KR102084227B1 - 인간 형질전환 연골세포주 기반 연골질환 치료제 스크리닝 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주, 및 이를 이용한 연골질환 치료에 유효한 약물을 스크리닝하는 방법 등에 관한 것으로, 모든 구성인자를 사람유래 유전인자들로 구성하였으므로 이를 통해 선별된 신규 약물들은 사람의 연골질환 치료에 더 효과적일 것으로 판단된다. 또한 본 발명은 추가 형질전환을 통하여 기능을 알지 못하는 유전자의 연골질환 치료가능 여부를 평가할 수 있는 장점이 있으므로 여러가지 약물의 연골질환 치료기능을 서로 비교 가능할 뿐만 아니라 최적의 처리 농도 및 간접적인 세포독성의 평가도 가능할 것으로 기대된다. 마지막으로, 본 발명에 따른 스크리닝 시스템을 통해 발굴한 연골재생 효능을 갖는 신규한 물질인 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid)은 각종 연골 질환의 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 형질전환 연골세포주 기반 연골질환 치료제 스크리닝 시스템 {Human transformed chondrocyte cell line mediated drug screening system for cartilage disease remedy}

본 발명은 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주, 및 이를 이용한 연골질환 치료에 유효한 약물을 스크리닝하는 방법 등에 관한 것이다.

관절연골의 손상은 원래의 조직으로 재생이 되지 않아 치유가 어렵기 때문에 이 문제를 해결하기 위한 여러 시도가 있어 왔다. 현재 진행된 퇴행성 관절염에 있어서는 이환된 연골과 골을 제거하고 금속과 폴리에틸렌으로 구성된 인공관절 치환술을 시행하는 것이 표준적인 치료로 되어 있으나, 60대 이하의 비교적 젊은 환자에 시술하는 경우는 인공관절의 수명이 문제가 되고 있다. 이러한 연골손상은 관절 연골조직의 외상성 결손이나 점진적인 파괴를 가져오는 골관절염에 의하여 발생하며 그 빈도가 매우 높으나, 원래의 조직인 초자연골로의 재생은 어려우며 연골재생의 분자적 조절 기전에 대하여는 많이 알려져 있지 아니한 실정이다.

기존 손상관절 치료법으로는 고전적인 약물치료, 자가골 연골 이식술, 골수 천공술 및 인공관절치환술 등이 있으며 이들 중 고전적인 약물치료는 보존적 치료에 해당되며 이는 단지 증상만을 완화시키므로 제한적인 기능 회복에 한정되고 관절연골의 외상성 결손에 이용하는 자가 골 연골 이식술은 골-연골편 채취로 인한 공여부 손상을 초래하며, 채취량이 제한되는 단점이 있다. 또한, 중등도로 진행된 골관절염에 시행하는 골수 천공술은 원래의 연골조직인 초자연골 대신 섬유연골을 재생시키는 것으로 임상 결과가 불량한 단점이 있으며, 골관절염의 표준적인 치료방법인 인공관절 치환술은 젊은 환자의 경우에는 인공관절의 수명이 또한 문제가 된다.

한편, 관절연골 재생을 위한 줄기세포는 자가 증식능과 특정 조직을 이루는 세포로 분화되는 분화능이 특징이며, 최근 관절 연골 치료에 적용하기 위한 새로운 세포 원으로 제시되고 있다. 따라서 이론적으로는 기존의 연골 세포를 이용한 세포 치료법이 가지고 있던 제한점들을 해결하고 전반적인 관절 연골의 퇴행과 손상에도 적용할 수 있는 가능성이 있다. 또한, 성체 간엽줄기세포 및 간엽전구세포는 윤리적 문제점이 없고 동종 이식시 생체 내 거부 반응이 없다는 장점이 있다.

그러나 모든 성체 간엽 줄기 세포가 동시에 완전히 연골세포로 분화되지는 아니한다. 따라서, 이들의 균일 연골세포로의 분화 유도방법이 필요한 실정이며 줄기세포로부터 분화한 연골세포를 세포치료에 적용하기 위해서는 간엽줄기세포의 연골 분화에 있어 세포의 연골로 유도된 세포의 세포사(apoptosis) 및 골분화의 전구 징후인 비후화(hypertrophy)를 정교하게 조절하여 억제하는 방법이 반드시 필요한 실정이다.

최근, 관절연골 치료법으로 급성장하고 있는 줄기세포 이식법 대비 고전적인 약물치료가 현재까지도 단순 보존적 치료에만 머무르는 원인으로는 고도로 발달되고 신속화된 약물분리 과정 대비 손상관절에 유효한 신규 약물만을 스크리닝할 수 있는 시스템의 부재가 원인이 될 수 있다. 동물 시험에서 발견하지 못한 부작용 또는 약물 효과의 유효성 부족으로 인해 임상 시험에 진입한 약물 중 90% 이상이 시장 진입에 실패를 하고 있는 현실로 미루어 볼 때, 합성 또는 천연화합물에 대한 효능 및 문제점을 보다 효과적으로 스크리닝할 수 있는 시험시스템 개발의 중요성이 높아지고 있다.

