CN110267981A - 用于从单t细胞克隆功能性t细胞受体的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本文提供了从单T细胞克隆功能性TCR所涉及的方法和材料。例如,提供了用于获得编码来自单T细胞的TCR的核酸并排列所述核酸以形成经成功设计以表达TCR的核酸载体的方法和材料,用于获得编码来自单T细胞的TCR的核酸并排列所述核酸以形成经成功设计以表达TCR的核酸载体,用于制备所述试剂盒的方法,经设计以扩增特定哺乳动物物种的功能性αβ或γδTCR的各个表达的V区段的两个可变区的整个编码序列的核酸引物的集合,使用所述核酸引物的集合以从单T细胞克隆功能性TCR的方法,和包含所述核酸引物的集合以从单T细胞克隆功能性TCR的试剂盒。
Description
关于联邦资助的声明
研究或开发
本发明是在国立卫生研究院授予的基金AR044077的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
相关申请交叉引用
本申请要求2016年11月29日提交的美国申请系列号62/427,335的优先权。该在先申请的公开内容视为本申请公开内容的组成部分并将其全文纳入。
背景技术
1.技术领域
本文涉及从单T细胞克隆功能性T细胞受体(TCR)所涉及的方法和材料。例如,本文涉及扩增步骤、克隆步骤和试剂的有效且简化的组合中所用的方法和材料,以从单T细胞获得编码TCR的核酸并排布所述核酸以形成核酸载体,其经成功设计以表达具有可变链组合(例如,α/β可变链组合或γ/δ可变链组合)的TCR(例如完全完整的TCR),如同该单T细胞中所存在的那样。
2.背景技术
TCR存在于T细胞表面,且包括两条不同的多肽链。在人类中,约95%的T细胞具有这样的TCR:其包含阿尔法(α)链和贝塔(β)链,而约5%的T细胞具有这样的TCR:其包含伽马(γ)链和达尔塔(δ)链。这种T细胞可分别称为αβ或γδT细胞。
各链(例如,α、β、γ和δ链)包括可变(V)区和恒定(C)区。α链的V区由α基因的V和J区段的重组形成。同样,γ链的V区由γ基因的V和J区段的重组形成。然而,β链的V区由β基因的V、D和J区段的重组形成,δ链的V区由δ基因的V、D和J区段的重组形成。因此,有几个因素促成了哺乳动物(例如人类)T细胞库中所见的巨大变异性。例如,一种特定αβTCR的特异性尤其通过以下因素确定:(a)α链的VJ区段的特定组合,(b)β链的VDJ区段的特定组合,和(c)结合在一起以形成该特定αβTCR的这两条链(α链和β链)的特定配对。此外,VJ外显子和VDJ外显子接合成编码序列的过程是明显不精确的过程;核苷酸从基因区段的边缘丢失并且添加额外的碱基(Matsuzaki等,Eur.J.Immunol.,23(12):3345-9(1993);Cabaniols等,J.Exp.Med.,194(9):1385-1390(1991))。
发明内容
本文提供了从单T细胞克隆功能性TCR所涉及的方法和材料。例如,本文提供了方法和材料,用于从单T细胞获得编码TCR的核酸并且排布该核酸以形成核酸载体,所述核酸载体经成功设计以表达TCR(例如,完全完整的TCR,例如具有该单T细胞中存在的可变链组合的完全完整的TCR);试剂盒,用于从单T细胞获得编码TCR的核酸并排布该核酸以形成核酸载体,所述核酸载体经成功设计以表达TCR(例如,完全完整的TCR,例如具有该单T细胞中存在的可变链组合的完全完整的TCR);以及制备这种试剂盒的方法。具有用于克隆该TCR的、单T细胞中存在的可变链组合的克隆的αβTCR可包括:该单T细胞中存在的VJα区段组合,该单T细胞中存在的VDJβ区段组合,该单T细胞中存在的整个α可变区的核苷酸序列,以及该单T细胞中存在的整个β可变区的核苷酸序列。同样,具有用于克隆该TCR的、单T细胞中存在的可变链组合的克隆的γδTCR可包括:该单T细胞中存在的VJγ区段组合,该单T细胞中存在的VDJδ区段组合,该单T细胞中存在的整个γ可变区的核苷酸序列,以及该单T细胞中存在的整个δ可变区的核苷酸序列。
本文还提供了核酸引物集合,其被设计用于扩增特定哺乳动物物种(例如,小鼠或人)的功能性αβ或γδTCR的每个表达的V区段(例如,每个表达的αV区段和βV区段,或每个表达的γV区段和δV区段)的两个可变区(例如,α可变区和β可变区,或γ可变区和δ可变区)的整个编码序列,使用这种核酸引物集合来克隆来自单T细胞的功能性TCR的方法,以及含有这种核酸引物集合的、用以克隆来自单T细胞的功能性TCR的试剂盒。
通常,本文提供的方法和材料可以允许人们进行高度多重化的反应以直接从单T细胞快速(例如,在某些情况下同时)且以遗漏极少(如果存在)α/β可变链组合(或γ/δ可变链组合)的方式克隆许多不同的TCR(例如,数百到数千或更多个不同的TCR)。例如,本文所述的方法和材料可用于直接从单个αβT细胞以如下方式克隆许多不同的αβTCR(例如,数百到数千或更多不同的αβTCR):其中,对于某一物种(例如小鼠或人类物种)的α/β可变链组合,可能遗漏小于10%(例如,小于9%,小于8%,小于7%,小于6%,小于5%,小于4%,小于3%,小于2%或小于1%)的α可变链和小于10%(例如,小于9%,小于8%,小于7%,小于6%,小于5%,小于4%,小于3%,小于2%或小于1%)的β可变链。同样地,本文所述的方法和材料可用于直接从单个γδT细胞以如下方式克隆许多不同的γδTCR(例如,数百至数千或更多不同的γδTCR):其中,对于某一物种(例如小鼠或人类物种)的γ/δ可变链组合,可能遗漏小于10%(例如,小于9%,小于8%,小于7%,小于6%,小于5%,小于4%,小于3%,小于2%或小于1%)的γ可变链和小于10%(例如,小于9%,小于8%,小于7%,小于6%,小于5%,小于4%,小于3%,小于2%或小于1%)的δ可变链。在一些情况中,本文所述的方法和材料可包括:(a)获得T细胞样品,(b)将那些T细胞分选到隔离位置(例如,孔)中,从而大多数(如果不是全部)隔离位置(例如,各孔)包含单T细胞,(c)裂解(例如,同时裂解)位于不同隔离位置(例如,不同的孔)中的单T细胞,以释放各单T细胞的RNA,(d)进行(例如,同时进行)逆转录,该逆转录采用释放的RNA为模板、适用于从RNA合成cDNA的引物和逆转录酶,以在各隔离位置(例如,各孔)中产生cDNA;所述cDNA代表由位于所述隔离位置(例如,孔)中的单T细胞表达的RNA,(e)对于各隔离位置,进行(例如,同时进行)第一轮扩增反应(例如,巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序)的第一轮聚合酶链式反应(PCR)),该第一轮扩增反应采用生成的cDNA为模板、第一轮引物集合(例如,第一轮PCR引物集合),和聚合酶(例如,Taq聚合酶),以至少产生:包含所述隔离位置的单T细胞的TCR的α可变链(或γ可变链)的核酸序列的扩增产物,以及包含相同隔离位置的相同单T细胞的TCR的β可变链(或δ可变链)的核酸序列的扩增产物,(f)对于各隔离位置,进行(例如,同时进行)巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序)的第二轮扩增反应(例如,第二轮PCR),该第二轮扩增反应采用第一轮扩增反应的扩增产物为模板、第二轮引物集合(例如,第二轮PCR引物集合),和聚合酶(例如,Taq聚合酶),以至少产生:包含所述隔离位置的单T细胞的TCR的α可变链(或γ可变链)的核酸序列的第一扩增产物,和相同隔离位置的相同单T细胞的TCR的β可变链(或δ可变链)的核酸序列的第二扩增产物,和(g)对于各隔离位置,将第一和第二扩增产物克隆进入表达载体,该表达载体经设计以表达功能性TCR,该功能性TCR具有用于产生所述扩增产物的单T细胞中存在的α/β或γ/δ可变链组合(或其部分,例如α/β或γ/δ可变链组合的V区段)。
可以将得到的表达载体导入细胞,从而那些细胞表达克隆的TCR。可筛选这些细胞和/或它们从引入的表达载体表达的TCR,以鉴定具有所需能力的TCR。例如,可以鉴定表达识别特定抗原(例如,源自肿瘤多肽的肽)的克隆TCR的细胞,并且那些细胞、它们所含的TCR表达载体或克隆的TCR构建体可以用于进一步分析或用于治疗应用。
在一些情况下,可以通过将本文提供的表达载体引入TCR-阴性报告细胞来评估克隆的TCR在表面上的表达和功能性TCR的表达,所述TCR-阴性报告细胞设计成一旦功能性TCR的信号转导器(signaling apparatus)被占用(engaged),即表达可测量的标志物信号或标志物多肽。在这些情况下,设计用于非特异性激活TCR的抗体(例如抗CD3抗体)可用于筛选功能性TCR。在一些情况下,可以筛选本文提供的克隆的TCR的抗原特异性。例如,可以筛选表达克隆的TCR的报告细胞对于特定抗原(例如,衍生自肿瘤多肽的肽)的识别。在一些情况下,可以用本文提供的表达载体转染原代T细胞(例如,人原代T细胞),并通过T细胞增殖试验筛选抗原特异性。
本文提供的方法和材料可以允许临床医生,医学专业人员,实验室人员和研究人员使用具有不同TCR的T细胞集合来产生表达载体集合,所述表达载体表达具有与用于产生所述集合的原始T细胞中存在的相同的可变链组合或其部分(例如,相同α/β可变链组合或相同γ/δ可变链组合)的那些不同TCR的功能形式。可以快速,高效,廉价且有效地获得这种表达载体集合。例如,在一些情况下,使用本文提供的方法和材料,可在少于12天内(例如,4-11天、5-11天、6-11天、7-11天、8-11天、4-10天、5-10天、6-10天、7-10天、8-10天、4-9天、5-9天、6-9天、7-9天、4-8天、5-8天、6-8天或7-8天),采用少于12个步骤(例如,5-11个步骤、6-11个步骤、7-11个步骤、8-11个步骤、5-10个步骤、6-10个步骤、7-10个步骤、8-10个步骤、5-9个步骤、6-9个步骤、7-9个步骤,或8-9个步骤),花费少于约10美元/TCR,且以大于约80%(例如,大于约85、90或95%)有效性(基于将单T细胞分选进入384孔板的384个孔中的各孔的分选),产生表达载体集合,所述表达载体表达许多不同TCR的功能形式,其具有在由哺乳动物(例如人)获得的T细胞中发现的真实可变链组合。在一些情况下,本文提供的方法和材料可以在不进行核酸测序,不进行限制性内切核酸酶切割步骤,不进行本文所述的其它步骤或技术,和/或不采用本文所述的特定试剂或材料的情况下进行。
本文提供的方法和材料还可允许用户从分选的T细胞群中成功捕获大多数(如果不是全部)功能性TCR。例如,在一些情况下,本文提供的方法和材料可包括巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序),其包括设计用于扩增哺乳动物(例如,人类)的特定TCR的两个可变链的每个已知功能性V区段(例如,特定αβTCR的α可变链和β可变链的任何已知功能性V区段或特定γδTCR的γ可变链和δ可变链的任何已知功能性V区段)的引物集合。具有克隆来自分选的T细胞群的大多数(如果不是全部)功能性TCR的能力可允许用户鉴定可能在其它情况中会遗漏的特定TCR,包括罕见TCR。可能遗漏的这些罕见TCR可以为有效治疗(例如涉及递送有效T细胞的癌症治疗)提供新克隆TCR的丰富来源。
在一些情况下,本文提供的方法和材料可允许用户获得关于产生功能性TCR克隆的单T细胞的其它信息。在一些情况下,本文所述的用于单细胞分选的流式细胞术技术可用于通过将那些细胞针对活化标志物进行染色以将活化细胞和经验细胞与原初T细胞相区分。当将本文提供的方法和材料应用于治疗特定疾病(例如癌症)的方法中时,可从患者分离T细胞(其已被活化且在该患者中扩增)。一旦分离出这些T细胞,并从单细胞RNA产生cDNA,即可应用其它选择水平。例如,除采用由单T细胞的RNA产生的cDNA来扩增和克隆该T细胞的TCR的可变链(或其部分)之外,该cDNA还可用于评估该T细胞中的RNA表达和/或RNA表达水平。
在CD8+T细胞的情况下,可以通过检查转录因子(例如脱中胚蛋白(Eomesodermin)和T-bet)表达的相对mRNA水平来鉴定与多功能(例如,多细胞因子生产者)效应细胞相关联的TCR或与静息或耗尽的长寿记忆细胞相关联的TCR(McLane等,J.Immunol.,190(7):3207-3215(2013);和Buggert等,PLoS Pathog.,10(7):e1004251(2014))。
在一些情况下,可以在分选之前刺激(例如,体外刺激)T细胞,然后可以评估RNA表达(通过例如qPCR),以确定哪种T细胞对刺激作出反应。可以使用任何合适类型的刺激,包括但不限于,非特异性刺激,例如采用如下物质的刺激:伴刀豆球蛋白A,植物血凝素-P,佛波醇酯加离子霉素,佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯加钙离子载体,或具有交联TCR能力的抗体(例如,抗CD3抗体加抗CD28抗体,或抗TCRβ抗体),或抗原特异性刺激,例如采用一种或多种特定抗原的刺激,如他处所述(Downward等,Nature,346:719-23(1990);和Dasgupta等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1094-8(1987))。在某些情况下,可以确定细胞因子的表达水平,如TNF-α,IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,IL-13或IL-17的表达水平,并与未受刺激的群体做比较。一旦对单T细胞进行分选,本文提供的方法即可用于确定哪些T细胞响应于所述刺激(例如,响应于用于刺激T细胞的肽抗原)而产生特定的细胞因子。在这些情况下,可以确定抗原特异性T细胞而无需扩增反应性T细胞的费力方法或多聚甲醛固定和细胞内细胞因子染色的破坏性方法(其可降低有效克隆TCR的能力)。在这种情况下,可快速鉴定由活性且抗原特异性T细胞(而非无活性旁观者T细胞)产生的特定TCR。
在一些情况中,可确定用于克隆功能性TCR的单T细胞的细胞因子表达水平,例如TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13或IL-17表达水平,从而允许基于提供所述特定TCR的可变链(或其部分)的T细胞的特定表型(例如,IFN-γ表达升高)来鉴定特定TCR。在这种情况下,可以快速鉴定由活性(而非无活性)T细胞产生的特定TCR。在一些情况下,可以快速鉴定由非活性(而不是活性)T细胞产生的特定TCR。
在一些情况下,T细胞不存在细胞因子生成不一定反映不存在TCR特异性。TCR起始的信号可能会被许多抑制性共受体破坏和/或抑制(Sheppard等,FEBS Lett.,574(1-3):37-41(2004);和Yokosuka等,J.Exp.Med.,209(6):1201-1217(2012))。在一些情况下,可使用难以刺激的T细胞来获得TCR,并且可以在不抑制经典TCR信号转导的细胞中测试或筛选克隆的TCR的特异性。
在一些情况下,MHC-肽复合物(或HLA-肽复合物)可用于鉴定识别这种复合物的克隆的TCR。在这些情况下,免疫应答期间的克隆排斥和/或缺乏抗原引发可能导致具有该特异性的TCR不存在于活化和/或扩增的TCR库中。在这种情况下,本文提供的方法和材料(在一些情况下仅需要存在单T细胞)可用于克隆识别这种复合物的原初或失活的TCR。在某些情况下,原初T细胞库可以用MHC-肽四聚体(或HLA-肽四聚体)染色,而原初T细胞中的任何MHC-肽(或HLA-肽)反应性TCR均可用于采用本文提供的方法和材料克隆那些TCR。
一般而言,本文的一个方面的特征在于一种用于获得含有编码功能性T细胞受体的核酸的多个核酸载体的方法。所述方法包括或基本由以下内容组成:(a)获得装置,该装置包含多个分开位置,其中所述分开位置各自包含由分选进入所述分开位置的单T细胞获得的RNA产生的cDNA,(b)采用所述多个分开位置中每一个的cDNA为模板,进行巢式扩增程序,以获得所述多个分开位置中每一个的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和(c)将所述多个分开位置中每一个的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得所述多个分开位置中每一个的cDNA的组装的核酸载体,其中,所述多个分开位置中每一个的cDNA的组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸。所述多个可以大于50。所述多个可以大于500。所述多个可以大于5000。所述多个核酸载体可以是多个核酸表达载体。所述装置可包含多孔板。多孔板可以是96孔板、384孔板或1536孔板。由单T细胞单一获得的RNA产生的cDNA可包含从单一人T细胞获得的RNA产生的cDNA。第一扩增产物可包含编码Vα或Vγ区段的L序列的核酸。第一扩增产物可包含编码Jα或Jγ区段的核酸。第一扩增产物可包含编码Cα或Cγ区的5'部分的核酸。第一扩增产物可包含编码Cα或Cγ区的5'部分、Jα或Jγ区段和Vα或Vγ区段的L序列的核酸。第二扩增产物可包含编码Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。第二扩增产物可包含编码Dβ或Dδ区段的核酸。第二扩增产物可包含编码Jβ或Jδ区段的核酸。第二扩增产物可包含编码Cβ或Cδ区的5’部分的核酸。第二扩增产物可包含编码Cβ或Cδ区的5’部分、Dβ或Dδ区段、Jβ或Jδ区段和Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。第一扩增产物可包含通过巢式扩增程序的第二轮扩增添加至扩增的cDNA模板序列的衔接体序列。第二扩增产物可包含通过巢式扩增程序的第二轮扩增添加至扩增的cDNA模板序列的衔接体序列。第一扩增产物可包含通过巢式扩增程序的第二轮扩增添加至扩增的cDNA模板序列的第一衔接体序列,而第二扩增产物可包含通过巢式扩增程序的第二轮扩增添加至扩增的cDNA模板序列的第二衔接体序列,其中,第一和第二衔接体序列不同。每个组装的核酸载体的功能性T细胞受体可包含该RNA的起源的单T细胞中存在的Vα/Vβ组合或Vγ/Vδ组合。每个组装的核酸载体的功能性T细胞受体可包含(a)全长α可变区和全长β可变区或(b)全长γ可变区和全长δ可变区。每个组装的核酸载体的功能性T细胞受体可包含(a)该RNA起源的单T细胞中存在的全长α可变区和全长β可变区,或(b)该RNA起源的单T细胞中存在的全长γ可变区和全长δ可变区。每个组装的核酸载体的功能性T细胞受体可包含(a)全长α恒定区和全长β恒定区或(b)全长γ恒定区和全长δ恒定区。每个组装的核酸载体可包含编码自切割肽的核酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)。该方法可包括将单T细胞分选到分开的位置。该方法可包括进行逆转录反应以获得cDNA。组装步骤可包括无缝克隆(seamless cloning)。每个组装的核酸载体可以在不进行核酸测序的情况下获得。每个组装的核酸载体可以在不进行限制性内切核酸酶切割反应的情况下获得。
除非另外定义,本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明,但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。若有抵触,以本说明书(包括定义)为准。此外,材料、方法和实施例都仅是说明性的,并不意在构成限制。
附图和以下说明进一步详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其它特征、目的和优势将通过说明、附图以及权利要求书得以清楚展现。
附图说明
图1是根据一个实施方式,从单T细胞到表达载体的TCR克隆方法的总体概述示意图。
图2A是根据一个实施方式的巢式PCR程序的示意图,其涉及使用两个分开的正向Vα引物库,以产生扩增产物,所述扩增产物含有5'添加的衔接体序列(AS),随后是Vα区段的前导序列(L),Vα区段,Jα区段和Cα的5'端的部分。在该实施方式中,来自用于第二轮PCR的正向Vα引物库的引物添加衔接体序列,其可用于将产生的扩增产物克隆到表达载体中。图2B是根据一个实施方式的巢式PCR程序的示意图,其涉及使用两个分开的正向Vβ引物库,以产生扩增产物,所述扩增产物含有5'添加的衔接体序列(AS),随后是Vβ区段的前导序列(L),Vβ区段,Dβ区段,Jβ区段和Cβ的5'端的部分。在该实施方式中,来自用于第二轮PCR的正向Vβ引物库的引物添加衔接体序列,其可用于将产生的扩增产物克隆到表达载体中。
图3A是根据一个实施方式的巢式PCR程序的示意图,其涉及使用一个正向Vα引物库和针对衔接体序列的引物,以产生含有5'添加的衔接体序列(AS),然后是Vα区段的前导序列(L),Vα区段,Jα区段和Cα的5'端的部分的扩增产物。在该实施方式中,来自第一轮PCR中使用的正向Vα引物库的引物添加衔接体序列,其可以同时用作第二轮的引物靶序列并将产生的扩增产物克隆到表达载体中。图3B是根据一个实施方式的巢式PCR程序的示意图,其涉及使用一个正向Vβ引物库和针对衔接体序列的引物,以产生扩增产物,所述扩增产物含有5'添加的衔接体序列(AS),随后是Vβ区段的前导序列(L),Vβ区段,Dβ区段,Jβ区段和Cβ的5'端的部分。在该实施方式中,来自第一轮PCR中使用的正向Vβ引物库的引物添加衔接体序列,其可以同时用作第二轮的引物靶序列并将产生的扩增产物克隆到表达载体中。
图4是使用本文所述的方法和材料,可使用本文提供的方法和材料快速获得所需TCR克隆的两种示例性筛选方法的流程图。在某些情况下,这些筛选程序可以这样进行:从将原始T细胞分选成单个分选的T细胞的步骤,然后进行TCR克隆,到从抗原筛选中分离出具有所需抗原特异性的特定TCR克隆的步骤,其无需进行核酸测序,无需进行限制性内切核酸酶切割步骤,或无需进行核酸测序或限制性内切核酸酶切割步骤。
图5是用于选择和设计可以扩增多于一种变体的引物的比对的实例。在ATG起始密码子上游的区域或与ATG起始密码子重叠的区域中选择在不同变体之间具有同源性的引物序列。该策略允许多重PCR反应中包含的个体引物的数量显著减少,从而能够扩增大多数(如果不是全部)TCR变体。该实例描述了小鼠TRAV13变体组的全部13种变体的序列,以及它们在ATG起始密码子上游的同源性。在该具体实例中,全部13个组成员仅使用一种正向引物(即mTRAV13_F,其具有以下序列5’-GGCTGGTTACTTGC-TTCTGTCT-3’;SEQ ID NO:99)扩增。该序列的位置,即ATG起始密码子上游20个核苷酸,由虚线框和箭头突出显示。在该序列标识下,提供具有多于一个核苷酸的位置的单字母代码。IUPA-IUB表包含这些混合碱基的代码。
图6A-6D显示了使用杂交瘤T细胞系1B9进行RNA提取,cDNA转化和TCR链检测直至单细胞水平的结果,以及将单细胞分选到384孔PCR板中的结果。图6A提供了使用SYBR绿实时PCR,从连续细胞稀释(10-0.08个细胞/孔)的GAPDH的扩增效率。图6B显示RNA提取和cDNA转化的条件能够使用两倍连续稀释(10-0.08个细胞/孔)、正向引物mTRBV17(SEQ ID NO:251)和反向引物mTRBCn(SEQ ID NO:273)来检测1B9杂交瘤细胞系中表达的小鼠TCRβ链TRBV17直至单细胞水平。图6C显示了使用玻璃移液管和在显微镜下控制的显微操纵器在单细胞水平检测的进一步确认。将单细胞接种在384孔PCR板中,在24个孔中的22个孔中检测mTRBV17。图6D显示了使用BD FACSaria分选器将单细胞铺板进入384孔PCR板的条件的结果。再次检测到24个孔中的22个孔的mTRBV17小鼠TCRβ链检测呈阳性。
图7显示了表1中列出的人引物扩增相应的人TCRα变体(上图)和表2中列出的人引物扩增相应的TCRβ变体(下图)的扩增效率。使用密度梯度离心从健康供体分离人外周血单核细胞(PBMC)。RNA使用RNAeasy Qiagen试剂盒分离,并使用Superscript IV转化为cDNA用于逆转录。对于表1中列出的hTRAV引物,采用hTRACf(SEQ ID NO:265)作为反向引物。对于表2中列出的hTRBV引物,采用hTRBCf(SEQ ID NO:268)作为反向引物。
图8显示了表3中列出的小鼠引物扩增相应的小鼠TCRα变体(上图)和表2中列出的小鼠引物扩增相应的小鼠TCRβ变体(下图)的扩增效率。从年轻C57/BL6小鼠的胸腺分离淋巴细胞,并使用RNAeasy试剂盒分离RNA。使用Superscript IV将RNA转化为cDNA用于逆转录。对于表3中列出的mTRAV引物,采用mTRAC(SEQ ID NO:266)作为反向引物。对于表4中列出的mTRBV引物,采用mTRBC(SEQ ID NO:269)作为反向引物。
图9A和9B显示了获得用于随后克隆的扩增产物的扩增效率,并鉴定了整个小鼠T细胞受体库的α和β链的序列。图9A显示用于分离从C57/BL6小鼠的脾中分离的LIVE/CD8阳性T细胞的FACS染色和门控。门控以顺序排列,从而最左边的图为第一门控为空,而正随后的右侧图是由前一个门控限定的群体。使用FACSaria分选器将最右边图中限定的CD8+CD4-事件以单细胞形式分选进入两个384孔PCR板。提取RNA并在每个孔中转化成cDNA,其中对于两块384孔PCR板,每个孔含有单细胞。小鼠mTRAV和mTRBV序列的第一轮扩增在一个混合PCR反应中进行,该反应合并表3和表4中列出的所有引物加反向引物mTRAC(SEQ ID NO:266)和mTRBC(SEQ ID NO:269)。在第一轮扩增后,进行两个独立的巢式PCR反应:一种用于使用表7中列出的所有引物加上反向引物mTRACn(SEQ ID NO:271)扩增mTRAV,以及使用表8中列出的所有引物加上反向引物mTRBCn(SEQ ID NO:273)扩增mTRBV的第二扩增反应。通过溴化乙锭凝胶电泳分析来自两个平板中每一块的前24个孔(图9B)。对于两块板中的孔A1-A8,B1-B8和C1-C8中的每个单细胞,mTRAV扩增显示在顶部,mTRBV扩增显示在底部。mTRAV和mTRBVDNA扩增的产物显示出不同的大小,因为它们来自多克隆T细胞群并且代表来自整个T细胞库的变体。
图10是绘制单T细胞的IL-2表达的图。通过使用BD iMag链霉亲和素珠和生物素化的人抗-CD4抗体从PBMC阳性选择来分离CD4+人T细胞。将细胞培养5天并用抗CD3/抗CD28DYNA珠活化16小时以模拟抗原呈递细胞(APC)或未刺激的对照细胞对T细胞的活化。孵育16小时后,将CD4+细胞以384孔PCR板中每孔一个的方式分选。完成RNA提取和cDNA转化。将五分之一的cDNA(2μL)用于人IL-2的基因表达分析,并与RLP13A的表达进行比较,其用作使用实时PCR进行标准化的参比基因。在从单细胞产生的cDNA的一部分中进行qPCR,活化的细胞基于它们的IL-2水平鉴定,其与未刺激的对照单细胞相比从两倍增加到几百倍增加。
图11A-F.用他处描述的与抗DEC205抗体偶联的H60肽(LTFNYRNL;SEQ ID NO:278)或OVA肽(SINFEKL;SEQ ID NO:279)疫苗接种野生型雌性C57Bl/6小鼠(Li等,Blood,118:5965-76(2011))。(A)来自用H60-MHC1四聚体染色的单个H60疫苗接种小鼠的脾细胞。该图在活、CD8+、TCR+和CD4-细胞上门控。将单个CD44hi四聚体+细胞(如图中绘制的门控所限定)分选到384孔板的各个孔中,并通过巢式PCR扩增α和βTCR链。使用表3和表4中的所有引物,联合TCRα和TCRβ指向的反向引物(分别为SEQ ID NO:266和SEQ ID NO:269),进行第一轮扩增。对于第二轮,将第一轮PCR产物的部分用于在两个分开的反应中扩增TCRα或TCRβ链,一个反应中,采用表7中包括的所有引物的多重体(multiplex)加上反向引物(SEQ ID NO:271),另一个反应中,采用表8中列出的所有引物加上反向引物(SEQ ID NO:273)。(B)来自用OVA-MHC 1四聚体染色的单个OVA疫苗接种小鼠的脾细胞。该图在活、CD8+和TCR+细胞上门控。将单个CD44hi四聚体+细胞(如图中绘制的门控所限定)分选到384孔板的各个孔中,并通过巢式PCR扩增α和βTCR链。使用表3和表4中的所有引物,联合TCRα和TCRβ指向的反向引物(分别为SEQ ID NO:266和SEQ ID NO:269),进行第一轮扩增。对于第二轮,将第一轮PCR产物的部分用于在两个分开的反应中扩增TCRα或TCRβ链,一个反应中,采用表7中包括的所有引物的多重体(multiplex)加上反向引物(SEQ ID NO:271),另一个反应中,采用表8中列出的所有引物加上反向引物(SEQ ID NO:273)。(C)为了证实该方法可以鉴定克隆上不同的群体,使用桑格测序对来自各个孔的α(数据未显示)和β链进行测序。对于H60疫苗接种小鼠,对198个TCR+孔进行测序,代表来自两只小鼠的细胞。对于OVA疫苗接种小鼠,对54个TCR+孔进行测序,代表来自四只小鼠的克隆的TCR。单独使用TRBV表明这些方法可用于分离克隆不同的群体。基于测序结果,从H60特异性TCR对的扩增中选择五个独特的TCR对。使用无缝克隆技术,将这些TCR对克隆到逆转录病毒载体中,并使用58-/-TCR-/-杂交瘤评估这些载体在细胞表面上表达TCR的能力。使用从单T细胞克隆的TRBV2序列和TRAV13D-2序列构建所用的TCR病毒载体。用表达TCR的病毒感染后,用抗Vβ4(TRBV2的基因产物)对细胞染色,并通过流式细胞术评估。(D)未感染的58-/-TCR-/-杂交瘤用抗Vβ4染色并评估Tdtomato基因的表达。(E)用表达TRBV15的病毒感染细胞并用抗Vβ4染色并评估Tdtomato基因的表达。(F)用表达TRBV2的病毒感染细胞并用抗Vβ4染色并评估Tdtomato基因的表达。
图12A-B.TCR-/-4G4杂交瘤细胞系是用NFAT-RE荧光素酶质粒转染的细胞系(Clipstone等,Nature,357:695-7(1992))。(A)使用无缝克隆技术组装表达TCRαβ和eGFP的病毒构建体,并使用PLAT-E细胞产生逆转录病毒。用TCR逆转录病毒感染4G4细胞,24小时后通过流式细胞术评估TCRβ表达和eGFP表达。未感染的细胞(左图)不表达GFP,并且没有针对TCRβ的染色。感染的培养物含有表达TCRβ和eGFP的细胞(右图的右上象限)。(B)将感染或未感染的细胞培养物与平板结合的抗CD3抗体一起培养3.5小时。将由表达TCR的培养物(感染的)产生的相对光单位(RLU)与没有感染的细胞(未感染的)的RLU进行比较。
图13是实施例7中所述的一个实施方式的概述的示意图。
图14是基于pMIGII逆转录病毒载体的受体载体的示意图。使用Gibson组装克隆方法在pMIGII逆转录病毒载体中组装包含含有PmeI和RsrII的限制性识别位点的27个核苷酸的接头和TCRβ链恒定区的合成DNA片段。得到的载体长度为6.95kb。
图15是与片段b和巢式α和βPCR产物组装的线性化受体载体的示意图。用限制酶PmeI和RsrII线性化的受体载体在与片段b的单个Gibson反应中组装,片段b含有TCRα恒定区和2a元件,以及未知TCR的αVJ和βVDJ巢式PCR产物。得到的逆转录病毒载体大小(大约8.1kb)将根据组装的α和β链的长度稍微变化。
图16是说明Gibson组件(GA)下游的两种不同克隆策略的图。左侧的流程图描绘了中等通量策略(策略1),右侧是高通量策略(策略2)。
图17是实施例7中所述的PCR策略,用于从重排的cDNA扩增任何VαJα和VβDβJβ。使用结合多个Vα和Vβ基因区段的前导序列的正向引物库和结合Cα或Cβ的两个反向引物,对来自单T细胞的RNA或克隆T细胞的RNA进行RT-PCR。5'端的所有Vα引物具有20nt的共同序列,其与线性化的pMIGII的5'端重叠,并且所有Vβ引物在5'端含有20nt的共同序列,其与片段b的3'端重叠。用正向引物和反向引物进行称为“巢式PCR”的第二次PCR,所述正向引物结合Vα或Vβ共有序列的最后18nt,所述反向引物结合Cα或Cβ的前20nt。Vα和Vβ扩增子分别与载体或片段b,具有完整前导序列的VαJα和VβDβJβ以及Cα或Cβ的前20nt包含18nt重叠。
图18显示了在实施例7的Gibson组装后筛选阳性组装载体的ClaI限制性消化。消化后的预期条带大小约为6700nt和1400nt。凝胶显示克隆13C2和1B9T细胞杂交瘤的TCR的效率约为50%。
图19显示TCR表达和T细胞功能。每个13C2或1B9TCR的三个组装的逆转录病毒载体在4G4细胞中转导。通过流式细胞术评估4G4细胞膜上的13C2(A)和1B9(B)TCR表达。GFP的双阳性染色(包含在RV载体中)和各自的Vβ表示表达TCR的细胞的百分比。(C)用1B9或13C2转导并用AM14Vk8R B细胞刺激的4G4的IL-2分泌,其可呈递PL2-3抗原,和PL2-3(黑条)或不相关的抗IgM(白条)。显示了对每种TCR用三个转导事件的刺激。
图20是显示Gibson组装的凝胶。显示了使用不同DNA浓度和DO11.10TCR的Gibson组装的两个测试。箭头指向纠正ClaI消化模式并纠正组装的pMIGII载体和DO11.10TCR。
