CN115397983A - 用于治疗疾病的靶向转移rna - Google Patents

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莉安娜·斯坦
理查德·沙利文
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Abstract

提供了识别并读通引起疾病的过早终止密码子的工程化的tRNA分子和编码工程化的抑制性tRNA分子的载体。提供了工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体的药物制剂，其用于治疗与由编码蛋白质的核酸序列中存在的过早终止密码子引起的蛋白质截短相关的疾病。

Description

用于治疗疾病的靶向转移RNA
交叉引用
本申请要求2019年12月2日提交的美国临时申请号62/942690、2019年12月2日提交的美国临时申请号62/942667、2020年4月16日提交的美国临时申请号63/010856和2020年11月10日提交的美国临时申请号63/111856的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
通过引用并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为2020年11月30日创建的、大小为86、501字节的、名为54761-709_601_SL.txt的文件提供。在序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
发明内容
在一些实施方案中，本文公开了组合物，其包含：工程化的tRNA变体，其相对于SEQID NOs:3-22或103-122中任一项的核酸序列在T环、T-茎、D-环、D-茎、可变环、反密码子茎或反密码子环中包含突变，其中在施用于受试者后，所述工程化的tRNA变体能够通过抑制编码基本上全长的多肽的靶mRNA中的过早终止密码子，相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，恢复至少10％的基本上全长的多肽的产生，如任选地通过以下确定的：将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA包含所述过早终止密码子；将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；以及比较所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光量。在一些实施方案中，所述工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NOs:23-48或123-148中的任一项至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:6或106至少70％相同的序列，并且可以在SEQ ID NO:6或106的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处具有取代。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为C，位置4处的取代可以是取代为C，位置6处的取代可以是取代为T，位置6处的取代可以是取代为A，位置12处的取代可以是取代为C，位置23处的取代可以是取代为G，位置27处的取代可以是取代为C，位置28处的取代可以是取代为C，位置31处的取代可以是取代为C，位置39处的取代可以是取代为G，位置40处的取代可以是取代为C，位置42处的取代可以是取代为G，位置43处的取代可以是取代为G，位置44处的取代可以是取代为G，位置46处的取代可以是取代为A，位置49处的取代可以是取代为G，位置50处的取代可以是取代为T，位置64处的取代可以是取代为A，位置65处的取代可以是取代为C，位置67处的取代可以是取代为A，位置67处的取代可以是取代为T，位置69处的取代可以是取代为G，位置71处的取代可以是取代为C，或位置71处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:6或106相同。在一些实施方案中，与包含SEQ IDNO:6或106中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体可表现出增加的体内稳定性，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量来确定的。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:45或145的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:3或103中的任一项至少70％相同的序列，并且可以在SEQ ID NO:3或103的位置2、6、13、15、22、28、31、37、39、42、44、50、64、67、71或72处包含取代。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为G，位置6处的取代可以是取代为G，位置13处的取代可以是取代为C，位置15处的取代可以是取代为G，位置22处的取代可以是取代为G，位置28处的取代可以是取代为C，位置31处的取代可以是取代为A，位置37处的取代可以是取代为G，位置39处的取代可以是取代为T，位置42处的取代可以是取代为G，位置44处的取代可以是取代为A，位置50处的取代可以是取代为C，位置64处的取代可以是取代为G，位置67处的取代可以是取代为C，位置71处的取代可以是取代为C，或位置72处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:3或103相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量来确定的，与包含SEQID NO:3或103中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体可表现出增加的体内稳定性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:32或132的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:5或105至少70％相同的序列，并且可以在SEQ ID NO:5或105的位置73处具有取代。在一些实施方案中，位置73处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ IDNO:5或105相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量来确定的，与包含SEQ ID NO:5或105中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体可表现出增加的体内稳定性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以用包括赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸酰化，或者可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是乳白终止密码子，赭石终止密码子或琥珀终止密码子。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽，FoxG1多肽，CDKL5多肽，MYH9多肽，COL11A2多肽或MYO7A多肽。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体能够恢复至少20％的基本上全长的多肽的产生。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体能够恢复至少40％的基本上全长的多肽的产生。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体能够恢复至少60％的基本上全长的多肽的产生。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体能够恢复至少80％的基本上全长的多肽的产生。在一些实施方案中，组合物可以包含编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸可以在病毒载体中。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，AAV载体包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施方案中，AAV可以包含来自AAV5的衣壳。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含来自AAV2的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含具有突变的末端解链位点且缺乏末端核苷酸的反向末端重复。在一些实施方案中，末端核苷酸可以包含A区的至少一部分，D区的至少一部分或两者。在一些实施方案中，多核苷酸可以是自身互补的。在一些实施方案中，多核苷酸可编码相同工程化的tRNA变体的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个拷贝。在一些实施方案中，多核苷酸可编码两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个拷贝的不同的工程化的tRNA变体。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含含有至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约150个核苷酸或至少约200个核苷酸的填充序列。在一些实施方案中，填充序列可以在多核苷酸内工程化的tRNA变体的一个或多个拷贝的3'或5'处。在一些实施方案中，填充序列可以将在多核苷酸内的工程化的tRNA变体的两个或更多个拷贝分开。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA的多核苷酸可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，过早终止密码子可以由编码MeCP2多肽的氨基酸位置168、255、270、294、198、186、453、8(例如，在同种型2中)、9(例如，在同种型1中)、84、85、89、91、106、111、115、133、162、167、188、190、211、250、253、268、306、309、344、354、420、458、468、471、478或484处的R的突变产生。在一些实施方案中，本文公开了包含所述组合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可以包含剂量单位形式。在一些实施方案中，本文公开了包含所述组合物或药物组合物以及包装或容器的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开了制备所述试剂盒的方法，所述方法包括使所述组合物或药物组合物与所述包装或容器接触。在一些实施方案中，本文公开了治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用所述组合物。
在一些实施方案中，本文公开了治疗或预防有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括：向所述受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸；以及相对于使用缺乏过早终止密码子的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽，其中工程化的tRNA或其变体能够读通编码基本上全长的多肽的靶mRNA中的过早终止密码子。在一些实施方案中，本文公开了治疗或预防有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括：向受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况；其中所述工程化的tRNA或其变体识别编码多肽的靶mRNA中的过早终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体在所述靶mRNA的翻译期间能够至少部分地将对所述过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽，任选地这通过以下确定：将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一标志物)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一标志物的筛查mRNA可以包含所述过早终止密码子；将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二标志物)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA可以不包含所述过早终止密码子；以及比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的可检测信号的量。在一些实施方案中，所述工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NOs:003-48或103-148中任一项至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述工程化的tRNA或其变体可以包含SEQ ID NOS:3-48或103-148中的任一项。在一些实施方案中，所述工程化的tRNA或其变体可以包含SEQ ID NOS:3、6、7、32、45、103、106、107、132或145中的任一项。在一些实施方案中，向受试者施用工程化的tRNA或其变体可以包括施用包含编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸的病毒。在一些实施方案中，病毒可以包括腺病毒，腺伴随病毒(AAV)或慢病毒。在一些实施方案中，病毒可以包括AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8或AAV2/9。在一些实施方案中，病毒可以包含AAV5衣壳。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以包含AAV2反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以包含具有突变的末端解链位点且缺乏末端核苷酸的反向末端重复。在一些实施方案中，末端核苷酸包含A区的至少一部分，D区的至少一部分或两者。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸是自身互补的。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可编码工程化的tRNA或其变体的另外一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个拷贝。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可编码不同于所述工程化的tRNA或其变体的第二工程化的tRNA或其变体的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个拷贝。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以包含含有至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约150个核苷酸或至少约200个核苷酸的填充序列。在一些实施方案中，填充序列可以在多核苷酸内工程化的tRNA或其变体的一个或多个拷贝的3'或5'处。在一些实施方案中，填充序列可以将多核苷酸内工程化的tRNA或其变体的两个或更多个拷贝分开。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以在递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸在包含药学上可接受的赋形剂，载体或稀释剂的药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物可以是剂量单位形式。在一些实施方案中，受试者可以患有与靶mRNA中的过早终止密码子相关的疾病或病况。在一些实施方案中，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，可以以至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％或至少约90％的效率产生多肽，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征、囊性纤维化、色素性视网膜炎或耳聋。在一些实施方案中，所述耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者可为非人动物。在一些实施方案中，施用可以是口服、直肠、肠胃外、静脉内、动脉内、鞘内、眼内、耳内、脑室内、脑池内、脑室内或腹腔内。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以是Rett综合征，并且Rett综合征的至少一种症状被减轻。在一些实施方案中，Rett综合征的至少一种症状可以包括生长缓慢、脑生长缓慢、微头症、运动或协调的减少或丧失、手控制减少、行走能力降低、僵硬或痉挛运动、言语能力降低、视力降低、冷漠、反复手部运动、异常眼部运动、呼吸困难、易怒、恐惧、焦虑、认知缺陷、癫痫、异常脑电图、脊柱侧凸、不规则心跳或异常睡眠模式。在一些实施方案中，可以施用1×1012至1×1015个病毒基因组。在一些实施方案中，受试者可为约10至30岁。在一些实施方案中，所述组合物可以减少或抑制靶mRNA的无义介导的mRNA衰变(NMD)。在一些实施方案中，相对于基线靶mRNA测量，所述组合物可以增加受试者中的靶mRNA的量。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，过早终止密码子可以由编码MeCP2多肽的氨基酸位置168、255、270、294、198、186、453、8(例如，在同种型2中)、9(例如，在同种型1中)、84、85、89、91、106、111、115、133、162、167、188、190、211、250、253、268、306、309、344、354、420、458、468、471、478或484处的R的突变产生。
本公开的一方面可以提供治疗受试者的疾病或病况的方法。所述方法可以包括：向受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸；和相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽，其中工程化的tRNA或其变体能够读通编码基本上全长的多肽的mRNA中的过早终止密码子。本公开的另一方面可以提供治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。所述方法可以包括：向受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码该工程化的tRNA或其变体的多核苷酸，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况；其中所述工程化的tRNA或其变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体在所述mRNA的翻译过程中可以至少部分地将对所述过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且，如通过以下确定的：(a)将编码工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一标志物)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一标志物的筛查mRNA可以包含过早终止密码子；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二标志物)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA可以不包含所述过早终止密码子；以及(c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的可检测信号的量，相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，第一人细胞或第二人细胞可以是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括恢复至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或100％的基本上全长多肽的表达。在一些实施方案中，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，工程化的tRNA或其变体可以以至少约35％的效率产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以用精氨酸酰化。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，编码多肽的mRNA对应于MeCP2。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA或其变体可以将氨基酸插入到由mRNA在体内响应于过早终止密码子而编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入时的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，所述至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。
在一些实施方案中，所述至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，过早终止密码子可以由对应于MeCP2多肽的序列中的氨基酸位置168、255、270、294、198、186、453、8(例如，在同种型2中)、9(例如，在同种型1中)、84、85、89、91、106、111、115、133、162、167、188、190、211、250、253、268、306、309、344、354、420、458、468、471、478或484或其任何组合处的R至X产生，其中X可以是过早终止密码子。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是乳白终止密码子。在一些实施方案中，所述过早终止密码子可以是琥珀终止密码子。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是赭石终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以是赖氨酰-tRNA、精氨酰-tRNA、组氨酰-tRNA、甘氨酰-tRNA、丙氨酰-tRNA、缬氨酰-tRNA、亮氨酰-tRNA、异亮氨酰-tRNA、甲硫氨酰-tRNA、苯丙氨酰-tRNA、色氨酰tRNA、脯氨酰tRNA、丝氨酰tRNA、苏氨酰tRNA、半胱氨酰tRNA、酪氨酰tRNA、天冬酰胺酰tRNA、谷氨酰tRNA、天冬氨酰tRNA、吡咯赖氨酰tRNA、硒代半胱氨酰tRNA或谷氨酰tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA或其变体的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，受试者可为非人动物。在一些实施方案中，人可以是约出生至约40岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是约6个月至约15岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是胚胎或胎儿。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括囊性纤维化。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括耳聋。在一些实施方案中，所述耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，施用可以是口服施用、直肠施用或肠胃外施用。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外施用，并且其中肠胃外施用可以是静脉内施用、动脉内施用、鞘内施用、眼内施用、耳内施用、脑室内施用或腹腔内施用。在一些实施方案中，施用可以是脑池内(ICM)。在一些实施方案中，施用可以是脑室内(ICV)。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括FoxG1多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括CDKL5多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYH9多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括COL11A2多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYO7A多肽。在一些实施方案中，施用可以在一段时间内进行至少两次。在一些实施方案中，所述一段时间可以是约24小时。在一些实施方案中，所述方法可以是预防疾病或病况的方法，并且其中所述预防可以包括向受试者预防性施用工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，可以将编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸施用于受试者。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以包含在载体中。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，载体可以包括质粒，腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，慢病毒(LV)载体。在一些实施方案中，AAV载体可以来自具有以下的AAV：(a)包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的血清型，或(b)包含AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAV-2i8的假型。在一些实施方案中，AAV载体可以包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV载体可以包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施方案中，AAV载体可以是AAV2/5载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体，或编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，所述方法还包括施用包含多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列包含或编码：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列募集RNA编辑实体，并且其中所述编辑实体当与所述多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，从而将所述过早终止密码子转化为有义密码子。在一些实施方案中，RNA编辑实体可以包含：(a)ADAR多肽；(b)APOBEC多肽；(c)(a)或(b)的生物活性片段；或(d)包含(c)的生物活性片段的融合蛋白。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子可以是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体可以是精氨酰tRNA，其中所述受试者可以是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA或其变体可以作为AAV载体施用于所述受试者时，在编码MeCP2多肽的mRNA的翻译期间，工程化的tRNA或其变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以包含化学修饰，所述化学修饰包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。在一些实施方案中，可在施用之前对受试者给予对所述疾病或病况的诊断。在一些实施方案中，诊断可以通过体外诊断试验来确定。
本公开的另一方面提供了一种组合物。所述组合物可以包含：本文所述的工程化的tRNA或其变体；和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本公开的另一方面提供了试剂盒，其在容器中包含本文所述的组合物。本公开的另一个方面提供了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，所述方法包括：向所述受试者施用工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸，其中所述工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO：3-22中任一项提供的参考tRNA的序列中包含一个或多个突变，并且其中所述工程化的tRNA变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，并且在mRNA翻译期间，至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子以在体内产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含工程化的tRNA变体的受体茎或反密码子茎中的彼此不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸用不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置72处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:23的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包括在参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置72处的尿嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQID NO:123的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置2处的胞嘧啶和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:24的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含在参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置2处的胞嘧啶和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:124的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置67处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:25的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置67处的尿嘧啶用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:125的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置13处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置22处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置13和核苷酸位置22可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5'末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:26的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置13处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置22处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置13和核苷酸位置22可以参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:126的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置15处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:27的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置15处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:127的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:28的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:128的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置39处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:29的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置39处的鸟嘌呤用尿嘧啶取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:129的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置37处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置37处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQID NO:130的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:31的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ IDNO:103或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:131的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置64处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:32的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置64处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:103或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:132的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:35的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用尿嘧啶取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:135的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置49处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置65处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置49和核苷酸位置65可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:36的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置49处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置65处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置49和核苷酸位置65可参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:136的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:37的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用尿嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:137的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:38的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置71处的尿嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:138的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置2处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置2和核苷酸位置72可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:39的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置2处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置71处的尿嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置2和核苷酸位置72可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:139的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置4处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置69处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置4和核苷酸位置69可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:40的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置4处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置69处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置4和核苷酸位置69可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:140的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:41的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用尿嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:141的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置12处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置23处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置12和核苷酸位置23可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:42的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置12处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置23处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置12和核苷酸位置23可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:142的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置27处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置43处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置27和核苷酸位置43可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:43的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置27处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置43处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置27和核苷酸位置43可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:143的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:44的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的尿嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:144的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置40处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:45的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置40处的尿嘧啶用胞嘧啶取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:145的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的腺嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置39处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:46的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的腺嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置39处的尿嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:146的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ IDNO:47的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:147的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置46处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:48的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQID NO:106或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置46处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:148的序列。在一些实施方案中，如通过以下确定的：(a)将编码工程化的tRNA变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包含过早终止密码子；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；(c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光量，相对于使用可以缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率产生多肽。在一些实施方案中，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，可以以至少约80％的效率产生多肽，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA变体将氨基酸插入到由mRNA在体内响应于过早终止密码子而编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，所述至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些实施方案中，所述至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以是赖氨酰-tRNA、精氨酰-tRNA、组氨酰-tRNA、甘氨酰-tRNA、丙氨酰-tRNA、缬氨酰-tRNA、亮氨酰-tRNA、异亮氨酰-tRNA、甲硫氨酰-tRNA、苯丙氨酰-tRNA、色氨酰-tRNA、脯氨酰-tRNA、丝氨酰-tRNA、苏氨酰-tRNA、半胱氨酰-tRNA、酪氨酰-tRNA、天冬酰胺酰-tRNA、谷氨酰胺酰-tRNA、天冬氨酰-tRNA、吡咯赖氨酰-tRNA、硒代半胱氨酰-tRNA、或谷氨酰-tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA变体的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA变体。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，人可以是约出生至约40岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是约6个月至约15岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是胚胎或胎儿。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括囊性纤维化。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括耳聋。在一些实施方案中，所述耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是乳白终止密码子。
在一些实施方案中，施用可以是口服施用、直肠施用或肠胃外施用。在一些实施方案中，所述施用可以是肠胃外施用，并且其中所述肠胃外施用可以是静脉内施用，动脉内施用，鞘内施用，眼内施用，耳内施用，脑室内施用，颅内施用，颅内施用至实质细胞或腹腔内施用。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括FoxG1多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括CDKL5多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYH9多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括COL11A2多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYO7A多肽。在一些实施方案中，施用可以在一段时间内进行至少两次。在一些实施方案中，所述一段时间可以是约24小时。在一些实施方案中，所述方法可以是预防疾病或病况的方法，并且其中所述预防可以包括向受试者预防性施用工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。在一些实施方案中，可以将编码工程化的tRNA变体的多核苷酸施用于受试者。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，AAV载体可以包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV载体可以包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施方案中，AAV载体可以是AAV2/5载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA的多核苷酸可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包含脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括施用包含多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列包含或编码RNA编辑多核苷酸，所述RNA编辑多核苷酸包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列经由所述募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中所述编辑实体当与所述RNA编辑多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，由此将过早终止密码子转化为有义密码子。在一些实施方案中，编辑实体可以包含：(a)ADAR多肽；(b)APOBEC多肽；(c)(a)或(b)的生物活性片段；或(d)包含(c)的生物活性片段的融合蛋白。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子可以是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA可以是精氨酰tRNA，其中所述受试者可以是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA变体可以作为AAV载体施用于所述受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，工程化的tRNA变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含化学修饰，其可以包含甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸可以包含在药物单位剂量形式中，所述药物单位剂量形式还包含药学上可接受的载体赋形剂，稀释剂或载体。在一些实施方案中，受试者被给予对疾病或病况的诊断。在一些实施方案中，通过体外诊断试验确定诊断。