한편, 인간은 노화가 진행됨에 따라 자연적으로 퇴행성 관절염이 진행되는데 이는 연골세포의 노화에 따른 제2형 콜라겐(type II collagen)의 합성량 감소가 원인이 된다. 정상관절에서 제2형 콜라겐은 관절연골의 85-90%를 구성하는 근간이 되는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)의 한 성분이다. 따라서 관절연골 내에 존재하는 연골세포로부터 이들의 합성이 부족해지거나 저해될 경우 관절염이 발생하게 된다. 반대로 건강한 관절연골의 유지 및 재생에 효능이 있는 유전적 및 비 유전적인 약물들의 효과는 최종적으로 제2형 콜라겐의 합성을 정상화시키거나 이들의 과발현을 유도하는 기능을 수행할 수 있어야 한다. 예를 들면, 최근까지 연골세포의 형상유지와 줄기세포의 연골세포 분화유도에 필수 인자들로 SOX-trio 유전자, TGF-beta(transforming growth factor beta), 덱사메타손(dexamethasone), Wnt 억제제 등이 알려져 있는데, 이들 유전인자 및 화학적 유기화합물이 연골형성에 도움을 주는 역할은 궁극적으로 다량의 제2형 콜라겐 합성을 최종 목표로 하고 있다.

그러므로 제2형 콜라겐의 합성을 향상시킬 수 있는 약물들을 평가할 수 있는 시스템의 개발은 우수한 관절염 치료제 개발을 용이하게 할 수 있을 것으로 기대되며 따라서, 이에 대한 많은 연구가 요구되고 있다.

KR 10-1642202 B1

본 발명자들은 건강한 관절연골에 존재하는 콜라겐의 대부분이 제2형 콜라겐(type II collagen)으로 구성되어 있는 사실에 근거하여 상기 제2형 콜라겐의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절 가능한 약물을 스크리닝 가능하도록 인간 형질전환 연골세포주 기반 연골질환 치료제 스크리닝 시스템을 개발하고 실제 효과가 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 Col2a1 프로모터(C2P), Col2a1 프로모터 인헨서(Col2a1 promoter enhancer; ENS), 및 리포터 유전자를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 연골질환 치료제 스크리닝용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환 세포주에 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물을 처리한 형질전환 세포주에서 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 2-안트라퀴논카복실산(2- Anthraquinonecarboxylic acid), 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 연골질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Col2a1 프로모터(C2P), Col2a1 프로모터 인헨서(Col2a1 promoter enhancer; ENS), 및 리포터 유전자를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Col2a1 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Col2a1 프로모터 인헨서는 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Col2a1 프로모터는 인간 제2형 콜라겐 프로모터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Col2a1 프로모터 및 Col2a1 프로모터 인헨서는 인간 간엽줄기세포에서 유래한 것일 수 있다.

