CN109897826A

CN109897826A - 重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到cho细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株

Info

Publication number: CN109897826A
Application number: CN201910151185.9A
Authority: CN
Inventors: 易吉辉; 王中胜; 何毅华; 杨淑琼; 许春莲
Original assignee: Shenzhen Gentarget Biotherapeutics Co ltd
Current assignee: Shenzhen Gentarget Biotherapeutics Co ltd
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109897826B

Abstract

本发明涉及一种重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株。重组细胞的保藏号为CCTCC NO：C2018241。上述重组细胞能够作为宿主细胞，以使外源基因能够稳定地整合到该重组细胞的基因组上。

Description

重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株。

背景技术

CHO细胞(Chinese Hamster Ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是重组蛋白及抗体药物的重要表达系统。通常重组CHO(rCHO)都是通过目的基因随机整合到基因组，然后加压和单克隆筛选获得。由于缺乏对基因插入位点的控制，导致细胞表型、表达水平和稳定性不均一，因此，需要进行繁琐的单克隆筛选工作。每个需要表达的外源基因，都需经过重新筛选构建一株rCHO，筛选过程及时间难以控制，极为费力。而外源基因定点整合技术可控制外源基因插入到特定的高表达位点，从而节省筛选时间提高筛选效率。目前主要利用Cre-LoxP和Flp-FRT技术定点插入基因，但由于这两种重组酶介导的序列交换是一个动态、可逆的过程，容易导致不能将外源基因稳定地整合到宿主细胞基因组上。

发明内容

基于此，有必提供一种重组细胞。该重组细胞能够作为宿主细胞，以使外源基因能够稳定地整合到该重组细胞的基因组上。

此外，还提供一种重组细胞的制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株。

一种重组细胞，所述重组细胞的保藏号为CCTCC NO：C2018241。

研究表明，CRISPR/Cas9系统能够使DNA在特定位点发生双链断裂(double-strandbreak，DSB)，DSB能够通过非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining，NHEJ)进行修复；基于NHEJ的CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因的编辑过程是不可逆的，不会发生敲入基因的随机丢失，在基因组上的整合更加稳定，能够将外源基因能够稳定地整合到宿主细胞基因组上。上述重组细胞含有序列为5’-GCTCGGTTACGCGTGGACGAAGG-3’的靶向片段，使得该重组细胞能够作为宿主细胞，应用于CRISPR/Cas9系统中，通过NHEJ将外源基因能够稳定地整合到该重组细胞的基因组上。经试验验证，以上述重组细胞作为宿主细胞，通过基于NHEJ的CRISPR/Cas9基因编辑技术获得一株能够稳定表达PD-1抗体的重组细胞株。

其中一个实施例中，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示；

及/或，所述能够表达Cas9核酸酶的质粒含有NLS-SpCas9-NLS基因，所述NLS-SpCas9-NLS基因的序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组细胞的制备方法，包括如下步骤：

将靶向片段整合到CHO细胞基因组上，得到重组细胞，所述靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，所述N为A、G、C和T中的一种，所述X为大于或等于17且小于或等于20的整数。

其中一个实施例中，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述将靶向片段整合到CHO细胞基因组上的步骤包括：将所述靶向片段和荧光蛋白基因整合到所述CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到所述重组细胞。

其中一个实施例中，所述将所述靶向片段和荧光蛋白基因整合到所述CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到所述重组细胞的步骤包括：

采用序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一扩增引物对扩增SV40启动子，得到第一PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的第二扩增引物对扩增荧光蛋白基因，得到第二PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的第三扩增引物对扩增Zeocin抗性基因，得到第三PCR产物；

将所述第一PCR产物、所述第二PCR产物及所述第三PCR产物转入线性化载体中，得到重组载体；及

采用所述重组载体转染所述CHO细胞中，依次经Zeocin抗性筛选和荧光强度筛选，得到所述重组细胞。

一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，包括如下步骤：

将靶向片段整合到CHO细胞基因组上，得到重组细胞，所述靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，所述N为A、G、C和T中的一种，所述X为大于或等于17且小于或等于20的整数；

构建含有所述靶向片段的供体质粒，且所述供体质粒的多克隆位点上插入有外源基因；及

将所述供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染所述重组细胞，以使所述外源基因定点整合到所述CHO细胞基因组上。

其中一个实施例中，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示；

其中一个实施例中，所述构建含有所述靶向片段的供体质粒的步骤包括：

采用序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的第四扩增引物对扩增polyA，得到第四PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的第五扩增引物对扩增EM7基因，得到第五PCR产物；

采用序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的第六扩增引物对扩增潮霉素抗性基因，得到第六PCR产物；及

将所述第四PCR产物、所述第五PCR产物及所述第六PCR产物转入线性化质粒中，将所述外源基因插入所述线性化质粒的多克隆位点，得到所述供体质粒。

其中一个实施例中，在将所述供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染所述重组细胞的步骤之前，还包括构建所述能够表达向导RNA的质粒的步骤：

将如SEQ ID No.15所示的第一正向引物和如SEQ ID No.16所示的第一反向引物混合退火后转入骨架质粒中，得到所述能够表达向导RNA的质粒。

一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的试剂盒，包括：

构建重组细胞的试剂，所述重组细胞为基因组上整合有靶向片段的CHO细胞，所述靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，所述N为A、G、C和T中的一种，所述X为大于或等于17且小于或等于20的整数。

一种重组细胞株，所述重组细胞株由权利要求6～9任一项所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法制备得到，所述重组细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2018257。

附图说明

图1为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒第410～1210位点区域的的测序图；

图2为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒第1036～1592位点区域的测序图；

图3为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒的结构示意图；

图4为实施例3中单克隆细胞的传代稳定性的对比图；

图5为实施例4中5B9细胞株的电泳图；

图6为实施例4中5B9细胞株的第三产物片段的测序比对图；

图7为PD-1抗体轻链的测序图；

图8为PD-1抗体重链第1～742位点区域的测序图；

图9为PD-1抗体重链第670～1380位点区域的测序图；

图10为pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的结构示意图；

图11为pNLS-SpCas9-NLS质粒的结构示意图；

图12为pNLS-SpCas9-NLS质粒的测序图；

图13为pU6-sgRNA质粒的测序图；

图14为pU6-sgRNA质粒的结构示意图；

图15为实施例8中重组细胞株内整合质粒结构；

图16为实施例9中外原基因整合位置的验证电泳图；

图17为实施例9中5’端的PCR产物测序结果比对图；

图18为实施例9中3’端的PCR产物测序结果比对图；

图19为实施例9中轻链验证引物对和重链验证引物对的扩增产物的电泳图；

图20为实施例10中培养第4天和第11天的PD-1抗体溶液的蛋白电泳对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明提供了一种重组细胞，该重组细胞于2018年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.湖北武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018241，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-S/pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo/CHO-S 5B9。