本公开的另一方面提供了一种组合物。所述组合物可以包含：工程化的tRNA变体，其参考SEQ ID NOS:3-22中任一项提供的序列包含一个或多个突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:48中的任一项的至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:1的至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:2的至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。本公开的另一方面提供了一种组合物；所述组合物可以包含：工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸，其中与包含SEQ ID NOS：3-22中任一项提供的序列的参考tRNA相比，工程化的tRNA变体可以在工程化的tRNA的序列中包含一个或多个突变，并且其中工程化的tRNA变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，并且在mRNA翻译期间将对过早终止密码子的解读至少部分地转化为有义密码子，以产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少70％相同的序列，并且可以在SEQ IDNO:6的序列的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处包含取代。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为C，位置4处的取代可以是取代为C，位置6处的取代可以是取代为T，位置6处的取代可以是取代为A，位置12处的取代可以是取代为C，位置23处的取代可以是取代为G，位置27处的取代可以是取代为C，位置28处的取代可以是取代为C，位置31处的取代可以是取代为C，位置39处的取代可以是取代为G，位置40处的取代可以是取代为C，位置42处的取代可以是取代为G，位置43处的取代可以是取代为G，位置44处的取代可以是取代为G，位置46处的取代可以是取代为A，位置49处的取代可以是取代为G，位置50处的取代可以是取代为T，位置64处的取代可以是取代为A，位置65处的取代可以是取代为C，位置67处的取代可以是取代为A，位置67处的取代可以是取代为T，位置69处的取代可以是取代为G，位置71处的取代可以是取代为C，或位置71处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列可以包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:6的序列相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:6中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体在体内表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少70％相同的序列，并且可以在SEQ ID NO:3的位置2、6、13、15、22、28、31、37、39、42、44、50、64、67、71或72处包含取代。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为G，位置6处的取代可以是取代为G，位置13处的取代可以是取代为C，位置15处的取代可以是取代为G，位置22处的取代可以是取代为G，位置28处的取代可以是取代为C，位置31处的取代可以是取代为A，位置37处的取代可以是取代为G，位置39处的取代可以是取代为T，位置42处的取代可以是取代为G，位置44处的取代可以是取代为A，位置50处的取代可以是取代为C，位置64处的取代可以是取代为G，位置67处的取代可以是取代为C，位置71处的取代可以是取代为C，或位置72处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列可以包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:3相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:3中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体在体内表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:5至少70％相同的序列，并且可以在SEQID NO:5的位置73处包含取代。在一些实施方案中，位置73处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列可以包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:5相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:5中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体在体内表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含工程化的tRNA变体的受体茎或反密码子茎中的彼此不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸用不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置2处的胞嘧啶和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置72处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置22处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置22和核苷酸位置71可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置67处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置13处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置22处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置13和核苷酸位置22可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置15处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置39处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置37处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置73处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:4或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用尿嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:104或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置49处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置65处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置49和核苷酸位置65可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置50处的胞嘧啶用尿嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64可以参考SEQ ID NO:106或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置4处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置69处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置4和核苷酸位置69可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置6处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置12处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置23处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置12和核苷酸位置23可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置27处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置43处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置27和核苷酸位置43可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置40处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在核苷酸位置31处的腺嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置39处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39可以参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，所述一个或多个突变可以包含在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置46处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。在一些实施方案中，如通过以下确定的：(a)将编码工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包含过早终止密码子；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；以及(c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光量，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率产生所述多肽。在一些实施方案中，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，可以以至少约80％的效率产生所述多肽，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA变体将氨基酸插入到由mRNA在体内响应于过早终止密码子而编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，所述至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些实施例中，所述至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以是赖氨酰-tRNA、精氨酰-tRNA、组氨酰-tRNA、甘氨酰-tRNA、丙氨酰-tRNA、缬氨酰-tRNA、亮氨酰-tRNA、异亮氨酰-tRNA、甲硫氨酰-tRNA、苯丙氨酰-tRNA、色氨酰-tRNA、脯氨酰-tRNA、丝氨酰-tRNA、苏氨酰-tRNA、半胱氨酰-tRNA、酪氨酰-tRNA、天冬酰胺酰-tRNA、谷氨酰胺酰-tRNA、天冬氨酰-tRNA、吡咯赖氨酰-tRNA、硒代半胱氨酰-tRNA或谷氨酰-tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA变体的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA变体。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，人可以是约出生至约40岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是约6个月至约15岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是胚胎或胎儿。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括囊性纤维化。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括耳聋。在一些实施方案中，所述耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是乳白终止密码子。在一些实施方案中，施用可以是口服施用、直肠施用或肠胃外施用。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外施用，并且其中肠胃外施用可以是静脉内施用、动脉内施用、鞘内施用、眼内施用、耳内施用、脑室内施用或腹腔内施用。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MeCP2多肽。
在一些实施方案中，所述多肽可以包括FoxG1多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括CDKL5多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYH9多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括COL11A2多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以包括MYO7A多肽。在一些实施方案中，施用可以在一段时间内进行至少两次。在一些实施方案中，所述一段时间内可以是约24小时。在一些实施方案中，组合物可以是预防疾病或病况的组合物，并且其中预防可以包括向受试者预防性施用工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。在一些实施方案中，可以将编码工程化的tRNA变体的多核苷酸施用于受试者。在一些实施方案中，多核苷酸可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，AAV载体可以包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复和来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV载体可以包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施方案中，AAV载体可以是AAV2/5载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA的多核苷酸可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物还可以包括施用包含多核苷酸序列或编码所述多核苷酸序列的载体的组合物，其中所述多核苷酸序列可以包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列经由所述募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中所述编辑实体在与所述多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，由此将过早终止密码子转化为有义密码子。在一些实施方案中，编辑实体可以包含：(a)ADAR多肽；(b)APOBEC多肽；(c)(a)或(b)的生物活性片段；或(d)包含(c)的生物活性片段的融合蛋白。在一些实施方案中，所述疾病或病况可以包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子可以是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA可以是精氨酰tRNA，其中所述受试者可以是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA变体可以作为AAV载体施用于所述受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，工程化的tRNA变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含化学修饰，所述化学修饰可以包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物可以是分离的。本公开的另一个方面提供了药物组合物；药物组合物可以包含本文提及的任何组合物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本公开的另一个方面提供了包含本文提及的任何组合物的分离的细胞。本公开的另一方面提供了包含本文提及的任何组合物的分离的多个细胞。本公开的另一方面提供了包含本文提及的任何组合物的工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体可以进一步任选地包含(例如以5’至3’顺序)：(a)第一启动子；(b)第一定量盒；(c)第二启动子；(d)第二定量盒；(e)第三启动子；(f)包含编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸的转基因；或(g)编码可检测多肽的报告基因。在一些实施方案中，多核苷酸还可以包含启动子上游的5'ITR和报告基因下游的3'ITR。在一些实施方案中，本文的可检测多肽可以包含mCherry、绿色荧光蛋白(GFP)或β-半乳糖苷酶。在一些实施方案中，本文的第一启动子和第二启动子可以是U6启动子，其中U6启动子可以任选地被甲基化，或其中U6启动子可以任选地是小鼠U6启动子。在一些实施方案中，本文的第三启动子可以是人巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，载体可以是纯化的或分离的。
一些实施方案涉及试剂盒，其包含：(a)本文提及的任何组合物、本文提及的药物组合物、如本文提及的分离的细胞或如本文提及的载体；和(b)配置成储存所述组合物的容器。
本公开的另一方面提供了产生如本文提及的载体的方法，所述方法包括：将工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸引入到主链载体序列的转基因中。
本公开的另一方面提供了产生本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括：将工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸引入到药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中。
本文公开了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。在一些实施方案中，方法可以包括向受试者施用工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA可以至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且可以相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以约1％至约100％(例如至少约80％)的效率产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，效率可以通过以下确定：(a)将编码工程化的tRNA的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包含过早终止密码子；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA可以不包含所述过早终止密码子；比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光量。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA可以将氨基酸插入到由mRNA在体内响应于过早终止密码子而编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入时的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰tRNA，脯氨酰tRNA，丝氨酰tRNA，苏氨酰tRNA，半胱氨酰tRNA，酪氨酰tRNA，天冬酰胺酰tRNA，谷氨酰胺酰tRNA，吡咯赖氨酰tRNA，硒代半胱氨酰tRNA，天冬氨酰tRNA，或谷氨酰-tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，人可以是约出生至约40岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是约6个月至约15岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是胚胎或胎儿。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括Rett综合征。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括囊性纤维化。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括色素性视网膜炎。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括耳聋。在一些实施方案中，耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，过早终止密码子可以是乳白终止密码子。在一些实施方案中，施用可以是口服施用、直肠施用或肠胃外施用。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外施用，其中肠胃外施用可以是静脉内施用、动脉内施用、鞘内施用、眼内施用、耳内施用、脑室内施用或腹腔内施用。在一些实施方案中，多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括FoxG1多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括CDKL5多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括MYH9多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括COL11A2多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括MYO7A多肽。在一些实施方案中，施用可在一段时间内进行至少两次。在一些实施方案中，所述一段时间可以是约24小时。在一些实施方案中，方法可以是预防疾病或病况的方法，其中预防可以包括向受试者预防性施用工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体。在一些实施方案中，可以将编码工程化的tRNA的载体施用于受试者。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA或编码tRNA的载体可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，方法可进一步包括施用包含多核苷酸序列或编码所述多核苷酸序列的载体的组合物，其中多核苷酸序列可以包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中多核苷酸序列可经由募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中编辑实体在与多核苷酸序列和mRNA接触时，可在mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰。从而将过早终止密码子转化为有义密码子。在一些实施方案中，编辑实体可以是ADAR多肽或APOBEC多肽。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括Rett综合征，其中mRNA可以编码MeCP2多肽，其中终止密码子可以是乳白终止密码子，其中工程化的tRNA可以是精氨酰tRNA，其中受试者可以是0-6岁的人，并且其中当工程化的tRNA可以作为AAV载体施用于受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，工程化的tRNA可以至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并且可以产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。
本文还公开了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。在一些实施方案中，方法可以包括向受试者施用工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA可以至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽，从而至少部分地治疗受试者的疾病或病况。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA可以将氨基酸插入到由mRNA在体内响应于过早终止密码子而编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入时的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酰-tRNA，或谷氨酰-tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，人可以是约出生至约40岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是约6个月至约15岁的年龄。在一些实施方案中，人可以是胚胎或胎儿。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括Rett综合征。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括囊性纤维化。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括色素性视网膜炎。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括耳聋。在一些实施方案中，耳聋可以包括常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。在一些实施方案中，终止密码子可以是乳白终止密码子。在一些实施方案中，施用可以是口服施用、直肠施用或肠胃外施用。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外施用，其中肠胃外施用可以是静脉内施用、动脉内施用、鞘内施用、眼内施用、耳内施用、脑室内施用或腹腔内施用。在一些实施方案中，多肽可以包括MeCP2多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括FoxG1多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括CDKL5多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括MYH9多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括COL11A2多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括MYO7A多肽。在一些实施方案中，施用可在一段时间内进行至少两次。在一些实施方案中，一段时间可以是约24小时。在一些实施方案中，方法可以是预防疾病或病况的方法，其中预防可以包括向受试者预防性施用工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体。在一些实施方案中，可以将编码工程化的tRNA的载体施用于受试者。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA或编码tRNA的载体可以存在于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统可以包括脂质体、带电聚合物、不带电聚合物、纳米颗粒、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物、病毒颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，方法可进一步包括施用包含多核苷酸序列或编码所述多核苷酸序列的载体的组合物，其中多核苷酸序列可以包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中多核苷酸序列可经由募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中编辑实体在与多核苷酸序列和mRNA接触时，可在mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，从而将过早终止密码子转化为有义密码子。在一些实施方案中，编辑实体可以是ADAR多肽或APOBEC多肽。在一些实施方案中，疾病或病况可以包括Rett综合征，其中mRNA可以编码MeCP2多肽，其中终止密码子可以是乳白终止密码子，其中工程化的tRNA可以是精氨酰tRNA，其中受试者可以是0-6岁的人，并且其中当工程化的tRNA可以作为AAV载体施用于受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，工程化的tRNA可以至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并且可以产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。
本文还公开了可以包含以下的组合物：工程化的tRNA或编码所述工程化的tRNA的载体；以及赋形剂，稀释剂或载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，可以以至少约80％的效率产生基本上全长的多肽。在一些实施方案中，效率可通过以下确定：(a)将编码工程化的tRNA的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包含过早终止密码子；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中可比较的筛查mRNA可以不包含过早终止密码子；以及(c)比较从第一人细胞和第二人细胞发出的荧光量。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以用非典型氨基酸酰化。在一些实施方案中，在mRNA翻译期间，工程化的tRNA可以将氨基酸插入到由mRNA响应于过早终止密码子而编码的初生多肽链中，其中与使用可缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽相比，插入时的氨基酸可以足以产生至少部分功能性的多肽。在一些实施方案中，编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包含至少两个过早终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些实施方案中，至少两个过早终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酰-tRNA，或谷氨酰-tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是工程化的前tRNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列可以在含有工程化的tRNA的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA。在一些实施方案中，第一人细胞或第二人细胞可以是HEK293细胞。在一些实施方案中，组合物可以包含编码工程化的tRNA的载体。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体，腺伴随病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，工程化的tRNA或编码工程化的tRNA的载体可以存在于脂质体，纳米颗粒或病毒颗粒中。在一些实施方案中，工程化的tRNA可以是精氨酰tRNA，其中过早终止密码子可以是乳白终止密码子，其中工程化的tRNA可以存在于载体中，其中载体可以是腺伴随病毒载体，并且其中第一人细胞和第二人细胞可以是HEK293细胞。
本文还公开了可在容器中包含如本文所述的组合物的试剂盒。一些实施方案包括制备所述试剂盒的方法，所述方法包括使所述组合物与所述容器接触。
从以下详细描述中，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到的，本公开能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述在本质上被认为是说明性的，而不是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请都通过引用并入到本文中，其程度如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入到本文中一样。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容矛盾的程度上，本说明书旨在替代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图的简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用了本发明的原理的说明性实施方案以及附图，其中：
图1示意性地说明了编码根据一些实施方案的工程化的tRNA抑制物的一个或两个拷贝的质粒构建体。
图2A示意性地说明了人Arg tRNA的共有二级结构和序列。
图2B示意性地说明了根据一些实施方案，在从诱变以工程改造抑制tRNA排除的人Arg tRNA的共有二级结构和序列中的位点。
图3A示意性地说明了根据一些实施方案，反密码子序列“CCT”已经被修饰为“TCA”以抑制mRNA中的过早乳白终止密码子的精氨酸(Arg)tRNA抑制物。
图3B示意性地说明了根据一些实施方案，反密码子序列“TCT”已经被修饰为“TCA”以抑制mRNA中的过早乳白终止密码子的Arg tRNA抑制物。
图4示意性地说明了根据一些实施方案，用编码工程化的tRNA抑制物和mCherry荧光报告基因的质粒载体转染稳定表达工程化GFP(含有过早乳白终止密码子)的细胞的工作流程。
图5A示意性地说明了根据一些实施方案(包括图5B和图6)，在人胚肾(HEK)细胞中筛查工程化的tRNA抑制物活性的实验工作流程。该示意图在时间上显示了图4中所示的实验设置。
图5B显示了根据一些实施方案，在稳定整合的GFP报告基因中携带两种不同的Arg-至-终止密码子突变的两种HEK细胞系中，工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子的抑制。
图5C显示了根据一些实施方案，由工程化的Arg tRNA抑制分子在携带不同Arg-至-终止突变的两种HEK细胞系之间抑制过早终止密码子的相关性分析。
图6显示了根据一些实施方案，在携带R74X或R97X Arg-至-终止密码子突变的不同HEK细胞系中，工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子的抑制。
图7示意性地说明了根据一些实施方案(包括图8-9B)，用于评价本文所述的工程化的tRNA抑制分子的双质粒筛查系统的工作流程。。
图8A显示了根据一些实施方案，使用图7所示的双质粒筛查系统在表达含有两种不同Arg-至-终止密码子突变的工程化GFP的HEK细胞中，在读通百分比(显示绿色荧光的tRNA/mCherry产生细胞的分数)方面测量的，通过工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子抑制的示例性结果。
图8B显示了根据一些实施方案，通过本文所述的工程化的Arg tRNA抑制分子在两种不同的工程化的GFP报道基因之间对过早终止密码子抑制的相关性分析，所述GFP报道基因包含图8A中使用的Arg-至-终止突变：R974X和R97X。
图9A显示了根据一些实施方案，通过双质粒筛查系统在携带两种不同Arg-至-终止突变(R74X和R97X，其中X是乳白终止密码子)的HEK细胞系中，过早终止密码子抑制的效率。
图9B显示了根据一些实施方案，通过本文所述的工程化的Arg tRNA抑制分子在两种不同的工程化的GFP报道基因之间对过早终止密码子抑制的相关性分析，所述GFP报道基因包含图9A中使用的Arg-至-终止突变：R974X和R97X。
图10A显示了根据一些实施方案，K562细胞中编码野生型(WT)mRNA(顶部)、41位处的乳白过早终止密码子和73位处的乳白终止密码子的荧光素酶的草图mRNA。
图10B示意性地说明了根据一些实施方案的断裂萤光素酶转染过程。
图10C显示了根据一些实施方案，使用断裂的萤光素酶筛查系统，本文所述的工程化的Arg tRNA抑制分子在含有图10A所示的两种不同的过早乳白终止密码子的K562细胞系中的抑制效率。
图11A显示了根据一些实施方案，HEK293细胞中编码WT mRNA(顶部)，氨基酸位置74处的乳白过早终止密码子和氨基酸位置97处的乳白终止密码子的绿色荧光蛋白(GFP)的草图mRNA。
图11B显示了根据一些实施方案，具有工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子(PTC)的读通的细胞的百分比。
图11C显示了根据一些实施方案，使用断裂的GFP筛查系统在携带两种不同的Arg-至-终止突变的细胞中，本文所述的工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子(PTC)的读通。
图11D显示了根据一些实施方案，使用断裂的GFP筛查系统在携带两种不同的Arg-至-终止突变的细胞中，本文所述的工程化的Arg tRNA抑制分子的抑制效力。
图11E示意性地说明了根据一些实施方案的载体图谱。
图11F示意性地说明了用于产生图11B所示结果的双转染系统。
图11G示意性地说明了根据一些实施方案，使用携带mCherry标签的Arg tRNA抑制物与未断裂的GFP相比抑制断裂GFP中的乳白终止密码子的过程。
图12显示了根据一些实施方案，通过流式细胞术的本文所述的不同工程化的ArgtRNA分子的效率水平的实例。
图13显示了工程化的tRNA分子可以使用的替代终止密码子的实例。
图14A示意性地说明了根据一些实施方案，用于工程化的tRNA构建体的载体设计。
图14B示意性地说明了根据一些实施方案，用于转染原代神经元的工程化的tRNA构建体的载体设计。
图15A说明了根据一些实施方案，终止密码子读通的代表性蛋白质印迹实例。
图15B是根据一些实施方案，不同工程化的tRNA终止密码子读通的直方图。
图16A-16F显示了根据一些实施方案，来自用工程化的tRNA及其变体处理的R255XRett小鼠模型的神经元细胞培养物的示例性流式细胞术结果。
图17A-17D显示了根据一些实施方案，使用D4F3抗体的示例性流式细胞术MeCP2信号。
图17E-17H显示了根据一些实施方案，使用NeuN抗体MAB377的示例性流式细胞术MeCP2信号。
图18A是根据一些实施方案，描绘具有MeCP2信号的神经元的百分比的直方图。
图18B是根据一些实施方案，描绘由携带工程化的tRNA或其变体的慢病毒转导的神经元中的总MeCP2信号的直方图。
图19A-19G示意性地说明了根据一些实施方案，具有一个或多个拷贝的具有或不具有外源启动子的工程化的tRNA的不同载体设计。
图20A是根据一些实施方案，描绘说明了使用不同载体的具有工程化的tRNA读通的细胞的比率的图。
图20B是根据一些实施方案，描绘使用不同载体的细胞中的总工程化的tRNA读通的图。
图21A-21C示意性地说明了根据一些实施方案，具有工程化的tRNA的一个或多个拷贝的不同的AAV-9载体设计。
图22A说明了根据一些实施方案，具有工程化的tRNA的一个或多个拷贝的单链AAV9载体的示意性实例。
图22B说明了根据一些实施方案，具有工程化的tRNA的一个或多个拷贝的自身互补的AAV9载体的示意性实例。
图23A示意性地说明了根据一些实施方案，AAV主链的载体构建体，所述载体构建体具有位于距反向末端重复不同距离处的工程化的tRNA或其变体。
图23B-23C示意性地说明了根据一些实施方案，AAV主链的载体构建体，所述载体构建体具有以不同方向放置的工程化的tRNA或其变体。
图24显示了在图25-图28中使用的门控策略。
图25显示了携带SEQ ID NO:3的0个拷贝，1个拷贝，3个拷贝或6个拷贝的自身互补的AAV2/9构建体的示例性流式细胞术点图。
图26显示了携带SEQ ID NO:3的0个拷贝，1个拷贝，3个拷贝或6个拷贝的单链和自身互补的AAV2/9构建体的细胞活力图。
图27A和27B显示了携带SEQ ID NO:3的0个拷贝，1个拷贝，3个拷贝或6个拷贝的单链和自身互补的AAV2/9构建体的感染力的图。
图28A和28B显示了携带SEQ ID NO:3的0个拷贝，1个拷贝，3个拷贝或6个拷贝的单链和自身互补的AAV2/9构建体的PTC读通的图。
图29A和28B显示了针对编码2个拷贝或3个拷贝的CCT和编码分隔tRNA有效载荷的6bp间隔区，500bp间隔区，100bp间隔区，200bp间隔区或500bp间隔区的质粒，表现出PTC抑制的细胞百分比(A)和被抑制的PTC的总百分比(B)的图。
图30A和30B分别显示了根据一些实施方案的ST21的％GFP和GFP MFI％的图。
图31显示了根据一些实施方案的提高gRNA编辑效率的示例性策略。
图32说明了根据一些实施方案的示例性gRNA设计。
图33显示了根据一些实施方案的功能测定的萤光素酶增益的实例。
图34显示了根据一些实施方案，筛查示例性gRNA设计的实验的示例性结果。
图35显示了根据一些实施方案的示例性筛查测定，细胞系以及分析测定和工具。
图36说明了根据一些实施方案的产生ADAR1 KO细胞系的示例性构建体。
图37说明了根据一些实施方案的产生ADAR1 KO细胞系的示例性构建体。
图38说明了根据一些实施方案，将ADAR2整合到ADAR1 KO细胞中的示意性过程。
图39说明了根据一些实施方案的数字微滴式PCR(ddPCR)过程的示意图。
图40显示了根据一些实施方案，使用ddPCR设计PCR引物和探针组的示例性分析。
图41显示了根据一些实施方案，定量gRNA表达的示例性系统。
图42显示了根据一些实施方案，转染入靶细胞后高细胞水平的gRNA的实例。
图43显示了根据一些实施方案的示例性gRNA构建体及其在HEK293细胞中编辑Rab7a的效率。
图44显示了根据一些实施方案的gRNA构建体及其在HEK293细胞中编辑Rab7a的效率的实例。
图45说明了根据一些实施方案，采用高通量筛查方法在利用gRNA设计中的示例性方法。
图46显示了根据一些实施方案的具有乳白过早突变的示例性萤光素酶。
图47A-47E显示了可以包含本文所述的多核苷酸的示例性载体图谱。
图48A-48B显示了可以包含本文所述的多核苷酸的示例性载体图谱。
图49显示了哺乳动物无义介导的衰变机制的实例。
详细描述
导致蛋白质突变的过早终止密码子已经涉及严重的神经发育病症，例如Rett综合征。含有过早终止密码子的mRNA分子的翻译可引起翻译过程过早终止以产生截短的多肽或蛋白质。如本文所用，“过早终止密码子(premature stop codon)”可与“过早终止密码子(premature termination codon)”(PTC)互换使用。对神经发育至关重要的蛋白质(特别是在儿童中)的非预期截短可引起严重的和改变生命的疾病或病症。
由MECP2(NCBI基因ID:4204)编码的蛋白甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)对于神经元的功能是重要的，并且可以在维持神经元之间的连接中起作用。此外，MeCP2可以是编码驱动正常脑功能的蛋白质的许多基因的调节剂。Rett综合征可由MeCP2中的功能丧失突变(其包括MECP2基因中的过早终止密码子)引起。在健康个体中，MeCP2蛋白可在参考SEQ ID NO:49或参考SEQ ID NO:50的氨基酸位置168、186、198、255、270、294和453处含有精氨酸(Arg)。在Rett综合征患者中，MeCP2蛋白中引起MeCP2蛋白在氨基酸位置168、255、270、294、198、186和453处的翻译过早终止的突变引起MeCP2的功能丧失，并且共同占引起Rett的突变的25％以上。MECP2中的精氨酸(Arg)也可以在位置R8(仅对于同种型2)、R9(仅对于同种型1)、R84、R85、R89、R91、R106、R111、R115、R133、R162、R167、R188、R190、R211、R250、R253、R268、R306、R309、R344、R354、R420、R458、R468、R471、R478和R484处找到。本公开提供了工程化的tRNA和工程化的tRNA变体，其能够过早终止密码子读通可以存在于MeCP2蛋白中的任何位置处的过早终止密码子，所述位置包括以下的任一种：R168X、R255X、R270X、R294X、R198X、R186X、R453X、R8X(在同种型2中)、R9X(在同种型1中)、R84X、R85X、R89X、R91X、R106X、R111X、R115X、R133X、R162X、R167X、R188X、R190X、R211X、R250X、R253X、R268X、R306X、R309X、R344X、R354X、R420X、R458X、R468X、R471X、R478X、R484X或其任何组合。已经表明，在患有晚期神经缺陷的成年MeCP2缺陷型小鼠中的MeCP2再活化可以稳健地逆转疾病。
MeCP2蛋白的第一异构体的蛋白序列的实例可以是SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，MeCP2蛋白可以包含MeCP2的第一异构体。MECP2蛋白的第二异构体的蛋白序列的实例可以是SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，MeCP2蛋白可以包含MeCP2的第二异构体。
本文提供了抑制过早终止密码子以使能够读通模板信使RNA(mRNA)中的过早终止密码子的工程化的转移RNA(tRNA)分子。这些也称为“工程化的tRNA抑制分子”或“工程化的tRNA抑制物”。本文所用的“抑制”和“读通”可互换使用以指代本文公开的工程化的tRNA及其变体的活性。还提供了编码本公开的工程化的tRNA分子的载体，其在一些情况下是病毒载体。可以将工程化的tRNA分子或编码工程化的tRNA分子的载体包装到病毒中，用于工程化的tRNA分子的病毒颗粒介导的递送到体内靶细胞或组织。在一些情况下，病毒可以是腺伴随病毒(AAV)。本文所述的包含工程化的tRNA分子或编码工程化的tRNA分子的载体的组合物可采用AAV(IV/CNS)载体递送至受试者。AAV载体递送可以用单剂量实现长期受益并且可以提供多重靶向的机会。方法可以包括鉴定AAV血清型，所述AAV血清型可以通过CNS/IV施用促进中枢神经元向性和生物分布。本公开的工程化的tRNA可以包含用于识别过早终止密码子的工程化的反密码子。本文还提供了工程化的tRNA变体，其相对于其亲本工程化的tRNA序列包含突变，所述突变可稳定或改善所述工程化的tRNA结构的一个或多个区域。例如，本公开的工程化的tRNA变体可在受体茎，D-环，D-茎，T-环，T-茎，可变环，反密码子茎，反密码子环或其任何组合中具有突变。本文还公开了用于在病毒载体中包装工程化的tRNA抑制分子的各种构建体，包括包装：多种工程化的tRNA抑制物有效载荷，标志物如GFP或mCherry，填充序列，或其任何组合。
本文提供了递送任选地包装到病毒中的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的载体的方法。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体，或编码工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的载体的递送可有效治疗本文所述的疾病，病况或病症(例如Rett综合征)。
I.组合物
本文公开了包含工程化的tRNA分子，工程化的tRNA变体，工程化的前tRNA分子，工程化的前tRNA变体，或编码工程化的tRNA，工程化的前tRNA分子，工程化的tRNA变体，或工程化的前tRNA变体的载体的组合物。如本文所述的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子且至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，例如通过将正确的(例如，非疾病引起的)氨基酸添加到生长肽中。“过早”终止密码子可以指终止密码子，当其存在时，导致多肽相对于野生型对应物的非预期截短。这种截短，也称为终止密码子读通或过早终止密码子读通(PTC)，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，可以以约1％至约100％的效率产生基本上全长的多肽。在一些情况下，效率可为至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些情况下，效率可以为至少约：1％至约10％、5％至约20％、10％至约35％、25％至约50％、40％至约70％、60％至约80％、75％至约90％或约85％至约100％。
在一些情况下，过早终止密码子(PTC)读通的效率可以包括PTC读通的体内效率。在一些情况下，PTC读通的体内效率可以通过至少部分地治疗疾病或病况来确定。例如，可以通过至少部分地改善听的能力，改善看的能力，改善运动能力，认知能力或其任何组合来测量PTC读通的体内效率。在一些情况下，PTC读通的效率可以包括PTC读通的体外效率，例如PTC抑制读通的体外效率，如通过以下确定的：(a)将编码工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码第一绿色荧光蛋白的筛查mRNA可以包括过早终止密码子(这在本文中可称为“断裂的”GFP)；(b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含过早终止密码子；以及(c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光量。在一些情况下，绿色荧光蛋白可以包含至少两个过早终止密码子。在一些情况下，过早终止密码子可以是相同的终止密码子或不同的终止密码子。
PTC读通的体内效率可以为约1％至100％。PTC读通的体内效率可以为约10％至100％。PTC读通的体内效率可以为约20％至100％。PTC读通的体内效率可为约30％至100％。PTC读通的体内效率可以为约40％至100％。PTC读通的体内效率可以为约50％至100％。PTC读通的体内效率可以为约60％至100％。PTC读通的体内效率可以为约70％至100％。PTC读通的体内效率可以为约75％至100％。PTC读通的体内效率可为约80％至100％。PTC读通的体内效率可以为约85％至100％。PTC读通的体内效率可以为约90％到100％。PTC读通的体内效率可以为约95％至100％。PTC读通的体内效率可以为约20％至约40％。PTC读通的体内效率可以为约20％至60％。PTC读通的体内效率可以为约10％至70％。
PTC读通的体外效率可以为约1％至100％。PTC读通的体外效率可以为约10％至100％。PTC读通的体外效率可以为约20％至100％。PTC读通的体外效率可以为约30％至100％。PTC读通的体外效率可以为约40％至100％。PTC读通的体外效率可以为约50％至100％。PTC读通的体外效率可以为约60％至100％。PTC读通的体外效率可以为约70％至100％。PTC读通的体外效率可以为约75％至100％。PTC读通的体外效率可以为约80％至100％。PTC读通的体外效率可以为约85％至100％。PTC读通的体外效率可以为约90％至100％。PTC读通的体外效率可以为约95％至100％。PTC读通的体外效率可以为约20％至约40％。PTC读通的体外效率可以为约20％至60％。PTC读通的体外效率可以为约10％至70％。
一些实施方案涉及多肽。在一些实施方案中，多肽可以包括多肽的片段。在一些实施方案中，多肽可以包括多肽的至少一个片段。在一些实施方案中，多肽可以包括全长多肽。在一些实施方案中，多肽可以由mRNA编码。在一些实施方案中，多肽的片段可以由具有过早终止密码子的mRNA编码。在一些实施方案中，全长多肽可以由没有过早终止密码子的mRNA编码。
如本文所公开的，本文所公开的工程化的tRNA及其变体能够过早终止密码子读通。例如，工程化的tRNA及其变体能够过早终止密码子读通MECP2基因中的Arg至乳白终止密码子的突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R168X突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R255X突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R270X突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R294X突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R198X突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA及其变体可以使得能够过早终止密码子读通MECP2基因中的R453X突变。
在一些实施方案中，编码多肽的mRNA对应于MeCP2。
在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用典型氨基酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用非典型氨基酸酰化。非典型氨基酸可以包括对乙酰基苯丙氨酸，对炔丙氧基苯丙氨酸，对叠氮基苯丙氨酸，O-甲基酪氨酸，对碘代苯丙氨酸，3-碘代酪氨酸，联苯丙氨酸，2-氨基辛酸，对苯甲酰基苯丙氨酸，邻硝基苄基半胱氨酸，邻硝基苄基丝氨酸，4,5-二甲氧基-2-硝基苄基丝氨酸，邻硝基苄基赖氨酸，丹磺酰基丙氨酸，乙酰基赖氨酸，甲基组氨酸，2-氨基壬酸，2-氨基癸酸，2-氨基癸酸，Cbz-赖氨酸，Boc-赖氨酸或烯丙氧基羰基赖氨酸。
在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用表1中提供的氨基酸酰化。
表1.氨基酸单字母代码和三字母代码
氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 ala A
精氨酸 arg R
天冬酰胺 asn N
天门氨酸 asp D
天冬酰胺或天冬氨酸 asx B
半胱氨酸 cys C
谷氨酸 glu E
谷氨酰胺 gln Q
谷氨酰胺或谷氨酸 glx Z
甘氨酸 gly G
组氨酸 his H
异亮氨酸 ile I
亮氨酸 leu L
赖氨酸 lys K
甲硫氨酸 met M
苯丙氨酸 phe F
脯氨酸 pro P
丝氨酸 ser S
苏氨酸 thr T
色氨酸 trp W
酪氨酸 tyr Y
缬氨酸 val V
在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用赖氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用精氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用组氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用甘氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用丙氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用缬氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用亮氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用异亮氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用甲硫氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用苯丙氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用色氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用脯氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用丝氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用苏氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用半胱氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用酪氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用天冬酰胺酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用谷氨酰胺酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用天冬氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用谷氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用吡咯赖氨酸酰化。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以用硒代半胱氨酸酰化。
在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酰-tRNA，或谷氨酰-tRNA。
本公开考虑并入特定的杂合tRNA或正交tRNA/tRNA合成酶对。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包括来自其它物种的设计者tRNA(例如由两种不同的天然存在的tRNA制备的杂合tRNA)或正交tRNA。在一些情况下，可以使用或包括合成的或嵌合的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一些情况下，可以与天然存在的tRNA合成酶相互作用的合成tRNA被包括或使用。在一些情况下，吡咯赖氨酰tRNA或硒代半胱氨酰tRNA可用于遗传密码扩增以将非典型氨基酸并入工程化的tRNA或工程化的tRNA变体中。
在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以是赖氨酸-tRNA、精氨酸-tRNA、组氨酸-tRNA、甘氨酸-tRNA、丙氨酸-tRNA、缬氨酸-tRNA、亮氨酸-tRNA、异亮氨酸-tRNA、甲硫氨酸-tRNA、苯丙氨酸-tRNA、色氨酸-tRNA、脯氨酸-tRNA、丝氨酸-tRNA、苏氨酸-tRNA、半胱氨酸-tRNA、酪氨酸-tRNA、天冬酰胺-tRNA、谷氨酰胺-tRNA、天冬氨酸-tRNA或谷氨酸-tRNA。