상기 간엽줄기세포의 유래는 제한이 없으나, 골수 유래 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 암호화 하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 재조합 발현벡터는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 제조한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스로 형질전환된 연골질환 치료제 스크리닝용 형질전환 세포주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 형질전환 세포주는 인간 연골 세포주일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00456의 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주에 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물을 처리한 형질전환 세포주에서 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 암호화 하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 측정된 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도가 클수록 손상연골의 재생 활성이 더 우수한 약물로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid), 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 연골재생을 통해 연골질환을 치료하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명인 연골질환 치료제 스크리닝 시스템은 모든 구성요소를 인간 유래 인자들로 하였으므로 이를 통해 선별된 신규 약물들은 사람의 연골질환 치료에 더욱 효과적일 것으로 판단된다. 또한, 본 발명은 추가 형질전환을 통하여 기능을 알지 못하는 유전자의 연골질환 치료효과를 평가할 수 있는 장점이 있으므로 여러가지 약물의 연골질환 치료효과를 서로 비교가능할 뿐만 아니라 최적 처리농도 및 간접적인 세포독성 유무도 평가 가능하다. 이에 더하여, 본 발명은 동시에 스크리닝 하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 시스템을 통해 발굴한 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid)은 우수한 연골재생 효능을 보여, 각종 연골질환의 치료제로서 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터를 제조하는 방법을 도시한 것이다.
도 2는 재조합 발현벡터 pCDH-ENS-C2P-copGFP-Puro의 구조를 도시한 것이다.
도 3은 재조합 발현벡터 pCDH-ENS-C2P-fLuc-Puro의 구조를 도시한 것이다.
도 4는 인간 제2형 콜라겐 융합 프로모터가 연골조직 특이적으로 발현되는지 확인하기 위해 GFP 형광을 관찰한 결과이다.
도 5는 루시퍼라아제를 연골세포 특이적으로 발현시킬 수 있는 형질전환된 사람 연골세포주의 단일클론을 선별하기 위한 루시퍼라아제 활성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 세포주를 이용하여 연골치료 약물인 카토제닌(Kartogenin)(도 6의 A) 및 TD-198946(도 6의 B)를 농도별로 처리한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 세포주를 이용하여 연골치료 약물인 카토제닌과 TD-198946를 4회 반복처리한 결과를 이미지화한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 스크리닝 시스템을 이용하여 37종의 천연물의 연골재생 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 카토제닌(좌측 그래프) 및 2-안트라퀴논카복실산(우측 그래프)의 처리 농도별 연골재생 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 및 도 10b는 C28/I2 세포주(도 10a) 및 골관절염 환자에서 분리한 연골세포(도 10b)에서 각각 카토제닌 및 2-안트라퀴논카복실산의 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 카토제닌 또는 2-안트라퀴논카복실산의 처리에 따른 연골분화 표지인자의 발현 양상을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 건강한 관절연골에 존재하는 콜라겐의 대부분이 제2형 콜라겐(type II collagen)으로 구성되어 있는 사실에 근거하여 상기 제2형 콜라겐의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절 가능한 약물을 스크리닝 가능하도록 형질전환 한 세포주를 이용한 스크리닝 시스템을 개발하고 실제 효과가 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 제2형 콜라겐 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제작하여 연골특이적 발현이 가능함을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 루시퍼라아제를 연골세포 특이적으로 발현시킬 수 있도록 형질전환된 사람 연골세포주의 단일클론을 선별한 결과 CN(Clone Number)5 세포주가 다른 클론들 대비 높은 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)를 보임과 동시에 각 약물에 대한 반응성 정도가 뚜렷한 차이를 보이는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 확립된 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 세포주를 이용하여 연골치료 약물들의 효과를 검증한 결과 약물의 효과를 직접적으로 비교할 수 있을 뿐만 아니라 약물의 세포독성 여부도 간접적으로 확인 가능하며 반복시험 없이 다수 약물의 스크리닝이 가능함을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 연골질환 치료제 스크리닝 시스템을 이용하여, 37종의 항염증 천연 화합물 중 연골재생 효능을 가지는 신규한 화합물인 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid)을 선별하였고, 상기 화합물의 높은 연골재생 활성 및 상승된 세포성장률을 확인하였다(실시예 5 참조).

이에, 본 발명은 Col2a1 프로모터(C2P), Col2a1 프로모터 인헨서(Col2a1 promoter enhancer; ENS), 및 리포터 유전자를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "벡터(vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함하며 상기 "형질전환" 또는 "형질도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 도입된 DNA의 발현이 가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "발현벡터"는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "리포터 유전자"는 관심있는 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해 관심있는 유전자에 부착하는 유전자를 말한다. 용도에 따라서 다양한 종류의 리포터 유전자(reporter gene)가 있으며 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GFP(green fluorescent protein) 유전자, 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자, CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자, CFP(Cyan Fluorescent Protein) 유전자 및 YFP(Yellow Fluorescent Protein) 유전자 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GFP(green fluorescent protein) 유전자, 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "연골질환"은 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 말하며, 연골손상 질환을 포함한다. 이러한 연골질환에는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Col2a1 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 Col2a1 프로모터 인헨서는 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 구체적으로, 상기 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 Col2a1 프로모터는 인간 제2형 콜라겐 프로모터일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 Col2a1 프로모터 및 Col2a1 프로모터 인헨서는 인간 간엽줄기세포에서 유래한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 간엽줄기세포는 포유동물에서 유래된 성체 줄기세포를 포함하며, 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체줄기세포에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들면 성체 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래 등으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 연골질환 치료제 스크리닝용 형질전환 세포주를 제공한다.

본 발명에서 상기 형질전환 세포주는 인간 연골 세포주일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 형질전환은 본 발명에 따른 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스를 이용하여 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00456의 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 세포주에 후보약물을 처리하는 단계; 및 상기 후보약물을 처리한 형질전환 세포주에서 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 암호화 하는 유전자일 수 있다.

본 발명에서 상기 측정된 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도가 클수록 손상연골의 재생 활성이 더 우수한 약물로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid), 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid)"은 IUPAC 명칭 9,10-다이옥소안트라센-2-카복실산(9,10-dioxoanthracene-2-carboxylic acid)으로, 안트라퀴논-2-카복실산(Anthraquinone-2-carboxylic acid), 2-카복시안트라퀴논(2-Carboxyanthraquinone) 등으로도 불리우며, 항염증 효능을 가지는 물질로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유도체"란, 상기 2-안트라퀴논카복실산에 작용기를 도입, 치환, 산화, 환원 등에 의해서 모체의 구조와 성질을 대폭적으로 변화시키지 않는 한도에서 변화시킨 화합물을 의미하며, 따라서 상기 유도체의 종류에는 제한이 없다.

