパッケージングと接触させることを含むことができる。方法は、組成物をパッケージングと接触させる工程を含むことができる。

ＩＶ．定義
別段定義されない限り、本明細書において使用される当該技術分野の全ての用語、記号ならびに他の技術用語および化学用語または用語法は、請求される主題が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。ある場合では、通常理解される意味を有する用語は、明確性および／または即時参照のため本明細書において定義され、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般的に理解され得るものに渡る実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。

本出願を通じて、様々な実施形態は、範囲フォーマットで提示され得る。範囲フォーマットでの説明は、単に便宜および簡潔さのためのものであり得、本開示の範囲の確固たる制限として理解されるべきでないことは、理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能性のあるサブレンジならびにその範囲内の個々の数値を有するとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示されるサブレンジ、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有するとみなされるべきである。これは、範囲の広さに関わらず、適用する。

本明細書および請求の範囲において使用される通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「１個の試料」は、その混合物を含む、複数の試料を含む。

用語「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「査定すること」、「アッセイすること」および「分析すること」は、測定値の形態を指すために、本明細書において互換的にしばしば使用される。用語は、構成要素が存在し得るかどうか（例えば、検出）を決定することを含む。これらの用語は、定量的、定性的または定量的かつ定性的な決定を含むことができる。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「存在を検出すること」は、それが、文脈に依存して存在し得るか、または不存在であり得るかどうかを決定することに加えて、存在するものの量を決定することを含むことができる。

用語「インビボ」は、対象の身体において生じる現象を記載するために使用することができる。

用語「エクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）」は、対象の身体外で生じる現象を記載するために使用することができる。エクスビボアッセイは、対象において行うことができない。むしろ、それは、対象由来の試料標本において行うことができる。試料で行われるエクスビボアッセイの例は、「インビトロ」アッセイであり得る。

用語「インビトロ」は、物質が得られ得る、生物学的供給源から分離され得るように、実験室試薬を保持するための容器に含有される、生じる現象を記載するために使用することができる。インビトロアッセイは、生細胞および死細胞が利用される、細胞ベースのアッセイを包含することができる。インビトロアッセイはまた、インタクトな細胞が利用されない、細胞フリーアッセイを包含することができる。

本明細書において使用される場合、用語「約」数は、その数のプラスまたはマイナス１０％の数を指すことができる。用語「約」範囲は、その最小値のマイナス１０％およびその最大値のプラス１０％の範囲を指すことができる。

本明細書において使用される場合、用語「処置」または「処置すること」は、レシピエントにおいて有益または所望の結果を得るための、医薬または他の治療介入レジメンを参照して使用される。有益または所望の結果は、治療上の恩恵および／または予防上の恩恵を含むが、これらに限定されない。治療恩恵は、症状または根底にある処置される障害の根絶または回復を指すことができる。また、対象が、依然として、根底にある障害で苦しめられ得るにも関わらず、改善が、対象において観察され得るように、治療上の恩恵は、根底にある障害と関連する、１つまたは複数の生理学的症状の根絶または回復を伴い、達成することができる。予防効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させること、予防すること、もしくは回復させること、疾患もしくは状態の症状の発生を遅延させることもしくは回復させること、疾患もしくは状態の進行を遅延させること、停止させること、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組合せを含む。予防上の恩恵のため、特定の疾患を発症するリスクのある対象、または疾患の１つまたは複数の生理学的症状を報告している対象は、この疾患の診断がなされていなくても、処置を受けることができる。

用語「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、動物、典型的には、哺乳動物を指すために、本明細書において互換的に使用される。任意の適当な対象は、本明細書に記載される組成物が投与されるか、または本明細書に記載される方法によって処置されることができる。哺乳動物の非限定的な例は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）ならびに実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり得る。哺乳動物は、任意の年齢であり得るか、または発生の任意の段階（例えば、大人、十代、小児、幼児、または子宮内の哺乳類）であり得る。ある場合では、ヒトは、胚、胎児、小児、または大人であり得る。ある場合では、ヒトは、約１日～約７日齢、１週～約５週齢、１月～約１２月齢、１歳～約１０歳、６月～約１５歳、５歳～約２５歳、２０歳～約５０歳、４０歳～約８０歳、７５歳～約１００歳、または約９０歳～約１３０歳であり得る。哺乳類は、オスまたはメスであり得る。一部の実施形態では、対象はオスであり得る。一部の実施形態では、対象はメスであり得る。一部の実施形態では、対象は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、対象は、レット症候群などの、疾患または状態を含むことができるか、または有することが疑われ得る。ある場合では、対象は、生殖に適した年齢の妊娠したヒトなどの、妊娠した対象であり得る。一部の実施形態では、患者は、約２０歳であり得る。一部の実施形態では、患者は、年齢１０～３０歳であり得る。

一部の実施形態では、患者は、少なくとも５歳、少なくとも１０歳、少なくとも１５歳、少なくとも２０歳、少なくとも２５歳、少なくとも３０歳、少なくとも３５歳、少なくとも５０歳、少なくとも７５歳、または少なくとも９５歳である。一部の実施形態では、患者は、５歳以下、１０歳以下、１５歳以下、２０歳以下、２５歳以下、３０歳以下、３５歳以下、５０歳以下、７５歳以下、または９５歳以下である。

「真核生物の細胞」は、モネラ界を除く、生命の界の全てを含む。それらは、膜に結合した核を通じて容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、真核生物であり得るか、または細胞が、内部の膜および細胞骨格によって複合体構造に組織化され得る生物であり得る。特徴的な膜結合構造は、核であり得る。用語「宿主」は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む、真核生物宿主を含むことができる。真核生物の細胞または宿主の非限定的な例は、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒトを含む。真核生物の細胞の他の例は、細胞株を含むことができる。ある場合では、初代細胞または細胞は、ニューロン、視細胞（例えば、Ｓ錐体細胞、Ｌ錐体細胞、Ｍ錐体細胞、杆体細胞細胞）、網膜色素上皮細胞、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、筋管）、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）であり得る。ある場合では、細胞は、水平細胞、神経節細胞、または双極細胞であり得る。ある場合では、細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ－６０、ＭＣＦ－７、ＨＬ－６０、ＲＤ、ＬＨＣＮ分化細胞、ＬＨＣＮ未分化細胞、Ｓａｏｓ－２、ＣＨＯ、またはＨｅＬａ細胞などの、哺乳類細胞株であり得る。ある場合では、細胞株は、Ｓｆ９などの、昆虫細胞株であり得る。

用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、互換的に使用することができ、その広義の意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチドミメティックの化合物を指すことができる。サブユニットは、ペプチド結合により結合されることができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって結合されることができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有することができ、タンパク質配列またはペプチド配列を含むことができる、最大数のアミノ酸に生じる制限はない。本明細書において使用される、用語「アミノ酸」は、グリシンならびに両方のＤおよびＬ光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチドミメティックを含む、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または合成アミノ酸のいずれかを指すことができる。本明細書において使用される場合、用語「融合タンパク質」は、１つより多くの天然に存在する、または組換え産生されたタンパク質由来のドメインを含むタンパク質を指すことができ、一般的に、それぞれのドメインが、異なる機能を果たす。この点について、用語「リンカー」は、適宜、融合したタンパク質ドメインの立体構造を保存する、それらのそれぞれの機能を損ない得る、融合したタンパク質ドメイン間の好ましくない相互作用を防ぐ、または両方のために、これらのドメインを一緒に結合するため使用され得るタンパク質フラグメントを指すことができる。

用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を指すことができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知もしくは未知の、任意の機能を果たすことができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴもしくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーである。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。存在するなら、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリ前または後に授けられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合作用後、例えば、標識成分との結合によりさらに修飾され得る。用語はまた、２本鎖分子と１本鎖分子の両方を指すことができる。別段特定または要求されなければ、ポリヌクレオチドであり得る本発明の任意の実施形態は、２本鎖形態と、２本鎖形態を作製することが公知または推定される２つの相補的な１本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。

ポリヌクレオチドは、特定の配列のヌクレオチドからなることができる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびリン酸塩基を含むことができる。ヌクレオチドは、糖（例えば、リボースまたは２’デオキシリボース）および窒素塩基などの、核酸塩基を含むことができる。核酸塩基の非限定的な例は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、およびイノシン（Ｉ）を含む。一部の実施形態では、Ｉは、ヒポキサンチンが、Ｐ－Ｎ９－グリコシド結合を介してリボフラノースに結合され得るとき、形成されることができ、これにより、化学構造：

をもたらし得る。イノシンは、グアニン（Ｇ）として翻訳機構によってリードされることができる。

用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示であり得る。このアルファベット表示は、中心処理ユニットを有するコンピューター内のデータベースにインプットされ、バイオインフォマティクスアプリケーション、例えば、機能ゲノミクス及び相同性検索のため使用され得る。

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指すことができる。相同性は、比較の目的のため配列され得る、それぞれの配列における位置を比較することによって決定されることができる。比較された配列における位置は、同じ塩基またはアミノ酸によって占められ得るとき、次に、分子は、その位置において相同であり得る。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致または相同な位置の数の関数であり得る。「無関連」または「非相同な」配列は、本開示の配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、または代わりに、２５％未満の同一性を共有する。配列相同性は、参照配列に対する配列の％同一性を指すことができる。任意の特定の配列は、本明細書に記載される任意の配列（本明細書に記載される特定の核酸配列と対応し得る）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得るかどうかの現実問題として、このような特定のポリペプチド配列は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８ｆｏｒＵｎｉｘ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して、通常決定することができる。特定の配列が、例えば、参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するためのＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用するとき、パラメーターは、同一性のパーセンテージが、参照配列の全長にわたり計算されることができ、トータルの参照配列の最大５％の配列相同性におけるギャップが可能になり得るように、設定され得る。

ある場合では、全体的な配列アライメントとしても言及される、参照配列（クエリー配列、すなわち、本開示の配列）と対象配列の間の同一性は、Brutlag et al.(Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて使用される、同一性が、狭義で解釈され得る、特定の実施形態についてのパラメーターは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（パーセント許容突然変異）０、ｋ－タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化群長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００またはどんなに短くても、対象配列の長さを含むことができる。本実施形態によると、対象配列が、内部欠損のためでなく、ＮまたはＣ末端欠損に起因したクエリー配列より短くてもよい場合、全体的パーセント同一性を計算するとき、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、対象配列のＮおよびＣ末端トランケーションを占めないという事実を考慮して、マニュアル補正が結果に対してなされ得る。クエリー配列と比べて、ＮおよびＣ末端で切断された対象配列について、パーセント同一性は、対象配列のＮおよびＣ末端の側面であり得る、クエリー配列の残基数を計算することによって補正することができ、クエリー配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列することができない。残基が一致／整列され得るかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定することができる。次に、このパーセンテージは、特定のパラメーターを使用して、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される、パーセント同一性から引かれ、最終のパーセント同一性スコアを得ることができる。この最終パーセント同一性スコアは、この実施形態の目的のため使用することができる。ある場合では、クエリー配列と一致／整列することができない、対象配列のＮおよびＣ末端の残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調節する目的が考慮され得る。すなわち、対象配列の最もＮおよびＣ末端残基の外側のクエリー残基位置のみが、このマニュアル補正が考慮される。例えば、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と整列させて、パーセント同一性を決定することができる。欠損は、対象配列のＮ末端で生じ、それ故、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の第１の１０残基の一致／アライメントを示さない。１０の対形成していない残基は、配列の１０％（ＮおよびＣ末端の不一致な残基数／クエリー配列における残基の総数）を表し、故に、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されるパーセント同一性スコアから引くことができる。残る９０残基が、完全に一致する場合、最終のパーセント同一性は、９０％であり得る。別の例では、９０残基の対象配列は、１００残基のクエリー配列と比較することができる。今回、欠損は、内部欠損であり得、故に、クエリーと一致／整列され得ない対象配列のＮまたはＣ末端に残基は存在し得ない。この場合では、ＦＡＳＴＤＢによって計算されるパーセント同一性は、手動で補正することができない。再度、クエリー配列と一致／整列され得ない、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて提示される、対象配列のＮおよびＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正されることができる。

ある場合では、全体的な配列アライメントとしても言及される、参照配列（クエリー配列、すなわち、本開示の配列）と対象配列の間の同一性は、Brutlag et al.(Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて使用される、同一性が、狭義で解釈され得る、特定の実施形態についてのパラメーターは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（パーセント許容突然変異）０、ｋ－タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化群長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００またはどんなに短くても、対象配列の長さを含むことができる。本実施形態によると、対象配列が、内部欠損のためでなく、ＮまたはＣ末端欠損に起因したクエリー配列より短くてもよい場合、全体的パーセント同一性を計算するとき、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、対象配列のＮおよびＣ末端トランケーションを占めないという事実を考慮して、マニュアル補正が結果に対してなされ得る。クエリー配列と比べて、ＮおよびＣ末端で切断された対象配列について、パーセント同一性は、対象配列のＮおよびＣ末端の側面であり得る、クエリー配列の残基数を計算することによって補正することができ、クエリー配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列することができない。残基が一致／整列され得るかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定することができる。次に、このパーセンテージは、特定のパラメーターを使用して、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される、パーセント同一性から引かれ、最終のパーセント同一性スコアを得ることができる。この最終パーセント同一性スコアは、この実施形態の目的のため使用することができる。ある場合では、クエリー配列と一致／整列することができない、対象配列のＮおよびＣ末端の残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調節する目的が考慮され得る。すなわち、対象配列の最もＮおよびＣ末端残基の外側のクエリー残基位置のみが、このマニュアル補正が考慮される。例えば、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と整列させて、パーセント同一性を決定することができる。欠損は、対象配列のＮ末端で生じ、それ故、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の第１の１０残基の一致／アライメントを示さない。１０の対形成していない残基は、配列の１０％（ＮおよびＣ末端の不一致な残基数／クエリー配列における残基の総数）を表し、故に、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されるパーセント同一性スコアから引くことができる。残る９０残基が、完全に一致する場合、最終のパーセント同一性は、９０％であり得る。別の例では、９０残基の対象配列は、１００残基のクエリー配列と比較することができる。今回、欠損は、内部欠損であり得、故に、クエリーと一致／整列され得ない対象配列のＮまたはＣ末端に残基は存在し得ない。この場合では、ＦＡＳＴＤＢによって計算されるパーセント同一性は、手動で補正することができない。再度、クエリー配列と一致／整列され得ない、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて提示される、対象配列のＮおよびＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正されることができる。

「トランスファーリボ核酸」または「ｔＲＮＡ」は、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するのを助ける核酸分子であり得る。ｔＲＮＡは、３つのヘアピンループ；アンチコドンをコードする「ステム」位置を含むことができるこれらのループの１つを含む、特有の折り畳み構造を有することができる。アンチコドンは、ｍＲＮＡ上の対応するコドンを認識することができる。それぞれのｔＲＮＡは、ｍＲＮＡコドンに対応するアミノ酸が「負荷され」得る。負荷は、酵素であるｔＲＮＡシンターゼによって達成することができる。そのアンチコドンに対応するコドンのｔＲＮＡ認識の際、ｔＲＮＡは、成長するアミノ酸鎖に荷電して、ポリペプチドまたはタンパク質を形成することができる、アミノ酸をトランスファーすることができる。内在性ｔＲＮＡは、内在性ｔＲＮＡシンターゼで荷電することができる。従って、内在性ｔＲＮＡは、典型的には、標準的なアミノ酸で荷電される。外部供給源からもたらされる、直交性ｔＲＮＡは、対応する直交性ｔＲＮＡシンターゼを必要とすることができる。このような直交性ｔＲＮＡは、標準的なアミノ酸と非標準アミノ酸の両方で荷電することができる。非標準アミノ酸の非限定的な例は、“Adding New Chemistries to the Genetic Code” By C. Liu and P. Schultz, Annu. Re. Biochem. 79:413-44 (2010)において見られる。一部の実施形態では、ｔＲＮＡが荷電され得るアミノ酸を検出可能に標識して、インビボでの検出が可能になる。標識の適当な技術は、天然でないアミノ酸を含有するアジド／アルキンが、直交性ｔＲＮＡ／シンターゼ対によって付加され、これにより、フルオロフォアまたは他のこのような分子を含むアルキン／アジドを使用して検出され得る、クリックケミストリーを含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用される、用語「操作されたｔＲＮＡ」は、例えば、アンチコドン領域における同等の野生型ｔＲＮＡと比べて、操作されたｔＲＮＡの配列において少なくとも１つの相違を有するトランスファーＲＮＡを指すことができる。本明細書において使用される、用語「操作されたｔＲＮＡ変異体」または「その変異体」は、参照操作されたｔＲＮＡと比較して、それらの配列における突然変異を有するトランスファーＲＮＡを指すことができる。一部の実施形態では、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、「抑制因子ｔＲＮＡまたはその変異体」、「ｔＲＮＡ抑制因子」または「操作されたｔＲＮＡ抑制因子」として言及され、一般的に、ｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンリードスルーを抑制することができる操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を指すことができる。