在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以衍生自人tRNA。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以衍生自非人tRNA。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以衍生自可以与人tRNA正交的tRNA。工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以被氨基-酰基合成酶酰化，该合成酶可以识别工程化的tRNA或工程化的tRNA变体，并且用氨基酸酰化工程化的tRNA或工程化的tRNA变体。在一些情况下，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以是工程化的前tRNA或工程化的前tRNA变体。这种工程化的前tRNA或其变体可以包含内含子序列。在一些情况下，可以剪接内含子序列以产生成熟的工程化的tRNA或其变体。在一些情况下，内含子序列可以在含有工程化的tRNA或其变体的细胞内剪接。在一些情况下，一旦内含子序列被剪接，成熟的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子。在一些情况下，与没有内含子的工程化的前tRNA或其变体相比，具有内含子的工程化的前tRNA或其变体在将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子方面可以更有效。可以通过将编码具有内含子的工程化的抑制性前tRNA或其变体的载体转化到包含工程化的抑制性前tRNA或其变体所识别的过早终止密码子的原代细胞系中，并与针对另一种可比较的细胞的过早终止密码子读通的水平进行比较来测量效率，所述另一种可比较的细胞已经用编码没有内含子的工程化的抑制性前tRNA或其变体的载体转化。在一些情况下，确定全长蛋白质的量可用于测量过早终止密码子读通。
工程化的tRNA或其变体可以用反密码子序列工程改造，所述反密码子序列与终止密码子，而不是编码目的氨基酸的密码子碱基配对。例如，工程化的tRNA或其变体靶向生长的多肽中精氨酸(目的氨基酸)可以是正常的(例如，不引起疾病)的位置处的过早终止密码子。在一些情况下，具有与过早终止密码子碱基配对的反密码子序列的工程化的Arg tRNA或其变体，可以与终止密码子碱基配对，使得工程化的tRNA或其变体装载Arg，以将Arg加入到生长的多肽分子中，从而实现过早终止密码子的读通。
本公开的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可经工程改造以识别和抑制琥珀终止密码子(UAG)、赭石终止密码子(UAA)或乳白终止密码子(UGA)或其组合。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以被工程改造以抑制琥珀终止密码子(UAG)的读通。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以被工程改造以抑制赭石终止密码子(UAA)的读通。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以被工程改造以抑制乳白终止密码子(UGA)的读通。在一些情况下，本公开提供了能够识别和抑制琥珀终止密码子，赭石终止密码子和乳色终止密码子中多于一种的多种工程化的tRNA或其变体的组合物(图13)。能够识别和抑制琥珀终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以包含精氨酸(Arg)tRNA异构体解码器(isodecoder)。能够识别和抑制琥珀终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以包含谷氨酰胺(Gln)tRNA异构体解码器(图13)。能够识别和抑制赭石终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以包含精氨酸(Arg)tRNA异构体解码器。能够识别和抑制赭石终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以包含谷氨酰胺(Gln)tRNA异构体解码器(图13)。在一些实施方案中，能够识别和抑制琥珀终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以具有与天然存在的Gln tRNA异构体解码器约70％至约100％的序列相似性。在一些实施方案中，能够识别和抑制赭石终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以具有与天然存在的Gln tRNA异构体解码器约70％至约100％的序列相似性。在一些实施方案中，能够识别和抑制琥珀终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以具有与天然存在的Arg tRNA异构体解码器(isodecoder)约70％至约100％的序列相似性。在一些实施方案中，能够识别和抑制赭石终止密码子的工程化的tRNA或其变体可以具有与天然存在的Arg tRNA异构体解码器约70％至约100％的序列相似性。
具有反密码子的工程化的tRNA或其变体可以用本文所述的任何一种氨基酸(典型的或非典型的)来装载，所述反密码子被配置为与本文所述的任何一种终止密码子碱基配对。图2A说明了人Arg tRNA的共有二级结构。图2B说明了被排除在诱变之外以产生本文公开的工程tRNA的人Arg tRNA的共有二级结构和序列中的位点。
在一些实施方案中，由工程化的tRNA或其变体靶向的mRNA可以包含一个，两个，三个，四个或五个过早终止密码子。因此，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可产生对所述一个或多个过早终止密码子的读通，至少部分地恢复基本上全长的多肽。在一些情况下，至少部分地恢复基本上全长的多肽可以包括至少部分地治疗疾病或病况。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可恢复约30％至约99％的PTC读通。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可恢复约40％至约45％，约40％至约50％，约40％至约55％，约40％至约60％，约40％至约65％，约40％至约70％，约40％至约75％，约40％至约80％，约40％至约85％，约40％至约90％，约40％至约95％，约45％至约50％，约45％至约55％，约45％至约60％，约45％至约65％，约45％至约70％，约45％至约75％，约45％至约80％，约45％至约85％，约45％至约90％，约45％至约95％，约50％至约55％，约50％至约60％，约50％至约65％，约50％至约70％，约50％至约75％，约50％至约80％，约50％至约85％，约50％至约90％，约50％至约95％，约55％至约60％，约55％至约65％，约55％至约70％，约55％至约75％，约55％至约80％，约55％至约85％，约55％至约90％，约55％至约95％，约60％至约65％，约60％至约70％，约60％至约75％，约60％至约80％，约60％至约85％，约60％至约90％，约60％至约95％，约65％至约70％，约65％至约75％，约65％至约80％，约65％至约85％，约65％至约90％，约65％至约95％，约70％至约75％，约70％至约80％，约70％至约85％，约70％至约90％，约70％至约95％，约75％至约80％，约75％至约85％，约75％至约90％，约75％至约95％，约80％至约85％，约80％至约90％，约80％至约95％，约85％至约90％，约85％至约95％，或约90％至约95％的PTC读通。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以恢复至少约40％的PTC读通。在一些情况下，两个或更多个终止密码子可以是相同的终止密码子。在一些情况下，两个或更多个终止密码子可以是不同的终止密码子。在一些情况下，当靶mRNA含有两个或更多个终止密码子时，一种类型的工程化的tRNA或其变体可用于至少部分地恢复全长的多肽，所述终止密码子是相同的终止密码子。在一些情况下，当靶mRNA含有两个或更多个终止密码子时，可以使用多于一种类型的工程化的tRNA或其变体来至少部分地恢复全长的多肽，所述终止密码子是不同的终止密码子。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以减少或预防靶mRNA的无义介导的衰变。
本文公开的工程化的tRNA可被修饰以产生工程化的tRNA变体。例如，本文公开的工程化的tRNA可以相对于参考tRNA进行修饰。在一些情况下，修饰可以是工程化的tRNA序列中的突变，例如核苷酸的插入或取代。在一些情况下，可以突变的序列可以是DNA序列，tRNA序列或前tRNA序列。在一些情况下，修饰可以是工程化的tRNA序列中核苷酸的化学修饰。化学修饰可以包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含化学修饰，所述化学修饰包含甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。
参考tRNA可以是野生型tRNA或工程化的tRNA，使得工程化的tRNA具有一个以上的突变。在本上下文中，野生型tRNA或工程化的tRNA可称为“主链”或“亲本”tRNA。
可在工程化的tRNA的任何区域中进行突变以产生本公开的工程化的tRNA变体，所述区域包括但不限于受体茎，反密码子茎，D-环，D-茎和T-环，T-茎或可变区或环。例如，取代受体茎和反密码子茎中的核苷酸以增加Watson-Crick碱基配对可以稳定工程化的tRNA的受体和反密码子茎。本文公开的对工程化的tRNA的突变的非限制性实例提供于表2中。
表2.对工程化的tRNA的示例性突变以产生工程化的tRNA变体
Figure BDA0003752489830000521
*N>N’是指N可以代替N’。在N>N'之前的数字表示参考编码工程化的tRNA的DNA序列的核苷酸位置。胸腺嘧啶(“T”)只能存在于DNA背景中，当涉及tRNA序列时，应理解为是指尿嘧啶(“U”)。
在一些实施方案中，本文公开了工程化的tRNA变体。工程化的tRNA变体可以在T-环，T-茎，D-环，D-茎，可变环，反密码子茎或反密码子环中包含突变。突变可以相对于SEQID NOS:3-22或103-122中任一项的核酸序列。在一些实施方案中，突变可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个突变，或由上述数目的突变中的任两个定义的一系列突变。在一些实施方案中，突变可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个突变。在一些实施方案中，突变可以包括不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个或不超过15个突变。在一些实施方案中，突变可以包括T环、T-茎、D-环、D-茎、可变环、反密码子茎、反密码子环或其组合中的突变。在一些实施方案中，突变可以在T环中包含突变。在一些实施方案中，突变可以在T-茎中包含突变。在一些实施方案中，突变可以在D-环中包含突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在可变环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在反密码子环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和T-茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和D环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和D-茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和可变环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T环和反密码子环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T-茎和D-环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T-茎和D-茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在T-茎和可变环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括T-茎和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括T-茎和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-环和D-茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-环和可变环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-环和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-环和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-茎和可变环中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在D-茎和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括D-茎和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在反密码子茎和反密码子茎中的突变。在一些实施方案中，突变可以包括在反密码子茎和反密码子茎中的突变。
在一些情况下，工程化的tRNA变体可以是工程化的tRNA变体的变体，其相对于SEQID NO:3可以包含72C、2G、71C、6G、67C、64G、13C、22G、15G、28C、42G、31A、39T、37G、44A或50C，或其任何组合。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含72C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含2G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含71G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含6G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含67C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含64G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含13C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含22G。在一些情况下，工程化的tRNA可以包含15G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含28C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含42G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含31A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含39T。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含37G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含44A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含50℃。在一些情况下，工程化的tRNA变体可具有与SEQ ID NO:3约70％至约100％的序列同一性。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含含有SEQ ID NO:23、24、25、25、27、28、29、30、31或32的序列的工程化的tRNA变体之一。在一些情况下，工程化的tRNA变体可与包含SEQ ID NO:23、24、25、25、27、28、29、30、31或32的序列的工程化的tRNA变体具有约70％至约100％的序列同一性。
在一些情况下，工程化的tRNA变体可以是工程化的tRNA TCT1的变体，其相对于SEQ ID NO:6的序列包含2C、6T、65C、71G、71C、6A、23G、28C、67A、50T、4C、67T、27C、42G、49G、64A、69G、12C、43G、40C、31C、39G、44G或46A，或其任何组合。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含6T。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含65C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含2C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含71C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含46A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含71G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含6A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含23G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含28C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含67A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含50T。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含4C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含67T。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含27C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含42G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含49G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含64A。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含69G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含12C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含43G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含40C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含31C。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含39G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含44G。在一些情况下，工程化的tRNA变体可具有与SEQ ID NO:6的序列约70％至约100％的序列同一性。在一些情况下，工程化的tRNA变体包含SEQ ID NO:35-48的序列之一。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:45的序列。在一些情况下，工程化的tRNA变体包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:45，以及SEQ ID NOS:1和2。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:32。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:45。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以与包含SEQ ID NO:35-48序列的任何工程化的tRNA变体具有约70％至约100％的序列同一性。在一些情况下，与包含SEQ ID NO:35-48序列的任何工程化的tRNA变体相比，工程化的tRNA变体可具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。
在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含多于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些情况下，工程化的tRNA变体可以包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体在反密码子中不包含取代。在一些情况下，本文所述的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可提供于表3中。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体的侧翼可以是包含SEQ ID NO:1序列的5'末端序列和/或包含SEQ ID NO:2序列的3’末端序列。在一些实施方案中，5’末端序列可以是工程化的tRNA或其变体的前导序列。在一些实施方案中，3’末端序列可以是工程化的tRNA或其变体的聚T终止信号和的尾随序列。
表3.tRNA序列
Figure BDA0003752489830000561
Figure BDA0003752489830000571
Figure BDA0003752489830000581
Figure BDA0003752489830000591
一些实施方案涉及DNA序列(例如SEQ ID NOS:1-48中的任一项)。在一些实施方案中，DNA序列与类似的RNA序列(例如SEQ ID NOs:101-148中的任一项)可以是可互换的。一些实施方案涉及RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列与类似的DNA序列是可以可互换的。在一些实施方案中，U和T在本文提供的序列中可以是可互换的。一些实施方案涉及DNA序列，例如表3中提供的DNA序列。在一些实施方案中，DNA序列与本文提供的类似RNA序列，例如表3中的相应RNA序列可以是可互换的。一些实施方案涉及RNA序列，例如表3中提供的RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列与本文提供的类似DNA序列，例如表3中的相应DNA序列可以是可互换的。在一些实施方案中，本文所述的工程化的tRNA可以包含表3中提供的DNA序列。在一些实施方案中，本文所述的工程化的tRNA具有表3中提供的RNA序列。通常，U和T在序列之间可以是可互换的，并且仍然可用于本文所述的方法和组合物。描述工程化的tRNA或tRNA序列的一些实施方案可以包括表3中的DNA或RNA序列。描述工程化的tRNA或tRNA序列的一些实施方案可以包括表3中的DNA序列。描述工程化的tRNA或tRNA序列的一些实施方案可以包括表3中的RNA序列。在一些情况下，对SEQ ID NOS:1-48中任一项的提及可以包括对SEQ ID NOS:101-148中相应序列的提及，或反之亦然。在一些情况下，本文提及的包含表3的DNA序列的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包括包含由包含DNA序列的多核苷酸编码的RNA序列的tRNA。
在一些实施方案中，A可以是包含腺苷的核碱基。在一些实施方案中，A可以是包含核糖或脱氧核糖以及腺苷的核苷。在一些实施方案中，A可以是包含磷酸，核糖或脱氧核糖以及腺苷的核苷酸。在一些实施方案中，T可以是包含胸腺嘧啶的核碱基。在一些实施方案中，T可以是包含核糖或脱氧核糖以及胸腺嘧啶的核苷。在一些实施方案中，T可以是包含磷酸，核糖或脱氧核糖以及胸腺嘧啶的核苷酸。在一些实施方案中，U可以是包含尿嘧啶的核碱基。在一些实施方案中，U可以是包含核糖或脱氧核糖以及尿嘧啶的核苷。在一些实施方案中，U可以是包含磷酸，核糖或脱氧核糖以及尿嘧啶的核苷酸。在一些实施方案中，C可以是包含胞嘧啶的核碱基。在一些实施方案中，C可以是包含核糖或脱氧核糖以及胞嘧啶的核苷。在一些实施方案中，C可以是包含磷酸，核糖或脱氧核糖以及胞嘧啶的核苷酸。在一些实施方案中，G可以是包含鸟嘌呤的核碱基。在一些实施方案中，G可以是包含核糖或脱氧核糖以及鸟嘌呤的核苷。在一些实施方案中，G可以是包含磷酸，核糖或脱氧核糖以及鸟嘌呤的核苷酸。
在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22中的任一序列具有约70％至约99％同一性的序列，如使用BLAST所测量的。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22中的任一序列之间的序列同一性可为约70％至约80％、80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约99％。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22中的任一序列之间的序列同一性可以是至少70％、71％、72％、73％、74％。75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22中的任一序列之间的序列同一性可以是至多约99％、98％、97％、69％、59％。94％、93％、92％、91％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％或更少。例如，包含SEQ ID NO:4序列的工程化的tRNA可以与SEQ ID NO:3具有约98.6％的序列同一性。
在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122中的任一序列具有约70％至约99％同一性的序列，如使用BLAST所测量的。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122中的任一序列之间的序列同一性可为约70％至约80％、80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约99％。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122中的任一序列之间的序列同一性可以是至少70％、71％、72％、73％、74％。75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122中的任一序列之间的序列同一性可以是至多约99％、98％、97％、69％、59％。94％、93％、92％、91％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％或更少。例如，包含SEQ IDNO:104序列的工程化的tRNA可以与SEQ ID NO:103具有约98.6％的序列同一性。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NOS:3、4、5或6中的任一序列具有约70％至约99％同一性的序列，如使用BLAST所测量的。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:3、4、5或6中的任一序列之间的序列同一性可以是约70％至约80％、80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约99％。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:3、4、5或6中的任一序列之间的序列同一性可以是至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％。86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:3、4、5或6中的任一序列之间的序列同一性可至多为约99％、98％、97％、69％、59％、94％、93％、92％、91％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％。82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％或更低。例如，包含SEQ ID NO:35序列的工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:6序列约97％的序列同一性。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3、6、7、32或45中的任一序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA与SEQ ID NO:3、6、7、32或45中的任一序列之间的序列同一性可以是约70％至约80％、80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约99％。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与本文公开的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列(例如包含表3中公开的序列)具有约70％至约100％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少70％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列具有100％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列相比具有不超过99％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸的范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列的核苷酸长度的100％的范围内。tRNA或工程化的tRNA变体序列可以是表3的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:1。工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:1或101，以及SEQ ID NOS:3-48中的任何一个。工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包括SEQ ID NO:1或101，以及SEQ IDNO:103-148中的任何一个。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:2。除了SEQ ID NO:2之外，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体还可以包括SEQ ID NO:3-48中的任何一个。除了SEQ ID NO:102之外，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体还可以包括SEQ ID NO:103-148中的任何一个。工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-48中的任何一个和SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3-48中的任何一个和SEQ ID NO:2组成。工程化的tRNA或工程化的tRNA变体可以包含SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103-148中的任何一个和SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103-148中的任何一个和SEQ ID NO:102组成。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQID NO:10。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ IDNO:11。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQID NO:30。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ IDNO:31。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:42。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:44。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:46。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:47。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:48。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:101。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQID NO:102。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ IDNO:103。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:104。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:105。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:106。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:107。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:109。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:110。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:111。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:112。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:113。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:114。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:115。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:116。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:117。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:118。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:119。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:120。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:121。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:122。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQID NO:123。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ IDNO:124。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:125。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:126。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:127。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:128。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:129。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:130。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:131。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:132。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:133。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:134。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:135。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:136。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:137。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:138。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:139。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:140。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:141。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:142。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:143。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQID NO:144。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ IDNO:145。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:146。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:147。在一些实施方案中，工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列可以包含SEQ ID NO:148。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:103的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQID NO:3或103的序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:3或103的序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:3或103的序列相比具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性在SEQ ID NO:3或103的核苷酸的范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:3或103的核苷酸长度的100％的范围内。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:132的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:32或132的序列相比具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:32或132的核苷酸长度的100％的范围内。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:106的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQID NO:6或106的序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:6或106的序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:6或106的序列相比具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸的范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:6或106的核苷酸长度的100％的范围内。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:145的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:45或145的序列相比具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:45或145的核苷酸长度的100％的范围内。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:107的序列具有约70％至约99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少75％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少80％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少85％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少90％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少91％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少92％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少93％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少94％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQID NO:7或107的序列相比具有至少95％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少96％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少97％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有至少98％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ IDNO:7或107的序列相比具有至少99％同一性的序列。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以包含与SEQ ID NO:7或107的序列相比具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸范围(例如，长度的70-100％)内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的70％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的75％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的80％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的85％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的90％的范围内。在一些实施方案中，％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的95％的范围内。在一些实施方案中，所述％同一性可以在SEQ ID NO:7或107的核苷酸长度的100％的范围内。
与相应的亲本tRNA相比，包含本文所述修饰的工程化的tRNA变体在一些情况下可以表现出改善的抑制效率。在一些情况下，抑制效率可以比相应的亲本tRNA的抑制效率高大于或等于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％。24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些情况下，抑制效率可以比相应的亲本tRNA的抑制效率高约1％至约30％、约2％至约29％、约3％至约28％、约4％至约27％、约5％至约26％、约6％至约25％、约7％至约24％、约8％至约23％、约9％至约22％、约10％至约21％、约11％至约20％、约12％至约19％、约13％至约18％、约14％至约17％、或约15％至约16％。
在一些情况下，与相应的亲本tRNA的稳定性相比，包含本文所述修饰的工程化的tRNA变体可表现出更好的稳定性。将碱基对改变为C-G而不是A-T或非Watson Crick可以至少对工程化的tRNA具有稳定作用，因为C-G键可以强于A-T键或非Watson Crick键。稳定性可以以不同的方式测量，例如，在热力学稳定性或屏蔽工程化的tRNA以免降解方面。将碱基对改变为G-C键可以至少提供热力学以及降解屏蔽，因此稳定了工程化的tRNA以免降解。
一些实施方案包括组合物，所述组合物包含：工程化的tRNA变体，所述变体参考SEQ ID NOS:3-22中任何一项提供的序列包含一个或多个突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含与SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:48中的任何一项的至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的序列。一些实施方案可以包括组合物，所述组合物可以包含：工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NOS:3-22中任何一项提供的序列的参考tRNA相比，工程化的tRNA变体可以在工程化的tRNA的序列中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，并且在mRNA翻译期间至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，以产生基本上全长的多肽。
在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少70％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少75％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少85％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:6至少95％相同的序列。
在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6的序列的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:106的序列的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置2处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置4处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置6处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置12处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQID NO:6或106的位置23处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ IDNO:6或106的位置27处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置28处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置31处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置39处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置40处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置42处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置43处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置44处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置46处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置49处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置50处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置64处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置65处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置67处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置69处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:6或106的位置71处包含取代。在一些实施方案中。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中。在一些实施方案中，位置4处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置6处的取代可以是取代为T。在一些实施方案中，位置6处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置12处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置23处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置27处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置28处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置31处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置39处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置40处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置42处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置43处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置44处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置46处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置49处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置50处的取代可以是取代为T。在一些实施方案中，位置64处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置65处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置67处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置67处的取代可以是取代为T。在一些实施方案中，位置69处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置71处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置71处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列可以包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:6或106相同。在一些实施方案中，通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:6中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体可表现出增加的体内稳定性。
在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少70％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少75％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少80％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少85％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少90％相同的序列。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:3至少95％相同的序列。
