CN111849985A - 一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，从而实现各种复杂的基因编辑。本发明利用Cas9核酸酶同时在基因组和供体DNA中个产生两个双链断裂，并实现供体DNA的两个双链断裂间片段置换基因组中两个双链断裂间的DNA片段，为高效地实现复杂的靶向基因编辑提供了新的途径。

Description

一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法
技术领域
本发明涉及基因技术领域，具体涉及改造基因组的构建物及改造方法。
背景技术
斑马鱼是生命科学研究重要模式动物之一。与人类相比，斑马鱼的组织器官具有较高的保守性和代表性。同时，斑马鱼体型较小且幼鱼透明，在目前实验室技术条件下，可方便的实现动态地观察组织器官发育和各种生理活动。为充分发挥斑马鱼在研究上的诸多优势，需要建立针对其基因的多种操作方法，制备基因功能缺失的突变体或将外源基因导入到特定的基因位点中。目前，在斑马鱼中，产生基因功能缺失的方法已成熟，并已经被广泛应用。然而，定向敲入外源基因的转基因技术还很不成熟，尤其是制备各种点突变或条件性敲除，这是目前制约斑马鱼研究领域发展的瓶颈之一。
目前，定向敲入外源基因的方法主要有两种。一种是通过同源重组的方式来实现的。这种方法往往构建的效率比较低，应用上有时会借助于指示正确重组的报告基因的筛选，这使得许多定向敲入的要求不能达到。另一种是通过非同源重组的方法定向插入一段基因。这种方法往往在插入的同时带入了一些多余的核苷酸序列，且不能实现目的片段的多个位点的编辑等一些复杂编辑。
基因置换是实现各种复杂基因编辑的根本途径。为此，还需要开发新的基因改造方法，以实现向基因组中片段的定向置换为外源基因，同时尽可能少的改变内源基因本身。
目前使用的用于制作各种基因编辑斑马鱼的方法存在一些缺点，如制作周期长、效率低、外源基因表达特异性差、内源基因被破坏、复杂编辑难以实现等。目前，缺乏一种效率高的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法。
发明内容
为了克服上述现有斑马鱼中实现基因置换技术中的制备周期长和成功效率低的问题，本发明的目的是提供了一种不依赖于同源重组而依赖于非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的高效方法。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的内含子、外显子、顺式作用元件和非翻译区段UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列(共两个)；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
进一步地，在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列，所述的外源DNA包括表达标签基因序列、报告基因、结构基因、功能基因或重组酶识别序列。
进一步地，在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸；在步骤(1)中，所述的目标的基因为胶质纤维酸蛋白基因或酪氨酸羟化酶基因。
更进一步地，在步骤(1)中，所述的目标基因为胶质纤维酸蛋白基因，靶序列分别为GTTAAGTTTACTTAATCGGG和GGAATGATGGATTTGGTCAG，所述的同源臂序列如SQR ID NO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中第1120-2445位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列如SEQ ID NO：1中的第331-1113位所示。
进一步地，在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGGTTGTTACACTCATAAAG和GAATTAAGCCAACACATTCA；所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：2中第414-1695为所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：2中第2530-3202位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列，如SEQ ID NO：2中的第1712-2494位所示。
进一步地，在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGATTTGCTATGCCATAGTAG和GTGTTGCCGAACTGAATGG；所述的同源臂序列如SEQ ID NO：3中第7-1005为所示；所述的有同源臂序列如SEQ ID NO：3中第1909-2739位所示；所述的外源基因为两个loxP位点，如SEQ ID：3中的第1012-1045和第1869-1902位所示。
更进一步地，在步骤(2)中，制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸。
进一步地，在步骤(2)中，制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
进一步地，在步骤(3)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列；获得loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，以斑马鱼基因组为模板，以loxP融合序列PCR引物扩增获得loxP-th_exon8-loxP融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。
本发明所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段培养斑马鱼的方法，包括如下步骤：
(1)利用所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为斑马鱼个体。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，所述的试剂盒包括：(1)所述的供体质粒或DNA片段；(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
有益效果：本发明利用Cas9核酸酶同时在基因组和供体DNA中个产生两个双链断裂，并实现供体DNA的两个双链断裂间片段置换基因组中两个双链断裂间的DNA片段，为高效地实现复杂的靶向基因编辑提供了新的途径。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的方法应用于制作基因编辑的斑马鱼时，极大地提高了制作效率，并且可实现多种复杂的遗传编辑。运用本发明的方法，高效地实现了对斑马鱼内源基因的定向操作，成功地将不同的外源基因置换内源基因的目标区段。与传统的同源重组实现基因置换的方法相比，本发明的方法具有很高的效率，且不限于同源臂的长短，是目前建立通过置换制备基因编辑斑马鱼品系的最佳方法。
(2)本发明特别适用于在斑马鱼基因组中实现外源基因的置换。在模式动物中实现内源基因的特定遗传操作是生命科学研究的重要工具，斑马鱼是近年来新兴的一种脊椎动物模型。
附图说明
为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述；
图1为本发明的非同源重组介导的EGFP敲入到斑马鱼gfap基因中的示意图；该示意图以斑马鱼gfap基因为例，将gfap的E9(两个sgRNA靶点间的序列，含第9个外显子)替换为E9-P2A-EGFP。
(A)在斑马鱼gfap基因座处非同源性末端连接介导的基因置换方法的示意图；E9代表gfap的第九个外显子。终止密码子用粉红色线表示；左右两侧的导向gRNA序列为sgRNA1和sgRNA2，分别用红色和蓝色的箭头指示。中间的环表示用于置换的供体质粒；EGFP和E9之间使用可实现共表达的P2A序列连接，同源臂用带双箭头的褐色线表示，左右同源臂的长度分别为324个碱基对和1326碱基对。将供体与sgRNA1，sgRNA2和zCas9 mRNA共同注射后，内源性E9在gfap位点被E9-P2A-EGFP序列取代。黑色箭头表示用于鉴定的引物，包括目标区段的左侧、右侧连接处鉴定的引物；
(B)与野生型斑马鱼和供体载体的序列相比，筛选得到的两个稳定品系F1后代置换区段的5'和3'连接序列，插入或删除(indel)突变以黄色突出显示，PAM和sgRNA靶序列分别以绿色和红色显示。5'和3'交界处碱基对的插入(+)和/或删除(-)数目显示在右侧的括号中。
(C)代表在不同区域的斑马鱼置换品系Ki(gfap-P2A-EGFP)三天大的幼鱼活体共聚焦成像。侧面观：C1，C4，C6；背测观：C2，C3，C5，比例尺分别为：250μm(C1)，50μm(C2)和25μm(C3-C6)；
图2为本发明的非同源重组介导的EGFP敲入到斑马鱼th基因中的示意图；
(A)在斑马鱼th基因座处非同源性末端连接介导的基因置换方法的示意图；E13代表th的第13个外显子。终止密码子用粉红色线表示；左右两侧的导向gRNA序列为sgRNA3和sgRNA4，分别用红色和蓝色的箭头指示。中间的环表示用于置换的供体质粒。EGFP和E13之间使用可实现共表达的P2A序列连接。同源臂用带双箭头的褐色线表示，左右同源臂的长度分别为1282个碱基对和671碱基对。将供体与sgRNA3，sgRNA4和zCas9 mRNA共同注射后，内源性E13在th位点被E13-P2A-EGFP序列取代。黑色箭头表示用于鉴定的引物，包括目标区段的左侧、右侧连接处鉴定的引物；