本发明还提供一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，该方法能够将外源基因稳定地整合CHO细胞基因组上，以能够用于构建表达外源基因的CHO重组细胞株。具体地，该方法包括如下步骤S110～S130：

S110、将靶向片段整合到CHO细胞基因组上，得到重组细胞，靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，N为A、G、C和T中的一种，X为大于或等于17且小于或等于20的整数；即17≤X≤20，且X为整数。

通过在CHO细胞基因组中预先插入一条能够被CRISPR/Cas9系统识别的靶向片段，以便后续外源表达基因的定点插入。靶向片段包括依次连接的sgRNA和PAM，sgRNA的结构为：5’-G-N_X-3’，PAM的结构为：5’-NGG-3’。

在其中一个实施例中，靶向片段在Cricetulus griseus(CriGri_1.0，灰仓鼠)上预测的脱靶率为0。

在一个具体示例中，靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为5’-GCTCGGTTACGCGTGGACGAAGG-3’。

在其中一个具体示例中，将靶向片段整合到CHO细胞基因组上的步骤包括：将靶向片段和荧光蛋白基因整合到CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到重组细胞。

通过将荧光蛋白基因与靶向片段均整合到CHO细胞基因组中，能够通过荧光强度即筛选重组细胞，更加方便。

在一个具体示例中，荧光蛋白基因表达的细胞占细胞总数的90％以上为单克隆细胞。进一步地，将靶向片段和绿色荧光蛋白基因整合到CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到重组细胞的步骤包括S111～S115：

S111、采用序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一扩增引物对扩增SV40启动子，得到第一PCR产物。

具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为：5’-TTTTGCGCTGCTTCGGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGA-3’；

如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-GCGTAACCGAGCTCATGGTGGCCCTGTCTCTTGATCAGATCCGA-3’。

S112、采用序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的第二扩增引物对扩增荧光蛋白基因，得到第二PCR产物。

具体地，如SEQ ID No.5所示的序列为：5’-ATGAGCTCGGTTACGCGTGGACGAAGGgtgagcaagggcgagga-3’；

如SEQ ID No.6所示的序列为：5’-CGGCTTGTTTCAGCAGAGAGAAGTTTGTTGCgCCGGATCCcttgtacagctcgtccatg-3’。

具体地，荧光蛋白为绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。在一个具体示例中，绿色荧光蛋白为EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein，增强绿色荧光蛋白)，是GFP突变系。绿色荧光蛋白用于细胞株表达量筛选。

S113、采用序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的第三扩增引物对扩增Zeocin抗性基因得到第三PCR产物。

具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为：5’-TGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGATGGCCAAGTTGACCAGT-3’；

如SEQ ID No.8所示的序列为：5’-TGGTCGGTCATTTCGTCAGTCCTGCTCCTCGGC-3’。

Zeocin为博莱霉素。Gibco Zeocin在多种生物中非常有效，包括哺乳动物和昆虫细胞系、酵母，细菌和植物。Zeocin通过插入和切割DNA导致细胞死亡。Zeocin能够用于细胞株稳定性筛选。

S114、将第一PCR产物、第二PCR产物及第三PCR产物转入线性化载体中，得到重组载体。

上述将第一PCR产物、第二PCR产物及第三PCR产物转入线性化载体中，得到含有EGFP-2A-zeo基因的表达框的重组载体，以用于稳定性和表达量的筛选。

在一个具体示例中，线性化载体为线性化的pcDNA3.4质粒载体。进一步地，线性化载体为经NruI酶切的pcDNA3.4质粒载体。需要说明的是，线性化在体不限于为上述指出的载体，还可以为其他线性化载体，例如可以为线性化的pcDNA3.1载体、线性化的pFRT/lacZeo2载体等。

在其中一个实施例中，第一PCR产物、第二PCR产物、第三PCR产物与线性化载体的摩尔比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。

在其中一个实施例中，S114的步骤包括：将第一PCR产物、第二PCR产物及第三PCR产物转入经NruI酶切的pcDNA3.4质粒载体中；转入大肠杆菌DH5α，将Amp(氨苄青霉素)抗性筛选得到单克隆重组菌；对单克隆重组菌进行质粒提取，得到重组载体。

S115、采用重组载体转染CHO细胞，依次经Zeocin抗性筛选和绿色荧光强度筛选，得到重组细胞。

通过上述步骤将靶向片段插入到EGFP-2A-zeo基因表达框的ATG之后，使后续的供体质粒需要正确敲入靶向片段后才能够表达供体质粒中的筛选标记，同时，EGFP基因和Zeocin基因因供体质粒的插入而失去启动子和ATG，进而不再表达。上述步骤通过靶向片段的插入使得EGFP和Zeocin的表达失活双向，以确保靶向片段定点插入指定位置，定点插入后通过失去荧光即可准确判断是否成功。

在其中一个实施例中，将重组载体转入CHO细胞中的步骤包括：将B液加入A液混匀，于室温孵育1min～5min，得到孵育液；将孵育液滴加到CHO细胞液中，置于37℃、8％CO₂、120rpm条件下培养45h～50h，得到转入重组载体的CHO细胞。其中，A液包括950μL的细胞培养基和5μg～20μg的重组载体，B液包括920μL的细胞培养基和80μg的转染助剂，A液与B液的体积比为1:1。进一步地，细胞培养基为OptiPRO SFM(购于invitrogen公司)；转染助剂为ExpiFectamine CHO(购于invitrogen公司)。

在其中一个实施例中，将转入重组载体的CHO细胞进行Zeocin抗性筛选的步骤包括：将转入重组载体的CHO细胞转入含有300μg/mL～800μg/mL的Zeocin的培养基中培养，每隔3天～4天将原有的培养基更换为新鲜的含有300μg/mL～800μg/mL的Zeocin的培养基，直至细胞活力恢复。

具体地，将转入重组载体的CHO细胞转入含有300μg/mL～800μg/mL的Zeocin的培养基中培养，每隔3天～4天将原有的培养基更换为新鲜的含有300μg/mL～800μg/mL的Zeocin的培养基，更换培养基3～5次，检测细胞存活率，直至细胞存活率恢复至85％以上。