在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置2、6、13、15、22、28、31、37、39、42、44、50、64、67、71或72处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置2处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置6处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置13处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置15处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置22处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置28处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQID NO:3或103的位置31处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ IDNO:3或103的位置37处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置39处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置42处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置44处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置50处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置64处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置67处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置71处包含取代。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以在SEQ ID NO:3或103的位置72处包含取代。在一些实施方案中，位置2处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置6处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置13处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置15处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置22处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置28处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置31处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置37处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置39处的取代可以是取代为T。在一些实施方案中，位置42处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置44处的取代可以是取代为A。在一些实施方案中，位置50处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置64处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，位置67处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置71处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，位置72处的取代可以是取代为C。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:103相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:103中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
在一些实施方案中，工程化的tRNA变体可以包含可以与SEQ ID NO:5至少70％相同的序列，并且可以在SEQ ID NO:5的位置73处包含取代。在一些实施方案中，位置73处的取代可以是取代为G。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体的序列可以包括多个取代。在一些实施方案中，除了取代之外，工程化的tRNA变体的序列可以与SEQ ID NO:5相同。在一些实施方案中，如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:5中提供的序列的可比较的tRNA相比，工程化的tRNA变体可表现出增加的体内稳定性。
在一些实施方案中，本文公开了包含工程化的tRNA变体的组合物，其表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，增加的稳定性可以包括增加的热力学稳定性。
另外的RNA编辑系统
在一些实施方案中，使用工程化的tRNA或其变体进行的终止密码子读通可以通过核酸编辑技术来补充。例如，可以使用基于聚集规则间隔回文重复(CRISPR)-Cas的系统来编辑编码mRNA的基因以去除过早终止密码子。在一些情况下，RNA编辑系统可用于直接编辑mRNA中的过早终止密码子。
RNA编辑系统可以包含工程化的多核苷酸序列，其可以包含：(i)募集区和/或(ii)靶向区。这种多核苷酸序列可以通过例如募集区的至少一部分募集RNA编辑实体。在一些情况下，RNA编辑系统可以不包含募集区。编辑实体在与工程化的多核苷酸序列和靶mRNA接触时，可以对mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基进行化学修饰，从而将过早终止密码子转化为有义密码子。
本文所述的RNA编辑实体可以包括双链RNA特异性腺苷脱氨酶，例如ADAR(由ADAR、NCBI基因ID:103编码)，包括ADAR1或ADAR2。编辑实体可以包括载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)，例如APOBEC亚基A(NCBI基因ID:200315)、B(NCBI基因ID:9582)、C(NCBI基因ID:27350)、D(NCBI基因ID:140564)、H(NCBI基因ID:164668)。RNA编辑实体可以是内源的。RNA编辑实体可以作为RNA编辑系统的一部分被外源递送。
在一些情况下，过早终止密码子转化为有义密码子可以以将过早终止密码子编辑为有义密码子的效率进行。RNA编辑的效率可以通过比较包含编码多肽的过早终止密码子的两个可比较的细胞或细胞系的全长多肽的量来确定。一种细胞或细胞系可以包含RNA编辑系统，而另一种细胞或细胞系可以不具有RNA编辑系统。可以确定两种细胞之间全长多肽的量的比较。在一些实施方案中，RNA编辑实体对靶RNA的核苷酸的碱基的编辑可以在体外测定中确定，所述体外测定包括：(i)直接或间接地将靶RNA引入(例如转染到)原代细胞系，(ii)直接或间接地将工程化的多核苷酸(例如具有募集区和/或靶向区的多核苷酸)引入(例如转染到)原代细胞系，以及(iii)对靶RNA进行测序。在一些情况下，将靶RNA转染到原代细胞系中可以包括将编码靶RNA的质粒转染到原代细胞系中。在一些情况下，将工程化的多核苷酸转染到原代细胞系中可以包括将编码工程化的多核苷酸的多核苷酸(例如，质粒)转染到原代细胞系中。在一些情况下，测序可以包括在靶RNA可以通过逆转录酶转化为cDNA之后对靶RNA进行的Sanger测序。
在一些情况下，RNA编辑的效率可以包括RNA编辑的体内效率。在一些情况下，RNA编辑的体内效率可以通过至少部分地治疗疾病或病况来确定。例如，RNA编辑的体内效率可以通过至少部分地改善听的能力，改善看的能力，改善运动能力，认知能力或其任何组合来测量。在一些情况下，RNA编辑的效率可以包括RNA编辑的体外效率。
RNA编辑的体内效率可为约1％至100％。RNA编辑的体内效率可为约10％至100％。RNA编辑的体内效率可为约20％至100％。RNA编辑的体内效率可为约30％至100％。RNA编辑的体内效率可为约40％至100％。RNA编辑的体内效率可为约50％至100％。RNA编辑的体内效率可为约60％至100％。RNA编辑的体内效率可为约70％至100％。RNA编辑的体内效率可为约75％至100％。RNA编辑的体内效率可为约80％至100％。RNA编辑的体内效率可为约85％至100％。RNA编辑的体内效率可为约90％至100％。RNA编辑的体内效率可为约95％至100％。RNA编辑的体内效率可为约20％至约40％。RNA编辑的体内效率可为约20％至60％。RNA编辑的体内效率可为约10％至70％。
RNA编辑的体外效率可为约1％至100％。RNA编辑的体外效率可为约10％至100％。RNA编辑的体外效率可为约20％至100％。RNA编辑的体外效率可为约30％至100％。RNA编辑的体外效率可为约40％至100％。RNA编辑的体外效率可为约50％至100％。RNA编辑的体外效率可为约60％至100％。RNA编辑的体外效率可为约70％至100％。RNA编辑的体外效率可为约75％至100％。RNA编辑的体外效率可为约80％至100％。RNA编辑的体外效率可为约85％至100％。RNA编辑的体外效率可为约90％至100％。RNA编辑的体外效率可为约95％至100％。RNA编辑的体外效率可为约20％至约40％。RNA编辑的体外效率可为约20％至60％。RNA编辑的体外效率可为约10％至70％。
编码工程化的tRNA及其变体和前tRNA的载体
在一些实施方案中，载体可以编码工程化的tRNA或其变体或工程化的前tRNA或其变体。在一些实施方案中，组合物可以包含载体。在一些情况下，载体可以包括质粒或病毒载体。在一些情况下，可以将编码工程化的tRNA或其变体或工程化的前tRNA或其变体的载体施用于受试者。病毒载体可以包括腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，这些载体中的任一种的一部分，或它们的任何组合。在一些情况下，载体可以包含DNA，例如双链DNA或单链DNA。载体可以包含RNA。载体可以包含重组载体。在一些情况下，可以从天然存在的载体修饰载体。载体可以包含DNA，例如双链DNA或单链DNA。载体可以包含RNA。在一些情况下，RNA可以包含碱基修饰。载体可以包括重组载体。载体可以是可以从天然存在的载体修饰的载体。载体可以包含非天然存在的载体的至少一部分。可以使用任何载体。病毒载体可以包括腺病毒载体，腺伴随病毒载体(AAV)，慢病毒载体，逆转录病毒载体，这些载体中的任一种的一部分，或它们的任何组合。在一些情况下，载体可以包括AAV载体。载体可以被修饰以包括修饰的VP1蛋白(例如被修饰以包括VP1蛋白的AAV载体)。在一方面，AAV载体可以是重组AAV(rAAV)载体。rAAV可以由与野生型AAV(wtAAV)中发现的基本相似的衣壳序列和结构组成。然而，rAAV壳体化基因组，所述基因组基本上不含AAV蛋白编码序列并具有治疗基因表达盒(例如原位设计的受试者多核苷酸)。在一些情况下，病毒来源的序列可以是ITR，其可以是在载体产生期间导向基因组复制和包装所需的。合适的AAV载体可以选自任何AAV血清型或血清型的组合。例如，AAV载体可以是以下的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV 11、AAV 12，或其任何组合。在一些情况下，可以基于载体的天然向性来选择载体。在一些情况下，可以基于载体的穿过血脑屏障的能力来选择载体血清型。已经显示AAV9和AAV10穿过血脑屏障来转导神经元和神经胶质。在一方面，AAV载体可以是AAV2、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。在一些情况下，AAV载体可以是至少两种血清型的嵌合体。在一方面，AAV载体可以是血清型AAV2和AAV5的嵌合体。在一些情况下，嵌合AAV载体可以包含来自AAV2的rep和ITR序列以及来自AAV5的cap序列。在一些实施方案中，AAV载体可以是自身互补的。在一些情况下，AAV载体可以包含反向末端重复。在其它情况下，AAV载体可以包含自身互补的反向末端重复(scITR)序列。在一些情况下，rep、cap和ITR序列可以与本文提供的所有不同AAV血清型混合和匹配。在一些情况下，可以进一步修饰合适的AAV载体以包括修饰，例如在衣壳或rep蛋白中的修饰。修饰还可以包括缺失，插入，突变及其组合。在一些情况下，可以对载体进行修饰以降低免疫原性，从而允许重复施用。在一些情况下，当可进行重复施用时，可改变可利用的载体的血清型以降低和/或消除免疫原性。
可以使用载体来递送核酸。载体可以包含DNA，例如双链DNA或单链DNA。载体可以包含RNA。在一些情况下，RNA可以包含碱基修饰。载体可以包括重组载体。载体可以是可以从天然存在的载体修饰的载体。载体可以包含非天然存在的载体的至少一部分。可以使用任何载体。病毒载体可以包括腺病毒载体，腺伴随病毒载体(AAV)，慢病毒载体，逆转录病毒载体，这些载体中的任一种的一部分，或它们的任何组合。在一些情况下，载体可以包括AAV载体。载体可以包含单链主链(例如，图22A所示的病毒主链)。在一些情况下，载体可以包含主链，其可以包含自身互补的区域(例如，图22B中所示的病毒主链)。载体可以被修饰以包括修饰的VP1蛋白(例如被修饰以包括VP1蛋白的AAV载体)。在一方面，AAV载体可以是重组AAV(rAAV)载体。rAAV可以由与野生型AAV(wtAAV)中发现的基本相似的衣壳序列和结构组成。然而，rAAV衣壳化基因组，所述基因组基本上不含AAV蛋白编码序列并具有治疗基因表达盒(例如原位设计的受试者多核苷酸)。在一些情况下，病毒来源的序列可以是ITR，其可以是在载体产生期间导向基因组复制和包装所需的。合适的AAV载体可以选自任何AAV血清型或血清型的组合。例如，AAV载体可以是以下的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12，或其任何组合。在一些情况下，可以基于载体的天然向性来选择载体。在一些情况下，可以基于载体穿过血脑屏障的能力来选择载体血清型。已经显示AAV9和AAV10穿过血脑屏障来转导神经元和神经胶质。在一方面，AAV载体可以是AAV2、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。在一些情况下，AAV载体可以是至少两种血清型的嵌合体。在一方面，AAV载体可以是血清型AAV2和AAV5的嵌合体。在一些情况下，嵌合AAV载体可以包含来自AAV2的rep和ITR序列以及来自AAV5的cap序列。在一些实施方案中，AAV载体可以是自身互补的。在一些情况下，AAV载体可以包含反向末端重复。在其它情况下，AAV载体可以包含自身互补的反向末端重复(scITR)序列。在一些情况下，rep、cap和ITR序列可以与本文提供的所有不同AAV血清型混合和匹配。在一些情况下，可以进一步修饰合适的AAV载体以包括修饰，例如在衣壳或rep蛋白中的修饰。修饰还可以包括缺失，插入，突变及其组合。在一些情况下，可以对载体进行修饰以降低免疫原性，从而允许重复施用。在一些情况下，当可进行重复施用时，可改变可利用的载体的血清型以降低和/或消除免疫原性。
在一些情况下，AAV载体可以来自具有以下的AAV：包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的血清型，或包含AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-Retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAV-218的假型。在一些情况下，AAV载体可以包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些情况下，AAV载体可以包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些情况下，AAV载体可以是AAV2/5载体。
在一些实施方案中，AAV载体可以包含2至6个拷贝的工程化的tRNA或其变体/病毒基因组。在一些情况下，AAV载体可以包含工程化的tRNA，工程化的tRNA变体或其组合。在一些情况下，AAV载体可以包含1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9，或2至10个拷贝/病毒基因组。在一些情况下，AAV载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝/病毒基因组。在一些实施方案中，AAV载体可以包含1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、1至35、1至40、1至45或1至50个拷贝/病毒基因组。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体，编码工程化的tRNA或其变体的载体，或两者可存在于递送系统中。在一些情况下，递送系统可以包括病毒颗粒、脂质体、纳米颗粒、外来体、细胞外囊泡、纳米网、带电聚合物、不带电聚合物、表面活性剂、渗透增强剂、基因转移剂、磷脂、胶束、合成载体、大分子、树枝状聚合物、生物聚合物或其任何组合。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的载体可以存在于病毒颗粒，脂质体，纳米颗粒，外来体，细胞外囊泡，纳米网或其任何组合中。在一些情况下，载体可以存在于多肽包被内。
在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体，工程化的前tRNA或其变体，或两者可以包含在组合物如药物组合物中。在一些实施方案中，编码工程化的tRNA或其变体的载体，编码工程化的前tRNA或其变体的载体，或其任何组合可以包含在组合物如药物组合物中。在一些情况下，组合物可以包含赋形剂，稀释剂或载体。
在一些实施方案中，本文公开的组合物可以是单位剂量形式或多剂量形式。例如，本文所述的药物组合物可以是单位剂量形式。本文所用的单位剂量形式可指适于施用于人或非人受试者(例如动物)的物理上离散的单位。在一些情况下，单位剂量形式可以单独包装。每个单位剂量可以含有预定量的活性成分，其与药物载体，稀释剂，赋形剂或其任何组合联合可以足以产生所需的治疗效果。单位剂量形式的实例可以包括安瓿、注射器和单独包装的片剂和胶囊剂。在一些情况下，单位剂量形式可以包含在一次性注射器中。在一些情况下，单位剂量形式可以以其分数或倍数施用。多剂量形式可以是包装在单个容器中的多个相同的单位剂量形式，其可以以分开的单位剂量形式施用。多剂量形式的实例可以包括小瓶，片剂或胶囊剂的瓶，或品脱或加仑的瓶。在一些情况下，多剂量形式可以包含相同的药物活性剂。在一些情况下，多剂量形式可以包含不同的药物活性剂。
本文所述的组合物可以包含赋形剂。可将赋形剂添加到干细胞中或可与其来源的干细胞共分离。赋形剂可以包括冷冻保护剂，例如DMSO，甘油，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其任何组合。赋形剂可以包括冷冻保护剂，例如蔗糖，海藻糖，淀粉，这些中的任何一种的盐，这些中的任何一种的衍生物，或它们的任何组合。赋形剂可以包括pH剂(例如以最小化组合物的组分的氧化或降解)，稳定剂(例如以防止组合物的组分的修饰或降解)，缓冲剂(例如以增强温度稳定性)，增溶剂(例如以增加蛋白质溶解度)或其任何组合。赋形剂可以包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。赋形剂可以包括碳酸钠，醋酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐，聚乙二醇(PEG)，人血清白蛋白(HSA)，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，聚山梨醇酯80，磷酸钠，蔗糖，磷酸二钠，甘露糖醇，聚山梨醇酯20，组氨酸，柠檬酸盐，白蛋白，氢氧化钠，甘氨酸，柠檬酸钠，海藻糖，精氨酸，醋酸钠，醋酸盐，HCl，乙二胺四乙酸二钠，卵磷脂，甘油，黄原胶，大豆异黄酮，聚山梨醇酯80，乙醇，水，替普瑞酮或其任何组合。赋形剂可以是在Handbook of Pharmaceutical Excipients，AmericanPharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。
本文所述的组合物可以包含天然存在或非天然存在的载体、惰性(例如，可检测的试剂或标记)或活性物，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等(例如且包括)。在一些情况下，载体可以包含药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质，肽，氨基酸，脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖，二-寡糖，三-寡糖，四-寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛酸、酯化的糖等；和多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，包含单独的或组合的1-99.99重量或体积％。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，重组人血清白蛋白(rHA)，明胶，酪蛋白等。也可在缓冲能力中起作用的代表性氨基酸组分，抗体组分或两者包括丙氨酸，精氨酸，甘氨酸，精氨酸，甜菜碱，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也可以意图在本技术的范围内，其实例包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖等；多糖，例如棉子糖，松三糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，淀粉等；和糖醇，例如甘露糖醇，木糖醇，麦芽糖醇，乳糖醇，木糖醇，山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
组合物可以包含稀释剂。稀释剂的非限制性实例可以包括水，甘油，甲醇，乙醇和其它类似的生物相容性稀释剂。在一些情况下，稀释剂可以是水性酸，例如乙酸、柠檬酸、马来酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸等。在其它情况下，稀释剂可选自碱金属碳酸盐，例如碳酸钙；碱金属磷酸盐，例如磷酸钙；碱金属硫酸盐，例如硫酸钙；纤维素衍生物，例如纤维素，微晶纤维素，乙酸纤维素；氧化镁，糊精，果糖，右旋糖，棕榈硬脂酸甘油酯，乳糖醇，胆碱，乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，二甲基硅油，山梨糖醇，淀粉，预胶化淀粉，滑石，木糖醇和/或其酸酐，水合物和/或药学上可接受的衍生物或其组合。
在一些情况下，可以施用本文所述的组合物以预防如本文所述的疾病或病况。例如，本文所述的组合物可以预防性地施用以预防疾病或病况的发生。预防可以至少部分地减少疾病或病况的一种或多种症状的出现，发作或发生率。
本文公开了核酸。核酸可以包括在图46A-46F或SEQ ID NOS:52-56的任一项中描述的质粒或载体。核酸可以被递送或包封在病毒载体如本文所述的AAV中。这种核酸的任何一种的一些形式可用于本文所述的方法中。例如，可以施用包含核酸的AAV。
导向RNA
导向RNA设计
在一些实施方案中，本文公开了工程化的多核苷酸，例如导向RNA(gRNA)。本文公开的方法的一些实施方案包括制备或使用gRNA，例如向有需要的受试者施用gRNA。
可以影响gRNA的编辑效率的各种参数和提高gRNA编辑效率的示例性策略在图31中显示。可以通过例如以下来设计和筛查多种工程化的gRNA：改变gRNA导向长度，在gRNA中引入隆起(例如，在gRNA中放置A/C错配)或在gRNA中放置GLURD结构域。示例性gRNA设计显示于图32中。
中等通量筛查测定可用于筛查导向RNA(gRNA)或tRNA(例如，工程化的tRNA或其变体)。中等通量筛查可以包括功能增益(例如荧光素酶信号增益)测定。图33显示了荧光素酶功能增益测定的实例，其中起始密码子通过使用t-RNA对起始密码子进行错误翻译而被减弱，所述t-RNA可增加下游荧光素酶的产生。图34显示了进行筛查示例性gRNA设计的一些实验结果。
在一些情况下，例如在不存在募集序列的情况下，工程化的多核苷酸能够与受试者RNA编辑实体(例如ADAR)关联以促进对靶RNA的编辑和/或调节由受试者靶RNA编码的多肽的表达。这可以通过结构特征来实现。结构特征可以包括以下中的任一种：错配，对称隆起，非对称隆起，对称内环，非对称内环，发夹，摆动碱基对，结构化基序，环化RNA，化学修饰，或其任何组合。在一方面，双链RNA(dsRNA)底物，例如杂交的多核苷酸链，可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。本文描述了一种特征，其可对应于可存在于本公开的dsRNA底物中的几个结构特征中的一个。特征的例子可以包括失配，隆起(对称隆起或非对称隆起)，内环(对称内环或非对称内环)，或发夹(招募发夹或包含非靶向结构域的发夹)。本公开的工程化的多核苷酸可具有1至50种特征。本公开的工程化的多核苷酸可以具有1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、5至20、1至3、4至5、2至10、20至40，10至40、20至50、30至50、4至7或8至10种特征。
如本文所公开的，结构化基序可以在dsRNA底物中包含两种或更多种特征。
双链RNA (dsRNA)底物可以在本公开的工程化的导向RNA与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，错配可指导向RNA中的核苷酸与dsRNA内的靶RNA中的相对核苷酸不配对。错配可以包括，任何两个核苷酸不碱基配对，不互补，或两者都有。在一些实施方案中，错配可以是A/C错配。A/C错配可以在本公开的工程化的导向RNA中包含与靶RNA中的A相对的C。A/C错配可以在本公开的工程化的导向RNA中包含与靶RNA中的C相对的A。在一个实施方案中，G/G错配可以在本公开的工程化的导向RNA中包含与靶RNA中的G相对的G。在一些实施方案中，位于编辑位点的5'处的错配可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。错配也可以帮助赋予序列特异性。在一个实施方案中，错配可以包括G/G错配。在一个实施方案中，错配可以包括A/C错配，其中A在靶RNA中，C在工程化的多核苷酸的靶向序列中。在另一个实施方案中，A/C错配中的A可以是受试者RNA编辑实体编辑的靶RNA中核苷酸的碱基。
在一方面，结构特征可以独立地在工程化的多核苷酸中形成。在其它情况下，当工程化的多核苷酸结合靶RNA时，可以形成结构特征。当工程化的多核苷酸与其它分子如肽，核苷酸或小分子关联时，也可以形成结构特征。在某些实施方案中，工程化的多核苷酸的结构特征可以独立于靶RNA形成，并且其结构可以由于工程化的多肽与靶RNA区杂交而改变。在某些实施方案中，当工程化的多核苷酸与靶RNA关联时，存在结构特征。
在一些情况下，结构特征可以是或可以包括发夹。在一些情况下，工程化的多核苷酸可以缺乏发夹结构域。在其它情况下，工程化的多核苷酸可含有发夹结构域或多于一个发夹结构域。发夹可以位于多核苷酸中的任何位置。如本文所公开的，发夹可以是RNA双链体，其中单个RNA链可以包括自身折叠以形成RNA双链体。由于在折叠区的上游和下游具有彼此碱基配对的核苷酸序列，单个RNA链可以自身折叠。发夹可以在整个双链体结构的长度上具有10至500个核苷酸。发夹的茎环结构可以是3-15个核苷酸长。发夹可以存在于本文公开的任何工程化的多核苷酸中。本文公开的工程化的多核苷酸可具有1至10个发夹。在一些实施方案中，本文公开的工程化的多核苷酸具有1个发夹。在一些实施方案中，本文公开的工程化的多核苷酸具有2个发夹。如本文所公开的，发夹可以指募集发夹或发夹或非募集发夹。发夹可以位于本公开的工程化的多核苷酸内的任何位置。在一些实施方案中，一个或多个发夹存在于本公开的工程化的多核苷酸的3’端、本公开的工程化的多核苷酸的5’端或本公开的工程化的多核苷酸的靶向序列内，或其任何组合。
在一些方面，结构特征可以包括如本文所公开的募集发夹。募集发夹可以募集RNA编辑实体，例如ADAR。在一些实施方案中，募集发夹可以包含GluR2结构域。在一些实施方案中，募集发夹可以包含Alu结构域。
在又一方面，结构特征可以包括非募集发夹。本文所公开的非募集发夹可表现出改善工程化的多核苷酸到靶RNA的定位的功能性。在一些实施方案中，非募集发夹改善核滞留。在一些实施方案中，非募集发夹可以包含来自U7 snRNA的发夹。
在另一方面，结构特征可以包括摆动碱基。摆动碱基对可以指弱配对的两个碱基。例如，本公开的摆动碱基对可以指G与U配对。
本公开的发夹可以具有任何长度。在一方面，发夹可以是约5-200个或更多个核苷酸。在一些情况下，发夹可以包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40。41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400个或更多个核苷酸。在其它情况下，发夹还可以包含5至10、5至20、5至30、5至40、5至50、5至60、5至70、5至80、5至90、5至100、5至110、5至120、5至130、5至140、5至150、5至160、5至170、5至180。5至190、5至200、5至210、5至220、5至230、5至240、5至250、5至260、5至270、5至280、5至290、5至300、5至310、5至320、5至330、5至340、5至350、5至360、5至370、5至380、5至390，或5至400个核苷酸。发夹可以是由单链RNA形成的结构特征，所述单链RNA自身具有足够的互补性以杂交成由核苷酸环分隔的双链杂交RNA组成的双链RNA基序/结构。
在一些情况下，结构特征可以是隆起。隆起可以包括靶链和工程化的多核苷酸链之间的单个(有意的)核酸错配。在其它情况下，如果隆起区，即碱基的错配节段，在两侧的侧翼为杂交的互补dsRNA区，则链之间的一个以上连续的错配构成隆起。隆起可以位于多核苷酸的任何位置。在一些情况下，隆起可位于距5'羟基或3'羟基的约30至约70个核苷酸处。
在一些实施方案中，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，隆起可以指在dsRNA底物形成时形成的结构，其中工程化的多核苷酸或靶RNA中的核苷酸与它们在相对链上的位置对应物不互补。隆起可改变dsRNA底物的二级或三级结构。在dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧或dsRNA底物的靶RNA侧，隆起可以具有1-4个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的工程化的多核苷酸可具有2个隆起。在一些实施方案中，本公开的工程化的多核苷酸可具有3个隆起。在一些实施方案中，本公开的工程化的多核苷酸可具有4个隆起。在一些实施方案中，dsRNA底物中隆起的存在可以定位ADAR以选择性地编辑靶RNA中的靶A并减少非靶标的脱靶编辑。在一些实施方案中，dsRNA底物中隆起的存在可以募集另外的ADAR。本文公开的dsRNA底物中的隆起可募集其它蛋白质，例如其它RNA编辑实体。在一些实施方案中，位于编辑位点的5'处的隆起可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。隆起也可以帮助赋予序列特异性。隆起可以通过将ADAR编辑限制在产生靶标A的选择性编辑的方向上来帮助直接的ADAR编辑。
在一些方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。隆起可以是对称隆起或非对称隆起。可以通过dsRNA底物的导向RNA侧或靶RNA侧上的1至4个参与核苷酸形成隆起。在一些情况下，当相同数目的核苷酸存在于隆起的每一侧时，可以形成对称隆起。对称隆起可以在dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧或dsRNA底物的靶RNA侧具有2-4个核苷酸。例如，本公开的dsRNA底物中的对称隆起可以在dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧和靶RNA侧上具有相同数目的核苷酸。本公开的对称隆起可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的对称隆起可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的对称隆起可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的4个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。
在一些情况下，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的导向RNA与靶RNA杂交时形成。隆起可以是对称隆起或非对称隆起。在一些情况下，当不同数目的核苷酸存在于隆起的每一侧时，可以形成非对称隆起。非对称隆起可以在dsRNA底物的导向RNA侧或靶RNA侧具有1-4个参与核苷酸。例如，本公开的dsRNA底物中的非对称隆起可以在dsRNA底物的工程化的导向RNA侧和靶RNA侧上具有不同数目的核苷酸。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的1个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的非对称隆起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的工程化的导向RNA侧上的4个核苷酸形成。在一些情况下，结构特征是环。
在一方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，内环可以指形成dsRNA底物时形成的结构，其中工程化的多核苷酸或靶RNA中的核苷酸与其在相对链上的位置对应物不互补，并且其中内环的一侧，无论是在dsRNA底物的靶RNA侧还是在工程化的多核苷酸侧，都可以包含多于5个核苷酸。内环可以是对称内环或非对称内环。存在于编辑位点附近的内环可以帮助待编辑的靶RNA中靶标A的碱基翻转。在一些情况下，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或非对称内环。在一些情况下，当相同数目的核苷酸存在于内环的每一侧时，可以形成对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的对称内环可以在dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧和靶RNA侧具有相同数目的核苷酸。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。
在一方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化的多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或非对称内环。在一些情况下，当不同数目的核苷酸存在于内环的每一侧时，形成非对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的非对称内环可以在dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧和靶RNA侧上具有不同数目的核苷酸。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的7个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧的10个核苷酸形成。本公开的非对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的工程化的多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。
包括隆起或环的结构特征可以是任何尺寸。在一些情况下，隆起或环可以包含至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基。在一些情况下，隆起或环可总共包含至少约1-10、5-15、10-20、15-25或20-30个碱基。
在一些情况下，结构特征是结构化基序。如本文所公开的，结构化基序可以在dsRNA底物中包含两个或更多个结构特征。结构化基序可以包括结构化特征的任何组合，例如在上述权利要求中，以产生用于在精确位置进行ADAR编辑的理想底物。这些结构化基序可以被人工工程改造以最大化ADAR编辑，和/或这些结构化基序可以被建模以再次捕获已知的ADAR底物。
在一些情况下，结构化特征可以包括多核苷酸的至少部分环化。在一些情况下，本文提供的多核苷酸可以被环化或呈环状构型。在一些方面，至少部分环状的多核苷酸可以缺乏5'羟基或3'羟基。
导向RNA筛查和定量
开发了多种筛查测定，细胞系和分析工具以筛查或分析包含gRNA或tRNA的各种构建体的效率。图35显示了示例性筛查测定，细胞系，以及分析测定和工具。生成了敲除(KO)细胞系。在一些情况下，KO细胞系可缺乏ADAR1。在一些情况下，KO细胞系缺乏ADAR2。产生ADAR1 KO细胞系的缺失区的实例和在示例性ADAR1 KO细胞系中的蛋白质表达分析显示于图36中。产生ADAR2 KO细胞系的缺失区的实例和示例性ADAR2 KO细胞系中的mRNA水平显示于图37中。在一些情况下，ADAR1可以稳定地整合到ADAR2 KO细胞系中。在一些情况下，ADAR2可以稳定地整合到ADAR1 KO细胞系中(例如，图38)。
在一些情况下，数字微滴式PCR用于定量基因表达，剪接变体，gRNA，编辑程度，变体的拷贝数等。数字微滴式PCR(ddPCR)过程的示意图在图39中描述。用于设计PCR引物和探针组的使用ddPCR的示例性分析显示在图40中。在一些情况下，使用例如通过使用ddPCR的测定来定量gRNA的细胞表达(gRNAQ)。可以设计ddPCR测定以使用通用标签来定量gRNA的细胞表达，所述通用标签可以置于gRNA的末端(例如，3’末端或5’末端)(例如，图41)。图42显示了转染入靶细胞后高细胞水平的gRNA的实例。gRNA的细胞表达水平的定量可用于分析(例如，建立gRNA和编辑效率之间的关系)细胞中的RNA编辑。
在一些情况下，在gRNA中引入发夹结构以增加稳定性。示例性gRNA构建体及其在HEK293细胞中编辑Rab7a的效率显示于图43中。数据表明，在存在ADAR2的情况下，向gRNA添加U6+27环可以增加编辑效率。gRNA构建体的其它实例及其在HEK293细胞中编辑Rab7a的效率显示于图44中。
在一些情况下，合理的和半合理的gRNA设计与高通量筛查组合。图45显示了利用gRNA设计与高通量筛查方法的示例性方法。
II.方法
递送方法
在一些情况下，可以施用本文所述的组合物(例如药物组合物)以使得能够将工程化的tRNA或其变体或编码工程化的tRNA或其变体的载体递送至期望的生物作用位点。例如，编码本文所述的工程化的tRNA或其变体的核酸可以包含在病毒载体中，并且可以通过静脉内施用来施用。本文公开的对需要治疗或疗法的区域的施用可以通过例如但不限于口服施用、局部施用、静脉内施用、吸入施用或其任何组合来实现。在一些实施方案中，递送可以包括注射、导管插入术、胃造口管施用、骨内施用、眼部施用、脑室内施用、耳部施用、透皮施用、口服施用、直肠施用、鼻部施用、阴道内施用、海绵体内施用、经尿道施用、舌下施用、颅内注射、颅内注射至实质细胞、脑池内(ICM)、脑室内(ICV)或其组合。递送可以包括直接施用于身体的受累组织或区域。在一些情况下，局部施用可以包括将洗剂、溶液、乳液、霜、膏、油、糊剂、人造黄油、气雾剂、泡沫、果冻、泡沫、口罩、垫、粉末、固体、酊剂、酱、贴剂、凝胶、喷雾剂、滴剂、液体制剂、软膏施用于表面的外表面，例如皮肤。在一些实施方案中，施用可以包括注射。在一些实施方案中，递送可以包括注射。递送可以包括实质注射、鞘内注射、心室内注射或脑池内注射。本文提供的组合物可以通过任何方法施用。施用方法可以是动脉内注射，脑池内注射，肌内注射，实质内注射，腹腔内注射，脊柱内注射，鞘内注射，静脉内注射，心室内注射，立体定向注射，皮下注射，硬膜外注射或其任何组合。递送可以包括肠胃外施用。肠胃外施用的实例可以包括静脉内施用、动脉内施用、鞘内施用、眼内施用、耳内施用、脑室内施用或腹腔内施用。在一些情况下，递送可以来自装置。在一些情况下，递送可以通过泵、输液泵或其组合施用。在一些实施方案中，递送可以通过灌肠剂、滴眼剂、鼻喷雾剂或其任何组合。在一些情况下，受试者可以在没有监督的情况下施用组合物。在一些情况下，受试者可以在医学专业人员(例如，医师、护士、医师助理、护理员、安宁工人等)的监督下施用组合物。在一些实施方案中，医学专业人员可以施用组合物。
在一些情况下，施用可以是口服摄取。在一些情况下，递送可以是胶囊剂或片剂。口服摄取递送可以包括茶、酏剂、食物、饮品、饮料、糖浆、液体、凝胶、胶囊剂、片剂、油、酊剂或其任何组合。在一些实施方案中，食物可以是医学食物。在一些情况下，胶囊剂可以包含羟甲基纤维素。在一些实施方案中，胶囊剂可以包含明胶、羟丙基甲基纤维素、支链淀粉或其任何组合。在一些情况下，胶囊剂可以包含包衣，例如肠溶衣。在一些实施方案中，胶囊剂可以包含素食产品或素食，例如羟丙甲纤维素胶囊剂。在一些实施方案中，递送可以包括通过吸入器、扩散器、喷雾器、汽化器或其组合的吸入。
在一些情况下，组合物可以作为单一单位剂量或作为分开的单位剂量施用/应用。在一些情况下，本文所述的组合物可以在第一时间点和第二时间点施用。在一些情况下，可以施用组合物，使得第一次施用可以在另一次施用之前施用，施用时间的差异为1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、4天、7天、2周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长。
本文公开的组合物的施用或应用可以进行至少约连续或不连续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天的治疗持续时间。在一些情况下，治疗持续时间可以是约1天至约30天、约2天至约30天、约3天至约30天、约4天至约30天、约5天至约30天、约6天至约30天、约7天至约30天、约8天至约30天、约9天至约30天、约10天至约30天、约11至约30天、约12至约30天、约13至约30天、约14至约30天、约15至约30天、约16至约30天、约17至约30天、约18至约30天、约19至约30天、约20至约30天、约21至约30天、约22天至约30天、约23天至约30天、约24天至约30天、约25天至约30天、约26天至约30天、约27天至约30天、约28天至约30天、或约29天至约30天。
本文公开的组合物的施用或应用可以进行至少约1周、至少约1个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更长的治疗持续时间。施用可以在受试者的生命期间重复进行，例如在受试者的生命期间每月一次或每年一次。施用可以在受试者的大部分生命中重复进行，例如每月一次或每年一次，持续至少约1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年或更长。
本文公开的组合物的施用或应用可以每天进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在一些情况下，本文公开的组合物的施用或应用可以每周进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些情况下，本文公开的组合物的施用或应用可以每月进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33。34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次。
在一些情况下，受试者可以接受疾病的诊断。在一些情况下，受试者可以没有接受疾病的诊断。诊断可以包括血液测试，基于一种或多种症状的临床诊断，或其任何组合。诊断(例如血液测试)可以证实编码多肽的mRNA中是否存在突变(例如过早终止密码子)。在一些情况下，诊断试验可以包括对来自受试者的生物样品进行测序(例如Sanger测序或通过合成进行测序)。在mRNA的一部分中存在或不存在突变可以包括多种突变(例如约1至约200种突变)。临床诊断可以基于一种或多种症状。症状可以包括失语，有意使用手的丧失，无意识的手运动，活动性丧失，步态紊乱，肌张力丧失，癫痫，脊柱侧凸，睡眠紊乱，生长速度减慢，呼吸问题或其任何组合。在一些情况下，症状可以包括听力丧失，语言和声音的混乱，难以理解的言语，麻烦的听力常数，视力丧失，受限的视野，视力朦胧，视力模糊，眼睛不适或其任何组合。在一些情况下，症状可以包括咳嗽，痰咳，气短，脂肪粪便，油样粪便，不育症，体重减轻，盐渍皮肤，呼吸困难或其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开了病毒载体，例如AAV载体的用途。病毒载体可以包含含有工程化的tRNA的病毒基因组。病毒载体可以包含含有工程化的tRNA变体的病毒基因组。病毒载体可以包含含有本文所述的构建体的病毒基因组。在一些情况下，所述方法可以包括施用病毒载体。
在一些实施方案中，施用至少1×103个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×104个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×105个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×106个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×107个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×108个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×109病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1010个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1011个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1012个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1013个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1014个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1015个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1016个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1017个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1018个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1019个病毒基因组。在一些实施方案中，施用至少1×1020个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×103个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×104个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×105个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×106个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×107个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×108个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×109个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1010个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1011个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1012个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1013个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1014个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1015个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1016个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1017个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1018个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1019个病毒基因组。在一些实施方案中，施用不超过1×1020个病毒基因组。在一些实施方案中，施用1×1012至1×1015个病毒基因组。在一些实施方案中，施用1×1011至1×1016个病毒基因组。在一些实施方案中，施用1×1010至1×1017个病毒基因组。
在一些实施方案中，本文公开了包含工程化的tRNA或其变体的组合物。在一些实施方案中，本文公开了包含工程化的tRNA变体的组合物。在一些实施方案中，组合物可以包括药物组合物。药物组合物可以包含工程化的tRNA或其变体以及药学上可接受的赋形剂，载体或稀释剂。药物组合物可以包含工程化的tRNA变体和药学上可接受的赋形剂，载体或稀释剂。药物组合物可以是剂量单位形式。
治疗方法
本文提供了治疗疾病、病症或病况的方法。本文提供了预防疾病、病症或病况的方法。本文提供了治疗疾病或病症或预防疾病或病症的方法。
本文提供了治疗可与编码过早终止密码子而不是所需氨基酸的mRNA序列中的突变有关的疾病，病症或病况的方法。在一些情况下，终止密码子可以是乳白(TGA；UGA)、赭石(TAA；UAA)或琥珀(TAG；UAG)终止密码子。在一些情况下，mRNA序列中的引起疾病的突变可以包括乳白终止密码子(TGA；UGA)代替编码Arg的密码子(例如，CGU、CGC、CGA、CGG、AGA或AAG)。在一些情况下，mRNA序列中的引起疾病的突变可以包括赭石(TAA；UAA)或赭石(TAG；UAG)终止密码子代替编码谷氨酰胺的密码子(例如，CCA、CAG)。在一些情况下，过早终止密码子导致多肽或蛋白质的截短形式。在一些情况下，所述疾病，病症或病况可由所述多肽的截短形式的水平升高或基本上全长多肽的水平降低引起。
例如，Rett综合征可由MeCP2多肽序列中的Arg-至-终止突变引起。在健康个体中，MeCP2蛋白在参考SEQ ID NO:49或参考SEQ ID NO:50的氨基酸位置168、255、270、294、198、186和453处含有精氨酸(Arg)。在Rett综合征患者中，MeCP2蛋白中引起MeCP2蛋白在氨基酸位置168、255、270、294、198、186和453处的翻译过早终止的突变引起MeCP2的功能丧失，并且共同占引起Rett的突变的25％以上。MECP2中的精氨酸(Arg)也可以位置R8(仅对于同种型2)、R9(仅对于同种型1)、R84、R85、R89、R91、R106、R111、R115、R133、R162、R167、R188、R190、R211、R250、R253、R268、R306、R309、R344、R354、R420、R458、R468、R471、R478和R484处找到。本公开提供了工程化的tRNA和工程化的tRNA变体，其能够过早终止密码子读通可以存在于MeCP2蛋白中的任何位置处的过早终止密码子，所述位置包括以下的任一种：R168X、R255X、R270X、R294X、R198X、R186X、R453X、R8X(在同种型2中)、R9X(在同种型1中)、R84X、R85X、R89X、R91X、R106X、R111X、R115X、R133X、R162X、R167X、R188X、R190X、R211X、R250X、R253X、R268X、R306X、R309X、R344X、R354X、R420X、R458X、R468X、R471X、R478X、R484X或其任何组合。在一些情况下，可通过向受试者施用本文所述的组合物来治疗受试者中的Rett综合征，其中所述组合物可以包含具有反密码子序列的工程化的tRNA或其变体，所述反密码子序列与引起疾病的过早终止密码子(例如，UGA)碱基配对。在翻译过程中，工程化的tRNA或其变体可以装载Arg，该Arg可以转移到生长中的MeCP2多肽上，从而至少基本上恢复受试者中的MeCP2表达。在一些情况下，与WT MeCP2蛋白相比，基本上恢复的MeCP2多肽可以是功能性的。在一些情况下，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，通过本文所述的组合物可以以大于至少10％的功效进行MeCP2多肽的恢复。
在一些情况下，mRNA可以包含一个，两个，三个，四个或五个过早终止密码子。因此，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可产生过早终止密码子的读通，至少部分地恢复基本上全长的多肽并至少部分地治疗疾病或病况。在一些情况下，可以向怀孕的女性受试者施用如本文所述的组合物。怀孕的女性受试者可以在怀孕的一个或多个阶段被施用组合物。可以在怀孕发作之前，在产前期给女性受试者施用所述组合物。在一些情况下，可以向怀孕的女性受试者内的胚胎或胎儿施用如本文所述的组合物。在一些情况下，胚胎可以在体外环境中施用如本文所述的组合物。
疾病或病况可以包括Rett综合征，孤独症，West综合征，Lennox-Gastaut综合征，癫痫性脑病(EEP)、Pitt-Hopkins综合征或其任何组合。在一些情况下，疾病或病况可以包括囊性纤维化、耳聋(例如常染色体显性17耳聋、常染色体显性13耳聋、常染色体显性11耳聋)、色素性视网膜炎或其任何组合。在一些情况下，疾病或病况可以包括Tay-Sachs、帕金森病、囊性纤维化、Usher综合征、沃尔曼病、肝病(α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺陷)或其任何组合。疾病或病况可以包括神经变性疾病、肌肉病症、代谢病症、眼部病症(例如眼部疾病)、癌症或其任何组合。所述疾病或病况可以包括囊性纤维化，白化病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化，哮喘，β-地中海贫血，Cadasil综合征，进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)，慢性阻塞性肺病(COPD)，痴呆，远端脊髓肌萎缩(DSMA)，营养不良性大疱性表皮松解症，大疱性表皮裂解(epidermolysis bullosa)，法布里病，因子VLeiden相关病症，家族性腺瘤，息肉病，半乳糖血症，戈谢病，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，血友病，遗传性血色病，亨特综合征，亨廷顿病，胡勒综合征，炎性肠病(IBD)，遗传性多凝集综合征，Leber先天性黑蒙，Lesch-Nyhan综合征，Lynch综合征，Marfan综合征，粘多糖病，I型和II型肌强直性营养不良，神经纤维瘤病，A型、B型和C型尼曼-匹克病，NY-eso 1相关的癌症，帕金森病，Peutz-Jeghers综合征，苯丙酮尿症，波姆病，原发性纤毛病，凝血酶原突变相关的病症，例如凝血酶原G20210A突变，肺高血压，色素性视网膜炎，Sandhoff病，严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞贫血，脊柱肌萎缩，斯塔加特氏病，X-连锁的免疫缺陷，各种形式的癌症(例如BRCA1和2连锁的乳腺癌和卵巢癌)。所述疾病或病况可以包括肌营养不良，鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌，皮肤癌，斯塔加特黄斑变性，进行性神经性腓骨肌萎缩症或其任何组合。疾病或病况可以包括肌营养不良。肌营养不良可以包括肌强直，Duchenne、Becker，肢带，面肩胛肱骨，先天性，眼咽，远端，Emery-Dreifuss肌营养不良或其任何组合。疾病或病况可以包括疼痛，例如慢性疼痛。疼痛可以包括神经性疼痛、伤害性疼痛或其组合。伤害性疼痛可以包括内脏疼痛、躯体疼痛或其组合。
