CN110036026A - 用于发现和表征t细胞受体与相关抗原相互作用的工程化两部分细胞装置 - Google Patents
用于发现和表征t细胞受体与相关抗原相互作用的工程化两部分细胞装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种两部分装置，其中第一部分是工程化的抗原呈递细胞系统(eAPCS)并且第二部分是工程化的TCR呈递细胞系统(eTPCS)。
Description
技术领域
本发明涉及构建和使用包括两个部分的工程化细胞装置，其中每个部分包含不同的工程化细胞系统，在系统的运行中所述的细胞系统彼此相互作用。该两部分细胞装置的第一部分是抗原呈递细胞(APC)系统，所述系统通过基因组编辑进行工程化，以使APC不能细胞表面呈递人白细胞抗原(HLA)分子、HLA样分子和不同形式的抗原呈递分子和抗原性分子。此外，该工程化的APC系统(eAPCS)含有用于插入编码抗原呈递分子的可读框(ORF)和任选地用于插入遗传编码的分析物抗原的基因组整合位点。该eAPCS可以由如下遗传供体载体完善，所述遗传供体设计成靶向APC的基因组整合位点，从而可以快速递送编码分析物抗原分子和/或编码抗原呈递复合体的ORF。两部分细胞装置的第二部分是呈递T细胞受体(TCR)的细胞系统，所述系统通过基因组编辑进行工程化，以使该细胞不能表面表达TCR链。这种工程化的TCR呈递细胞系统(eTPCS)保持一旦引入编码TCR的ORF、则在细胞表面上CD3复合体背景下表达TCR异二聚复合体的能力，并且有能力以可检测方式响应于TCR连接。该eTPCS由如下遗传供体载体完善，所述遗传供体载体设计成靶向TCR呈递细胞的基因组整合位点从而快速递送分析物TCR ORF。这种工程化的两部分细胞装置设计用于标准化分析在细胞-细胞通讯的天然功能背景中的TCR/抗原相互作用。
发明简介
T淋巴细胞(T细胞)的免疫监视是全部有颌类脊椎动物的适应性免疫中的核心功能。T细胞免疫监视通过T细胞亚型的丰富功能多样性来实现，其起到消除病原体感染细胞和肿瘤细胞并协调适应性免疫应答以针对正在入侵的病原体、共生性微生物、共生非自我因素(如食品原料的分子组分)、和甚至维持自我免疫耐受性。为了响应于各种外来因素和自我因素，T细胞必须能够特异性检测这些外来因素和自我因素的分子组分。因此T细胞必须能够以足够的特异性来检测个体遭遇的庞大自我分子和非自我分子，从而针对致病生物和患病自我发动有效应答，同时避免对健康自我发动这类应答。考虑到外来分子和自我分子的多样性实际上不受限制且致病生物处于逃避T细胞检测的进化压力下，这项任务的高度复杂性质是明显的。
T细胞受体(TCR)
T细胞主要依据表达的T细胞受体(TCR)界定。TCR是T细胞的组分，其负责与T细胞适应性免疫的靶标相互作用并感知该靶标。概括而言，TCR由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条TCR链各自由两个胞外结构域组成，即可变(V)区和恒定(C)区，两者均为免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，形成反平行β-折叠。这些结构域由连接短胞质尾的I型跨膜结构域锚定在细胞膜中。T细胞能够适应并且检测分子组分多样性的性质，源自TCR链在T细胞发生期间产生的变异。这种变异与类似于B细胞中抗体生成的方式通过体细胞重组而产生。
TCR链多样性
T细胞集合由几个功能上和表型上异质的亚群组成。但是，T细胞可以根据它们在表面表达的体细胞重排的TCR形式，广义地划分为αβ或γδ。存在两种形式的TCR链对；TCRα(TRA)和TCRβ(TRB)对；和TRCγ(TRG)和TCRδ(TRD)对。表达TRA:TRB对的T细胞称作αβT细胞，而表达TRG:TRD对的T细胞经常称作γδT细胞。
αβ形式和γδ形式的TCR均负责识别多样的配体或‘抗原’，并且每个T细胞在T细胞成熟期间从头生成αβ或γδ受体链。这些新生TCR链对通过在称作体细胞V(D)J重组的过程中产生受体序列多样性，实现多样性识别，此后，每个T细胞表达单一一种独特重排的TCR的拷贝。在TRA基因座和TRG基因座，众多离散的可变(V)和功能(J)基因区段可用于重组并且靠近恒定(C)基因区段，因此称作VJ重组。在TRB基因座和TRD基因座处的重组额外地包括多样性(D)基因区段，并且称作VDJ重组。
每个重组的TCR具有针对独特配体特异性的潜力，这由α链和β链(在αβT细胞情况下)或γ链和δ链(在γδT细胞情况下)形成的配体结合位点的结构决定。TCR的结构多样性主要限于每条链上的三个短发夹环，称作互补决定区(CDR)。受体链对的每条链各贡献三个CDR，这六个CDR环总体上位于TCR胞外结构域的远膜端，形成抗原结合位点。
每条TCR链中的序列多样性以两种方式实现。首先，通过随机选择基因区段以重组，提供了基本的序列多样性。例如，TRB重组在47个独特V、2个独特D和13个独特J种系基因区段之间发生。通常而言，V基因区段贡献CDR1环和CDR2环，并且因此是种系编码的。产生序列多样性的第二方式出现在高变性CDR3环内部，其中通过在正在重组的V、(D)和J基因区段之间的交界处随机缺失模板核苷酸和加入非模板核苷酸，产生所述CDR3环。
TCR:CD3复合体
成熟的αβ和γδTCR链对在细胞表面呈递，与多种称作ε、γ、δ和ζ的辅助CD3亚基形成复合体。这些亚基以三种二聚体(εγ、εδ、ζζ)形式与αβ或γδTCR缔合。这种TCR:CD3复合体形成当αβ或γδTCR与相关抗原(cognate antigen)接合时启动细胞信号传导响应的单位。缔合在TCR:CD3复合体中的CD3辅助亚基贡献了信号传导基序，其称作免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ε，CD3γ和CD3δ各自贡献单一ITAM，而CD3ζ同型二聚体含有3个ITAM。与TCR装配的三种CD3二聚体(εγ、εδ、ζζ)因此贡献10个ITAM。一旦TCR与相关抗原连接，则串联酪氨酸残基的磷酸化可以为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质(如关键的ζ链缔合70kDa蛋白(ZAP-70))提供配对的对接位点。招募这类蛋白质将启动最终负责T细胞活化和分化的TCR:CD3信号传导复合体的形成。
αβT细胞
人类中αβT细胞通常比其γδT细胞对应物更丰富。大部分的αβT细胞与细胞表面上HLA复合体呈递的肽抗原相互作用。这些识别肽-HLA(pHLA)的T细胞是首先被描述并且迄今最充分表征的。也已经描述了比较少见形式的αβT细胞。粘膜相关的不变T(MAIT)细胞看起来具有相对有限的α链和β链多样性，并且识别细菌代谢物而非蛋白质片段。不变天然杀伤T细胞(iNK T细胞)和种系编码的分枝酰(mycolyl)反应性T细胞(GEM T细胞)限于识别由非HLA分子交叉呈递的糖脂。大部分认为iNK T细胞与CD1d呈递的糖脂相互作用，而GEM T细胞与CD1b呈递的糖脂相互作用。其他形式的T细胞据认为与CD1a和CD1c背景中的糖脂相互作用，然而，这些细胞仍待详细表征。
常规αβT细胞
大部分αβT细胞的关键特征是识别HLA分子背景下的肽抗原。这些细胞经常称作‘常规’αβT细胞。在个体内部，自我-HLA分子向T细胞呈递源于自我和外来蛋白的肽，从而为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫、针对共生生物、食品原料和自我的适应性耐受，提供必要基础。编码HLA蛋白的HLA基因座是人类基因组中基因最密集和最具多态性的区域，并且人类中描述了存在超过12,000个的等位基因。HLA基因座中的高度多态性确保了个体之间的肽抗原呈递多样性，这对群体水平的免疫力是重要的。
HLA I类和II类
存在两种形式的经典HLA复合体：HLA I类(HLAI)和HLA II类(HLAII)。存在三个经典的HLAI基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C。这些基因编码跨膜α链，其与不变的β2-微球蛋白(β2M)链缔合。HLAIα链由具有免疫球蛋白折叠的三个结构域：α1、α2和α3组成。α3结构域在近膜端并且基本上不变，而α1结构域和α2结构域共同形成远膜端的多态性抗原结合槽。存在六个经典的HLAII基因：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。这些基因编码包含α链和β-链的配对的DP、DQ和DR异二聚HLA复合体。每条链具有两个具有免疫球蛋白折叠的主要结构域，其中α2结构域和β2结构域包含类似于HLAIα3结构域的近膜端且基本上不变的模块。HLAIIα2和β2结构域共同形成远膜端的抗原结合槽并且是高多态性区域。
HLAI和HLAII的抗原结合槽包含在八个反平行β-折叠的平台上的两个反平行α-螺旋。在这个槽中，肽抗原结合并以延伸的构象呈递。在HLAI和HLAII中接触肽的残基是最具序列多态性的位置，构成了不同HLA等位基因呈递的肽库多样性的分子基础。肽与抗原结合槽广泛接触，并且因此，每个HLA等位基因对呈递的肽施与不同的序列约束和偏好性。因此，给定的肽将仅结合有限数目的HLA，并且对应地，每个等位基因仅容纳来自给定蛋白质的肽集合的一个特定部分。每位个体中存在的HLAI和HLAII等位基因集合称作HLA单倍型。HLAI基因和HLAII基因的多态性和遗传的等位基因的共显性表达在人类群体中驱动了极庞大的HLA单倍型多样性，这与αβTCR的众多序列多样性组合，为这些HLA-抗原-TCR相互作用的分析标准化设置了高度障碍。
HLAI和HLAII的αβTCR接合作用(engagement)
αβTCR通过混合的pHLA结合界面的一部分识别肽，所述结合界面由HLA和肽抗原(改变的自我)的残基形成。HLAI复合体呈递在几乎全部有核细胞的表面上并且通常被认为呈递衍生自内源蛋白的肽。T细胞因此可以通过采样相互作用性细胞的pHLAI复合体，探查HLAI呈递细胞的内源性细胞蛋白质组。HLAI接合需要由相互作用性T细胞表达TCR辅助受体CD8，因此HLAI采样限于CD8+αβT细胞。相反，HLAII复合体的表面呈递主要地限于专职APC，并且通常视为呈递从外源于呈递细胞的蛋白质衍生的肽。相互作用性T细胞可以因此探查呈递细胞所在的胞外微环境的蛋白质组。HLAII接合需要由相互作用性T细胞表达TCR辅助受体CD4，因此HLAII采样限于CD4+αβT细胞。
αβTCR的胸腺选择
如上文所述的αβTCR的作用是检测pHLA复合体，由此呈递TCR的T细胞可以产生与该T细胞在建立免疫中的作用密切相关的应答。应当考虑到，在个体内部生成的αβTCR组库必须解决在抗原实际出现之前、在特定单倍型背景下可能遭遇到的全部外来抗原的浩瀚和不可预见的多样性。这种结果可以在如下背景下实现，其中按照准随机化的方式生成极端多样和众多的αβTCR，其潜在地识别未明确的pHLA复合体，而仅被特别地指导以避免与自我pHLA的强烈相互作用。在称作胸腺选择的过程中，这在T细胞成熟期间被仔细地协调。
在胸腺中T细胞成熟的第一步，携带不能够与自我-pHLA复合体以足够亲和力相互作用的αβTCR的T细胞，将被剥夺存活信号并被消除。这个称作正向选择的步骤可以确保存活的T细胞携带这样的TCR组库，所述的TCR组库(repertoire)至少潜在地能够识别在正确HLA背景下呈递的外来肽或变异肽。随后，通过负向选择过程，主动移除与自我-pHLA强烈相互作用并且因此具有驱动自身免疫性的可能性的αβTCR。正向选择和负向选择的这种组合，导致只有携带对自我-pHLA具有低亲和力的αβTCR的T细胞在外周增殖。由此建立自我限制的但非自我反应的αβT细胞库。T细胞生成过程针对HLA单倍型的这种高度个体化性质，加大了对αβTCR-抗原-HLA相互作用进行标准化分析的挑战性。另外，这也形成移植排异和移植物抗宿主病和如下一般原则的基础，所述的一般原则是：在一位个体中鉴定到的αβTCR可能在第二位个体中具有完全不同作用，这对于临床实践中出现的基于TCR和基于T细胞的治疗和诊断策略具有明确意义。
非常规αβT细胞
非HLA限制或‘非常规’形式的αβT细胞具有非常不同的分子抗原靶。这些非常规的αβT细胞不接合经典HLA复合体，反而接合保守的HLA样蛋白质如CD1家族或MR1。CD1家族包括参与抗原交叉呈递的四种形式(CD1a、b、c和d)。这些细胞表面复合体具有与HLAI相似的α链，其与β2-M形成异二聚体。在该α链的远膜端表面呈献的疏水性小口袋形成病原体衍生的基于脂质的抗原的结合位点。先天样NK T细胞(iNK T细胞)形成最佳理解脂质/CD1家族识别的例子，GEM T细胞是另一明显例子。已知‘I型’iNK T细胞与在CD1d背景下的脂质α-GalCer强烈相互作用。这些iNK T细胞展示非常有限的TCR多样性，具有固定的TCRα链(Vα10/Jα18)和数目有限的β-链(受限的vβ利用)，已经被类比于先天病原体相关的分子模式(PAMPS)识别受体如toll样受体和Nod样受体。相反，‘II型’NK T细胞展示更多样的TCR组库，并且看起来具有更多样的CD1d-脂质复合体接合模式。GEM T细胞识别CD1b呈递的分枝杆菌(Mycobacteria)来源糖脂，然而，对CD1a、b和c呈递抗原的分子细节以及它们的T细胞识别作用的理解，才刚开始。
MAIT细胞主要表达能够与一系列TCRβ-链配对的不变TCRα链(TRAV1-2，连接于TRAJ33、TRAJ20或TRAJ12)。替代肽或脂质，MAIT TCR可以结合HLAI样分子(MR1)呈递的、基于叶酸和基于核黄素的病原体衍生代谢物。在MAIT TCR上观察到的有限但明显的TCR多样性，看起来能够在保守的MR1背景下实现多样但相关代谢物的识别。
并不充分理解，非经典HLA限制肽αβT细胞TCR在胸腺中在成熟期间如何被选择的。但是，看上去上文所概述的负向选择和正向选择的基本过程可能仍适用，并且一些证据表明，这在胸腺中在特化的微生境中发生。
γδT细胞
与αβTCR生成和pHLA接合的详细机理性理解相反，对抗原靶及其γδT细胞对应物的情况，所知道的相对少。这部分地归因于它们在循环T细胞区室中相对低的丰度。但是，广泛地认为，γδT细胞不是严格HLA限制性的，并且类似于抗体，似乎更自由地识别表面抗原。另外，最近，已经获悉，γδT细胞可以在上皮组织的常驻性T细胞区室(免疫系统与外来抗原相互作用的主要部位)中占主导。此外，文献中开始出现γδT细胞如何免疫监测肿瘤和监测其他自我失调形式的各种机制。先天样和适应性γδT细胞两者的特定抗原靶仍界定模糊，但是PAMP的组织分布和快速识别提示，两种γδT细胞在外来抗原的早期应答以及适应性免疫系统仍在成熟的生命早期具有重大作用。
γδT细胞的多样功能似乎基于不同的VγVδ基因区段的利用，并且可以按照两个主要类别宽泛地理解，其中主要具有不变TCR的γδT细胞介导感染期间极早期的PAMP先天样识别。除了PAMP之外，还认为这些类型的γδT细胞识别自我分子，包括磷酰抗原，这些分子可能提供细胞应激、感染和潜在地肿瘤形成的极早期标签。对PAMP和这类所谓危险相关分子模式(DAMPS)以及大量组织限制性先天样γδT细胞的认识，强烈地表明，这些细胞适合快速应答抗原攻击，而无需先前活化、归巢和克隆性扩增。
第二形式的γδT细胞被认为在本质上是更为适应性的，具有高度多样的γδTCR组库并能够外周循环和直接接近淋巴组织。已经描述了针对人常见病原体如CMV的这类抗原特异性γδT细胞，并且它们似乎形成记忆应答。但是，也已经观察到，γδT细胞在活化后仅显示相对有限的克隆性增殖，并且关于γδT细胞在外周循环中或在组织中的TCR多样性和特异性应答的程度，可用数据甚少。另外，尽管通常认为γδTCR不与pHLA复合体相互作用并且因此不与在此背景下的肽抗原接合，但仅有γδT细胞的少数抗原靶已经得到表征，并且潜藏的分子构架仅有很少的理解。
人体中外周γδT细胞的低频率和研究组织常驻性T细胞的困难性，已经限制我们对这种重要和多样的T细胞类型如何参与适应性免疫应答的了解。这个新兴的研究领域需要更可靠的技术来捕获和表征罕见γδT细胞、分离其TCR对、以及鉴定其相关抗原。
抗原和抗原呈递细胞
在T细胞和TCR的情况下，抗原可以定义为可以由TCR接合并且在T细胞中导致信号转导的任何分子。最充分表征的T细胞抗原是在HLAI和HLAII复合体中呈递并且由常规αβT细胞接合的肽。但是，近几年，已经显而易见，非常规的αβT细胞和γδT细胞能够接合广泛类型的生物分子作为抗原，包括脂质、脂肽、糖肽、糖脂和一系列代谢物和分解代谢物。此外，已经提出，γδT细胞或许能够以抗体样方式直接接合充分折叠的蛋白质。因此，T细胞抗原基本上限制于HLA呈递肽的观点已经在过去二十年期间扩展为包括几乎任何生物分子。由此概念，定义什么可以被视为抗原呈递细胞(APC)是有意义的。
如上文章节中所指出，HLAI和HLAII具有跨细胞类型的不同表达谱。广泛认可的是，几乎全部有核细胞均在细胞表面上呈递HLAI复合体，并且因此有能力呈递肽抗原供T细胞采样。相反，HLAII具有限的表达谱，并且至少在稳态条件中仅表达在具有抗原呈递专职作用的细胞的表面上，所述细胞包括树状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。这些专职细胞类型经常称作专职APC。出于本文的目的，术语APC用来描述能够呈递抗原供αβ或γδT细胞采样的任何有核细胞。这类抗原不限于在特异性抗原呈递复合体如HLA和HLA样分子中作为‘载货’呈递的那些，还可以包括在细胞表面呈递的、能够接合携带αβ或γδTCR的细胞的任何结构部分。
TCR的治疗性用途
原代T细胞过继转移(adoptive transfer)在二十世纪九十年代早期首次在临床环境下试验，始于离体扩增的T细胞，这些T细胞被极化以针对病毒性抗原，旨在赋予免疫受损患者对病毒的免疫力。之后很快，在恶性肿瘤治疗中，使用离体扩增的针对特定癌抗原的原代T细胞，试验了相似方案。在这些早期方案中出现的且持续成为如今难题的一个限制是，对于T细胞的本质和多样性缺乏理解，这与精细优化治疗产品的组成的需求发生冲突。目前，离体扩增的原代T细胞的使用已经基本上为制药业摒弃，除了屈指可数的使用具有病毒抗原特异性的原代T细胞的举措。
近年来，将遗传物质可靠引入人原代细胞的能力已经见证了多种实验性基因修饰的T细胞治疗药的出现。这类治疗用细胞产品旨在利用T细胞应答的能力并使T细胞特异性针对疾病相关性抗原靶(例如，恶性细胞独特表达的抗原)重定向。这些产品主要依赖于将嵌合抗原受体(CAR)转移入接受者T细胞，而非实际的TCR链对。CAR代表导引部分(最经常是靶向恶性细胞的表面表达蛋白质的单链抗体元件)，其中所述导引部分移植到信号受体元件(如CD3复合体的ζ链)上，以产生模拟CD3-TCR功能的人造嵌合受体。这些所谓的CAR T细胞(CAR-T)产品迄今在临床试验中达到综合成功，然而尽管如此，它们的潜力并不容易超出具有固有唯一分子靶的肿瘤(如B细胞恶性肿瘤)的范围。备选地，将全长TCR链对的ORF转移入T细胞，正在越来越多地被关注。这类TCR工程化的T细胞治疗药目前受限于生产工艺的挑战性以及(类似于CAR-T产品)缺少已验证的抗原靶和导引构建体。迄今，一直致力于使用αβTCR识别HLAI呈递在恶性细胞上的肽抗原，而这种方法的一个基本问题是需要特异于恶性细胞的抗原。
由于TCR-pHLA相互作用具有相对低的亲和力，所以天然TCR被认为可能次优于TCR工程化的T细胞疗法。已经构思了几种方案以使TCR按照几乎与单链抗体亲和力成熟过程相同的方式在体外亲和力成熟。这些TCR亲和力成熟方案通常也利用单链样式，其中一条链的V区与另一条链的V区融合以产生单一多肽构建体。这类单一多肽随后可以用于改编自抗体工程化作业流程的噬菌体展示系统或酵母展示系统中，并且经过多轮次基于靶结合的选择。就产生功能性TCR链对而言，这种单链TCR方案中存在两个固有局限性。首先，选择过程基于的是靶结合亲和力。但是，文献已经充分记载，TCR亲和力并不总是与TCR信号传导输出的强度或能力相关。其次，一旦将单链构建体重构为全长受体后，基于亲和力对单链构建体的选择并不总是能够转换成等同的亲和力。
在治疗用背景中，对于亲和力成熟的TCR对，存在一个附加和决定性的限制。即，考虑到它们的序列已经改变，所产生的构建体依据定义已经不再接受胸腺选择，在胸腺选择中与自我抗原强烈反应的TCR将从组库中被去除。因此，这些修饰的TCR携带自反应性的内在风险，所述风险很难使用现有方法在体外排除。出于相同理由，用于治疗性应用时，任何选择的或工程化的TCR需要个体化。如果TCR是跨个体应用的经人工工程化或天然的TCR，则必须基于每个特定个体的HLA单倍型和呈递的肽组库来排除交叉反应，以避免潜在灾难性的自身免疫性。原因是：胸腺选择是在仅特异于给定个体的全部可用HLA分子的背景上进行的。不清楚这种交叉反应性的可能性。但是，我们的TCR组库将相同物种的其他个体的pHLA复合体识别为外来的能力，是适应性免疫的基本特性，并且是移植排异和移植物抗宿主病的基础。使用针对癌特异性黑素瘤相关抗原(MAGE)的成熟TCR链对，进行的最近临床试验，凸显了绕过胸腺选择的潜在问题。将携带成熟TCR的自体T细胞返输回两位癌症患者时，这些患者快速地出现致命的心脏病。后续研究确定，MAGE特异的成熟TCR与HLAI呈递的来自心脏蛋白质肌联蛋白的肽交叉反应。这强烈地表明，交叉反应性是治疗性使用TCR时的一种明显的可能性。
出于治疗目的利用TCR的一个不同途径是，按照几乎与抗体治疗用物质相同的方式使用它们作为亲和试剂。已经试验，单链TCR分子可以用于递送缀合的药物物质至特定的HLA抗原表达细胞群。总体上认为这种方案比CAR-T或TCR工程化的T细胞治疗药更安全，因为可以简单地停止该药物物质的施用。但是，难以预测的交叉反应性及脱靶效应可能性仍是这种设定下的潜在限制。
临床诊断中的TCR组库检测
在一个相关方面，日益浮现的兴趣是，出于临床诊断目的，检测特定TCR序列的丰度。尤其随着深度测序方法出现，可以全局地以及针对特定背景下的匹配αβ对，捕获某个体内部的完整TCR多样性。这潜在地构成了一种诊断特定状况和疾病状态的手段，其中仅检测扩增的T细胞克隆的丰度，作为患者中疾病相关性抗原的既定免疫应答的替代性读出结果。但是，这类全局方案目前受限于十分强烈的免疫反应和确立的临床时间点，并且遭遇以下基础性难题：鉴定依据测序鉴定的任何具体TCR的特异性抗原靶。
T细胞抗原的治疗性和诊断性用途
利用适应性免疫应答的该基本手段可以转换成一个核心技术难题，即，TCR-抗原相互作用的精致特异性需要详细知晓与每种病原体、癌细胞或自身免疫疾病特异性相关的抗原。另外，每种抗原可以由特定的抗原呈递复合体或其等位基因呈递，从而一直是针对每个相关的HLA基因和等位基因来进行抗原开发。对于与强烈适应性免疫应答相关并且通常显示保守性表位应答层级的几种传染性疾病如HIV、流感和CMV，已经在某些常见HLA的背景下作图定位最重要的表位。类似地，癌症、过敏和自身免疫性领域已经见证增长和系统性的相关T细胞抗原定位工作。但是，这些是有挑战性的过程，并且由于缺少有效、稳健、快速和可放大方案，也阻碍了系统性描述与不同临床背景相关的T细胞抗原的进行。
特别地，癌细胞代表一个有挑战性和重要的方面，这是因为呈递在恶性细胞表面上的大部分肽是自身抗原或与自身抗原十分相似。因此，胸腺选择将已经去除可能强烈识别这些肽的TCR，而与此同时，肿瘤会演进以逃避免疫识别。这意味着，针对已建立肿瘤，强力免疫应答是相对少见的，并且难以预测或发现靶标。但是，这些应答的确存在，并且重要地，通常与更好的结果相关。在大多数情况下，这类应答的靶，肿瘤相关抗原(TAA)，将具有区别于自我的特征，并且衍生自这样蛋白质，所述蛋白质在癌形成期间过量表达、或者在此形成阶段从细胞类型中缺失、或通过遗传突变或翻译后修饰(如磷酸化)被特异性改变。
这类表位的知识，如果可获得，则允许探查相关的T细胞应答，用于基础发现、诊断目的和例如检测疫苗效力。重要地，也可以为过敏和自身免疫中的T细胞耐受作用提供高度特异的靶，并且至关重要的是，可以指出用于特异性免疫疗法和对抗恶性细胞的有价值靶。恶性肿瘤是特别有价值的靶点，除了癌类型的特异标记物碰巧可获得的少数情况，细胞免疫疗法的前景和T细胞操作的进展因缺少已验证的靶TAA而被延缓。
鉴于细胞疗法的潜力和缺少已验证的靶，鉴定有前景的TCR抗原仍是基于TCR的免疫治疗的最急迫瓶颈之一，在治疗癌症的工作中尤其如此。
TCR和T细胞抗原分析的技术方面
总体上，基于TCR的疗法的开发仍处于早期，并且成功有限。诊断方案，尽管潜力巨大，但一直很少用于旨在评估患者疾病状态或治疗响应的对照临床研究中。用于可靠捕获天然TCR链对和以高通量和在细胞-细胞通讯的功能背景下系统分析TCR-抗原相互作用的技术不足，已经成为基于TCR的疗法和诊断学发展的主要障碍。
深度测序方案已经导致对健康和疾病情况下T细胞受体多样性的理解改进。但是，这些方案总体上聚焦于跨越CDR3区域(主要地TCRβ-链)的短段。大部分研究忽略了TCRα链的贡献，并且很少研究力图分析配对的αβ链以及确定为有意义的TCR的抗原特异性。使用单细胞包囊化和遗传条形码的最近作业流程，已经能够使天然TCRαβ链对或γδ链对配对及分析全长序列，然而，这类作业流程仍是实验性的。
可以按生物物理模式或功能模式，从抗原特异性方面分析分离的TCR链对。生物物理分析需要重组产生TCR以及分析物抗原的可溶性形式。在HLA限制型肽TCR的情况下，这将因此需要产生全部独立TCR以及相关的pHLA复合体。这在技术上有高度挑战性、缓慢且通量十分低。另外，这种分析将仅提供相互作用亲和力，后者并不以可预测方式与功能特征充分相关。
直至最近，细胞背景下已分离TCR序列的详细功能性分析尚限于以下繁琐方案：将分析物TCR链对转染入原代T细胞或永生T细胞系，通过传统的细胞活化流式细胞分析来检测细胞应答、或检测已转染细胞在抗原攻击时产生的分泌因子。在Guo等人的最新发表物中，报道了来自单细胞的配对TCR链的快速克隆、表达和功能性表征(Molecular Therapy–Methods and clinical development(2016)3:15054)。在这项研究中，人αβTCR对分析物在报道细胞系中表达，所述报道细胞系缺少αβTCR表达并含有Nur77启动子连接的绿色荧光蛋白(GFP)报道分子系统，该报道系统可以在TCR刺激时被激活。这个系统仍是低效的，原因在于缺少向报道细胞系基因组中的标准化TCR整合，并且未提供通过APC元件用于细胞结合型抗原攻击的系统方式。
类似于鉴定已知T细胞抗原的TCR的作业流程，在健康和疾病情况下从头发现新T细胞抗原仍高度有挑战性。大部分方案在本质上仍是生物物理的，并且旨在产生候选抗原，以便可以在免疫接种方案中测试、或通过鉴定如上所述的相关TCR而测试。在T细胞抗原开发领域，很少存在或不存在标准化，并且该领域主要限于学术研究。
尽管对TCR及其相关抗原在治疗性和诊断使用中的兴趣日益积累并且出现了捕获明显数目的天然TCRαβ和γδ链对的手段，但是仍缺少系统分析TCR-抗原相互作用的可靠高通量和标准化技术。重要地，缺少在天然的细胞-细胞通讯背景下功能性分析TCR链对的标准化系统，其中TCR和抗原均由活细胞呈递。另外，缺少在细胞-细胞通讯背景下可以实现候选TCR选择和/或TCR链对亲和力成熟的系统。
如所述，目前缺少标准化技术用于高通量产生在天然细胞背景下表达TCR对的细胞。迫切需要这样的系统，其中全长TCR对可以作为单拷贝插入TCR呈递细胞的基因组，由此所述TCR呈递在天然CD3细胞表面复合体中供分析和选择。CD3复合体呈递的TCR对可以确保亲和力分析反映实际的天然TCR组成，这对于单链TCR和其他非天然TCR展示技术而言并非如此。另外，在活细胞上在CD3复合体中呈递TCR对是功能性分析TCR对的绝对要求。功能性分析，意指分析TCR信号传导输出，这在TCR选择和工程化作业流程中具有关键重要性，在这些流程中信号输出是对细胞治疗药背景下的用途通常最为重要的参数，并且与在其他展示平台所确定的TCR与相关抗原/HLA的亲和力不能充分相关联。
发明详述
本发明解决了上文提到的需求。特别地，本发明涉及用于发现和表征TCR和T细胞抗原的工程化两部分细胞装置的构建和用途。整个细胞装置的两部分由在装置运行时彼此接触的不同工程化细胞类型组成。该装置用于分析物TCR针对分析物抗原的反应性的标准化功能性分析。这类反应性的读出可以用于鉴定并选择TCR、T细胞抗原、和详细功能性表征TCR/抗原相互作用。该装置借助第一细胞群体呈递分析物抗原，所述第一细胞群体为使用eAPC系统(eAPCS)制备的工程化抗原呈递细胞(eAPC)。该装置借助第二细胞群体呈递分析物TCR，所述第二细胞群体为使用eTPC系统(eTPCS)制备的工程化TCR呈递细胞(eTPC)。
本发明的两部分装置含有这样的特征，所述特征能够实现高程度的标准化、重现性，并且极为重要地，限制分析物TCR和T细胞抗原集合的复杂度。主要地，通过以定义的且高度受控的方式将分析物抗原呈递复合体和抗原整合到eAPC的基因组中以及将TCR整合到eTPC的基因组中，实现这种标准化。这允许以快速的循环时间来产生分析物细胞群体，并且大幅度减少现行随机整合和病毒载体平台的成本。另外，本发明允许按照eAPC为中心和eTPC为中心的方式，产生基于细胞的分析物实体阵列，这意味着巨大的载体文库可以整合入任一个细胞群体，并且作为每个细胞表达单一分析物实体的细胞文库来分析。工程化引入eAPC和eTPC的基因组中的单拷贝基因组接受位点可以实现这个意图，由此(对于HLA、抗原或TCR链)在通过匹配的供体载体中的ORF提供时，仅可以从载体汇集物整合单拷贝的ORF。这意味着，如果载体汇集物包含混合身份的ORF，每个整合的细胞将仅整合单个身份；实质上产生类似于其他展示平台(如噬菌体)的基于细胞的阵列。这种高水平的标准化和复杂度的降低，与现行方法相反，在现有方法中，使用原代或永生细胞培养物以及延长的生长和内源性信号传导反应来实现输出、或部分系统化的APC为中心或T细胞为中心的输入。重要的是，代表本发明的两部分工程化细胞装置可以实现在细胞-细胞通讯背景下对相关功能性应答的标准化。这对于通过增加对TCR和T细胞抗原的体内作用的可预测性而减少发现和临床检验新TCR候选物和T细胞抗原候选物的时间和成本，是关键性的。
本发明涉及提供和运行一种两部分装置，其中第一部分是工程化的抗原呈递细胞系统(eAPCS)并且第二部分是工程化的TCR呈递细胞系统(eTPCS)。总体上，该装置是一种多细胞分析系统，由两类不同的工程化人细胞组成，用于功能性分析T细胞抗原的TCR识别过程。这个装置的初级输出是表达分析物抗原或分析物TCR的细胞，所述细胞随后可以用来分别地测定装置的终端输出，即特定的T细胞抗原或TCR序列(图1)。
两部分装置以两个阶段运行，所述阶段包括
i.阶段1，制备携带分析物抗原和分析物TCR的细胞群体，及将它们组装在组合系统中，使两种分析物细胞群体接触
ii.阶段2，读出组合系统中接触的细胞群体的任一者内在的应答以获得装置的输出，
其中eAPCS和eTPCS分别提供制备待组装在eAPC:eTPC组合系统中的分析物eAPC和eTPC群体的手段(图1，步骤i和ii)。
eAPCS定义为这样的系统，通过该系统制备供给eAPC:eTPC组合系统的各种形式的分析物eAPC群体，其中分析物eAPC群体定义为以下之一
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
iv.其文库
其中，输入eAPC:eTPC组合系统的分析物eAPC群体的选择，由装置运行所针对的抗原的性质来决定。即，所需要组合在eAPC:eTPC系统中的eAPC群体由装置所需的初级输出和/或装置所需的终端输出来确定(图1，步骤i)。
eTPCS定义为这样的系统，通过该系统制备供给eAPC:eTPC组合系统的分析物eTPC群体，其中分析物eTPC群体定义为以下之一，
i.eTPC-t
ii.eTPC-t文库
其中，输入eAPC:eTPC组合系统的分析物eTPC群体的选择，由装置运行所针对的TCR的性质来决定。即，所需要组合在eAPC:eTPC系统中的eTPC群体由装置所需的初级输出和/或装置所需的终端输出来确定(图1，步骤ii)。
装置的初级输出是选择的细胞群体，所述细胞群体已经应答或未应答于eAPC:eTPC系统中提供的对应细胞呈递的分析物。即，初级输出可以表现为单细胞或细胞汇集物，其已经基于在eAPC:eTPC组合系统中存在或不存在报告响应而进行过选择(图1步骤v)。分析物eAPC中的应答仅可以通过与接触的eTPC呈递的相关TCR接合而激发。分析物eTPC中的应答仅可以通过与接触的eAPC呈递的相关抗原接合而激发(图1步骤iv)。