在其中一个实施例中，将Zeocin抗性筛选后细胞进行绿色荧光强度筛选的步骤包括：使用有限稀释法将Zeocin抗性筛选后细胞细胞转移至96孔板中进行培养；培养2周～3周，挑取荧光表达较强的细胞集落扩大培养；取含有1×10⁵个～8×10⁵细胞的培养液，固液分离并收集细胞，用PBS缓冲液将收集的细胞重悬，得到重悬液；将重悬液进行流式细胞筛选，GFP表达的细胞占细胞总数的90％可判定为单克隆细胞。

在其中一个实施例中，筛选绿色荧光强度不低于预设值的单克隆细胞的步骤之后，还包括：对单克隆细胞进行传代稳定性实验。进一步地，对单克隆细胞进行传代稳定性实验的步骤中，共传代培养60代。每隔5代进行流式细胞检测，以确定绿色荧光蛋白的表达量。

S120、构建含有靶向片段的供体质粒，且供体质粒的多克隆位点上插入有外源基因。

通过构建携带外源基因的供体质粒，使得供体质粒能够配合CRISPR/Cas9敲入系统切开重组细胞的基因组上的合适位点，发生以供体质粒DNA为模板的非同源末端连接(NHEJ，Non-Homology End Joining)修复，从而敲入外源基因的表达框。基于上述要求，供体质粒除了带有外源基因和筛选标记外，还需要带有能介导NHEJ的靶向片段。同时，通过使供体质粒的筛选标记基因不携带启动子和ATG，以降低其发生表达的可能性。

在其中一个实施例中，构建含有靶向片段的供体质粒的步骤包括S121～124：

S121、采用序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的第四扩增引物对扩增polyA，得到第四PCR产物。

具体地，如SEQ ID No.9所示的序列为：5’-ATCCCGTACGCCTAGGCCAGACATGATAAGATACATTGATGA-3’；

如SEQ ID No.10所示的序列为：5’-CCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC-3’。

在一个具体示例中，polyA为SV40polyA。

S122、采用序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的第五扩增引物对扩增EM7启动子基因，得到第五PCR产物；

具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：5’-ACAAATGTGGTATGGCTGACTGTTTGACAATTAATCATCGG-3’；

SEQ ID No.12所示的序列为：5’-AGCTCGGTTACGCGTGGACGAAGGCATGGTGGCCCTCCTATAGT-3’。

S123、采用序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的第六扩增引物对扩增潮霉素抗性基因得到第六PCR产物。

具体地，如SEQ ID No.13所示的序列为：5’-ACGCGTAACCGAGCTAAGAAACCTGAACTGACAGCAAC-3’；

如SEQ ID No.14所示的序列为：5’-TTGTGCTCTTCTGCTGATGCAG-3’。

S124、将第四PCR产物、第五PCR产物及第六PCR产物转入线性化质粒中，将外源基因插入线性化质粒的多克隆位点上，得到供体质粒。

在其中一个实施例中，外源基因为PD-1抗体的轻链和重链。进一步地，线性化质粒具有两个多克隆位点，PD-1抗体的轻链和重链分别插入线性化质粒的两个多克隆位点上。

需要说明的是，外源基因不限于上述指出基因，还可以为其他外源基因，例如可以为VEGF和PCSK9等多肽、重组蛋白或抗体基因序列。

在一个具体示例中，PD-1抗体的轻链的序列如SEQ ID No.21所示，PD-1抗体的重链的序列如SEQ ID No.22所示。

具体地，如SEQ ID No.21所示序列为：5’-EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-3’；

如SEQ ID No.22所示序列为：5’-QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK-3’。

在一个具体示例中，线性化质粒为线性化的pVITRO1-hygro-mcs质粒。进一步地，线性化质粒为经AvrII和SapI双酶切的pVITRO1-hygro-mcs质粒。

需要说明的是，S110与S120的操作顺序不限，可以先进行S110再进行S120，也可以先进行S120再进行S110，还可以并行S110和S120。

S130、将供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染重组细胞，以使外源基因定点整合到CHO细胞基因组上。

将供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染重组细胞，以使重组细胞的靶向片段和供体质粒的的靶向片段均在在Cas9核酸酶和向导RNA的作用下被剪切而形成DSB(DNA Double Strand Break，DNA双链断裂)末端，且在CHO细胞的非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining，NHEJ)的作用下，使外源基因定点整合到CHO细胞基因组上。

Cas9核酸酶基因需要在宿主细胞中表达，所以应对Cas9核酸酶基因序列密码子进行优化，以使其适合在CHO细胞中表达。Cas9核酸酶表达后要对CHO细胞的基因组进行切割编辑，就需要留在细胞核中。因此，还要对Cas9核酸酶基因的核定位信号(NLS，nuclearlocation signals)进行优化，并在N端和C端融合NLS。在一个具体示例中，能够表达Cas9核酸酶的质粒含有NLS-SpCas9-NLS基因，NLS-SpCas9-NLS基因的序列如SEQ ID No.2所示。其中，NLS-SpCas9-NLS基因具有两个酶切位点，分别为位于5’端和3’端，且序列分别为5’-atgtcgccgaagaaaaagcgcaaggtcgaagcgtcc-3’和5’-agccccaagaagaagagaaaggtggaggccagctaa-3’。

在其中一个实施例中，供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒的质量比为(1～3):(1～3):(1～3)。进一步地，供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒的质量比为1:1:1。

在其中一个实施例中，在将供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染所述重组细胞的步骤之前，还包括构建能够表达向导RNA的质粒的步骤：将如SEQ ID No.15所示的第一正向引物和如SEQ ID No.16所示的第一反向引物混合退火后转入骨架质粒中，得到能够表达向导RNA的质粒。进一步地，向导RNA的序列如SEQ IDNo.33所示。

具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：5’-accGCTCGGTTACGCGTGGACGA-3’；如SEQID No.16所示的序列为：5’-aacTCGTCCACGCGTAACCGAGC-3’。如SEQ ID No.33所示的序列为：5’-GCTCGGTTACGCGTGGACGA-3’。

在一个具体示例中，骨架载体为pU6质粒。

在其中一个实施例中，在S110之后，在S130之前，还包括如下步骤：采用染色体移步技术(Genome Walking技术)确认重组细胞中靶向片段的整合位点。

具体地，采用染色体移步技术确认重组细胞中靶向片段的整合位点的步骤包括S141：

S141、采用第一PCR引物对对重组细胞进行扩增，得到第一产物片段，第一PCR引物对的序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

具体地，如SEQ ID No.17所示的序列为：5’-GCCAATTCCGGATNGAYKSNGGNTC-3’，其中，N为兼并碱基，N表示A、T、G、C中的一种，Y为兼并碱基，Y表示T或C，K为兼并碱基，K表示G或T，S为兼并碱基，S表示G或C；