본 발명에서, 상기 조성물은 연골재생을 통해 연골질환을 치료하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 제2형 콜라겐 융합 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터 제작

도 1에 나타난 바와 같이, 인간 간엽줄기세포의 게노믹(genomic) DNA로부터 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭된 제2형 콜라겐 유전자의 첫번째 인트론(intron)의 +2127 ~ +2842bp에 해당되는 Col2a1 프로모터 인헨서(Col2a1 promoter enhancer; ENS) DNA 및 코어 프로모터(core promoter) C2P DNA는 우선, T-vector 에 연결하여 각 염기서열의 진위여부를 확인한 후, pBluescript KS(-) 셔틀 벡터에 연결하여 융합된 인간 제2형 합성 콜라겐 프로모터를 완성하였다.

그리고 상기 벡터로부터 융합 프로모터를 한 번의 PCR 반응으로 재증폭하였고 상기 결과물을 pCDH-Puro 벡터에 존재하는 SpeI-XbaI 위치에 삽입함으로써 CMV 프로모터와 교환하였다. 그 다음, 상기 벡터의 다음 제한효소 구간인 NheI-NotI 위치에 pMIR-REPORT-Luc 벡터로부터 증폭된 루시퍼라아제 유전자 또는 pCDH-copGFP 벡터로부터 증폭된 copGFP 유전자를 연결하여 최종 목적하는 pCDH-ENS/C2P-copGFP-Puro(도 2)와 pCDH-ENS/C2P-fLuc-Puro(도 3) 렌티바이러스 벡터들을 완성하였다.

실시예 2. 제2형 콜라겐 융합 프로모터의 연골조직 특이적 발현유도 여부 확인

상기 실시예 1에서 제조된 pCDH-ENS/C2P-copGFP-Puro 벡터 및 293FT 세포를 이용하여 copGFP-Puro 렌티바이러스를 합성하였고 상기 바이러스를 분화 이전 단계의 세포인 간엽줄기세포 및 분화된 세포인 연골세포주 C28/I2에 각각 감염시켜 GFP 발현여부를 형광현미경으로 확인하였다.

이때, 형질전환 음성대조군으로 벡터를 이용하지 않은 vehicle을 사용하였고 양성대조군으로 분화 전후 세포에서 모두 GFP의 발현을 유도할 수 있는 pECFP 비바이러스 벡터를 사용하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, pECFP 벡터를 이용하여 형질전환된 간엽줄기세포 및 C28/I2 세포주는 모두 GFP 형광이 관찰되는 반면에, copGFP-Puro 렌티바이러스를 이용하여 상기 두 가지 세포를 형질전환 하였을 경우에는 GFP 형광이 C28/I2 연골 세포주에서만 검출되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 실시예 1에서 제작한 인간 유래 제2형 콜라겐 융합 프로모터가 연골세포에서만 특이적으로 발현이 유도되므로 목적한 대로 작동한다는 것을 의미한다.

실시예 3. 루시퍼라아제를 연골세포 특이적으로 발현시킬 수 있는 형질전환 사람 연골세포주 단일클론의 선별

상기 실시예 1에서 제조된 벡터와 293FT 세포를 이용하여 fLuc-Puro 렌티바이러스를 합성하였으며 상기 바이러스는 사람 연골세포주인 C28/I2 감염에 사용되었다. MOI=30의 바이러스 농도로 상기 세포를 12시간 감염시킨 후 추가로 4μg/ml 푸로마이신(puromycin) 항생제가 포함된 DMEM/F12 배양액을 2~3일 간격으로 더 이상 세포가 죽지 않고 정상적으로 성장할 때까지 처리하여 폴리클로날 트렌스폼드(polyclonal transformed) C28/I2 세포군을 확립하였다.

이후, 최종 확립된 세포군은 항생제의 농도를 1μg/ml로 감소시켜 배양하였고 상기 세포군을 이용하여 추가로 96-well plate 세포 희석법을 통하여 약 1개월 간 단일클론 선별과정을 거친 결과, 14종의 단일클론 세포주를 확보하였다. 단일클론 세포주마다 각각 약물에 반응하는 정도가 다르므로 최적의 단일클론을 확보하기 위해 연골재생 및 분화 효과가 우수한 것으로 알려진 카토제닌(Kartogenin) 또는 TD-198946을 각각의 세포에 처리함으로써 각 클론의 반응을 살펴보았다. 우선, 약물들을 처리하기 하루 전에 96-well plate에 1 × 10⁴ cells로 각 well에 세포를 분주하였고, 다음날 7시간 동안 모든 세포는 무혈청배양액(serum-free media)에서 스타베이션(starvation) 시킨 후 각각의 약물들의 농도가 10μM 이 되도록 첨가된 complete DMEM/F12 media를 첨가하여 배양하였다.