在一些情况下，疾病或病况可以是Rett综合征。Rett综合征可以包括一系列相关病症。Rett综合征可以包括非典型Rett综合征。Rett综合征可以包括先天性变体，zappella变体，hanefeld变体或其任何组合。疾病或病况可以包括由MECP2、CDKL5、FOXG1、STXBP1、TCF4、SCN2A、WDR45、MEF2C或其任何组合中的一个或多个突变引起的任何数量的疾病。在一些实施方案中，Rett综合征可由编码多肽如MeCP2、FoxG1或CDKL5的mRNA中存在的过早终止密码子引起。例如，患有Rett综合征的受试者可以在编码MeCP2多肽的mRNA中具有R168X、R225X、R270X、R294X、R198X或R453X突变，其中X可以是过早终止密码子。因此，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可识别mRNA中的过早终止密码子，并响应所述终止密码子而将氨基酸插入初生MeCP2多肽中，从而至少部分地恢复基本上全长的MeCP2多肽。在一些情况下，可以通过确定用工程化的tRNA或其变体治疗的受试者与未用工程化的tRNA或其变体治疗的受试者相比的全长MeCP2多肽的量来测量至少部分地恢复。在一些情况下，患有Rett综合征的受试者可以在编码CDKL5多肽的mRNA中具有R59X、R134X、R550X、R559X、R952X、R970X、Q118X、Q347X、Q459X、Q464X、Q652X、Q805X、Q832X、Q834X、Q865X或Q902X突变，其中X可以是过早终止密码子。在一些情况下，患有Rett综合征的受试者可以在编码FOXG1多肽的mRNA中具有Q46X、Q86X或Q196X突变，其中X可以是过早终止密码子。因此，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可识别mRNA中的过早终止密码子，并响应所述终止密码子而将氨基酸插入到初生CDKL5或FOXG1多肽中，从而至少部分地恢复基本上全长的多肽。在一些情况下，可以通过确定用工程化的tRNA或其变体治疗的受试者与未用工程化的tRNA或其变体治疗的受试者相比的全长多肽的量来测量至少部分地恢复。
在一些情况下，所述多肽包括FoxG1多肽。在一些情况下，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可识别FoxG1 mRNA中的过早终止密码子，并响应所述终止密码子而将氨基酸插入到初生FoxG1多肽中，从而至少部分地恢复基本全长的多肽。在一些情况下，FoxG1中的过早终止密码子可以是Q46X、Q86X或Q196X，其中X代表终止密码子突变。
在一些实施方案中，Rett综合征的至少一种症状被减轻。例如，与基线测量相比，可以改善与Rett综合征的症状有关的测量。Rett综合征的症状的实例可以包括生长缓慢、脑生长缓慢、微头症、运动或协调的减少或丧失、手控制减少、行走能力降低、僵硬或痉挛运动、言语能力降低、视力降低、冷漠、反复手部运动、异常眼部运动、呼吸困难、易怒、恐惧、焦虑、认知缺陷、癫痫、异常脑电图、脊柱侧凸、不规则心跳或异常睡眠模式
在一些实施方案中，所述疾病或病况是Rett综合征，并且Rett综合征的至少一种症状被减轻。在一些情况下，Rett综合征的症状可以通过使用本文提供的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体读通终止密码子来减轻。在一些情况下，Rett综合征的症状可通过以下方式减轻：读通终止密码子少至5％的时间、少至10％的时间、少至15％的时间、少至20％的时间，或少至25％的时间。在一些情况下，Rett综合征的症状可通过以下方式减轻：读通终止密码子至少5％的时间、至少10％的时间、至少15％的时间、至少20％的时间或至少25％的时间。
在一些情况下，所述多肽包括CDKL5多肽。在一些情况下，如本文所述的工程化的tRNA或其变体可识别CDKL5 mRNA中的过早终止密码子，并响应所述终止密码子而将氨基酸插入到初生CDKL5多肽中，从而至少部分地恢复基本上全长的多肽。在一些情况下，CDKL5中的过早终止密码子可以在R59X、R134X、R550X、R559X、R952X、R970X、Q118X、Q347X、Q459X、Q464X、Q652X、Q805X、Q832X、Q834X、Q865X或Q902X处，其中X代表终止密码子突变。
在一些情况下，疾病或病况可以是耳聋。一些形式的耳聋可以由编码多肽如MYH9、COL11A2或MYO7A的mRNA中存在的过早终止密码子引起。在一些实施方案中，常染色体显性17型耳聋可由编码MYH9多肽的mRNA中的R1933X突变产生。在一些实施方案中，常染色体显性13型耳聋可由编码COL11A2多肽的mRNA中的R845X突变引起。在一些实施方案中，常染色体显性11型耳聋可由编码MYO7A多肽的mRNA中的R666X突变引起。
在一些情况下，疾病或病况可以是Usher综合征。一些形式的Usher综合征如IB型Usher综合征可与MYO7A突变有关。Usher综合征可与组合性耳聋和失明有关。MYO7A编码肌球蛋白VIIA，其可以编码肌球蛋白，所述肌球蛋白可以是肌动蛋白结合分子马达。在一些情况下，突变可以包括C628X突变、R1861X突变或两者。在一些情况下，突变可以包括A26E突变、P132L突变、R241G突变、L366P突变、I1045T突变、L1863P突变、G1218R突变、R1240Q突变、A1492V突变、A2204P突变或其任何组合。
在一些情况下，疾病或病况可以是由编码多肽的mRNA中存在的过早终止密码子引起的囊性纤维化。在一些情况下，疾病或病况可以是由编码多肽的mRNA中存在的过早终止密码子引起的色素性视网膜炎。
治疗可以包括向受试者施用一种或多种如本文所述的组合物。治疗可以包括向受试者施用联合疗法。在一些情况下，联合疗法可以包括癌症治疗(例如放射疗法、化学疗法、CAR-T疗法、免疫疗法、激素疗法、冷冻消融)。在一些情况下，联合疗法可以包括手术、抗生素、抗病毒剂或其任何组合。在一些情况下，联合疗法可以包括粘液稀释剂、囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)调节剂治疗、肺移植、支气管扩张剂、气道清除、抗炎药物、喷雾器治疗、口服胰酶、大便软化剂。在一些情况下，联合疗法可以包括elexacaftor、ivacaftor和tezacaftor、lumacaftor或其任何组合。在一些实施方案中，联合疗法可以包括物理疗法、水疗法、职业疗法、言语疗法、进食辅助、抗癫痫药、抗反流药、左卡尼汀或其任何组合。联合疗法可以包括手术，类固醇疗法，非类固醇抗炎药(NSAID)或其任何组合。在一些情况下，联合疗法可以帮助修复视力丧失(例如眼镜，或矫正眼睛手术)或帮助治疗听力丧失(例如助听器)。在一些情况下，联合疗法可以包括RNA或DNA编辑技术。治疗可以包括治愈疾病或病况。治疗可以包括基本上减轻疾病或病况的一种或多种症状。
在一些实施方案中，本文公开了包括向受试者施用工程化的tRNA或其变体的方法。一些实施方案包括向受试者施用工程化的tRNA变体。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，其中工程化的tRNA或其变体在mRNA的翻译期间至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且如任选地通过以下确定的：将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一标志物)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一标志物的筛查mRNA可以包含所述过早终止密码子；将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二标志物)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA可以不包含所述过早终止密码子；以及比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的可检测信号的量，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，在体内以至少约10％的效率产生基本上全长的多肽。
诊断方法
如本文所述的方法和组合物可以包括鉴定疾病或病况的存在或不存在，治疗疾病或病况，或其任何组合。所述方法可以包括向需要的受试者施用药学上可接受量的组合物或化合物，例如本文所述的工程化的tRNA或其变体。
在一些实施方案中，受试者可以或可以包括在施用之前被给予疾病或病况的诊断。在一些实施方案中，诊断可以或可以包括通过体外诊断试验确定的。在一些实施方案中，可以在诊断时提供治疗。
对无义介导的衰变的抑制
在一些实施方案中，工程化的tRNA抑制包括靶mRNA在内的mRNA的无义介导的衰变(NMD)。在一些实施方案中，工程化的tRNA变体抑制NMD。通过工程化的tRNA或工程化的tRNA变体对NMD的这种抑制可以包括在本文所述的任何方法中。一些实施方案可以包括抑制NMD的方法，其包括使细胞与工程化的tRNA或其变体接触。在一些实施方案中，接触可导致细胞中靶mRNA的NMD的预防或降低。在一些实施方案中，相对于基线测量，接触可导致细胞中靶mRNA测量的增加。一些实施方案可以包括抑制NMD的方法，其包括向有需要的受试者施用工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，施用可导致受试者中靶mRNA的NMD的预防或降低。在一些实施方案中，相对于基线测量，施用可导致受试者中靶mRNA测量的增加。靶mRNA测量的增加可以是相对于在从受试者取得的第一样品中的基线靶mRNA测量，在从受试者取得的第一样品中的增加。第一和/或第二样品可以包括本文所述的组织或流体样品。
在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以将靶mRNA的NMD降低：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％、或上述百分比中的任何两个的范围。在一些情况下，工程化的tRNA或其变体可以将靶mRNA的NMD降低至少约：1％至约10％、5％至约20％、10％至约35％、25％至约50％、40％至约70％、60％至约80％、75％至约90％或约85％至约100％。
在一些情况下，NMD可以是降解含有过早终止密码子(PTC)的mRNA的质量控制途径。外显子-外显子连接已经被表征用于确定mRNA是否靶向NMD。在mRNA剪接过程中，外显子连接复合体(EJC)可在外显子-外显子连接上游形成20-24个核苷酸。EJC可以在剪接后保持与mRNA结合，直到在第二轮翻译期间被置换。如果不存在PTC，可以在翻译过程中去除EJC，使mRNA抵抗NMD的降解。如果PTC存在于EJC上游至少50个核苷酸处，则核糖体可以停滞并且EJC可以保持与mRNA稳定地缔合。该复合体可以是动态结构，具有可募集Upf3(核质穿梭因子)和Upf2(核周蛋白)的异源蛋白组成，Upf3和Upf2二者均可参与NMD。RNA依赖性解旋酶如Upf1可通过翻译释放因子募集至mRNA并桥接终止的核糖体和下游EJC以形成可触发mRNA衰变的活性NMD复合体。这种降解可以包括脱帽，随后是5'至3'衰变和去腺苷酸化，随后是3'至5'衰变。在PTC读通的情况下，在一些情况下，终止复合体和EJC之间的桥可以不形成，并且核糖体可以将EJC蛋白复合体与突变体转录物分离，所述突变体转录物不再是NMD的靶标。这可以帮助解释终止密码子读通如何能够拮抗NMD并且可以稳定mRNA。工程化的tRNA或其变体可干扰本文所述的NMD的这些方面中的任何一个。
PTC抑制可通过使得(1)翻译继续和/或(2)最后一个EJC与mRNA解离来抑制NMD(参见，例如，图49-从Keling和Bedwell，Wiley Interdiscip Rev RNA(2011)中改编)。
通过抑制性tRNA对含有PTC/无义突变的靶mRNA的PTC抑制和读通可以是逃避NMD途径和稳定/增加靶mRNA水平的方法之一。例如，将抑制性tRNA转染到Ulrich疾病成纤维细胞中已被证实导致靶mRNA的上调。Sako等人，NASS(2006)。
用本文所述的抑制性tRNA进行PTC读通可抑制靶mRNA的无义介导的衰变(NMD)。这可以增加靶mRNA的细胞内水平。随后抑制靶mRNA中的PTC可产生全长的功能蛋白。
制备方法
本文提供了产生工程化的tRNA或其变体，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸，或本文所述的药物组合物的方法。所述方法可以包括本文公开的方面。在一些情况下，可产生可以包含多个启动子，编码一种或多种工程化的tRNA或其变体的基因序列的载体。载体可以包含第一启动子(例如，hU6或mU6启动子)，第二启动子(例如，hU6或mU6启动子)，第三启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)启动子)，包含编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸的转基因，和编码可检测多肽的报告基因。多核苷酸可以包含启动子上游的5'ITR。在一些情况下，多核苷酸可以包含报告基因下游的3'ITR。在一些情况下，报告基因可以包含一种或多种编码mCherry、绿色荧光蛋白(GFP)或β-半乳糖苷酶的基因。第一启动子或第二启动子可以包含U6启动子(例如，人U6(hU6))。U6启动子可以是人U6启动子或小鼠U6启动子。U6启动子可以被甲基化。第三启动子可以是人巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些情况下，载体可以通过纯化或分离来产生。在一些情况下，启动子可以是U7启动子。在一些情况下，启动子可以是PolIII启动子。
包装
本公开提供了包装工程化的tRNA或其变体，启动子，填充序列及其任何组合的病毒载体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装一个或多个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装2个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装3个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装4个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装6个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装多于6个拷贝的工程化的tRNA或其变体。本公开的病毒载体可以包装1-200、1-100、50-100、20-40、10-50或1-70个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装至少1个、10个、20个、30个、40个、50个、70个、100个、200个、300个、400个或更多个拷贝的工程化的tRNA或其变体。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以包装至多约400、300、200、100、70、50、40、30、20、10、2个或更少个拷贝的工程化的tRNA或其变体。
一种或多种工程化的tRNA或其变体可以包装在载体中，包括但不限于质粒，AAV载体，慢病毒载体或任何其它载体系统。本文公开的载体还可以编码标志物或报告基因，例如GFP或mCherry。本文公开的载体还可以编码上游外源启动子，例如人U6(hU6)。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体，标志物和/或填充序列包装在病毒载体中，处于外源启动子(例如，小鼠U6(mU6)或人U6(hU6)启动子)的控制之下。在一些实施方案中，工程化的tRNA抑制物或其变体，标志物和/或填充序列被包装在没有外源启动子的病毒载体中。在一些情况下，载体可以包含多个启动子，编码一种或多种工程化的tRNA或其变体的基因序列。载体可以包含第一启动子(例如，hU6或mU6启动子)，第二启动子(例如，hU6或mU6启动子)，第三启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)启动子)，包含编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸的转基因，和编码可检测多肽的报告基因。多核苷酸可以包含启动子上游的5'ITR。在一些情况下，多核苷酸可以包含报告基因下游的3'ITR。在一些情况下，报告基因可以包含一种或多种编码mCherry、绿色荧光蛋白(GFP)或β-半乳糖苷酶的基因。第一启动子或第二启动子可以包含U6启动子(例如，人U6(hU6))。U6启动子可以是人U6启动子或小鼠U6启动子。U6启动子可以被甲基化。第三启动子可以是人巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些情况下，载体可以是纯化的或分离的。
本公开的载体还可以包装填充序列，以确保成功产生包装待递送的整个基因组的病毒颗粒。例如，天然存在的填充序列(例如，来自草莓或λ噬菌体的DNA)可以包括在载体中。在一些实施方案中，填充序列可以是完全合成的序列。在一些实施方案中，本文提供的载体包装1-6个工程化的tRNA或其变体以及填充序列。在一些实施方案中，本文提供的载体包装外源hU6启动子，1-6个工程化的tRNA和填充序列。间隔序列可以包括填充序列(stuffer sequence)或补充序列(filler sequence)。在一些实施方案中，间隔序列，填充序列或补充序列可以互换使用。在一些情况下，载体可以包含一个或多个间隔序列，以将工程化的tRNA或其变体的序列置于距ITR不同的距离。间隔序列可以包括6个核苷酸(nt)长的序列。间隔序列可以包含10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、1000个核苷酸或本文提及的核苷酸的任何两个数之间的任何数目的核苷酸。例如，间隔序列可以包含约10nt至约100nt，约100nt至约500nt，约50nt至约600nt，或约200nt至约1000nt。在一些情况下，间隔序列可以包含少于6nt或多于1000nt。在一些情况下，间隔序列可以包括填充序列。填充序列的长度可以是约25个，约50个，约100个，约150个，约200个，约250个或约300个核苷酸。填充序列的长度可以是25个、50个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸，或包括前述数目的核苷酸中的任两个的长度范围。在一些实施方案中，填充序列可以包含至少25个核苷酸，至少50个核苷酸，至少100个核苷酸，至少150个核苷酸，至少200个核苷酸，至少250个核苷酸或至少300个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列是至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约150个核苷酸，或至少约200个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列可以包含至少250个核苷酸，至少300个核苷酸，至少350个核苷酸，至少400个核苷酸，至少450个核苷酸或至少500个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列可以包含不超过25个核苷酸，不超过50个核苷酸，不超过100个核苷酸，不超过150个核苷酸，不超过200个核苷酸，不超过250个核苷酸或不超过300个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列不超过约50个核苷酸，不超过约100个核苷酸，不超过约150个核苷酸，或不超过约200个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列可以包含不超过250个核苷酸，不超过300个核苷酸，不超过350个核苷酸，不超过400个核苷酸，不超过450个核苷酸或不超过500个核苷酸。
在一些实施方案中，填充序列在多核苷酸内工程化的tRNA变体的一个或多个拷贝的5’。在一些实施方案中，填充序列在多核苷酸内工程化的tRNA变体的一个或多个拷贝的3’。在一些实施方案中，填充序列在多核苷酸内分隔两个或更多个拷贝的工程化的tRNA变体。在一些实施方案中，多个填充序列在多核苷酸内分隔多个拷贝的工程化的tRNA变体。例如，编码工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的多核苷酸可以包含工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的第一拷贝，随后是第一填充序列，随后是工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的第二拷贝，随后是第二填充序列，随后是工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的第三拷贝(沿5’至3’方向)。也可以在工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的第一拷贝的5’，或工程化的tRNA或工程化的tRNA变体的第三拷贝的3’存在一个或多个填充序列。
SEQ ID NO:57包括含有补充序列的多核苷酸的实例。一些实施方案包括与SEQ IDNO:57，或其片段(例如包括其中提供的任何间隔序列的片段)具有至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，或100％同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：57的片段是10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500个或更多个核苷酸长，或由上述数字中的任两个定义的核苷酸范围。
在一些情况下，改变工程化的tRNA或其变体与ITR的距离可以增加工程化的tRNA或其变体的终止密码子读通的效率。在一些情况下，载体构建体中工程化的tRNA或其变体的序列的方向可以影响工程化的tRNA或其变体的终止密码子读通的效率。在一些情况下，载体可以包含以不同方向放置的载体中的一个或多个工程化的tRNA序列或工程化的tRNA变体序列。
III.试剂盒
在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文所述的组合物和容器。例如，试剂盒可以包含药物组合物，其可以包含工程化的tRNA或其变体，编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸(例如载体)，或两者。在一些情况下，容器可以是塑料的、玻璃的、金属的或其任何组合。在一些情况下，试剂盒可以包含使用说明书，例如向有需要的受试者施用的说明书。
在一些情况下，包含本文所述的组合物的包装产品可以被适当地标记。在一些情况下，本文所述的药物组合物可以根据优质生产实践(cGMP)和标记规则来制备。在一些情况下，本文公开的药物组合物可以是无菌的。
在一些实施方案中，本文公开了包含工程化的tRNA或其变体的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开了包含工程化的tRNA变体的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文所述的药物组合物(例如工程化的tRNA或其变体以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，任选地呈剂量单位形式)。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含包装或容器。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含包装。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含容器。
一些实施方案涉及制备试剂盒的方法。所述方法可以包括使所述组合物与包装或容器接触。所述方法可以包括使所述组合物与包装接触。所述方法可以包括使所述组合物与容器接触。
IV.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有专门术语、符号和其它技术和科学术语或专用语旨在具有与所要求保护的主题所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中是为了清楚和/或为了容易参考而定义的，并且在本文中包括这样的定义不应必然被解释为代表与本领域中通常理解的内容相比的实质差异。
在整个本申请中，可以以范围格式呈现各种实施方案。应当理解，范围格式的描述可以仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本公开的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围如1至6的描述应被认为已经具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都是适用的。
如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种样品”包括多种样品，包括其混合物。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中经常可互换地用于指测量形式。所述术语包括确定元素是否可以存在(例如，检测)。这些术语可以包括定量、定性或定量和定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“检测…的存在”可以包括除了根据上下文确定某物是否可以存在或不存在之外还确定其存在的量。
术语“体内”可用于描述在受试者体内发生的事件。
术语“离体”可用于描述在受试者体外发生的事件。不能对受试者进行离体测定。相反，它可以在从受试者分离的样品上进行。对样品进行的离体测定的实例可以是“体外”测定。
术语“体外”可用于描述在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得其可与可从中获得材料的生物来源分离。体外测定可以包括其中使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定也可以包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
如本文所用，术语“约”一个数字可以指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”一个范围可指该范围减去其最低值的10％并加上其最大值的10％。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于在接受者中获得有益或期望的结果的药物或其它干预方案。有益或期望的结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处可指根除或改善症状或所治疗的潜在病症。此外，治疗益处可以通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现，使得可以在受试者中观察到改善，尽管受试者仍然可以患有潜在病症。预防作用包括延迟，预防或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减慢，停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。为了预防益处，即使可能尚未进行特定疾病的诊断，处于发展该疾病的风险中的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者也可经历治疗。
术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指动物，通常是哺乳动物。任何合适的受试者可以施用如本文所述的组合物或通过如本文所述的方法治疗。哺乳动物的非限制性实例包括人，非人灵长类(例如，类人猿、长臂猿，黑猩猩，猩猩、猴子、猕猴等)，家畜(例如，狗和猫)，农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。在一些情况下，人可以是胚胎，胎儿，儿童或成年人。在一些情况下，人可为：约1天至约7天、1周至约5周、1个月至约12个月、1岁至约10岁、6个月至约15岁、5岁至约25岁、20岁至约50岁、40岁至约80岁、75岁至约100岁、或约90岁至约130岁。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，受试者可以是雄性。在一些实施方案中，受试者可以是雌性。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些实施方案中，受试者可以包括或可以被怀疑患有疾病或病况，例如Rett综合征。在一些情况下，受试者可以是怀孕的受试者，例如年龄适于生殖的怀孕的人。在一些实施方案中，患者可以是约20岁。在一些实施方案中，患者可以是10-30岁。
在一些实施方案中，患者是至少5岁、至少10岁、至少15岁、至少20岁、至少25岁、至少30岁、至少35岁、至少50岁、至少75岁或至少95岁。在一些实施方案中，患者不超过5岁、不超过10岁、不超过15岁、不超过20岁、不超过25岁、不超过30岁、不超过35岁、不超过50岁、不超过75岁或不超过95岁。
“真核细胞”包括除原核生物外的所有生命界。它们可以容易地通过膜结合的核来区分。动物，植物，真菌和原生生物可以是真核生物或生物体，其细胞可以通过内膜和细胞主链组织成复杂的结构。特征性膜结合结构可以是核。术语“宿主”可以包括真核生物宿主，包括例如酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性实例包括猿，牛，猪，鼠，大鼠，鸟，爬行动物和人。真核细胞的其它实例可以包括细胞系。在一些情况下，原代细胞或细胞可以是神经元，光感受器细胞(例如S锥形细胞，L锥形细胞，M锥形细胞，杆状细胞)，视网膜色素上皮细胞，神经胶质细胞(例如星形胶质细胞，少突胶质细胞，小神经胶质细胞)，肌细胞(例如成肌细胞，肌管)，肝细胞，肺上皮细胞或成纤维细胞(例如真皮成纤维细胞)。在一些情况下，细胞可以是水平细胞，神经节细胞或双极细胞。在一些情况下，细胞系可以是哺乳动物细胞系，例如HEK293T、HEK293、NCI-60、MCF-7、HL-60、RD、LHCN分化的、LHCN未分化的、Saos-2、CHO或HeLa细胞。在一些情况下，细胞系可以是昆虫细胞系，例如Sf9。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用，并且在其最广泛的意义上可以指两个或更多个亚单位氨基酸，氨基酸类似物或模拟肽的化合物。亚单位可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚单元可以通过其它键，例如酯，醚等连接。蛋白质或肽可含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”可指天然氨基酸，非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体，氨基酸类似物和模拟肽。如本文所用，术语“融合蛋白”可指由来自一种以上天然存在的或重组产生的蛋白的结构域组成的蛋白，其中通常每个结构域具有不同的功能。在这方面，术语“接头”可指蛋白质片段，其可用于将这些结构域连接在一起——任选地保持融合蛋白结构域的构象，防止融合蛋白结构域之间不利的相互作用——其可损害它们各自的功能，或两者。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，并且可以指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针，引物，EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA (mRNA)，转移RNA，核糖体RNA、RNAi，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸装配之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还可以指双链和单链分子。除非另有说明或需要，可以是多核苷酸的本发明的任何实施方案都包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸可以由特定的核苷酸序列组成。核苷酸可以包含核苷和磷酸基团。核苷酸可以包含糖(例如核糖或2’脱氧核糖)和核碱基，例如含氮碱基。核碱基的非限制性实例包括腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，尿嘧啶(U)和肌苷(I)。在一些实施方案中，当次黄嘌呤可以通过P-N9-糖苷键与呋喃核糖连接时，可以形成I，得到以下化学结构：
Figure BDA0003752489830001191
肌苷可以由翻译机器读取为鸟嘌呤(G)。
术语“多核苷酸序列”可以是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。
“同源性”或“同一性”或“相似性”可以指两条肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每条序列中的位置(可以为了比较的目的而进行比对)来确定同源性。当所比较的序列中的位置可以被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置可以是同源的。序列之间的同源性程度可以是序列共享的匹配位置或同源位置的数目的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本公开的序列之一共享小于40％的同一性，或可选地小于25％的同一性。序列同源性可以指序列与参考序列的％同一性。作为实际问题，无论任何特定序列是否可以与本文所述的任何序列(其可以对应于本文所述的特定核酸序列)至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同，这种特定的多肽序列可以常规地使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，第8版，Unix，Genetics Computer Group、University Research Park、575Science Drive、Madison、Wis.53711)来确定。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否例如与参考序列95％相同时，可以设定参数，使得可以在参考序列的全长上计算同一性的百分比，并且可以允许序列同源性中的空位高达总参考序列的5％。
在一些情况下，参考序列(查询序列，即公开的序列)和目标序列之间的同一性(也称为全局序列比对)可以使用FASTDB计算机程序---基于Brutlag等人的算法来确定(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。在一些实施方案中，在FASTDB氨基酸比对中使用的其中可受限地解释同一性的特定实施方案的参数可以包括：评分方案＝PAM(接受突变百分比)0、k-元组＝2，错配惩罚＝1，连接惩罚＝20，随机化组长度＝0，截止评分＝1，窗大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗大小＝500或目标序列的长度，无论哪一个都可以更短。根据该实施方案，如果目标序列由于N-或C-末端缺失而不是由于内部缺失而比查询序列短，则可以对结果进行人工校正，以考虑到FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑目标序列的N-和C-末端截短这一事实。对于相对于查询序列，在N-末端和C-末端截短的目标序列，通过计算可以在目标序列的N-末端和C-末端侧的查询序列的残基数(其不能与相应的目标残基匹配/比对上)，作为查询序列的总碱基的百分比，可以来校正百分比同一性。对残基是否能够匹配/比对上的确定可以通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后可以从由使用指定参数的FASTDB程序计算的百分比同一性中减去该百分比，以获得最终的百分比同一性评分。该最终的百分比同一性评分可用于本实施方案的目的。在一些情况下，只有目标序列的N-末端和C-末端的残基(其不能与查询序列匹配/比对上)可以被考虑用于手动调节百分比同一性评分的目的。也就是说，只有目标序列最远的N-末端和C-末端残基之外的查询残基位置，才能被考虑这种手动校正。例如，90个残基的目标序列可以与100个残基的查询序列进行比对，以确定百分比同一性。缺失发生在目标序列的N-末端，因此，FASTDB比对不显示N-末端前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(N-末端和C-末端不匹配的残基数目/查询序列中的残基总数)，因此可以从由FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，最终的百分比同一性可以是90％。在另一个实例中，可以将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失可以是内部缺失，因此在目标序列的N-末端或C-末端可以不存在不能与查询匹配/比对上的残基。在这种情况下，通过FASTDB计算的百分比同一性无法手动校正。再一次，只能手动校正目标序列的N-末端和C-末端之外的不能与查询序列匹配/比对上的残基位置，如在FASTDB比对中显示的。
在一些情况下，参考序列(查询序列，即公开的序列)和目标序列之间的同一性(也称为全局序列比对)可以使用FASTDB计算机程序---基于Brutlag等人的算法来确定(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。在一些实施方案中，在FASTDB氨基酸比对中使用的其中可受限地解释同一性的特定实施方案的参数可以包括：评分方案＝PAM(接受突变百分比)0、k-元组＝2，错配惩罚＝1，连接惩罚＝20，随机化组长度＝0，截止评分＝1，窗大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗大小＝500或目标序列的长度，无论哪一个都可以更短。根据该实施方案，如果目标序列由于N-或C-末端缺失而不是由于内部缺失而比查询序列短，则可以对结果进行人工校正，以考虑到FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑目标序列的N-和C-末端截短这一事实。对于相对于查询序列，在N-末端和C-末端截短的目标序列，通过计算可以在目标序列的N-末端和C-末端侧的查询序列的残基数(其不能与相应的目标残基匹配/比对上)，作为查询序列的总碱基的百分比，可以来校正百分比同一性。对残基是否能够匹配/比对上的确定可以通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后可以从由使用指定参数的FASTDB程序计算的百分比同一性中减去该百分比，以获得最终的百分比同一性评分。该最终的百分比同一性评分可用于本实施方案的目的。在一些情况下，只有目标序列的N-末端和C-末端的残基(其不能与查询序列匹配/比对上)可以被考虑用于手动调节百分比同一性评分的目的。也就是说，只有目标序列最远的N-末端和C-末端残基之外的查询残基位置，才能被考虑这种手动校正。例如，90个残基的目标序列可以与100个残基的查询序列进行比对，以确定百分比同一性。缺失发生在目标序列的N-末端，因此，FASTDB比对不显示N-末端前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(N-末端和C-末端不匹配的残基数目/查询序列中的残基总数)，因此可以从由FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，最终的百分比同一性可以是90％。在另一个实例中，可以将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失可以是内部缺失，因此在目标序列的N-末端或C-末端可以不存在不能与查询匹配/比对上的残基。在这种情况下，通过FASTDB计算的百分比同一性无法手动校正。再一次，只能手动校正目标序列的N-末端和C-末端之外的不能与查询序列匹配/比对上的残基位置，如在FASTDB比对中显示的。
“转移核糖核酸”或“tRNA”可以是帮助将mRNA翻译成蛋白质的核酸分子。tRNA可以具有独特的折叠结构，包括三个发夹环；这些环之一可以包含编码反密码子的“茎”部分。反密码子可以识别mRNA上的相应密码子。每种tRNA可以“装载”对应于mRNA密码子的氨基酸。装载可以通过酶tRNA合成酶来完成。当tRNA识别对应于其反密码子的密码子时，tRNA可将其可被装载的氨基酸转移至生长中的氨基酸链以形成多肽或蛋白质。内源tRNA可由内源tRNA合成酶装载。因此，内源tRNA通常装载有典型氨基酸。来源于外部来源的正交tRNA可能需要相应的正交tRNA合成酶。这种正交tRNA可以用典型氨基酸和非典型氨基酸装载。非典型氨基酸的非限制性实例可见于“Adding New Chemistries to the Genetic Code”ByC.Liu and P.Schultz,Annu.Re.Biochem.79:413-44(2010)。在一些实施方案中，可以用其对tRNA进行装载的氨基酸可以进行可检测标记，以便能够在体内进行检测。用于标记的合适技术包括但不限于点击化学，其中含有非天然氨基酸的叠氮化物/炔烃可以通过正交tRNA/合成酶对加入，因此可以使用包含荧光团或其它这样的分子的炔烃/叠氮化物来检测。
本文所用的术语“工程化的tRNA”可以指相对于可比较的野生型tRNA，在工程化的tRNA的序列中具有至少一个差异(例如在反密码子区中)的转移RNA。本文所用的术语“工程化的tRNA变体”或“其变体”可指与参考工程化的tRNA相比在其序列中具有突变的转移RNA。在一些实施方案中，工程化的tRNA或其变体被称为“抑制性tRNA或其变体”、“tRNA抑制物”或“工程化的tRNA抑制物”，其通常可以指能够抑制mRNA中过早终止密码子读通的工程化的tRNA或其变体。
术语“tRNA异构体解码器”可以在本文中可互换地使用，是指当被氨基酰化时被相同氨基酸氨基酰化的tRNA分子。在一些情况下，tRNA异构体解码器可以指共享相同反密码子序列的tRNA分子。
“信使RNA”或“mRNA ”在本文中是指包含编码多肽或蛋白质的序列的RNA分子。通常，RNA可以从DNA转录。在一些情况下，序列中含有非蛋白编码区的前体mRNA可以从DNA转录，然后加工去除所有或部分非编码区(内含子)以产生成熟的mRNA。如本文所用，术语“前mRNA”可指在进行去除非蛋白编码区的加工之前从DNA转录的RNA分子。
术语“终止密码子”可以指信使RNA内的三核苷酸连续序列，其发出翻译终止的信号。非限制性实例包括在RNA中的UAG(琥珀)、UAA(赭石)、UGA(棕土，也称为乳白)和在DNA中的TAG、TAA或TGA。除非另有说明，该术语还可以包括在DNA或RNA中引入过早终止密码子的无义突变，导致任何产生的蛋白质被异常缩短。对应于各种终止密码子的tRNA通过其终止密码子对应的名称是已知的：琥珀(UAG)，赭石(UAA)和乳白(UGA)。
“典型氨基酸”是指天然存在的20种氨基酸，包括例如表4所示的氨基酸。
表4.用三字母缩写、单字母缩写、结构和相应密码子表示的天然存在的氨基酸
Figure BDA0003752489830001241
Figure BDA0003752489830001251
Figure BDA0003752489830001261
术语“有效量”可指足以实现所需效果的量。在治疗或预防应用的上下文中，有效量可取决于所讨论的病况的类型和严重程度以及个体受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在一些实施方案中，有效量可以是至少部分地治疗患有疾病如Rett综合征或耳聋的患者所需的量。在一些情况下，本领域技术人员将能够根据这些和其它因素来确定合适的量。
在体外应用的情况下，在一些实施方案中，有效量将取决于所讨论的应用的大小和性质。它还取决于体外靶标的性质和敏感性以及使用的方法。在一些情况下，本领域技术人员将能够基于这些和其它考虑来确定有效量。有效量可以包括一次或多次施用组合物，这取决于实施方案。
如本文所用，与蛋白质表达相关的术语“恢复”可以指建立全长蛋白质表达的能力，其中先前的蛋白质表达由于突变如过早终止密码子而被截短。
本文所用的术语“突变”可以指核酸序列或多肽序列相对于参考序列的改变。突变可以发生在DNA分子，RNA分子(例如，tRNA、mRNA)，或多肽或蛋白质，或其任何组合中。参考序列可以从诸如NCBI参考序列数据库(RefSeq)的数据库中获得。可以构成突变的具体变化可以包括一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入，倒转或转换。核酸序列中突变的非限制性实例(没有所述突变，则编码多肽序列)包括：“错义”突变，其可导致一个密码子取代另一个密码子，“无义”突变，其可将密码子从编码特定氨基酸的密码子改变为终止密码子(其可导致蛋白质的截短翻译)，或“沉默”突变，其可为对所得蛋白质无影响的突变。突变可以是“点突变”，其可以指仅影响DNA或RNA序列中的一个核苷酸的突变。突变可以是“剪接位点突变”，其可以存在于前mRNA(在加工以去除内含子之前)，导致误译和经常从剪接位点的不正确描绘中截短蛋白质。突变可以是融合基因。融合对或融合基因可由突变，例如易位，间质缺失，染色体倒转或其任何组合产生。突变可以造成重复序列数量的变异性，例如三倍，四倍或其它。例如，突变可以是与给定序列相关的拷贝数的增加或减少(即，拷贝数变异或CNV)。突变可以包括不同等位基因中的两个或更多个序列变化或一个等位基因中的两个或更多个序列变化。突变可以在一个等位基因中的一个位置处包括两个不同的核苷酸，例如镶嵌的。突变可以在一个等位基因的一个位置处包括两个不同的核苷酸，例如嵌合的。突变可存在于恶性组织中。突变可以包括单核苷酸变异(SNV)。突变可以包括序列变体，序列变异，序列改变或等位基因变体。
突变的存在或不存在可以指示发展疾病或病况的风险增加。突变的存在或不存在可以指示疾病或病况的存在。突变可存在于良性组织中。不存在突变可以表明组织或样品可以是良性的。或者，不存在突变可能无法表明组织或样品可以是良性的。本文所述的方法可以包括鉴定样品中突变的存在。
本文所用的术语“编码”可指多核苷酸提供足以产生相应基因表达产物的信息或指令序列的能力。在非限制性实例中，mRNA可在翻译期间编码多肽，而DNA可在转录期间编码mRNA分子。
术语“互补的”或“互补性”可以指核酸通过例如氢键(例如，传统Watson-Crick)，共价键或其它类似方法与相应核酸序列形成一个或多个键的能力。在Watson-Crick碱基配对中，在核碱基T和A之间形成双氢键，而在核碱基C和G之间形成三氢键。例如，序列A-G-T可以与序列T-C-A互补。百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(10个中的5、6、7、8、9、10个分别是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补的)。“完全互补的”可以指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。本文所用的“基本上互补的”可以指在10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上可以是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或可以指在严格条件(即，严格杂交条件)下杂交的两种核酸。核酸可以包括非特异性序列。如本文所用的，术语“非特异性序列”或“非特异性的”可指含有一系列残基的核酸序列，所述一系列残基可以不旨在与任何其它核酸序列互补或仅可以与任何其它核酸序列部分互补。
单独使用或与“基序”组合使用的术语“发夹”、“发夹环”、“茎-环”和/或“环”可指单链多核苷酸分子中形成并类似于发夹或环的结构。当多核苷酸分子的第一核苷酸序列和多核苷酸分子的第二核苷酸序列碱基配对或以其它方式键合以形成发夹或环结构时，可以形成这种结构。这种结构如图2所示，图2显示了根据一些实施方案在天然存在的或工程化的tRNA中的各种茎-环结构。
如本文所用的，术语“结构域”可指蛋白质，多核苷酸(例如工程化的tRNA)或多肽的特定区域，且可与特定功能相关联。例如，“与RNA发夹基序关联的结构域”可以指结合一个或多个RNA发夹的蛋白质结构域。
可以在没有明确记载的情况下推断，并且除非另有说明，否则当本公开涉及多肽，蛋白质，多核苷酸或抗体时，这些的等同物或生物学等同物可以意图在本公开的范围内。本文所用的术语“其生物学等同物”当指参考蛋白，抗体，多肽或核酸时，可以指与“其等同物”同义，指具有最小同源性同时仍保持所需的结构或功能的那些。除非本文具体记载，可以预期本文提及的任何多核苷酸，多肽或蛋白质也包括其等同物。例如，等同物是指至少约70％的同源性或同一性，或至少80％的同源性或同一性，并且可选地，或者至少约85％，或可选地至少约90％，或可选地至少约95％，或可选地98％的百分比同源性或同一性，并表现出与参考蛋白，多肽或核酸基本等同的生物活性。或者，当提及多核苷酸时，其等同物可以是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。
“RNA编辑实体”可以包括可编辑靶RNA序列的内源酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括重组酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括融合多肽。在一些实施方案中，RNA编辑实体可以包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(“APOBEC3E”现在可指这个)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、活化诱导的(胞苷)脱氨酶(AID)、ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3或其任何组合。在一些情况下，RNA编辑实体可以包含与APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(“APOBEC3E”现在可指这个)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、活化诱导的(胞苷)脱氨酶(AID)、ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3或其任何组合至少约80％的序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体可以是病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自麻疹，流行性腮腺炎或副流感病毒的病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的能够在靶RNA中添加或删除一个或多个核苷酸的酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自布氏锥虫的能够在靶RNA中添加或删除尿嘧啶或多于一个尿嘧啶的酶。
本文所用的术语“ADAR”可以指腺苷脱氨酶，其可以将RNA序列中的腺苷(A)转换为肌苷(I)。ADAR1和ADAR2可以是可参与体内mRNA编辑的ADAR的两种示例性种类。ADAR1的非限制性示例性序列可以在以下参考数字下找到：HGNC：225；Entrez基因：103；Ensembl:ENSG00000160710；OMIM：146920；UniProtKB：P55265；和GeneCards:GC01M154554，及其生物学等同物。ADAR2的非限制性示例性序列可以在以下参考数字下找到：HGNC：226；Entrez基因：104；Ensembl：ENSG00000197381；OMIM：601218；UniProtKB：P78563；和GeneCards:GC21P045073，及其生物学等同物。
本文所用的术语“APOBEC”可以指属于参与mRNA编辑的进化上保守的胞苷脱氨酶家族的任何蛋白质——催化C至U转换——及其等同物。在一些方面，术语APOBEC可以指APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4或其各自的等同物中的任一种。包含一个或多个APOBEC结构域的融合蛋白的非限制性示例性序列可在本文中提供均融合至ADAR结构域或融合至替代结构域以使其适合用于RNA编辑系统。为此，APOBEC可以被认为是ADAR的等同物-催化编辑，尽管通过不同的转换。因此，不受理论的束缚，申请人相信，本文预期的用于基于ADAR的编辑系统的所有实施方案都可适用于基于APOBEC的RNA编辑系统。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
V.实施方案
提供了以下非限制性实施方案：
1.治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，包括：
向所述受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸；和
相对于使用缺乏过早终止密码子的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率在体内产生基本上全长的多肽，
其中所述工程化的tRNA或其变体能够读通编码所述基本上全长的多肽的mRNA中的过早终止密码子。
2.治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，包括：
向所述受试者施用工程化的tRNA或其变体或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸，从而至少部分地治疗所述受试者的疾病或病症；
其中所述工程化的tRNA或其变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体在所述mRNA的翻译期间至少部分地将对所述过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且如通过以下所确定的，相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率在体内产生基本上全长的多肽：
a)将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一标志物)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一标志物的所述筛查mRNA包含所述过早终止密码子；
b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二标志物)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；和
c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的可检测信号的量。
3.如实施方案2所述的组合物，其中所述第一人细胞或所述第二人细胞是HEK293细胞。
4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，还包括恢复至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约92％，至少约95％，至少约97％，至少约99％或100％的基本上全长多肽的表达。
5.如实施方案3所述的方法，其中相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，所述工程化的tRNA或其变体以至少约35％的效率产生所述基本上全长的多肽。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体用精氨酸酰化。
8.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体用非典型氨基酸酰化。
9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中编码所述多肽的mRNA对应于至少MeCP2的片段。