如SEQ ID No.18所示的序列为：5’-atgagtattcaacatttccgtgtcg-3’。

S142、采用第二PCR引物对第一产物片段进行扩增，得到第二产物片段，第二PCR引物对的序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.19所示。

具体地，如SEQ ID No.19所示的序列为：5’-acccagaaacgctggtgaaagt-3’。

S143、采用第三PCR引物对第二产物片段进行扩增，得到第三产物片段，第三PCR引物对的序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.20所示。

具体地，如SEQ ID No.20所示的序列为：5’-ccttgagagttttcgccccga-3’。

S144、对第三产物片段进行电泳检测和测序比对，以确认重组细胞中靶向片段的整合位点。

在其中一个实施例中，在S130之后，包括验证外源基因定点整合到CHO细胞基因组上。进一步地，验证的方法为测序或PCR反应。

在一个具体示例中，采用序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示轻链验证引物对验证重组细胞株中PD-1抗体轻链序列进行验证；

采用序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示重链验证引物对验证重组细胞株中PD-1抗体重链序列进行验证。

具体地，如SEQ ID No.23所示的序列为：5’-ATCCCGTACGCCTAGGCCACCATGGACATGAGAGT-3’；

如SEQ ID No.24所示的序列为：5’-TCATGTCTGGCCTAGCTCGAGTCAACACTCGCC-3’；

如SEQ ID No.25所示的序列为：5’-ATTCAAAGCAACCGGTGCCACCATGGAGTTCGG-3’；

如SEQ ID No.26所示的序列为：5’-TGTCTGGCCAGCTAGCTCACTTGCCCAGGGACAGA-3’。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，通过将靶向片段整合到CHO细胞基因组上得到重组细胞，靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，N为A、G、C和T中的一种，X为大于或等于17且小于或等于20的整数，使得该重组细胞能够作为宿主细胞，应用于CRISPR/Cas9系统中，通过NHEJ将外源基因能够稳定地整合到该重组细胞的基因组上。经试验验证，以上述重组细胞作为宿主细胞，通过基于NHEJ的CRISPR/Cas9基因编辑技术获得一株能够稳定表达PD-1抗体的重组细胞株。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，还通过构建含有靶向片段的供体质粒，且供体质粒的多克隆位点上插入有外源基因，将供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染重组细胞，以使重组细胞的靶向片段和供体质粒的的靶向片段均在Cas9核酸酶和向导RNA的作用下被剪切而形成DSB(DNADouble StrandBreak，DNA双链断裂)末端，且在CHO细胞的非同源末端连接修复机制(non-homologous endjoining，NHEJ)的作用下，使外源基因定点整合到CHO细胞基因组上。上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，通过基于NHEJ的CRISPR/Cas9基因敲入技术，实现CHO基因组定点插入，对基因的编辑过程不可逆，不会发生敲入基因的随机丢失，在基因组上的整合更加稳定。经试验验证，通过上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法得到一株能够稳定表达PD-1抗体的重组细胞株。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，采用携带有靶向片段的重组载体转染CHO细胞，通过Zeocin抗性筛选和绿色荧光强度筛选，能够直观确定高表达稳定转染细胞株，得到重组细胞。同时，通过上述方法，不需要明确整合位点在CHO细胞基因组上的具体位置，只要筛选到靶向片段的稳定高表达细胞株，既能够利用CRISPR/Cas9技术将外源基因精确插入到该细胞株的基因组进行稳定表达，获得高表达外源基因的稳定细胞株。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，通过将靶向片段整合到CHO细胞基因组上得到重组，同时构建含有外源基因和靶向片段的供体质粒，使得多种不同的外源基因均可以通过上述重组细胞和供体质粒，并采用CRISPR/Cas9技术定点整合到CHO细胞基因组上，无需针对每个外源基因重新设计和筛选整合位点。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，利用Genome Walking技术确定靶向片段在重组细胞基因组的整合位点，再利用CRISPR/Cas9技术将外源基因精准地整合到靶向片段所在的位点，能够得到稳定表达外源基因的细胞株。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法中，采用基于NHEJ的外源基因的插入，定点整合入CHO细胞的外源基因因为补全了抗性基因的启动子，使得整合后的细胞表达抗性，而未能定点整合的质粒因为没有抗性基因启动子不能被表达。同时，只有精确定点整合入CHO基因组的细胞EGFP才会表达失活，失去荧光。上述方法由于结合了两种筛选条件，筛选时间大大缩短，筛选效率得以提高。

在一个具体示例中，重组细胞株于2018年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.湖北武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018257，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-S/pcDNA3.4-hygro-Nivo H-Nivo L/CHO-S 5B9。该重组细胞株能够稳定表达PD-1抗体。

本研究一实施方式还提供一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的试剂盒，采用该试剂盒能够将外源基因整合到CHO细胞基因组上，以能够用于构建表达外源基因的CHO重组细胞株。

具体地，该试剂盒包括：构建重组细胞的试剂；重组细胞为基因组上整合有靶向片段的CHO细胞，靶向片段的结构为：5’-G-N_X-NGG-3’，所述N为A、G、C和T中的一种，X为大于或等于17且小于或等于20的整数。

进一步地，构建重组细胞的试剂包括序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一扩增引物、序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的第二扩增引物对、序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示的第三扩增引物对。需要说明的是，构建重组细胞的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他构建重组细胞所需试剂，例如PCR反应的常规试剂，具体地，PCR反应的常规试剂例如可以是dNTPs、PCR反应液等。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括构建供体质粒的试剂。供体质粒含有靶向片段，且供体质粒的多克隆位点上插入有外源基因。

进一步地，构建供体质粒的试剂包括序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的第四扩增引物对、序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的第五扩增引物对、序列如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示的第六扩增引物对。需要说明的是，构建供体质粒的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他构建供体质粒的试剂所需试剂，例如PCR反应的常规试剂，具体地，PCR反应的常规试剂例如可以是dNTPs、PCR反应液等。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括构建能够表达Cas9核酸酶的质粒的试剂。

进一步地，构建能够表达Cas9核酸酶的质粒的试剂包括连接酶。连接酶用于将Cas9核酸酶基因连接骨架质粒中。进一步地，Cas9核酸酶基因为NLS-SpCas9-NLS基因，NLS-SpCas9-NLS基因的序列如SEQ ID No.2所示。需要说明的是，构建能够表达Cas9核酸酶的质粒的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他构建能够表达Cas9核酸酶的质粒的试剂所需试剂，例如可以为限制性核酸内切酶，以用于酶切骨架质粒。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括构建能够表达向导RNA的质粒的试剂。

