CN114502181A - 人工抗原特异性免疫调控性t(airt)细胞 - Google Patents
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Abstract
本文公开的组合物和方法的一些实施方式包括经基因编辑的人工免疫调控性T细胞(airT细胞)，所述airT细胞包含组成型表达的FoxP3基因产物和经转导的(例如通过基因编辑、病毒载体转导、转染或其它基因工程方法人工工程化的)T细胞受体(TCR)，所述FoxP3基因产物的表达水平等于或高于天然的调控性T(Treg或抑制性T)细胞中的FoxP3表达水平。在一些实施方式中，所述TCR优选地对与自身免疫性、过敏性或其它炎性病症相关的抗原而言是特异性的。一些实施方式包括airT细胞的制备方法和/或用途。一些此类实施方式包括airT细胞用于治疗和/或改善在其中抗原特异性免疫抑制可能是有益的紊乱(例如自身免疫性、过敏性或其它炎性紊乱)的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月10日提交的名称为“ARTIFICIAL ANTIGEN-SPECIFICIMMUNOREGULATORY T(AIRT)CELLS”的美国临时专利申请第62/987,810号以及2019年6月27日提交的名称为“ANTIGEN-SPECIFIC TREG THERAPY FOR AUTOIMMUNE DISEASE”的美国临时专利申请第62/867670号的优先权，各自以引用的方式将其整体明确地并入。
关于美国联邦资助研发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的合同号U01AI101981以及国防部授予的合同号W81XWH-15-1-0003的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。将序列表作为2020年6月23日创建的名称为SCRI252WOSEQLIST的文件提供，其大小为约550Kb。序列表的电子格式内的信息以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文提供的一些实施方式包括人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞。airT细胞包含人工工程化的免疫系统T淋巴细胞，所述免疫系统T淋巴细胞通过基因编辑被稳定地重编程以表现出某些调控性T细胞(Treg)的特性，并且还通过基因编辑、病毒载体转导、转染或其它基因工程方法进行人工工程化以表达期望的功能性T细胞抗原受体(TCR)或其它抗原受体(例如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方式中，所述airT细胞能够具有免疫抑制活性，通过TCR响应于特异性抗原识别。
背景技术
自身免疫性疾病(例如1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE，或“狼疮”))为慢性的、通常危及生命的病症，所述病症由免疫自我耐受性的改变导致，引发异常的免疫活性和终末器官病变。免疫耐受性的不适当和有害的失调也可不期望地导致与过敏、哮喘、移植排斥和/或移植物抗宿主病(GVHD)相关的病变。被称为调控性T细胞(Treg，也称为抑制性T细胞)的特化的抗原识别性源自胸腺的T淋巴细胞在维持免疫耐受性和阻止自身免疫中的作用已得到公认，并且多种自身免疫性病症的特征在于功能失调或调控失调的Treg区室(compartments)。
作为自身免疫性疾病的潜在疗法，已经在小鼠模型和早期临床试验中探索了根据其免疫抑制能力选择的功能性Treg向患病受试者的过继性转移。然而，此类Treg细胞缺乏自身抗原特异性、以及导致免疫抑制Treg活性丧失的不受控制的细胞可塑性(例如从免疫力的免疫抑制性负调控物向促炎效应样表型的转化)包括对此类Treg过继性转移的有效和持续的治疗益处的两种主要的限制。据信，与多特异性Treg的简单转移相比，使用被选择以抗原特异性地对疾病相关自身抗原进行应答的免疫抑制Treg将带来更安全、更有效的过继性转移策略。在此方面，在输注入受试者后，预期所述自身抗原特异性Treg细胞将特异性地归巢至自身免疫活性明显的组织部位，并且重要的是，将特异性地介导免疫抑制以响应于驱动自身免疫性疾病发病机制的所述自身抗原。支持此构思的是，小鼠中的研究已表明在自身免疫性疾病的鼠模型中，抗原特异性Treg比多克隆Treg更有效(Duggleby等，2018Front.Immunol.9:252；Tang等，2004 J Exp Med.199(11):1455-1465；Tarbell等，2004 JExp Med 199:1467-1477.)。
然而，过继性转移的抗原特异性Treg或甚至多克隆Treg用来治疗自身免疫性疾病的治疗应用受到如下限制，尤其是在从天然来源(例如血液和淋巴)分离足够数量的罕见的抗原特异性Treg细胞的过程中遇到的困难，以及外周血中的天然Treg的总体稀缺性(例如大约1％-4％的外周血单核细胞包含天然Treg)。Treg过继性转移疗法的发展也受到与如下相关的挑战的阻碍：离体扩大Treg群体至治疗数量并同时保持其免疫抑制功能，过继性转移的Treg细胞在过继性宿主中持续存在并在重新输注后增殖的能力较差。在体内炎性环境中Treg可塑性也存在问题，例如从免疫力的免疫抑制负调控物向促炎效应子样表型的转化(Singer等，2014Front.Immunol.5:Art.46；Trzonkowski等，2015 Sci.Translat.Med.7(304):ps18 Romano等，2016 Transplant.Internatl.30:745，McGovern等，2017Front.Immunol.8:Art.1517)。
没有在先的方法提供具有期望的抗原特异性的抑制活性的大的稳定的Treg细胞群，例如对参与其中抗原特异性免疫抑制有益的病症(例如自身免疫性疾病、过敏和/或其它炎症)的发病机制的抗原的特异性。
因此，仍然需要稳定的、抗原特异性的免疫调控细胞，所述细胞在体外和体内保持抗原特异性的免疫抑制能力而不表现出可塑性，因为可以通过过继性转移免疫疗法而有用地给予至需要抗原特异性免疫抑制的受试者。本文提供的实施方式解决了这种需要，并提供了其它相关的优点。
发明内容
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞包含：(a)叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰，其中，经修饰的基因组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
在一些实施方式中，提供了人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞通过CD4+CD25ˉT细胞中的叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰以及至少一个经转导的多核苷酸而获得，其中，所述人工修饰使得airT细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
在一些实施方式中，所述FOXP3基因存在于包含内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的FOXP3基因座中，所述TSDR具有多个胞嘧啶-鸟嘌呤(CG)二核苷酸，其中，每个CG二核苷酸包含甲基化胞嘧啶(C)核苷酸，所述甲基化胞嘧啶(C)核苷酸位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处。在一些实施方式中，位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处的所述TSDR C核苷酸的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被甲基化。在一些实施方式中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在体外维持CD4+CD25+表型至少21天的水平表达。在一些实施方式中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在过继性转移至需要抗原特异性免疫抑制的免疫相容性哺乳动物宿主后在体内维持CD4+CD25+表型至少60天的水平表达。在一些实施方式中，所述细胞包含选自以下的一种或多种中的表型：(i)HeliosLo、(ii)CD152+、(iii)CD127ˉ或(iv)ICOS+。在一些实施方式中，所述人工修饰包括所述细胞中的天然FOXP3基因座的敲除。
在一些实施方式中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子，其中，所述启动子定位于所述FOXP3基因中以能够促进FOXP3基因座的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录。在一些实施方式中，所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，包含所述组成型活化的启动子的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。在一些实施方式中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。在一些实施方式中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含与位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。在一些实施方式中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与CISC诱导物分子特异性结合。
在一些实施方式中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。在一些实施方式中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。
在一些实施方式中，所述人工修饰包括在除所述细胞的天然FOXP3基因座以外的染色体位点处的核酸分子的插入，所述核酸分子包含与组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。在一些实施方式中，所述airT细胞的至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸替换。在一些实施方式中，被敲除或失活的所述至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。在一些实施方式中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。在一些实施方式中，除天然FOXP3基因座之外的所述染色体位点位于所述细胞的T细胞受体α链(TRAC)基因座内，并且在所述染色体位点处插入包含外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子，所述外源的编码FOXP3的多核苷酸与组成型活化的启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，在所述airT细胞中，至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸替换。在一些实施方式中，被敲除的至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。
在一些实施方式中，提供了人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞包含：(a)编码外源叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因产物的经转导的核酸序列，其中，所述细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽；其中，编码所述外源FOXP3基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合；并且其中，编码所述外源TCR基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
在一些实施方式中，提供了人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞包含：(a)已被敲除或失活的天然FOXP3基因座，并通过同源定向修复将FOXP3基因座插入以下的任一项中：(i)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子能够促进FOXP3基因的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录，或(ii)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子与编码外源FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接，并且所述核酸分子组成型地表达所述FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的所述FOXP3表达水平，其中，编码所述组成型活化的启动子或编码与编码外源FoxP3蛋白或其功能衍生物的所述核苷酸序列可操作地连接的所述组成型活化的启动子的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合；以及(b)已被敲除的天然的T细胞受体α链(TRAC)基因座，并通过同源定向修复将TRAC基因座插入编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸，其中，编码所述外源TCR多肽的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
在一些实施方式中，编码所述第一CISC组分的核酸序列和编码所述第二CISC组分的核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，所述airT细胞包含各自编码抗原特异性TCR多肽的至少第一经转导的多核苷酸和第二经转导的多核苷酸，其中，所述第一经转导的多核苷酸编码TCR V-α多肽并且所述第二经转导的多核苷酸编码TCR V-β多肽，其中，所述V-α多肽和所述V-β多肽包含能够特异性识别抗原的功能性TCR。在一些实施方式中，所述airT细胞表达包含抗原特异性TCR多肽的抗原特异性T细胞受体(TCR)，所述TCR多肽由编码所述TCR多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸编码，并且所述TCR能够响应于通过由所述TCR多肽特异性识别的抗原引起的HLA限制性刺激来进行抗原特异性诱导的免疫抑制。在一些实施方式中，所述抗原特异性诱导的免疫抑制包括以下中的一种或多种：(i)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过所述airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子、穿孔素/颗粒酶或抗炎性产物的加工(elaboration)，或在所述airT细胞中诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和抑制性受体的表达中的至少一种，以及(iv)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。
在一些实施方式中，所述TCR特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原。在一些实施方式中，(i)所述自身免疫性病症选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、自身免疫性肝炎、牛皮癣、干燥综合征、或乳糜泻；(ii)所述过敏性病症选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎；以及(iii)所述炎性病症选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症。在一些实施方式中，(i)与所述自身免疫性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的自身抗原，(ii)与所述过敏性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的过敏性抗原，以及(iii)与所述炎性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的炎症相关抗原。
在一些实施方式中，所述airT细胞包含编码TCR多肽的至少一个经转导的多核苷酸序列，所述TCR多肽以人HLA限制性方式特异性地结合至：选自图141-图144的任一者或多者中列出的所述抗原性多肽序列中的任一项的氨基酸序列或由图139-图140的任一者或多者中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列的不超过35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个连续氨基酸的抗原性多肽表位。在一些实施方式中，所述airT细胞包含分别编码TCR的TCR V-α多肽和TCR V-β多肽的至少第一经转导的多核苷酸序列和第二经转导的多核苷酸序列，所述TCR以人HLA限制性方式特异性地结合至选自图141-图144的任一者或多者中列出的所述抗原性多肽序列中的任一项的氨基酸序列的不超过35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个连续氨基酸的抗原性多肽表位，或所述TCR包含图136-图140的任一者或多者中列出的任一TCR-α多肽序列或由图139-图140的任一者或多者中列出的核苷酸序列编码的任一TCR-α多肽序列。在一些实施方式中，所述airT细胞包含分别编码TCR的TCR V-α多肽和TCR V-β多肽的至少第一经转导的多核苷酸序列和第二经转导的多核苷酸序列，所述TCR以人HLA限制性方式特异性地结合至抗原性多肽，其中，所述TCR V-α多肽和V-β多肽包含选自图143中列出的任一成对的TCR V-α多肽和V-β多肽序列的成对的序列。