(B)与野生型斑马鱼和供体载体的序列相比，筛选得到的一个稳定品系F1后代置换区段的5'和3'连接序列。插入或删除(indel)突变以黄色突出显示，PAM和sgRNA靶序列分别以绿色和红色显示。5'和3'交界处碱基对的插入(+)和/或删除(-)数目显示在下方的括号中；(C)背侧观代表在不同区域的斑马鱼置换品系Ki(th-P2A-EGFP)三天大的幼鱼活体共聚焦成像。HI，下丘脑中段；LC，蓝斑；MO，延髓；OB，嗅球；Pre，前脑；PT，后结核，比例尺分别为：100μm。
图3为本发明的非同源重组介导的条件性敲除片段敲入到斑马鱼th基因中；
(A)在Ki(th-P2A-EGFP)斑马鱼中利用非同源性连接介导的基因置换实现制备th基因条件性敲除的方法示意图；其中P2A和EGFP的编码序列顺序连接到th编码序列的3'侧，这样EGFP可在th表达细胞中表达。左右两侧的导向RNA为sgRNA1和sgRNA2，分别由红色或蓝色箭头指示；中间的环表示用于置换的供体质粒，在th的条件性供体中，目标区段的两侧各添加了一个loxP位点，同源臂用带双箭头的棕线表示。左臂和右臂的长度分别为999个碱基对和831个碱基对。E7，E8和E13分别代表th的第7、8和13个外显子，E8的长度为136bps，将供体与sgRNA1，sgRNA2和zCas9 mRNA共同注射后，内源性E8在th位点被loxP-exon8-loxP序列取代，黑色箭头表示用于鉴定的引物，包括目标区段的左侧、右侧连接处鉴定的引物，(B)与野生型(WT)动物和供体载体的序列相比，携带DNA替换(3#，13#和30#)的三个品系的F1后代在目标区段的5'和3'连接序列。插入或删除(indel)突变以黄色突出显示，PAM和sgRNA靶序列分别以绿色和红色显示。5'和3'交界处碱基对的插入(+)和/或删除(-)数目显示在右侧的括号中；(C)th条件性敲除品系的整个目标区段PCR验证，显示在杂合[Tg(dat:mRFP-Cre)；Ki(thfl-P2A-EGFP)]中由引物F1和R1扩增的～2.3kb处的另一个产物(红色箭头)；该产物应该是由Cre介导的删除导致。原始序列为～3.2kb，Cre介导的切除～0.9kb后产生(见A)。(D，E)投影的[Tg(dat:mRFP-Cre)；Ki(th-P2A-EGFP)](D)和[Tg(dat:mRFP-Cre)；Ki(thfl-P2A-EGFP)](E)受精后5天的幼鱼，表明在条件敲除胚胎中，表达mRFP-Cre的细胞(红色)不表达EGFP；在D1-D3和E1-E3中分别示出了由(D)和(E)中的矩形勾勒出区域的放大图；HI，下丘脑中段；LC，蓝斑轨迹；OB，嗅球；Pre，前期；PT，后结核。比例尺分别为：100μm(D，E)，20μm(D1-D3，E1-E3)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
其它常用于进行基因编辑操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用，例如显微注射用的试剂等。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的内含子、外显子、顺式作用元件和非翻译区段UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列(共两个)；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列(见图1A，上侧)；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列(见图1A，中间)；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞(见图1A，下侧；见图1B，1C)。
在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列，所述的外源DNA包括表达标签基因序列、报告基因、结构基因、功能基因或重组酶识别序列(见图1，图2，和图3)。
在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸；在步骤(1)中，所述的目标的基因为胶质纤维酸蛋白基因或酪氨酸羟化酶基因(见图1，图2，和图3)。
在步骤(1)中，所述的目标基因为胶质纤维酸蛋白基因，靶序列分别为GTTAAGTTTACTTAATCGGG和GGAATGATGGATTTGGTCAG，所述的同源臂序列如SQR ID NO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中第1120-2445位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列如SEQ ID NO：1中的第331-1113位所示。
在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGGTTGTTACACTCATAAAG和GAATTAAGCCAACACATTCA；所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：2中第414-1695为所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：2中第2530-3202位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列，如SEQ ID NO：2中的第1712-2494位所示。
在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGATTTGCTATGCCATAGTAG和GTGTTGCCGAACTGAATGG；所述的同源臂序列如SEQ ID NO：3中第7-1005为所示；所述的有同源臂序列如SEQ ID NO：3中第1909-2739位所示；所述的外源基因为两个loxP位点，如SEQ ID：3中的第1012-1045和第1869-1902位所示。
在步骤(2)中，制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸。制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
在步骤(3)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列(见图1A，图2A)；获得loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，以斑马鱼基因组为模板，以loxP融合序列PCR引物扩增获得loxP-th_exon8-loxP融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基(见图3A)。
本发明所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段培养斑马鱼的方法，包括如下步骤：
(1)利用所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为斑马鱼个体。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)所述的供体质粒或DNA片段；
(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；
(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
实施例1
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源gfap基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)以基因组中gfap基因的非翻译区段内含子和UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列(共两个)；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列。
在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸。
在步骤(2)中，制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸。制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
在步骤(1)中，所述的左同源臂序列如SQR ID NO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中第1120-2445位所示。
在步骤(3)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP和loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列如SEQ ID NO：1中的第331-1113位所示。