进一步地，构建能够表达向导RNA的质粒的试剂包括如SEQ ID No.15所示的第一正向引物和如SEQ ID No.16所示的第一反向引物。需要说明的是，构建能够表达向导RNA的质粒的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他构建能够表达向导RNA的质粒的试剂所需试剂，例如PCR反应的常规试剂，具体地，PCR反应的常规试剂例如可以是dNTPs、PCR反应液等。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括检测重组细胞中靶向片段的整合位点的试剂。进一步地，检测重组细胞中靶向片段的整合位点的试剂包括序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的第一PCR引物对、序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.19所示的第二PCR引物对、序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.20所示的第三PCR引物对。需要说明的是，检测重组细胞中靶向片段的整合位点的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他检测重组细胞中靶向片段的整合位点的试剂所需试剂，例如PCR反应的常规试剂，具体地，PCR反应的常规试剂例如可以是dNTPs、PCR反应液等。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括验证外源基因定点整合入CHO基因组的试剂。进一步地，验证外源基因定点整合入CHO基因组的试剂包括序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示轻链验证引物对和序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示重链验证引物对。需要说明的是，验证外源基因定点整合入CHO基因组的试剂不限于包括上述试剂，还可以包括其他验证外源基因定点整合入CHO基因组的试剂所需试剂，例如PCR反应的常规试剂，具体地，PCR反应的常规试剂例如可以是dNTPs、PCR反应液等。

上述外源基因定点整合到CHO细胞基因组的试剂盒能够通过构建重组细胞，以能够通过基于NHEJ的CRISPR/Cas9基因敲入技术，实现CHO基因组定点插入，对基因的编辑过程不可逆，不会发生敲入基因的随机丢失，在基因组上的整合更加稳定。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

未特别说明，以下实施例中，大肠杆菌DH5ɑ购于北京全式金生物技术有限公司；Amp抗性LB平板购于生工生物工程(上海)股份有限公司；Amp抗性的LB培养基购于生工生物工程(上海)股份有限公司；OptiPRO SFM购于invitrogen公司；ExpiFectamine CHO购于invitrogen公司；hygromycin抗性LB平板购于invitrogen公司；hygromycin抗性的LB培养基购于invitrogen公司。pH7.4的PBS缓冲液购于康宁公司。

实施例1

pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒的构建

采用下列表1中的三对扩增引物对分别对SV40启动子、EGFP基因和Zeocin抗性基因进行扩增，得到第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物；切胶纯化后，按照Takara公司的Infusion试剂盒的操作说明，把第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物连入经NruI酶切的pcDNA3.4质粒载体(购于Invitrogen公司)；然后转化到大肠杆菌DH5ɑ中，置于Amp抗性LB平板中于37℃培养14h；挑取单克隆菌体接种到Amp抗性的LB培养基中于37℃、220rpm下培养18h；采用质粒小量提取试剂盒(购于Axygen公司)提取质粒，测序验证，得到pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒。测序结果详见图1～2。图1为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒第410～1210位点区域的测序图，其中，靶向片段质粒第410～1210位点区域即为目的片段第1～800位点区域。图2为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒第1036～1592位点区域的测序图，其中，靶向片段质粒第1036～1592位点区域即为目的片段第626～1182位点区域。

其中，SV40启动子的序列如SEQ ID No.27所示。EGFP基因的序列如SEQ ID No.28所示。Zeocin抗性基因的序列如SEQ ID No.29所示。pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒的结构示意图如图3所示。图3为pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒的结构示意图。图3中的“ATG”即为终止子，“sgRNA”的序列为5’-GCTCGGTTACGCGTGGACGA-3’；“PAM”的序列为5’-AGG-3’。

表1构建pcDNA34-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒的引物对

实施例2

重组细胞的制备

(1)转染前一天，将CHO-S细胞(购于Gibco公司)以1.0×10⁶个/mL接种于装有ExpiCHO Expression Medium培养基(购于Gibco公司)的摇瓶中，于37℃、8％CO₂、120rpm下培养24小时。转染当天，取CHO-S细胞培养液计数，计算细胞密度及活率。将CHO-S细胞调整到6×10⁶个/mL，接种于装有新鲜ExpiCHO Expression Medium培养基的摇瓶中，得到待转染细胞液。以未转染的CHO-S细胞作为阴性对照。摇瓶的体积为125mL。

(2)将采用ScaI内切酶(购于NEB公司)将pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo靶向片段质粒线性化，得到线性化的质粒。按照表2的配方配置A液和B液，将B液加入到A液中，上下颠倒混匀，得到制备质粒-脂质体复合物。

表2制备质粒-脂质体复合物的配方

(3)将质粒-脂质体复合物于室温孵育5min，逐滴加入待转染细胞液中，边加边慢慢晃动培养瓶；将转染后的CHO-S细胞放入细胞悬浮培养箱中于37℃、8％CO₂、120rpm下培养48h，得到转染后细胞液。同时，用荧光显微镜观察转染情况。

(3)配制筛选培养基，筛选培养基为含有500μg/mL的Zeocin的新鲜ExpiCHOExpression Medium培养基。按照0.5×10⁶个/mL将转染后细胞液接种于筛选培养基中，每隔3天离心并更换新鲜筛选细胞培养基，直至细胞存活率恢复至85％，得到筛选后细胞培养液。

(4)根据活细胞密度，使用有限稀释法将筛选后细胞培养液转移至96孔板中，即将筛选后细胞培养液按500、250、125、63、32、16、8、4、2、1个细胞分别加入96孔培养板中；培养体积为200μL/孔；培养大约20天。挑取荧光表达较强的细胞集落扩大培养。取含有3×10⁵个细胞的细胞扩大培养液，于1000rpm离心5min，弃上清；用1mL的pH7.4的PBS轻轻吹散混匀细胞，于1000rpm离心5min，弃上清；用500μL的pH7.4的PBS重悬细胞于流式试管中，用流式细胞仪的FITC通道检测筛选细胞的GFP表达，以阴性细胞群做对照，GFP表达的细胞占细胞总数的90％可判定为单克隆细胞。

