JP2023058626A - 単一ｔ細胞から機能的ｔ細胞受容体をクローニングする方法及び材料 - Google Patents

単一ｔ細胞から機能的ｔ細胞受容体をクローニングする方法及び材料 Download PDF

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Abstract

【課題】単一Ｔ細胞から機能的ＴＣＲをクローニングする方法及び材料を提供する。【解決手段】単一Ｔ細胞からＴＣＲをコードする核酸を得、その核酸を配置して、ＴＣＲを発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成する方法及び材料、単一Ｔ細胞からＴＣＲをコードする核酸を得、その核酸を配置して、ＴＣＲを発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成するためのキット、そのようなキットを作製する方法、特定の哺乳動物種の機能的αβ、又はγδＴＣＲのそれぞれの発現されたＶセグメントについての両方の可変領域の全コード配列を増幅するように設計された核酸プライマーのコレクション、核酸プライマーのそのようなコレクションを使用して、単一Ｔ細胞から機能的ＴＣＲをクローニングする方法、並びに単一Ｔ細胞から機能的ＴＣＲをクローニングするための核酸プライマーのそのようなコレクションを含有するキットが提供される。【選択図】図１

Description

連邦政府資金援助による研究開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認められた助成金AR044077の下、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、2016年11月29日に出願された米国出願第62/427,335号の優先権を主張する。先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、その全体が本出願に組み込まれる。
背景
1.技術分野
本文書は、単一T細胞から機能的T細胞受容体(TCR)をクローニングすることに関与する方法及び材料に関する。例えば、本文書は、増幅工程、クローニング工程、及び試薬の有効かつ合理化された組合せを使用して単一T細胞からTCRをコードする核酸を得、その核酸を配置して、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せ(例えば、α/β可変鎖の組合せ又はγ/δ可変鎖の組合せ)を有するTCR(例えば、完全にインタクトなTCR)を発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成することに関与する方法並びに材料に関する。
2.背景
TCRは、T細胞の表面上に見られ、2つの異なるポリペプチド鎖を含む。ヒトでは、T細胞の約95パーセントが、アルファ(α)鎖及びベータ(β)鎖を含むTCRを有し、T細胞の約5パーセントが、ガンマ(γ)鎖及びデルタ(δ)鎖を含むTCRを有する。そのようなT細胞は、それぞれ、αβ又はγδT細胞と呼ぶことができる。
それぞれの鎖(例えば、α、β、γ、及びδ鎖)は、可変(V)領域及び定常(C)領域を含む。α鎖のV領域は、α遺伝子のVとJセグメントの組換えから形成される。同様に、γ鎖のV領域は、γ遺伝子のVとJセグメントの組換えから形成される。しかしながら、β鎖のV領域は、β遺伝子のV、D、及びJセグメントの組換えから形成され、δ鎖のV領域は、δ遺伝子のV、D、及びJセグメントの組換えから形成される。したがって、哺乳動物の(例えば、ヒトの)T細胞レパートリーにおいて観察されるとてつもない可変性に関与するいくつかの要因が存在する。例えば、1つの特定のαβTCRの特異性は、とりわけ、(a)α鎖のVJセグメントの特定の組合せ、(b)β鎖のVDJセグメントの特定の組合せ、及び(c)一緒になってその特定のαβTCRを形成するそれらの2つの鎖(そのα鎖及びそのβ鎖)の特定の対形成により決定される。加えて、VJエクソン及びVDJエクソンのコード配列への連結は、特に不正確なプロセスであり、ヌクレオチドは、遺伝子セグメントの端から失われ、追加の塩基が付加される(Matsuzakiら、Eur. J. Immunol.、23(12):3345～9ページ(1993);Cabaniolsら、J. Exp. Med.、194(9):1385～1390ページ(1991))。
本文書は、単一T細胞から機能的TCRをクローニングすることに関与する方法及び材料を提供する。例えば、本文書は、単一T細胞からTCRをコードする核酸を得、その核酸を配置して、TCR(例えば、完全にインタクトなTCR、例えば、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有する完全にインタクトなTCR)を発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成する方法及び材料、単一T細胞からTCRをコードする核酸を得、その核酸を配置して、TCR(例えば、完全にインタクトなTCR、例えば、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有する完全にインタクトなTCR)を発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成するためのキット、並びにそのようなキットを作製する方法を提供する。そのTCRをクローニングするために使用される、単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有するクローニングされたαβTCRは、その単一T細胞に存在するVJαセグメントの組合せ、その単一T細胞に存在するVDJβセグメントの組合せ、その単一T細胞に存在する全α可変領域のヌクレオチド配列、及びその単一T細胞に存在する全β可変領域のヌクレオチド配列を含み得る。同様に、そのTCRをクローニングするために使用される、単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有するクローニングされたγδTCRは、その単一T細胞に存在するVJγセグメントの組合せ、その単一T細胞に存在するVDJδセグメントの組合せ、その単一T細胞に存在する全γ可変領域のヌクレオチド配列、及びその単一T細胞に存在する全δ可変領域のヌクレオチド配列を含み得る。
本文書はまた、特定の哺乳動物種(例えば、マウス若しくはヒト)の機能的αβ又はγδTCRについてのそれぞれの発現したVセグメント(例えば、それぞれの発現したαVセグメント及びβVセグメント、又はそれぞれの発現したγVセグメント及びδVセグメント)についての両方の可変領域(例えば、α可変領域及びβ可変領域、又はγ可変領域及びδ可変領域)の全コード配列を増幅するように設計された核酸プライマーのコレクション、核酸プライマーのそのようなコレクションを使用して、単一T細胞から機能的TCRをクローニングする方法、並びに単一T細胞から機能的TCRをクローニングするための核酸プライマーのそのようなコレクションを含有するキットを提供する。
一般に、本明細書において提供される方法及び材料は、人が、単一T細胞から直接、迅速(例えば、ある場合には同時に)かつたとえあっても、α/β可変鎖の組合せ(又はγ/δ可変鎖の組合せ)をほとんど見逃さない様式で、多くの異なるTCR(例えば、何百～何千個以上の異なるTCR)をクローニングするための高多重化反応を行うことを可能にすることができる。例えば、本明細書において提供される方法及び材料を実施して、単一αβT細胞から直接、種(例えば、マウス又はヒト種)のα/β可変鎖の組合せについて可能性のある、α可変鎖の10パーセント未満(例えば、9パーセント未満、8パーセント未満、7パーセント未満、6パーセント未満、5パーセント未満、4パーセント未満、3パーセント未満、2パーセント未満、又は1パーセント未満)及びβ可変鎖の10パーセント未満(例えば、9パーセント未満、8パーセント未満、7パーセント未満、6パーセント未満、5パーセント未満、4パーセント未満、3パーセント未満、2パーセント未満、又は1パーセント未満)を見逃す様式で、多くの異なるαβTCR(例えば、何百～何千個以上の異なるαβTCR)をクローニングすることができる。同様に、本明細書において提供される方法及び材料を実施して、単一γδT細胞から直接、種(例えば、マウス若しくはヒト種)のγ/δ可変鎖の組合せについて可能性のある、γ可変鎖の10パーセント未満(例えば、9パーセント未満、8パーセント未満、7パーセント未満、6パーセント未満、5パーセント未満、4パーセント未満、3パーセント未満、2パーセント未満、又は1パーセント未満)及びδ可変鎖の10パーセント未満(例えば、9パーセント未満、8パーセント未満、7パーセント未満、6パーセント未満、5パーセント未満、4パーセント未満、3パーセント未満、2パーセント未満、又は1パーセント未満)を見逃す様式で、多くの異なるγδTCR(例えば、何百～何千個以上の異なるγδTCR)をクローニングすることができる。ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、(a)T細胞の試料を得ること、(b)それらのT細胞を隔離された場所(例えば、ウェル)に、全てではないが、大部分の隔離された場所(例えば、それぞれのウェル)が単一T細胞を含有するように選別すること、(c)別々の隔離された場所(例えば、別々のウェル)に位置する単一T細胞を溶解して(例えば、同時に溶解して)、それぞれの単一T細胞のRNAを放出させること、(d)放出されたRNAを鋳型として、RNAからのcDNA合成のための適当なプライマー、及びそれぞれの隔離された場所(例えば、それぞれのウェル)内でcDNAを産生させるための逆転写酵素(そのcDNAは、その隔離された場所(例えば、ウェル)に位置していた単一T細胞により発現されたRNAを表す)を使用して逆転写を行うこと(例えば、同時に行うこと)、(e)それぞれの隔離された場所について、産生されたcDNAを鋳型として、第1ラウンドのプライマーコレクション(例えば、第1ラウンドのPCRプライマーコレクション)、及びポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)を使用したネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)の第1ラウンドの増幅反応(例えば、第1ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応(PCR))を行って(例えば、同時に行って)、その隔離された場所の単一T細胞のTCRのα可変鎖(又はγ可変鎖)の核酸配列を含有する増幅産物、及びその同じ隔離された場所のその同じ単一T細胞のTCRのβ可変鎖(又はδ可変鎖)の核酸配列を含有する増幅産物を少なくとも産生させること、(f)それぞれの隔離された場所について、第1ラウンドの増幅反応の増幅産物を鋳型として、第2ラウンドのプライマーコレクション(例えば、第2ラウンドのPCRプライマーコレクション)、及びポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)を使用したネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)の第2ラウンドの増幅反応(例えば、第2ラウンドのPCR)を行って(例えば、同時に行って)、その隔離された場所の単一T細胞のTCRのα可変鎖(又はγ可変鎖)の核酸配列を含有する第1の増幅産物、及びその同じ隔離された場所のその同じ単一T細胞のTCRのβ可変鎖(又はδ可変鎖)の核酸配列を含有する第2の増幅産物を少なくとも産生させること、並びに(g)それぞれの隔離された場所について、第1及び第2の増幅産物を、増幅産物を生成するために使用された単一T細胞に存在していたα/β又はγ/δ可変鎖の組合せ(又はその部分、例えば、α/β若しくはγ/δ可変鎖の組合せのVセグメント)を有する機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターにクローニングすることを含み得る。
生じた発現ベクターは、それらの細胞がクローニングされたTCRを発現するように、細胞に導入することができる。そのような細胞及び/又はそれらが導入された発現ベクターから発現するTCRをスクリーニングして、所望の能力を有するTCRを同定することができる。例えば、特定の抗原(例えば、腫瘍ポリペプチドに由来するペプチド)を認識するクローニングされたTCRを発現する細胞を同定することができ、それらの細胞、それらが含有するTCR発現ベクター、又はクローニングされたTCR構築物を、さらなる解析のため、又は治療適用のため使用することができる。
ある場合には、クローニングされたTCRの表面上での発現及び機能的TCRの発現は、機能的TCRのシグナル伝達装置が係合すると、測定可能なマーカーシグナル又はマーカーポリペプチドを発現するように設計されたTCR陰性レポーター細胞に本明細書において提供される発現ベクターを導入することにより、評価することができる。これらの場合には、TCRを非特異的に活性化するように設計された抗体(例えば、抗CD3抗体)を使用して、機能的TCRをスクリーニングすることができる。ある場合には、本明細書において提供されるクローニングされたTCRを、抗原特異性についてスクリーニングすることができる。例えば、クローニングされたTCRを発現するレポーター細胞を、特定の抗原(例えば、腫瘍ポリペプチドに由来するペプチド)の認識についてスクリーニングすることができる。ある場合には、初代T細胞(例えば、ヒト初代T細胞)は、本明細書において提供される発現ベクターをトランスフェクトし、T細胞増殖アッセイを介して抗原特異性についてスクリーニングすることができる。
本明細書において提供される方法及び材料は、臨床医、医療従事者、実験室の人々、及び研究者が、異なるTCRを有するT細胞のコレクションを使用して、コレクションを生成するために使用される元々のT細胞に存在する同じ可変鎖の組合せ又はその部分(例えば、同じα/β可変鎖の組合せ又は同じγ/δ可変鎖の組合せ)を有するそれらの異なるTCRの機能的バージョンを発現する発現ベクターのコレクションを生成することを可能にすることができる。発現ベクターのそのようなコレクションは、迅速、効率的、安価、かつ有効に得ることができる。例えば、ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料を使用して、哺乳動物(例えば、ヒト)から得られるT細胞において見られる本物の可変鎖の組合せを有する多くの異なるTCRの機能的バージョンを発現する発現ベクターのコレクションを、(単一T細胞を384ウェルプレートの384個のウェルのそれぞれに選別することに基づき)12日未満(例えば、4～11日、5～11日、6～11日、7～11日、8～11日、4～10日、5～10日、6～10日、7～10日、8～10日、4～9日、5～9日、6～9日、7～9日、4～8日、5～8日、6～8日、又は7～8日)以内に、12工程未満(例えば、5～11工程、6～11工程、7～11工程、8～11工程、5～10工程、6～10工程、7～10工程、8～10工程、5～9工程、6～9工程、7～9工程、又は8～9工程)を使用し、1つのTCR当たり約10ドル未満、及び約80パーセントより高い(例えば、約85、90、又は95パーセントより高い)有効性で生成することができる。ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、核酸配列決定を実施することなく、制限酵素切断工程を実施することなく、本明細書に記載される他の工程若しくは技術を実施するとなく、及び/又は本明細書に記載される特定の試薬若しくは材料を使用することなく、実施することができる。
本明細書において提供される方法及び材料はまた、使用者が、選別されたT細胞集団から、全てではないが、大部分の機能的TCRを首尾よく捕捉することを可能にすることができる。例えば、ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、哺乳動物(例えば、ヒト)の特定のTCRの2つの可変鎖の全ての公知の機能的Vセグメント(例えば、特定のαβ TCRのα可変及びβ可変鎖の公知の機能的Vセグメントのいずれか、又は特定のγδTCRのγ可変及びδ可変鎖の公知の機能的Vセグメントのいずれか)を増幅するように設計されたプライマーコレクションを含むネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)を含み得る。選別されたT細胞集団から、全てではないが、大部分の機能的TCRをクローニングする能力を有することは、使用者が、そうでなければ見逃されることがある、稀なTCRを含む特定のTCRを同定することを可能にすることができる。有効な治療、例えば、有効なT細胞の送達を含む癌治療のための新たなクローニングされたTCRの豊富な供給源をもたらし得るのは、見逃されることがあるこれらの稀なTCRである。
ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、使用者が、機能的TCRクローンが生成される単一T細胞についてのさらなる情報を得ることを可能にすることができる。ある場合には、本明細書に記載される単一細胞選別のため使用されるフローサイトメトリー技術を使用して、活性化され、経験した細胞をナイーブT細胞から、それらの細胞を活性化マーカーについて染色することにより、区別することができる。特定の疾患(例えば、癌)を処置する方法において本明細書において提供される方法及び材料を適用するとき、患者から、その患者の内部で既に活性化され、拡大されたT細胞を単離することができる。これらのT細胞が単離され、cDNAが単一細胞RNAから生成されると、さらなるレベルのセレクションが適用され得る。例えば、単一T細胞のRNAから産生されたcDNAを使用して、そのT細胞のTCRの可変鎖(又はその部分)を増幅し、クローニングすることに加え、そのcDNAを使用して、そのT細胞内のRNA発現及び/又はRNA発現レベルを評価することもできる。
CD8+T細胞の場合、多機能の(例えば、複数種のサイトカイン産生株)エフェクター細胞と関連するTCR又は静止状態若しくは疲弊した長期生存メモリー細胞と関連するTCRを、転写因子、例えば、エオメソデルミン及びT-betの発現について相対的mRNAレベルを調べることにより同定することができる(McLaneら、J. Immunol.、190(7):3207～3215ページ (2013);及びBuggertら、PLoS Pathog.、10(7):e1004251 (2014))。
ある場合には、T細胞は、選別に先立ち刺激する(例えば、インビトロで刺激する)ことができ、次に、RNA発現を評価して(例えば、qPCRを介して)、どのT細胞が刺激に応答したかを決定することができる。非特異的刺激、例えば、コンカナバリンA、植物性血球凝集素P、ホルボールエステル＋イオノマイシン、ホルボールミリステートアセテート＋カルシウムイオノフォア、若しくはTCRと架橋結合する能力を有する抗体(例えば、抗CD3抗体＋抗CD28抗体、又は抗TCRβ抗体)での刺激、又は抗原特異的刺激、例えば、他で記載される1つ以上の特定の抗原での刺激を含むがこれらに限定されない任意の適当なタイプの刺激を使用することができる(Downwardら、Nature、346:719～23ページ(1990);及びDasguptaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:1094～8ページ(1987))。ある場合には、サイトカイン発現レベル、例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、又はIL-17発現レベルが、決定され、刺激されていない集団と比較され得る。単一T細胞が選別されると、本明細書において提供される方法を使用して、どのT細胞が、刺激に応答して(例えば、T細胞を刺激するために使用されたペプチド抗原に応答して)、特定のサイトカインを作っていたかを決定することができる。これらの場合には、抗原特異的T細胞は、TCRを有効にクローニングする能力を低減し得る、反応性T細胞を拡大する困難な方法又はパラホルムアルデヒド固定及び細胞内サイトカイン染色の破壊的な方法なしで決定することができる。そのような場合には、不活性な傍観者と反対に、活性かつ抗原特異的なT細胞から生成された特定のTCRを、迅速に同定することができる。
ある場合には、サイトカイン発現レベル、例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、又はIL-17発現レベルは、機能的TCRをクローニングするために使用される単一T細胞について決定することができ、それにより、特定のTCRが、その特定のTCRの可変鎖(又はその部分)をもたらしたT細胞の特定の表現型(例えば、上昇したIFN-γ発現)に基づき同定されることを可能にする。そのような場合には、不活性なT細胞と反対に、活性なT細胞から生成された特定のTCRを、迅速に同定することができる。ある場合には、活性なT細胞と反対に、不活性なT細胞から生成された特定のTCRを、迅速に同定することができる。
ある場合には、T細胞によるサイトカイン産生の不在は、必ずしもTCR特異性の不在を反映しない。TCRから始まった細胞へのシグナルは、多数の抑制性共受容体により失われ、及び/又は抑制され得る(Sheppardら、FEBS Lett.、574(1-3):37～41ページ(2004);及びYokosukaら、J. Exp. Med.、209(6):1201～1217ページ(2012))。ある場合には、TCRは、刺激へのT細胞抵抗性を使用して得ることができ、クローニングされたTCRの特異性は、基準のTCRシグナル伝達が抑制されていない細胞において、試験するか、又はスクリーニングすることができる。
ある場合には、MHC-ペプチド複合体(又はHLA-ペプチド複合体)を使用して、そのような複合体を認識するクローニングされたTCRを同定することができる。これらの場合には、免疫応答中のクローン排除及び/又は抗原プライミングの欠如が、活性化された及び/又は拡大されたTCRプールに存在しないこの特異性を有するTCRをもたらし得ることが可能である。そのような場合には、ある場合には単一T細胞が存在することをただ必要とする、本明細書において提供される方法及び材料を使用して、そのような複合体を認識するナイーブ又は不活性化TCRをクローニングすることができる。ある場合には、ナイーブT細胞のプールを、MHC-ペプチドテトラマー(又はHLA-ペプチドテトラマー)で染色することができ、ナイーブT細胞中の任意のMHC-ペプチド(又はHLA-ペプチド)応答性TCRを使用して、本明細書において提供される方法及び材料を使用してそれらのTCRをクローニングすることができる。
一般に、本文書の1つの態様は、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法を特徴とする。方法は、(a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、、別々の場所のそれぞれが、別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、(b)複数の別々の場所のそれぞれのcDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行い、複数の別々の場所のそれぞれのcDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに(c)複数の別々の場所のそれぞれのcDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、複数の別々の場所のそれぞれのcDNAについてのアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、複数の別々の場所のそれぞれのcDNAについてのアセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む工程を含むか、又は本質的にそれらからなる。複数は、50より多いものであり得る。複数は、500より多いものであり得る。複数は、5000より多いものであり得る。複数の核酸ベクターは、複数の核酸発現ベクターであり得る。デバイスは、マルチウェルプレートを含み得る。マルチウェルプレートは、96ウェルプレート、384ウェルプレート、又は1536ウェルプレートであり得る。単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAは、単一ヒトT細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含み得る。第1の増幅産物は、Vα又はVγセグメントのL配列をコードする核酸を含み得る。第1の増幅産物は、Jα又はJγセグメントをコードする核酸を含み得る。第1の増幅産物は、Cα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含み得る。第1の増幅産物は、Vα又はVγセグメントのL配列、Jα又はJγセグメント、及びCα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含み得る。第2の増幅産物は、Vβ又はVδセグメントのL配列をコードする核酸を含み得る。第2の増幅産物は、Dβ又はDδセグメントをコードする核酸を含み得る。第2の増幅産物は、Jβ又はJδセグメントをコードする核酸を含み得る。第2の増幅産物は、Cβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含み得る。第2の増幅産物は、Vβ又はVδセグメントのL配列、Dβ又はDδセグメント、Jβ又はJδセグメント、及びCβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含み得る。第1の増幅産物は、ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介してcDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含み得る。第2の増幅産物は、ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介してcDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含み得る。第1の増幅産物は、ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介してcDNAの増幅された鋳型配列に付加された第1のアダプター配列を含み得、第2の増幅産物は、ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介してcDNAの増幅された鋳型配列に付加された第2のアダプター配列を含み得、第1及び第2のアダプター配列が異なる。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの機能的T細胞受容体が、RNAの起源である単一T細胞に存在するVα/Vβの組合せ又はVγ/Vδの組合せを含み得る。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの機能的T細胞受容体が、(a)全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含み得る。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの機能的T細胞受容体が、(a)RNAの起源である単一T細胞に存在する全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)RNAの起源である単一T細胞に存在する全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含み得る。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの機能的T細胞受容体が、(a)全長α定常領域及び全長β定常領域又は(b)全長γ定常領域及び全長δ定常領域を含み得る。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、自己切断ペプチドをコードする核酸配列又は配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み得る。方法は、単一T細胞を別々の場所に選別する工程を含み得る。方法は、逆転写反応を行って、cDNAを得る工程を含み得る。アセンブルする工程が、シームレスクローニングを含み得る。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれは、核酸配列決定を行うことなく得ることができる。アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれは、制限酵素切断反応を行うことなく得ることができる。
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、本発明を実施するために使用することができるが、適当な方法及び材料が以下に記載される。本明細書において述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め本明細書が支配する。加えて、材料、方法、及び実施例は、ただ説明であり、制限することを意図されない。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細が、添付の図面及び以下の説明において記載される。本発明の他の特徴、対象及び利点は、説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
一実施形態による、単一T細胞から発現ベクターまで進むTCRクローニング方法の模式的な総合的概観図である。 一実施形態による、5'に付加されたアダプター配列(AS)、続いて、Vαセグメントのリーダー(L)配列、Vαセグメント、Jαセグメント、及びCαの5'末端の部分を含有する増幅産物を産生するためのフォワードVαプライマーの2つの別々のプールの使用を含むネステッドPCR法の模式図である。この実施形態において、第2ラウンドのPCRのためのフォワードVαプライマーのプール由来のプライマーが、アダプター配列を付加し、それを使用して、産生された増幅産物を発現ベクターにクローニングすることができる。 一実施形態による、5'に付加されたアダプター配列(AS)、続いて、Vβセグメントのリーダー(L)配列、Vβセグメント、Dβセグメント、Jβセグメント、及びCβの5'末端の部分を含有する増幅産物を産生するためのフォワードVβプライマーの2つの別々のプールの使用を含むネステッドPCR法の模式図である。この実施形態において、第2ラウンドのPCRのためのフォワードVβプライマーのプール由来のプライマーが、アダプター配列を付加し、それを使用して、産生された増幅産物を発現ベクターにクローニングすることができる。 一実施形態による、5'に付加されたアダプター配列(AS)、続いて、Vαセグメントのリーダー(L)配列、Vαセグメント、Jαセグメント、及びCαの5'末端の部分を含有する増幅産物を産生するための、フォワードVαプライマーの1つのプール及びアダプター配列に対するプライマーの使用を含むネステッドPCR法の模式図である。この実施形態において、第1ラウンドのPCRにおいて使用されるフォワードVαプライマーのプール由来のプライマーが、アダプター配列を付加し、それを、第2ラウンドのためのプライマー標的配列として、また産生された増幅産物を発現ベクターにクローニングするための両方に使用することができる。 一実施形態による、5'に付加されたアダプター配列(AS)、続いて、Vβセグメントのリーダー(L)配列、Vβセグメント、Dβセグメント、Jβセグメント、及びCβの5'末端の部分を含有する増幅産物を産生するための、フォワードVβプライマーの1つのプール及びアダプター配列に対するプライマーの使用を含むネステッドPCR法の模式図である。この実施形態において、第1ラウンドのPCRにおいて使用されるフォワードVβプライマーのプール由来のプライマーが、アダプター配列を付加し、それを、第2ラウンドのためのプライマー標的配列として、また産生された増幅産物を発現ベクターにクローニングするための両方に使用することができる。 本明細書において提供される方法及び材料を使用して所望のTCRクローンを迅速に得るために、本明細書に記載される方法及び材料を使用して行われ得る2つの例示的なスクリーニング法のフローチャートである。ある場合には、これらのスクリーニング法は、核酸配列決定を行うことなく、制限酵素切断工程を行うことなく、又は核酸配列決定若しくは制限酵素切断工程のいずれも行うことなく、TCRクローニングに先立ちオリジナルのT細胞を単一選別したT細胞に選別する工程から、抗原スクリーニングから所望の抗原特異性を有する特定のTCRクローンを単離する工程までが行われ得る。 1つより多くのバリアントを増幅することができるプライマーの選択及び設計のため使用されるアライメントの例を示す図である。異なるバリアント間で相同性を有するプライマー配列が、ATG開始コドンの上流の領域において、又はATG開始コドンと重複する領域で選択された。このストラテジーにより、マルチプレックスPCR反応液に含まれる個々のプライマーの数が大幅に低減され、全てではないが、大部分のTCRバリアントを増幅するのを可能にする。この例は、マウスTRAV13バリアント群のバリアントの全13種についての配列、及びATG開始コドンの上流のそれらの相同性を描く。この特定の例では、全13種の群メンバーが、1つのフォワードプライマー(すなわち、mTRAV13_F、以下の配列5'-GGCTGGTTACTTGCTTCTGTCT-3'、配列番号99を有する)のみを使用して増幅された。ATG開始コドンの上流の20ヌクレオチドであるこの配列の位置が、破線の四角及び矢印で強調されている。配列ロゴ下に、1つより多くのヌクレオチドを有する位置についての1文字コードが提供される。IUPA-IUB表は、これらの混合された塩基についてのコードを含む。 ハイブリドーマT細胞株1B9を使用した単一細胞レベルまで落とした、RNA抽出、cDNA変換、及びTCR鎖の検出についての結果、並びにまた単一細胞を384ウェルPCRプレートに選別した結果を示す図である。図6Aは、SYBRグリーンリアルタイムPCRを使用した、連続細胞希釈液(10～0.08個の細胞/ウェル)からのGAPDHの増幅効率を提供する。 ハイブリドーマT細胞株1B9を使用した単一細胞レベルまで落とした、RNA抽出、cDNA変換、及びTCR鎖の検出についての結果、並びにまた単一細胞を384ウェルPCRプレートに選別した結果を示す図である。図6Bは、RNA抽出及びcDNA変換についての条件が、2倍連続希釈液(10～0.08個の細胞/ウェル)、フォワードプライマーmTRBV17(配列番号251)、及びリバースプライマーmTRBCn(配列番号273)を使用して、単一細胞レベルまで落とした1B9ハイブリドーマ細胞株において発現されたマウスTCRベータ鎖TRBV17を検出することができることを示す。 ハイブリドーマT細胞株1B9を使用した単一細胞レベルまで落とした、RNA抽出、cDNA変換、及びTCR鎖の検出についての結果、並びにまた単一細胞を384ウェルPCRプレートに選別した結果を示す図である。図6Cは、顕微鏡下で制御されたガラスピペット及びマイクロマニピュレーターの使用での単一細胞レベルにおける検出についてのさらなる確認を示す。単一細胞を384ウェルPCRプレートに播種し、24個のうち22個のウェルにおいてmTRBV17が検出された。 ハイブリドーマT細胞株1B9を使用した単一細胞レベルまで落とした、RNA抽出、cDNA変換、及びTCR鎖の検出についての結果、並びにまた単一細胞を384ウェルPCRプレートに選別した結果を示す図である。図6Dは、BD FACSariaソーターを使用して単一細胞を384ウェルPCRプレートに播種する条件の結果を示す。再び、24個のうち22個のウェルが、mTRBV17マウスTCRβ鎖の検出について陽性であると試験された。 対応するヒトTCRαバリアントを増幅するための表1に挙げられるヒトプライマーの増幅効率(上部パネル)、及び対応するTCRβバリアントを増幅するための表2に挙げられるヒトプライマーの増幅効率(下部パネル)を示す図である。ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用して、健常ドナーから単離された。RNAは、RNAeasy Qiagenキットを使用して単離され、逆転写用Superscript IVを使用してcDNAに変換された。表1に挙げられるhTRAVプライマーについて、hTRACf(配列番号265)が、リバースプライマーとして使用された。表2に挙げられるhTRBVプライマーについて、hTRBCf(配列番号268)が、リバースプライマーとして使用された。 対応するマウスTCRαバリアントを増幅するための表3に挙げられるマウスプライマーの増幅効率(上部パネル)、及び対応するマウスTCRβバリアントを増幅するための表2に挙げられるマウスプライマーの増幅効率(下部パネル)を示す図である。リンパ球は、若いC57/BL6マウスの胸腺から単離され、RNAは、RNAeasyキットを使用して単離された。RNAは、逆転写用Superscript IVを使用してcDNAに変換された。表3に挙げられるmTRAVプライマーについて、mTRAC(配列番号266)が、リバースプライマーとして使用された。表4に挙げられるmTRBVプライマーについて、mTRBC(配列番号269)が、リバースプライマーとして使用された。 全マウスT細胞受容体レパートリーのα及びβ鎖について、その後のクローニング並びに配列同定のための得られた増幅産物の増幅効率を示す図である。図9Aは、C57/BL6マウスの脾臓から単離された生(LIVE)/CD8陽性T細胞の単離に使用されたFACS染色及びゲーティングを示す。一番左のパネルが、第1の空のゲートであり、右に直ぐ続くパネルが、先のゲートにより定義された集団であるように、ゲートが順次配置された。一番右のパネルにおける定義されたCD8+CD4-事象は、FACSariaソーターを使用して2枚の384ウェルのPCRプレートに単一細胞として選別された。両方の384ウェルPCRプレートについて、単一細胞を含有していたそれぞれ個々のウェルにおいて、RNAを抽出し、cDNAに変換した。マウスmTRAV及びmTRBV配列についての第1ラウンドの増幅を、表3及び表4に挙げられる全てのプライマー＋リバースプライマーmTRAC(配列番号266)及びmTRBC(配列番号269)を組み合わせた1つの混合PCR反応において、行った。第1ラウンドの増幅後、2つの別々のネステッドPCR反応を行った。1つ目は、表7に挙げられた全てのプライマー＋リバースプライマーmTRACn(配列番号271)を使用したmTRAVの増幅のためであり、第2の増幅反応は、表8に挙げられた全てのプライマー＋リバースプライマーmTRBCn(配列番号273)を使用したmTRBVの増幅のためであった。2枚のプレートのそれぞれのウェルからの最初の24個のウェルが、エチジウムブロマイドゲル電気泳動により解析された(図9B)。両方のプレートについてのウェルA1～A8、B1～B8、及びC1～C8中のそれぞれ個々の単一細胞について、mTRAV増幅が上部に示され、mTRBV増幅が下部に示される。mTRAV及びmTRBV DNA増幅産物は、それらがポリクローナルなT細胞集団に由来するため異なるサイズを示し、全T細胞レパートリー由来のバリアントを表す。 図９Ａの続き。 単一T細胞についてのIL-2発現をプロットしたグラフである。CD4+ヒトT細胞は、BD iMagストレプトアビジンビーズ及びビオチン化ヒト抗CD4抗体を使用してPBMCからの陽性選択により単離された。細胞を、5日間培養し、抗CD3/抗CD28DYNAビーズで16時間活性化して、抗原提示細胞(APC)によるT細胞の活性化又は刺激していない対照細胞を模倣した。16時間のインキュベーション後、CD4+細胞は、384ウェルPCRプレート中の1個のウェル当たり1個の細胞として選別された。RNA抽出及びcDNA変換が完了された。cDNAの5分の1(2μL)が、ヒトIL-2の遺伝子発現解析のため使用され、リアルタイムPCRを使用した正規化のための参照遺伝子として使用された、RLP13Aの発現と比較された。単一細胞から生成されたcDNAの画分においてqPCRを行い、活性化細胞が、刺激されていない対照単一細胞と比較して2倍の増加から数百倍の増加の範囲のそれらのIL-2レベルに基づき同定された。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(A)H60-MHC1のテトラマーで染色した、1匹のH60ワクチン接種したマウス由来の脾細胞。プロットは、生細胞(Live)、CD8+細胞、TCR+細胞、及びCD4-細胞上でゲーティングした。単一のCD44hiテトラマー+細胞(プロット上に描かれたゲートにより定義される)を、384ウェルプレートの個々のウェルに選別し、α及びβTCR鎖を、ネステッドPCRを介して増幅した。増幅の第1ラウンドは、表3及び表4中の全プライマーをTCRα及びTCRβに指向したリバースプライマー(それぞれ、配列番号266及び配列番号269)と組合せて使用して実行された。第2ラウンドについては、第1ラウンドのPCR産物の一部を使用して、一方の反応において表7に含まれる複数の全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号271)、及び他の反応において表8に挙げられる全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号273)を使用する2つの別々の反応においてTCRα又はTCRβ鎖を増幅した。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(B)OVA-MHC1のテトラマーで染色した、1匹のOVAワクチン接種したマウス由来の脾細胞。プロットは、生細胞、CD8+細胞、及びTCR+細胞上でゲーティングした。単一のCD44hiテトラマー+細胞(プロット上に描かれたゲートにより定義される)が、384ウェルプレートの個々のウェルに選別され、α及びβTCR鎖が、ネステッドPCRを介して増幅された。増幅の第1ラウンドは、表3及び表4中の全プライマーをTCRα及びTCRβに指向したリバースプライマー(それぞれ、配列番号266及び配列番号269)と組み合わせて使用して実行された。第2ラウンドについては、第1ラウンドのPCR産物の一部を使用して、一方の反応において表7に含まれる複数の全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号271)、及び他の反応において表8に挙げられる全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号273)を使用する2つの別々の反応においてTCRα又はTCRβ鎖を増幅した。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(C)方法が、クローナルに異なる集団を同定することができるかを確かめるために、個々のウェル由来のα(データは示さない)及びβ鎖を、サンガーの配列決定を使用して配列決定した。H60ワクチン接種したマウスについて、198個のTCR+ウェルが配列決定され、これは、2匹のマウス由来の細胞を表している。OVAワクチン接種したマウスについては、54個のTCR+ウェルが配列決定され、これは、4匹のマウス由来のクローニングされたTCRを表している。TRBVの単独使用は、これらの方法を使用して、クローナルに異なる集団を単離することができることを示す。配列決定結果に基づき、5つの固有のTCR対が、H60特異的なTCR対の増幅から選択された。これらのTCR対を、シームレスクローニング技術を使用してレトロウイルスベクターにクローニングし、細胞の表面上でTCRを発現するこれらのベクターの能力を、58-/-TCR-/-ハイブリドーマを使用して評価した。使用されたTCRウイルスベクターは、単一T細胞からクローニングされたTRBV2配列及びTRAV13D-2配列を使用して構築した。TCRを発現するウイルスでの感染後、細胞を、抗Vβ4(TRBV2の遺伝子産物)で染色し、フローサイトメトリーにより評価した。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(D)抗Vβ4で染色され、Tdtomato遺伝子の発現について評価された、感染させていない58-/-TCR-/-ハイブリドーマ。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(E)TRBV15を発現するウイルスで感染させ、抗Vβ4で染色され、Tdtomato遺伝子の発現について評価された細胞。 野生型のメスC57Bl/6マウスに、他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL;配列番号278)又はOVAペプチド(SINFEKL;配列番号279)をワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。(F)TRBV2を発現するウイルスで感染させ、抗Vβ4で染色され、Tdtomato遺伝子の発現について評価された細胞。 TCR-/-4G4ハイブリドーマ細胞株は、NFAT-REルシフェラーゼプラスミドをトランスフェクトした細胞株である(Clipstoneら、Nature、357:695～7ページ(1992))。(A)TCRαβを発現するウイルス構築物及びeGFPを発現するウイルス構築物は、シームレスクローニング技術を使用してアセンブルされ、レトロウイルスが、PLAT-E細胞を使用して生成された。4G4細胞を、TCRレトロウイルスで感染させ、24時間後、TCRβ発現及びeGFP発現を、フローサイトメトリーにより評価した。感染させていない細胞(左パネル)は、GFPを発現せず、TCRβについて染色されなかった。感染させた培養物は、TCRβとeGFP両方を発現する細胞を含有していた(右パネルの右上の象限)。(B)感染させた、又は感染させていない細胞培養物を、抗CD3抗体を結合させたプレートでの培養に、3.5時間置いた。TCRを発現する培養物(感染させている)により産生された相対的光単位(RLU)を、感染させていない(未感染の)細胞のRLUと比較した。 実施例7に記載の一実施形態の外観を表す模式図である。 pMIGIIレトロウイルスベクターベースのアクセプターベクターを表す模式図である。PmeI及びRsrIIのための制限酵素認識部位を含有する27個のヌクレオチドのリンカー並びにTCRβ鎖の定常領域を含む合成されたDNAフラグメントを、ギブソンアセンブリクローニング方法を使用してpMIGIIレトロウイルスベクターにアセンブルした。生じたベクターは、長さ6.95kbである。 フラグメントb及びネステッドα並びにβPCR産物でアセンブルされる直鎖化されたアクセプターベクターを表す模式図である。制限酵素PmeI及びRsrIIで直鎖化されたアクセプターベクターを、フラグメントbでの1回のギブソン反応においてアセンブルし、それは、TCRα定常領域及び2aエレメント、並びに未知のTCRのαVJ及びβVDJネステッドPCR産物を含有している。生じたレトロウイルスベクターのサイズ(およそ8.1kb)は、アセンブルされたα及びβ鎖の長さに従いわずかに変動する。 ギブソンアセンブリ(GA)の下流の2つの異なるクローニングストラテジーを説明する図である。左側のフローチャートは、中スループットのストラテジー(ストラテジー1)を描き、右側は、高スループットのストラテジー(ストラテジー2)である。 再配置されたcDNAから任意のVαJα及びVβDβJβを増幅するための実施例7に記載のPCRストラテジーの図である。単一T細胞由来のRNA又はクローナルなT細胞のRNAのいずれかのRT-PCRを、複数のVα及びVβ遺伝子セグメントのリーダー配列に結合するフォワードプライマーのプール並びにCα又はCβのいずれかに結合する2つのリバースプライマーを使用して行う。全てのVαプライマーは、5'末端に直鎖化されたpMIGIIの5'末端と重複する20ntの共通配列を有し、全てのVβプライマーは、5'末端にフラグメントbの3'末端と重複する20ntの共通配列を含有する。「ネステッドPCR」と呼ばれる第2のPCRは、Vα又はVβ共通配列のいずれかの最後の18ntと結合するフォワードプライマー、及びCα又はCβのいずれかの最初の20ntと結合するリバースプライマーを用いて行う。VαとVβアンプリコンの両方が、それぞれ、ベクター又はフラグメントbのいずれかとの18ntの重複、インタクトなリーダー配列を有するVαJα及びVβDβJβ、並びにCα又はCβのいずれかの最初の20ntを含有する。 実施例7のギブソンアセンブリ後の陽性のアセンブルされたベクターのスクリーニングのためのClaI制限酵素消化を示す図である。消化後の予想バンドサイズは、約6700nt及び1400ntである。ゲルは、13C2及び1B9T細胞ハイブリドーマのTCRのクローニングについて約50%の効率を示す。 TCR発現及びT細胞機能を示す図である。それぞれ13C2又は1B9TCRの3つのアセンブルされたレトロウイルスベクターを、4G4細胞に形質導入した。4G4細胞の膜上での13C2(A)及び1B9(B)TCR発現を、フローサイトメトリーにより評価した。GFP(RVベクターに含有される)及びそれぞれのVβの二重陽性染色は、TCRを発現する細胞のパーセンテージを示す。(C)PL2-3抗原、及びPL2-3(黒色の棒)又は無関係の抗IgM(白色の棒)を提示し得る、1B9又は13C2のいずれかで形質導入され、AM14Vk8R B細胞で刺激された4G4のIL-2分泌。それぞれのTCRについて3種の形質導入での刺激が示される。 図１９－１の続き。 ギブソンアセンブリを示すゲルの図である。異なるDNA濃度及びDO11.10TCRを使用したギブソンアセンブリの2回の試験が示される。矢印は、正しいClaI消化パターン、並びに正しくアセンブルされたpMIGIIベクター及びDO11.10TCRを指し示す。 P2Aヌクレオチド及びアミノ酸配列を説明する模式図である。(複数の)第1のフォワードVβプライマーに対する相同性(重複)のおよその領域が示される。 フラグメントbヌクレオチド配列を説明する模式図である。アンプリコンに対する相同性(重複)のおよその領域が示される。 アクセプターベクターpMIGII中のCβヌクレオチド配列を説明する模式図である。