用語「ｔＲＮＡイソデコーダー」は、アミノアシル化されるとき、同じアミノ酸でアミノアシル化されるｔＲＮＡ分子を指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ある場合では、ｔＲＮＡイソデコーダーは、同じアンチコドン配列を共有するｔＲＮＡ分子を指すことができる。

ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ分子である「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」が、本明細書において言及される。一般的に、ＲＮＡは、ＤＮＡから転写することができる。ある場合では、配列における非タンパク質コード領域を含有する前駆体ｍＲＮＡは、ＤＮＡから転写され、次に、処理されて、非コード領域（イントロン）の全てまたは一部を除去して、成熟ｍＲＮＡが産生され得る。本明細書において使用される場合、用語「ｍＲＮＡ前駆体」は、非タンパク質コード領域を除去するための処理を受ける前に、ＤＮＡから転写されるＲＮＡ分子を指すことができる。

用語「停止コドン」は、翻訳の終結をシグナル伝達するメッセンジャーＲＮＡ内の３つのヌクレオチドの連続した配列を指すことができる。非限定的な例は、ＲＮＡ、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパールとしても知られる、アンバー）およびＤＮＡＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡを含む。別段示されない限り、用語はまた、未成熟停止コドンを導入するＤＮＡまたはＲＮＡ内のノンセンス突然変異を含むことができ、これにより、任意の得られたタンパク質が異常に短くなり得る。様々な停止コドンに対応するｔＲＮＡは、それらの停止コドンに対応する名称：アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）、およびオパール（ＵＧＡ）によって知られている。

「基準アミノ酸」は、例えば、表４に示されるアミノ酸を含む、天然で生じる、その２０種のアミノ酸を指す。

表４. 3文字略語、1文字略語、構造、および対応するコドンで示される天然に存在するアミノ酸

用語「有効量」は、所望の効果を達成するのに十分な量を指すことができる。治療または予防適用の文脈において、有効量は、一般的な健康、年齢、性別、体重および医薬組成物に対する抵抗性などの、個々の対象の問題の状態のタイプおよび重症度ならびに特徴に依存し得る。一部の実施形態では、有効量は、レット症候群、または難聴などの疾患を有する患者を、少なくとも一部処置するために必要とされ得る量であり得る。ある場合では、当業者は、これらおよび他の要因に依存して適当な量を決定することができる。

インビトロでの適用の場合、一部の実施形態では、有効量は、問題の適用の大きさおよび性質に依存するであろう。これはまた、インビトロでの標的および用いられる方法の性質および感度にも依存するであろう。ある場合では、当業者は、これらおよび他の考慮すべき事項に基づき、有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に依存して、１つまたは複数の組成物投与を含むことができる。

本明細書において使用される、タンパク質の発現に関して、用語「回復させること」は、以前のタンパク質発現が、未成熟停止コドンなどの突然変異に起因して、切断された、全長タンパク質の発現を確立する能力を指すことができる。

本明細書において使用される、用語「突然変異」は、参照配列との比較であり得る、核酸配列またはポリペプチド配列の変更を指すことができる。突然変異は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドもしくはタンパク質、あるいはそれらの任意の組合せで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）データベースなどのデータベースから得ることができる。突然変異を構成し得る特定の変更は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは１つまたは複数のアミノ酸における置換、欠損、挿入、転化、または変換を含むことができる。突然変異を有さない、ポリペプチド配列をコードする、核酸配列における突然変異の非限定的な例は、あるコドンの別のものへの置換をもたらし得る「ミスセンス」突然変異、特定のアミノ酸をコードするもの由来のコドンを停止コドン（タンパク質の切断された翻訳をもたらし得る）に変更し得る「ナンセンス」突然変異、または得られたタンパク質に対する作用を有さないものであり得る「サイレント」突然変異を含む。突然変異は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における１つのみのヌクレオチドに影響する突然変異を指すことができる、「点突然変異」であり得る。突然変異は、「スプライス部位突然変異」であり得、現在のｍＲＮＡ前駆体（イントロンを除去するための処理の前）であり得、これにより、スプライス部位の不正確な描写からのタンパク質のミス翻訳およびしばしばトランケーションをもたらし得る。突然変異は、融合遺伝子であり得る。融合対または融合遺伝子は、転座、中間部欠損、染色体逆位、またはそれらの任意の組合せなどの突然変異から生じ得る。突然変異は、三倍体化、四倍体化などの、反復配列の数における変異性を構成することができる。例えば、突然変異は、所定の配列（すなわち、コピー数のバリエーション、またはＣＮＶ）と関連するコピー数における増加または減少であり得る。突然変異は、異なる対立遺伝子における２つ以上の配列変更または１つの対立遺伝子における２つ以上の配列変更を含み得る。突然変異は、モザイクなどの、１つの対立遺伝子における１つの位置における２つの異なるヌクレオチドを含み得る。突然変異は、キメラなどの、１つの対立遺伝子における１つの位置における２つの異なるヌクレオチドを含み得る。突然変異は、悪性組織に存在することができる。突然変異は、一塩基多様性（ＳＮＶ）を含むことができる。突然変異は、配列変異体、配列バリエーション、配列変更、または対立遺伝子変異体を含むことができる。

突然変異の存在または不存在は、疾患または状態を発症する増加したリスクを示し得る。突然変異の存在または不存在は、疾患または状態の存在を示し得る。突然変異は、良性組織に存在することができる。突然変異の不存在は、組織または試料が良性であり得ることを示すことができる。代替として、突然変異の不存在は、組織または試料が良性であり得ることを示し得ない。本明細書に記載される方法は、試料における突然変異の存在を同定することを含むことができる。

本明細書で使用される、用語「コードする」は、ポリヌクレオチドの、対応する遺伝子発現産物を産生するのに十分な情報または指示配列をもたらす能力を指すことができる。非限定的な例では、ｍＲＮＡは、翻訳中に、ポリペプチドをコードすることができ、一方、ＤＮＡは、転写中に、ｍＲＮＡ分子をコードすることができる。

用語「相補な」または「相補性」は、例えば、水素結合（例えば、典型的なワトソン・クリック）、共有結合、または他の類似の方法によって、対応する核酸配列と１つまたは複数の結合を形成する、核酸の能力を指すことができる。ワトソン・クリック塩基対形成において、二重水素結合は、核酸塩基ＴとＡの間で形成し、一方、三重水素結合は、核酸塩基ＣとＧの間で形成する。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａに相補であり得る。パーセント相補性は、第２の核酸配列（例えば、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補である１０のうち５、６、７、８、９、１０）と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子における残基のパーセンテージを示す。「完全な相補性」は、核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続した残基と水素結合するであろうことを意味し得る。本明細書において使用される、「実質的に相補な」は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のヌクレオチドの領域に渡り少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る相補性の程度を指すことができるか、またはストリンジェントな条件（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする２つの核酸を指すことができる。核酸は、非特定の配列を含むことができる。本明細書において使用される場合、用語「非特定の配列」または「特定でない」は、任意の他の核酸配列に相補的であるよう設計されることができず、または任意の他の核酸配列に部分的にのみ相補的であり得る、一連の残基を含有する核酸配列を指すことができる。

単独または「モチーフ」と組み合わせて使用される、用語「ヘアピン」、「ヘアピンループ」、「ステムループ」、および／または「ループ」は、ヘアピンまたはループを形成し、似ている１本鎖ポリヌクレオチド分子における構造を指すことができる。ポリヌクレオチド分子の第１のヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド分子における第２のヌクレオチド配列が、塩基対形成するか、またはそうでなければ、結合して、ヘアピンもしくはループ構造を形成するとき、この構造が形成することができる。このような構造は、図２において説明され、一部の実施形態による、天然に存在するまたは操作されたｔＲＮＡにおける様々なステムループ構造を示す。

本明細書において使用される場合、用語「ドメイン」は、タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、操作されたｔＲＮＡ）またはポリペプチドの特定の領域を指すことができ、特定の機能と関連することができる。例えば、「ＲＮＡヘアピンモチーフと関連するドメイン」は、１つまたは複数のＲＮＡヘアピンに結合するタンパク質のドメインを指すことができる。

本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関するとき、かかるものの均等物または生物学的な均等物が、本開示の範囲内にあることが意図され得ることは、明確な制限および別段意図されない限り、判断されるべきであり得る。本明細書において使用される場合、用語「その生物学的な均等物」は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及が、依然として所望の構造または機能性を維持しながら、最小の相同性を有するものを意図するとき、「その均等物」と同義であることが意図され得る。本明細書において具体的に引用されない限り、本明細書で述べられる任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質がまた、その均等物を含むことが企図され得る。例えば、均等物は、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対する少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性およびあるいは、または少なくとも約８５％、またはあるいは少なくとも約９０％、またはあるいは少なくとも約９５％、またはあるいは９８％のパーセント相同性もしくは同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対する実質的に均等な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及するとき、その均等物は、ストリンジェントな条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得る。

「ＲＮＡ編集実体」は、標的ＲＮＡ配列を編集することができる内在性酵素を含むことができる。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、組換え酵素を含むことができる。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、融合ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、ここで、これを指すことができる）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導性（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、ここで、これを指すことができる）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導性（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、またはそれらの任意の組合せに対する少なくとも約８０％の配列相同性を含むことができる。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、ウイルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、麻疹、ムンプス、またはパラインフルエンザ由来のウイルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、標的ＲＮＡにおいてヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを付加するか、または欠損することができるトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）由来の酵素であり得る。ある場合では、ＲＮＡ編集実体は、標的ＲＮＡにおいてウラシルまたは１つより多くのウラシルを付加するか、または欠損することができるトリパノソーマ・ブルセイ由来の酵素であり得る。

本明細書において使用される、用語「ＡＤＡＲ」は、ＲＮＡ配列におけるアデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換することができるアデノシンデアミナーゼを指すことができる。ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２は、インビボでのｍＲＮＡ編集に関与することができるＡＤＡＲの２つの代表的な種であり得る。ＡＤＡＲ１の非限定的な代表的な配列は、以下の参照数：ＨＧＮＣ：２２５；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６０７１０；ＯＭＩＭ：１４６９２０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５５２６５；およびＧｅｎｅＣａｒｄ：ＧＣ０１Ｍ１５４５５４、ならびにその生物学的な均等物の下見出すことができる。ＡＤＡＲ２の非限定的な代表的な配列は、以下の参照数：ＨＧＮＣ：２２６；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：１０４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７３８１；ＯＭＩＭ：６０１２１８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８５６３；およびＧｅｎｅＣａｒｄ：ＧＣ２１Ｐ０４５０７３、ならびにその生物学的な均等物の下見出すことができる。

本明細書において使用される、用語「ＡＰＯＢＥＣ」は、ＣからＵへの変更を触媒する、ｍＲＮＡ編集に関与する、進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリー内にある任意のタンパク質、およびその均等物を指すことができる。ある点で、用語ＡＰＯＢＥＣは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、またはその互いの均等物のいずれか１つを指すことができる。ＡＤＡＲドメインに融合されるか、またはＲＮＡ編集システムにおける使用に適したそれらを付与するための代わりのドメインに融合される、１つまたは複数のＡＰＯＢＥＣドメインを含む融合タンパク質の非限定的な代表的な配列が、本明細書において提供することができる。この目的のために、ＡＰＯＢＥＣは、異なる変換によるにも関わらず、編集を触媒する、ＡＤＡＲの均等物と見なすことができる。従って、理論によって拘束されないが、本出願人は、ＡＤＡＲベースの編集システムを用いた使用が本明細書で企図される全ての実施形態が、ＡＰＯＢＥＣベースのＲＮＡ編集システムにおける使用に適用することができると考える。