24시간 동안 배양한 후, 배양액을 모두 걷어내고 150μg/ml의 D-루시페린(D-luciferin) 이 함유된 새로운 complete DMEM/F12 media를 각각의 well에 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후, TECAN SPARK 멀티리더의 루미네선스(luminescence) 분석옵션을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 모든 클론이 vehicle 음성 대조군 (DMSO only) 대비 상기 두 가지 약물에 반응을 보이는 것으로 확인되었고, 클론들 중에서도 CN(Clone Number) 5 세포주가 다른 클론들 대비 높은 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 보임과 동시에 각 약물에 대한 반응성 정도가 뚜렷한 차이를 보이는 것으로 확인하여 이를 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5로 확립하고 한국세포주연구재단에 기탁하였다(수탁번호 KCLRF-BP-00456).

실시예 4. C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 세포주를 이용한 연골치료 약물들의 효능 검증

상기 실시예 3에서 확립된 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5 세포주를 상기 언급한 바와 같이 96-well plate에 분주하고 연골치료 약물로 알려진 카토제닌과 TD-198946를 농도별로 처리했을 때 세포의 반응을 관찰하였으며 이때 각 약물의 농도는 0 ~ 50μM을 사용하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 두 약물 모두 농도를 증가시킴에 따라 루시퍼라아제 활성이 증가하는 것을 보여주었다. 특히, TD-198946의 활성이 카토제닌 보다 더 높게 나타나는 것으로 확인되었으며 이는 본 연골치료 유효약물 스크리닝 세포 시스템을 이용하여 기존에 서로 비교된 바 없었던 두 가지 약물의 효능을 직접적으로 비교가 가능함을 의미한다.

또한, 지속적으로 루시퍼라아제 활성이 증가하는 TD-198946과는 달리 카토제닌은 50μM 수준에서 루시퍼라아제 활성이 감소하는 것으로 보아 고농도에서 세포독성을 지님을 간접적으로 확인할 수 있었다.

더불어, 측정기기의 옵션에 따라 본 결과는 분석자가 약물활성에 대한 평가가 용이하도록 그 결과를 이미지화 시킬 수도 있다. 도 7은 각 약물의 4회 반복 처리 결과를 이미지화한 결과이며 붉은색을 나타낼수록 처리 약물의 연골치료 활성이 더 우수함을 보여주고 각 well 간의 반복 결과의 오차범위가 크지 않아 현재의 시스템으로 반복시험 없이 총 96개의 약물 스크리닝이 가능할 것으로 판단된다.

실시예 5. 연골치료 유효약물 스크리닝 세포 시스템을 이용한 신규 연골치료제 선별 및 효과 검증

본 발명에 따른 연골질환 치료제 스크리닝 시스템을 이용하여, 여러 가지 항염증 천연물질 중 우수한 연골재생 효능을 갖는 물질을 선별함으로써 본 발명에 따른 스크리닝 시스템을 검증하고, 우수한 연골재생 효능을 가지는 신규한 물질인 2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid; 이하 '2-AQCA'라 함)을 발굴하였다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.

5.1. 항염증(anti-inflamatory) 천연물질의 연골재생 효능 탐색

본 실시예에 사용될 항염증 효능이 알려진 천연물질 37종은 항염증 천연 화합물 라이브러리(anti-inflammatory natural compound library, ChemFace社, 중국)를 기반으로 선정하였다. 화합물의 종류는 하기 표 1에 나타내었다.

No.	화합물 이름
1	탄닌산(Tannic acid)
2	글리시리진산(Glycyrrhizic acid)
3	진세노사이드 화합물 K(Ginsenoside Compound K)
4	악틴(Arctiin)
5	마데카식산(Madecassic acid)
6	올레아놀린산(Oleanolic acid)
7	윌포라이드 A(Wilforlide A)
8	페이민(Peimine)
9	히드로코르티손(Hydrocortisone)
10	네오클로로제닉산(Neochlorogenic acid)
11	바바치닌(Bavachinin)
12	베르베린(Berberine)
13	시노메닌(Sinomenine)
14	리쏘스퍼모사이드(Lithospermoside)
15	이소바바찰콘(Isobavachalcone)
16	퀘르세틴(Quercetin)
17	엘라그산(Ellagic acid)
18	엠벨린(Embelin)
19	노니바마이드(Nonivamide)
20	시코닌(Shikonin)
21	우고닌(Wogonin)
22	아피게닌(Apigenin)
23	알너스톤(Alnustone)
24	인디루빈(Indirubin)
25	4-(p-바이페닐)-3-히드록시부티르산[4-(p-Biphenylyl)-3-hydroxybutyric acid]
26	2-안트라퀴논카복실산(2-Anthraquinonecarboxylic acid)
27	아트락틸레놀라이드 II(Atractylenolide II)
28	레스베라트롤(Resveratrol)
29	메틸 시린게이트(Methyl syringate)
30	알파-캐리오필렌(Alpha-caryophyllene)
31	진저론(Zingerone)
32	메틸 갈레이트(Methyl gallate)
33	켈리돈산(Chelidonic acid)
34	파에놀(Paeonol)
35	메틸 신나메이트(Methyl cinnamate)
36	피로갈롤(Pyrogallol)
37	4-히드록시벤질알콜(4-Hydroxybenzyl alcohol)