本文書は、単一T細胞から機能的TCRをクローニングすることに関与する方法及び材料を提供する。例えば、本文書は、単一T細胞からTCRをコードする核酸を得、その核酸を配置して、TCR(例えば、完全にインタクトなTCR、例えば、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有する完全にインタクトなTCR)を発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成する方法及び材料を提供する。一般に、単一T細胞から機能的TCRをクローニングする方法は、T細胞を別々の場所に選別する工程、単一T細胞を溶解して、RNAを放出させる工程、逆転写を行って、放出されたRNAからcDNAを産生する工程、ネステッド増幅反応を行って、それぞれの単一細胞について同じネステッド増幅反応混合物内にそれぞれの単一T細胞のVα(又はVγ)についての第1の増幅産物及びそれぞれの単一T細胞のVβ(又はVδ)についての第2の増幅産物を生成する工程、並びに第1及び第2の増幅産物を発現ベクターにクローニングする工程を含み得る(図1)。ある場合には、逆転写工程由来のcDNAの一部を使用して、増幅反応(例えば、PCR又は定量的PCR(qPCR))を行い、単一T細胞による他の遺伝子(例えば、IFNγ)の発現の存在、不在、又は量を検出することができる(図1)。
任意のタイプのT細胞を得て、本明細書に記載される通り使用して、機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを生成することができる。例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、制御性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤Tリンパ球(TIL)、ナイーブT細胞、活性化T細胞、メモリーT細胞、公知の抗原特異性を有するT細胞、未知の抗原特異性を有するT細胞、MHCクラスI拘束性T細胞の拡大した集団、MHCクラスII拘束性T細胞の拡大した集団、又はそれらの組合せを得て、本明細書に記載される通り使用して、機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを生成することができる。ある場合には、異なるタイプのT細胞の混合物(例えば、MHCクラスI拘束性T細胞とMHCクラスII拘束性T細胞の混合物)を含有する試料を得て、本明細書に記載される通り使用して、機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを得ることができる。
加えて、生きたT細胞を含有する任意の適当な試料を使用して、本明細書に記載される通り使用することができるT細胞を得ることができる。機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを生む出すために本明細書に記載される通り使用され得るT細胞を含有する試料の例は、血液試料、末梢血単核球(PBMC)試料、単離されたリンパ球試料、組織試料(例えば、皮膚、リンパ節試料、粘膜組織、皮膚若しくは粘膜組織内のウイルス病変、又は腫瘍試料)、細胞培養試料(例えば、T細胞株、例えば、ジャーカット細胞、1301細胞、又はT細胞白血病株の細胞培養試料)、特異的な抗原又はワクチンに対してエクスビボで拡大されたT細胞の試料、及び最近死亡したマウス又はヒトの死体の組織由来の試料を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される方法のためのT細胞の供給源として使用され得る組織試料の例は、リンパ節試料、腫瘍試料、胸腺試料、骨髄試料、腸生検試料、肺生検試料、腎生検試料、及び器官移植片生検試料を含むがこれらに限定されない。乳腺腫瘍試料、前立腺腫瘍試料、大腸癌試料、肺癌試料、メラノーマ試料、及び膵臓癌試料を含むがこれらに限定されない、任意の適当なタイプの腫瘍試料が、本明細書に記載される方法のためT細胞の供給源として使用され得る。ある場合には、T細胞を含有する試料は、炎症の部位、組織拒絶の部位、感染の部位、疾患の部位、免疫応答の部位、自己免疫浸潤の部位、アレルギー反応の部位、腫瘍の部位、又は移植反応の部位から得ることができる。組織試料、例えば、腫瘍試料を使用するとき、組織試料(例えば、腫瘍試料)を、哺乳動物(例えば、ヒト)から得て、破壊するか又は消化して、T細胞を含む細胞懸濁液を形成することができる。ある場合には、組織試料(例えば、腫瘍試料)は、その組織試料から(例えば、その腫瘍試料から)抗原特異的T細胞の集団を得るために、免疫調節薬療法の対象にされているか、又はされていない、治療ワクチンで処置された哺乳動物(例えば、ヒト)から得ることができる。
ある場合には、TILを得るために、切除された固形腫瘍及び/又は腫瘍生検から得た組織を消化して、単一細胞懸濁液を形成することができる。単一細胞懸濁液を、T細胞特異的マーカー及び/又は腫瘍関連細胞の特徴について染色して、T細胞を腫瘍細胞から区別することができる。腫瘍特異的表面マーカーは、腫瘍サブタイプに基づき選択することができる(例えば、表面タンパク質Met-72は、ある特定のメラノーマについて使用することができる)。ある場合には、細胞周期を決定するためのVybrant(登録商標)DyeCycle(商標)試薬、並びに/又は染料、例えば、細胞のDNA内容物についての7AAD染色、ヨウ化プロピジウム染色、及び/若しくはDNA内容物についてのヘキスト染色を使用することができる(Loken、Cytometry、1(2):136～142ページ(1980);並びにSchmid及びSakamoto、Curr. Protoc. Cytom.、7章:7単元 16 (2001))。ある場合には、腫瘍細胞は、免疫細胞関連表面タンパク質の不在、例えば、CD45、CD4、CD8、TCRβ、CD11b、CD19、又はそれらの組合せの不在により同定することができる。区別されたT細胞及び腫瘍細胞は、選別され、TCRが、本明細書に記載される通り、T細胞からクローニングされ得る。ある場合には、選別された腫瘍細胞が、単離され、さらに解析され(例えば、配列決定され)得る。この二重選別システムにより、人が、腫瘍細胞と関連するTILの両方から遺伝子情報を同時に得ることを可能にし得る。
ある場合には、マイクロダイセクション技術、例えば、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション(LMM)、レーザープレッシャーカタパルティング(LPC)、メンブレンマウント組織のマイクロダイセクション(MOMeNT)、又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を使用して、他で記載された通り、T細胞を他の細胞(例えば、腫瘍細胞又は疾患組織)から分けることができる(Pinzaniら、Mol. Aspects Med.、27:140～59ページ(2006);及びTjernlundら、PloS One、11:e0149907ページ(2016))。
ある場合には、本明細書において提供される方法において使用するためのT細胞を含有する試料は、T細胞のクローンを生成するために拡大されていない新たに単離されたT細胞の試料であり得る。
機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを生成するために本明細書に記載される通り使用されるT細胞は、任意の適当な哺乳動物由来であり得る。例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ種、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、又はマウス由来のT細胞を、本明細書に記載される通り使用して、機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを生成することができる。
T細胞が得られると、それらは、単一T細胞を1つの場所に置く様式(例えば、1個のT細胞/ウェル)で、例えば、容器、例えば、マルチウェルプレートの別々の場所に選別され得る。任意の適当なセル選別方法を使用して、単一T細胞を別々の場所に選別することができる。例えば、T細胞集団は、特異的マーカーに結合する特定の蛍光剤で染色され、セルソーターを使用してマルチウェルプレートの別々のウェルに単一細胞に選別することができる。ある場合には、蛍光剤、例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)、蛍光標識された抗体(例えば、蛍光標識された抗CD3抗体、蛍光標識された抗CD4抗体、蛍光標識された抗CD8抗体、蛍光標識された抗CD69抗体、蛍光標識された抗CD40L抗体、蛍光標識された抗CD44抗体、又は蛍光標識された抗CD62L抗体)、蛍光標識されたペプチド-テトラマーの複合体(例えば、蛍光標識された腫瘍抗原-テトラマーの複合体)、又はそれらの組合せを使用して、セル選別のためT細胞を染色することができる。例えば、単一CD8+T細胞を、別々の場所に選別し得るように、蛍光標識された抗CD3抗体(例えば、フルオレセインで標識された抗CD3抗体、例えば、FITC-OKT3)及び蛍光標識された抗CD8抗体(例えば、フィコエリトリンで標識された抗CD8抗体、例えば、PE-SK1)を使用して、CD8+T細胞を染色することができる。セル選別中に使用され得る蛍光標識の例は、フルオレセイン、フィコエリトリン、Cy3、Cy5、ローダミン、アレキサ(Alexa)488、及びブリリアントバイオレット(Brilliant Violet)を含むがこれらに限定されない。
ある場合には、T細胞(例えば、CD3+T細胞)又は特定のタイプのT細胞(例えば、CD4+又はCD8+T細胞)を同定し、選別するのを助けるように設計され、使用されるもの以外の1種以上の蛍光剤(例えば、蛍光標識された抗体)が、それらの蛍光剤からの蛍光シグナルが、T細胞を選別するために使用されてもよいか、又は使用されなくてもよいが、選別プロセス中に含まれて、選別されたT細胞の表現型についてのさらなる情報をもたらし得る。例えば、表面タンパク質又はマーカー、例えば、PD-1、TIM3、LAG3、CD28、CD152、CD44、CD69、CD107a、CD11b、CD62L、CD127、CD30、CD27、若しくはCD45RA/CDR45Oに結合する蛍光剤を使用して、それぞれの選別されたT細胞によりそれらの表面タンパク質又はマーカーについての発現情報を捕捉することができる。それぞれの単一の選別されたT細胞の特定の場所は既知であるので、その時には、それらの特定の選別されたT細胞のそれぞれについてそれぞれの蛍光シグナルのレベルも既知であり、それらを産生したT細胞と関連し得る。例えば、蛍光標識された抗CD3抗体、蛍光標識された抗CD8抗体、蛍光標識された抗CD28抗体、及び蛍光標識された抗CD152抗体を使用したセル選別プロセス中に、全4種の抗体からの蛍光シグナルが捕捉され、そのT細胞が、容器の特定の別々の場所に選別され得るように、細胞をCD3+/CD8+T細胞であると同定するために使用されている抗CD3及び抗CD8抗体からのシグナルを含むそれらのシグナルを生成する細胞に割り当てられ得る。この場合には、全4種のマーカーの蛍光レベルは、たとえ2種(すなわち、CD28及びCD152マーカー)が、実際の選別のため使用されなかったとしても、それらのシグナルを生成したT細胞に割り当てられ得る。
T細胞を別々の場所(例えば、ウェル)に選別するときに得られるこの発現情報は、単一の選別されたT細胞についての重要な情報をもたらし得る。例えば、この情報で、例えば、CD28+T細胞から、本明細書に記載される通り生成されるTCRを発現する発現ベクターは、たとえCD28+発現が、選別の基準として使用されていなくても(例えば、CD28+及びCD28-T細胞両方が、選別プロセス中に単一細胞に選別された)、より早期の選別プロセス中に蛍光標識された抗CD28抗体からの蛍光シグナルに基づき構築された後、選択され得る。ある場合には、CD45ROは、ナイーブT細胞を同定するためのマーカーとして使用することができ、CD45RAは、刺激されたT細胞(例えば、刺激されたヒトT細胞)を同定するためのマーカーとして使用することができる。
ある場合には、任意の特定の蛍光剤由来の染色の存在(又は不在)が、選別の基準として使用することができ、その場合には、それらの選別された単一T細胞から生成されたTCRを発現する発現ベクターのそれぞれは、その蛍光剤のマーカーについて陽性(又は陰性)のT細胞由来である。例えば、CD28+染色の存在を選別の基準として使用するとき、TCRを発現する発現ベクターのそれぞれが、単一CD28+T細胞から生成されたTCRを発現する。そのような場合には、染色の具体的な程度(例えば、CD28+染色の程度)についての情報が、たとえそのマーカーが、選別基準として使用されたとしても、選別され、使用されたそれぞれの単一T細胞と関連し得る。この情報は、クローニングされたTCRの機能的性状を評価するとき有用である。
任意の適当な容器は、本明細書に記載される方法の間、T細胞を選別するとき、使用され得る。例えば、マルチウェルプレート、例えば、96ウェルプレート、384ウェルプレート、1536ウェルプレート、又は微小管を使用することができる。ある場合には、容器は、互いに空間的に離れている個々の液滴を保持するように設計され、それにより、それぞれの液滴が、単一T細胞を含有する(例えば、1個のT細胞/液滴)別々の場所を形成し得る。例えば、単一T細胞は、他で記載される通り、表面(例えば、平な表面)上の個々の液滴に選別することができる(Kanzら、Cytometry、7:491～4ページ(1986))。
ある場合には、個々のTCRクローニング法が、1つ以上のマルチウェルプレートを使用して、本明細書に記載される通り行われ得る。例えば、2つ以上(例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50以上)の384ウェルプレート又は1536ウェルプレートを使用して、本明細書に記載される方法を使用して単一供給源から(例えば、1人のヒトから)得られた単一T細胞からTCRをクローニングすることができる。望ましいほどではないが、ある場合には、単一T細胞を別々の場所に選別することにより、2個以上のT細胞を有するいくつかの別々の場所(例えば、いくつかの別々のウェル)を生じてもよい。2個の細胞に由来する産物の約25パーセントが、少なくとも1つの出発細胞の本物のTCRを再構築することができ、続くスクリーニングプロセスにおいて同定され得るので、潜在的に単一より多くのT細胞を有する場所は、クローニングプロセスにとどまることができる。
本明細書に記載される方法の間、任意の適当なセルソーターを使用して、T細胞を選別することができる。使用され得るセルソーターの例は、BD FACSAria IIソーター、BD FACSAria IIIソーター、MOFLO XDPソーター、MOFLO Astrios EQソーター、ソニーiCyt SY3200セルソーター、及びソニーSH800Sセルソーターを含むがこれらに限定されない。T細胞を選別するとき、選別されたT細胞を含有するエアロゾル化された液滴の体積は、約1nL～約4nLであり得、選別されたT細胞を含有する液滴は、約0.1μL～約5μL(例えば、約0.5μL～約5μL、約1μL～約5μL、約2μL～約5μL、約0.5μL～約4μL、約0.5μL～約3μL、約0.5μL～約2μL、又は約0.5μL～約1μL)の範囲の体積の液体に集められ得る。
T細胞が選別されると(例えば、1個のT細胞/ウェル)、単一T細胞を溶解して、それぞれのT細胞のRNAを放出することができる。任意の適当な方法を使用して、別々の場所に選別された単一T細胞を溶解することができる。例えば、超音波処理、1回以上の凍結/融解サイクル、1種以上の細胞溶解剤での処理、加熱、浸透圧ストレス、酵素消化、又はそれらの組合せを使用して、単一T細胞を溶解して、RNAを放出させることができる。
単一T細胞についてのRNAを放出させた後、逆転写を行って、放出されたRNAからcDNAを生成することができる。任意の適当なセットのプライマーは、放出されたRNAからcDNAを生成するための鋳型としてのRNAと共に使用することができる。ある場合には、ランダムオリゴマーを使用して、単一T細胞から放出されたRNAからcDNAを生成することができる。放出されたRNAからcDNAを生成するためのプライマーとして使用され得るランダムオリゴマーの例は、ランダム6量体プライマー、ランダム9量体プライマー、ランダム10量体プライマー、又はランダムペンタデカマープライマーを含むがこれらに限定されない。ある場合には、ポリ-Tプライマー(例えば、オリゴ(dT)18プライマー)を使用して、放出されたRNAからcDNAを生成することができる。ある場合には、TCRをコードするRNAに特異的なプライマーを、単独、又は他のポリペプチドをコードするRNAに特異的なプライマーと一緒に使用して、放出されたRNAからcDNAを生成することができる。例えば、TCRをコードするRNAに特異的なプライマーを、発現又は発現レベルが評価されている他のポリペプチド(例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、又はIL-17)のいずれかをコードするRNAに特異的なプライマーと一緒に使用することができる。
任意の適当な逆転写酵素を使用して逆転写を行って、放出されたRNAからcDNAを生成することができる。本明細書に記載される通り使用され得る逆転写酵素の例は、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素(Promegaから市販されている)及びモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素、例えば、Superscript III、Superscript IV(共に、ThermoFisher Scientificから市販されている)、iScript(Bioradから市販されている)、並びにAccuscript HiFi(Agilentから市販されている)を含むものであったがこれらに限定されない。逆転写を行うための他の成分は、dNTP、非変性界面活性剤(例えば、IGEPAL CA-630)、RNase阻害剤、例えば、RNasin(Promegaから市販されている)、及びRNase OUT(ThermoScientificから市販されている)を含み得るがこれらに限定されない。
本明細書において提供される逆転写反応は、RNAを温度約55℃～約75℃(例えば、約60℃～約70℃、約62℃～約68℃、又は約64℃～約66℃)まで、約2分～約10分(例えば、約2分～約8分、約3分～約7分、又は約4分～約6分)の期間、加熱する任意選択の工程を含むことができる。ある場合には、逆転写反応は、RNAを約65℃まで約5分間加熱する工程を含むことができる。この加熱工程は、逆転写反応に関与する1種以上の成分(例えば、プライマー、dNTP、非変性界面活性剤、又はそれらの組合せ)の存在下でRNAを使用して行われ得る。ある場合には、加熱工程は、逆転写酵素を除き、逆転写反応に関与する全ての必要とされる成分と共に実施され得る。任意選択の加熱工程を実施した後、試料は、プライマー結合のため氷上に置かれ得る。
本明細書において提供される逆転写反応は、RNAを逆転写酵素と、プライマー、dNTP、及び任意選択の界面活性剤(例えば、非変性界面活性剤)の存在下、温度約30℃～約55℃(例えば、約35℃～約50℃、約37℃～約47℃、又は約40℃～約45℃)で、約20分～約90分(例えば、約25分～約80分、約30分～約60分、又は約35分～約45分)の期間接触させることにより、行われ得る。ある場合には、逆転写反応は、約42℃で約40分間行われ得る。
ある場合には、高い質のcDNAが、本明細書に記載される方法及び材料を使用して、高スループットかつ有効な様式で、単一T細胞から得られたRNAから生成され得る。例えば、一実施形態において、高い質のcDNAは、本明細書に記載される通り、それぞれの単一T細胞を迅速に溶解し、逆転写反応を行うことにより、高スループットかつ有効な様式で、単一T細胞から得られたRNAから生成され得る。ある場合には、単一T細胞から生成された生じたcDNAは、一部(例えば、最終総cDNA反応混合物の約75パーセント以下、約50パーセント以下、約25パーセント以下、約10パーセント以下、約75パーセント～約10パーセント、約75パーセント～約25パーセント、約75パーセント～約50パーセント、約60パーセント～約40パーセント、約50パーセント～約10パーセント、又は約50パーセント)を使用して、ネステッド増幅及びクローニング工程を続けて、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せ(又は少なくともVαセグメントとVβセグメントの組合せ若しくは少なくともVγセグメントとVδセグメントの組合せ)を有する機能的TCRを発現する発現ベクターを首尾よく得られる、高い質のものであり得る。
ある場合には、本明細書に記載されるネステッド増幅反応を実施するために使用される成分の1つ以上が、逆転写反応のための反応混合物に、逆転写反応の実施前、中、又は後に加えられ得る。例えば、逆転写反応は、本明細書に記載される第1ラウンドのネステッド増幅反応のためのプライマーコレクションの存在下で、本明細書に記載される第2ラウンドのネステッド増幅反応のためのプライマーコレクションの存在下で、熱サイクルのため設計されたポリメラーゼ酵素(例えば、Taqポリメラーゼ)の存在下で、又はそれらの組合せの存在下で、本明細書に記載される通り実施され得る。
ある場合には、逆転写反応は、完了まで、本明細書に記載されるネステッド増幅反応を実施するために使用される1つ以上の成分の不在下で本明細書に記載される通り実施され得る。例えば、逆転写反応は、完了まで、本明細書に記載される第1ラウンドのネステッド増幅反応のためのプライマーコレクションの不在下で、本明細書に記載される第2ラウンドのネステッド増幅反応のためのプライマーコレクションの不在下で、熱サイクルのため設計されたポリメラーゼ酵素(例えば、Taqポリメラーゼ)の不在下で、又はそれらの組合せの不在下で本明細書に記載される通り実施され得る。
生成されたcDNAの一部のみを使用して、ネステッド増幅及びクローニング工程を続け、本明細書に記載される単一T細胞に存在する可変鎖の組合せ(又は少なくともVαセグメントとVβセグメントの組合せ若しくは少なくともVγセグメントとVδセグメントの組合せ)を有する機能的TCRを発現する発現ベクターを得るとき、単一T細胞から得られたRNAから生成された残りのcDNA(又は残りのcDNAの一部)を使用して、遺伝子発現の存在若しくは不在を検出するためのPCRのような技術、又は遺伝子発現のレベルを検出するためのqPCRのような技術を介して、単一T細胞の表現型についての他の重要な情報を得ることができる。例えば、単一T細胞から生成されたcDNAの一部(例えば、最終総cDNA反応混合物の約75パーセント以下、約50パーセント以下、約25パーセント以下、約10パーセント以下、約75パーセント～約10パーセント、約75パーセント～約25パーセント、約75パーセント～約50パーセント、約60パーセント～約40パーセント、約50パーセント～約10パーセント、又は約50パーセント)を使用して、単一細胞選別されたT細胞により示されるRNA発現の存在、不在、又は量を検出することができる。任意の特定のRNAについての発現(又はその欠如)は、単一細胞選別されたT細胞について、本明細書に記載される通り評価され得る。例えば、ポリペプチド、例えば、サイトカイン(例えば、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、EBI3、p40、p35、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、又はIL-17)、受容体(例えば、CD3、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40L、CD122、CXCR3、CXCR6、CCR5、CCR6、CCR7、FASL、LFA-1、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG3、Tim-3、又はVLA-4)、転写因子(例えば、RORγT、FOXP3、FOXO1、RUNX1、T-bet、エオメソデルミン(Eomesdermin)、Gata-3、Bcl-2、Bcl-6、BIM、Blimp-1、又はp53)、酵素(例えば、グランザイムA、グランザイムB、DNAメチルトランスフェラーゼ、又はヒストン/タンパク質脱アセチル化酵素(HDAC)、例えば、HDAC1若しくはHDAC9)、サイトカインシグナル伝達の抑制因子 (例えば、SOCS1又はSOCS9)、カッパBキナーゼの阻害剤、又はケモカイン(例えば、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4、CCL5/RANTES、CCL6、CXCL12、又はCXCL16)をコードするRNAの存在、不在、又は量が、単一T細胞について決定することができる。ある場合には、マイクロRNA(例えば、miRNA-17、miRNA-31、miRNA-139、又はmiRNA-150)の存在、不在、又は量が、本明細書に記載される通り、単一T細胞について決定することができる。ある場合には、本明細書に記載される通り、単一T細胞について評価されたRNA発現の存在、不在、又は量を使用して、特定の単一T細胞を望ましい表現型を有すると同定することができる。例えば、単一T細胞を、IL-2若しくはIFN-γRNA発現の存在又は量を検出することにより、活性化されていると同定することができる。
任意の適当な技術を使用して、本明細書に記載される単一T細胞から生成されたcDNAを使用して、特定のRNAについてRNA発現の存在又は不在を検出することができる。例えば、PCR、リアルタイムPCR、又は蛍光プローブ(例えば、SYBRグリーン)若しくはTaqmanプローブの使用を含むPCRを使用して、特定のRNAのRNA発現の存在又は不在を検出することができる。同様に、任意の適当な技術を使用して、本明細書に記載される単一T細胞から生成されたcDNAを使用して、特定のRNAについてRNA発現の量を検出することができる。例えば、qPCRを使用して、特定のRNAのRNA発現の量を検出することができる。
いくつかの標的は、cDNAから直接予め増幅されるか、又は増幅され、特定のプライマー対並びに/又は蛍光色素、例えば、FAM、TET、HEX、JOE、Cy3、TAMRA、Rox、LCRed、Texas Red、LC640、若しくはCy5及びクエンチャー、例えば、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMARA、DABCYL、若しくはIowa Black FQで標識されたTaqmanプローブを使用して同時に解析され得る。ある場合には、標的mRNAの発現レベルの定量は、1つ以上の参照核酸に対して正規化され得る。正規化のため使用され得る参照核酸の例は、ACTB、ALAS1、B2M、GAPDH、HBB、HMBS、HPRT1、IPO8、PGK1、PPIA、RPLP0、RPL13A、SDHA、TBP、TFRC、YWHAZ、及び18Sを含むがこれらに限定されない。NormFinderのようなソフトウェアが、正規化のため使用され得る安定な核酸の同定のため使用され得る。
単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAの全て又は一部(例えば、約4分の1、約3分の1、約2分の1、約3分の2、又は約4分の3)を使用して、単一の反応混合物内で少なくとも2つの増幅産物を生成するように設計されたネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)を行うことができる(図1)。第1の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞についてα鎖のVセグメント(Vα)又はγ鎖のVセグメント(Vγ)を含むことができ、第2の増幅産物は、その同じ単一αβ又はγδT細胞についてβ鎖のVセグメント(Vβ)又はδ鎖のVセグメント(Vδ)を含むことができる。ある場合には、全長Vセグメントが、供給源RNAをもたらした単一T細胞に存在したので、第1及び第2の増幅産物は、全長Vセグメントをコードすることができる。例えば、Vα1.2セグメント及びVβ11.3セグメントを含むTCRを有するヒトαβT細胞を、別々のウェルに選別し、溶解して、T細胞のRNAを放出させることができる。そのRNAを使用して、逆転写を介してcDNAを生成することができ、その生成されたcDNAをネステッド増幅反応における鋳型として使用して、そのヒトαβT細胞に存在する全長Vα1.2セグメントをコードする核酸配列を含む第1の増幅産物、及びそのヒトαβT細胞に存在する全長Vβ11.3セグメントをコードする核酸配列を含む第2の増幅産物を作製することができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、α鎖のV及びJセグメント(VαJα又はVJα)又はγ鎖のV及びJセグメント(VγJγ又はVJγ)を含み得る。例えば、全長Vα及びJαセグメントが、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長Vα及びJαセグメントをコードすることができるか、又は全長Vγ及びJγセグメントが、供給源RNAを提供した単一γδT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長Vγ及びJγセグメントをコードすることができる。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、リーダー(L)配列並びにα鎖のV及びJセグメント(L-VαJα又はL-VJα)又はL配列並びにγ鎖のV及びJセグメント(L-VγJγ又はL-VJγ)を含み得る。例えば、全長L配列並びに全長Vα及びJαセグメントは、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長L配列並びに全長Vα及びJαセグメントをコードすることができるか、又は全長L配列並びに全長Vγ及びJγセグメントは、供給源RNAをもたらした単一γδT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長L配列並びに全長Vγ及びJγセグメントをコードすることができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、α鎖のV及びJセグメント並びに定常(C)領域の少なくとも一部(VαJαCα又はVJCα)又はγ鎖のV及びJセグメント並びにC領域の少なくとも一部(VγJγCγ又はVJCγ)を含むことができる。例えば、全長Vα及びJαセグメント並びにCαの少なくとも一部が、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長Vα及びJαセグメント並びにCαの少なくとも一部をコードすることができるか、又は全長Vγ及びJγセグメント並びにCγの少なくとも一部が、供給源RNAを提供した単一γδT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長Vγ及びJγセグメント並びにCγの少なくとも一部をコードすることができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、L配列、α鎖のV及びJセグメント、並びにC領域の少なくとも一部(L-VαJαCα又はL-VJCα)又はL配列、γ鎖のV及びJセグメント、並びにC領域の少なくとも一部(L-VγJγCγ又はL-VJCγ)を含むことができる。例えば、全長L配列、全長Vα及びJαセグメント、並びにCαの少なくとも一部は、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長L配列、全長Vα及びJαセグメント、並びにCαの少なくとも一部をコードすることができるか、又は全長L配列、全長Vγ及びJγセグメント、並びにCγの少なくとも一部は、供給源RNAをもたらした単一γδT細胞に存在したので、第1の増幅産物は、全長L配列、全長Vγ及びJγセグメント、並びにCγの少なくとも一部をコードすることができる。全長L配列、全長Vα及びJαセグメント、並びにCαの少なくとも一部をコードする第1の増幅産物の例が、図2A及び3Aの下パネルに示される。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、β鎖のV及びDセグメント(VβDβ又はVDβ)又はδ鎖のV及びDセグメント(VδDδ又はVDδ)を含むことができる。例えば、全長Vβ及びDβセグメントが、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vβ及びDβセグメントをコードすることができるか、又は全長Vδ及びDδセグメントが、供給源RNAを提供した単一γδT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vδ及びDδセグメントをコードすることができる。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、β鎖のV、D、及びJセグメント(VβDβJβ又はVDJβ)又はδ鎖のV、D、及びJセグメント(VδDδJδ又はVDJδ)を含むことができる。例えば、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメントが、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメントをコードすることができるか、又は全長Vδ、Dδ、及びJδセグメントが、供給源RNAを提供した単一γδT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vδ、Dδ、及びJδセグメントをコードすることができる。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、それぞれ、単一αβ又はγδT細胞について、L配列並びにβ鎖のV、D及びJセグメント(L-VβDβJβ又はL-VDJβ)又はL配列並びにδ鎖のV、D及びJセグメント(L-VδDδJδ又はL-VDJδ)を含むことができる。例えば、全長L配列並びに全長Vβ、Dβ、及びJβセグメントは、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長L配列並びに全長Vβ、Dβ、及びJβセグメントをコードすることができるか、又は全長L配列並びに全長Vδ、Dδ、及びJδセグメントは、供給源RNAをもたらした単一γδT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長L配列並びに全長Vδ、Dδ、及びJδセグメントをコードすることができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、それぞれ、単一αβ若しくはγδT細胞について、β鎖のV、D及びJセグメント並びにC領域の少なくとも一部(VβDβJβCβ又はVDJCβ)又はδ鎖のV、D及びJセグメント並びにC領域の少なくとも一部(VδDδJδCδ又はVDJCδ)を含むことができる。例えば、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメント並びにCβの少なくとも一部が、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメント並びにCβの少なくとも一部をコードすることができるか、又は全長Vδ、Dδ、及びJδセグメント並びにCδの少なくとも一部が、供給源RNAを提供した単一γδT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長Vδ、Dδ、及びJδセグメント並びにCδの少なくとも一部をコードすることができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、それぞれ、単一αβ若しくはγδT細胞について、L配列、β鎖のV、D及びJセグメント、並びにC領域の少なくとも一部(L-VβDβJβCβ又はL-VDJCβ)或いはL配列、δ鎖のV、D及びJセグメント、並びにC領域の少なくとも一部(L-VδDδJδCδ又はL-VDJCδ)を含むことができる。例えば、全長L配列、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメント、並びにCβの少なくとも一部は、供給源RNAをもたらした単一αβT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長L配列、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメント、並びにCβの少なくとも一部をコードすることができるか、又は全長L配列、全長Vδ、Dδ、及びJδセグメント、並びにCδの少なくとも一部は、供給源RNAをもたらした単一γδT細胞に存在したので、第2の増幅産物は、全長L配列、全長Vδ、Dδ、及びJδセグメント、並びにCδの少なくとも一部をコードすることができる。全長L配列、全長Vβ、Dβ、及びJβセグメント、並びにCβの少なくとも一部をコードする第2の増幅産物の例が、図2B及び3Bの下パネルに示される。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2の増幅産物は、L配列のATG開始部位から始まり、L配列へと下流に進む。この例が、図2A及び2Bの下パネルに示される。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2の増幅産物は、L配列の上流に位置する5'非翻訳領域の一部を含むことができ、これは、その部分が、供給源RNAをもたらした単一T細胞に存在したからである。この例が、図3A及び3Bの下パネルに示される。本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2の増幅産物内のL配列の上流に位置する5'非翻訳領域の一部を含むとき、L配列のATG開始部位に先行するヌクレオチドで開始し、上流で作用する任意の適当な長さの5'非翻訳領域が含まれ得る。例えば、5'非翻訳領域の0個のヌクレオチド～約100個以上のヌクレオチド(例えば、0個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～3個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、又は5個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド)が、第1及び/又は第2の増幅産物内に含まれ得る。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、α又はγ鎖の5'非翻訳領域の0個～約100個以上のヌクレオチド(例えば、0個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～3個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、又は5個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド)を含み得、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、β又はδ鎖の0個～約100個以上のヌクレオチド(例えば、0個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、0個のヌクレオチド～3個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド～5個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～100個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド～25個のヌクレオチド、又は5個のヌクレオチド～10個のヌクレオチド)を含み得る。
一実施形態において、全長VJセグメント及び全長VDJセグメントは、供給源RNAをもたらした単一T細胞に存在したので、第1及び第2の増幅産物は、全長VJセグメント及び全長VDJセグメントをコードすることができる。例えば、Vα1.2セグメント、Jα32セグメント、Vβ11.3セグメント、Dβ2セグメント、及びJβ1-5セグメントを含むTCRを有するヒトαβT細胞を、別々のウェルに選別し、溶解して、T細胞のRNAを放出させることができる。そのRNAを使用して、逆転写を介してcDNAを生成することができ、その生成されたcDNAをネステッド増幅反応における鋳型として使用して、そのヒトαβT細胞に存在する全長Vα1.2及びJα32セグメントをコードする核酸配列を含む第1の増幅産物、並びにそのヒトαβT細胞に存在する全長Vβ11.3、Dβ2及びJβ1-5セグメントをコードする核酸配列を含む第2の増幅産物を作製することができる。