可以基于发生接触的细胞中的应答，从eAPC:eTPC组合系统选择分析物eAPC和/或分析物eTPC。即，可以基于发生接触的分析物eTPC中报告的响应或该响应的缺乏，选择分析物eAPC。反过来，可以基于发生接触的分析物eAPC中报告的响应或该响应的缺乏，选择分析物eTPC。
来自装置的初级eAPC输出是选择的细胞，其中基于存在或不存在报告的信号响应作出选择，并且这些细胞可以包含以下一者或多者
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
其中选择的细胞可以包括单细胞、身份相同的细胞的汇集物、身份不同的细胞的汇集物(图1步骤v)。
来自装置的初级eTPC输出是选择的细胞，其中基于存在或不存在报告的信号响应作出选择，并且这些细胞包含eTPC-t；其中选择的细胞可以包括单细胞、身份相同的细胞的汇集物、身份不同的细胞的汇集物(图1步骤v)。
当运行两部分细胞装置时，选择分析物细胞群体以制备和组合成eAPC:eTPC系统，其中所述选择由eAPC和eTPC群体各自呈递的分析物的性质决定。
eAPC-p定义为在细胞表面上表达抗原呈递复合体(aAPX)。aAPX可以加载载货分子(CM)作为抗原载货。加载有抗原载货的aAPX定义为aAPX:CM复合体。
eAPC-a定义为表达分析物抗原分子(aAM)。aAM可以呈递在细胞表面上、和/或在胞内表达或加工，由此其是可以装入aAPX中的载货aAM。
eAPC-pa定义为表达aAPX和aAM两者。aAM可以在胞内表达或加工，由此其是可以装入aAPX中的载货aAM。eAPC-pa因此在细胞表面表达aAPX，并且还可以表达作为载货装入所述aAPX中的aAM，这被定义为aAPX:aAM复合体。eAPC-pa可以不将aAM作为载货装入aAPX中形成aAPX:aAM复合体。另外，归因于生物系统的性质，不可避免的是aAPX:CM复合体也存在于aAPC-pa中。
eTPC-t定义为具有分析物TCR链对，所述分析物TCR链对表达为与CD3复合的TCR表面蛋白(TCRsp)，其中CD3代表在其中呈递TCR异二聚对的表面复合体并且定义为具有ε、γ、δ和ζ亚基，这些亚基以三种二聚体(εγ、εδ、ζζ)形式与互补TCR链对缔合。为了在细胞表面呈递，需要CD3和一对互补TCR链的表达，因此，TCR或CD3表达的缺失将阻止彼此呈递在细胞表面上。在制备eTPC-t时，使用αβ或γδTCR对和/或CD3的表达作为正向选择。因此，无论用来制备eTPC-t的TCRα、β、γ或δ链的组合的性质如何，仅具有与CD3复合的、在细胞表面上呈递的成对互补TCR链的细胞命名为eTPC-t。
上述初级输出均代表细胞群体，所述细胞群体依据在eAPC:eTPC组合系统中其报告的响应而选择产生。每个分析物eAPC呈递一套潜在分析物抗原、固有载货分子和/或分析物抗原呈递复合体，而eTPC呈递分析物TCRsp。从选择的细胞中，可以获得选择的分析物分子作为终端装置输出(图1，步骤vi)。
eAPC-p定义为在细胞表面上呈递aAPX，并且可以在细胞表面呈递aAPX:CM复合体。因此，基于报告的响应从eAPC:eTPC组合系统选择的eAPC-p，可以用来确定aAPX、CM和/或aAPC:CM终端装置输出，其中已经依据确定的分析物抗原与分析物TCRsp形成复合物和/或被分析物TCRsp刺激而报道信号响应的能力，选择这些输出物的身份，其中所述分析物TCRsp由在eAPC:eTPC组合系统中接触所选eAPC-p的分析物eTPC-t呈递。
eAPC-a定义为在细胞表面上或胞内呈递aAM。因此，基于报告的响应从eAPC:eTPC组合系统选择的eAPC-a，可以用来确定aAM终端装置输出，其中依据确定的分析物与分析物TCRsp形成复合物和/或被分析物TCRsp刺激而报道信号响应的能力，选择该输出物的身份，其中所述分析物TCRsp由在eAPC:eTPC组合系统中接触所选eAPC-a的分析物eTPC-t呈递。
eAPC-pa定义为在细胞表面呈递aAPX、aAM、aAPX、aAPX:aM或aAPX:CM。因此，基于报告的响应从eAPC:eTPC组合系统选择的eAPC-pa，可以用来确定aAM、aAPX、aAPX:aM和/或aAPX:CM终端装置输出，其中依据确定的分析物与分析物TCRsp形成复合物和/或受分析物TCRsp刺激而报道信号响应的能力，选择输出物的身份，其中所述分析物TCRsp由在eAPC:eTPC组合系统中接触所选eAPC-pa的分析物eTPC-t呈递。
如上所述，可以基于发生接触的eTPC中报告的响应，选择分析物eAPC。因此，如果在制备分析物eTPC-t之前输入eTPCS的TCRsp是已知的，则可以使用eAPC-p、eAPC-a和eAPC-pa的任一者来间接地获得TCRsp输出。
在本发明语境下，eTPC-t定义为呈递TCRsp。因此，基于报告的响应从eAPC:eTPC组合系统选择的eTPC-t，可以用来确定TCRsp终端装置输出，其中依据确定的分析物TCRsp与分析物抗原形成复合物和/或受分析物抗原刺激而报道信号响应的能力，选择这种输出身份，其中所述分析物抗原由在eAPC:eTPC组合系统中接触所选eTPC的分析物eAPC呈递。
如上所述，可以基于发生接触的eAPC中报告的响应，选择分析物eTPC。因此，如果在制备分析物eAPC之前输入eAPCS的分析物抗原是已知的，则可以用eTPC来间接地获得分析物抗原输出aAM、aAPX、aAPX:aM和/或aAPX:CM的任一者。
eAPCS描述
如上文提到，本发明涉及提供两部分细胞装置，其中每个部分是工程化细胞系统。第一工程化细胞系统是工程化多组分eAPCS，其用来制备分析物eAPC以在装置中组合成两部分eACP:eTPC系统。
最低形式eAPCS是这样的多组分系统，其中第一组分是eAPC，命名为组分1A，其含有基因组接受位点作为第二组分(组分B)、和遗传供体载体作为第三组分，命名为组分1C(图2)。
eAPC代表与系统eAPCS的全部其他组分相关的eAPCS基础组分。因此，eAPC含有某些天然或工程化的特征，这些特征使eAPC同时适用于eAPCS和组合的两部分装置。
在本发明语境下eAPC，即，组分1A
i.缺少aAPX和/或aAM的至少一个家族的内源性表面表达，并且
ii.含有至少一个基因组接受位点，命名为组分1B
其中i)可以通过选择缺少所述aAPX和/或aAM表达的天然细胞群体获得，或可以经工程化以缺少该表达，并且ii)是人造的并且可以通过定向或非定向基因组整合引入。
可以通过本领域熟知的方法，从天然存在的细胞群体选择缺少所需aAPX表达和/或aAM表达的候选eAPC细胞。这可以通过以下方式直接实现：用亲和试剂着染靶细胞，所述亲和试剂对希望从eAPC缺少的aAPX和/或aAM特异，并且选择缺少靶aAPX和/或aAM表达的细胞。
可以通过非定向和定向手段，使细胞工程化以缺少aAPX和/或aAM表达。可以通过向细胞提供化学、放射学或其他诱变剂并且随后选择缺少靶aAPX和/或aAM表达的细胞，实现细胞非定向诱变。可以通过不同手段实现基因组座位的定向突变，所述手段包括但不限于借助以下方式的位点定向诱变
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的打靶
iii.合成的转录激活物样效应核酸酶(TALEN)
其中所述位点定向核酸酶在靶基因座处诱导位点特异性DNA-修复错误诱变(也称作非同源末端接合)，此后通过选择缺少靶aAPX和/或aAM表达的细胞获得突变的细胞。
作为组分1A的eAPC可以任选地包含附加的T细胞共刺激受体，其中此特征允许稳健形式或变化形式的分析物eAPC与分析物eTPC通讯，其中该可调谐通讯与鉴定或表征特定分析物TCRsp和/或分析物抗原相关。在本发明语境下，可以通过纳入CD80、CD86和/或其他B7家族蛋白中一者或多者，促进eTPC上不同形式的CD28连接。
作为组分1A的eAPC可以任选地额外包含引入的细胞表面黏附分子组分、或消除内源细胞表面黏附分子，以促进eAPC与分析物eTPC接合和免疫突触形成，或避免在eAPC:eTPC组合系统内的紧密结合和有害细胞团簇形成。这类可以作为组分1A的额外ORF引入或从1A遗传消除的黏附分子可以选自整联蛋白家族的黏附蛋白。
eAPC可以任选地具有通过天然加工和加载机器来加工抗原和将抗原作为载货载入aAPX的能力。具有通过天然加工和加载机器来加工抗原和将抗原作为载货载入aAPX的能力的eAPC，也可以加工并加载eAPC或含有它的培养系统所固有的载货分子(CM)，其中加载有CM的aAPX命名为aAPX:CM复合体。
最低多组分eAPCS的第二组分是作为遗传供体载体的组分1C，其用于整合至少一个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF(图2)。
组分1C是遗传供体载体，其与包含于eAPC(组分1A)中的组分1B基因组接受位点配对。组分1C设计用于将在遗传供体载体中编码的一个或多个编码aAPX和/或aAM的ORF整合入基因组接受位点1B，其中整合导致靶eAPC表达aAPX和/或aAM。
在本发明语境下，配对的遗传供体载体和基因组接受位点被描述为整合对偶(integration couple)。
在扩展形式或多组分eAPCS中，作为组分1A的eAPC可以还含有第二基因组接受位点，命名为组分1D，其与命名为组分1E的第二基因组供体载体配对，也添加至该系统中(图3)。
多组分eAPCS可以进一步包含一个或多个额外的整合对偶。
包含eAPC和一个或两个整合对偶的多组分eAPCS可以用于制备衍生eAPC形式
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
其中每个遗传供体载体可以含有一个或多个编码一个或多个aAPX和/或aAM的ORF，以便将所述ORF整合入配对的基因组接受位点中，从而i)表达至少一个aAPX，ii)表达至少一个aAM，以及iii)表达至少一个aAPX和至少一个aAM(图4)。
遗传供体载体和基因组接受位点作为eAPCS的整合对偶子系统运作。遗传供体载体必须首先与靶ORF组合，从而基础供体载体现在编码那些靶ORF。随后将装配的该引发供体载体(primed donor vector)引入到靶eAPC中以将靶ORF交换到基因组接受位点上，由此使靶ORF整合到靶细胞的配对接受位点上(图5)。
包含遗传供体载体组分1C和/或1E的多组分eAPCS与至少一个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF组合，以获得组分1C’和/或1E’，其中组合定义为将遗传物质连接入遗传供体载体的正确编码框架中并且处于正确取向。
一个或多个ORF向遗传供体载体1C和/或1E中的组合可以用独特ORF文库以以下方式多次进行：
i.以分开的多个单反应，获得编码多个ORF的1C’和/或1E’载体的分立文库
ii.以单一反应，获得编码多个ORF的1C’和/或1E’载体的汇总文库
其中分立文库可以与组分1A多次组合，从而获得具有编码独特aAPX和/或aAM的独特ORF的eAPC的分立文库；或汇总文库可以与组分1A作为单一事件组合，从而获得eAPC的汇总文库，其中每个eAPC各自具有编码独特aAPX和/或aAM的独特ORF。
对于运行标准化eAPC而言，可预测拷贝数的一个或多个ORF在基因组接受位点的高效整合是高度有利的，由此可以快速地制备并表征分析物eAPC群体。因此，基因组接受位点和配对的供体载体，对eAPC的功能至关重要。另外，可能迫切期望拥有这样的eAPC，其中组分1B和1D彼此隔绝，从而供体载体组分1C不能在组分1B处整合，并且反之亦然。此外，可能期望，组分1B和/或组分1D适应于eAPC制备方法，其中分析物抗原的引入快速且可重复，并且正确整合和递送所需拷贝数的aAPX和/或aAM的概率高。
基因组接受位点可以选自以下
i.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体
ii.设计用于位点定向同源重组的合成构建体
iii.用于位点定向同源重组的天然基因组位点
其中i)是优选的。RMCE方法可以利用选择的异特异性(heterospecific)位点，其中所述异特异性位点对不同重组酶特异，从而每种组分1B和1D均拥有隔绝的特异性。
在本发明语境下，作为基因组接受位点的组分1B和/或组分1D，包含以下至少一个遗传元件
i.异特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件性调节元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接接纳位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.可移动遗传元件
xii.大范围核酸酶(meganuclease)识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)
xiv.病毒自我剪切性肽元件
xv.kozak共有序列。
优选的基因组接受位点将包含使用选自前述元件列表的以下元件的两种不同排布。第一种排布借助RMCE整合用于接受单一ORF和/或整合选择标记，所述ORF编码一个或多个aAPX和/或一个或多个aAM链，其中该排布是
5’-[A][B][C][D][E][F]-3’
其中
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记
E)是元件i)异特异性重组酶位点2
F)是元件v)真核终止子。
第二种排布借助RMCE整合用于接受两个ORF和/或整合选择标记，所述两个ORF编码一个或多个aAPX和/或一个或多个aAM，其中该排布是
5’-[A][B][C][D][E][F][G][H][I]-3’
其中
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记1
E)是元件v)真核双向转录终止子
F)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记2
G)是元件xv)Kozak共有序列
H)是元件i)异特异性重组酶位点2
I)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
另外，在这个第二种排布中，元件F、G和I按反义方向编码。
组分1C和/或1E包含以下至少一个遗传元件
i.异特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件性调节元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接接纳位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.可移动遗传元件
xii.大范围核酸酶识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)
xiv.病毒自我剪切性肽元件
xv.kozak共有序列
xvi.整合选择标记
xvii.抗生素耐药性盒
xviii.细菌复制起点
xix.酵母复制起点
xx.克隆位点
在遗传供体载体的一个优选实施方案中，组分1C和/或组分1E包含使用选自前述元件列表的以下元件的两种不同的可能排布。
借助RMCE整合，第一种排布用于递送单一ORF和/或整合选择标记，所述ORF编码一个或多个aAPX和/或一个或多个aAM，其中该排布是，
5’-[A][B][C][D][E]-3’
其中
A)是元件i)异特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)单一ORF的克隆位点和/或元件xvi)整合选择标记，所述ORF编码一个或多个aAPX和/或一个或多个aAM，
D)是元件i)异特异性重组酶位点2
E)是元件xvii)抗生素耐药性盒和元件xviii)细菌复制起点，无特定取向
另外，元件viii和/或xiv可以用来将多个aAPX和/或一个或多个aAM和/或元件xvi连接在一起。
借助RMCE整合，第二种排布用于递送两个ORF和/或整合选择标记，所述两个ORF编码一个或多个aAPX和/或aAM，其中该排布是，
5’-[A][B][C][D][E][F]-3’
其中
A)是元件i)异特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)用于引入两个或更多个ORF的克隆位点和/或元件xvi)整合选择标记，其中所述两个或更多个ORF带有真核终止子，且编码一个或多个aAPX和/或一个或多个aAM
D)是元件xv)kozak共有序列(反义方向)
E)是元件i)异特异性重组酶位点2
F)是元件xvii)抗生素耐药性盒和元件xviii)细菌复制起点，无特定取向
另外，元件viii和/或xiv可以用来在每个ORF内部将多个aAPX和/或aAM和/或元件xvi连接在一起。
在eAPCS中制备分析物eAPC群体
上述eAPCS系统可以按照多种方式用来制备不同形式的分析物eAPC或其文库，以起到如下作用：在两部分装置运行时，在eAPC:eTPC组合系统中向eTPC呈递分析物aAPX、aAM、aAPX:aAM和aAPX:CM。
包含单一整合对偶的eAPCS可以用来从组分1A通过如下方式一步制备eAPC-p：提供与aAPX的ORF组合的组分1C’，从而使该aAPX整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAPX，并且它呈递在细胞表面(图6)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-p：提供与aAPX的ORF组合的组分1C’，从而使该aAPX整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAPX，并且它呈递在细胞表面。第二整合对偶1D/1E保持未修饰并且可以用于下游整合步骤(图7)。
包含单一整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-a：提供与aAM的ORF组合的组分1C’，从而该aAM整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAM，并且在细胞表面呈递或在胞内留置(图8)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-a：提供与aAM的ORF组合的组分1C’，从而该aAM整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAM，并且在细胞表面呈递或在胞内留置。第二整合对偶1D/1E保持未修饰并且可以用于下游整合步骤(图9)。
包含单一整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-pa：提供与两个ORF(一个编码aAPX,另一个编码aAM)组合的组分1C’，从而aAPX和aAM均整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAPX和aAM，并且可以在细胞表面呈递aAPX:aAM(图10)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-pa：提供与两个ORF(一个编码aAPX，另一个编码aAM)组合的组分1C’，从而aAPX和aAM均整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAPX和aAM，并且可以在细胞表面呈递aAPX:aAM。第二整合对偶1D/1E保持未修饰并且可以用于下游整合步骤(图11)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-pa：提供分别与编码aAPX或aAM的一个ORF组合的组分1C’和1E’，从而aAPX和aAM整合至整合位点1B或1D，以产生1B’和1D’。所产生的细胞系表达提供的aAPX和aAM，并且可以在细胞表面呈递aAPX:aAM(图12)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式两步从组分1A制备eAPC-pa：首先提供与编码aAPX的ORF组合的组分1C’，从而aAPX整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAPX，并且它在细胞表面呈递。第二整合对偶1D/1E保持未修饰。在第二步骤中，提供1E’，其中该供体载体与编码aAM的ORF组合，从而使该aAM整合至位点1E，以产生1E’。所产生的细胞系表达提供的aAM，并且其可以被加工并作为载货加载于aAPX中，以在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体(图13)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式两步从组分1A制备eAPC-pa：首先提供与编码aAM的ORF组合的组分1C’，从而aAM整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAM(eAPC-a中间体)。第二整合对偶1D/1E保持未修饰。在第二步骤中，提供1E’，其中该供体载体与编码aAPX的ORF组合，从而aAPX整合至位点1E，以产生1E’。所产生的细胞系表达提供的aAPX，其呈递在细胞表面上。在第一步骤中整合的aAM可以经加工并作为载货加载于aAPX中，以在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体(图14)。
在上述从eAPC制备分析物eAPC-p、eAPC-a和eAPC-pa群体的例子中，eAPCS系统用来按确定的方式提供已知的aAPX和aAM候选物，以制备表达已确定aAPX和/或aAM的分析物eAPC的分立群体。在运行装置时，这个过程可以重复许多次，以建立eAPC-p、eAPC-a和eAPC-pa的文库以提供给eAPC:eTPC组合系统。一个替代性方案是，取得与遗传供体载体组合的候选物aAPX和/或aAM ORF的汇总文库，并且在单个反应中整合这些文库，以获得表达多个aAPX、aAM和/或aAPX:aAM的分析物eAPC-p、eAPC-a或eAPC-pa的汇总文库。将载体汇集物转化成eAPC-p、-a和/或-pa汇集物的这个过程称作鸟枪法整合(shotgun integration)。当针对固定aAPX分析大型候选物aAM文库时，这特别有用，或反之亦然。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式两步从组分1A制备eAPC-pa：首先提供与编码aAPX的ORF组合的组分1C’，从而aAPX整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系在细胞表面上表达提供的aAPX(eAPC-p中间体)。第二整合对偶1D/1E保持未修饰。在第二步骤中，提供多重1E’的文库，其中该供体载体文库包含载体汇集物，每个载体与编码aAM的单一ORF组合，从而每个aAM在单个细胞内整合至位点1E，以产生1E’。所得到的细胞汇集物含有一组细胞，其中每个细胞已经整合来自原始载体汇集物的单个随机aAM ORF。在第二步骤中整合的aAM可以经加工并作为载货加载于第一步骤中整合的aAPX中，以在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体(图15)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式两步从组分1A制备eAPC-pa：首先提供与编码aAM的ORF组合的组分1C’，从而aAM整合至位点1B，以产生1B’。所产生的细胞系表达提供的aAM(eAPC-a中间体)。第二整合对偶1D/1E保持未修饰。在第二步骤中，提供多重1E’的文库，其中该供体载体文库包含载体汇集物，其中每个载体与编码aAPX的单一ORF组合，从而每个aAPX在单个细胞内整合至位点1E，以产生1E’。所得到的细胞汇集物含有一组细胞，其中每个细胞已经整合来自原始载体汇集物的单一随机aAPX ORF。在第一步骤中整合的aAM可以经加工并作为载货加载于第二步骤中整合的aAPX中，以在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体(图16)。
包含两个整合对偶的eAPCS可以用来通过如下方式一步从组分1A制备eAPC-pa：提供各自与编码aAPX文库或aAM文库的ORF文库组合的组分1C’和1E’，从而aAPX和aAM整合至整合位点1B或1D，以产生1B’和1D’。所得到的细胞汇集物含有一组细胞，其中每个细胞已经整合来自原始载体汇集物的单一随机aAPX ORF和单一随机aAM ORF。在汇总文库中的每个细胞内部，整合的aAM可以经加工并作为载货加载于整合入相同细胞的aAPX中，以在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体。这种汇总文库将含有来自所提供aAPX和aAM集合的全部可能aAPX:aAM组合(图17)。
在上文提到的用于提供eAPC-pa汇总文库的鸟枪法整合的方法中，系统的稳健性依赖于单拷贝的基因组接受位点。这将确保，仅单个分析物可以借助整合对偶引入每个细胞。此单拷贝的基因组接受位点是eAPCS的任选方面，因为多拷贝的相同基因组接受位点可能在提供如下整合步骤方面是有益的，其中可以在制备的eAPC中获得来自所提供的载体文库的多个‘等位基因’。
在本发明语境下，aAPX可以选自以下之一
i.一个或多个HLA I类成员
ii.一个或多个HLA II类成员
iii.一个或多个非HLA抗原呈递复合体。
aAPX可以选自以下之一
i.作为分析物抗原提供的多肽或多肽复合体
ii.从作为分析物抗原提供的多肽衍生的肽
iii.作为分析物抗原提供的肽
iv.作为分析物抗原提供的代谢物
v.从分析物抗原性分子ORF(一或多个)翻译的多肽或多肽复合体
vi.从翻译自分析物抗原性分子ORF(一或多个)的多肽衍生的肽
vii.从改变组分A蛋白质组衍生的肽
viii.从改变组分A蛋白质组衍生的多肽
ix.从改变组分A代谢物组衍生的代谢物
eTPCS描述
如上文提到，本发明涉及提供两部分细胞装置，其中每个部分是工程化细胞系统。第一工程化细胞系统是如上文所述的eAPCS。第二工程化细胞系统是用来制备分析物eTPC以组合入装置内的两部分eACP:eTPC系统中的工程化多组分eTPCS。
最低形式eTPCS是这样的多组分系统，其中第一组分是eTPC，命名为组分2A，并且第二组分是遗传供体载体，命名为组分2C(图18)。
eTPC代表与eTPCS系统全部其他组分相关的eTPCS基础组分。因此，eTPC含有某些天然或工程化的特征，这些特征使eTPC同时适用于eTPCS和组合的两部分装置。
eTPC，即，组分2A，
i.缺少TCR链α、β、δ和γ的内源表达，并且
ii.表达CD3蛋白，其中所述CD3蛋白仅当细胞表达互补TCR链对时才在细胞表面上条件呈递；并
iii.含有命名为2B的又一组分，即，用于整合编码至少一个分析物TCRα、β、δ或γ链的单一ORF和/或编码分析物TCR链对的两个ORF的基因组接受位点，
其中i可以通过选择缺少所述表达的天然细胞群体获得，或可以经工程化以缺少该表达，并且ii可以通过选择包含所述表达的天然存在细胞群体获得，或可以经工程化以包含该表达；iii可以是基因组的或借助基因工程引入到基因组上。
可以通过本领域熟知的方法，从天然存在的细胞群体选择缺少TCR链α、β、δ和γ的候选eTPC细胞。用针对TCR链α、β、δ和γ特异的亲和试剂着染靶细胞，并且选择缺少TCR链α、β、δ和γ的细胞，可以直接实现这点。
可以通过非定向和定向手段，将eTPC工程化以缺少TCR链α、β、δ和γ表达。可以通过向细胞提供化学、放射学或其他诱变剂并且随后选择缺少靶aAPX和/或aAM表达的细胞，实现细胞非定向诱变。可以通过不同手段实现基因组座位的定向突变，所述手段包括但不限于借助以下方式的位点定向诱变
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的打靶
iii.合成的转录激活物样效应核酸酶(TALEN)
其中所述位点定向核酸酶在靶基因座处诱导位点特异性DNA-修复错误诱变，此后通过选择缺少TCRα、β、δ和γ表达的细胞获得突变的细胞。
用于整合CD3和组分B和/或D的可选方式是本领域技术人员熟知的，可以包括同源定向重组(HDR)法和/或随机整合法，其中HDR可以通过在待发生HDR的基因组座位处的定向突变来促进，并且可以通过不同手段实现，所述手段包括但不限于借助以下方式的位点定向诱变
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的打靶
iii.合成的转录激活物样效应核酸酶(TALEN)
其中所述位点定向核酸酶通过HDR在靶基因座位处诱导位点特异性DNA-修复。在此事件后，一定比例的细胞将已经掺入HDR载体，可以通过任何以下组合来选择和/或确定，
iv.非破坏性表型表达分析
v.破坏性的表型表达分析
vi.遗传分析：
其中iv和vi是选择和确定成功基因组整合事件的优选方法。
备选地，病毒载体可以用来按位点定向或非定向方式递送所需组分。
考虑到eTPC组分2A设计成与上述eAPC组分1A在eAPC:eTPC组合系统中联合使用，出于分析TCR和T细胞抗原相互作用的目的(图1)，在优选的方面中，eTPC含有如下特征，所述特征最大限度地减少将在这类分析中起干扰作用的eTPC呈递因子。
eTPC组分2A任选地缺少aAPX和/或aAM的至少一个家族的内源性表面表达，其中选择表面表达的缺少，从而在靶分析物抗原的匹配分析中最大限度减少干扰。
aAPX家族可以为以下任一者
i.HLA I类
ii.HLA II类
iii.非HLA抗原呈递复合体。
aAM选自
i.从分析物抗原性分子ORF(一或多个)翻译的多肽或多肽复合体
ii.从翻译自分析物抗原性分子ORF(一或多个)的多肽衍生的肽
iii.从改变组分A蛋白质组衍生的肽
iv.从改变组分A蛋白质组衍生的多肽
v.从改变组分A代谢物组衍生的代谢物
组分2A eTPC可以任选地额外包含T细胞辅助受体，其中该特征允许稳健形式或可变形式的分析物eTPC与分析物eAPC通讯，其中该可调谐通讯与鉴定或表征特定分析物TCRsp和/或分析物抗原相关。
eTPC组分2A可以任选地表达CD4和/或CD8，其中CD4或CD8的表达将eTPC分别限于接合HLAII型和HLAI型的aAPX。
在本发明语境下，eTPC组分2A可以任选地表达CD28和/或CD45，其中CD28和CD45通过正前馈影响信号传导来促进信号灵敏度，但它们也可以通过负反馈影响信号传导来有助于信号特异性，因为它可以通过表达的分析物TCRsp的信号传导相关。
组分2A eTPC可以任选地额外包含引入的细胞表面黏附分子组分、或消除内源细胞表面黏附分子，以促进eTPC与分析物eAPC接合和免疫突触形成，或以避免在eAPC:eTPC组合系统内的紧密结合和有害细胞团簇的形成。
这类可以作为组分2A的额外ORF引入或从2A遗传消除的黏附分子可以选自整联蛋白家族的黏附蛋白。
最低多组分eTPCS的第二组分是遗传供体载体，组分2C，其用于整合至少一个编码至少一个分析物TCR链的ORF(图18)。
组分2C是遗传供体载体，其与包含于eTPC(组分2A)的基因组内的2B基因组接受位点配对。组分2C设计用于将在遗传供体载体中编码的一个或多个编码分析物TCR链的ORF整合入基因组接受位点2B，其中整合导致靶eTPC表达分析物TCR链。
配对的遗传供体载体和基因组接受位点被描述为整合对偶。
eTPC设计成对相关抗原的刺激产生响应，所述相关抗原由eAPC:eTCP组合系统内的eAPC呈递。因此，对于通过刺激表达的TCRsp所致的信号传导响应，期望具有标准化的报道分子读出。
在本发明语境下，eTPC组分2A还含有命名为2F的组分，即，合成的基因组TCR刺激反应元件，其选自
i.含有至少一个天然启动子和/或至少一个人造启动子和至少一个报道分子的单组分人造构建体
ii.设计成具有至少一个天然启动子和/或至少一个人造启动子和至少一个报道分子的多组分合成构建体，
其中激活i和/或ii依赖于至少一个选自合成途径、天然途径或其组合的信号转导途径。
eTPC可以设计成分析呈递的TCRsp与分析物抗原的接合。可以通过引入响应于TCRsp接合的合成报道分子元件，实现接合的读取。因此，eTPC可以还含有命名为2F的组分，即合成的基因组TCR刺激反应元件，其选自