본 발명에 따른 스크리닝 시스템의 검증 및 신규 연골재생 물질 탐색 실험을 위한 모든 실험군은 DMSO(dimethyl Sulfoxide)에 20 mM의 농도로 동일하게 용해하여 준비하였다. 실험 24시간 전 분석세포를 루미네선스(luminescence) 분석 전용 plate인 white-bottom 96-well plate에 well 당 10,000개의 초기 세포 농도로 분주하여 고정하였고, 다음날 7시간 동안 무혈청 배양액(DMEM/F12 media)에서 세포를 스타베이션(starvation)시켜 준비하였다. 그 후 혈청배양액[DMEM/F12, 10% FBS, 1% 페니실린(Penicillin), 및 스트렙토마이신(Streptomycin)]으로 교체해 주면서 동시에 각각의 20 mM로 준비된 천연물 실험군들을 1/400로 희석하여 3회 반복하여 처리해주고 48시간 동안 추가 배양하였다. 이때 처리된 천연물의 최종농도는 50μM이었고, 음성대조군으로는 상기 물질이 함유되지 않은 DMSO를 사용하였으며, 양성대조군으로는 상기 실시예 3 및 4에서 본 발명에 따른 스크리닝 시스템의 검증시험에 사용되었던, 연골재생 효능이 알려져 있는 천연물질인 카토제닌(Kartogenin)과 TD-198946을 동일한 농도로 사용하였다.

5.2. 연골재생 활성물질의 선별

상기 5.1에서 천연물질들이 처리된 분석세포들을 48시간 동안 추가배양한 후 배양액은 모두 제거하고 D-루시페린(D-luciferin)이 최종농도 150μg/ml으로 함유된 새로운 배양액으로 교체하여 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 각각의 세포들로부터 발광되는 정도를 TECAN SPARK 멀티리더의 루미네선스(luminescence) 분석기능을 활용하여 측정하였다. 각 물질을 본 발명에 따른 연골질환 치료제 스크리닝 시스템으로 검색한 후, 연골재생 활성을 지닐 것으로 추측되는 최종물질은, TD-198946이 카토제닌보다 더 높은 연골재생 활성을 보였으므로, 카토제닌의 연골재생 활성과 동등하거나 더 높은 것을 기준으로 선정하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 하기의 화학식 1로 표시되는, 26번 물질인 2-AQCA가 상기 조건에 부합되는 것을 확인하였다. 이에, 2-AQCA에 대하여 아래와 같이 연골재생 활성, 세포독성 및 연골분화 표지인자의 발현 양상을 검증하였다.

[화학식 1]

5.3. 2-AQCA의 농도별 연골재생 활성 검증

본 발명에 따른 연골질환 치료제 스크리닝 시스템을 활용하여 2-AQCA의 처리 농도에 따른 연골재생 활성의 변화 양상을 양성대조군 천연물질인 카토제닌(Kartogenin)의 활성과 비교 검토하였다. 세포의 준비 및 분석과정은 상기와 동일하였으며 다만, 시험물질의 처리농도는 최종적으로 각각 0, 3.125, 6.25, 12.5, 및 25μM가 되도록 세포에 처리하였으며, 실험 조건을 동등하게 하기 위해 모든 실험군의 최종 DMSO의 농도는 0.25%가 되도록 처리하였다.

그 결과 도 9에서 나타난 바와 같이, 2-AQCA를 농도별로 처리하였을 때, 양성대조군으로 사용된 카토제닌과 유사한 활성 증가 양상을 보였으며, 25μM 미만의 농도로 처리한 경우에는 카토제닌보다 활성이 다소 낮았으나, 25μM에서는 카토제닌보다 다소 높은 연골재생 활성이 나타남을 확인하였다.

5.4. 2-AQCA의 세포독성 검증

2-AQCA에 의한 세포성장률 저해 효과 및 독성 존재 여부를 확인하기 위해, 실험 24시간 전 분석세포(C28/I2 세포주 및 골관절염 환자로부터 분리된 연골세포)를 96-well plate에 well 당 10,000개의 초기 세포농도로 분주하여 고정하고, 다음날 7시간 동안 무혈청 배양액에서 세포를 스타베이션 (starvation)시켜 준비하였다. 그 후, 배양액을 10% FBS가 포함된 혈청배양액으로 교체해 주면서, 동시에 카토제닌(Kartogenin) 및 2-AQCA의 농도별 실험군들을 3회 반복하여 처리해주고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 시험물질의 처리농도는 상기 농도별 처리 효과 검증에 사용되었던 농도인 0, 3.125, 6.25, 12.5, 및 25μM을 세포에 각각 처리하였다. 마찬가지로 실험 조건을 동등하게 하기 위해 모든 실험군의 최종 DMSO의 농도를 0.25%가 되도록 처리하였다. 48시간 후 배양액을 모두 제거하고 세포를 well당 200μl의 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 2회 반복 세척하고, 1/10 부피의 EZ-Cytox(DoGen社, 대한민국)가 포함된 배양액 200μl를 첨가하여 다시 1 시간동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에 추가 배양하였다. 그런 후 TECAN SPARK 멀티리더를 이용하여 세포 각각의 흡광도를 450nm에서 측정하였다.