在一些实施方式中，相对于在没有抗原的MHC限制性刺激的情况下由airT细胞表现出的Treg生物活性的对照水平，所述细胞表现出响应于由至少一个经转导的多核苷酸编码的TCR多肽识别的抗原对所述airT细胞的MHC限制性刺激而增加的Treg生物活性的诱导水平，其中，所述Treg生物活性包括以下中的一项或多项：(i)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的抗原，所述airTTCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过所述airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子、穿孔素/颗粒酶或抗炎性产物的加工，或在所述airT细胞中诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和抑制性受体的表达中的至少一种，或(iv)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。
在一些实施方式中，(1)与自身免疫性病症的发病机制相关的抗原为IGRP(241-270)肽，其中，所述自身免疫性病症为1型糖尿病，并且其中，所述TCR为以HLA DRB1*0404限制性方式识别所述IGRP(241-270)肽的TCR T1D4，或(2)与自身免疫性病症的发病机制相关的抗原为IGRP(305-324)肽，其中，所述自身免疫性病症为1型糖尿病，并且其中，所述TCR为以HLA DRB1*0404限制性方式识别IGRP(305-324)肽的TCR T1D5。
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括前述的airT细胞中的任一种用于治疗、抑制或改善如下中的用途：自身免疫性病症(例如选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎中的一种)，过敏性病症(例如选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎中的一种)，或炎性病症(例如选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症中的一种)。
在一些实施方式中，所述TCR多肽结合至与选自以下的紊乱相关的抗原：1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。
在一些实施方式中，所述抗原选自于由以下所组成的组：波形蛋白、聚集蛋白聚糖、软骨中间层蛋白(CILP)、前胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、以及烯醇酶。
在一些实施方式中，所述抗原包含选自于由Enol326、CILP297-1、Vim418、Agg520和SLE3所组成的组中的表位。
在一些实施方式中，所述抗原包含具有SEQ ID NO：1363-SEQ ID NO：1376和SEQID NO：1408-SEQ ID NO：1415中任一项的氨基酸序列的表位。
在一些实施方式中，所述TCR多肽包含：CD3α多肽，所述CD3α多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项的氨基酸序列；和/或CD3β多肽，所述CD3β多肽具有SEQ IDNO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项的氨基酸序列。
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括药物组合物，所述药物组合物包含前述的airT细胞中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括前述的airT细胞中的任一种作为药物的用途。
在一些实施方式中，提供了产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：(a)在足以敲除或失活细胞中的所述天然FOXP3基因座和插入全部或部分所述FOXP3基因座供体模板核酸的条件和时间下，向CD4+ T细胞中引入：(1)FOXP3向导RNA(gRNA)或编码FOXP3 gRNA的核酸，所述gRNA包含与所述细胞中的天然叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因内的序列互补的间隔区序列；(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的FOXP3 gRNA形成复合物；以及(3)FOXP3基因座供体模板，所述FOXP3基因座供体模板选自(i)包含能够促进所述FOXP3基因的内源的编码FOXP3的核苷酸序列转录的组成型活化的启动子的核酸分子，和(ii)包含与编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接的组成型活化的启动子的核酸分子；以及(b)与(a)同时或依次以及以任意顺序，用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸转导所述CD4+ T细胞。在一些实施方式中，步骤(b)选自：(i)用包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的多核苷酸的至少一个逆转录病毒载体转导所述CD4+ T细胞，以及(ii)在足以敲除或失活细胞中的所述天然TRAC基因座和插入全部或部分所述TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向CD4+ T细胞中引入：(1)T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码TRAC gRNA的核酸，所述gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的序列互补的间隔区序列；(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的TRAC gRNA形成复合物；以及(3)TRAC基因座供体模板，所述TRAC基因座供体模板包含编码所述抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。
在一些实施方式中，提供了产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：(a)在足以敲除细胞中的所述天然TRAC基因座和插入全部或部分所述第一TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向CD4+ T细胞中引入：(1)第一T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码第一TRAC gRNA的核酸，所述第一TRAC gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的第一序列互补的第一间隔区序列；(2)第一DNA核酸内切酶或编码所述第一DNA核酸内切酶的核酸，所述第一DNA核酸内切酶能够与(1)的所述第一TRAC gRNA形成复合物；以及(3)第一TRAC基因座供体模板，所述第一TRAC基因座供体模板选自(i)包含编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列的核酸分子，和(ii)包含与编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接的组成型活化的启动子的核酸分子；以及(b)与(a)同时或依次以及以任意顺序，在足以敲除或失活细胞中的所述天然TRAC基因座并插入全部或部分所述第二TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向所述CD4+ T细胞中引入：(1)第二T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码第二TRAC gRNA的核酸，所述第二TRAC gRNA包含与TRAC基因内的第二序列互补的第二间隔区序列，其中，所述第二间隔区序列与所述第一间隔区序列不同；(2)第二DNA核酸内切酶或编码所述第二DNA核酸内切酶的核酸，所述第二DNA核酸内切酶能够与(1)的第二TRAC gRNA形成复合物，其中，所述第二DNA核酸内切酶选自与第一DNA核酸内切酶相同的DNA核酸内切酶以及与所述第一DNA核酸内切酶不同的DNA核酸内切酶；以及(3)第二TRAC基因座供体模板，所述第二TRAC基因座供体模板包含编码所述抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。
在一些实施方式中，提供了产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：在足以敲除或失活细胞中的天然TRAC基因座和通过同源定向修复插入全部或部分TRAC基因座供体模板的条件和时间下，向CD4+ T细胞中引入：(1)T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码TRAC gRNA的核酸，所述TRAC gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的序列互补的间隔区序列；(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的所述TRAC gRNA形成复合物；以及(3)TRAC基因座供体模板，所述TRAC基因座供体模板包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。在一些实施方式中，所述插入供体模板中的第一个进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合，并且所述插入供体模板中的第二个进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，所述第一插入供体模板和所述第二插入供体模板中的至少一个进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。在一些实施方式中，以下中的一项或多项：(a)所述DNA核酸内切酶选自CRISPR/Cas、TALEN、大范围核酸酶、megaTAL或锌指核酸酶，(b)所述组成型活化的启动子为MND，插入通过选自同源定向修复和非同源末端连接的机制进行，(d)所述第一CISC组分和所述第二CISC组分以相互排斥的方式从IL2RB和IL2RG中选择，(e)所述第三CISC组分为FKBP，以及(f)所述CISC诱导物分子为雷帕霉素或其类似物。
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括产生前述的人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞中的任一种的方法，所述方法包括实施前述的产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法中的任一种。
在一些实施方式中，提供了用于治疗、抑制或改善患有需要抗原特异性免疫抑制的病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的多个人工免疫调控性T(airT)细胞，其中，所述airT细胞表达至少一种T细胞受体(TCR)，所述TCR特异性地识别需要抗原特异性免疫抑制的抗原。在一些实施方式中，所述需要抗原特异性免疫抑制的病症为自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症。在一些实施方式中，(i)所述自身免疫性病症选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎；(ii)所述过敏性病症选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎；以及(iii)所述炎性病症选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症。在一些实施方式中，(i)与所述自身免疫性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图144中任一者或多者列出的自身抗原，(ii)与所述过敏性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图144中任一者或多者列出的过敏性抗原，以及(iii)与所述炎性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图144中任一者或多者列出的炎症相关抗原。
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于治疗或改善患有紊乱的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予前述的人工免疫调控性T(airT)细胞中的任一种。
在一些实施方式中，所述紊乱选自于由如下所组成的组：1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎，过敏性病症(例如选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎中的一种)，或炎性病症(例如选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症中的一种)。在一些实施方式中，所述TCR多肽结合至与选自1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)的紊乱相关的抗原。
在一些实施方式中，所述TCR多肽与选自于由以下所组成的组中的抗原结合：波形蛋白、聚集蛋白聚糖、软骨中间层蛋白(CILP)、前胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、以及烯醇酶。在一些实施方式中，所述TCR多肽与包含表位的抗原结合，所述表位具有SEQ ID NO：1363-SEQ ID NO：1376和SEQ ID NO：1408-SEQ ID NO：1415中任一项所述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述TCR多肽包含：CD3α多肽，所述CD3α多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项所述的氨基酸序列；和/或CD3β多肽，所述CD3β多肽具有SEQID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项所述的氨基酸序列。
附图说明
图1A-图11涉及使用基因编辑将人CD4+ T细胞工程化为airT细胞。
图1A、图1B和图1C描述了用于将CD4+ T细胞转化为本公开的airT细胞的示例性方案。图1A为在使用具有FOXP3向导RNA的FOXP3 TALEN或CRISPR/Cas9进行基因编辑之前(顶部)和之后(底部)的FOXP3基因座的示意图。TALEN或CRISPR/Cas9在外显子1处切割FoxP3基因座，起始位点特异性双链DNA断裂。AAV提供了包含MND和GFP(以允许分析编辑效率)的供体模板，该模板在DNA断裂处被插入外显子1中。在同源定向修复后，MND启动子驱动FoxP3和GFP报告子的表达。图1B描述了基因编辑和细胞分析的步骤的时间线以及从输入的Tconv细胞生成airT的功效。图1C描述了示出在编辑后第4天的Foxp3和GFP之间的相关性的代表性流式图。图右侧的三个子图分别示出了Foxp3+GFP+门控细胞中的CD25、CD127、Helios、CD45RO、ICOS和CTLA-4的表达。
图2描述了示出了根据顶部所示出的时间线在编辑后第4天和第11天的GFP和Foxp3表达的流式图(底部)。这些数据表明CD4+ T细胞中的Foxp3编辑是有效的并且使得Foxp3高效、稳定地表达。
图3A、图3B、图3C和图3D描述了比较airT细胞和激活的天然的调控性T(nTreg)细胞的数据。图3A描述了产生用于比较的激活的nTreg和edTreg的步骤的时间线。使用MACSCD4+分离试剂盒从PBMC中分离CD4+细胞，并通过流式进一步分选Tconv(CD25-CD127+)和Treg(CD25高CD127-)细胞。将分选的Tconv和Treg细胞用CD3/CD28激活剂珠激活，并在激活48小时后移除珠。使用Cas9/Foxp3 gRNA和AAV-MND-LNGFR-Foxp3 ki仅对Tconv细胞进行Foxp3编辑以产生edTreg/airT。在没有Foxp3编辑的情况下以相同的方式处理nTreg细胞。来自Foxp3编辑的Tconv细胞的LNGFR+细胞在第10天使用MACS LNGFR珠进行富集。将LNGFR+edTreg和nTreg细胞用于抑制测定。图3B描述了从1×107PBMC产生edTreg和nTreg的功效的比较。在第0天，1×107PBMC。从第0天到第10天，第0天激活的Tconv和nTreg细胞分别扩增10-30倍和1-2倍。对于edTreg，根据编辑率(10％-30％)计算第10天的Treg产量。图3C描述了示出第10天在Foxp3编辑的Tconv和nTreg细胞中的Treg表型的代表性流式图。顶部子图示出了(最左侧子图)经编辑的Tconv中的LNGFR的表达以及(右侧)在经编辑的Treg(LNGFR+门，顶部子图)和nTreg(底部子图)中的Foxp3、Helios、CD25、CD127、ICOS和CTLA-4的表达。图3D(上部子图)描述了edTreg/airT(蓝色)和nTreg(红色)中的Foxp3、CTLA-4和ICOS表达的比较。图3D(底部表格)示出了MFI。