i.含有至少一个天然启动子和/或至少一个人造启动子和至少一个报道分子的单组分人造构建体
ii.设计成具有至少一个天然启动子和/或至少一个人造启动子和至少一个报道分子的多组分合成构建体，
其中激活i和/或ii依赖于至少一个选自合成途径、天然途径或其组合的信号转导途径。
人造的TCR-刺激反应元件(组分2F)，具有人造的而非天然的启动子，将不太可能模拟天然TCR刺激反应，并且因此是对天然T细胞刺激的较远类似。但是，人造启动子可以提供更大的灵活性来调谐和调节报道分子响应，以稳健地鉴定生产性接合分析物抗原的eTPC-t呈递性TCRsp。
单组分人造构建体为放大或调节信号报道分子响应提供有限的空间，但是在执行和预测结果方面更为直接。多组分构建体具有构建复杂应答网络的空间几乎不受限制的优点，然而，随之而来的代价是执行和预测的难度更大。网络也提供启动反馈回路、阻遏和激活第二响应报道分子的例子。
人造启动子可以与非天然的人造信号传导组分连接，所述信号传导组分可以在初始天然TCR信号传导途径下游或置换它。在这种情况下，CD3复合体可以与非天然的人造信号传导途径和应答网络部分地或完全地偶联。这类人工通路为更充分地精细调节或增加各种响应，提供了高度模块化和适应性的优点。
优选的实施方案利用具有人造启动子和至少具有部分人造的信号传导途径的多组分合成构建体。这提供了最稳健的手段，以确保静息状态信号响应有限，而在分析物抗原与TCRsp的连接出现时具有高度偶联的报道分子信号。
无论TCRsp刺激过程与组分2F偶联的确切架构是什么，所需的最终结果是可检测的报道分子。在优选的实施方案中，适用于荧光检测(即FACS)和/或物理选择方法(如磁激活细胞分选(MACS))的报道分子，是期望的。备选地，报道分子可以是通过分光光度、荧光或发光测定法、优选地性质上非破坏的测定法检测的分泌的分子或胞内分子，其中随后可以基于报道分子的存在或不存在选择群体。此外，响应不限于单一报道分子类型，而可以是一个或多个不同报道分子的组合。
在一个情况下，具有人造启动子和部分人造的信号传导途径的多组分合成构建体(驱动物-激活物/阻遏物+放大物-报道分子)将包含：
驱动物-激活物/阻遏物：
a)人造启动子
b)Kozak序列
c)转录因子，
d)第一终止子；
放大物-报道分子
e)第二人造启动子
f)Kozak序列
g)报道分子
h)第二终止子；
其中；a)代表设计成与初始天然信号传导途径偶联的人造启动子(驱动物)，所述初始天然信号传导途径由TCRsp与分析物抗原的连接所引起。最低驱动物包含一个或多个转录因子结合位点和核心启动子，其中核心启动子最少包含TATA框、起始子件(Inr)和转录起始位点；b)代表用于转录因子高效翻译起始的Kozak序列；c)代表编码人造的或天然转录因子(激活物，或阻遏物)的ORF，其可以与第二人造启动子的DNA序列结合；d)代表用于转录因子mRNA转录物的高效转录和多聚腺苷化的转录终止子，和任选的一个或多个非翻译3’遗传元件。这些遗传元件可以包括但不限于转录物稳定化或去稳定化元件和独特标识符序列；e)代表第二人造启动子(放大物)，其编码用于c)转录因子和核心启动子结合的一个或多个识别位点，其中核心启动子最少包含TATA框、Inr和转录起始位点；f)代表用于报道分子高效翻译起始的Kozak序列；g)代表编码报道分子蛋白的ORF；h)代表用于报道分子mRNA转录物的高效转录和多聚腺苷化的转录终止子，和任选的一个或多个非翻译3’遗传元件。这些遗传元件可以包括但不限于转录物稳定化或去稳定化元件和独特标识符序列。
重要的是认识到，可以扩展与放大物-报道分子样式偶联的驱动物-激活物/阻遏物，以纳入其他的驱动物-激活物/阻遏物和放大物-报道分子对和/或其他的放大物-报道分子单元。另外，激活物可以用阻遏物替换，以关闭放大物-报道分子单元和/或驱动物-激活物/阻遏物单元，用于负向选择方法和/或负反馈回路。
在第二个情况下，具有人造启动子的单组分人造构建体(驱动-报道分子)将包含：
a)人造启动子
b)Kozak序列
c)报道分子
d)终止子
其中；a)代表设计成与初始天然信号传导途径偶联的人造启动子(驱动物)，其中所述初始天然信号传导途径由TCRsp与分析物抗原连接所产生。最低驱动物包含一个或多个转录因子结合位点和核心启动子，其中核心启动子最少包含TATA框、Inr和转录起始位点；b)代表用于报道分子高效翻译起始的Kozak序列；c)代表编码报道分子蛋白的ORF；d)代表用于报道分子mRNA转录物的高效转录和多聚腺苷化的转录终止子，和任选的一个或多个非翻译3’遗传元件。这些遗传元件可以包括但不限于转录物稳定化或去稳定化元件和独特标识符序列。
在扩展形式或多组分eTPCS中，组分2A eTPC可以还含有第二基因组接受位点，命名为组分2D，其与也添加至该系统的命名为组分2E的第二基因组供体载体配对(图19)。
eTPCS组分2A可以进一步包含一个或多个额外的整合对偶。
包含eTPC和一个或两个整合对偶的eTPCS用于制备eTPC-t，后者用于装配eAPC:eTPC组合系统。
eTPC-t可以通过整合两个互补TCR链以形成TCRsp来制备，或备选地可以通过两个步骤依次提供每条互补链来制备(图20)。
遗传供体载体和基因组接受位点作为eTPCS的整合对偶子系统运作。遗传供体载体必须首先与靶ORF组合，从而基础供体载体现在编码那些靶ORF。随后将装配的该引发供体载体引入到靶eTPC中，以将靶ORF交换到基因组接受位点上，由此使靶ORF整合到靶细胞的配对接受位点上(图21)。
包含遗传供体载体组分2C和/或2E的eTPCS与至少一个编码至少一个分析物TCR链的ORF组合，以获得组分2C’和/或2E’，其中组合定义为将遗传物质连接入遗传供体载体的正确编码框架并且处于正确取向。
一个或多个ORF在遗传供体载体2C和/或2E中的组合可以用独特ORF的文库以如下方式多次进行：
i.分开的多个单反应，以获得编码多个ORF的2C’和/或2E’载体的分立文库
ii.单一反应，以获得编码多个ORF的2C’和/或2E’载体的汇总文库
其中分立文库可以与组分2A多次组合，从而获得具有编码独特TCR链的独特ORF的eTPC的分立文库；或汇总文库可以与组分2A组合一次或多次，从而获得eTPC-t的汇总文库，其中每个eTPC-t整合了来自载体原始汇集物的编码分析物TCR链的随机化ORF，从而每个eTPC-t表达单一随机的独特TCRsp。
对于运行标准化eTPC而言，可预测拷贝数的一个或多个ORF在基因组接受位点的高效整合是高度有利的，由此可以快速地制备并表征分析物eTPC群体。因此，基因组接受位点和配对的供体载体，对eTPC的功能至关重要。另外，迫切期望具有这样的eTPC，其中组分2B和2D彼此隔绝，从而供体载体组分2C不能在组分2B处整合，并且反之亦然。此外，也期望组分2B和/或组分2D适用于eTPC-t制备方法，其中单个互补TCR链对的引入快速且可重复，同时正确整合和递送仅一对的概率高。
基因组接受位点可以选自以下
i.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体
ii.设计用于位点定向同源重组的合成构建体
其中i)是优选形式，用于RCME的基因组接受位点。RMCE方法可以利用选择的异特异性位点，其中所述异特异性位点对不同重组酶特异，从而每种组分2B和2D均拥有隔绝的特异性。
基因组接受位点，组分2B和/或组分2D，包含以下至少一个遗传元件
i.异特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件性调节元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接接纳位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.可移动遗传元件
xii.大范围核酸酶识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)病毒自我剪切性肽元件
xiv.kozak共有序列。
优选的基因组接受位点可以包含使用选自前述元件列表的以下元件的两种不同排布。
借助RMCE整合，第一种排布用于接受编码一个或多个TCR链的单一ORF和/或整合选择标记，其中该排布是
5’-[A][B][C][D][E][F]-3’
其中
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记
E)是元件i)异特异性重组酶位点2
F)是元件v)真核终止子
借助RMCE整合，第二种排布用于接受编码一个或多个TCR链的两个ORF和/或整合选择标记，其中该排布是
5’-[A][B][C][D][E][F][G][H][I]-3’
其中
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记1
E)是元件v)真核双向转录终止子
F)是元件vi)FACS和/或MACS相容性编码的蛋白质标记2
G)是元件xv)Kozak共有序列
H)是元件i)异特异性重组酶位点2
I)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
另外，在这个第二种排布中，元件F、G和I按反义方向编码。
组分2C和/或2E包含以下至少一个遗传元件
i.异特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件性调节元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接接纳位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.可移动遗传元件
xii.大范围核酸酶识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)
xiv.病毒自我剪切性肽元件
xv.kozak共有序列
xvi.整合选择标记
xvii.抗生素耐药性盒
xviii.细菌复制起点
xix.酵母复制起点
xx.克隆位点
优选的遗传供体载体，组件C和/或组分E，可以包含使用选自前述元件列表的以下元件的两种不同的可能排布。
借助RMCE整合，第一种排布用于接受编码一个或多个TCR链的单一ORF和/或整合选择标记，其中该排布是
5’-[A][B][C][D][E]-3’
其中
A)是元件i)异特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)用于编码一个或多个TCR链的单一ORF的克隆位点和/或元件xvi)整合选择标记，
D)是元件i)异特异性重组酶位点2
E)是元件xvii)抗生素耐药性盒和元件xviii)细菌复制起点，无特定取向
另外，元件viii和/或xiv可以用来将多个TCR链和/或元件xvi连接在一起。
第二种排布是：
5’-[A][B][C][D][E][F]-3’
其中
A)是元件i)异特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)用于引入两个或更多个ORF的克隆位点和/或元件xvi)整合选择标记，所述两个或更多个ORF带有真核终止子，编码一个或多个TCR链
D)是元件xv)kozak共有序列(反义方向)
E)是元件i)异特异性重组酶位点2
F)是元件xvii)抗生素耐药性盒和元件xviii)细菌复制起点，无特定取向
另外，元件viii和/或xiv可以用在每个ORF内将多个TCR链和/或元件xvi连接在一起。
在eTPCS中制备分析物eTPC群体
上述eTPCS系统可以按照多种方式用来制备不同形式的分析物eTPC群体或其文库，它们起到以下作用：在两部分装置运行时，呈递分析物TCRsp至eTPC:eTPC组合系统中的eAPC。
产生的eTPC-t群体需要从某些来源得到分析物TCR链以用于分析候选物抗原。
分析物TCR链编码序列的来源可以源自
i.来自原代T细胞的TCR链ORF序列(一个或多个)的配对克隆
ii.来自原代T细胞的TCR链ORF序列(一个或多个)的非配对克隆
iii.合成的TCR链ORF序列(一个或多个)
其中i优选用于发现因胸腺选择而通常不太可能对自我aAPX和/或aAPX载货有交叉反应性的天然TCRsp；ii可以用来鉴定候选TCR亲和试剂；iii可以用于TCR亲和试剂的亲和力成熟中。
包含单一整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t：提供与互补TCR链对的ORF组合的组分2C’，从而分析物TCR对整合至位点2B，以产生2B’。所产生的细胞系表达所提供的TCR对，并且它在细胞表面作为TCRsp呈递(图21)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t：提供与互补TCR链对的ORF组合的组分2C’，从而分析物TCR对整合至位点2B，以产生2B’。所产生的细胞系表达所提供的TCR对，并且它在细胞表面作为TCRsp呈递。第二整合对偶1D/1E保持未修饰并且可以用于下游整合步骤(图22)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t：提供各自与编码互补TCR链对的一条链的一个ORF组合的组分2C’和2E’，从而两条分析物TCR链整合至位点2B或2D，以产生2B’和2D’。所产生的细胞系表达所提供的TCR对，并且它在细胞表面作为TCRsp呈递。(图23)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-x：提供与单一分析物TCR链的ORF组合的组分2C’，从而分析物TCR链整合至位点2B，以产生2B’。所产生的细胞系表达提供的TCR链，但是缺少互补链并且因此不表达任何表面TCR。第二整合对偶1D/1E保持未修饰并且可以用于下游整合步骤(图24)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式两步从组分2A制备eTPC-t：首先提供与单一分析物TCR链的ORF组合的组分2C’，从而分析物TCR链整合至位点2B，以产生2B’。所产生的细胞系表达提供的TCR链，但是缺少互补链并且因此不表达任何表面TCR(eTPC-x中间体)。第二整合对偶1D/1E保持未修饰。在第二步骤中，提供2E’，其中载体与第二单一分析物TCR链(与先前整合的TCR链互补)的ORF组合，从而第二互补性分析物TCR链整合至位点2D，以产生2D’。所产生的细胞系表达所提供的互补性分析物TCR链对，并且它在细胞表面作为TCRsp呈递。(图25)。
在上述从eTPC制备分析物eTPC-x群体和/或eTPC-t群体的例子中，eTPCS系统可以用来按确定的方式提供已知的分析物TCR链，以制备表达已确定TCRsp的分析物eTPC的分立群体。在运行装置时，这个过程可以重复许多次，以建立eTCP-x和/或eTCP-t的文库，以提供给eAPC:eTPC组合系统。一个替代性方案是，取得分析物eTPC-t的汇总文库，其中每个eTPC-t整合来自原始载体汇集物的单一随机TCR对ORF，并且因此每个eTPC-t表达单一随机的TCRsp，但是总体上，该汇集物编码在原始载体汇集物中代表的多种TCRsp。相同的鸟枪原理可以适用于产生eTPC-x的汇集物。当针对分析物抗原分析候选物TCRsp的大型文库时，这特别有用。
包含一个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t汇集物：提供与编码分析物TCR对的汇集物的多重ORF文库组合的组分2C’，从而在每个细胞内部，一个TCR对整合至位点B，以产生B’，其中每个eTPC-t整合来自原始载体汇集物的单一随机TCR ORF对，并且因此每个eTPC-t表达单一随机的TCRsp，但是总体上，该汇集物编码在原始载体汇集物中代表的多种TCRsp。所产生的汇集物细胞含有总体上表达多种分析物TCRsp的一组细胞(图26)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t汇集物：提供与编码分析物TCR对的汇集物的多重ORF文库组合的组分2C’，从而在每个细胞内部，一个TCR对整合至位点B，以产生B’，其中每个eTPC整合来自原始载体汇集物的单一随机TCR ORF对，并且因此每个eTPC-t表达单一随机的TCRsp，但是总体上，该汇集物编码在原始载体汇集物中代表的多个种类的TCRsp。所产生的汇集物细胞含有总体上表达多种分析物TCRsp的一组细胞。第二整合对偶1D/1E保持未修饰(图27)。
包含两个整合对偶的eTPCS可以用来通过如下方式一步从组分2A制备eTPC-t汇集物：提供与编码单一分析物TCR链的汇集物的多重ORF文库组合的组分2C’，从而每个eTPC将组分2C’中编码的单一随机化TCR链ORF整合至位点2B，以产生2B’。同时，提供与多重ORF文库组合的组分2E’，所述多重ORF编码与2C’中提供的第一文库互补的单一分析物TCR链的汇集物，从而每个eTPC-t将组分2E’中编码的单一随机化互补TCR链ORF整合入位点2D，以产生2D’。eTPC-t汇集物中每个所得的细胞具有单一随机化互补TCR链ORF对，从而汇集物中的每个细胞表达随机化的TCRsp。这种汇总文库将含有从组分2C’和2E’的集合提供的互补TCR链的全部可能组合(图28)。
在本发明语境下，包含两个整合对偶的eTPCS可以用来从先前获得的e-TPC-x一步制备eTPC-t汇集物，其中位点2B已经转变成2B’并且含有单一分析物TCR链。通过以下方式制备eTPC-t：提供与多重ORF文库组合的组分2E’，所述多重ORF编码与已经整合的链互补的单一分析物TCR链的汇集物，从而每个eTPC-t将提供的2E’文库的单一随机化TCR链ORF整合在位点2D中，以产生2D’。eTPC-t汇集物中的每个所得的细胞具有起始eTPC-x提供的分析物TCR链及选择的单一互补性分析物TCR链，从而汇集物中的每个细胞表达随机的ORF对作为TCRsp。当分析在互补TCR链对中相对于固定链变动单一链的影响时，可以使用这种方案(图29)。
可以通过提供编码整合标记或不编码ORF的其他整合载体，即组分2Y或2Z的任一者，从eTPC-t可以制备eTPC-x。组分2Y或2Z组合到eTPC-t，将交换任一个位点以获得表达单一TCR链的eTPC-x。
用于eTPC-t转化成eTPC-x的优选遗传整合载体(组分2Y和组分2Z)将包含与上述组分2C和2E相同的整合载体要件，但不编码任何TCR链ORF，并且优选地编码整合标记。
使分析物eAPC和eTPC接触
本发明涉及提供工程化两部分细胞装置。装置的两个部分eAPCS和eTPCS分别用来装配分析物eAPC和分析物eTPC。这些分析物细胞群体随后装配成eAPC:eTPC组合系统，从中可以获得装置输出。eAPC:eTPC系统包含选择的一个或多个分析物eAPC群体和一个或多个eTPC群体(图1)，所述群体如上述制备(图4至图29)。eAPC:eTPC系统以允许分析物eAPC群体和分析物eTPC群体之间物理接触的形式提供，其中这种触允许复合体在一个或多个分析物抗原和一个或多个分析物eTPC-t的TCRsp之间形成，其中分析物抗原为以下任一者
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM
其中分析物抗原由分析物eAPC呈递，同时分析物TCRsp由分析物eTPC呈递，从而复合体形成可以导致这种复合体稳定化，并且其中可以报告并测量在分析物eAPC和/或分析物eTPC内部诱导的信号传导。
在分析物eAPC和分析物eTPC之间的接触在容许性细胞培养系统中进行，其中所述系统包含允许eAPC细胞和eTPC细胞二者履行功能的细胞培养基。
从eAPC:eTPC组合系统获得的分析物eTPC可以用于表征表达分析物TCRsp的分析物eTPC针对分析物eAPC呈递的分析物抗原的信号响应，其中此信号响应可以是二态的(binary)或渐变的(graduated)，并且可以计量为eTPC所内在的(图30)或eAPC所内在的(图31)。
从eAPC:eTPC组合系统、自输入的分析物eTPC或分析物eTPC文库选择一个或多个分析物eTPC，以获得其中表达的TCRsp与分析物eAPC呈递的一个或多个分析物抗原结合的一个或多个分析物eTPC的方法，包括：
i.将一个或多个分析物eTPC与一个或多个分析物eAPC组合以导致分析物TCRsp与分析物抗原接触，以及以下至少一者
ii.测量一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间复合物的形成(如果存在的话)，和/或
iii.测量由一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的、由分析物eTPC产生的信号响应(如果存在的话)，和/或
iv.测量由一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的、由分析物eAPC产生的信号响应(如果存在的话)，和
v.基于步骤b、c和/或d，选择一个或多个分析物eTPC，其中依据正测量值和/或负测量值作出选择，
其中i、iii和v包括优选的排布。
从eAPC:eTPC组合系统获得的分析物eAPC可以用于表征表达分析物抗原的分析物eAPC针对分析物eTPC呈递的分析物TCRsp的信号响应，其中此信号响应可以是二态或渐变的，并且可以计量为eTPC内在的(图30)或eAPC内在的(图31)。
从eAPC:eTPC组合系统、自输入的分析物eAPC或分析物eAPC文库选择一个或多个分析物eAPC，以获得其中表达的分析物抗原与分析物eTPC呈递的一个或多个分析物TCRsp结合的一个或多个分析物eAPC的方法，包括：
i.将一个或多个分析物eAPC与一个或多个分析物eTPC组合，以导致分析物eAPC呈递的分析物抗原与一个或多个分析物eTPC的分析物TCRsp接触，以及
ii.测量一个或多个分析物抗原与一个或多个分析物TCRsp之间复合物的形成(如果存在的话)和/或，
iii.测量一个或多个eTPC中由分析物TCRsp与分析物抗原之间的复合物形成诱导的信号响应(如果存在的话)，和/或
iv.测量由一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的、由分析物eAPC产生的信号响应(如果存在的话)，和
v.从步骤b、c和/或d选择一个或多个分析物eAPC，其中依据正测量值和/或负测量值作出选择，
其中i、iii和v包括优选的排布。
可以自包含eAPC:eTPC系统的双元培养系统，选择eTPC或eAPC，其中提供制备的单一分析物eAPC群体和制备的单一分析物eTPC群体，并且基于eTPC(图30)和/或eAPC(图31)内部的二态或渐变响应，选择响应的eAPC或eTPC。
eAPC:eTPC系统可以包含输入制备的单一分析物eAPC和制备的eTPC汇总文库(图32)。
eAPC:eTPC系统可以包含输入制备的单一分析物eTPC和制备的eAPC汇总文库(图33)。
在eATP:eTPC组合系统内部，测量一个或多个分析物eTPC或一个或多个eAPC中的信号响应(如果有的话，所述信号响应可以由分析物TCRsp与分析物抗原之间的复合物形成所诱导)，对选择初级装置输出至关重要，其中初级装置输出是以下一项或多项的单细胞或细胞汇集物
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
iv.eTPC-t
其中可以根据接触的分析物eAPC细胞或分析物eTPC细胞的任一者或两者中存在或不存在报告的信号响应，选择细胞。
在本发明语境下，一种基于eTPC内报告的信号响应从eAPC:eTPC组合系统选择分析物eTPC和/或分析物eAPC的方法，其包括
i.确定天然信号传导响应和/或
ii.如果eTPC含有组分2F以及如果eAPC含有等同的合成报道分子元件，则确定人造的信号传导响应。
可以通过检测以下一者或多者的增加或减少，测量诱导的天然或合成信号响应，所述信号响应是eAPC和/或eTPC内在的，
i.分泌的生物分子
ii.分泌的化学物
iii.胞内生物分子
iv.胞内化学物
v.表面表达的生物分子
vi.分析物eTPC对分析物eAPC的细胞毒作用
vii.分析物eTPC对分析物eAPC的旁分泌作用，从而在分析物eAPC中诱导信号响应并且通过检测a至e的任一者的增加或减少来确定该信号响应，
viii.分析物eTPC的增殖
ix.分析物eTPC和分析物eAPC之间的免疫突触，
其中将所述检出的信号响应与分析物eAPC和/或分析物eTPC在装配eAPC:eTPC组合系统之前和/或在平行装配的组合系统中固有的非诱导的信号响应状态比较，其中在所述平行装配的组合系统中，分析物eAPC和/或分析物eTPC可以呈递已知在所用eAPC:eTPC组合系统中不诱导信号响应的对照分析物抗原和/或分析物TCR种类。
从eAPC:eTPC系统获得初级装置输出
本发明涉及提供工程化两部分细胞装置。装置的两个部分eAPCS和eTPCS分别用来装配分析物eAPC和分析物eTPC。这些分析物细胞群体随后装配成eAPC:eTPC组合系统，从中可以获得装置输出。eAPC:eTPC系统包含选择的一个或多个分析物eAPC群体和一个或多个eTPC群体(图1)，所述群体如上述制备(图4至图29)。eAPC:eTPC系统以允许分析物eAPC群体和分析物eTPC群体之间物理接触的形式提供，其中该接触允许复合体在一个或多个分析物抗原和一个或多个分析物eTPC-t的TCRsp之间形成，其中分析物抗原为以下任一者
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM
其中所述分析物抗原由分析物eAPC呈递，同时分析物TCRsp由分析物eTPC呈递，从而复合体形成可以导致这种复合体稳定化并且其中可以报告并测量在分析物eAPC和/或分析物eTPC内部诱导的信号传导。
上文描述了诱导的信号响应报告模式，并且这些报告的响应被要求测量以获得两部分装置的初级输出。
来自装置的初级输出是选择的细胞群体，所述细胞群体已经应答或未应答于eAPC:eTPC系统中提供的对应细胞呈递的分析物。即，这种初级输出可以表现为单细胞或细胞汇集物，其已经依据在eAPC:eTPC组合系统内存在或不存在报告的响应而被选择(图1步骤v)。分析物eAPC内部的应答仅通过与发生接触的eTPC呈递的相关TCR接合而激发。分析物eTPC内部的应答仅通过与发生接触的eAPC呈递的相关抗原接合而激发(图1步骤iv)。
可以基于发生接触的细胞中的应答，从eAPC:eTPC组合系统选择分析物eAPC和/或分析物eTPC。即，可以基于发生接触的分析物eTPC中报告的响应或该响应的缺乏，选择分析物eAPC。反过来，可以基于发生接触的分析物eAPC中报告的响应或该响应的缺乏，选择分析物eTPC。
在本发明语境下，来自装置的初级eAPC输出是选择的细胞，其中基于存在或不存在报告的信号响应作出选择，并且这些细胞可以包含以下一者或多者
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
其中选择的细胞可以包括单细胞、身份相同的细胞的汇集物、身份不同的细胞的汇集物(图1步骤v)。
来自装置的初级eTPC输出是选择的细胞，其中基于存在或不存在报告的信号响应作出选择，并且这些细胞包含eTPC-t；其中选择的细胞可以包括单细胞、身份相同的细胞的汇集物、身份不同的细胞的汇集物(图1步骤v)。
eAPC:eTPC组合系统中分析物eAPC和/或分析物eTPC内报告的信号用来选择分析物细胞群体以提供初级输出。
在其中eAPC:eTPC组合系统属于双元培养物性质的情形下(例如，图30和图31)，可以通过从双元系统选择所需的分析物eAPC群体和/或分析物eTPC群体，实现eAPC型和/或eTPC型初级输出。
可以从其中eAPC:eTPC组合系统的性质属于具有固定的eAPC和汇总的文库分析物eTPC的情形(例如，图32)或从其中eAPC:eTPC组合系统的性质属于具有固定的eTPC和汇总的文库分析物eAPC的情形(例如，图33)，通过从该组合培养物系统选择所需的分析物eAPC群体和/或分析物eTPC群体，实现eAPC型和/或eTPC型初级输出。
存在可以获得初级输出的几种不同模式，其中每种模式需要细胞分选步骤。可以通过荧光激活细胞分选法(FACS)和/或磁激活的细胞分选(MACS)和/或不同的亲和力激活细胞分选方法，实现细胞分选。
可以通过以下方式获得初级输出eAPC细胞和/或eTPC细胞：通过单细胞分选以获得单细胞，和/或将细胞分选到一个池中以获得细胞汇集物。
可以通过以下方式获得初级输出eAPC细胞和/或eTPC细胞：单细胞分选以获得单细胞，随后培育单细胞以获得所选择eAPC细胞或eTPC细胞的单克隆汇集物。
可以通过以下方式获得初级输出eAPC细胞和/或eTPC细胞：将细胞分选到一个池中，以获得细胞汇集物，并且随后培育细胞汇集物，以获得所选择eAPC细胞和/或eTPC细胞的汇集物。
从eAPC:eTPC系统获得终端装置输出
续上述的获得初级输出的方法(其中初级输出是选择的分析物eAPC细胞和/或eTPC细胞，所述细胞基于测量的信号响应来选择)之后，可以通过进一步处理选择的eAPCa和/或eTPC初级输出，获得两部分细胞装置的终端输出。
来自两部分细胞装置的终端输出可以是由分析物eAPC(i至v)或分析物eTPC(vi)呈递的以下所列者的身份
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM和/或
vi.TCRsp
其中所述的分析物eAPC(i至v)或分析物eTPC通过从eAPC:eTPC组合系统选择该分析物，作为两部分装置的初级输出而获得。
在两部分细胞装置之内，分析物eAPC和分析物eTPC呈递的分析物分子往往是遗传编码的。因此，为了鉴定分析物eAPC或eTPC呈递的分析物分子，可以对制备自eAPC或eTPC的分析物分子进行基因测序。
可以处理eAPC，以获得分选和/或扩增的eAPC-p细胞、eAPC-a细胞或eAPC-pa细胞的组分1B’和/或组分1D’的基因序列，从而确定以下者的身份
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM
其中获得的身份代表来自两部分细胞装置的终端输出。
可以处理eAPC，以获得分选和/或扩增的eAPC-p细胞、eAPC-a细胞或eAPC-pa细胞的基因组的基因序列，以确定以下者的身份
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM
iv.CM和/或
v.aAPX:CM
其中获得的身份代表来自两部分细胞装置的终端输出。
可以处理eTPC，获得分选和/或扩增的eTPC-t细胞的组分2B’和/或组分2D’的基因序列以确定TCRsp的身份，其中获得的TCRsp的身份代表来自两部分细胞装置的终端输出。
可以处理eTPC，获得分选和/或扩增的eTPC-t细胞的基因组的基因序列以确定TCRsp的身份，其中获得的TCRsp的身份代表来自两部分细胞装置的终端输出。
可以通过一系列模式并且从一系列遗传物质源，在进行和不进行特异性加工情况下，实现基因测序。
在本发明语境下，可以在测序步骤之前
i.提取基因组DNA和/或
ii.提取组分1B’和/或1D’和/或2B’和/或2D’RNA转录物和/或
iii.通过PCR和/或RT-PCR扩增组分1B’和/或1D’和/或2B’和/或2D’的DNA和/或RNA转录物。
测序步骤，对于作为初级输出从两部分装置获得的eAPC或eTPC或其汇集物，是破坏性的。
在测序步骤对初级输出eAPC或eTPC具有破坏性的情况下，如果期望从两部分装置获得初级输出，则可以用作为两部分装置的终端输出获得的序列信息，通过利用eAPCS或eTPCS，制备与分析物eAPC或分析物eTPC等同的eAPC和eTPC输出。
在遗传编码的分析物分子的上述情况中，可以通过从组分1B’和/或1D’和/或2B’和/或2D’，和/或从细胞基因组，获得序列信息，由此得到两部分装置的终端输出。但是，在一些实施方案中，抗原信息不是遗传编码的。翻译后修饰的抗原、通过非遗传手段向eAPC:eTPC组合系统提供的抗原、从分析物eAPC蛋白质组或代谢物的诱导型状态或修饰型状态出现的抗原、和eAPC:eTPC系统所固有的CM，可能无法通过遗传手段合理鉴定。