本明細書において使用される節の表題は、構成目的のみのためであり、記載される主題を制限すると解釈されるべきではない。

Ｖ．実施形態
以下の非限定的な実施形態が提供される。
１．それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、
対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを投与すること；および
未成熟停止コドンが欠如するｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生することを含み、
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、実質的に全長のポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを通じて、リードすることができる、方法。
２．それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、
対象に、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを投与し、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置すること；
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、
ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを、第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含む；
ｂ）第２のマーカーをコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および
ｃ）第１のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量と第２のヒト細胞から放出される検出可能なシグナルの量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で、インビボで、実質的に全長のポリペプチドを産生する、方法。
３．第１のヒト細胞または第２のヒト細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、実施形態２の組成物。
４．実質的に全長のポリペプチドの少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の発現を回復させることをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つの方法。
５．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約３５％の効率で、実質的に全長のポリペプチドを産生する、実施形態３の方法。
６．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化される、実施形態１～５のいずれか１つの方法。
７．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、アルギニンでアシル化される、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
８．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、非標準アミノ酸でアシル化される、実施形態１～７のいずれか１つの方法。
９．ポリペプチドをコードするｍＲＮＡが、少なくともＭｅＣＰ２のフラグメントに対応する、実施形態１～８のいずれか１つの方法。
１０．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入し、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分である、実施形態１～９のいずれか１つの方法。
１１．ｍＲＮＡが、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含む、実施形態１～１０のいずれか１つの方法。
１２．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、同じ停止コドンである、実施形態１１の方法。
１３．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、異なる停止コドンである、実施形態１１の方法。
１４．未成熟停止コドンが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドの対応する配列における、アミノ酸１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６、４５３、８（アイソフォーム２中）、９（アイソフォーム１中）、８４、８５、８９、９１、１０６、１１１、１１５、１３３、１６２、１６７、１８８、１９０、２１１、２５０、２５３、２６８、３０６、３０９、３４４、３５４、４２０、４５８、４６８、４７１、４７８、もしくは４８４位、またはそれらの任意の組合せに、ＲからＸを生じ、Ｘは、未成熟停止コドンである、実施形態１～１３のいずれか１つの方法。
１５．未成熟停止コドンが、オパール停止コドンである、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
１６．未成熟停止コドンが、アンバー停止コドンである、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
１７．未成熟停止コドンが、オーカー停止コドンである、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
１８．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡである、実施形態１～１７のいずれか１つの方法。
１９．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、操作されたｔＲＮＡ前駆体である、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。
２０．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、イントロン配列を含む、実施形態１９の方法。
２１．イントロン配列が、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を産生する、実施形態２０の方法。
２２．対象がヒトである、実施形態１～２１のいずれか１つの方法。
２３．対象が非ヒト動物である、実施形態１～２１のいずれか１つの方法。
２４．ヒトが、約生誕時～約４０歳の年齢である、実施形態２２の方法。
２５．ヒトが、約６カ月間～約１５歳の年齢である、実施形態２２または２５の方法。
２６．ヒトが、胚または胎児である、実施形態２２の方法。
２７．疾患または状態が、レット症候群を含む、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
２８．疾患または状態が、嚢胞性線維症を含む、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
２９．疾患または状態が、網膜色素変性症を含む、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
３０．疾患または状態が、難聴を含む、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
３１．難聴が、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含む、実施形態３０の方法。
３２．投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することである、実施形態１～３１のいずれか１つの方法。
３３．投与することは、非経口投与することであり、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することである、実施形態３２の方法。
３４．投与することが、大槽内（ＩＣＭ）である、実施形態１～３１のいずれか１つの方法。
３５．投与することが、脳室内（ＩＣＶ）である、実施形態１～３１のいずれか１つの方法。
３６．ポリペプチドが、ＭｅＣＰ２ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
３７．ポリペプチドが、ＦｏｘＧ１ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
３８．ポリペプチドが、ＣＤＫＬ５ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
３９．ポリペプチドが、ＭＹＨ９ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
４０．ポリペプチドが、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
４１．ポリペプチドが、ＭＹＯ７Ａポリペプチド、またはそのフラグメントを含む、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
４２．投与することが、期間中、少なくとも２回行われる、実施形態１～４１のいずれか１つの方法。
４３．期間が、約２４時間である、実施形態４２の方法。
４４．方法が、疾患または状態を予防する方法であり、予防することが、操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドの対象への予防投与を含む、実施形態１～４３のいずれか１つの方法。
４５．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、対象に投与される、実施形態１～４４のいずれか１つの方法。
４６．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、ベクターに含まれる、実施形態４４または４５の方法。
４７．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態４６の方法。
４８．ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルス（ＬＶ）ベクターを含む、実施形態４６または４７の方法。
４９．ＡＡＶベクターが、
ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２を含む血清型、または
ｂ）ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－レトロ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＳもしくはＡＡＶ－２ｉ８を含むシュードタイプを有するＡＡＶ由来のものである、実施形態４８の方法。
５０．ＡＡＶベクターが、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含む、実施形態４８または４９の方法。
５１．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含む、実施形態４８～５０のいずれか１つの方法。
５２．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクターである、実施形態４８～５１のいずれか１つの方法。
５３．操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、デリバリーシステムに存在する、実施形態１～５２のいずれか１つの方法。
５４．デリバリーシステムが、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態５３の方法。
５５．（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むか、またはコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することをさらに含み、ポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡ編集実体を動員し、編集実体が、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触させたとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態１～５４のいずれか１つの方法。
５６．ＲＮＡ編集実体が、
ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；
ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；
ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または
ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメント、（ａ）のＡＤＡＲポリペプチド、または（ｂ）のＡＰＯＢＥＣポリペプチドを含む融合タンパク質を含む、実施形態５５の方法。
５７．疾患または状態が、レット症候群を含み、ｍＲＮＡが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンが、オパール停止コドンであり、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、アルギニルｔＲＮＡであり、対象が、０～６歳の年齢のヒトであり、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する、実施形態１の方法。
５８．操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含む、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
５９．対象が、投与前に、疾患または状態を有すると診断されている、実施形態１～５８のいずれか１つの方法。
６０．診断が、インビトロ診断検査によって決定されている、実施形態５９の方法。
６１．ａ）実施形態１～６０のいずれか１つの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体；および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、組成物。
６２．実施形態６１の組成物を容器において含む、キット。
６３．それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、
対象に、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３～２２のいずれか１つにおいて提供される参照ｔＲＮＡの配列における１つまたは複数の突然変異を含み、操作されたｔＲＮＡ変異体が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換して、インビボで実質的に全長のポリペプチドを産生する、方法。
６４．１つまたは複数の突然変異が、互いにワトソン・クリック塩基対形成しない操作されたｔＲＮＡ変異体のアクセプターステムまたはアンチコドンステムにおける少なくとも２つのヌクレオチドの、ワトソン・クリック塩基対形成する少なくとも２つのヌクレオチドでの置換を含む、実施形態６３の方法。
６５．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７２位におけるチミンのシトシンでの置換を含む、実施形態６３または６４の方法。
６６．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド２位にシトシンおよびヌクレオチド７１位にグアニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
６７．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてグアニンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド６７位においてシトシンで置換されたチミンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
６８．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド１３位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド１３位およびヌクレオチド２２位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
６９．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド１５位においてグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
７０．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７１．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド３１位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド３９位においてチミンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７２．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド３７位においてグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
７３．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてアデニンで置換されたグアニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
７４．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド５０位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６４位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７５．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてアデニンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７６．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド４９位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６５位においてシトシンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド４９位およびヌクレオチド６５位が、配列番号６に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７７．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
７８．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７１位においてシトシンで置換されたチミンを含む、実施形態６３または６４の方法。
７９．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド７１位においてグアニンで置換されたチミンを含み、ヌクレオチド２位およびヌクレオチド７２位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８０．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド４位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６９位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド４位およびヌクレオチド６９位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８１．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてチミンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８２．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド１２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド２３位においてグアニンで置換されたシトシンを含み、ヌクレオチド１２位およびヌクレオチド２３位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８３．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２７位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４３位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２７位およびヌクレオチド４３位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８４．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８５．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４０位においてシトシンで置換されたチミンを含む、実施形態６３または６４の方法。
８６．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド３１位においてシトシンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド３９位においてグアニンで置換されたチミンを含み、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態６３または６４の方法。
８７．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位においてグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
８８．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４６位においてアデニンで置換されたグアニンを含む、実施形態６３または６４の方法。
８９．ポリペプチドが、
ａ）操作されたｔＲＮＡ変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡが、未成熟停止コドンを含む；
ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および
ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で産生される、実施形態６３～８８のいずれか１つの方法。
９０．ポリペプチドが、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約８０％の効率で産生され、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置する、実施形態６３～８９のいずれか１つの方法。
９１．操作されたｔＲＮＡ変異体が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化される、実施形態６３～９０のいずれか１つの方法。
９２．操作されたｔＲＮＡ変異体が、非標準アミノ酸でアシル化される、実施形態６３～９１のいずれか１つの方法。
９３．操作されたｔＲＮＡ変異体が、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入し、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分である、実施形態６３～９２のいずれか１つの方法。
９４．ｍＲＮＡが、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含む、実施形態６３～９３のいずれか１つの方法。
９５．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、同じ停止コドンである、実施形態９４の方法。
９６．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、異なる停止コドンである、実施形態９４の方法。
９７．操作されたｔＲＮＡ変異体が、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡである、実施形態６３～９６のいずれか１つの方法。
９８．操作されたｔＲＮＡ変異体が、操作されたｔＲＮＡ前駆体である、実施形態６３～９７のいずれか１つの方法。
９９．操作されたｔＲＮＡ変異体が、イントロン配列を含む、実施形態９８の方法。
１００．イントロン配列が、操作されたｔＲＮＡ変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡ変異体を産生する、実施形態９８の方法。
１０１．対象がヒトである、実施形態６３～１００のいずれか１つの方法。
１０２．ヒトが、約生誕時～約４０歳の年齢である、実施形態１０１の方法。
１０３．ヒトが、約６カ月間～約１５歳の年齢である、実施形態１０１の方法。
１０４．ヒトが、胚または胎児である、実施形態１０１の方法。
１０５．疾患または状態が、レット症候群を含む、実施形態６３～１０４のいずれか１つの方法。
１０６．疾患または状態が、嚢胞性線維症を含む、実施形態６３～１０４のいずれか１つの方法。
１０７．疾患または状態が、網膜色素変性症を含む、実施形態６３～１０４のいずれか１つの方法。
１０８．疾患または状態が、難聴を含む、実施形態６３～１０４のいずれか１つの方法。
１０９．難聴が、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含む、実施形態１０８の方法。
１１０．未成熟停止コドンが、オパール停止コドンである、実施形態６３～１０９のいずれか１つの方法。
１１１．投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することである、実施形態６３～１１０のいずれか１つの方法。
１１２．投与することは、非経口投与することであり、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳投与すること、脳室内投与すること、頭蓋内、実質への頭蓋内、または腹腔内投与することである、実施形態６３～１１１の方法。
１１３．ポリペプチドが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１４．ポリペプチドが、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１５．ポリペプチドが、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１６．ポリペプチドが、ＭＹＨ９ポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１７．ポリペプチドが、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１８．ポリペプチドが、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含む、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１１９．投与することが、期間中、少なくとも２回行われる、実施形態６３～１１２のいずれか１つの方法。
１２０．期間が、約２４時間である、実施形態１１９の方法。
１２１．疾患または状態を予防する方法であり、予防することが、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを対象に予防投与することを含む、実施形態６３～１２０のいずれか１つの方法。
１２２．操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドが、対象に投与される、実施形態６３～１２１のいずれか１つの方法。
１２３．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態６３～１２２の方法。
１２４．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである、実施形態１２３の方法。
１２５．ＡＡＶベクターが、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含む、実施１２４の方法。
１２６．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含む、実施１２４または１２５の方法。
１２７．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクターである、実施形態１２４～１２６のいずれか１つの方法。
１２８．操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、デリバリーシステムに存在する、実施形態６３～１２７のいずれか１つの方法。
１２９．デリバリーシステムが、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１２８の方法。
１３０．（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含むＲＮＡ編集ポリヌクレオチドを含むか、またはコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することをさらに含み、ポリヌクレオチド配列が、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員し、編集実体は、ＲＮＡ編集ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触されたとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態６３～１２９のいずれか１つの方法。
１３１．編集実体が、
ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；
ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；
ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または
ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメント、（ａ）のＡＤＡＲポリペプチド、または（ｂ）のＡＰＯＢＥＣポリペプチドを含む融合タンパク質を含む、実施形態１３０の方法。
１３２．疾患または状態が、レット症候群を含み、ｍＲＮＡが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンが、オパール停止コドンであり、操作されたｔＲＮＡが、アルギニルｔＲＮＡであり、対象が、０～６歳の年齢のヒトであり、操作されたｔＲＮＡ変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡ変異体が、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する、実施形態６３の方法。
１３３．操作されたｔＲＮＡ変異体が、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含む、実施形態６３～１３２のいずれか１つの方法。
１３４．操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドが、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含む医薬単位投薬形態で含まれる、実施形態６３～１３３のいずれか１つの方法。
１３５．対象が、疾患または状態を有すると診断されている、実施形態６３～１３４のいずれか１つの方法。
１３６．診断が、インビトロ診断検査によって決定されている、実施形態１３５の方法。
１３７．配列番号３～２２のいずれかに提供される配列に関して、１つまたは複数の突然変異を含む操作されたｔＲＮＡ変異体を含む、組成物。
１３８．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号２３～配列番号４８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、実施形態１３７の組成物。
１３９．操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３～２２のいずれかに提供される配列を含む参照ｔＲＮＡと比較して、操作されたｔＲＮＡの配列における１つまたは複数の突然変異を含み、操作されたｔＲＮＡ変異体は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンを認識し、ｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換して、実質的に全長のポリペプチドを産生する、組成物。
１４０．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号６と少なくとも７０％同一であり、配列番号６の２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９、または７１位に置換を有する配列を含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１４１．２位での置換が、Ｃへの置換であり、４位での置換が、Ｃへの置換であり、６位での置換が、Ｔへの置換であり、６位での置換が、Ａへの置換であり、１２位での置換が、Ｃへの置換であり、２３位での置換が、Ｇへの置換であり、２７位での置換が、Ｃへの置換であり、２８位での置換が、Ｃへの置換であり、３１位での置換が、Ｃへの置換であり、３９位での置換が、Ｇへの置換であり、４０位での置換が、Ｃへの置換であり、４２位での置換が、Ｇへの置換であり、４３位での置換が、Ｇへの置換であり、４４位での置換が、Ｇへの置換であり、４６位での置換が、Ａへの置換であり、４９位での置換が、Ｇへの置換であり、５０位での置換が、Ｔへの置換であり、６４位での置換が、Ａへの置換であり、６５位での置換が、Ｃへの置換であり、６７位での置換が、Ａへの置換であり、６７位での置換が、Ｔへの置換であり、６９位での置換が、Ｇへの置換であり、７１位での置換が、Ｃへの置換であり、または７１位での置換が、Ｇへの置換である、実施形態１４０の組成物。
１４２．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、複数の置換を含む、実施形態１４０または１４１の組成物。
１４３．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換（複数可）を除いて、配列番号６と同一である、実施形態１４０～１４２のいずれか１つの組成物。
１４４．操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号６に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す、実施形態１４０～１４３のいずれか１つの組成物。
１４５．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３と少なくとも７０％同一であり、配列番号３の２、６、１３、１５、２２、２８、３１、３７、３９、４２、４４、５０、６４、６７、７１、または７２位に置換を有する配列を含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１４６．２位での置換が、Ｇへの置換であり、６位での置換が、Ｇへの置換であり、１３位での置換が、Ｃへの置換であり、１５位での置換が、Ｇへの置換であり、２２位での置換が、Ｇへの置換であり、２８位での置換が、Ｃへの置換であり、３１位での置換が、Ａへの置換であり、３７位での置換が、Ｇへの置換であり、３９位での置換が、Ｔへの置換であり、４２位での置換が、Ｇへの置換であり、４４位での置換が、Ａへの置換であり、５０位での置換が、Ｃへの置換であり、６４位での置換が、Ｇへの置換であり、６７位での置換が、Ｃへの置換であり、７１位での置換が、Ｃへの置換であり、または７２位での置換が、Ｃへの置換である、実施形態１４５の組成物。
１４７．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、複数の置換を含む、実施形態１４５または１４６の組成物。
１４８．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換（複数可）を除いて、配列番号３と同一である、実施形態１４５～１４７のいずれか１つの組成物。
１４９．操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号３に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す、実施形態１４５～１４８のいずれか１つの組成物。
１５０．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号５と少なくとも７０％同一であり、配列番号５の７３位に置換を有する配列を含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１５１．位置７３での置換が、Ｇへの置換である、実施形態１５０の組成物。
１５２．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、複数の置換を含む、実施形態１５０または１５１の組成物。
１５３．操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換を除いて、配列番号５と同一である、実施形態１５０～１５２のいずれか１つの組成物。
１５４．操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号５に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す、実施形態１５０～１５３のいずれか１つの組成物。
１５５．１つまたは複数の突然変異が、互いにワトソン・クリック塩基対形成しない操作されたｔＲＮＡ変異体のアクセプターステムまたはアンチコドンステムにおける少なくとも２つのヌクレオチドの、ワトソン・クリック塩基対形成する少なくとも２つのヌクレオチドでの置換を含む、実施形態１５０の組成物。
１５６．操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド２位にシトシンおよびヌクレオチド７１位にグアニンを含む、実施形態１５０～１５３のいずれか１つの組成物。
１５７．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７２位におけるチミンのシトシンでの置換を含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの方法。
１５８．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド７１位においてシトシンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド２２位およびヌクレオチド７１位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１５９．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてグアニンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド６７位においてシトシンで置換されたチミンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６０．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド１３位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド２２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド１３位およびヌクレオチド２２位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６１．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド１５位におけるグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６２．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６３．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド３１位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド３９位においてチミンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６４．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド３７位におけるグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６５．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位におけるアデニンで置換されたグアニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６６．１つまたは複数の突然変異が、配列番号３または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７３位におけるグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６７．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位が、配列番号４または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６８．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてアデニンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１６９．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド４９位においてグアニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６５位においてシトシンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド４９位およびヌクレオチド６５位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７０．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド５０位においてチミンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６４位においてアデニンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド５０位およびヌクレオチド６４位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７１．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド７１位におけるグアニンで置換されたチミンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７２．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド４位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド６９位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド４位およびヌクレオチド６９位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７３．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド６位においてアデニンで置換されたシトシンおよびヌクレオチド６７位においてチミンで置換されたグアニンを含み、ヌクレオチド６位およびヌクレオチド６７位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７４．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド１２位においてシトシンで置換されたグアニンおよびヌクレオチド２３位においてグアニンで置換されたシトシンを含み、ヌクレオチド１２位およびヌクレオチド２３位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７５．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２７位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４３位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２７位およびヌクレオチド４３位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７６．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド２８位においてシトシンで置換されたチミンおよびヌクレオチド４２位においてグアニンで置換されたアデニンを含み、ヌクレオチド２８位およびヌクレオチド４２位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７７．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４０位におけるシトシンで置換されたチミンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７８．１つまたは複数の突然変異が、ヌクレオチド３１位においてシトシンで置換されたアデニンおよびヌクレオチド３９位においてグアニンで置換されたチミンを含み、ヌクレオチド３１位およびヌクレオチド３９位が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関してである、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１７９．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４４位におけるグアニンで置換されたアデニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１８０．１つまたは複数の突然変異が、配列番号６または参照ｔＲＮＡの５’末端に関して、ヌクレオチド４６位におけるアデニンで置換されたグアニンを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの組成物。
１８１．ポリペプチドが、
ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすること、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡが、未成熟停止コドンを含む；
ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすること、同等のスクリーニングｍＲＮＡは、未成熟停止コドンを含まない；および
ｃ）第１のヒト細胞から放出される蛍光の量と第２のヒト細胞から放出される蛍光の量を比較することによって決定される、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率で産生される、実施形態１３７～１８０のいずれか１つの組成物。
１８２．ポリペプチドが、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約８０％の効率で産生され、これにより、対象における疾患または状態を少なくとも一部、処置する、実施形態１８１の組成物。
１８３．操作されたｔＲＮＡ変異体が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリジン、およびセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸でアシル化される、実施形態１３７～１８２のいずれか１つの組成物。
１８４．操作されたｔＲＮＡ変異体が、非標準アミノ酸でアシル化される、実施形態１３７～１８２のいずれか１つの組成物。
１８５．操作されたｔＲＮＡ変異体が、ｍＲＮＡの翻訳中に、インビボで未成熟停止コドンに応答して、アミノ酸を、ｍＲＮＡによってコードされる新生ＭｅＣＰ２ポリペプチド鎖に挿入し、アミノ酸は、挿入されたとき、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生される同等のＭｅＣＰ２ポリペプチドと比較して、少なくとも一部の機能的なＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生するのに十分である、実施形態１３７～１８２のいずれか１つの組成物。
１８６．ｍＲＮＡが、少なくとも２つの未成熟停止コドンを含む、実施形態１３７～１８５のいずれか１つの組成物。
１８７．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、同じ停止コドンである、実施形態１８６の組成物。
１８８．少なくとも２つの未成熟停止コドンが、異なる停止コドンである、実施形態１８６の組成物。
１８９．操作されたｔＲＮＡ変異体が、リジルｔＲＮＡ、アルギニルｔＲＮＡ、ヒスチジルｔＲＮＡ、グリシルｔＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ、バリルｔＲＮＡ、ロイシルｔＲＮＡ、イソロイシルｔＲＮＡ、メチオニルｔＲＮＡ、フェニルアラニルｔＲＮＡ、トリプトファニル－ｔＲＮＡ、プロリルｔＲＮＡ、セリルｔＲＮＡ、スレオニルｔＲＮＡ、システイニルｔＲＮＡ、チロシルｔＲＮＡ、アスパラギニルｔＲＮＡ、グルタミニルｔＲＮＡ、アスパルチルｔＲＮＡ、ピロールリジルｔＲＮＡ、セレノシスチルｔＲＮＡまたはグルタミル－ｔＲＮＡである、実施形態１３７～１８８のいずれか１つの組成物。
１９０．操作されたｔＲＮＡ変異体が、操作されたｔＲＮＡ前駆体である、実施形態１３７～１８９のいずれか１つの組成物。
１９１．操作されたｔＲＮＡ変異体が、イントロン配列を含む、実施形態１９０の組成物。
１９２．イントロン配列が、操作されたｔＲＮＡ変異体を含有する細胞内でスプライシングされ、これにより、成熟な操作されたｔＲＮＡ変異体を産生する、実施形態１９１の組成物。
１９３．対象がヒトである、実施形態１３７～１９２のいずれか１つの組成物。
１９４．ヒトが、約生誕時～約４０歳の年齢である、実施形態１９３の組成物。
１９５．ヒトが、約６カ月間～約１５歳の年齢である、実施形態１９３の組成物。
１９６．ヒトが、胚または胎児である、実施形態１９３の組成物。
１９７．疾患または状態が、レット症候群を含む、実施形態１３７～１９６のいずれか１つの組成物。
１９８．疾患または状態が、嚢胞性線維症を含む、実施形態１３７～１９６のいずれか１つの組成物。
１９９．疾患または状態が、網膜色素変性症を含む、実施形態１３７～１９６のいずれか１つの組成物。
２００．疾患または状態が、難聴を含む、実施形態１３７～１９６のいずれか１つの組成物。
２０１．難聴が、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴、または常染色体優性１１難聴を含む、実施形態２００の組成物。
２０２．未成熟停止コドンが、オパール停止コドンである、実施形態１３７～２０１のいずれか１つの組成物。
２０３．投与することは、経口投与すること、直腸投与すること、または非経口投与することである、実施形態１３７～２０２のいずれか１つの組成物。
２０４．投与することは、非経口投与することであり、非経口投与することは、静脈内投与すること、動脈内投与すること、くも膜下腔内投与すること、眼内投与すること、耳投与すること、脳室内投与すること、または腹腔内投与することである、実施形態１３７～２０３のいずれか１つの組成物。
２０５．ポリペプチドが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２０６．ポリペプチドが、ＦｏｘＧ１ポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２０７．ポリペプチドが、ＣＤＫＬ５ポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２０８．ポリペプチドが、ＭＹＨ９ポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２０９．ポリペプチドが、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２１０．ポリペプチドが、ＭＹＯ７Ａポリペプチドを含む、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２１１．投与することが、期間中、少なくとも２回行われる、実施形態１３７～２０４のいずれか１つの組成物。
２１２．期間が、約２４時間である、実施形態２１１の組成物。
２１３．疾患または状態を予防する組成物であり、予防することが、操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを対象に予防投与することを含む、実施形態１３７～２１２のいずれか１つの組成物。
２１４．操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドが、対象に投与される、実施形態１３７～２１３のいずれか１つの組成物。
２１５．ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターである、実施形態２１４の組成物。
２１６．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである、実施形態２１５の組成物。
２１７．ＡＡＶベクターが、複製遺伝子を含むゲノムならびに第１のＡＡＶ血清型由来の逆位末端反復および第２のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含む、実施形態２１６の方法。
２１８．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、またはＡＡＶ２／９ベクターを含む、２１６または２１７の方法。
２１９．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクターである、実施形態２１６～２１８のいずれか１つの方法。
２２０．操作されたｔＲＮＡ変異体または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、デリバリーシステムに存在する、実施形態１３７～２１９のいずれか１つの組成物。
２２１．デリバリーシステムが、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態２２０の組成物。
２２２．ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含む組成物を投与することをさらに含み、ポリヌクレオチド配列が、（ｉ）動員領域および（ｉｉ）標的化領域を含み、ポリヌクレオチド配列が、動員領域の少なくとも一部を介して編集実体を動員し、編集実体が、ポリヌクレオチド配列およびｍＲＮＡと接触されたとき、ｍＲＮＡの未成熟停止コドンのヌクレオチドの塩基上で化学修飾を行い、これにより、未成熟停止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態１３７～２２１のいずれか１つの組成物。
２２３．編集実体が、
ａ）ＡＤＡＲポリペプチド；
ｂ）ＡＰＯＢＥＣポリペプチド；
ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の生物学的に活性なフラグメント；または
ｄ）（ｃ）の生物学的に活性なフラグメント、（ａ）のＡＤＡＲポリペプチド、または（ｂ）のＡＰＯＢＥＣポリペプチドを含む融合タンパク質を含む、実施形態２２２の組成物。
２２４．疾患または状態が、レット症候群を含み、ｍＲＮＡが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードし、未成熟停止コドンが、オパール停止コドンであり、操作されたｔＲＮＡが、アルギニルｔＲＮＡであり、対象が、０～６歳の年齢のヒトであり、操作されたｔＲＮＡ変異体が、対象にＡＡＶベクターとして投与されたとき、操作されたｔＲＮＡ変異体が、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳中に、未成熟停止コドンのアルギニンセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、実質的に全長のＭｅＣＰ２ポリペプチドを産生し、これにより、レット症候群を少なくとも一部、処置する、実施形態２２３の組成物。
２２５．操作されたｔＲＮＡ変異体が、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸塩基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組合せを含む化学修飾を含む、実施形態１３７～２２４のいずれか１つの組成物。
２２６．単離される、実施形態１３７～２２５のいずれか１つの組成物。
２２７．実施形態１３７～２２６の組成物および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、医薬組成物。
２２８．実施形態１３７～２２７のいずれか１つの組成物を含む、単離された細胞。
２２９．実施形態１３７～２２８のいずれか１つの組成物を含む、単離された複数の細胞。
２３０．実施形態１３７～２２９のいずれか１つの組成物の操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
２３１．（例えば、５’から３’の順に）：
ａ）第１のプロモーター；
ｂ）第１の定量カセット；
ｃ）第２のプロモーター；
ｄ）第２の定量カセット；
ｅ）第３のプロモーター；
ｆ）操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子；
ｇ）検出可能なポリペプチドをコードするレポーター遺伝子；または
ｈ）それらの任意の組合せをさらに含む、実施形態２３０のベクター。
２３２．ポリヌクレオチドが、プロモーターの５’ＩＴＲ上流およびレポーター遺伝子の３’ＩＴＲ下流をさらに含む、実施形態２３１のベクター。
２３３．本明細書において、検出可能なポリペプチドが、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ－ガラクトシダーゼを含む、実施形態２３１または２３２のベクター。
２３４．本明細書において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、Ｕ６プロモーターが、メチル化されてもよいか、またはＵ６プロモーターが、マウスＵ６プロモーターであってもよい、実施形態２３１のベクター。
２３５．本明細書において、第３のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、実施形態２３１のベクター。
２３６．精製されるか、または単離される、実施形態２３１～２３５のいずれか１つのベクター。
２３７．ａ）実施形態１３７～２２６のいずれか１つの組成物、実施形態２２７の医薬組成物、実施形態２２８もしくは２２９の単離された細胞（複数可）、または実施形態２３０～２３６のいずれか１つのベクター；および
ｂ）組成物を保存するために構成された容器を含む、キット。
２３８．操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを、骨格ベクター配列の導入遺伝子に導入することを含む、実施形態２３０～２３６のいずれか１つのベクターを生成する方法。
２３９．操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体に導入する工程を含む、実施形態２２７の医薬組成物を生成する方法。