그 결과 도 10a 및 10b에서 나타난 바와 같이, 사람 연골세포주인 C28/I2 세포주에 카토제닌 과 2-AQCA를 농도별로 처리한 경우 독성에 의한 세포성장률 저해효과는 발견되지 않았다. 오히려, 두 가지 천연물질 모두 음성대조군(DMSO 처리군) 대비 세포성장률이 최대 47% 이상 상승되는 결과가 확인되었다(도 10a). 두 가지 처리물질의 세포성장률을 비교하면, 2-AQCA가 카토제닌보다 6.25μM 농도 구간에서 약 11%, 12.5μM의 농도구간에서는 약 8.2% 더 높은 세포성장률 상승효과가 나타났다. 동일한 방법으로 골관절염 환자로부터 분리된 연골세포에 카토제닌과 2-AQCA를 농도별로 처리한 경우에도, 시험물질의 독성에 의한 세포성장률 저해효과는 발견되지 않았으며, 12.5μM 이하의 농도 구간에서는 8~9% 이하의 연골세포주 실험과 유사한 세포성장률 상승 결과가 나타났다.

5.5. 2-AQCA 처리에 의한 연골분화 표지인자의 발현 양상 비교

장기간 연골분화유도 배양 시 복합기능성 천연물질 2-AQCA 처리에 의해 대표적인 연골분화 표지인자인 Col2a1, Sox9와 연골비후화 표지인자인 Col10의 발현 변화를 비교 검토하기 위해, C28/I2 세포주의 마이크로매스 배양(micromass culture)을 수행하였다. 이를 위해 3일간 배양된 C28/I2 세포를 회수하여 2 × 10⁷ cells/ml의 농도로 세포액을 준비한 후, 여기서 10μl의 세포를 취하여 24-well plate의 정중앙에 주입하고, 이를 2~3 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 바닥에 모두 붙을 때까지 고정하였다. 세포가 모두 고정되면 500μl의 혈청배양액(DMEM/F12, 10% FBS, 1% 페니실린, 및 스트렙토마이신)을 첨가하여 7시간 이상 추가 배양하였다. 다음날 안정적으로 세포 덩어리(cell mass)가 형성된 후, 각각의 천연물질이 첨가된 새로운 배양액으로 교체한 후 2~3일 간격으로 배양액을 교체해주면서 총 14일간 분화유도 배양을 실시하였다. 이때 천연물질의 처리 농도는 세포성장률이 가장 높았던 수준인 10μM을 사용하였으며 DMSO는 세포독성을 최소화하기 위해 0.1%를 사용하였다.

14일 간의 마이크로매스 배양이 종료된 후, 각각의 세포 펠릿(pellet)으로부터 TRIzol™을 사용하여 RNA를 분리하였고, 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 각 유전자에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 Rq-PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction)을 통해 해당 유전자의 발현을 비교 분석하였다. 해당 유전자들에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

Col2a1, 정방향, 5'-AACCAGATTGAGAGCATCCG-3' (서열번호 5);

Col2a1, 역방향, 5'-ACCTTCATGGCGTCCAAG-3' (서열번호 6);

Sox9, 정방향, 5'-ACTTGCACAACGCCGAG-3' (서열번호 7);

Sox9, 역방향, 5'-CTGGTACTTGTAATCCGGGTG-3' (서열번호 8);

Col10a1, 정방향, 5'-ACGATACCAAATGCCCACAG-3' (서열번호 9);

Col10a1, 역방향, 5'-GTACCTTGCTCTCCTCTTACTG-3' (서열번호 10);

Gapdh, 정방향, 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3' (서열번호 11);

Gapdh, 역방향, 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3' (서열번호 12);

Rq-PCR 분석을 수행한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 연골재생의 가장 중요한 표지인자인 Col2a1의 경우 2-AQCA의 처리에 의해 양성대조군인 카토제닌(Kartogenin) 처리군보다 약 4.2배 더 높은 발현율을 보였고, 천연물을 처리하지 않은 음성대조군 대비 7.6배 더 높은 발현율을 보이는 것으로 확인되었다. 또한, 연골세포에서 Col2a1 합성을 유도하는 주요 전사인자(transcription factor)인 Sox9의 경우, 카토제닌의 처리에 의해 음성대조군 대비 미미한 증가를 보인 반면, 2-AQCA 처리군은 2.1배 이상의 Sox9 유전자 발현이 증가됨을 확인하였다. 마지막으로, 연골세포의 비후화를 유도하여 세포사멸을 유도하는 Col10a1 유전자 발현의 경우는 카토제닌 또는 2-AQCA 처리군 모두에서 음성대조군 대비 약 40% 가량 발현이 감소됨을 확인하였다. 상기 결과들을 종합하면, 2-AQCA는 연골세포의 비후화를 억제하면서 연골분화 및 재생을 촉진할 수 있는 신규물질이며, 이는 기존에 연골재생물질로 알려진 카토제닌보다 그 효능이 월등한 물질임을 확인할 수 있었다.