实施例3

单克隆细胞的传代稳定性实验

向一新培养瓶中加入30mL预热后的ExpiCHO Expression Medium完全培养基(购于Gibco公司)，从培养箱中单克隆细胞，充分轻柔混匀，取样进行细胞计数；取9×10⁶个细胞加入到ExpiCHO Expression Medium完全培养基中，置于细胞培养系统中，37℃、8％CO₂、120rpm下培养，每天观察细胞的生长情况，当细胞到达5×10⁶个/mL时，再进行下一次的细胞传代，共培养60代。每5代用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达量。测定结果详见图4。图4为实施例3中单克隆细胞的传代稳定性的对比图；其中，图4a)为细胞传代8代的绿色荧光蛋白表达量；图4b)为细胞传代15代的绿色荧光蛋白表达量；图4c)为细胞传代20代的绿色荧光蛋白表达量；图4d)为细胞传代32代的绿色荧光蛋白表达量；图4f)为细胞传代42代的绿色荧光蛋白表达量；图4e)为细胞传代52代的绿色荧光蛋白表达量；图4g)为细胞传代60代的绿色荧光蛋白表达量。

从图4可以看出，经检测，传代60代后，仍能够高表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞即为重组细胞，简称为细胞株5B9。将该重组细胞于2018年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.湖北武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018241，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-S/pcDNA3.4-sgRNA-EGFP-2A-zeo/CHO-S 5B9。

实施例4

重组细胞中靶向序列质粒基因组的整合位置确认

(1)采用细胞基因组提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)提取细胞株5B9的基因组DNA。

(2)采用染色体步移法获取插入靶向序列质粒侧翼未知序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物，详见表3。采用上述引物对细胞株5B9的基因组DNA进行三轮巢式PCR来获取靶向序列的侧翼序列。

表3进行巢式PCR的引物对

具体地，(a)采用第一PCR引物对对基因组DNA进行扩增，得到第一产物片段。反应体系50μL，反应条件如表3所示。其中，“60℃→47.5℃、30sec，降低0.5℃/循环”表示：初始温度为60℃，每个循环降低0.5℃，每个温度维持30sec。

表3第一轮PCR的反应条件

(b)采用无菌水将第一产物片段稀释10倍。采用第二PCR引物对对稀释后的第一产物片段进行扩增，得到第二产物片段。反应体系50μL，反应条件如表3所示。

(c)采用无菌水将第三产物片段稀释100倍。采用第三PCR引物对对稀释后的第二产物片段进行扩增，得到第三产物片段。反应体系50μL，反应条件如表4所示。

表4第三轮PCR的反应条件

(d)取第三产物片段进行DNA凝胶电泳，切胶回收PCR产物片段，测序和比对。电泳检测结果详见图5，测序比对测定结果见图6。图5为实施例4中5B9细胞株的电泳图。图5中，第1泳道(即M)为Marker，第2泳道(即1)为5B9细胞株；第3泳道(即2)为5B9细胞株；其中，第2泳道和第3泳道为两个平行样。图6为实施例4中5B9细胞株的第三产物片段的测序比对图。

从图5～6可以看出，靶向序列质粒已成功插入CHO-S基因组中。同时，从图6可以看出，经测序表明，上述回收的PCR产物片段的一部分序列(1bp～65bp)位于线性化载体质粒的5’端，另一部分位于NW_003614849(NCBI)上，其中，66bp～491bp与NW_003614849的第407813～407421位一致。

实施例5

pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒构建

(1)采用pVITRO1-hygro-mcs质粒(购于InvivoGen公司)作为供体质粒的骨架。用AvrII和SapI双酶切pVITRO1-hygro-mcs质粒，以去掉Hygromycin筛选标记前的IRES(Internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点序列)。

(2)采用表5中的三对引物分别扩增SV40polyA基因、EM7基因和Hygromycin抗性基因，分别得到第四PCR产物、第五PCR产物和第六PCR产物。按照按Takara公司的Infusion试剂盒的操作说明，把第四PCR产物、第五PCR产物和第六PCR产物连入酶切后的pVITRO1-hygro-mcs质粒中，再把PD-1抗体的轻链和重链分别插入pVITRO1-hygro-mcs质粒的两个多克隆位点，得到连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，置于hygromycin抗性LB平板中于37℃培养16h；挑取单克隆菌体接种到hygromycin抗性的LB培养基中，于37℃、220rpm下培养18h，采用质粒小量提取试剂盒(购于Axygen公司)提取质粒，测序验证，得到pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒。测序结果详见图7～9，图7为PD-1抗体轻链的测序图。图8为PD-1抗体重链第1～742位点区域的测序图，其中，PD-1抗体重链第1～742位点区域即对应的质粒图谱碱基编号为第1574～2316位点区域。图9为PD-1抗体重链第670～1380位点区域的测序图，其中，PD-1抗体重链第670～1380位点区域即对应的质粒图谱碱基编号为第号2243～2953位点区域。

其中，SV40polyA基因的序列如SEQ ID No.30所示。EM7启动子基因的序列如SEQID No.31所示。Hygromycin抗性基因的序列如SEQ ID No.32所示。PD-1抗体的轻链的序列如SEQ ID No.21所示，PD-1抗体的重链的序列如SEQ ID No.22所示。构建的pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的结构示意图详见图10。图10为pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的结构示意图。

表5构建供体质粒的扩增引物对

实施例6

pNLS-SpCas9-NLS质粒构建

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成NLS-SpCas9-NLS基因，NLS-SpCas9-NLS基因的序列如SEQ ID No.2所示。将NLS-SpCas9-NLS基因经KpnI和EcoRI双酶切，得到酶切后的待插入序列。将pA20骨架质粒(由深圳大学赠送)经KpnI和EcoRI双酶切，得到酶切后的骨架质粒。将酶切后的待插入序列与酶切后的骨架质粒按照摩尔比为1:2混合后置于25℃下进行连接反应，得到连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，置于Amp抗性LB平板中于37℃培养30min；挑取单克隆菌体接种到Amp抗性的LB培养基中，于37℃、220rpm下培养18h，采用质粒小量提取试剂盒(购于Axygen公司)提取质粒，测序验证，得到pNLS-SpCas9-NLS质粒。pNLS-SpCas9-NLS质粒的结构示意图见图11。图11为pNLS-SpCas9-NLS质粒的结构示意图。测序结果如图12。图12为pNLS-SpCas9-NLS质粒的测序图。

实施例7

pU6-sgRNA质粒构建

合成表6中的两条引物。将两条引物等摩尔比例混合，于95℃、5min退火降至室温后，与经SapI酶切的pA30骨架质粒(即pU6骨架质粒，由深圳大学赠送)按照摩尔比为1:2混合后置于25℃下进行连接反应，得到连接产物，连接产物中含有U6启动子驱动的表达盒。将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，置于Amp抗性LB平板中于37℃培养30min；挑取单克隆菌体接种到Amp抗性的LB培养基中，于37℃、220rpm下培养18h，采用质粒小量提取试剂盒(购于Axygen公司)提取质粒，测序验证，得到pU6-sgRNA质粒。测序结果详见图13。图13为pU6-sgRNA质粒的测序图。pU6-sgRNA质粒的结构示意图见图14。图14为pU6-sgRNA质粒的结构示意图。