在可能通过非遗传手段向eACP:eTPC系统提供aAM的重要情况下，存在两种不同模式，通过所述模式eAPC-p或eAPC-pa可以将提供的aAM作为aAPX:aAM复合体呈递。在第一情况下，aAM以可以直接与aAPX结合并在细胞表面形成aAPX:aAM复合体的形式提供(图34)。这种aAM的例子是HLA复合体的肽抗原。在第二情况下，aAM可以按这样的形式提供，所述形式的aAM可以被分析物eAPC摄取并加工，从而作为载货加载于aAPX中并在细胞表面形成aAPX:aAM复合体(图35)。
在本发明语境下，一种选择并鉴定aAM载货或CM载货的方法，其中载货是代谢物和/或肽，其装载在作为两部分装置的初级输出而选择并获得的eAPC的aAPX中，所述方法包括
i.分离aAPX:aAM或aAPX:CM或载货aM或载货CM和
ii.鉴定加载的载货
其中鉴定的加载的载货代表两部分装置的终端输出。
通常存在两种模式可以用于从选择的eAPC鉴定载货分子。第一，从aAPX:aAM或aAPX:CM强迫释放载货，导致分离出可用于后续鉴定的aAM或CM(图36)。这种情况的例子是，酸洗eAPC以从HLA复合体释放肽aAM。第二，捕获aAPX:aAM或aAPX:CM(例如，通过释放复合体和免疫亲和分离方法)，导致分离出aAPX:aAM复合体或aAPX:CM复合体，从而可以鉴定aAM或CM(图37)。
用于直接或从分离的aAPX:aAM或aAPX:CM复合体鉴定分离的aAM和/或CM的方法，可以包括
i.质谱分析
ii.肽测序分析
其中所含aAM和/或CM的身份是来自两部分细胞装置的终端输出。
附图简述
在以下非限制性附图中举例说明本发明。
图1-包含eAPC系统和eTPC系统的两部分装置的运行
两部分工程化细胞装置包含两个多组分细胞系统，eAPCS和eTPCS，它们作为eAPC:eTPC组合系统接触。总体装置的运行包括两个阶段，制备阶段和分析阶段。在第1阶段的一个方面，使用eAPCS系统制备在细胞表面表达分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的细胞(步骤i)。呈递单独aAPX的eAPC称作eAPC-p。呈递单独aAM的eAPC称作eAPC-a。呈递作为载货呈递于aAPX中的aAM的eAPC称作eAPC-pa。这些分析物统称为分析物抗原。在第1阶段的另一方面，使用eTPCS系统制备在细胞表面表达分析物TCR链对(TCRsp)的细胞(步骤ii)。在细胞表面呈递TCRsp的eTPC称作eTPC-t。总体系统的第2阶段是，使在第1阶段制备的携带分析物的细胞接触，以形成eAPC:eTPC组合系统(步骤iii)。接触的分析物eAPC向分析物eTPC呈递分析物抗原。在eAPC:eTPC组合系统内，通过读出接触依赖性分析物eAPC和/或eTPC应答(通过*和加阴影框指示，以代表这些报告分析物细胞的改变的信号状态)，测定分析物TCR链对针对所提供的分析物抗原的应答性(步骤iv)。作为eAPC:eTPC系统的结果，特定的eAPC和/或eTPC-t可以基于其应答和/或其在接触的对应分析物细胞中推动应答的能力而被选择。因此，装置运行的初级输出是选择的eAPC-p、eAPC-a、eAPC-pa和/或eTPC-t类的单细胞或细胞群体(步骤v)。通过从步骤v获得分析物细胞，可以从这些细胞鉴定呈递的分析物aAPX、aAM、aAPX:aAM、CM、aAPX:CM和/或TCRsp，作为装置运行的终端输出(步骤vi)。
图2-单一整合对偶eAPCS的组分说明。
eAPCS的一个例子包含三个组分。第一组分1A是eAPC系本身，具有该细胞全部所需的工程化特征。eAPC 1A含有一个其他组分1B，其是用于整合aAPX和/或aAM的基因组整合位点。再一个组分1C是遗传供体载体，用于将ORF定向整合入位点1B，其中箭头指示配对的特异性。可以规定配对的整合位点/供体载体对偶的格式来整合单一ORF或成对ORF，以诱导aAPX和/或aAM表达。
图3-双整合对偶eAPCS的组分说明。
eAPCS的一个例子包含五个组分。第一组分1A是eAPC系本身，具有该细胞全部所需的工程化特征。eAPC 1A含有两个其他组分，1B和1D，其是用于整合aAPX和/或aAM的基因组整合位点。另外两个组分，1C和1E，分别是用于将ORF定向整合入位点1B和1D的遗传供体载体，其中箭头指示配对的特异性。可以规定每个配对的整合位点/供体载体对偶的格式以整合单一ORF或成对ORF，以诱导aAPX和/或aAM表达。
图4-编纂呈递不同分析物抗原的eAPC
该eAPCS系统始于eAPC，使用供体载体产生在细胞表面表达分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的细胞。呈递单独aAPX的eAPC称作eAPC-p，并且可以通过向eAPC引入编码aAPX的ORF来产生(步骤i)。表达单独aAM的eAPC称作eAPC-a，其中aAM可以在细胞表面表达并可用于TCR接合、或需要加工并作为载货作为aAPX:aAM复合体装载入aAPX。eAPC 1A可以通过向eAPC引入编码aAM的ORF来产生(步骤ii)。将aAM作为载货呈递于aAPX中的eAPC称作eAPC-pa。可以通过以下方式之一产生eAPC-pa：向eAPC同时引入编码aAM和编码aAPX的ORF(步骤iii)；向eAPC-p引入编码aAM的ORF(步骤iv)；向eAPC-a引入编码aAPX的ORF(步骤v)。
图5-遗传供体载体和基因组接受位点整合对偶的运行
遗传供体载体和基因组接受位点形成整合对偶，其中在遗传供体载体中编码的一个或多个ORF可以特异性整合至与其配对的基因组接受位点。整合对偶运行中的步骤1是向供体载体引入一个或多个靶ORF。初始供体载体称作X，并且通过引入靶ORF(一个或多个)，修饰成引发的供体载体X’。步骤2需要引发的供体载体X’与携带基因组接受位点Y的细胞组合。向接受位点引入由引发供体载体编码的ORF，导致产生携带整合位点Y’的细胞。
图6-用一个整合对偶一步编纂eAPC-p的例子
eAPC 1A含有基因组接受位点1B。引发的遗传供体载体1C’与1B配对并编码aAPX。1A eAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞中，1C’的ORF交换至1B基因组接受位点，产生位点1B’并引入aAPX表达。这导致aAPX在细胞表面上表达及产生eAPC-p。
图7-用一个整合对偶和一个未使用的整合位点一步编纂eAPC-p的例子
eAPC 1A含有基因组接受位点1B和1D。引发的遗传供体载体1C’与1B配对并编码aAPX。1A eAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞中1C’的ORF交换至1B基因组接受位点，产生位点1B’并引入aAPX表达。这导致aAPX在细胞表面上表达及产生eAPC-p。基因组接受位点1D保持未使用。
图8-用一个整合对偶一步编纂eAPC-a的例子
eAPC 1A含有基因组接受位点1B。引发的遗传供体载体1C’与1B配对并编码aAM。1AeAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞中1C’的ORF交换至1B基因组接受位点，产生位点1B’并引入aAM表达。这产生在细胞表面或胞内表达aAM的两种形式eAPC-a之一。
图9-用一个整合对偶和一个未使用的整合位点一步编纂eAPC-a的例子
eAPC 1A含有基因组接受位点1B和1D。引发的遗传供体载体1C’与1B配对并编码aAM。1A eAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞中1C’的ORF交换至1B基因组接受位点，产生位点1B’并引入aAM表达。这产生在细胞表面或胞内表达aAM的两种形式eAPC-a之一。基因组接受位点1D保持未使用。
图10-用一个整合对偶一步编纂eAPC-pa的例子
eAPC 1A含有基因组接受位点1B。遗传供体载体1C’与1B配对。供体载体1C’编码aAPX以及aAM。
1A eAPC与供体载体1C’组合。所产生的细胞使得ORF 1C’交换至1B基因组接受位点以产生位点1B’并递送aAPX和aAM的ORF。这导致aAPX在细胞表面上表达、aAM在胞内表达，并由此aAM作为载货装载于aAPX中在细胞表面形成aAPX:aAM复合体。
图11-用一个整合对偶和一个未使用的整合位点一步编纂eAPC-pa的例子
eAPC 1A含有不同的基因组接受位点1B和1D。遗传供体载体1C’与1B配对。供体载体1C’编码aAPX以及aAM。1A eAPC与供体载体1C’组合。所产生的细胞使得ORF 1C’交换至1B基因组接受位点以产生位点1B’并递送aAPX和aAM的ORF。基因组接受位点1D保持未使用。这导致aAPX在细胞表面上表达、aAM在胞内表达，并因此aAM作为载货装载于aAPX中在细胞表面形成aAPX:aAM复合体。这产生eAPC-pa细胞系。基因组接受位点1D保持未使用。
图12-用两个整合对偶一步编纂eAPC-pa的例子
eAPC 1A含有不同的基因组接受位点1B和1D。不同的遗传供体载体1C’和1E’分别独立地与1B和1D配对。供体载体1C’编码aAPX并且供体载体1E’编码aAM。1A eAPC与供体载体1C’和1E’同时组合。所产生的细胞使得ORF 1C’交换至1B基因组接受位点以产生位点1B’并递送aAPX的ORF。同时，使1E’的ORF交换至1D基因组接受位点以产生位点1D’并递送aAM的ORF。这导致aAPX在细胞表面上表达、aAM在胞内表达及因此aAM作为载货装载于aAPX中在细胞表面形成aAPX:aAM复合体。这产生eAPC-pa细胞系。
图13-借助eAPC-p用两个整合对偶按两个步骤编纂eAPC-pa的例子
eAPC 1A含有不同的基因组接受位点1B和1D。不同的遗传供体载体1C’和1E’分别独立地与1B和1D配对。供体载体1C’编码aAPX并且供体载体1E’编码aAM。在步骤1中，1AeAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞使得插入物1C’交换至1B基因组接受位点，以产生位点1B’并递送aAPX的ORF。这导致aAPX在细胞表面上表达及产生eAPC-p。基因组接受位点1D保持未使用。在步骤2中，步骤1中产生的eAPC-p与1E’供体载体组合。所产生的细胞使得插入物1E’交换至1D基因组接受位点，以产生位点1D’并递送aAM的ORF。这导致aAM表达在细胞表面上作为已表达aAPX的载货以及产生eAPC-pa。
图14-借助eAPC-a按两个步骤用两个整合对偶编纂eAPC-pa的例子
eAPC 1A含有不同的基因组接受位点1B和1D。不同的遗传供体载体1C’和1E’分别独立地与1B和1D配对。供体载体1C’编码aAM并且供体载体1E’编码aAPX。在步骤1中，1AeAPC与1C’供体载体组合。所产生的细胞使得插入物1C’交换至1B基因组接受位点，以产生位点1B’并递送aAM的ORF。这导致aAM在细胞表面上表达及产生eAPC-a。基因组接受位点1D保持未使用。在步骤2中，步骤1中产生的eAPC-a与1E’供体载体组合。所产生的细胞使得插入物1E’交换至1D基因组接受位点，以产生位点1D’并递送aAPX的ORF。这导致aAPX在细胞表面上表达并以aAM作为载货、以及产生eAPC-pa。
图15-鸟枪法自eAPC-p编纂eAPC-pa汇集物
eAPC-p含有表达aAPX的交换的基因组接受位点1B’和不同的基因组接受位点1D。遗传供体载体1E’i-iii的汇集物与1D配对。供体载体1E’i-iii各自编码单一aAM基因。eAPC-p与供体载体1E’i、1E’ii、1E’iii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物1E’i-iii之任一在多个独立情形下交换至1D基因组接受位点，以产生位点1D’i-iii，各自递送aAM基因的单一ORF。所得到的eAPC-pa细胞汇集物包含三个不同细胞群组的混合群体，所述群组各自表达1B’的不同组合，以aAPX:aAM形式呈递初始载体文库中所含的aAM基因任一者。
图16-鸟枪法自eAPC-a编纂eAPC-pa汇集物
eAPC-a含有表达aAM的交换的基因组接受位点1B’和不同的基因组接受位点1D。遗传供体载体1E’i-iii的汇集物与1D配对。供体载体1E’i-iii各自编码单一aAPX基因。eAPC-a与供体载体1E’i、1E’ii、1E’iii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物1E’i-iii之任一在多个独立情形下交换至1D基因组接受位点，以产生位点1D’i-iii，各自递送aAM基因的单一ORF。所得到的eAPC-pa细胞汇集物包含三个不同细胞群组的混合群体，所述群组各自表达1B’中编码的aAM与初始载体文库中所含任一aAPX基因的不同组合。
图17-鸟枪法自eAPC编纂含有组合配对的aAM基因和aAPX基因的汇总eAPC-pa文库
eAPC 1A含有不同的基因组接受位点1B和1D。不同的遗传供体载体1C’和1E’分别与1B和1D配对。供体载体1C’i和1C’ii各自编码单一aAM基因，并且供体载体1E’i和1E’ii各自编码单一aAPX基因。eAPC 1A与供体载体1C’i、1C’ii、1E’i和1E’ii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物1C’i或1C’ii在多个独立情形下交换至1B基因组接受位点，以产生位点1B’i和1B’ii，各自递送aAM的单一ORF。所得到的细胞汇集物进一步具有插入物1E i或1Eii在多个独立情形下交换至1D基因组接受位点，以产生位点1D’i和1D’ii，各自递送APX基因的单一ORF。所得到的eAPC-pa细胞汇集物包含四个不同细胞群组的混合群体，所述群组各自在表面表达随机化的不同aAPX:aAM对，所述对包含初始载体文库中所含的基因之一。
图18-单一整合对偶eTPCS的组分说明
eTPCS的一个例子包含四个组分。第一组分2A是eTPC系本身，具有该细胞全部所需的工程化特征。eTPC 2A含有第二组分2B，其是用于整合一对互补性分析物TCR链ORF的基因组整合位点。第三组分包括在eTPC 2A中，是在TCR连接时可以被诱导的合成报道分子构建体2F。再一个独立组分，2C，是用于将ORF定向整合入位点2B的遗传供体载体位点，其中箭头指示配对的特异性。
图19-双整合对偶eTPCS的组分说明
eTPCS的一个例子包含六个组分。第一组分2A是eTPC系本身，具有该细胞全部所需的工程化特征。eTPC 2A含有另外三个组分，其中两者是2B和2D，它们是用于整合分析物TCR链对的基因组整合位点。eTPC 2A中所含的第三组分是当TCR连接时受诱导的合成报道分子构建体2F。两个另外的独立组分，2C和2E，分别是用于将ORF定向整合入位点2B和2D的遗传供体载体，其中箭头表示配对的特异性。可以规定每个配对的整合位点/供体载体对偶的格式以整合单一ORF或成对ORF，以通过不同手段诱导分析物TCR链对表达。
图20-编纂呈递不同分析物TCRsp的eTPC
该eTPCS始于eTPC，使用供体载体(一个或多个)产生在细胞表面表达分析物TCRsp或单一分析物TCR链的细胞。呈递TCRsp的eTPC称作eTPC-t，并且可以通过向eTPC引入两个编码互补TCR链的ORF来产生(步骤i)。单独表达单一分析物TCR链的eTPC称作eTPC-x，并且可以通过向eTPC引入编码单一TCR链的ORF来产生(步骤ii)。eTPC-t可以备选地从eTPCx产生，其中向已有的eTPC-x引入编码第二互补TCR链的ORF(步骤iii)。
图21-用一个步骤和一个载体样式编纂eTPC系统
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点。遗传供体载体2C与2D配对。供体载体2C编码TCR链对。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC2A与供体载体2C组合。所产生的细胞具有插入物2C交换至2B基因组接受位点，以产生位点2C’并递送编码TCR链对的两个ORF。这种细胞能够在表面呈递TCRsp，并且因此命名为eTPC-t。
图22-用一个载体和未使用的接受位点一步编纂eTPC-t
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。遗传供体载体2C’与2D配对。供体载体2C’编码TCR链对。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC 2A与供体载体2C’组合。所产生的细胞具有插入物2C’交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’并递送编码TCR链对的两个ORF。基因组接受位点2D保持未使用。这种细胞能够在表面呈递TCRsp，并且因此命名为eTPC-t。
图23-用两个载体和两个整合对偶一步编纂eTPC-t
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。不同的遗传供体载体2C’和2E’分别独立地与2B和2D配对。供体载体2C’编码单一TCR链，并且供体载体2E’编码第二对应TCR链。eTPC 2A与供体载体2C’和2E’组合。所产生的细胞具有插入物2C’交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’并递送第一TCR链的ORF。此外，所产生的细胞具有插入物2E’交换至2D基因组接受位点，以产生位点2D’并递送第二TCR链的ORF。这种细胞能够在表面呈递TCRsp，并且因此命名为eTPC-t。
图24-用一个载体和未使用的接受位点一步编纂eTPC-x
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。遗传供体载体2C’与2D配对。供体载体2C’编码单一TCR链。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC 2A与供体载体2C’组合。所产生的细胞具有插入物2C’交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’并递送单一TCR链ORF。基因组接受位点2D保持未使用。这种细胞仅表达单一TCR链并且因此命名为eTPC-x。
图25-按两个步骤用两个载体编纂eTPC-t
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。不同的遗传供体载体2C’和2E’分别独立地与2B和2D配对。供体载体2C’编码单一TCR链，并且供体载体2E’编码第二对应TCR链。在步骤1中，eTPC 2A与供体载体2C’组合。所产生的细胞具有插入物2C’交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’并递送第一TCR链的ORF。这种细胞仅表达单一TCR链并且因此命名为eTPC-x。基因组接受位点2D保持未使用。在步骤2中，eTPC-x与供体载体2E’组合。所产生的细胞具有插入物2E’交换至2D基因组接受位点，以产生位点2D’并递送第二互补TCR链的ORF。这种细胞能够在表面呈递TCRsp，并且因此命名为eTPC-t。
图26–使用在单一复制载体中配对的分析物TCR链，鸟枪法自eTPC编纂eTPC-t汇集物，以表达来自选择的TCR链对文库的不同TCR链对
eTPC 2A含有基因组接受位点2B。遗传供体载体2C’与2B配对。供体载体2C’i、2C’ii和2C’iii编码不同的TCR链对并构成不同TCR链对的混合载体文库。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC 2A与供体载体2C’i、2C’ii和2C’iii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物2C在多个独立情形下交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’i、2B’ii和2B’iii，各自递送初始载体文库中所含的一个分立TCR链对的两个ORF。这种eTPC-t细胞汇集物包含三个不同细胞克隆的混合群体，所述克隆各自表达不同的TCR链对，称作TCRsp i、ii和iii，形成eTPC-t汇总文库。
图27-使用在单一复制载体中的配对分析物TCR链和未使用的接受位点，鸟枪法自eTPC编纂eTPC-t汇集物，以表达来自选择的TCR链对文库的不同TCR链对
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。遗传供体载体2C’与2B配对。供体载体2C’i、2C’ii和2C’iii编码不同的TCR链对并构成不同TCR链对的混合载体文库。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC 2A与供体载体2C’i、2C’ii和2C’iii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物2C在多个独立情形下交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’i、2B’ii和2B’iii，各自递送初始载体文库中所含的一个分立TCR链对的两个ORF。这种eTPC-t细胞汇集物包含三个不同细胞克隆的混合群体，所述克隆各自表达不同的TCR链对，称作TCRsp i、ii和iii，形成eTPC-t汇总文库。基因组接受位点2D保持未使用。
图28-用两个载体，鸟枪法自eTPC编纂eTPC-t汇集物，以表达来自选择的单个TCR链文库的随机组合的配对TCR链对
eTPC 2A含有不同的基因组接受位点2B和2D。不同的遗传供体载体2C’和2E’分别独立地与2B和2D配对。供体载体2C’i和2C’ii各自编码单一TCR链，并且供体载体2E’i和2E’ii各自编码单一的对应TCR链。eTPC 2A还含有TCR信号响应元件2F。eTPC 2A与供体载体2C’i、2C’ii、2E’i和2E’ii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物2C’i或2C’ii在多个独立情形下交换至2B基因组接受位点，以产生位点2B’i和2B’ii，各自递送单一ORF编码TCR链。所得到的细胞汇集物进一步具有插入物2E i或2E ii在多个独立情形下交换至2D基因组接受位点，以产生位点2E’i和2E’ii，各自递送单一ORF编码与位点2C’i和2C’ii处的TCR链对应的TCR链。所得到的eTPC-t细胞汇集物包含四个不同细胞群组的混合群体，所述群组各自在表面表达不同的随机化TCRsp，所述TCRsp包含初始载体文库中所含的对应TCR链之一。
图29-用非配对的分析物TCR链，鸟枪法自eTPC-x编纂eTPC-t汇集物，以表达来自选择的单个TCR链文库的随机组合的配对TCR链对
eTPC-x含有表达单一TCR链的交换的基因组接受位点2B’和不同的基因组接受位点2D。不同的遗传供体载体2E’i和2E’ii分别地与2D配对。供体载体2E’i和2E’ii各自编码单一TCR链。eTPC-x还含有TCR信号响应元件2F。eTPC-x与供体载体2E’i和2E’ii同时组合。所得到的细胞汇集物具有插入物2E’i或2E’ii在多个独立情形下交换至2D基因组接受位点，以产生位点2E i和2E’ii，各自递送编码TCR链的单一ORF。所得到的eTPC-t细胞汇集物包含2个不同细胞群组的混合群体，所述群组各自在表面表达不同的TCRsp，所述TCRsp包含从2B’表达的与初始载体文库中所含的TCR链之一配对的TCR链。
图30-eAPC:eTPC组合系统的运行,显示可能的eTPC-t输出状态
分析物eAPC含有位点1C’和1E’，各自整合了一个ORF，以编码一个aAPX和一个aAM，其中aAM在细胞表面上作为载货加载于aAPX中。分析物eTPC含有位点2C’和2E’，各自整合了一个ORF，在表面编码相应TCRsp。eTPC-t还含有TCR信号响应元件2F。当eTPC-t群体和eAPC-pa群体接触时，可以实现四种eTPC-t应答状态：一个阴性和三个阳性。阴性状态是eTPC-t的静息状态，其中在2F元件处无信号强度，表示eAPC aAPX:aAM复合体不能刺激eTPC-t呈递的链对。三个阳性状态显示自2F的信号强度增加。状态2F’+、2F’++和2F’+++分别表示低、中等和高信号强度。六角体所指示的基因产物2F积累以报告每个细胞状态的信号强度，通过细胞的更深阴影所指示。这表示分析物eTPC-t群体表达的TCRsp分级响应于eAPC-pa呈递的分析物aAPX:aAM。
图31-eAPC:eTPC组合系统的运行，显示可能的eAPC-pa输出状态
分析物eAPC-pa含有位点1C’和1E’，各自整合了一个ORF，编码一个aAPX和一个aAM，细胞表面aAM作为载货加载于aAPX中。分析物eTPC含有位点2C’和2E’，各自整合了一个ORF，在表面编码相应TCRsp。eTPC-t还含有TCR信号响应元件2F。当分析物eTPC群体和eAPC-pa群体接触时，可以实现四种eAPC应答状态：一个阴性和三个阳性。阴性状态是分析物eAPC的静息状态，表示TCRsp链对未能刺激分析物eAPC呈递的aAPX:aAM复合体。三个阳性状态显示来自接触的aAPX:aAM的信号强度增加。每个细胞状态的报告的信号强度由*、**和***指示，并且还由细胞的更深阴影指示。这表示aAPX:aAM分级响应于分析物TCRsp链对。
图32-两部分分析物APC:eTPC系统的联合运行，以自表达不同分析物TCR链对的eTPC-t的文库中鉴定与分析物aAPX:aAM反应的TCR链对
eTPC-t汇集物含有携带位点2C’i、ii或iii的细胞，其中每个细胞整合了两个ORF编码相应TCR链对，并且因此群体中的每个细胞群组各自在表面表达不同的TCRsp。eTPC-t还含有TCR信号响应元件2F。分析物eAPC含有位点1C’和1E’，整合了一组不同的ORF，以编码一个aAPX和一个aAM，其中细胞表面aAM作为载货加载于aAPX中。在本例子中，仅表达自2C’i的TRC链对特异于分析物APC呈递的aAPX:aAM，从而在eTPC-t汇集物和分析物APC群体接触时，仅携带2C’i的eTPC-t的细胞群组通过状态2F’报告TCRsp接合。
图33-两部分eAPC:eTPC系统的联合运行，以自表达不同分析物aAPX:aAM复合体的分析物eAPC的文库中鉴定与分析物eTPC反应的aAM。
分析物eAPC含有位点1C’和1E’，各自整合了一套不同的ORF，编码一个aAPX和一个aAM，其中细胞表面aAM作为载货加载于aAPX中。分析物eTPC含有交换的基因组接受位点2C’，在表面表达TCRsp。它还含有TCR信号响应元件2F。在本例子中，仅复合体aAPX:aAM i特异于分析物eTPC呈递的TCR，由此在分析物eAPC汇集物和分析物eTPC群体接触时，仅表达aAM i的细胞群组表达不同的信号*。
图34-从eAPC-p和添加的可溶且可呈递抗原aAM产生eAPC-p+aAM
eAPC-p含有表达aAPX的交换的基因组接受位点1B’。可溶性、直接可呈递的抗原aAM与eAPC-p组合。这导致aAPX:aAM复合体在细胞表面上形成及产生eAPC-p+aAM。
图35-从eAPC-p和可溶性aAM产生eAPC-p+aAM
eAPC-p含有表达aAPX的交换的基因组接受位点1B’。可溶性抗原aAM与eAPC-p组合，这导致aAPX在细胞表面上表达、aAM在胞内存在、以及因此aAM作为载货装载于aAPX中在细胞表面上形成aAPX:aAM复合体、和产生eAPC-p+aAM。
图36-通过强迫释放aAM鉴定由eAPC-p+aAM呈递的aAM
eAPC-p+aAM含有表达aAPX的交换的基因组接受位点1B’以及内化aAM，所述aAM在表面上作为aAPX:aAM复合体呈递。通过温育从aAPX:aAM表面复合体释放aAM并且释放的aAM可用于鉴定。
图37-通过捕获aAPX:aAM复合体鉴定由eAPC-p+aAM呈递的aAM
eAPC-p+aAM含有表达aAPX的交换的基因组接受位点1B’以及内化的aAM，所述aAM在表面上作为aAPX:aAM复合体呈递。捕获aAPX:aAM表面复合体以鉴定加载的aAM。
图38-在HEK239细胞系中选择HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座定向诱变的细胞
a)与HEK293对照细胞(虚线图)相比，质粒转染后48小时在两个独立细胞群体中的GFP荧光信号(灰色图)，所述质粒编码Cas9-P2A-GFP和靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座的gRNA。分选GFP信号在GFP子集门控中的细胞，作为多克隆群体。b)用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合的抗体标记时，在两个分选的多克隆群体上观察到的细胞表面HLA-ABC信号(灰色图)。分选显示低PE-Cy5抗-HLA-ABC信号并且展示在分选门中的单细胞，以建立单克隆。未标记的HEK293细胞(虚线图)和PE-Cy5抗-HLA-ABC标记的HEK293细胞(实黑线图)充当对照。
图39-HLA-ABC无效单克隆的表型分析：将单克隆群体用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合的抗体染色并通过流式细胞术分析(灰色图)。未标记的HEK293细胞(虚线图)和PE-Cy5抗-HLA-ABC标记的HEK293细胞(实黑线图)充当对照。全部三个单克隆系均显示匹配于未标记对照的荧光信号，说明每个细胞系都缺少HLA-ABC表面表达。
图40-遗传表征选择的缺少表面HLA-ABC表达的单克隆，显示靶向的HLA等位基因中的基因组缺失。用跨特定HLA等位基因的gRNA基因组靶位点的引物生成PCR扩增子，并且通过电泳确定它们的大小。野生型HLA-A扩增子的预期大小是1067bp，HLA-B扩增子是717bp并且HLA-C扩增子是1221bp。
图41-选择定向基因组整合了合成组分B加上或不加合成组分D的细胞
a)质粒转染后48小时的GFP荧光信号，所述质粒编码Cas9-P2A-GFP、靶向AAVS1基因座的gRNA、和旁侧为AAVS1左同源臂和右同源臂的组分B遗传元件(灰色图)。HEK293细胞充当GFP阴性对照(虚线图)。分选具有GFP+门内GFP信号的细胞作为多克隆群体。b)质粒转染后48小时的GFP荧光信号，所述质粒编码Cas9-P2A-GFP、靶向AAVS1基因座的gRNA、和组分组分B和D，组分B和D两者都在旁侧分布有AAVS1左同源臂和右同源臂(灰色图)。HEK293细胞充当GFP阴性对照(虚线图)。分选具有GFP+门内部GFP信号的细胞作为多克隆群体。c)在D1分选的多克隆群体中观察到维持的BFP信号但不可检的RFP信号。分选在象限Q3中显示高BFP信号的单细胞，以建立含有合成组分B的eAPC单克隆。d)在D2分选的多克隆群体中观察到维持的BFP信号和RFP信号。分选在象限Q2中显示高BFP信号和高RFP信号的单细胞，以建立含有合成组分B和合成组分D的eAPC单克隆。
图42-eAPC单克隆的表型分析
a和b)展示BFP表达维持的单克隆群体提示合成组分B的整合。c)展示维持的BFP表达和RFP表达的单克隆群体提示合成组分B和合成组分D均整合。
图43-遗传表征选择的单克隆，确定组分B或组分B和D在AAVS1基因座中的整合。
a)用在组分B和/或D内进行引发的引物生成PCR扩增子，并且通过电泳确定大小。阳性扩增子的预期大小是380bp，表明组分B和/或D稳定整合。b)用引物生成PCR扩增子，所述引物在远离同源臂编码区域的AAVS1基因组序列上以及在组分B和/或D编码的SV40pA终止子上进行引发，通过电泳确定大小。阳性扩增子的预期大小是660bp，表明组分B和/或D的整合发生在AAVS1位点中。
图44-选择组分C’定向基因组整合入组分B中的细胞
a)质粒转染后48小时的GFP荧光信号，质粒编码Cas9-P2A-GFP、靶向AAVS1基因座的gRNA、和组分C’HLA-A*24:02(左小图)或组分C’HLA-B*-07:02(右小图)。分选具有GFP+门内GFP信号的细胞作为多克隆群体ACL-303或ACL-305。