图21是说明P2A核苷酸和氨基酸序列的示意图。显示了与(多个)第一正向Vβ引物的近似同源区域(重叠)。
图22是说明片段b核苷酸序列的示意图。显示了与扩增子的近似同源区域(重叠)。
图23是说明受体载体pMIGII中Cβ核苷酸序列的示意图。
具体实施方式
本文提供了从单T细胞克隆功能性TCR所涉及的方法和材料。例如,该文献提供了用于从单T细胞获得编码TCR的核酸并且安排该核酸以形成核酸载体的方法和材料,所述核酸载体经成功设计以表达TCR(例如,完全完整的TCR,例如具有单T细胞中存在的可变链组合的完全完整的TCR)。通常,从单T细胞克隆功能性TCR的方法可包括以下步骤:将T细胞分选到分开的位置,裂解单T细胞以释放RNA,进行逆转录以从释放的RNA产生cDNA,进行巢式扩增反应,以产生针对各单T细胞的Vα(或Vγ)的第一扩增产物和针对各单细胞的相同巢式扩增反应混合物中各单T细胞的Vβ(或Vδ)的第二扩增产物,和,将第一和第二扩增产物克隆到表达载体中(图1)。在一些情况下,来自逆转录步骤的cDNA的部分可用于进行扩增反应(例如,PCR或定量PCR(qPCR))以检测其它基因(例如,IFNγ)在单T细胞中的存在、不存在或表达量(图1)。
可如本文所述获得和使用任何类型的T细胞以产生设计用于表达功能性TCR的表达载体。例如,细胞毒性T淋巴细胞(CTL),调节性T细胞(Tregs),辅助性T细胞,肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL),原初T细胞,活化T细胞,记忆T细胞,具有已知抗原特异性的T细胞,具有未知抗原特异性的T细胞,MHC I类限制性T细胞的扩增群,MHC II类限制性T细胞的扩增群或其组合,可如本文所述获得并用于产生设计以表达功能性TCR的表达载体。在一些情况下,含有不同类型T细胞的混合物(例如,MHC I类限制性T细胞和MHC II类限制性T细胞的混合物)的样品可如本文所述获得并用于获得经设计以表达功能性TCR的表达载体。
另外,含有活T细胞的任何合适样品均可用于获得可如本文所述使用的T细胞。含有可如本文所述用于产生表达载体的T细胞的样品的示例包括但不限于:血液样品,外周血单核细胞(PBMC)样品,分离的淋巴细胞样品,组织样品(例如皮肤,淋巴结样品,粘膜组织,皮肤或粘膜组织内的病毒病灶,或肿瘤样品),细胞培养样品(如T细胞系的细胞培养样品,所述T细胞系如Jurkat细胞,1301细胞或T细胞白血病细胞系),对于特定抗原或疫苗的T细胞离体扩增样品,以及来自近期死亡小鼠或人尸体的组织的样品。可用作本文所述方法的T细胞来源的组织样品的示例包括但不限于淋巴结样品,肿瘤样品,胸腺样品,骨髓样品,肠活检样品,肺活检样品,肾活检样品,和器官移植活检样品。任何合适类型的肿瘤样品均可用作本文所述方法的T细胞来源,包括但不限于,乳腺肿瘤样品,前列腺肿瘤样品,结肠癌样品,肺癌样品,黑素瘤样品和胰腺癌样品。在某些情况下,含有T细胞的样品可获自炎症部位,组织排斥部位,感染部位,疾病部位,免疫应答部位,自身免疫浸润部位,过敏反应部位,肿瘤部位或移植反应部位。当使用组织样品如肿瘤样品时,可从哺乳动物(例如人)获得组织样品(例如,肿瘤样品)并破碎或消化以形成包含T细胞的细胞悬液。在一些情况下,组织样品(例如,肿瘤样品)可获自用治疗性疫苗治疗的哺乳动物(例如,人),伴随或不伴随免疫调节疗法,以从该组织样品(例如,从所述肿瘤样品)获得抗原特异性T细胞的群体。
在一些情况下,为了获得TIL,可以消化获自切除的实体瘤和/或肿瘤活检的组织,以形成单细胞悬浮液。可对单细胞悬浮液针对T细胞特异性标志物和/或肿瘤相关细胞特征进行染色,以区分T细胞和肿瘤细胞。可以基于肿瘤亚型选择肿瘤特异性表面标志物(例如,对于某些黑素瘤,可采用表面蛋白Met-72)。在某些情况下,可使用DyeCycleTM试剂来确定细胞周期和/或染色,如7AAD染色(针对细胞DNA含量),碘化丙锭染色和/或Hoechst染色(针对DNA含量)(Loken,Cytometry,1(2):136-142(1980);以及Schmid和Sakamoto,Curr.Protoc.Cytom.,第7章:第7单元16(2001))。在一些情况下,肿瘤细胞可在免疫细胞相关表面蛋白不存在(例如不存在CD45,CD4,CD8,TCRβ,CD11b,CD19或其组合)的情况下鉴定。可以分选区分的T细胞和肿瘤细胞,并且如本文所述从T细胞克隆TCR。在一些情况下,分选的肿瘤细胞可经分离并做进一步分析(例如,测序)。这种双重分选系统可以同时获得来自肿瘤细胞和相关TIL的遗传信息。
在一些情况下,可采用显微切割技术,如激光微束显微切割(LMM),激光压力弹射(LPC),膜固定组织的微解剖(MOMeNT),或激光捕获显微切割(LCM)来将T细胞与其它细胞(例如,肿瘤细胞或患病组织)分离,如他处所述(Pinzani等,Mol.Aspects Med.,27:140-59(2006);和Tjernlund等,PloS One,11:e0149907(2016))。
在一些情况下,用于本文提供的方法的含有T细胞的样品可以是新鲜分离的T细胞的样品,所述T细胞未扩增以产生T细胞克隆。
如本文所述使用的用于产生表达功能性TCR的表达载体的T细胞可来自任何合适的哺乳动物。例如,可以如本文所述使用来自人,猴,马,牛物种,猪,狗,猫,大鼠或小鼠的T细胞以产生设计用于表达功能性TCR的表达载体。
一旦获得T细胞,就可以使单T细胞置于单一位置(例如,一个T细胞/孔)的方式将它们分选到例如容器(例如多孔板)的分开位置。可以使用任何合适的细胞分选方法将单T细胞分选到分开的位置。例如,T细胞群可以用结合特定标志物的特定荧光剂染色,并使用细胞分选器将单细胞分选到多孔板的分开的孔中。在某些情况下,荧光剂如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE),荧光标记的抗体(例如,荧光标记的抗CD3抗体,荧光标记的抗CD4抗体,荧光标记的抗CD8抗体,荧光标记的抗CD69抗体,荧光标记的抗CD40L抗体,荧光标记的抗CD44抗体或荧光标记的抗CD62L抗体),荧光标记的肽-四聚体复合物(例如,荧光标记的肿瘤抗原-四聚体复合物),或其组合,可用于对T细胞进行染色,用于细胞分选。例如,荧光标记的抗CD3抗体(例如,荧光素标记的抗CD3抗体,如FITC-OKT3)和荧光标记的抗CD8抗体(例如,藻红蛋白标记的抗CD8抗体,如PE-SK1)可用于染色CD8+T细胞,从而可将单CD8+T细胞分选到分开的位置。可在细胞分选期间使用的荧光标记物的示例包括但不限于荧光素,藻红蛋白,Cy3,Cy5,罗丹明,Alexa 488和亮紫。
在一些情况下,不同于那些经设计用于帮助鉴定和分选T细胞(例如CD3+T细胞)或特定类型的T细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)的一种或多种荧光剂(例如,荧光标记的抗体)可在分选过程中使用,以提供关于分选的T细胞表型的其它信息,即便来自那些荧光剂的荧光信号可以或可以不用于分选T细胞。例如,结合表面蛋白或标志物如PD-1,TIM3,LAG3,CD28,CD152,CD44,CD69,CD107a,CD11b,CD62L,CD127,CD30,CD27或CD45RA/CDR45O的荧光剂可用于捕获关于各个分选的T细胞的那些表面蛋白或标志物的表达信息。由于每个分选的单T细胞的特定位置是已知的,因此那些特定分选的T细胞中每一个的各荧光信号的水平也是已知的,并且可与它们来源的T细胞相关联。例如,在使用荧光标记的抗CD3抗体,荧光标记的抗CD8抗体,荧光标记的抗CD28抗体和荧光标记的抗CD152抗体的细胞分选过程中,来自所有四种抗体的荧光信号可经捕获并分配到产生这些信号的细胞,其中来自抗CD3和抗CD8抗体的信号用于将细胞鉴定为CD3+/CD8+T细胞,从而该T细胞可被分选到容器的特定单独位置。在这种情况下,即使两种(即CD28和CD152标志物)未用于实际分选,全部四种标志物的荧光水平也可分配给产生这些信号的T细胞。
在将T细胞分选到分开的位置(例如,孔)时获得的该表达信息可提供关于单细胞分选的T细胞的重要信息。例如,利用该信息,在基于来自早期分选过程期间来自荧光标记的抗CD28抗体的荧光信号构建之后,可从例如CD28+T细胞选择表达如本文所述产生的TCR的表达载体,即便CD28+表达不用作分选标准(例如,CD28+和CD28-T细胞在分选过程中都是单细胞分选的)也是如此。在一些情况下,CD45RO可以用作鉴定原初T细胞的标志物,并且CD45RA可以用作鉴定引发的T细胞(例如,引发的人T细胞)的标志物。
在一些情况下,来自任何特定荧光剂的染色的存在(或不存在)可以用作分选的标准,在这种情况下,表达从那些分选的单T细胞产生的TCR的每个表达载体将来自荧光剂标志物呈阳性(或阴性)的T细胞。例如,当以CD28+染色的存在作为分选标准时,表达TCR的各表达载体表达由单CD28+T细胞产生的TCR。在这种情况下,关于特定染色程度(例如,CD28+染色程度)的信息可以与分选和使用的各单T细胞相关联,即使该标志物用作分选标准也是如此。在评估克隆的TCR的功能属性时,此信息非常有用。
当在本文所述的方法过程中分选T细胞时,可以使用任何合适的容器。例如,可以使用多孔板,例如96孔板,384孔板,1536孔板或微管。在一些情况下,容器可经设计以保持在空间上彼此分离的各个液滴,从而形成每个液滴包含单T细胞(例如,1个T细胞/液滴)的分开的位置。例如,如他处所述(Kanz等,Cytometry,7:491-4(1986)),可以将单T细胞分选进入表面(例如,平坦表面)上的单个液滴。
在一些情况下,可以使用一块或多于一块多孔板,如本文所述进行单独的TCR克隆程序。例如,可以使用两个或更多个(例如,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50或更多个)384孔板或1536孔板来使用本文所述的方法从获自单一来源(例如,来自一个人)的单T细胞克隆TCR。尽管不是所期望的,但在一些情况下,将单T细胞分选到分开的位置可能会导致具有两个或更多个T细胞的一些分开的位置(例如,一些分开的孔)。具有可能多于一个T细胞的位置可以保持在克隆过程中,因为来自两个细胞的产物的约25%可以重建至少一个起始细胞的真实TCR,并且可在随后的筛选过程中被鉴定。
当在本文所述的方法过程中,可采用任何合适的细胞分选器来分选T细胞。可以使用的细胞分选器的示例包括但不限于BD FACSAria II分选器,BD FACSAria III分选器,MOFLO XDP分选器,MOFLO Astrios EQ分选器,Sony iCyt SY3200细胞分选器和SonySH800S细胞分选器。当分选T细胞时,含有分选的T细胞的雾化液滴的体积可以为约1nL至约4nL,并且,含有分选的T细胞的液滴可收集在约0.1μL至约5μL(例如,约0.5μL至约5μL、约1μL至约5μL、约2μL至约5μL、约0.5μL至约4μL、约0.5μL至约3μL、约0.5μL至约2μL或约0.5μL至约1μL)的流体体积中。
一旦对T细胞进行分选(例如,1个T细胞/孔),就可以裂解单T细胞以释放每个T细胞的RNA。可以使用任何合适的方法以裂解分选进入分开的位置的单T细胞。例如,可采用超声处理,一个或多个冷冻/解冻循环,采用一种或多种细胞裂解剂的处理,加热,渗透压,酶促消化或其组合来裂解单T细胞,以释放RNA。
在释放单T细胞的RNA后,可以进行逆转录以从释放的RNA产生cDNA。可采用任何合适的引物组和作为模板的RNA,从释放的RNA产生cDNA。在一些情况下,随机寡聚体可用于从单T细胞释放的RNA产生cDNA。可用作引物以从释放的RNA产生cDNA的随机寡聚物的示例包括但不限于:随机六聚体引物,随机九聚体引物,随机十聚体引物或随机十五聚体引物。在一些情况下,多聚T引物(例如,寡聚(dT)18引物)可用于从释放的RNA产生cDNA。在一些情况下,对编码TCR的RNA具有特异性的引物可单独使用或与对编码其它多肽的RNA具有特异性的引物一起使用,以从释放的RNA产生cDNA。例如,对编码TCR的RNA具有特异性的引物可与对编码任何其它多肽(其表达或表达水平被评估,例如,TNF-α,IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,IL-13或IL-17)的RNA具有特异性的引物一起使用。
可采用任何合适的逆转录酶进行逆转录,以从释放的RNA产生cDNA。可如本文所述使用的逆转录酶的示例包括但不限于:禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶(普洛麦格(Promega)市售可得)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶如SuperscriptIII,Superscript IV(赛默飞世尔(ThermoFisher Scientific)市售可得),iScript(伯乐(Biorad)市售可得)和Accuscript HiFi(安捷伦(Agilent)市售可得)。用于进行逆转录的其它成分可包括但不限于,dNTP,非变性洗涤剂(例如IGEPAL CA-630),RNA酶抑制剂如RNasin(普洛麦格市售可得)和RNA酶OUT(赛默飞世尔市售可得)。
本文所述的逆转录反应可包括如下任选步骤:将RNA加热至约55℃至约75℃(例如,约60℃至约70℃,约62℃至约68℃,或约64℃至约66℃)的温度保持约2分钟至约10分钟(例如,约2分钟至约8分钟,约3分钟至约7分钟,或约4分钟至约6分钟)的一段时间。在一些情况下,逆转录反应可包括将RNA加热至约65℃保持约5分钟的步骤。该加热步骤可以在参与逆转录反应的一种或多种成分(例如,引物,dNTP,非变性洗涤剂或其组合)的存在下使用RNA进行。在一些情况下,除了逆转录酶,可采用逆转录反应中涉及的全部所需成分进行加热步骤。在进行任选的加热步骤后,可将样品置于冰上以进行引物结合。
本文所述的逆转录反应可通过如下方式进行:使RNA与逆转录酶在引物、dNTP和任选的洗涤剂(例如,非变性洗涤剂)存在下,于约30℃至约55℃(例如,约35℃至约50℃、约37℃至约47℃或约40℃至约45℃)的温度下接触持续约20分钟至约90分钟(例如,约25分钟至约80分钟、约30分钟至约60分钟,或约35分钟至约45分钟)的一段时间。在一些情况下,逆转录反应可在约42℃下进行约40分钟。
在一些情况下,使用本文所述的方法和材料,可以高通量和有效的方式从获自单T细胞的RNA产生高质量的cDNA。例如,在一个实施方式中,通过快速裂解各单T细胞并进行如本文所述的逆转录反应,可以高通量和有效的方式从单T细胞获得的RNA产生高质量的cDNA。在一些情况下,由单T细胞产生的所得cDNA可以具有如此高的质量,以至于部分(例如,约75%或更少,约50%或更少,约25%或更少,约10%或更少,约75%至约10%,约75%至约25%,约75%至约50%,约60%至约40%,约50%至约10%,或约50%的最终总cDNA反应混合物)可继续用于巢式扩增和克隆步骤,以成功获得表达具有该单T细胞中存在的可变链组合(或至少Vα区段和Vβ区段组合或至少Vγ区段和Vδ区段组合)的功能性TCR的表达载体。
在一些情况下,可以在进行逆转录反应之前,期间或之后,将用于进行本文所述的巢式扩增反应的一种或多种成分加入反应混合物中用于逆转录反应。例如,逆转录反应可如本文所述,在针对本文所述的第一轮巢式扩增反应的引物集合存在下,在针对本文所述的第二轮巢式扩增反应的引物集合存在下,在设计用于热循环的聚合酶(例如Taq聚合酶)存在下,或在其组合存在下进行。
在一些情况下,可以如本文所述进行逆转录反应,以在不存在用于进行本文所述的巢式扩增反应的一种或多种成分的情况下完成。例如,可以如本文所述进行逆转录反应,以在不存在针对本文所述的第一轮巢式扩增反应的引物集合的情况下,在不存在针对本文所述的第二轮巢式扩增反应的引物集合的情况下,在不存在设计用于热循环的聚合酶(例如,Taq聚合酶)的情况下,或在不存在其组合的情况下完成。
当仅使用产生的cDNA的部分来继续巢式扩增和克隆步骤以获得表达具有本文所述的该单T细胞中存在的可变链组合(或至少Vα区段和Vβ区段组合或至少Vγ区段和Vδ区段组合)的功能性TCR的表达载体时,从获自单T细胞的RNA产生的其余cDNA(或其余cDNA的部分)可用于,通过诸如PCR检测基因表达的存在或不存在的技术,或通过诸如qPCR检测基因表达的水平的技术,来获得关于单T细胞表型的其它重要信息。例如,由单T细胞产生的cDNA的部分(例如,约75%或更少,约50%或更少,约25%或更少,约10%或更少,约75%至约10%,约75%至约25%,约75%至约50%,约60%至约40%,约50%至约10%,或约50%的最终总cDNA反应混合物)可用以检测由单细胞分选的T细胞显示的RNA表达的存在、不存在或量。可如本文就单细胞分选的T细胞所述评估任何特定RNA的表达(或其缺失)。例如,可以确定单T细胞的编码多肽,例如细胞因子(例如,TGF-β,TNF-α,IFN-γ,EBI3,p40,p35,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13或IL-17),受体(例如,CD3,CD25,CD27,CD28,CD30,CD40L,CD122,CXCR3,CXCR6,CCR5,CCR6,CCR7,FASL,LFA-1,ICOS,CTLA-4,PD-1,LAG3,Tim-3或VLA-4),转录因子(例如,RORγT,FOXP3,FOXO1,RUNX1,T-bet,脱中胚蛋白(Eomesdermin),Gata-3,Bcl-2,Bcl-6,BIM,Blimp-1或p53),酶(例如,颗粒酶A,颗粒酶B,DNA甲基转移酶,或组蛋白/蛋白质脱乙酰酶(HDAC)如HDAC1或HDAC9),细胞因子信号转导抑制剂(例如,SOCS1或SOCS9),κB激酶抑制剂或趋化因子(例如CCL2/MCP-1,CCL3/MIP-1α,CCL4,CCL5/RANTES,CCL6,CXCL12或CXCL16)的RNA的存在,不存在或量。在一些情况下,可以确定本文所述的单T细胞的微小RNA(例如,miRNA-17,miRNA-31,miRNA-139或miRNA-150)的存在,不存在或量。在一些情况下,如本文所述评估的单T细胞的RNA表达的存在,不存在或量可用于鉴定具有所需表型的特定单T细胞。例如,可以通过检测IL-2或IFN-γRNA表达的存在或量来将单T细胞鉴定为被活化。
可以使用任何合适的技术,利用由本文所述的单T细胞产生的cDNA来检测特定RNA的RNA表达的存在或不存在。例如,PCR,实时PCR或包括使用荧光探针(例如SYBR Green)或Taqman探针的PCR可用于检测特定RNA的RNA表达的存在或不存在。同样地,可采用任何合适的技术,使用由本文所述的单T细胞产生的cDNA来检测特定RNA的RNA表达量。例如,qPCR可用于检测特定RNA的RNA表达量。
几种靶标可以直接从cDNA中预扩增或扩增,并使用特定引物对和/或用荧光染料(如FAM,TET,HEX,JOE,Cy3,TAMRA,Rox,LCRed,Texas Red,LC640或Cy5)标记的Taqman探针和猝灭剂(如BHQ1,BHQ2,BHQ3,TAMARA,DABCYL或Iowa Black FQ)同时分析。在一些情况下,靶mRNA的表达水平的定量可以针对一种或多种参考核酸标准化。可用于标准化的参考核酸的示例包括但不限于ACTB,ALAS1,B2M,GAPDH,HBB,HMBS,HPRT1,IPO8,PGK1,PPIA,RPLP0,RPL13A,SDHA,TBP,TFRC,YWHAZ和18S。软件例如NormFinder可用于鉴定可用于标准化的稳定核酸。
由获自单T细胞的RNA产生cDNA的全部或部分(例如,约四分之一,约三分之一,约一半,约三分之二,或约四分之三)可用于进行设计用于在单一反应混合物中产生至少两种扩增产物的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)(图1)。对于单αβ或γδT细胞,第一扩增产物可分别包括α链的V区段(Vα)或γ链的V区段(Vγ),并且对于相同的单αβ或γδT细胞,第二扩增产物可包括β链的V区段(Vβ)或δ链的V区段(Vδ)。在一些情况下,第一和第二扩增产物可以编码全长V区段,因为它们存在于提供源RNA的单T细胞中。例如,具有带有Vα1.2区段和Vβ11.3区段的TCR的人αβT细胞可被分选到分开的孔中并裂解以释放T细胞的RNA。该RNA可用于通过逆转录产生cDNA,并且该产生的cDNA可用作巢式扩增反应中的模板以产生第一扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在的全长Vα1.2区段的核酸序列,和第二扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在的全长Vβ11.3区段的核酸序列。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可分别包括单αβ或γδT细胞的α链的V和J区段(VαJα或VJα)或γ链的V和J区段(VγJγ或VJγ)。例如,第一扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在的全长Vα和Jα区段,或第一扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在的全长Vγ和Jγ区段。在一些情况下,对于单个αβ或γδT细胞,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可分别包括前导序列(L)和α链的V和J区段(L-VαJα或L-VJα)或L序列和γ链的V和J区段(L-VγJγ或L-VJγ)。例如,第一扩增产物可编码全长L序列和全长Vα和Jα区段,因为它们存在于提供源RNA的单个αβT细胞中,或第一扩增产物可编码全长L序列和全长Vγ和Jγ区段,因为它们存在于提供源RNA的单个γδT细胞中。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可分别包括单αβ或γδT细胞的α链的V和J区段和至少部分恒定(C)区(VαJαCα或VJCα)或γ链的V和J区段和至少部分C区(VγJγCγ或VJCγ)。例如,第一扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在形式的全长Vα和Jα区段和至少部分Cα,或第一扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在形式的全长Vγ和Jγ区段和至少部分Cγ。
在一些情况下,对于单个αβ或γδT细胞,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可分别包括L序列、α链的V和J区段和至少部分C区(L-VαJαCα或L-VJCα)或L序列、γ链的V和J区段和至少部分C区(L-VγJγCγ或L-VJCγ)。例如,第一扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在形式的全长L序列、全长Vα和Jα区段和至少部分Cα,或第一扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在形式的全长L序列、全长Vγ和Jγ区段和至少部分Cγ。编码全长L序列、全长Vα和Jα区段和至少部分Cα的第一扩增产物的示例显示在图2A和3A的下图中。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可分别包括单αβ或γδT细胞的β链的V和D区段(VβDβ或VDβ)或δ链的V和D区段(VδDδ或VDδ)。例如,第二扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在的全长Vβ和Dβ区段,或第二扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在的全长Vδ和Dδ区段。在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可分别包括单αβ或γδT细胞的β链的V、D和J区段(VβDβJβ或VDJβ)或δ链的V、D和J区段(VδDδJδ或VDJδ)。例如,第二扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在的全长Vβ、Dβ和Jβ区段,或第二扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在的全长Vδ、Dδ和Jδ区段。在一些情况下,对于单个αβ或γδT细胞,本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可分别包括的L序列和β链的V、D和J区段(L-VβDβJβ或L-VDJβ)或L序列和δ链的V、D和J区段(L-VδDδJδ或L-VDJδ)。例如,第二扩增产物可编码全长L序列和全长Vβ、Dβ和Jβ区段(如它们在提供源RNA的单个αβT细胞中的存在形式),或第二扩增产物可编码全长L序列和全长Vδ、Dδ和Jδ区段(如它们在提供源RNA的单个γδT细胞中的存在形式)。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可分别包括单αβ或γδT细胞的β链的V、D和J区段和至少部分C区(VβDβJβCβ或VDJCβ)或δ链的V、D和J区段和至少部分C区(VδDδJδCδ或VDJCδ)。例如,第二扩增产物可编码提供源RNA的单个αβT细胞中存在形式的全长Vβ、Dβ和Jβ区段和至少部分Cβ,或第二扩增产物可编码提供源RNA的单个γδT细胞中存在形式的全长Vδ、Dδ和Jδ区段和至少部分Cδ。
在一些情况下,对于单个αβ或γδT细胞,本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可分别包括L序列、β链的V、D和J区段和至少部分C区(L-VβDβJβCβ或L-VDJCβ)或L序列、δ链的V、D和J区段和至少部分C区(L-VδDδJδCδ或L-VDJCδ)。例如,第二扩增产物可编码全长L序列、全长Vβ、Dβ和Jβ区段和至少部分Cβ(如它们在提供源RNA的单个αβT细胞中的存在形式),或第二扩增产物可编码全长L序列、全长Vδ、Dδ和Jδ区段和至少部分Cδ(如它们在提供源RNA的单个γδT细胞中的存在形式)。编码全长L序列、全长Vβ、Dβ和Jβ区段和至少部分Cβ的第二扩增产物的示例显示在图2B和3B的下图中。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一和/或第二扩增产物可从L序列的ATG起始位点开始并向下游进入L序列。其示例在图2A和2B的下图示出。
在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一和/或第二扩增产物可包括位于L序列上游的5'非翻译区的部分,因为该部分存在于提供源RNA的单T细胞中。其示例在图3A和3B的下图示出。当在本文提供的巢式扩增反应的第一和/或第二扩增产物中包含位于L序列上游的5'非翻译区的部分时,可包括从L序列的ATG起始位点前的核苷酸开始并在上游工作的任何合适长度的5'非翻译区。例如,来自5'非翻译区的0个核苷酸到约100或更多个核苷酸(例如,0个核苷酸到100个核苷酸,0个核苷酸到50个核苷酸,0个核苷酸到25个核苷酸,0个核苷酸到10个核苷酸,0个核苷酸到5个核苷酸,0个核苷酸到3个核苷酸,3个核苷酸到100个核苷酸,3个核苷酸到50个核苷酸,3个核苷酸到25个核苷酸,3个核苷酸到10个核苷酸,3个核苷酸到5个核苷酸,5个核苷酸到100个核苷酸,5个核苷酸至50个核苷酸,5个核苷酸至25个核苷酸,或5个核苷酸至10个核苷酸)可包括在第一和/或第二扩增产物中。在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可包括α或γ链的5'非翻译区的0至约100或更多个核苷酸(例如,0个核苷酸至100个核苷酸,0个核苷酸至50个核苷酸,0个核苷酸至25个核苷酸,0开始核苷酸至10个核苷酸,0个核苷酸至5个核苷酸,0个核苷酸至3个核苷酸,3个核苷酸至100个核苷酸,3个核苷酸至50个核苷酸,3个核苷酸至25个核苷酸,3个核苷酸至10个核苷酸,3个核苷酸5个核苷酸,5个核苷酸至100个核苷酸,5个核苷酸至50个核苷酸,5个核苷酸至25个核苷酸,或5个核苷酸至10个核苷酸),而本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可包括β或δ链的0至约100或更多个核苷酸(例如,0个核苷酸至100个核苷酸,0个核苷酸到50个核苷酸,0个核苷酸到25个核苷酸,0个核苷酸到10个核苷酸,0个核苷酸到5个核苷酸,0个核苷酸到3个核苷酸,3个核苷酸到100个核苷酸,3个核苷酸到50个核苷酸,3个核苷酸至5个核苷酸,3个核苷酸至10个核苷酸,3个核苷酸至5个核苷酸,5个核苷酸至100个核苷酸,5个核苷酸至50个核苷酸,5个核苷酸至25个核苷酸,或5个核苷酸至10个核苷酸)。
在一个实施方式中,第一和第二扩增产物可以编码全长VJ区段和全长VDJ区段,因为它们存在于提供源RNA的单T细胞中。例如,具有带有Vα1.2区段、Jα32区段、Vβ11.3区段、Dβ2区段和Jβ1-5区段的TCR的人αβT细胞可被分选到分开的孔中并裂解以释放T细胞的RNA。该RNA可用于通过逆转录产生cDNA,并且该产生的cDNA可用作巢式扩增反应中的模板以产生第一扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在形式的全长Vα1.2和Jα32区段的核酸序列,和第二扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在形式的全长Vβ11.3,Dβ2和Jβ1-5区段的核酸序列。
在另一个实例中,第一和第二扩增产物可编码包括L序列的全长VJ区段、包括L序列的全长VDJ区段,和至少部分各C区,因为它们存在于提供源RNA的单T细胞中。例如,具有带有包括L序列的Vα1.2区段、Jα32区段、Cα区、包括L序列的Vβ11.3区段、Dβ2区段、Jβ1-5区段和Cβ区的TCR的人αβT细胞可被分选到分开的孔中并裂解以释放T细胞的RNA。该RNA可用于通过逆转录产生cDNA,并且该产生的cDNA可用作巢式扩增反应中的模板以产生第一扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在形式的全长Vα1.2和Jα32区段(包括L序列)和Cα的5’端的至少部分的核酸序列,和第二扩增产物,其包括编码该人αβT细胞中存在形式的全长Vβ11.3,Dβ2和Jβ1-5区段(包括L序列)和Cβ的5’端的至少部分的核酸序列。
当在本文提供的巢式扩增反应的第一和/或第二扩增产物中包括C区的部分时,可包括从该C区的5'端开始的任何合适长度的C区。例如,C区的约15个核苷酸至约550个或更多个核苷酸(例如,约15个核苷酸至约550个核苷酸,约15个核苷酸至约450个核苷酸,约15个核苷酸至约400个核苷酸,约15个核苷酸至约300个核苷酸,约15个核苷酸至约200个核苷酸,约15个核苷酸至约100个核苷酸,约15个核苷酸至约50个核苷酸,约20个核苷酸至约550个核苷酸,约20个核苷酸至约450个核苷酸,约20个核苷酸至约400个核苷酸,约20个核苷酸至约300个核苷酸,约20个核苷酸至约200个核苷酸,约20个核苷酸至约100个核苷酸,或约20个核苷酸至约50个核苷酸)可包括在第一和/或第二扩增产物中。在一些情况下,本文提供的巢式扩增反应的第一扩增产物可包括Cα或Cγ区的前15至约450个核苷酸,并且本文提供的巢式扩增反应的第二扩增产物可包括Cβ或Cδ区的前15至约550个核苷酸。
如本文所述,本文提供的方法和材料可以允许用户成功地从分选的T细胞群捕获大多数(如果不是全部)功能性TCR。例如,本文提供的巢式扩增(例如,巢式PCR)程序可包括使用经设计用于扩增哺乳动物(例如人类)的特定TCR的两个可变链的每个已知功能性V区段(例如,特定αβTCR的α可变链和β可变链的任何已知功能性V区段或特定γδTCR的γ可变链和δ可变链的任何已知功能性V区段)的引物集合。对于人类,本文提供的巢式扩增程序可包括引物集合,其经设计用于扩增目前已知的具有功能性的α链的所有45个V区段和目前已知的具有功能性的β链的所有48个V区段。本文中当提及α链的TCR V区段时,可以使用简写缩写TRAV。同样,当本文中提及β链的TCR V区段时,可以使用简写缩写TRBV。对于γ和δ链的TCR V区段也是如此,其可分别称为TRGV和TRDV。目前已知在人类中具有功能性的45种TRAV列于表1的第二列,而目前已知在人类中具有功能性的48种TRBV列于表2的第二列中。
表1.靶向目前已知在人类中具有功能性的45种TRAV的引物。
W=A,T;R=A,G。
表2.靶向目前已知在人类中具有功能性的48种TRBV的引物。
Y=C,T;M=A,C。