表6构建pU6-sgRNA质粒的引物

引物名称	引物序列
		第一正向引物	5’-accGCTCGGTTACGCGTGGACGA-3’(如SEQ ID No.15所示，命名为sgRNA-F)
第一反向引物	5’-aacTCGTCCACGCGTAACCGAGC-3’(如SEQ ID No.16所示，命名为sgRNA-R)

实施例8

pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒共转染重组细胞

(1)转染前一天，将细胞株5B9按3.0×10⁷cells接种于含有ExpiCHO ExpressionMedium培养基(购于Gibco公司)的125mL摇瓶中，于37℃、8％CO₂、120rpm培养24h。转染当天，取细胞株5B9培养液计算细胞密度及活率。将细胞株5B9培养液中的细胞调整到1.5×10⁷cells接种于含有ExpiCHO Expression Medium培养基的125mL摇瓶，共分装4瓶细胞，得到待转染细胞。

(2)实验共分为三组，分别为空白对照组、阴性对照组和实验组。以未加转染试剂的5B9细胞作为空白对照。以加入转染试剂且未加入质粒的5B9细胞作为阴性对照。既加入转染试剂又加入质粒的5B9细胞作为实验组。按照表7的配方配置A液和B液，将B液加入到A液中，上下颠倒混匀，得到制备质粒-脂质体复合物。

表7制备质粒-脂质体复合物的配方

(3)将质粒-脂质体复合物于室温孵育5min，逐滴加入实验组的待转染细胞液中，边加边慢慢晃动培养瓶；将转染后的重组细胞放入细胞悬浮培养箱中于37℃、8％CO₂、120rpm下培养48h，得到转染后细胞液。同时，用荧光显微镜观察转染情况。

(3)配制筛选培养基，筛选培养基为含有500μg/mL的hygromycin B(潮霉素B)的新鲜ExpiCHO Expression Medium培养基。按照3×10⁶个/mL将转染后细胞液接种于筛选培养基中，每隔3天离心并更换新鲜筛选细胞培养基，每隔2天取样计细胞活率，并观察荧光。直至空白对照和阴性对照细胞全部死亡，转染后的细胞株活率恢复至90％，冻存细胞株，得到能够表达PD-1的重组细胞株，重组细胞株命名为pVitro-sgRN-H-L，重组细胞株中整合质粒结构示意图如15。图15为实施例8中重组细胞株内整合质粒结构。

实施例9

敲入基因的检测

采用天根生化科技(北京)有限公司的细胞基因组DNA提取试剂盒抽提pVitro-sgRN-H-L重组细胞株的基因组作为PCR模板，验证目的片段的是否正确整合。

具体地，(1)对于5’端的序列，使用SV40-F引物(如SEQ ID No.3)和Hygro-R引物(如SEQ ID No.14所示)对上述PCR模板进行扩增；对于3’端的序列，使用EM7-F引物(如SEQID No.11所示)和Zeo-R引物(如SEQ ID No.8所示)对上述PCR模板进行扩增；对扩增产物进行电泳测定，测定结果见图16。切胶回收条带，测序比对，详见图17～18。图16为实施例9中外原基因整合位置的验证电泳图。图16中，第1道泳道为Marker，第2泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为1:1:1转染后5’端的序列的检测结果；第3泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为2:2:3转染后5’端的序列的检测结果，第4泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为1:1:1转染后3’端的序列的检测结果，第5泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为2:2:3转染后3’端的序列的检测结果。图17为5’端的PCR产物测序结果比对图。图18为3’端的PCR产物测序结果比对图。

从图16可以看出，对于5’端的序列，扩增出725bp的条带；对于3’端的序列，扩增出1274bp的条带。从图17～18可以看出，pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒正确插入到重组细胞株的靶向片段中。

(2)分别用表8中的轻链验证引物对和重链验证引物对对PCR模板进行扩增，对扩增产物进行电泳测定，测定结果详见图19。图19为实施例9中轻链验证引物对和重链验证引物对的扩增产物的电泳图。图19中，第1泳道为Marker，第2泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为1:1:1转染轻链，第3泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为2:2:3转染轻链，第4泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为1:1:1转染重链，第5道泳道为pNLS-SpCas9-NLS质粒、pU6-sgRNA质粒和pVITRO1-sgRNA-hygro-H-L供体质粒的质量比为2:2:3转染重链。

表8轻链验证引物对和重链验证引物对

从图19可以看出，轻链验证引物对和重链验证引物对分别正确扩出753bp和1418bp条带，说明重组细胞株中整合质粒没有丢失PD-1抗体轻链和重链。

实施例10

PD-1抗体表达纯化和鉴定

将实施例8得到的重组细胞株置于ExpiCHO Expression Medium培养基中，于37℃、8％CO₂、120rpm下悬浮培养11天。分别取培养第4天和第11天的细胞培养液按照下列操作进行纯化：将细胞培养液3000g离心5分钟，收集上清。将上清用0.45μm过滤器过滤，以去除颗粒物；将过滤后的上清以1mL/min流入protein A预装柱(购于GE公司)中，进行上样；上样结束后，将pH7.4的PBS缓冲液平衡柱子，平衡5个柱床体积；用含有pH2.5、0.1M的Gly-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱0.5个柱体积开始收集，共收集2mL的收集液；用pH9.0、1M Tris-HCl缓冲液中和收集液，即为PD-1抗体溶液。分别对培养第4天和第11天的PD-1抗体溶液进行还原性蛋白电泳，测定结果详见图20。图20为实施例10中培养第4天和第11天的PD-1抗体溶液的蛋白电泳对比图。图20中，第1泳道为Marker，第2泳道为第11天的细胞培养上清，第3泳道为第11天的细胞培养上清的过柱流穿，第4泳道为第11天的细胞培养上清春花后的收集液；第5泳道为第4天细胞培养上清纯化后的收集液。

从图20可以看出，上述重组细胞株能够稳定高效地表达PD-1抗体，说明PD-1抗体基因稳定地整合到CHO细胞基因组上。

将上述敲入基因检测正确且PD-1抗体表达鉴定正确的重组细胞株于2018年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.湖北武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018257，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-S/pcDNA3.4-hygro-Nivo H-NivoL/CHO-S 5B9。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳精准医疗科技有限公司

<120> 重组细胞及制备方法、外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法及试剂盒、重组细胞株