b)用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合的抗体标记时，在两个分选的多克隆群体上观察到的分析物HLA细胞表面表达(灰色图)。分选显示高PE-Cy5抗-HLA-ABC信号并且展示在右侧分选门内的单细胞，以建立单克隆。从PE-Cy5抗-HLA-ABC标记的ACL-128、HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系检测到的信号(虚线图)充当对照。
图45-表型分析在细胞表面上表达分析物HLA I类蛋白的eAPC-p单克隆
将单克隆群体用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合物抗体染色并通过流式细胞术分析(灰色图)。ACL-128、HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系(虚线图)充当对照。与HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系对照相比，单克隆细胞系ACL-321和ACL-331显示更强的荧光信号，表明每个细胞系分别表达它们的分析物aAPX、HLA-A*24:02或HLA-B*-07:02ORF，并且因此是eAPC-p细胞系。
图46-遗传表征选择的单克隆，显示它们的基因组整合了组分C’并且显示整合发生在AAVS1基因组接受位点中，产生组分B’
a)PCR扩增子证实存在HLA插入物，810bp条带指示正确的CMV启动子扩增子并且380bp条带是从SV40pA终止子产生的扩增子。b)用在远离同源臂编码区域的AAVS1基因组序列上进行引发的两套引物，以及独特于与分析物HLA ORF连接的SV40pA终止子的引物，生成PCR扩增子。阳性扩增子的1kb和1.1kb预期大小表明生成组分B’。
图47-选择组分C’定向基因组整合入组分B中的细胞
a)质粒转染后48小时的GFP荧光信号，质粒编码Cas9-P2A-GFP、靶向AAVS1基因座的gRNA、和组分C’HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01(左小图)或组分C’HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01(右小图)。分选具有GFP+门内GFP信号的细胞作为多克隆群体。
b)用Alexa 647抗-HLA-DR,DP,DQ缀合的抗体标记时，在两个分选的多克隆群体上观察到的分析物HLA细胞表面表达(灰色图)。分选显示高Alexa 647抗-HLA-ABC信号并且展示在右侧分选门内的单细胞，以建立单克隆。从Alexa 647抗-HLA-ABC标记的ACL-128(HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系)(虚线图)和ARH野生型细胞系(实黑线图)检测的信号，充当对照。
图48-表型分析在细胞表面上表达分析物HLA II类蛋白的eAPC-p单克隆
将单克隆群体用Alexa 647抗-HLA-DR,DP,DQ缀合的抗体染色并通过流式细胞术分析(灰色图)。ACL-128(HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系)(虚线图)和ARH野生型细胞系(实黑线图)充当对照。与HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系对照相比，单克隆细胞系ACL-341和ACL-350显示更强的荧光信号，表明每个细胞系分别表达它们的分析物aAPX、HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01或HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01，并且因此是eAPC-p细胞系。
图49-通过RMCE整合分析物HLA I类蛋白产生的eAPC-p单克隆
a)eAPC-p单克隆群体ACL-421和ACL-422丧失BFP荧光(灰色图)。它们的亲本eAPC细胞系ACL-385(实黑线图)和BFP阴性ARH野生型细胞系(虚线图)充当控制。
b)当用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合抗体染色时，eAPC-p单克隆群体ACL-421和ACL-422表现HLA-A*02:01表达(灰色图)。它们的亲本ACL-385HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系(虚线图)和ARH野生型细胞系(实黑线图)分别充当阴性和阳性PE-Cy5抗-HLA-ABC标记对照。
这些结果强烈地表明，在ACL-421和ACL-422细胞系中在BFP ORF和HLA-A*02:01ORF之间成功发生RMCE。
图50-遗传表征选择的单克隆，证实由RMCE引起HLA-A*02:01整合
630bp的扩增子表示HLA-A2在单克隆ACL-421和-422中存在，但是在对照细胞系ACL-128中则无。
图51-在细胞表面上表达分析物HLA I类蛋白和aAM的eAPC-pa单克隆的表型分析
a)将eAPC-p单克隆群体用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合抗体染色并通过流式细胞术分析(灰色图)。ACL-128、HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系(虚线图)充当控制。与对照相比，单克隆细胞系ACL-321和ACL-331显示更强的荧光信号，表明每个细胞系分别表达它们的分析物aAPX、HLA-A*02:01或HLA-B*35:01ORF，并且因此是eAPC-p细胞系。
b)通过流式细胞术评估eAPC-pa单克隆群体的GFP荧光(灰色图)。ACL-128、HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效eAPC细胞系(虚线图)充当控制。与对照相比，单克隆细胞系ACL-391和ACL-395显示更强的荧光信号，表明每个细胞系分别表达分析物aAM选择标记以及因此推断的aAM表达，在细胞系中还分别表达HLA-LA-A*02:01或HLA-B*35:01ORF。因此ACL-391和ACL-395是eAPC-pa细胞系。
图52-含有组分1D和/或1B的单克隆的遗传表征
给出了两个表，总结了对生成的、分别含有组分1B、或组分1B和1D的eAPC的遗传表征。
图53-一步构建的其中组分1C’编码单一HLAI ORF的eACP-p。
通过用编码Tyr-重组酶Flp(V4.1.8)表达的质粒连同编码选自HLA-A*02:01(V4.H.5)或HLA-A*24:02(V4.H.6)的aAPX的一个组分1C’质粒，对细胞系ACL-402进行电穿孔，借助RMCE产生eAPC-p。在电穿孔后10天，分选了HLAI表面表达阳性和组分1B选择标记编码的荧光蛋白信号RFP削弱的独立细胞。将所得的单克隆eAPC-p系通过流式细胞术与亲本eAPC细胞系平行分析，并且展示两个例子：a)将生长的单克隆系(ACL-900和ACL-963)通过流式细胞术分析，确定RFP的丢失、BFP的存在和HLA-ABC(aAPX)的获得。左侧图展示BFPvs.RFP，亲本细胞具有BFP和RFP两者(Q2，顶图，99.2％)，而ACL-900(Q3，中图，99.7％)和ACL-963(Q3，底图，99.9％)均缺少RFP信号，表明在组分1B/1C’之间的整合对偶已经发生。右侧图展示BFP vs.HLA-ABC(aAPX)，其中ACL-900(Q2，顶图，99.2％)和ACL-963(Q2，底图，99.2％)均显示HLA-ABC(aAPX)的强信号，进一步支持1B/1C’整合。重要地，ACL-900和ACL-963均具有强烈的BFP信号，这表明组分1D保持开放并与组分1B/1C’整合对偶隔离。b)为了进一步表征ACL-900和ACL-963以及第三eAPC-p(在a)中不存在的ACL-907)，提取基因组DNA并且使用靶向组分1B’相邻和内部的引物(表5，8.B.3、15.H.2)实施PCR，因而仅选择性扩增成功的整合对偶事件。与其中缺少组分1B的未修饰的亲本系ACL-3比较。对全部三个eAPC-p单克隆，产生对组分1B’特异的扩增子产物，而在ACL-3反应中未检出产物，从而证实组分1B和组分1C’之间的特异性整合对偶事件已经发生。
图54–一步从eAPC-p构建的eAPC-pa，其中组分1D’编码单一分析物抗原分子(aAM)ORF。
从亲本eAPC-p(ACL-905)平行构建多个eAPC-pa，其中通过引发的遗传供体载体(组分1E’)靶向基因组接受位点(组分1D)用于实现整合，所述载体包含编码aAM的单一ORF。通过电穿孔，将eAPC-p(ACL-900，实施例8)分别独立地与编码表达RMCE重组酶(Flp，V4.1.8)以及V9.E.6、V9.E.7或V9.E.8的组分1E’的载体组合。在电穿孔后10天，选择各eAPC-pa，并且基于由组分1D编码的整合选择标记BFP的信号削弱，分选单细胞(单克隆)。将所得的单克隆eAPC-pa系通过流式细胞术与亲本eAPC系平行分析，并且展示三个例子。此外，还以遗传方式表征所得的单克隆以证实整合对偶事件。a)将eAPC-pa单克隆，ACL-1219、ACL-1227和ACL-1233，通过流式细胞术分析，并针对BFP信号丢失和HLA-ABC信号保留进行选择。展示BFP vs.SSC图，连同BFP-门。与亲本eAPC-p相比，观察到BFP-事件数目增加，表示组分1D/1E’之间的整合对偶已经发生。选择来自BFP-门的单细胞、分选并培养。b)将选择的单克隆ACL-1219、ACL-1227、ACL-1233通过流式细胞术分析以证实BFP丢失和HLA-ABC信号保留。展示BFP vs.HLA-ABC图，其中可以观察到与亲本eAPC-p相比，全部三个单克隆均已经丢失BFP信号(最右侧图)，表明成功的整合对偶事件。c)为了显示单克隆含有正确片段大小的aAM ORF，利用靶向aAM ORF的引物，实施聚合酶链反应，并且展示代表性琼脂糖凝胶。显示代表每个aAM ORF的来自两个单克隆的结果。泳道1：2_log DNA标记；泳道2-3：pp28ORF(预期大小0.8kb)；泳道4：2_log DNA标记；泳道5-6：pp52ORF(预期大小1.5kb)；泳道7：2_log DNA标记；泳道8-9：pp65ORF(预期大小1.9kb)；泳道10：2_logDNA标记。分析的全部单克隆均具有相应aAM的预期扩增子大小，这进一步表明整合对偶已经发生。
图55–在一个步骤中鸟枪法整合多个抗原至eAPC-p中以产生eAPC-pa汇总文库
通过一步整合入亲本eAPC-p，从总体上编码多个aAM ORF(HCMVpp28、HCMVpp52和HCMVpp65)的已引发组分1E载体(组分1E’)的汇集物，产生eAPC-pa汇总文库，其中每个单独细胞在组分1D’整合来自载体原始汇集物的单一随机分析物抗原ORF，从而每个生成的eAPC-pa都表达单一随机aAM，但是总体上，eAPC-pa汇总文库代表载体原始汇总文库中编码的全部aAM ORF。eAPC-pa文库通过如下方式借助电穿孔产生：将eAPC-p(ACL-905，aAPX:HLA-A*02:01)与包含各个载体的汇总载体文库组合，所述载体分别编码HCMVpp28、HCMVpp52或HCMVpp65(V9.E.6、V9.E.7和V9.E.8)之一的ORF并且按1:1:1的分子比率混合。将所得的eAPC-pa群体通过流式细胞术与亲本eAPC-p系平行分析并选择。a)在电穿孔后10天，与亲本系(ACL-905)平行比较，通过流式细胞术分析并选择推定的eAPC-pa细胞(转染子)。图上展示了BFP vs.SSC，对BFP-群体设门，其中与亲本系相比，在BFP-门中观察到BFP-细胞增加。基于BFP-门，从转染子分选大量细胞，命名为ACL-1050。b)在培养后，将ACL-1050细胞通过流式细胞术分析BFP丢失。图展示BFP vs.SSC，其中与亲本系约4％BFP-相比，ACL-1050已经富集至96.4％BFP-。随后，从ACL-1050的BFP-群体分选单细胞。c)为了表明多克隆ACL-1050包含编码HCMVpp28、HCMVpp52和HCMVpp65的细胞的混合物，随机选择12个单克隆，培养并用于遗传表征。使用靶向aAM ORF(组分1D’)以扩增和检测整合的aAM的引物，通过PCR表征细胞。借助PCR筛选的全部12个单克隆均具有可检测的扩增子并且具有以下预期大小之一：pp28(0.8kb)、pp52(1.5kb)或pp65(1.9kb)。此外，跨12个单克隆展示全部3种aAM。在比较中，将来自其中aAM已知的三个分立单克隆的扩增子，平行扩增作为对照；全部三个对照均产生大小正确的扩增子：pp28(0.8kb)、pp52(1.5kb)和pp65(1.9kb)。因此，证实汇集物包含这样的eAPC-pa，其中每个细胞具有从三个载体的原始汇集物随机选择的单一aAM。
图56-从亲本eTPC产生eTPC-t的展示
选择对HLA-A*02:01中呈递的HCMV抗原具有已知特异性的模型TCRα/β对(JG9-TCR)，用于整合至eTPC亲本系。将JG9-TCR-αORF克隆在组分2E’背景中，并且将JG9-TCR-β克隆在2C’背景中。通过将组分2C’和2E’质粒和编码flp重组酶的构建体转染入eTPC细胞系ACL-488，借助RMCE产生eTPC-t，所述细胞系ACL-488携带两个基因组整合位点2B和2D，分别编码报道分子BFP和RFP。在转染后10天，分选由组分2B和2D选择标记编码的BFP信号和RFP信号削弱的独立细胞为单细胞。将所得的单克隆eTPC-t ACL-851与亲本eTPC平行分析，并且展示一个例子。a)和b)将亲本eTPC细胞系ACL-488和示例单克隆通过流式细胞术分析BFP信号和RFP信号。通过BFP vs.RFP,图展示活的单细胞，显示eTPC细胞系对于组分2B和2D中存在的选择标记为阳性(a)，并且如对2B/2C和2D/2E之间整合对偶事件所预期那样，所得的单克隆已经丧失这些标记(b)。百分数值代表a)中双阳性细胞的百分数和b)中双阴性细胞的百分数。c)至f)将eTPC ACL-488和单克隆eTPC-t ACL-851用抗CD3和TCRα/β(TCRab)抗体和对JG9-TCR特异的HLA多聚体试剂(Dex HLA-A*02:01-NLVP)染色，并且通过流式细胞术分析并且对活的单细胞设门。亲本eTPC系未显示细胞表面上CD3或TCR的阳性染色(c)，并且对HLA多聚体试剂染色也为阴性(d)。相反，所产生的单克隆对细胞表面上CD3和TCR均显示阳性染色(e)，并且也对特异于表达的JG9-TCR的多聚体试剂染色，显示为阳性。百分数值在c)和e)中代表CD3/TCRab双阳性细胞的百分数，在d)和f)中代表CD3/HLA-多聚体双阳性细胞的百分数。g)从单克隆eTPC-t ACL-851制备基因组DNA，并采用以下引物进行PCR，所述引物对组分2D’编码的JG9-TCR-α链或组分2B’编码的JG9-TCR-β链特异。PCR产物通过琼脂糖凝胶解析并且观察到为预期条带大小。h)从单克隆eTPC-t ACL-851制备基因组DNA，并采用以下引物和探针进行数字降落式PCR(drop PCR)，所述引物和探针对组分2D’编码的JG9-TCR-α链或组分2B’编码的JG9-TCR-β链特异。纳入针对TCRα恒定区(TRAC)的内含子的参比扩增子引物/探针对。该表展示参比物对TCRα和TCRβ的比率。接近于0.33的比率表示在三倍体系的eTPC-t细胞系ACL-851中存在每个TCRα链和β链的单拷贝。
图57-展示从eTPC-t逆转为eTPC-x。
通过使组分2D’与编码GFP的供体载体(组分2Z)交换，将分别在位点2D’和2B’处表达TCRα链和β链的亲本eTPC-t细胞系ACL-851逆转成eTPC-x系。组分2Z含有置于GFP ORF侧翼的重组酶异特异性F14/F15位点，并且因此与组分2D’相容。将eTPC-t细胞系ACL-851用组分2Z连同编码flp重组酶的构建体转染。转染后7天，分选GFP信号阳性的独立细胞并培育为单克隆。将所得的单克隆eTPC-x细胞系通过流式细胞术与亲本eTPC-t平行分析，并且展示一个例子。a)和b)将衍生自亲本eTPC-t ACL-851的单克隆eTPC-x(ACL-987)连同亲本系一起通过流式细胞术分析GFP表达。图展示设门的活单细胞的SSC vs.GFP参数。亲本细胞系没有GFP表达(a)，而单克隆ACL-987如预期那样已经获得GFP(b)，这表明TCRαORF交换成GPFORF。c)和d)将衍生自亲本ACL-851的单克隆eTPC-x ACL-987连同亲本eTPC-t ACL-851一起用针对CD3和TCRab的抗体染色并通过流式细胞术分析。图展示CD3vs.TCRab参数，对活的单细胞设门。亲本细胞显示CD3和TCRab均阳性染色(c)，而衍生的单克隆显示二者均阴性染色(d)；证实在衍生的eTPC-x系中TCRαORF丢失。
图58-展示鸟枪法整合入eTPC-x以产生eTPC-t汇集物
eTPC-t汇集物从eTPC-x亲本系产生，所述亲本系在组分2B’中表达单一TCRβ链。eTPC-x系将GFP在可用位点2D表达为报道分子。构建64个变异TCRα链(包括亲本链)的汇集物。亲本TCR链对是，对HLA-A*02:01中呈递的HCMV抗原具有已知特异性的JG9-TCR。将组分2E汇集物连同编码flp重组酶的构建体转染入亲本eTPC-x ACL-987。转染后10天，通过分选GFP阳性细胞，选择多克隆系。随后基于GFP阴性染色和HLA多聚体试剂(DEX HLA-A*02:01-NLVP)阳性染色或阴性染色，分选所产生的ACL-988多克隆eTPC-t。对回收的单细胞测序以鉴定编码的TCR-α链，并且就HLA多聚体试剂染色(特异于亲本TCR链对)而言，比较与配对于天然TCR-β链的每个TCR-α链变体的平行分析结果。a)和b)将亲本eTPC-x ACL-987系和所得的多克隆eTPC-t ACL-988系通过流式细胞术分析GFP表达。图展示活的单细胞的SSCvs.GFP参数。亲本细胞系显示GFP阳性信号，表明组分2D完整(a)。衍生的多克隆系显示GFP的一半阳性和一半阴性(b)，这表明多克隆群体中的半数细胞可能已经将D处的GFP ORF交换成TCRαORF以形成组分2D’。c)和d)将亲本eTPC-x ACL-987系和所得的多克隆eTPC-tACL-988系用CD3抗体和HLA多聚体(DEX HLA-A*02:01-NLVP)(对亲本JG9-TCR具有特异性)染色，并通过流式细胞术分析。图展示活的单细胞的CD3vs.HLA多聚体参数。亲本细胞系对CD3和HLA多聚体染色均为阴性(c)。左侧小图d)显示设门的GFP阴性事件，并且右侧小图显示设门的GFP阳性事件。只有其中组分2D转化成2D’的GFP阴性事件显示CD3阳性染色，其子集显示对HLA多聚体阳性染色。从设门的HLA多聚体阴性门和阳性门分选单细胞并且对组分2D’处整合的ORF测序以确定TCRαORF的身份。e)将全部64个JG9-TCR-α变体克隆入表达构建体，以允许将每种变体独立转染至亲本eTPC-x(ACL-987)。对每种变体测定HLA-A*02:01-NLVP四聚体试剂的相对染色单位(RSU)。RSU计算为CD3阳性群体对CD3阴性群体的HLA-A*02:01-NLVP四聚体信号平均荧光强度(MFI)的比率，并且表示每种TCR链对变体针对HLA多聚体试剂的结合强度。图e)中作图的每个点代表对64个变体中每个变体观察到的RSU。空心圆圈与回收自GFP阴性/HLA多聚体阳性门的已测序细胞相关。空心三角形与回收自GFP阴性/HLA多聚体阴性门的已测序细胞相关。
图59-使用eAPC-p和外源aAM在eAPC:eTPC系统中组分2F的功能性展示
eTPC-t细胞系携带组分2F(ACL-1277)，其中组分2B’和2D’处的TCR链编码对HLA-A*02:01中呈递的HMCV抗原性肽NLVPMVATV特异的TCR对。组分2F报道分子是RFP。使这种eTPC-t与具有不同–p特征的多种eAPC细胞系在模式肽抗原存在和不存在下接触24小时，并且通过流式细胞术分析接触培养物。流式细胞术图显示事件计数vs.活的单T细胞的RFP信号，其中通过针对eAPC不呈递的特异性表面标记进行抗体染色，鉴定所述细胞。a)和b)将仅表达HLA-A*02:01的eAPC-p细胞(ACL-209)用NLVPMVATV(a)肽或VYALPLKML(b)肽脉冲，并随后与eTPC-t共培养24小时。c)和d)将仅表达HLA-A*24:02的eAPC-p细胞(ACL-963)用NLVPMVATV(c)肽或VYALPLKML(d)肽脉冲，并随后与eTPC-t共培养24小时。e)仅表达HLA-A*02:01的eAPC-p细胞(ACL-209)不接受肽脉冲，并随后与eTPC-t共培养24小时。f)将细胞表面上不表达HLA的eAPC亲本细胞(ACL-128)用NLVPMVATV脉冲，并随后与eTPC-t共培养24小时。仅在用NLVPMVATV(其代表已表达TCR的已知靶)脉冲的表达HLA-A*02:01的eAPC-p存在下，eTPC-t ACL-1277中RFP信号才显著增加。图上的门和值反映在RFP阳性门和RFP阴性门中的事件的百分数。这表示组分2F特异性响应于eTPC-t表达的TCRsp与相关HLA/抗原(aAPX:aAM)的接合。
图60-使用aAM已整合的eAPC-pa在eAPC:eTPC系统中组分2F的功能性展示
eTPC-t细胞系携带组分2F(ACL-1150)，其中组分2B’和2D’处的TCR链编码对HLA-A*02:01中呈递的HMCV抗原性肽NLVPMVATV特异的TCR对。组分2F报道分子是RFP。使这种eTPC-t与具有不同–pa特征的多种eAPC细胞系在外源抗原不存在下接触24小时。a)表达HLA-A*02:01和HCMV蛋白pp52全长ORF的eAPC-pa系(ACL-1044)。pp52不含有JG9-TCR识别的抗原性序列。b)表达HLA-A*02:01和HCMV蛋白pp65全长ORF的eAPC-pa系(ACL-1046)。pp65含有在HLA-A*02:01中呈递时被JG9-TCR识别的抗原性序列。c)表达HLA-B*07:02和HCMV蛋白pp52全长ORF的eAPC-pa系(ACL-1045)。pp52不含有JG9-TCR识别的抗原性序列。d)表达HLA-B*07:02和HCMV蛋白pp65全长ORF的eAPC-pa系(ACL-1048)。pp65含有在HLA-A*02:01中呈递时被JG9-TCR识别的抗原性序列。将每个eAPC-pa系与eTPC-t独立共培养48小时后，通过流式细胞术测定eTPC-t中的RFP表达。仅在接触eAPC-pa ACL-1046时，eTPC-t ACL-1150中的RFP信号才显著增加。这是同时具有识别的抗原性肽序列和正确的HLA限制的唯一eAPC-pa，其中所述抗原性肽序列由整合的aAM ORF编码。图上的门和值反映在RFP阳性门和RFP阴性门中的事件的百分数。这表示组分2F特异性响应于eTPC-t表达的TCRsp与相关HLA/抗原(aAPX:aAM)的接合。
材料和方法
本申请中使用的全部细胞系均基于ARH或HEK293背景。它们由ACL后续编号代表。如表1展示在本申请中使用的细胞系的总结。
细胞转染
在转染/电穿孔之前一天，将细胞以1.2-1.4x106细胞/60mm培养皿的密度接种在90％DMEM+2mM L-谷氨酰胺+10％HI-FBS(Life Technologies)中。次日，将具有65％汇合度的细胞用总量5ug DNA和 (Polyplus转染试剂，Life Technologies)按N/P比率6转染。将DNA和的母液分别稀释于无菌1M NaCl和150mM NaCl中。每种溶液的终体积等于总混合物体积的50％。随后添加PEI溶液至稀释的DNA并将混合物在室温温育15分钟。最后，将DNA/PEI混合物添加至60-mm培养皿，小心切勿破坏细胞膜。在DNA递送标记表达分析之前，将细胞在(37℃，5％CO2，95％相对湿度)温育48小时。在转染前更换培养基。
荧光激活的细胞分选法(FACS)
使用BDInflux仪，通过标准细胞分选方法学实现单细胞分选或多克隆分选。简而言之，将ACL细胞用TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)收获并且在含有20％HI-FBS和抗-抗100X的DMEM 1X培养基(Life Technologies)中重悬于合适体积的DPBS 1X(Life Technologies)中，之后进行细胞分选。表2总结了本申请中用于FACS的抗体和多聚体。
Flp介导的HLA-A*02:01序列在eAPC细胞系中的整合
将eAPC细胞用编码Flp的载体、编码用来追踪递送的标记的DNA(编码GFP的载体)和含有HLA-A*02:01的载体电穿孔。HLA-A*02:01序列还在3’末端编码接头和3xMyc标签。使用的电穿孔条件是258V，12.5毫秒，2次脉冲，1个脉冲间隔。每种整合载体和Flp载体之间的比率是1:3。分别使用仅以GFP-载体电穿孔的细胞和未电穿孔的细胞作为对照，以便为二天后的GFP分选设门。在次日(电穿孔后2天)，分析并基于GFP表达分选细胞。使用BD Influx细胞分选仪分选细胞。
在电穿孔后3天，进行基于GFP表达的分选以富集电穿孔的细胞。电穿孔后7-8天，收获细胞并且对HLA-ABC表达进行表面染色。对BFP+ve RFP-ve HLA+ve细胞作单克隆单细胞分选。
为了对细胞进行基因分型，使用100ng DNA作为模板进行PCR反应，以检查整合是否已经在预期的整合位点发生。使用了靶向整合盒的正向引物(Pan_HLA_GT_F1)和靶向整合位点紧邻外部的反向引物(SV40pA_GT_R1)并且将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上走胶。
Flp介导的HCMV ORF序列在eAPC-p细胞系中中整合
将eAPC-p细胞用编码Flp的载体、编码用来追踪递送的标记的DNA(编码GFP的载体)和含有HCMV pp28、pp52或pp65aAM-ORF的载体电穿孔。HCMV-ORF序列还在3’末端编码接头和3xMyc标签。使用的电穿孔条件是258V，12.5毫秒，2次脉冲，1个脉冲间隔。
每种整合载体和Flp载体之间的比率是1:3。分别使用仅以GFP-载体电穿孔的细胞和未电穿孔的细胞作为对照，以便为二天后的GFP分选设门。在次日(电穿孔后2天)，分析并基于GFP表达分选细胞。使用BD Influx细胞分选仪分选细胞。
Flp介导的3个HCMV ORF序列在eAPC-p细胞系中的鸟枪法整合
将eAPC-p细胞用编码Flp的载体、编码用来追踪递送的标记的DNA(编码GFP的载体)和含有HCMV pp28、pp52或pp65aAM-ORF的载体电穿孔。HCMV-ORF序列还在3’末端编码接头和3xMyc标签。使用的电穿孔条件是258V，12.5毫秒，2次脉冲，1个脉冲间隔。为了鸟枪法整合，含有HCMV-ORF的各载体按1:1:1比率汇集并且将混合物电穿孔至eAPC-p细胞中。所得到的eAPC-pa细胞是多克隆的。分选独立的单克隆细胞并遗传表征以显示多克隆由含有全部三个HCMV-ORF的细胞组成。
单克隆的遗传表征
评估HCMV ORF向组分D中RMCE整合的PCR反应
用来评估HCMV ORF整合的引物与接头复性(正向引物10.D.1)和与EF1aplha启动子复性(反向引物15.H.4)。预期大小对于pp28是0.8kb，对于pp52是1.5kb，对于pp65是1.9kb。使用PowerPac Basic(Bio-Rad)，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上1XTAE缓冲剂中走胶，用10,000稀释度的sybersafe染色并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。
配对的整合对偶之间的RMCE
对于RMCE整合，将细胞用0.6μg编码FLP的DNA载体(V4.I.8)、2μg组分C/Y、2μg组分E/Z、0.4μg编码旨在追踪DNA递送的标记的DNA转染。转染后2天，通过FACS分选DNA递送标记阳性(GFP阳性或RFP阳性)的细胞。转染后4-10天，通过FACS分选出展示由组分D和B选择标记编码的荧光蛋白信号削弱的独立细胞。对于产生ACL-987是例外的，其中通过FACS分选出展示GFP阳性的独立细胞。
瞬时表达TCR链对以表征它们的RSU
为了瞬时表达，将细胞用编码FLP(V4.I.8)、JG9-TCR-α变体(VP.7751.RC1.A1至VP.7751.RC1.H8)、JG9-TCR-βWT链(V3.C.5)的DNA载体和DNA载体溶媒(V1.C.2)转染。转染后2天，全部细胞均用HLA-A*02:01-NLVP四聚体和抗CD3抗体染色。RSU计算为CD3阳性群体对CD3阴性群体的HLA-A*02:01-NLVP四聚体信号的平均荧光强度(MFI)比率，并且表示每种TCR链对变体的结合强度。
HLA多聚体染色
将细胞用HLA-多聚体试剂在冰上染色10分钟，随后用CD3和/或TCRab抗体染色。表6中定义了通过BDInflux仪检测特异性细胞荧光特性。
分选单一细胞以产生单克隆，将展示目的表型的细胞沉积至含有200ul生长培养基的96孔板中。每份样品分选一至两块平板。使用细胞分选仪InfluxTM(BD Biosciences)中的双路分选设定，将多克隆细胞分选物导入含有培养基的FACS管中。
将用于分子表征其JG9-TCR-α变体的单细胞分选物分选至事先载有5μL无核酸酶的水的PCR平板中。将标本急冻直至后续加工。
提取基因组DNA用于遗传表征
使用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)，从5x106个细胞提取DNA。DNA储存在1xTE(10mM Tris pH 8.0和0.1mM EDTA)中。
评估TRA-ORF和TRB-ORF向组分2B或2D中RMCE整合的PCR反应。
用来评估TCR-α整合的引物与作为基因组接受位点预先存在部分的TRAC区段复性(正向引物1.F.7)和与sv40pA终止子复性(反向引物15.H.2)。预期大小566bp。用来评估TCR-β整合的引物与作为基因组接受位点预先存在部分的TRBC区段复性(正向引物1.F.9)和与sv40pA终止子复性(反向引物15.H.2)。预期大小610bp。使用PowerPac Basic(Bio-Rad)，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上1XTAE缓冲剂中走胶，用10,000稀释度的sybersafe染色并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。
评估DNA递送后基因组中TRA-ORF和TRB-ORF的拷贝数的ddPCR反应
通过使用靶向目的TCR ORF C区段(TRAC)的特异性引物和探针，分析所选择ACL-851单克隆的DNA。用来评估TRA-ORF拷贝数的引物和探针，其与TRAC区段(正向引物1.F.7、反向引物1.F.8和探针1.G.1)复性。用来评估TRB-ORF拷贝数的引物和探针，其与TRB-C区段(正向引物1.F.9、反向引物1.F.10和探针1.G.2)复性。
在全部情况下，使用引物10.A.9和10.A.10连同与HEX缀合的荧光探针10.B.6，同时筛选参比基因(TRAC)以确定染色体拷贝数。认定HEK293细胞对参比基因为三倍体(TRAC)的整合拷贝数。在滴式数字PCR之前，用MfeI(NEB)消化DNA以分离串联整合。使用QX200TM滴式读数仪和滴式发生器及C1000TouchTM深孔热循环仪(Bio-Rad)，根据探针用ddPCRTM超级混合物(无dUTP)(Bio-Rad)的方案，遵循反应设置和循环条件。使用检测FAM的Ch1和针对HEX的Ch2，使用QuantaSoftTM软件获得数据。
来自单一T细胞的TCRα链和β链的测序
FACS分选的独立eTPC-t细胞经历一个两步骤扩增过程，该过程需要针对每种TRA和TRB链的V区特异性引物集合，随后进行产生TRA和TRB扩增子供序列分析的配对巢式PCR反应。先前描述了这种方法(Han等人,Nat Biotechnol.2014 32(7):684-692)。以下材料用于所述方法中：