別の例として、L配列を含む全長VJセグメント、L配列を含む全長VDJセグメント、及びそれぞれのC領域の少なくとも一部が、供給源RNAをもたらした単一T細胞に存在したので、第1及び第2の増幅産物は、L配列を含む全長VJセグメント、L配列を含む全長VDJセグメント、及びそれぞれのC領域の少なくとも一部をコードすることができる。例えば、L配列を含むVα1.2セグメント、Jα32セグメント、Cα領域、L配列を含むVβ11.3セグメント、Dβ2セグメント、Jβ1.5セグメント、及びCβ領域を含むTCRを有するヒトαβT細胞を、別々のウェルに選別し、溶解して、T細胞のRNAを放出させることができる。そのRNAを使用して、逆転写を介してcDNAを生成することができ、その生成されたcDNAをネステッド増幅反応における鋳型として使用して、そのヒトαβT細胞に存在するL配列を含む全長Vα1.2及びJα32セグメント、並びにCαの5'末端の少なくとも一部をコードする核酸配列を含む第1の増幅産物、並びにそのヒトαβT細胞に存在するL配列を含む全長Vβ11.3、Dβ2、及びJβ1-5セグメント、並びにCβの5'末端の少なくとも一部をコードする核酸配列を含む第2の増幅産物を作製することができる。
本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2の増幅産物内にC領域の一部を含むとき、そのC領域の5'末端から開始する、任意の適当な長さのC領域が含まれ得る。例えば、C領域の約15個のヌクレオチド～約550個以上のヌクレオチド(例えば、約15個のヌクレオチド～約550個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約450個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約400個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約300個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約200個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約100個のヌクレオチド、約15個のヌクレオチド～約50個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約550個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約450個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約400個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約300個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約200個のヌクレオチド、約20個のヌクレオチド～約100個のヌクレオチド、又は約20個のヌクレオチド～約50個のヌクレオチド)が、第1及び/又は第2の増幅産物内に含まれ得る。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1の増幅産物は、Cα又はCγ領域の最初の15個～約450個のヌクレオチドを含み得、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2の増幅産物は、Cβ又はCδ領域の最初の15個～約550個のヌクレオチドを含み得る。
本明細書に記載される通り、本明細書において提供される方法及び材料は、使用者が、選別されたT細胞集団から、全てではないが、大部分の機能的TCRを首尾よく捕捉することを可能にすることができる。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅(例えば、ネステッドPCR)法は、哺乳動物(例えば、ヒト)の特定のTCRの2つの可変鎖の全ての公知の機能的Vセグメント(例えば、特定のαβTCRのα可変及びβ可変鎖の公知の機能的Vセグメントのいずれか、又は特定のγδTCRのγ可変及びδ可変鎖の公知の機能的Vセグメントのいずれか)を増幅するように設計されたプライマーコレクションを使用することを含み得る。ヒトについて、本明細書において提供されるネステッド増幅法は、機能的であることが現在公知であるα鎖の全45種のVセグメント、及び機能的であることが現在公知であるβ鎖の全48種のVセグメントを増幅するように設計されたプライマーコレクションを含むことができる。本明細書においてα鎖のTCR Vセグメントに言及するとき、短縮された略語TRAVを使用することができる。同様に、本明細書においてβ鎖のTCR Vセグメントに言及するとき、短縮された略語TRBVを使用することができる。同じく、γ及びδ鎖のTCR Vセグメントについても忠実であり、それぞれ、TRGV及びTRDVと呼ぶことができる。ヒトにおいて機能的であることが現在公知である45種のTRAVが、表1の2欄に挙げられ、一方、ヒトにおいて機能的であることが現在公知である48種のTRBVが、表2の2欄に挙げられる。
Figure 2023058626000002
Figure 2023058626000003
Figure 2023058626000004
Figure 2023058626000005
ある場合には、本明細書に記載される表1のプライマーを含有するプライマーセットを使用するとき、表1に挙げられるhTRAV38_2DV8_Fプライマーは、GGACCTGTGAGCATGGCATG (配列番号283)、GTTCAGATCAGAAGAGGAGGCTTC (配列番号284)、又はCTCAAGGTTCAGATCAGAAGAGGAG (配列番号285)で置き換えることができる。
ある場合には、本明細書に記載される表1のプライマーを含有するプライマーセットを使用するとき、表1に挙げられるhTRAV39_Fプライマーは、ATCTGAGTTTTCAGTGAACTGGACAG (配列番号286)、CTCCTAAATCTGAGTTTTCAGTGAACT (配列番号287)、又はCAAGGCTCCTAAATCTGAGTTTTCAGTG (配列番号288)で置き換えることができる。
ある場合には、本明細書に記載される表2のプライマーを含有するプライマーセットを使用するとき、表2に挙げられるhTRBV13_Fプライマーは、CACCCCAGGAGACCAGCAAC (配列番号289)、GGAGCAAAAGCCCTGCTTTCT (配列番号290)、又はAAACGGTGAGGAGGAGCAAAAG (配列番号291)で置き換えることができる。
ある場合には、本明細書に記載される表2のプライマーを含有するプライマーセットを使用するとき、表2に挙げられるhTRBV14_Fプライマーは、CTTGTAAGCTCCTTCTTCATCTGGAAATG (配列番号292)、CAGATTTGCTTTCCTTTTTCTCATAC (配列番号293)、又はTTACAGGGCCAAGAGACAGATTTG (配列番号294)で置き換えることができる。
マウスについて、本明細書において提供されるネステッド増幅法は、機能的であることが現在公知であるα鎖の全104種のVセグメント、及び機能的であることが現在公知であるβ鎖の全22種のVセグメントを増幅するように設計されたプライマーコレクションを含むことができる。マウスにおいて機能的であることが現在公知である104種のTRAVが、表3の2欄に挙げられ、一方、マウスにおいて機能的であることが現在公知である22種のTRBVが、表4の2欄に挙げられる。
Figure 2023058626000006
Figure 2023058626000007
Figure 2023058626000008
Figure 2023058626000009
任意の適当なプライマーコレクションを、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンドの増幅中に使用して、α及びβ鎖又はγ及びδ鎖核酸を含む核酸を増幅することができる。ある場合には、プライマーコレクションは、少なくとも1つのTRAV(又は少なくとも1つのTRGV)を増幅するように設計された少なくとも1つのフォワードプライマー、及び少なくとも1つのTRBV(又は少なくとも1つのTRGV)を増幅するように設計された少なくとも1つのフォワードプライマーを含み得る。ヒトについて、一般に、これは、フォワードプライマーコレクションが、少なくとも45種のフォワードTRAV特異的プライマー(ヒトにおける45種のTRAVのそれぞれについての1つ)及び少なくとも48種のフォワードTRBV特異的プライマー(ヒトにおける48種のTRBVのそれぞれについての1つ)を含むように設計され得ることを意味し、マウスについて、これは、フォワードプライマーコレクションが、少なくとも104種のフォワードTRAV特異的プライマー(マウスにおける104種のTRAVのそれぞれについての1つ)及び少なくとも22種のフォワードTRBV特異的プライマー(マウスにおける22種のTRBVのそれぞれの1つ)を含むように設計され得ることを意味する。例えば、ヒトについて、合計少なくとも93種のフォワードTRAV及びTRBVプライマーに関して、α鎖の可能性について、1番目のフォワードTRAVプライマーは、TRAV1-1を増幅するように設計され得、2番目のフォワードTRAVプライマーは、TRAV1-2を増幅するように設計され得、3番目のフォワードTRAVプライマーは、TRAV2を増幅するように設計され得、4番目のフォワードTRAVプライマーは、TRAV3を増幅するように設計され得、5番目のフォワードTRAVプライマーは、TRAV4を増幅するように設計され得るなどであり(例えば、表1に挙げられる標的TRAVを参照)、β鎖の可能性について、1番目のフォワードTRBVプライマーは、TRBV2を増幅するように設計され得、2番目のフォワードTRBVプライマーは、TRBV3を増幅するように設計され得、3番目のフォワードTRBVプライマーは、TRBV4-1を増幅するように設計され得、4番目のフォワードTRBVプライマーは、TRBV4
-2を増幅するように設計され得、5番目のフォワードTRBVプライマーは、TRBV4-3を増幅するように設計され得るなどである(例えば、表2に挙げられる標的TRBVを参照)。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中に、少なくとも1つのTRAV(又は少なくとも1つのTRGV)を増幅するように設計された少なくとも1つのフォワードプライマー及び少なくとも1つのTRBV(又は少なくとも1つのTRDV)を増幅するように設計された少なくとも1つのフォワードプライマーを使用して、αとβ鎖の可能性のある組合せ(又はγとδ鎖の可能性のある組合せ)を増幅する機会を持つとき、多数のプライマーを合成し、それぞれ単一の第1ラウンドの増幅反応に組み合わせることができる。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中に、ヒトの場合には少なくとも93種の異なるフォワードTRAV及びTRBVプライマーを使用して、単一細胞選別されたT細胞に存在するヒトαとβ鎖の可能性のある組合せ(例えば、表1及び2において挙げられる全てのTRAV及びTRBV)を増幅する機会を持つとき、多数のプライマー(すなわち、この場合には、少なくとも93種)を合成し、それぞれ単一の第1ラウンドの増幅反応に組み合わせることができる。ある場合には、フォワードプライマーの数は、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中に、単一細胞選別されたT細胞に存在するαとβ鎖の可能性のある組合せ(又はγとδ鎖の可能性のある組合せ)(例えば、表1及び2において挙げられる全てのTRAV及びTRBV)を増幅する能力を失うことなく、低減することができる。例えば、単一のフォワードTRAVプライマーは、1つより多くの異なるTRAVを増幅する能力を有するように設計することができる。ヒト用のそのようなプライマーの例は、hTRAV1_12_Fプライマー(表1のプライマー番号1)であり、TRAV1-2とTRAV1-2両方を増幅するように設計されている。ある場合には、単一のフォワードTRBVプライマーは、1つより多くの異なるTRBVを増幅する能力を有するように設計することができる。ヒト用のそのようなプライマーの例は、TRBV4-1、TRBV4-2、及びTRBV4-3を増幅するように設計されている、hTRBV4_123_Fプライマー(表2のプライマー番号3)、TRBV6-2とTRBV6-3両方を増幅するように設計されている、hTRBV6_23_Fプライマー(表2のプライマー番号8)、TRBV10-1とTRBV10-2両方を増幅するように設計されている、hTRBV10_12_Fプライマー(表2のプライマー番号14)、並びにTRBV12-3とTRBV12-4両方を増幅するように設計されている、hTRBV12_34_Fプライマー(表2のプライマー番号18)を含むがこれらに限定されない。
ある場合には、hTRAV1_12_Fプライマー、hTRBV4_123_Fプライマー、hTRBV6_23_Fプライマー、hTRBV10_12_Fプライマー、及びhTRBV12_34_Fプライマーを、これらの5種のプライマーにより標的とされないヒトTRAV及びTRBVのそれぞれについての他のプライマーと組み合わせて使用するとき、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中の、表1及び2に挙げられる全てのヒトTRAV及びTRBVを増幅するためのフォワードプライマーの数を、93種のフォワードプライマーから81種に減らすことができる。同様に、表3及び4に示される通り、単一のプライマーを使用して、表3並びに4に挙げられる複数のTRAV又はTRBVを標的とするとき、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中の、表3及び4に挙げられる全てのマウスTRAV並びにTRBVを増幅するためのフォワードプライマーの数を、126種のフォワードプライマーから64種に減らすことができる。
複数のTRAV配列(又は複数のTRBV、TRGV、若しくはTRDV配列)の配列アライメントを使用して、1つより多くの異なるTRAV(又は1つより多くの異なるTRBV、TRGV、若しくはTRDV)を増幅する能力を有する単一のフォワードTRAVプライマー(又は単一のフォワードTRBV、TRGV、若しくはTRDVプライマー)を選択することができる。例えば、図5を参照し、複数のTRAV(例えば、マウスTRAV13-1、TRAV13D-1、TRAV13N-1、TRAV13-2、TRAV13D-2、TRAV13N-2、TRAV13-3、TRAV13D-3、TRAV13N-3、TRAV13-4、TRAV13D-4、TRAV13N-4、及びTRAV13-5)について、ATG開始部位の上流の5'非翻訳領域の部分、ATG開始部位、並びにATG開始部位の下流の翻訳領域の部分のヌクレオチド配列を整列させることができる。整列されると、プライマーの配列、例えば、mTRAV13_Fについて図5の四角で強調された配列(配列番号99)が、選択され得る。ある場合には、整列されたTRAV配列(又は整列されたTRBV、TRGV、若しくはTRDV配列)のいずれかに関してミスマッチを欠くプライマー配列が選択され得る。図5に示される通り、ある場合には、整列されたTRAV配列(又は整列されたTRBV、TRGV、若しくはTRDV配列)に関して数個のミスマッチ(例えば、1つ又は2つのミスマッチ)を有するプライマー配列が選択され得る。例えば、図5に示される、TRAV13D-1、TRAV13-2、TRAV13D-2、TRAV13-3、TRAV13-4、TRAV13D-4、TRAV13N-4、及びTRAV13-5のそれぞれに関して1つのミスマッチを有し、他の5種のTRAVに関してミスマッチを有しない、mTRAV13_Fプライマー(配列番号99)が選択された。ほんの数個のミスマッチ(例えば、1つ又は2つのミスマッチ)でTRAV、TRBV、TRGV、又はTRDV配列を標的とするように設計されたそれらのプライマーについて、設計されたプライマーの、ミスマッチを有するその標的を増幅する能力は、その設計されたプライマー、リバースプライマー、及び標的を使用したPCR試験を介して確認され得る。増幅された標的核酸の首尾よい生成は、たとえそれがミスマッチを含有しても、その設計されたプライマーの、その標的を増幅する能力を確認することができる。
ある場合には、単一細胞選別されたT細胞に存在するヒトαとβ鎖の可能性のある組合せ(又はγとδ鎖の可能性のある組合せ)(例えば、表1及び2に挙げられる全てのTRAV及びTRBV)を増幅するためのプライマー調製物の数の低減が、達成され得る。例えば、単一のプライマー調製物は、それぞれが異なるTRAV又はTRBVを標的とする、2つ以上の配列の混合物を含有するように設計された様式で、合成され得る。例えば、表1のhTRAV8_246_Fプライマーは、5'-CCWCTGCTCAGCCATGCTC-3'(配列番号10)配列を用いて合成され得、TRAV8-2、TRAV8-4、及びTRAV8-6を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらす。他の例は、5'-CCAGGGCAGARAAGAATGATG-3'(配列番号14)配列を使用して合成して、TRAV12-1、TRAV12-2、及びTRAV12-3を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表1のhTRAV12_123_Fプライマー、5'-CAGAAYTCACTCGGCTCTTC-3'(配列番号44)配列を使用して合成して、TRBV5-4、TRBV5-6、及びTRBV5-8を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表2のhTRBV5_468_Fプライマー、5'-CYYCCTTGAGAGTCCTGTTC-3'(配列番号47)配列を使用して合成して、TRBV6-1、TRBV6-6、TRBV6-8、及びTRBV6-9を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表2のhTRBV6_1689_Fプライマー、5'-CCTCTGCTCCTGCTCAYAGTGA-3'(配列番号51)配列を使用して合成して、TRBV7-2及びTRBV7-4を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表2のhTRBV7_24_Fプライマー、5'-CAGTGACMCTGATCTGGTAAAG-3'(配列番号52)配列を使用して合成して、TRBV7-3、TRBV7-6、TRBV7-7、TRBV7-8、及びTRBV7-9を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表2のhTRBV7_36789_Fプライマー、並びに5'-TCCCACYTCCTCTGC-TCCTG-3'(配列番号56)配列を使用して合成して、TRBV11-1及びTRBV11-3を標的とする別々の配列を有するプライマー調製物をもたらし得る、表2のhTRBV11_13_Fプライマーを含むがこれらに限定されない。
ある場合には、ヒトについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用プライマーコレクションは、表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマー又は表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマーのサブセットを含み得る。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表1に記載のTRAVプライマーの1、5、10、20、30、35個以上を含み得るか、表2に記載のTRBVプライマーの1、5、10、20、30個以上を含み得るか、又は表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマーの1、5、10、20、30、40、50、60、70個以上を含み得る。ある場合には、ヒトについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマーを含み、Vα若しくはVβセグメントの配列、Vα若しくはVβセグメントのL配列、又はVα若しくはVβセグメントの上流の5'非翻訳領域の配列を有する他のプライマーを含み得ない。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中に、表1及び2に挙げられた72種のようなフォワードプライマー調製物の低減したセットを使用して、単一細胞選別されたT細胞に存在するヒトαとβ鎖の可能性のある組合せ(例えば、表1及び2に挙げられる全てのTRAV及びTRBV)を増幅するための機会を有することは、多くの異なる別々の場所にわたる(例えば、多くの異なるウェルにわたる)有効な増幅、及び有効な下流クローニングをもたらし得る(例えば、単一T細胞を含有する別々の場所の数に基づき80、85、90、又は95パーセントより高い成功)。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、単一T細胞から得られたcDNAの一部を鋳型として使用した本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を行うために使用されているそれぞれのサブセットを含む2つ以上のサブセットに分けることができる。ある場合には、ヒトについて、例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、単一T細胞から得られたcDNAの一部を鋳型として使用した本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を行うために使用されているそれぞれのサブセットを含む、2つ以上のサブセット(例えば、表1に挙げられるTRAVプライマーのみを含む第1のサブセット、及び表2に挙げられるTRBVプライマーのみを含む第2のサブセット、又は表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマーの第1のサブセット並びに表1及び2に記載のTRAV及びTRBVプライマーの第2のサブセット)に分けることができる。例えば、単一T細胞から得られたcDNAの一部を使用して、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表1に挙げられたプライマーを使用したTRAVについての第1ラウンドの増幅反応は、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表2に挙げられたプライマーでのTRBVについての第1ラウンドの増幅反応とは別に行われ得る。これらの別々の第1ラウンドの増幅反応の後に、ネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)の別々の第2ラウンドの増幅が続き得る。例えば、TRAVについて、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表5に挙げられるプライマーが使用され得、TRBVについて、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表6に挙げられるプライマーが使用され得る。ある場合には、同じ単一細胞についての別々の第1ラウンドの増幅反応物が、プールされ得、それらのプールされた混合物が、ネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)の第2ラウンドの増幅のための鋳型として使用され得る。例えば、単一T細胞から得られたcDNAの部分を使用して、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表1に挙げられたプライマーを使用したTRAVについての第1ラウンドの増幅反応が、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表2に挙げられたプライマーでのTRBVについての第1ラウンドの増幅反応とは別に行われ得、リバースプライマーと一緒に表5及び表6に挙げられるプライマーを使用したTRAVとTRBV両方についての1回の混合されたネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)が続く。
ある場合には、特異的TCRが、固有のTRAVとTRBVの組合せで同定される場合、CDR3領域内のバリアントは、1つ以上のリバースプライマーと一緒にその特定のTRAVに特異的な1つのフォワードプライマー(例えば、表1に挙げられるフォワードプライマーの1つ)及び1つ以上のリバースプライマーと一緒にその特定のTRBVに特異的な1つのフォワードプライマー(例えば、表2に挙げられるフォワードプライマーの1つ)を用いた第1ラウンドの増幅反応を使用して同定され得る。例えば、1つ以上のリバースプライマーと一緒に表1に挙げられたフォワードプライマーhTRAV8-246_F(配列番号10)及び1つ以上のリバースプライマーと一緒に表2に挙げられたフォワードプライマーhTRBV12-34_F(配列番号58)が、使用され得る。
ある場合には、TRAVのセットとTRBVのセットの組合せが増幅される場合、それらのTRAV及びTRBVに特異的な表1及び表2に挙げられたプライマーの一部のみが、使用され得る。
一実施形態において、表1において記載のTRAVプライマーの第1のサブセット(例えば、表1のフォワードプライマー番号1～36及び39～40)、表1において記載のTRAVプライマーの第2のサブセット(例えば、表1のフォワードプライマー番号37～38)、表2において記載のTRBVプライマーの第1のサブセット(例えば、表2のフォワードプライマー番号1～19及び22～32)、及び表2において記載のTRBVプライマーの第2のサブセット(例えば、表2のフォワードプライマー番号21～22)が、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅の4種の異なる組合せ(例えば、第1のTRAVサブセット＋第1のTRBVサブセット、第2のTRAVサブセット＋第1のTRBVサブセット、第1のTRAVサブセット＋第2のTRBVサブセット、及び第2のTRAVサブセット＋第2のTRBVサブセット)のTRAVについての1つ以上のリバースプライマー及びTRBVについての1つ以上のリバースプライマーと共に使用され得る。これらの場合には、生じた第1ラウンドの反応混合物は、ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅のため別々に、又はプールされた後に使用され得る。同様の技術が、表3及び4のマウスプライマーと共に、並びに/又は本明細書に記載される第2ラウンドの増幅のため使用され得る。
ある場合には、マウスについて、例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用プライマーコレクションは、表3及び4に記載のTRAV及びTRBVプライマー又は表3及び4に記載のTRAV及びTRBVプライマーのサブセットを含み得る。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表3に記載のTRAVプライマーの1、5、10、20、30、35個以上を含み得るか、表4に記載のTRBVプライマーの1、5、10、20、30個以上を含み得るか、又は表3及び4に記載のTRAV及びTRBVプライマーの1、5、10、20、30、40、50、60、70個以上を含み得る。ある場合には、マウスについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表3及び4に記載のTRAV及びTRBVプライマーを含み、Vα若しくはVβセグメントの配列、Vα若しくはVβセグメントのL配列、又はVα若しくはVβセグメントの上流の5'非翻訳領域の配列を有する他のプライマーを含み得ない。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅中に、表3及び4に挙げられた53種のようなフォワードプライマー調製物の低減したセットを使用して、単一細胞選別されたT細胞に存在するマウスαとβ鎖の可能性のある組合せ(例えば、表3及び4に挙げられる全てのTRAV及びTRBV)を増幅するための機会を有することは、多くの異なる別々の場所にわたる(例えば、多くの異なるウェルにわたる)有効な増幅、及び有効な下流クローニングをもたらし得る(例えば、単一T細胞を含有する別々の場所の数に基づき80、85、90、又は95パーセントより高い成功)。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションの一部又は全てのフォワードプライマーは、TCRをコードするcDNAの核酸に、1、2、又は3つ以下ミスマッチで(例えば、1つ以下のミスマッチで、2つ以下のミスマッチで、又は3つ以下のミスマッチで)アニーリングする配列から完全になることができる。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションの一部又は全てのフォワードプライマーの全核酸配列は、Vセグメント、VセグメントのL配列、又はVセグメントの上流に見られる5'非翻訳領域由来であり得る。そのような場合には、それらのフォワードプライマーは、外来性核酸配列、例えば、プライマーバーコード配列又はプライマーアダプター配列を欠き得る。それぞれのプライマーの配列が、TCRをコードするcDNAの核酸にアニーリングする配列から完全になる、本明細書に記載されるネステッド増幅反応の第1ラウンド用のフォワードVαプライマーコレクションの例が、図2Aの上部パネルにおいて模式的に示される。本明細書に記載されるネステッド増幅反応の第1ラウンド用のフォワードVβプライマーコレクションについての同じものが、図2Bの上部パネルにおいて示される。外来性の核酸配列を欠く、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションのフォワードプライマーを使用するとき、単一T細胞由来のTCRの可変鎖をコードする核酸の高度に有効な増幅が達成され得る。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションのそれぞれのフォワードプライマーは、TCRをコードするcDNAのVセグメントの上流に見られる5'非翻訳領域にアニーリングするように設計されているそのヌクレオチドの大部分を有する配列からなり得る。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションのそれぞれのフォワードプライマーの配列の全てが、5'非翻訳領域、5'非翻訳領域＋ATG開始部位、又は5'非翻訳領域＋ATG開始部位＋ATG開始部位の下流の5個以下のヌクレオチドにアニーリングするように設計され得る。表1に挙げられたプライマーコレクションは、それぞれのプライマーが、5'非翻訳領域、5'非翻訳領域＋ATG開始部位、又は5'非翻訳領域＋ATG開始部位＋ATG開始部位の下流の5個以下のヌクレオチドにアニーリングする本明細書に記載されるネステッド増幅反応の第1ラウンド用のフォワードVαプライマーコレクションの例であり、表2におけるプライマーコレクションは、それぞれのプライマーが、5'非翻訳領域、5'非翻訳領域＋ATG開始部位、又は5'非翻訳領域＋ATG開始部位＋ATG開始部位の下流の5個以下のヌクレオチドにアニーリングする本明細書に記載されるネステッド増幅反応の第1ラウンド用のフォワードVβプライマーコレクションの例である。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションの一部又は全てのフォワードプライマーは、プライマーバーコード配列及び/又はプライマーアダプター配列を含み得る(例えば、図3A及び3Bの上部パネルを参照)。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションの全てのフォワードプライマーは、5'プライマーアダプター配列、続いて、Vセグメント、VセグメントのL配列、及び/又はVセグメントの上流に見られる5'非翻訳領域を標的とするプライマー配列を有し得る(例えば、図3A及び3Bを参照)。これらの場合には、第1ラウンド由来の増幅産物を鋳型として使用する、ネステッド増幅反応の増幅の第2ラウンドは、第1ラウンド中に全ての増幅産物に付加されたアダプター配列に特異的な単一のフォワードプライマーを使用し得る(例えば、図3A及び3Bの中程のパネルを参照)。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンド用のフォワードプライマー由来の付加された5'アダプター配列を使用して、第1及び第2の増幅産物の発現ベクターへのクローニングを助けることができる。
本明細書において使用される、用語「プライマーバーコード配列」は、長さ少なくとも約15個のヌクレオチド(例えば、約15～約50個のヌクレオチド、約15～約40個のヌクレオチド、約15～約30個のヌクレオチド、約20～約50個のヌクレオチド、約20～約40個のヌクレオチド、又は約20～約30個のヌクレオチド)であり、産生された増幅産物が、増幅された鋳型配列と付加された同定可能なヌクレオチド配列両方を含むように、鋳型配列にアニーリングするように設計されたプライマー(例えば、PCRプライマー)配列に付加されている同定可能なヌクレオチド配列を指す。複数のフォーマットで多くの増幅反応を行うとき、それぞれ固有の場所(例えば、それぞれの反応混合物)で使用される少なくとも1つのプライマーは、使用者が、増幅産物を、プライマーバーコード配列の配列に基づきその特定の反応混合物に一致させることを可能にする固有のプライマーバーコード配列を含み得る。例えば、Vαセグメントを増幅するように設計されたプライマー対のフォワードプライマーは、場所番号1(例えば、ウェル番号1)において使用されるプライマー対についてVαセグメントに特異的なプライマーの5'末端に付加された5'-AAAA-3'配列を含み得、一方、同じVαセグメントを増幅するように設計されたプライマー対のフォワードプライマーは、場所番号2(例えば、ウェル番号2)において使用されるプライマー対についてVαセグメント特異的な同じプライマーの5'末端に付加された5'-TTTT-3'配列を含み得、同じVαセグメントを増幅するように設計されたプライマー対のフォワードプライマーは、場所番号3(例えば、ウェル番号3)において使用されるプライマー対についてVαセグメントに特異的な同じプライマーの5'末端に付加さられた5'-GGGG-3'配列を含み得るなどである。この場合には、プライマー配列に基づき増幅産物の適当な領域にAAAAを含むそのVαセグメントの任意の増幅産物は、場所番号1から生じたと同定され得る。本明細書において記載される通り、ある場合には、本明細書において提供されるTCRクローニング方法は、プライマーバーコード配列を含むことなく、可変領域配列を増幅するように設計されているプライマーを使用する工程を含むネステッド増幅法(例えば、ネステッドPCR法)を使用して行われ得る。
本明細書において使用される、用語「プライマーアダプター配列」は、長さ少なくとも約15個のヌクレオチド(例えば、約15～約50個のヌクレオチド、約15～約40個のヌクレオチド、約15～約30個のヌクレオチド、約20～約50個のヌクレオチド、約20～約40個のヌクレオチド、又は約20～約30個のヌクレオチド)であり、その産生された増幅産物が、増幅された鋳型配列と付加された公知のヌクレオチド配列両方を含むように、鋳型配列にアニーリングするように設計されたプライマー(例えば、PCRプライマー)配列に付加された公知のヌクレオチド配列を指す。ネステッド増幅反応を行うとき、ネステッド増幅法の初期の増幅ラウンド(例えば、ネステッドPCR法の第1ラウンド)中に使用される少なくとも1つのプライマーは、第1ラウンド由来のその付加されたプライマーアダプター配列にアニーリングするように設計されるネステッド増幅法の続くラウンド(例えば、ネステッドPCR法の第2ラウンド)用のプライマーを可能にする固定されたプライマーアダプター配列を含み得る。これは、使用者が、増幅された鋳型に、プライマーアダプター配列を有するプライマーを介して、その付加されたプライマーアダプター配列に対するプライマーを設計することにより、続く工程又は方法のため付加された、固定されたプライマーアダプター配列の利点を受け取ることを可能にする。本明細書において記載される通り、ある場合には、本明細書において提供されるTCRクローニング方法は、プライマーアダプター配列を含むことなく、可変領域配列を増幅するように設計されているプライマーを使用する工程を含むネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドを使用して行われ得る。
本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅のフォワードプライマー上のこれらの5'プライマーアダプター配列を使用しないとき(図2A及び2Bの上部パネルにおいて模式的に示される通り)、次に、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンド用のプライマーコレクションは、第1ラウンド用のフォワードプライマーのものと同様の様式で、TCRのそれぞれの可変鎖(例えば、それぞれのTRAV及びTRAB又はそれぞれのTRGV及びTRDV)に特異的なフォワードプライマーのセットを含むように設計され得る(例えば、図2A及び2Bの中程のパネルを参照)。例えば、第1ラウンドのフォワードプライマーが、鋳型として使用される元々のcDNAにおいて見られない余分な5'配列を増幅産物に付加することなく、様々な可能性のある可変鎖から増幅産物を生成するように設計されるとき、次に、第2ラウンド用のフォワードプライマーは、第1ラウンド中に生成されるそれらの増幅産物の5'部分を標的とするように設計され得る。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドのフォワードプライマーは、機能TCRをクローニングするために使用されるネステッド増幅反応の第1及び第2の増幅産物が、ATG開始部位を含むように、VセグメントのL配列のATG開始部位を含むか、又はそのATG開始部位の上流である第1ラウンドの増幅産物の配列を標的とするように設計され得る。ある場合には、ヒトについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用プライマーコレクションは、表5及び6に記載のTRAV及びTRBVプライマー又は表5及び6に記載のTRAV及びTRBVプライマーのサブセットを含み得る。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表5に記載のTRAVプライマーの1、5、10、20、30、35個以上を含み得るか、表6に記載のTRBVプライマーの1、5、10、20、30個以上を含み得るか、又は表5及び6に記載のTRAV及びTRBVプライマーの1、5、10、20、30、40、50、60、70個以上を含み得る。ある場合には、ヒトについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表5及び6に記載のTRAV及びTRBVプライマーを含み、Vα若しくはVβセグメントの配列、Vα若しくはVβセグメントのL配列、又はVα若しくはVβセグメントの上流の5'非翻訳領域の配列を有する他のプライマーを含み得ない。
Figure 2023058626000010
Figure 2023058626000011
Figure 2023058626000012
Figure 2023058626000013
Figure 2023058626000014
Figure 2023058626000015
ある場合には、マウスについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用プライマーコレクションは、表7及び8に記載のTRAV及びTRBVプライマー又は表7及び8に記載のTRAV及びTRBVプライマーセットのサブセットを含み得る。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表7に記載のTRAVプライマーの5、10、20、30、35個以上を含み得るか、表8に記載のTRBVプライマーの5、10、20、30個以上を含み得るか、又は表7及び8に記載のTRAV及びTRBVプライマーの5、10、20、30、40、50、60、70個以上を含み得る。ある場合には、マウスについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、表7及び8に記載のTRAV及びTRBVプライマーを含み、Vα若しくはVβセグメントの配列、Vα若しくはVβセグメントのL配列、又はVα若しくはVβセグメントの上流の5'非翻訳領域の配列を有する他のプライマーを含み得ない。
Figure 2023058626000016
Figure 2023058626000017
Figure 2023058626000018
Figure 2023058626000019
Figure 2023058626000020
Figure 2023058626000021
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、第1ラウンドの増幅から生じた増幅反応の一部を鋳型として使用した本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を行うために使用されているそれぞれのサブセットを含む2つ以上のサブセットに分けることができる。ある場合には、ヒトについて、例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、第1ラウンドの増幅から生じた増幅反応の一部を鋳型として使用した本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を行うために使用されているそれぞれのサブセットを含む、2つ以上のサブセット(例えば、表5及び6において記載のTRAV及びTRBVプライマーの第1のサブセット、並びに表5及び6において記載のTRAV及びTRBVプライマーの第2のサブセット)に分けることができる。ある場合には、マウスについて、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、第1ラウンドの増幅から生じた増幅反応の一部を鋳型として使用した本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を行うために使用されているそれぞれのサブセットを含む、2つ以上のサブセット(例えば、表7及び8において記載のTRAV及びTRBVプライマーの第1のサブセット並びに表7及び8において記載のTRAV及びTRBVプライマーセットの第2のサブセット)に分けることができる。同じ単一T細胞から得られたcDNAについてのネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)のこれらの別々の第2ラウンドの増幅の結果を組み合わせることができ、組合せを使用して、本明細書に記載される通り、発現ベクターをアセンブルすることができる。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンド用のフォワードプライマーは、プライマーバーコード配列及び/又はプライマーアダプター配列を含むように設計され得る(例えば、図2A及び2Bの中程のパネルを参照)。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションの全てのフォワードプライマーは、5'プライマーアダプター配列、続いて、Vセグメント、VセグメントのL配列、及び/又はVセグメントの上流に見られる5'非翻訳領域を標的とするプライマー配列を有し得る(例えば、図2A及び2Bを参照)。ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンド用のフォワードプライマー由来の付加された5'アダプター配列を使用して、第1及び第2の増幅産物の発現ベクターへのクローニングを助けることができる。ある場合には、表5～8において記載のプライマー配列のいずれか1つ以上は、例えば、図2A及び2Bに示される通り、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンド用のフォワードプライマーを作製するよう、示された配列の5'末端にプライマーアダプター配列を含むように設計され得る。例えば、表5及び6に記載の全てのプライマー配列は、示された配列の5'末端にプライマーアダプター配列を含むように設計され得る。
任意の適当なプライマーアダプター配列は、プライマー、例えば、第1ラウンドのプライマー、その場合には、プライマーアダプター配列は、本明細書に記載されるネステッド増幅法の第2ラウンドのフォワードプライマーの標的として、並びに第1及び第2の増幅産物の発現ベクターへのクローニングを助けるための重複配列として働き得る、又は第2ラウンドのプライマー、その場合には、プライマーアダプター配列は、第1及び第2の増幅産物の発現ベクターへのクローニングを助けるための重複配列として働き得る、に付加され得る。ある場合には、プライマーアダプター配列は、長さ約15～約50個のヌクレオチド(例えば、約15～約45個のヌクレオチド、約15～約40個のヌクレオチド、約15～約30個のヌクレオチド、約20～約50個のヌクレオチド、約20～約40個のヌクレオチド、又は約20～約30個のヌクレオチド)であり得る。本明細書に記載される通り使用され得るプライマーアダプター配列の例は、TTCAGGTGTCGTGAGGATCTATTTCCGGTG (配列番号260); GTGGAAGAAAACCCCGGTCCC (配列番号261); TCTCTAGGCGCCGG-AATTCA (配列番号262);及びTGGAAGAAAACCCCGGTCCC (配列番号263)を含むがこれらに限定されない。