图4A和图4B示出了airT细胞具有优于nTreg的体外抑制活性。图4A描述了来自体外抑制测定的数据，该测定比较了在所示的Treg:Teff比率下edTreg/airT和nTreg对CD4+Teff细胞的抑制活性。将airT或nTreg细胞用EF670进行标记且将CD4+ Teff细胞用CellTrace Violet(CTV)进行标记。将Teff细胞与airT或nTreg以0:1(仅Teff)、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32(Treg:Teff)的不同比例共培养。将CD3/CD28激活剂珠以1:25(珠与Teff的比率)加入，并在孵育4天后通过流式分析细胞。将Teff细胞中的CTV的稀释度测量为增殖。图4B描述了按如下计算的抑制百分比：(仅Teff+珠中的增殖％-与Treg共培养的Teff细胞中的增殖％)/(仅Teff+珠中的增殖％)×100。
图5描述了示例性的慢病毒胰岛特异性TCR构建体，所述构建体表达衍生自1型糖尿病(T1D)受试者的稀有的胰岛特异性TCR。子图A描述了编码GAD65或IGRP特异性TCR(4.13、T1D2、T1D4、T1D5-1或T1D5-2)的慢病毒载体、它们的表位特异性以及TCRα或β链的使用的表格。子图B描述了慢病毒胰岛特异性TCR的结构。TCR构建体包含来自胰岛特异性TCR的人TCR可变区和允许改善转导的人TCR链之间的配对的小鼠TCR恒定区。
图6描述了胰岛Ag特异性TCR表达的验证：鼠TCRβ表达和胰岛抗原特异性T细胞的增殖。子图A描述了用CD3/CD28珠分离、激活并用LV胰岛-TCR转导CD4+ T细胞的流式图。流式图示出了用编码胰岛特异性TCR的慢病毒(LV)转导后第9天的CD3/CD28激活的CD4+细胞上受门控的mTCRβ表达。子图B描述了用CTV标记的LV胰岛-TCR转导并与APC(经辐照的PBMC)及其同源的肽或无关的肽共培养5天的CD4+ T细胞的流式图。流式图示出在与抗原呈递细胞(APC；经辐照的PBMC)和同源或无关的肽共培养5天后，用CTV标记的LV转导的CD4+ T细胞的细胞增殖。增殖以CTV稀释度示出。
图7示出了具有胰岛特异性TCR的Foxp3编辑的T细胞的产生。子图A描述了产生具有胰岛特异性TCR的edTreg细胞的时间线。子图B描述了示出在用T1D4或T1D5-1 TCR转导和Foxp3编辑后第7天的CD4+细胞的mTCRβ表达和LNGFR/Foxp3表达的代表性流式图。右子图示出了LNGFR+细胞上受门控的CD25、CD127、CTLA-4和ICOS的表达。
图8涉及本公开的示例性的抗原特异性抑制测定。子图A描述了产生表达胰岛特异性TCR的edTreg细胞的时间线。通过使用MACS LNGFR珠的LNGFR表达来富集具有胰岛特异性TCR(无LV TCR、T1D4或T1D5-1 TCR)的edTreg细胞。LNGFR+细胞被等分并冷冻用于进一步的实验。子图B描述了用于评价抗原特异性抑制测定的方法的概括。将用胰岛特异性TCR(T1D4或T1D5-1 TCR)转导的CD4+ T细胞用作Teff细胞。Teff细胞和Treg细胞用不同的试剂标记(例如CTV或EF670)，并在APC(自体辐照的PBMC)和各种肽的存在下与或不与edTreg细胞以1:1或1:2的比例共培养。细胞在孵育1天或4天后进行染色并通过流式分析，以分别测量Teff细胞的细胞因子产生和增殖。
图9和图10描述了在APC和所示的肽的存在下edTreg/airT对Teff增殖的抑制活性。将Teff和Treg细胞分别用CTV和EF670标记。在APC和各种肽(DMSO、IGRP241、IGRP305或IGRP241+IGRP305)的存在下，将用T1D4-TCR(T1D4 Teff)转导的CD4+ T细胞与或不与表达T1D4-TCR(T1D4 edTreg)或T1D5-1-TCR(T1D5-1 edTreg)的edTreg共培养。共培养4天后，对细胞进行染色并分析作为CTV的稀释度的Teff增殖。流式图示出了对CD3+CD4+CTV+EF670-LNGFR-门控的Teff增殖。
图11描述了edTreg/airT对Teff中的细胞因子产生的抑制。Teff和Treg细胞分别用CTV和EF670标记。在APC和肽(DMSO或IGRP 241)存在下，将T1D4 Teff细胞与或不与未转导的edTreg或T1D4 edTreg/airT细胞共培养。共培养1天后，将细胞与BFA接触4h，染色并分析Teff细胞产生的细胞因子。流式图示出了CD4+CTV+EF670-上受门控的T1D4 Teff细胞产生的TNF、IFNg或IL-17。
图12-图17涉及抗原特异性的人Foxp3编辑的人CD4+ T细胞的开发和表征。
图12描述了用于从外周血细胞产生人抗原特异性edTreg/airT的示例性方案(顶部)和FOXP3编辑的人抗原特异性CD4+ T细胞的表型(底部)。在底部子图中，在基因编辑后4天(n＝5)，四聚体阳性(Tr+；MHC II类的四聚体与流感或破伤风肽的混合物)人CD4+ T细胞中的GFP表达的代表性流式图(左侧)和百分比(右侧)。
图13描述了FOXP3编辑的人抗原特异性CD4+ T细胞的表征。子图A描述了FOXP3编辑的人抗原特异性CD4+ T细胞的表型。柱状图总结了流式细胞术数据(n＝5)；图中示出了Tmr+edTreg、Tmr+空白(Mock)编辑的细胞以及从无关供体获得的胸腺生成的Treg(tTreg)中的Treg标志物的表达和细胞内IL-2的产生。示出的数据代表5次独立实验。统计学显著差异的P值在柱状图上方示出。子图B描述了人抗原特异性edTreg/airT在体外抑制Teff的增殖。使用与来自健康对照的Teff、APC以及可溶性抗CD3和抗CD28共培养的空白编辑的Tmr+细胞或Tmr+edTreg/airT进行抑制测定。抗原呈递细胞(经辐照的CD4-PBMC):Tmr+edTreg或空白编辑的Tmr+细胞:Teff的比率为2:1:1。在4天测定结束前18小时加入1μCi 3H，并通过闪烁计数器测量增殖。柱状图示出来自以三个供体进行的三次实验的平均结果。
图14描述了通过肽刺激和后随的Foxp3编辑成功产生抗原特异性edTreg/airT。子图A描述了抗原特异性T细胞扩增和基因编辑的步骤的时间线。经过9天的肽刺激以扩增对MP、HA或破伤风而言特异性的T细胞后，用CD3/CD28激活剂珠激活细胞以进行基因编辑。将珠添加至分选的细胞以增强抗原特异性Treg的扩增。子图B描述的流式图示出了编辑后第15天的GFP和Foxp3表达。GFP+Foxp3+细胞为CD25+CD127-并且大约60％的细胞为四聚体特异性的MP、HA或TT。
图15描述了通过Foxp3编辑的Treg/airT进行的抗原特异性抑制。子图A描述了产生用于抑制测定的抗原特异性edTreg/airT细胞的步骤的时间线。在编辑后第15天对GFP+细胞进行分选并用CD3/CD28珠扩增。孵育7天后移除珠，并且收获edTreg/airT细胞并在扩增11天后用于抑制测定。子图B描述了抑制测定设计的总结。将CD4+CD25+细胞从用EF670标记的自体PBMC中分离，并用作Teff细胞。CD4-CD25+细胞被辐照并用作APC，且将edTreg/airT细胞用Cell Trace Violet(CTV)标记。在DMSO或肽池(MP+HA+TT)存在下，Teff细胞和APC与或不与edTreg/airT细胞共培养。子图C描述了共培养7天后，对细胞染色并通过流式进行分析。CD3+CD4+EF670+CTV-细胞受门控作为Teff细胞。子图D描述了Teff细胞中的EF670的稀释度被测量作为增殖，并且来自Teff细胞与APC和肽池的共培养的15％EF670-细胞被归一化为100％增殖。将抑制％计算为(100-增殖％)。
图16描述了通过肽刺激扩增具有多种特异性的胰岛特异性T细胞。子图A描述了生成胰岛抗原特异性edTreg/airT细胞的示例性时间线。通过APC(经辐照的自体CD4-CD25+细胞)和胰岛特异性肽的池刺激新鲜分离的CD4+CD25-细胞14天，并在第13天通过四聚体染色来分析胰岛特异性T细胞的扩增。子图B描述的流式图示出了CD4+细胞上受门控的、通过单个四聚体或四聚体池染色的胰岛特异性T细胞。
图17描述了具有多种特异性的胰岛特异性Treg的产生。子图A描述了胰岛特异性T细胞被四聚体染色并在第14天分选。分选的四聚体+细胞用CD3/CD28珠激活72h以用于Foxp3编辑。编辑后3天对细胞进行染色并分析。流式图示出了空白细胞或经编辑的细胞中的Foxp3和LNGFR的表达(左侧)以及LNGFR+门控的细胞中的CD25、CD127和CD45RO的表达(右侧)。子图B描述了细胞被单个四聚体或四聚体池染色，并且流式图示出了LNGFR+Foxp3+编辑的细胞中的四聚体+细胞。
图18-图33涉及使用双等位基因靶向产生经双重编辑的人CD4+ T细胞以工程化表达Foxp3和抗原特异性TCR的人工Treg细胞，所述人CD4+ T细胞具有内源TCR失活。
图18描述了经编辑以具有Treg表型并表达外源Ag特异性TCR但不表达内源TCR的示例性CD4+ T细胞的示意图。在此方案中，常规CD4+ T细胞向抗原特异性Treg的转化包括三种遗传改变：1)转录因子FOXP3的稳定表达以驱动细胞转向Treg表型；2)所定义的抗原特异性重排的T细胞受体(Ag特异性TCR)的稳定表达以指导Treg免疫抑制活性；以及3)内源T细胞受体(TCR)的基因缺失以确保免疫抑制功能仅针对期望的抗原。
图19描述了用于在人和小鼠TRAC基因座处的CRISPR基因编辑的示例性AAV构建体。该列表包括为了基于CRISPR的同源定向修复而生成的、基于相关gRNA进行组织的腺相关病毒质粒构建体，并包括数字标号。
图20描述了用于靶向人TRAC基因座以进行敲除/敲入的示例性的基于CRISPR的方法。尤其是，该图像示出了人TRAC基因座的示意性代表，该人TRAC基因座表明了经测试的四个gRNA序列(PC_TRAC_E1_gRNA1至PC_TRAC_E1_gRNA4)的相对位置。TRAC外显子1由从约1160位连续至1400位的最低的柱示出。常见的SNP由约1160位和1400位示出。先前公布的阳性对照gRNA序列(TCRa G4old)的位置在约1320位示出。
图21涉及用于敲除人CD4+原代T细胞中的CD3的非同源末端连接(NHEJ)的向导RNA(gRNA)鉴定。数据来自FACS分析。子图A描述了示出使用四种不同的向导RNA在空白编辑和TCR编辑的CD4+ T细胞中编辑后2天的CD3的表达的流式图。将先前证明敲除CD3表达的TCRa_G4old用作对照。子图B描述了示出CD3敲除百分比的直方图。
图22描述了来自插入缺失频率的Inference of CRISPR Edits(ICE)分析的结果。通过ICE(Inference of CRISPR Edits)测量中靶位点特异性活性，并确认相对于预测的脱靶位点的TRAC中的gRNA_1和gRNA_4的特异性插入缺失诱导。
图23描述了来自TRAC gRNA的预测的脱靶位点的ICE分析的结果。通过ICE序列去卷积分析测试了TRAC gRNA1和TRAC gRNA2的前3的预测的脱靶位点(基于错配的频率和位置)的插入缺失诱导频率。
图24描述了用于进行双重AAV编辑以评价双等位基因敲入的示例性实验大纲。A.本实验中使用的AAV构建体的图示；编辑后，MND启动子驱动GFP/BFP的表达。B.实验程序的时间线。CD4+ T细胞在编辑前进行了3天的珠刺激(CD3/CD28)。编辑后三天和六天通过流式细胞术评估细胞的GFP和BFP表达。
图25描述了人CD4+细胞中的TRAC基因座的双重编辑产生细胞的双阳性群体。子图A描述了示出编辑两天后的空白编辑以及混合的MND.GFP和MND.BFP编辑的细胞(10％#3207病毒+10％#3208 AAV)中的GFP和BFP表达的流式图。#3207和#3208的病毒滴度分别为3.3x10^12和2.53x10^12。子图B描述了示出双重编辑的细胞内的双阴性、GFP单阳性、mCherry单阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比的直方图。
图26描述了示出用于选择双重编辑细胞的示例性的分开的IL-2CISC HDR敲入构建体的示意图。在所描述的构建体中，CISC(化学诱导信号复合物)被分到2个不同的构建体，并且每个CISC组分与不同的报告子(在该示例中为GFP或mCherry)共表达。每个构建体包含一半的雷帕霉素结合复合物(FKBP或FRB结构域)，具有与IL-2R信号复合物(IL-2RB或IL-2RG)跨膜和细胞内结构域的一半融合的嵌合内质网靶向结构域。将编码与GFP/mCherry标签共表达的每个CISC组分的cDNA递送至原代人CD4+ T细胞使得能够选择性扩增含有两种CISC组分的细胞，并因此也对GFP和BFP进行双重编辑。
图27描述了用于CD4+ T细胞的双重AAV编辑、用rapalog扩增和所富集的细胞的分析的步骤的示例性时间线。在编辑前用珠(CD3/CD28)刺激细胞3天。编辑后两天，通过流式分析细胞的GFP和mCherry表达，然后在含有50ng/mL人IL-2或100nM rapalog的培养基中扩增。在编辑后第6天、第8天和第10天进行流式细胞术以评价GFP、mCherry双阳性细胞的富集。
图28描述了初始双重编辑率的FACS分析。子图A描述了示出空白编辑的、MND.GFP.FRB.IL-2RB编辑的(20％#3207 AAV)、MND.mCherry.FKBP.IL-2RB(20％#3208AAV)编辑的以及混合编辑的(10％#3207+10％#3208)细胞中的GFP和mCherry表达的流式图。#3207和#3208的病毒滴度分别为3.3x1012和2.53x1012。子图B描述了示出双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比的直方图。
图29描述了示出双重编辑细胞的rapalog富集的示例性数据。子图A描述了示出编辑两天后在空白编辑的细胞以及混合的MND.GFP和MND.BFP编辑的细胞(10％#3207病毒+10％#3208 AAV)中的GFP和BFP表达的流式图。#3207和#3208的病毒滴度分别为3.3×1012和2.53×1012。子图B描述的直方图示出了双重编辑细胞内的双阴性、GFP单阳性、mCherry单阳性和GFP/mCherry双阳性的细胞百分比。
图30描述了示出与IL-2和rapalog接触后的双阴性、GFP单阳性和mCherry单阳性的细胞百分比的直方图。这些数据表明，rapalog处理不会显著改变单阳性和未经编辑的群体。
图31描述了来自使用两个不同供体的初始双重编辑率的FACS分析的数据。子图A描述了编辑和分析步骤的时间线。子图B描述了示出每个供体的双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性的细胞百分比的直方图。供体R003657为男性，白人且28岁。供体R003471为男性，白人且29岁。
图32描述了来自双等位基因R003471细胞的rapalog富集的FACS分析的数据。子图A描述了示出在rapalog中富集5天后的GFP和mCherry的表达的流式图。子图B描述了示出在IL-2或rapalog中扩增后的GFP/mCherry双阳性细胞百分比的直方图。
图33描述了示出用于插入TCR和Foxp3以及富集经双重编辑的细胞的示例性的分开的CISC构建体的示意图。将CISC分到两个不同的构建体，且每个CISC组分都与Ag特异性TCR(在图示中，示例性T1D4TCR)或Foxp3共表达。每个构建体包含一半的雷帕霉素结合复合物(FKBP或FRB结构域)，具有与IL-2R信号复合物(IL-2RB或IL-2RG)跨膜和细胞内结构域的一半融合的嵌合内质网靶向结构域。将编码与T1D4 TCR/Foxp3共表达的每个CISC组分的cDNA递送至原代人CD4+ T细胞使得能够选择性扩增含有两种CISC组分的细胞，并因此也对T1D4 TCR和Foxp3进行双重编辑。
图34-图37涉及用于在自身免疫的体内模型中评价抗原特异性airT细胞功能的试剂的产生。
图34描述了鼠TRAC基因座的示意性代表，该基因组示出了经测试的三个新的gRNA序列(PC_mmTrac_E1_gRNA1至PC_mmTrac_E1_gRNA3)的相对位置。TRAC外显子1以蓝色示出。
图35描述了来自鼠CD4+ T细胞中的CD3敲除的FACS分析的数据。子图A描述的流式图示出使用三种不同的向导在空白编辑和TCR编辑的CD4+ T细胞中编辑后两天的鼠CD3表达。子图B描述了示出每个向导RNA的mCD3敲除百分比的直方图。
图36描述了用于评价双等位基因敲入的双重AAV编辑的示例性实验大纲。子图A描述了此实验中使用的AAV构建体的图示；编辑后，MND启动子驱动GFP/BFP的表达。B.实验程序的时间线。鼠CD4+ T细胞在编辑前用珠刺激(CD3/CD28)3天。编辑后三天和五天，通过流式细胞术评估细胞的GFP和BFP表达。
图37描述了来自鼠TCRa基因座中的单和双重编辑率的FACS分析的数据。流式图示出了在空白、MND.GFP(10％#3211)、MND.BFP(10％#3212)和混合编辑的细胞(5％#3207+5％#3208)中的编辑后3天的GFP和BFP表达。混合编辑的细胞具有总计1.97％的GFP/BFP双阳性细胞。
图38-图43涉及抗原特异性体内环境中的airT细胞功能。
图38描述了测试MOG特异性edTreg/airT(以白色示出)在多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠模型中抑制T效应细胞(Teff)的能力的实验设计的示意图。
图39涉及示出小鼠FOXP3 TALEN催化有效的FOXP3破坏并起始供体模板的非破坏性重组的实验。子图A描述了人FOXP3基因中的FOXP3 TALEN对的结合位点。子图B描述了鼠FOXP3基因中的小鼠FOXP3 TALEN对的靶结合位点。子图C描述了在分别用编码对照mRNA(编码蓝色荧光蛋白)或者对人FOXP3或小鼠FoxP3而言特异性的TALEN的mRNA转染后5～7天，人(左侧)和小鼠(右侧)CD4+ T细胞中的FOXP3 TALEN切割位点处的插入缺失频率。图示出了在gDNA靶位点周围的集落测序PCR扩增子后的插入缺失的平均频率；每个实验对20-40个集落测序。