10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中在mRNA翻译期间，所述工程化的tRNA或其变体响应于所述过早终止密码子而将氨基酸插入到由mRNA在体内编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入的氨基酸足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。
11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含至少两个过早终止密码子。
12.如实施方案11所述的方法，其中所述至少两个过早终止密码子是相同的终止密码子。
13.如实施方案11所述的方法，其中所述至少两个过早终止密码子是不同的终止密码子。
14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述过早终止密码子由对应于MeCP2多肽的序列中的氨基酸位置168、255、270、294、198、186、453、8(在同种型2中)、9(在同种型1中)、84、85、89、91、106、111、115、133、162、167、188、190、211、250、253、268、306、309、344、354、420、458、468、471、478或484，或其任何组合处的R至X产生，其中X是过早终止密码子。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子。
16.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述过早终止密码子是琥珀终止密码子。
17.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述过早终止密码子是赭石终止密码子。
18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酸酰tRNA或谷氨酰tRNA。
19.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体是工程化的前-tRNA。
20.如实施方案19所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体包含内含子序列。
21.如实施方案20所述的方法，其中所述内含子序列在含有所述工程化的tRNA或其变体的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA或其变体。
22.如实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
23.如实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述人的年龄为约出生至约40岁。
25.如实施方案22或25所述的方法，其中所述人的年龄为约6个月至约15岁。
26.如实施方案22所述的方法，其中所述人是胚胎或胎儿。
27.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括Rett综合征。
28.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括囊性纤维化。
29.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括色素性视网膜炎。
30.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括耳聋。
31.如实施方案30所述的方法，其中所述耳聋包括常染色体显性17耳聋，常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。
32.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述施用是口服施用，直肠施用或肠胃外施用。
33.如实施方案32所述的方法，其中所述施用是肠胃外施用，并且其中所述肠胃外施用是静脉内施用，动脉内施用，鞘内施用，眼内施用，耳内施用，脑室内施用或腹腔内施用。
34.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述施用是脑池内(ICM)施用。
35.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述施用是脑室内(ICV)施用。
36.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MeCP2多肽或其片段。
37.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括FoxG1多肽或其片段。
38.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括CDKL5多肽或其片段。
39.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MYH9多肽或其片段。
40.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括COL11A2多肽或其片段。
41.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MYO7A多肽或其片段。
42.如实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述施用在一段时间内进行至少两次。
43.如实施方案42所述的方法，其中所述一段时间为约24小时。
44.如实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述方法是预防疾病或病况的方法，并且其中所述预防包括向所述受试者预防性施用所述工程化的tRNA或其变体或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸。
45.如实施方案1-44中任一项所述的方法，其中将编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸施用于受试者。
46.如实施方案44或45所述的方法，其中编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸包含在载体中。
47.如实施方案46所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
48.如实施方案46或47所述的方法，其中所述载体包括质粒，腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，慢病毒(LV)载体。
49.如实施方案48所述的方法，其中所述AAV载体来自具有以下的AAV:
a)包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的血清型，或
b)包含AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-Retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAV-2i8的假型。
50.如实施方案48或49所述的方法，其中所述AAV载体包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。
51.如实施方案48-50中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。
52.如实施方案48-51中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/5载体。
53.如实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体，或编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸存在于递送系统中。
54.如实施方案53所述的方法，其中所述递送系统包括脂质体，带电聚合物，不带电聚合物，纳米颗粒，表面活性剂，渗透增强剂，基因转移剂，磷脂，胶束，合成载体，大分子，树枝状聚合物，生物聚合物，病毒颗粒或其任何组合。
55.如实施方案1-54中任一项所述的方法，其还包括施用包含多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列包含或编码：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列募集RNA编辑实体，并且其中所述编辑实体当与所述多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，由此将所述过早终止密码子转化为有义密码子。
56.如实施方案55所述的方法，其中所述RNA编辑实体包含：
a)ADAR多肽；
b)APOBEC多肽；
c)(a)或(b)的生物活性片段；或
d)融合蛋白，其包含：(c)的生物活性片段，(a)的ADAR多肽或(b)的APOBEC多肽。
57.如实施方案1所述的方法，其中所述疾病或病况包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体是精氨酰tRNA，其中所述受试者是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA或其变体作为AAV载体施用于所述受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，所述工程化的tRNA或其变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗所述Rett综合征。
58.如实施方案1-57中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体包含化学修饰，所述化学修饰包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。
59.如实施方案1-58中任一项所述的方法，其中在施用之前对所述受试者给予对所述疾病或病况的诊断。
60.如实施方案59所述的方法，其中所述诊断通过体外诊断试验确定。
61.组合物，其包含：
a)实施方案1-60中任一项所述的工程化的tRNA或其变体；和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
62.试剂盒，其包含在容器中的实施方案61所述的组合物。
63.治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，包括：
向所述受试者施用工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸，其中所述工程化的tRNA变体在SEQ ID NOS:3-22任一项中提供的参考tRNA的序列中包含一个或多个突变，并且其中所述工程化的tRNA变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，并且在所述mRNA的翻译期间，将对所述过早终止密码子的解读至少部分地转化为有义密码子以在体内产生基本上全长的多肽。
64.如实施方案63所述的方法，其中所述一个或多个突变包括所述工程化的tRNA变体的受体茎或反密码子茎中的彼此不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸用不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸取代。
65.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置72处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。
66.如实施方案63或64所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体包含在参考SEQID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置2处的胞嘧啶和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤。
67.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置67处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
68.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置13处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置22处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置13和核苷酸位置22是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
69.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置15处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
70.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
71.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置31处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置39处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
72.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置37处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
73.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。
74.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置50处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置64处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
75.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
76.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置49处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置65处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置49和核苷酸位置65是参考SEQ ID NO:6。
77.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
78.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。
79.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置2处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置2和核苷酸位置72是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
80.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置4处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置69处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置4和核苷酸位置69是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
81.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
82.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置12处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置23处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置12和核苷酸位置23是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
83.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置27处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置43处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中所述核苷酸位置27和所述核苷酸位置43是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
84.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中所述核苷酸位置28和所述核苷酸位置42是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
85.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置40处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。
86.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置31处的腺嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置39处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
87.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
88.如实施方案63或64所述的方法，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ IDNO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置46处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。
89.如实施方案63-88中任一项所述的方法，其中如通过以下所确定的，相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率产生所述多肽：
a)将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一绿色荧光蛋白的所述筛查mRNA包含所述过早终止密码子；
b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；和
c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光的量。
90.如实施方案63-89中任一项所述的方法，其中相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约80％的效率产生所述多肽，从而至少部分地治疗所述受试者的疾病或病况。
91.如实施方案63-90中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸，和硒代半胱氨酸。
92.如实施方案63-91中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体用非典型氨基酸酰化。
93.如实施方案63-92中任一项所述的方法，其中在所述mRNA的翻译期间，所述工程化的tRNA变体响应于所述过早终止密码子而将氨基酸插入到由所述mRNA在体内编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入时的氨基酸足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。
94.如实施方案63-93中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含至少两个过早终止密码子。
95.如实施方案94所述的方法，其中所述至少两个过早终止密码子是相同的终止密码子。
96.如实施方案94所述的方法，其中所述至少两个过早终止密码子是不同的终止密码子。
97.如实施方案63-96中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA，苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酰tRNA，或谷氨酰tRNA。
98.如实施方案63-97中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体是工程化的前tRNA。
99.如实施方案98所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体包含内含子序列。
100.如实施方案98所述的方法，其中所述内含子序列在含有所述工程化的tRNA变体的细胞内被剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA变体。
101.如实施方案63-100中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
102.如实施方案101所述的方法，其中所述人的年龄为约出生至约40岁。
103.如实施方案101所述的方法，其中所述人的年龄为约6个月至约15岁。
104.如实施方案101所述的方法，其中所述人是胚胎或胎儿。
105.如实施方案63-104中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括Rett综合征。
106.如实施方案63-104中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括囊性纤维化。
107.如实施方案63-104中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括色素性视网膜炎。
108.如实施方案63-104中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况包括耳聋。
109.如实施方案108所述的方法，其中所述耳聋包括常染色体显性17耳聋，常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。
110.如实施方案63-109中任一项所述的方法，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子。
111.如实施方案63-110中任一项所述的方法，其中所述施用是口服施用，直肠施用或肠胃外施用。
112.如实施方案63-111所述的方法，其中所述施用是肠胃外施用，并且其中所述肠胃外施用是静脉内施用，动脉内施用，鞘内施用，眼内施用，耳内施用，脑室内施用，颅内施用，颅内施用至实质细胞或腹腔内施用。
113.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MeCP2多肽。
114.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括FoxG1多肽。
115.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括CDKL5多肽。
116.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MYH9多肽。
117.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括COL11A2多肽。
118.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述多肽包括MYO7A多肽。
119.如实施方案63-112中任一项所述的方法，其中所述施用在一段时间内进行至少两次。
120.如实施方案119所述的方法，其中所述一段时间为约24小时。
121.如实施方案63-120中任一项所述的方法，其中所述方法是预防疾病或病况的方法，并且其中所述预防包括向所述受试者预防性施用所述工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。
122.如实施方案63-121中任一项所述的方法，其中将编码工程化的tRNA变体的多核苷酸施用于所述受试者。
123.如实施方案63-122所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
124.如实施方案123所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。
125.如实施方案124所述的方法，其中所述AAV载体包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。
126.如权利要求124或125所述的方法，其中所述AAV载体包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。
127.如实施方案124-126中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/5载体。
128.如实施方案63-127中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA的多核苷酸存在于递送系统中。
129.如实施方案128所述的方法，其中所述递送系统包括脂质体，带电聚合物，不带电聚合物，纳米颗粒，表面活性剂，穿透增强剂，基因转移剂，磷脂，胶束，合成载体，大分子，树枝状聚合物，生物聚合物，病毒颗粒或其任何组合。
130.如实施方案63-129中任一项所述的方法，其还包括施用包含多核苷酸序列的组合物，所述多核苷酸序列包含或编码RNA编辑多核苷酸，所述RNA编辑多核苷酸包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列经由所述募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中所述编辑实体当与所述RNA编辑多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰，由此将过早终止密码子转化为有义密码子。
131.如实施方案130所述的方法，其中所述编辑实体包括：
a)ADAR多肽；
b)APOBEC多肽；
c)(a)或(b)的生物活性片段；或
d)融合蛋白，其包含(c)的生物活性片段，(a)的ADAR多肽或(b)的APOBEC多肽。
132.如实施方案63所述的方法，其中所述疾病或病况包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA是精氨酰tRNA，其中所述受试者是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA变体作为AAV载体施用于所述受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，所述工程化的tRNA变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。
133.如实施方案63-132中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体包含化学修饰，所述化学修饰包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。
134.如实施方案63-133中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸包含在药物单位剂量形式中，所述药物单位剂量形式还包含药学上可接受的载体赋形剂，稀释剂或载体。
135.如实施方案63-134中任一项所述的方法，其中所述受试者被给予所述疾病或病况的诊断。
136.如实施方案135所述的方法，其中所述诊断通过体外诊断试验确定。
137.组合物，其包含：工程化的tRNA变体，其参考SEQ ID NOS:3-22中任一项提供的序列包含一个或多个突变。
138.如实施方案137所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体与SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:48中的任一项具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。
139.组合物，其包含：
工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸，其中所述工程化的tRNA变体与包含SEQ ID NOS:3-22中任一项提供的序列的参考tRNA相比，在所述工程化的tRNA的序列中包含一个或多个突变，并且其中所述工程化的tRNA变体识别编码多肽的mRNA中的过早终止密码子，并且在所述mRNA的翻译期间至少部分地将对所述过早终止密码子的解读转化为有义密码子，以产生基本上全长的多肽。
140.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:6至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:6的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处具有取代。
141.如实施方案140所述的组合物，其中位置2处的取代是取代为C，位置4处的取代是取代为C，位置6处的取代是取代为T，位置6处的取代是取代为A，位置12处的取代是取代为C，位置23处的取代是取代为G，位置27处的取代是取代为C，位置28处的取代是取代为C，位置31处的取代是取代为C，位置39处的取代是取代为G，位置40处的取代是取代为C，位置42处的取代是取代为G，位置43处的取代是取代为G，位置44处的取代是取代为G，位置46处的取代是取代为A，位置49处的取代是取代为G，位置50处的取代是取代为T，位置64处的取代是取代为A，位置65处的取代是取代为C，位置67处的取代是取代为A，位置67处的取代是取代为T，位置69处的取代是取代为G，位置71处的取代是取代为C，或位置71处的取代是取代为G。
142.如实施方案140或141所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体的序列包括多个取代。
143.如实施方案140-142中任一项所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:6相同。
144.如实施方案140-143中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ IDNO:6中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
145.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:3至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:3的位置2、6、13、15、22、28、31、37、39、42、44、50、64、67、71或72处具有取代。
146.如实施方案145所述的组合物，其中位置2处的取代是取代为G，位置6处的取代是取代为G，位置13处的取代是取代为C，位置15处的取代是取代为G，位置22处的取代是取代为G，位置28处的取代是取代为C，位置31处的取代是取代为A，位置37处的取代是取代为G，位置39处的取代是取代为T，位置42处的取代是取代为G，位置44处的取代是取代为A，位置50处的取代是取代为C，位置64处的取代是取代为G，位置67处的取代是取代为C，位置71处的取代是取代为C，或位置72处的取代是取代为C。
147.如实施方案145或146所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体的序列包括多个取代。
148.如实施方案145-147中任一项所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:3相同。
149.如实施方案145-148中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ IDNO:3中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
150.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:5至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:5的位置73处具有取代。
151.如实施方案150所述的组合物，其中位置73处的取代是取代为G。
152.如实施方案150或151所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体的序列包括多个取代。
153.如实施方案150-152中任一项所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:5相同。
154.如实施方案150-153中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量，半衰期测量，氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ IDNO:5中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
155.如实施方案150所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括所述工程化的tRNA变体的受体茎或反密码子茎中的彼此不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸用不进行Watson-Crick碱基配对的至少两个核苷酸取代。
156.如实施方案150-153中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置2处的胞嘧啶和核苷酸位置71处的鸟嘌呤。
157.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置72处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。
158.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置22处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置71处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置22和核苷酸位置71是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
159.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置67处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
160.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置13处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置22处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置13和核苷酸位置22是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
161.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置15处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
162.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
163.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包含在核苷酸位置31处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置39处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39是参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端。
164.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置37处相对于腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
165.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。
166.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:3或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置73处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
167.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64是参考SEQ ID NO:4或参考tRNA的5’末端。
168.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
169.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置49处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代和在核苷酸位置65处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代，其中核苷酸位置49和核苷酸位置65是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
170.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置50处的胞嘧啶用胸腺嘧啶取代和在核苷酸位置64处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代，其中核苷酸位置50和核苷酸位置64是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
171.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置71处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代。
172.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置4处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置69处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置4和核苷酸位置69是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
173.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置6处的胞嘧啶用腺嘌呤取代和在核苷酸位置67处的鸟嘌呤用胸腺嘧啶取代，其中核苷酸位置6和核苷酸位置67是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
174.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置12处的鸟嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置23处的胞嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置12和核苷酸位置23是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
175.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置27处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置43处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置27和核苷酸位置43是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
176.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置28处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代和在核苷酸位置42处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置28和核苷酸位置42是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
177.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置40处的胸腺嘧啶用胞嘧啶取代。
178.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在核苷酸位置31处的腺嘌呤用胞嘧啶取代和在核苷酸位置39处的胸腺嘧啶用鸟嘌呤取代，其中核苷酸位置31和核苷酸位置39是参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端。
179.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置44处的腺嘌呤用鸟嘌呤取代。
180.如实施方案137-139中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个突变包括在参考SEQ ID NO:6或参考tRNA的5’末端的核苷酸位置46处的鸟嘌呤用腺嘌呤取代。
181.如实施方案137-180中任一项所述的组合物，其中如通过以下所确定的，相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率产生所述多肽：
a)将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA(其编码第一绿色荧光蛋白)的第二载体转染到第一人细胞中，其中编码所述第一绿色荧光蛋白的所述筛查mRNA包含所述过早终止密码子；
b)将编码可比较的筛查mRNA(其编码第二绿色荧光蛋白)的第三载体转染到第二人细胞中，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；和
c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光的量。
182.如实施方案181所述的组合物，其中相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约80％的效率产生所述多肽，从而至少部分地治疗所述受试者的所述疾病或病况。
183.如实施方案137-182中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体用选自以下的氨基酸酰化：赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸，和硒代半胱氨酸。
184.如实施方案137-182中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体用非典型氨基酸酰化。
185.如实施方案137-182中任一项所述的组合物，其中在所述mRNA翻译期间，所述工程化的tRNA变体响应于所述过早终止密码子而将氨基酸插入到由mRNA在体内编码的初生MeCP2多肽链中，其中与使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的MeCP2多肽相比，插入时的氨基酸足以产生至少部分功能性的MeCP2多肽。
186.如实施方案137-185中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含至少两个过早终止密码子。
187.如实施方案186所述的组合物，其中所述至少两个过早终止密码子是相同的终止密码子。
188.如实施方案186所述的组合物，其中所述至少两个过早终止密码子是不同的终止密码子。
189.如实施方案137-188中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体是赖氨酰-tRNA，精氨酰-tRNA，组氨酰-tRNA，甘氨酰-tRNA，丙氨酰-tRNA，缬氨酰-tRNA，亮氨酰-tRNA，异亮氨酰-tRNA，甲硫氨酰-tRNA。苯丙氨酰-tRNA，色氨酰-tRNA，脯氨酰-tRNA，丝氨酰-tRNA，苏氨酰-tRNA，半胱氨酰-tRNA，酪氨酰-tRNA，天冬酰胺酰-tRNA，谷氨酰胺酰-tRNA，天冬氨酰-tRNA，吡咯赖氨酰-tRNA，硒代半胱氨酰tRNA，或谷氨酰tRNA。
190.如实施方案137-189中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体是工程化的前-tRNA。
191.如实施方案190所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含内含子序列。
192.如实施方案191所述的组合物，其中所述内含子序列在含有所述工程化的tRNA变体的细胞内剪接，从而产生成熟的工程化的tRNA变体。
193.如实施方案137-192中任一项所述的组合物，其中所述受试者是人。
194.如实施方案193所述的组合物，其中所述人的年龄为约出生至约40岁。
195.如实施方案193所述的组合物，其中所述人的年龄为约6个月至约15岁。
196.如实施方案193所述的组合物，其中所述人是胚胎或胎儿。
197.如实施方案137-196中任一项所述的组合物，其中所述疾病或病况包括Rett综合征。
198.如实施方案137-196中任一项所述的组合物，其中所述疾病或病况包括囊性纤维化。
199.如实施方案137-196中任一项所述的组合物，其中所述疾病或病况包括色素性视网膜炎。
200.如实施方案137-196中任一项所述的组合物，其中所述疾病或病况包括耳聋。
201.如实施方案200所述的组合物，其中所述耳聋包括常染色体显性17耳聋，常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。
202.如实施方案137-201中任一项所述的组合物，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子。
203.如实施方案137-202中任一项所述的组合物，其中所述施用是口服施用，直肠施用或肠胃外施用。
204.如实施方案137-203中任一项所述的组合物，其中所述施用是肠胃外施用，并且其中所述肠胃外施用是静脉内施用，动脉内施用，鞘内施用，眼内施用，耳内施用，脑室内施用或腹腔内施用。
205.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括MeCP2多肽。
206.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括FoxG1多肽。
207.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括CDKL5多肽。
208.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括MYH9多肽。
209.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括COL11A2多肽。
210.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括MYO7A多肽。
211.如实施方案137-204中任一项所述的组合物，其中所述施用在一段时间内进行至少两次。
212.如实施方案211所述的组合物，其中所述一段时间为约24小时。
213.如实施方案137-212中任一项所述的组合物，其中所述组合物是预防疾病或病况的组合物，并且其中所述预防包括向受试者预防性施用所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸。
214.如实施方案137-213中任一项所述的组合物，其中将编码工程化的tRNA变体的多核苷酸施用于受试者。
215.如实施方案214所述的组合物，其中所述多核苷酸是病毒载体。
216.如实施方案215所述的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。
217.如实施方案216所述的方法，其中所述AAV载体包含基因组，所述基因组包含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。
218.如权利要求216或217所述的方法，其中所述AAV载体包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。
219.如实施方案216-218中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/5载体。
220.如实施方案137-219任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA的多核苷酸存在于递送系统中。
221.如实施方案220所述的组合物，其中所述递送系统包括脂质体，带电聚合物，不带电聚合物，纳米颗粒，表面活性剂，渗透增强剂，基因转移剂，磷脂，胶束，合成载体，大分子，树枝状聚合物，生物聚合物，病毒颗粒或其任何组合。
222.如实施方案137-221中任一项所述的组合物，其还包括施用包含多核苷酸序列或编码所述多核苷酸序列的载体的组合物，其中所述多核苷酸序列包含：(i)募集区和(ii)靶向区，其中所述多核苷酸序列经由所述募集区的至少一部分募集编辑实体，并且其中所述编辑实体当与所述多核苷酸序列和所述mRNA接触时，在所述mRNA的过早终止密码子的核苷酸的碱基上进行化学修饰。从而将过早终止密码子转化为有义密码子。
223.如实施方案222所述的组合物，其中所述编辑实体包含：
a)ADAR多肽；
b)APOBEC多肽；
c)(a)或(b)的生物活性片段；或
d)融合蛋白，其包含(c)的生物活性片段，(a)的ADAR多肽或(b)的APOBEC多肽。
224.如实施方案223所述的组合物，其中所述疾病或病况包括Rett综合征，其中所述mRNA编码MeCP2多肽，其中所述过早终止密码子是乳白终止密码子，其中所述工程化的tRNA是精氨酰tRNA，其中所述受试者是0-6岁的人，并且其中当所述工程化的tRNA变体作为AAV载体施用于所述受试者时，在翻译编码MeCP2多肽的mRNA期间，所述工程化的tRNA变体至少部分地将对过早终止密码子的解读转化为精氨酸有义密码子，并产生基本上全长的MeCP2多肽，从而至少部分地治疗Rett综合征。
225.如实施方案137-224中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含化学修饰，所述化学修饰包括甲基，氟基，甲氧基乙基，乙基，磷酸基，酰胺基，酯基或其任何组合。
226.如实施方案137-225中任一项所述的组合物，其中所述组合物是分离的。
227.药物组合物，其包含实施方案137-226所述的组合物和药学上可接受的赋形剂，稀释剂或载体。
228.分离的细胞，其包含实施方案137-227中任一项所述的组合物。
229.分离的多个细胞，其包含实施方案137-228中任一项所述的组合物。
230.载体，其包含实施方案137-229中任一项所述的组合物的工程化的tRNA变体或编码工程化的tRNA变体的多核苷酸。
231.如实施方案230所述的载体，其进一步包含(例如，以5’到3’顺序):
a)第一启动子；
b)第一定量盒；
c)第二启动子；
d)第二定量盒；
e)第三启动子；
f)转基因，其包含编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸；
g)编码可检测多肽的报告基因；或
h)它们的任何组合。
232.如实施方案231所述的载体，其中所述多核苷酸进一步包含所述启动子上游的5’ITR和所述报告基因下游的3’ITR。
233.如实施方案231或232所述的载体，其中所述可检测多肽包括mCherry，绿色荧光蛋白(GFP)或β-半乳糖苷酶。
234.如实施方案231所述的载体，其中所述第一启动子和第二启动子是U6启动子，其中所述U6启动子任选地被甲基化，或其中U6启动子任选地是小鼠U6启动子。
235.如实施方案231所述的载体，其中所述第三启动子是人巨细胞病毒(CMV)启动子。
236.如实施方案231-235中任一项所述的载体，其是纯化的或分离的。
237.试剂盒，其包含：
a)实施方案137-226中任一项所述的组合物、实施方案227所述的药物组合物、实施方案228或229所述的分离的细胞或实施方案230-236中任一项所述的载体；和
b)容器，其被配置为存储所述组合物。
238.产生实施方案230-236中任一项所述的载体的方法，所述方法包括：将所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸引入主链载体序列的转基因中。
239.产生实施方案227所述的药物组合物的方法，所述方法包括：将所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸引入药学上可接受的赋形剂，稀释剂或载体中。
VI.实施例
以下实施例仅用于说明性的目的，而不是意图限制本发明的范围。
实施例1.工程化的精氨酸tRNA
存在5种天然存在的人精氨酸(Arg)tRNA异构体解码器。在该实施例中，突变5种Arg异构体解码器中的每一种的反密码子序列以识别乳白终止密码子，并将其克隆到主链载体(下文称为Arg-tRNA(UGA)异构体解码器)中。如图1所示，这些载体包含每种Arg-tRNA(UGA)异构体解码器的一个拷贝(左侧)或两个拷贝(右侧)。一个拷贝在人U6启动子之下，另一个拷贝在小鼠U6启动子(mU6)之下。然而，两个拷贝的Arg-tRNA(UGA)异构体解码器保留了它们的内源启动子。每种构建体还含有驱动mCherry标签表达的CMV启动子，以便能够评价转染效率。每种载体还含有反向末端重复(ITR)区，其用于通过qPCR使用对ITR区特异的引物进行定量。图1(右侧)显示了本文所述的构建体，其具有编码工程化的tRNA(UGA)异构体解码器的基因的两个拷贝；图1(左侧)显示了载体的一个实例，该载体仅包含在人U6启动子下而不是小鼠U6启动子下的一个拷贝的编码工程化的tRNA(UGA)异构体解码器的基因。本文所述的载体用于产生工程化的Arg tRNA分子文库以筛查抑制效率。
图2A说明了人Arg tRNA的共有二级结构。图2B说明了人Arg tRNA的共有二级结构和序列中的位点，其被排除在产生本文公开的工程tRNA的诱变之外。人Arg tRNA的共有二级结构及其序列。根据一些实施方案，划掉的残基(具有黑线)表示高度保守的位置/核苷酸，其被排除，同时选择用于制备工程化的抑制性tRNA靶向诱变的推定位点。
实施例2.工程化的tRNA分子的mRNA编辑效率
K562细胞中断裂的荧光素酶筛查