#=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有四种引物排列。在某些情况下,可以替代该引物制备物,从而使用以下三种引物:CTCCCTTGAGAGTC-CTGTTC(SEQID NO:280),CTTCCTTGAGAGTCCTGTTC(SEQ ID NO:281)和CCCCCTTGAGAGTCCTGTTC(SEQ IDNO:282)。
在一些情况下,当使用含有如本文所述的表1的引物的引物组时,表1中列出的hTRAV38_2DV8_F引物可以用GGACCTGTGAGCATGGCATG(SEQ ID NO:283),GTTCAGATCAGAAGAGG-AGGCTTC(SEQ ID NO:284)或CTCAAGGTTCAGATCAGAAGAGGAG(SEQ IDNO:285)替代。
在一些情况下,当使用含有如本文所述的表1的引物的引物组时,表1中列出的hTRAV39_F引物可以用ATC-TGAGTTTTCAGTGAACTGGACAG(SEQ ID NO:286),CTCCTAAATCTGAG-TTTTCAGTGAACT(SEQ ID NO:287)或CAAGGCTCCTAAATCTGAGTTTT-CAGTG(SEQ ID NO:288)替代。
在一些情况下,当使用含有如本文所述的表2的引物的引物组时,表2中列出的hTRBV13_F引物可以用CAC-CCCAGGAGACCAGCAAC(SEQ ID NO:289),GGAGCAAAAGCCCTGCTTTCT(SEQ ID NO:290)或AAACGGTGAGGAGGAGCAAAAG(SEQ ID NO:291)替代。
在一些情况下,当使用含有如本文所述的表2的引物的引物组时,表2中列出的hTRBV14_F引物可以用CTTG-TAAGCTCCTTCTTCATCTGGAAATG(SEQ ID NO:292),CAGATTTGCTTTC-CTTTTTCTCATAC(SEQ ID NO:293)或TTACAGGGCCAAGAGACAGATTTG(SEQ IDNO:294)替代。
对于小鼠,本文提供的巢式扩增程序可包括引物集合,其经设计用于扩增目前已知的具有功能性的α链的所有104个V区段和目前已知的具有功能性的β链的所有22个V区段。目前已知在小鼠中具有功能性的104种TRAV列于表3的第二列,而目前已知在小鼠中具有功能性的22种TRBV列于表4的第二列中。
表3.靶向目前已知在小鼠中具有功能性的104种TRAV的引物。
Y=C,T;W=A,T;R=A,G。
#=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有四种引物排列。在某些情况下,可以替代该引物制备物,从而使用以下两种引物:AGGAAGGAGGAGAGAATGAAATC(SEQ ID NO:295)和AGGAAAGAAGAGAGAATGAAATC(SEQ ID NO:296)。
表4.靶向目前已知在小鼠中具有功能性的22种TRBV的引物。
R=A,G。
在本文提供的巢式扩增反应的第一轮扩增期间,可以使用任何合适的引物集合,以扩增包括α和β链或γ和δ链核酸的核酸。在一些情况下,引物集合可包括经设计用于扩增至少一种TRAV(或至少一种TRGV)的至少一种正向引物和经设计用于扩增至少一种TRBV(或至少一种TRGV)的至少一种正向引物。一般而言,对于人类,这意味着正向引物集合可以设计为包括至少45个正向TRAV特异性引物(对于人类中45个TRAV各一个)和至少48个正向TRBV特异性引物(对于人类中48个TRBV各一个),而对于小鼠,这意味着正向引物集合可以设计为包括至少104个正向TRAV特异性引物(对于小鼠中104个TRAV各一个)和至少22个正向TRBV特异性引物(小鼠中22个TRBV各一个)。例如,对于人类,对于α链的可能性(参见例如表1中列出的靶TRAV),一个正向TRAV引物可以设计用于扩增TRAV1-1,第二个正向TRAV引物可以设计用于扩增TRAV1-2,第三个正向TRAV引物可以设计用于扩增TRAV2,第四个正向TRAV引物可以设计用于扩增TRAV3,第五个正向TRAV引物可以设计用于扩增TRAV4等,并且,对于β链的可能性(参见例如,表2中列出的靶TRBV),一个正向TRBV引物可以设计用于扩增TRBV2,第二个正向TRBV引物可以设计用于扩增TRBV3,第三个正向TRBV引物可以设计用于扩增TRBV4-1,第四个正向TRBV引物可以设计用于扩增TRBV4-2,第五个正向TRBV引物可以设计用于扩增TRBV4-3等,总共至少93个正向TRAV和TRBV引物。
在一些情况下,当使用设计用于扩增至少一种TRAV(或至少一种TRGV)的至少一种正向引物和设计用于扩增至少一种TRBV(或至少一种TRDV)的至少一种正向引物以获得在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间扩增α和β链的可能组合(或γ和δ链的可能组合)的机会时,可合成大量引物并将其组合进入每一个单独的第一轮扩增反应。例如,当在人类的情况下使用至少93种不同的正向TRAV和TRBV引物以获得在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间扩增单细胞分选的T细胞中存在的人α和β链的可能组合(例如,表1和2中列出所有TRAV和的TRBV)的机会时,可合成大量(即,在该情况下至少93个)引物并将其组合进入每一个单独的第一轮扩增反应。在一些情况下,可以减少正向引物的数量而不丧失在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间扩增单细胞分选的T细胞中存在的α和β链的可能组合(或γ和δ链的可能组合)(例如,表1和2中列出的所有TRAV和TRBV)的能力。例如,单个正向TRAV引物可经设计以具有扩增多于一种不同TRAV的能力。这种人类引物的一个示例是hTRAV1_12_F引物(表1的引物#1),其设计用于扩增TRAV1-2和TRAV1-2。在一些情况下,单个正向TRBV引物可经设计以具有扩增多于一种不同TRBV的能力。这种用于人类的引物的示例包括但不限于:hTRBV4_123_F引物(表2的引物#3),其设计用于扩增TRBV4-1,TRBV4-2和TRBV4-3;hTRBV6_23_F引物(表2的引物#8),其设计用于扩增TRBV6-2和TRBV6-3;hTRBV10_12_F引物(表2的引物#14),其设计用于扩增TRBV10-1和TRBV10-2;和hTRBV12_34_F引物(表2的引物#18),其设计用于扩增TRBV12-3和TRBV12-4。
在某些情况下,当使用hTRAV1_12_F引物,hTRBV4_123_F引物,hTRBV6_23_F引物,hTRBV10_12_F引物和hTRBV12_34_F引物与不被这5种引物靶向的每种人TRAV和TRBV的其它引物组合时,在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间,用于扩增表1和2中列出的所有人TRAV和TRBV的正向引物的数量可从93个正向引物减少至81个。类似地,当使用单一引物靶向如表3和4所示的表3和4中列出的多种TRAV或TRBV时,在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增过程中,扩增表3和4中列出的所有小鼠TRAV和TRBV的正向引物的数量可从126个正向引物减少到64个。
多个TRAV序列(或多个TRBV、TRGV或TRDV序列)的序列比对可用于选择具有扩增多于一种不同TRAV(或多于一种不同的TRBV、TRGV或TRDV)的能力的单个正向TRAV引物(或单个正向TRBV、TRGV或TRDV引物)。例如,参照图5,ATG起始位点上游的5'非翻译区的部分的核苷酸序列,ATG起始位点,和多个TRAV的ATG起始位点下游的翻译区的部分(例如,小鼠TRAV13-1,TRAV13D-1,TRAV13N-1,TRAV13-2,TRAV13D-2,TRAV13N-2,TRAV13-3,TRAV13D-3,TRAV13N-3,TRAV13-4,TRAV13D-4,TRAV13N-4和TRAV13-5)可以比对。一旦比对,可选择引物的序列,例如图5的框中突出显示的对于mTRAV13_F的序列(SEQ ID NO:99)。在一些情况下,可以选择缺乏与任何比对的TRAV序列(或比对的TRBV、TRGV或TRDV序列)错配的引物序列。如图5所示,在一些情况下,可以选择相对于比对的TRAV序列(或比对的TRBV、TRGV或TRDV序列)具有一些错配(例如,一个或两个错配)的引物序列。例如,选择mTRAV13_F引物(SEQ IDNO:99)以与TRAV13D-1,TRAV13-2,TRAV13D-2,TRAV13-3,TRAV13-4,TRAV13D-4,TRAV13N-4和TRAV13-5中的每一个具有一个错配且相对于图5所示的其它5个TRAV没有错配。对于那些设计用于靶向具有一些错配(例如,一个或两个错配)的TRAV,TRBV,TRGV或TRDV序列的引物,可以通过使用所述设计的引物、反向引物和靶标的PCR测试来确认设计的引物扩增具有错配的靶标的能力。成功产生扩增的靶核酸可以证实该设计的引物扩增该靶标的能力,即使它含有错配。
在一些情况下,用于扩增单细胞分选的T细胞(例如,表1和表2中列出的所有TRAV和TRBV)中存在的人α和β链的可能组合(或γ和δ链的可能组合)的引物制备物的数量减少是可实现的。例如,单一引物制备物可以设计成含有两种或更多种序列的混合物的方式合成,每种序列靶向不同的TRAV或TRBV。例如,表1的hTRAV8_246_F引物可以使用5'-CCWCTGCTCAGCCATGCTC-3'(SEQ ID NO:10)序列合成,这将产生具有靶向TRAV8-2,TRAV8-4和TRAV8-6的分开序列的引物制备物。其它示例包括但不限于表1的hTRAV12_123_F引物,其可以使用5'-CCAGGGCAGARAAGAATGATG-3'(SEQ ID NO:14)序列合成,以产生具有靶向TRAV12-1,TRAV12-2和TRAV12-3的分开序列的引物制备物;表2的hTRBV5_468_F引物,其可以使用5'-CAGAAYTCACTCGGCTCTTC-3'(SEQ ID NO:44)序列合成,以产生具有靶向TRBV5-4,TRBV5-6和TRBV5-8的分开序列的引物制备物;表2的hTRBV6_1689_F引物,其可以使用5'-CYYCCTTGAGAGTCCTGTTC-3'(SEQ ID NO:47)序列合成,以产生具有靶向TRBV6-1,TRBV6-6,TRBV6-8和TRBV6-9的分开序列的引物制备物;表2的hTRBV7_24_F引物,其可以使用5'-CCTCTGCTCCTGCTCAYAGTGA-3'(SEQ ID NO:51)序列合成,以产生具有靶向TRBV7-2和TRBV7-4的分开序列的引物制备物;表2的hTRBV7_36789_F引物,其可以使用5'-CAGTGACMCTGATCTGGTAAAG-3'(SEQ ID NO:52)序列合成,以产生具有靶向TRBV7-3,TRBV7-6,TRBV7-7,TRBV7-8和TRBV7-9的分开序列的引物制备物;表2的hTRBV11_13_F引物,其可以使用5'-TCCCACYTCCTCTGC-TCCTG-3'(SEQ ID NO:56)序列合成,以产生具有靶向TRBV11-1和TRBV11-3的分开序列的引物制备物。
在一些情况下,对于人类,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括表1和2中列出的TRAV和TRBV引物或表1和2中列出的TRAV和TRBV引物的子集。例如,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括表1中列出的1种,5种,10种,20种,30种,35种或更多种TRAV引物,可以包括表2中列出的1种,5种,10种,20种,30种或更多种TRBV引物,或者可以包括表1和2中列出的1,5,10,20,30,40,50,60,70或更多种TRAV和TRBV引物。在一些情况下,对于人类,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可以包括表1和2中列出的TRAV和TRBV引物,并且没有具有序列Vα或Vβ区段、Vα或Vβ区段的L序列,或Vα或Vβ区段上游的5'非翻译区的其它引物。在某些情况下,在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间使用一组减少的正向引物制备物(例如表1和表2中列出的72种)以获得扩增单细胞分选的T细胞中存在的人α和β链的可能组合(例如,所有表1和表2中列出的所有TRAV和TRBV)的机会可导致跨越许多不同的不同位置(例如,跨越许多不同的孔)的有效扩增和有效下游克隆(例如,基于包含单T细胞的分开位置的数量,大于80%,85%,90%或95%的成功率)。
在一些情况下,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可以被分成两个或更多个子集,每个子集用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增,采用由单T细胞获得的cDNA的部分作为模板。在一些情况下,例如对于人类,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可以分成两个或更多个子集(例如,仅具有表1中列出的TRAV引物的第一子集和仅具有表2中列出的TRBV引物的第二子集,或表1和2中列出的TRAV和TRBV引物的第一子集以及表1和表2中列出的TRAV和TRBV引物的第二子集),每个子集用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增,使用从单T细胞获得的cDNA的部分作为模板。例如,使用从单T细胞获得的cDNA的部分,使用表1中列出的引物和一个或多个反向引物的对于TRAV的第一轮扩增反应可以与使用表2中列出的引物与一种或多种反向引物一起的对于TRBV的第一轮扩增反应分开进行。这些分开的第一轮扩增反应之后可以进行巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序)的分开的第二轮扩增。例如,对于TRAV,可以使用表5中列出的引物和一种或多种反向引物,对于TRBV,可以使用表6中列出的引物和一种或多种反向引物。在一些情况下,可以合并用于相同单细胞的分开的第一轮扩增反应,并且那些合并的混合物可用作巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序)的第二轮扩增的模板。例如,使用从单T细胞获得的cDNA的部分,采用表1中列出的引物和一个或多个反向引物的对于TRAV的第一轮扩增反应可以与使用表2中列出的引物与一种或多种反向引物一起的对于TRBV的第一轮扩增反应分开进行,随后对于TRAV和TRBV两者,采用表5和表6中列出的引物与反向引物一起进行一次混合巢式扩增反应(例如,巢式PCR)。
在某些情况下,如果使用独特的TRAV和TRBV组合鉴定特定TCR,则可使用第一轮扩增反应来鉴定CDR3区中的变体,该第一轮扩增反应采用针对该特定TRAV具有特异性的一个正向引物(例如,表1中列出的正向引物之一)连同一种或多种反向引物一起,以及对特定TRBV具有特异性的一个正向引物(例如,表2中列出的正向引物之一)连同一种或多种反向引物一起。例如,可使用表1中列出的正向引物hTRAV8-246_F(SEQ ID NO:10)连同一个或多个反向引物一起,和表2中列出的正向引物hTRBV12-34_F(SEQ ID NO:58)连同一个或多个反向引物。
在一些情况下,当要扩增一组TRAV和一组TRBV的组合时,可以仅使用表1和表2中列出的对于那些TRAV和TRBV具有特异性的部分引物。
在一个实施方式中,表1中列出的TRAV引物的第一子集(例如,表1的正向引物编号#1-36和39-40),表1中列出的TRAV引物的第二子集(例如,表1的正向引物编号#37-38),表2中列出的TRBV引物的第一子集(例如,表2的正向引物编号#1-19和22-32),和表2中列出的TRBV引物的第二子集(例如,表2的正向引物编号#21-22)可与本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的四个不同组合中的TRAV的一个或多个反向引物和TRBV的一个或多个反向引物一起使用(例如,第一TRAV子集加第一TRBV子集,第二TRAV子集加第一TRBV子集,第一TRAV子集加第二TRBV子集,第二TRAV子集加第二TRBV子集)。在这些情况下,得到的第一轮反应混合物可单独或在合并后用于巢式扩增程序的第二轮扩增。类似的技术可以与表3和4的小鼠引物一起使用和/或用于本文所述的第二轮扩增。
在一些情况下,例如对于小鼠,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括表3和4中列出的TRAV和TRBV引物或表3和4中列出的TRAV和TRBV引物的子集。例如,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括表3中列出的1种,5种,10种,20种,30种,35种或更多种TRAV引物,可以包括表4中列出的1种,5种,10种,20种,30种或更多种TRBV引物,或者可以包括表3和4中列出的1,5,10,20,30,40,50,60,70或更多种TRAV和TRBV引物。在一些情况下,对于小鼠,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可以包括表3和4中列出的TRAV和TRBV引物,并且没有具有序列Vα或Vβ区段、Vα或Vβ区段的L序列,或Vα或Vβ区段上游的5'非翻译区的其它引物。在某些情况下,在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增期间使用一组减少的正向引物制备物(例如表3和表4中列出的53种)以获得扩增单细胞分选的T细胞中存在的小鼠α和β链的可能组合(例如,所有表3和表4中列出的所有TRAV和TRBV)的机会可导致跨越许多不同的不同位置(例如,跨越许多不同的孔)的有效扩增和有效下游克隆(例如,基于包含单T细胞的分开位置的数量,大于80%,85%,90%或95%的成功率)。
在一些情况下,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的一些或全部正向引物可以完全由与编码TCR的cDNA的核酸退火的序列(具有不多于一个,两个或三个错配,例如,不超过一个错配,不超过两个错配,或不超过三个错配)组成。例如,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的一些或全部正向引物的完整核酸序列可来自V区段,V区段的L序列,或在V片段上游发现的5'非翻译区。在这种情况下,那些正向引物可缺乏外来核酸序列,例如引物条码序列或引物衔接体序列。图2A的上图中示意性地示出本文所述的第一轮巢式扩增反应的正向Vα引物集合的示例,其中每个引物的序列完全由与编码TCR的cDNA的核酸退火的序列组成。同样在图2B的上图中显示本文所述的第一轮巢式扩增反应的正向Vβ引物集合。当使用用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的缺乏外来核酸序列的引物集合的正向引物时,可实现编码来自单T细胞的TCR可变链的核酸的高效扩增。
在一些情况下,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的每个正向引物可包含这样的序列,所述序列的大多数核苷酸被设计为与在编码TCR的cDNA的V区段的上游发现的5'非翻译区退火。在一些情况下,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的每个正向引物的所有序列可以设计为与5'非翻译区,5’非翻译区域加ATG起始位点,或5'非翻译区加ATG起始位点加ATG起始位点下游不超过5个核苷酸退火。表1中列出的引物集合是本文所述的第一轮巢式扩增反应的正向Vα引物集合的示例,其中每个引物与5'非翻译区,5'非翻译区加ATG起始位点,或5'非翻译区加ATG起始位点加ATG起始位点下游不超过5个核苷酸退火,表2中的引物集合是本文所述的第一轮巢式扩增反应的正向Vβ引物集合的示例,其中每个引物与5'非翻译区,5'非翻译区加ATG起始位点,或5'非翻译区加ATG起始位点加ATG起始位点下游不超过5个核苷酸退火。
在一些情况下,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的一些或全部正向引物可包括引物条码序列和/或引物衔接体序列(参见例如,图3A和3B的上图)。例如,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的所有正向引物可具有5'引物衔接体序列,接着是引物序列,其靶向V区段、V区段的L序列,和/或在V区段上游发现的5'非翻译区(参见例如图3A和3B)。在这些情况下,巢式扩增反应的第二轮扩增(使用第一轮的扩增产物作为模板)可以使用对第一轮中添加到所有扩增产物中的衔接体序列具有特异性的单一正向引物(参见例如,图3A和3B的中图)。在一些情况下,来自本文提供的第一轮巢式扩增反应的正向引物的添加的5'衔接体序列可用于帮助将第一和第二扩增产物克隆到表达载体中。
本文所用的术语“引物条码序列”是指可鉴定的核苷酸序列,其长度为至少约15个核苷酸(例如,约15至约50个核苷酸,约15至约40个核苷酸,约15至约30个核苷酸,约20至约50个核苷酸,约20至约40个核苷酸,或约20至约30个核苷酸),且被添加到设计用于与模板序列退火的引物(例如,PCR引物)序列中,使得产生的扩增产物包括扩增的模板序列和添加的可鉴定的核苷酸序列。当以多重形式进行许多扩增反应时,在每个独特位置(例如,每个反应混合物)使用的至少一个引物可包括独特的引物条码序列,其允许用户基于引物条码序列的序列将扩增产物与其特定的反应混合物匹配。例如,设计用于扩增Vα区段的引物对的正向引物可包括添加到对位置#1(例如,孔#1)中使用的引物对的Vα区段具有特异性的引物的5'端的5'-AAAA-3'序列,而设计用于扩增相同Vα区段的引物对的正向引物可包括添加到对位置#2(例如,孔#2)中使用的引物对的Vα区段具有特异性的相同引物的5'端的5'-TTTT-3'序列,并且设计用于扩增相同Vα区段的引物对的正向引物可包括添加到对位置#3(例如,孔#3)中使用的引物对的Vα区段具有特异性的相同引物的5'端的5'-GGGG-3'序列,等等。在这种情况下,基于引物序列在扩增产物的合适区域包括AAAA的该Vα区段的任何扩增产物均可被鉴定为由位置#1产生。如本文所述,在一些情况下,本文提供的TCR克隆方法可以使用巢式扩增程序(例如,巢式PCR程序)进行,所述巢式扩增程序包括使用设计用于扩增可变区序列而不包括引物条码序列的引物。
本文所用的术语“引物衔接体序列”是指已知的核苷酸序列,其长度为至少约15个核苷酸(例如,约15至约50个核苷酸,约15至约40个核苷酸,约15至约30个核苷酸,约20至约50个核苷酸,约20至约40个核苷酸,或约20至约30个核苷酸),且被添加到设计用于与模板序列退火的引物(例如,PCR引物)序列中,使得产生的扩增产物包括扩增的模板序列和添加的已知的核苷酸序列。当进行巢式扩增反应时,在巢式扩增程序的早期扩增轮次(例如,第一轮巢式PCR程序)过程中使用的至少一种引物可以包括固定的引物衔接体序列,其允许用于后续轮次的巢式扩增程序(例如,第二轮巢式PCR程序)的引物被设计成与第一轮中添加的引物衔接体序列退火。这允许用户利用固定的引物衔接体序列,其通过具有引物衔接体序列的引物添加到扩增的模板中,通过设计针对添加的引物衔接体序列的引物而用于随后的步骤或程序。如本文所述,在一些情况下,本文提供的TCR克隆方法可以使用第一轮巢式扩增(例如PCR)程序进行,所述程序包括使用设计用于扩增可变区序列而不包括引物衔接体序列的引物。
若在本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的正向引物上不使用这些5'引物衔接体序列(如图2A和2B的上图中示意性所示),则本文提供的第二轮巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的引物集合可以设计为包括对于TCR的每个可变链(例如,每个TRAV和TRAB或每个TRGV和TRDV)具有特异性的一组正向引物,其方式类似于第一轮的正向引物(参见例如图2A和2B的中图)。例如,若第一轮的正向引物被设计为从各种可能的可变链产生扩增产物而不添加在用作扩增产物的模板的原始cDNA中未发现的额外5'序列,则第二轮的正向引物可被设计成靶向第一轮过程中产生的那些扩增产物的5'部分。
在一些情况下,本文提供的第二轮巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的正向引物可设计为靶向第一轮扩增产物的包括V区段的L序列的ATG起始位点或在该ATG起始位点上游的序列,从而用于克隆功能性TCR的巢式扩增反应的第一和第二扩增产物包括ATG起始位点。在一些情况下,对于人类,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括表5和6中列出的TRAV和TRBV引物或表5和6中列出的TRAV和TRBV引物的子集。例如,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括表5中列出的1种,5种,10种,20种,30种,35种或更多种TRAV引物,可以包括表6中列出的1种,5种,10种,20种,30种或更多种TRBV引物,或者可以包括表5和6中列出的1,5,10,20,30,40,50,60,70或更多种TRAV和TRBV引物。在一些情况下,对于人类,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可以包括表5和6中列出的TRAV和TRBV引物,并且没有具有Vα或Vβ区段的序列、Vα或Vβ区段的L序列,或Vα或Vβ区段上游的5'非翻译区的其它引物。
表5.靶向目前已知在人类中具有功能性的45种TRAV的引物。这些引物中的每一个包括引物衔接体序列(TTCAGGTGTCGTGAGGA-TCTATTTCCGGTG,SEQ ID NO:126)。
W=A,T。
表6.靶向目前已知在人类中具有功能性的48种TRBV的引物。这些引物中的每一个包括引物衔接体序列(GTGGAAGAAAACCCCG-GTCCC,SEQ ID NO:297)。
S=C,G;Y=C,T。
在一些情况下,对于小鼠,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括表7和8中列出的TRAV和TRBV引物或表7和8中列出的TRAV和TRBV引物的子集。例如,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括表7中列出的5种,10种,20种,30种,35种或更多种TRAV引物,可以包括表8中列出的5种,10种,20种,30种或更多种TRBV引物,或者可以包括表7和8中列出的5,10,20,30,40,50,60,70或更多种TRAV和TRBV引物。在一些情况下,对于小鼠,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可以包括表7和8中列出的TRAV和TRBV引物,并且没有具有Vα或Vβ区段的序列、Vα或Vβ区段的L序列,或Vα或Vβ区段上游的5'非翻译区的其它引物。
表7.靶向目前已知在小鼠中具有功能性的104种TRAV的引物。这些引物中的每一个包括引物衔接体序列(TCTCTAGGCGCCGG-AATTCA,SEQ ID NO:298)。
Y=C,T;M=A,C;W=A,T;R=A,G;K=G,T。
#=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有四种引物排列。在某些情况下,可以更换此引物制备物,从而使用以下三种引物:TCTCTAGGCGCCGGAA-TTCAATGAAGACGGTGACTGGACCTT(SEQ ID NO:299),TCTCTAGGC-GCCGGAATTCAATGAAGACAGTGACTGGACCTT(SEQ ID NO:300),和TCTCTAGGCGCCGGAATTCAATGAAAACAGTGACTGGACCTT(SEQ IDNO:301)。
##=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有八种引物排列。在某些情况下,可以更换此引物制备物,从而使用以下三种引物:TCTCTAGGCGCCGGAAT-TCAATGAAAACATACGCTCCTACATTATTC(SEQ ID NO:302),TCTCTAG-GCGCCGGAATTCAATGAAAACATATGCTCCTACATTATTC(SEQ ID NO:303),和TCTCTAGGCGCCGGAATTCAATGAAAACACATGCTTC-TACATTATTC(SEQ ID NO:304)。
###=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有八种引物排列。在某些情况下,可以更换此引物制备物,从而使用以下四种引物:TCTCTAGGCGCCGGAATT-CAATGAACCATTCCCCAGCTTTAGTGAC(SEQ ID NO:305),TCTCTAGG-CGCCGGAATTCAATGAACCTTTCTCCAGCTTTAGTGAC(SEQ ID NO:306),TCTCTAGGCGCCGGAATTCAATGAACCATTCTCCAGCTTTAGTGAC(SEQ ID NO:307),TCTCTAGGCGCCGGAATTCAATGAACTATTCTCCAGCTTTAGT-GAC(SEQ ID NO:308)。
*=当在实施例部分中使用该引物制备物时,制备并使用所有四种引物排列。在某些情况下,可以替代该引物制备物,从而使用以下两种引物:TCTCTAGGCGCCGG-AATTCAATGAAGTCCTTGAGTGTTTCCCTAG(SEQ ID NO:309)和TCTC-TAGGCGCCGGAATTCAATGAAGTCCTTTAGTATTTCCCTAG(SEQ ID NO:310)。
**=当在实施例部分中使用该引物制备物时,仅制备、组合并使用以下三种引物:TCTCTAGGCGCCGGAATTCAA-TGCTCCTGGCACTCCTC(SEQ ID NO:311),TCTCTAGGCGCCGGAATTCAA-TGCTCCTGGCGCTCCTC(SEQ ID NO:312),和TCTCTAGGCGCCGGAATT-CAATGCTCCTGGTGCTCCTC(SEQ ID NO:313)。在一些情况下,这三种引物混合物可被替代,从而制备并使用全部四种引物排列。
***=当在实施例部分中使用该引物制备物时,仅制备、组合并使用以下两种引物:TCTCTAGGCGCCGGAATT-CAATGAAGAGGCTGCTGTGTTCTC(SEQ ID NO:314)和TCTCTAGGCGCC-GGAATTCAATGAGGAGGCTGATGTGTTCTC(SEQ ID NO:315)。在一些情况下,这三种引物混合物可被替代,从而制备并使用全部四种引物排列。
表8.靶向目前已知在小鼠中具有功能性的22种TRBV的引物。这些引物中的每一个包括引物衔接体序列(TGGAAGAAAACCC-CGGTCCC,SEQ ID NO:316)。
在一些情况下,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可以被分成两个或更多个子集,每个子集用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增,采用来自第一轮扩增的所得扩增反应的部分作为模板。在一些情况下,例如对于人类,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可以分成两个或更多个子集(例如,表5和6中列出的TRAV和TRBV引物的第一子集以及表5和表6中列出的TRAV和TRBV引物的第二子集),每个子集用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增,使用来自第一轮扩增的所得扩增反应的部分作为模板。在一些情况下,例如对于小鼠,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可以分成两个或更多个子集(例如,表7和8中列出的TRAV和TRBV引物的第一子集以及表7和表8中列出的TRAV和TRBV引物的第二子集),每个子集用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增,采用来自第一轮扩增的所得扩增反应的部分作为模板。可组合从相同的单T细胞获得的cDNA的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的这些分开进行的第二轮扩增的结果,并且该组合可以用于组装如本文所述的表达载体。