进一步地，包括如下步骤：(1)利用权利要求9所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为个体。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)权利要求9所述的供体质粒或DNA片段；
(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；
(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
实施例2
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源th基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的非翻译区段内含子和翻译区段外显子作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列(共两个)；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列。
在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸。
制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸。
制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
在步骤(1)中，所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：2中第414-1695为所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：2中第2530-3202位所示。
在步骤(3)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP和loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列如SEQ ID NO：2中的第1712-2494位所示。
包括如下步骤：(1)利用权利要求9所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为个体。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)权利要求9所述的供体质粒或DNA片段；
(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；
(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
实施例3
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源th基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的非翻译区段内含子作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列(共两个)；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列。
在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸。
制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸。
制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
在步骤(1)中，所述的同源臂序列如SEQ ID NO：3中第7-1005为所示；所述的有同源臂序列如SEQ ID NO：3中第1909-2739位所示。
在步骤(3)中，供体斑马鱼基因组为模板PCR扩增loxP-th_exon8-loxP的DNA片段；所述的loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，如SEQ ID：3中的第1006-1908位所示；所述的外源基因为两个loxP位点，如SEQ ID：3中的第1012-1045和第1869-1902位所示。
包括如下步骤：(1)利用权利要求9所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为个体。
本发明的一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)权利要求9所述的供体质粒或DNA片段；
(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；
(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
实施例中，基因置换的主要设计思路如下：
1、设计针对目的基因的目标区段两侧序列中特异的导向RNA。
2、以PDM-19T为骨架，构建供体质粒。质粒包括三部分：左臂序列、外源序列和右臂序列。左臂的序列为目标区段5’上游的基因组序列，且包含左侧导向RNA靶点序列。左臂序列后面紧跟着外源序列。接下来是右臂，右臂目标区段的3’下游序列，且包含右侧的导向RNA靶点序列。
3、将上面合成好的导向RNA和供体质粒，连同优化的斑马鱼Cas9 mRNA，共同显微注射到一细胞期的斑马鱼受精卵中。
材料和方法：
1、供体质粒的制备
1.1.获得P2A-EGFP和loxP-th_exon8-loxP的DNA片段
以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列；以斑马鱼基因组为模板，以loxP融合序列PCR引物扩增获得loxP-th_exon8-loxP融合序列。PCR引物加入酶切位点和保护碱基。
P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物：
F：
ccaggatccggagctactaatttctccttgcttaagcaagctggtgatgttgaagaaaatcctggtcctatggtgagcaagggcgagga(SEQ ID NO:4)；
R：ttaaccggtcttgtacagctcgtccatgcc(SEQ ID NO:5)。
R2：
ttaaccggtGAATTAAGCCAACACATTCAGGGcatctttacttgtacagctcgtccatgcc(SEQ IDNO:6)
loxP-th_exon8-loxP融合序列PCR扩增引物：
F：
tccggatccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATctctgaaaacccaggcatca(SEQID NO:7)；
R：actaccggtATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATtgacgtcacccattcaaagt(SEQID NO:8)。
P2A序列是一种被剪切的序列，用于分别表达P2A序列前后两种蛋白。EGFP序列来自质粒pEGFP-N1(Clonetech)。loxP为Cre重组酶识别的序列，同向的两个loxP间的序列可被Cre酶所删除。
1.2.制备最终置换受体质粒
用斑马鱼基因组DNA为模板，分别设计引物通过PCR扩增各基因的左臂右臂。设引物带入酶切位点和保护碱基。将扩增的左臂使用不同的内切酶双酶切，再将右臂同样双酶切，同样将pMD-19T载体(购自Takara)双酶切。将上述3个双酶切片段与需置换的酶切片段连接形成最终的供体质粒。
上述片段的具体使用引物和对应的内切酶如下标注：
胶质纤维酸性蛋白基因(gfap)用于EGFP置换
左臂F ctcggtacctggtgtagggcagtggaggt(SEQ ID NO:9)
左臂R tccggatcctggcagatccttcctctccg(SEQ ID NO:10)
右臂F aagaccggttaataaggctcagacactgg(SEQ ID NO:11)
右臂R aggtcgacattcacaaatacaggcaaat(SEQ ID NO:12)
酪氨酸羟化酶基因(th)用于EGFP置换
左臂F ctcggtaccgcgattacatggcgtagtac(SEQ ID NO:13)
左臂R tccggatccggccaatacgttaagtgcatctgtgagaatcttcag(SEQ ID NO:14)
右臂F TTCaccggttaattctgcttaatcattcc(SEQ ID NO:15)
右臂R aggtcgacatgggaacctcctagtacct(SEQ ID NO:16)
酪氨酸羟化酶基因(th)用于条件性敲除的置换
左臂F ctcggtacctgaatactgcttagagtgag(SEQ ID NO:17)
左臂R TATggatccggatttgctatgccatagta(SEQ ID NO:18)
右臂F TATaccggtagtgttgccgaactgaatgg(SEQ ID NO:19)
右臂R cagGTCGACtgtctttctggtgtttcccg(SEQ ID NO:20)
2、sgRNA和zCas9 mRNA的合成
表达zCas9的质粒pGH-T7-zCas9获自北京大学生命科学院。将该质粒用Xba I内切酶线性化后，用mMACHINE T7 Ultra kit(Ambion)试剂盒转录纯化，获得zCas9 mRNA。