图40涉及从抗原特异性鼠CD4+ T细胞产生edTreg/airT。子图A描述了使用小鼠FOXP3 TALEN和小鼠AAV FOXP3 MND-GFP敲入(ki)供体模板成功进行基因编辑后的FOXP3基因座的示意图。编辑后，MND启动子驱动嵌合GFP-FoxP3蛋白的表达。子图B描述了示出编辑后第2天的抗原特异性小鼠CD4+ T细胞中的GFP表达的流式图。子图C描述了多个实验中的GFP+细胞的平均百分比(n＝10)。D.示出相关Treg标志物表达的鼠edTreg/airT的流式图。
图41示出多发性硬化症小鼠模型中的相比于多克隆edTreg/airT的抗原特异性的功能评价。子图A描述了示出FACS分选后编辑后第2天的MOG特异性和多克隆的小鼠CD4+ T细胞中的GFP表达的流式图。子图B描述了鼠EAE体内实验设计和时间线的示意图。将2D2(MOG特异性的)Teff(30K)与或不与从2D2或C57Bl/6小鼠产生的共转移的edTreg/airT(30K)一起递送到RAG1-/-受者小鼠中；所有细胞株都处于C57Bl/6背景。在第7天进行分析。
图42描述的数据示出了Teff的抗原特异性edTreg/airT延迟扩增、激活和细胞因子产生。通过流式细胞术评价在细胞转移后第7天从受者小鼠中的腹股沟淋巴结和腋淋巴结获得的T细胞的免疫表型。CD45+＝泛CD45(识别所有CD45亚型以及CD45.1和CD45.2同种异体抗原两者)。示出了总CD45+CD4+细胞(A)和其它示出的T细胞亚群(B)的总数以及(C)GFP+细胞的扩增。数据为3次独立实验的代表结果；柱状图示出平均值±SD；统计学显著差异的p值在柱的上方示出。
图43提供的数据示出抗原特异性edTreg/airT细胞在体内抑制Teff增殖。子图A描述了流式图：为了标记活跃分裂的细胞，在处死所选择的动物前2小时给予胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)。通过用抗EdU抗体进行细胞内标记和流式细胞术来确定T细胞中的EdU掺入。流式图来自细胞转移后7天从LN中分离的T细胞。子图B描述的柱状图总结了不同的细胞亚群中掺入EdU的细胞的平均百分比和(C)GFP+淋巴细胞的百分比。流式图代表至少3次独立实验的结果；柱状图示出平均值±SD；统计学显著差异的p值在柱的上方示出。
图44-图47涉及在1型糖尿病的NSG过继性转移模型中研究抗原特异性T细胞功能的实验。将工程化的抗原特异性(BDC)或多克隆(NOD)edTreg/airT、或抗原特异性nTreg输注入小鼠中，然后输注抗原特异性Teff细胞。输注后对小鼠监测糖尿病长达90天。图示出了接受效应细胞以及来自NOD和BDC2.5小鼠的指定的空白编辑细胞、Foxp3编辑细胞或nTreg细胞的糖尿病小鼠的百分比。
图44涉及抗原特异性NOD小鼠的CD4+ T细胞中的Foxp3编辑。子图A描述了使用不同的向导RNA在BDC2.5 NOD小鼠中的CAS9/CRISPR RNP切割效率。子图B描述了AAV5递送的修复模板。编辑后，MND启动子将驱动嵌合GFP-FoxP3蛋白的表达。子图C描述的流式图示出了空白编辑和GFP-Foxp3编辑的抗原特异性小鼠CD4+ T细胞在编辑后第2天的GFP表达。
图45涉及FOXP3编辑的抗原特异性NOD CD4+ T细胞的表型。左侧.流式细胞图示出经编辑的细胞中的GFP和Foxp3表达。中间.流式细胞图示出GFP-Foxp3编辑(上图)和空白编辑(下图)的鼠抗原特异性NOD CD4+ T细胞中的IL-2、IFN-g和IL-4表达。右侧.直方图示出了编辑后四天对IL-2、IFN-γ和IL-4呈阳性的细胞百分比。
图46涉及研究NSG过继性转移模型的输入细胞的表型的实验。子图A描述了示出向每组动物给予的细胞的量和类型的实验设计。子图B描述了流式细胞图，示出了注射到NSG小鼠中的Teff、edTreg/airT和nTreg细胞的表型。
图47涉及NSG过继性转移模型中的抗原特异性T细胞功能。子图A描述了实验设计；将工程化的抗原特异性(BDC)或多克隆(NOD)edTreg/airT、或抗原特异性nTreg输注入小鼠中，然后输注抗原特异性Teff细胞。输注后对小鼠监测糖尿病长达90天。子图B描述的图示出了接受效应细胞以及来自NOD和BDC2.5小鼠的指定的空白编辑细胞、Foxp3编辑细胞或nTreg细胞的糖尿病小鼠的百分比。与空白编辑的T细胞、多克隆edTreg/airT或多克隆nTreg相比，抗原特异性edTreg/airT表现出显著更高水平的T1D保护。
图48-图51涉及将小鼠AAV供体模板设计进行工程化以产生具有选择性标志物(LNGFR)的airT细胞产物。
图48描述了在鼠Foxp3编辑中使用的示例性修复模板。在鼠T细胞中测试了AAV.启动子-LNGF.P2A敲入构建体的Foxp3稳定表达。
图49描述了使用替代的同源性供体盒的鼠edTreg/airT的表型。流式细胞图示出空白编辑细胞和用MND.LNGFR.P2A KI(3189)或PGK.LNGFR.P2A KI(3227)编辑的细胞中的LNGFR、FOXP3、CD25和CTLA-4。
图50描述了示出在鼠的经编辑的Treg/airT细胞中的LNGFR的编辑率和表达的数据。流式细胞图示出空白、MND-GFPki(#1331)MND.LNGFR.P2A.KI(#3189)编辑的细胞中的LNGFR和GFP表达。
图51描述了示出使用抗LNGFR柱富集来自B6小鼠的LNGFR+编辑的T细胞的数据。流式细胞图示出了在Miltenyi抗LNGFR柱上纯化前细胞的LNGFR表达、流过物(flow through)中的细胞和从柱中洗脱的细胞。
图52描述了相比于FOXP3慢病毒(LV)转导的人CD4 T细胞的FOXP3编辑的细胞的比较。子图A描述了LV构建体的图：MND启动子驱动编码与airT相同的GFP-FOXP3融合蛋白的转录本的表达；转录本包含WPRE和poly(A)信号，用于有效的核输出和mRNA稳定性。以下是示出空白编辑的T细胞或分选的tTreg(CD4+CD25++CD127-)、airT和LV Treg(CD4+GFP+)中的FOXP3和GFP表达的代表性流式图，均在用CD3/CD28珠在体外扩增≥14天后。子图B描述了LV转导的分选细胞(左侧；n＝6)的平均病毒拷贝数(±SD)。散点图(右侧)示出了每个样本的GFP+群体的MFI(n＝5；来自双尾学生T检验的P值)。子图C描述的柱状图示出了通过对所示出的蛋白质的流式细胞术染色的细胞平均值％(顶部)和MFI(底部)。存活的单态(singlet)进一步在如下上受门控：CD4+GFP+(LV Treg和edTreg)、CD4+FOXP3+(tTreg)或CD4+(空白)。对于具有不同的双峰分布的标记，仅计算阳性群体的MFI。误差棒示出±SD。进行普通的双向方差分析，并用Tukey的多重比较检验调整P值。黑色的P值示出与空白编辑细胞的比较；红色的是以虚线示出的组的比较。子图D描述了作为Treg或空白稀释(顶部)的函数的抑制百分比。以Treg或空白与Teff的不同比率来绘制增殖的直方图(底部)。抑制％＝[(无Treg的分裂％-用Treg的分裂％％/无Treg的分裂]×100。子图E描述了示出FACS纯化后培养物中的GFP+细胞％随时间的简单线性回归和数据点的图；airT(n＝4)和LV Treg(n＝6)；来自6个实验的数据。虚线示出95％的置信区间；P值使用F检验获得。
图53-图73提供了与本公开的用于产生具有敲除的内源TCR的抗原特异性、药物可选择的airT细胞的示例性的双重编辑策略相关的额外的示意图和数据。
图53描述了示出被设计为：a)消除内源TCR表达和b)产生可选择的抗原特异性airT的双重编辑策略的示意图。FOXP3表达盒以及与IL-2 CISC/DISC的两半(FKBP-IL2RG和FRB-IL2RB)配对的候选胰岛抗原特异性TCR(T1D4)的表达盒的递送可定向到相同的基因座(策略1)或两个分开的基因座(策略2)。CD4+ T细胞中TRAC基因座的靶向可删除内源TCR。策略2可引起更高的初始双重编辑率，但需要两个核酸酶靶位点，产生介导HDR的宿主细胞基因组中的两个双链断裂(DSB)。策略1利用产生单个DSB的单个核酸酶靶位点。
图54描述了用于人T细胞双重编辑中的AAV HDR供体构建体的示意图。前7个构建体是IL-2分开的CISC修复模板，所述修复模板具有由MND启动子驱动的T1D4、GFP、mCherry、或HA标记的FOXP3。分开的CISC的每个组分包含异二聚体的雷帕霉素结合复合物(FKBP和FRB结构域)，以及融合至IL2R信号复合物(IL2RB或IL2RG)跨膜和细胞内结构域的一半的嵌合内质网靶向结构域。每个修复模板侧接有300bp同源臂，该同源臂与靶向TRAC基因座(gRNA_4)或FOXP3基因座(gRNA_T9)(#3207、3208、3240、3243、3251、3252、3273)的gRNA匹配。将接下来的四个构建体(#3253、3258、3292、0001)用于框内敲入包含CISC的组分的无启动子的TCR盒，靶向TRAC基因座的第一外显子(gRNA_1)。最后两个构建体(#3280和#3262)是分开的DISC修复模板，该修复模板包括CISC元件以及编码游离FRB结构域的cDNA，所述结构域在细胞质雷帕霉素螯合(消除或减少雷帕霉素对基因编辑细胞任何负面影响)中起作用。后面的这些构建体还包含被MND启动子驱动的mCherry或FOXP3。
图55描述了在存在或不存在来自供体R003657的CISC编辑的CD4+T细胞的基于rapalog的选择的情况下，人TRAC基因座内的双重编辑率。子图A描述了使用AAV#3207和#3208进行的供体R003657 CD4+ T细胞的编辑(使用RNP和AAV共同递送)、富集和分析步骤的时间线。子图B描述的流式图示出了相比于双重编辑样品的空白样品中的初始的GFP/mCherry双阳性细胞百分比，以及在IL-2或Rapalog(AP21967)的存在下富集7天后的GFP/mCherry双阳性的百分比。子图C描述的直方图示出了在相比于Rapalog的IL-2中富集后的双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比。
图56描述了TRAC基因座中的双重编辑率和来自供体R003471的CISC编辑的CD4+ T细胞的基于rapalog的选择。子图A描述了使用AAV#3207和#3208进行的供体R003471 CD4+T细胞的编辑、富集和分析步骤的时间线。子图B描述的流式图示出了相比于双重编辑样品的空白样品中的初始的GFP/mCherry双阳性细胞的百分比，以及在IL-2或Rapalog(AP21967)存在下富集7天后的GFP/mCherry双阳性的百分比。子图C描述的直方图示出了在相比于Rapalog的IL-2中富集后的双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比。
图57示出了人CD4+ T细胞中的TRAC基因座的双重编辑产生rapalog可选择的、抗原特异性airT。子图A描述的示意图示出了用于引入“分开的”IL-2 CISC元件以选择双重编辑细胞的AAV HDR供体构建体。CISC组分(IL2RG相比于IL2RB)在2个构建体之间分开，并与HA-FoxP3 cDNA或胰岛特异性TCR、T1D4(分别为AAV#3240和#3243)共表达。每个修复模板侧接有不能被靶向TRAC基因座的gRNA切割的相同的同源臂。预期仅并入了各构建体的一个拷贝的经编辑的CD4+ T细胞在Rapalog的处理下选择性地扩增。子图B描述了双重的基于AAV/RNP的CD4+ T细胞编辑、用Rapalog扩增和分析富集的细胞的关键步骤的时间线。细胞在编辑前被珠刺激(CD3/CD28)3天。编辑后两天，通过流式来分析细胞的HA-FoxP3和TCR表达，然后在含有50ng/mL人IL-2或100nM Rapalog的培养基中扩增。在编辑后第5天和第8天进行流式细胞术以评价HA-FoxP3、TCR双阳性细胞的富集。子图C描述了双重编辑细胞的rapalog富集。左子图：在IL-2或Rapalog中扩增8天后的双编辑细胞中的HA-FoxP3和TCR的流式图；右子图：在IL-2或Rapalog中扩增5天和8天后，HA-FoxP3/TCR双阳性细胞百分比的定量。
图58提供的数据示出降低血清浓度会增加TRAC基因座内的总编辑率和双重编辑率。子图A描述的时间线示出了CD4+ T细胞的双重AAV编辑和用Rapalog进行扩增的步骤。使用TRAC gRNA_4以及#3243和#3240 AAV构建体(单基因座双重编辑)编辑人CD4+ T细胞。在电穿孔以递送RNP之后，立即将所述细胞置于含有20％、2.5％、1％或0％FBS的培养基(恢复培养基，recovery media)中并用AAV感染。～16小时后，将培养基替换为含有20％FBS的培养基，并在第3天进行FACS分析以确定编辑率。在含有2.5％FBS的培养基中恢复的细胞在IL-2或Rapalog存在下再扩增7天。子图B描述的流式图示出了编辑后三天空白编辑、单编辑和混合编辑的细胞(10％#3243和10％#3240 AAV)中的T1D4和FOXP3的表达。#3243pAAV.MND.T1D4.FRB.IL2RB和#3240pAAV.MND.FOXP3-HA.FKBP.IL2RG的病毒滴度分别为4.2E11和1.3E12。子图C描述的直方图示出了双重编辑细胞内的双阴性、FOXP3-HA阳性、T1D4阳性和FOXP3/T1D4双阳性细胞的百分比。
图59示出了双重编辑细胞群的相比于Rapalog的IL-2的富集。TRAC基因座双重编辑如图5所示进行。子图A描述的流式图示出了相比于FOXP3/T1D4(#3240/3243)双重编辑细胞的空白编辑细胞中的T1D4和FOXP3表达，这些细胞用50ng/mL IL-2或100nM Rapalog(AP21967)处理7天。仅示出2.5％FBS恢复培养基条件下的数据。子图B描述的直方图示出了富集后的双重编辑细胞内的双阴性、FOXP3-HA阳性、T1D4阳性和FOXP3/T1D4双阳性细胞的百分比。
图60涉及用于测试人CD4+ T细胞的双基因座双重编辑的策略。子图A描述了AAVHDR供体构建体的示意图，该构建体被设计以引入分开的IL-2构建体，以使用双基因座双编辑方法选择双重编辑细胞。CISC组分在2个构建体之间分开，并与mCherry或GFP(分别为#3207和#3251)共表达。修复模板侧接有分别与靶向TRAC或FOXP3基因座的gRNA匹配的同源臂。在Rapalog处理下，预期仅并入两种表达盒(并入适当的基因座中)的经编辑的CD4+ T细胞选择性地扩增。子图B描述的时间线示出了CD4+ T细胞的双重AAV编辑和用Rapalog扩增的步骤。使用人TRAC gRNA_4、人FOXP3 gRNA_T9和#3251(MND.mCherry.FKBP.IL2RG)和#3207(MND.GFP.FRB.IL2RB)AAV构建体(双基因座双重编辑)编辑人CD4+ T细胞。电穿孔后立即将所述细胞置于含有20％或2.5％FBS的培养基(恢复培养基)中。～16小时后，将培养基替换为含有20％FBS的培养基，并在第3天进行FACS分析以确定编辑率。在含有2.5％FBS的培养基中恢复的细胞在IL-2或Rapalog存在下进一步生长7天以监测富集。
图61示出在含有2.5％FBS的培养基中的恢复提高了在编辑后第3天测量的双重编辑率。进行了如图59所示的双基因座双重编辑。子图A描述的流式图示出了编辑后3天的在相比于2.5％FBS的20％FBS恢复培养基中的空白编辑和双重编辑的细胞中的GFP和mCherry表达。#3251pAAV.MND.mCherry.FKBP.IL2RG和#3207pAAV.MND.GFP.FRB.IL2RB的病毒滴度分别为6.55E^10和2.50E^12，且每种病毒的10％培养体积用于编辑反应。子图B描述的直方图示出了双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性群体的百分比。
图62示出了用rapalog选择处理的双基因座双重编辑细胞的稳健富集。进行如图59所示的双基因座双重编辑。子图A描述的流式图示出了空白编辑和GFP/mCherry(#3207/3251)编辑的细胞(在2.5％血清中编辑)中的GFP和mCherry表达，这些细胞用相比于100nMRapalog(AP21967)的50ng/mL IL-2处理10天。子图B描述的直方图示出了在相比于Rapalog的IL-2中处理10天后的经编辑群体中的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比。
图63涉及人类CD4+ T细胞的双基因座双编辑的工程化。CD4+ T细胞的双重AAV编辑和用Rapalog扩增的编辑条件和时间线。使用人TRAC gRNA_4、人FOXP3 gRNA_T9和#3251(MND.mCherry.FKBP.IL2RG)和#3207(MND.GFP.FRB.IL2RB)AAV(双基因座双重编辑)编辑人CD4+ T细胞。编辑条件根据具有不同的病毒储备的百分比以及HDR增强子或DMSO存在与否的表而变化。电穿孔后立即将所述细胞置于含有2.5％FBS的培养基(恢复培养基)中。～16小时后，将培养基替换为含有20％FBS的培养基，并在第3天进行FACS分析以确定编辑率。在含有2.5％FBS的培养基中恢复的细胞在IL-2或Rapalog存在下进一步生长10天以监测富集。
图64描述了示出所匹配的10％体积的AAV HDR供体产生改善的双重编辑的图。如图62所示进行编辑。图示出在30μM HDR增强子或DMSO存在下用不同量的#3207和#3251 AAV编辑后3天，双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性群体的百分比。
图65提供的数据示出了用rapalog选择对双基因座双重编辑CD4+ T细胞的稳健富集；使用2.5％FBS培养基和匹配的10％体积的AAV供体获得最佳结果。如图62所示进行编辑。图示出了来自图10的细胞，(在2.5％血清中编辑，匹配10％病毒+/-HDR增强子)作为与IL-2或Rapalog接触10天后的编辑群体内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比。