将K562细胞进行工程改造以稳定地表达被R41X(图10A中的中的中间条带))或R73X(图10A中的底部条带)过早乳白终止密码子断裂的萤光素酶基因，其中X代表乳白终止密码子(图10A)。图39显示了与野生型(WT)萤光素酶相比，以及以野生型活性的百分比显示的由于一些这样的突变而导致的萤光素酶活性损失的实例。破坏的萤光素酶转染过程的示意图可在图10B中提供。氨基酸位置可以相对于编码荧光素酶的全长模板mRNA。用Arg-tRNA(UGA)异构体解码器对这些工程化的细胞进行核转染(SF缓冲液，FF120程序，每孔1μg DNA，每孔200K细胞)，如上所述对于两个生物重复中的每一个重复两次。转染后48小时，通过Promega
Figure BDA0003752489830001561
萤光素酶测定系统(N1110)，使用50μl培养基测量萤光素酶，并根据制造商的说明书，通过Qiagen RNeasy Plus试剂盒(74136)从细胞裂解物中分离mRNA。用于携带mCherry的工程化的tRNA及其变体的载体设计的示意图显示在图14A中。载体携带位于两个U6启动子上游的两个拷贝的工程化的tRNA或其变体。一个是人U6(hU6)启动子，另一个是小鼠U6(mU6)启动子。使用瞬时转染进行筛查。通过Varioskan LUX以1000ms的测量时间获得萤光素酶读数。使用TaqMan Fast Advanced Master mix(ThermoFisher 4444557)和FAM缀合的TaqMan探针(Mr07319439_mr)通过定量PCR(Biorad CFX Connect)获得mCherry的mRNA表达。mCherry mRNA表达以一式两份的技术重复测量。一个技术重复含有管家基因Hprt，另一个技术重复含有管家基因Gapdh(VIC缀合的TaqMan探针)。将这些技术重复取平均值，然后用于将来自其相应孔的荧光素酶读数标准化，作为转染效率的对照。每个数据点代表如图10C所示的两个生物重复的平均值和平均值的标准误差(+/-SEM)。
HEK293细胞中的断裂GFP筛查
使用如上所述的图14A所示的载体，以及含有被R74X或R97X过早终止密码子断裂的GFP基因(ST21主链)的构建体(300ng)，用Arg-tRNA(UGA)异构体解码器(300ng)(例如，来自一组20种Arg-tRNA(UGA)异构体解码器)转染HEK293s，其中X代表乳白终止密码子(图11A)。氨基酸位置可以相对于编码GFP的全长模板mRNA。ST21(例如SEQ ID NO:51)载体图谱提供于图11E中。使用TransIT293试剂(Mirus Bio MIR2705)，根据制造商的说明书，以与DNA的2:1比率实现转染。每孔铺板30K至60K个细胞，并且每孔的细胞数在每一生物重复内保持恒定。48和72小时后，用活力染料Zombie Violet以1:2000稀释度对细胞染色15分钟，然后通过流式细胞术进行分析。选择细胞(例如使用流式细胞术FACS机门控)以去除碎片，双联体和死细胞(Zombie Violet阳性)。每种Arg-tRNA(UGA)异构体解码器的等级顺序在48和72小时时间点之间是相同的，然而GFP表达的强度在48小时时间点是较高的。这样，在图11B-11D中所示的图都反映了48小时的数据。每个数据点代表三个生物重复的平均值和平均值的标准误差(+/-SEM)，如图11B-11D所示。在图11B-11D中，基于mCherry进一步选择活细胞(例如，通过流式细胞术FACS门控)以选择已经接受Arg tRNA抑制分子的活细胞群，然后通过GFP选择表现出工程化的断裂GFP基因读通的含有Arg tRNA抑制分子的细胞群(tRNA+)。图11F示意性地显示了双转染系统，其中HEK293s用Arg-tRNA (UGA)异构体解码器(300ng)(例如，来自一组20种Arg-tRNA(UGA)异构体解码器)以及含有被R74X或R97X过早终止密码子断裂的GFP基因(ST21主链)的构建体(300ng)转染，其中X代表乳白终止密码子；R74X或R97X在图11A中显示。结果的分析显示在图11B中。在图11B中，y轴描绘了GFP阳性(GFP+)细胞的百分比，其可以表明已经接受Arg tRNA抑制分子的细胞(tRNA+细胞)可以发生读通。在20种V1.0异构体解码器的14种中，50％或更多的表达工程化的tRNA的细胞存在PTC抑制。在图11C中，y轴显示通过将用断裂的GFP和工程化的Arg tRNA抑制分子转染的细胞中的GFP平均荧光强度(MFI)标准化至用未断裂的GFP转染的细胞(对照细胞)中的GFPMFI而抑制的PTC的总百分比。在20种V1.0异构体解码器的8种中，70％或更多的PTC在显示读通的细胞中被抑制。图11G示意性地显示了使用携带mCherry标签的Arg tRNA抑制物与未断裂的GFP相比抑制断裂的GFP中的乳白终止密码子的过程，用于产生图11C所示的结果。在图11D中，y轴显示了如通过mCherry表达所测量的，用断裂的GFP和工程化的Arg tRNA抑制分子转染的细胞中的GFP MFI，标准化至用工程化的Arg tRNA抑制分子转染的细胞。使用这种tRNA效力的代理，相比它们另外可以进行的，20种V1.0异构体解码器中的5种可以采用相对较少的tRNA来抑制PTC。图11D中所示的20种工程化的tRNA中的4种(各自包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中的一项)的荧光成像数据提供于图12中。所用的ST21主链质粒的序列如SEQ ID NO:51所示。
图12显示了基于细胞中的GFP产生，鉴定Arg-tRNA(UGA)异构体解码器(例如，包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之一的工程化的tRNA)的低效率，中等效率或高效率抑制活性的流式细胞术结果。基于mCherry选择活细胞(例如，通过流式细胞术FACS门控)以选择已经接受Arg tRNA抑制分子的活细胞群，然后通过GFP选择表现出工程化的断裂GFP基因读通的含有Arg tRNA抑制分子的细胞群(tRNA+)。图12中的y轴显示mCherry表达，表明用工程化的Arg tRNA抑制分子转染的细胞，而x轴显示GFP表达，表明用断裂的GFP转染的细胞。高GFP表达表明通过Arg tRNA抑制分子成功地读通了断裂的GFP基因中的过早终止密码子。换句话说，抑制性tRNA(Arg-tRNA(UGA)异构体解码器)的较高活性可导致由存在相对较少的tRNA分子产生的由断裂的GFP基因产生较高水平的GFP。效力的代理可以通过检查图的曲线来观察。20种工程化的tRNA的荧光成像结果的分析提供于图11D中，如本文所述。
实施例3.Arg异构体解码器中的突变产生更好的抑制效率
为了阐明各种突变在本文所述的其变体(或Arg tRNA异构体解码器)中的作用，将10种突变引入到具有反密码子序列“CCT”的工程化的tRNA SEQ ID NO:3的工程化的tRNA序列中以产生工程化的tRNA变体SEQ ID NOS:23-32，其在图3A中图示说明。被认为稳定受体茎的突变包括但不限于G1T72至G1C72、C2G71至G2C71和/或A6T67至G6C67。认为稳定工程化的tRNA的D-茎区的突变包括但不限于T13A22至C13G22。被认为稳定反密码子茎的突变包括但不限于T28A42至C28G42。被认为稳定T-茎的突变包括但不限于T50A64至C50G64。与人tRNA的共有A-box启动子序列匹配的突变包括A15至G15。与人Arg tRNA的共有反密码子茎序列匹配的突变包括C31G39至A31T39。共有序列可以在比对所有人Arg tRNA异构体解码器时产生(例如，如图2所示)。20条独特的Arg tRNA序列中的14条具有A31T39，因此提供了共有序列的这种碱基对部分。然而，CCT异构体解码器具有C31G39，其被修饰以匹配共有A31T39，以便评估抑制效率。与共有人Arg序列匹配的突变包括G44A。进行包括A37G在内的突变，其改变正好在反密码子下游的+1位。反密码子区可以包含碱基34至36。+1位可以被认为是37位，因此进行突变A37G以评价改变紧挨着反密码子区右侧的碱基对抑制效率的影响。
类似地，在具有反密码子序列“TCT”的SEQ ID NO:6的工程化的tRNA序列中引入14种突变，以产生14种工程化的tRNA变体，其各自包括SEQ ID NO:35-48的序列，其在图3B中图示说明。表3中提供了亲本tRNA SEQ ID NO:6及其14种变体的序列SEQ ID NO:35-48。可以认为，稳定受体茎的突变包括但不限于G2T71至G2C71、G2T71至C2G71、T4A69至C4G69。与共有Arg tRNA序列相比，被认为稳定反密码子茎的一些示例性突变包括T28A42至C28G42、G30T40至G30C40、T27A43至C27G43、或A31T39至C31G39(例如，在工程化的tRNA变体SEQ IDNOS:37、42、48、29、31中)。在SEQ ID NO:36中，可以将C49改变为G49以部分匹配共有ArgtRNA序列，并且在SEQ ID NO:27中，A15改变为G15以匹配所有人tRNA，而不仅仅是Arg tRNA序列的共有A-box序列。表3提供了变体tRNA序列。与工程化的tRNA序列中的共有序列匹配的突变包括但不限于C49至G49、C50G64至T50A64、G12C23至C12G23或G46A。对SEQ ID NO:6进行的以匹配SEQ ID NO:3的突变包括C6G67至A6T67、A44G和T27A43至C27G43。与其它TCT异构体解码器序列(例如SEQ ID NOS:9-012)匹配的突变包括C6G67至T6A67。制备含有上述突变的变体以评价这些变化对工程化的tRNA的抑制效率的影响。
实施例4.为了抑制效率而筛查工程化的tRNA分子
如实施例1所述，将如本文所述的工程化的抑制性tRNA克隆到包含mCherry标签的质粒载体中。该过程的示例性工作流程可以在图4中示出。将质粒转染到HEK293(或HEK细胞)中，HEK293(或HEK细胞)是来源于人胚胎肾细胞的细胞系。使用PiggyBac(PB)转座子系统，通过无义突变(例如，在R74X或在R97X)将断裂的绿色荧光蛋白(GFP)基因稳定地整合到包含过早终止密码子的HEK细胞染色体DNA中。在以下实施例中，使用1:5或1:2.5的PB转座酶与转座子比率转染HEK细胞。每个数据点代表一个生物重复的平均值和标准偏差(+/-SD)。
图5A显示了在如图4所示的携带断裂GFP基因的HEK细胞中筛查抑制性tRNA的示意性工作流程。HEK细胞(以20,000个细胞/孔的浓度接种)在48小时时使用300纳克(ng)编码工程化的(抑制性)tRNA的质粒或不含抑制性tRNA的对照质粒转染。将具有工程化的tRNA的ST21主链以及未断裂的GFP质粒用作阳性对照(或基准)，所述工程化的tRNA包含SEQ IDNO:3或6的序列。将无活性的tRNA质粒(例如，包含SEQ ID NO:8的序列，或SEQ ID NO:18的序列)以及编码GFP的质粒(ST21)用作阴性对照。基于单一染色和未转染的细胞设定流动门控。转染后48小时使用流式细胞术评估读通以测量还呈GFP阳性的tRNA-mCherry阳性细胞的分数。在活细胞群中进行测量。
图5B显示了对于包含来自工程化的tRNA SEQ ID NO:3或6的工程化的tRNA变体的工程化抑制性tRNA变体以及阳性和阴性对照质粒，在R74X(黑色方框)和R97X(灰色方框)中tRNA和GFP阳性细胞的百分比比率。所有变体都显示出保留的抑制活性。包含SEQ ID NO:32序列的工程化的tRNA变体(502)显示出约70％的抑制活性(终止密码子读通)。使用灰色方框501显示具有至少约60％抑制活性的变体。将40,000个细胞/孔和1:5的转座酶：转座子比率用于本研究。数据显示每种GFP构建体重复一次。
研究R74X和R79X突变(其中X代表乳白终止密码子)之间的抑制活性的相关性，以发现由于突变位置引起的差异。图5C显示了R2值为约0.88的相关性。结果显示了抑制活性基本上与精氨酸突变的位置无关。另外，一些高性能工程化的tRNA变体各自包括SEQ IDNOS:32、39、40、45、47和34的序列之一。具有至少约60％抑制活性的工程化的tRNA变体(图5B中的灰色方框501)在图5C中使用椭圆形511来标记。
在三种稳定细胞系中重复类似的实验，包括在具有稳定整合断裂的GFP(其包含R74X和/或R97X的过早终止密码子)的细胞中的1:5的PB转座酶与转座子比率，和在整合GFP(其具有包含R74X的过早终止密码子)的细胞中的1:2.5的PB转座酶与转座子比率。将GFP和mCherry阳性细胞(表示携带工程化的抑制性tRNA变体的细胞)的百分比读通的比率与阳性对照(例如，包含SEQ ID NO:3的序列)进行比较(或用其归一化)。数据点代表跨越3种不同细胞系-R74X(1:2.5)、R74X(1:5)和R97X(1:5)的平均值+/-平均值的标准偏差(SD)。结果显示于图6中。平均值以黑色方框显示，误差棒表示SD值。所有变体在所有三种细胞系中都显示出保留的抑制活性。
实施例5.工程化的tRNA分子的双质粒筛查
如本文所述，将编码工程化的tRNA的DNA序列并入包含mCherry标签的载体中。还提供了包含断裂的GFP标签的第二质粒。用工程化的tRNA质粒和GFP质粒共转染HEK细胞。使用嘌呤霉素处理(5μg/mL)10-12天，选择具有稳定整合质粒的细胞的断裂的GFP构建体的整合。具有稳定整合了携带工程化的tRNA的质粒的细胞表达工程化的tRNA和mCherry。稳定整合了两种质粒的细胞表达GFP和mCherry。图7显示了用两种质粒共转染细胞和选择两种质粒稳定整合的细胞的过程的示意图。在转染后48小时进行流式细胞术。
实施例6.使用双质粒系统测量抑制效率
将40,000个HEK细胞接种在孔中。接种后24小时，用300纳克(ng)的每种质粒转染细胞，如实施例5所述。在转染后48小时对细胞进行流式细胞术。测量GFP和mCherry在两个质粒稳定整合的细胞中的几何平均荧光强度。图8A显示了在两种不同的表达工程化GFP的HEK细胞系中，使用图7所示的双质粒筛查系统，在读通百分比(显示绿色荧光的tRNA/mCherry产生细胞的分数)方面测量的，通过工程化的Arg tRNA抑制分子对过早终止密码子抑制的示例性结果，所述细胞系含有两种不同的Arg-至-终止密码子突变(R74X和R97X，其中X代表乳白终止密码子)。在位置74和97(R74X和R97X)具有不同精氨酸突变的细胞之间建立了R2为约0.99的非常高的相关性(图8B)。高相关性显示工程化的tRNA抑制活性在不同的精氨酸位置处基本上保留了。这些结果表明，使用灰色方框801显示的，几种工程化的tRNA或工程化的tRNA变体(例如，包括SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:5的序列)在转染到细胞中后产生高百分比的具有PTC读通的细胞(超过90％的tRNA +细胞)。
基于mCherry表达水平将来自本文所述的相同实验的结果归一化以评价过早终止密码子抑制的效率。因此，可以通过将GFP信号的平均荧光强度(由工程化GFP中的终止突变的读通产生)归一化至mCherry信号的平均荧光强度(其与tRNA表达水平相关)来评价抑制效率。图9A显示了通过双质粒筛查系统，在携带两种不同的Arg-至-终止突变(R74X和R97X，其中X代表乳白终止密码子)的HEK细胞系中过早终止密码子抑制的效率。在含有Arg-至-终止突变：R74X和R97X的两种不同的工程化GFP报告基因之间建立了R2为约0.89的高相关性(图9B)。高相关性显示工程化的tRNA抑制效率在不同的精氨酸位置处基本上保留了。总的来说，如本文公开的实施例中所述，本文公开的HEK细胞中抑制性tRNA活性的结果显示了一组除反密码子突变之外的突变，其可以保持和/或增强精氨酸异构体解码器中的抑制性tRNA活性。各自包含SEQ ID NO:3、32、34、39、45和47的序列的多种工程化的tRNA或其变体在断裂的GFP报道系统的稳定和瞬时表达中都显示出高的精氨酸抑制活性(或终止密码子读通)。具有图5B(502)和图6所示的序列SEQ ID NO:32的tRNA的结果显示，存在于SEQ IDNO:32中的突变(T50A64->C50G64)可进一步稳定SEQ ID NO:3tRNA并可导致改善的抑制活性(例如效率)。在另一个实例中，在天然存在的异构体解码器SEQ ID NO:6的相同位置处，G-C碱基对改变为A-T碱基对(例如，在包含SEQ ID NO:37的序列的工程化的tRNA变体中)可以降低tRNA的精氨酸抑制活性(例如，精氨酸抑制效率)。在一些实例中，包括在SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34中的A73G突变提高了抑制物效率。其也可以在结果(图5B、6、8A和9A)中示出。将G-T非Watson-Crick对改变为受体茎中的G-C Watson Crick对或改变为反密码子茎中的C-G Watson Crick对，如SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：45中进行的，能够稳定所述受体茎/反密码子茎；与G-C相比，C-G键被证明在2-71位是非常优选的。
实施例7.Rett综合征模型
在从R255X Rett模型小鼠收获的原代神经培养物中测试选择的工程化的tRNA。图14B显示了用于原代神经培养物的载体设计的草图描绘。载体包含位于人U6(hU6)启动子上游的所选择的工程化的tRNA或其变体的拷贝。将载体包装到慢病毒(pSMPUW)中。
选择的工程化的tRNA包括8种工程化的tRNA，每种包含选自SEQ ID NOS:6、9、10、11、20、3、7和13的序列之一，它们在断裂的荧光素酶筛查实验中产生高荧光素酶信号，以及在断裂的GFP筛查实验中产生高GFP信号。在相同的实验中产生最低信号的两种工程化的tRNA，每种单独包含SEQ ID NOS:19或8的序列，被用作阴性对照。
为了收获从R255X Rett模型小鼠收获的原代神经培养物，从与相同小鼠品系的野生型雄性小鼠杂交的R255X杂合雌性(Jackson Laboratory，库存#012602)取出生后0-2天的小鼠幼仔。将幼仔安乐死以收集脑和皮肤样品。皮肤样品用于基因分型。分离脑并去除小脑。将剩余的脑用木瓜蛋白酶消化，用Lo Ovomucoid和DNase洗涤，解离，并通过70微米滤器过滤。细胞培养物在第二天用表达所选工程化的tRNA的慢病毒感染，如本文所述。在解剖后一周(转染后6天)收获细胞。在含有蛋白酶抑制剂(ThermoFisher 78444)的RIPA缓冲液中使用机械解离对细胞进行蛋白质纯化过程。通过使用针对MeCP2的C-末端的抗体(Thermofisher 49-1049)进行免疫印迹来测量MeCP2蛋白水平。MeCP2蛋白的检测用于检查R255X的工程化的tRNA读通。图15A说明了代表性的蛋白质印迹实施例，其显示包含SEQ IDNO:19序列的工程化的tRNA(阴性对照)缺乏读通，并显示分别包含SEQ ID NO:20、3和7序列的工程化的tRNA在不同水平上的成功读通。图15B显示由每个样品中的Gapdh信号归一化，然后至野生型对照的的MeCP2 EC1信号的直方图。每列代表工程化的tRNA读通，并且每列中的每个数据点(黑圈)代表从不同小鼠收集的数据。数据表示平均值+/-SEM(误差条)。
在另一项研究中，如本文所述的原代神经培养物用四种工程化的tRNA及其变体(例如SEQ ID NOS:8、39、45和7)处理。流式细胞术结果示于图16A-16F中。分离后5天感染神经元培养物，并在分离后1周(感染后48小时)通过流式细胞术分析。病毒载体设计可示于图14B中，并使用慢病毒递送。选择单个活细胞。然后进行进一步的选择(流式细胞术门控)以门控神经元(NeuN+细胞)，其也具有mCherry信号(mCherry+)，表明存在工程化的tRNA(tRNA+细胞)，最后是MeCP2抗体信号。对于图16A-16F中的不同处理组，所选择的群体使用梯形示出。未处理的R255X细胞(图16A)没有mCherry+细胞，因为它们没有被表达mCherry的慢病毒转导。用工程化的tRNA SEQ ID NO:8处理的R255X细胞显示可忽略的MeCP2+群体(图16B)。用工程化的tRNA变体(例如SEQ ID NO:39)(图16C)，工程化的tRNA变体SEQ ID NO:45(图16D)，或工程化的tRNA SEQ ID NO:7(图16E)处理的R255X细胞显示MeCP2阳性群体的相应增加。事实上，用工程化的tRNA SEQ ID NO:7处理的细胞中的MeCP2+群体分布与用工程化的tRNA SEQ ID NO:8感染的野生型(WT)群体相当，所述野生型(WT)群体用作阴性对照(图16F)。WT对照组用于确认流式细胞术过程中的门控策略。
使用来自与相同小鼠品系的野生型雄性小鼠杂交的R255X杂合雌性(JacksonLaboratory，库存#012602)的细胞培养物进一步验证本文用于测量神经元中MeCP2表达的流式细胞术。如本文所述产生培养物。图17A-17D说明了使用抗体D4F3的MeCP2信号结果。细胞信号转导MeCP2抗体D4F3证明了野生型(WT)神经培养物中的强表达(图17A)，在R255X杂合雌性中大约为野生型表达的一半(图17B)，并且在R255X雄性(图17C)或未染色的样品(图17D)中没有可检测的表达。图17E-17H说明了使用抗体Sigma NeuN抗体MAB377的MeCP2信号结果。Sigma NeuN抗体MAB377在未染色的对照LUHMES(LUH)细胞(图17E)或未染色的原代培养物(图17H)中不产生信号。然而，它几乎对所有分化的LUHMES细胞染色(图17F)，其作为阳性对照，给予该细胞系在用强力霉素处理以终止v-myc转基因后经历的完全分化。在原代神经培养物中(图17G)，该NeuN抗体染色约60％的所有细胞，对应于神经元1701与其它神经细胞类型1702(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)的预测比率。
在另一个实验中，从如本文所述的R255X Rett模型小鼠中分离原代神经培养物。分离后5天，用携带构建体的慢病毒感染神经培养物(图14B)，所述构建体包含9种选择的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体序列中的一个：SEQ ID NOS：39、28、34、40、7、45、6、32或3。感染后2天分析细胞培养物，如图17A-17H所示。描述表达MeCP2的慢病毒(mCherry+)转导的神经元(NeuN+)的百分比的直方图可在图18A中说明。几乎60％的由携带工程化的tRNA SEQID NO:3的慢病毒转导的神经元显示出MeCP2信号。这种MeCP2表达水平可以与野生型细胞相当，其中MeCP2在约70％的转导神经元中表达。图18B显示了转导2天后的细胞中被抑制的PTC的总百分比。将用携带如本文所述的构建体的慢病毒转导的细胞中MeCP2的平均荧光强度(MFI)归一化至从野生型小鼠分离的神经培养物中的MeCP2 MFI。包含SEQ ID NO:6序列的工程化的tRNA可抑制约65％的PTC(在细胞中产生65％的MeCP2)。
实施例8.载体设计
设计了7种不同的载体来检查(I)外源启动子是否增强了tRNA的产生，从而增强了效力，(II)拷贝数是否增强了tRNA的产生，从而增强了效力。图19A-19G显示了携带一个，两个或三个拷贝的工程化的tRNA SEQ ID NO:3的七种不同的构建体。构建体包含mU6、hU6或其组合。用包含1-6个拷贝的SEQ ID NO:3(300ng)序列的工程化的tRNA(其具有或不具有上游hU6)转染HEK293s(图19A–图19G显示了具有1-3个拷贝的工程化的tRNA抑制物的构建体的示例性示意图)。构建体还包含被R74X或R97X过早终止密码子断裂的GFP基因(ST21主链)(300ng)，其中X代表过早终止密码子，类似于图11A所示的基因。使用TransIT293试剂(MirusBio MIR2705)根据制造商的说明书以与DNA的3:1的比率实现转染。每孔铺板50K个细胞。进行两个生物重复。使用流式细胞术，门控细胞以去除碎片，双联体和死细胞(ZombieViolet阳性)。然后，通过mCherry进一步门控活细胞以选择已经接受工程化的tRNA的活细胞群体，然后通过GFP门控活细胞以选择表现出工程化的断裂GFP基因的读通的含有工程化的tRNA的细胞(tRNA+)的群体。图20A显示也表达GFP(表明可以发生读通)的tRNA+细胞的百分比。结果显示上游hU6启动子没有提供比tRNA内部启动子明显的益处。图20B显示通过将用断裂的GFP转染和工程化的tRNA转染的细胞中的GFP平均荧光强度(MFI)归一化至用未断裂的GFP转染的细胞(对照细胞)中的GFP MFI的被抑制的PTC的总百分比。如图20B所示，较高的tRNA拷贝数导致更多的PTC抑制。
实施例9.治疗Rett综合征
可以将使用GFP筛查鉴定的Arg-tRNA异构体解码器克隆到AAV载体中。可以将AAV载体转染到含有AAV辅助载体的哺乳动物细胞系中以产生含有编码Arg-tRNA异构体解码器的转基因的AAV病毒颗粒。AAV载体的实例包括但不限于AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体，或AAV2/9载体，或本文所述的任何AAV载体。
在患有Rett综合征的受试者中施用不同剂量的AAV，所述Rett综合征是由于编码MeCP2多肽的mRNA中的R168X、R225X、R270X、R294X、R198X、R186X和R453X突变引起，其中X代表UGA乳白终止密码子。监测受试者在治疗过程中Rett综合征的病状改善。病状的改善是由于Arg-tRNA异构体解码器对过早终止密码子的抑制，导致终止密码子的读通和响应于过早终止密码子而将精氨酸插入到MeCP2多肽中。
实施例10.治疗耳聋
如上所述制备的AAV载体可用于治疗患有耳聋的受试者，所述耳聋是由于编码MYH9多肽的mRNA中的R1933X突变，编码COL11A2多肽的mRNA中的R845X突变，或编码MYO7A多肽的mRNA中的R666X突变引起，其中X代表UGA乳白终止密码子。使用测听测试监测受试者在治疗过程中耳聋病状的改善。病状的改善是由于Arg-tRNA异构体解码器对过早终止密码子的抑制，导致终止密码子的读通和响应于过早终止密码子而将精氨酸插入到MYH9、COL11A2或MYO7A多肽中。
实施例11.自身互补的载体的设计
图24至图28B中所示的数据如下收集：使用piggybac系统以1:5和1:2.5的转座酶与转座子的比率将包含R74X(STX488)或R97X过早终止密码子(STX489)的断裂GFP构建体稳定地整合到K562细胞中，每种断裂的精氨酸产生两个独立的piggybac细胞系。在使用前使用5μg/mL嘌呤霉素选择含有piggybac有效载荷的细胞至少8天。将包含不同拷贝数的包含SEQ ID NO:3序列的工程化的tRNA的构建体克隆到单链或自身互补的主链中。将这些构建体包装到AAV2/9中。表5描述了构建体。用100万vg/细胞的病毒感染具有断裂GFP构建体piggybac整合的K562细胞(在96孔格式的每孔中，50K个)。48小时后通过流式细胞术分析细胞。每个数据点是生物重复(n＝2-3)。重复中的两个来自1:5整合，第三个来自1:2.5整合。数据表示平均值+/-SEM。
表5.用于图24-28B中的构建体
Figure BDA0003752489830001671
Figure BDA0003752489830001681
图24显示了说明用于图25至图28B的门控策略的草图。所显示的代表性样品是自身互补的填充序列(sc 0x)。对细胞进行门控以去除碎片，双联体和死细胞(Zombie Violet阳性)。通过mCherry进一步门控活细胞以选择已经接受Arg tRNA抑制分子的活细胞群体，然后通过GFP选择表现出工程化的断裂GFP基因读通的含有Arg tRNA抑制分子的细胞群(tRNA+)。
图25显示了自我互补的AAV2/9的代表性流程图，所述自我互补的AAV2/9包装了0、1、3或6个拷贝的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA。y轴表示还表达GFP(表明正发生读通)的tRNA+细胞的百分比。x轴表示侧向散射。当用表达0x(仅填充序列)或1x个拷贝的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的AAV2/9转导细胞时，不存在断裂的GFP构建体(在此显示了R97X)的读通。相比之下，在用表达3x或6x个拷贝的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的AAV2/9转导时，大约有60-70％的读通。
图26显示了用100万vg/细胞的病毒转导具有断裂GFP构建体piggybac整合的K562细胞不改变细胞活力。这里，对细胞进行门控以去除碎片，双联体和死细胞(Zombie Violet阳性)。在未感染和感染的细胞中，活力为约90-100％。
图27A和图27B显示了具有不同拷贝数的tRNA的单链和自身互补的AAV的转导效率。如图27A所示，表达mCherry的活细胞的百分比，表明细胞已被特定的AAV转导。图27B显示了在转导(mCherry+)且表现出PTC抑制(GFP+)的细胞中mCherry的平均荧光指数。尽管在这些样品的每一个中病毒载量均归一化(100万vg/细胞)，但与3x或6x病毒相比，1x AAV转导更多的细胞且处于更高的水平。单链主链几乎不提供转导效率。
图28A和图28B显示了每个测试组的过早终止密码子的读通图。在图28A的图中，y轴代表表现出PTC抑制的接受特定tRNA的细胞的百分比。包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的3x和6x形式在50-85％的表达R97X的转导细胞中产生读通并在90-100％的表达R74X的转导细胞中产生读通。在图28B的图中，y轴显示通过将用工程化的Arg tRNA抑制分子转导的细胞中的GFP平均荧光强度(MFI)归一化至用未断裂GFP转染的细胞(对照细胞)中的GFP MFI而抑制的PTC的总百分比。6x的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的自身互补形式证明了优于单链形式的读通。然而，3x的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的自身互补形式比6x的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的自身互补形式表现得更好。每个数据点是生物重复(n＝2-3)。数据表示平均值+/-SEM。
设计AAV2/9载体以携带6(图21A)、3(图21B)或1(图21C)个拷贝的包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA。AAV载体由单链主链(图22A)或自身互补的主链(图22B)制成。单链主链包括大量填充AAV载体的填充DNA 2201、2202或2203。构建体包括驱动mCherry标签表达的CMV启动子。为了研究自身互补的主链设计的效率，将表达0、3或6个拷贝的在自身互补主链中的包含SEQ ID NO:3序列的工程化的tRNA的AAV9载体，以3*10^10vg/脑的滴度，单侧注射到雄性R255X小鼠0-2日或5-8日龄的幼仔的侧脑室(ICV)中(对于样品大小参见表6)。对照小鼠包括未注射的R255X小鼠(包括2只小鼠(n＝2))，和注射的WT小鼠(0x构建体)(4只小鼠(n＝4))。将脑显微解剖成3个区域(海马，皮层和脑的其余部分)并加工用于流式细胞术以评估转导细胞(mCherry+)中全长MeCP2的表达。
表6.tRNA拷贝数研究设计
Figure BDA0003752489830001701
实施例12.具有间隔序列的载体设计
测试在载体构建体中使用不同长度的间隔区将工程化的tRNA或其变体置于反向末端重复序列(ITR)之间对工程化的tRNA的读通效率的影响。在图23A中示意性地显示了具有置于距ITR不同距离处的工程化的tRNA或其变体的AAV主链的例子。所述载体包含AAV载体，所述AAV载体具有包含SEQ ID NO:3序列的工程化的tRNA的三个拷贝。工程化的tRNA或其变体的三个拷贝被6、50、100、200或500个核苷酸间隔序列分开。间隔序列可以包含AACAAA的6核苷酸接头序列或TTTTTT的终止序列。间隔序列可以包括本文公开的填充序列。接头序列基于在水稻中发现的双顺反子tRNA-sncRNA。本文所述的研究设计的实例提供于表6中。
图29A和29B显示了K562细胞中质粒转染的结果，所述K562细胞具有包含不同的间隔区长度的载体设计。使用piggybac系统以1:5和1:2.5的转座酶与转座子的比率，将包含R74X(STX488)和/或R97X过早终止密码子(STX489)的断裂GFP构建体稳定地整合到K562细胞中，每种断裂的精氨酸产生两个独立的piggybac细胞系。在使用前使用5μg/mL嘌呤霉素选择含有piggybac有效载荷的细胞至少8天。将包含2个拷贝的SEQ ID NO:3工程化的tRNA和6个碱基对间隔区的2x构建体，或包含3个拷贝的SEQ ID NO:3工程化的tRNA和50(STX617)、100(STX618)、200(STX619)或500(STX620)个碱基对的不同间隔区长度的间隔区的3x构建体克隆到自身互补的主链中。将这些构建体核转染到上述K562细胞中(SF缓冲液，FF120程序，每孔1μg DNA，每孔200K个细胞)。由于500bp间隔区构建体的大小限制，mCherry不包括在该主链中。72小时后通过流式细胞术分析细胞。对细胞进行门控以去除碎片，双联体和死细胞(Zombie Violet阳性)。通过GFP进一步门控活细胞以选择表现出工程化的断裂GFP基因的读通的细胞群。重复中的两个来自1:5整合，第三个来自1:2.5整合。每个数据点是生物重复(n＝3)。数据表示平均值+/-SEM。
在图29A中，y轴表示表现出PTC抑制的细胞的百分比。包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA的100和200bp间隔区形式在60-95％的表达任一断裂精氨酸残基的转导细胞中产生读通。相比之下，具有50bp和500bp间隔区的SEQ ID NO:3构建体对R97X系表现出降低的效率。在图29B中，y轴显示通过将用工程化的Arg tRNA抑制分子转染的细胞中的GFP平均荧光强度(MFI)归一化至用未断裂GFP转染的细胞(对照细胞)中的GFP MFI而抑制的PTC的总百分比。同样，具有100或200bp间隔区的SEQ ID NO:3构建体表现出最高的GFP强度。
另外，测试AAV构建体中包含SEQ ID NO:3序列的工程化的tRNA的方向对工程化的tRNA的读通效率的影响。在图23B-23C中显示了以不同方向置于AVAV主链中的工程化的tRNA或其变体的实例。图30A和30B包括具有不同位置或方向的工程化的tRNA的构建体的数据。
将相对于ITR具有不同位置的1×SEQ ID NO:3构建体克隆到自身互补的主链中(表7)。将这些构建体包装到AAV2/9中。使用piggybac系统以1:5的转座酶与转座子的比率，将包含R74X(STX488)或R97X过早终止密码子(STX489)的断裂GFP构建体稳定地整合到K562细胞中。用100万vg/细胞的病毒感染具有断裂GFP构建体piggybac整合的K562细胞(每孔50K，96孔格式)。48小时后通过流式细胞术分析细胞。对细胞进行门控以去除碎片，双联体和死细胞(Zombie Violet阳性)。通过GFP进一步门控活细胞以选择表现出工程化的断裂GFP基因的读通的细胞群。每个数据点是生物重复(n＝3)。数据表示平均值+/-SEM。将实验组与未断裂的GFP(标记为ST21；阳性对照)和无转导(阴性对照)进行比较。
表7.用于图30A和30B中的构建体
Figure BDA0003752489830001721
实施例13.工程化的tRNA的体内表征
设计在小鼠中的体内实验以进一步确定工程化的tRNA或其变体在不同细胞类型和/或不同脑区域中进行终止密码子读通，监测毒性和读通效率的效率。用表达包含SEQ IDNOS:3、6、7、32或45的序列的工程化的tRNA或其变体的AAV(例如AAV2/9)，以3×1010个载体基因组(vg)/脑的剂量，双侧注射5-8日龄的雄性野生型(WT)、R255X和R168X小鼠的侧脑室(ICV)中。测试小鼠在高架十字迷宫(EPM)和套入试验上的表现，并在注射后3周安乐死。将一个脑半球显微解剖成海马，皮层和脑的其余部分，并解离以通过流式细胞术评估全长MeCP2。另一半球可用于免疫组织化学(IHC)，蛋白质印迹或mRNA分析。mCherry将存在于AAV中。该群组将证明在每个脑区域和神经细胞类型中MeCP2读通的程度，毒性，并确定过早终止密码子读通的程度。本文所述的研究设计的实例提供于表8中。
表8.工程化的tRNA研究设计的体内表征
Figure BDA0003752489830001731
实施例14.工程化的tRNA的体内功效研究
设计在小鼠中的体内实验以分析所选择的工程化的tRNA或其变体的功效。将选择来自实施例9的显示出最高性能的两种工程化的tRNA或其变体。用表达从实施例9鉴定的前两种工程化的tRNA或其变体的AAV(例如AAV2/9)，以3×1010个载体基因组(vg)/半球的剂量，单侧注射0-2日龄的雄性WT、R255X和R168X小鼠的侧脑室(ICV)中。小鼠将经历完全的行为分析，包括套入、开放场地测试(OFT)、高架十字迷宫(EPM)、条件和上下文恐惧条件以及感觉运动测试。小鼠将在注射后2个月被安乐死，或者可以进行寿命分析。对一个脑半球进行显微解剖并解离，以通过流式细胞术评估全长MeCP2。另一半球可用于免疫组织化学(IHC)，蛋白质印迹和/或mRNA分析。mCherry将不存在于AAV中。该实验将证实在每个脑区域和神经细胞类型中的MeCP2读通的程度是否足以影响行为结果。我们还将通过收集和分析来自中央脊髓液，血浆，血清，肝，肾，肺或心脏的样品来监测任何毒性迹象。本文所述的研究设计的实例提供于表9中。
表9.工程化的tRNA研究设计的体内功效研究
Figure BDA0003752489830001741
实施例15.示例性质粒
可用于本文所述的方法和组合物的核酸构建体的一些非限制性实例包括在表10和图47A-47E中。这些构建体的各个特征可单独使用或与其它构建体或实施方案的特征组合使用。包含pscAAV-scITR-0x-CMVmChSV40-lambda-strw2-wtITR2的核酸构建体可适于编码本文所述的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体。
表10.载体图谱和质粒序列
Figure BDA0003752489830001742
实施例16.间隔序列
一些实施方案包括填充序列。包含填充序列的多核苷酸构建体的非限制性实例显示于图48A-48B中。这些构建体的各个特征可单独使用或与其它构建体或实施方案的特征组合使用。一些这样的实施方案的核酸构建体可以编码本文所述的工程化的tRNA或工程化的tRNA变体。图48A-48B可以显示如何在AAV构建体中定向补充序列(例如SEQ ID NO:57)，并且包括6X-100bp间隔区图谱(例如包含SEQ ID NO:3的序列的工程化的tRNA)。在本文所述的构建体中使用的方向在方向上可以与图中所示的那些相似，或者可以用各种异构体解码器序列或补充序列修改。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这种实施方案仅仅是通过示例的方式来提供的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在可以想到多种变化，改变和替换。应当理解，可以在实施本发明时采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物由此被覆盖。
序列表
<110> 西普治疗公司（SHAPE THERAPEUTICS INC.）
<120> 用于治疗疾病的靶向转移RNA
<130> 54761-709.601
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<141>
<150> 63/111,856
<151> 2020-11-10
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<151> 2020-04-16
<150> 62/942,690
<151> 2019-12-02
<150> 62/942,667
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<160> 148
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 来源
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<400> 1
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
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<220>
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tcccggcaga gatg 74
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 12
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttgc gggttcgagt 60
ccctccagag tcg 73
<210> 13
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 13
ggccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattgc aggttcgagt 60
cctgccgcgg tcg 73
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 14
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgaat 60
ccctccgtgg tta 73
<210> 15
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 15
gaccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgagt 60
cccttcgtgg tcg 73
<210> 16
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 16
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgaat 60
cccttcgtgg tta 73
<210> 17
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 17
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgaat 60
cccttcgtgg ttg 73
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 18
ggccgtgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc aaaagattgc aggtttgagt 60
tctgccacgg tcg 73
<210> 19
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 19
ggccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg atttcagatc agaagattga gggttcgagt 60
cccttcgtgg tcg 73
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 20
gacccagtgg cctaatggat aaggcatcag ccttcagagc tggggattgt gggttcgagt 60
cccatctggg tcg 73
<210> 21
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 21
gggccagtgg cgcaatggat aacgcgtctg acttcagatc agaagattcc aggttcgact 60
cctggctggc tcg 73
<210> 22
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 22
gggccagtgg cgcaatggat aacgcgtctg acttcagatc agaagattct aggttcgact 60
cctggctggc tcg 73
<210> 23
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 23
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gcg 73
<210> 24
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 24
ggcccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg ctg 73
<210> 25
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 25
gccccggtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacccggg gtg 73
<210> 26
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 26
gccccagtgg cccaatggat agggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 27
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 27
gccccagtgg cctagtggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 28
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 28
gccccagtgg cctaatggat aaggcaccgg ccttcaaagc cggggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 29
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 29
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg acttcaaatc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 30
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 30
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcagagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 31
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 31
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagagattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 32
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 32
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgc gggttcgagt 60
cccgcctggg gtg 73
<210> 33
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 33
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 34
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 34
gccccggtgg cctaatggat aaggcattgg ccttcaaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacccggg gtg 73
<210> 35
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 35
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcagag tcg 73
<210> 36
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 36
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttgc gggttcgagt 60
cccgccggag tcg 73
<210> 37
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 37
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttct gggttcgagt 60
cccagcggag tcg 73
<210> 38
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 38
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag ccg 73
<210> 39
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 39
gcctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag gcg 73
<210> 40
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 40
ggccccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcgggg tcg 73
<210> 41
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 41
ggctcagtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggctgag tcg 73
<210> 42
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 42
ggctccgtgg cccaatggat agggcattgg acttcaaatt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 43
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 43
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcactgg acttcaaatt cagaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 44
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 44
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcatcgg acttcaaatt cgaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 45
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 45
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatc caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 46
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 46
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg ccttcaaagt caaaggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 47
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 47
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caagggttcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 48
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 48
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaagattcc gggttcgagt 60
cccggcggag tcg 73
<210> 49
<211> 498
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Glu Glu Glu Arg Leu Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln Asp Leu Gln Gly
20 25 30
Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys Lys Asp Lys Lys
35 40 45
Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro Ser Ala His His
50 55 60
Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr Ser Glu Gly Ser
65 70 75 80
Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Lys Gln Arg
85 90 95
Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp Asp Pro Thr Leu
100 105 110
Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys Ser Gly Arg Ser
115 120 125
Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys Val Gly Asp Thr
145 150 155 160
Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr Gly Arg Gly Ser
165 170 175
Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Ser Pro Lys
180 185 190
Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln Val Lys Arg Val
210 215 220
Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met Pro Phe Gln Thr
225 230 235 240
Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr Thr Ser Thr Gln
245 250 255
Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys Ala Glu Ala Asp
260 265 270
Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro Gly Ser Val Val
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val Lys Glu Ser Ser
290 295 300
Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys Lys Arg Lys Thr
305 310 315 320
Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val Lys Pro Leu Leu