用于制备不同sgRNA的DNA序列如下所示：
gfap：GTTAAGTTTACTTAATCGGG(SEQ ID NO:21)(reverse strand，在反义链上)；
gfap：ggaatgatggatttggtcag(SEQ ID NO:22)(forward strand，在正义链上)；
th：GGGTTGTTACACTCATAAAG(SEQ ID NO:23)(reverse strand，在反义链上)；
th：GAATTAAGCCAACACATTCA(SEQ ID NO:24)(forward strand，在正义链上)；
th：GGATTTGCTATGCCATAGTAG(SEQ ID NO:25)(reverse strand，在反义链上)；
th：和GTGTTGCCGAACTGAATGG(SEQ ID NO:26)(forward strand，在正义链上)；
分别将上面的sgRNA序列克隆到pT7-sgRNA质粒(获自北京大学生命科学院)的BbsI位点中，通过MAXIscript T7 Kit(Ambion)，进行体外转录，并用mirVanaTMmiRNAIsolation Kit(Ambion)试剂盒回收，获得导向RNA。
3、斑马鱼品系及饲养
成年斑马鱼采用北京爱生公司水生动物养殖系统，培养在水温28℃，pH7-8，以及光周期14小时亮/10小时暗的环境中。胚胎饲养在10％的Hank’s溶液中。溶液成分如下(毫摩)：140NaCl，5.4KCl，0.25Na2HPO4，0.44KH2PO4，1.3CaCl2，1.0MgSO4和4.2NaHCO3(pH 7.2)。
4、显微注射
zCas9 mRNA，sgRNA和供体质粒一起通过显微注射注入到一细胞期的斑马鱼受精卵中。每个受精卵注入1nl液体。其中含有600ng/μl zCas9 mRNA，100ng/μl sgRNA，和15ng/μl供体质粒。受精卵在体外培养条件下(见3.斑马鱼饲养)可以直接发育为斑马鱼。
5、PCR验证基因组置换
提取斑马鱼胚胎的基因DNA，利用PCR方法鉴定正确的插入和基因置换，使用引物如下：
gfap-LF：TAATTCAGGATCCCACACAACTCG(SEQ ID NO:27)；
EGFP-R：CTCGCCCTTGCTCACCATAG(SEQ ID NO:28)；
EGFP-F：catggtcctgctggagttcgtg(SEQ ID NO:29)；
gfap-RR：TTGCTTGAAGGCACTACTAGG(SEQ ID NO:30)；
th-LF：ATTCCGCCGAAACGCAGTAAAGA(SEQ ID NO:31)；
th-RR：AGTGTACCGTAAAGGTGTTA(SEQ ID NO:32)；
th-F:TACAGCCCAGATAACATCCCT(SEQ ID NO:33)；
thLloxp-R:TGGGTTTTCAGAGATAACTTCGT(SEQ ID NO:34)；
thRloxp-F：ATGGGTGACGTCAATAACTTCGTA(SEQ ID NO:35)；
th-R：GAAACAGACTATGACTGAATGAGTT(SEQ ID NO:36)。
6、共聚焦成像
共聚焦成像使用FV1000共聚焦显微镜(Olympus，Japan)，用20倍或者40倍的水镜(N.A.，0.80)以光切片的方式在Z轴方向采集连续的荧光图片。所有图片的分辨率是1024×1024或者800×600。后期通过ImageJ软件(NIH)重构结构形态。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京歆佳医药科技有限公司
<120> 一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5110
<212> DNA
<213> 人工序列(胶质纤维酸蛋白基因序列)
<400> 1
ggtacctggt gtagggcagt ggaggttaca gacaggaaag tattggcagc agagaggggg 60
gagggttagt aaaggacctt gagcagggaa tcgaactcgg gtcgccatga gaactgtggt 120
gctacagtat atgtcggcaa acttaaccac taggctattg gcgccgcccg attaagtaaa 180
cttaacaaat ttaagtggat taaacataaa acaattaagt tgtccccaaa aacagaacag 240
aattgtgttg attctgctca ttcttcattt tacacattct ctcttttgca gatcattaaa 300
gagtccacta cggagaggaa ggatctgcca ggatccggag ctactaattt ctccttgctt 360
aagcaagctg gtgatgttga agaaaatcct ggtcctatgg tgagcaaggg cgaggagctg 420
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 480
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 540
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 600
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 660
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 720
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 780
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 840
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 900
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 960
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 1020
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 1080
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagaccggtt aataaggctc agacactggc 1140
ttggctgcag aagaagatct ccttcactaa tgcttcagga agctgtgttt gtcaaacctt 1200
gtattttctc accaactttc cctgcttctc tcctggtata tatagttcat ggaaactgta 1260
ttcactgttt ttagcaacta cctatatgtt ttgatctcct tttcttcctg ggcttctctt 1320
tttatctgtc tgtttcttct gtggcagcgt ctttgcaaga tagtagacta gtttatcgca 1380
gaatgtgcta taaaaagtca tggttggaca gatgaagtaa acagtaggac aagatgtagc 1440
tagtggtcag agcaggtggg aaatatagtg gttttttttt tgtcaagcat aaattgtaga 1500
gaacaagttc ttgagcttta ttgtagtctt taagaatgcc agaagaaaaa aagagcaagt 1560
ctggagctgg tagtttttaa atctgaacag taggtgttaa agtaaggcag aagggaattt 1620
taacagcaag atgtttgtaa gagttttaaa ggaatgatgg atttggtcag cggtgctatt 1680
tgaacatttt actccacatt ttttttgtcc tcctccactg tgtgtgtgct cagtgttttt 1740
gcacagtagc taactcatct cttggaccta ggttaaaatg ctttaaattg ctcgttgaca 1800
cattactgac ctgtagaaga cattaaaatc ttaacattaa gcatcttact gaatgaatta 1860
tggtataaat atctgacaca gtgttcccca tcatgtgacc agatcatttg attcagattt 1920
atactgatag ctttcaattg tcacgcttac atttccttgg tgaaattgag caatttttcc 1980
atttccatct gtgtgatcag gcacttttgc atgagggtga aaggttcctc ctgcagttta 2040
tgcttacatt tgagttgtta ttctgaattg cacaaatatc atcttggttt gaaagtgact 2100
taagtgtgag cagtgtttca cacatcacta caatgttaat aatatgcatt aataataatc 2160
aaaactgtga ccatatcttc actgtgagat aacattgctt gatttacacc gttttcaact 2220