图66提供了用于插入胰岛特异性TCR和FOXP3以及使用双基因座双重编辑策略富集双编辑细胞的示例性的分开的CISC构建体的图。将IL-2 CISC(化学诱导信号复合物)分到2个不同的构建体，并与T1D4 TCR或FOXP3(分别为#3243和#3252)共表达。每个构建体包含一半的异二聚体的雷帕霉素结合复合物(FKBP和FRB结构域)，以及融合至IL-2R信号复合物(IL-2RB或IL-2RG)跨膜和细胞内结构域的一半的嵌合内质网靶向域。将编码与T1D4TCR/FOXP3共表达的每个CISC组分的cDNA递送至原代人CD4+ T细胞使我们能够仅扩增包含两种CISC组分的细胞，并因此也进行了双重编辑以表达T1D4 TCR和FOXP3。
图67示出了具有TRAC启动子的捕获的单基因座双重编辑的示例性策略。AAV HDR编辑构建体的示意图，所述构建体被设计用于在TRAC基因座内进行双重编辑以引入：(顶部)(#3240)FOXP3表达和分开的CISC以及(底部)(#3258)框内敲入到TRAC外显子1中以驱动使用TRAC内源启动子的分开的CISC和T1D4 TCR的表达。
图68示出了TRAC基因座HDR编辑破坏TCR表达并通过内源TRAC增强子-启动子介导稳健的转基因表达。子图A描述了在内源TRAC基因座处的mCherry-分开的CISC盒的框内整合的编辑策略。通过使用靶向TRAC外显子1的gRNA，标志物荧光团(mCherry)的框内整合及后随的由P2A元件分隔开的FRB-IL2RB CISC(构建体#3253)允许由内源TRAC启动子驱动的表达，同时破坏内源TCR的表达。子图B描述的时间线示出CD4+ T细胞的AAV#3253编辑的步骤。在编辑前对细胞进行珠刺激(CD3/CD28)3天。子图C描述了如下的分析：编辑后7天通过流式来分析细胞的CD3和mCherry表达。流式细胞图示出了与空白编辑和仅AAV的对照相比，经编辑细胞中的mCherry的显著表达伴随CD3的缺失。
图69示出了通过相比于MND启动子的TRAC内源启动子介导的mCherry表达的比较。如图67所示使用可替代的HDR供体(#3253与#3208)进行基因编辑，以分别评价相比于MND启动子的TRAC内源启动子的相对表达活性。流式细胞图示出内源启动子(P2A.mCherry.FRB.IL2RB(#3253))驱动时的mCherry的表达水平与MND启动子(MND.mCherry.FKBP.IL2RG(#3208))驱动时的表达水平相比更低。子图的底部的行示出了使用#3253供体进行的重复实验的数据。
图70示出了用于靶向TRAC和/或FOXP3基因座并且利用框内敲入构建体来捕获TRAC内源启动子的示例性的替代的双重编辑策略。用于测试单基因座和双基因座双重编辑策略并产生具有IL-2 CISC选择能力的抗原特异性airT的示例性AAV供体构建体的示意图。将T1D4 TCR作为代表性TCR示出，其可根据疾病靶标和用于治疗应用的其它相关特征由替代性TCR替换。IL-2 DISC构建体也被类似地应用。
图71涉及使用诱饵(decoy)-CISC(分开的DISC)构建体对人CD4+ T细胞进行双重编辑。子图A描述了分开的IL-2 DISC HDR敲入构建体(#3280)的图，所述构建体用于选择雷帕霉素中的双重编辑细胞。为了产生分开的诱饵-CISC(分开的DISC)，将用于细胞质雷帕霉素螯合的游离FRB结构域添加到MND.mCherry.FKBP.IL2RG构建体以产生(MND.mCherry.FKBP.IL2RG.FRB(#3280))。每个修复模板(#3280和#3207，未示出)侧接有与靶向TRAC基因座的gRNA匹配的相同的同源臂。预期并入各构建体的一个拷贝的经编辑的CD4+ T细胞在Rapalog或雷帕霉素处理下选择性地扩增。子图B描述的时间线示出了使用AAV(#3280和#3207)对CD4+ T细胞进行双重AAV编辑、使用Rapalog/雷帕霉素进行扩增和分析富集的细胞的步骤。在编辑前对细胞进行珠刺激(CD3/CD28)3天。编辑后两天，通过流式来分析细胞的GFP和mCherry表达，然后在含有50ng/mL人IL-2、100nM Rapalog或10nM雷帕霉素的培养基中扩增。子图C描述的流式图示出了在编辑后第3天的GFP/mCherry双阳性细胞的百分比。
图72示出了用分开的DISC构建体对人CD4+ T细胞进行的双重编辑产生雷帕霉素选择性细胞。双重编辑如图70所描述的进行。子图A描述的流式图示出了在50ng/mL人IL-2、100nM Rapalog(AP21967)、10nM雷帕霉素或无处理的存在下，8天后双阳性GFP/mCherry细胞的百分比。子图B描述了对在IL-2、Rapalog(AP21967)、雷帕霉素或无处理的富集后的双重编辑细胞内的双阴性、GFP阳性、mCherry阳性和GFP/mCherry双阳性细胞的百分比进行量化的直方图。
图73示出了用于体内测试双重编辑的Treg(分开的DISC)的示例性构建体。FOXP3分开的IL-2 DISC HDR敲入构建体(#3262)与T1D4 CISC构建体(#3243)配对以用于双重编辑细胞的雷帕霉素选择的图。CISC组分在2个构建体之间分开，并与HA-FoxP3或T1D4 TCR共表达。FOXP3 CISC构建体还包含FRB结构域，且被预期在雷帕霉素(FOXP3 DISC构建体)存在下保护mTOR信号转导。每个修复模板侧接有与靶向TRAC基因座的gRNA匹配的相同的同源臂。在Rapalog和雷帕霉素处理下，并入各构建体的一个拷贝的经编辑的CD4+ T细胞可选择性地扩增。
图74-图94提供了与鼠airT细胞的产生和表征相关的额外的示意图和数据。
图74描述了在鼠Foxp3编辑中使用的修复模板。在鼠T细胞中被开发和测试用于编辑效率、FOXP3表达和抑制功能的替代性的AAV.GFP.KI和AAV.LNGFR.P2A构建体的图。
图75描述了示出用于使用MND.GFP.KI(或替代性的)HDR供体构建体产生鼠airT的方法的示意图。
图76涉及利用替代性启动子来表达内源Foxp3的鼠airT细胞的产生和富集。流式细胞图示出了在空白、MND.GFP.KI(#1331)、MND.LNGFR.P2A(#3189和3261)、PGK.LNGFR.P2A(#3227)和EF-1a-LNGFR.P2A(#3229)编辑的细胞中通过FACS分选的LNGFR富集之前和之后的LNGFR和GFP表达。上图示出了初始的编辑率，以及下图示出了FACS分选后的富集。数据表明可用每个候选供体构建体产生airT。
图77描述了使用替代性同源供体盒的鼠airT中的Foxp3的表达水平。子图A描述的流式细胞图示出了HDR编辑的脾脏T细胞中的LNGFR和GFP表达。子图分别示出了：未经操作的C57BL/6对照细胞；空白编辑的、MND.GFP.KI(#1331)、MND.GFP.KI与UCOE(#3213)、以及PGK.GFP.KI(#3209)编辑的C57BL/6鼠T细胞。子图B描述了示出来自子图A中数据的FOXP3表达的流式直方图。子图C描述了示出用所示出的替代性HDR供体构建体产生的nTreg和edTreg/airT中的FOXP3MFI的柱状图。包含供体的MND启动子介导了最高水平的FOXP3表达。
图78描述了使用鼠tTreg或airT的体外抑制测定的设计和结果。A.将用于体外抑制测定的airT细胞在编辑后第2天通过FACS分选进行富集，并重新悬浮至含有10％FBS的RPMI培养基中。将nTreg(CD4+CD25+)、Teff(CD4+CD25-)和抗原呈递细胞(CD4-CD25-)通过柱富集从8至10周龄C56BL/6小鼠的合并的脾脏和淋巴结细胞中分离。将富集的5×106Teff重新悬浮在2mL PBS中，并在37℃下用cell trace violet(CTV)标记15分钟，然后在其加入抑制测定中之前，洗涤并重新悬浮在培养基中。为了设置该测定，将1.25×105经辐照的APC(2500rad)与0.25×105Teff和滴定数量的nTreg和airT在1mg/mL抗CD3存在下在具有总体积为300μL培养基的U型底96孔组织培养板中共培养，并在37℃的CO2培养箱中孵育四天。在第4天，将细胞用PBS洗涤两次并用活/死指示剂、抗CD4、抗CD45和抗CD25染色，并通过FACS(LSRII)分析airT对Teff增殖的抑制。B)代表性流式数据示出了在airT细胞存在下Teff增殖的减少。
图79描述了体外测试鼠airT抑制功能的结果。流式细胞图示出了在空白编辑的T细胞、MND.GFP.KI(#1331)编辑的T细胞或MND.LNGFR.P2A(#3261)编辑的T细胞、或来自C57BL/6小鼠的nTreg存在和不存在时的cell trace violet标记的CD4+ T细胞。这些数据证明，鼠airT(用MND.GFP.KI或MND.LNGFR.P2A HDR供体产生)和nTreg表现出相当的、稳健的体外抑制功能。
图80描述了具有替代启动子的鼠airT的体外抑制功能。流式细胞图示出空白编辑的T细胞、MND.GFP.KI(#1331)编辑的T细胞、MND.LNGFR.P2A(#3261)编辑的T细胞、PGK.LNGFR.P2A(#3227)编辑的T细胞和EF-1a.LNGFR.P2A(#3229)编辑的T细胞、或来自C57BL/6小鼠的nTreg存在和不存在时的cell trace violet标记的CD4+ T细胞。具有MND启动子的鼠airT表现出与nTreg相当的抑制功能。与之相反，使用PGK或EF-1a启动子的airT仅表现出有限的抑制或没有抑制。
图81描述了用以在NSG过继性转移模型中比较分选与柱纯化富集的LNGFR+编辑的细胞的实验设计。该表格列出了5个实验群组中每个群组的受者NSG宿主动物的数量、以及过继性转移的对照、airT或nTreg细胞的来源和数量。
图82描述了柱纯化之前和之后的LNGFR.P2A编辑的NOD BDC2.5+鼠细胞的流式分析。子图A描述的流式细胞图示出了空白编辑和MND.LNGFR.P2A(#3189)编辑的细胞中的LNGFR表达。子图B描述的流式细胞图示出了通过分选富集后的MND.LNGFR.P2A(#3189)编辑的细胞的LNGFR表达。FACS分选始终富集纯度>90％的edTreg产物，以用于体外和体内研究。
图83描述了柱富集之前和之后经编辑的鼠细胞的流式分析。流式细胞图示出了在柱富集之前和之后的MND-LNGFR.P2A(#3189)编辑的细胞。在此富集实例中，将初始编辑率为～7％的72×106细胞添加到抗LNGFR柱，产生纯度>84％的2×106edTreg。
图84描述了评价NSG过继性转移模型中的胰岛抗原特异性airT功能的实验设计和结果：FACS分选的airT和柱富集的airT的比较。胰岛抗原特异性(BDC)airT(使用HDR供体3261或3389而产生的)或抗原特异性nTreg通过眶后(R.O.)递送而过继性转移至成年的8-10周龄受者NSG小鼠中，然后输注抗原特异性Teff细胞。对小鼠监测糖尿病的发展长达60天。图示出了接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑的、MND.LNGFR.P2A编辑的(FACS分选或柱富集的)或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比。柱富集的Ag特异性MND.LNGFR.P2A airT降低了NSG小鼠中的糖尿病发病率，并表现出与FACS分选的airT相当的功能。更高剂量的柱富集的MND.LNGFR.P2A airT或nTreg完全保护受者动物免于糖尿病的发展。
图85描述了在NSG过继性转移模型中使用替代启动子产生的airT的体内功能的比较。工程化的抗原特异性(BDC)airT(使用MND或PGK启动子产生；供体构建体分别为1331或3209)或抗原特异性nTreg被过继性转移到NSG受者小鼠中，然后输注抗原特异性Teff细胞。对小鼠监测糖尿病的发展长达60天。图示出了接受效应细胞(5×104)以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑、MND.GFP.KI(#1331)、PGK.GFP.KI(#3209)的airT或nTreg细胞(5×104)后的糖尿病小鼠的百分比。具有MND启动子的抗原特异性airT预防了所有受者小鼠中的糖尿病的发展。nTreg在4/5受者小鼠中预防疾病。与之相反，掺入PGK启动子的抗原特异性airT几乎没有或没有保护作用。这些数据直接证明，来自T1D的保护对使用MND启动子以驱动Foxp3表达来产生的airT而言是特异性的，支持在T1D或其它免疫疾病的人体试验中的该构建体的使用。
图86示出了胰岛Ag特异性MND.GFP.KI airT在靶器官(胰脏)中在体内持续至少60天并表现出稳定的表型。流式细胞图示出了NSG小鼠中过继性转移后第60天在胰腺中恢复的MND.GFP.KI(#1331)NOD BDC2.5 airT中的FOXP3和GFP表达。数据示出了来自两只小鼠的结果。受者小鼠还表现出源自输入的Teff群体的内源Treg或iTreg(FOXP3+.GFP-CD4 T细胞)的扩增(可能继发于airT递送的额外的有益的旁观者影响)。
图87描述了用于敲入/敲除的鼠Rosa26基因座的基于CRISPR的靶向的设计和结果。子图A描述了Rosa26基因座被选为鼠T细胞的安全港HDR整合位点的模型。两种新的gRNA(gRNA_1和gRNA_2)的位置在鼠Rosa26基因座内。来自Pesch等和Wu等的gRNA包括该基因座区域内的先前公开的gRNA。子图B描述了由ICE(Inference of CRISPR Edits)测量的中靶向位点特异性活性，证明了在将Cas9-RNP递送至原代小鼠CD4+ T细胞后，在Rosa26中使用R26 gRNA_1的特异性的插入缺失诱导。
图88描述了在小鼠Rosa26基因座处进行HDR编辑的实验大纲。子图A描述了本实验中使用的AAV构建体#3245的示意图。在小鼠T细胞中的基于HDR的编辑后，MND启动子驱动GFP的表达。子图B描述了实验程序的时间线。鼠C57BL/6J CD4+ T细胞在编辑前被分离并珠刺激(CD3/CD28)3天。在编辑后第3天和第8天，通过流式细胞术评价细胞的GFP。
图89描述的数据证明了鼠CD4+ T细胞中的Rosa26基因座内基于HDR的编辑。如图88中概括的对CD4+ T细胞进行编辑，并在第3天通过流式细胞术评价。子图A描述的流式图示出了空白编辑、单独的AAV#3245和AAV#3245/RNP编辑的细胞在编辑后3天的GFP表达。子图B描述的直方图示出了经编辑的群体内的生存力百分比、GFP阳性细胞和高GFP+细胞的％。
图90示出了鼠T细胞在Rosa26基因座的HDR编辑后保持GFP的稳定表达。如图88中概括的对CD4+ T细胞进行编辑。并在第8天通过流式细胞术评价。子图A描述的流式图示出了空白编辑、单独的AAV#3245和AAV#3245/RNP编辑的细胞在编辑后8天的GFP表达。子图B描述的直方图示出了经编辑群体中的GFP阳性细胞的％。
图91描述了用于在鼠T细胞的Rosa26基因座内表达鼠Foxp3-和P2A-连接的LNGFR的AAV HDR供体构建体的示意图。修复模板侧接有与R26_gRNA_1切割位点匹配的300bp同源臂，并包含驱动mFOXP3和LNGFR表达的替代启动子(MND或PGK)。此外，还包括含有Foxp3 4XCDK磷酸化位点突变体的盒，因为该构建体被预期增加Foxp3的稳定性。
图92涉及用于转导鼠CD4+ T细胞和用Rapalog测试选择性的扩增的慢病毒CISC构建体。子图A描述了慢病毒构建体#1272的示意图。开发该构建体是为了评价在Rapalog存在下使用人CISC组分富集鼠T细胞的概念验证。小鼠T细胞的转导后，MND启动子驱动与IL-2CISC组分(FKBP-IL2RG和FRB-IL2RB)连接的mCherry的表达。子图B描述了实验程序的时间线。鼠C57BL/6J CD4+ T细胞在转导前用珠刺激(CD3/CD28)3天。在转导后第2天和第5天，通过流式细胞术评估细胞的mCherry。
图93示出了用慢病毒CISC转导的鼠CD4+ T细胞在Raplog中表现出稳健的富集。子图A描述的流式图示出了空白或鼠CD4+ T细胞的慢病毒转导(#1272)后2天的mCherry表达。子图B描述的流式图示出了在用IL-2、IL-7和IL-15处理的空白鼠细胞，或者用IL-2、IL-7和IL-15、单独的Rapalog，或Rapalog+珠刺激处理的慢病毒(#1272)转导的鼠细胞中的mCherry表达。
图94示出airT细胞抑制CD8+ T细胞以及CD4+ T细胞的增殖。
图95描述了通过用模型(model)抗原肽(MP)刺激和针对FoxP3表达进行编辑来产生抗原特异性airT细胞的过程的示意图。
图96描述了通过MP肽特异性airT细胞进行的抗原特异性抑制。简而言之，Teff：由MP肽(右侧)或HA肽(左侧)刺激的第23天的T细胞；Treg：对MP肽(右侧)或HA肽(左侧)而言特异性的第23天的经编辑的细胞，由CRISPR/Cas9和AAV Foxp3-MND-LNGFRki编辑；APC：经辐照的自体CD4-CD25+细胞DMSO或HA肽5μg/mL；孵育6天。
图97示出了airT细胞对Teff增殖示出抑制活性。简而言之，3天孵育；对于珠抑制：Teff+Treg(untd edTreg、T1D5-1 airT或T1D5-1空白)；对于Ag特异性抑制：T1D5-1 Teff+Treg；Teff门：CD4+CD11c-CTV+EF670-mTCRb+门。
图98描述了airT对Teff中的细胞因子产生的抑制。简而言之，T1D4 Teff；Treg(d10)：T1D4空白或T1D4 airT；以及肽1μg/mL；孵育3天。
图99描述了airT对Teff的抗原特异性和旁观者抑制。简而言之，Teff1.25×104；Treg 2.5×104；APC 1×105；以及肽5μg/mL。
图100描述了airT对Teff的抗原特异性和旁观者抑制。简而言之，Teff 1.25×104；Treg 2.5×104；APC 1×105；以及肽5μg/mL。
图101示出了Teff细胞因子产生的旁观者抑制。简而言之，T1D5-2 Teff；Treg(d10)：T1D4空白或T1D4 edTreg；以及肽1μg/mL；以及孵育3天。
图102示出了TCR的剂量响应：增殖测定。简而言之，mTCR表达数据：转导后第8天；增殖测定：第11天的细胞，以及孵育4天。
图103示出了胰岛Ag特异性TCR表达的验证：mTCRb表达和增殖测定。简而言之，T细胞：转导后第9天，用Cell Trace Violet标记；APC：经辐照的CD4-CD25+细胞；以及孵育5天。
图104示出了可在胰腺中检测到的抗原特异性GFP+airT。也参见图107和图116。