本明細書に記載される通り、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、TRAV(又はTRGV)を標的とするためのフォワードプライマーのプール、及びTRBV(又はTRDV)を標的とするためのフォワードプライマーのプールを含み得る。そのようなプライマーコレクションは、フォワードプライマーのそれぞれのプールについて少なくとも1つのリバースプライマーを含み得る。例えば、αβTCR(又はγδTCR)について本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、TRAV(又はTRGV)の配列を有する増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)と、それらのフォワードTRAVプライマー(又はそれらのフォワードTRGVプライマー)の1つ以上と対形成するように設計された1つ以上のリバースプライマーのセット、TRBV(又はTRDV)の配列を有する増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)と、それらのフォワードTRBVプライマー(又はそれらのフォワードTRDVプライマー)の1つ以上と対形成するように設計された1つ以上のリバースプライマーのセットを含み得る。一般に、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクション内の1つ以上のフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)と対形成するように設計されたリバースプライマーは、α鎖のC領域の配列(又はγ鎖のC領域の配列)に特異的であるように設計され得る。ある場合には、1つのCα(若しくはCγ)リバースプライマー又は1つより多くのCα(又はCγ)リバースプライマー(例えば、2、3、4、5つ以上のCα(若しくはCγ)リバースプライマー)は、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンドの増幅のため使用され得る。同様に、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクション内の1つ以上のフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)と対形成するように設計されたリバースプライマーは、β鎖のC領域の配列(又はδ鎖のC領域の配列)に特異的であるように設計され得る。ある場合には、1つのCβ(若しくはCδ)リバースプライマー又は1つより多くのCβ(又はCδ)リバースプライマー(例えば、2、3、4、5つ以上のCβ(若しくはCδ)リバースプライマー)は、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1ラウンドの増幅のため使用され得る。
ある場合には、αβTCR(又はγδTCR)について本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、TRAV(又はTRGV)の配列を有する増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)のセットと、それらのフォワードTRAVプライマー(又はそれらのフォワードTRGVプライマー)のそれぞれと対形成するように設計された単一のリバースプライマー、TRBV(又はTRDV)の配列を有する増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)のセットと、それらのフォワードTRBVプライマー(又はそれらのフォワードTRDVプライマー)のそれぞれと対形成するように設計された単一のリバースプライマーを含み得る。
一般に、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅用のプライマーコレクションについてのリバースプライマーは、その標的とされたC領域の最も5'のヌクレオチドから約15ヌクレオチド～約550ヌクレオチド(例えば、約15ヌクレオチド～約500ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約450ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約300ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約200ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約100ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約50ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約550ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約450ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約300ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約200ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約100ヌクレオチド、又は約20ヌクレオチド～約50ヌクレオチド)であるC領域に特異的であるように設計され得る。例えば、Cαリバースプライマーは、Cα領域の約ヌクレオチド15～約ヌクレオチド450であるヌクレオチド配列に特異的であるように設計され得る。ヒト及びマウスについて、そのようなCαリバースプライマーの例は、表9に記載のCαリバースプライマーを含むがこれらに限定されない。Cβリバースプライマーは、Cβ領域の約ヌクレオチド15～約ヌクレオチド550であるヌクレオチド配列に特異的であるように設計され得る。ヒト及びマウスについて、そのようなCβリバースプライマーの例は、表10に記載のCβリバースプライマーを含むがこれらに限定されない。
Figure 2023058626000022
Figure 2023058626000023
本明細書に記載される通り、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、例えば、プライマーアダプター配列が、例えば、図2A及び2Bにおいて示される通り、第1ラウンド中に使用されないとき、TRAV(又はTRGV)を標的とするためのフォワードプライマーのプール、及びTRBV(又はTRDV)を標的とするためのフォワードプライマーのプールを含み得る。そのようなプライマーコレクションは、フォワードプライマーのそれぞれのプールについて少なくとも1つのリバースプライマーを含み得る。例えば、αβTCR(又はγδTCR)について本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、TRAV(又はTRGV)の配列を有する第1の増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)と、それらのフォワードTRAVプライマー(又はそれらのフォワードTRGVプライマー)の1つ以上と対形成するように設計された1つ以上のリバースプライマーのセット、TRBV(又はTRDV)の配列を有する第2の増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)と、それらのフォワードTRBVプライマー(又はそれらのフォワードTRDVプライマー)の1つ以上と対形成するように設計された1つ以上のリバースプライマーのセットを含み得る。一般に、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクション内の1つ以上のフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)と対形成するように設計されたリバースプライマーは、α鎖のC領域の配列(又はγ鎖のC領域の配列)に特異的であるように設計され得る。ある場合には、1つのCα(若しくはCγ)リバースプライマー又は1つより多くのCα(若しくはCγ)リバースプライマー(例えば、2、3、4、5つ以上のCα(若しくはCγ)リバースプライマー)は、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンドの増幅のため使用され得る。同様に、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクション内の1つ以上のフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)と対形成するように設計されたリバースプライマーは、β鎖のC領域の配列(又はδ鎖のC領域の配列)に特異的であるように設計され得る。ある場合には、1つのCβ(若しくはCδ)リバースプライマー又は1つより多くのCβ(若しくはCδ)リバースプライマー(例えば、2、3、4、5つ以上のCβ(若しくはCδ)リバースプライマー)は、αβTCR(又はγδTCR)について、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第2ラウンドの増幅のため使用され得る。
ある場合には、αβTCR(又はγδTCR)について本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、TRAV(又はTRGV)の配列を有する第1の増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRAVプライマー(又はフォワードTRGVプライマー)のセットと、それらのフォワードTRAVプライマー(又はそれらのフォワードTRGVプライマー)のそれぞれと対形成するように設計された単一のリバースプライマー、TRBV(又はTRDV)の配列を有する第2の増幅産物を生成するための、本明細書に記載されるフォワードTRBVプライマー(又はフォワードTRDVプライマー)のセットと、それらのフォワードTRBVプライマー(又はそれらのフォワードTRDVプライマー)のそれぞれと対形成するように設計された単一のリバースプライマーを含み得る。
一般に、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンド増幅用のプライマーコレクションについてのリバースプライマーは、その標的とされたC領域の最も5'のヌクレオチドから約15ヌクレオチド～約550ヌクレオチド(例えば、約15ヌクレオチド～約500ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約450ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約300ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約200ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約100ヌクレオチド、約15ヌクレオチド～約50ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約550ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約450ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約300ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約200ヌクレオチド、約20ヌクレオチド～約100ヌクレオチド、又は約20ヌクレオチド～約50ヌクレオチド)であるC領域に特異的であるように設計され得る、但し、それは、完全なネステッド増幅法が使用されるとき、第1ラウンド用に使用されたリバースプライマーの部位内にある。ある場合には、本明細書に記載されるネステッド増幅法は、半ネステッドであり得、その場合には、増幅の第1及び第2ラウンド用のリバースプライマーの1つ以上が同じであり得る。例えば、Cαリバースプライマーは、第1ラウンドのため使用されるリバースプライマーが、完全なネステッド増幅法においてCα領域の約ヌクレオチド40～約ヌクレオチド70である配列に特異的であるように設計されたとき、Cα領域の約ヌクレオチド1～約ヌクレオチド30であるヌクレオチド配列に特異的であるように設計され得る。ヒト及びマウスについて、そのようなCαリバースプライマーの例は、表11に記載のCαリバースプライマーを含むがこれらに限定されない。Cβリバースプライマーは、Cβ領域の約ヌクレオチド1～約ヌクレオチド549であるヌクレオチド配列に特異的であるように設計され得る、但し、その部位は、完全なネステッド増幅法において第1ラウンド中に使用されるリバースプライマーの部位内である。ヒト及びマウスについて、そのようなCβリバースプライマーの例は、表12に記載のCβリバースプライマーを含むがこれらに限定されない。
Figure 2023058626000024
Figure 2023058626000025
また本明細書に記載される通り、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅用のプライマーコレクションは、(a)例えば、図3Aに示される通り、プライマーアダプター配列が、第1ラウンド中に使用されるとき、第1ラウンド中にTRAV(又はTRGV)増幅産物に付加されたプライマーアダプター配列を標的とするように設計された1つ以上のフォワードプライマー、(b)(a)の1つ以上のフォワードプライマーと対形成するための1つ以上のリバースプライマー、(c)例えば、図3Bに示される通り、プライマーアダプター配列が、第1ラウンド中に使用されるとき、第1ラウンド中にTRBV(又はTRDV)増幅産物に付加されたプライマーアダプター配列を標的とするように設計された1つ以上のフォワードプライマー、及び(d)(c)の1つ以上のフォワードプライマーと対形成するための1つ以上のリバースプライマーを含み得る。
一実施形態において、表1のフォワードプライマーと対形成するためのリバースプライマーとしての表9のhTRACプライマー、及び表2のフォワードプライマーと対形成するためのリバースプライマーとしての表10のhTRBCプライマーと一緒に、表1及び2に記載のプライマーを含むプライマーコレクションを使用する、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅が、行われ得る(例えば、図2A及び2Bの上部パネルを参照)。この第1ラウンドの増幅産物は、第2ラウンドの増幅における鋳型として使用され得る。(5'末端でプライマーアダプター配列を付加された)表5に記載のプライマー、(表5のプライマーと共に使用されるアダプター配列と異なる5'末端でプライマーアダプター配列を付加された)表6において見られるプライマー、表5のフォワードプライマーと対形成するためのリバースプライマーとしての表11のhTRACnプライマー、及び表6のフォワードプライマーと対形成するためのリバースプライマーとしての表12のhTRBCnプライマーを含むプライマーコレクションを使用する、第2ラウンドが行われ得る(例えば、図2A及び2Bの中程のパネルを参照)。この第2ラウンドの増幅は、アダプター配列、Vαセグメントの全L配列、Vαセグメント、Jαセグメント、及びCα領域の5'部分を含む第1の増幅産物、並びに異なるアダプター配列、Vβセグメントの全L配列、Vβセグメント、Dβセグメント、Jβセグメント、及びCβ領域の5'部分を含む第2の増幅産物をもたらし得る(例えば、図2A及び2Bの下パネルを参照)。第1及び第2の増幅産物を、本明細書に記載される通り使用して、単一T細胞からクローニングされた機能的TCRを発現する能力を有する発現ベクターをアセンブルすることができる。
任意の適当なポリメラーゼ酵素(例えば、熱安定性ポリメラーゼ酵素)を使用して、本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2ラウンドを行うことができる。本明細書に記載される通り使用され得るポリメラーゼ酵素の例は、Taq DNAポリメラーゼ(ThermoFisher Scientificから市販されている)、Phusion DNAポリメラーゼ(ThermoFischer Scientificから市販されている)、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ(Agilentから市販されている)、Q5 High Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabsから市販されている)、及びMyFi DNAポリメラーゼ(Biolineから市販されている)を含むものであったがこれらに限定されない。本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2ラウンドを行うための他の成分は、適当なポリメラーゼ緩衝液、MgCl2、DMSO、及びdNTPを含み得るがこれらに限定されない。
本明細書において提供されるネステッド増幅反応の第1及び/又は第2ラウンドは、鋳型を熱安定性ポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)と、本明細書に記載されるプライマーコレクション、dNTP、及び任意選択で界面活性剤(例えば、非変性界面活性剤)の存在下で接触させること、並びに反応混合物を熱サイクル条件、例えば、98℃、1分間、53℃、30秒間、及び72℃、40秒間の40サイクルにかけることにより、行われ得る。
ある場合には、本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1及び/又は第2ラウンドのフォワードプライマーは、それらのVセグメントのL配列を増幅することなく、Vセグメントの増幅物を標的とするように設計され得る。そのような場合には、異種性リーダー配列を、それらのVセグメントのL配列の代わりに使用して、細胞の表面上のクローニングされたTCRの発現を促進することができる。そのような異種性リーダー配列は、増幅法中、及び/又は発現ベクターのアセンブリの間にもたらされ得る。本明細書に記載される通り使用され得る異種性リーダー配列の例は、マウスTRAVについてMLTASLLRAVIASICVVSSM(配列番号317)配列、マウスTRBVについてMSTRLLCWMALCLLGALS(配列番号318)配列、ヒトTRAVについてMLQMWGFVLYLFLMVGAA(配列番号319)配列、及びヒトTRBVについてMWQFCILCLCVLMASVAT(配列番号320)配列をコードするリーダー配列を含むがこれらに限定されない。
Vαセグメント(又はVγセグメント)を含有する第1の増幅産物、例えば、Vαセグメントの全L配列、Vαセグメント、Jαセグメント、及びCα領域の5'部分を含有する第1の増幅産物、並びにVβセグメント(又はVδセグメント)を含有する第2の増幅産物、例えば、Vβセグメントの全L配列、Vβセグメント、Dβセグメント、Jβセグメント、及びCβ領域の5'部分を含有する第2の増幅産物(例えば、図2A、2B、3A又は3Bの下パネルを参照)が生成されると、それらは、単一のT細胞供給源に存在するαとβ可変領域の組合せ(又はγとδ可変領域の組合せ)を有する機能的TCRが発現されるような様式で、発現ベクターにクローニングされ得る。
任意の適当なクローニング技術を使用して、単一T細胞からクローニングされた機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターをアセンブルすることができる。ある場合には、クローニング工程は、制限酵素を使用することなく、第1及び第2の増幅産物を得るポイントから、単一T細胞かクローニングされたら機能的TCRを発現する能力を有するアセンブルされた発現ベクターを得るポイントまで行われ得る。そのような場合には、クローニング技術は、本明細書において「シームレス」クローニング技術として言及され得る。単一T細胞からクローニングされた機能的TCRを発現するように設計された発現ベクターを作製する様式で、第1の増幅産物を完全なα(又はγ)鎖(例えば、全長L配列、全長Vαセグメント、全長Jαセグメント、及び全長Cα領域)に配置し、第2の増幅産物を完全なβ(又はδ)鎖(例えば、全長L配列、全長Vβセグメント、全長Dβセグメント、全長Jβセグメント、及び全長Cβ領域)に配置するため使用され得るシームレスクローニング技術の例は、エキソヌクレアーゼベースのクローニング技術、例えば、ギブソンアセンブリ技術、High-5アセンブリ技術、並びにライゲーション非依存性クローニング(LIC)技術及びエキソヌクレアーゼ非依存性クローニング技術、例えば、ゴールデンゲートアセンブリ技術及びユニベクタープラスミド融合アセンブリ技術を含むがこれらに限定されない。
図1を参照し、ギブソンアセンブリ技術を、本明細書において提供されるネステッド増幅反応由来の第1及び第2の増幅産物、別々のクローニングフラグメント、並びに第1及び第2の増幅産物を受け取るように設計された発現ベクターを使用して行われ得る。ある場合には、第1の増幅産物は、第1の増幅産物を受け取るよう調製された発現ベクターの一部と重複する5'配列を有するように設計され得る。この5'重複配列は、本明細書に記載される通り、プライマーアダプター配列を介して、第1の増幅産物に付加され得る。第1の増幅産物はまた、別々のクローニングフラグメントの5'部分と重複する3'配列を有するように設計され得る。例えば、第1の増幅産物のCα(又はCγ)の3'部分は、別々のクローニングフラグメントのCα(又はCγ)の5'部分と重複し得る。ある場合には、図1に示される通り、例えば、この別々のクローニングフラグメントは、第1の増幅産物に欠けている全長α鎖(又はγ鎖)の任意の3'部分をもたらすように設計され得る。図1の場合には、別々のクローニングフラグメントは、Cα領域の残部を提供している。
第2の増幅産物は、第2の増幅フラグメントが、別々のクローニングフラグメントに結合し得るように、別々のクローニングフラグメントの3'配列と重複する5'配列を有するように設計され得る。第2の増幅産物のこの5'重複配列は、本明細書に記載される通り、プライマーアダプター配列を介して、第2の増幅産物に付加され得る。第2の増幅産物はまた、第2の増幅産物を受け取るよう調製された発現ベクターの一部と重複する3'配列を有するように設計され得る。図1に示す通り、発現ベクターのこの部分は、第2の増幅産物に欠いている全長β鎖(又はδ鎖)の任意の3'部分をもたらすように設計され得る。図1の場合には、第2の増幅産物を受け取るための発現ベクターは、Cβ領域の残部をもたらしている。
例えば、図1に示される通り、本明細書において提供されるネステッド増幅反応由来の第1及び第2の増幅産物、別々のクローニングフラグメント、並びにそれぞれが重複配列を有する、第1及び第2の増幅産物を受け取るよう調製された発現ベクターを、ギブソンアセンブリを行うための5'エキソヌクレアーゼ酵素、DNAポリメラーゼ酵素、及びDNAリガーゼ酵素と一緒にインキュベートするとき、別々のクローニングフラグメントに続く第1の増幅産物、続いて、第2の増幅産物及び次に、ベクター配列を有する、アセンブルされた発現ベクターが産生され得る。
ある場合には、第1の増幅産物の上流のベクター配列は、TCRのα鎖(又はγ鎖)をコードするアセンブルされた核酸の発現を駆動するように設計されたプロモーター配列であり得る。任意のタイプのプロモーター配列が使用され得る。使用され得るプロモーター配列の例は、高発現のためのCMVプロモーター配列、高発現のためのMCSVプロモーター配列、中程度の発現のためのE1Faプロモーター配列、中程度の発現のためのPGKプロモーター配列、及び低発現のためのUbCプロモーター配列を含むがこれらに限定されない。
ある場合には、別々のクローニングフラグメントは、自己切断ペプチド、例えば、2Aペプチドを、それらが、アセンブルされたベクターにおいてα鎖(又はγ鎖)をコードする核酸とβ鎖(又はδ鎖)をコードする核酸の間に位置するように、コードするように設計され得る。これらの場合には、1つのみのプロモーターが、αとβ鎖(又はγとδ鎖)両方の発現を駆動することが必要とされる。本明細書に記載される通り使用され得る2Aペプチドの例は、口蹄疫ウイルスの2Aペプチド、ウマの鼻炎Aウイルスの2Aペプチド、ゾーシーア・シグナ(Thosea asigna)ウイルスの2Aペプチド、及びブタのテッショウウイルス-1の2Aペプチドを含むがこれらに限定されない。例示的な2Aポリペプチドのアミノ酸配列が、表13において提供される。クローニングされたヒト又はマウスTCRを発現する発現ベクターを得るために、本明細書において提供されるギブソンアセンブリ技術において使用され得る別々のクローニングフラグメントの例は、表14に記載のものを含むがこれらに限定されない。ある場合には、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする配列(例えば、2Aペプチドをコードする配列)の上流に含まれ得る。そのようなリンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする配列のリーディングフレームを維持する長さを有し得る。例えば、リンカーは、長さ約3～約45個のヌクレオチド(例えば、27個のヌクレオチド)であり得る。
Figure 2023058626000026
Figure 2023058626000027
自己切断ペプチド、例えば、2Aペプチドを使用するとき、発現ベクターは、α鎖(又はγ鎖)、続いて、自己切断ペプチド(例えば、2Aペプチド)、続いて、β鎖(又はδ鎖)をコードする転写物の転写をもたらし得る。これらの転写物の翻訳中、成長していくポリペプチドは、β鎖(又はδ鎖)に向けて翻訳を継続しながら、2Aペプチドで切断され得る。マルチシストロン単位としてα及びβ鎖(又はγ及びδ鎖)を発現する発現ベクターを設計するとき、2つのTCR鎖及び自己切断ペプチド(例えば、2Aペプチド)をコードする核酸は、それらが、互いと翻訳フレーム内にあるように、設計され得る。
ある場合には、配列内リボソーム進入部位(IRES)は、自己切断ペプチドの代わりに使用され得る。IRES配列の例は、脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRES(例えば、IRES2)、C型肝炎ウイルス(HCV)IRES、ピコルナウイルスIRES、及びペスチウイルスIRESを含むがこれらに限定されない。
ある場合には、別々のプロモーター配列が、自己切断ペプチド又はIRESの代わりに使用され得る。これらの場合には、あるプロモーター配列が、α鎖(又はγ鎖)の発現を駆動し得、別のプロモーター配列が、β鎖(又はδ鎖)の発現を駆動し得る。これらの2つのプロモーター配列は、同じであり得るか、又は異なり得る。
任意の適当な5'エキソヌクレアーゼ酵素、DNAポリメラーゼ酵素、及びDNAリガーゼ酵素を使用して、本明細書において提供されるギブソンアセンブリ技術を行うことができる。本明細書に記載される通り使用され得る5'エキソヌクレアーゼ酵素の例は、T5エキソヌクレアーゼ(New England Biolabsから市販されている)を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される通り使用され得るDNAポリメラーゼ酵素の例は、Phusion DNAポリメラーゼ(ThermoFisher Scientificから市販されている)、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ(Agilentから市販されている)、及びQ5 High Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabsから市販されている)を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される通り使用され得るDNAリガーゼ酵素の例は、T4 DNAリガーゼ(ThermoFischer Scientificから市販されている)、T3 DNAリガーゼ(New England Biolabsから市販されている)、T7 DNAリガーゼ(New England Biolabsから市販されている)、及びHiFi Taq DNAリガーゼ(New England Biolabsから市販されている)を含むがこれらに限定されない。本明細書において提供されるギブソンアセンブリ技術を行うための他の成分は、dNTPS、MgCl2、DTT、PEG-8000、及びNADを含み得るがこれらに限定されない。
一般に、ギブソンアセンブリ技術を使用して、重複配列を有する任意の適当な2本鎖DNAフラグメントを連結することができる。簡単に言うと、5'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、5'末端を分解していく（chews back）。重複配列がアニーリングするとき、DNAポリメラーゼが、3'末端から伸長する配列を埋め、DNAリガーゼがニックをふさぎ、これにより、2つの重複フラグメントを連結する。
本明細書において提供されるギブソンアセンブリ技術は、第1及び第2の増幅産物、別々のクローニングフラグメント、並びにそれぞれが本明細書に記載されるそれらの重複配列を有する、調製されたベクター(例えば、挿入を受け取るよう開かれたベクター)を、5'エキソヌクレアーゼ活性、DNAポリメラーゼ活性、及びDNAリガーゼ活性を有する酵素と、dNTPS、MgCl2、DTT、PEG-8000、及びNADを含有する反応混合物の存在下で接触させること、並びに反応混合物を、約40～約60℃(例えば、約45～約55℃、約48～約52℃、又は約50℃で)の等温で、約10～約120分間(例えば、約10～約90分間、約10～約60分間、約10～約45分間、約15～約90分間、約15～約60分間、又は約15～約45分間)インキュベートすることにより、行われ得る。
ある場合には、制限酵素クローニングを使用して、両方が発現されるような様式で、発現ベクター内に、第1の増幅産物を完全なα(又はγ)鎖(例えば、全長L配列、全長Vαセグメント、全長Jαセグメント、及び全長Cα領域)に配置し、第2の増幅産物を、完全なβ(又はδ)鎖(例えば、全長L配列、全長Vβセグメント、全長Dβセグメント、全長Jβセグメント、及び全長Cβ領域)に配置することができる。例えば、制限酵素クローニングを使用して、プロモーター配列、続いて、α鎖(若しくはγ鎖)をコードする核酸、続いて、自己切断ペプチド(若しくはIRES)をコードする核酸、又は第2のプロモーター配列の核酸、続いて、β鎖(若しくはδ鎖)をコードする核酸を有する発現ベクターをアセンブルすることができる。
本明細書において提供される発現ベクター並びにそれらの発現ベクターをアセンブルするために使用される成分(例えば、第1及び第2の増幅産物)の配置を記載するとき、α鎖(又はγ鎖)は、β鎖(又はδ鎖)の上流にあるとして記載される。発現ベクターは、α及びβ鎖(又はγ及びδ鎖)をいずれかの順で発現するように設計され得るので、これは要件ではない。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列が、β鎖(若しくはδ鎖)をコードする核酸、続いて、自己切断ペプチド(若しくはIRES)をコードする核酸、又は第2のプロモーター配列の核酸、続いて、α鎖(若しくはγ鎖)をコードする核酸で始まる転写物の発現を駆動するように、本明細書において提供される方法及び材料を使用して構築され得る。
ポリペプチド発現を駆動するように設計された任意の適当なベクターを使用して、本明細書において提供される発現ベクターをアセンブルすることができる。例えば、レンチウイルスベクターを使用して、本明細書に記載される通り、単一T細胞からクローニングされる機能的TCRを発現する能力を有する発現ベクターを作製することができる。本明細書に記載される発現ベクターを作製するために使用され得る他のベクターは、ウイルスベースのベクター、例えば、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、若しくはレトロウイルスベクター、又は標的細胞に導入され得る他のDNA若しくはRNA細胞発現ベクターを含むがこれらに限定されない。ある場合には、レンチウイルスベクター、例えば、pLVX-IRES(Clontechから市販されている)又はレトロウイルスベクター、例えば、pMIG II(Addgeneから市販されている)を使用して、本明細書に記載される通り、単一T細胞からクローニングされる機能TCRを発現する能力を有する発現ベクターをアセンブルすることができる。
本明細書に記載される通り、発現ベクターが、単一T細胞からクローニングされたTCRについての配列を含むようアセンブルされると、そのベクターを使用して、それ自体のさらなるコピーを作製することができる。例えば、細菌を形質転換して、アセンブルされた発現ベクターを複製することができる。そのような場合には、発現ベクターは、細菌の複製起源を含むように設計され得る。
本明細書において提供されるアセンブルされた発現ベクターを使用して、任意の適当な方法を使用して、目的のTCRについてクローニングされたTCRをスクリーニングすることができる。例えば、図4に示される方法を行い、本明細書において提供されるクローニングされたTCRをスクリーニングすることができる。
ある場合には、それぞれのアセンブルされた発現ベクターは、発現ベクターのそれぞれの核酸調製物が、単一T細胞についてであるように、個々に拡大され得る。これらの場合には、例えば下流のTCRスクリーニング及び解析に基づき、目的のものであると同定された任意の特定のTCRは、そのTCRについての核酸調製物に遡ることができる。
ある場合には、2つ以上(例えば、何十、何百、何千個以上)のアセンブルされた発現ベクターが、プールされ、プールとして拡大され得る。これらの場合には、プールされた核酸を使用して、クローニングされたTCRのいずれかを発現する細胞のプールの下流スクリーニング及び解析を行うことができる。目的の特定のTCRを発現すると同定されたそれらの細胞が単離され、その細胞内に含有される特定の発現ベクター(又はTCRをコードする核酸の全て若しくは一部)が、回収され得る。例えば、一実施形態において、それぞれが単一T細胞からクローニングされた特定のTCRをコードする、本明細書において提供される異なる発現ベクターのプールは、それぞれの細胞をトランスフェクトして、それが受け取る発現ベクターによりそれにもたらされるTCRを発現するように、細胞(例えば、天然のTCRを欠く細胞)の集団に送達され得る。次に、異なるクローニングされたTCRを発現する細胞のプールを評価して、目的のTCRを発現する細胞を同定することができる。目的のTCRを発現しているそれらの細胞を単離することができる。単離されると、細胞は、TCRの同一性を決定するために評価され得る。例えば、核酸配列決定を行って、TCRを同定することができる。ある場合には、TCRをコードする核酸が、単離された細胞から単離され得る。例えば、1回以上の増幅反応(例えば、PCR)を行い、TCRの全て又は一部をコードする核酸を含む1つ以上の増幅産物を得ることができる。
本明細書において提供される方法及び材料は、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現する能力を有する発現ベクターを得ることに焦点を当てながら記載される。ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、そのベクターが発現ベクターである必要がないことを除き、本明細書に記載されるTCRをコードするベクターを産生するように設計される様式で行われ得る。例えば、クローニングベクター、例えば、pUC19又はPCR TOPOベクターを使用して、本明細書に記載される、α鎖(又はγ鎖)、β鎖(又はδ鎖)、並びに任意選択で自己切断ペプチド(若しくはIRES)及び/又はプロモーター配列をコードする核酸構築物をアセンブルすることができる。そのような場合には、発現が後に望まれるなら、アセンブルされた構築物は、クローニングベクターから発現ベクターに移され得る。発現が望まれないなら、次に、アセンブルされた構築物を含有するベクターが、そのまま使用され得る。例えば、核酸配列決定を、そのようなベクターを使用して行い、単一T細胞から得られた対形成したα及びβ鎖(又はγ及びδ鎖)についての配列情報を得ることができる。ある場合には、核酸配列決定を、本明細書に記載される第1及び/又は第2の増幅産物を使用して行い、単一T細胞から得られたα及び/又はβ鎖(又はγ及び/若しくはδ鎖)についての配列情報を得ることができる。
本明細書において提供される方法及び材料は、α及びβ(又はγ及びδ)C領域を含有するクローニングされたTCRを発現する能力を有する発現ベクターを得ることに焦点を当てながら記載される。ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、異なるシグナル伝達ドメイン又は発現されている可溶性TCRをもたらすドメインが付加されることを除き、本明細書に記載される、TCRをコードするベクター(例えば、発現ベクター)を産出するように設計された様式で行われ得る。ある場合には、本明細書において提供される方法及び材料は、α及び/又はβ(又はγ及び/若しくはδ)C領域の全て又は一部が、異なるシグナル伝達ドメインで、又は発現されている可溶性TCRをもたらすドメインで置き換えられることを除き、本明細書に記載される、TCRをコードするベクター(例えば、発現ベクター)を産生ように設計された様式で行われ得る。例えば、本明細書において提供されるベクター(例えば、発現ベクター)は、シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3-ゼータシグナル伝達ドメイン)をコードする核酸が、クローニングされ、定常領域とインフレームで付加されたTCRのα又はβ(又はγ若しくはδ)C領域の停止コドンと置き換わるように、アセンブルされ得る。本明細書において提供されるクローニングされたTCRのα及び/又はβ(又はγ及び/若しくはδ)C領域の全て又は一部に付加され得るか、或いはその代わりに使用され得るシグナル伝達ドメインの例は、CD3-ゼータシグナル伝達ドメイン(Ohnoら、The EMBO Journal、12:4357～66ページ(1993);Exley etら、Journal Biol. Chem.、269:15140～6ページ(1994);及びMaherら、Nat. Biotechnol.、20:70～5ページ(2002))、CD28シグナル伝達ドメイン(Maherら、Nat. Biotechnol.、20:70～5ページ(2002);及びTianら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、112:E1594～603ページ(2015))、同時刺激性TNFRファミリーシグナル伝達ドメイン(例えば、OX-40、4-1BB、CD30、CD27、及びGITRシグナル伝達ドメイン;Archら、Mol. Cell. Biol.、18:558～65ページ(1998);Croft、Cytok. Growth Factor Rev.、14:265～73ページ(2003);及びWatts、Ann. Rev. Immunol.、23:23～68ページ(2005))、CD278シグナル伝達ドメイン(Bertramら、Eur. J. Immunol.、32:3376～85ページ(2002);及びGigouxら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、106:20371～6ページ(2009))、並びにそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。個々に又は組合せで、発現されている可溶性TCRをもたらす能力を有し、クローニングされたTCRのα及び/又はβ(又はγ及び/若しくはδ)C領域(又はその一部)を置き換えるために使用され得るか、或いはクローニングされたTCRのC領域に付加され得るドメイン及び/又は変異の例は、α及び/又はβ(又はγ及び/若しくはδ)C領域に置かれたビオチン化標的モチーフ(Laugelら、J. Biol. Chem.、280:1882～92ページ(2005))、C領域の1つ又は両方の代わりの1つ以上のIgドメイン、さらなるシステイン残基がαとβ(又はγとδ)C領域両方で発現されるような、C領域配列の変異(Laugelら、J. Biol. Chem.、280:1882～92ページ(2005))、定常領域の1つ又は両方の膜貫通及び細胞内ドメインの欠失、α及びβC領域に付加されたJun-ジッパードメイン、並びにγ及びδC領域に付加されたFos-ジッパードメイン(Willcoxら、Protein Sci.、8:2418～23ページ(1999))を含むがこれらに限定されない。ある場合には、FLAGタグ又はHisタグを、C領域の1つ又は両方に付加して、タンパク質精製を促進することができる。ある場合には、1つ又は両方のC領域の内部の細胞質末端を取り除いて、TCR鎖の細胞なしでの発現を促進することができる(Walsengら、PloS One、10:e0119559ページ(2015))。
本明細書に記載されるアセンブルされた発現ベクター又は本明細書に記載される異なる発現ベクターのプールが調製されると、それは、細胞がもたらされたTCRを発現するように、細胞に導入され得る。任意の適当な細胞を使用することができる。ある場合には、本明細書に記載される発現ベクターは、内在性TCRを発現しない細胞(例えば、T細胞)に導入され得る。例えば、本明細書において提供される発現ベクターは、TCRの内在性α鎖(若しくはγ鎖)の発現を欠くか、TCRの内在性β鎖(若しくはδ鎖)の発現を欠くか、又はTCRの内在性αとβ鎖両方(又は内在性γとδ鎖両方)の発現を欠くように操作されたT細胞(例えば、ヒトT細胞)に導入され得る。任意の適当な方法を使用して、内在性TCRの1つ又は両方の鎖の発現を欠くT細胞を生成することができる。例えば、遺伝子編集技術、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)テクノロジー又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)テクノロジーを使用することを含むものを使用して、内在性TCRの1つ又は両方の鎖の発現と干渉し得る。
ある場合には、ナチュラルキラー(NK)細胞を使用することができる。例えば、本明細書に記載される発現ベクターは、TCR複合体のCD3鎖(例えば、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、及び任意選択でCD3δ)を発現するよう操作されたNK細胞に導入され得る。そのような場合には、外来性にもたらされたTCRは、外来性にもたらされたCD3複合体と組み合わせて、NK細胞の表面上で発現され得る。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、内在性TCRを発現するT細胞(例えば、ヒトT細胞)に導入され得る。そのような場合には、そのようなT細胞の表面上に存在するTCRの一部は、内在性TCRであり得、そのようなT細胞の表面上に存在するTCRの一部は、外来性にもたらされたTCR(例えば、導入された発現ベクターによりコードされる2つのTCR鎖から生成されたTCR)であり得、そのようなT細胞の表面上に存在するTCRの一部は、1つの内在性にもたらされたTCR鎖及び1つの外来性にもたらされたTCR鎖を有し得る。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターによりコードされるα及びβ鎖(又はγ及びδ鎖)の定常領域は、細胞(例えば、内在性TCRを発現する細胞)内で発現されたとき、それらの鎖の互いとの対形成を増大させるための1つ以上のシステイン残基をコードする配列を含むよう操作され得る。例えば、本明細書に記載される、単一細胞選別されたT細胞から得られたTCR配列は、発現ベクターのそれぞれのコードされた定常領域が、細胞(例えば、内在性TCRを発現する細胞)内で発現されたとき、それらの鎖の互いとの対形成を増大する導入されたシステイン残基を含むように、発現ベクターにアセンブルされ得る。そのようなシステイン残基の例は、他で記載されたものを含むがこれらに限定されない(Kuballら、Blood、109:2331～2338ページ(2007))。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、その発現ベクターのTCR配列をクローニングするために使用された種と異なる種由来のT細胞に導入され得る。例えば、マウスT細胞から得られた可変領域を有するTCRを発現する本明細書において提供される発現ベクターは、マウス種以外の種由来のT細胞(例えば、ヒトT細胞)に導入され得る。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、1つの種(例えば、ヒト)由来の可変領域及び異なる種(例えば、マウス)由来の定常領域を有するキメラTCRを発現するよう操作され得る。そのような場合には、発現ベクターは、定常領域の種と異なる種由来のT細胞に導入され得る。例えば、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するキメラTCRを発現するよう操作された発現ベクターは、ヒトT細胞(例えば、内在性TCRを発現するヒトT細胞)に導入され得る。そのような場合には、他で記載される通り、外来性にもたらされたヒト/マウスキメラTCRが、発現され、ヒトT細胞の表面上の機能的TCRにアセンブルされ得る(Cohenら、Cancer Res.、66(17):8878～8886ページ、(2006))。