在一些情况下,本文提供的第二轮巢式扩增反应的正向引物可以设计为包括引物条码序列和/或引物衔接体序列(参见例如图2A和2B的中图)。例如,用于本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合的所有正向引物可具有5'引物衔接体序列,接着是引物序列,其靶向V区段、V区段的L序列,和/或在V区段上游发现的5'非翻译区(参见例如图2A和2B)。在一些情况下,来自本文提供的第二轮巢式扩增反应的正向引物的添加的5'衔接体序列可用于帮助将第一和第二扩增产物克隆到表达载体中。在一些情况下,表5-8中列出的任何一种或多种引物序列均可设计为在序列的5'端包含引物衔接体序列,以产生本文提供的第二轮巢式扩增的正向引物,如例如图2A和2B所示。例如,表5和6中列出的所有引物序列均可被设计成在所示序列的5'端包括引物衔接体序列。
可以将任何合适的引物衔接体序列添加到引物例如第一轮引物中,在这种情况下,引物衔接体序列可以用作本文所述的第二轮巢式扩增程序的正向引物的靶标,以及用作有助于将第一和第二扩增产物克隆到表达载体或第二轮引物中的重叠序列,在这种情况下,引物衔接体序列可以作为重叠序列以帮助将第一和第二扩增产物克隆到表达载体中。在一些情况下,引物衔接体序列的长度可以是约15至约50个核苷酸(例如,约15至约45个核苷酸,约15至约40个核苷酸,约15至约30个核苷酸,约20至约50个核苷酸,约20至约40个核苷酸,或约20至约30个核苷酸)。可如本文所述使用的引物衔接体序列的示例包括但不限于TTCAGGTGTCGTGAGGATCTATTTCCGGTG(SEQ ID NO:260);GTGGAAGAAAACCCCGGTCCC(SEQ IDNO:261);TCTCTAGGCGCCGG-AATTCA(SEQ ID NO:262);和TGGAAGAAAACCCCGGTCCC(SEQ IDNO:263)。
如本文所述,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括靶向TRAV(或TRGV)的正向引物库和靶向TRBV(或TRDV)的正向引物库。这种引物集合可包括每个正向引物库的至少一个反向引物。例如,用于αβTCR(或γδTCR)的本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括如本文所述的一组正向TRAV引物(或正向TRGV引物),设计用于与那些正向TRAV引物(或那些正向TRGV引物)中一个或多个配对以产生具有TRAV(或TRGV)序列的扩增产物的一个或多个反向引物,如本文所述一组正向TRBV引物(或正向TRDV引物),和设计用于与那些正向TRBV引物(或那些正向TRDV引物)中一个或多个配对以产生具有TRBV(或TRDV)序列的扩增产物的一个或多个反向引物。通常,对于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第一轮扩增,设计用于与引物集合内的一个或多个正向TRAV引物(或正向TRGV引物)配对的反向引物可设计为对α链的C区序列(或γ链的C区序列)具有特异性。在一些情况下,一个Cα(或Cγ)反向引物或多于一个Cα(或Cγ)反向引物(例如,两个,三个,四个,五个或更多个Cα(或Cγ)反向引物)可用于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第一轮扩增。同样地,对于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第一轮扩增,设计用于与引物集合内的一个或多个正向TRBV引物(或正向TRDV引物)配对的反向引物可设计为对于β链的C区序列(或δ链的C区序列)具有特异性。在一些情况下,一个Cβ(或Cδ)反向引物或多于一个Cβ(或Cδ)反向引物(例如,两个,三个,四个,五个或更多个Cβ(或Cδ)反向引物)可用于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第一轮扩增。
在一些情况中,用于αβTCR(或γδTCR)的本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合可包括如本文所述的一组正向TRAV引物(或正向TRGV引物),设计用于与那些正向TRAV引物(或那些正向TRGV引物)中每一个配对以产生具有TRAV(或TRGV)序列的扩增产物的单个反向引物,如本文所述一组正向TRBV引物(或正向TRDV引物),和设计用于与那些正向TRBV引物(或那些正向TRDV引物)中每一个配对以产生具有TRBV(或TRDV)序列的扩增产物的单个反向引物。
通常,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合的反向引物可以被设计为对距离靶向的C区的最5’核苷酸约15个核苷酸至约550个核苷酸(例如,约15个核苷酸至约500个核苷酸,约15个核苷酸至约450个核苷酸,约15个核苷酸至约400个核苷酸,约15个核苷酸至约300个核苷酸,约15个核苷酸至约200个核苷酸,约15个核苷酸至约100个核苷酸,约15个核苷酸至约50个核苷酸,约20个核苷酸至约550个核苷酸,约20个核苷酸至约450个核苷酸,约20个核苷酸至约400个核苷酸,约20个核苷酸至约300个核苷酸,约20个核苷酸至约200个核苷酸,约20个核苷酸至约100个核苷酸,或约20个核苷酸至约50个核苷酸)的C区具有特异性。例如,可以将Cα反向引物设计为对Cα区的约核苷酸15至约核苷酸450的核苷酸序列具有特异性。对于人和小鼠,此类Cα反向引物的示例包括但不限于表9中列出的Cα反向引物。可以将Cβ反向引物设计为对Cβ区的约核苷酸15至约核苷酸550的核苷酸序列具有特异性。对于人和小鼠,此类Cβ反向引物的示例包括但不限于表10中列出的Cβ反向引物。
表9.示例性的靶向人或小鼠的Cα的第一轮反向引物。
表10.示例性的靶向人或小鼠的Cβ的第一轮反向引物。
如本文所述,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括靶向TRAV(或TRGV)的正向引物库和靶向TRBV(或TRDV)的正向引物库,例如,当在第一轮中不使用引物衔接体序列时,如例如图2A和2B所示。这种引物集合可包括每个正向引物库的至少一个反向引物。例如,用于αβTCR(或γδTCR)的本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括如本文所述的一组正向TRAV引物(或正向TRGV引物),设计用于与那些正向TRAV引物(或那些正向TRGV引物)中一个或多个配对以产生具有TRAV(或TRGV)序列的第一扩增产物的一个或多个反向引物,如本文所述一组正向TRBV引物(或正向TRDV引物),和设计用于与那些正向TRBV引物(或那些正向TRDV引物)中一个或多个配对以产生具有TRBV(或TRDV)序列的第二扩增产物的一个或多个反向引物。通常,对于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第二轮扩增,设计用于与引物集合内的一个或多个正向TRAV引物(或正向TRGV引物)配对的反向引物可设计为对α链的C区序列(或γ链的C区序列)具有特异性。在一些情况下,一个Cα(或Cγ)反向引物或多于一个Cα(或Cγ)反向引物(例如,两个,三个,四个,五个或更多个Cα(或Cγ)反向引物)可用于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第二轮扩增。同样地,对于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第二轮扩增,设计用于与引物集合内的一个或多个正向TRBV引物(或正向TRDV引物)配对的反向引物可设计为对于β链的C区序列(或δ链的C区序列)具有特异性。在一些情况下,一个Cβ(或Cδ)反向引物或多于一个Cβ(或Cδ)反向引物(例如,两个,三个,四个,五个或更多个Cβ(或Cδ)反向引物)可用于本文提供的αβTCR(或γδTCR)的巢式扩增反应的第二轮扩增。
在一些情况中,用于αβTCR(或γδTCR)的本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括如本文所述的一组正向TRAV引物(或正向TRGV引物),设计用于与那些正向TRAV引物(或那些正向TRGV引物)中每一个配对以产生具有TRAV(或TRGV)序列的第一扩增产物的单个反向引物,如本文所述一组正向TRBV引物(或正向TRDV引物),和设计用于与那些正向TRBV引物(或那些正向TRDV引物)中每一个配对以产生具有TRBV(或TRDV)序列的第二扩增产物的单个反向引物。
通常,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合的反向引物可以被设计为对距离靶向的C区的最5’核苷酸约15个核苷酸至约550个核苷酸(例如,约15个核苷酸至约500个核苷酸,约15个核苷酸至约450个核苷酸,约15个核苷酸至约400个核苷酸,约15个核苷酸至约300个核苷酸,约15个核苷酸至约200个核苷酸,约15个核苷酸至约100个核苷酸,约15个核苷酸至约50个核苷酸,约20个核苷酸至约550个核苷酸,约20个核苷酸至约450个核苷酸,约20个核苷酸至约400个核苷酸,约20个核苷酸至约300个核苷酸,约20个核苷酸至约200个核苷酸,约20个核苷酸至约100个核苷酸,或约20个核苷酸至约50个核苷酸)的C区具有特异性,限制条件是在使用完全巢式的扩增程序时它处于用于第一轮的反向引物的位点内。在一些情况下,本文描述的巢式扩增程序可以是半巢式的,在这种情况下,用于第一轮和第二轮扩增的一个或多个反向引物可以是相同的。例如,当用于第一轮的反向引物被设计为在完全巢式扩增程序中对于Cα区的约核苷酸40至约核苷酸70的序列具有特异性时,Cα反向引物可被设计为对Cα区的约核苷酸1至约核苷酸30的核苷酸序列具有特异性。对于人和小鼠,此类Cα反向引物的示例包括但不限于表11中列出的Cα反向引物。可将Cβ反向引物设计为对Cβ区的约核苷酸1至约核苷酸549的核苷酸序列具有特异性,限制条件是,该位点在完全巢式扩增程序的第一轮中使用的反向引物的位点内。对于人和小鼠,此类Cβ反向引物的示例包括但不限于表12中列出的Cβ反向引物。
表11.示例性的靶向人或小鼠的Cα的第二轮反向引物。
表12.示例性的靶向人或小鼠的Cβ的第二轮反向引物。
如本文所述,本文提供的用于巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合可包括(a)一个或多个正向引物,其设计用于靶向在第一轮过程中添加至TRAV(或TRGV)扩增产物的引物衔接体序列(此时在第一轮过程中采用引物衔接体序列,如例如图3A中所示),(b)一个或多个反向引物,用以与(a)的一个或多个正向引物配对,(c)一个或多个正向引物,其设计用于靶向在第一轮过程中添加至TRBV(或TRDV)扩增产物的引物衔接体序列(此时在第一轮过程中采用引物衔接体序列,如例如图3B中所示),和(d)一个或多个反向引物,用以与(c)的一个或多个正向引物配对。
在一个实施方式中,本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增可使用引物集合进行,所述引物集合包括表1和2中列出的引物,以及表9的hTRAC引物作为反向引物用以与表1的正向引物配对,和表10的hTRBC引物作为反向引物用以与表2的正向引物配对(参见例如图2A和2B的上图)。该第一轮的扩增产物可用作第二轮扩增中的模板。第二轮可以使用引物集合进行,该引物集合包括表5中列出的引物(在5'端添加引物衔接体序列),表6中列出的引物(在5'端添加引物衔接体序列,其不同于表5引物使用的衔接体序列),表11的hTRACn引物作为反向引物用以与表5的正向引物配对,和表12的hTRBCn引物作为反向引物用以与表6的正向引物配对(参见例如,图2A和2B的中图)。该第二轮扩增可以产生第一扩增产物,其包括衔接体序列,Vα区段的整个L序列,Vα区段,Jα区段和Cα区的5'部分,和第二扩增产物,其包括不同的衔接体序列,Vβ区段的整个L序列,Vβ区段,Dβ区段,Jβ区段和Cβ区的5'部分(参见例如图2A和2B的下图)。可以如本文所述使用第一和第二扩增产物来组装具有表达从单T细胞克隆的功能性TCR的能力的表达载体。
任何合适的聚合酶(例如,热稳定聚合酶)可用于进行本文提供的巢式扩增反应的第一轮和/或第二轮。可以如本文所述使用的聚合酶的示例包括但不限于:Taq DNA聚合酶(赛默飞世尔市售可得),Phusion DNA聚合酶(赛默飞世尔市售可得),Pfu Turbo DNA聚合酶(安捷伦市售可得),Q5高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)市售可得)和MyFi DNA聚合酶(生物线公司(Bioline)市售可得)。用于进行本文提供的第一轮和/或第二轮巢式扩增反应的其它成分可包括但不限于合适的聚合酶缓冲液,MgCl2,DMSO和dNTP。
本文提供的第一轮和/或第二轮巢式扩增反应可以通过在如本文所述的引物集合,dNTP和任选的去污剂(例如,非变性去污剂)存在下使模板与热稳定聚合酶(例如,Taq聚合酶)接触,并使反应混合物经历热循环条件,例如40个循环的:98℃ 1分钟,53℃30秒和72℃40秒来进行。
在一些情况下,本文提供的第一轮和/或第二轮巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的正向引物可以设计成靶向V区段的扩增而不扩增那些V区段的L序列。在这种情况下,可以使用异源前导序列代替那些V区段的L序列,以促进克隆的TCR在细胞表面上的表达。可以在扩增过程期间和/或在表达载体的组装过程中提供这种异源前导序列。可如本文所述使用的异源前导序列的示例包括但不限于这样的前导序列,其编码:MLTASLLRAVIASICVVSSM(SEQID NO:317)序列(对于小鼠TRAV),MSTRLLCWMALCLLGALS(SEQ ID NO:318)序列(对于小鼠TRBV),MLQMWGFVLYLFLMVGAA(SEQ ID NO:319)序列(对于人TRAV)和MWQFCILCLCVLMASVAT(SEQ ID NO:320)序列(对于人TRBV)。
一旦生成含有Vα区段(或Vγ区段)的第一扩增产物,例如包含Vα区段的整个L序列,Vα区段,Jα区段和Cα区的5'部分的第一扩增产物,和含有Vβ区段(或Vδ区段)的第二扩增产物,例如含有Vβ区段的整个L序列,Vβ区段,Dβ区段,Jβ区段和Cβ区的5'部分的第二扩增产物(参见例如,图2A、2B、3A或3B的下图),可将它们以使得具有单T细胞来源中存在形式的α和β可变区组合(或γ和δ可变区组合)的功能性TCR能够表达的方式克隆到表达载体中。
可以使用任何合适的克隆技术来组装设计用于表达从单T细胞克隆的功能性TCR的表达载体。在一些情况下,克隆步骤可以从获得第一和第二扩增产物的点到获得组装的表达载体的点进行,所述组装的表达载体具有在不使用限制酶的情况下表达从单T细胞克隆的功能性TCR的能力。在这种情况下,该克隆技术在本文中可称为“无缝(seamless)”克隆技术。可用于以产生表达载体(所述表达载体设计用于表达从单T细胞克隆的功能性TCR)的方式将第一扩增产物排列成完整的α(或γ)链(例如,全长L序列,全长Vα区段,全长Jα区段和全长Cα区)并将第二扩增产物排列成完整的β(或δ)链(例如,全长L序列,全长Vβ区段,全长Dβ区段,全长Jβ区段和全长Cβ区)的无缝克隆技术的示例包括但不限于:基于核酸外切酶的克隆技术,例如Gibson组装技术,High-5组装技术和连接独立克隆(LIC)技术,以及核酸外切酶独立克隆技术,如金门(Golden Gate)组装技术和Univector质粒融合组装技术。
参考图1,可以使用来自本文提供的巢式扩增反应的第一和第二扩增产物,分开的克隆片段和设计用于接受第一和第二扩增产物的表达载体进行Gibson组装技术。在一些情况下,第一扩增产物可以设计成具有5'序列,其与制备用于接受第一扩增产物的表达载体的部分重叠。可通过本文所述的引物衔接体序列将该5'重叠序列添加至第一扩增产物。第一扩增产物也可以设计成具有与分开的克隆片段的5'部分重叠的3'序列。例如,第一扩增产物的Cα(或Cγ)的3'部分可以与分开的克隆片段的Cα(或Cγ)的5'部分重叠。在一些情况下,如图1所示,例如,可以设计该分开的克隆片段以提供第一扩增产物中缺失的全长α链(或γ链)的任何3'部分。在图1的情况下,分开的克隆片段提供Cα区的其余部分。
可以将第二扩增产物设计成具有与分开的克隆片段的3'序列重叠的5'序列,使得第二扩增片段可以与分开的克隆片段连接。可通过本文所述的引物衔接体序列将第二扩增产物的该5'重叠序列添加至第二扩增产物。第二扩增产物可被设计成具有3'序列,其与制备用于接受第二扩增产物的表达载体的部分重叠。如图1所示,表达载体的这部分可被设计成提供第二扩增产物中缺失的全长β链(或δ链)的任何3'部分。在图1的情况下,接受第二扩增产物的表达载体提供Cβ区的其余部分。
当来自本文提供的巢式扩增反应的第一和第二扩增产物,分开的克隆片段和制备用于接受第一和第二扩增产物(各自具有重叠序列)的表达载体(例如,如图1所示),与5'核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶一起孵育以进行Gibson组装时,可产生组装的表达载体,其中第一扩增产物之后是分开的克隆片段,然后是第二扩增产物,然后载体序列。
在一些情况下,第一扩增产物上游的载体序列可以是设计用于驱动编码TCR的α链(或γ链)的组装核酸的表达的启动子序列。可以使用任何类型的启动子序列。可以使用的启动子序列的示例包括但不限于,用于高表达的CMV启动子序列,用于高表达的MCSV启动子序列,用于中度表达的E1Fa启动子序列,用于中度表达的PGK启动子序列和用于低表达的UbC启动子序列。
在一些情况下,分开的克隆片段可经设计以编码自切割肽,例如2A肽,从而其在组装的载体中位于编码α链(或γ链)的核酸和编码β链(或δ链)的核酸之间。在这些情况下,仅需要一个启动子来驱动α和β链(或γ和δ链)的表达。可以如本文所述使用的2A肽的示例包括但不限于:口蹄疫病毒的2A肽,马鼻炎A病毒的2A肽,明脉扁刺蛾β四体病毒的2A肽和猪捷申病毒-1的2A肽。表13中提供了示例性2A多肽的氨基酸序列。可用于本文提供的Gibson组装技术以获得表达克隆的人或小鼠TCR的表达载体的分开的克隆片段的示例包括但不限于表14中列出的那些。在一些情况下,可在编码自切割肽的序列(例如,编码2A肽的序列)的上游包括接头序列。这种接头序列可以具有维持编码自切割肽的序列的阅读框的长度。例如,接头长度可为约3至约45个核苷酸(例如,27个核苷酸)。
表13.示例性的2A肽。
表14.示例性的分开的克隆片段。
当使用自切割肽如2A肽时,表达载体可以驱动编码α链(或γ链),然后是自切割肽(例如,2A肽),然后是β链(或δ链)的转录物的转录。在翻译这些转录物期间,可以在2A肽处切割生长的多肽,其中翻译继续通过β链(或δ链)。当设计表达载体以表达多顺反子单元形式的α和β链(或γ和δ链)时,可以设计编码两个TCR链和自切割肽(例如,2A肽)的核酸,使得它们彼此处于翻译框架中。
在某些情况下,可以使用内部核糖体进入位点(IRES)代替自切割肽。IRES序列的示例包括但不限于脑肌炎病毒(EMCV)IRES(例如IRES2),丙型肝炎病毒(HCV)IRES,细小核糖核酸病毒IRES和瘟病毒IRES。
在一些情况下,可以使用分开的启动子序列代替自切割肽或IRES。在这些情况下,一个启动子序列可以驱动α链(或γ链)的表达,并且分开的启动子序列可以驱动β链(或δ链)的表达。这两个启动子序列可以相同或不同。
任何合适的5'核酸外切酶,DNA聚合酶和DNA连接酶均可用于进行本文提供的Gibson组装技术。可以如本文所述使用的5'核酸外切酶的示例包括但不限于T5核酸外切酶(新英格兰生物实验室市售可得)。可以如本文所述使用的DNA聚合酶的示例包括但不限于:Phusion DNA聚合酶(赛默飞世尔市售可得),Pfu Turbo DNA聚合酶(安捷伦市售可得)和Q5高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室市售可得)。可以如本文所述使用的DNA连接酶的示例包括但不限于:T4DNA连接酶(赛默飞世尔市售可得),T3DNA连接酶(新英格兰生物实验室市售可得),T7DNA连接酶(新英格兰生物实验室市售可得))和HiFi Taq DNA连接酶(新英格兰生物实验室市售可得)。用于实施本文提供的Gibson组装技术的其它成分可包括但不限于:dNTPS、MgCl2、DTT、PEG-8000和NAD。
通常,Gibson组装技术可用于连接任何具有重叠序列的合适的双链DNA片段。简言之,具有5'核酸外切酶活性的酶从5'端逐个回切。当重叠序列退火时,DNA聚合酶填充从3'端延伸的序列,DNA连接酶封合切口,从而连接两个重叠的片段。
本文提供的Gibson组装技术可以通过使第一和第二扩增产物、分开的克隆片段和制备的载体(例如,打开以接受插入物的载体),每个载体具有如本文所述的重叠序列,与具有5'外切核酸酶活性、DNA聚合酶活性和DNA连接酶活性的酶,在含有dNTPS、MgCl2、DTT、PEG-8000和NAD的反应混合物存在下接触,并将反应混合物在约40至约60℃(例如,约45至约55℃,约48至约52℃,或约50℃)等温孵育约10至约120分钟(例如,约10至约90分钟,约10至约60分钟,约10至约45分钟,约15至约90分钟,约15至约60分钟,或约15至约45分钟)来进行。
在一些情况下,限制性内切核酸酶克隆可用于在表达载体内以两者均表达的方式将第一扩增产物排列成完整的α(或γ)链(例如,全长L序列,全长Vα区段,全长Jα区段,和全长Cα区)并将第二扩增产物排列成完整的β(或δ)链(例如,全长L序列,全长Vβ区段,全长Dβ区段,全长Jβ区段和全长Cβ区)。例如,限制性内切核酸酶克隆可用于组装表达载体以具有启动子序列,接着是编码α链(或γ链)的核酸,接着是编码自切割肽(或IRES)的核酸或第二启动子序列的核酸,接着是编码β链(或δ链)的核酸。
当描述本文提供的表达载体的排列和用于组装那些表达载体的组分(例如,第一和第二扩增产物)时,α链(或γ链)被描述为处于β链(或δ链)的上游。这不是必需的,因为表达载体可以设计成以任一顺序表达α和β链(或γ和δ链)。例如,可以使用本文提供的方法和材料构建表达载体,使得启动子序列驱动转录物的表达,所述转录物以编码β链(或δ链)的核酸开始,接着是编码自切割肽(或IRES)的核酸或第二启动子序列的核酸,接着是编码α链(或γ链)的核酸。
设计用于驱动多肽表达的任何合适的载体均可用于组装本文提供的表达载体。例如,慢病毒载体可用于制备表达载体,该载体具有表达如本文所述的单T细胞克隆的功能性TCR的能力。可用于制备本文所述表达载体的其它载体包括但不限于:基于病毒的载体,例如疱疹病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体或逆转录病毒载体,或可被引入靶细胞的其它DNA或RNA细胞表达载体。在一些情况下,可以使用慢病毒载体如pLVX-IRES(Clontech市售可得)或逆转录病毒载体如pMIG II(Addgene市售可得)来组装具有表达从本文所述的单T细胞克隆的功能性TCR的能力的表达载体。
一旦组装表达载体以包括本文所述的从单T细胞克隆的TCR的序列,该载体即可用于制备其自身的其它拷贝。例如,可以转化细菌以复制组装的表达载体。在这种情况下,表达载体可以设计为包括细菌复制起点。
本文提供的组装的表达载体可用于使用任何合适的方法筛选感兴趣的TCR的克隆的TCR。例如,可以进行图4中所示的方法以筛选本文提供的克隆的TCR。
在一些情况下,每个组装的表达载体可经单独扩增,从而表达载体的每个核酸制备物用于单T细胞。在这些情况下,基于例如下游TCR筛选和分析的鉴定为感兴趣的任何特定TCR均可追溯到该TCR的核酸制备物。
在一些情况下,可以合并两个或更多个(例如,数十,数百,数千或更多个)组装的表达载体并将其扩展为库。在这些情况下,成库的核酸可用于对表达任何克隆的TCR的细胞库进行下游筛选和分析。可以分离经鉴定为表达感兴趣的特定TCR的那些细胞,并且可以回收该细胞内包含的特定表达载体(或TCR编码核酸的全部或部分)。例如,在一个实施方式中,可将本文提供的不同表达载体的库(各自编码从单T细胞克隆的特定TCR)递送至细胞群(例如,缺乏天然TCR的细胞),从而每个细胞被转染以表达由它接受的表达载体提供给它的TCR。然后可以评估表达不同克隆的TCR的细胞的库以鉴定表达感兴趣TCR的细胞。可以分离那些表达感兴趣TCR的细胞。一旦分离,该细胞就可经评估以确定TCR的特征(identity)。例如,可以进行核酸测序以鉴定TCR。在一些情况下,可以从分离的细胞中分离编码TCR的核酸。例如,可以进行一个或多个扩增反应(例如PCR)以获得一种或多种扩增产物,其包括编码全部或部分TCR的核酸。
描述本文提供的方法和材料,重点在于获得具有表达从单T细胞获得的克隆的TCR的能力的表达载体。在一些情况下,本文提供的方法和材料可以以设计用于产生编码如本文所述的TCR的载体的方式进行,不同之处在于该载体不必是表达载体。例如,克隆载体如pUC19或PCR TOPO载体可用于组装编码α链(或γ链)、β链(或δ链)和任选的自切割肽(或IRES)和/或如本文所述的启动子序列的核酸构建体。在这种情况下,如果之后需要表达,则可将组装的构建体从克隆载体移动到表达载体。如果不需要表达,则可以原样使用含有组装的构建体的载体。例如,可以使用这样的载体进行核酸测序,以获得关于从单T细胞获得的成对的α和β链(或γ和δ链)的序列信息。在一些情况下,可以使用本文所述的第一和/或第二扩增产物进行核酸测序,以获得关于从单T细胞获得的α和/或β链(或γ和/或δ链)的序列信息。
描述本文提供的方法和材料,重点在于获得具有表达含有α和β(或γ和δ)C区的克隆的TCR的能力的表达载体。在一些情况下,本文提供的方法和材料可以以设计用于产生编码如本文所述的TCR的载体(例如,表达载体)的方式进行,不同之处在于添加不同的信号转导结构域或导致表达可溶性TCR的结构域。在一些情况下,本文提供的方法和材料可以以设计用于产生编码如本文所述的TCR的载体(例如,表达载体)的方式进行,不同之处在于,α和/或β(或γ和/或δ)C区的全部或部分被不同的信号转导结构域或用导致表达可溶性TCR的结构域替换。例如,可以组装本文提供的载体(例如,表达载体),从而编码信号转导结构域(例如,CD3-ζ信号转导结构域)的核酸替代克隆的TCR的α或β(或γ或δ)C区的终止密码子,并与恒定区域一起框内添加。可以添加到或用于代替本文提供的克隆的TCR的α和/或β(或γ和/或δ)C区的全部或部分的信号转导结构域的示例包括但不限于:CD3-ζ信号转导结构域(Ohno等,The EMBO Journal,12:4357-66(1993);Exley等,Journal Biol.Chem.,269:15140-6(1994);和Maher等,Nat.Biotechnol.,20:70-5(2002)),CD28信号转导结构域(Maher等,Nat.Biotechnol.,20:70-5(2002);和Tian等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,112:E1594-603(2015)),共刺激TNFR家族信号转导结构域(例如,OX-40、4-1BB、CD30、CD27和GITR信号转导结构域;Arch等,Mol.Cell.Biol.,18:558-65(1998);Croft,Cytok.GrowthFactor Rev.,14:265-73(2003);和Watts,Ann.Rev.Immunol.,23:23-68(2005)),CD278信号转导结构域(Bertram等,Eur.J.Immunol.,32:3376-85(2002);和Gigoux等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106:20371-6(2009)),及其组合。以单独或组合形式具有导致可溶性TCR被表达且可用于替代克隆的TCR的α和/或β(或γ和/或δ)C区(或其部分)或可被添加至克隆的TCR的C区的能力的结构域和/或突变的示例包括但不限于,位于α和/或β(或γ和/或δ)C区上的生物素化靶基序(Laugel等,J.Biol.Chem.,280:1882-92(2005)),代替一个或两个C区的一个或多个Ig结构域,使得其它半胱氨酸残基在α和β(或γ和δ)C区γ中表达的C区的突变形式(Laugel等,J.Biol.Chem.,280:1882-92(2005)),一个或两个恒定区的跨膜和胞内结构域的缺失,Jun-Zipper结构域向α和βC区的添加,和Fos-Zipper结构域γ向γ和δC区的添加(Willcox等,Protein Sci.,8:2418-23(1999))。在一些情况下,可以将FLAG标签或His标签添加到一个或两个C区以促进蛋白质纯化。在一些情况下,可以去除一个或两个C区的内部细胞质尾部以促进TCR链的无细胞表达(Walseng等,PloS One,10:e0119559(2015))。
一旦制备了本文所述的组装的表达载体或本文所述的不同表达载体的库,就可将其引入细胞中,从而所述细胞表达所提供的TCR。可以使用任何合适的细胞。在一些情况下,可以将本文所述的表达载体引入不表达内源性TCR的细胞(例如,T细胞)中。例如,可以将本文提供的表达载体引入T细胞(例如,人T细胞)中,所述T细胞经工程改造以缺乏TCR的内源α链(或γ链)的表达,以缺乏TCR的内源β链(或δ链)的表达,或以缺乏TCR的内源α和β链(或内源γ和δ链)的表达。可以使用任何合适的方法产生缺乏内源性TCR的一条链或两条链的表达的T细胞。例如,基因编辑技术,例如涉及使用规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)技术或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术的基因编辑技术可用于干扰内源性TCR的一条或两条链的表达。
在某些情况下,可以使用自然杀伤(NK)细胞。例如,可将本文所述的表达载体引入NK细胞中,所述NK细胞经工程改造以表达TCR复合物的CD3链(例如CD3ε,CD3γ,CD3ζ和任选的CD3δ)。在这种情况下,外源提供的TCR可以与外源提供的CD3复合物一起在NK细胞表面上表达。
在一些情况下,可以将本文提供的表达载体引入表达内源性TCR的T细胞(例如,人T细胞)中。在这种情况下,存在于这种T细胞表面上的部分TCR可以是内源性TCR,存在于这种T细胞表面上的部分TCR可以是外源性提供的TCR(例如,由引入的表达载体编码的两条TCR链产生的TCR),并且存在于这种T细胞表面上的部分TCR可以具有一个内源提供的TCR链和一个外源提供的TCR链。
在一些情况下,由本文提供的表达载体编码的α和β链(或γ和δ链)的恒定区可被工程改造以包括编码一个或多个半胱氨酸残基的序列,以增加这些链在细胞(例如,表达内源性TCR的细胞)内表达时彼此的配对。例如,可以将如本文所述的从单细胞分选的T细胞获得的TCR序列组装进入表达载体,使得表达载体的每个编码的恒定区包括引入的半胱氨酸残基,其在细胞(例如,表达内源性TCR的细胞)内表达时增加这些链彼此的配对。此类半胱氨酸残基的示例包括但不限于他处描述的那些(Kuball等,Blood,109:2331-2338(2007))。
在一些情况下,本文提供的表达载体可以引入来自与用于克隆该表达载体的TCR序列的物种不同的物种的T细胞。例如,本文提供的表达具有从小鼠T细胞获得的可变区的TCR的表达载体可以引入来自除小鼠物种之外的物种的T细胞(例如人T细胞)。
在一些情况下,可以工程改造本文提供的表达载体以表达嵌合TCR,其具有来自一个物种(例如人)的可变区和来自不同物种(例如小鼠)的恒定区。在这种情况下,可以将表达载体引入来自与恒定区的物质不同的物种的T细胞中。例如,可以将经工程改造以表达具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合TCR的表达载体引入人T细胞(例如,表达内源性TCR的人T细胞)。在这种情况下,外源提供的人/小鼠嵌合TCR可以表达并组装成人T细胞表面上的功能性TCR,如他处所述(Cohen等,Cancer Res.,66(17):8878-8886(2006))。
在一些情况下,可以将表达具有αβ恒定区的克隆的TCR的本文提供的表达载体引入具有内源γδTCR的γδT细胞中。在这些情况下,外源TCR的两条链可以通过αβ恒定区正确配对,而内源γ和δTCR链对此几乎没有或没有干扰。在一些情况下,可以将表达具有γδ恒定区的克隆的TCR的本文提供的表达载体引入具有内源αβTCR的αβT细胞中。在这些情况下,外源TCR的两条链可以通过γδ恒定区正确配对,而内源α和βTCR链对此几乎没有或没有干扰。
在一些情况下,可以工程改造本文提供的表达载体以表达具有从单个γδT细胞获得的γδ可变区和αβ恒定区的TCR。在这种情况下,可以将表达载体引入具有内源γδTCR的γδT细胞中。在这些情况下,即使那些TCR含有γδ可变区,外源TCR的两条链也可以通过αβ恒定区正确配对。