图105涉及用于体内抑制研究的鼠LNGFR+airT细胞的产生和富集。也参见图114。
图106示出了Ag特异性MND.LNGFR.P2A-airT在NSG小鼠中完全预防了糖尿病。也参见图115、图134和图135。
图107示出了可在胰腺中检测到的抗原特异性GFP+airT。
图108示出了与本公开的示例性IL-2 CISC相关的示意图和数据。
图109示出了体内雷帕霉素接触促进CISC细胞的持久性。
图110示出了本公开的示例性的经编辑细胞的示意图。
图111涉及用于TRAC基因座靶向的gRNA选择。
图112涉及具有靶向至TRAC基因座的IL-2分开的CISC组分的双重编辑策略。
图113示出了为体外的经双重编辑的细胞而选择的CISC接合(engagement)。
图114描述了柱纯化之前和之后的LNGFR.P2A编辑的NOD BDC2.5+鼠细胞的流式分析。子图A描述的流式细胞图示出了LNGFR在MND.LNGFR.P2A(#3261)编辑的细胞中、而不在空白细胞中特异性表达。子图B描述的流式细胞图示出了流过物(F.T.)和通过柱纯化而富集后的洗脱样品中的MND.LNGFR.P2A(#3261)编辑的细胞中的LNGFR表达。柱富集产生了纯度为74.5％的airT产物，以用于体内研究。
图115描述了NSG过继性转移模型中的胰岛抗原特异性airT功能的评价：将胰岛抗原特异性(BDC)airT(使用HDR供体3261而产生的)或抗原特异性nTreg(50K)通过眶后(R.O.)递送而过继性转移至成年的、8-10周龄的受者NSG小鼠，然后输注50K抗原特异性Teff细胞。子图A描述的流式细胞图示出了MND.LNGFR.P2A(#3261)编辑的细胞中的nTreg和LNGFR+表达的CD4和CD25谱。子图B描述了如下的图：对小鼠监测糖尿病发展长达49天。图示出了接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑、MND.LNGFR.P2A编辑的(柱富集的)或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比。柱富集的Ag特异性MND.LNGFR.P2A-airT完全预防了NSG小鼠的糖尿病。
图116示出了胰岛Ag特异性MND.GFP.KI airT在靶器官(胰脏)中在体内持续至少49天并且表现出稳定的表型。流式细胞图示出在NSG小鼠过继性转移后第49天在胰脏中恢复的NOD BDC2.5 airT中的LNGFR和FOXP3表达。
图117A描述了在转导后第9天的CD4+细胞上受门控的mTCRb表达的流式图。
图117B描述了用由CTV标记的RA Ag特异性TCR转导并与APC(经辐照的PBMC)及其同源的肽或DMSO共培养3天的CD4+ T细胞的流式图。
图118B描述了使用烯醇酶特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。
图118C描述了由图118B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和烯醇酶肽(灰色)存在下由无Treg、untd edTreg、Enol edTreg或空白对Teff增殖的抑制百分比的图。
图119A描述了在分别用无LV和LV CILP297-1-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的edTreg和CILP297-1 edTreg中的mTCRb表达的流式图。
图119B描述了使用CILP特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。
图119C描述了由图119B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和CILP肽(灰色)存在下由无Treg、untd edTreg、CILP edTreg或空白对CILP Teff增殖的抑制百分比的图。
图120A描述了在分别用无LV和LV Vim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的edTreg和Vim418 edTreg中的mTCRb表达的流式图。
图120B描述了使用波形蛋白特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。
图120C描述了由图120B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和波形蛋白肽(灰色)存在下由无Treg、untd edTreg、Vim edTreg或空白对Vim Teff增殖的抑制百分比的图。
图121A描述了示出分别用无LV、LV Agg520-TCR和LV Vim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的、Agg520和Vim418 edTreg中的mTCRb表达的流式图。
图121B描述了使用Agg520 Teff和edTreg或者对Agg520或Vim418而言特异性的空白的多克隆抑制测定。
图121C描述了由图121B中的增殖百分比计算的无Treg、untd edTreg、AggedTreg/空白或Vim edTreg/空白对Agg520 Teff增殖的抑制百分比的图。
图121D描述了使用Agg520 Teff和edTreg或者对Agg520或Vim418而言特异性的空白的抗原特异性和旁观者抑制测定。
图121E描述了由图121D中的增殖百分比计算的无Treg、edTreg或空白对Agg520Teff增殖的抑制百分比的图。
图122A描述了分别用无LV、LV CILP297-1-TCR和LV Vim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的、CILP297-1和Vim418 edTreg中的mTCRb表达的流式图。
图122B描述了使用CILP297-1 Teff和edTreg或者对CILP297或Vim418而言特异性的空白的多克隆抑制测定。
图122C描述了由图122B中的增殖百分比计算的无Treg、untd edTreg、CILPedTreg或空白、或Vim edTreg或空白对CILP Teff增殖的抑制百分比的图。
图122D描述了使用对CILP297和Vim418而言特异性的edTreg和CILP297-1 Teff的抗原特异性和旁观者抑制测定。
图122E描述了由图122D中的增殖百分比计算的无Treg、edTreg或空白对CILPTeff增殖的抑制百分比的图。
图123A描述了在第7天表达SLE3-TCR的经编辑细胞中的mTCRb表达和LNGFR/Foxp3表达的流式图。
图123B描述了使用SLE特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。
图124A描述了AAV HDR-供体构建体的示意图，该构建体被设计用于使用单基因座双重编辑方法将分开的CISC元件引入TRAC基因座中。
图124B描述了CD4+ T细胞的双重AAV编辑和用Rapalog扩增的关键步骤的时间线。
图125A描述了在编辑后第3天的空白编辑、经单编辑和经双重编辑的细胞(使用10％体积的#3243和#3240 AAV两者)中的T1D4和FOXP3表达的流式图。
图125B描述了空白编辑和混合编辑的细胞中的T1D4和CD4表达的流式图。
图125C描述了经双重编辑的细胞内的双阴性、FOXP3-HA阳性、T1D4阳性和FOXP3/T1D4双阳性细胞的百分比的直方图。
图125D描述了相比于空白编辑细胞的FOXP3/T1D4双重编辑细胞中的CD3敲除百分比的直方图。
图126A描述了用50ng/mL IL-2(上子图)或100nM Rapalog(AP21967；下子图)处理7天的经双重编辑细胞中的生存力以及T1D4和FOXP3表达的流式图。
图126B描述了用50ng/mL IL-2(上子图)或100nM Rapalog(AP21967；下子图)处理7天的T1D4/FOXP3双阳性vs.双阴性细胞群的CTLA4表达的流式图。
图127A描述了在IL-2培养基中恢复后用50ng/mL IL-2(上图)vs.100nM AP21967(下图)处理之后的经双编辑的细胞中的生存力(右图)以及T1D4和FOXP3表达(左图)的流式图。
图127B描述了在最后3天处于含有IL-2的恢复培养基中的10天期间内用50ng/mLIL-2或100nM Rapalog(AP21967)处理的双阳性T1D4/FOXP3细胞的富集倍数的图。
图128A描述了用于在Rapalog或雷帕霉素中选择经双重编辑细胞的分开的IL-2DISC HDR敲入构建体(#3280)的图。
图128B描述了使用AAV#3280和#3207对CD4+ T细胞进行双重AAV编辑、用Rapalog/雷帕霉素扩增以及分析富集的细胞的关键步骤的时间线。
图129A描述了编辑后四天的经双重编辑细胞(分别为10％培养体积的#3280和#3207 AAV供体)中的mCherry和GFP表达的流式图。#3280和#3207的病毒滴度分别为3.30E+12和3.1E+10。双重编辑的400万总细胞初始双阳性率：4.47％。gRex容器接种了总计760万个细胞，340,000个双阳性。
图129B描述了在gREX中接种760万个经编辑细胞并在AP21967存在下扩增7天使得双阳性细胞扩增32倍后的生存力(上子图)以及GFP和mCherry表达(下子图)的流式图。gRex中的双阳性细胞总数：1110万。
图130A描述了使用AAV#3280和#3207对CD4+ T细胞进行双重AAV编辑、用Rapalog扩增和分析富集的细胞的步骤的时间线。
图130B描述了经双重编辑的细胞(10％#3280和10％#3207 AAV)中的mCherry和GFP表达的流式图。#3280MND.mCherry.FKBP.IL2RG.FRB和#3207 pAAV.MND.GFP.FRB.IL2RB的病毒滴度分别为3.30E+12和3.1E+10。编辑了总计1000万个细胞，初始双阳性率：2.37％。用总计910万个细胞、216,000个双阳性接种gRex。
图131描述了在gREX中接种经编辑的细胞并在AP21967存在下扩增7天后的生存力以及GFP和mCherry表达的流式图。扩增7天后的结果包括gRex中的双阳性细胞总数：970万；由最初的216,000个双阳性细胞扩增约45倍。
图132A描述了使用小鼠edTreg或nTreg的体外抑制测定的设计。
图132B描述了示出在BDC2.5+edTreg细胞存在下BDC2.5+Teff增殖减少的代表性流式数据。
图133描述的流式细胞图示出了在来自NOD BDC2.5+小鼠的空白、MND.LNGFR.p2A(#3261)编辑的Treg或nTreg存在和不存在下的cell trace violet标记的CD4+ T细胞。鼠胰岛TCR+edTreg(由MND.LNGFR p2A(#3261)HDR供体产生)和tTreg表现出抗原特异性体外抑制功能。50K Teff+抗CD3(1μg/mL)+200K经辐照的APC(2500 rad)。分析@第4天。CTV＝celltrace violet。示出的数据：1:1(Teff与Treg的比率)。
图134描述了在接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑的、MND.LNGFR.P2A编辑的或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比的图。与nTreg相似，MND.LNGFR p2A edTreg完全预防了糖尿病的发病，而空白编辑的对照细胞对疾病发病没有任何影响。
图135描述了在重复实验中接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑的、MND.LNGFR.P2A编辑的或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比的图。柱富集的Ag特异性LNGFR p2A edTreg完全预防了(第33天)NSG小鼠中的糖尿病，
图136A、图136B和图136C各自示出了列出TCRα和βCDR3以及TCR的J区的氨基酸序列的表格，它们特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原。
图137示出了列出TCRα和βCDR3以及TCR的J区的氨基酸序列的表格，它们特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原。
图138示出了列出TCR的J区的氨基酸序列的表格，所述TCR的J区特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原。
图139A示出了列出编码TCR的TCRα和β链V区的核苷酸序列的表格，所述TCR的TCRα和β链V区特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原；
图139B示出了列出TCR的J区的氨基酸序列的表格，所述TCR的J区特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原。
图140A示出了列出编码TCR的TCRα和β链V区的核苷酸序列的表格，所述TCR的TCRα和β链V区特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原；
图140B示出了列出TCR的TCRα和βJ区的氨基酸序列的表格，所述TCR的TCRα和β链J区特异性识别与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的抗原。
图141示出了列出与自身免疫性2型肝炎相关的CYP2D6抗原的由特异性TCR识别的抗原表位的氨基酸序列的表格。
图142示出了列出与大疱性类天疱疮相关的BP230或BP180抗原的由特异性TCR识别的抗原表位的氨基酸序列的表格。
图143A示出了列出与自身免疫性、过敏性和/或炎性病症的发病机制相关的多肽抗原的氨基酸序列的表格，包含由特异性TCR识别的抗原表位以及特异性识别抗原的TCR的TCRα和βCDR3区的氨基酸序列。
图143B示出了列出与自身免疫性、过敏性和/或炎性病症的发病机制相关的多肽抗原的氨基酸序列的表格，包含由特异性TCR识别的抗原表位以及特异性识别抗原的TCR的TCRα和βCDR3区的氨基酸序列。
图144示出了列出与自身免疫性、过敏性或炎性病症的发病机制相关的多肽抗原的氨基酸序列的表格，包含由特异性TCR识别的抗原表位以及特异性识别抗原的TCR的TCRα和βCDR3区域的氨基酸序列。
图145示出了列出可用于本文提供的实施方式的某些核酸序列的表格，包括向导RNA(gRNA)和含有TOXP3编辑序列的AAV载体。
具体实施方式
本文所提供的方法和组合物的一些实施方式涉及人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞。airT细胞也可称为“edTreg”或“经编辑的Treg”细胞。一些实施方式包括包含CD4+CD25+ T细胞的人工工程化T细胞(例如T淋巴细胞)，所述CD4+CD25+ T细胞具有叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰以及编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸，并且所述细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平。
在一些实施方式中，当通过由TCR识别的特异性抗原(例如与其特征在于过度的免疫应答的炎性病症的发病机制相关的另一抗原、自身抗原或过敏原)而被诱导时，所述airT细胞能够介导抗原特异性免疫抑制。有意义的是，现有的airT细胞的产生不需要作为用于基因编辑的起始材料的相对罕见(人PBMC的1％-4％)的天然Treg细胞分离相关的时间、成本和低效率，因此为用于过继性免疫疗法的治疗有效量的期望细胞的产生提供了某些优势。
在一些实施方式中，所述airT细胞表达功能性TCR，所述TCR特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原，例如包含本文公开的任意TCR多肽序列或由本文公开的TCR编码多核苷酸序列所编码的任意TCR多肽的TCR，包括附图中列出的那些。
在一些实施方式中，所述airT细胞表达功能性TCR，所述TCR特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原，例如包含本文公开的多肽抗原氨基酸序列的任意多肽自身抗原、过敏原和/或炎症相关抗原，或与包含本文公开的多肽抗原氨基酸序列的多肽自身抗原、过敏原和/或炎症相关抗原免疫学上交叉反应的任意多肽抗原，包括附图中列出的那些。
本文公开的某些实施方式涉及用于airT细胞的产生的基因编辑策略，所述策略包括以下的出乎意料的有利的功能性连接：(i)由靶向的FoxP3基因编辑所产生的稳定的FoxP3表达，包括组成型启动子的引入以在先前不表达FoxP3的细胞中驱动FoxP3的表达，其中，所述FoxP3的表达处于等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FoxP3表达水平的水平，以维持所述airT细胞的稳定的FoxP3受控的免疫调控(免疫抑制)程序，以及(ii)外源TCR通过基因编辑在相同细胞中稳定表达，以将本公开的编码TCR的特定核苷酸序列引入所述airT细胞，所述TCR识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原，以允许与期望的TCR表达共分离的其特征在于稳定的免疫抑制潜力的工程化T细胞的选择和扩增。不希望受理论的束缚，据信通过人工工程化的稳定的FoxP3表达，本文所述的airT细胞的一些实施方式包括用于适应症(例如自身免疫性、过敏性或其它炎性病症)的安全且有效的过继性转移免疫疗法细胞，其中抗原特异性免疫抑制是可期望的，而没有与天然的Treg可塑性相关的风险(例如，回归至T效应子行为)。