ＶＩ．実施例
以下の実施例は、説明としての目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されない。

［実施例１］
操作したアルギニンｔＲＮＡ
５つの天然に存在するヒトアルギニン（Ａｒｇ）ｔＲＮＡイソデコーダーが存在する。本実施例では、５つのＡｒｇイソデコーダーのそれぞれを、オパール停止コドンを認識するためのアンチコドン配列に突然変異させて、骨格ベクターにクローニングした（本明細書において以下、Ａｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーとして言及する）。図１に示す、これらのベクターは、それぞれのＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーの１つのコピー（左）または２つのコピー（右）を含有していた。一方のコピーは、ヒトＵ６プロモーター下にあり、他方は、マウスＵ６プロモーター（ｍＵ６）下にあるものであった。しかしながら、Ａｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーの両方のコピーは、それらの内在性プロモーターを保持していた。それぞれの構築物はまた、トランスフェクション効率の評価を可能にするためのｍＣｈｅｒｒｙタグの発現をもたらすＣＭＶ－プロモーターを含有していた。それぞれのベクターは、ＩＴＲ領域に特異的なプライマーを使用するｑＰＣＲによる定量のため使用した、末端逆位配列（ＩＴＲ）領域をさらに含有していた。図１（右）は、操作したｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーをコードする遺伝子の２つのコピーを含む、本明細書に記載する構築物を示し、図１（左）は、マウスＵ６プロモーター下ではなく、ヒトＵ６プロモーター下に、操作したｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーをコードする遺伝子の１つのコピーのみを含むベクターの例を示す。本明細書に記載するベクターを使用して、操作したＡｒｇｔＲＮＡ分子のライブラリーを生成して、抑制効率についてスクリーニングした。

図２Ａは、ヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造を説明する。図２Ｂは、本明細書に開示される操作ｔＲＮＡを生成するために突然変異誘発から除外されたヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサス二次構造および配列における部位を説明する。コンセンサス二次構造およびヒトＡｒｇｔＲＮＡの配列。切り出した残基（黒色の線を付す）は、一部の実施形態による操作した抑制因子ｔＲＮＡを作製するための標的化変異誘発のための推定部位を選択しながら除外した、高度に保存された位置／ヌクレオチドを示す。

［実施例２］
操作したｔＲＮＡ分子のｍＲＮＡ編集効率
Ｋ５６２細胞における破壊したルシフェラーゼスクリーニング
Ｋ５６２細胞を操作して、Ｒ４１Ｘ（図１０Ａ中の中央の線）またはＲ７３Ｘ（図１０Ａ中の下の線）未成熟オパール停止コドン、Ｘは、オパール停止コドンを表す、のいずれかによって破壊したルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現させた（図１０Ａ）。図３９は、野生型（ＷＴルシフェラーゼならびに野生型活性のパーセントで示すルシフェラーゼ）と比較して、いくつかのこのような突然変異に起因した、ルシフェラーゼ活性の喪失の例を示す。破壊したルシフェラーゼトランスフェクションプロセスの模式図を、図１０Ｂに提供し得る。アミノ酸位置は、ルシフェラーゼをコードする全長鋳型ｍＲＮＡと比べることができる。これらの操作した細胞を、２つの生物学的複製物のそれぞれについて二重で、上記のＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーを用いてヌクレオフェクションした（ＳＦ緩衝液、ＦＦ１２０プログラム、１ウェル当たりＤＮＡ１μｇ、１ウェル当たり細胞２００Ｋ個）。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼを、ＰｒｏｍｅｇａＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｎ１１１０）によって、培地５０μｌを使用して測定し、ｍＲＮＡを、製造元の指示に従い、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＰｌｕｓキット（７４１３６）によって細胞溶解物から単離した。ｍＣｈｅｒｒｙを有する操作したｔＲＮＡおよびその変異体のため使用したベクター設計の模式図を、図１４Ａに示す。ベクターは、２つのＵ６プロモーターの上流に位置する操作したｔＲＮＡまたはその変異体の２つのコピーを有していた。一方は、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターであり、他方は、マウスＵ６（ｍＵ６）プロモーターであった。スクリーニングを、一過性のトランスフェクションを使用して行った。ルシフェラーゼ読み取り値を、１０００ｍｓの測定時間でＶａｒｉｏｓｋａｎＬＵＸによって得た。ｍＣｈｅｒｒｙのｍＲＮＡ発現を、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ４４４４５５７）およびＦＡＭコンジュゲートＴａｑＭａｎプローブ（Ｍｒ０７３１９４３９＿ｍｒ）を使用して、定量的ＰＣＲ（ＢｉｏｒａｄＣＦＸＣｏｎｎｅｃｔ）によって得た。ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ発現を、二重の技術的複製物において測定した。一方の技術的複製物は、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔを含有しており、他方の技術的複製物は、ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈ（ＶＩＣコンジュゲートＴａｑＭａｎプローブ）を含有していた。これらの技術的複製物を平均化し、次に、これを使用して、トランスフェクション効率についてその代表的ならびに対照のルシフェラーゼ読み取り値を標準化した。それぞれのデータポイントは、図１０Ｃに示す通り、２つの生物学的複製物の平均の標準誤差（＋／－ＳＥＭ）と共に平均を表す。