ある場合には、αβ定常領域を有するクローニングされたTCRを発現する本明細書において提供される発現ベクターが、内在性γδTCRを有するγδT細胞に導入され得る。これらの場合には、外来性TCRの2つの鎖は、内在性γ及びδTCR鎖からの干渉が少しであるか、又はなく、αβ定常領域を通して正確に対形成することができる。ある場合には、γδ定常領域を有するクローニングされたTCRを発現する本明細書において提供される発現ベクターが、内在性αβTCRを有するαβT細胞に導入され得る。これらの場合には、外来性TCRの2つの鎖は、内在性α及びβTCR鎖からの干渉が少しであるか、又はなく、γδ定常領域を通して正確に対形成することができる。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、単一γδT細胞から得られたγδ可変領域及びαβ定常領域を有するTCRを発現するよう操作することができる。そのような場合には、発現ベクターは、内在性γδTCRを有するγδT細胞に導入され得る。これらの場合には、外来性TCRの2つの鎖は、たとえ、それらのTCRがγδ可変領域を含有しても、αβ定常領域を通して正確に対形成することができる。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、単一αβT細胞から得られたαβ可変領域及びγδ定常領域を有するTCRを発現するよう操作することができる。そのような場合には、発現ベクターは、内在性αβTCRを有するαβT細胞に導入され得る。これらの場合には、外来性TCRの2つの鎖は、たとえ、それらのTCRがαβ可変領域を含有しても、γδ定常領域を通して正確に対形成することができる。この正確な対形成は、内在性α及びβTCR鎖からの干渉が少しであるか、又はなしで生じ得る。
ある場合には、本明細書において提供される発現ベクターは、単一γδT細胞から得られたγδ可変領域及びαβ定常領域を有するTCRを発現するよう操作することができる。そのような場合には、発現ベクターは、内在性γδTCRを有するγδT細胞に導入され得る。これらの場合には、外来性TCRの2つの鎖は、たとえ、それらのTCRがγδ可変領域を含有しても、αβ定常領域を通して正確に対形成することができる。
本明細書に記載される通り、アセンブルされた発現ベクター又は異なる発現ベクターのプールが調製されると、それは、細胞がもたらされたTCRを発現するように、細胞に導入され得る。任意の適当な細胞を使用することができる。例えば、本明細書において提供される発現ベクターは、不死のヒトT細胞株、例えば、ジャーカット細胞、Molt細胞株、又はこれらの供給源に由来する細胞株に導入され得る。ある場合には、内在性の配置されたTCRを発現しないジャーカット又はMolt細胞株の亜株を使用することができる(Minowadaら、Haematol. Blood Transfus.、32:233～236ページ(1989);Zhangら、PLoS Pathog.、6(7):e1001018ページ(2010))。ある場合には、マウス細胞株を使用して、ヒト又はマウスTCRを発現させることができる。ある場合には、外来性CD3核酸を発現するように設計された細胞株、例えば、4G4細胞株、BW5147細胞株、又はCD3遺伝子を発現するよう形質転換された58種のハイブリドーマ細胞株を使用することができる。
処置されている特定の患者又は疾患に関連するTCRの選別は、TCRクローニング前及び後に同定され得る。適当なTCRの検出は、選別工程と共に開始し得る。例えば、選別に先立ち、スクリーニングは、細胞をしばらく(例えば、4時間)、1つ以上の抗原(例えば、ワクチン、例えば、前立腺腫瘍ワクチン、非主要組織適合性抗原ワクチン、又は抗ウイルスワクチン、例えば、インフルエンザワクチンの抗原)でパルスされた抗原提示細胞(APC)と共に培養することにより、行われ得る。使用され得るAPCの例は、MHC1及び/又は2を発現することが知られている不死の細胞株、並びに専門のAPCに分化し、TLRリガンドでの刺激により拡大され、IL-4及びGM-CSFと共に培養された末梢血単球を含むがこれらに限定されない。刺激後、末梢血を染色して、T細胞を同定することができる。T細胞のその群内で、活性化T細胞は、マーカー、例えば、CD62L、CD127、CD69、CD44、及びCD45RA/ROの発現に基づき同定され得る。
1つ以上の抗原に曝露された細胞が、本明細書に記載される、単一T細胞に選別されると、生成されたcDNA、単一T細胞から生成されたcDNAの最大約80パーセントが、TCRクローニングの効率と干渉することなく、qPCRに使用され得る。ある場合には、刺激されたT細胞は、IFN-γ、IL-2、TNF-αのようなエフェクター分子、及び発現されることが知られた他の分子のアップレギュレーションについて、刺激後直接、スクリーニングされ得る。単一細胞レベルで、これらの細胞の発現を1つ以上のハウスキーピング遺伝子に正規化することにより、T細胞集団を刺激するために使用された抗原に特異的なTCRを有する単一T細胞を含有するウェルを同定することができる。ある場合には、クローニング工程は、T細胞集団を刺激するために使用された抗原に特異的なTCRを有すると同定されたT細胞から得られたそれらのTCRについて継続され得る。
発現ベクターがアセンブルされると、それらが発現するように設計されているTCRが、機能性及び抗原特異性について試験され得る。機能性及び抗原特異性は、細胞株又は初代細胞のいずれかにおいて、アセンブルされたTCRを発現することにより確かにされ得る。ある場合には、クローニングされたTCRを発現する細胞は、目的のクローニングされたTCRを同定するための任意の適当な方法を使用してスクリーニングされ得る。例えば、特定の抗原ペプチド-テトラマーの複合体を使用して、その複合体に結合する能力を有するTCRを発現する細胞を染色することができる。ある場合には、本明細書において提供されるアセンブルされた発現ベクターは、クローニングされ、かつ機能的なTCRの首尾よくいった活性化の際に、同定可能なシグナルをもたらすよう操作されたレポーター細胞に導入され得る。
ある場合には、細胞株は、機能的TCRを同定するために使用され得る、マーカーポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ)を、NFAT応答エレメントの制御下で発現するように設計され得る。NFATは、TCRライゲーションのようなシグナルが、その脱リン酸化、及びその後の核への輸送を導くまで、核に隔離されている転写因子である(Crabtreeら、Cell、109(補遺):S67～79ページ(2002))。次に、NFATは、NFAT応答エレメントに結合し、そのNFAT応答エレメントの下流の核酸配列によりコードされるマーカーポリペプチドの発現を導く。ある場合には、市販の不死のT細胞株、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸の上流にNFAT応答エレメントを含有するジャーカット細胞株(Promega;カタログ番号J1621)を使用して、機能的TCRを同定することができる。機能的TCRのTCRライゲーションの際に、これらの細胞は、ルシフェラーゼを発現することができる。本明細書に記載される通り、4G4 NFAT-RE細胞は、本明細書に記載される、クローニングされたTCRを発現するレトロウイルスベクターをトランスフェクトすることができ、それらの細胞は、抗CD3抗体でコーティングされている384ウェルプレートにおいて刺激することができる。これらの場合には、刺激された細胞は、ルシフェラーゼを発現することができ、それは、刺激の4時間以内に検出され得る。このシステムにより、機能的TCRの発現について、1枚の384ウェルプレート当たり360個より多くのウイルスベクターの迅速スクリーニングを可能にすることができる。そのような場合には、24個のウェルが、陽性及び陰性アッセイ対照のため使用され得る。
ある場合には、クローニングされたTCRの抗原特異性を確かめるアッセイを行うことができる。例えば、細胞は、抗原ペプチドでパルスされたか、又は標的遺伝子を発現するウイルスベクターで感染させたか、又は疑われる標的遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクトしたAPCと共に培養され得る。標的遺伝子の例は、腫瘍関連抗原、ワクチン関連抗原、及び病原体ウイルス関連抗原を含むがこれらに限定されない。TCR機能性の評価と同様に、特異性は、適当なMHC分子内の特異的抗原が、抗CD3抗体の代わりに、試験されているTCRを刺激するために使用されることを除き、NFAT応答エレメントルシフェラーゼアッセイを使用して評価され得る。本明細書に記載される細胞株により発現されるMHC分子は、ペプチドを培養物に直接入れること、又はMHC発現細胞に、目的の1つ以上のペプチドを発現するベクター(例えば、プラスミド)をトランスフェクトすることのいずれかにより、特定のペプチドを充填され得る。ある場合には、ペプチド(又は抗原発現ベクター)は、異なるTCR親和性及び異なるペプチド/MHC親和性についての対照に対して滴定され得る。
ある場合には、TCR発現、機能性、及び/又は特異性は、フローサイトメトリーにより、同時に評価され得る。NFAT応答エレメントレポーターシステムのルシフェラーゼタンパク質を、蛍光タンパク質(例えば、eGFP又はtdTomato)と置き換えることにより、本明細書において提供される、発現ベクターから発現されたクローニングされたTCRが、トランスフェクトした細胞において正しい発現、機能性、及び/又は特異性について評価され得る。簡単に言うと、蛍光タンパク質の発現を制御する、NFAT応答エレメントレポーターシステムを含有する細胞株は、クローニングされたTCRを発現する、本明細書において提供される発現ベクターをトランスフェクトし得る。次に、細胞株は、抗原でパルスされたAPC又はAPC細胞株とインキュベートし得る。次に、細胞は、蛍光マーカーの発現についてフローサイトメトリーにより評価され得る。刺激後の蛍光タンパク質の存在は、導入されたTCRが発現され、機能的であり、細胞を刺激するために使用された抗原に特異的であることを示し得る。ある場合には、クローニングされたTCRを発現する、本明細書において提供される発現ベクターは、どの細胞が発現ベクターを受け取るかを追跡するための指標として使用され得るマーカーポリペプチドをコードする核酸を含み得る。発現ベクター及び細胞株は、細胞株により発現されるレポーターポリペプチド、及び発現ベクターにより発現される指標が、互いに干渉しないように、選択され得る。
ある場合には、これらのフローサイトメトリー評価は、別のラウンドの単一細胞選別と組み合わせることができる。例えば、抗原応答性細胞(例えば、特異的抗原＋MCHでの刺激に応答して、蛍光マーカーを発現するもの)が、384ウェルプレートに選別され得、増幅反応(例えば、PCR)を行って、これらの細胞に導入されたTCR構築物を増幅することができる。
この選別方法を使用して、複数の発現ベクターを同時にスクリーニングすることができる。簡単に言うと、レポーター細胞に、本明細書において提供される発現ベクターをトランスフェクトして、クローニングされたTCRを発現させることができる。レポーター細胞は、単一の発現ベクターをトランスフェクトし得るが、複数の培養物が、(それぞれが、異なる発現ベクターで)感染され得る。これらの培養物を合わせ、次に、所望の抗原(1つ又は複数)の抗原を有するAPCと、約4～12時間の間インキュベートし得る。この時間の後、培養物は、フローサイトメトリーにより評価され得、NFAT応答エレメントを介して蛍光マーカーを発現している細胞が、単一のウェルに選別され得る。それらの細胞は、クローニングされ、治療用TCRベクターとして使用され得る。ある場合には、このプロセスを使用して、クローニングされたTCRを発現するように設計された何百もの発現ベクターを同時にスクリーニングすることができる。
ある場合には、初代T細胞を使用して、本明細書において提供される発現ベクターによりコードされる、クローニングされたTCRの特異性をスクリーニングすることができる。ある場合には、初代T細胞は、標的T細胞(例えば、特定の癌細胞)を殺滅する能力についてスクリーニングされ得る。例えば、クローニングされたMHCクラスI拘束性TCRは、細胞傷害性リンパ球(CTLに分化した初代細胞又はCD3遺伝子を発現するよう形質転換された拡大された初代ナチュラルキラー(NK)細胞のいずれか)に導入され、次に、標識された標的細胞と共に共培養され得る。これらの標的T細胞は、拡大された腫瘍細胞(例えば、腫瘍切除の生検試料から拡大された腫瘍細胞)、腫瘍試料に由来する抗原でパルスされたMHCクラスI発現細胞、及び/又は腫瘍特異的遺伝子を発現する抗原プラスミドをトランスフェクトしたMHCクラスI発現細胞株であり得る。これらの場合には、CTL活性は、標的T細胞を、クロム51のような放射性同位元素、又は色素のいずれかで負荷すること、及びインキュベーション後に負荷されたマーカーの放出を測定することにより、測定され得る(Roweら、Toxicol. Appl. Pharmacol.、221:179～88ページ(2007))。TCRの特異性及びエフェクター細胞における溶解性の的中を促進するTCRの能力に関心を持ったとき、脱顆粒は、TCRで形質転換されたエフェクター細胞の細胞傷害性の可能性の有効な評価として測定され得る。エフェクター細胞の標的とのインキュベーション後、パーフォリン又はグランザイムB ELISAが行われ得る。フローサイトメトリーによる、エフェクター細胞の表面上でのCD107a発現(Bettsら、Methods Cell Biol.、75:497～512ページ(2004))及び標的の細胞死の測定を使用して、エフェクター細胞集団の細胞傷害性の可能性を評価することができる。
ある場合には、TCR刺激後の公知又は疑われる抗原に応答した細胞の拡大を使用して、クローニングされたTCRの抗原特異的な活性化を評価することができる。初代哺乳動物(例えば、ヒト)T細胞の増殖を駆動する本明細書に記載されるTCRベクターの能力は、CFSE又は別の細胞増殖色素で測定され得る(Lyons、Immunol. Cell. Biol.、77:509～15ページ(1999))。細胞増殖の測定を使用して、ベクターベースのTCRの抗原特異性を決定することができる。簡単に言うと、初代T細胞は、機能及びTCR鎖対形成について検証された本明細書において提供されるTCR発現ベクターで感染され得る。初代T細胞は、CFSEで標識し、1つ以上の抗原ペプチド又は1つ以上の抗原タンパク質を発現するベクターでパルスされたAPCと共にインキュベートし得る。APCにより発現されている抗原に特異的であるTCRベクターを受け取っている初代T細胞が分裂し、これにより、CFSE色素を希釈する。より少量のCFSE(すなわち、より分裂した)を発現するそれらの細胞が、単一細胞選別を介して単離され得、αβTCR(又はγδTCR)をコードするアセンブルされた核酸は、単一細胞から増幅され(例えば、PCR増幅され)得る。
本明細書において提供される方法及び材料を使用して、多くの異なるクローニングされたTCRを得ることができる。それらを得たら、それらをスクリーニングして、様々な状態、例えば、自己免疫、癌、臓器移植拒絶反応、ウイルス感染症、細菌感染症、T細胞により制御され得る炎症プロセス(例えば、炎症性腸疾患、乾癬、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、非感染性肝炎、又は自己免疫胆管炎)を処置するために使用され得るものを同定することができる。例えば、ある場合には、腫瘍浸潤T細胞は、癌を有するヒト患者から単離され得る。それらのT細胞を、本明細書に記載する通り使用して、そのヒト由来の何百又は何千もの異なるクローニングされたTCRのコレクションを迅速に生成することができる。次に、それらのクローニングされたTCRを迅速にスクリーニングして、またその患者から得られた癌細胞を殺滅する能力を有するクローニングされたTCRの集団を同定することができる。それらのクローニングされ同定されたTCRを使用して、それらのTCRを発現するさらなる細胞株を生成することができ、それを使用して、そのヒトを処置することができる。ある場合には、供給源T細胞を得ることから、本明細書に記載される通り、クローニングされた治療上有効なTCRをコードする発現ベクターをトランスフェクトした細胞を治療剤として使用することまでの全てのこれらの工程は、治療上有効なTCRの配列同一性を決定することなく、行われ得る。
ある場合には、本明細書において提供される方法は、核酸配列決定を実施することなく、制限酵素切断工程を実施することなく、本明細書に記載される他の工程若しくは技術を実施するとなく、及び/又は本明細書に記載される特定の試薬若しくは材料を使用することなく、実施することができる。例えば、ある場合には、本明細書に記載される通り、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、核酸配列決定を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。ある場合には、本明細書において提供される方法は、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得る工程、及び任意の核酸配列決定を行うことなく、発現ベクターのそのコレクションから特定のTCRを同定する工程を含み得る。例えば、特定の機能を有するTCRは、TCR配列の任意の核酸配列決定を行うことなく、本明細書において提供される方法及び材料を使用して、クローニングされ、同定され得る。
本明細書に記載される通り、ある場合には、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、クローニング又はその他のための任意の制限酵素切断反応を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。例えば、シームレスクローニング技術を使用して、第1及び第2の増幅産物から発現ベクターをアセンブルすることができる。
また本明細書に記載される通り、ある場合には、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、1つのタイプの可変鎖の核酸のみを増幅するように設計されている(例えば、α可変鎖の核酸のみを増幅し、β可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆も真なり)、又はγ可変鎖の核酸のみを増幅し、δ可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆も真なり))反応混合物内で、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドの増幅を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。例えば、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドの増幅は、その反応混合物内でαとβ可変鎖核酸両方(又はγとδ可変鎖核酸両方)を増幅するように設計されている反応混合物内で行われ得る。
本明細書に記載される通り、ある場合には、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、1つのタイプの可変鎖の核酸のみを増幅するように設計されている(例えば、α可変鎖の核酸のみを増幅し、β可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆も真なり)、又はγ可変鎖の核酸のみを増幅し、δ可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆も真なり))反応混合物内で、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第2ラウンドの増幅を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。例えば、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第2ラウンドの増幅は、その反応混合物内でαとβ可変鎖核酸両方(又はγとδ可変鎖核酸両方)を増幅するように設計されている反応混合物内で行われ得る。
ある場合には、本明細書に記載される通り、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の核酸を増幅するのに特異的なプライマーが、外来性の核酸配列(例えば、プライマーバーコード配列又はプライマーアダプター配列)を含む、第1ラウンドのプライマーコレクションを使用するネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドの増幅を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。例えば、第1ラウンドのプライマーコレクションは、5つの連続するヌクレオチドより長い、増幅されている可変鎖に相補的でない、増幅されている可変鎖に相補的な核酸配列に結合している、外来核酸配列(例えば、プライマーバーコード配列又はプライマーアダプター配列)を欠くが、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の核酸を増幅するのに特異的な配列を有するプライマーを含み得る。
ある場合には、本明細書に記載される通り、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るために使用される方法は、CDR1領域の不在下又はCDR1領域とCDR2領域両方の不在下で、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の全長コード領域を含有しない増幅産物、例えば、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)のCDR3領域を含有する増幅産物を産生するように設計されたネステッド増幅(例えば、PCR)法を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別するポイントからアセンブルされた発現ベクターを有するポイントまで行われ得る。例えば、本明細書において提供されるネステッド増幅(例えば、PCR)法は、全長α可変鎖(又は全長γ可変鎖)を含有する第1の増幅産物及び全長β可変鎖(又は全長δ可変鎖)を含有する第2の増幅産物を増幅するように設計され得る。
一部の実施形態において、単一T細胞から得られたクローニングされたTCRを発現するように設計された発現ベクターのコレクションを得るための方法は、(a)任意の核酸配列決定を行うことなく、(b)クローニング又はその他のための任意の制限酵素切断反応を行うことなく、(c)1つのタイプの可変鎖の核酸のみを増幅するように設計されている(例えば、α可変鎖の核酸のみを増幅し、β可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆)、又はγ可変鎖の核酸のみを増幅し、δ可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆))反応混合物内で、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドの増幅を行うことなく、(d)1つのタイプの可変鎖の核酸のみを増幅するように設計されている(例えば、α可変鎖の核酸のみを増幅し、β可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆)、又はγ可変鎖の核酸のみを増幅し、δ可変鎖の核酸を増幅しないように設計されている(若しくは逆))反応混合物内で、ネステッド増幅(例えば、PCR)法の第2ラウンドの増幅を行うことなく、(e)可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の核酸を増幅するのに特異的なプライマーが、5つの連続するヌクレオチドより長く、増幅されている可変鎖に相補的でなく、かつ増幅されている可変鎖に相補的な核酸配列に結合している、外来核酸配列(例えば、プライマーバーコード配列又はプライマーアダプター配列)を含む、第1ラウンドのプライマーコレクションを使用するネステッド増幅(例えば、PCR)法の第1ラウンドの増幅を行うことなく、及び/或いは(f)可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の全長コード領域を含有しない増幅産物、例えば、CDR1領域の不在下又はCDR1領域とCDR2領域両方の不在下で、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)のCDR3領域を含有する増幅産物を産生するように設計されたネステッド増幅(例えば、PCR)法を行うことなく、T細胞を単一T細胞に選別する時点からアセンブルされた発現ベクターを有する時点まで実施され得る。ある場合には、本明細書に記載される方法(例えば、本明細書に記載されるマルチプレックス方法)は、前の文章の(a)ないし(f)の排除的項目のいずれか1つ以上が、細胞選別の時点から、機能的TCRを発現する能力がある発現ベクターを得る時点まで合致するように、行われ得る。細胞選別の時点から、発現ベクターを得る時点まで、本明細書に記載される方法(例えば、本明細書に記載されるマルチプレックス方法)を行うとき、合致され得るそのような排他的項目の組合せの例は、(a)及び(b);(a)及び(c);(a)及び(d);(a)及び(e);(a)及び(f);(b)及び(c);(b)及び(d);(b)及び(e);(b)及び(f);(c)及び(d);(c)及び(e);(c)及び(f);(d)及び(e);(d)及び(f);(a)、(b)、及び(c);(a)、(b)、及び(d);(a)、(b)、及び(e);(a)、(b)、及び(f);(a)、(c)、及び(d);(a)、(c)、及び(e);(a)、(c)、及び(f);(a)、(d)、及び(e);(a)、(d)、及び(f);(a)、(e)、及び(f);(b)、(c)、及び(d);(b)、(c)、及び(e);(b)、(c)、及び(f);(b)、(d)、及び(e);(b)、(d)、及び(f);(b)、(e)、及び(f);(c)、(d)、及び(e);(c)、(d)、及び(f);(c)、(e)、及び(f);(d)、(e)、及び(f);(a)、(b)、(c)、及び(d);(a)、(b)、(c)、及び(e);(a)、(b)、(c)、及び(f);(a)、(c)、(d)、及び(e);(a)、(c)、(d)、及び(f);(a)、(d)、(e)、及び(f);(a)、(b)、(d)、及び(e);(a)、(b)、(d)、及び(f);(a)、(d)、(e)、及び(f);(b)、(c)、(d)、及び(e);(b)、(c)、(d)、及び(f);(b)、(d)、(e)、及び(f);(c)、(d)、(e)、及び(f);(a)、(b)、(c)、(d)、及び(e);(a)、(b)、(c)、(d)、及び(f);(a)、(c)、(d)、(e)、及び(f);(a)、(b)、(d)、(e)、及び(f);(a)、(b)、(c)、(e)、及び(f);並びに(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、及び(f)を含むがこれらに限定されない。例えば、本明細書に記載される方法(例えば、本明細書に記載されるマルチプレックス方法)は、細胞選別のポイントから、機能的TCRを発現する能力のある発現ベクターを得るポイントまで、(a)任意の核酸配列決定を行うことなく、及び(b)任意の制限酵素切断反応を行うことなく、行われ得る。ある場合には、本明細書に記載される方法(例えば、本明細書に記載されるマルチプレックス方法)は、可変鎖(例えば、α、β、γ、又はδ可変鎖)の核酸を増幅するのに特異的なプライマーが、5つの連続するヌクレオチドより長く、増幅されている可変鎖に相補的でなく、かつ増幅されている可変鎖に相補的な核酸配列に結合している、外来核酸配列(例えば、プライマーバーコード配列又はプライマーアダプター配列)を含む、第1ラウンドのプライマーコレクションを使用するネステッド増幅法の第1ラウンドの増幅を行うことなく、行われ得る。
本文書はまた、単一T細胞からTCRをコードする核酸を得、その核酸を配置して、TCR(例えば、完全にインタクトなTCR、例えば、その単一T細胞に存在する可変鎖の組合せを有する完全にインタクトなTCR)を発現するように首尾よく設計された核酸ベクターを形成するためのキットを提供する。例えば、本明細書において提供されるキットは、本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を実行するためのプライマーコレクションとの組合せで、本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を実行するためのプライマーコレクションを含み得る。
1つの実施形態において、本明細書において提供されるキットは、(a)本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を実施するためのプライマーコレクション、(b)本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を実施するためのプライマーコレクション、並びに(c)クローニングフラグメント及び/又はベクターを含み得る。この場合には、プライマーコレクションは、ネステッド増幅反応中に、L配列、Vαセグメント(又はVγセグメント)、Jαセグメント(又はJγセグメント)、及びCα領域(又はCγ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第1の増幅産物、並びにL配列、Vβセグメント(又はVδセグメント)、Dβセグメント(又はDδセグメント)、Jβセグメント(又はJδセグメント)、及びCβ領域(又はCδ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第2の増幅産物を作製する能力を有し得る。キットがクローニングフラグメントを含むそれらの場合には、クローニングフラグメントは、TCRのC領域の一部(例えば、Cα領域、Cγ領域、Cβ領域、又はCδ領域の一部)をコードする核酸を含有し得る。キットがベクターを含むそれらの場合には、ベクターは、TCRの一部(例えば、Cα領域、Cγ領域、Cβ領域、又はCδ領域の一部)をコードする核酸を含み得る。
ある場合には、本明細書において提供されるキットは、(a)第1のプライマーセットのプライマーの少なくとも1つが、表1又は表2に記載のか(例えば、hTRAV1_12_F、hTRBV4_123_F、hTRBV10_12_F、及び/又はhTRBV12_34_F)、又は(b)第2のプライマーセットのプライマーの少なくとも1つが、表5又は表6に記載の(例えば、Vect_hTRAV1_12_F、Vect_hTRAV8_246、Vect_hTRBV4_123_F、Vect_hTRBV6_23_F、Vect_hTRBV6_89_F、Vect_hTRBV7_2348_F、及び/又はVect_hTRBV12_34_F)、本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を行うための第1のプライマーセット、及び本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を行うための第2のプライマーセットを含むプライマーコレクションを含み得る。この場合には、第1のプライマーセットのプライマーの1つ以上(例えば、第1のセットの全フォワードプライマー)は、アダプター配列を欠き得、第2のプライマーセットの1つ以上のプライマー(例えば、第2のセットの全フォワードプライマー)は、アダプター配列を含み得る。ある場合には、そのようなキットは、増幅の第1及び第2ラウンド用のリバースプライマーを含み得る。キット用の他の任意選択の成分は、逆転写プライマー(例えば、ランダムオリゴマー)、逆転写酵素、PCR用のDNAポリメラーゼ酵素(例えば、Taqポリメラーゼ、緩衝液、クローニングフラグメント、TCRをコードする核酸を受け取るように構成された発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)、5'エキソヌクレアーゼ酵素、ギブソンアセンブリ反応を行うためのDNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ酵素、及びそれらの組合せを含み得る。例えば、本明細書において提供されるキットは、クローニングフラグメント及び/又はTCRをコードする核酸を受け取るように構成された発現ベクターと組み合わせて、本明細書に記載されるプライマーコレクションを含み得る。本明細書に記載される通り、クローニングフラグメントは、TCRの一部をコードする核酸及び自己切断ペプチド(又はIRES)をコードする核
酸を含み得る。ある場合には、クローニングフラグメントは、TCRの一部をコードする核酸及びプロモーター配列を含み得る。ある場合には、発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)は、本明細書に記載されるTCRの少なくとも一部をコードする核酸を含むように構成され得る。
別の例では、本明細書において提供されるキットは、(a)表1に記載のプライマーの第1のセット、(b)表2に記載のプライマーの第2のセット、(c)第1及び第2のセットのそれぞれについてのリバースプライマー、(d)表5に記載のプライマーの第3のセット(5'末端でプライマーアダプター配列が付加された)、(e)表6に記載のプライマーの第4のセット(プライマーの第3のセットと使用されるアダプター配列と異なる、5'末端でプライマーアダプター配列が付加された)、並びに(f)第3及び第4のセットのそれぞれについてのリバースプライマーを含むプライマーコレクションを含み得る。
本文書はまた、反応混合物を提供した。例えば、一実施形態において、本明細書において提供される反応混合物は、(a)L配列、Vαセグメント(又はVγセグメント)、Jαセグメント(又はJγセグメント)、及びCα領域(又はCγ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第1の増幅産物、並びに(b)L配列、Vβセグメント(又はVδセグメント)、Dβセグメント(又はDδセグメント)、Jβセグメント(又はJδセグメント)、及びCβ領域(又はCδ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第2の増幅産物を含み得る。この実施形態において、反応混合物は、クローニングフラグメント及び/又はベクターを任意選択で含み得る。反応混合物がクローニングベクターを含むそれらの場合には、クローニングフラグメントは、TCRのC領域の一部(例えば、Cα領域、Cγ領域、Cβ領域、又はCδ領域の一部)をコードする核酸を含有し得る。反応混合物がベクターを含むそれらの場合には、ベクターは、TCRの一部(例えば、Cα領域、Cγ領域、Cβ領域、又はCδ領域の一部)をコードする核酸を含み得る。
別の例では、本明細書において提供される反応混合物は、(a)本明細書において提供されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドを行うためのプライマーコレクション、(b)L配列、Vαセグメント(又はVγセグメント)、Jαセグメント(又はJγセグメント)、及びCα領域(又はCγ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第1の増幅産物、並びに(c)L配列、Vβセグメント(又はVδセグメント)、Dβセグメント(又はDδセグメント)、Jβセグメント(又はJδセグメント)、及びCβ領域(又はCδ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第2の増幅産物を含み得る。この実施形態において、反応混合物は、ポリメラーゼ酵素(例えば、Taqポリメラーゼ)を任意選択で含み得る。
本文書はまた、本明細書に記載される第1及び第2の増幅産物を生成する能力を有するネステッド増幅法を実施するように設計された核酸プライマーのコレクションを提供する。例えば、本明細書において提供される核酸プライマーのコレクションは、(a)L配列、Vαセグメント(又はVγセグメント)、Jαセグメント(又はJγセグメント)、及びCα領域(又はCγ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第1の増幅産物、並びに(b)L配列、Vβセグメント(又はVδセグメント)、Dβセグメント(又はDδセグメント)、Jβセグメント(又はJδセグメント)、及びCβ領域(又はCδ領域)の少なくとも一部をコードする核酸を含有する第2の増幅産物を生成する能力を有するネステッド増幅法を行うように設計され得る。
ある場合には、本明細書において提供される核酸プライマーのコレクションは、(a)第1のプライマーセットのプライマーの少なくとも1つが、表1又は表2に記載されている(例えば、hTRAV1_12_F、hTRBV4_123_F、hTRBV10_12_F、及び/又はhTRBV12_34_F)、又は(b)第2のプライマーセットのプライマーの少なくとも1つが、表5又は表6に記載されている(例えば、Vect_hTRAV1_12_F、Vect_hTRAV8_246、Vect_hTRBV4_123_F、Vect_hTRBV6_23_F、Vect_hTRBV6_89_F、Vect_hTRBV7_2348_F、及び/又はVect_hTRBV12_34_F)、本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第1ラウンドの増幅を行うための第1のプライマーセット、及び本明細書に記載されるネステッド増幅反応(例えば、ネステッドPCR)の第2ラウンドの増幅を行うための第2のプライマーセットを含むプライマーコレクションを含み得る。この場合には、第1のプライマーセットのプライマーの1つ以上(例えば、第1のセットの全フォワードプライマー)は、アダプター配列を欠き得、第2のプライマーセットの1つ以上のプライマー(例えば、第2のセットの全フォワードプライマー)は、アダプター配列を含み得る。ある場合には、本明細書において提供されるプライマーのコレクションは、増幅の第1及び第2ラウンド用のリバースプライマーを含み得る。
別の例では、本明細書において提供されるプライマーのコレクションは、(a)表1に記載のプライマーの第1のセット、(b)表2に記載のプライマーの第2のセット、(c)第1及び第2のセットのそれぞれについてのリバースプライマー、(d)表5に記載のプライマーの第3のセット(5'末端にプライマーアダプター配列の付加を有する)、(e)表6に記載のプライマーの第4のセット(プライマーの第3のセットで使用されるアダプター配列と異なる、プライマーアダプター配列の付加を5'末端に有する)、並びに(f)第3及び第4のセットのそれぞれについてのリバースプライマー、を含み得る。
本文書はまた、本明細書に記載されるキットを作製する方法、本明細書に記載される反応混合物、及び本明細書に記載される核酸プライマーのコレクションを提供する。例えば、本明細書に記載されるキットの構成要素を得て、パッケージ内に配置して、本明細書に記載されるキットを形成することができる。ある場合には、本明細書に記載されるキットのそれぞれの構成要素は、パッケージを有する別々の容器内に収納され得る。本明細書に記載される反応混合物を作製するために、本明細書に記載される反応混合物の成分は、単一の反応ベッセルに合わせることができる。例えば、本明細書に記載される反応混合物の成分は、マルチウェルプレートの単一のウェルに合わせることができる。本明細書に記載される核酸プライマーのコレクションを作製するために、本明細書に記載されるコレクションのプライマーは、単一の反応ベッセルに合わせることができる。例えば、本明細書に記載される核酸プライマーのコレクションのそれぞれのプライマーは、マルチウェルプレートの単一のウェルに合わせることができる。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、それは、特許請求の範囲において記載される発明の範囲を制限しない。
［実施例1 単一T細胞からのT細胞の選別及びcDNAの取得］
本明細書に記載する方法及び材料を使用するTCRα及びβ鎖の個々の対の増幅は、単一T細胞を正確に播種すること、RNAを効率的に抽出すること、及びRNAの完全性を保つことを含むものであった。これらのそれぞれを確かめるために、mTRAV6-7α鎖及びmTRBV17β鎖を発現する、マウスハイブリドーマT細胞株、1B9を使用した。1個のウェル当たり0.08個の細胞まで落とした連続2倍限界細胞希釈を使用し、マウスGAPDH mRNAの検出を、リアルタイムqPCRを使用して検出した。qPCR反応を、Biorad CFX384リアルタイム機器において、KAPA SYBR Green FASTキット(Kapa Biosystemsから商業的に得た)、フォワードプライマー(5'-TCCCACTCTTCCACCTTCGA-3'、配列番号323)、及びリバースプライマー(5'-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT-3'、配列番号324)を利用して行った。PCR条件は、DNAポリメラーゼ活性化のため95℃で10分間、続いて変性のため95℃で10秒間及びアニーリング/伸長のため60℃で30秒間の55サイクルを含むものであった。融解曲線解析を行い、特異性を確立した。
GAPDHを読み取りとして使用し、有効な条件は以下の通りであると決定した:1mg/mLウシ血清アルブミン(Ambionから商業的に得た)を含有するPBS 1μLに1個の1B9 細胞/ウェルを懸濁し、0.3%IGEPAL CA-630(Sigmaから商業的に得た)1μLを使用して溶解した。Random Hexamers(Promegaから商業的に得た)1μL、dNTP(Biolineから商業的に得た)1μL、RNase OUT(Promegaから商業的に得た)1μL、DTT1μL、5×緩衝液2μL、及びSuperscript IV(ThermoFisher Scientificから商業的に得た)1μLを総体積10μLまで加えることにより、cDNAを作製した。プライマー結合のため25℃で10分間、伸長のため50℃で40分間、及び酵素の熱不活性化のため85℃で5分間インキュベートすることにより、cDNA合成を行った。
mTRBV17についてのフォワードプライマー(配列番号251)を対応するリバースプライマー(mTRBCn;配列番号273)と共に使用し、細胞の連続希釈から作製したcDNAからのマウスTRBV17β鎖の増幅を、Phusion(プルーフリーディングDNAポリメラーゼ)を使用して行い、増幅ステージ中に組み込まれる変異を低減し、その後のクローニング工程に適合し得るものとした。
図6A及び6Bに示す通り、10個の細胞から384ウェルPCRプレート中1個のウェル当たり0.08個の細胞まで落とした連続希釈を使用して単一細胞を含有するウェルに位置する単一細胞から効率的にRNAを抽出し、そのRNAからcDNAを首尾よく得た。cDNA反応液5μLを使用し、推定0.31個の細胞/ウェルまで落としてGAPDHを検出した(図6A)。並行して、cDNA反応の他の半分を使用し、推定0.31個の細胞/ウェルに再度落としてGAPDHについて陽性と試験された全てのウェルにおいて、mTRBV17を増幅した(図6B)。それぞれの希釈液を、3連で試験した(図6B)。
これらの条件が、単一細胞からTCR鎖を増幅することができることを確かめるために、単一1B9細胞を、顕微鏡下でモニターしてマイクロマニピュレーター及びガラスピペットを使用して、384ウェルプレートに播種した。この実施例において、24個のうち22個の単一1B9細胞が、それらの特定のmTRBV17β鎖の増幅をもたらし、続いてRNAを放出させるための細胞溶解及びRNAをcDNAに変換するための逆転写を行った(図6C)。
単一細胞からのTCR鎖の有効な増幅を確かめた後、FACSソーターを使用して、単一1B9細胞を384ウェルプレートの別々のウェルに選別した。mTRBV17増幅を読み取りとして使用して、セルソーターを使用して選別した単一T細胞からの増幅の成功を確かめた。セルソーターは、100ミクロンのノズルで構成され、384ウェルプレートにおける効率的な播種のため25psiに設定したBD FACSAriaソーターであった。この実施例において、BD FACSAriaセルソーターにより選別した1B9単一細胞を含有する24個のうち22個のウェルが、それらの特定のmTRBV17β鎖の増幅をもたらし、続いてRNAを放出させるための細胞溶解及びRNAをcDNAに変換するための逆転写を行った(図6D)。
これらの結果は、本明細書に記載する方法及び材料を使用して、単一T細胞を別々の場所に選別し(例えば、1個のT細胞/ウェルを得て)、それらの単一T細胞からRNAを得て、そのRNAをcDNAに、そのcDNAからのTCR配列の増幅を可能にする様式で変換することができることを実証する。
［実施例2 第1ラウンドの増幅プライマーの増幅効率の確認］
表1及び2に挙げた全てのヒトhTRAV及びhTRBVの増幅のため、プライマーのパネルを合成した。密度勾配遠心分離を使用して、健常ドナーの血液からヒト末梢血単核球細胞(PBMC)を単離した。簡単に言うと、新たに単離した血液35mLを、Ficoll-Paque PLUS(GE LifeSciencesから商業的に得た)15mLの上に注意深く重ね、30分間、400×gにて室温でスウィングバケットローターにおいてブレーキをかけず遠心分離した。単核細胞層を単離し、100×gで7分間、2回遠心分離することにより、血小板を取り除いた。RNeasyキット(Qiagenから商業的に得た)を使用して、107個のヒト単核細胞由来の総RNAを単離した。Superscript IV逆転写酵素を使用して、cDNAを合成し、表1及び2に挙げたそれぞれの個々のプライマーを、対応するバリアントを増幅するその増幅効率について試験した。表1に挙げたhTRAVフォワードプライマーについて、hTRACfリバースプライマー(配列番号265)を使用した。表2に挙げたhTRBVフォワードプライマーについて、hTRBCリバースプライマー(配列番号268)を使用した。PCR増幅反応は、Phusion DNAポリメラーゼを使用した。
全てのhTRAVプライマーは、長さ463塩基対～569塩基対の範囲にあるDNA産物を生成する、対応するhTRAVを増幅する能力を有していた(図7)。同様に、全てのhTRBVプライマーは、長さ561塩基対～636塩基対の範囲にあるDNA産物を生成する、対応するhTRBVを増幅する能力を有していた(図7)。