本公开的airT细胞有利地产生并且在一些实施方式中不包括首先分离的天然Treg细胞，如上所述的，天然Treg细胞以低频率天然存在于外周血中，仅代表人外周血单核细胞的约1％-4％。相反，如本文所述的，airT细胞的产生可以通过分离CD4+ T细胞来实现，尽管相对于其它细胞表面标志物是异质的，但CD4+ T细胞可包含约25％-60％的人PBMC，并因此代表了根据本文提供的各种策略的用于基因编辑的相对丰富的起始材料。
在某些实施方式中，本发明的抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞组合物和方法将用于治疗和/或改善某些自身免疫性病症、过敏性病症和/或炎性病症，包括用于过继性转移免疫疗法中，其中抗原特异性免疫调控功能的维持和稳定的airT细胞生存力提供了前所未有的优势。
在某些实施方式中，本文所述的airT细胞在被与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原(例如本文公开的抗原之一)刺激时，出乎意料地能够诱导抗原特异性免疫抑制应答。此种抗原特异性诱导的免疫抑制可包括以下中的一种或多种：(i)对效应T细胞的激活和增殖中任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airTTCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子或抗炎性产物的加工，例如对如下的一种或多种抑制机制的加工，所述抑制机制包括免疫抑制细胞因子或穿孔素/颗粒酶的释放、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的诱导、对IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和通过airT细胞的抑制性受体的表达，以及(iv)对效应T细胞的激活和增殖中任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。在一些实施方式中，所述airT细胞的此种抗原刺激是HLA限制性的。
在一些实施方式中，如本文所述稳定表达FoxP3的本发明airT细胞的产生克服了与其中通过逆转录病毒或慢病毒基因转移来实现FOXP3转基因表达的现有方法相关的某些缺点。由于在不同基因组位点具有不同稳定性和不同表达水平的随机整合的FOXP3转基因，所得病毒性FoxP3转导的细胞群具有遗传异质性。尽管至少暂时地表现出Treg特征(例如表型标志物和细胞因子表达谱)，但此类转导的群体也会因携带伴随的遗传毒性风险而潜在地受到损害，以及容易被病毒整合位点处的局部调控元件沉默。
为了避免这些风险，本文提供的一些实施方式包括特异性靶向的基因编辑、并且任选地特异性靶向的TCR基因编辑用于人工修饰所述FOXP3基因的用途，而不是依赖于病毒FOXP3基因转移。本文描述的某些实施方式利用慢病毒基因递送将候选的自身免疫相关的TCR引入CD4 T细胞中，然后进行所述细胞的FOXP3基因编辑以推动稳定的FoxP3表达。在一些相关实施方式中，该方法与基因编辑方法结合以同时删除内源TCR基因(例如通过失活，在本文中也称为“敲除”)。
作为不同于慢病毒TCR递送的替代策略，本文所述的一些实施例涉及在相同基因座的不同等位基因处同时进行的基因编辑，例如单基因座双等位基因双重编辑，其中双重编辑在单基因座(例如具有单个向导RNA和AAV供体同源构建体)处实现。
作为另一替代，本文所述的一些实施方式涉及在两个不同基因座处的同时的基因编辑，例如双基因座双重编辑，其中在两个基因座(例如具有两个不同的向导RNA和基因座特异性AAV供体同源盒)中的每一处发生不同的基因编辑事件。
通过这些方法，工程化的FOXP3和TCR基因可被递送至单个特定基因座或两个不同的特定基因座。还如本文所述，在一些实施方式中，此策略可进一步包括掺入分开的化学诱导信号复合物(分开的CISC)组分，所述CISC组分仅允许那些在相同细胞中表达插入的TCR和Foxp3基因两者的T细胞的选择性扩增，从而富集airT细胞。
化学诱导信号复合物(CISC)
如本文所述，一些实施方式利用分开的化学诱导信号复合物(分开的CISC)策略，通过该策略可基于相同细胞中以下的成功表达产生和选择性扩增基因编辑的airT细胞：(i)组成型表达的FoxP3基因编辑的基因产物，所述基因产物的表达与第一CISC组分的细胞表面表达相关，所述第一CISC组分与CISC诱导物分子特异性结合，所述第一CISC组分作为具有第一细胞外CISC诱导物分子结合结构域、跨膜结构域和第一细胞内激活信号转导结构域的跨膜融合蛋白而存在；以及(ii)经转导的异源TCR基因编辑的基因产物，所述基因产物的表达与第二CISC组分的细胞表面表达相关，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且与所述CISC诱导物分子特异性结合，所述第二CISC组分作为具有第二细胞外CISC诱导物分子结合结构域、跨膜结构域和不同于所述第一细胞内激活信号转导结构域的第二细胞内激活信号转导结构域的跨膜融合蛋白而存在。
在某些实施方式中，在如本文所述的基因编辑(例如双重编辑)之前，从生物样品(例如外周血单核细胞(PBMC))中富集CD4+ T细胞。在某些实施方式中，富集的CD4+ T细胞在如本文所述的基因编辑(例如双重编辑)之前被非特异性地激活(例如用固相固定的抗CD3和抗CD28抗体)。
在一些实施方式中，如本文所述的双重编辑的T细胞暴露于所述CISC诱导物分子使得所述诱导物分子与所述第一CISC组分和第二CISC组分两者的细胞外结构域结合，以及由第一CISC组分和第二CISC组分形成异二聚体以激活由所述第一细胞内激活信号转导结构域和第二细胞内激活信号转导结构域形成的功能性信号转导复合物。结果，在其中表达第一CISC组分和第二CISC组分两者(并因此FoxP3和异源TCR两者)的airT细胞群被选择性地扩增。
在一些实施方式中，引起本文的airT细胞中的伴随FoxP3基因产物的第一CISC组分和伴随TCR基因产物的第二CISC组分表达的两个基因编辑事件可被设计为发生在相同基因座的不同等位基因中(例如双等位基因双重编辑)，或发生在两个不同的基因座处(例如双基因座双重编辑)。在一些实施方式中，与CISC诱导物分子特异性结合的第三CISC组分也可与FoxP3基因产物或TCR基因产物共表达。所述第三CISC组分在被表达时保留在细胞内位置处并充当结合的诱饵，从而避免与可能到达细胞内部的某些CISC诱导物分子相关的毒性。
包括第一CISC组分、第二CISC组分和第三CISC组分的结构以及CISC诱导物分子的结构的CISC系统的细节描述于本文别处以及WO/2018/111834和WO/2019/210078中，它们均通过引用的方式将其整体明确地并入。简而言之，WO/2018/111834描述了通过编码配体二聚化融合蛋白化学诱导信号复合物(CISC)的基因构建体的敲入(插入)来基因编辑宿主细胞的组合物和方法。两种融合蛋白亚基的细胞表达后随着宿主细胞暴露于所述化学配体允许配体诱导的CISC二聚化以转导细胞激活信号。因此，所述CISC系统提供经历过基因修饰以掺入两种CISC组分的细胞的选择和扩增(例如激活诱导的增殖)，以选择其中发生基因编辑的细胞。WO/2019/210078描述了基因编辑组合物和方法，其中在单靶向的FOXP3、TRAC或AAVS1基因座处将编码第一CISC亚基组分和第二CISC亚基组分的核酸序列引入宿主细胞作为基因编辑的一部分。CISC的化学配体诱导的二聚化可诱导用于选择和扩增经编辑的细胞的生物信号转导事件。任选地并且在一些相关实施方式中，编码第三CISC亚基组分的核酸也在所述宿主细胞中表达；第三CISC组分作为诱饵保持在细胞内表达，以减少对具有内化的CISC配体的细胞的潜在有害影响。
示例性的第一CISC亚基组分和第二CISC亚基组分可包含IL2-受体β和γ亚基(IL2RB、IL2RG)的功能性细胞内信号转导结构域。示例性的第三CISC组分可包含FK506结合蛋白(FKBP)的功能性雷帕霉素结合结构域。
FOXP3/airT表型标志物和抑制物功能
FOXP3基因编辑可包括对天然FOXP3基因座的人工修饰和/或可进一步包括对除天然FOXP3基因座之外的染色体位点的人工修饰。例如，基因编辑可包括包含外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子的敲入(例如插入)，所述多核苷酸与除天然FOXP3基因座之外的染色体位点处的组成型启动子可操作地连接，例如T细胞受体α链(TRAC)基因座、T细胞受体β链(TCRB)基因座或腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或其它基因座。因此，某些实施方式出乎意料地提供了本文所述的airT细胞，当将人工FoxP3基因序列引入至除天然FOXP3基因座之外的基因组位点(例如在TRAC基因座中)时，所述airT细胞能够介导抗原特异性免疫抑制，并且能够组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的水平等于或高于天然存在的Treg细胞的FOXP3表达水平。
在某些实施方式中，引起本文的airT细胞中的伴随第一CISC组分的FoxP3基因产物和伴随第二CISC组分的TCR基因产物的表达的两个基因编辑事件可被设计为发生在相同基因座的不同等位基因中(例如双等位基因双重编辑)，或发生在两个不同的基因座处(例如双基因座双重编辑)。在一些实施方式中，本公开的airT细胞出乎意料地能够以如下的表达水平来表达FOXP3基因产物，所述表达水平足以使所述airT细胞在体外维持CD4+CD25+表型至少21天或在体内维持至少60天。然后过继性转移至需要抗原特异性免疫抑制的免疫相容哺乳动物宿主，同时功能性地表达特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原的本文公开的TCR，或表达特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的本文公开的抗原的TCR。
因此在某些实施方式中，本文公开的CD4+CD25+airT细胞涉及通过CD4+CD25-T细胞中的FOXP3基因的人工修饰而获得的遗传工程化的细胞。在一些实施方式中，所述人工修饰使所述airT细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平。在一些实施方式中，所述airT细胞可进一步以免疫调控细胞(例如天然Treg)的特征水平表达CD25、CD152和/或ICOS细胞表面标志物。然而，在一些实施方式中，与天然Treg不同，本文的airT细胞可表现出HeliosLo细胞表面表型，例如Helios细胞表面标志物的表达水平相对于天然存在的Treg细胞中的Helios表达水平以统计学显著的方式降低。
本文以及WO/2018/080541和WO/2019/210078中描述了在T细胞中诱导FoxP3表达的基因编辑策略的示例性细节，它们通过引用的方式将其整体明确地并入。通过包括将全长的、密码子优化的FoxP3 cDNA敲入(插入)至FOXP3或AAVS1基因座中的基因编辑推动的FOXP3表达的示例性细节可见于WO/2019/210042中，通过引用的方式将其整体明确地并入。
简而言之，WO/2018/080541描述了CD4+ T细胞，其中使用Cas9、ZFN或TALEN来敲入(例如通过插入)组成型启动子通过基因编辑来工程化内源FoxP3的稳定表达，所述组成型启动子为EFla、PGK或MND启动子。FoxP3表达可通过在FOXP3基因座处靶向敲入(插入)包含调控序列的多核苷酸来实现，所述调控序列与所述第一表达的FOXP3外显子的编码序列可操作地连接。所述调控序列可包含启动子，在一些实施方式中，所述启动子可为MND、PGK或EF1a启动子，或另一可诱导的、弱的或组成型启动子。示例性的经编辑的FOXP3+细胞可包含敲入启动子整合位点上游的完全甲基化的FOXP3基因内含子调控性T细胞特异性去甲基化区域(TSDR)。
WO/2019/210078描述了CD4+ T细胞中推动的FoxP3的表达以获得具有Treg样表型的细胞，选择此类细胞以获得富集Treg的制剂的方法，以及用于在体外扩增此类细胞群的方法。WO/2019/210078还描述了用于在FOXP3、AAVS1和/或TCRα(TRAC)基因座处的靶向的基因编辑的组合物和方法，包括对用于通过HDR进行的基因编辑的这些基因座和供体模板和中的每一个而言特异性的向导RNA(gRNA)序列。WO/2019/210078还描述了CISC体系，其中第一CISC组分和第二CISC组分的化学配体二聚化产生了影响T细胞增殖并因此影响经编辑的T细胞的选择性扩增的激活信号。WO/2019/210078描述了第一CISC组分和第二CISC组分，其中CISC诱导物分子为雷帕霉素或任意大量的公开的雷帕霉素类似物、衍生物和模拟物，并且其中CISC组分的激活信号转导结构域包含IL-2受体(IL2R)的IL-2受体β(IL2Rb，也称为IL2RP)亚基和IL-2受体γ(IL2Rg，也称为IL2R)亚基的细胞质结构域的功能性部分。
用于Treg细胞(其中包括FoxP3过表达的细胞)的表型和功能表征的某些方法是本领域已知的(例如WO/2018/080541、WO/2019/210078、McMurchy等，2013Meths.Mol.Biol.946:115-132；Thornton等，2019 Eur.J.Immunol.49:398-412；Aarts-Riemens等，2008 Eur.J.Immunol.38:1381-1390；McGovern等，2017 Front.Immunol.8:Art.1517；它们各自以引用的方式将其整体明确地并入)并在本文中进行了描述。这些和相关的方法可应用于如本文所述的本文的airT细胞的表征。
与天然Treg细胞不同，在本公开的airT细胞中，FoxP3基因座中的内含子Treg特异性去甲基化区域(TSDR)包含胞嘧啶-鸟嘌呤(CG)二核苷酸，所述CG二核苷酸在某些位置处具有主要被甲基化的胞嘧啶(C)核苷酸。例如，在本文的airT细胞中，位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处的TSDR C核苷酸的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被甲基化。通过数种不同方法中的任一种，FoxP3 TSDR的甲基化分析在本领域中已知为常规的(例如Salazar等，2017 Front.Immunol.8:219；Ngalamika等，2014 Immunol.Invest.44(2):126-136，它们通过引用的方式将其整体明确地并入)。
尽管在airT细胞和天然Treg细胞之间的TSDR表观遗传修饰存在这种差异，但本文的airT细胞能够通过被特异性识别的抗原对TCR刺激进行免疫抑制应答。因此，鉴于Wright等的报告(2009 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 106:19078)，即用在病毒载体中的FoxP3和TCR构建体共转染CD4+细胞不会产生在功能上能够表现出抗原特异性抑制的Treg样细胞，本公开的airT细胞的抗原特异性免疫抑制特性是出乎意料的。不希望受理论的束缚，据信本公开的airT细胞因此提供了不可预见的优势，这些优势可至少部分地源自制备它们的方式，包括通过本文所述的人工基因编辑。
T细胞受体(TCR)
将在airT细胞中表达的编码外源TCR的经转导的多核苷酸可涉及天然TCR基因座(例如TRAC)的人工修饰和/或还可涉及除天然TCR基因座之外的染色体位点的人工修饰，例如通过敲入(插入)核酸分子进行的基因编辑，所述核酸分子包含位于除天然TCR基因座之外的染色体位点处的编码外源TCR的多核苷酸(例如FOXP3基因座或AAVS1或另一基因座)。
在某些实施方式中，引起本文的airT细胞中的伴随有第一CISC组分的TCR基因产物和伴随有的第二CISC组分的FoxP3基因产物表达的两个基因编辑事件可被设计为发生在相同基因座的不同等位基因中(例如双等位基因双重编辑)，或发生在两个不同的基因座处(例如双基因座双重编辑)。示例性的TCR氨基酸以及编码核苷酸序列在本文中公开(例如图136-图144)，用于特异性识别与自身免疫性、过敏性和/或炎性病症的发病机制相关的抗原的TCR。
基因编辑
如本文所用，术语“染色体基因敲除”是指宿主细胞中的遗传性改变、失活或引入的抑制剂，其阻止(例如减少、延迟、抑制或消除)宿主细胞产生功能活性的内源多肽产物。引起染色体基因敲除或失活的改变可包括，例如引入的无义突变(包括过早终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失或链断裂，以及抑制所述宿主细胞中的内源基因表达的抑制性核酸分子的异源表达。
在某些实施方式中，染色体基因敲除或基因敲入(例如插入)是通过宿主细胞的染色体编辑进行的。可使用例如核酸内切酶进行染色体编辑。如本文所用，“核酸内切酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键的切割的酶。在某些实施方式中，核酸内切酶能够切割靶向基因，从而使靶基因失活或“敲除”靶基因。核酸内切酶可为天然存在的、重组的、遗传修饰的或融合的核酸内切酶。用于基因编辑用途的核酸内切酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas核酸酶、大范围核酸酶或megaTAL。
由所述核酸内切酶引起的核酸链断裂通常为双链断裂(DSB)，其通常可通过同源重组或通过非同源末端连接(NHEJ)由同源定向修复(HDR)的不同机制来修复(NHEJ：Ghezraoui等，2014 Mol Cell 55(6):829-842；HDR：Jasin和Rothstein,2013 Cold SpringHarb Perspect Biol 5(11):a012740,PMID 24097900)。在HDR/同源重组期间，供体核酸分子可用于供体基因的“敲入”、靶基因的“敲除”，并且任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。NHEJ为易错修复过程，通常使得所述切割位点处的DNA序列发生变化，例如至少一个核苷酸的替换、缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。HDR在DSB形成时被供体模板的存在青睐，并且HDR是根据本文所述的某些实施方式的优选的基因编辑机制。