ＨＥＫ２９３細胞における破壊したＧＦＰスクリーニング。
ＨＥＫ２９３を、上記の通り、図１４Ａに示すベクターならびにＲ７４ＸまたはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（３００ｎｇ）、Ｘは、オパール停止コドンを表す（図１１Ａ）のいずれかによって破壊したＧＦＰ遺伝子（ＳＴ２１骨格）を含有する構築物を使用して、Ａｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダー（３００ｎｇ）（例えば、２０のＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーのセット由来）を用いてトランスフェクトした。アミノ酸位置は、ＧＦＰをコードする全長鋳型ｍＲＮＡと比べることができる。ＳＴ２１（例えば、配列番号５１）ベクターマップを、図１１Ｅに提供する。トランスフェクションを、ＤＮＡと２：１の比で、製造元の指示に従い、ＴｒａｎｓＩＴ２９３試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏＭＩＲ２７０５）を使用して達成した。細胞３０Ｋ～６０Ｋ個を、１ウェル毎に播種し、１ウェル当たりの細胞数を、それぞれの生物学的複製物において一定に維持した。４８および７２時間後、細胞を、１：２０００希釈で１５分間、生死判別色素であるＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔを用いて染色し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を除去するため、細胞を選択した（例えば、フローサイトメトリーＦＡＣＳマシーンを使用してゲーティング）。それぞれのＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーの順序は、４８時間ポイントと７２時間ポイントの間で同一であったが、ＧＦＰ発現の強度は、４８時間ポイントでより強かった。従って、図１１Ｂ～１１Ｄにおいて描かれたグラフは全て、４８時間のデータを反映する。それぞれのデータポイントは、図１１Ｂ～１１Ｄに示す通り、３つの生物学的複製物の平均の標準誤差（＋／－ＳＥＭ）と共に平均を表す。図１１Ｂ～１１Ｄにおいて、生細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙに基づき、（例えば、フローサイトメトリーＦＡＣＳゲーティングによって）さらに選択して、ＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子を受け取った生細胞の集団を選択し、次に、ＧＦＰによって、操作した破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した細胞（ｔＲＮＡ＋）を含有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子の集団を選択した。図１１Ｆは、二重のトランスフェクションシステムを模式的に示し、ＨＥＫ２９３を、Ａｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダー（３００ｎｇ）（例えば、２０のＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダーのセット由来）ならびにＲ７４ＸまたはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（３００ｎｇ）、Ｘは、オパール停止コドンを表す、のいずれかによって破壊したＧＦＰ遺伝子（ＳＴ２１骨格）を含有する構築物を用いてトランスフェクトし、Ｒ７４ＸまたはＲ９７Ｘを、図１１Ａに示す。分析の結果を、図１１Ｂに示す。図１１Ｂにおいて、ｙ軸は、ＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞のパーセンテージを示し、リードスルーが、ＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子を受け取った細胞（ｔＲＮＡ＋細胞）の出現率であり得ることを示し得る。２０のうち１４のＶ１．０イソデコーダーにおいて、操作したｔＲＮＡを発現する細胞の５０％以上が、ＰＴＣ抑制の存在を有する。図１１Ｃにおいて、ｙ軸は、破壊したＧＦＰおよび操作したＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子をトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、破壊していないＧＦＰ（対照細胞）でトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰＭＦＩに標準化することによって、抑制されたＰＴＣの総パーセントを示す。２０のうち８のＶ１．０イソデコーダーにおいて、ＰＴＣの７０％以上が、リードスルーを示している細胞において抑制される。図１１Ｇは、図１１Ｃに示す結果を得るために使用した、破壊していないＧＦＰと比較して、ｍＣｈｅｒｒｙタグを有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子を使用して破壊したＧＦＰにおけるオパール停止コドンの抑制プロセスを模式的に示す。図１１Ｄにおいて、ｙ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現によって測定する、操作したＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子をトランスフェクトした細胞に標準化した、破壊したＧＦＰおよび操作したＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子をトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰＭＦＩを示す。ｔＲＮＡ効力についてのこの代理を使用して、２０のうちの５つのＶ１．０イソデコーダーは、そうでなければそれらがし得るより、比較的に少ないｔＲＮＡを得て、ＰＴＣを抑制することができる。図１１Ｄに示す、２０のうち４つの操作したｔＲＮＡ（それぞれが、配列番号４、配列番号２２、配列番号６、または配列番号７のいずれか１つを含む）の蛍光画像化データを、図１２において提供する。使用したＳＴ２１骨格プラスミドの配列を、配列番号５１として含む。

図１２は、細胞におけるＧＦＰ産生に基づき、低い効率、中程度の効率、または高い効率の抑制因子活性のＡｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダー（例えば、操作されたｔＲＮＡは、配列番号４、配列番号２２、配列番号６、または配列番号７の１つを含む）を同定するためのフローサイトメトリー結果を示す。生細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙに基づき、（例えば、フローサイトメトリーＦＡＣＳゲーティングによって）選択して、ＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子を受け取った生細胞の集団を選択し、次に、ＧＦＰによって、操作された破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した細胞（ｔＲＮＡ＋）を含有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子の集団を選択した。図１２におけるｙ軸は、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子でトランスフェクションした細胞を示す、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を示し、ｘ軸は、破壊したＧＦＰでトランスフェクトした細胞を示す、ＧＦＰ発現を示す。高いＧＦＰ発現は、ＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子によって破壊したＧＦＰ遺伝子における成熟停止コドン前駆体の首尾良いリードスルーを示す。言い換えると、より高い活性の抑制因子ｔＲＮＡ（Ａｒｇ－ｔＲＮＡ（ＵＧＡ）イソデコーダー）は、存在する比較的低いｔＲＮＡ分子によって産生される破壊したＧＦＰ遺伝子由来のより高いレベルのＧＦＰ産生をもたらすことができる。効力についての代理を、グラフの曲線を調べることによって観察することができる。２０の操作されたｔＲＮＡの蛍光画像化結果の分析を、本明細書に記載する通り、図１１Ｄにおいて提供する。

［実施例３］
Ａｒｇイソデコーダーにおける突然変異は、より良好な抑制効率を生じる
本明細書に記載する様々な突然変異またはその変異体（もしくはＡｒｇｔＲＮＡイソデコーダー）の役割を解明するために、１０の突然変異を、「ＣＣＴ」のアンチコドン配列を有する操作されたｔＲＮＡ配列番号３の操作されたｔＲＮＡ配列に導入して、操作したｔＲＮＡ変異体配列番号２３～３２を得、これを、図３Ａにおいて図として説明する。アクセプターステムを安定化すると考えられる突然変異は、Ｇ１Ｔ７２からＧ１Ｃ７２、Ｃ２Ｇ７１からＧ２Ｃ７１、および／またはＡ６Ｔ６７からＧ６Ｃ６７を含むが、これらに限定されない。操作されたｔＲＮＡのＤステム領域を安定化すると考えられる突然変異は、Ｔ１３Ａ２２からＣ１３Ｇ２２を含むが、これらに限定されない。アンチコドンステムを安定化すると考えられる突然変異は、Ｔ２８Ａ４２からＣ２８Ｇ４２を含むが、これらに限定されない。Ｔステムを安定化すると考えられる突然変異は、Ｔ５０Ａ６４からＣ５０Ｇ６４を含むが、これらに限定されない。ヒトｔＲＮＡのコンセンサスＡボックスプロモーター配列と一致する突然変異は、Ａ１５からＧ１５を含む。ヒトＡｒｇｔＲＮＡのコンセンサスアンチコドンステム配列と一致する突然変異は、Ｃ３１Ｇ３９からＡ３１Ｔ３９を含む。コンセンサス配列は、全てのヒトＡｒｇｔＲＮＡイソデコーダー（例えば、図２に示す）のアライメントの際に生じ得る。２０のうちの１４の固有のＡｒｇｔＲＮＡ配列は、Ａ３１Ｔ３９を有し、これにより、コンセンサス配列の塩基対部分を付与する。しかしながら、ＣＣＴイソデコーダーは、Ｃ３１Ｇ３９を有し、抑制効率を評価するために、コンセンサスＡ３１Ｔ３９と一致するよう修飾した。コンセンサスヒトＡｒｇ配列と一致する突然変異は、Ｇ４４Ａを含む。アンチコドンのすぐ下流の＋１位を変更させる、Ａ３７Ｇを含む突然変異を生じさせた。アンチコドン領域は、塩基３４～３６を含むことができる。＋１位は、３７位とみなすことができ、従って、突然変異Ａ３７Ｇを作製して、アンチコドン領域の右横の塩基の変更の、抑制効率に対する効果を評価した。

同様に、１４つの突然変異を、「ＴＣＴ」のアンチコドン配列を有する配列番号６の操作したｔＲＮＡ配列に導入して、それぞれが、配列番号３５～４８の配列を含む、１４の操作されたｔＲＮＡ変異体を生成し、これを、図３Ｂにおいて図で説明する。親ｔＲＮＡ配列番号６およびその１４の変異体の配列を、配列番号３５～４８として表３において提供する。アクセプターステムを安定化する突然変異は、Ｇ２Ｔ７１からＧ２Ｃ７１、Ｇ２Ｔ７１からＣ２Ｇ７１、Ｔ４Ａ６９からＣ４Ｇ６９を含むが、これらに限定されないと考えることができる。アンチコドンステムを安定化すると考えられるいくつかの代表的な突然変異は、コンセンサスＡｒｇｔＲＮＡ配列と比較して、Ｔ２８Ａ４２からＣ２８Ｇ４２、Ｇ３０Ｔ４０からＧ３０Ｃ４０、Ｔ２７Ａ４３からＣ２７Ｇ４３、またはＡ３１Ｔ３９からＣ３１Ｇ３９（例えば、操作されたｔＲＮＡ変異体配列番号３７、４２、４８、２９、３１における）を含む。配列番号３６において、Ｃ４９を、Ｇ４９に変更して、コンセンサスＡｒｇｔＲＮＡ配列と部分的に一致させ、配列番号２７のＡ１５における突然変異を、Ｇ１５に変更して、単にＡｒｇｔＲＮＡ配列ではなく、全てのヒトｔＲＮＡのコンセンサスＡボックス配列と一致させることができる。変異体ｔＲＮＡ配列を、表３に提供する。操作されたｔＲＮＡ配列におけるコンセンサス配列と一致する突然変異は、Ｃ４９からＧ４９、Ｃ５０Ｇ６４からＴ５０Ａ６４、Ｇ１２Ｃ２３からＣ１２Ｇ２３、またはＧ４６Ａを含むが、これらに限定されない。配列番号３と一致する配列番号６に対して作製した突然変異は、Ｃ６Ｇ６７からＡ６Ｔ６７、Ａ４４ＧおよびＴ２７Ａ４３からＣ２７Ｇ４３を含む。他のＴＣＴイソデコーダー配列（例えば、配列番号９～０１２）と一致する突然変異は、Ｃ６Ｇ６７からＴ６Ａ６７を含む。上記の突然変異を含有する変異体を作製して、これらの変更の、操作したｔＲＮＡの抑制効率に対する効果を評価した。

［実施例４］
抑制効率についての操作されたｔＲＮＡ分子のスクリーニング
本明細書に記載する、操作された抑制因子ｔＲＮＡを、実施例１に記載した通り、ｍＣｈｅｒｒｙタグを含むプラスミドベクターにクローニングした。代表的なワークフロープロセスを、図４に示し得る。プラスミドを、ヒト胚性腎細胞からもたらされた細胞株である、ＨＥＫ２９３（またはＨＥＫ細胞）にトランスフェクションした。破壊した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムを使用して、ノンセンス突然変異（例えば、Ｒ７４ＸまたはＲ９７Ｘにおける）により、未成熟停止コドンを含むＨＥＫ細胞染色体ＤＮＡに安定的に組み換えた。以下の実施例において、ＨＥＫ細胞を、トランスポゾンに対するＰＢトランスポザーゼ比１：５または１：２．５を使用して、トランスフェクションした。それぞれのデータポイントは、１つの生物学的複製物の平均を標準偏差（＋／－ＳＤ）と共に表す。

図５Ａは、図４に示す破壊したＧＦＰ遺伝子を有するＨＥＫ細胞におけるスクリーニング抑制因子ｔＲＮＡの模式的ワークフローを示す。ＨＥＫ細胞（濃度２０，０００細胞／ウェルで播種した）を、操作された（抑制因子）ｔＲＮＡをコードするプラスミドまたは抑制因子ｔＲＮＡを含まない対照プラスミド３００ナノグラム（ｎｇ）を使用して、４８時間でトランスフェクションした。破壊していないＧＦＰプラスミドを有する配列番号３または６の配列を含む操作されたｔＲＮＡを有するＳＴ２１骨格を、陽性対照（またはベンチマーク）として使用した。不活性なｔＲＮＡプラスミド（例えば、配列番号８の配列、または配列番号１８の配列を含む）ならびにＧＦＰをコードするプラスミド（ＳＴ２１）を、陰性対照として使用した。フローゲーティングを、単一染色およびトランスフェクションしていない細胞に基づき、設定した。リードスルーを、フローサイトメトリーを使用して、トランスフェクションの４８時間後に評価して、ＧＦＰが陽性でもあった、ｔＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の分画を測定した。測定を、生細胞の集団において行った。

図５Ｂは、操作されたｔＲＮＡ配列番号３、または６由来の操作されたｔＲＮＡ変異体を含む操作された抑制因子ｔＲＮＡ変異体、ならびに陽性および陰性対照プラスミドについてのＲ７４Ｘ（黒色の四角）およびＲ９７Ｘ（灰色の四角）におけるｔＲＮＡおよびＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ比を示す。全ての変異体は、保持された抑制因子活性を示した。配列番号３２（５０２）の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体は、約７０％の抑制因子活性（停止コドンリードスルー）を示した。少なくとも約６０％の抑制因子活性を有する変異体を、灰色の四角５０１を使用して示す。４０，０００細胞／ウェルおよびトランスポザーゼ：トランスポゾン比１：５を、本研究のため使用した。データは、それぞれのＧＦＰ構築物についての１つの複製物を示す。

Ｒ７４ＸとＲ７９Ｘ突然変異、Ｘは、オパール停止コドンを表す、の間の抑制因子活性の相関を調べて、突然変異の位置に起因した相違を見出した。図５Ｃは、Ｒ^２値約０．８８での相関を示す。結果は、抑制因子活性は、アルギニン突然変異の位置に実質的に依存しなかったことを示す。加えて、いくつかの高い性能の操作されたｔＲＮＡ変異体それぞれは、配列番号３２、３９、４０、４５、４７、および３４の配列の１つを含んでいた。少なくとも約６０％抑制因子活性を有する操作されたｔＲＮＡ変異体（図５Ｂにおける灰色の四角５０１）を、楕円形５１１を使用して、図５Ｃにおいて印を付ける。

類似の実験を、Ｒ７４Ｘおよび／またはＲ９７Ｘを含む未成熟停止コドンを有する破壊したＧＦＰを安定的に組み込むための細胞におけるトランスポゾンに対するＰＢトランスポザーゼ比１：５、ならびにＲ７４Ｘを含む未成熟停止コドンを有するＧＦＰを組み込むための細胞におけるトランスポゾンに対するＰＢトランスポザーゼ比１：２．５を含む、３つの安定な細胞株において繰り返した。操作された抑制因子ｔＲＮＡ変異体を有する細胞を示す、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセンテージリードスルーの比を、陽性対照（例えば、配列番号３の配列を含む）と比較した（またはこれによって標準化した）。データポイントは、３つの異なる細胞株－Ｒ７４Ｘ（１：２．５）、Ｒ７４Ｘ（１：５）およびＲ９７Ｘ（１：５）に渡る、平均＋／－平均（ＳＤ）からの標準偏差を表す。結果を、図６に示す。平均値を、ＳＤ値を表すエラーバーと共に、濃い四角で示す。全ての変異体は、全ての３つの細胞株において保持された抑制因子活性を示した。