表3及び4に挙げた第1ラウンドのマウスプライマーの増幅効率を確かめるために、同様のアプローチを使用した。簡単に言うと、若いBL6マウスの胸腺からリンパ球を単離し、RNeasy Qiagenキットを使用して、総RNAを単離した。Superscript IVを使用してcDNAを作製し、Phusionを熱安定性DNAポリメラーゼとして、並びに対応するmTRACリバースプライマー(配列番号266)及び対応するmTRBCリバースプライマー(配列番号269)を使用するPCR反応において、増幅効率を試験した。mTRAV5-1、mTRAV6-1、mTRAV6-2、及びmTRAV6-3プライマーを除き、表3の全てのmTRAVフォワードプライマーが、対応するmTRAVを増幅することを、ゲル電気泳動を介して示した(図8)。mTRAV6-1、mTRAV6-2、及びmTRAV6-3プライマーが、対応するmTRAVを増幅することを、増幅された産物の配列決定を介して確かめた。このデータから、mTRAV5-1バリアントが、マウスレパートリーにおいて稀であり得ることが明らかとなった。全てのmTRBVフォワードプライマーが、対応するmTRBVを増幅することを、ゲル電気泳動を介して示した(図8)。これをまた、配列決定を介して確かめた。
［実施例3 マウスTCR配列を得るためのネステッド増幅法の実施］
表3及び4に挙げたプライマーを使用して、マウスTCRの増幅を行った。C57BL/6マウス由来のナイーブCD8+脾細胞を選別し、PBS 1μL及び1mg/mL ultra-pure BSAを含有する2枚の384ウェルPCRプレートにおいて、FACS Ariaを使用して単一細胞を播種した。実施例1に記載した方法を使用して、cDNAを合成し、cDNA反応液5μLを使用して、α及びβのTCR鎖対を増幅した。
第1のPCR増幅工程において、表3及び表4に挙げた全てのプライマーを、それぞれの個々のプライマーについて200nMの2つの特定のリバースプライマー(mTRAC、配列番号266;及びmTRBC、配列番号269)を含む1つのPCR反応に組み合わせた。反応液25μLにおいて、200nM dNTP及び1.5mM MgCl2の存在下で、1回の反応当たり1単位のPhusion DNAポリメラーゼを使用して、PCRを行った。熱サイクル条件は、98℃で1分間、98℃で10秒間、55℃で30秒間、及び72℃で40秒間を計30サイクル含むものであった。
第1ラウンドの増幅後、α及びβ鎖の別々の増幅のため、2回の別々の「ネステッド」PCR反応を行った。簡単に言うと、mTRAVのネステッド増幅のための表7に挙げた全てのプライマー＋リバースプライマーとしてのmTRACnプライマー(配列番号271)の混合物、又はmTRBVのネステッド増幅のための表8に挙げた全てのプライマー＋リバースプライマーとしてのmTRBCnプライマー(配列番号273)の混合物のいずれかで、第1の増幅物1μLを増幅した。反応液25μLにおいて、200nM dNTP及び1.5mM MgCl2の存在下で、1回の反応当たり1単位のPhusion DNAポリメラーゼを使用して、PCRを行った。熱サイクル条件は、98℃で1分間、計45サイクルについて98℃で10秒間、55℃で30秒間、及び72℃で40秒間を含むものであり、最後に、72℃での10分間のインキュベーションを含むものであった。
2枚の384ウェルプレートにおいて選別したCD8+/TCR β+T細胞の染色及び選択を、FACS scansにおいて示した(図9A)。加えて、プレート番号1の単一T細胞/ウェルを有する最初の24個のウェルについて、及びプレート番号2の単一T細胞/ウェルを有する最初の24個のウェルについての増幅反応を、エチジウムブロマイドゲル電気泳動により解析した(図9B)。単一T細胞からTCRαとβ鎖の対を増幅するこれらの方法の能力を確かめた(図9B)。増幅されたDNA産物は、mTRAV～mTRBV間で予想したのと異なるサイズを示し、これは、増幅の特異性を示すものであり、DNA混入に起因する増幅ではないことを示している(図9B)。合計で、48種のうち45種のα鎖が増幅され、48種のうち44種のβ鎖が増幅され、48種のうち41種のTCR対が増幅され、85.4パーセントの効率に達した。これらのPCR増幅された産物は、十分な量であり、特異的であり、非特異的な増幅されたバンドを欠き、それにより、それらを下流の機能的TCRの高スループットクローニングに適当なものにした。増幅された産物を配列決定して、非常に様々な異なるTCRを、CDR3領域でのそれらの配列により決定したクローン性の例で同定した。
第1ラウンドの増幅について、異なる供給源のマウスT細胞、並びにフォワードプライマーとして表3及び4に記載のプライマー並びに2種のリバースプライマー(配列番号266及び269)を使用して、このアプローチを複数回行った。生じた第1ラウンドの増幅反応混合物の一部をそれぞれ使用して、2回の別々の第2ラウンドの増幅を行った。一方は、リバースプライマー(配列番号271)と一緒にフォワードプライマーとして表7に記載のプライマーを含み、他方は、リバースプライマー(配列番号273)と一緒にフォワードプライマーとして表8に記載のプライマーを含むものであった。400種を超える異なる増幅産物を配列決定した。これらの配列決定の結果から、表3及び7の全てのTRAVプライマー(TRAV5-1に特異的なプライマーを除く)からの成功した増幅を確かめた。配列決定の結果はまた、全22種のmTRBVの成功した増幅を確かめた。ある場合には、増幅産物を発現ベクター(例えば、レトロウイルスベクター)中にクローニングした。これらのうち5つの発現ベクターを細胞に導入し、機能的なクローニングされたTCRの発現を、抗CD3抗体での刺激を介して確かめた。これらの5つのうち1つを、実施例5及び6においてより詳細に記載した。
［実施例4 単一T細胞における遺伝子発現レベルの評価］
高い効率のRNA抽出及びcDNA変換に起因し、生成されたcDNAの一部(例えば、約半分)を首尾よく使用して、単一T細胞からTCR鎖の対を得た。これにより、増幅前の工程で又は生成されたcDNAから直接のいずれかでの遺伝子発現解析を使用するこれらの単一T細胞の状態のさらなる特徴付けのため、約半分が残された。
当たりを確かめるためのいくつかのスクリーニングアッセイを使用して、特定のTCRについてのスクリーニングを行うことができる。ある場合には、TCRをクローニングしながら並行して、遺伝子発現を行い、個々のT細胞の活性化状態を決定することができる。FACSにより、例えば、CD69発現のアップレギュレーションを使用して、これに対処し得るが、第2のスクリーニングアッセイにおける活性化遺伝子の同定を使用して、陽性の当たりをさらに確かめることができる。
BD iMagストレプトアビジンビーズ及びビオチン化ヒト抗CD4抗体を使用した、PBMCからの陽性選択により、CD4+ヒトT細胞を単離した。RPMI1640、10%FCS、及び1%PS/Glu培地で5日間、細胞を培養した。続いて、16時間、37℃で、DYNAビーズに結合した抗CD3/抗CD28抗体で、CD4+細胞を活性化して、抗原提示細胞(APC)によるT細胞の活性化を模倣した。活性化後、陽性選択したCD4+細胞を、マイクロマニピュレーターを使用して、それぞれのウェルがPBS 1μL、1mg/mL超高純度BSAを含有する、384ウェルPCRプレート中1個のT細胞/ウェルで播種した。本明細書に記載される通り、RNAを抽出し、反応液10μL中で、cDNAを生成した。生じたcDNA混合物2μLを、正規化のための参照遺伝子としてのRLP13A発現と比較したヒトIL-2の遺伝子発現解析のため利用した。Biorad CFX384リアルタイム機器において、KAPA SYBR Green FASTキット(Kapa Biosystemsから商業的に得た)を利用して、IL-2フォワードプライマー(5'-AGGGATCTGAAACAACATTC-3'、配列番号325)、IL-2リバースプライマー(5'-GCCTGATATGTTTTAAGTGGG-3'、配列番号326)、RLP13Aフォワードプライマー(5'-GTCTGAAGCCTACAAGAAAG-3'、配列番号327)、及びRLP13Aリバースプライマー(5'-TGTCAATTTTCTTCTCCACG-3'、配列番号328)を使用して、qPCR反応を行った。PCR条件は、DNAポリメラーゼ活性化のため95℃で10分間、計45サイクルについて、変性のため95℃で10秒間、及びアニーリング/伸長のため60℃で30秒間を含むものであり、続いて、特異性を確立するための融解曲線解析を行った。RLP13A参照遺伝子で正規化したIL-2発現の倍数増加を決定した。抗CD3/抗CD28ビーズで活性化すると、IL-2発現は、刺激なしから数百倍の増加まで変動し、このアッセイを使用して、特定の刺激に応答した単一選別したT細胞を、応答しなかったものから区別することができることが確かめられた(図10)。
［実施例5 TCRのクローニング］
他で記載される通り、抗DEC205抗体にコンジュゲートしたH60ペプチド(LTFNYRNL)又はOVAペプチド(SINFEKL)で、野生型のメスC57Bl/6マウスをワクチン接種した(Liら、Blood、118:5965～76ページ(2011))。ワクチン接種の7日後、脾臓及びリンパ節を回収し、単一細胞懸濁液とし、抗TCRβ(PerCp Cy5.5にコンジュゲートしたクローンH57、Biolegend)、抗CD8α(PEにコンジュゲートしたクローン53-6.7、Biolgend、又はAF488にコンジュゲートしたクローン53-6.7)、抗CD44(AF647又はAF488のいずれかにコンジュゲートしたクローンIM7)、及びH60単離のみの場合には、抗CD4(PE-Cy7にコンジュゲートしたクローンGK1.5、Biolegend)についての蛍光標識した抗体で染色した。単一細胞懸濁液も、H60ペプチド又はOVAペプチドのいずれかをロードしたV450コンジュゲートMHC-Iテトラマーで染色した。
表面染色後、細胞を、PBS中で1回洗浄し、Ghost780(Tonbo)で30分間、室温、PBS中で染色した。細胞を、2回洗浄し、無菌のPBS中に懸濁した。選別に先立ち、別々のマウス由来の細胞をプールしなかった。個々のマウス由来の細胞を、異なるプレート又は共有プレートの異なるセクションに選別した。本明細書に記載した通り、2匹のH60でワクチン接種したマウス及び4匹のOVAでワクチン接種したマウス由来のワクチンで活性化した抗原特異的細胞(CD8+、TCRβ+、CD44hi、OVA又はH60 テトラマー+)を、複数の384ウェルプレートに選別した。CD44hi CD8+脾細胞によるテトラマーの相対的結合を、フローサイトメトリーにより評価した(図11A及び11B)。ランダムヘキサマー(Promega)及びSuperscript IV(Thermo Fisher)を使用して、総cDNAを作製した。KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(Sigma Aldrich)を使用したGAPDHについてのqPCR(フォワードプライマー:5'-TCCCACTCTTCCACCTTCGA-3'、配列番号329;及びリバースプライマー:5'-AGTTGGATAGGGCCTCTCTT-3'、配列番号330)により、cDNAの質を確かめた。それぞれのウェルについて、TCRα及びβ鎖を増幅するように、それぞれのウェルを処理した。リバースプライマー(配列番号266及び269)と一緒に表3及び4に記載のマウス特異的フォワードプライマーを、第1ラウンドの増幅において一緒に使用した。第2ラウンドについては、第1ラウンドのPCR産物の一部を使用して、一方の反応において表7に含まれる複数の全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号271)、及び他の反応において表8に挙げられる全てのプライマー＋リバースプライマー(配列番号273)を使用する2つの別々の反応においてTCRα又はTCRβ鎖を増幅した。
TCRα及びβ陽性ウェルのサブセットを、サンガーの配列決定方法(Genewiz)を使用して配列決定した。2つのプライマー(配列番号263及び262)を配列決定用プライマーとして使用し、結果をSnapGeneソフトウェア(SnapGene)を使用して解析した。クローニングの結果(図11C)は、固有のクローナルな細胞集団の存在を示した。
配列決定に基づき、TCRαとβの対を、Tdtomato発現レトロウイルス構築物中にクローニングした。簡単に言うと、H60ソート由来の5つのTCRαとβの対を、ギブソンクローニングキット(New England Biolabs)を使用して、表14のマウスINSERT_Bと共にレトロウイルスベクター中にアセンブルした。アセンブルされたベクターを、NEB5αコンピテント細胞(New England Biolabs)においてプラスミドとして成長させ、アンピシリン抵抗性に基づき選択した。プラチナEレトロウイルスパッケージング細胞(PLAT-E細胞)を、製造元の指示(Cell Biolabs Inc)通りに成長させ、LipoJetインビトロトランスフェクションキット(Signa Gen Laboratories)を使用して、TCRを含有するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、トランスフェクトしたPLAT-E細胞培養物由来の上清を回収した。
TCRα-β-ハイブリドーマ細胞株を、H60-テトラマーを結合するCD8細胞から単離し、拡大したTCR遺伝子、又は別のプライマーセットを使用してアセンブルしたTCR遺伝子ベクターのいずれかを含有した個々のレトロウイルスベクターで感染させた。感染の2、4、及び6日後に、細胞を、TCRβ及びtdtomatoの発現についてフローサイトメトリーにより評価した。H60選別からの増幅について選択した全5つのTCRは、ハイブリドーマ細胞株の表面上でTCRを首尾よく発現した。感染の6日後に、Tdtomato+細胞を、バルク選別技術を使用して選別し出し、細胞は、Tdtomato遺伝子と表面TCRの両方を2カ月にわたり発現した。H60 TCRβ細胞のうち2つを、TRVB2遺伝子(TCRVβ4遺伝子をコードする)を発現すると同定した。配列の特異性及びウイルス産生のフィデリティーを、TRVB2を含有するウイルスで感染させた細胞株を抗TCRVβ4(クローンKT4、ビオチン標識、BD Biosciences)で染色することにより、試験した。LSR II(BD Bioscience)を使用して、染色を評価した。染色結果は、クローニングし、染色又は配列決定を介して選択したTCR(この場合には、H60由来のTCR Vβ4)が選択的に発現されたことを示した(図11D～F)。これらの形質転換した細胞株は、選択したTCRを2カ月にわたり安定して発現した。
［実施例6 単一T細胞からクローニングした機能的TCRの発現］
Lipojetトランスフェクションキット(Signa Gen Laboratories)を使用して、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有する、NFAT-REにより駆動されるルシフェラーゼレポータープラスミドを、4G4細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、4G4を、1mg/mL濃度のハイグロマイシンを含む培養物中に入れた。この濃度は、トランスフェクトしていない4G4細胞の100%を10日以内に殺滅した。ハイグロマイシン抵抗性4G4細胞を、繰り返しサブクローニングし、NFATにより駆動されるルシフェラーゼを誘導するために、PMA/Iで刺激した。ルシフェラーゼ活性を、BioGlowルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用して、384ウェルの乳白色の組織培養物で処理したプレート(Greiner)において測定した。ハイグロマイシン抵抗性細胞の亜株を、低いルシフェラーゼバックグラウンド発現及び高い誘導性ルシフェラーゼ発現で選択した。
単一細胞でソートされたT細胞から得たTCR配列を使用するギブソンアセンブリを使用してアセンブルした2つの異なるTCR発現レトロウイルスベクターで、4G4細胞を感染させた。PLAT-E細胞を使用して、ウイルスを生成した。1つのTCR発現ベクターを、初代T細胞の単一細胞選別から生成し、Tdtomatoを発現するウイルス骨格を含有させた。他のTCR発現ベクターを、エクスビボで拡大したT細胞から得たTCRから生成し、eGFP発現骨格を含有させた。
レトロウイルストランスフェクション及びTCR発現の特異性及び効率を決定するために、感染していない細胞を抗TCRβ(クローンH57)で染色し、それらをtdtomato及びTCRの発現について評価することにより、バックグラウンドレベルを得た。感染していない4G4細胞は、TCRβを発現しなかった(図12A、左パネル)。TCRβ、及びeGFPとtdtomato発現の両方(使用したウイルスベクターに依存して)について感染の24時間後に染色したウイルス感染細胞を評価した。感染の24時間後に、検出可能なレベルの表面TCR及びeGFP発現が存在した(図12A、右パネル)。
ルシフェラーゼレポーター細胞を、TCR発現ウイルスで感染させた。細胞を感染させた1日後、4G4細胞を384ウェルの乳白色の組織培養処理プレート(Greiner)に入れた。乳白色の組織培養処理384ウェルプレートの個々のウェルを、変動する濃度の抗マウスCD3抗体でコーティングし、一晩4℃でインキュベートした(クローン2C11、BD Biosceinces)。ウェルをPBSで2回洗浄し、培養物由来の3×104個の4G4細胞を、TCR発現ウイルスベクターで感染させ、それを総体積40μLの培地に播種した。感染させた4G4培養物のフローサイトメトリー解析により、感染効率が、大抵の場合で、Tdtomato又はeGFP発現により判断して、80%未満であったことを見出した。細胞の表面上でのTCR発現を、抗マウスTCRβクローンH57(Biolegend)を染色することにより、測定した。
抗CD3との培養の3.5時間後、BioGlow基質(Promega)40μLを、それぞれのウェルに加え、プレートを10分間室温でインキュベートした。相対的光単位を、SpectaMax i3(Molecular Devices)を使用して、100msの間にわたり測定した。
感染していない細胞は、0より上のRLUにより測定して幾分かのルシフェラーゼを発現していた(図12B)。しかしながら、感染していない細胞は、抗CD3刺激に非応答性であった。感染した細胞培養物は、抗CD3刺激に非常に応答性であった(図12B)。
［実施例7 単一T細胞からの全長T細胞受容体可変領域の同時捕捉のための組成物及び方法］
背景技術
TCRをコードする遺伝子をクローニングする探求及びその発見データは、30年より前に遡る。TCRの単離、特徴付け及び再発現は、T細胞により引き起こされる疾患を理解すること、並びに癌を治癒させるための治療として定義されたTCRを有するT細胞を用いるための主な目標を表す。したがって、そのような方法は、研究/基礎及び治療上の意味の両方を有する。
ここでは、定義した抗原に特異的なT細胞クローンを同定する一般的な方法において、T細胞を生物から単離し、抗原及び/又は非特異的な刺激並びに炎症促進性サイトカインの存在下でインビトロで拡大した。次に、それらを、細胞でクローニングし、及び/又はそれ自体のTCR発現を欠く持続的T細胞腫瘍株と融合させることにより、T細胞ハイブリドーマとして不死化する。抗原により低い親和性を有するT細胞を、その同じ抗原により高い親和性を有するT細胞により過成長し得、低い親和性TCRを発見できないままにするので、これは偏った方法である。また、組織又は固形腫瘍から単離される多くのT細胞は、インビトロで十分に拡大せず、それらのTCR特異性は失われる。さらに、それは低スループットであり、遅く、多くの人手を要する。
これらの課題をある程度解決するアプローチは、免疫をインビボで行い、活性化マーカーの発現を示すか、又は特異的な公知のペプチド抗原標的を予め負荷している所定のMHC-テトラマーに結合する単一T細胞を選別することである。以前のアプローチの欠点は、活性化マーカーを示している多くのT細胞を、バイスタンダー機序により刺激し、抗原に特異的でないことである。テトラマーの使用は進歩であるが、入手可能なテトラマーは限られた数のみ存在し、それらは作製するのに骨が折れ、高価であり得、さらに、それらはHLA/MHC拘束性であり、それらがより低い親和性のT細胞を取り出すための感度を欠き得るという点で制限される。テトラマーアプローチはまた、公知の、予め定義した特異性を有する細胞を単離することのみができ、未知だが、重要な抗原ペプチドを認識するT細胞及びそれらの受容体の発見のため使用することができない。
次に、そのように単離されるT細胞は、典型的には、TCR配列決定に供される。TCRβのVDJ境界及びTCRVαのVJ境界を超えて配列を捕捉することは、TCRを完全に区別し、それ故、それぞれのT細胞を(幾分かのさらなる努力で)不死化するための「フック」であり、これは、細胞自体が不死化されないので、必要である。これは、典型的には、順に、アルファ(Vα)及びベータ(Vβ)鎖の可変領域において結合する公開されたプライマーのプール、並びにアルファ及びベータ鎖の定常部分に結合するプライマーを使用すること、続いて、ネステッドPCRにより達成される。最近まで、T細胞レパートリーは、実際、高スループット配列決定(HTS)を使用してでも、細胞のプール由来のVβ又はVαいずれかを配列決定することにより、通常解析されてきた。しかしながら、この方法は多様性及び起源を評価する一方、それは、一緒にのみ特異性を決定することができる単一細胞のVα/Vβ対を失う。
故に、過去数年に、数種類の方法及び文献が、単一T細胞から連結したVα/Vβを捕捉することを明らかにした。そのような方法は、どのようにそれらを構成するかに依存し、低スループットから中スループットであり、高価である(1回の配列当たり3～7ドル、1つのTCR当たりアルファとベータ鎖の両方を6～14ドルとみなす)。そのような配列決定は、必要な情報を同定するが、それらは、全長Vα/Vβではない。それ故、この全長配列は、目標が発現であるなら、再構築されなければならず、それぞれのTCRに特異的なPCRが、行われなければならない(それぞれのTCRについてのプライマーのオーダーは、1つのプライマー当たり約5ドル、1つのTCR当たり20ドルかかる)か、又は完全なアルファ及びベータ配列が、合成されなければならない(1つのTCR当たり160～200ドル)のいずれかである。VαとVβ配列の両方が、増幅され/合成されると、それらは、最終的に、最適なベクターにクローニングされ得る。人が、抗原の高スループットスクリーニング若しくは治療での適用に適当な組織又は血液から単離された任意の単一T細胞の公正な高スループットの同定及びクローニングを行うことを可能にするまで、開発された技術は存在しない。
この実施例7に開示する組成物、ベクター、及び方法は、これらの及び他の要求に対処することができる。
概要
単一ベクターにおいて単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vα及び全長Vβを含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法を、この実施例7において提供する。単一ベクターに単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vγ及び全長Vδを含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法も、この実施例7において提供する。さらなるクローニング工程なしで、TCRを容易に発現させることができる。
一態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVα領域及びVβ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、この実施例7で提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化したベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
別の態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVα領域及びVβ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、この実施例7で提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る、工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化したベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の複数の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の複数の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
一態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVγ領域及びVδ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、この実施例7で提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cδをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cγをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVγプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vγ遺伝子の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVγプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCγプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vδアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVδプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vδ遺伝子の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVδプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCδプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vγアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVγプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVγプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCγプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vδアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR δアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVδプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVδプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCδプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vγアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vδアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
別の態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVγ領域及びVδ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、この実施例7で提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cδをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cγをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVγプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vγ遺伝子の複数の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVγプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCγプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vδアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVδプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vδ遺伝子の複数の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVδプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCδプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vγアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVγプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVγプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCγプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vδアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR δアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVδプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVδプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCδプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vγアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vδアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向で、ライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
一実施形態において、工程(d)及び(e)を、単一反応で行う。一実施形態において、工程(f)及び(g)を、単一反応で行う。
一実施形態において、ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程は、相同性のある短い領域を利用するシームレスクローニング方法を含む。一実施形態において、ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程は、ギブソンアセンブリ方法を含む。
一実施形態において、第1のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第1のヌクレオチド配列は、長さ20個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第5のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第5のヌクレオチド配列は、長さ20個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第9のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第9のヌクレオチド配列は、長さ18個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第12のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第12のヌクレオチド配列は、長さ18個のヌクレオチドである。
一実施形態において、直線化されたベクターは、pMIGIIを含む。
一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、2Aペプチド配列をコードするヌクレオチド配列から選択され、2Aペプチド配列は、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される。一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、2Aペプチド配列をコードするヌクレオチド配列から選択され、2Aペプチド配列は、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される。一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、2Aペプチド配列をコードするヌクレオチド配列から選択され、2Aペプチド配列は、配列番号335である。
一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、配列番号336である。
一実施形態において、T細胞は、ヒト由来である。一実施形態において、T細胞は、マウス由来である。
一実施形態において、RNAは、ワンステップRT-PCR反応の一部としてT細胞から直接得られる。一実施形態において、RNAは、RT-PCR反応に先立ち、T細胞から得られ、単離される。
説明
単一ベクターにおいて単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vα及び全長Vβを含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法を、この実施例7において提供する。単一ベクターに単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vγ及び全長Vδを含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法も、この実施例7において提供する。さらなるクローニング工程なしで、TCRを容易に発現させることができる。例えば、図13～23を参照。
本出願を通じて使用される用語は、当業者にとって通常かつ典型的な意味を有すると解釈されるべきである。しかしながら、以下の用語は、以下に定義される通り、特定の定義が与えられる。
本明細書及び請求の範囲において使用される通り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「1個の細胞」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
用語「約」及び「およそ」は、当業者により理解される「近似する」こととして定義される。非限定的な一実施形態において、用語は、10%以内であると定義される。別の非限定的な実施形態において、用語は、5%以内であると定義される。さらに別の非限定的な実施形態において、用語は、1%以内であると定義される。
用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、子孫を含む。全ての子孫は、意図的又は不注意による変異に起因し、DNA内容物において正確に同一であり得ないことも理解される。集団内のバリアント子孫が含まれ、その集団は、元々操作した細胞集団においてスクリーニングしたのと同じTCR発現を有する。
本明細書において使用される、用語「含むこと」は、組成物及び方法が、列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。「本質的にからなること」は、組成物及び方法を定義するため使用されるとき、組合せにとっていずれかの本質的に有意な、他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量混入、並びに医薬的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを排除しない。「からなること」は、微量より多い要素の他の成分及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法の工程を排除することを意味する。これらの遷移用語のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
「対照」は、比較目的のため実験において使用される代わりの対象又は試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。
用語「フラグメントb」は、本明細書において、5'から3'方向で、Cαポリヌクレオチド及びウイルス2aポリヌクレオチドを含むDNAポリヌクレオチド配列を指し、フラグメントbは、ギブソンアセンブリ方法を使用して、その5'と3'末端の両方をこの実施例7のアンプリコン産物と連結可能である。一実施形態において、フラグメントbは、配列番号337に示す通りである。
本明細書において使用される、「遺伝子発現」及び「タンパク質発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセス、及び転写されたmRNAが、続いて、それぞれ、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核生物の細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。「遺伝子過剰発現」は、対照試料において検出された発現レベルより2.5倍高い、5倍高い、又は10倍高いレベルでの、遺伝子から転写されたmRNAの過剰産生を指す。「タンパク質過剰発現」は、対照試料において検出された発現レベルより2.5倍高い、5倍高い、又は10倍高いレベルでの、遺伝子によりコードされるタンパク質の過剰産生を含む。
本明細書において使用される「表面発現」は、ポリペプチドの少なくとも一部が、細胞表面の外側に位置するように、細胞の表面に移行されるプロセスを指す。「表面過剰発現」は、対照試料において検出された表面発現レベルより2.5倍高い、5倍高い、又は10倍高いレベルでの、細胞の外側表面での特定のポリペプチドの量における増加を含む。
実施例7において使用される、用語「ギブソンアセンブリ方法」は、Gibson DG、Young Lら、(2009)、Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases、Nature Methods、6(5):343～345ページにおいて最初に記載された、当業者に公知の複数のDNAフラグメントの方向性閉鎖をもたらす方法を指す。ギブソンアセンブリ方法は、DNAフラグメント、並びにエキソヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼと共に、連結される位置に重複する配列を有するように設計されたアクセプターベクターを使用する。
用語「同一性」又は「相同性」は、全配列について最大パーセントの同一性を達成することが必要なら、配列を整列させ、ギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮することなく、それと比較される対応する配列の塩基若しくは残基と同一である候補配列におけるヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味するよう解釈される。N末端伸長もC末端伸長も、挿入も、同一性又は相同性を低減させると解釈されない。別の配列に対するある特定のパーセンテージ(例えば、80%、85%、90%、又は95%)の「配列相同性」を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域)は、整列させたとき、塩基(又はアミノ酸)のパーセンテージが、2つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。一実施形態において、デフォルトパラメーターが、アライメントのため使用される。一実施形態において、BLASTプログラムは、デフォルトパラメーターと共に使用される。一実施形態において、BLASTプログラムBLASTN及びBLASTPは、以下のデフォルトパラメーター:遺伝コード=標準、フィルター=なし、標準=両方、カットオフ=60、予想=10、マトリックス=BLOSUM62、記載=50個の配列、ソート=高スコア、データベース=非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+SwissProtein+SPupdate+PIRと共に、使用される。
実施例7において使用される処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物及び家畜、非ヒト霊長類、並びに動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。
用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合形態、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有してもよく、公知若しくは未知の、任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は以下である:遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在するなら、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリ前又は後に授けられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合作用後、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによりさらに修飾されてもよい。用語はまた、2本鎖分子と1本鎖分子の両方を指す。別段特定又は要求されなければ、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、2本鎖形態と、2本鎖形態を作製することが公知又は推定される2つの相補的な1本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。ポリヌクレオチドは、特定の配列の4種のヌクレオチド塩基、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)及びポリヌクレオチドがRNAであるとき、チミン(T)の代わりにウラシル(U)からなる。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中心処理ユニットを有するコンピューター内のデータベースにインプットされ、バイオインフォマティクスアプリケーション、例えば、機能ゲノミクス及び相同性検索のため使用され得る。
用語「ポリペプチド」をその広義の意味で使用して、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、又はペプチドミメティックの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結してもよい。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより連結してもよい。本明細書において使用される、用語「アミノ酸」は、グリシン及びD若しくはL光学異性体の両方を含む、天然及び/又は非天然若しくは合成アミノ酸のいずれか、並びにアミノ酸類似体及びペプチドミメティックを指す。ペプチド鎖が短いなら、3つ以上のアミノ酸のペプチドは、オリゴペプチドと一般に呼ばれる。ペプチド鎖が長いなら、ペプチドは、ポリペプチド又はタンパク質と一般に呼ばれる。
「プライマー」は、標的と特異的にハイブリダイズし、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合作用を促進することにより、一般に、目的の試料に潜在的に存在する標的又は「鋳型」に結合する遊離3'-OH基を有する、短いポリヌクレオチドである。「プライマー特異性」は、標的に特異的に結合するプライマーの能力を指す。プライマー特異性は、本明細書において「ハイブリダイズする領域」とも呼ばれる、標的にハイブリダイズするプライマー内のポリヌクレオチド領域により決定される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)は、複製コピーが、「フォワード」及び「リバース」プライマーからなる「プライマーの対」又は「プライマーのセット」、並びに重合作用の触媒、例えば、DNAポリメラーゼ、及び典型的には、熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドから作製される反応である。一部の実施形態において、フォワードプライマーは、T細胞リーダー配列に特異的に結合し、リーダー配列を含むアンプリコン産物を生じる。PCR方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、「PCR: A PRACTICAL APPROACH」(M. MacPhersonら、IRL Press at Oxford University Press(1991))において教示される。用語「RT-PCR」は、本明細書において、RNA分子、例えば、mRNAが、cDNA分子に逆転写され、次に、当業者に公知の通り増幅される、逆転写PCRプロセスを指す。用語「ネステッドPCR」は、本明細書において、第1のPCRプロセスに続き、第1のPCRプロセスの産物内にある標的を増幅するために、少なくとも1つの、第1のプロセスとは異なるプライマーを使用する、PCRプロセスを指す。一部の実施形態において、第1のPCRプロセスはRT-PCRプロセスである。ポリヌクレオチドの複製コピーを作製する全てのプロセス、例えば、PCR又は遺伝子クローニングは、本明細書において、「複製」とまとめて言及される。