组分F的功能性展示
将eTPC-t细胞和eAPC细胞在0.2x 10^6–1.5x 10^6个细胞/ml之间，在37℃，90％相对湿度和5％CO2常规培养于RPMI+10％热灭活胎牛血清(完全培养基)中。肽NLVPMVATV由Genescript合成并且冻干收到。肽主原液悬浮于10％DMSO中并储存在-80℃。施用时按50μM在完全培养基中配制工作原液(50x浓缩)。使用以下eAPC-p，其呈递HLA-A*02:01(ACL-900)或HLA-B*07:02(ACL-906)；或使用以下具有aAPX和外源aAM的eAPC-pa：HLA-A*02:01+HCMVpp52(ACL-1044)或HLA-A*02:01+HCMVpp65(ACL-1046)或HLA-B*07:02+HCMVpp52(ACL-1045)或HLA-B*07:02+HCMVpp65(ACL-1048)，或亲本eAPC(ACL-128)。使用两个不同的eTPC-t细胞系；第一eTPC-t，为ACL-1277，(组分A)用两个独特基因组接受位点工程化，利用天然CD3表达，并且携带基因组双组分，人造的反应元件(组分F，RFP报道分子)(参见实施例14)。第二eTPC-t，为ACL-1150，(组分A)用两个独特基因组接受位点工程化，利用天然CD3表达，并且携带基因组单组分，人造的反应元件(组分F，RFP报道分子)(参见实施例15)。将两种eTPC-t在组分2B’和2E’处载以TCR链ORF，后者编码对HLA-肽复合体(HLA)HLA-A*02:01-NLVPMVATV特异的TCR对。
抗原脉冲操作
悬浮活跃生长的eAPC细胞培养物(0.4-1.0x 10^6个细胞/ml)，取得样品并计数以确定细胞浓度。随后，收获1百万个细胞，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gibco)洗涤一次，随后按1至2x 10^6个细胞/ml之间的细胞浓度悬浮于含1μM肽或无肽的完全培养基中。将细胞在标准培养条件下，在24孔培养板中温育2小时。2小时后，收获细胞，通过离心沉淀(400rcf，3分钟)，随后用DPBS进行3x 10ml洗涤。随后将细胞按0.2x 10^6个细胞/ml悬浮在完全培养基中。
eTPC-t收获
悬浮活跃生长的eTPC-t细胞培养物(0.4-1.0x 10^6个细胞/ml)，取得样品并计数以确定细胞浓度。收获细胞，用DPBS洗涤一次并且随后按0.4x10^6(内源测定法)或0.6x 10^6个细胞/ml(或外源测定法)的浓度悬浮在完全培养基中。
在eTPC:eAPC细胞系统中的eTPC-t和eAPC与外源抗原性分子接触
向96孔圆底平板的每个孔，添加50μl完全培养基、50μl eAPC，随后添加50μleTPC-t。对于比率1:3按大约0.27x 10^6个细胞/ml的总细胞浓度，这等于大约10,000个eAPC和30,000个eTPC-t。随后将细胞混合物在标准培养条件温育大约24小时。
在eTPC:eAPC细胞系统中的eTPC-t和eAPC与内源抗原性分子接触
向96孔圆底平板的每个孔，添加50μl完全培养基、50μl eAPC，随后添加50μleTPC-t。对于比率1:2按大约0.2x 10^6个细胞/ml的总细胞浓度，这等于大约10,000个eAPC和20,000个eTPC-t。随后将细胞混合物在标准培养条件温育大约48小时。
染色和分析
在24小时或48小时温育后，收获细胞并移植到0.75ml V形底Micronic管中，用500μl DPBS洗涤一次并随后用死细胞标记(DCM-APC-H7)如下染色；向每个孔添加25μl染色液，通过混合，使细胞悬浮并且随后温育15-20分钟。染色液包含每100μl染色液0.5μl DCM-APC-H7。在温育后，将细胞用500μl DPBS+2％FCS(洗涤缓冲液)洗涤两次。随后将细胞对eTPC-t独特的表面标记染色；向每个孔添加30μl染色液，通过混合，使细胞悬浮并且随后温育30-45分钟。染色液包含每100μl染色液2.5μl抗myc-AF647(克隆9E10，Santa CruzBiotech)。在温育后，将细胞用500μl洗涤缓冲液洗2次，悬浮于200μl洗涤缓冲液中并且随后通过FACS在LSRFortessa(BD Biosciences)上分析。
实施例
实施例1：通过定向诱变删除APX基因家族
这里，描述如何实现抗原呈递复合体(APX)编码基因家族的定向诱变以产生工程化抗原呈递细胞(eAPC)的第一性状。所述性状是缺少至少一个APX家族成员的表面表达。
在这个实施例中，HEK293细胞系中靶向的APX包括主要HLA I类家族的三个成员：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HEK293细胞衍生自显示HLA-ABC内源性表面表达的人胚肾细胞。细胞遗传学分析显示，该细胞系具有近三倍体核型，因此，HEK293细胞编码每个HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的三个等位基因。
使用工程化的CRISPR/Cas9系统进行HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的定向诱变，其中，通过合成向导RNA(gRNA)，将Cas9核酸酶活性靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座。4至5种独特的gRNA设计成靶向每个HLA基因座的保守核苷酸序列，并且靶向位点偏向成于基因编码性序列的起点，因为这更可能产生无效等位基因。测定gRNA在其靶向的基因座处诱导突变的效率，并且选择最高效的gRNA以产生HLA-A、HLA-B和HLA-C无效(HLA-ABC无效)HEK293细胞系。
编码靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座的最佳gRNA的质粒，连同编码Cas9-P2A-GFP的质粒，如方法中所述，转染入HEK293细胞。转染后2天，基于GFP荧光，FAC分选对Cas9-P2A-GFP质粒摄取为阳性的细胞(图38a)。GFP分选的细胞进一步扩增超过5天，以留出足够时间供基因编辑事件发生，并且在有害突变的情况下，允许残留的内源性HLAI蛋白表达丢失。在这种生长期后，将细胞用泛HLA-ABC抗体染色，导致鉴定其表面上HLA-ABC表达减少的细胞(图38b)。不存在泛HLA-ABC抗体染色，则暗示每个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因均突变。分选各个HLA-ABC阴性细胞并扩增以代表一组单克隆。
依据缺少HLA-ABC表面表达，确认HLA-ABC无效单克隆。显示单克隆的一个子集缺少HLA-ABC表面表达，图39中描述其三个示例单克隆：ACL-414、ACL-415和ACL-416。通过确定细胞系在HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的全部等位基因中均拥有潜藏性遗传突变，对缺少HLAI表面表达的单克隆进行进一步遗传表征(图40)。采用跨越gRNA基因组靶位点的引物，通过PCR进行遗传表征，以检测扩增子尺寸变化和/或作为测序用模板使用。图40显示HLA-ABC无效单克隆的选择，与建立者细胞系的扩增子大小相比，依据较短PCR扩增子所检测到的，所选择的单克隆在HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的等位基因中含有遗传缺失(例如，ACL-414)。
总之，证实基因修饰的HEK293细胞系，包括ACL-414、ACL-415和ACL-416，缺少HLA-ABC表面表达并且因此拥有工程化抗原呈递细胞(eAPC)的第一性状。
实施例2：产生含有组分1B的eAPC
这里，描述了组分1B如何稳定整合入HLA-ABC无效单克隆系ACL-414以产生eAPC的第二性状。所述第二性状含有至少一个用于整合至少一个ORF的基因组接受位点，其中基因组接受位点是设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体。
在这个实施例中，基因组整合位点，组分1B，包含选择的遗传元件。两个独特的异特异性重组酶位点(FRT和F3)，所述位点侧置于编码选择标记——蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF的侧翼。在FRT位点的5’编码的是EF1a启动子并且在F3位点的3’编码的是SV40多聚腺苷化信号终止子。在该异特异性重组酶位点外部设置非编码性顺式调节元件的益处在于，由此在匹配的遗传供体载体(组分1C)中不需要这些元件。因此，在遗传供体载体的细胞性递送后，将观察到无编码的ORF的瞬时表达。这使得更可靠地选择成功的RMCE，因为来自遗传供体载体的ORF的细胞表达将仅在正确整合入组分1B后才最有可能发生，因为它现在含有适宜的顺式调节物元件(参见实施例6)。
为了促进组分1B向基因组安全港基因座AAVS1中的稳定基因组整合，构建质粒，其中组分1B的DNA元件旁侧分布有AAVS1左同源臂和右同源臂。每条臂包含与AAVS1基因组座位同源的>500bp序列。
通过在基因组安全港基因座AAVS1处同源定向重组(HDR)的过程，实现组分1B的稳定整合。用编码靶向AAVS1基因座的最佳gRNA的质粒、编码Cas9-P2A-GFP的质粒、和编码旁侧分布有AAVS1左同源臂和右同源臂的组分1B遗传元件的质粒，转染ACL-414细胞系。转染后2天，基于GFP荧光，FAC分选对Cas9-P2A-GFP质粒摄取为阳性的细胞(图41a)。GFP分选的细胞进一步扩增超过7天，这留出足够时间供HDR发生以及丢失选择标记BFP的瞬时表达。在这种生长期后，在FACS机上分析细胞，并且分选各个BFP阳性细胞并扩增以代表一组单克隆(图41c)。
基于BFP表达维持并且组分1B在所需的AAVS1基因组位置的单一整合，选择单克隆系作为eAPC。细胞系ACL-469和ACL-470代表了维持BFP表达的单克隆(图42a和b)。在提取自单克隆ACL-469和ACL-470的DNA上进行遗传表征，并且显示它们的基因组整合了组分1B并且组分1B已经整合入AAVS1位点(图43)。通过检测到具有预期大小的PCR扩增子，确证基因组整合，所述检测利用对组分1B特异的引物进行(图43a)。通过检测到具有预期大小的PCR扩增子，确证组分1B整合入AAVS1位点，所述检测利用针对以下AAVS1基因组序列设计的引物和对组分1B编码的SV40pA终止子特异的引物进行，所述基因组序列远离同源臂编码的区域(图43b)。通过降落式数字PCR测定组分1B的拷贝数，其中测量组分1B和参比基因DNA分子的数目并且计算比率(表1)。单克隆ACL-469和ACL-470含有1个组分1B分子对3个参比基因分子的比率。当考虑到建立者HEK293细胞系具有近三倍体核型时，这表明组分1B单一整合在ACL-469和ACL-470细胞系中。
总之，基因修饰的ACL-469和ACL-470细胞系是HLA-ABC无效并含有单拷贝的为RMCE设计的人造基因组接受位点，因此表明产生了具有单一合成整合接受位点的eAPC。
实施例3：产生含有组分1B和组分1D的eAPC
这里，描述了组分1B和组分1D如何稳定整合入HLA-ABC无效单克隆系ACL-414以产生eAPC的第二性状。所述第二性状含有两个用于整合至少一个ORF的基因组接受位点，其中基因组接受位点是设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体。
这个实施例使用与实施例2中所述相同的方法和组分，但是增加了第二基因组接受位点，组分1D。组分1D遗传元件包含不同于组分1B的两个独特异特异性重组酶位点，F14和F15。这些位点侧置于编码选择标记——红色荧光蛋白(RFP)的ORF的侧翼。在F14位点的5’编码的是EF1a启动子并且在F15位点的3’编码的是SV40多聚腺苷化信号终止子。如实施例2中，组分1D遗传元件旁侧分布有AAVS1左同源臂和右同源臂，每条臂包含与AAVS1基因组座位同源的>500bp序列。
组分1B和组分1D如实施例2中所述那样整合入AAVS1，但向转染混合物增加编码组分1D元件的质粒。转染后2天，基于GFP荧光，FAC分选对Cas9-P2A-GFP质粒摄取为阳性的细胞(图41b)。GFP分选的细胞进一步扩增超过7天，此后，在FACS机上分析细胞，并且分选各个BFP和RFP阳性细胞并扩增以代表一组单克隆(图41d)。
基于BFP和RFP表达维持以及组分1B单一整合入及组分1D单一整合入不同的AAVS1等位基因，选择单克隆系作为eAPC。细胞系ACL-472是维持BFP和RFP表达的代表性单克隆(图42c)。如实施例2中所述，对提取自单克隆ACL-472的DNA进行遗传表征，并且显示它们的基因组整合了组分1B和组分1D以及两种组分均整合入AAVS1位点(图43)。通过降落式数字PCR测定组分1B和组分D的拷贝数，其中测量组分1B、D和参比基因DNA分子的数目并且计算比率。单克隆ACL-472含有2个组分1B和D分子对3个参比基因分子的比率(表2)。当考虑到建立者HEK293细胞系具有近三倍体核型时，这表明组分1B单一整合入及组分1D单一整合入ACL-472细胞系。
总之，基因修饰的ACL-472细胞系是HLA-ABC无效并含有单拷贝的为RMCE设计的人造基因组接受位点(组分1B和组分1D)并且因此显示具有两个独特合成整合接受位点的eAPC的产生。
实施例4：用一个整合对偶一步构建的其中组分1C’编码单一HLAI ORF的eAPC-p
这里，描述如何用一个整合对偶一步构建eAPC-p，其中基因组接受位点(组分1B)是天然基因组位点并且遗传供体载体组分1C’包含编码一个分析物抗原呈递复合体(aAPX)的单一ORF。
在这个实施例中，eAPC是基因修饰的ARH-77细胞系，命名为ACL-128，其中突变了两个APX家族，主要HLA I类家族和HLA II类。建立者细胞系ARH-77是衍生自浆细胞白血病的B淋巴母细胞，其显示强烈的HLA-A,B,C和HLA-DR,DP,DQ细胞表面表达。细胞遗传学分析显示建立者ARH-77细胞系具有近二倍体核型，还展示染色体6p21(编码HLA基因座的区域)缺失。ARH-77基因座的DNA测序证实，ARH-77仅编码HLA-A、HLA-B和HLA-C和HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA和HLA-DPB基因家族的单一等位基因。
使用实施例1中描述的方法，通过采用靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C和HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA和HLA-DPB基因家族的gRNA，通过CRISPR/cas9定向诱变，产生HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效细胞系ACL-128。用泛抗HLA-ABC或泛抗HLA-DR、DP、DQ进行表面标记，证实ACL-128缺少两个APX家族的表面表达，分别为图44b和图45和图47b。
在这个实施例中，基因组接受位点(组分1B)是天然AAVS1基因组位点并且通过HDR实现定向整合。遗传供体载体(组分1C)借助编码AAVS1左同源臂和右同源臂的组分1C,匹配于组分1B，所述臂各自包含与AAVS1基因组座位同源的>500bp序列。在AAVS1左同源臂和右同源臂之间，质粒编码CMV启动子和SV40终止子。目的aAPX克隆在该启动子和终止子之间，产生组分1C’。这个实施例中，组分1C’包含编码一个aAPX(HLA-A*24:02或HLA-B*-07:02)的单一ORF，分别称作组分1C’HLA-A*24:02和组分1C’HLA-B*-07:02。
构建eAPC-p的过程为借助HDR诱导组分1C’整合入组分1B以产生组分1B’。用质粒电穿孔细胞系ACL-128，所述质粒编码靶向AAVS1基因座的最佳gRNA、Cas9-P2A-GFP和组分1C’。电穿孔后2天，基于GFP荧光，FAC分选对Cas9-P2A-GFP质粒摄取为阳性的细胞(图44a)。GFP分选的细胞进一步扩增超过7天，从而允许足够时间供HDR发生和丢失aAPX的瞬时表达。在这种生长期后，将细胞用泛HLA-ABC抗体染色，导致鉴定在其表面上获得分析物HLA表达的细胞(图44b)。泛HLA-ABC抗体染色的存在暗示，在组分1C’中编码的分析物HLA ORF已经整合至基因组中。分选各个HLA-ABC阳性染色的细胞并扩增以代表一组eAPC-p单克隆。
基于分析物HLA表面表达维持以及分析物ORF整合入基因组接受位点产生组分1B’，选择各个单克隆系作为eAPC-p。细胞系ACL-321和ACL-331是分别维持HLA-A*24:02或HLA-B*-07:02分析物HLA表面表达的代表性单克隆(图45)。对提取自所选择的单克隆ACL-321、ACL-327、ACL-331和ACL-332的DNA进行遗传表征，并显示它们的基因组整合了组分1C’并且显示整合发生在AAVS1基因组接受位点中产生组分1B’(图46)。使用对组分1C’特异的引物，通过检测到具有预期大小的PCR扩增子，确证基因组整合(图46a)。利用针对以下AAVS1基因组序列设计的引物和对连接于分析物HLA ORF的SV40pA终止子特异的引物，通过检测到具有预期大小的PCR扩增子，确认存在组分1B’，其中所述基因组序列远离同源臂编码的区域(图46b)。
总之，在基因组接受位点(组分1B’)内部分别含有aAPX HLA-A*24:02或HLA-B*-07:02ORF拷贝的基因修饰ACL-321和ACL-331细胞系的产生，导致所述分析物aAPX是在细胞表面上表达的唯一主要HLA I类成员。因此，这表明使用多组分系统产生了两种确定的eAPC-p细胞系。
实施例5：用一个整合对偶一步构建的其中组分1C’编码配对HLAII ORF的eAPC-p
这里，描述如何用一个整合对偶一步构建eAPC-p，其中基因组接受位点(组分1B)是天然基因组位点并且遗传供体载体组分1C’包含编码二条aAPX链的单一ORF。
这个实施例使用eAPC(ACL-128)和组分1B，二者均在实施例4中定义。但是，组分1C’包含单一ORF，其编码通过病毒自我剪切性肽元件与HLA-DRB1*01:01等位基因连接的HLA-DRA*01:01等位基因，或通过病毒自我剪切性肽元件与HLA-DPB1*04:01等位基因连接的HLA-DPA1*01:03等位基因，分别称作组分1C’HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01和组分1C’HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01。病毒自我剪切性肽元件编码一个肽序列，当转录时，所述肽序列导致合成的肽自我剪切并且产生定义每条HLA链的两个多肽。
在实施例4，描述了构建eAPC-p的过程，例外在于:通过用泛抗HLA-DR,DP,DQ抗体进行细胞表面标记，评估在其表面上获得分析物HLA表达的细胞的鉴定过程(图47)。泛抗HLA-DR,DP,DQ抗体染色的存在暗示，在组分1C’中编码的分析物HLA ORF已经整合至基因组中。分选各个HLA-DR,DP,DQ阳性染色的细胞并扩增以代表一组eAPC-p单克隆。
如实施例4中所述，基于分析物HLA表面表达维持以及分析物ORF整合入基因组接受位点产生组分1B’，选择单克隆系作为eAPC-p。细胞系ACL-341和ACL-350是分别维持HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01或HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01分析物HLA表面表达的代表性单克隆(图48)。
总之，在基因组接受位点(组分1B’)内部分别含有aAPX HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01或HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01ORF拷贝的基因修饰ACL-341和ACL-350细胞系的产生,导致所述分析物aAPX是在细胞表面上表达的唯一主要HLA II类成员。因此，这表明使用多组分系统产生了两种确定的eAPC-p细胞系。
实施例6：用一个整合对偶一步构建的其中组分1B是合成构建体的eAPC-p。
这里，描述如何用一个整合对偶一步构建eAPC-p，其中基因组接受位点(组分1B)是为RMCE基因组位点设计的合成构建体并且遗传供体载体组分1C’包含编码一种aAPX的单一ORF。
在这个实施例中，基因组整合位点，组分1B，包含选择的遗传元件。两个独特异特异性重组酶位点(FRT和F3)，所述位点侧置于编码选择标记——蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF的侧翼。在FRT位点的5’编码的是EF1a启动子并且在F3位点的3’编码的是SV40多聚腺苷化信号终止子。通过电穿孔用如实施例2中所述的相同质粒，在细胞系ACL-128中整合遗传元件组分1B。如实施例2中所述，基于BFP表达维持，选择各个单克隆系，并且遗传表征以含有组分1B向所需的AAVS1基因组位置的单一整合(图49a)。所得到的eAPC细胞系，ACL-385，是HLA-ABC无效和HLA-DR,DP,DQ无效并且含有单拷贝的为RMCE设计的人造基因组接受位点，组分1B。
遗传供体载体(组分1C)匹配于组分1B，因为组分1C编码相同的异特异性重组酶位点，FRT和F3。目的aAPX ORF，紧邻起始密码子之前还编码kozak序列，被克隆在两个异特异性重组酶位点之间，并且产生组分1C’。这个实施例中，组分1C’包含编码一个aAPX(HLA-A*02:01)的单一ORF，称作组分1C’FRT:HLA-A*02:01:F3。
通过用编码Tyr-重组酶Flp的质粒连同组分1C’FRT:HLA-A*02:01:F3对细胞系ACL-385进行电穿孔，借助RMCE产生eAPC-p。在电穿孔后4-10天，分选了HLAI表面表达阳性和组分1B选择标记编码的荧光蛋白标记BFP阴性/减少的独立细胞。基于其维持HLAI等位基因表达和BFP荧光丢失(这表明预期的RMCE发生)，选择各个长成的单克隆系。为了鉴定这类单克隆，进行表型检测和基因检测。首先，对全部单克隆细胞系筛选细胞表面HLA-ABC表达和缺少BFP荧光(图49)。自这类细胞系例如ACL-421和ACL-422提取基因组DNA，并且通过检测到组分1B’特异性PCR产物，证实组分1C’整合入组分1B中产生组分1B’(图50)。
总之，在人造基因组接受位点(组分1B’)内部分别含有aAPX HLA-A*02:01ORF拷贝的基因修饰ACL-421和ACL-422细胞系的产生，导致所述分析物aAPX是在细胞表面上表达的唯一主要HLA I类成员。因此，这表明使用多组分系统产生了两种确定的eAPC-p细胞系。
实施例7：按两个步骤用两个整合对偶构建的eAPC-pa
这里，描述如何按两个步骤构建eAPC-pa。步骤1，其中基因组接受位点(组分1B)是天然基因组位点并且遗传供体载体组分1C’包含编码一种aAPX的单一ORF。步骤2，其中基因组接受位点(组分1D)是第二天然基因组位点并且遗传供体载体组分1E’包含编码一种分析物抗原分子(aAM)的单一ORF。
在这个实施例中，进行步骤1，其中，eAPC是ACL-128，基因组接受位点(组分1B)是突变的HLA-A等位基因基因组位点，命名为HLA-A无效，并且通过HDR实现定向整合。遗传供体载体(组分1C)借助编码HLA-A无效左同源臂和右同源臂的组分1C匹配于组分1B，所述臂各自包含与HLA-A无效基因组座位同源的>500bp序列。在HLA-A无效左同源臂和右同源臂之间，质粒编码CMV启动子和SV40终止子。目的aAPX克隆在该启动子和终止子之间，产生组分1C’。这个实施例中，组分1C’包含编码一个aAPX(HLA-A*02:01或HLA-B*-35:01)的单一ORF，分别称作组分1C’HLA-A*02:01和组分1C’HLA-B*-35:01。
如实施例4中所述，将组分1C’整合入组分1B并选择单克隆eAPC-p细胞系，例外是：靶向HLA-A无效基因组座位的gRNA用来促进HDR整合组分1C’到组分1B中。单克隆eAPC-p ACL-191和ACL-286在细胞表面分别表达HLA-A*02:01或HLA-B*-35:01(图51a)。
在这个实施例中，进行步骤2，其中，基因组接受位点(组分1D)是天然AAVS1基因组位点并且通过HDR实现定向整合。遗传供体载体(组分1E)借助编码AAVS1左同源臂和右同源臂的组分1E匹配于组分1D，所述臂各自包含与AAVS1基因组座位同源的>500bp序列。在AAVS1左同源臂和右同源臂之间，质粒编码CMV启动子和SV40终止子。目的aAM克隆在该启动子和终止子之间，产生组分1E’。这个实施例中，组分1E’包含编码选择标记GFP的单一ORF，其与编码hCMV-pp65的aAM ORF连接，称作组分1E’GFP:2A:pp63。病毒自我剪切性肽元件编码一个肽序列，当转录时，所述肽序列导致合成的肽自我剪切并且产生两个多肽——GFP和胞内hCMV-pp65蛋白。
如实施例4中所述，将组分1E’整合入组分1D。基于其维持的选择标记GFP表达，将单克隆系ACL-391和ACL-395选择作为eAPC-pa(图51b)。
总之，产生了基因修饰的ACL-391和ACL-395细胞系，其在基因组接受位点(组分1B’)内部分别含有aAPX HLA-A*02:01或HLA-B*-35:01ORF拷贝和在基因组接受位点组分1D’内部含有aAM ORF pp65。这些基因修饰导致所述aAPX是在以下细胞的细胞表面上表达的唯一主要HLA I类成员，其中所述细胞还表达所述aAM。因此，这表明使用多组分系统产生了两种确定的eAPC-pa细胞系。
实施例8：一步构建的其中组分1C’编码单一HLAI ORF的eACP-p。
这里，描述借助单一整合对偶事件，一步使eAPC转化成eAPC-p，以整合编码分析物抗原呈递复合体(aAPX)的单一HLAI ORF，其中，所述eAPC含有为基于RMCE的基因组整合所设计的两个人造基因组接受位点：组分1B和组分1D。产生的eAPC-p具有一个被HLAI ORF占据的基因组接受位点(组分1B’)，而剩余的组分1D可用于另外的整合对偶事件。
这个实施例使用在实施例3中产生的eAPC(ACL-402)，其含有组分1B和1D，其中组分1B包含两个独特异特异性重组酶位点，F14和F15，所述位点侧置于编码选择标记——红色荧光蛋白(RFP)的ORF的侧翼。在F14位点的5’编码的是EF1a启动子并且在F15位点的3’编码的是SV40多聚腺苷化信号终止子。组分1D包含两个独特异特异性重组酶位点FRT和F3，其侧置于编码选择标记——蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF的侧翼。在FRT位点的5’编码的是EF1a启动子并且在F15位点的3’编码的是SV40多聚腺苷化信号终止子。
这个实施例利用包含异特异性重组酶位点F14和F15并且因此匹配于组分1B的组分1C遗传供体载体。从组分1C产生两个独立组分1C’，其中一个载体(V4.H.5)在F14/F15位点之间包含Kozak序列、起始密码子和编码HLA-A*02:01的aAPX ORF，并且其中第二载体(V4.H.6)在F14/F15位点之间包含Kozak序列、起始密码子和编码HLA-A*24:02的aAPX ORF。
通过电穿孔，将eAPC(ACL-402)独立地与编码表达RMCE重组酶(Flp，V4.1.8)的载体和分别V4.H.5或V4.H.6的组分1C’组合。将细胞培养4-10天，选择细胞并基于细胞表面上整合选择标记(RFP)的丢失和HLAI的获得来分选。随后，基于获得HLAI表面表达和丢失RFP荧光(这表明预期的组分1B转化成1B’已经发生)，表征、确认和选择独立长成的单克隆系。与亲本ACL-402细胞系相比，选择的eAPC-p单克隆ACL-900(V4.H.5，HLA-A*02:01)和ACL-963(V4.H.6，HLA-A*24:02)为RFP阴性并且维持HLAI表面表达(图53a)。另外，两个单克隆均保留BFP整合选择标记的表达，这表明组分1D保持未对偶并与组分1B整合对偶事件分离。为了进一步表征eAPC-p单克隆，从细胞提取基因组DNA，并且通过检测对组分1B’特异的PCR产物，确认在组分1C’和组分1B之间的整合对偶，产生组分1B’(图53b)。引物设计成靶向与基因组接受位点毗邻的区域(引物ID 8.B.3)和整合对偶事件内部的区域(引物ID 15.H.2)。仅在特异性整合的情况下，扩增才发生，而无产物从对照(ACL-3)或从脱靶重组产生。
总之，使用多组分系统，这个实施例展示了eAPC转化成eAPC-p的两个具体实例，其中两种不同的aAPX被分别递送(组分1C’)并通过RMCE基因组整合方法整合入单一基因组接受位点(组分1B)，随后产生包含两种不同eAPC-p的有限文库。另外，说明第二基因组接受位点(组分1D)隔绝于并且不受组分1B/组分1C’整合对偶影响。
实施例9：一步从eAPC-p构建的eAPC-pa，其中组分1D’编码单一分析物抗原分子(aAM)ORF。
本实施例描述如何从(实施例8中描述的)亲本eAPC-p平行构建多个eAPC-pa，其中靶向基因组接受位点(组分1D)用于通过引发的遗传供体载体(组分1E’)整合，所述载体包含编码aAM的单一ORF。
在本实施例中，使用的亲本eAPC-p系是ACL-900，其表达在组分1B’处整合的单一aAPX(HLA-A*02:01)(实施例8中描述)。eAPC-p组分1D保持空敞并且包含两个独特异特异性重组酶位点(FRT和F3)，所述位点侧置于编码选择标记即蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF。FRT位点的5’编码EF1a启动子并且在F15位点的3’编码SV40多聚腺苷化信号终止子。遗传供体载体(组分1E)用于该实施例中并且包含两个异特异性重组酶位点F14和F15，因此匹配于组分1D。在这个实施例中，将组分1E用选自HCMVpp28(V9.E.6)、HCMVpp52(V9.E.7)或HCMVpp65(V9.E.8)(还各自编码C末端甘氨酸-丝氨酸丰富接头和c-myc标签)的一个目的aAM ORF进一步引发。另外，每种组分1E’还包含紧邻aAM ORF 5’的Kozak序列和起始密码子。因此，产生组分1E’的小型分立文库，其包含三个载体。
通过电穿孔，将eAPC-p(ACL-900)独立地与编码RMCE重组酶表达的载体(Flp，V4.1.8)和V9.E.6、V9.E.7或V9.E.8的每种组分1E’组合。将细胞温育4-10天以允许整合对偶发生，因此，选择各个eAPC-pa并且基于由组分1D编码的整合选择标记BFP的信号削弱，分选单一细胞(单克隆)(图54a)。随后，基于BFP表达丢失和维持HLAI表面表达(组分1B’处的aAPX)(图54b)(这表明预期的组分1D转化成1D’已经发生)，表征、确认和选择独立长成的单克隆eAPC-pa，为ACL-1219(pp28)、ACL-1227(pp52)和ACL-1233(pp65)。另外，维持aAPX表面表达表明，组分1B’不受影响并且与组分1D和组分1E’之间的整合对偶事件分离。为了进一步表征选择的eAPC-pa单克隆，提取基因组DNA，并且通过检测对组分1D’(10.D.1，15.H.4)特异的聚合酶链反应(PCR)扩增子产物，实施对组分1E’和组分1D之间整合对偶的确认，产生组分1D’。在图54c中，显示了代表这三种eAPC-pa中每种eAPC-pa的两个单克隆，其中观察到具有aAM ORF pp28(0.8kb)、pp52(1.5kb)和pp65(1.9kb)的预期大小的扩增子产物，这进一步证实预期的整合事件已经发生。
总之，使用多组分系统，这个实施例展示了eAPC-p转化成eAPC-pa的三个具体实施例，其中三种不同的aAM被分别递送(组分1E’)并通过RMCE基因组整合方法整合入单一基因组接受位点(组分1D)，随后产生了携带三个不同aAM ORF的三个分立eAPC-pa的小文库。另外，显示了事先加载的第二基因组接受位点(组分1B)隔绝并且不受组分1D/组分1E’整合对偶影响。