aagatggact aactttcata ctgaattgga cattacttct ttgtggtgcc ttatattaat 2280
agaaattaaa aaaaagaaaa atttttatat gttagtgtcg gttctgtttg tcaactaata 2340
tctatgttaa gtgtcagcac tgcaactgat acattatgat aattatgacc taataaagtt 2400
tagattgtag tcttttaaat actgcatttg cctgtatttg tgaatgtcga cctgcaggca 2460
tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 2520
aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 2580
gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 2640
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 2700
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 2760
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2820
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2880
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 2940
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 3000
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 3060
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 3120
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 3180
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 3240
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 3300
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 3360
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 3420
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 3480
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 3540
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 3600
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 3660
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 3720
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 3780
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 3840
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 3900
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 3960
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 4020
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4080
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 4140
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 4200
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 4260
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 4320
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 4380
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 4440
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 4500
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4560
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 4620
aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 4680
gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 4740
catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 4800
ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 4860
agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 4920
gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 4980
atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 5040
attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 5100
attcgagctc 5110
<210> 2
<211> 5460
<212> DNA
<213> 人工序列(酪氨酸羟化酶基因序列)
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accgcgatta 420
catggcgtag tacgctattt atattctcct ggatattgta taagtgtggt ggtgcttgct 480
tctgattttt atataatcca ttaacatatt tatacacata gctaggcctg tttataaact 540
tttatgttca aaaaagcttg tacacatgga tgtattaaaa gaacttttat tacctgctgc 600
cttttcttcc gtttacacag tttttttttt actttctccc ctttatgagt gtaacaaccc 660
ctgggtagtc taggggagtg gggttgcaca cttgaccgaa gattttgttc aaataaacgc 720
tcaaagaaaa ttgtactcaa agtaatgacc acatacaaga attgctgtgc aaataaagtg 780
atttattaca ggtggtgata agtgaagcag tgagtgagct atttacaata tttacaattc 840
acaaccaaaa caaaacataa attagaaaga ctggctatgg gtggcgctaa agcaaagaaa 900
caatcaaaac caaacagtct tactaatatc aaatccctgc taatctagtc taataaacaa 960
taatgtgaaa aataaatctt gattgtccaa gatgtcttac ctaaactacc taaaaacgtt 1020
tggaagtcta taaaagttgt tcagcatttc ttattttgat caatttaaac aattataaag 1080
aacacaaaac ataaacattt tgatgttatg atagcaattc caatgtagaa gaatcacttt 1140
ctgccctcca tacacaaata aattcagatg gaggctccat ctgaattttg tgcgtcaaca 1200
atgacgtcat gtgaaaacaa cctattgcat gcatttggaa atgtacaata acattgcaac 1260
aaccaacaca acaacaacca caattataat aataatatca gcgataataa caataataaa 1320
aaatatagat tttattctta ttaaaaatag ttttaaaatc acaaagcaaa aagatgcgat 1380