在一些情况下,可以工程改造本文提供的表达载体以表达具有从单个αβT细胞获得的αβ可变区和γδ恒定区的TCR。在这种情况下,可以将表达载体引入具有内源αβTCR的αβT细胞中。在这些情况下,即使那些TCR含有αβ可变区,外源TCR的两条链也可以通过γδ恒定区正确配对。这种正确配对可在几乎没有或没有内源α和βTCR链干扰的情况下发生。
在一些情况下,可以工程改造本文提供的表达载体以表达具有从单个γδT细胞获得的γδ可变区和αβ恒定区的TCR。在这种情况下,可以将表达载体引入具有内源γδTCR的γδT细胞中。在这些情况下,即使那些TCR含有γδ可变区,外源TCR的两条链也可以通过αβ恒定区正确配对。
如本文所述,一旦制备了组装的表达载体或不同表达载体的库,就可将其引入细胞中,使得细胞表达所提供的TCR。可以使用任何合适的细胞。例如,可以将本文提供的表达载体引入永生人T细胞系,例如Jurkat细胞,Molt细胞系或衍生自这些来源的细胞系。在一些情况下,可以使用不表达内源性排列的TCR的Jurkat或Molt细胞系的亚株(Minowada等,Haematol.Blood Transfus.,32:233-236(1989);Zhang等,PLoS Pathog.,6(7):e1001018(2010))。在一些情况下,鼠细胞系可用于表达人或小鼠TCR。在一些情况下,可以使用设计用于表达外源CD3核酸的细胞系,例如转化为表达CD3基因的58杂交瘤细胞系、4G4细胞系或BW5147细胞系。
可以在TCR克隆之前和之后鉴定与特定患者或正在治疗的疾病相关的TCR的选择。合适的TCR的检测可从分选步骤开始。例如,在分选之前,可以通过用一种或多种抗原(例如,疫苗的抗原,例如前列腺肿瘤疫苗,次要组织相容性抗原疫苗,或抗病毒疫苗,如流感疫苗)重复处理(pulse)的抗原呈递细胞(APC)培养细胞一段时间(例如,4小时)来进行筛选。可以使用的APC的示例包括但不限于,已知表达MHC1和/或2的永生细胞系和已经分化成专职性APC并通过用TLR配体刺激并用IL-4和GM-CSF培养扩增的外周血单核细胞。刺激后,可以对外周血染色以鉴定T细胞。在该组T细胞内,可以基于诸如CD62L,CD127,CD69,CD44和CD45RA/RO的标志物的表达来鉴定活化的T细胞。
一旦将暴露于一种或多种抗原的细胞分选成如本文所述的单T细胞并产生cDNA,就可以将单T细胞产生的高达约80%的cDNA用于qPCR而不干扰TCR克隆的效率。在一些情况下,可以筛选经刺激的T细胞的效应分子(例如IFN-γ,IL-2,TNF-α和已知在刺激后直接表达的其它分子)的上调。通过在单一细胞水平上将这些细胞的表达标准化为一个或多个管家基因,可以鉴定包含具有对用于刺激T细胞群的抗原具有特异性的TCR的单T细胞的孔。在一些情况下,可对从鉴定为具有对用于刺激T细胞群的抗原具有特异性的TCR的T细胞获得的那些TCR继续克隆步骤。
一旦组装了表达载体,就可以测试经设计以表达的TCR的功能性和抗原特异性。通过在细胞系或原代细胞中表达组装的TCR,可以确认功能性和抗原特异性。在一些情况下,可以使用任何合适的方法筛选表达克隆的TCR的细胞以鉴定感兴趣的克隆的TCR。例如,特定的抗原肽-四聚体复合物可用于对表达具有结合该复合物能力的TCR的细胞进行染色。在一些情况下,可以将本文提供的组装的表达载体引入报告细胞中,所述报告细胞经工程改造以在成功激活克隆的和功能性TCR后提供可识别的信号。
在一些情况下,细胞系可经设计以在NFAT反应元件的控制下表达标志物多肽(例如荧光素酶),可以用于鉴定功能性TCR。NFAT是一种转录因子,其在细胞核中隔离直到这种TCR连接的信号导致其去磷酸化并随后转运至细胞核(Crabtree等,Cell,109(增刊):S67-79(2002))。然后,NFAT将结合NFAT反应元件并导致由该NFAT反应元件下游的核酸序列编码的标志物多肽的表达。在一些情况下,可以使用市售的永生T细胞系,例如在编码荧光素酶的核酸(普洛麦格;目录号J1621)上游含有NFAT反应元件的Jurkat细胞系,来鉴定功能性TCR。在功能性TCR的TCR连接后,这些细胞可以表达荧光素酶。如本文所述,可以用表达如本文所述的克隆的TCR的逆转录病毒载体转染4G4NFAT-RE细胞,并且那些细胞可在用抗CD3抗体被覆的384孔板中被刺激。在这些情况下,受刺激的细胞可表达荧光素酶,其可以在刺激后4小时内检测到。该系统可允许每个384孔板快速筛选超过360个病毒载体的功能性TCR表达。在这种情况下,24个孔可用于阳性和阴性测定对照。
在一些情况下,可以进行确认克隆TCR的抗原特异性的测定。例如,可以用已经用抗原肽重复处理或用表达靶基因的病毒载体感染或用表达疑似靶基因的质粒转染的APC培养细胞。靶基因的示例包括但不限于:肿瘤相关抗原、疫苗相关抗原和病原性病毒相关抗原。与TCR功能性的评估一样,可使用NFAT反应元件荧光素酶测定来评估特异性,不同之处在于,使用合适的MHC分子内的特定抗原代替抗CD3抗体来刺激待测试的TCR。本文所述细胞系表达的MHC分子可加载特定肽,通过将该肽直接置于培养物中或用表达一种或多种感兴趣的肽的载体(例如质粒)转染表达MHC的细胞来进行。在一些情况下,可以滴定肽(或抗原表达载体)以控制不同的TCR亲和性和不同的肽/MHC亲和性。
在一些情况下,可以通过流式细胞术同时评估TCR表达、功能性和/或特异性。通过用荧光蛋白(例如,eGFP或tdTomato)替代NFAT反应元件报告系统的荧光素酶蛋白,可评估从本文提供的表达载体表达的克隆的TCR在转染细胞中的正确表达、功能性和/或特异性。简言之,含有控制荧光蛋白表达的NFAT反应元件报告系统的细胞系可用表达克隆的TCR的本文提供的表达载体转染。然后可以将细胞系与抗原重复处理的APC或APC细胞系一起孵育。然后可以通过流式细胞术评估细胞的荧光标志物的表达。刺激后,荧光蛋白的存在可表明引入的TCR的表达、功能性和对于用于刺激细胞的抗原的特异性。在一些情况下,表达克隆的TCR的本文提供的表达载体可包括编码标志物多肽的核酸,所述标志物多肽可用作追踪哪些细胞接受表达载体的指标。可以选择表达载体和细胞系,从而由所述细胞系表达的报告多肽和由所述表达载体表达的指标不会相互干扰。
在一些情况下,这些流式细胞术评估可以与另一轮单细胞分选组合。例如,可以将抗原响应性细胞(例如,响应于用特定抗原加MCH刺激而表达荧光标志物的细胞)分选到384孔板中,并且可以进行扩增反应(例如PCR)以扩增引入这些细胞的TCR构建体。
这种分类方法可用于同时筛选多个表达载体。简言之,可用本文提供的表达载体转染报告细胞以表达克隆的TCR。报告细胞可用单一表达载体转染,然而,多种培养物(每种培养物用不同的表达载体)可被感染。可以将这些培养物合并,然后与具有所需一种或多种抗原的APC一起孵育约4至12小时。此后,可以通过流式细胞术评估培养物,并且可将通过NFAT反应元件表达荧光标志物的细胞分选到单个孔中。那些细胞可经克隆并用作治疗性TCR载体。在某些情况下,该过程可用于筛选数百种设计用于同时表达克隆的TCR的表达载体。
在一些情况下,原代T细胞可用于筛选由本文提供的表达载体编码的克隆的TCR的特异性。在一些情况下,可筛选原代T细胞杀伤靶细胞(例如,特定癌细胞)的能力。例如,可将克隆的MHC I类限制性TCR转移到细胞毒性淋巴细胞(分化为CTL的原代细胞或经转化以表达CD3基因的扩增的原代自然杀伤(NK)细胞)中,然后与标记的靶细胞共同培养。这些靶细胞可以是扩增的肿瘤细胞(例如,从肿瘤切除的活检样品扩增的肿瘤细胞),用来自肿瘤样品的抗原重复处理的MHC I类表达型细胞,和/或用表达肿瘤特异性基因的抗原质粒转染的MHC I类表达型细胞系。在这些情况下,CTL活性可以通过用放射性同位素如铬51或染料加载靶细胞并在孵育后测量加载的标志物的释放来测量(Rowe等,Toxicol.Appl.Pharmacol.,221:179-88(2007))。当对TCR的特异性和该TCR促进效应细胞中的裂解命中的能力感兴趣时,可测量脱粒作为TCR转化的效应细胞的细胞毒性潜力的有效评估。在用靶标、穿孔素或颗粒酶B孵育效应细胞后,可进行ELISA。通过流式细胞术测量效应细胞表面上的CD107a表达(Betts等,Methods Cell Biol.,75:497-512(2004))和靶标的细胞死亡可用于评估效应细胞群的细胞毒性潜力。
在一些情况下,在TCR刺激后响应已知或可疑抗原的细胞的扩增可用于评估克隆的TCR的抗原特异性活化。本文所述的TCR载体驱动原代哺乳动物(例如人)T细胞增殖的能力可用CFSE或另一种细胞增殖染料测量(Lyons,Immunol.Cell.Biol.,77:509-15(1999))。细胞增殖的测量可用于确定基于载体的TCR的抗原指定性(specify)。简言之,原代T细胞可以用本文提供的表达TCR的载体感染,所述载体已经过功能和TCR链配对验证。可以用CFSE标记原代T细胞,并与用一种或多种抗原肽反复处理的APC或表达一种或多种抗原蛋白的载体一起孵育。接受对APC表达的抗原具有特异性的TCR载体的原代T细胞将分裂并因此稀释CFSE染料。可以通过单细胞分选来分离表达较低量CFSE(即,分裂更多)的那些细胞,并且可以从单细胞扩增(例如,PCR扩增)编码αβTCR(或γδTCR)的组装核酸。
本文提供的方法和材料可用于获得许多不同的克隆的TCR。获得后,可对其进行筛选,以确定可用于治疗各种疾病(如自身免疫,癌症,器官移植排斥,病毒感染,细菌感染,可被T细胞调节的炎症进程(例如,炎症性肠病,牛皮癣,血管炎,动脉粥样硬化,非传染性肝炎或自身免疫性胆管炎))的那些。例如,在一些情况下,肿瘤浸润性T细胞可从患有癌症的人类患者分离。可如本文所述使用那些T细胞以快速产生来自该人的数百或数千种不同克隆的TCR的集合。然后,可以快速筛选那些克隆的TCR以鉴定具有杀伤同样从该患者获得的癌细胞的能力的克隆的TCR的群体。那些克隆和鉴定的TCR可用于产生其它细胞系,所述其它细胞系表达那些TCR并可用于治疗该人。在一些情况下,从获得来源T细胞到使用编码如本文所述克隆的治疗有效TCR的表达载体转染的细胞作为治疗剂的所有这些步骤可在无需确定治疗有效TCR的序列同一性的情况下进行。
在一些情况下,本文提供的方法可在无需进行核酸测序,无需进行限制性内切核酸酶切割步骤,无需进行本文所述的其它步骤或技术,和/或无需采用本文所述的特定试剂或材料的情况下进行。例如,在一些情况下,用于获得设计用于表达从本文所述的单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可从将T细胞分选成单T细胞的点到具有所述组装的表达载体的点进行,无需进行任何核酸测序。在一些情况下,本文提供的方法可包括获得表达载体的集合,所述表达载体被设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR,以及从该表达载体的集合中鉴定特定的TCR,无需进行任何核酸测序。例如,可以使用本文提供的方法和材料克隆和鉴定具有特定功能的TCR,无需进行TCR序列的任何核酸测序。
如本文所述,在一些情况下,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可从将T细胞分选成单T细胞的点到具有所述组装的表达载体的点进行,无需进行用于克隆或其它情况的限制性内切核酸酶切割反应。例如,无缝克隆技术可用于组装来自第一和第二扩增产物的表达载体。
同样如本文所述,在一些情况下,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可以从将T细胞分选成单T细胞的点到具有组装的表达载体的点进行,无需进行如下反应混合物的巢式扩增(例如,PCR)程序的第一轮扩增,所述反应混合物被设计为仅扩增一种类型的可变链的核酸(例如,设计为仅扩增α可变链而不是β可变链的核酸(或反之亦然),或设计为仅扩增γ可变链而不是δ可变链的核酸(或反之亦然))。例如,巢式扩增(例如,PCR)程序的第一轮扩增可在设计用于扩增该反应混合物中的α和β可变链核酸(或γ和δ可变链核酸)的反应混合物内进行。
如本文所述,在一些情况下,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可从将T细胞分选成单T细胞的点到具有组装的表达载体的点进行,无需进行如下反应混合物的巢式扩增(例如,PCR)程序的第二轮扩增,所述反应混合物被设计为仅扩增一种类型的可变链的核酸(例如,设计为仅扩增α可变链而不是β可变链的核酸(或反之亦然),或设计为仅扩增γ可变链而非δ可变链的核酸(或反之亦然))。例如,巢式扩增(例如,PCR)程序的第二轮扩增可在设计用于扩增该反应混合物中的α和β可变链核酸(或γ和δ可变链核酸)的反应混合物内进行。
在一些情况下,如本文所述,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可从将T细胞分选成单T细胞的点到具有组装的表达载体的点进行,无需进行使用第一轮引物集合的巢式扩增(例如,PCR)程序的第一轮扩增,所述第一轮引物集合中,对于扩增可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的核酸具有特异性的引物包括外来核酸序列(例如,引物条码序列或引物衔接体序列)。例如,第一轮引物集合可包括这样的引物,所述引物具有对于扩增可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的核酸具有特异性的序列,同时缺少长于5个连续核苷酸、与被扩增的可变链不互补并且附连于与被扩增的可变链互补的核酸序列的外来核酸序列(例如,引物条码序列或引物衔接体序列)。
在一些情况下,如本文所述,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可从将T细胞分选成单T细胞的点到具有组装的表达载体的点进行,无需进行如下巢式扩增(例如,PCR)程序,该程序被设计用于产生包含比可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的全长编码区少的扩增产物,例如在不存在CDR1区或不存在CDR1区和CDR2区两者的情况下的包含可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的CDR3区的扩增产物。例如,可以设计本文提供的巢式扩增(例如,PCR)程序以扩增含有全长α可变链(或全长γ可变链)的第一扩增产物和含有全长β可变链(或全长δ可变链)的第二扩增产物。
在一些实施方式中,用于获得设计用于表达从单T细胞获得的克隆的TCR的表达载体的集合的方法可在如下情况下进行:从将T细胞分选成单T细胞的点到具有组装的表达载体的点,(a)无需进行任何核酸测序,(b)无需进行用于克隆或其它情况的任何限制性内切核酸酶切割反应,(c)无需进行如下反应混合物中的巢式扩增(例如,PCR)程序的第一轮扩增,所述反应混合物被设计为仅扩增一种类型的可变链的核酸(例如,设计为仅扩增α可变链而不是β可变链的核酸(或反之亦然),或设计为仅扩增γ可变链而非δ可变链的核酸(或反之亦然)),(d)无需进行如下反应混合物中的巢式扩增(例如,PCR)程序的第二轮扩增,所述反应混合物被设计为仅扩增一种类型的可变链的核酸(例如,设计为仅扩增α可变链而不是β可变链的核酸(或反之亦然),或设计为仅扩增γ可变链而非δ可变链的核酸(或反之亦然)),(e)无需使用第一轮引物集合进行巢式扩增(例如,PCR)程序的第一轮扩增,其中对扩增可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的核酸具有特异性的引物包括外来核酸序列(例如,引物条码序列或引物衔接体序列),所述外来核酸序列长于5个连续核苷酸,与被扩增的可变链不互补,并且附连于与被扩增的可变链互补的核酸序列,和/或(f)无需进行巢式扩增(例如,PCR)程序,该程序被设计为产生含有比可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的全长编码区小的扩增产物,例如在不存在CDR1区或不存在CDR1区和CDR2区两者的情况下含有可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的CDR3区的扩增产物。在一些情况下,可以进行本文所述的方法(例如,本文所述的多重方法),从而前句中(a)到(f)的排除项中的任何一项或多项满足从细胞分选的点到获得能够表达功能性TCR的表达载体的点。进行本文所述的方法(例如,本文所述的多重方法)时,能够从细胞分选的点到获得表达载体的点都满足的所述排除项的组合的示例包括但不限于:(a)和(b);(a)和(c);(a)和(d);(a)和(e);(a)和(f);(b)和(c);(b)和(d);(b)和(e);(b)和(f);(c)和(d);(c)和(e);(c)和(f);(d)和(e);(d)和(f);(a)、(b)和(c);(a)、(b)和(d);(a)、(b)和(e);(a)、(b)和(f);(a)、(c)和(d);(a)、(c)和(e);(a)、(c)和(f);(a)、(d)和(e);(a)、(d)和(f);(a)、(e)和(f);(b)、(c)和(d);(b)、(c)和(e);(b)、(c)和(f);(b)、(d)和(e);(b)、(d)和(f);(b)、(e)和(f);(c)、(d)和(e);(c)、(d)和(f);(c)、(e)和(f);(d)、(e)和(f);(a)、(b)、(c)和(d);(a)、(b)、(c)和(e);(a)、(b)、(c)和(f);(a)、(c)、(d)和(e);(a)、(c)、(d)和(f);(a)、(d)、(e)和(f);(a)、(b)、(d)和(e);(a)、(b)、(d)和(f);(a)、(d)、(e)和(f);(b)、(c)、(d)和(e);(b)、(c)、(d)和(f);(b)、(d)、(e)和(f);(c)、(d)、(e)和(f);(a)、(b)、(c)、(d)和(e);(a)、(b)、(c)、(d)和(f);(a)、(c)、(d)、(e)和(f);(a)、(b)、(d)、(e)和(f);(a)、(b)、(c)、(e)和(f);和(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。例如,可在如下情况下进行本文所述的方法(例如,本文所述的多重方法):从细胞分选的点到获得能够表达功能性TCR的表达载体的点,(a)无需进行任何核酸测序,和(b)无需进行任何限制性内切核酸酶切割反应。在一些情况下,本文所述的方法(例如,本文所述的多重方法)可在如下情况下进行:无需进行使用第一轮引物集合进行巢式扩增程序的第一轮扩增,其中对扩增可变链(例如,α、β、γ或δ可变链)的核酸具有特异性的引物包括外来核酸序列(例如,引物条码序列或引物衔接体序列),所述外来核酸序列长于5个连续核苷酸,与被扩增的可变链不互补,并且附连于与被扩增的可变链互补的核酸序列。
本文还提供了用于从单T细胞获得编码TCR的核酸并且安排该核酸以形成核酸载体的试剂盒,所述核酸载体经成功设计以表达TCR(例如,完全完整的TCR,例如具有单T细胞中存在的可变链组合的完全完整的TCR)。例如,本文提供的试剂盒可包括:用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合,和用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合的组合。
在一个实施方式中,本文提供的试剂盒可包括(a)用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的引物集合,(b)用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的引物集合,和(c)克隆片段和/或载体。在这种情况下,引物集合可以在巢式扩增反应期间具有产生含有编码L序列,Vα区段(或Vγ区段),Jα区段(或Jγ区段)和至少部分Cα区(或Cγ区)的核酸的第一扩增产物,和含有编码L序列,Vβ区段(或Vδ区段),Dβ区段(或Dδ区段),Jβ区段(或Jδ区段)和至少部分Cβ区(或Cδ区)的核酸的第二扩增产物的能力。在试剂盒包含克隆片段的那些情况下,克隆片段可含有编码TCR的C区的部分(例如,Cα区、Cγ区、Cβ区或Cδ区的部分)的核酸。在试剂盒包括载体的那些情况下,载体可包括编码TCR的部分(例如,Cα区、Cγ区、Cβ区或Cδ区的部分)的核酸。
在一些情况下,本文提供的试剂盒可包括引物集合,其包括用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的第一引物组和用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的第二引物组,其中(a)第一引物组的至少一个引物列于表1或表2中(例如,hTRAV1_12_F,hTRBV4_123_F,hTRBV10_12_F和/或或hTRBV12_34_F)或(b)第二引物组的至少一个引物列于表5或表6中(例如,Vect_hTRAV1_12_F,Vect_hTRAV8_246,Vect_hTRBV4_123_F,Vect_hTRBV6_23_F,Vect_hTRBV6_89_F,Vect_hTRBV7_2348_F和/或Vect_hTRBV12_34_F)。在这种情况下,第一引物组的一个或多个引物(例如,第一组的所有正向引物)可以缺少衔接体序列,且第二引物组的一个或多个引物(例如,第二组的所有正向引物)可包括衔接体序列。在一些情况下,所述试剂盒可包括用于第一轮和第二轮扩增的反向引物。试剂盒的其它任选成分可包括逆转录引物(例如,随机寡聚体),逆转录酶,用于PCR的DNA聚合酶(例如,Taq聚合酶,缓冲液,克隆片段,经设置以接受编码TCR的核酸的表达载体(例如,慢病毒载体)),5'外切核酸酶,用于进行Gibson组装反应的DNA聚合酶,DNA连接酶及其组合。例如,本文提供的试剂盒可包括如本文所述的引物集合,联合克隆片段和/或设置成接受编码TCR的核酸的表达载体。如本文所述,克隆片段可包括编码TCR的部分的核酸和编码自切割肽(或IRES)的核酸。在一些情况下,克隆片段可包括编码TCR的部分和启动子序列的核酸。在一些情况下,表达载体(例如,慢病毒载体)可以设置为包括编码如本文所述的至少部分TCR的核酸。
在另一个实例中,本文提供的试剂盒可包括引物集合,其包括:(a)表1中列出的第一组引物,(b)表2中列出的第二组引物,(c)针对第一组和第二组中各组的反向引物,(d)表5中列出的第三组引物(在5'端添加引物衔接体序列),(e)表6中列出的第四组引物(在5'端添加引物衔接体序列,其不同于伴随第三组引物使用的衔接体序列),和(f)针对第三组和第四组中各组的反向引物。
本文还提供了反应混合物。例如,在一个实施方式中,本文提供的反应混合物可包括:(a)含有编码L序列,Vα区段(或Vγ区段),Jα区段(或Jγ区段)和至少部分Cα区(或Cγ区)的核酸的第一扩增产物,和(b)含有编码L序列,Vβ区段(或Vδ区段),Dβ区段(或Dδ区段),Jβ区段(或Jδ区段)和至少部分Cβ区(或Cδ区)的核酸的第二扩增产物。在该实施方式中,反应混合物可任选地包括克隆片段和/或载体。在反应混合物包含克隆载体的那些情况下,克隆片段可含有编码TCR的C区的部分(例如,Cα区、Cγ区、Cβ区或Cδ区的部分)的核酸。在反应混合物包括载体的那些情况下,载体可包括编码TCR的部分(例如,Cα区、Cγ区、Cβ区或Cδ区的部分)的核酸。
在另一个实例中,本文提供的反应混合物可包括:(a)用于进行本文提供的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的引物集合,(b)含有编码L序列,Vα区段(或Vγ区段),Jα区段(或Jγ区段)和至少部分Cα区(或Cγ区)的核酸的第一扩增产物,和(c)含有编码L序列,Vβ区段(或Vδ区段),Dβ区段(或Dδ区段),Jβ区段(或Jδ区段)和至少部分Cβ区(或Cδ区)的核酸的第二扩增产物。在该实施方式中,反应混合物可任选地包括聚合酶(例如Taq聚合酶)。
本文还提供了设计用于进行巢式扩增程序的核酸引物的集合,其具有产生本文所述的第一和第二扩增产物的能力。例如,可以设计本文提供的核酸引物的集合以进行具有产生如下物质的能力的巢式扩增程序:(a)含有编码L序列,Vα区段(或Vγ区段),Jα区段(或Jγ区段)和至少部分Cα区(或Cγ区)的核酸的第一扩增产物,和(b)含有编码L序列,Vβ区段(或Vδ区段),Dβ区段(或Dδ区段),Jβ区段(或Jδ区段)和至少部分Cβ区(或Cδ区)的核酸的第二扩增产物。
在一些情况下,本文提供的核酸引物的集合可包括引物集合,其包括用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第一轮扩增的第一引物组和用于进行本文所述的巢式扩增反应(例如,巢式PCR)的第二轮扩增的第二引物组,其中(a)第一引物组的至少一个引物列于表1或表2中(例如,hTRAV1_12_F,hTRBV4_123_F,hTRBV10_12_F和/或或hTRBV12_34_F)或(b)第二引物组的至少一个引物列于表5或表6中(例如,Vect_hTRAV1_12_F,Vect_hTRAV8_246,Vect_hTRBV4_123_F,Vect_hTRBV6_23_F,Vect_hTRBV6_89_F,Vect_hTRBV7_2348_F和/或Vect_hTRBV12_34_F)。在这种情况下,第一引物组的一个或多个引物(例如,第一组的所有正向引物)可以缺少衔接体序列,且第二引物组的一个或多个引物(例如,第二组的所有正向引物)可包括衔接体序列。在一些情况下,本文提供的引物集合可包括用于第一轮和第二轮扩增的反向引物。
在另一个实例中,本文提供的引物集合可包括:(a)表1中列出的第一组引物,(b)表2中列出的第二组引物,(c)针对第一组和第二组中各组的反向引物,(d)表5中列出的第三组引物(在5'端添加引物衔接体序列),(e)表6中列出的第四组引物(在5'端添加引物衔接体序列,其不同于伴随第三组引物使用的衔接体序列),和(f)针对第三组和第四组中各组的反向引物。
本文还提供了制备本文所述的试剂盒、本文所述的反应混合物和本文所述核酸引物集合的方法。例如,可获得本文所述试剂盒的成分并将其安排到包装中以形成本文所述的试剂盒。在一些情况下,本文所述的试剂盒的每种成分可以与包装一起容纳在单独的容器内。为制备本文所述的反应混合物,可将本文所述的反应混合物的成分合并进入单一反应容器。例如,本文所述的反应混合物的成分可以合并进入多孔板的单个孔。为了制备本文所述的核酸引物的集合,可将本文所述的集合的引物合并进入单个反应容器。例如,本文所述的核酸引物集合的每个引物可以合并进入多孔板的单个孔。
以下通过实施例进一步说明本发明,这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。
实施例
实施例1-分选T细胞并从单T细胞中获得cDNA
使用本文所述的方法和材料扩增TCRα和β链的各个对包括准确地铺板单T细胞,高效提取RNA,以及保持RNA的完整性。为了证实这些中的每一项,使用表达mTRAV6-7α链和mTRBV17β链的小鼠杂交瘤T细胞系1B9。使用连续两倍有限细胞稀释至0.08个细胞/孔的稀释物,并使用实时qPCR检测小鼠GAPDH mRNA的检测。qPCR反应在Biorad CFX384实时仪器中进行,使用KAPA SYBR Green FAST试剂盒(Kapa Biosystems市售可得),正向引物(5'-TCCCACTCTTCCACCTTCGA-3';SEQ ID NO:323)和反向引物(5'-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT-3';SEQ ID NO:324)。PCR条件包括在95℃保持10分钟用于DNA聚合酶活化,然后进行55个循环:95℃保持10秒进行变性,60℃保持30秒进行退火/延伸。进行解链曲线分析以确定特异性。
使用GAPDH作为读数,确定有效条件如下:将1个1B9细胞/孔悬浮于1μL含有1mg/mL牛血清白蛋白(Ambion市售可得)的PBS中,并使用1μL 0.3%IGEPAL CA-630(西格玛(Sigma)市售可得)裂解。通过加入1μL随机六聚体(普洛麦格市售可得),1μL dNTP(生物线公司市售可得),1μL RNA酶OUT(普洛麦格市售可得),1μL DTT,2μL 5X缓冲液和1μLSuperscriptIV(赛默飞世尔市售可得)至总体积10μL来产生cDNA。cDNA合成如下进行:在25℃孵育10分钟进行引物结合,在50℃孵育40分钟进行延伸,并在85℃孵育5分钟进行酶热失活。
使用mTRBV17的正向引物(SEQ ID NO:251)和相应的反向引物(mTRBCn;SEQ IDNO:273),使用Phusion(校正DNA聚合酶)从连续稀释的细胞产生的cDNA扩增小鼠TRBV17β链,以减少在扩增阶段掺入的突变并与随后的克隆步骤相容。
如图6A和6B所示,在384孔PCR板中使用从10个细胞到0.08个细胞/孔的连续稀释,从位于含有单个细胞的孔中的单个细胞中有效提取RNA,并且从该RNA成功获得cDNA。使用5μL的cDNA反应,检测到GAPDH低至估计的0.31细胞/孔(图6A)。平行地,使用另一半cDNA反应,在测试GAPDH阳性的所有孔中扩增mTRBV17,再次降至估计的0.31细胞/孔(图6B)。各稀释物一式三份进行测试(图6B)。
为了证实这些条件能够从单细胞扩增TCR链,使用显微操作器和显微镜下监测的玻璃移液管将单1B9细胞接种在384孔板中。在该实施例中,24个单1B9细胞中的22个在细胞裂解后产生其特异性mTRBV17β链的扩增以释放RNA并逆转录以将RNA转化为cDNA(图6C)。
在确认来自单细胞的TCR链的有效扩增后,使用FACS分选器将单1B9细胞分选到384孔板的分开的孔中。使用mTRBV17扩增作为读数以确认使用细胞分选器分选的单T细胞的成功扩增。细胞分选器是BD FACSAria分选器,配置有100微米喷嘴,设定为25psi,可在384孔板中高效铺板。在该实施例中,通过BD FACSAria细胞分选器分选的含有1B9单细胞的24个孔中的22个产生细胞裂解后其特异性mTRBV17β链的扩增以释放RNA并逆转录以将RNA转化为cDNA(图6D)。
这些结果表明,本文所述的方法和材料可用于将单T细胞分选到分开的位置(例如,获得一个T细胞/孔),从那些单T细胞获得RNA,并以允许从该cDNA扩增TCR序列的方式将该RNA转化为cDNA。
实施例2-确认第一轮扩增引物的扩增效率
合成一组引物用于扩增表1和2中列出的所有人hTRAV和hTRBV。使用密度梯度离心从健康供体的血液分离人外周血单核细胞(PBMC)。简言之,将35mL新鲜分离的血液小心地铺在15mL Ficoll-Paque PLUS(GE LifeSciences市售可得)的上部,并在室温下于没有制动器的摇摆桶转子中以400×g离心30分钟。分离单核细胞层,通过以100×g离心两次7分钟除去血小板。使用RNeasy试剂盒(Qiagen市售可得)分离来自107个人单核细胞的总RNA。使用Superscript IV逆转录酶合成cDNA,并测试表1和2中列出的每种单独的引物扩增相应变体的扩增效率。对于表1中列出的hTRAVs正向引物,使用hTRACf反向引物(SEQ ID NO:265)。对于表2中列出的hTRBVs正向引物,使用hTRBC反向引物(SEQ ID NO:268)。PCR扩增反应使用Phusion DNA聚合酶。
所有hTRAV引物都能够扩增相应的hTRAV,产生长度为463个碱基对至569个碱基对的DNA产物(图7)。类似地,所有hTRBV引物都能够扩增相应的hTRBV,产生长度为561个碱基对至636个碱基对的DNA产物(图7)。
为了证实表3和4中列出的第一轮小鼠引物的扩增效率,使用了类似的方法。简言之,从年轻BL6小鼠的胸腺中分离淋巴细胞,并使用RNeasy Qiagen试剂盒分离总RNA。使用Superscript IV产生cDNA,并使用Phusion作为热稳定DNA聚合酶和相应的mTRAC反向引物(SEQ ID NO:266)和相应的mTRBC反向引物(SEQ ID NO:269)在PCR反应中测试扩增效率。除了mTRAV5-1,mTRAV6-1,mTRAV6-2和mTRAV6-3引物,表3的所有mTRAV正向引物通过凝胶电泳显示扩增了相应的mTRAV(图8)。通过扩增产物的测序确认mTRAV6-1,mTRAV6-2和mTRAV6-3引物扩增了相应的mTRAV。根据这些数据,mTRAV5-1变体似乎可能在小鼠谱系中很少见。通过凝胶电泳显示所有mTRBV正向引物扩增了相应的mTRBV(图8)。这也通过测序得到证实。
实施例3-进行巢式扩增程序以获得小鼠TCR序列
表3和4中列出的引物用于进行小鼠TCR的扩增。分选来自C57BL/6小鼠的原初CD8+脾细胞,并使用FACS Aria在含有1μL PBS和1mg/mL超纯BSA的两个384孔PCR板中进行单细胞接种。使用实施例1中描述的方法合成cDNA,并使用5μL cDNA反应扩增α和βTCR链对。