［実施例５］
操作されたｔＲＮＡ分子の二重プラスミドスクリーニング
操作されたｔＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、本明細書に記載する通り、ｍＣｈｅｒｒｙタグを含むベクターに取り込んだ。破壊したＧＦＰタグを含む第２のプラスミドも提供した。ＨＥＫ細胞を、操作されたｔＲＮＡプラスミドおよびＧＦＰプラスミドを同時トランスフェクションした。プラスミドの安定的な組み込みを伴う細胞を、１０～１２日間のピューロマイシン処理（５μｇ／ｍＬ）を使用して、破壊したＧＦＰ構築物の組み込みについて選択した。操作されたｔＲＮＡを有するプラスミドの安定的な組み込みを伴う細胞は、操作されたｔＲＮＡおよびｍＣｈｅｒｒｙを発現していた。両方のプラスミドの安定的な組み込みを伴う細胞は、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを発現していた。図７は、２つのプラスミドを用いて細胞を同時トランスフェクションするプロセス、および両方のプラスミドの安定的な組み込みを伴う細胞を選択するプロセスの模式図を示す。フローサイトメトリーを、トランスフェクションの４８時間後に行った。

［実施例６］
二重プラスミドシステムを使用した抑制効率の測定
ＨＥＫ細胞４０，０００個を、ウェルに播種した。播種の２４時間後に、細胞を、実施例５に記載した、プラスミドのぞれぞれの３００ナノグラム（ｎｇ）を用いてトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に、フローサイトメトリーに供した。両方のプラスミドの安定的な組み込みを伴う細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的平均蛍光強度を測定した。図８Ａは、図７に示す二重のプラスミドスクリーニングシステムを使用した、２つの異なる、Ａｒｇから停止コドンへの突然変異（Ｒ７４ＸおよびＲ９７Ｘ、Ｘは、オパール停止コドンを表す）を含有する操作されたＧＦＰを発現する２つの異なるＨＥＫ細胞における、パーセンテージリードスルー（緑色蛍光を示すｔＲＮＡ／ｍＣｈｅｒｒｙ産生細胞の分画）に関して測定された、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子による未成熟停止コドン抑制の代表的な結果を示す。７４位と９７位における異なるアルギニン突然変異（Ｒ７４ＸおよびＲ９７Ｘ）を有する細胞間で、Ｒ２との非常に高い相関約０．９９を確立した（図８Ｂ）。高い相関は、操作されたｔＲＮＡ抑制因子活性を、異なるアルギニン位置で実質的に保持したことを示す。これらの結果は、灰色の四角８０１（例えば、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号５の配列を含む）を使用して示す、操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体のいくつかが、細胞へのトランスフェクションの際に、高いパーセンテージのＰＴＣリードスルーを有する細胞（９０％より高いｔＲＮＡ＋細胞）を生じたことを示した。

本明細書に記載する、同じ実験の結果を、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルに基づき標準化して、未成熟停止コドン抑制の効率を評価した。従って、抑制効率を、ＧＦＰシグナル（操作されたＧＦＰにおける停止突然変異のリードスルーによって産生）の平均蛍光強度を、ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（ｔＲＮＡ発現レベルと相関する）の平均蛍光強度と標準化することによって、評価することができる。図９Ａは、二重のプラスミドスクリーニングシステムによる、２つの異なる、Ａｒｇから停止への突然変異（Ｒ７４ＸおよびＲ９７Ｘ、Ｘは、オパール停止コドンを表す）を有するＨＥＫ細胞株における未成熟停止コドン抑制の効率を示す。Ａｒｇから停止への突然変異：Ｒ７４ＸおよびＲ９７Ｘを含有する２つの異なる操作されたＧＦＰレポーター間で、Ｒ^２との非常に高い相関約０．８９を確立した（図９Ｂ）。高い相関は、操作されたｔＲＮＡ抑制因子効率を、異なるアルギニン位置で実質的に保持したことを示す。全体として、本明細書に開示する実施例において記載する通り、本明細書に開示するＨＥＫ細胞における抑制因子ｔＲＮＡ活性の結果は、アルギニンイソデコーダーにおける抑制因子ｔＲＮＡ活性を保存し、および／または増強することができるアンチコドン突然変異以外の突然変異のセットを示す。それぞれ配列番号３、３２、３４、３９、４５、および４７の配列を含む複数の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、破壊したＧＦＰレポーターシステムの安定的な発現と一過性の発現の両方にわたり、高いアルギニン抑制因子活性（または停止コドンリードスルー）を示した。図５Ｂ（５０２）および図６に示す配列番号３２の配列を有するｔＲＮＡの結果は、配列番号３２に存在する突然変異（Ｔ５０Ａ６４－＞Ｃ５０Ｇ６４）が、配列番号３ｔＲＮＡをさらに安定化することができ、抑制活性（例えば、効率）の改善を導き得ることを示す。別の例では、天然に存在するイソデコーダー配列番号６において、同じ位置で、Ａ－Ｔ塩基対（例えば、配列番号３７の配列を含む操作されたｔＲＮＡ変異体）へのＧ－Ｃ塩基対変更は、ｔＲＮＡのアルギニン抑制因子活性（例えば、アルギニン抑制効率）を減少することができる。いくつかの実施例において、配列番号３３または配列番号３４に含まれるＡ７３Ｇ突然変異は、抑制因子効率を改善する。結果（図５Ｂ、６、８Ａおよび９Ａ）において、配列番号３９または配列番号４５において作製した、Ｇ－Ｔの非ワトソン・クリック対の、アクセプターステムにおけるＧ－Ｃワトソン・クリック対、またはアンチコドンステムにおけるＣ－Ｇワトソン・クリック対への変更は、アクセプター／アンチコドンステムを安定化することができ、Ｃ－Ｇ結合が、Ｇ－Ｃと比較して、２～７１位で大いに好ましいことを示すことができることも、示すことができる。

［実施例７］
レット症候群モデル
選択した操作されたｔＲＮＡを、Ｒ２５５Ｘレットモデルマウスから回収した初代神経培養物において試験した。図１４Ｂは、初代神経培養物において使用したベクター設計の模式図を示す。ベクターは、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターの上流に位置する選択した操作されたｔＲＮＡまたはその変異体のコピーを含んでいた。ベクターを、レンチウイルス（ｐＳＭＰＵＷ）にパッケージングした。

選択した操作されたｔＲＮＡは、それぞれが、配列番号６、９、１０、１１、２０、３、７、および１３から選択される配列の１つを含む、操作されたｔＲＮＡの８つを含んでおり、破壊したルシフェラーゼスクリーニング実験において強いルシフェラーゼシグナルを生成し、ならびに破壊したＧＦＰスクリーニング実験において強いＧＦＰシグナルを生成した。同じ実験において最も弱いシグナルを生成した、それぞれが、配列番号１９または８の配列を個別に含む、操作されたｔＲＮＡの２つを、陰性対照として使用した。

Ｒ２５５Ｘレットモデルマウスから回収した初代神経培養物を回収するために、出生後０～２日のマウス子を、同じマウス系統の野生型のオスのマウスと交雑したＲ２５５Ｘヘテロのメス（ｔｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０１２６０２）から得た。子を安楽死させて、脳および皮膚試料を回収した。皮膚試料を、遺伝子型判定のため使用した。脳を単離し、小脳を取り除いた。脳の残りの部分を、パパインで消化し、ＬｏオボムコイドおよびＤＮａｓｅで洗浄し、解離させ、７０ミクロンのフィルターを通して濾過した。翌日、細胞培養物を、本明細書に記載する通り、選択した操作されたｔＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いて感染させた。細胞を、解体の１週間後（トランスフェクションの６日後）に回収した。タンパク質精製プロセスを、タンパク質分解酵素阻害因子（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ７８４４４）を含有するＲＩＰＡ緩衝液における機械的解体を使用して、細胞上で行った。ＭｅＣＰ２タンパク質レベルを、ＭｅＣＰ２のＣ末端に対する抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ４９－１０４９）を使用した免疫ブロッティングによって測定した。ＭｅＣＰ２タンパク質の検出を使用して、Ｒ２５５Ｘの操作されたｔＲＮＡリードスルーを調べた。図１５Ａは、配列番号１９の配列を含む操作されたｔＲＮＡ（陰性対照）によるリードスルーの欠如を示す代表的なウエスタンブロット例ならびに配列番号２０、３、および７の配列をそれぞれ含む操作されたｔＲＮＡによる、変動するレベルでの首尾良いリードスルーを示す代表的なウエスタンブロット例を説明する。図１５Ｂは、それぞれの試料におけるＧａｐｄｈシグナル、次いで、野生型対照によって標準化したＭｅＣＰ２ＥＣｌシグナルのヒストグラムを示す。それぞれのカラムは、操作されたｔＲＮＡリードスルーを表し、それぞれのカラム内のそれぞれのデータポイント（濃い円）は、異なるマウスから収集したデータを表す。データは、平均＋／－ＳＥＭ（エラーバー）を表す。

別の研究において、本明細書に記載する、初代神経培養物を、４つの操作されたｔＲＮＡならびにその変異体（例えば、配列番号８、３９、４５、および７）で処理した。フローサイトメトリー結果を、図１６Ａ～１６Ｆに示す。神経培養物を、単離の５日後に感染させ、単離の１週間後（感染の４８時間後）にフローサイトメトリーによって分析した。ウイルスベクター設計を、図１４Ｂに示すことができ、レンチウイルスを使用してもたらした。単一の生細胞を選択した。次に、さらなる選択（フローサイトメトリーゲーティング）を行って、操作されたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ＋細胞）の存在を示すｍＣｈｅｒｒｙシグナル（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）、および最終的にＭｅＣＰ２抗体シグナルも有するニューロン（ＮｅｕＮ＋細胞）についてゲーティングした。選択した集団を、図１６Ａ～１６Ｆにおける異なる処理群について台形を使用して示す。無処理のＲ２５５Ｘ細胞（図１６Ａ）は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レンチウイルスによって形質転換されていないので、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を有さない。操作されたｔＲＮＡ配列番号８で処理したＲ２５５Ｘ細胞は、ごくわずかなＭｅＣＰ２＋集団を示した（図１６Ｂ）。操作されたｔＲＮＡ変異体（例えば、配列番号３９）で処理したＲ２５５Ｘ細胞（図１６Ｃ）、操作されたｔＲＮＡ変異体配列番号４５で処理したＲ２５５Ｘ細胞（図１６Ｄ）、または操作されたｔＲＮＡ配列番号７で処理したＲ２５５Ｘ細胞（図１６Ｅ）は、ＭｅＣＰ２陽性集団におけるそれぞれの増加を示す。事実、操作されたｔＲＮＡ配列番号７で処理した細胞におけるＭｅＣＰ２＋集団分布は、陰性対照として使用した、操作されたｔＲＮＡ配列番号８を感染させた野生型（ＷＴ）集団と同等であった（図１６Ｆ）。ＷＴ対照群を使用して、フローサイトメトリープロセスにおけるゲーティングストラテジーを確実にした。

ニューロンにおけるＭｅＣＰ２発現を測定するために本明細書において使用したフローサイトメトリーを、同じマウス系統の野生型のオスのマウスと交雑させたＲ２５５Ｘヘテロのメス（ｔｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０１２６０２）由来の細胞培養物を使用してさらに検証した。培養物を、本明細書に記載する通り、生成した。図１７Ａ～１７Ｄは、抗体Ｄ４Ｆ３を使用した、ＭｅＣＰ２シグナル結果を説明する。細胞シグナル伝達ＭｅＣＰ２抗体Ｄ４Ｆ３は、野生型（ＷＴ）神経培養物における強い発現（図１７Ａ）、Ｒ２５５Ｘヘテロのメスにおけるおよそ半分の野生型発現（図１７Ｂ）、およびＲ２５５Ｘオスにおいて認識できる発現がないこと（図１７Ｃ）、または染色されない試料（図１７Ｄ）を示す。図１７Ｅ～１７Ｈは、抗体ＳｉｇｍａＮｅｕＮ抗体ＭＡＢ３７７を使用した、ＭｅＣＰ２シグナル結果を説明する。ＳｉｇｍａＮｅｕＮ抗体ＭＡＢ３７７は、染色されない対照ＬＵＨＭＥＳ（ＬＵＨ）細胞（図１７Ｅ）または染色されない初代培養物（図１７Ｈ）においてシグナルを生成しなかった。しかしながら、それは、ほぼ全ての分化したＬＵＨＭＥＳ細胞を染色し（図１７Ｆ）、これは、ｖ－ｍｙｃ導入遺伝子を停止するためのドキシサイクリンを用いた処置後、この細胞株が経験する完全な分化を付与する正の対照として機能した。初代神経培養物（図１７Ｇ）において、このＮｅｕＮ抗体は、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトなどの、神経細胞１７０１の他の神経細胞タイプ１７０２に対する推定比に対応する、全ての細胞の約６０％を染色した。

別の実験において、初代神経培養物を、本明細書に記載するＲ２５５Ｘレットモデルマウスから単離した。単離の５日後、神経培養物を、９つの選択した操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体配列：配列番号３９、２８、３４、４０、７、４５、６、３２または３の１つを含む構築物（図１４Ｂ）を含むレンチウイルスを用いて感染させた。細胞培養物を、図１７Ａ～１７Ｈに記載する通り、感染の２日後に分析した。ＭｅＣＰ２を発現したレンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）によって形質導入した神経細胞（ＮｅｕＮ＋）のパーセンテージを示すヒストグラムを、図１８Ａにおいて説明することができる。操作されたｔＲＮＡ配列番号３を有するレンチウイルスによって形質導入した神経細胞のほぼ６０％が、ＭｅＣＰ２シグナルを示した。このレベルのＭｅＣＰ２発現は、野生型細胞と同等であり得、ＭｅＣＰ２を、形質導入した神経細胞の約７０％において発現した。図１８Ｂは、形質導入の２日後に、細胞において発現したＰＴＣの総パーセントを示す。本明細書に記載する構築物を有するレンチウイルスを用いて形質導入した細胞におけるＭｅＣＰ２の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、野生型マウスから単離した神経培養物におけるＭｅＣＰ２ＭＦＩに標準化した。配列番号６の配列を含む操作されたｔＲＮＡは、ＰＴＣの約６５％（細胞における６５％ＭｅＣＰ２産生）を抑制することができた。

［実施例８］
ベクター設計
７つの異なるベクターを設計して、（Ｉ）外来性プロモーターが、ｔＲＮＡ産生を増強し、従って、有効性を増強するか、（ＩＩ）コピー数が、ｔＲＮＡ産生を増強し、従って、有効性を増強するかを調べた。図１９Ａ～１９Ｇは、操作したｔＲＮＡ配列番号３の１つ、２つまたは３つのコピーを有する、７つの異なる構築物を示す。構築物は、ｍＵ６、ｈＵ６、またはその組合せを含んでいた。ＨＥＫ２９３を、上流ｈＵ６を有するか、有さない、１～６つのコピーにおける配列番号３（３００ｎｇ）の配列を含む操作されたｔＲＮＡ（図１９Ａ～図１９Ｇは、操作されたｔＲＮＡ抑制因子の１～３つのコピーを有する構築物の模式的な例を示す）を用いてトランスフェクションした。構築物はまた、図１１Ａに示す遺伝子に類似する、Ｒ７４ＸまたはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（３００ｎｇ）、Ｘは、未成熟停止コドンを表す、のいずれかによって破壊したＧＦＰ遺伝子（ＳＴ２１骨格）を含んでいた。トランスフェクションを、ＤＮＡと３：１の比で、製造元の指示に従い、ＴｒａｎｓＩＴ２９３試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏＭＩＲ２７０５）を使用して達成した。細胞５０Ｋ個を、１ウェル毎に播種した。２つの生物学的複製を行った。フローサイトメトリーを使用し、細胞をゲーティングして、細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を取り除いた。次に、生細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙによってさらにゲーティングして、操作されたｔＲＮＡを受け取った生細胞の集団を選択し、次に、操作された破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した操作されたｔＲＮＡ含有細胞（ｔＲＮＡ＋）の集団を選択するためにＧＦＰによってゲーティングした。図２０Ａは、ＧＦＰをまた発現するｔＲＮＡ＋細胞のパーセントを示し、これは、リードスルーが生じ得ることを示している。結果は、上流ｈＵ６プロモーターが、ｔＲＮＡ内部プロモーターを超える認識できる恩恵をもたらさなかったことを示した。図２０Ｂは、破壊したＧＦＰおよび操作されたｔＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、破壊していないＧＦＰ（対照細胞）でトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰＭＦＩに標準化することによって、抑制されたＰＴＣの総パーセントを示す。図２０Ｂに示す通り、ｔＲＮＡコピー数が多いほど、より高いＰＴＣ抑制をもたらした。