aatgagataa aactttctga agttttcaca gtatgtcaac tatcattttt ttgaactagc 1440
ttttaaaaaa atgcaattaa ctttttttaa agacatatcc cttaaaacag catgaattga 1500
ctaatcacat ttttatttct taaatgtttt ttatttgtta attattattt acagaacata 1560
tgtgacccgc atcaagcgac cgttttctgt gcggttcgat ccgtacacgg acagcataga 1620
agtgctggac aacccactga agatccagaa aggcctggag accataaaag atgaactgaa 1680
gattctcaca gatgcactta acgtattggc cggatccgga gctactaatt tctccttgct 1740
taagcaagct ggtgatgttg aagaaaatcc tggtcctatg gtgagcaagg gcgaggagct 1800
gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 1860
cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 1920
ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg 1980
cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 2040
catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 2100
gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 2160
catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 2220
ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 2280
ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc 2340
catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct 2400
gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc 2460
cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaaga tgccctgaat gtgttggctt 2520
aattcaccgg ttaattctgc ttaatcattc ctctatgctt catgtgtgac ggtctcattg 2580
ttatgctgtg cttctatgtc tactgtacat ctgctgctat agacattgtt gcttctaaaa 2640
tactgaatga aaaactttaa accttcagcg ttaaataatg tatccaaaaa tgaaagttca 2700
ccactcaaac tcacattaca gtagaatatg ataatagaga tagagaaaga gagagacaga 2760
gagagacttt tatttctgaa tgaacttttt ttattttttt ttttaagtca tatatgatca 2820
aaatttaaaa tgataacatt ttccgctata attttcattt tggggtaaat tataactcgt 2880
ctaaacagaa atttctgata tgacatttaa ttaatttatg tacaggattt atttatattt 2940
cagatagacg taccctcatt attaaagctt tttaagtcaa aaggtatata tgaaatatta 3000
ccagaggtca tattcacaat acatattaag cctaaaagca gatcctaagt ttacaatata 3060
tatactccaa catacaaata aacatacaaa atctgtcact gaggtggtac tttttcaaaa 3120
aatacatttt tgtaaaataa agatggacat tagaatcttt agggtacact tttgtacctt 3180
aaaggtacta ggaggttccc atgtcgacct gcaggcatgc aagcttggcg taatcatggt 3240
catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 3300
gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 3360
tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 3420
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3480
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3540
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3600
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3660
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3720
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3780
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3840
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3900
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3960
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4020
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4080
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4140
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4200
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4260
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4320
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4380
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 4440
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 4500
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 4560
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 4620
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 4680
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 4740
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 4800
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 4860
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 4920
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 4980
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 5040
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 5100
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 5160
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5220
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 5280
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 5340