实施例10：鸟枪法整合多个分析物抗原分子ORF至eAPC-p中，以以单一步骤产生eAPC-pa汇总文库
此处描述如何将总体上编码多个aAM ORF(HCMVpp28、HCMVpp52和HCMVpp65)的已引发组分1E载体(组分1E’)的汇集物以单一步骤整合入(实施例8中描述的)亲本eAPC-p，以产生汇总eAPC-pa文库，其中每个单独细胞在组分1D’整合衍生自载体原始汇集物的单一随机分析物抗原ORF，从而每个eAPC-pa表达单一随机aAM，但是总体上，eAPC-pa汇总文库代表载体原始汇总文库中编码的全部aAM ORF。这种产生各自从载体汇集物中表达单一随机ORF的eAPC-pa汇集物的方法称作鸟枪法整合。
在这个实施例中，使用的亲本eAPC-p系是在细胞表面上表达aAPX(HLA-A*02:01)的ACL-905(实施例8中描述细胞系构建)，组分1D和组分1E’如实施例9中所述。在这个实施例中，实施例9的各个组分1E’载体：V9.E.6、V9.E.7和V9.E.8(其分别包含编码HCMVpp28、HCMVpp52和HCMVpp65的aAM ORF)按1:1:1摩尔比混合在一起，以产生载体汇集物。通过电穿孔，将eAPC-p(ACL-905)与该载体汇集物和编码RMCE重组酶表达的载体(Flp，V4.1.8)组合。将细胞温育4-10天，此后，基于已经削弱由组分1D编码的整合选择标记BFP的信号，大体分选细胞(图55a)，从而产生汇总细胞群体ACL-1050(图55b)。
为了证实eAPC-pa汇集物ACL-1050包含各自在组分1D’处编码HCMVpp28、HCMVpp52或HCMVpp65之一的eAPC-pa的混合物，对来自多克隆群体的各细胞进行单细胞分选并且随机选择12个供遗传表征。使用跨越每种aAM的引物(10.D.1和15.H.4)，实施组分1D’的扩增。在图55c中，展示对12个细胞生成的扩增子，设置对照，其中对于全部12个细胞，均观察到与aAM ORF之一：pp28(0.8kb)、pp52(1.5kb)和pp65(1.9kb)的预期大小相符的单一扩增子产物。另外，鉴定到每个aAM ORF至少一次，这表明eAPC-pa汇集物包含eAPC-pa的混合物，其中汇集物中的每个eAPC-pa已经整合了来自三个载体的原始汇集物中的单一随机aAM ORF。
总之，这个实施例表明了使用多组分系统通过将eAPC-p与编码三种不同分析物抗原分子的三个载体(组分1E’)的汇总文库并利用基于RMCE的鸟枪法整合方案，以单一步骤将eAPC-p转化成eAPC-pa汇总文库。另外，这个实施例表明，在生成的eAPC-pa汇集物中的每个eAPC-pa已经通过组分1D和组分1E’之间的整合对偶事件，整合了来自原始载体汇集物的单一随机aAM ORF，并且全部三个aAM ORF均在生成的汇总eAPC-pa文库中得到表现。
实施例11：一步产生eTPC-t的展示
本实施例描述按标准化方式产生eTPC-t，其中亲本eTPC含有不同的人造基因组接受位点组分2B和2D。在这个实施例和全部其他实施例中描述的全部eTPC亲本系均采用与上文实施例中所示eAPC细胞系相同的技术产生。遗传供体载体组分2C’和2E’包含了已知在HLA-A*02等位基因中呈递时接合衍生自人巨细胞病毒多肽65(HCMV pp65)的抗原性肽NLVPMVATV(NLVP)的TCR对(JG9-TCR)的单链。设计组分C’和E’用于RMCE，并且衍生自亲本组分2C和2E。
这个实施例使用亲本eTPC细胞系ACL-488，其为TCR无效、HLA无效、CD4无效和CD8无效并且还含有组分2B和2D。组分2B包含两个独特异特异性重组酶位点FRT和F3，所述位点侧置于Kozak序列和编码选择标记—蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF。在FRT位点的5’编码EF1a启动子并且在F3位点的3’编码SV40多聚腺苷化信号终止子。组分2D包含不同于组分2B的两个独特异特异性重组酶位点F14和F15。这些位点侧置于Kozak序列和编码选择标记—红色荧光蛋白(RFP)的ORF。在F14位点的5’编码EF1a启动子并且在F15位点的3’编码SV40多聚腺苷化信号终止子。
这个实施例使用遗传供体载体—组分2C’和组分2E’，各自分别包含两个异特异性重组酶位点FRT/F3(2C’)和F14/F15(2E’)，因此匹配于组分2B和2D。组分2C’还在FRT/F3位点之间包含Kozak序列、起始密码子和编码JG9-TCR-β链的TCR ORF。组分2E’还在F14/F15位点之间包含Kozak序列、起始密码子和编码JG9-TCR-α链的TCR ORF。
借助RMCE，通过电穿孔ACL-488(eTPC)，产生eTPC-t。电穿孔后四至十天，通过FACS分选出展示由组分2D和2B选择标记编码的荧光蛋白信号(BFP和RFP)削弱的独立细胞。使独立单克隆长成并且随后进行表型评估。所产生的单克隆ACL-851是BFP和RFP阴性的(图56a和b)。ACL-851还显示TCR和CD3表面表达，而亲本细胞系则否(图56c和e)。另外，引入的JG9-TCR显示HLA-A*02:01-NLVP四聚体特异性染色，这表明它是在eTPC-t的表面上有功能的TCRsp(图56d至f)。通过PCR确认ACL-851含有由整合至基因组中的组分2B’和组分2D’编码的TCRsp(图56g和h)。
总之，通过使用基于RMCE的整合方法，将eTPC转化成eTPC-t，其中所述方法使组分2C’和2E’中递送的TCR ORF整合，从而使组分2B和2D转化成组分2B’和2D’，并且从而这种eTPC-t在细胞表面上表达有功能的TCRsp。另外，这个实施例展示了简单eTPC:A系统的运行，其中组合eTPC-t和分析物抗原的二元组合物并且基于可溶性分析物抗原(HLA多聚体：HLA-A*02:01-NLVPMVATV)之间的复合体形成选择eTPC-t。
实施例12：使eTPC-t转化成eTPC-x的展示
本实施例描述eTPC-t转化成eTPC-x，其中eTPC-x具有编码TCR链ORF的组分2B’并且组分2D可用于整合互补TCR链ORF。通过使用匹配于组分2D’的遗传供体载体(组分2Z)，实现使eTPC-t的组分2D’转化成eTPC-x的组分2D。
在这个实施例中，使用在实施例11中产生的亲本eTPC-t细胞系ACL-851。组分2Z是包含匹配于组分2D’的两个异特异性重组酶位点F14/F15、Kozak序列、起始密码子和编码绿色荧光蛋白(GFP)作为整合选择标记的ORF的质粒载体。通过电穿孔，将eTPC-t与组分2Z和编码RMCE重组酶的载体组合，因此，随后对细胞选择CD3呈递作用丢失和获得整合GFP的选择标记。通过FACS对单克隆ACL-987进行表型特征，并且观察到ACL-987已经获得GFP并丢失CD3和TCRab(图57b、d)，这表明JG9-TCR-α与GFP ORF成功交换及组分2D’转化成组分2D，并且因此产生eTPC-x。相比而言，作为亲本eTPC-t的ACL-851缺少GFP表达并且具有CD3和TCRab表面表达(图57a、c)。
总之，这个实施例展示了eTPC-t转化成eTPC-x，同时移除组分2D’处的JG9-TCR-αTCR ORF以交换整合GFP的选择标记，因而产生组分2D，用于备选互补TCR链ORF的进一步整合偶联事件。使用基因组整合的RMCE方法，实施这个转化。
实施例13：鸟枪法整合入eTPC-x以产生eTPC-t汇集物的展示
本实施例描述如何将编码64个单一JG9-TCR-α变体(作为组分2E’)载体的汇集物作为单一步骤整合入(实施例12中描述的)亲本eTPC-x细胞系，以产生汇总eTPC-t文库，其中每种独立细胞整合来自载体原始汇集物的编码α链的单一随机TCR ORF，从而每个eTPC-t表达单一随机成对的TCR ORF作为TCRsp。合并单独的eTPC-t在一起，包含了eTPC-t汇总文库，其中细胞汇集物潜在地代表64个TCR-α与恒定原始TCRβ链配对的全部可能组合。这种方法现在称作‘鸟枪法’整合。已经通过修饰处于V片段和J片段交界的CDR3序列，产生64个JG9-TCR-α变体。
在这个实施例中，使用不表面表达JG9-TCR-β(组分2B’)和CD3复合体的亲本eTPC-x细胞系ACL-987(参见实施例12)。组分2D编码如实施例12中所述的选择标记GFP。在这个实施例中，将64个JG9-TCR-α变体片段克隆入组分2E供体载体，产生匹配于组分2D的组分2E’，其旁侧分布有F14/F15位点。64个载体随后合并成载体单一汇集物。
借助基于RMCE的基因组整合，产生eTPC-t汇集物，其中通过电穿孔，使eTPC-x(ACL-987)和64个组分2E’和RMCE重组酶载体组合。基于GFP表达选择多克隆。所产生的多克隆ACL-988包含GFP阳性细胞群体和GFP阴性细胞群体，不同于仅包含GFP阳性细胞的亲本系(图58a和b)。但是，仅GFP阴性群体显示始终强烈的CD3表达，这表明组分2D成功转化成组分2D’并且因此eTPC-x已经转化成eTPC-t汇集物(图58c和d)。另外，用JG9-TCR特异性多聚体试剂(DEX HLA-A*02:01-NLVP)染色时，ACL-988GFP阴性群体显示两种不同的强度，这显示该群体包含了表达结合效率不同的TCR变体的细胞。
平行地，将全部64个JG9-TCR-α变体克隆入允许对亲本eTPC-x(ACL-987)瞬时转染的表达构建体，并且相对于参比，对表达变体JG9-TCR的上述汇总eTPC-t中呈递的每个TCR对，测定针对HLA-A*02:01-NLVP多聚体试剂的相对染色单位(RSU)。RSU计算为CD3阳性群体对CD3阴性群体的HLA多聚体信号的平均荧光强度(MFI)比率，并且表示每种TCR链对变体的结合强度。用每个JG9-TCR-α变体独立转染亲本ACL-987系后，将细胞用针对CD3的抗体并用HLA-多聚体试剂染色，并且通过流式细胞术分析。图58e中作图的每个点代表对64个变体中每个变体观察到的RSU。
从HLA-多聚体阳性群体和HLA-多聚体阴性群体中，来自ACL-988汇集物的独立细胞接受单细胞分选。将每个单一细胞的编码变体JG9-TCR-αORF的组分2D’扩增并测序并且与上文描述的瞬时表达RSU单位的结果比较(图58e)。实际上，HLA-多聚体阳性的独立ACL-988细胞编码在单独测试的变体优势显示高RSU结果的JG9-TCR-α变体(图58e，空心圆圈)。另外，pHLA-多聚体阴性的独立ACL-988细胞编码优势显示低RSU结果的JG9-TCR-α变体(图58e，空心三角形)。
总之，这个实施例展示了多组分系统使eTPC-x和载体汇总文库(组分2E’)转化成含有多种不同TCRsp的eTPC-t汇总文库的用途。以单一步骤使用鸟枪法整合，实现了这点。另外，这个实施例显示，eTPC-t汇集物连同分析物抗原(作为可溶性亲和试剂)合并入eTPC:A系统，其中显示汇集物的各单一细胞可以基于与分析物抗原形成复合体(HLA-多聚体)来选择并且其中提取组分2D’中编码的后续TCR链ORF并且获得DNA序列。
实施例14-具有外源aAM的eAPC:eTPC组合系统中组分2F的功能展示
这里，描述了eTPC细胞系(ACL-1063，组分2A)，所述细胞系用两个独特基因组接受位点(组分2B，2D)工程化，经工程化成HLA无效，利用天然CD3表达，并且携带工程化基因组双组分、人造的反应元件(组分2F)。在这个实施例中，将eTPC细胞系如前述实施例11中那样转化成eTPC-t细胞系(ACL-1277)，其中组分2B’和2E’处的TCR链ORF编码对HLA-肽复合体(HLA)(HLA-A*02:01-NLVPMVATV)特异的TCR对。这种eTPC-t与上述的eAPC-p在可溶性肽形式的外源aAM存在下组合，以装配eAPC:eTPC系统。这些合并型系统的读出是eTPC-t中的RFP信号，其是来自组分2F的报道分子。
定义为组分2F的反应元件包含驱动物-激活物组分和放大物-报告组分，其中两个单元均利用人造启动子。驱动物是响应于天然TCR信号传导途径的人造启动子，其编码三组串联的NFAT-AP1-NFkB转录因子结合位点(3xNF-AP-NB)。当转录激活时，驱动物诱导激活蛋白(设计的合成转录因子)表达，其中通过融合疱疹病毒VP16激活结构域、GAL4DNA结合结构域和两个在N末端和C末端的核定位信号(NV16G4N)，衍生所述设计的合成转录因子，其相关DNA识别序列在放大物启动子中串联存在6次。驱动物启动子和放大物启动子均利用紧邻相应转录因子结合位点3’的来自HCMV IE1启动子的核心启动子序列(B识别元件(BRE)、TATA框、起始子(INR)和转录起始位点)。当转录激活时，放大物驱动报道分子红色荧光蛋白(RFP)表达。
随后针对呈递HLA-A*02:01(ACL-209)或HLA-A*24:02(ACL-963)的eAPC-p激发eTPC-t细胞系或它是HLA-无效亲本eAPC(ACL-128)。其中通过用肽NLVPMVATV或VYALPLKML分析物抗原脉冲或不用肽脉冲eAPC-p，制备分析物eAPC-pa。随后，将eTPC-t和分析物eAPC-pa编纂入eAPC:eTPC系统，所述系统由与10,000个eAPC-pa共培养24小时的30,000个eTPC-t组成。在24小时后，将细胞收获，洗涤，用针对eTPC-t和分析物eAPC-pa特异的标记染色以区分群体，并通过流式细胞术分析。仅在呈递已知相关抗原pHLA复合体的分析物eAPC-pa(即具有HLA-A*02:01和NLVPMVATV的eAPC-pa)激发的eTPC-t中观察到eTPC-t组分2F的强烈活化(图59a)。相反，在包含非特异性分析物eAPC-pa(图59b、c、d)或缺少HLA的对照亲本eAPC(图59f)或缺少外源aAM肽的eAPC-p(图59e)的eAPC:eTPC编纂物中仅观察到静息状态RFP表达。
总之，工程化了含有具有功能的组分2F的eTPC-t细胞系，并且该细胞系随后用来产生eTPC-t。一旦eTPC-t与呈递其相关靶T细胞抗原(作为外源可溶解性aAM提供)的分析物eAPC-pa相互作用，则应答作为RFP表达增加可度量。相反，与不呈递相关T细胞抗原和HLA或无HLA的分析物eAPC或eAPC-p或eAPC-pa接触时，eTPC-t不展示高于背景的可度量RFP表达增加。另外，这个实施例展示了一种eAPC:eTPC系统，其中分析物eAPC-pa和分析物eTPC-t在分立的二元组合物中编纂并且eTPC-t应答用来鉴定其中TCRsp和分析物抗原之间出现合作性复合体的分析物eAPC-pa和eTPC-t。
实施例15：具有aAM ORF整合至eAPC-pa状态的eAPC:eTPC组合系统中组分2F的功能展示
本实施例描述eTPC-t(ACL-1150)(组分2A)的用途，所述eTPC-t用两个独特基因组接受位点工程化，在组分2B’和2E’处加载有编码对HLA-肽复合体(HLA)，HLA-A*02:01-NLVPMVATV特异的TCR对的TCR链ORF，利用天然CD3表达，并且携带基因组单组分的人造反应元件(组分2F)，后者被编纂入具有eAPC-pa的eAPC:eTPC系统，其中通过与位点1D’处整合的编码aAM的ORF整合，产生所述eAPC-pa。在这个实施例中，用两种不同HLA等位基因和衍生自HCMV基因组的两种不同aAM ORF装配四个不同的eAPC-pa变体；产生四个不同的eAPC-pa细胞系。
反应元件定义为包含驱动物-报道分子组分的组分2F。驱动物是人造启动子，其响应于天然TCR信号传导途径，编码六组串联的NFAT-AP1转录因子结合位点(6xNF-AP)并利用紧邻相应转录因子结合位点3’的来自HCMV IE1启动子的核心启动子序列(B识别元件(BRE)、TATA框、起始子(INR)和转录起始位点)。一旦转录激活，驱动物诱导报道分子红色荧光蛋白(RFP)表达。
第一eAPC-pa系(ACL-1046)表达HLA-A*02:01和HCMV蛋白pp65全长ORF，其中在HLA-A*02:01中呈递时，pp65含有eTPC-t TCRsp识别的抗原性肽。第二eAPC-pa系(ACL-1044)表达HLA-A*02:01和HCMV蛋白pp52全长ORF。第三eAPC-pa系ACL-1045表达HLA-B*07:02和HCMV蛋白pp52全长ORF。第四eAPC-pa系(ACL-1048)表达HLA-B*07:02和HCMV蛋白pp65全长ORF。第二、第三和第四eAPC-pa表达eTPC-t TCRsp不识别的aAPX:aAM复合体。
将eTPC-t细胞系ACL-1150编纂入独立的eAPC:eTPC系统，后者具有如上文所述的四种eAPC-pa的每一者。在48小时后，将细胞收获，洗涤，用针对eTPC-t和分析物eAPC-pa特异的标记染色以区分群体，并通过流式细胞术分析。仅在呈递已知相关抗原pHLA复合体的分析物eAPC-pa(即具有HLA-A*02:01和pp65的eAPC-pa)激发的eTPC-t中观察到eTPC-t组分2F的强烈活化(图60b)。相反，在包含非特异性分析物eAPC-pa的eAPC:eTPC编纂物中仅观察到静息状态RFP表达(图60a、c、d)。
总之，工程化了含有具有功能的组分2F的eTPC-t细胞系，并且该细胞系随后用来产生eTPC-t。一旦使eTPC-t与呈递其相关靶T细胞抗原(通过整合作用，以内源aAM ORF提供)的分析物eAPC-pa相互作用，则应答作为RFP表达增加可度量。相反，与不呈递相关T细胞抗原和HLA的分析物eAPC-pa接触时，eTPC-t不展示高于背景的可度量RFP表达增加。另外，这个实施例展示了一种eAPC:eTPC系统，其中分析物eAPC-pa和分析物eTPC-t在分立的二元组合物中编纂并且eTPC-t应答用来鉴定TCRsp和分析物抗原之间出现合作性复合体的分析物eAPC-pa和eTPC-t。
序列表
<110>Genovie AB
<120>发现和表征T细胞受体与相关抗原相互作用的工程化两部分细胞装置
<130>ANO15
<160>104
<170>BiSSAP 1.3
<210>1<223>分析物抗原性肽
<210>2<223>分析物抗原性肽
<210>3<223>HCMV抗原
<210>4<223>HCMV抗原
<210>5<223>pcDNA3.1_GFP载体V1.A.4
<210>6<223>pcDNA3.1_RFP载体V1.A.6
<210>7<223>pMA-SV40pA载体V1.C.2
<210>8<223>pMA-CS-JG9-TCRβ载体V3.C.5
<210>9<223>pMA-F14-GFP-F15载体V4.H9
<210>10<223>pMA-F14-TCR-JG9-α-F15载体V7.A.3
<210>11<223>pMA-FRT-TCR-JG9-β-F3载体V7.A.4
<210>12<223>F14-TCRaF15CDR3degen.64mix载体V8.F.8
<210>13<223>CMVpro-Flp-sv40pA-V2载体V4.I.8
<210>14<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A1的CDR3序列
<210>15<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A2的CDR3序列
<210>16<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A3的CDR3序列
<210>17<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A4的CDR3序列
<210>18<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A5的CDR3序列
<210>19<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A6的CDR3序列
<210>20<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A7的CDR3序列
<210>21<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A8的CDR3序列
<210>22<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B1的CDR3序列
<210>23<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B2的CDR3序列
<210>24<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B3的CDR3序列
<210>25<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B4的CDR3序列
<210>26<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B5的CDR3序列
<210>27<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B6的CDR3序列
<210>28<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B7的CDR3序列
<210>29<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B8的CDR3序列
<210>30<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C1的CDR3序列
<210>31<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C2的CDR3序列
<210>32<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C3的CDR3序列
<210>33<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C4的CDR3序列
<210>34<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C5的CDR3序列
<210>35<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C6的CDR3序列
<210>36<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C7的CDR3序列
<210>37<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D1的CDR3序列
<210>38<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D2的CDR3序列
<210>39<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D3的CDR3序列
<210>40<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D4的CDR3序列
<210>41<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D5的CDR3序列
<210>42<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D6的CDR3序列
<210>43<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D7的CDR3序列
<210>44<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D8的CDR3序列
<210>45<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E1的CDR3序列
<210>46<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E2的CDR3序列
<210>47<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E3的CDR3序列
<210>48<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E4的CDR3序列
<210>49<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E5的CDR3序列
<210>50<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E6的CDR3序列
<210>51<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E7的CDR3序列
<210>52<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E8的CDR3序列
<210>53<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F1的CDR3序列
<210>54<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F2的CDR3序列
<210>55<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F3的CDR3序列
<210>56<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F4的CDR3序列
<210>57<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F5的CDR3序列
<210>58<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F6的CDR3序列
<210>59<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F7的CDR3序列
<210>60<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F8的CDR3序列
<210>61<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G1的CDR3序列
<210>62<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G2的CDR3序列
<210>63<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G3的CDR3序列
<210>64<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G4的CDR3序列
<210>65<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G5的CDR3序列
<210>66<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G6的CDR3序列
<210>67<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G7的CDR3序列
<210>68<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G8的CDR3序列
<210>69<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H1的CDR3序列
<210>70<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H2的CDR3序列
<210>71<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H3的CDR3序列
<210>72<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H4的CDR3序列
<210>73<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H5的CDR3序列
<210>74<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H6的CDR3序列
<210>75<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H7的CDR3序列
<210>76<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H8的CDR3序列
<210>77<223>pMA_F14_HLA-A*02:01-6xHis_F15载体V4.H.5
<210>78<223>pMA_F14_HLA-A*24:02-6xHis_F15载体V4.H.6
<210>79<223>pMA_F14_HLA-B*07:02-6xHis_F15载体V4.H.7
<210>80<223>pMA_F14_HLA-B*35:01-6xHis_F15载体V4.H.8
<210>81<223>FRT_HCMVpp28-3xMYC_F3载体V9.E.6
<210>82<223>FRT_HCMVpp52-3xMYC_F3载体V9.E.7
<210>83<223>FRT_HCMVpp52-3xMYC_F3载体V9.E.8
<210>84<223>SpCas9-2A-GFP载体V1.A.8
<210>85<223>HLA-A-sg-sp-opti1载体V2.A.1
<210>86<223>HLA-B-sg-sp-3载体V2.A.7
<210>87<223>HLA-C-sg-sp-4载体V2.B.3
<210>88<223>HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_1载体V2.I.10
<210>89<223>HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2载体V2.J.1
<210>90<223>AAVSI_sg-sp-opti_3载体V2.J.6
<210>91<223>TRAC-GT-F1ddPCR引物/探针
<210>92<223>TRAC-GT-R1ddPCR引物/探针1.F.8
<210>93<223>TRAC-探针-FAM ddPCR引物/探针
<210>94<223>TRBC2-GT-F1ddPCR引物/探针1.F.9
<210>95<223>TRBC2-GT-R1ddPCR引物/探针1.F.10
<210>96<223>TRBC2-探针-FAM ddPCR引物/探针1.G.2
<210>97<223>TRAC-TCRA-ex1-F1ddPCR引物/探针10.A.9
<210>98<223>TRAC-TCRA-ex1-F1ddPCR引物/探针10.A.10
<210>99<223>TRAC-探针(HEX)ddPCR引物/探针10.B.6
<210>100<223>HCMVpp65_GT_F2ddPCR引物/探针21.I.1
<210>101<223>HCMVpp28_GT_F1ddPCR引物/探针21.I.2
<210>102<223>HCMVpp52_GT_F1ddPCR引物/探针21.I.3
<210>103<223>Myc-Tag_GT_R1ddPCR引物/探针20.H.10
<210>104<223>接头-Myc_Probe_Fam ddPCR引物/探针20.H.9
缩略语列表
aAPX 分析物抗原呈递复合体
aAM 分析物抗原性分子
aCT 分析物TCR
APC 抗原呈递细胞
APX 抗原呈递复合体
BFP 蓝色荧光蛋白
CAR-T CAR T细胞
CM 载货分子.