用語「対象」は、本明細書において、動物、例えば、霊長類(例えば、ヒト)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物を含むように定義される。一部の実施形態において、対象はヒトである。
用語「T細胞」は、本明細書において、T細胞受容体を発現するリンパ球を指す。T細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及びNK T細胞を含む。T細胞の定義内に含まれるCD4+T細胞サブセットは、Th1、Th2、Th9、Th22、Treg、及びTfhである。CD8+T細胞は、メモリーとエフェクター細胞サブセットの両方を含む。
用語「T細胞受容体」は、用語「TCR」と互換的に使用される。これらの用語は、典型的には、抗原(アルファ(α)鎖(又はガンマ(γ)鎖)、ベータ(β)鎖(又はデルタ(δ)鎖)、2つのゼータ(ζ)鎖、CD3デルタ(δ)鎖、CD3(ε)鎖、及びCD3(γ)鎖)に応答したT細胞の活性化に関与する膜内在性タンパク質の複合体を指すが、本明細書において使用される、用語「T細胞受容体」及び「TCR」は、TCRのアルファ(α)(又はガンマ(γ))及びベータ(β)(又はデルタ(δ))鎖(ポリペプチド)を指す。「TCRαポリヌクレオチド」は、TCRα鎖(可変領域(V)及び定常領域(C)を含む)をコードし、一方、「TCRβポリヌクレオチド」は、TCRβ鎖(可変領域(V)及び定常領域(C)を含む)をコードする。したがって、「Vαポリヌクレオチド」は、本明細書において、TCRα鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。「Cαポリヌクレオチド」は、本明細書において、TCRα鎖定常領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。「Vβポリヌクレオチド」は、TCRβ鎖可変領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。「Cβポリヌクレオチド」は、本明細書において、TCRβ鎖定常領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、コードされたポリペプチドは、全長ポリペプチドである。他の実施形態において、コードされたポリペプチドは、フラグメントである。Vαポリヌクレオチドが、TCR VαポリヌクレオチドとTCR Jαポリヌクレオチドの両方を含むことは、理解されるべきである。Vβポリヌクレオチドが、TCR Vβポリヌクレオチド、TCR Dβポリヌクレオチド、及びTCR Jβポリヌクレオチドの全てを含むことは、さらに理解されるべきである。一実施形態において、Cβポリヌクレオチド配列は、配列番号338である。
実施例7において使用される用語「発現ベクター」は、適当な宿主におけるDNAの発現に作用する能力がある、適当な対照配列に作動可能に連結しているDNA配列を含有するDNA構築物を意味する。そのような対照配列は、転写に作用するプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。発現ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のあるゲノムインサートであってもよい。適当な宿主に形質転換されると、発現ベクターは、宿主ゲノムとは独立して、複製し、機能し得るか、又はある場合には、ゲノム自体に統合し得る。プラスミドは、最も一般的に使用される形態の発現ベクターであるが、本発明は、当該技術分野において公知なものと同等の機能を果たすそのような他の形態の発現ベクター、及び当該技術分野において公知であるか、又は公知となるそのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
用語「2aポリヌクレオチド」は、本明細書において、2Aペプチド又はAsp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(配列番号331)の2Aペプチドコンセンサスモチーフをコードするポリヌクレオチドを指す。2Aペプチドは、口蹄疫ウイルスの2Aペプチド(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP、配列番号332)、ウマの鼻炎Aウイルスの2Aペプチド(QCTNYALLKLAGDVESNPGP、配列番号333)、ゾーシーア・シグナウイルスの2Aペプチド(EGRGSLLTCGDVEENPGP、配列番号334)、ブタのテッショウウイルス-1の2Aペプチド(ATNFSLLKQAGDVEENPGP、配列番号335)を含むがこれらに限定されない。
方法
単一ベクターにおいて単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vα及び全長Vβを捕捉することにより、TCR発現ベクターをアセンブルする方法を、この実施例7において提供する。単一ベクターに単一T細胞(又は同種のT細胞集団)由来の全長Vγ及び全長Vδを捕捉することを含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法も、この実施例7において提供する。さらなるクローニング工程なしで、TCRを容易に発現させることができる。
任意のベクターにおける任意の公知又は未知のTCRの迅速なクローニングを可能にする方法を、実施例7において開示する。これらの方法は、先行技術の方法より高価でなく、公正である。一部の実施形態において、これらの方法は、任意のT細胞のインタクトなTCRの迅速かつ安価な増幅、及び最適なベクターにおける産物の直接シームレスクローニングを可能にする。これらの方法及び材料の適用は、多数であり、例えば、抗原のスクリーニング及び/又はレトロジェニック若しくはトランスジェニックマウスの生成のための、中から高スループットの単離並びにTCRのレトロウイルスベクターへのクローニングである。
実施例7に記載の方法を、ヒトα及びβ鎖に特異的なプライマーのセットを設計することにより、並びにヒト細胞に感染するのに適当なベクター(例えば、レトロウイルスベクター又はプロウイルス)を使用することにより、ヒトのシステムに適合する。一部の実施形態において、これらの方法を、癌の免疫療法のため使用することができる。免疫療法のため使用すべき患者リンパ球を形質導入するという最終的な目標で、多数の腫瘍浸潤細胞(TIL)由来のTCRをアクセプターレトロウイルスベクターにクローニングすることにより、これを達成する。一部の実施形態において、実施例7に開示の方法を使用して、自己免疫患者の炎症組織由来の多数のTCRをクローニングして、自己抗原についてスクリーニングする。この知見と共に、ストラテジーを用いて、その抗原又はそれを認識している特異的な自己反応性T細胞のいずれかを中和する。別の実施形態において、TCRを、宿主による拒絶を経験している固形器官移植片、例えば、肝臓、腎臓、肺、又は腸から採取したT細胞からクローニングする。そのようなTCRを使用して、拒絶プロセスを研究し、拒絶プロセスをモニタリングし、これらのT細胞を、拒絶を処置するために使用することができる制御機能を有する宿主ヒトT細胞に導入することができる。
一態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVα領域及びVβ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、実施例7において提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化したベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)により、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
別の態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVα領域及びVβ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、実施例7において提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化したベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の複数の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の複数の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)により、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
1つの態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVγ領域及びVδ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、実施例7において提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cδをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cγをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVγプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vγ遺伝子の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVγプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCγプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vδアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVδプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vδ遺伝子の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVδプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCδプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vγアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVγプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVγプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCγプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vδアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR δアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVδプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVδプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCδプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vγアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vδアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)により、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
別の態様において、単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)由来のVγ領域及びVδ領域を含むTCR発現ベクターをアセンブルする方法であって、以下の工程を含む方法を、実施例7において提供する：
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cδをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cγをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞(又はT細胞の同種の集団)からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVγプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vγ遺伝子の複数の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVγプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCγプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vδアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVδプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vδ遺伝子の複数の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVδプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCδプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vγアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vγアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVγプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVγプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCγプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vδアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR δアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVδプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVδプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCδプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vγアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vδアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)により、TCR発現ベクターをアセンブルする工程。
一実施形態において、工程(d)及び(e)を、単一反応で行う。一実施形態において、工程(f)及び(g)を、単一反応で行う。
一実施形態において、ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程は、相同性を有する短い領域を利用するシームレスクローニング方法を含む。一実施形態において、ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程は、ギブソンアセンブリ方法を含む。
一実施形態において、第1のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第1のヌクレオチド配列は、長さ20個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第5のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第5のヌクレオチド配列は、長さ20個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第9のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第9のヌクレオチド配列は、長さ18個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第12のヌクレオチド配列は、長さ15～25個のヌクレオチドである。一実施形態において、第12のヌクレオチド配列は、長さ18個のヌクレオチドである。
一実施形態において、第1のヌクレオチド配列は、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に完全に相補的である。一実施形態において、第3のヌクレオチド配列は、フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に完全に相補的である。
一実施形態において、第5のヌクレオチド配列は、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に完全に相補的である。一実施形態において、第7のヌクレオチド配列は、直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に完全に相補的である。一実施形態において、第10のヌクレオチド配列は、フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に完全に相補的である。一実施形態において、第13のヌクレオチド配列は、直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に完全に相補的である。
一実施形態において、複数の第1のフォワードVαプライマーは、配列番号345～配列番号416(計72種のプライマー)を含む。一実施形態において、複数の第1のフォワードVβプライマーは、配列番号417～配列番号441(計25種のプライマー)を含む。
一実施形態において、直線化されたベクターは、pMIGIIを含む。
一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される。一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される。一実施形態において、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列は、配列番号335である。
代替的な実施形態において、本明細書における方法は、2A配列の代わりに、任意の自己切断可能なペプチドを含むリンカー配列を使用することができる。
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、それぞれのVα及びVβについて5'「第1の」プライマー中に全リーダー配列を含むプライマーを使用する。
一部の実施形態において、TCR発現ベクター構築物は、異なる配置でクローニングされてもよい。例えば、TCR発現ベクターは、以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向で、ライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)によりアセンブルされてもよい。
一部の実施形態において、TCR発現ベクターは、以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vδアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vγアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向で、ライゲーション(例えば、シームレスクローニング方法又はギブソンアセンブリ方法)によりアセンブルされてもよい。
一実施形態において、T細胞は、ヒト由来である。一実施形態において、T細胞は、マウス由来である。
他の実施形態において、TCR α及びβ RNAは、単一T細胞よりむしろクローナルな集団から得られる。
一部の実施形態において、TCR α及びTCR β RNAのいずれか又は両方は、それぞれのプライマーが、同じ端の5'末端及び異なるプライマー特異性を有する、複数の第1のフォワードVαプライマーに曝露される。本明細書において使用される通り、「プライマー特異性」は、標的TCR α又はTCR β RNAに特異的に結合するプライマーの能力を指す。プライマー特異性は、本明細書において「ハイブリダイズする領域」とも呼ばれる、TCR α又はTCR β RNAにハイブリダイズするプライマー内のポリヌクレオチド領域により決定される。
方法に従い使用される発現ベクターは、当業者に公知の任意の適当な発現ベクターであり得る。一部の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一部実施形態において、発現ベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、発現ベクターは、pMIGIIである(Holstら、Nat. Protoc.、1(1):406～17ページ(2006))。
プライマー生成
インターネットベースのゲノムデータベースから未加工のテキストフォーマットで得た所定のDNA配列についてのプライマーの生成のため、マトラボ言語コードを使用して、アルゴリズムを発展させた。この方法は、他の形態のインプットについて容易に適合され得る。IMGTデータベースを使用して、全ての注釈を付けた機能的マウスVα及びVβ鎖のテキストフォーマットのリストを生成した。使用者は、プライマーについての融点の1つ又は2つの所望の温度範囲、及び同様にヌクレオチドの数の所望の範囲を設定することができた。加えて、使用者は、生じたプライマーの5'側に任意の一定のヌクレオチド配列を付加することができる。この実施例において、一定のヌクレオチド配列は20個のヌクレオチドであり、それは、それぞれ、アクセプターベクター又はフラグメントbに対して相同性を有するVα及びVβについてのプライマーに付加した。インプットパラメーターを設定したら、プログラムは、それぞれの配列名及びそれと結び付いた配列を自動的に認識し、それぞれの配列についての所定のインプット制約内で最適なプライマーを決定しながら、何百又は何千ものDNA配列を含有する未加工のテキストをスキャンした。プログラムは、ニアレストネイバー方法(Santa Lucia、J Jr. (1998) 「A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics.」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95、1460～1465)を使用して、融解温度を計算し、できるだけ互いに融点に近いプライマーを組み立てる。
アウトプットとして、プログラムは、テキストファイルの一連のリストを自動で保存する。
1.全てのプライマー、並びに融点温度、温度範囲、プライマーが、所望のパラメーター並びにいくつのプライマーがうまくいったか、及びいくつが繰り返しプライマーであるかについての一般的な記述内に当てはまり得るかどうか、であるそれらの特性を挙げた全結果報告書。
2.繰り返しのないプライマー及び全てのその特性のみを含むリスト。
3.繰り返しプライマー及び全てのその特性を含むリスト。
4.プライマー名のリスト。
5.プライマーを注文するための購入リスト。
6.それらの融点温度、それらのサイズ、及びそれらが属する温度範囲にわたるプライマーの分布についてのヒストグラムを含む統計的解析。
全計算プロセスは、使用者が働く日数を減らし、所望の最終プライマーについて異なる可能性を迅速に試すことを可能にしながら、事実上即時のものである。
TCR発現ベクターのアセンブリ
「プライマー生成」の節に記載した方法を使用して、今までにIMGTデータバンクにおいて注釈を付けた任意のマウス系統のVαレパートリー並びにVβレパートリーの全てのリーダー配列に、一緒に結合し得るフォワードプライマーのセットを作製した。これらのVα及びVβプライマーの配列を、それぞれ、配列番号345～416及び配列番号417～441において提供する。α及びβの定常領域に結合するリバースプライマー(それぞれ、配列番号339及び配列番号340)と組合せでのこれらのプライマーを、ワンステップRT-PCR反応においてクローナルな集団のmRNA又は単一細胞のいずれかと一緒に使用して、全長の発現可能なV配列を増幅することができる。それぞれのフォワードプライマーの5'末端上に、ベクターに対する又はアルファ鎖の定常領域及びその下流の2aエレメントを含有するDNAフラグメント(本明細書において以下、「フラグメントb」)に対する相同性を有する一定の20ヌクレオチドセグメントが存在する(図15を参照)。一実施例において、Vαプライマーの不変の20ヌクレオチドは、pMIGIIレトロウイルスベクターベースの直鎖化されたアクセプターベクターの5'末端に対する相同性を有し、Vβプライマーの不変の20ヌクレオチドは、フラグメントbの3'末端に相同である(図14及び15)。直鎖化されたアクセプターベクターは、その3'末端上にベータ鎖の定常領域を含有する。
RT-PCR後、試料を分け、α及びβ鎖について、Vα又はVβの不変の部分のいずれかに結合する18ヌクレオチドのフォワードプライマー、並びにCα及びCβについてのネステッドリバースプライマーで、ネステッドPCRを行う。ネステッドPCRの完了後、Vα＋20ヌクレオチドのCα、及びVβ＋20ヌクレオチドのCβを含有する産物を、総反応液10μLにおいて、ギブソンアセンブリ方法を使用して、フラグメントbと一緒に直鎖化したアクセプターベクター中にアセンブルする。例として、直鎖化した(アクセプター)ベクター50ng、アルファアンプリコン10ng、ベータアンプリコン10ng、及びフラグメントb 10ng(計10μLの混合物)を、2×ギブソンアセンブリ酵素(NEBのキット)10μLに加え、1時間、50℃でインキュベートする。
TCR発現ベクターの特徴付け
TCR発現ベクターの作製後、取り得る2つの下流ストラテジーがあり、ここで、それぞれの単一細胞のVα/Vβが、1つの環状DNAフラグメントにおいて連結していることに注意する(図16)。
ストラテジー1は、区別したそれぞれのTCRのギブソンアセンブリ反応を維持する工程、及び大腸菌(E. coli)においてそれぞれ単一反応液として形質転換する工程からなる。第1のRT-PCRからギブソンアセンブリまでの工程、及び大腸菌における形質転換は、およそ8時間で完了する。翌日、それぞれのTCRの5つのコロニーを、アンピシリンを含有するLB培地5～10mLにおいて一緒に成長させ、それぞれのTCRについて、プラスミドミニプレップを行う。ギブソンアセンブリ反応は、およそ30～50%の陽性コロニーをもたらすので、およそ5つのうち少なくとも1つのコロニーが、正しいα及びβインサートを含むレトロウイルスベクターを含有する。次に、12ウェルプレート上で成長させたPlatE細胞に、DMEM培地1～1.5mL中のそれぞれのプラスミドプール2～5μg及びEcohelperプラスミド1.4～3.6μgでをトランスフェクトする。24時間後、4G4 TCRα-/-CD4+細胞0.5～1×105個を、12ウェルプレートにおいてそれぞれのPlatEウェル由来のRV上清1～1.5mLで又は48ウェルプレートにおいて1mLで形質導入する。翌日、ウイルス上清を用いて形質導入を繰り返す。
メンブレン上でのTCR発現の検出及び抗原についてのスクリーニングを、3日目又は4日目に行う。プール(不正確にアセンブルされた及び/又は空のアクセプターベクターを含有し得る)の代わりに、単一の正しいRVベクターが好ましいとき、プールを、細菌に再度形質転換し、プラスミドをEcoRI及びXhoIで消化することにより、α及びβ鎖の正しい挿入について、細菌のコロニーをスクリーニングする。消化後、正しくアセンブルされたα並びにβ産物を含有するフラグメント(又はアルファ若しくは/及びベータが、EcoRI若しくは/及びXhoI制限酵素部位を含有するなら、フラグメントの合計)のサイズは、およそ1.8kbでなければならず、ベクター骨格のサイズは、およそ6.3kbでなければならない。このストラテジーは、未知のT細胞の中スループットのクローニング及び抗原のスクリーニングに適している。
ストラテジー2を、高スループットの目的に取り組むように設計する。このストラテジーにおいて、それぞれのTCRのギブソンアセンブリ反応液をプールし(1つのプール当たり最大40個のTCR)、大腸菌の化学成分120μL中8μLで形質転換する。細菌を、アンピシリンを含有するLB寒天上に播種する。播種の12時間後すぐに、細菌のコロニーを拾い、アンピシリンを含有する液体LBにおいて成長させる。200個以下のコロニー(1個のコロニー/LB培地2.5mL)を拾い、一緒に一晩、LB培地500mLにおいて成長させる。ギブソンアセンブリ反応は、およそ30～50%の陽性コロニーをもたらすので、拾った200個のコロニーは、正しいα及びβインサートを含む60～100個のレトロウイルスベクター、理論上、1つのインプットTCR当たり少なくとも1個の正しいレトロウイルス(1個のプール当たり40個、上記)を含有する。およそ12時間後、マキシプレップを行い、プラスミドDNAライブラリーを単離する。DMEM培地20mLを含有する6個のT175フラスコにおいて12時間成長させたPlatE細胞それぞれに、脂質トランスフェクション試薬を使用して、1個のフラスコ当たりEco-ヘルパープラスミド25μg及びプラスミドライブラリー35μgをトランスフェクトする。24時間後、それぞれが、2×106個の指数関数的に成長している4G4 TCRα-/-CD4+細胞(或いは、他のCD4+、例えば、B3Z/lacZ、又はCD8+細胞株を使用することができる)を含む、5個のT75フラスコを、ウイルス上清20mLで形質導入する。翌日、ウイルス上清を用いた形質導入を繰り返した。
メンブレン上でのTCR発現の検出及び抗原特異性についてのスクリーニングを、3日目～4日目に行う。抗原のTCR依存性認識を経験した4G4細胞は、IL-2を分泌した(他のレシピエント指標細胞を容易に使用することができることに注意)。反応性4G4細胞を、表面IL-2捕捉又は他の手段に基づき単一細胞として選別する。これらの細胞におけるVα-2a-Vβ導入遺伝子(およそ1850bp)を、EcoRIの20ヌクレオチド上流及びXhoI制限酵素部位20ヌクレオチド下流のゲノムに組み込まれたプロウイルスに結合するように設計したプライマーでPCRを行うことにより、増幅する。機能的及び抗原特異的TCRを有するレトロウイルスベクターを得るために、Vα-2a-Vβ導入遺伝子を、EcoRI及びXhoIで切断したアセンブリベクターにおいて、迅速にアセンブルすることができる。このストラテジーは、未知の特異性の高スループットクローニング、続く、候補抗原の巨大スケールのスクリーニングに十分に合致する。作製したライブラリーをまた増幅し、再利用することができる。
本明細書に開示した方法において使用したさらなる配列:
FASTAフォーマットの自己切断可能なペプチド2Aをコードするヌクレオチド配列(配列番号336):
5'-GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC-3'
FASTAフォーマットのフラグメントbをコードするヌクレオチド配列(配列番号337):
5'-ACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCT
CGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGTGGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC-3'
FASTAフォーマットのCβをコードするヌクレオチド配列(配列番号338):
5'-AGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCC
ATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGAAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGAATCACTTCAGCATCCTATCATCAGGGGGTTCTGTCTGCAACCATCCTCTATGAGATCCTACTGGGGAAGGCCACCCTATATGCTGTGCTGGTCAGTGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAAAAAAAATTCCTGA-3'
第1のリバースCαプライマー(配列番号339):
GTCAAAGTCGGTGAACAGGC
第1のリバースCβプライマー(配列番号340):
TTGGGTGGAGTCACATTTCTC
Cαについてのネステッドリバースプライマー(第2のリバースCαプライマー)(配列番号341):
AGGTTCTGGGTTCTGGATGT
Cβについてのネステッドリバースプライマー(第2のリバースCβプライマー)(配列番号342):
GGAGTCACATTTCTCAGATCCT
ネステッドフォワードアルファ(第2のフォワードVαプライマー)(配列番号343):
TCTAGGCGCCGGAATTCA
ネステッドフォワードベータ(第2のフォワードVβプライマー)(配列番号344):
GAAGAAAACCCCGGTCCC
プライマーアルファ(Vα)プール(複数の第1のフォワードVαプライマー)(配列番号345～配列番号416):
ATN-a1: tctctaggcgccggaattcaatgctgcagatgtgggggtttg (配列番号345)
ATN-a2: tctctaggcgccggaattcaatgaagacatcccttcacactg (配列番号346)
ATN-a3: tctctaggcgccggaattcaatggataaaacatcccttcaca (配列番号347)
ATN-a4: tctctaggcgccggaattcaatggattaagacatcccttcac (配列番号348)
ATN-a5: tctctaggcgccggaattcaatgaaaaagtgccttagtgcct (配列番号349)
ATN-a6: tctctaggcgccggaattcaatgaaaaagcgcctgagtgcct (配列番号350)
ATN-a7: tctctaggcgccggaattcaatgaaaaagtgcctgagtgcct (配列番号351)
ATN-a8: tctctaggcgccggaattcaatgcgtcctgtcacctgctcag (配列番号352)
ATN-a9: tctctaggcgccggaattcaatgaacatgcatcctgtcacct (配列番号353)
ATN-a10: tctctaggcgccggaattcaatgcgtcctggcacctgc (配列番号354)
ATN-a11: tctctaggcgccggaattcaatgcgtcctgacacctgctcag (配列番号355)
ATN-a12: tctctaggcgccggaattcaatgaacatgcgtcctgtcacct (配列番号356)
ATN-a13: tctctaggcgccggaattcaatgcgtcctgtcacctcctcag (配列番号357)
ATN-a14: tctctaggcgccggaattcaatgcgtcctgacacctcctcag (配列番号358)
ATN-a15: tctctaggcgccggaattcaatgaacaggctgctgtgctctc (配列番号359)
ATN-a16: tctctaggcgccggaattcaatgaagaggctgctgtgttctc (配列番号360)
ATN-a17: tctctaggcgccggaattcaatgaagaggctgctgtgctctc (配列番号361)
ATN-a18: tctctaggcgccggaattcaatgaagaggctgatgtgctctc (配列番号362)
ATN-a19: tctctaggcgccggaattcaatgaggaggctgatgtgttctc (配列番号363)
ATN-a20: tctctaggcgccggaattcaatgaagaggctgctgagctctc (配列番号364)
ATN-a21: tctctaggcgccggaattcaatgaagaggctagtgtgttctc (配列番号365)
ATN-a22: tctctaggcgccggaattcaatgaaaaggctgctgtgctctc (配列番号366)
ATN-a23: tctctaggcgccggaattcaatggacaagatcctgacagcaa (配列番号367)
ATN-a24: tctctaggcgccggaattcaatggacacgatcctgacagcat (配列番号368)
ATN-a25: tctctaggcgccggaattcaatggacaagatcctgacagcat (配列番号369)
ATN-a26: tctctaggcgccggaattcaatggacaagattctgacagcat (配列番号370)
ATN-a27: tctctaggcgccggaattcaatggacaagaacctgacagcat (配列番号371)
ATN-a28: tctctaggcgccggaattcaatgcctcctcacagcctg (配列番号372)
ATN-a29: tctctaggcgccggaattcaatgcctcctcagagcctg (配列番号373)
ATN-a30: tctctaggcgccggaattcaatgcctcctcacagcctgttct (配列番号374)
ATN-a31: tctctaggcgccggaattcaatgctgattctaagcctgttgg (配列番号375)
ATN-a32: tctctaggcgccggaattcaatgttcctagtgaccattctgc (配列番号376)
ATN-a33: tctctaggcgccggaattcaatgttcccagtgaccattctgc (配列番号377)
ATN-a34: tctctaggcgccggaattcaatgactggcttcctgaaggcct (配列番号378)
ATN-a35: tctctaggcgccggaattcaatgaagcaggtggcaaaagtga (配列番号379)
ATN-a36: tctctaggcgccggaattcaatgggatgtgtgagtggaattg (配列番号380)
ATN-a37: tctctaggcgccggaattcaatgaagacagtgactggacctt (配列番号381)
ATN-a38: tctctaggcgccggaattcaatgaagacggtgactggacctt (配列番号382)
ATN-a39: tctctaggcgccggaattcaatgaaaacagtgactggacctt (配列番号383)
ATN-a40: tctctaggcgccggaattcaatggagaggagcccggga (配列番号384)
ATN-a41: tctctaggcgccggaattcaatggagaggaacctggttgctg (配列番号385)
ATN-a42: tctctaggcgccggaattcaatgcagaggaacctgggagctg (配列番号386)
ATN-a43: tctctaggcgccggaattcaatgcagaggaacctggttgctg (配列番号387)
ATN-a44: tctctaggcgccggaattcaatggagaggaacctgggagctg (配列番号388)
ATN-a45: tctctaggcgccggaattcaatgaagacagctattcatgctt (配列番号389)
ATN-a46: tctctaggcgccggaattcaatgaaaacatacgctcctacat (配列番号390)
ATN-a47: tctctaggcgccggaattcaatgaaaacatatgctcctacattattca (配列番号391)
ATN-a48: tctctaggcgccggaattcaatgaactattctccagctttagtg (配列番号392)
ATN-a49: tctctaggcgccggaattcaatgaacacttctccagctttag (配列番号393)
ATN-a50: tctctaggcgccggaattcaatgaacaattccccagctttag (配列番号394)
ATN-a51: tctctaggcgccggaattcaatgaatacttctccagttttagtaact (配列番号395)
ATN-a52: tctctaggcgccggaattcaatgaacctttatcctgaactgg (配列番号396)
ATN-a53: tctctaggcgccggaattcaatgaacctttgtcctgaactgg (配列番号397)
ATN-a54: tctctaggcgccggaattcaatggactcttctccaggcttcg (配列番号398)
ATN-a55: tctctaggcgccggaattcaatgaactcttctccaggcttca (配列番号399)
ATN-a56: tctctaggcgccggaattcaatgaatacttctccagttttagtga (配列番号400)
ATN-a57: tctctaggcgccggaattcaatggacttttctccaggcttcg (配列番号401)
ATN-a58: tctctaggcgccggaattcaatgaagtccttgtgtgtttcac (配列番号402)
ATN-a59: tctctaggcgccggaattcaatgaaatccttgagtgtttcact (配列番号403)
ATN-a60: tctctaggcgccggaattcaatgaaatcctttagtatttccctagtg (配列番号404)
ATN-a61: tctctaggcgccggaattcaatgaaatccttgagtgtttccc (配列番号405)
ATN-a62: tctctaggcgccggaattcaatgcattccttacatgtttcac (配列番号406)
ATN-a63: tctctaggcgccggaattcaatggtacaaacacagatgttct (配列番号407)
ATN-a64: tctctaggcgccggaattcaatgaaatccttgagtgttttactagt (配列番号408)
ATN-a65: tctctaggcgccggaattcaatgcacagcctcctgggg (配列番号409)
ATN-a66: tctctaggcgccggaattcaatgaacagattcctgggaatat (配列番号410)
ATN-a67: tctctaggcgccggaattcaatgcacagcctcctagggttgt (配列番号411)
ATN-a68: tctctaggcgccggaattcaatgctcctggtcctcatctcgt (配列番号412)
ATN-a69: tctctaggcgccggaattcaatgctcctggttctcatctcgt (配列番号413)
ATN-a70: tctctaggcgccggaattcaatgctcctggtgctcctc (配列番号414)
ATN-a71: tctctaggcgccggaattcaatgctcctggcgctcctc (配列番号415)
ATN-a72: tctctaggcgccggaattcaatgctcctggcactcctc (配列番号416)
プライマーベータ(Vβ)プール(複数の第1のフォワードVβプライマー)(配列番号417～配列番号441):
ATN-b1: tggaagaaaaccccggtcccatgtggcagttttgcattctgt (配列番号417)
ATN-b2: tggaagaaaaccccggtcccatgccacggacaccaggc (配列番号418)
ATN-b3: tggaagaaaaccccggtcccatgtctaacactgtcctcgctg (配列番号419)
ATN-b4: tggaagaaaaccccggtcccatgtctaacactgccttccctg (配列番号420)
ATN-b5: tggaagaaaaccccggtcccatgtgtaatactaccctccttaatttt (配列番号421)
ATN-b6: tggaagaaaaccccggtcccatgggctccaggctctttctgg (配列番号422)
ATN-b7: tggaagaaaaccccggtcccatgggctccaggctcttcttcg (配列番号423)
ATN-b8: tggaagaaaaccccggtcccatgggctccagactcttctttg (配列番号424)
ATN-b9: tggaagaaaaccccggtcccatgggcaccaggcttctt (配列番号425)
ATN-b10: tggaagaaaaccccggtcccatgggcatccagaccctctgtt (配列番号426)