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 5400
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 5460
<210> 3
<211> 5404
<212> DNA
<213> 人工序列(FDF)
<400> 3
ggtacctgaa tactgcttag agtgaggcaa gaacctggga gcttacattg gtgacatgac 60
tttgatggta gtgaggttta ggggtgtggg cagagtgtaa attacatggg ttttggggga 120
ttgaccgccc taattaattc ttgctctcac tctgaaggac atcaaaacaa catgtatggg 180
aggtcagccc tcttaatagt gagaaatagt ttgttctaat ctgtatctta aataataaca 240
ttaattaaaa caagagatta tataaatatg catttgtcca cccctatgat gttgcatacc 300
attgtaaatg catattggca tcatgccaat cagtgtatac cagaaaaaaa tcattcaaca 360
gtctgaaaca cgattcggtt ctagagggct attaccaaac ccaaccatca ttgggaatga 420
gcaaattgta gactactaag tcaaaattat tacccccctg tattattagc cccctgttta 480
ttttttcccc aatttctgtt taatggagag aagatttttt caaaacattt ctaaacataa 540
tatttttaat aactaatttc taataactga tttattttat ctttgtcatg atgacagtaa 600
ataatatttt actagatatt tttcaagaca cttctataca cttctataaa gtgacattta 660
aaggcttaac taggttaatt aagttaatta ggcaggttag ggtaattagg caagctattg 720
tataatgatg gtttgttctg taaactatta aaaaataatt agcttaaagg ggctaataat 780
tttgacttta aaatgatgtt taaaaaatta aaaactgctt ttattctagc caaaataaaa 840
caaataagac tttctccaaa agaaaaatca ttatcagaca tactgtgaaa aattctttgc 900
tctgttaaac atcatttggc aaatatttaa agaagaaaaa aaaaatcaaa gggggttcaa 960
taattcttat ttcaactgta acccctacta tggcatagca aatccggatc cataacttcg 1020
tatagcatac attatacgaa gttatctctg aaaacccagg catcaacaca gctcatcaaa 1080
attaccatga atattctagc aaccaccaga aaccctagaa acaacttact gtaacaatgc 1140
agtagcagat acttcaaaca cctaaatact attgtcatag caaacaacca ggatgacatt 1200
gaaatgtgac aaccagtaag aatgacagaa tgacagacca atctctctct ctctctctct 1260
ctctctgttt gatctttttt catggataaa gaacgcacag gatttcagtt gaggccagtg 1320
gcaggtttgc tctcagcacg cgattttttg gccagcctgg cttttcgtgt gttccagtgc 1380
acacagtaca tacggcacgc ttcctccccc atgcactccc ctgaaccgta agagacttcc 1440
tgtcacatat ttcacattta tcaagacact tcctgtttat taagcattga tttatatcaa 1500
ggcgtaggct tggtgcactc atccaaacct gctaaaaagg tcaaataaaa tgaaaggtgc 1560
tgtacaaaaa tcaaataaaa caaaaacaaa attgtaatcc ttgttaaaaa gtactgcata 1620
attaaaacaa atgcttatta gaaaaaaaat tcctttcctc cctttcactt gccacagtgg 1680
aatgaactgc caactactct ggcatatgtt ttacacagcg gctaagacgt tctgcaaatg 1740
gtcaaatgta cacgttcctc agcttttaag ccacaaaatg tatataaata gcttactatc 1800
aattcttgta ttcacttaaa cctttgctaa ctccataatg attatttcac tttgaatggg 1860
tgacgtcaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt ataccggtag tgttgccgaa 1920
ctgaatggtg gcttcttcat ggtcgttgct cgttgcagaa agtgggaatt tcttaaaatt 1980
tcaaaaacga aagcgtccgc caatcagatc gcttgatgca aattccccag ctcaggcagt 2040
agccgttagc agacttgttt cattggctga tgctgctatg acaattgcgt cagccccaac 2100
tgcagacacg ccctctgtca agcgttgacg ctgaagcctc gtgtgaatcg gatgtaatac 2160
ggctgtttgt aaaagcacac tgtggcaatt gttgctcaaa actaatctca attagagaga 2220
attgtaatgc atttgggaaa tctaagaatc aatgctgaac catttatcga tttgcaaggc 2280
attgatcatt ccagctttaa taaactactt taaagaattt gcatttgtta tatgtgaagt 2340
aatgcatcag ttttacattg tttatctaaa gggatgacga gtaaataacc atcacagtaa 2400
taccataata caggggaggt ttaaatgtac acaaatcatc accttagaat tctaaggctc 2460
tatctgacat ttttgtcaaa attaaggtat tctcatattc ttattaaatg acaacctatt 2520
tatcttatgg gctgtttttt ataagttgct tatatttgaa aaacttttta tttaaaaaaa 2580
caaaaccgat ctacaaagtc gaactctagc ttggttctat aaggtttttt ctgtgagcca 2640
atcagcattt ttaatgcacg cacaaggacc aatcaggatc agctttcttt gtcattttgc 2700
cagactgctc cattgacagc gggaaacacc agaaagacag tcgacctgca ggcatgcaag 2760
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 2820
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 2880
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 2940
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 3000
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3060
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3120
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3180
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3240
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3300
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3360
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 3420
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3480
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3540