在第一PCR扩增步骤中,将表3和表4中列出的所有引物合并进入一个PCR反应,对于每个个体引物,包括200nM的两个特异性反向引物(mTRAC,SEQ ID NO:266;和mTRBC,SEQID NO:269)。在每个反应中使用1单位Phusion DNA聚合酶,在200nM dNTP和1.5mM MgCl2存在下,在25μL反应中进行PCR。热循环条件包括在98℃持续1分钟,在98℃持续10秒,在55℃持续30秒和在72℃持续40秒,总共30个循环。
在第一轮扩增后,进行两个单独的“巢式”PCR反应以分别扩增α和β链。简言之,用表7中列出的所有引物的混合物加上mTRACn引物(SEQ ID NO:271)作为用于巢式扩增mTRAV的反向引物或用表8中列出的所有引物的混合物加上mTRBCn引物(SEQ ID NO:273)作为用于巢式扩增mTRBV的反向引物扩增1μL第一扩增。在每个反应中使用1单位Phusion DNA聚合酶,在200nM dNTP和1.5mM MgCl2存在下,在25μL反应中进行PCR。热循环条件包括在98℃持续1分钟,在98℃持续10秒,在55℃持续30秒和在72℃持续40秒,总共45个循环,然后在末期包括72℃持续10分钟的孵育。
在FACS扫描中显示了在两个384孔板中分选的CD8+/TCRβ+T细胞的染色和选择(图9A)。此外,通过溴化乙锭凝胶电泳分析来自#1板的具有单T细胞/孔的前24个孔和来自#2板的具有单T细胞/孔的前24个孔的扩增反应(图9B)。证实了这些方法从单T细胞扩增TCRα和β链对的能力(图9B)。扩增的DNA产物在mTRAV和mTRBV之间表现出预期的不同大小,表明扩增具有特异性,且不是由于DNA污染引起的扩增(图9B)。总计,48个α链中有45个被扩增,48个β链中有44个被扩增,48个TCR对中有41个被扩增,效率达到85.4%。这些PCR扩增产物的数量足够,具有特异性且缺乏非特异性扩增条带,使其适用于功能性TCR的下游高通量克隆。在对扩增产物进行测序后,鉴定了多种不同的TCR(有克隆性实例,由它们在CDR3区的序列确定)。
该方法多次进行,使用不同来源的小鼠T细胞,和表3和4所列引物作为正向引物,两个反向引物(SEQ ID NO:266和269),用于第一轮扩增。使用所得第一轮扩增反应混合物的部分进行两次分开的第二轮扩增。一次包括表7中列出的引物作为正向引物,和反向引物(SEQ ID NO:271),另一次包括表8中列出的引物作为正向引物,和反向引物(SEQ ID NO:273)。对超过400种不同的扩增产物进行测序。根据这些测序结果,证实了表3和7的所有TRAV引物的成功扩增(除了对TRAV5-1具有特异性的引物)。测序结果还证实了所有22种mTRBV的成功扩增。在一些情况下,将扩增产物克隆到表达载体(例如,逆转录病毒载体)中。将这些表达载体中的5个引入细胞中,并通过用抗CD3抗体刺激证实功能性克隆的TCR的表达。在实施例5和6中更详细地描述了这五种中的一种。
实施例4-评估单T细胞中的基因表达水平
由于RNA提取和cDNA转化的高效率,产生的cDNA的部分(例如,约一半)成功地用于从单T细胞获得TCR链对。通过使用预扩增步骤或直接从产生的cDNA进行基因表达分析,这留下了约一半用于进一步表征这些单T细胞的状态。
可以使用几种筛选试验来进行特定TCR的筛选以确认命中。在一些情况下,基因表达可以与克隆TCR同时进行以确定个体T细胞的活化状态。即使这可以通过FACS解决,利用例如CD69表达的上调,也可使用二次筛选测定中活化基因的鉴定来进一步确认阳性命中。
通过使用BD iMag链霉亲和素珠和生物素化的人抗CD4抗体从PBMC正选择来分离CD4+人T细胞。将细胞用RPMI 1640,10%FCS和1%PS/Glu培养基培养5天。随后,CD4+细胞在37℃下用与CDNA珠偶联的抗CD3/抗CD28抗体活化16小时,以模拟抗原呈递细胞(APC)对T细胞的活化。激活后,使用显微操作器将正选择的CD4+细胞以一个T细胞/孔中接种在384孔PCR板中,每个孔含有1μL PBS、1mg/mL超纯BSA。提取RNA,并如本文所述在10μL反应中产生cDNA。将2μL所得cDNA混合物用于人IL-2的基因表达分析,与RLP13A(作为标准化的参照基因)表达相比。使用KAPA SYBR Green FAST试剂盒(Kapa Biosystems市售可得),在BioradCFX384实时仪器中进行qPCR反应,使用IL-2正向引物(5'-AGGGATCTGAAACAACATTC-3',SEQID NO:325),IL-2反向引物(5'-GCCTGATATGTTTTAAGTGGG-3',SEQ ID NO:326),RLP13A正向引物(5'-GTCTGAAGCCTACAAGAAAG-3',SEQ ID NO:327)和RLP13A反向引物(5')-TGTCAATTTTCTTCTCCACG-3',SEQ ID NO:328)。PCR条件包括在95℃持续10分钟进行DNA聚合酶活化,在95℃变性10秒,在60℃退火/延伸30秒,总共45个循环,然后进行解链曲线分析以确定特异性。测定用RLP13A参考基因标准化的IL-2表达的倍数增加。在用抗CD3/抗CD28珠激活后,IL-2表达从无刺激变为数百倍增加,证实该测定可用于区分响应特定刺激的分选的单T细胞和没有响应的那些(图10)。
实施例5-克隆TCR
将野生型雌性C57Bl/6小鼠用偶联抗DEC205抗体(如他处所述,Li等,Blood,118:5965-76(2011))的H60肽(LTFNYRNL)或OVA肽(SINFEKL)疫苗接种。在接种后7天,收获脾脏和淋巴结,加工成单细胞悬浮液,并用荧光标记的抗TCRβ抗体(与PerCp Cy5.5Biolegend偶联的克隆H57),抗CD8α(与PE,Biolgend偶联的克隆53-6.7或与AF488偶联的克隆53-6.7),抗CD44(与AF647或AF488偶联的克隆IM7),和(在H60分离的情况下)仅抗-CD4(与PE-Cy7,Biolegend偶联的克隆GK1.5)染色。单细胞悬浮液也用装载有H60肽或OVA肽的V450偶联物MHC-I四聚体染色。
表面染色后,细胞在PBS中洗涤一次,并在室温下在PBS中用Ghost 780(Tonbo)染色30分钟。细胞洗涤两次并悬浮在无菌PBS中。在分选之前,不合并来自分开的小鼠的细胞。将来自个体小鼠的细胞分选到不同的平板或共用平板的不同部分。将来自两只H60疫苗接种的小鼠和四只OVA疫苗接β种小鼠的疫苗活化的抗原特异性细胞(CD8+,TCR+,CD44hi,OVA或H60四聚体+)分选进入本文所述的多个384孔板。通过流式细胞术评估CD44hiCD8+脾细胞对四聚体的相对结合(图11A和11B)。使用随机六聚体(普洛麦格)和Superscript IV(赛默飞世尔)产生总cDNA。通过qPCR确认GAPDH的cDNA质量(正向引物:5’-TCCCACTCTTCCACCTTCGA-3’,SEQ ID NO:329;和反向引物:5'-AGTTGGATAGGGCCTCTCTT-3',SEQ ID NO:330),使用KAPA SYBR FAST qPCR主混物(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))。对每个孔进行处理,从而每个孔扩增TCRα和β链。表3和4中列出的鼠特异性正向引物与反向引物(SEQ ID NO:266和269)一起用于第一轮扩增。对于第二轮,将第一轮PCR产物的部分用于在两个分开的反应中扩增TCRα或TCRβ链,一个反应中,采用表7中包括的所有引物的多重体(multiplex)加上反向引物(SEQ ID NO:271),另一个反应中,采用表8中列出的所有引物加上反向引物(SEQ ID NO:273)。
使用桑格测序方法(Genewiz)对TCRα和β阳性孔的子集进行测序。使用两个引物(SEQ ID NO:263和262)作为测序引物,并使用SnapGene软件(SnapGene)分析结果。克隆的结果(图11C)表明存在独特的克隆细胞群。
基于测序,将TCRα和β对克隆到Tdtomato表达型逆转录病毒构建体中。简言之,使用Gibson克隆试剂盒(新英格兰生物实验室)将来自H60类的五个TCRα和β对与表14的小鼠INSERT_B组装进入逆转录病毒载体。组装的载体以质粒形式在NEB5α感受态细胞(新英格兰生物实验室)中生长,并基于氨苄青霉素抗性进行选择。根据制造商的说明书(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs Inc))培养Platinum-E逆转录病毒包装细胞(PLAT-E细胞),并使用LipoJet体外转染试剂盒(Signa Gen实验室公司)用含TCR的质粒转染。在转染后48小时,收获来自转染的PLAT-E细胞培养物的上清液。
用个体逆转录病毒载体感染TCRα-β-杂交瘤细胞系,所述逆转录病毒载体含有从H60-四聚体结合CD8细胞分离和扩增的TCR基因或使用另一引物组组装的TCR基因载体。在感染后两天、四天和六天,通过流式细胞术评估细胞的TCRβ和tdtomato的表达。选择用于从H60分选扩增的全部五种TCR在杂交瘤细胞系的表面上成功表达TCR。在感染后6天,使用大量分选技术分选出Tdtomato+细胞,并且细胞表达Tdtomato基因和表面TCR超过两个月。鉴定出两个H60TCRβ细胞表达TRVB2基因(其编码TCRVβ4基因)。通过用抗TCRVβ4(克隆KT4,生物素标记的,BD生物科学公司(BD Biosciences))对用含有TRVB2的病毒感染的细胞系染色来测试序列的特异性和病毒生产的保真度。使用LSR II(BD生物科学公司)评估染色。染色结果表明,克隆并通过染色或测序选择的TCR(在β这种情况下是H60衍生的TCR Vβ4)被选择性表达(图11D-F)。这些转化细胞系稳定表达所选择的TCR超过两个月。
实施例6-表达从单T细胞克隆的功能性TCR
使用Lipojet转染试剂盒(Signa Gen实验室),用含有潮霉素抗性基因的NFAT-RE驱动的荧光素酶报告质粒转染4G4细胞。转染后两天,将4G4置于含有1mg/mL浓度的潮霉素的培养物中。该浓度在10天内杀死100%未转染的4G4细胞。将潮霉素抗性4G4细胞重复亚克隆并用PMA/I刺激以诱导NFAT驱动的荧光素酶。使用BioGlow荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格)在384孔、不透明的白色组织培养物处理的板(Greiner)中测量荧光素酶活性。选择潮霉素抗性细胞的亚系用于低荧光素酶背景表达和高诱导型荧光素酶表达。
用两种不同的TCR表达型逆转录病毒载体感染4G4细胞,所述逆转录病毒载体使用从单细胞分选的T细胞获得的TCR序列使用Gibson组装进行组装。使用PLAT-E细胞产生病毒。一种TCR表达型载体由原代T细胞的单细胞分选产生,并含有Tdtomato表达型病毒骨架。另一种TCR表达型载体由获自体外扩增的T细胞的TCR产生,并含有eGFP表达型骨架。
为了确定逆转录病毒转染和TCR表达的特异性和效率,通过用抗TCRβ(克隆H57)对未感染的细胞染色并评估它们的tdtomato和TCR的表达来获得背景水平。未受影响的4G4细胞不表达TCRβ(图12A,左图)。感染后24小时,对病毒感染的细胞进行针对TCRβ的染色,并评估eGFP和tdtomato表达(取决于所用的病毒载体)。在感染后24小时,存在可检测水平的表面TCR和eGFP表达(图12A,右图)。
荧光素酶报告细胞感染表达TCR的病毒。在细胞被感染后一天,将4G4细胞置于384孔不透明白色组织培养物处理的板(Greiner)中。用不同浓度的抗鼠CD3抗体被覆白色不透明组织培养物处理的384孔板的各个孔,并在4℃孵育过夜(克隆2C11,BD生物科学公司)。将孔用PBS洗涤两次,并用表达TCR的病毒载体感染来自培养物的3×104个4G4细胞,将其铺板在总体积为40μL的培养基中。感染的4G4培养物的流式细胞术分析发现,在大多数情况下感染效率低于80%,并且通过Tdtomato或eGFP表达来判断。通过对抗鼠TCRβ克隆H57(白乐津公司(Biolegend))进行染色来测量细胞表面上的TCR表达。
在用抗CD3培养3.5小时后,向每个孔添加40μL BioGlow底物(普洛麦格),并将板在室温下孵育10分钟。使用SpectaMax i3(分子装置公司(Molecular Devices))在100ms的时间段内测量相对光单位。
未感染的细胞表达一些荧光素酶,如RLU高于零所测量的(图12B)。然而,未感染的细胞对抗CD3刺激没有响应。感染的细胞培养物对抗CD3刺激非常敏感(图12B)。
实施例7-用于从单T细胞同时捕获全长T细胞受体可变区的组合物和方法
背景
克隆编码TCR的基因的追求及其发现可追溯到30多年前。分离、表征和重新表达TCR代表了理解由T细胞引起的疾病以及使用具有确定的TCR的T细胞作为治疗癌症的治疗的主要目标。因此,这些方法具有研究/基础和治疗意义。
目前,在鉴定对确定的抗原特异的T细胞克隆的常用方法中,T细胞从生物中被分离并在抗原和/或非特异性刺激和促炎细胞因子的存在下体外扩增。然后通过与缺乏其自身TCR表达的连续T细胞肿瘤系融合,将它们细胞克隆和/或永生化为T细胞杂交瘤。这是一种偏倚(biased)方法,因为对抗原具有较低亲和性的T细胞可能被对同一抗原具有更高亲和性的T细胞过度生长(overgrown),留下低亲和性TCR不被发现。从组织或实体瘤分离的许多T细胞在体外也不会很好地扩增,并且它们的TCR特异性将被遗漏。而且,它的通量低、速度慢、劳动强度大。
部分解决这些问题的方法是在体内进行免疫,并对单T细胞进行分选,所述单T细胞显示活化标志物的表达或结合预先装载有特定已知肽抗原靶标的限定的MHC-四聚体。前一种方法的缺点是许多显示活化标志物的T细胞受到旁观者机制(bystander mechanism)的刺激,并且对抗原不具有特异性。四聚体的使用是一种进步,但其局限性在于只有有限数量的四聚体可用并且它们的生产是费力且昂贵的;此外,它们受到HLA/MHC限制,并且它们可能缺乏抽出较低亲和性T细胞的灵敏度。四聚体方法也只能分离具有已知的预确定特异性的细胞,并且不能用于发现识别未知但重要的抗原肽的T细胞及其受体。
通常对如此分离的T细胞进行后续TCR测序。对于跨越TCRβ的VDJ边界和TCRVα的VJ边界的序列的捕获完全指定了TCR,因此是每个T细胞永生化(需进一步努力)的“钩子(hook)”;这是必要的,因为细胞本身并没有永生化。这进而通常通过使用结合在α(Vα)和β(Vβ)链的可变区中的已公开的引物库和结合α和β链的恒定部分的引物,随后进行巢式PCR来实现。实际上直到最近才通过对来自细胞库的Vβ或Vα进行测序,甚至使用高通量测序(HTS),来惯常地分析T细胞库。然而,虽然这种方法评估了多样性和起源,但它失去了Vα/Vβ的单细胞配对,它们只能在一起时才能确定特异性。
因此,在过去几年中,有少数方法和论文出现,以从单T细胞捕获连锁的Vα/Vβ。根据它们的设置方式,这些方法是低通量到中等通量且昂贵的(每个序列3-7美元;考虑到α和β链/TCR为6-14美元)。这样的序列确实识别所需信息,但它们不是全长Vα/Vβ。因此,必须重建该全长序列,如果目标是表达:必须进行对每个TCR具有特异性的PCR(对每个TCR定序引物将耗费约5美元/引物,需要20美元/TCR)或者必须合成完整的α和β序列(160-200美元/TCR)。一旦扩增/合成Vα和Vβ序列两者,它们最终可被克隆到选择的载体中。目前尚无开发的技术允许人们对从组织或血液分离的任何单T细胞进行进行无偏倚的高通量鉴定和克隆,以适用于高通量抗原筛选或在治疗中应用。
该实施例7中公开的组合物,载体和方法可以解决这些和其它需要。
总述
实施例7中提供组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体在单一载体中包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vα和全长Vβ。该实施例7中还提供组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体在单一载体中包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vγ和全长Vδ。所述TCR可容易地被表达而无需进一步克隆步骤。
一方面,该实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vα区和Vβ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vα引物,其中该第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的第一前导序列;和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vβ引物,其中该第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
另一方面,该实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vα区和Vβ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vα引物,其中所述第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的多个第一前导序列;
和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一
组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vβ引物,其中所述第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的多个第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
一方面,该实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vγ区和Vδ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cδ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cγ的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vγ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vγ引物,其中该第一正向Vγ引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vγ基因的第一前导序列;和
2.第一反向Cγ引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vδ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vδ引物,其中该第一正向Vδ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vδ基因的第二前导序列;和
2.第一反向Cδ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vγ扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vγ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vγ引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vγ引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cγ引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vδ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRδ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vδ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vδ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cδ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vγ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vδ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
另一方面,该实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vγ区和Vδ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cδ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cγ的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vγ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vγ引物,其中所述第一正向Vγ引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vγ基因的多个第一前导序列;
和
2.第一反向Cγ引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vδ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vδ引物,其中所述第一正向Vδ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vδ基因的多个第二前导序列;和
2.第一反向Cδ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vγ扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vγ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vγ引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vγ引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cγ引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vδ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRδ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vδ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vδ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cδ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vγ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vδ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
在一个实施方式中,步骤(d)和(e)在单一反应中进行。在一个实施方式中,步骤(f)和(g)在单一反应中进行。
在一个实施方式中,通过连接来组装TCR表达载体包括:采用短同源区域的无缝克隆方法。在一个实施方式中,通过连接进行的TCR表达载体的组装包括Gibson组装方法。
在一个实施方式中,第一核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第一核苷酸序列长度为20个核苷酸。
在一个实施方式中,第五核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第五核苷酸序列长度为20个核苷酸。
在一个实施方式中,第九核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第九核苷酸序列长度为18个核苷酸。
在一个实施方式中,第十二核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第十二核苷酸序列长度为18个核苷酸。
在一个实施方式中,线性化载体包含pMIGII。
在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列选自编码2A肽序列的核苷酸序列,其中2A肽序列选自SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335。在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列选自编码2A肽序列的核苷酸序列,其中2A肽序列选自SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:334。在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列选自编码2A肽序列的核苷酸序列,其中2A肽序列是SEQ ID NO:335。
在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列是SEQ ID NO:336。
在一个实施方式中,T细胞来自人类。在一个实施方式中,T细胞来自小鼠。
在一个实施方式中,RNA直接获自T细胞,作为单步骤RT-PCR反应的部分。在一个实施方式中,在RT-PCR反应之前,RNA获得并分离自T细胞。
说明
该实施例7中提供组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体在单一载体中包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vα和全长Vβ。该实施例7中还提供组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体在单一载体中包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vγ和全长Vδ。所述TCR可容易地被表达而无需进一步克隆步骤。参见例如图13-23。
贯穿本申请使用的术语应被解释为对于本领域普通技术人员而言具有普通和典型含义。然而,对于以下术语给出如下定义的特定含义。
在本说明书和权利要求中,所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物,除非上下文中有明显的表示。例如,术语“一个细胞”可以包括多个细胞,并包括其混合物。
如本领域普通技术人员所理解的,术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一个非限制性实施方式中,该术语定义为在10%以内。在另一个非限制性实施方式中,该术语定义为在5%以内。在另一个非限制性实施方式中,该术语定义为在1%内。
术语“细胞”,“细胞系”和“细胞培养物”包括后代。还应理解,由于有意或偶然的突变,所有的后代的DNA内容可能不是精确相同的。包括群体内的变异后代,该群体具有与最初工程改造的细胞群体中筛选的相同的TCR表达。
如本文所用,术语“包括”或“包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素,但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时,“基本由……组成”应表示排除对于该组合物具有任何基本意义的其它要素。因此,基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的运载体,例如磷酸盐缓冲盐水,防腐剂等。“由……组成”表示排除多于用于给予本发明的组合物的微量元素的其它成分和基本方法步骤。通过各这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。
“对照”是用于比较目的的实验中使用的替代对象或样品。对照可为“阳性(正)”或“阴性(负)”。
本文中,术语“片段b”指DNA多核苷酸序列,其以5’至3’方向包含Cα多核苷酸和病毒2a多核苷酸,其中,采用Gibson组装方法,片段b在其5’和3’端均与该实施例7的扩增子产物可接合。在一个实施方式中,片段b如SEQ ID NO:337所示。
如本文所用,“基因表达”和“蛋白质表达”分别是指多核苷酸转录成mRNA的过程和转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA,则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。“基因过表达”是指从基因转录的mRNA的过量产生,其水平比对照样品中检测到的表达水平高2.5倍、高5倍或高10倍。“蛋白质过表达”包括由基因编码的蛋白质产物的过量产生,其水平比对照样品中检测到的表达水平高2.5倍、高5倍或高10倍。
如本文所用,“表面表达”是指多肽易位至细胞表面的过程,使得至少一部分多肽位于细胞表面的外部。“表面过表达”包括细胞外表面上特定多肽量的增加,其水平比对照样品中检测到的表面表达水平高2.5倍、高5倍或高10倍。
实施例7中使用的术语“Gibson组装方法”是指提供多个DNA片段的方向性闭合的方法,所述多个DNA片段是本领域技术人员已知的,首先描述于Gibson DG,Young L等.(2009)高达数百千碱基的DNA分子的酶组装(Enzymatic assembly of DNA molecules upto several hundred kilobases).Nature Methods,6(5):343–345。Gibson组装方法利用DNA片段和在待接合的位置设计有重叠序列的受体载体,以及外切核酸酶、连接酶和聚合酶。
术语“同一性”或“同源性”应解释为在对齐序列和引入缺口(如果需要)以实现整个序列的最大百分比同一性之后,表示候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与比较序列的相应序列的碱基或残基相同的百分比,且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。N-或C-末端延伸和插入都不应被解释为降低同一性或同源性。与另一序列具有一定百分比(例如,80%,85%,90%或95%)的“序列同源性”的多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)意指在比较两个序列时,对齐时,上述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序测定该比对和同源性或序列相同性百分比。在一个实施方式中,采用默认参数进行对齐。在一个实施方式中,采用默认参数进行BLAST程序。在一个实施方式中,BLAST程序BLASTN和BLASTP采用以下默认参数使用:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两条;截留值=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序依据=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
用于实施例7中所用治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人类、家养和农场动物、非人灵长类动物,以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、马、猫、奶牛等。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用,并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式,即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构,并且可以进行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子:基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸,如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在,对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰,如通过与标记组分结合。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求,本发明包含多核苷酸的任何实施方式都是双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成:腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鸟嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);当多核苷酸是RNA时,尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(U)。因此,术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。可以将该字母表示输入具有中央处理单元的计算机中的数据库中,并用于生物信息学应用,如功能基因组学和同源性搜索。