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcggttac gcgtggacga agg 23

<210> 2

<211> 4173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcgccga agaaaaagcg caaggtcgaa gcgtccgaca agaagtacag catcggcctg 60

gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc 120

aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga 180

gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga 240

agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag 300

atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag agtccttcct ggtggaagag 360

gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac 420

gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc 480

gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca agttccgggg ccacttcctg 540

atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg 600

cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag 660

gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg 720

cccggcgaga agaagaatgg cctgttcggc aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc 780

cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac 840

acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg 900

tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac 960

accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca agagatacga cgagcaccac 1020

caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag 1080

attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg agccagccag 1140

gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg 1200

ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc 1260

atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt 1320

tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc 1380

tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg cctggatgac cagaaagagc 1440

gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag 1500

agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc 1560

aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac 1620

gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg 1680

gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc 1740

aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc 1800

tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt cctggacaat 1860

gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga 1920

gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag 1980

cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc 2040

atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc 2100

aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga cctttaaaga ggacatccag 2160

aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc 2220

agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa 2280

gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc 2340

acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa 2400

gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag 2460

aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac 2520

atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac 2580

gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac 2640

gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc 2700

aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc 2760

gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag 2820

cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg 2880

atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat 2940

ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcctacctg 3000

aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg 3060

tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc 3120

ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca tgaacttttt caagaccgag 3180

attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc 3240

ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg 3300

ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct 3360

atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag 3420

aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg 3480

gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg 3540

gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa 3600

gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc 3660

cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc 3720

tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg agaagctgaa gggctccccc 3780

gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct ggacgagatc 3840

atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa 3900

gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc 3960

atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc 4020

accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac 4080

cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacagc 4140

cccaagaaga agagaaaggt ggaggccagc taa 4173

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttgcgctg cttcggtgtg tcagttaggg tgtgga 36

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtaaccga gctcatggtg gccctgtctc ttgatcagat ccga 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagctcgg ttacgcgtgg acgaagggtg agcaagggcg agga 44

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggcttgttt cagcagagag aagtttgttg cgccggatcc cttgtacagc tcgtccatg 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctgaaaca agccggagat gtcgaagaga atcctggacc gatggccaag ttgaccagt 59

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtcggtca tttcgtcagt cctgctcctc ggc 33

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcccgtacg cctaggccag acatgataag atacattgat ga 42

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccataccaca tttgtagagg ttttac 26

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaaatgtgg tatggctgac tgtttgacaa ttaatcatcg g 41

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agctcggtta cgcgtggacg aaggcatggt ggccctccta tagt 44

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgcgtaacc gagctaagaa acctgaactg acagcaac 38

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgtgctctt ctgctgatgc ag 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

accgctcggt tacgcgtgga cga 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aactcgtcca cgcgtaaccg agc 23

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gccaattccg gatngayksn ggntc 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgagtattc aacatttccg tgtcg 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acccagaaac gctggtgaaa gt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccttgagagt tttcgccccg a 21

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 22

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atcccgtacg cctaggccac catggacatg agagt 35

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcatgtctgg cctagctcga gtcaacactc gcc 33

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

attcaaagca accggtgcca ccatggagtt cgg 33

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgtctggcca gctagctcac ttgcccaggg acaga 35

<210> 27

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 60

atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 120

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc 180

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 240

tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 300

ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 330

<210> 28

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714

<210> 29

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actga 375

<210> 30

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 60

aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 120

aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg 180

tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatgg 226

<210> 31

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctgactgttt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgactcact 60

ataggagggc cacc 74

<210> 32

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atgccttcgt ccacgcgtaa ccgagctaag aaacctgaac tgacagcaac ttctgttgag 60

aagtttctca ttgaaaaatt tgattctgtt tctgatctca tgcagctgtc tgaaggtgaa 120

gaaagcagag ccttttcttt tgatgttgga ggaagaggtt atgttctgag ggtcaattct 180

tgtgctgatg gtttttacaa agacagatat gtttacagac actttgcctc tgctgctctg 240

ccaattccag aagttctgga cattggagaa ttttctgaat ctctcaccta ctgcatcagc 300

agaagagcac aaggagtcac tctccaggat ctccctgaaa ctgagctgcc agctgttctg 360

caacctgttg ctgaagcaat ggatgccatt gcagcagctg atctgagcca aacctctgga 420

tttggtcctt ttggtcccca aggcattggt cagtacacca cttggaggga tttcatttgt 480

gccattgctg atcctcatgt ctatcactgg cagactgtga tggatgacac agtttctgct 540

tctgttgctc aggcactgga tgaactcatg ctgtgggcag aagattgtcc tgaagtcaga 600

cacctggtcc atgctgattt tggaagcaac aatgttctga cagacaatgg cagaatcact 660

gcagtcattg actggtctga agccatgttt ggagattctc aatatgaggt tgccaacatt 720

tttttttgga gaccttggct ggcttgcatg gaacaacaaa caagatattt tgaaagaaga 780

cacccagaac tggctggttc ccccagactg agagcctaca tgctcagaat tggcctggac 840

caactgtatc aatctctggt tgatggaaac tttgatgatg ctgcttgggc acaaggaaga 900

tgtgatgcca ttgtgaggtc tggtgctgga actgttggaa gaactcaaat tgcaagaagg 960

tctgctgctg tttggactga tggatgtgtt gaagttctgg ctgactctgg aaacaggaga 1020

ccctccacaa gacccagagc caaggaatga 1050

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctcggttac gcgtggacga 20

Claims

1.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的保藏号为CCTCC NO：C2018241。

2.一种重组细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求2所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述将靶向片段整合到CHO细胞基因组上的步骤包括：将所述靶向片段和荧光蛋白基因整合到所述CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到所述重组细胞。

5.根据权利要求4所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述将所述靶向片段和荧光蛋白基因整合到所述CHO细胞基因组，筛选荧光强度不低于预设值的单克隆细胞，得到所述重组细胞的步骤包括：

6.一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，所述靶向片段的序列如SEQ ID No.1所示；

8.根据权利要求7所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，所述构建含有所述靶向片段的供体质粒的步骤包括：

9.根据权利要求7所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法，其特征在于，在将所述供体质粒、能够表达Cas9核酸酶的质粒和能够表达向导RNA的质粒共转染所述重组细胞的步骤之前，还包括构建所述能够表达向导RNA的质粒的步骤：

10.一种外源基因定点整合到CHO细胞基因组的试剂盒，其特征在于，包括：

11.一种重组细胞株，其特征在于，所述重组细胞株由权利要求6～9任一项所述的外源基因定点整合到CHO细胞基因组的方法制备得到，所述重组细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2018257。