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3600
ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 3660
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3720
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3780
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3840
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3900
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3960
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 4020
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 4080
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 4140
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 4200
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 4260
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 4320
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 4380
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 4440
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 4500
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 4560
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 4620
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 4680
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4740
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4800
cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4860
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4920
gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 4980
cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 5040
gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 5100
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 5160
gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 5220
ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 5280
gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 5340
ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcga 5400
gctc 5404

Claims (10)

1.一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的内含子、外显子、顺式作用元件和非翻译区段UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
2.根据权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列，所述的外源DNA包括表达标签基因序列、报告基因、结构基因、功能基因或重组酶识别序列。
3.根据权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸；在步骤(1)中，所述的目标的基因为胶质纤维酸蛋白基因或酪氨酸羟化酶基因。
4.根据权利要求3所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标基因为胶质纤维酸蛋白基因，靶序列分别为GTTAAGTTTACTTAATCGGG和GGAATGATGGATTTGGTCAG，所述的同源臂序列如SQRID NO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中第1120-2445位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列如SEQ ID NO：1中的第331-1113位所示。
5.根据权利要求3所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGGTTGTTACACTCATAAAG和GAATTAAGCCAACACATTCA；所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：2中第414-1695为所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：2中第2530-3202位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列，如SEQ ID NO：2中的第1712-2494位所示。
6.根据权利要求3所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGATTTGCTATGCCATAGTAG和GTGTTGCCGAACTGAATGG；所述的同源臂序列如SEQ ID NO：3中第7-1005为所示；所述的有同源臂序列如SEQ ID NO：3中第1909-2739位所示；所述的外源基因为两个loxP位点，如SEQ ID：3中的第1012-1045和第1869-1902位所示。
7.根据权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(2)中，制备左同源臂序列：在靶向基因的目的区段左侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定左同源臂序列，左同源臂序列为该目的区段的5’端序列，并含有左侧导向RNA靶序列，且左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸；制备右同源臂序列：在靶向基因的目的区段右侧确定一个导向RNA靶序列，针对目的区段确定右同源臂序列，右同源臂序列为该目的区段的3’端序列，并含右侧导向RNA靶序列，且右侧导向RNA靶序列的3’端序列大于50个核苷酸。
8.根据权利要求4、5或6所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(3)中，供体质粒的制备，获得P2A-EGFP的DNA片段，以pEGFP-N1(Clonetech)为模板，以P2A-EGFP融合序列PCR扩增引物扩增获得P2A-EGFP融合序列；获得loxP-th_exon8-loxP的DNA片段，以斑马鱼基因组为模板，以loxP融合序列PCR引物扩增获得loxP-th_exon8-loxP融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。
9.权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段培养斑马鱼的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用权利要求9所述的方法制备供体质粒；
(2)将获得的供体质粒、单导向RNA或能形成所述单导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共转斑马鱼受精卵或体细胞，获得基因组中以非同源整合方式置换进了外源基因的细胞；
(3)将该细胞继续培养扩增或培养为斑马鱼个体。
10.一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：
(1)权利要求9所述的供体质粒或DNA片段；
(2)导向RNA或能形成导向RNA的DNA；
(3)Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA。
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