종합하면, 상기 실시예를 통해 개시한 일련의 실험들을 통하여 본 발명에 따른 연골치료 유효약물 스크리닝 세포 시스템을 이용하는 경우, 연골재생 효과가 있는 연골치료제를 효율적으로 선별할 수 있으며, 이렇게 발굴한 신규 연골재생 물질인 2-AQCA가 기존에 알려진 연골재생 물질과 비교하여 더 우수한 연골재생 효과를 나타냄을 증명하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국세포주연구재단 KCLRFBP00456 20180903

<110> Lugen Sci Co., Ltd. <120> Human transformed chondrocyte cell line mediated drug screening system for cartilage disease remedy <130> MP18-073 <150> KR 10-2018-0106190 <151> 2018-09-05 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1 promoter <400> 1 cccgggtttg gggggcaggg gccatctctg cgccccgccc gatcaggcca ctcggcgcac 60 taggggtgga gggcgggaag cgtgactccc agagaggggg gtccggcttg ggcaggtgcg 120 ggcactggca gggcccaggc gggctccggg ggcgggcggt tcaggttaca gcccagctgg 180 gggcaggggg cggcccgcgg tttgggcgag ttcgccagcc tcgaaagggg ccgggcgcat 240 ataacgggcg ccgcggcggg gagaagacgc agagcgctgc tgggctgccg ggtctcccgc 300 ttcctcctcc tgctccaagg gcctcctgca tgagggcgcg gtagagaccc ggacccgcgc 360 cgtgctcctg ccgtttcgct gcgctccgcc cggg 394 <210> 2 <211> 725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1 Promoter Enhancer <400> 2 gaattcggcc acacccctcc tctccatctt tccacgagtt tgagaaactt actggcggcg 60 gcgtctttga ccctcatctg catttcagag ccctcgcctc cgaaagtgcc 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gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 6360 caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 6420 tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt 6480 taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 6540 gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gataagatct gctttttgct tgtactgggt 6600 ctctctggtt agaccaaatc ggagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 6660 ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 6720 actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta 6780 gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga 6840 gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 6900 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6960 atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca gttccgccca 7020 ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 7080 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga 7140 cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 7200 aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 7260 gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 7320 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 7380 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 7440 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 7500 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 7560 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 7620 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 7680 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 7740 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 7800 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 7860 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 7920 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 7980 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 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aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 8880 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 8940 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 9000 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 9060 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 9120 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 9180 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 9240 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 9300 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 9360 gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 9420 catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 9480 ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 9540 agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 9600 gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 9660 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 9720 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc 9780 caagctg 9787 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Col2a1 <400> 5 aaccagattg agagcatccg 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Col2a1 <400> 6 accttcatgg cgtccaag 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Sox9 <400> 7 acttgcacaa cgccgag 17 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Sox9 <400> 8 ctggtacttg taatccgggt g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Col10a1 <400> 9 acgataccaa atgcccacag 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Col10a1 <400> 10 gtaccttgct ctcctcttac tg 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Gapdh <400> 11 acatcgctca gacaccatg 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Gapdh <400> 12 tgtagttgag gtcaatgaag gg 22

Claims (16)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 Col2a1 프로모터(Col2a1 promoter; C2P), 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Col2a1 프로모터 인헨서(Col2a1 promoter enhancer; ENS), 및 리포터 유전자를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 Col2a1 프로모터 및 Col2a1 프로모터 인헨서는 인간 간엽줄기세포에서 유래한 것을 특징으로 하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 발현벡터는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 발현벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 연골질환 치료제 스크리닝용 재조합 발현벡터.
   
9. 제1항의 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스로 형질전환된 연골질환 치료제 스크리닝용 형질전환 세포주로서,
   상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00456의 C28/I2-EC2P-fLuc-CN5인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
   
10. 삭제
11. 삭제
12. 제9항의 형질전환 세포주에 후보약물을 처리하는 단계; 및
    상기 후보약물을 처리한 형질전환 세포주에서 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 연골질환 치료제 스크리닝 방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 상기 측정된 리포터 유전자의 발현 또는 활성 정도가 클수록 손상연골의 재생 활성이 더 우수한 약물로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 연골질환 치료제 스크리닝 방법.
    
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15. 삭제
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