CRISPR 成簇规律间隔的短回文重复序列
gRNA Cas9向导RNA
CAR 嵌合抗原受体
CDR 互补决定区
C-区域 恒定区
CMV 巨细胞病毒
DAMPS 危险相关分子样式
DC 树状细胞
DNA 脱氧核糖核酸
D-区域 多样化区域
eAPC 工程化抗原呈递细胞
eAPC-p 呈递分析物抗原呈递复合体的工程化抗原呈递细胞
eAPC-pa 呈递分析物抗原呈递复合体和分析物抗原性分子的工程化抗原呈递细胞
eAPC-a 表达分析物抗原性分子的工程化抗原呈递细胞
eAPCS 工程化的抗原呈递细胞系统
eTPC 工程化TCR呈递细胞
eTPCS 工程化TCR呈递细胞系统
eTPC-t 呈递全长TCR对的工程化TCR呈递细胞
FACS 荧光激活的细胞分选法
GEM T细胞 种系编码的分枝酰反应性T细胞
GFP 绿色荧光蛋白
HLAI HLA I类
HLAII HLA II类
HDR 同源定向重组
HLA 人白细胞抗原
IgSF 免疫球蛋白超家族
IRES 内部核糖体进入位点
iNK T细胞 不变性天然杀伤T细胞
J-区域 连接区
MACS 磁激活的细胞分选
MAGE 黑素瘤相关抗原
MAIT 粘膜相关的不变性T
NCBP 不基于细胞的粒子
ORF 可读框
PAMPS 病原体相关的分子模式
PCR 聚合酶链反应
RMCE 重组酶介导的盒交换
RFP 红色荧光蛋白
DNA 核糖核酸
SH2 Src同源性2
T细胞 T淋巴细胞
TCR T细胞受体
TRA TCRα
TRB TCRβ
TRD TCRδ
TCRsp 与CD3复合的TCR表面蛋白
TALEN 转录激活物样效应核酸酶
TRG TRCγ
TAA 肿瘤相关抗原
V区 可变区
β2M β2-微球蛋白
ZAP-70 70kDaζ链相关蛋白
定义
成对互补TCR链：二条TCR链，其中翻译的蛋白质能够在TCR呈递细胞的表面上形成TCRsp
亲和力：两个或更多个分子或蛋白质之间相互作用的动力学参数或平衡参数
亲和试剂：设计成对分析物具有特定亲和力的任何试剂。经常在HLA-抗原复合体的亲和力背景下中使用
等位基因：给定基因的变体形式
AM：分析物抗原性分子。通常由细胞从其基因组DNA和/或引入的特定遗传序列表达的蛋白质，但还可能是代谢物。AM在细胞中表达并且片段随后可以由APX作为载货或本身呈递在细胞表面上。作为载货或者不作为载货，AM随后可以是携带T细胞受体的细胞或相关亲和试剂的靶。
扩增子：使用多种方法(包括PCR)时作为人工扩增的来源和/或产物的一段DNA或RNA。
分析物：在组合系统中令人感兴趣地鉴定和/或测量和/或查询的实体
抗体：由免疫系统的特化细胞(称作B细胞)表达和含有两条链的亲和分子。B细胞表达非常大和非常多样性的抗体组库，所述抗体通常不结合自身蛋白质，而可以结合并中和将威胁宿主的病原体或毒素。天然抗体或人工工程化的抗体经常用作亲和试剂。
抗原：可以由TCR接合并且在T细胞中导致信号转导的任何分子，经常由抗原呈递复合体呈递。
分析物抗原：总体上代表任何实体呈递抗原供分析性确定的eAPC:eTPC系统
APC：抗原呈递细胞。在细胞表面上携带AM、APX、APX的细胞
APX：抗原呈递复合体。由有核细胞从基因/编码ORF的基因组DNA和/或引入的特定遗传序列表达并呈递在细胞表面上的蛋白质。APX呈递作为肽或其他代谢物分子的载货。
C-区域：恒定区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。c-区域是在免疫系统中定义其一般功能而非驱动TCR多样性的独特区段。
载货加载装置：从细胞中存在的蛋白质或其他已呈递分子产生载货分子并使其加载于APX上的一套细胞蛋白质。
CDR：互补决定区。在TCR和抗体的面向抗原的末端上执行大部分靶结合功能的短序列。每种抗体和TCR含有六个CDR并且它们通常是分子的最可变部分，允许检测庞大数目的多样性靶分子。
CM：载货分子。由抗原呈递复合体(例如HLA I或HLA II)呈递的肽或代谢物。CM可以由细胞从基因组DNA固有表达，被引入培养基或从特异性引入的基因序列表达。
拷贝数：在细胞的基因组中编码的定义序列的存在整数
细胞遗传学：与染色体结构和功能有关的遗传研究，即确定细胞的核型
细胞毒的/细胞毒性：其中T细胞释放直接和特异性损伤靶细胞的因子的过程。
D-区域：多样化区域。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
DNA：脱氧核糖核酸。形成编码基因和蛋白质的遗传物质的分子的化学名称。
eAPC系统：eAPCS，籍此制备eAPC-pa、eAPC-p和eAPC-a细胞或其文库以便在eAPC:eTPC系统中组合的系统。
eTPC系统：eTPCS是籍此制备eTPC-t细胞或其文库以便在eAPC:eTPC系统中组合的系统。
eAPC:eTPC系统：将eAPC呈递的分析物抗原和eTPC呈递的分析物TCR籍此组合的系统
内源的：源自细胞中的物质
工程化的细胞：基因组已经通过基因修饰过程工程化的细胞。
真核条件性调节元件：可以影响启动子的活性的DNA序列，所述启动子在限定条件下可能被诱导或阻遏。
真核启动子：编码RNA聚合酶结合位点及反应元件DNA序列。启动子区的序列控制RNA聚合酶和转录因子结合，因此启动子在确定何处和何时您的目的基因将表达方面发挥巨大作用。
真核终止子/信号终止子：与RNA聚合酶II结合并触发转录过程终止的蛋白质因子识别的DNA序列。它还编码聚腺苷酸信号。
FACS/流式细胞术：荧光激活的细胞分选法。籍此可以对独立细胞分析特定细胞表面标记和胞内标记表达的分析技术。该技术的变型，细胞分选，允许取回携带限定标记集合的细胞供进一步分析。
APX家族：编码构成抗原呈递复合体的功能相关蛋白质的一套数个相似基因。
荧光(蛋白)标记：具有特定消光特征和发射特征并且可以用显微术、FACS和相关技术检测到的分子。
遗传供体载体：用于递送遗传物质至基因组接受位点的基于遗传学的载体
基因组接受位点：基因组中用于定向整合在遗传供体载体内部编码的供体遗传物质的位点。
异特异性重组酶位点：由重组酶识别以促进两个DNA分子交叉互换的DNA序列
HLA I：人白细胞抗原I类。在人体的全部有核细胞中表达并将表达产物输出到细胞表面上的基因，在所述细胞表面，它将内部蛋白质的短片段、肽作为载货呈递至T细胞受体。就这一点而论，它提供潜在持续感染性片段连同固有蛋白质。HLA I可以额外地将添加至培养基、从表达自所引入遗传元件的蛋白质产生或从细胞摄取的蛋白质产生的肽作为载货呈递。HLA I类基因呈多态性，这意味着不同个体可能在相同基因中具有变异，其导致呈递过程变异。与HLA II类相关，
HLA II：人白细胞抗原II类。在人体中协调并帮助适应性免疫应答的特定细胞(例如树状细胞)中表达的基因。与HLA I类相关。HLA II类蛋白输出至细胞表面，在那里它们将外部蛋白的短片段、肽作为载货呈递给T细胞受体。就这一点而论，它提供潜在持续感染性片段连同固有蛋白质。HLA II可以额外地将添加至培养基、从表达自所引入遗传元件的蛋白质产生或从细胞摄取的蛋白质产生的肽作为载货呈递。HLA II类基因呈多态性，这意味着不同个体可能在相同基因中具有变异，其导致呈递过程变异。
同源臂：一段DNA，其与互补性同源臂具有几乎相同序列同一性并因此通过细胞过程(同源性指导的修复)促进两个DNA分子发生交换。
免疫监视：其中免疫系统检测并因感染、恶性肿瘤或其他潜在致病性变异而变得活化的过程。
隔绝体：防止基因受附近基因激活或阻遏过程影响的DNA序列。隔绝体还防止异染色质从沉默的基因扩散至活跃转录的基因。
整合：DNA序列物理连接入细胞的染色体。
整合对偶：配对的遗传供体载体和基因组接受位点
内部核糖体进入位点(IRES)：一旦转录则编码允许翻译以非帽依赖性方式起始的RNA元件的DNA序列
J-区域：连接区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
核型：细胞的染色体组成
Kozak序列：高效翻译起始所要求的短序列
主要HLA I类：包含基因HLA-A、HLA-B和HLA-C的APX家族
匹配：此时，两种组分编码了指导并限制互补的组分之间相互作用的遗传元件
大范围核酸酶识别位点：由常称作大范围核酸酶的内切脱氧核糖核酸酶识别的DNA序列。
代谢物：通过细胞的代谢途径产生或改变的分子
移动遗传元件：可以允许具有转座酶活性的DNA整合的DNA序列
单克隆细胞系：通过反复细胞复制从单一祖先细胞产生的定义的细胞群体
天然：对细胞而言天然存在的实体
非编码性基因：转录成有功能的非编码性RNA分子的不编码蛋白质的DNA序列
ORF：可读框。一段编码翻译框架以借助核糖体合成蛋白质(多肽)的遗传物质
旁分泌：借助直接作用于相邻细胞的可溶性因子的信号传导。
PCR：其中指数扩增特定靶DNA分子的聚合酶链反应
肽：6-30个氨基酸长度之间的短氨基酸串
表型分析：细胞可观测特征的分析。
多态性：在相同物种的个体中因存在相同基因的不同等位基因而以不同形式存在。
多肽：由一段肽组成，形成三维结构的蛋白质。
初级输出：可以从中衍生和/或测定终端输出的eAPC细胞和eTPC细胞
引物：允许例如在PCR期间特异性识别靶DNA序列的短DNA序列。
启动子：用于基因表达受控起始的调节性DNA元件
选择标记：赋予适于人工选择方法的性状的DNA序列
鸟枪法整合：籍此向细胞群体引入载体文库，从而仅任何给定载体插入物的单拷贝可以向每个单一细胞的基因组整合的过程。用来指汇总的载体借助整合对偶向给定细胞群体整合
剪接接纳位点：在内含子AM、APX CM或亲和试剂3'端与表面上具有TCRsp的细胞或基于TCRsp的试剂相互作用的DNA序列
剪接供体位点：在内含子5'端的DNA序列
合成：人工产生并向细胞引入的实体
T细胞：T淋巴细胞。在其表面上表达T细胞受体的白细胞。受免疫系统选择不与自体反应，但是具有识别感染和恶性肿瘤以及排斥来自相同物种大部分成员的移植物的潜力。
TCR：T细胞受体。由称作T-淋巴细胞的淋巴细胞亚群表达的亲和分子。在人体中，TCR识别APX CM或APX AM呈递的载货，包括来自病毒或细菌性感染或癌细胞的片段。因此，TCR识别是适应性免疫系统的有机部分。TCR由两条在细胞表面上配对的链组成。在每个细胞的表面上表达的TCR从巨大的变异基因(v、d、j和c区域)汇集物中随机装配，并且因此每名个体具有表达非常庞大和多样的不同TCR组库的T细胞汇集物。
TCRsp：作为与CD3复合的表面蛋白表达的一对互补TCR链或作为可溶性试剂、固定化试剂形式或NCBP呈递的蛋白质表达的一对互补TCR链。
终端输出：处于AM、APX、APX:CM、APX:AM或TCRsp形式的分析物抗原和TCR序列。
TRA：编码TCRα的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的基因的四个不同基因座之一。翻译的TCRα链蛋白一般与翻译的TCRβ链蛋白配对，以形成α/βTCRsp。
TRB：编码TCRβ的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的基因的四个不同基因座之一。翻译的TCRβ链蛋白一般与TCRα链蛋白配对，以形成α/βTCRsp。
TRD：编码TCRδ的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的基因的四个不同基因座之一。翻译的TCRδ链蛋白一般与翻译的TCRγ链蛋白配对，以形成γ/δTCRsp。
TRG：编码TCRγ的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的基因的四个不同基因座之一。翻译的TCRγ链蛋白一般与翻译的TCRδ链蛋白配对，以形成γ/δTCRsp。
V-区域：可变区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
实施方案项目
1.一种两部分装置，其中第一部分是工程化的抗原呈递细胞系统(eAPCS)，并且第二部分是工程化的TCR呈递细胞系统(eTPCS)。
2.根据项1的两部分装置，其中eAPCS提供一个或多个选自以下的分析物eAPC
a.eAPC-p和/或
b.eAPC-a，和/或
c.eAPC-pa，和/或
d.a和/或b和/或c的一个或多个文库。
3.根据项2的两部分装置，其中eAPC-p、eAPC-a或eAPC-pa表达选自以下的分析物抗原
a.aAPX或
b.aAM或
c.aAPX:aAM或
d.aAPX:CM或
e.其组合。
4.根据项1或2的两部分装置，其中eTPCS提供一个或多个选自以下的分析物eTPC
a.eTPC-t和/或
b.其一个或多个文库。
5.根据项4的两部分装置，其中分析物TCR链对由分析物eTPC表达为与CD3复合的TCR表面蛋白(TCRsp)。
6.根据前述项中任一者的两部分装置，其中一个或多个分析物eAPC与一个或多个分析物eTPC组合。
7.根据项6的两部分装置，其中所述组合导致如项3中定义的分析物TCRsp和分析物抗原之间接触。
8.根据项7的两部分装置，其中所述接触可以导致复合物在分析物TCRsp和分析物抗原之间形成。
9.根据项8的两部分装置，其中复合物的形成(如果存在的话)可以在分析物eTPC和/或分析物eAPC中诱导信号响应。
10.根据项9的两部分装置，其中响应用来选择具有或没有信号响应的分析物eTPC或分析物eTPC的汇集物和/或具有或没有信号响应的分析物eAPC或分析物eAPC的汇集物。
11.从根据前述项中任一者的两部分装置获得的分析物eTPC，用于表征表达分析物TCRsp的分析物eTPC对分析物抗原的信号响应。
12.用于从输入分析物eTPC或分析物eTPC文库中选择一个或多个分析物eTPC，以获得一个或多个分析物eTPC的方法，其中表达的TCRsp与如项3中定义的一个或多个分析物抗原结合，其中该方法包括
a.将一个或多个分析物eTPC与一个或多个分析物eAPC组合，导致分析物TCRsp与分析物抗原之间接触，和至少一个以下操作
b.测量一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间复合物的形成(如果存在的话)和/或
c.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eTPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和/或
d.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eAPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和
e.基于步骤b、c和/或d，选择一个或多个分析物eTPC，其中依据正量值和/或负量值作出选择。
13.根据项12的方法，其中通过单细胞分选和/或汇集物的细胞分选，执行选择步骤e。
14.根据项13的方法，其中分选之后是扩增分选的单细胞。
15.根据项13的方法，其中分选之后是扩增分选的细胞汇集物。
16.根据项13至15中任一项所述的方法，还包括步骤：对分选和/或扩增的细胞的组分2B’和/或组分2D’测序。
17.根据项16的方法，其中测序步骤之前为以下
a.提取基因组DNA和/或
b.提取组分2B’和/或组分2D’RNA转录物和/或
c.通过PCR和/或RT-PCR扩增组分2B’和/或组分2D’的DNA和/或RNA转录物。
18.根据项16或17的方法，其中测序步骤对细胞是破坏性的并且其中获得的测序信息用于制备在项12的步骤e中选择的分析物eTPC。
19.根据项12、13、14、15、18中任一项所述的方法，其中对选择的分析物eTPC进行信号响应的表征，其中该方法还包括
a.确定天然信号传导响应和/或
b.如果eTPC含有组分2F，则确定人造的信号传导响应。
20.根据项19的方法，其中与非诱导的信号响应状态相比，通过检测以下一者或多者增加或减少，确定诱导的信号响应
a.分泌的生物分子
b.分泌的化学物
c.胞内生物分子
d.胞内化学物
e.表面表达的生物分子
f.分析物eTPC对分析物eAPC的细胞毒作用
g.分析物eTPC对分析物eAPC的旁分泌作用，从而在分析物eAPC中诱导信号响应并且通过检测a至e的任一者增加或减少来确定该信号响应
h.分析物eTPC的增殖
i.分析物eTPC和分析物eAPC之间的免疫突触。
21.分析物eAPC，从如项1至10中定义的两部分装置获得，以鉴定分析物抗原，所述分析物抗原诱导一个或多个表达分析物TCRsp的分析物eTPC对该表达的分析物抗原的信号响应。
22.用于从输入分析物eAPC或分析物eAPC文库中选择一个或多个分析物eAPC，以获得一个或多个分析物eAPC的方法，其中所获得的一个或多个分析物eAPC诱导一个或多个表达分析物TCRsp的分析物eTPC对如项3中定义的已表达分析物抗原的信号响应，其中该方法包括
a.将一个或多个分析物eAPC与一个或多个分析物eTPC组合，导致分析物eAPC呈递的分析物抗原与一个或多个分析物eTPC的分析物TCRsp之间接触，和
b.测量一个或多个分析物抗原与一个或多个分析物TCRsp之间复合物的形成(如果存在的话)和/或，
c.测量一个或多个分析物eTPC中受分析物TCRsp与分析物抗原之间的复合物形成诱导的信号响应(如果存在的话)，和/或
d.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eAPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和
e.从步骤b、c和/或d选择一个或多个分析物eAPC，其中依据正量值和/或负量值作出选择。
23.根据项22的方法，其中通过单细胞分选和/或汇集物的细胞分选，执行选择步骤e。
24.根据项23的方法，其中分选之后是扩增分选的单细胞。
25.根据项24的方法，其中分选之后是扩增分选的细胞汇集物。
26.根据项23至25中任一项所述的方法，还包括步骤：对分选和/或扩增的细胞的组分1B’和/或组分1D’测序。
27.根据项26的方法，其中测序步骤之前为以下
a.提取基因组DNA和/或
b.提取组分1B’和/或组分1D’RNA转录物和/或
c.通过PCR和/或RT-PCR扩增组分1B’和/或组分1D’的DNA和/或RNA转录物。
28.根据项26或27的方法，其中测序步骤对细胞是破坏性的并且其中获得的测序信息用于制备在项22的步骤e中选择的分析物eAPC。
29.根据项22,23,24,25,28中任一项所述的方法，其中基于分析物eTPC的信号响应选择所选择的分析物eAPC，其中该方法还包括
a.确定天然信号传导响应和/或
b.确定人造的信号传导响应。
30.根据项29的方法，其中与非诱导的信号响应状态相比，通过检测以下一者或多者增加或减少，确定诱导的信号响应
a.分泌的生物分子
b.分泌的化学物
c.胞内生物分子
d.胞内化学物
e.表面表达的生物分子
f.分析物eTPC对分析物eAPC的细胞毒作用
g.分析物eTPC对分析物eAPC的旁分泌作用，从而在分析物eAPC中诱导信号响应并且通过检测a至e的任一者增加或减少来确定该信号响应
h.分析物eTPC的增殖
i.分析物eTPC和分析物eAPC之间的免疫突触。
31.选择并鉴定aAM载货或CM载货的方法，其中所述载货是在通过项22至30中定义的方法所选择并获得的分析物eAPC的aAPX中装载的代谢物和/或肽，其中该方法包括
a.分离aAPX:aAM或aAPX:CM或载货aM或载货CM和
b.鉴定加载的载货。
32.根据项31的方法，其中步骤b包括对分离的aAPX:aAM或aAPX:CM实施以下一个或多个分析
a.质谱分析
b.肽测序分析。
33.通过如项12至20中所定义的方法选择的成对TCR链序列或成对TCR链序列文库，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
34.通过如项22至32中所定义的方法选择的抗原性分子和/或编码所述抗原性分子的ORF或其文库，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
35.通过如项22至32中所定义的方法选择的以抗原性分子作为载货加载的抗原呈递复合体和/或编码所述复合体的ORF或其文库，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
36.通过如项22至30中所定义的方法选择的eAPC或eAPC文库，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
37.通过如项12至20中所定义的方法选择的eTPC或eTPC文库，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
38.根据项1-10中任一项的装置，用于以下至少之一方面
a.诊断
b.药物
c.化妆品
d.研究和开发。
Claims (22)
1.一种两部分装置，其中第一部分是工程化的抗原呈递细胞系统(eAPCS)，并且第二部分是工程化的TCR呈递细胞系统(eTPCS)。
2.根据权利要求1所述的两部分装置，其中eAPCS提供一个或多个选自以下的分析物eAPC
a.eAPC-p和/或
b.eAPC-a，和/或
c.eAPC-pa，和/或
d.a和/或b和/或c的一个或多个文库。
3.根据权利要求2所述的两部分装置，其中eAPC-p、eAPC-a或eAPC-pa表达选自以下的分析物抗原
a.aAPX或
b.aAM或
c.aAPX:aAM或
d.aAPX:CM或
e.其组合。
4.根据权利要求1或2所述的两部分装置，其中eTPCS提供一个或多个选自以下的分析物eTPC
a.eTPC-t和/或
b.其一个或多个文库。
5.根据权利要求4所述的两部分装置，其中分析物TCR链对由分析物eTPC表达为与CD3复合的TCR表面蛋白(分析物TCRsp)。
6.根据权利要求5所述的两部分装置，其中eTPC含有组分2F，其代表工程化到eTPC的基因组上的人造TCR信号响应元件，并且其用来报告在分析物TCRsp和eAPC–p、-a或–pa呈递的分析物抗原之间形成复合物，并且其在eTPC中导致信号响应。
7.根据前述权利要求中任一项所述的两部分装置，其中一个或多个分析物eAPC与一个或多个分析物eTPC组合。
8.根据权利要求7所述的两部分装置，其中所述组合导致如权利要求3中定义的分析物TCRsp和分析物抗原之间接触，其中所述接触可以导致或可以不导致信号响应。
9.根据权利要求8所述的两部分装置，其中所述接触可以导致复合物在分析物TCRsp和分析物抗原之间形成。
10.根据权利要求9所述的两部分装置，其中复合物的形成(如果存在的话)可以在分析物eTPC和/或分析物eAPC中诱导信号响应。
11.根据权利要求7-9中任一项所述的两部分装置，其中信号响应用来选择具有或没有信号响应的分析物eTPC或分析物eTPC的汇集物和/或具有或没有信号响应的分析物eAPC或分析物eAPC的汇集物。
12.从根据前述权利要求中任一项所述的两部分装置获得的分析物eTPC，用于表征表达分析物TCRsp的分析物eTPC对分析物抗原的信号响应。
13.用于从输入的分析物eTPC或分析物eTPC的文库中选择一个或多个eTPC，以获得一个或多个分析物eTPC的方法，其中表达的TCRsp与如权利要求3中定义的一个或多个分析物抗原结合，其中所述方法包括
a.将一个或多个分析物eTPC与一个或多个分析物eAPC组合，导致分析物TCRsp与分析物抗原之间接触，和至少一个以下操作
b.测量一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间复合物的形成(如果存在的话)和/或
c.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eTPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和/或
d.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eAPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和
e.基于步骤b、c和/或d，选择一个或多个eTPC，其中依据正量值和/或负量值作出选择。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过单细胞分选和/或汇集物的细胞分选，执行选择步骤e。
15.根据权利要求14所述的方法，其中分选之后是扩增分选的单细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中分选之后是扩增分选的细胞汇集物。
17.根据权利要求13、14、15、16中任一项所述的方法，其中对选择的eTPC进行信号响应的表征，其中所述方法还包括
a.确定天然信号传导响应和/或
b.如果eTPC含有组分2F，则确定人造的信号传导响应
18.eAPC，其从如权利要求1至11中定义的两部分装置获得，以鉴定分析物抗原，所述分析物抗原诱导一个或多个表达分析物TCRsp的分析物eTPC对该表达的分析物抗原的信号响应。
19.用于从输入的分析物eAPC或分析物eAPC的文库中选择一个或多个eAPC，以获得一个或多个分析物eAPC的方法，其中所获得的一个或多个分析物eAPC诱导一个或多个表达分析物TCRsp的分析物eTPC对如权利要求3中定义的已表达分析物抗原的信号响应，其中所述方法包括
a.将一个或多个分析物eAPC与一个或多个分析物eTPC组合，导致分析物eAPC呈递的分析物抗原与一个或多个分析物eTPC的分析物TCRsp之间接触，和
b.测量一个或多个分析物抗原与一个或多个分析物TCRsp之间复合物的形成(如果存在的话)和/或，
c.测量一个或多个分析物eTPC中受分析物TCRsp与分析物抗原之间的复合物形成诱导的信号响应(如果存在的话)，和/或
d.测量受一个或多个分析物TCRsp与一个或多个分析物抗原之间的复合物形成诱导的由分析物eAPC所产生的信号响应(如果存在的话)，和
e.从步骤b、c和/或d选择一个或多个eAPC，其中依据正量值和/或负量值作出选择。
20.根据权利要求19所述的方法，其中通过单细胞分选和/或汇集物的细胞分选，执行选择步骤e。
21.根据权利要求20所述的方法，其中分选之后是扩增分选的单细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中分选之后是扩增分选的细胞汇集物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116286982A (zh) * | 2022-09-09 | 2023-06-23 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11293021B1 (en) | 2016-06-23 | 2022-04-05 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems |
| JP6803480B2 (ja) | 2016-11-07 | 2020-12-23 | ジェノヴィー エービーＧｅｎｏｖｉｅ Ａｂ | Ｔ細胞受容体の合成及びｔｃｒ提示細胞への安定なゲノム組込みのための二部分装置 |
| DK3535387T3 (da) | 2016-11-07 | 2022-02-14 | Genovie Ab | Konstrueret flerkomponentsystem til identifikation og karakterisering af t-cellereceptorer og t-celleantigener |
| US10011849B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
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| HRP20220615T1 (hr) | 2017-06-30 | 2022-06-24 | Inscripta, Inc. | Postupci, moduli, instrumenti i sustavi za automatiziranu obradu stanica |
| WO2019200004A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
| WO2019209926A1 (en) | 2018-04-24 | 2019-10-31 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of peptide libraries |
| US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
| US10557216B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-02-11 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries |
| EP4070802A1 (en) | 2018-06-30 | 2022-10-12 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
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| US11214781B2 (en) | 2018-10-22 | 2022-01-04 | Inscripta, Inc. | Engineered enzyme |
| EP3870697A4 (en) | 2018-10-22 | 2022-11-09 | Inscripta, Inc. | MODIFIED ENZYMES |
| CA3134168A1 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| US11001831B2 (en) | 2019-03-25 | 2021-05-11 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| AU2020288623A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-01-06 | Inscripta, Inc. | Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing |
| US10920189B2 (en) | 2019-06-21 | 2021-02-16 | Inscripta, Inc. | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli |
| US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
| WO2021102059A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
| EP4069837A4 (en) | 2019-12-10 | 2024-03-13 | Inscripta, Inc. | NEW MAD NUCLEASES |
| US10704033B1 (en) | 2019-12-13 | 2020-07-07 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| WO2021126886A1 (en) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | Inscripta, Inc. | Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells |
| US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
| KR20220133257A (ko) | 2020-01-27 | 2022-10-04 | 인스크립타 인코포레이티드 | 전기천공 모듈 및 기구 |
| US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
| EP4142782A1 (en) | 2020-04-27 | 2023-03-08 | Genovie AB | Methods to generate vaccine compositions that prime human leukocyte antigen class i restricted cd8 t-cell responses against viral non-virion-integral derived epitopes |
| US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
| US11299731B1 (en) | 2020-09-15 | 2022-04-12 | Inscripta, Inc. | CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells |
| US11512297B2 (en) | 2020-11-09 | 2022-11-29 | Inscripta, Inc. | Affinity tag for recombination protein recruitment |
| WO2022146497A1 (en) | 2021-01-04 | 2022-07-07 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| US11332742B1 (en) | 2021-01-07 | 2022-05-17 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| US11884924B2 (en) | 2021-02-16 | 2024-01-30 | Inscripta, Inc. | Dual strand nucleic acid-guided nickase editing |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2161095A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-27 | Solis Therapeutics, Inc. | Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents |
| CA2467893A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-08-14 | Naoto Hirano | Modified antigen-presenting cells |
| EP2601521B1 (en) * | 2010-08-06 | 2018-05-02 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Identification of t cell target antigens |
| JP6126804B2 (ja) * | 2012-07-25 | 2017-05-10 | 国立大学法人富山大学 | Ｔ細胞受容体のクローニング方法 |
| US9937207B2 (en) * | 2013-03-21 | 2018-04-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using talens |
| US20170333480A1 (en) * | 2014-11-05 | 2017-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells |
| CN105316362B (zh) * | 2015-08-19 | 2020-03-17 | 暨南大学 | 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法 |
-
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GUO XZ等: "Rapid cloning, expression, and functional characterization of paired αβ and γδ T-cell receptor chains from single-cell analysis", 《MOL THER METHODS CLIN DEV》 * |
| HAMANA H等: "A novel, rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells", 《BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN》 * |
| ZHANG Y等: "Transduction of human T cells with a novel T-cell receptor confers anti-HCV reactivity", 《PLOS PATHOG》 * |
Cited By (2)
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