术语“多肽”以其最广泛的含义使用,是指两个或更多个亚基氨基酸,氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方式中,亚基可以通过其它键,例如酯、醚等连接。如本文所用,术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸,包括甘氨酸和D或L光学异构体,以及氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链短,则通常将三个或更多个氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链长,则肽通常称为多肽或蛋白质。
“引物”是短的多核苷酸,通常具有游离的3'-OH基团,其通过与靶标特异性杂交来结合可能存在于目标样品中的靶标或“模板”,然后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“引物特异性”是指引物特异性结合靶标的能力。引物特异性由引物内与靶标杂交的多核苷酸区域决定,在本文中也称为“杂交区域”。
“聚合酶链式反应”(“PCR”)是这样的反应,其中复制拷贝由靶多核苷酸采用以下组分制得:“引物对”或由“正向”和“反向”引物组成的“引物组”,和聚合催化剂,例如DNA聚合酶,并且通常是热稳定的聚合酶。在一些实施方式中,正向引物特异性结合T细胞前导序列,产生包含前导序列的扩增子产物。用于PCR的方法是本领域熟知的,并且例如在“《PCR:实践方法》(PCR:A PRACTICAL APPROACH)”(M.MacPherson等,牛津大学出版社的IRL出版公司(1991))中教导。术语“RT-PCR”在本文中是指逆转录PCR过程,其中RNA分子(例如mRNA)被逆转录成cDNA分子,然后如本领域技术人员已知的那样扩增。术语“巢式PCR”在本文中是指在第一PCR过程之后并且使用至少一种不同于第一过程的引物的PCR过程,以扩增位于第一PCR过程的产物内的靶标。在一些实施方式中,第一PCR过程是RT-PCR过程。产生多核苷酸的重复拷贝的所有过程,例如PCR或基因克隆,在本文中统称为“复制”。
术语“对象”在本文中定义为包括动物,例如哺乳动物,包括但不限于灵长类动物(例如人),牛,绵羊,山羊,马,狗,猫,兔,大鼠,小鼠等。在一些实施方式中,该对象是人。
术语“T细胞”在本文中是指表达T细胞受体的淋巴细胞。T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK T细胞。包含在T细胞定义内的CD4+T细胞亚群是Th1、Th2、Th9、Th22、Treg和Tfh。CD8+T细胞包括记忆和效应细胞亚群。
术语“T细胞受体”可与术语“TCR”互换使用。尽管这些术语通常指参与响应抗原(阿尔法(α)链(或伽马(γ)链)、贝塔(β)链(或达尔塔(δ)链)、两条泽塔(ζ)链、CD3达尔塔(δ)链、CD3(ε)链和CD3(γ)链)的T细胞活化的整合膜蛋白的复合物,如本文所用,术语“T细胞受体”和“TCR”指TCR的阿尔法(α)(或伽马(γ))和贝塔(β)(或达尔塔(δ))链(多肽)。“TCRα多核苷酸”编码TCRα链(包括可变区(V)和恒定区(C)),而“TCRβ多核苷酸”编码TCRβ链(包括可变区(V)和恒定区(C))。因此,本文中“Vα多核苷酸”指编码TCRα链可变区多肽的多核苷酸。本文中“Cα多核苷酸”指编码TCRα链恒定区多肽的多核苷酸。“Vβ多核苷酸”指编码TCRβ链可变区多肽的多核苷酸。本文中“Cβ多核苷酸”指编码TCRβ链恒定区多肽的多核苷酸。在一些实施方式中,编码的多肽是全长多肽。在其它实施方式中,编码的多肽是片段。应当理解,Vα多核苷酸包含TCRVα多核苷酸和TCRJα多核苷酸。应进一步理解,Vβ多核苷酸包含TCRVβ多核苷酸,TCRDβ多核苷酸和TCRJβ多核苷酸的全部。在一个实施方式中,Cβ多核苷酸序列是SEQ ID NO:338。
如实施例7中所用的术语“表达载体”是指含有DNA序列的DNA构建体,所述DNA序列与能够在合适的宿主中实现DNA表达的合适的控制序列操作性连接。这些控制序列包括能实现转录的启动子,能控制这种转录的可选的操纵基因序列,编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列,以及控制转录和翻译终止的序列。表达载体可以是质粒、噬菌体颗粒,或简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中,表达载体可以独立于宿主基因组复制和起作用,或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。质粒是最常用的表达载体形式,然而,本发明旨在包括这样的其它形式的表达载体,其具有与本领域相同的功能,并且是本领域已知的或变得已知的。
本文中术语“2a多核苷酸”指编码2A肽或2A肽共有基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:331)的多核苷酸。2A肽包括但不限于:口蹄疫病毒的2A肽(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP,SEQ ID NO:332)、马鼻炎病毒的2A肽(QCTNYALLKLAGDVESNPGP,SEQ ID NO:333)、明脉扁刺蛾β四体病毒的2A肽(EGRGSLLTCGDVEENPGP,SEQ ID NO:334)、猪捷申病毒-1的2A肽(ATNFSLLKQAGDVEENPGP,SEQ ID NO:335)。
方法
实施例7中提供通过在单一载体中捕集来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vα和全长Vβ来组装TCR表达载体的方法。实施例7中还提供组装TCR表达载体的方法,其包括将来自单T细胞(或同源T细胞群)的全长Vγ和全长Vδ捕集进入单一载体。所述TCR可容易地被表达而无需进一步克隆步骤。
实施例7中公开的方法允许在任何载体中快速克隆任何已知或未知TCR。这些方法的花费低于现有技术方法且是无偏倚的。在一些实施方式中,这些方法允许快速且低价地扩增任何T细胞的完整TCR并指导产物在所选载体中的无缝克隆。这些方法和材料的应用很多,例如中到高通量分离和将TCR克隆到逆转录病毒载体中以筛选抗原和/或产生逆基因或转基因小鼠。
实施例7中描述的方法适用于人体系统,通过设计对人α和β链具有特异性的一组引物,并使用适合感染人细胞的载体(例如,逆转录病毒载体或原病毒)。在一些实施方式中,这些方法可用于癌症的免疫治疗。这是通过将来自大量肿瘤浸润细胞(TIL)的TCR克隆到受体逆转录病毒载体中来实现的,其最终目标是转导患者淋巴细胞用于免疫疗法。在一些实施方式中,实施例7中公开的方法用于从自身免疫患者的发炎组织中克隆大量TCR以筛选自身抗原。利用这些知识,采用策略来中和该抗原或识别它的特定自身反应性T细胞。在另一个实施方式中,从取自宿主排斥的实体器官移植物(例如肝、肾、肺或肠)的T细胞克隆TCR。此类TCR可用于研究排斥过程,监测排斥过程,并将这些T细胞引入可用于治疗排斥的具有调节功能的宿主人T细胞中。
一方面,实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vα区和Vβ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vα引物,其中该第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的第一前导序列;和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vβ引物,其中该第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.组装TCR表达载体,其通过以5′至3′方向连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
另一方面,实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vα区和Vβ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vα引物,其中所述第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的多个第一前导序列;和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vβ引物,其中所述第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的多个第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.组装TCR表达载体,其通过以5′至3′方向连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
一方面,实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vγ区和Vδ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cδ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cγ的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vγ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vγ引物,其中该第一正向Vγ引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vγ基因的第一前导序列;和
2.第一反向Cγ引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vδ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vδ引物,其中该第一正向Vδ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vδ基因的第二前导序列;和
2.第一反向Cδ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vγ扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vγ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vγ引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vγ引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cγ引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vδ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRδ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vδ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vδ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cδ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.组装TCR表达载体,其通过以5′至3′方向连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vγ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vδ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
另一方面,实施例7中提供一种组装TCR表达载体的方法,所述TCR表达载体包含来自单T细胞(或同源T细胞群)的Vγ区和Vδ区,所述方法包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cδ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cγ的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞(或同源T细胞群)获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vγ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vγ引物,其中所述第一正向Vγ引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vγ基因的多个第一前导序列;和
2.第一反向Cγ引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vδ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vδ引物,其中所述第一正向Vδ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vδ基因的多个第二前导序列;和
2.第一反向Cδ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vγ扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vγ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vγ引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vγ引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cγ引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vδ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRδ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vδ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vδ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cδ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.组装TCR表达载体,其通过以5′至3′方向连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分:
i.线性化载体5’端;
ii.第二组TCR Vγ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vδ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
在一个实施方式中,步骤(d)和(e)在单一反应中进行。在一个实施方式中,步骤(f)和(g)在单一反应中进行。
在一个实施方式中,通过连接来组装TCR表达载体包括:采用短同源区域的无缝克隆方法。在一个实施方式中,通过连接进行的TCR表达载体的组装包括Gibson组装方法。
在一个实施方式中,第一核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第一核苷酸序列长度为20个核苷酸。
在一个实施方式中,第五核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第五核苷酸序列长度为20个核苷酸。
在一个实施方式中,第九核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第九核苷酸序列长度为18个核苷酸。
在一个实施方式中,第十二核苷酸序列长度为15至25个核苷酸。在一个实施方式中,第十二核苷酸序列长度为18个核苷酸。
在一个实施方式中,第一核苷酸序列与第二核苷酸序列在线性化载体的5’端完美互补。在一个实施方式中,第三核苷酸序列与第四核苷酸序列在片段b的5’端完美互补。
在一个实施方式中,第五核苷酸序列与第六核苷酸序列在片段b的3’端完美互补。在一个实施方式中,第七核苷酸序列与第八核苷酸序列在线性化载体的3’端完美互补。在一个实施方式中,第十核苷酸序列与第十一核苷酸序列在片段b的5’端完美互补。在一个实施方式中,第十三核苷酸序列与第十四核苷酸序列在线性化载体的3’端完美互补。
在一个实施方式中,多个第一正向Vα引物包含SEQ ID NO:345至SEQ ID NO:416(总共72个引物)。在一个实施方式中,多个第一正向Vβ引物包含SEQ ID NO:417至SEQ IDNO:441(总共25个引物)。
在一个实施方式中,线性化载体包含pMIGII。
在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列选自SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335。在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列选自SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335。在一个实施方式中,编码2A的第三多核苷酸序列是SEQ ID NO:335。
在替代性实施方式中,本文的方法可采用接头序列,所述接头序列包含任何自切割肽,而不是2A序列。
在一些实施方式中,对于各Vα和Vβ,本文公开的方法采用在5’的“第一”引物包含整个前导序列的引物。
在一些实施方式中,所述TCR表达载体构建体可以不同排列克隆。例如,TCR表达载体可以5’至3’方向,通过连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分组装:
i.线性化载体的5’端;
ii.第二组TCR Vβ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vα扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
在一些实施方式中,所述TCR表达载体可以5’至3’方向通过连接(例如,无缝克隆方法或Gibson组装方法)以下部分组装:
i.线性化载体的5’端;
ii.第二组TCR Vδ扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vγ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
在一个实施方式中,T细胞来自人类。在一个实施方式中,T细胞来自小鼠。
在其它实施方式中,TCRα和βRNA获自克隆群体而非单T细胞。
在一些实施方式中,TCRα和TCRβRNA之一或两者暴露至多个第一正向Vα引物,各引物具有相同末端5’端和不同引物特异性。如本文所述,“引物特异性”指引物特异性结合至靶TCRα或TCRβRNA的能力。引物特异性由引物中杂交至TCRα或TCRβRNA的多核苷酸区域确定,在本文中也称为“杂交区域”。
所述方法采用的表达载体可以是本领域技术人员已知的任何合适表达载体。在一些实施方式中,表达载体是病毒载体。在一些实施方式中,表达载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中,表达载体是腺病毒载体。在一些实施方式中,表达载体是pMIGII(Holst等,Nat.Protoc.,1(1):406-17(2006))。
引物生成
使用matlab代码语言开发了一种算法,用于生成从基于因特网的基因组数据库以原始文本格式获得的给定DNA序列的引物。该方法可以很容易地适应其它形式的输入。IMGT数据库用于生成所有注释的功能性小鼠Vα和Vβ链的文本(text)格式的列表。使用者能够设定引物的一个或两个所需的解链温度范围和所需的核苷酸数目范围。此外,用户可以在所得引物的5'侧添加任何固定的核苷酸序列。在该实施例中,固定的核苷酸序列是添加到Vα和Vβ的引物的20个核苷酸,分别与受体载体或片段b具有同源性。一旦设置了输入参数,程序就扫描包含数百甚至数千个DNA序列的原始文本,自动识别每个序列名称和与其相关的序列,并确定每个序列的给定输入约束条件内的最佳引物。该程序使用最近邻法(SantaLucia,J Jr.(1998)“聚合物、哑铃和寡核苷酸DNA最近邻热力学的统一视图(A unifiedview of polymer,dumbbell,and oligonucleotide DNA nearest-neighborthermodynamics).”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,1460-1465)以计算解链温度并构建解链温度尽可能彼此接近的引物。
作为输出,程序会自动将一系列列表保存在文本文件中:
1.完整的结果报告,其列出所有引物及其特征,如解链温度,温度范围,引物是否适合所需参数,以及关于引物成功的数量和重复引物数量的一般说明。
2.仅包含非重复引物及其所有特征的列表。
3.仅包含重复引物及其所有功能的列表。
4.引物名称列表
5.订购引物的购买清单
6.关于引物在其解链温度,其大小以及其属于哪个温度范围内的分布的直方图的统计分析。
整个计算过程几乎是瞬间完成的,从而节省了用户的工作时间,并且可快速尝试所需最终引物的不同可能性。
TCR表达载体的组装
“引物生成”部分中描述的方法用于产生一组正向引物,它们一起可结合Vα谱系的所有前导序列以及迄今为止在IMGT数据库中标注的任何小鼠品系的Vβ谱系的前导序列。这些Vα和Vβ引物的序列分别在SEQ ID NO:345-416和SEQ ID NO:417-441中提供。这些引物与结合α和β恒定区的反向引物(分别为SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340)组合,可以与克隆群的mRNA或单个细胞(在单步骤RT-PCR反应中)一起使用,以扩增全长可表达的V序列。在每个正向引物的5'端,存在固定的20个核苷酸的区段,其与载体或与包含α链的恒定区和其下游的2a元件的DNA片段(下文称为“片段b”)具有同源性(参见图15)。在一个实例中,Vα引物的不变的20个核苷酸与基于pMIGII逆转录病毒载体的线性化受体载体的5'端具有同源性,并且Vβ引物的不变的20个核苷酸与片段b的3'端具有同源性(图14和15)。线性化的受体载体在其3'端含有β链的恒定区。
在RT-PCR之后,将样品分开,并对α和β链进行巢式PCR,采用18个核苷酸的正向引物(与Vα或Vβ的不变部分结合)和用于Cα和Cβ的巢式反向引物。在巢式PCR完成后,使用Gibson组装方法将含有Vα加上Cα的20个核苷酸和Vβ加上Cβ的20个核苷酸的产物与片段b一起在10μL的总反应中组装在线性化的受体载体中。例如,将50ng线性化(受体)载体,10ngα扩增子,10ngβ扩增子和10ng片段b(10μL总混合物)添加到10μL 2xGibson组装酶中(试剂盒来自NEB)并在50℃孵育1小时。
TCR表达载体的表征
在产生TCR表达载体后可以采取两种下游策略,注意现在每个单细胞的Vα/Vβ在一个环状DNA片段中连接(图16)。
策略1由以下组成:保持每个TCR的Gibson组装反应是分开的,并将其各自转化为大肠杆菌中的单一反应。从第一次RT-PCR到Gibson组装和大肠杆菌中转化的步骤在大约8小时内完成。第二天,每个TCR的5个菌落在含有氨苄青霉素的5-10mL LB培养基中一起生长,并对每个TCR进行质粒小量制备(mini-prep)。因为Gibson组装反应产生大约30-50%的阳性克隆,所以5个菌落中大约至少1个含有具有正确α和β插入物的逆转录病毒载体。然后用在1-2.5mL DMEM培养基中的2-5μg每个质粒库和1.4-3.6μg Ecohelper质粒转染在12孔板上生长的PlatE细胞。24小时后,用来自12个孔中每个PlatE孔的1-1.5mL RV上清液或48孔板中的1mL转导0.5-1x105个4G4TCRα-/-CD4+细胞。第二天,重复使用病毒上清液的转导。
在第3天或第4天检测膜上的TCR表达并筛选抗原。当优选单个正确的RV载体而不是库(其可能包含错误组装和/或空的受体载体)时,将库转化回细菌,并通过用EcoRI和XhoI消化质粒来筛选正确插入α和β链的细菌菌落。消化后,含有正确组装的α和β产物的片段大小(或者如果α或/和β具有EcoRI或/和XhoI限制位点,则为片段总和大小)必须大约1.8kb,并且载体主链大小必须在6.3kb左右。该策略适用于未知T细胞的中等通量克隆和抗原筛选。
策略2旨在实现高通量目的。在该策略中,合并每个TCR的Gibson组装反应(每个库最多40个TCR),并且在120μL化学感受态大肠杆菌中转化8μL。将细菌涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂上。在接种后12小时,挑选细菌菌落在含有氨苄青霉素的液体LB中生长。挑取不超过200个菌落(1个菌落/2.5mL LB培养基)并在500mL LB培养基中一起生长过夜。因为Gibson组装反应提供大约30-50%的阳性克隆,所挑选的200个菌落含有60到100个具有正确α和β插入物的逆转录病毒载体,理论上每个输入TCR(每个库40个,如上所述)至少1个正确的逆转录病毒。大约12小时后,进行大量制备(maxi prep)以分离质粒DNA文库。在含有20mL DMEM培养基的6个T175烧瓶中生长12小时的PlatE细胞各自采用脂质转染试剂用每个培养瓶25μgEco-辅助质粒和35μg质粒文库转染。24小时后,5个T75烧瓶,每个烧瓶具有2×106个指数生长的4G4TCRα-/-CD4+细胞(或者可以使用其它CD4+,例如B3Z/lacZ或CD8+细胞系),用20mL病毒上清液转导。第二天,重复使用病毒上清液的转导。
在第3-4天检测膜上的TCR表达并筛选抗原特异性。已经经历对于抗原的TCR依赖性识别的4G4细胞(注意可以容易地使用其它受体指示细胞)分泌IL-2。基于表面IL-2捕获或其它手段将反应性4G4细胞分选为单个细胞。通过用设计用于结合EcoRI限制性位点上游20个核苷酸和XhoI限制性位点下游20个核苷酸的基因组整合原病毒的引物进行PCR来扩增这些细胞中的Vα-2a-Vβ转基因(约1850bp)。为了获得携带功能性和抗原特异性TCR的逆转录病毒载体,可以在用EcoRI和XhoI切割的组装载体中快速组装Vα-2a-Vβ转基因。该策略非常适用于高通量克隆未知特异性的TCR,然后大规模筛选候选抗原。制作的库也可以被放大和重复使用。
本文公开的方法中使用的其它序列:
FASTA形式的编码自切割肽2A的核苷酸序列(SEQ ID NO:336):
5’-GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC-3’
FASTA形式的编码片段b的核苷酸序列(SEQ ID NO:337):
5’-ACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGTGGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC-3’
FASTA形式的编码Cβ的核苷酸序列(SEQ ID NO:338):
5’-AGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGAAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGAATCACTTCAGCATCCTATCATCAGGGGGTTCTGTCTGCAACCATCCTCTATGAGATCCTACTGGGGAAGGCCACCCTATATGCTGTGCTGGTCAGTGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAAAAAAAATTCCTGA-3’
第一反向Cα引物(SEQ ID NO:339):
GTCAAAGTCGGTGAACAGGC
第一反向Cβ引物(SEQ ID NO:340):
TTGGGTGGAGTCACATTTCTC
Cα的巢式反向引物(第二反向Cα引物)(SEQ ID NO:341):
AGGTTCTGGGTTCTGGATGT
Cβ的巢式反向引物(第二反向Cβ引物)(SEQ ID NO:342):
GGAGTCACATTTCTCAGATCCT
巢式正向α(第二正向Vα引物)(SEQ ID NO:343):
TCTAGGCGCCGGAATTCA
巢式正向β(第二正向Vβ引物)(SEQ ID NO:344):
GAAGAAAACCCCGGTCCC
引物α(Vα)库(多个第一正向Vα引物)(SEQ ID NO:345-SEQ ID NO:416):
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引物β(Vβ)库(多个第一正向Vβ引物)(SEQ ID NO:417-SEQ ID NO:441):
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ATN-b25:tggaagaaaaccccggtcccatgggctgaaaaatgctctgct(SEQ ID NO:441)
本文还提供:
段落#1.一种组装T细胞受体表达载体的方法,所述T细胞受体表达载体包含来自单T细胞的Vα区和Vβ区,包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vα引物,其中该第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的第一前导序列;和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.第一正向Vβ引物,其中该第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体的5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
2.如段落#1所述的方法,其中,步骤(d)和(e)在单一反应中进行。
3.如段落#1或段落#2所述的方法,其中,步骤(f)和(g)在单一反应中进行。
4.如段落#1-#3中任一项所述的方法,其中,通过连接组装所述TCR表达载体包括无缝克隆方法,其采用短同源区域。
5.如段落#1-#3中任一项所述的方法,其中,通过连接组装所述TCR表达载体包括Gibson组装方法。
6.如段落#1-#5中任一项所述的方法,其中,第一核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
7.如段落#1-#5中任一项所述的方法,其中,第一核苷酸序列长度为20个核苷酸。
8.如段落#1-#7中任一项所述的方法,其中,第五核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
9.如段落#1-#7中任一项所述的方法,其中,第五核苷酸序列长度为20个核苷酸。
10.如段落#1-#9中任一项所述的方法,其中,第九核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
11.如段落#1-#9中任一项所述的方法,其中,第九核苷酸序列长度为18个核苷酸。