［実施例９］
レット症候群の処置
ＧＦＰスクリーニングを使用して同定したＡｒｇ－ｔＲＮＡイソデコーダーを、ＡＡＶベクターにクローニングすることができる。ＡＡＶベクターを、Ａｒｇ－ｔＲＮＡイソデコーダーをコードする導入遺伝子を含有するＡＡＶウイルス粒子を産生するＡＡＶヘルパーベクターを含有する哺乳類細胞株にトランスフェクトすることができる。ＡＡＶベクターの例は、本明細書に記載するＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、もしくはＡＡＶ２／９ベクター、または任意のＡＡＶベクターを含むが、これらに限定されない。

変動する用量のＡＡＶを、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ１６８Ｘ、Ｒ２２５Ｘ、Ｒ２７０Ｘ、Ｒ２９４Ｘ、Ｒ１９８Ｘ、Ｒ１８６ＸおよびＲ４５３Ｘ突然変異、Ｘは、ＵＧＡオパール停止コドンを表す、に起因して、レット症候群に罹患している対象において投与する。対象を、処置経過にわたり、レット症候群の病理の改善についてモニターする。病理の改善は、Ａｒｇ－ｔＲＮＡイソデコーダーによる未成熟停止コドンの抑制に起因し、停止コドンのリードスルーおよび未成熟停止コドンに応答したアルギニンのＭｅＣＰ２ポリペプチドへの挿入をもたらす。

［実施例１０］
難聴の処置
上記の通り調製したＡＡＶベクターを使用して、ＭＹＨ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ１９３３Ｘ突然変異、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ８４５Ｘ突然変異、またはＭＹＯ７ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＲ６６６Ｘ突然変異、Ｘは、ＵＧＡオパール停止コドンを表す、に起因した、難聴に罹患している対象を処置することができる。対象を、聴力検査を使用して、処置経過にわたり、難聴の病理の改善についてモニターする。病理の改善は、Ａｒｇ－ｔＲＮＡイソデコーダーによる未成熟停止コドンの抑制に起因し、停止コドンのリードスルーおよび未成熟停止コドンに応答したアルギニンのＭＹＨ９、ＣＯＬ１１Ａ２、またはＭＹＯ７Ａポリペプチドへの挿入をもたらす。

［実施例１１］
自己相補的ベクター設計
図２４～図２８Ｂに示すデータを、以下の通り収集した：Ｒ７４Ｘ（ＳＴＸ４８８）またはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（ＳＴＸ４８９）を含む破壊したＧＦＰ構築物を、破壊したアルギニン１つ当たり２つの独立したｐｉｇｇｙｂａｃ細胞株を生じる、トランスポゾンに対するトランスポザーゼ比１：５および１：２．５でｐｉｇｇｙｂａｃシステムを用いて、Ｋ５６２細胞に安定的に組み込んだ。ｐｉｇｇｙｂａｃペイロードを含有する細胞を、使用前少なくとも８日間、５μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して選択した。配列番号３の配列を含む、変動するコピー数の操作されたｔＲＮＡを含む構築物を、１本鎖または自己相補的骨格にクローニングした。これらの構築物を、ＡＡＶ２／９にパッケージングした。表５は、構築物を記載する。破壊したＧＦＰ構築物のｐｉｇｇｙｂａｃ組み込みを伴うＫ５６２細胞（９６ウェルフォーマットの１ウェル当たり５０Ｋ）を、百万ｖｇ／ウイルス細胞を用いて感染させた。細胞を、４８時間後、フローサイトメトリーによって分析した。それぞれのデータポイントは、生物学的複製物（ｎ＝２～３）である。複製物のうち２つは、１：５の組み込みのものであり、３つ目は、１：２．５の組み込みのものである。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。

表５. 図24～28Bにおいて使用したコンストラクト

図２４は、図２５～図２８Ｂのため使用したゲーティングストラテジーを説明する模式図を示す。示した代表的な試料は、自己相補的スタッファー配列（ｓｃ０×）である。細胞をゲーティングして、細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を取り除いた。生細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙによってさらにゲーティングして、ＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子を受け取った生細胞の集団を選択し、次に、ＧＦＰによって、操作された破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した細胞（ｔＲＮＡ＋）を含有するＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子の集団を選択した。

図２５は、配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの０、１、３、または６つのコピーをパッケージングする自己相補的ＡＡＶ２／９についての代表的なフロープロットを示す。ｙ軸は、ＧＦＰ（リードスルーが生じることを示している）も発現するｔＲＮＡ＋細胞のパーセントを示す。ｘ軸は、側方散乱を示す。配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの０×（スタッファー配列のみ）または１×コピーを発現するＡＡＶ２／９を伴う細胞の形質導入の際に、破壊したＧＦＰ構築物（Ｒ９７Ｘをここに示す）のリードスルーは存在しなかった。対照的に、配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの３×または６×コピーを発現するＡＡＶ２／９を用いた形質導入の際に、約６０～７０％のリードスルーが存在した。

図２６は、百万ｖｇ／ウイルス細胞を用いた破壊したＧＦＰ構築物のｐｉｇｇｙｂａｃ組み込みを伴うＫ５６２細胞の形質導入が、細胞生存率を変更しなかったことを示す。ここで、細胞をゲーティングして、細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を取り除いた。生存率は、未感染細胞および感染細胞において細胞の約９０～１００％であった。

図２７Ａおよび図２７Ｂは、変動するコピー数のｔＲＮＡを伴う１本鎖ＡＡＶおよび自己相補的ＡＡＶの形質導入効率を示す。図２７Ａに示す通り、ｍＣｈｅｒｒｙを発現した生細胞のパーセンテージは、細胞を特定のＡＡＶによって形質導入したことを示した。図２７Ｂは、形質導入し（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）、ＰＴＣ抑制（ＧＦＰ＋）を示した細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光指数を示す。これらの試料（百万ｖｇ／細胞）のそれぞれのウイルス負荷量の標準化にも関わらず、１×ＡＡＶは、３×または６×ウイルスより、多くの細胞を、より高いレベルで形質導入した。１本鎖骨格は、形質導入効率をほぼもたらさなかった。

図２８Ａおよび図２８Ｂは、試験したそれぞれの群で、未成熟停止コドンのリードスルーのプロットを示す。図２８Ａのプロットにおいて、ｙ軸は、ＰＴＣ抑制を示した特定のｔＲＮＡを受け取った細胞のパーセンテージを表す。配列番号３の配列を含む、３×および６×バージョンの操作されたｔＲＮＡは、Ｒ９７Ｘを発現する形質導入した細胞の５０～８５％のリードスルーおよびＲ７４Ｘを発現する形質導入した細胞の９０～１００％のリードスルーを生じた。図２８Ｂのプロットにおいて、ｙ軸は、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子を形質導入した細胞におけるＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、破壊していないＧＦＰ（対照細胞）でトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰＭＦＩに標準化することによって、抑制されたＰＴＣの総パーセントを示す。配列番号３の配列を含む６×操作されたｔＲＮＡの自己相補的バージョンは、１本鎖バージョンより優れたリードスルーを示した。しかしながら、配列番号３の配列を含む３×操作されたｔＲＮＡの自己相補的バージョンは、配列番号３の配列を含む６×操作されたｔＲＮＡの自己相補的バージョンより良好に機能した。それぞれのデータポイントは、生物学的複製物（ｎ＝２～３）である。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。

配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの６つ（図２１Ａ）、３つ（図２１Ｂ）、または１つ（図２１Ｃ）のコピーを有するＡＡＶ２／９ベクターを設計した。ＡＡＶベクターを、１本鎖骨格（図２２Ａ）または自己相補的骨格（図２２Ｂ）から作製した。１本鎖骨格は、ＡＡＶベクターを充填するための多量のスタッファーＤＮＡ２２０１、２２０２、または２２０３を含んでいた。構築物は、ｍＣｈｅｒｒｙタグの発現をもたらすＣＭＶ－プロモーターを含んでいた。自己相補的骨格設計の効率を調べるために、自己相補的骨格における配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの０、３、または６つのコピーを発現するＡＡＶ９ベクターを、３×１０＾１０ｖｇ／脳のタイターで、オスのＲ２５５Ｘマウス０～２または５～８日齢の子（試料サイズについては表６を参照）の側脳室（ＩＣＶ）に一側性注入する。対照マウスは、２匹のマウス（ｎ＝２）を含む注射していないＲ２５５Ｘマウス、および４匹のマウス（ｎ＝４）を含む注射したＷＴマウス（０×構築物）を含む。脳を、３つの領域（海馬、皮質、および脳の残りの部分）に顕微解剖し、フローサイトメトリーのため処理して、形質導入した細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）における全長ＭｅＣＰ２の発現を評価する。

表6. tRNAコピー数研究設計

［実施例１２］
スペーサー配列を用いたベクター設計
操作されたｔＲＮＡのリードスルー効率に対する、ベクター構築物における異なる長さのスペーサーを使用した末端逆位配列（ＩＴＲ）間に操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を入れる効果を試験した。ＩＴＲから異なる距離で入れた操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を有するＡＡＶ骨格の例を、図２３Ａに模式的に示す。ベクターは、配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの３つのコピーを有するＡＡＶベクターを含む。操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の３つのコピーを、６、５０、１００、２００、または５００ヌクレオチドのスペーサー配列で隔てた。スペーサー配列は、６ヌクレオチドのリンカー配列であるＡＡＣＡＡＡまたは終結配列であるＴＴＴＴＴＴを含むことができる。スペーサー配列は、本明細書に開示するスタッファー配列を含むことができる。リンカー配列は、米で見出されたバイシストロニックｔＲＮＡ－ｓｎｃＲＮＡに基づく。本明細書に記載する研究設計の例を、表６に提供する。

図２９Ａおよび２９Ｂは、変動するスペーサー長を含むベクター設計を用いた、Ｋ５６２細胞におけるプラスミドトランスフェクションの結果を示す。Ｒ７４Ｘ（ＳＴＸ４８８）およびまたはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（ＳＴＸ４８９）を含む破壊したＧＦＰ構築物を、破壊したアルギニン１つ当たり２つの独立したｐｉｇｇｙｂａｃ細胞株を生じる、トランスポゾンに対するトランスポザーゼ比１：５および１：２．５でｐｉｇｇｙｂａｃシステムを用いて、Ｋ５６２細胞に安定的に組み込んだ。ｐｉｇｇｙｂａｃペイロードを含有する細胞を、使用前少なくとも８日間、５μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して選択した。配列番号３の操作されたｔＲＮＡの２つのコピーおよび６塩基対のスペーサーを含む２×構築物、または配列番号３の操作されたｔＲＮＡの３つのコピーおよび変動するスペーサー長の５０（ＳＴＸ６１７）、１００（ＳＴＸ６１８）、２００（ＳＴＸ６１９）、または５００（ＳＴＸ６２０）塩基対スペーサーを含む３×構築物を、自己相補的骨格にクローニングした。これらの構築物を、前述のＫ５６２細胞（ＳＦ緩衝液、ＦＦ１２０プログラム、１ウェル当たりＤＮＡ１μｇ、１ウェル当たり２００Ｋ細胞）にヌクレオフェクションした。５００ｂｐスペーサー構築物での大きさの制約のため、ｍＣｈｅｒｒｙはこの骨格に含まれなかった。細胞を、７２時間後、フローサイトメトリーによって分析した。細胞をゲーティングして、細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を取り除いた。生細胞を、ＧＦＰによってさらにゲーティングして、操作された破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した細胞の集団を選択した。複製物のうち２つは、１：５の組み込みのものであり、３つ目は、１：２．５の組み込みのものである。それぞれのデータポイントは、生物学的複製物（ｎ＝３）である。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。

図２９Ａにおいて、ｙ軸は、ＰＴＣ抑制を示した細胞のパーセンテージを表す。配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの１００および２００ｂｐのスペーサーバージョンは、破壊したアルギニン残基のいずれかを発現する形質導入した細胞の６０～９５％でのリードスルーを生じた。対照的に、５０ｂｐおよび５００ｂｐのスペーサーを有する配列番号３の構築物は、Ｒ９７Ｘ株について効率の低減を示した。図２９Ｂにおいて、ｙ軸は、操作されたＡｒｇｔＲＮＡ抑制因子分子をトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、破壊していないＧＦＰ（対照細胞）でトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰＭＦＩに標準化することによって、抑制されたＰＴＣの総パーセントを示す。再度、１００または２００ｂｐのスペーサーを有する配列番号３の構築物は、最高のＧＦＰ強度を示した。

加えて、操作されたｔＲＮＡのリードスルー効率に対する、ＡＡＶ構築物における配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡの向きの効果を試験した。異なる距離で、ＡＶＡＶ骨格に入れた操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の例を、図２３Ｂ～２３Ｃに示す。図３０Ａおよび３０Ｂは、様々な位置または向きで操作されたｔＲＮＡを有する構築物についてのデータを含む。

ＩＴＲと比べて異なる位置を有する１×配列番号３の構築物を、自己相補的骨格にクローニングした（表７）。これらの構築物を、ＡＡＶ２／９にパッケージングした。Ｒ７４Ｘ（ＳＴＸ４８８）またはＲ９７Ｘ未成熟停止コドン（ＳＴＸ４８９）を含む破壊したＧＦＰ構築物を、トランスポゾンに対するトランスポザーゼ比１：５でｐｉｇｇｙｂａｃシステムを用いて、Ｋ５６２細胞に安定的に組み込んだ。破壊したＧＦＰ構築物のｐｉｇｇｙｂａｃ組み込みを伴うＫ５６２細胞（９６ウェルフォーマットの１ウェル当たり５０Ｋ）を、百万ｖｇ／ウイルス細胞を用いて感染させた。細胞を、４８時間後、フローサイトメトリーによって分析した。細胞をゲーティングして、細胞破片、二重のもの、および死細胞（ＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ陽性）を取り除いた。生細胞を、ＧＦＰによってさらにゲーティングして、操作された破壊したＧＦＰ遺伝子のリードスルーを示した細胞の集団を選択した。それぞれのデータポイントは、生物学的複製物（ｎ＝３）である。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。実験群を、破壊していないＧＦＰ（標識したＳＴ２１；陽性対照）および形質導入なし（陰性対照）と比較した。

表7. 図30Aおよび30Bにおいて使用したコンストラクト

［実施例１３］
操作されたｔＲＮＡのインビボでの特徴決定
マウスにおけるインビボ実験を設計して、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の効率をさらに決定して、停止コドンリードスルーを行い、異なる細胞タイプおよび／または異なる脳領域における毒性、ならびにリードスルー効率をモニターした。オスの野生型（ＷＴ）、Ｒ２５５Ｘ、およびＲ１６８Ｘマウスに、５～８日齢で、配列番号３、６、７、３２または４５の配列を含む操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を発現するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／９）を、３×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）／脳の用量で、側脳室（ＩＣＶ）に両側性に注射する。マウスを、高架式十字迷路（ＥＰＭ）および巣作り検査での性能について検査し、注射の３週間後に安楽死させる。一方の脳半球を、海馬、皮質、および脳の残りの部分に顕微解剖し、フローサイトメトリーによる全長ＭｅＣＰ２の評価のため分離させる。他方の半球を、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット、またはｍＲＮＡ分析のため使用することができる。ｍＣｈｅｒｒｙは、ＡＡＶに存在する。このコホートは、それぞれの脳領域および神経細胞タイプにおけるＭｅＣＰ２リードスルーの程度、毒性、および未成熟停止コドンリードスルーの程度の決定を示す。本明細書に記載する研究設計の例を、表８に提供する。