325 330 335
Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu Lys Thr Cys Lys
340 345 350
Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys Gly Arg Ser Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His His His His His
370 375 380
Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro Pro Leu Pro Pro
385 390 395 400
Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr Ser Pro Pro Glu
405 410 415
Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu Lys Met Pro Arg
420 425 430
Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu Pro Ala Lys Thr
435 440 445
Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu Lys Tyr Lys His
450 455 460
Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser Ser Met Pro Arg
465 470 475 480
Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro Val Thr Glu Arg
485 490 495
Val Ser
<210> 50
<211> 486
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln
1 5 10 15
Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys
20 25 30
Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro
35 40 45
Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr
50 55 60
Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser
65 70 75 80
Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp
85 90 95
Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln
115 120 125
Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys
130 135 140
Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr
145 150 155 160
Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro
165 170 175
Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln
195 200 205
Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met
210 215 220
Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr
225 230 235 240
Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro
260 265 270
Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val
275 280 285
Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys
290 295 300
Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val
305 310 315 320
Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Lys Thr Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys
340 345 350
Gly Arg Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His
355 360 365
His His His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro
370 375 380
Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr
385 390 395 400
Ser Pro Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu
405 410 415
Lys Met Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu
420 425 430
Pro Ala Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu
435 440 445
Lys Tyr Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser
450 455 460
Ser Met Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Val Thr Glu Arg Val Ser
485
<210> 51
<211> 5265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的多核苷酸"
<400> 51
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 360
ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg acgcgccatt gggatgttgt 420
aaaacgacgg ccagtgaacc tgcaggcagc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc 480
gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc 540
gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg cggccgcacg cgtggaggag 600
ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 660
attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 720
taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg 780
cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga 840
aacaccgaga gaccagctgg atggtctcag tggttttttg ctagcgtact gagtcgccca 900
gtctcagata gatccgacgc cgccatctct aggcccgcgc cggccccctc gcacagactt 960
gtgggagaag ctcggctact cccctgcccc ggttaatttg catataatat ttcctagtaa 1020
ctatagaggc ttaatgtgcg ataaaagaca gataatctgt tctttttaat actagctaca 1080
ttttacatga taggcttgga tttctataag agatacaaat actaaattat tattttaaaa 1140
aacagcacaa aaggaaactc accctaactg taaagtaatt gtgtgttttg agactataaa 1200
tatcccttgg agaaaagcct tgtttggaat tcatacgcgt tgacattgat tattgactag 1260
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 1320
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 1380
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 1440
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 1500
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 1560
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 1620
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 1680
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<210> 52
<211> 4933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的多核苷酸"
<400> 52
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actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 4020
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 4080
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 4140
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 4200
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 4260
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 4320
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 4380
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 4440
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 4500
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 4560
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 4620
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 4680
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 4740
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 4800
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 4860
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 4920
aggccctttc gtc 4933
<210> 57
<211> 3000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的多核苷酸"
<400> 57
tatcaagaac caacctagaa caggatacca cagtgaatat cactgttaga ttggaccgtt 60
ataaccggta ttatcttcgt gttattgccg tcgtagcaga actgttaaca agacacagtg 120
tgttgtctat tcggttggaa tacctaacgc tatctgcaag cctggcaatt ccacgttata 180
gccgttgatc agataagagt caagcggcgc tcactgtaga ccttgacaca ccactgatcg 240
gcagattcct taactgtaat caagagttct tagaggagac aatccaactc cttggtctcc 300
tcgaataact ctactcggtt cacagtggaa cactattgat tgtagattac ggtgaggccg 360
tgctcagact tcgagatcga tcacaagatt gtatccaagc ggaagactta gaacaatctg 420
caagctaata ccacggcaga tcgtattgga gtataggatt ctacctaata cggtattcag 480
tcaggagatt aagattgcgc agtgcagatt ctgaacttgt caagttcctt actcgcagcg 540
tactggccta gctatcgtgc tcacactgct atcttggtgc gactattgtt ctgttgcagt 600
caccgtgtgt agtgtatctg cagtcagact actctctacg gaggctgctt aagtatcagc 660
gctgagttgt cgcttgattg tgctggtgac tataagtcct gaagtccgat tgttgcctca 720
attgttactg tagcgatacg attaagcgac gatataggcg acggaagata cagcttgcta 780
ttgagtgcgc gttctatcgt gacagattat tagaagtgta gaccggagga tcagatagat 840
cggcctaccg cacacctgag atcaatacgt cggtaagagc gctgtaagga ctaatacaat 900
agtaataaga cctattatag aggtgtatca gcacgtacta agattgcggc ctggccactg 960
actaagatag aagctgtaac ttgcctcaga ttgtggccgc tgatctgact ggtacaggaa 1020
gtatctgatc tagacgaatt ggcacacaac ttgaattgtt ctatactgta ttgtcagtgt 1080
tgacgtgcta gaccgatatc cacacttgtc atacacgctc ctctgaggta agtaattgaa 1140
cagagcgata atcgctgcga tactggtgaa gacgctattg tcagacaaga atagtaatag 1200
cttccgagat atcgtaataa gactgtaatc aacgcagatc gtgtctagtg acacgtagag 1260
acgataggct gttgtaaggc gattggtgaa ggaatacgcg gtacaagtac actcgagtac 1320
ggaatagtta cagcgattac cgcctattac caacacggaa gcactagact aatacagcgt 1380
gtagacgtat ctagctggca acggacgtgg ccaagcagtc caactcgatc taagtgtctt 1440
aggaatagtg ttgtatcttc gagttcagga agtgtgctcg gcttgattgt attgctccgt 1500
aggttcttgg tatctgcgca gcaacaattg actttcagga tatcggcacc tccttatcct 1560
tggtagaatt agaggcgact tggatccaca ctgagccgag actatacgcg attggcaagt 1620
agttgatcga gcaattggag acgttcagtc tacacgtgtg tagaagaaca accgtacgcc 1680
actaacgatc gaagcttgat caattgaaga ataatagtgg accagccggt atccacagtc 1740
tcaagagaga ggacaggccg gtatcgactc aagcgacagg acctacttaa ttgaggtaat 1800
attcgttgtc gagtagaatt attcctatac aatcgcaggt tcgattgaga ttctacttcg 1860
cgttcttgac agctgaagtc cttgtgaaca atagcgcggc gcaattgaag acgtacttga 1920
caagcgtatc gatctctgtg aagcaccgaa ttggcaagaa gtattgtatt ataattaccg 1980
tctggttaac agagtgttca ctactccgcc aatcgaggtt attacttgaa tcaaccgtca 2040
gtacaacttc gacacactaa ctactagcca atcgagatac gtaagacacg tgtgtatacc 2100
tctcctatca gtgcgttcaa gtgttacacg atagttcgct taattgactc ggtcaagatt 2160
atcacgtagc tattgttaca atacttgtag aatctaagcc gtatcgctat cggaattagc 2220
cgctgtcacc tatgacacta tccgcactgt aagatcgctg cagttcgcag cctccgaacg 2280
attgaggtga ataaggttat tcttgcagtt gcaccaggaa cctgcgttat aattagtcct 2340
tggcgtcact tgcgaagatt aggatcagat tgcagcactc gtaggacttg acttcactac 2400
agtgagcagt atctagacgc caaggtagct tccagtacgc ctcgttactt cggagttacg 2460
tatactcacg cgtaagttgc cgaataggtg cactatgact ggagtgctta gcgcgtgatt 2520
actgctggag gattggaatt ggcgattctt acgcggaacc acgataacga gataacgtta 2580
agtcgctaga cttaaggcgg cacgcgatcg agcaactcct cactacgata ggtgagcgca 2640
gtccagtgta gctcagtcgg ccaattacgg ttctattaga cagttgcacg ttgacatcac 2700
actcgttcct atagtgtata gactcaattg tagttcaccg ctgagtatca ctcacagcac 2760
gatctactca gacttaatcg cactactgga cggaatcgcg tcgtcggcca ataagcctgt 2820
gtccagagct gcagtagtaa ctccactgta gctgttagac aataagacga gtgatactgg 2880
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ctagcagtct gcggtgattg agtctcgcgg ccgctgttat cgccagtacg gaataggtcg 3000
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
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uuuuuugaug gccagcuccg aggaucuagc guacugaguc gcccagucu 49
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 103
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 104
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gua 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 105
gccccggugg ccuaauggau aaggcauugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccacccggg gua 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 106
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
cccggcggag ucg 73
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<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 107
gccccagugg ccuaauggau aaggcauugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaucuggg gug 73
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<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 108
gccccagugg ccugauggau aagguacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
uccaccuggg gua 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 109
ggcucugugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguugu ggguucgaau 60
cccaccagag ucg 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 110
ggcucugugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguugu ggguucgagu 60
cccaccagag ucg 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 111
gucucugugg cgcaauggac gagcgcgcug gacuucaaau ccagagguuc cggguucgag 60
ucccggcaga gaug 74
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<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 112
ggcucugugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguugc ggguucgagu 60
cccuccagag ucg 73
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<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 113
ggccgcgugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc agaagauugc agguucgagu 60
ccugccgcgg ucg 73
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<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 114
gaccacgugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc agaagauuga ggguucgaau 60
cccuccgugg uua 73
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<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 115
gaccgcgugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc agaagauuga ggguucgagu 60
cccuucgugg ucg 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 116
gaccacgugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc agaagauuga ggguucgaau 60
cccuucgugg uua 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 117
gaccacgugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc agaagauuga ggguucgaau 60
cccuucgugg uug 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 118
ggccgugugg ccuaauggau aaggcgucug acuucagauc aaaagauugc agguuugagu 60
ucugccacgg ucg 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 119
ggccgcgugg ccuaauggau aaggcgucug auuucagauc agaagauuga ggguucgagu 60
cccuucgugg ucg 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 120
gacccagugg ccuaauggau aaggcaucag ccuucagagc uggggauugu ggguucgagu 60
cccaucuggg ucg 73
<210> 121
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 121
gggccagugg cgcaauggau aacgcgucug acuucagauc agaagauucc agguucgacu 60
ccuggcuggc ucg 73
<210> 122
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 122
gggccagugg cgcaauggau aacgcgucug acuucagauc agaagauucu agguucgacu 60
ccuggcuggc ucg 73
<210> 123
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 123
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gcg 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 124
ggcccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg cug 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 125
gccccggugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccacccggg gug 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 126
gccccagugg cccaauggau agggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 127
gccccagugg ccuaguggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 128
gccccagugg ccuaauggau aaggcaccgg ccuucaaagc cggggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
<210> 129
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 129
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cccaccuggg gug 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 130
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucagagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
<210> 131
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 131
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagagauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
<210> 132
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 132
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugc ggguucgagu 60
cccgccuggg gug 73
<210> 133
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 133
gccccagugg ccuaauggau aaggcacugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccaccuggg gug 73
<210> 134
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 134
gccccggugg ccuaauggau aaggcauugg ccuucaaagc cagggauugu ggguucgagu 60
cccacccggg gug 73
<210> 135
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 135
ggcucugugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
cccggcagag ucg 73
<210> 136
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 136
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguugc ggguucgagu 60
cccgccggag ucg 73
<210> 137
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 137
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucu ggguucgagu 60
cccagcggag ucg 73
<210> 138
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 138
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
cccggcggag ccg 73
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<212> RNA
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gccuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
cccggcggag gcg 73
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<400> 140
ggccccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
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ggcucagugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
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ggcuccgugg cccaauggau agggcauugg acuucaaauu caaagguucc ggguucgagu 60
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ggcuccgugg cgcaauggau agcgcacugg acuucaaauu cagagguucc ggguucgagu 60
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ggcuccgugg cgcaauggau agcgcaucgg acuucaaauu cgaagguucc ggguucgagu 60
cccggcggag ucg 73
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> /注意="对人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 145
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauc caaagguucc ggguucgagu 60
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<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg ccuucaaagu caaagguucc ggguucgagu 60
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<212> RNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 148
ggcuccgugg cgcaauggau agcgcauugg acuucaaauu caaagauucc ggguucgagu 60
cccggcggag ucg 73

Claims (81)

1.组合物，其包含：
工程化的tRNA变体，其相对于SEQ ID NO:3-22或103-122中任一项的核酸序列在T环、T-茎、D-环、D-茎、可变环、反密码子茎或反密码子环中包含突变，
其中在向受试者施用后，相对于使用缺乏过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，所述工程化的tRNA变体能够通过抑制编码基本上全长的多肽的靶mRNA中的过早终止密码子恢复至少10％的所述基本上全长的多肽的产生，这通过以下确定：
a)将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA的第二载体转染到第一人细胞中，所述筛查mRNA编码第一绿色荧光蛋白，其中编码所述第一绿色荧光蛋白的所述筛查mRNA包含所述过早终止密码子；
b)将编码可比较的筛查mRNA的第三载体转染到第二人细胞中，所述可比较的筛查mRNA编码第二绿色荧光蛋白，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；和
c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的荧光的量。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体与SEQ ID NO:23-48或123-148中的任一项具有至少70％的序列同一性。
3.如权利要求1或2如的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:6或106至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:6或106的位置2、4、6、12、23、27、28、31、39、40、42、43、44、46、49、50、64、65、67、69或71处具有取代。
4.如权利要求3所述的组合物，其中位置2处的取代是取代为C，位置4处的取代是取代为C，位置6处的取代是取代为T，位置6处的取代是取代为A，位置12处的取代是取代为C，位置23处的取代是取代为G，位置27处的取代是取代为C，位置28处的取代是取代为C，位置31处的取代是取代为C，位置39处的取代是取代为G，位置40处的取代是取代为C，位置42处的取代是取代为G，位置43处的取代是取代为G，位置44处的取代是取代为G，位置46处的取代是取代为A，位置49处的取代是取代为G，位置50处的取代是取代为T，位置64处的取代是取代为A，位置65处的取代是取代为C，位置67处的取代是取代为A，位置67处的取代是取代为T，位置69处的取代是取代为G，位置71处的取代是取代为C，或位置71处的取代是取代为G。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:6或106相同。
6.如权利要求3-5中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量、半衰期测量、氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:6或106中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含SEQ IDNO:45或145的序列。
8.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:3或103中任一项至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:3或103的位置2、6、13、15、22、28、31、37、39、42、44、50、64、67、71或72处具有取代。
9.如权利要求8所述的组合物，其中位置2处的取代是取代为G，位置6处的取代是取代为G，位置13处的取代是取代为C，位置15处的取代是取代为G，位置22处的取代是取代为G，位置28处的取代是取代为C，位置31处的取代是取代为A，位置37处的取代是取代为G，位置39处的取代是取代为T，位置42处的取代是取代为G，位置44处的取代是取代为A，位置50处的取代是取代为C，位置64处的取代是取代为G，位置67处的取代是取代为C，位置71处的取代是取代为C，或位置72处的取代是取代为C。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:3或103相同。
11.如权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量、半衰期测量、氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:3或103中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
12.如权利要求1、2或8-11中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含SEQ ID NO:32或132的序列。
13.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体包含与SEQ ID NO:5或105至少70％相同的序列，并且在SEQ ID NO:5或105的位置73处具有取代。
14.如权利要求13所述的组合物，其中位置73处的取代是取代为G。
15.如权利要求13或14所述的组合物，其中除了取代之外，所述工程化的tRNA变体的序列与SEQ ID NO:5或105相同。
16.如权利要求13-15中任一项所述的组合物，其中如通过代理测量、半衰期测量、氨基酸装载效率测量或与合成酶或核糖体机构结合的测量所确定的，与包含SEQ ID NO:5或105中提供的序列的可比较的tRNA相比，所述工程化的tRNA变体表现出增加的体内稳定性。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体用氨基酸酰化或者用非典型氨基酸酰化，所述氨基酸包括赖氨酸，精氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述过早终止密码子是蛋白石终止密码子，赭石终止密码子或琥珀终止密码子。
19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述多肽包括MeCP2多肽，FoxG1多肽，CDKL5多肽，MYH9多肽，COL11A2多肽或MYO7A多肽。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体能够恢复至少20％的所述基本上全长的多肽的产生。
21.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体能够恢复至少40％的所述基本上全长的多肽的产生。
22.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体能够恢复至少60％的所述基本上全长的多肽的产生。
23.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体能够恢复至少80％的所述基本上全长的多肽的产生。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述工程化的tRNA变体的多核苷酸。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述多核苷酸在病毒载体中。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述AAV载体包括AAV2/5载体，AAV2/6载体，AAV2/7载体，AAV2/8载体或AAV2/9载体。
28.如权利要求26-27中任一项所述的组合物，其中所述AAV包含来自AAV5的衣壳。
29.如权利要求26-28中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含来自AAV2的反向末端重复(ITR)序列。
30.如权利要求26-29中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含具有突变的末端解链位点且缺乏末端核苷酸的反向末端重复。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述末端核苷酸包含A区的至少一部分，D区的至少一部分或两者。
32.如权利要求27-31中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸是自身互补的。
33.如权利要求25-32中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸编码相同工程化的tRNA变体的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或者六个或更多个拷贝。
34.如权利要求25-33中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸编码不同的工程化的tRNA变体的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或者六个或更多个拷贝。
35.如权利要求25-34中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含填充序列，所述填充序列包含至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约150个核苷酸或至少约200个核苷酸。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述填充序列位于所述多核苷酸内一个或多个拷贝的所述工程化的tRNA变体的3’或5’。
37.如权利要求35或36所述的组合物，其中所述填充序列将所述多核苷酸内的所述工程化的tRNA变体的两个或更多个拷贝分开。
38.如权利要求24-37任一项所述的组合物，其中所述工程化的tRNA变体或编码所述工程化的tRNA的多核苷酸存在于递送系统中。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述递送系统包括脂质体，带电聚合物，不带电聚合物，纳米颗粒，表面活性剂，渗透增强剂，基因转移剂，磷脂，胶束，合成载体，大分子，树枝状聚合物，生物聚合物，病毒颗粒或其任何组合。
40.药物组合物，其包含权利要求1-39中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其为剂量单位形式。
42.试剂盒，其包含权利要求1-39中任一项所述的组合物或者权利要求40或41所述的药物组合物，以及包装或容器。
43.制备权利要求42所述的试剂盒的方法，其包括使所述组合物或药物组合物与所述包装或容器接触。
44.治疗或预防疾病或病症的方法，其包括：
向有需要的受试者施用权利要求1-40中任一项所述的组合物。
45.治疗或预防有需要的受试者中的疾病或病况的方法，其包括：
向所述受试者施用工程化的tRNA或其变体或者编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸；和
相对于使用缺乏过早终止密码子的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率在体内产生基本上全长的多肽，
其中所述工程化的tRNA或其变体能够读通编码所述基本上全长的多肽的靶mRNA中的所述过早终止密码子。
46.治疗或预防有需要的受试者中的疾病或病况的方法，其包括：
向所述受试者施用工程化的tRNA或其变体或者编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸，从而至少部分地治疗所述受试者的疾病或病况；
其中所述工程化的tRNA或其变体识别编码多肽的靶mRNA中的过早终止密码子，其中所述工程化的tRNA或其变体在所述靶mRNA的翻译期间至少部分地将对所述过早终止密码子的解读转化为有义密码子，并且相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％的效率在体内产生基本上全长的多肽，这通过以下确定：
a)将编码所述工程化的tRNA或其变体的第一载体和编码筛查mRNA的第二载体转染到第一人细胞中，所述筛查mRNA编码第一标志物，其中编码所述第一标志物的所述筛查mRNA包含所述过早终止密码子；
b)将编码可比较的筛查mRNA的第三载体转染到第二人细胞中，所述可比较的筛查mRNA编码第二标志物，其中所述可比较的筛查mRNA不包含所述过早终止密码子；和
c)比较从所述第一人细胞和所述第二人细胞发出的可检测信号的量。
47.如权利要求45或46所述的组合物，其中所述工程化的tRNA或其变体与SEQ ID NO:003-48或103-148中的任一项具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体包含SEQID NOS:3-48或103-148中的任一项。
49.如权利要求45或46所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体包含SEQ ID NOS:3、6、7、32、45、103、106、107、132或145中的任一项。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述工程化的tRNA或其变体包括施用包含编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸的病毒。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述病毒包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)或慢病毒。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述病毒包括AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8或AAV2/9。
53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述病毒包含AAV5衣壳。
54.如权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸包含AAV2反向末端重复(ITR)序列。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸包含具有突变的末端解链位点且缺乏末端核苷酸的反向末端重复。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述末端核苷酸包含A区的至少一部分、D区的至少一部分或两者。
57.如权利要求50-56中任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸是自身互补的。
58.如权利要求50-57中任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸编码所述工程化的tRNA或其变体的另外的一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或者六个或更多个拷贝。
59.如权利要求50-58任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸编码不同于所述工程化的tRNA或其变体的第二工程化的tRNA或其变体的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或者六个或更多个拷贝。
60.如权利要求50-59中任一项所述的方法，其中所述编码工程化的tRNA或其变体的多核苷酸包含填充序列，所述填充序列包含至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约150个核苷酸或至少约200个核苷酸。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述填充序列位于所述多核苷酸内的所述工程化的tRNA或其变体的一个或多个拷贝的3’或5’。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述填充序列将所述多核苷酸内的所述工程化的tRNA或其变体的两个或更多个拷贝分开。
63.如权利要求45-62中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体或者编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸在递送系统中。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述递送系统包括脂质体，带电聚合物，不带电聚合物，纳米颗粒，表面活性剂，渗透增强剂，基因转移剂，磷脂，胶束，合成载体，大分子，树枝状聚合物，生物聚合物，病毒颗粒或其任何组合。
65.如权利要求50-64中任一项所述的方法，其中所述工程化的tRNA或其变体或者编码所述工程化的tRNA或其变体的多核苷酸在包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物中。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述药物组合物为剂量单位形式。
67.如权利要求44-66中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与靶mRNA中过早终止密码子相关的疾病或病况。
68.如权利要求44-67中任一项所述的方法，其中相对于使用缺乏所述过早终止密码子的可比较的mRNA产生的可比较的多肽，以至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％或至少约90％的效率产生所述多肽，从而至少部分地治疗所述受试者的疾病或病况。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述疾病或病况包括Rett综合征，囊性纤维化，色素性视网膜炎或耳聋。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述耳聋包括常染色体显17性耳聋，常染色体显性13耳聋或常染色体显性11耳聋。
71.如权利要求44-70中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
72.如权利要求44-70中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
73.如权利要求44-72中任一项所述的方法，其中所述施用是口服、直肠、肠胃外、静脉内、动脉内、鞘内、眼内、耳内、脑室内、脑池内、脑室内或腹腔内施用。
74.如权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是Rett综合征，并且Rett综合征的至少一种症状被减轻。
75.如权利要求74所述的方法，其中Rett综合征的至少一种症状包括生长缓慢、脑生长缓慢、微头症、运动或协调的减少或丧失、手控制减少、行走能力降低、僵硬或痉挛运动、言语能力降低、视力降低、冷漠、反复手部运动、异常眼部运动、呼吸困难、易怒、恐惧、焦虑、认知缺陷、癫痫、异常脑电图、脊柱侧凸、不规则心跳或异常睡眠模式。
76.如权利要求44-75中任一项所述的方法，其中施用1×1012至1×1015个病毒基因组。
77.如权利要求44-76中任一项所述的方法，其中所述受试者为约10至30岁。
78.如权利要求44-77中任一项所述的方法，其中所述组合物减少或抑制靶mRNA的无义介导的mRNA衰变(NMD)。
79.如权利要求44-78中任一项所述的方法，其中所述组合物相对于基线靶mRNA测量增加所述受试者中的靶mRNA的量。
80.如权利要求1-79中任一项的所述组合物或方法，其中所述多肽包括MeCP2多肽。
81.如权利要求80所述的组合物或方法，其中所述过早终止密码子由编码MeCP2多肽的氨基酸位置168、255、270、294、198、186、453、8(例如，在同种型2中)、9(例如，在同种型1中)、84、85、89、91、106、111、115、133、162、167、188、190、211、250、253、268、306、309、344、354、420、458、468、471、478或484处的R的突变产生。
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