12.如段落#1-#11中任一项所述的方法,其中,第十二核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
13.如段落#1-#11中任一项所述的方法,其中,第十二核苷酸序列长度为18个核苷酸。
14.如段落#1-#13中任一项所述的方法,其中,线性化载体包含pMIGII。
15.如段落#1-#14中任一项所述的方法,其中,编码2A的第三多核苷酸序列选自SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335。
16.如段落#1-#15中任一项所述的方法,其中,所述T细胞来自人类。
17.如段落#1-#15中任一项所述的方法,其中,所述T细胞来自小鼠。
段落#18.一种组装T细胞受体(TCR)表达载体的方法,所述T细胞受体表达载体包含来自单T细胞的Vα区和Vβ区,包括步骤:
a.获得线性化载体,其包含5’端、3’端和编码TCR Cβ的第一多核苷酸序列;
b.获得片段b多核苷酸序列;其中所述片段b多核苷酸序列包含编码TCR Cα的第二多核苷酸序列,其操作性地连接至编码2A的第三多核苷酸序列;
c.从单T细胞获得RNA;
d.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vα扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vα引物,其中所述第一正向Vα引物在5′端包含第一核苷酸序列,该第一核苷酸序列与位于线性化载体5′端的第二核苷酸序列互补;其中该第一核苷酸序列操作性地连接至Vα基因的多个第一前导序列;
和
2.第一反向Cα引物,其具有第三核苷酸序列,该第三核苷酸序列与位于片段b的5’端的第四核苷酸序列互补;
e.进行单步骤逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以扩增第一组TCR Vβ扩增子产物,包括步骤:
i.将RNA逆转录为cDNA;
ii.对该cDNA进行聚合酶链式反应,采用:
1.多个第一正向Vβ引物,其中所述第一正向Vβ引物在5′端包含第五核苷酸序列,该第五核苷酸序列与位于片段b的3’端的第六核苷酸序列互补;其中该第五核苷酸序列操作性地连接至Vβ基因的多个第二前导序列;和
2.第一反向Cβ引物,其具有第七核苷酸序列,该第七核苷酸序列与线性化载体3’端的第八核苷酸序列互补;
f.对第一组TCR Vα扩增子产物进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCR Vα扩增子产物,采用:
i.第二正向Vα引物,其包含第九核苷酸序列,该第九核苷酸序列包含第一正向Vα引物的第一核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cα引物,其具有第十核苷酸序列,该第十核苷酸序列与位于片段b的5’端的第十一核苷酸序列互补;
g.对第一组TCR Vβ扩增子进行巢式聚合酶链式反应以扩增第二组TCRβ扩增子产物,采用:
i.第二正向Vβ引物,其在其5′端具有第十二核苷酸序列,该第十二核苷酸序列包含第一正向Vβ引物的第十五核苷酸序列的部分;和
ii.第二反向Cβ引物,其具有第十三核苷酸序列,该第十三核苷酸序列与线性化载体的3’端的第十四核苷酸序列互补;
h.通过以5′至3′方向连接以下部分来组装TCR表达载体:
i.线性化载体的5’端;
ii.第二组TCR Vα扩增子产物;
iii.片段b多核苷酸序列;
iv.第二组TCR Vβ扩增子产物;和
v.线性化载体的3’端。
19.如段落#18所述的方法,其中,步骤(d)和(e)在单一反应中进行。
20.如段落#18或段落#19所述的方法,其中,步骤(f)和(g)在单一反应中进行。
21.如段落#18-#20中任一项所述的方法,其中,通过连接组装所述TCR表达载体包括无缝克隆方法,其采用短同源区域。
22.如段落#18-#20中任一项所述的方法,其中,通过连接组装所述TCR表达载体包括Gibson组装方法。
23.如段落#18-#22中任一项所述的方法,其中,第一核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
24.如段落#18-#22中任一项所述的方法,其中,第一核苷酸序列长度为20个核苷酸。
25.如段落#18-#24中任一项所述的方法,其中,第五核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
26.如段落#18-#24中任一项所述的方法,其中,第五核苷酸序列长度为20个核苷酸。
27.如段落#18-#26中任一项所述的方法,其中,第九核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
28.如段落#18-#26中任一项所述的方法,其中,第九核苷酸序列长度为18个核苷酸。
29.如段落#18-#28中任一项所述的方法,其中,第十二核苷酸序列长度为15-25个核苷酸。
30.如段落#18-#28中任一项所述的方法,其中,第十二核苷酸序列长度为18个核苷酸。
31.如段落#18-#30中任一项所述的方法,其中,线性化载体包含pMIGII。
32.如段落#18-#31中任一项所述的方法,其中,编码2A的第三多核苷酸序列选自SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335。
33.如段落#18-#32中任一项所述的方法,其中,所述T细胞来自人类。
34.如段落#18-#32中任一项所述的方法,其中,所述T细胞来自小鼠。
实施例8–概述本文提供的其它实施方式的段落
本文还提供:
段落#35.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码含有信号转导结构域的功能性T细胞受体的核酸。
36.如段落#35所述的方法,其中,所述多个为大于50。
37.如段落#35所述的方法,其中,所述多个为大于500。
38.如段落#35所述的方法,其中,所述多个为大于5000。
39.如段落#35-38中任一项所述的方法,其中,所述多个核酸载体是多个核酸表达载体。
40.如段落#35-39中任一项所述的方法,其中,所述装置包含多孔板。
41.如段落#40所述的方法,其中,所述多孔板是96孔板、384孔板或1536孔板。
42.如段落#35-41中任一项所述的方法,其中,由获自单T细胞单一的RNA产生的所述cDNA包含由获自单一人T细胞的RNA产生的cDNA。
43.如段落#35-42中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列的核酸。
44.如段落#35-43中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Jα或Jγ区段的核酸。
45.如段落#35-44中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
46.如段落#35-45中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列、Jα或Jγ区段和Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
47.如段落#35-46中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
48.如段落#35-47中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Dβ或Dδ区段的核酸。
49.如段落#35-48中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Jβ或Jδ区段的核酸。
50.如段落#35-49中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分的核酸。
51.如段落#35-50中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分、Dβ或Dδ区段、Jβ或Jδ区段和Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
52.如段落#35-51中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
53.如段落#35-52中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
54.如段落#35-53中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含第一衔接体序列,所述第一衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,并且其中,所述第二扩增产物包含第二衔接体序列,所述第二衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,其中,所述第一和第二衔接体序列不同。
55.如段落#35-54中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的Vα/Vβ组合或Vγ/Vδ组合。
56.如段落#35-55中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)全长α可变区和全长β可变区或(b)全长γ可变区和全长δ可变区。
57.如段落#35-56中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长α可变区和全长β可变区,或(b)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长γ可变区和全长δ可变区。
58.如段落#35-57中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)全长α恒定区和全长β恒定区或(b)全长γ恒定区和全长δ恒定区。
59.如段落#35-58中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体包含编码自切割肽或内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。
60.如段落#35-59中任一项所述的方法,其中,所述方法包括将单T细胞分选进入所述分开的位置。
61.如段落#35-60中任一项所述的方法,其中,所述方法包括进行逆转录反应来获得所述cDNA。
62.如段落#35-61中任一项所述的方法,其中,所述组装步骤包括无缝克隆。
63.如段落#35-62中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行核酸测序的情况下获得。
64.如段落#35-63中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行限制性内切核酸酶切割反应的情况下获得。
65.如段落#35-64中任一项所述的方法,其中,所述异源信号转导结构域是CD3-ζ信号转导结构域、CD28信号转导结构域、OX-40信号转导结构域、4-1BB信号转导结构域、CD30信号转导结构域、CD27信号转导结构域或GITR信号转导结构域。
66.如段落#35-65中任一项所述的方法,其中,所述异源信号转导结构域附连至所述功能性T细胞受体的恒定区。
段落#67.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码可溶性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码可溶性T细胞受体的核酸。
68.如段落#67所述的方法,其中,所述多个为大于50。
69.如段落#67所述的方法,其中,所述多个为大于500。
70.如段落#67所述的方法,其中,所述多个为大于5000。
71.如段落#67-70中任一项所述的方法,其中,所述多个核酸载体是多个核酸表达载体。
72.如段落#67-71中任一项所述的方法,其中,所述装置包含多孔板。
73.如段落#72所述的方法,其中,所述多孔板是96孔板、384孔板或1536孔板。
74.如段落#67-73中任一项所述的方法,其中,由获自单T细胞单一的RNA产生的所述cDNA包含由获自单一人T细胞的RNA产生的cDNA。
75.如段落#67-74中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列的核酸。
76.如段落#67-75中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Jα或Jγ区段的核酸。
77.如段落#67-76中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
78.如段落#67-77中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列、Jα或Jγ区段和Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
79.如段落#67-78中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
80.如段落#67-79中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Dβ或Dδ区段的核酸。
81.如段落#67-80中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Jβ或Jδ区段的核酸。
82.如段落#67-81中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分的核酸。
83.如段落#67-82中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分、Dβ或Dδ区段、Jβ或Jδ区段和Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
84.如段落#67-83中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
85.如段落#67-84中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
86.如段落#67-85中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含第一衔接体序列,所述第一衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,并且其中,所述第二扩增产物包含第二衔接体序列,所述第二衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,其中,所述第一和第二衔接体序列不同。
87.如段落#67-86中任一项所述的方法,其中,所述组装的核酸载体中各自的所述可溶性T细胞受体包含所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的Vα/Vβ组合或Vγ/Vδ组合。
88.如段落#67-87中任一项所述的方法,其中,所述组装的核酸载体中各自的所述可溶性T细胞受体包含(a)全长α可变区和全长β可变区或(b)全长γ可变区和全长δ可变区。
89.如段落#67-88中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述可溶性T细胞受体包含(a)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长α可变区和全长β可变区,或(b)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长γ可变区和全长δ可变区。
90.如段落#67-89中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述可溶性T细胞受体包含(a)全长α恒定区和全长β恒定区或(b)全长γ恒定区和全长δ恒定区。
91.如段落#67-90中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体包含编码自切割肽或内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。
92.如段落#67-91中任一项所述的方法,其中,所述方法包括将单T细胞分选进入所述分开的位置。
93.如段落#67-92中任一项所述的方法,其中,所述方法包括进行逆转录反应来获得所述cDNA。
94.如段落#67-93中任一项所述的方法,其中,所述组装步骤包括无缝克隆。
95.如段落#67-94中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行核酸测序的情况下获得。
96.如段落#67-95中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行限制性内切核酸酶切割反应的情况下获得。
97.如段落#67-96中任一项所述的方法,其中,所述异源可溶性T细胞受体缺乏其α链(或γ)链的跨膜结构域和/或胞内结构域。
98.如段落#67-97中任一项所述的方法,其中,所述异源可溶性T细胞受体缺乏其β链(或δ)链的跨膜结构域和/或胞内结构域。
99.如段落#67-98中任一项所述的方法,其中,所述异源可溶性T细胞受体缺乏其α链和β链两者(或其γ链和δ链两者)的跨膜结构域和/或胞内结构域。
100.如段落#67-99中任一项所述的方法,其中,所述异源可溶性T细胞受体缺乏其α链和β链两者(或其γ链和δ链两者)的胞内结构域和跨膜结构域。
段落#101.一种组合物,其包含如表1-12中任一所示的一种或多种引物。
102.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表1中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
103.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表2中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
104.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表3中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
105.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表4中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
106.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表5中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
107.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表6中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
108.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表7中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
109.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表8中所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
110.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表9中所示的一种或两种引物。
111.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表10中所示的一种或两种引物。
112.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表11中所示的引物之一。
113.如段落#101所述的组合物,其中,所述组合物包含表12中所示的引物之一。
段落#114.一种组合物,其包含SEQ ID NO:283-294所示的一种或多种引物。
段落#115.一种组合物,其包含SEQ ID NO:283-288所示的一种或多种引物,和表1所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
段落#116.一种组合物,其包含SEQ ID NO:289-294所示的一种或多种引物,和表2所示的一种或多种引物(例如,至少1、5、10、15或20种引物)。
段落#117.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)将T细胞分选进入装置(例如,多孔板如384孔板)的多个分开的位置,以获得各所述多个分开的位置一个分选的T细胞,
(b)裂解所述多个分开的位置的各个所述分选的T细胞,以释放RNA,
(c)由所述释放的RNA产生cDNA,
(d)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(e)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸。
段落#118.一种从多个核酸载体表达克隆的T细胞受体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,由此获得不同的组装的核酸载体的集合,其中所述多个分开的位置的所述cDNA的各个组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,和
(d)将所述不同的组装的核酸载体的集合引入细胞,其中,所述细胞从引入的载体表达功能性T细胞受体。
119.如段落#118所述的方法,其中,所述方法包括筛选所述细胞的T细胞受体活性。
120.如段落#118或段落#119所述的方法,其中,所述方法包括在所述引入步骤之后分选所述细胞。
段落#121.一种从多个核酸载体表达克隆的T细胞受体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)将T细胞分选进入装置(例如,多孔板如384孔板)的多个分开的位置,以获得各所述多个分开的位置一个分选的T细胞,
(b)裂解所述多个分开的位置的各个所述分选的T细胞,以释放RNA,
(c)由所述释放的RNA产生cDNA,
(d)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,
(e)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,由此获得不同的组装的核酸载体的集合,其中所述多个分开的位置的所述cDNA的各个组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,和
(f)将所述不同的组装的核酸载体的集合引入细胞,其中,所述细胞从引入的载体表达功能性T细胞受体。
122.如段落#121所述的方法,其中,所述方法包括筛选所述细胞的T细胞受体活性。
123.如段落#121或段落#122所述的方法,其中,所述方法包括在所述引入步骤之后分选所述细胞。
其它实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述,但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围,该范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优势和修改在所附权利要求的范围内。
Claims (39)
1.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述多个为大于50。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述多个为大于500。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述多个为大于5000。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,所述多个核酸载体是多个核酸表达载体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述装置包含多孔板。
7.如权利要求6所述的方法,其中,所述多孔板是96孔板、384孔板或1536孔板。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,由获自单T细胞单一的RNA产生的所述cDNA包含由获自单一人T细胞的RNA产生的cDNA。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列的核酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Jα或Jγ区段的核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的L序列、Jα或Jγ区段和Cα或Cγ区的5’部分的核酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Dβ或Dδ区段的核酸。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Jβ或Jδ区段的核酸。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分的核酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含编码Cβ或Cδ区的5’部分、Dβ或Dδ区段、Jβ或Jδ区段和Vβ或Vδ区段的L序列的核酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中,所述第二扩增产物包含衔接体序列,该衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中,所述第一扩增产物包含第一衔接体序列,所述第一衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,并且其中,所述第二扩增产物包含第二衔接体序列,所述第二衔接体序列通过所述巢式扩增程序的第二轮扩增添加至所述cDNA的扩增的模板序列,其中,所述第一和第二衔接体序列不同。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的Vα/Vβ组合或Vγ/Vδ组合。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)全长α可变区和全长β可变区或(b)全长γ可变区和全长δ可变区。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长α可变区和全长β可变区,或(b)所述RNA来源的所述单T细胞中存在形式的全长γ可变区和全长δ可变区。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体的所述功能性T细胞受体包含(a)全长α恒定区和全长β恒定区或(b)全长γ恒定区和全长δ恒定区。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体包含编码自切割肽或内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法,其中,所述方法包括将单T细胞分选进入所述分开的位置。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法,其中,所述方法包括进行逆转录反应以获得所述cDNA。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中,所述组装步骤包括无缝克隆。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行核酸测序的情况下获得。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法,其中,各个所述组装的核酸载体在无需进行限制性内切核酸酶切割反应的情况下获得。
31.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码含有信号转导结构域的功能性T细胞受体的核酸。
32.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码可溶性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码可溶性T细胞受体的核酸。
33.一种组合物,其包含如表1-12中任一所示的一种或多种引物。
34.一种组合物,其包含SEQ ID NO:283-294所示的一种或多种引物。
35.一种组合物,其包含SEQ ID NO:283-288所示的一种或多种引物,和表1所示的一种或多种引物。
36.一种组合物,其包含SEQ ID NO:289-294所示的一种或多种引物,和表2所示的一种或多种引物。
37.一种获得多个核酸载体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)将T细胞分选进入装置的多个分开的位置,以获得每个各所述多个分开的位置一个分选的T细胞,
(b)裂解所述多个分开的位置的各个所述分选的T细胞,以释放RNA,
(c)由所述释放的RNA产生cDNA,
(d)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,和
(e)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,其中,各所述多个分开的位置的cDNA的所述组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸。
38.一种从多个核酸载体表达克隆的T细胞受体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)获得包含多个分开的位置的装置,其中各个所述分开的位置包含由获自单T细胞的RNA产生的cDNA,所述单T细胞经分选进入所述分开的位置,
(b)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,
(c)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,由此获得不同的组装的核酸载体的集合,其中所述多个分开的位置的所述cDNA的各个组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,和
(d)将所述不同的组装的核酸载体的集合引入细胞,其中,所述细胞从引入的载体表达功能性T细胞受体。
39.一种从多个核酸载体表达克隆的T细胞受体的方法,所述核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,其中,所述方法包括:
(a)将T细胞分选进入装置的多个分开的位置,以获得每个各所述多个分开的位置一个分选的T细胞,
(b)裂解所述多个分开的位置的各个所述分选的T细胞,以释放RNA,
(c)由所述释放的RNA产生cDNA,
(d)进行巢式扩增程序,采用各所述多个分开的位置的cDNA为模板,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的第一扩增产物和第二扩增产物,其中,所述第一扩增产物包含编码Vα或Vγ区段的核酸,并且其中,所述第二扩增产物包含编码Vβ或Vδ区段的核酸,
(e)将各所述多个分开的位置的cDNA的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物组装进入核酸载体,以获得各所述多个分开的位置的cDNA的组装的核酸载体,由此获得不同的组装的核酸载体的集合,其中所述多个分开的位置的所述cDNA的各个组装的核酸载体包含编码功能性T细胞受体的核酸,和
(f)将所述不同的组装的核酸载体的集合引入细胞,其中,所述细胞从引入的载体表达功能性T细胞受体。
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