ATN-b11: tggaagaaaaccccggtcccatggcccccaggctccttttc (配列番号427)
ATN-b12: tggaagaaaaccccggtcccatggatcctagacttctttgct (配列番号428)
ATN-b13: tggaagaaaaccccggtcccatgaacaagtgggttttctgct (配列番号429)
ATN-b14: tggaagaaaaccccggtcccatgggctccattttcctcagtt (配列番号430)
ATN-b15: tggaagaaaaccccggtcccatgttactgcttctattacttctgg (配列番号431)
ATN-b16: tggaagaaaaccccggtcccatgggtgcacggctcatttgctat (配列番号432)
ATN-b17: tggaagaaaaccccggtcccatgggtgcaagactgctc (配列番号433)
ATN-b18: tggaagaaaaccccggtcccatgactgccaagttcatgcatt (配列番号434)
ATN-b19: tggaagaaaaccccggtcccatggtcaccagtctctcaagat (配列番号435)
ATN-b20: tggaagaaaaccccggtcccatgagagttaggctcatctctg (配列番号436)
ATN-b21: tggaagaaaaccccggtcccatggatatctggcttctaggtt (配列番号437)
ATN-b22: tggaagaaaaccccggtcccatgctgtactctctccttgcct (配列番号438)
ATN-b23: tggaagaaaaccccggtcccatgggctgtaggctcctaagct (配列番号439)
ATN-b24: tggaagaaaaccccggtcccatgagctgcaggcttctcctct (配列番号440)
ATN-b25: tggaagaaaaccccggtcccatgggctgaaaaatgctctgct (配列番号441)
本文書はまた以下を提供する。
パラグラフ番号1.単一T細胞からVα領域及びVβ領域を含むT細胞受容体発現ベクターをアセンブルする方法であって、
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化されたベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程
を含む、方法。
2.工程(d)及び(e)が単一反応において行われる、パラグラフ番号1に記載の方法。
3.工程(f)及び(g)が単一反応において行われる、パラグラフ番号1又はパラグラフ番号2に記載の方法。
4.ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程が、短い領域の相同性を利用するシームレスクローニング方法を含む、パラグラフ番号1～3のいずれか1つに記載の方法。
5.ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程が、ギブソンアセンブリ方法を含む、パラグラフ番号1～3のいずれか1つに記載の方法。
6.第1のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～5のいずれか1つに記載の方法。
7.第1のヌクレオチド配列が、20ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～5のいずれか1つに記載の方法。
8.第5のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～7のいずれか1つに記載の方法。
9.第5のヌクレオチド配列が、20ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～7のいずれか1つに記載の方法。
10.第9のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～9のいずれか1つに記載の方法。
11.第9のヌクレオチド配列が、18ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～9のいずれか1つに記載の方法。
12.第12のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～11のいずれか1つに記載の方法。
13.第12のヌクレオチド配列が、18ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号1～11のいずれか1つに記載の方法。
14.直鎖化されたベクターがpMIGIIを含む、パラグラフ番号1～13のいずれか1つに記載の方法。
15.2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列が、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される、パラグラフ番号1～14のいずれか1つに記載の方法。
16.T細胞がヒト由来である、パラグラフ番号1～15のいずれか1つに記載の方法。
17.T細胞がマウス由来である、パラグラフ番号1～15のいずれか1つに記載の方法。
パラグラフ番号18.単一T細胞からVα領域及びVβ領域を含むT細胞受容体(TCR)発現ベクターをアセンブルする方法であって、
a.5'末端、3'末端、及びTCR Cβをコードする第1のポリヌクレオチド配列を含む直鎖化されたベクターを得る工程、
b.フラグメントbポリヌクレオチド配列を得る工程であって、フラグメントbポリヌクレオチド配列が、2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したTCR Cαをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、工程、
c.単一T細胞からRNAを得る工程、
d.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、直鎖化したベクターの5'末端で第2のヌクレオチド配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVαプライマーであって、第1のヌクレオチド配列が、Vα遺伝子の複数の第1のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVαプライマー、及び
2.フラグメントbの5'末端で第4のヌクレオチド配列に相補的である第3のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCαプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
e.ワンステップ逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行って、TCR Vβアンプリコン産物の第1のセットを増幅する工程であって、
i.RNAのcDNAへの逆転写を行う工程、
ii.cDNA上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であって、
1.5'末端に、フラグメントbの3'末端で第6のヌクレオチド配列に相補的である第5のヌクレオチド配列を含む、複数の第1のフォワードVβプライマーであって、第5のヌクレオチド配列が、Vβ遺伝子の複数の第2のリーダー配列に作動可能に連結している、複数の第1のフォワードVβプライマー、及び
2.直鎖化されたベクターの3'末端で第8のヌクレオチド配列に相補的である第7のヌクレオチド配列を有する、第1のリバースCβプライマー
を使用する、工程
を含む、工程、
f.TCR Vαアンプリコン産物の第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR Vαアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVαプライマーの第1のヌクレオチド配列の一部を含有する第9のヌクレオチド配列を含む、第2のフォワードVαプライマー、及び
ii.フラグメントbの5'末端で第11のヌクレオチド配列に相補的である第10のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCαプライマー
を使用する、工程、
g.TCR Vβアンプリコンの第1のセット上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行って、TCR βアンプリコン産物の第2のセットを増幅する工程であって、
i.第1のフォワードVβプライマーの第5のヌクレオチド配列の一部を含有する、その5'末端に第12のヌクレオチド配列を有する、第2のフォワードVβプライマー、及び
ii.直鎖化されたベクターの3'末端で第14のヌクレオチド配列に相補的である第13のヌクレオチド配列を有する、第2のリバースCβプライマー
を使用する、工程、
h.以下:
i.直鎖化されたベクターの5'末端、
ii.TCR Vαアンプリコン産物の第2のセット、
iii.フラグメントbポリヌクレオチド配列、
iv.TCR Vβアンプリコン産物の第2のセット、及び
v.直鎖化されたベクターの3'末端
の5'から3'方向でのライゲーションにより、TCR発現ベクターをアセンブルする工程
を含む、方法。
19.工程(d)及び(e)が単一反応において行われる、パラグラフ番号18に記載の方法。
20.工程(f)及び(g)が単一反応において行われる、パラグラフ番号18又はパラグラフ番号19に記載の方法。
21.ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程が、短い領域の相同性を利用するシームレスクローニング方法を含む、パラグラフ番号18～20のいずれか1つに記載の方法。
22.ライゲーションによりTCR発現ベクターをアセンブルする工程が、ギブソンアセンブリ方法を含む、パラグラフ番号18～20のいずれか1つに記載の方法。
23.第1のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～22のいずれか1つに記載の方法。
24.第1のヌクレオチド配列が、20ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～22のいずれか1つに記載の方法。
25.第5のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～24のいずれか1つに記載の方法。
26.第5のヌクレオチド配列が、20ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～24のいずれか1つに記載の方法。
27.第9のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～26のいずれか1つに記載の方法。
28.第9のヌクレオチド配列が、18ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～26のいずれか1つに記載の方法。
29.第12のヌクレオチド配列が、15～25ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～28のいずれか1つに記載の方法。
30.第12のヌクレオチド配列が、18ヌクレオチドの長さである、パラグラフ番号18～28のいずれか1つに記載の方法。
31.直鎖化されたベクターがpMIGIIを含む、パラグラフ番号18～30のいずれか1つに記載の方法。
32.2Aをコードする第3のポリヌクレオチド配列が、配列番号332、配列番号333、配列番号334、又は配列番号335から選択される、パラグラフ番号18～31のいずれか1つに記載の方法。
33.T細胞がヒト由来である、パラグラフ番号18～32のいずれか1つに記載の方法。
34.T細胞がマウス由来である、パラグラフ番号18～32のいずれか1つに記載の方法。
［実施例8 本明細書において提供する他の実施形態を説明するパラグラフ］
本文書はまた以下を提供する。
段落番号35.機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
(a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
(b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
(c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、シグナル伝達ドメインを含む機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程
を含む、方法。
36.前記複数が50より多い、パラグラフ番号35に記載の方法。
37.前記複数が500より多い、パラグラフ番号35に記載の方法。
38.前記複数が5000より多い、パラグラフ番号35に記載の方法。
39.前記複数の核酸ベクターが、複数の核酸発現ベクターである、パラグラフ番号35～38のいずれか1つに記載の方法。
40.前記デバイスがマルチウェルプレートを含む、パラグラフ番号35～39のいずれか1つに記載の方法。
41.前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレート、又は1536ウェルプレートである、パラグラフ番号40に記載の方法。
42.単一T細胞から得られたRNAから生成された前記cDNAが、単一ヒトT細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含む、パラグラフ番号35～41のいずれか1つに記載の方法。
43.前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～42のいずれか1つに記載の方法。
44.前記第1の増幅産物が、Jα又はJγセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～43のいずれか1つに記載の方法。
45.前記第1の増幅産物が、Cα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～44のいずれか1つに記載の方法。
46.前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列、Jα又はJγセグメント、及びCα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～45のいずれか1つに記載の方法。
47.前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～46のいずれか1つに記載の方法。
48.前記第2の増幅産物が、Dβ又はDδセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～47のいずれか1つに記載の方法。
49.前記第2の増幅産物が、Jβ又はJδセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～48のいずれか1つに記載の方法。
50.前記第2の増幅産物が、Cβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～49のいずれか1つに記載の方法。
51.前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列、Dβ又はDδセグメント、Jβ又はJδセグメント、及びCβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号35～50のいずれか1つに記載の方法。
52.前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、パラグラフ番号35～51のいずれか1つに記載の方法。
53.前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、パラグラフ番号35～52のいずれか1つに記載の方法。
54.前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第1のアダプター配列を含み、前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第2のアダプター配列を含み、前記第1及び第2のアダプター配列が異なる、パラグラフ番号35～53のいずれか1つに記載の方法。
55.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在するVα/Vβの組合せ又はVγ/Vδの組合せを含む、パラグラフ番号35～54のいずれか1つに記載の方法。
56.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含む、パラグラフ35～55のいずれか1つに記載の方法。
57.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含む、パラグラフ番号35～56のいずれか1つに記載の方法。
58.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)全長α定常領域及び全長β定常領域又は(b)全長γ定常領域及び全長δ定常領域を含む、パラグラフ番号35～57のいずれか1つに記載の方法。
59.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、自己切断ペプチドをコードする核酸配列又は配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む、パラグラフ番号35～58のいずれか1つに記載の方法。
60.単一T細胞を前記別々の場所に選別する工程を含む、パラグラフ番号35～59のいずれか1つに記載の方法。
61.逆転写反応を行って、前記cDNAを得る工程を含む、パラグラフ番号35～60のいずれか1つに記載の方法。
62.前記アセンブルする工程がシームレスクローニングを含む、パラグラフ番号35～61のいずれか1つに記載の方法。
63.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、核酸配列決定を行うことなく得られる、パラグラフ番号35～62のいずれか1つに記載の方法。
64.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、制限酵素切断反応を行うことなく得られる、パラグラフ番号35～63のいずれか1つに記載の方法。
65.前記異種性シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、OX-40シグナル伝達ドメイン、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD30シグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、又はGITRシグナル伝達ドメインである、パラグラフ番号35～64のいずれか1つに記載の方法。
66.前記異種性シグナル伝達ドメインが、前記機能的T細胞受容体の定常領域に結合している、パラグラフ番号35～65のいずれか1つに記載の方法。
パラグラフ番号67.可溶性T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
(a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
(b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
(c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、可溶性T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程
を含む、方法。
68.前記複数が50より多い、パラグラフ番号67に記載の方法。
69.前記複数が500より多い、パラグラフ番号67に記載の方法。
70.前記複数が5000より多い、パラグラフ番号67に記載の方法。
71.前記複数の核酸ベクターが、複数の核酸発現ベクターである、パラグラフ番号67～70のいずれか1つに記載の方法。
72.前記デバイスがマルチウェルプレートを含む、パラグラフ番号67～71のいずれか1つに記載の方法。
73.前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレート、又は1536ウェルプレートである、パラグラフ番号72に記載の方法。
74.単一T細胞から得られたRNAから生成された前記cDNAが、単一ヒトT細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含む、パラグラフ番号67～73のいずれか1つに記載の方法。
75.前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～74のいずれか1つに記載の方法。
76.前記第1の増幅産物が、Jα又はJγセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～75のいずれか1つに記載の方法。
77.前記第1の増幅産物が、Cα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～76のいずれか1つに記載の方法。
78.前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列、Jα又はJγセグメント、及びCα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～77のいずれか1つに記載の方法。
79.前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～78のいずれか1つに記載の方法。
80.前記第2の増幅産物が、Dβ又はDδセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～79のいずれか1つに記載の方法。
81.前記第2の増幅産物が、Jβ又はJδセグメントをコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～80のいずれか1つに記載の方法。
82.前記第2の増幅産物が、Cβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～81のいずれか1つに記載の方法。
83.前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列、Dβ又はDδセグメント、Jβ又はJδセグメント、及びCβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、パラグラフ番号67～82のいずれか1つに記載の方法。
84.前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、パラグラフ番号67～83のいずれか1つに記載の方法。
85.前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、パラグラフ番号67～84のいずれか1つに記載の方法。
86.前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第1のアダプター配列を含み、前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第2のアダプター配列を含み、前記第1及び第2のアダプター配列が異なる、パラグラフ番号67～85のいずれか1つに記載の方法。
87.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記可溶性T細胞受容体が、前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在するVα/Vβの組合せ又はVγ/Vδの組合せを含む、パラグラフ番号67～86のいずれか1つに記載の方法。
88.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記可溶性T細胞受容体が、(a)全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含む、パラグラフ67～87のいずれか1つに記載の方法。
89.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記可溶性T細胞受容体が、(a)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長α可変領域及び全長β可変領域又は(b)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長γ可変領域及び全長δ可変領域を含む、パラグラフ番号67～88のいずれか1つに記載の方法。
90.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記可溶性T細胞受容体が、(a)全長α定常領域及び全長β定常領域、又は(b)全長γ定常領域及び全長δ定常領域、を含む、パラグラフ番号67～89のいずれか1つに記載の方法。
91.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、自己切断ペプチドをコードする核酸配列又は配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む、パラグラフ番号67～90のいずれか1つに記載の方法。
92.単一T細胞を前記別々の場所に選別する工程を含む、パラグラフ番号67～91のいずれか1つに記載の方法。
93.逆転写反応を行って、前記cDNAを得る工程を含む、パラグラフ番号67～92のいずれか1つに記載の方法。
94.前記アセンブル工程がシームレスクローニングを含む、パラグラフ番号67～93のいずれか1つに記載の方法。
95.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、核酸配列決定を行うことなく得られる、パラグラフ番号67～94のいずれか1つに記載の方法。
96.前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、制限酵素切断反応を行うことなく得られる、パラグラフ番号67～95のいずれか1つに記載の方法。
97.前記異種性可溶性T細胞受容体が、膜貫通ドメインを欠くか、及び/又はそのα鎖(若しくはγ鎖)の細胞内ドメインを欠く、パラグラフ番号67～96のいずれか1つに記載の方法。
98.前記異種性可溶性T細胞受容体が、膜貫通ドメインを欠くか、及び/又はそのβ鎖(若しくはδ鎖)の細胞内ドメインを欠く、パラグラフ番号67～97のいずれか1つに記載の方法。
99.前記異種性可溶性T細胞受容体が、膜貫通ドメインを欠くか、及び/又はそのα鎖とβ鎖両方(若しくはそのγ鎖とδ鎖両方)の細胞内ドメインを欠く、パラグラフ番号67～98のいずれか1つに記載の方法。
100.前記異種性可溶性T細胞受容体が、膜貫通ドメインを欠き、そのα鎖とβ鎖両方(若しくはそのγ鎖とδ鎖両方)の細胞内ドメインを欠く、パラグラフ番号67～99のいずれか1つに記載の方法。
パラグラフ番号101.表1～12のいずれか1つに記載の1つ以上のプライマーを含む、組成物。
102.表1に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
103.表2に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
104.表3に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
105.表4に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
106.表5に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
107.表6に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
108.表7に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
109.表8に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
110.表9に記載のプライマーの1つ又は2つを含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
111.表10に記載のプライマーの1つ又は2つを含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
112.表11に記載のプライマーの1つを含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
113.表12に記載のプライマーの1つを含む、パラグラフ番号101に記載の組成物。
パラグラフ番号114.配列番号283～294に記載の1つ以上のプライマーを含む、組成物。
パラグラフ番号115.配列番号283～288に記載の1つ以上のプライマー及び表1に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、組成物。
パラグラフ番号116.配列番号289～294に記載の1つ以上のプライマー及び表2に記載の1つ以上のプライマー(例えば、少なくとも1、5、10、15、又は20個のプライマー)を含む、組成物。
パラグラフ番号117.機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
(a)T細胞をデバイス(例えば、マルチウェルプレート、例えば、384ウェルプレート)の複数の別々の場所に選別して、前記複数の別々の場所のそれぞれ毎に1つの選別されたT細胞を得る工程、
(b)前記複数の別々の場所の前記選別されたT細胞のそれぞれを溶解して、RNAを放出させる工程、
(c)前記放出されたRNAからcDNAを生成する工程、
(d)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
(e)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、
を含む、方法。
パラグラフ番号118.機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターからクローニングされたT細胞受容体を発現させる方法であって、
(a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
(b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、
(c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得て、それにより、異なるアセンブルされた核酸ベクターのコレクションを得る工程であって、前記複数の別々の場所の前記cDNAについてそれぞれのアセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、並びに
(d)異なるアセンブルされた核酸ベクターの前記コレクションを細胞に導入する工程であって、前記細胞が、導入されたベクターから機能的T細胞受容体を発現する、工程
を含む、方法。
119.T細胞受容体活性について前記細胞をスクリーニングする工程を含む、パラグラフ番号118に記載の方法。
120.前記導入する工程の後に、前記細胞を選別する工程を含む、パラグラフ番号118又はパラグラフ番号119に記載の方法。
パラグラフ番号121.機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターからクローニングされたT細胞受容体を発現させる方法であって、
(a)T細胞をデバイス(例えば、マルチウェルプレート、例えば、384ウェルプレート)の複数の別々の場所に選別して、前記複数の別々の場所のそれぞれ毎に1つの選別されたT細胞を得る工程、
(b)前記複数の別々の場所の前記選別されたT細胞のそれぞれを溶解して、RNAを放出させる工程、
(c)前記放出されたRNAからcDNAを生成する工程、
(d)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、
(e)前記複数別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得て、それにより、異なるアセンブルされた核酸ベクターのコレクションを得る工程であって、前記複数の別々の場所の前記cDNAについてそれぞれのアセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、並びに
(f)異なるアセンブルされた核酸ベクターの前記コレクションを細胞に導入する工程であって、前記細胞が、導入されたベクターから機能的T細胞受容体を発現する、工程
を含む、方法。
122.T細胞受容体活性について前記細胞をスクリーニングする工程を含む、パラグラフ番号121に記載の方法。
123.前記導入する工程の後に、前記細胞を選別する工程を含む、パラグラフ番号121又はパラグラフ番号122に記載の方法。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載される一方、前述の説明は、添付の請求の範囲により定義される、本発明の範囲を説明することが意図され、制限しないことは、理解されるべきである。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (39)

  1. 機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
    (a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
    (b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
    (c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程
    を含む方法。
  2. 前記複数が50より多い、請求項1に記載の方法。
  3. 前記複数が500より多い、請求項1に記載の方法。
  4. 前記複数が5000より多い、請求項1に記載の方法。
  5. 前記複数の核酸ベクターが複数の核酸発現ベクターである、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記デバイスがマルチウェルプレートを含む、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレート、又は1536ウェルプレートである、請求項6に記載の方法。
  8. 単一T細胞から得られたRNAから生成された前記cDNAが、単一ヒトT細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含む、請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列をコードする核酸を含む、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記第1の増幅産物が、Jα又はJγセグメントをコードする核酸を含む、請求項1～9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記第1の増幅産物が、Cα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントのL配列、Jα又はJγセグメント、及びCα又はCγ領域の5'部分をコードする核酸を含む、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列をコードする核酸を含む、請求項1～12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 前記第2の増幅産物が、Dβ又はDδセグメントをコードする核酸を含む、請求項1～13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記第2の増幅産物が、Jβ又はJδセグメントをコードする核酸を含む、請求項1～14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記第2の増幅産物が、Cβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、請求項1～15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントのL配列、Dβ又はDδセグメント、Jβ又はJδセグメント、及びCβ又はCδ領域の5'部分をコードする核酸を含む、請求項1～16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、請求項1～17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加されたアダプター配列を含む、請求項1～18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記第1の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第1のアダプター配列を含み、前記第2の増幅産物が、前記ネステッド増幅法の第2ラウンドの増幅を介して前記cDNAの増幅された鋳型配列に付加された第2のアダプター配列を含み、前記第1及び第2のアダプター配列が異なる、請求項1～17のいずれか1項に記載の方法。
  21. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在するVα/Vβの組合せ又はVγ/Vδの組合せを含む、請求項1～20のいずれか1項に記載の方法。
  22. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)全長α可変領域及び全長β可変領域、又は(b)全長γ可変領域及び全長δ可変領域、を含む、請求項1～21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長α可変領域及び全長β可変領域、又は(b)前記RNAの起源である前記単一T細胞に存在する全長γ可変領域及び全長δ可変領域、を含む、請求項1～22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれの前記機能的T細胞受容体が、(a)全長α定常領域及び全長β定常領域又は(b)全長γ定常領域及び全長δ定常領域を含む、請求項1～23のいずれか1項に記載の方法。
  25. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、自己切断ペプチドをコードする核酸配列又は配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む、請求項1～24のいずれか1項に記載の方法。
  26. 単一T細胞を前記別々の場所に選別する工程を含む、請求項1～25のいずれか1項に記載の方法。
  27. 逆転写反応を行って、前記cDNAを得る工程を含む、請求項1～26のいずれか1項に記載の方法。
  28. 前記アセンブルする工程がシームレスクローニングを含む、請求項1～27のいずれか1項に記載の方法。
  29. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、核酸配列決定を行うことなく得られる、請求項1～28のいずれか1項に記載の方法。
  30. 前記アセンブルされた核酸ベクターのそれぞれが、制限酵素切断反応を行うことなく得られる、請求項1～29のいずれか1項に記載の方法。
  31. 機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
    (a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
    (b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
    (c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、シグナル伝達ドメインを含む機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程
    を含む方法。
  32. 可溶性T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
    (a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
    (b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
    (c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、可溶性T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程
    を含む方法。
  33. 表1～12のいずれか1つに記載の1つ以上のプライマーを含む組成物。
  34. 配列番号283～294に記載の1つ以上のプライマーを含む組成物。
  35. 配列番号283～288に記載の1つ以上のプライマー及び表1に記載の1つ以上のプライマーを含む組成物。
  36. 配列番号289～294に記載の1つ以上のプライマー及び表2に記載の1つ以上のプライマーを含む組成物。
  37. 機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターを得る方法であって、
    (a)T細胞をデバイスの複数の別々の場所に選別して、前記複数の別々の場所のそれぞれ毎に1つの選別されたT細胞を得る工程、
    (b)前記複数の別々の場所の前記選別されたT細胞のそれぞれを溶解して、RNAを放出させる工程、
    (c)前記放出されたRNAからcDNAを生成する工程、
    (d)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、並びに
    (e)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得る工程であって、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記アセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、
    を含む方法。
  38. 機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターからクローニングされたT細胞受容体を発現させる方法であって、
    (a)複数の別々の場所を含むデバイスを得る工程であって、前記別々の場所のそれぞれが、前記別々の場所に選別された単一T細胞から得られたRNAから生成されたcDNAを含有する、工程、
    (b)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、
    (c)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得て、それにより、異なるアセンブルされた核酸ベクターのコレクションを得る工程であって、前記複数の別々の場所の前記cDNAについてそれぞれのアセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、並びに
    (d)異なるアセンブルされた核酸ベクターの前記コレクションを細胞に導入する工程であって、前記細胞が、導入されたベクターから機能的T細胞受容体を発現する、工程
    を含む方法。
  39. 機能的T細胞受容体をコードする核酸を含有する複数の核酸ベクターからクローニングされたT細胞受容体を発現させる方法であって、
    (a)T細胞をデバイスの複数の別々の場所に選別して、前記複数の別々の場所のそれぞれ毎に1つの選別されたT細胞を得る工程、
    (b)前記複数の別々の場所の前記選別されたT細胞のそれぞれを溶解して、RNAを放出させる工程、
    (c)前記放出されたRNAからcDNAを生成する工程、
    (d)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAを鋳型として使用するネステッド増幅法を行って、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて第1の増幅産物及び第2の増幅産物を得る工程であって、前記第1の増幅産物が、Vα又はVγセグメントをコードする核酸を含み、前記第2の増幅産物が、Vβ又はVδセグメントをコードする核酸を含む、工程、
    (e)前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについて前記第1の増幅産物及び前記第2の増幅産物を核酸ベクター中にアセンブルして、前記複数の別々の場所のそれぞれの前記cDNAについてアセンブルされた核酸ベクターを得て、それにより、異なるアセンブルされた核酸ベクターのコレクションを得る工程であって、前記複数の別々の場所の前記cDNAについてそれぞれのアセンブルされた核酸ベクターが、機能的T細胞受容体をコードする核酸を含む、工程、並びに
    (f)異なるアセンブルされた核酸ベクターの前記コレクションを細胞に導入する工程であって、前記細胞が、導入されたベクターから機能的T細胞受容体を発現する、工程
    を含む方法。
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