表８. 操作されたtRNA研究設計のインビボでの特徴決定

［実施例１４］
操作されたｔＲＮＡのインビボでの有効性研究
マウスにおけるインビボ実験を設計して、選択した操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の有効性を分析する。実施例９の２つの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体は、最高の性能を選択することを示した。オスのＷＴ、Ｒ２５５Ｘ、およびＲ１６８Ｘマウスを、０～２日齢で、実施例９から同定した上位２つの操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を発現するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／９）を、３×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）／半球の用量で側脳室（ＩＣＶ）に一側性に注射する。マウスは、巣作り、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、高架式十字迷路（ＥＰＭ）、条件つきかつ文脈的恐怖条件づけ、および感覚運動試験を含む完全行動分析を受ける。マウスを、注射の２カ月後、安楽死させるか、または寿命分析を行うことができる。一方の脳半球を、顕微解剖し、フローサイトメトリーによる全長ＭｅＣＰ２の評価のため分離させる。他方の半球を、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット、および／またはｍＲＮＡ分析のため使用することができる。ｍＣｈｅｒｒｙは、ＡＡＶに存在しない。この実験は、それぞれの脳領域および神経細胞タイプにおけるＭｅＣＰ２リードスルーの程度が、行動結果に影響するのに十分であるかどうかを示す。本発明者らは、中枢髄液、血漿、血清、肝臓、腎臓、肺、または心臓由来の試料を収集し、分析することによって、毒性の任意の徴候をモニターする。本明細書に記載する研究設計の例を、表９に提供する。

表9. 操作されたtRNA研究設計のインビボ有効性研究

［実施例１５］
代表的なプラスミド
本明細書に記載する方法および組成物において使用することができる核酸構築物のいくつかの非限定な例は、表１０および図４７Ａ～４７Ｅに含む。これらの構築物の個々の特性を、単独、または他の構築物もしくは実施形態の特性と組み合わせて使用することができる。ｐｓｃＡＡＶ－ｓｃＩＴＲ－０ｘ－ＣＭＶｍＣｈＳＶ４０－ラムダ－ｓｔｒｗ２－ｗｔＩＴＲ２を含む核酸構築物を、本明細書に記載する操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするよう、適合させることができる。

表１０. ベクターマップおよびプラスミド配列

［実施例１６］
スペーサー配列
一部の実施形態は、スタッファー配列を含む。スタッファー配列を含むポリヌクレオチド構築物の非限定的な例を、４８Ａ～４８Ｂに示す。これらの構築物の個々の特性を、単独、または他の構築物もしくは実施形態の特性と組み合わせて使用することができる。いくつかのこのような実施形態の核酸構築物は、本明細書に記載する操作されたｔＲＮＡまたは操作されたｔＲＮＡ変異体をコードすることができる。図４８Ａ～４８Ｂは、どのように充填剤配列（例えば、配列番号５７）が、ＡＡＶ構築物内で方向づけ、６Ｘ－１００ｂｐスペーサーマップ（例えば、配列番号３の配列を含む操作されたｔＲＮＡのため）を含むことができるかを示すことができる。本明細書に記載する構築物において使用する向きは、図に示すものと同様の向きであり得るか、または様々なイソデコーダー配列または充填剤配列を用いて修飾することができる。

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載される一方、このような実施形態が、例示のみの目的で提供されることは、当業者に明らかである。多数のバリエーション、変更、および置換が、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に起こるであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明の実施において利用することができることは、理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を定義すること、およびこれらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造は、これによりカバーされることが意図される。

Claims

配列番号３～２２または１０３～１２２のいずれか１つの核酸配列と比べて、Ｔループ、Ｔステム、Ｄループ、Ｄステム、可変ループ、アンチコドンステム、またはアンチコドンループに突然変異を含む操作されたｔＲＮＡ変異体を含む組成物であって、
ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、第１の緑色蛍光タンパク質をコードするスクリーニングｍＲＮＡが未成熟停止コドンを含む、トランスフェクトすること；
ｂ）第２の緑色蛍光タンパク質をコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、同等のスクリーニングｍＲＮＡが未成熟停止コドンを含まない、トランスフェクトすること；ならびに
ｃ）第１のヒト細胞および第２のヒト細胞から放射された蛍光の量を比較すること
によって決定した場合、操作されたｔＲＮＡ変異体が、対象に投与されると、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生した同等のポリペプチドと比べて、実質的に全長のポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンの抑制によって、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも１０％の産生を回復させることができる、組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号２３～４８または１２３～１４８のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号６または１０６と少なくとも７０％同一である配列を含み、配列番号６または１０６の２、４、６、１２、２３、２７、２８、３１、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４９、５０、６４、６５、６７、６９または７１位に置換を有する、請求項１または２に記載の組成物。
２位での置換がＣへの置換であり、４位での置換がＣへの置換であり、６位での置換がＴへの置換であり、６位での置換がＡへの置換であり、１２位での置換がＣへの置換であり、２３位での置換がＧへの置換であり、２７位での置換がＣへの置換であり、２８位での置換がＣへの置換であり、３１位での置換がＣへの置換であり、３９位での置換がＧへの置換であり、４０位での置換がＣへの置換であり、４２位での置換がＧへの置換であり、４３位での置換がＧへの置換であり、４４位での置換がＧへの置換であり、４６位での置換がＡへの置換であり、４９位での置換がＧへの置換であり、５０位での置換がＴへの置換であり、６４位での置換がＡへの置換であり、６５位での置換がＣへの置換であり、６７位での置換がＡへの置換であり、６７位での置換がＴへの置換であり、６９位での置換がＧへの置換であり、７１位での置換がＣへの置換であり、または７１位での置換がＧへの置換である、請求項３に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換を除いて、配列番号６または１０６と同一である、請求項３または４に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンテターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号６または１０６に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）で安定性の増加を示す、請求項３～５のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号４５または１４５の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３または１０３のいずれか１つと少なくとも７０％同一である配列を含み、配列番号３または１０３の２、６、１３、１５、２２、２８、３１、３７、３９、４２、４４、５０、６４、６７、７１または７２位に置換を有する、請求項１または２に記載の組成物。
２位での置換がＧへの置換であり、６位での置換がＧへの置換であり、１３位での置換がＣへの置換であり、１５位での置換がＧへの置換であり、２２位での置換がＧへの置換であり、２８位での置換がＣへの置換であり、３１位での置換がＡへの置換であり、３７位での置換がＧへの置換であり、３９位での置換がＴへの置換であり、４２位での置換がＧへの置換であり、４４位での置換がＡへの置換であり、５０位での置換がＣへの置換であり、６４位での置換がＧへの置換であり、６７位での置換がＣへの置換であり、７１位での置換がＣへの置換であり、または７２位での置換がＣへの置換である、請求項８に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換を除いて、配列番号３または１０３と同一である、請求項８または９に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンテターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号３または１０３に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号３２または１３２の配列を含む、請求項１、２または８～１１のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、配列番号５または１０５と少なくとも７０％同一である配列を含み、配列番号５または１０５の７３位に置換を有する、請求項１または２に記載の組成物。
７３位での置換がＧへの置換である、請求項１３に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体の配列が、置換を除いて、配列番号５または１０５と同一である、請求項１３または１４に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、プロキシ測定、半減期測定、アミノ酸変換効率測定、またはシンテターゼもしくはリボソーム機構への結合の測定によって決定した場合、配列番号５または１０５に提供される配列を含む同等のｔＲＮＡと比較して、インビボで安定性の増加を示す、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ピロリシン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）もしくはセレノシステインを含むアミノ酸でアシル化されているか、または非標準アミノ酸でアシル化されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
未成熟停止コドンが、オパール停止コドン、オーカー停止コドンまたはアンバー停止コドンである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
ポリペプチドが、ＭｅＣＰ２ポリペプチド、ＦｏｘＧ１ポリペプチド、ＣＤＫＬ５ポリペプチド、ＭＹＨ９ポリペプチド、ＣＯＬ１１Ａ２ポリペプチドまたはＭＹＯ７Ａポリペプチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも２０％の産生を回復させることができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも４０％の産生を回復させることができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも６０％の産生を回復させることができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体が、実質的に全長のポリペプチドの少なくとも８０％の産生を回復させることができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
組成物が、操作されたｔＲＮＡ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドがウイルスベクター中にある、請求項２４に記載の組成物。
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２５に記載の組成物、
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターを含む、請求項２６に記載の方法。
ＡＡＶが、ＡＡＶ５由来のキャプシドを含む、請求項２６～２７のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ２由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが、突然変異した末端分離部位を有し、末端ヌクレオチドが欠如している、逆位末端反復を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の組成物。
末端ヌクレオチドが、Ａ領域の少なくとも一部、Ｄ領域の少なくとも一部、またはその両方を含む、請求項３０に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが自己相補的である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが、同じ操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のコピーをコードする、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが、異なる操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のコピーをコードする、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の組成物。
ポリヌクレオチドが、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチドまたは少なくとも約２００ヌクレオチドを含むスタッファー配列を含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の組成物。
スタッファー配列が、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の１つまたは複数のコピーの３’または５’にある、請求項３５に記載の組成物。
スタッファー配列が、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡ変異体の２つ以上のコピーを分離する、請求項３５または３６に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡ変異体、または操作されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、デリバリーシステム中に存在する、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の組成物。
デリバリーシステムが、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３８に記載の組成物。
請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
用量単位形態の請求項４０に記載の医薬組成物。
請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項４０もしくは４１に記載の医薬組成物、および包装または容器を含む、キット。
請求項４２に記載のキットを作製する方法であって、組成物または医薬組成物を包装または容器と接触させることを含む、方法。
疾患または障害の処置または予防の方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
それを必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、
操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを対象に投与すること；および
未成熟停止コドンが欠如するｍＲＮＡを使用して産生した同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率でインビボで実質的に全長のポリペプチドを産生させること
を含み、
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、実質的に全長のポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡにおいて未成熟停止コドンをリードスルーすることができる、方法。
それを必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、
操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを対象に投与し、それによって対象における疾患または状態を少なくとも部分的に処置すること
を含み、
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、ポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンを認識し、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、標的ｍＲＮＡの翻訳の間に、未成熟停止コドンのセンスコドンへの解釈を少なくとも部分的に形質転換し、
ａ）操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードする第１のベクターおよび第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡをコードする第２のベクターを第１のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、第１のマーカーをコードするスクリーニングｍＲＮＡが未成熟停止コドンを含む、トランスフェクトすること；
ｂ）第２のマーカーをコードする同等のスクリーニングｍＲＮＡをコードする第３のベクターを第２のヒト細胞にトランスフェクトすることであって、同等のスクリーニングｍＲＮＡが未成熟停止コドンを含まない、トランスフェクトすること；ならびに
ｃ）第１のヒト細胞および第２のヒト細胞から放射された測定可能なシグナルの量を比較すること
によって決定した場合、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生した同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％の効率でインビボで実質的に全長のポリペプチドを産生する、方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、配列番号００３～４８または１０３～１４８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５または４６に記載の組成物。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、配列番号３～４８または１０３～１４８のいずれか１つを含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体が、配列番号３、６、７、３２、４５、１０３、１０６、１０７、１３２または１４５のいずれか１つを含む、請求項４５または４６に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体を対象に投与することが、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスを投与することを含む、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスを含む、請求項５０に記載の方法。
ウイルスが、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９を含む、請求項５０または５１に記載の方法。
ウイルスがＡＡＶ５キャプシドを含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、突然変異した末端分離部位を有し、末端ヌクレオチドが欠如している、逆位末端反復を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
末端ヌクレオチドが、Ａ領域の少なくとも一部、Ｄ領域の少なくとも一部、またはその両方を含む、請求項５５に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが自己相補的である、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の追加の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のコピーをコードする、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、操作されたｔＲＮＡまたはその変異体と異なる第２の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のコピーをコードする、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチドまたは少なくとも約２００ヌクレオチドを含むスタッファー配列を含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
スタッファー配列が、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の１つまたは複数のコピーの３’または５’にある、請求項６０に記載の方法。
スタッファー配列が、ポリヌクレオチド内の操作されたｔＲＮＡまたはその変異体の２つ以上のコピーを分離する、請求項６０または６１に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、デリバリーシステム中にある、請求項４５～６２のいずれか一項に記載の方法。
デリバリーシステムが、リポソーム、荷電ポリマー、非荷電ポリマー、ナノ粒子、界面活性剤、浸透増強剤、遺伝子導入剤、リン脂質、ミセル、合成ベクター、高分子、デンドリマー、生体高分子、ウイルス粒子、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項６３に記載の方法。
操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体、または操作されたｔＲＮＡもしくはその変異体をコードするポリヌクレオチドが、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物中にある、請求項５０～６４のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が用量単位形態である、請求項６５に記載の方法。
対象が、標的ｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンに関連する疾患または状態を有する、請求項４４～６６のいずれか一項に記載の方法。
ポリヌクレオチドが、未成熟停止コドンが欠如する同等のｍＲＮＡを使用して産生した同等のポリペプチドと比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の効率で産生され、それによって対象における疾患または状態が少なくとも部分的に処置される、請求項４４～６７のいずれか一項に記載の方法。
疾患または状態が、レット症候群、嚢胞性線維症、網膜色素変性症または難聴を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
難聴が、常染色体優性１７難聴、常染色体優性１３難聴または常染色体優性１１難聴を含む、請求項６９に記載の方法。
対象がヒトである、請求項４４～７０のいずれか一項に記載の方法。
対象が非ヒト動物である、請求項４４～７０のいずれか一項に記載の方法。
投与が、経口、直腸、非経口、静脈内、動脈内、髄腔内、眼内、耳、脳室内、大槽内、脳室内または腹腔内である、請求項４４～７２のいずれか一項に記載の方法。
疾患または状態がレット症候群であり、レット症候群の少なくとも１つの症状が軽減される、請求項６７～７３のいずれか一項に記載の方法。
レット症候群の少なくとも１つの症状が、成長遅滞、脳成長遅滞、小頭症、動作もしくは協調の減少もしくは喪失、手の制御の低減、歩行能力の減少、硬直性もしくは痙縮性の動作、話す能力の減少、視力の減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｙｅ）、無関心、反復的な手の動作、普通でない眼球運動、呼吸困難、易刺激性、恐怖、不安、認知障害、けいれん、異常な脳波、脊柱側弯、不整脈または異常な睡眠パターンを含む、請求項７４に記載の方法。
１×１０^１２～１×１０^１５ウイルスゲノムが投与される、請求項４４～７５のいずれか一項に記載の方法。
対象がおよそ１０～３０歳である、請求項４４～７６のいずれか一項に記載の方法。
組成物が、標的ｍＲＮＡのナンセンス媒介ｍＲＮＡデコイ（ＮＭＤ）を減少させるかまたは阻害する、請求項４４～７７のいずれか一項に記載の方法。
組成物が、ベースラインの標的ｍＲＮＡ測定値と比べて、対象における標的ｍＲＮＡの量を増加させる、請求項４４～７８のいずれか一項に記載の方法。
ポリヌクレオチドがＭｅＣＰ２ポリペプチドを含む、請求項１～７９のいずれか一項に記載の組成物または方法。
未成熟停止コドンが、ＭｅＣＰ２ポリペプチドの１６８、２５５、２７０、２９４、１９８、１８６、４５３、８（例えば、アイソフォーム２において）、９（例えば、アイソフォーム１において）、８４、８５、８９、９１、１０６、１１１、１１５、１３３、１６２、１６７、１８８、１９０、２１１、２５０、２５３、２６８、３０６、３０９、３４４、３５４、４２０、４５８、４６８、４７１、４７８または４８４位のアミノ酸においてＲをコードする突然変異から生じる、請求項８０に記載の組成物または方法。