如本文所用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指包含与非特异性DNA切割结构域融合的锌指DNA结合结构域的融合蛋白，例如Fokl核酸内切酶。具有约30个氨基酸的每个锌指基序与DNA的约3个碱基对结合，并且可以改变某些残基处的氨基酸以改变三联体序列的特异性(参见例如Desjarlais等，Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,1993；Wolfe等，J.Mol.Biol.285:1917-1934,1999)。可串联连接多个锌指基序以产生对期望的DNA序列(例如具有约9个至约18个碱基对的长度范围的区域)的结合特异性。作为背景，ZFN通过催化基因组中的位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导所述基因组的编辑，并且转基因的靶向整合通过同源定向修复(HDR)进行，所述转基因包含与DSB位点处的基因组同源的侧翼序列。或者，由ZFN产生的DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)的修复引起靶基因敲除，这是引起在切割位点处的核苷酸插入或缺失的易错细胞修复途径。在某些实施方式中，基因敲除或失活包含使用ZFN分子产生的插入、缺失、突变或其组合。
如本文所用，“转录激活因子样效应子核酸酶”(TALEN)是指包含TALE DNA结合结构域和DNA切割结构域的融合蛋白，例如FokI核酸内切酶。“TALE DNA结合域”或“TALE”由一个或多个TALE重复结构域/单元组成，每个结构域/单元通常具有高度保守的33-35个氨基酸序列，所述氨基酸序列具有不同的第12和第13个氨基酸。TALE重复结构域参与TALE与靶DNA序列的结合。不同的氨基酸残基(称为重复可变双残基(RVD))与特定的核苷酸识别相关。已经确定了用于这些TALE的DNA识别的天然(典型)代码，从而使得TALE的位置12和位置13处的HD(组氨酸-天冬氨酸)序列引起与胞嘧啶(C)、NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合的TALE结合至T核苷酸，NI(天冬酰胺-异亮氨酸)结合至A，NN(天冬酰胺-天冬酰胺)结合至G或A核苷酸，并且NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合至T核苷酸。非典型(非常见的)RVD也是已知的(参见例如美国专利公开号US 2011/0301073，其非常见的RVD通过引用的方式将其整体并入本文)。TALEN可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端接连(NHEJ)连接来自双链断裂两侧的DNA，其中几乎没有或没有用于退火的序列重叠，从而引入敲除基因表达的错误。或者，同源定向修复(HDR)可在含有该转基因的供体模板中存在同源侧翼序列的情况下，在DSB位点处引入转基因。在某些实施方式中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并使用TALEN分子进行。
如本文所用，“成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶体系是指如下的体系：利用CRISPR RNA(crRNA)引导的Cas核酸酶通过碱基配对互补来识别基因组内的靶位点(被称为前间隔区)，并随后用于切割DNA(如果短的、保守的前间隔区相关基序(PAM)紧接在互补靶序列的3'端)。CRISPR/Cas体系根据Cas核酸酶的序列和结构分为三种类型(即I型、II型和III型)。I型和III型中crRNA引导的监视复合物需要多个Cas亚基。研究最多的II型体系包含至少三个组分：RNA引导的Cas9核酸酶、crRNA和反式作用crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区域。crRNA和tracrRNA形成双链体，所述双链体能够与Cas9核酸酶相互作用，并能够通过PAM上游的靶DNA上的前间隔区和crRNA上的间隔区之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9/crRNA:tracrRNA复合物引导至靶DNA上的特定位点。Cas9核酸酶在由crRNA间隔区定义的区域内切割双链断裂。NHEJ修复引起破坏靶基因座表达的插入和/或缺失。或者，可以通过同源定向修复(HDR)在DSB位点处引入具有同源侧翼序列的供体模板转基因。crRNA和tracrRNA可被工程化为单个向导RNA(sgRNA或gRNA)(参见例如Jinek等，Science 337:816-21,2012)。此外，可改变或编程与靶位点互补的向导RNA的所述区域以靶向期望的序列(Xie等，PLOS One 9:e100448,2014；美国专利申请公开号US2014/0068797；美国专利申请公开号US 2014/0186843；美国专利号8,697,359和PCT公开号WO 2015/071474；它们各自以引用的方式并入)。
在某些实施方式中，基因敲除或失活包括插入、缺失、突变或其组合，并且使用CRISPR/Cas核酸酶体系来进行。US/2016/033377以引用的方式将其整体明确地并入，教导了用于增强基于核酸内切酶的基因编辑的方法，包括用于CRISPR/Cas(例如Cas9)基因编辑系统的表达AAV的向导RNA。示例性gRNA序列和使用其以敲除编码免疫细胞蛋白的内源基因的方法包括Ren等，Clin.Cancer Res.23(9):2255-2266(2017)所描述的gRNA、CAS9 DNA、载体和基因敲除技术，在此通过引用的方式将其整体明确地并入。
如本文所用，“大范围核酸酶”，也称为“归巢核酸内切酶”，是指以大识别位点(约12个至约40个碱基对的双链DNA序列)为特征的脱氧核糖核酸内切酶。大范围核酸酶可根据序列和结构基序分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys框和PD-(D/E)XK。示例性的大范围核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，它们的识别序列是已知的(参见例如美国专利号5,420,032和6,833,252；Belfort等，Nucleic Acids Res.25:3379-3388,1997；Dujon等，Gene 82:115-118,1989；Perler等，Nucleic Acids Res.22:1125-1127,1994；Jasin，Trends Genet.12:224-228,1996；Gimble等，J.Mol.Biol.263:163-180,1996；Argast等，J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。
在某些实施方式中，天然存在的大范围核酸酶可用于促进选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、FasL、HLA编码基因或TCR组分编码基因的靶标的位点特异性基因组修饰。在其它实施方式中，将对靶基因具有新结合特异性的工程化大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(Porteus等，Nat.Biotechnol.23:967-73,2005；Sussman等，J.Mol.Biol.342:31-41,2004；Epinat等，Nucleic Acids Res.31:2952-62,2003；Chevalier等，Molec.Cell 10:895-905,2002；Ashworth等，Nature 441:656-659,2006；Paques等，Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公开号US 2007/0117128；US 2006/0206949；US 2006/0153826；US2006/0078552；以及US 2004/0002092)。在进一步的实施方式中，使用归巢核酸内切酶产生染色体基因敲除，所述归巢核酸内切酶已用TALEN的模块化DNA结合结构域修饰以制备被称为megaTAL的融合蛋白。MegaTAL不仅可用于敲除或一个或多个靶基因使一个或多个靶基因失活，而且当与编码感兴趣的多肽的外源供体模板组合使用时，还可引入(敲入)异源或外源多核苷酸。
在使用敲除程序或试剂后，可通过宿主免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因的敲除。染色体基因敲除还可从所述敲除后的基因表达的缺乏(例如由所述基因编码的mRNA或多肽产物的缺乏)推断。
在某些实施方式中，染色体基因敲除或失活包括选自TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因或其组合的TCR组分基因的敲除或失活。
T细胞和TCR
本文的CD4+CD25+airT细胞包含如本文所述的FOXP3基因的人工修饰，并且进一步包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸。优选地并且在某些实施方式中，天然TCR基因已被敲除，例如通过TCRα(TRAC)基因座中的靶基因编辑敲除。如本文所用，“敲除”可指基因和/或所述基因的产物的失活，例如，比如通过所述基因或基因的部分的缺失，通过将核酸插入所述基因中以中断转录和/或所述基因和/或其产物的翻译。还优选地并且在某些实施方式中，编码TCR的经转导的多核苷酸已通过基因编辑敲入至特定的基因座，例如TRAC基因座或另一靶基因座。
本文的airT细胞因此包含人工免疫调控性T细胞，所述人工免疫调控性T细胞在优选实施方式中通过选择性编辑如本文所述的T淋巴细胞中的一个或多个特定基因座而产生。优选的T细胞为哺乳动物来源的，例如从人、非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴、大猩猩等)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)、兔类动物(例如兔、野兔、鼠兔等)、有蹄类动物(例如牛、马、猪、羊等)或其它哺乳动物获得的T细胞。在某些优选的实施方式中，所述T细胞为人T细胞。
T细胞或T淋巴细胞为在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)(例如通常由α-β异二聚体或γ-δ异二聚体构成的抗原特异性异二聚体细胞表面受体)的免疫系统细胞。具有给定的克隆性的T细胞通常仅表达单个TCR克隆型，所述克隆型识别在主要的组织相容性复合物编码的决定簇的背景下由同系抗原呈递细胞呈递的特定抗原表位。T细胞可为：幼稚T细胞(“TN”；未暴露于抗原；与(本文所述的)TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA表达增加，而CD45RO表达减少或不表达)；记忆T细胞(TM)(抗原刺激过并长期存活的)，包括干细胞记忆T细胞，以及效应细胞(抗原刺激过的，细胞毒性的)。TM可进一步分为中央记忆T细胞(TCM，表达CD62L、CCR7、CD28、CD95、CD45RO和CD127)和效应记忆T细胞(TEM，表达CD45RO，CD62L、CCR7、CD28和CD45RA的表达减少)的亚群。效应T细胞(TE)是指表达CD45RA，相较于TCM具有减少的CD62L、CCR7和CD28表达且对颗粒酶和穿孔素而言是阳性的抗原刺激过的CD8+细胞毒性T淋巴细胞。辅助T细胞(TH)为CD4+细胞，通过释放细胞因子影响其它免疫细胞的活性。CD4+ T细胞可激活和抑制适应性免疫应答，并且诱导这两种功能取决于其它细胞和信号的存在。可使用已知技术收集T细胞，并且可通过已知技术富集或耗尽所述各种亚群或其组合，例如使用特异性识别一种或多种T细胞表面表型标志物的抗体、通过与抗体的亲和结合、流式细胞术、荧光激活的细胞分选(FACS)或免疫磁珠选择。其它的示例性T细胞包括调控性T细胞(Treg，也称为抑制性T细胞)，例如CD4+CD25+(Foxp3+)调控性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。
如本文所用，“T细胞受体”(TCR)是指具有可变结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短的胞质尾的免疫球蛋白超家族成员；参见例如Janeway等，Immunobiology:The ImmuneSystem in Health and Disease，第3版，Current Biology Publications,p.433,1997。TCR能够特异性结合至抗原肽，所述抗原肽与主要的组织相容性复合物编码(MHC)受体结合。TCR可见于T细胞表面，也可以可溶的形式释放至细胞外环境中，并通常由具有α和β链(分别也被称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(分别也称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成，每条链都具有链特征性恒定(C)区和高度多态的可变(V)区，其中驻留的互补决定区(CDR)主要负责TCR的特异性抗原识别和结合。在某些实施方式中，可对编码TCR的多核苷酸进行密码子优化以增强在特定宿主细胞中的表达，例如，比如免疫系统细胞、造血干细胞、T细胞、原代T细胞、T细胞系、NK细胞或自然杀伤T细胞(Scholten等，Clin.Immunol.119:135,2006)。
可表达根据本公开的某些实施方式引入细胞中的异源遗传物质编码的TCR的示例性T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及其相关亚群(例如幼稚、中央记忆、干细胞记忆、效应记忆)。在优选的实施方式中，示例性T细胞为CD4+ T细胞，编码TCR的遗传物质通过基因编辑(例如基因组DNA中特异性靶向的双链断裂后的同源定向修复)引入，并且TCR特异性识别自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原，例如本文在结构上定义的特定TCR或特异性识别本文公开的特定自身抗原、过敏原或炎性疾病抗原T细胞表位的TCR。
与免疫球蛋白超家族(例如免疫球蛋白，也被称为抗体)的其它抗原结合成员一样，TCR链(例如α-链、β-链)的胞外部分包含两个免疫球蛋白结构域，位于N-末端的可变结构域(例如α-链可变结构域或Vα,β-链可变结构域或Vβ；通常为基于Kabat编号(Kabat等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and HumanServices,Public Health Service National Institutes of Health,1991，第5版)的氨基酸1至氨基酸116)，以及邻近细胞膜的一个恒定结构域(例如α-链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat的5氨基酸117至氨基酸259，β-链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的氨基酸117至氨基酸295)。此外，像免疫球蛋白一样，所述可变结构域包含由骨架区(FR)分隔开的互补决定区(CDR)(参见例如Jores等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:9138,1990；Chothia等，EMBO J.7:3745,1988；另参见Lefranc等，Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。本公开中使用的TCR的来源可来自各种动物物种，例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔或其它哺乳动物。
术语“可变区”或“可变结构域”是指免疫球蛋白超家族结合蛋白的结构域(例如TCRα-链或β-链(或γδTCR的γ链和δ链))，该结构域参与免疫球蛋白超家族结合蛋白(例如TCR)与抗原的特异性结合。天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个通常保守的骨架区(FR)和三个CDR。Vα结构域由两个分开的DNA片段(所述可变基因片段和连接基因片段(V-J))编码；Vβ结构域由三个分开的DNA片段(所述可变基因片段、多样性基因片段和连接基因片段(V-D-J))编码。单个Vα或Vβ结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自与抗原结合的TCR的Vα或Vβ结构域来分离与特定抗原结合的TCR，以分别筛选互补的Vα或Vβ结构域的文库。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且本领域已知是指免疫球蛋白(例如TCR)可变区内的氨基酸序列，它们赋予抗原特异性和/或结合亲和力，并且在一级氨基酸序列中被骨架区彼此分开。通常，每个TCRα链可变区中存在3个CDR(αCDR1、αCDR2、αCDR3)，且每个TCRβ链可变区中存在3个CDR(βCDR1、βCDR2、βCDR3)。在TCR中，CDR3被认为是负责识别经加工的抗原的主要CDR。通常，CDR1和CDR2主要或专门与MHC相互作用。
在TCR可变区编码序列的可变基因片段内编码CDRl和CDR2，而CDR3由跨越Vα的可变片段和连接片段的区域或跨越Vβ的可变片段、多样性片段和连接片段的区域编码。因此，如果已知Vα或Vβ的可变基因片段的身份，就可以推导出它们相应的CDR1和CDR2的序列(例如根据如本文所述的编号方案)。与CDR1和CDR2相比，由于在重组过程期间的核苷酸的添加和缺失，CDR3通常显著更加多样化。
TCR可变结构域序列可与编号方案(例如Kabat、Chothia、EU、IMGT、EnhancedChothia和Aho)进行比对，使得能够注释等效的残基位置并且使用例如ANARCI软件工具(2016,Bioinformatics 15:298-300)比较不同的分子。编号方案提供了TCR可变结构域中的骨架区和CDR的标准化描述。在某些实施方式中，根据IMGT编号方案(Lefranc等，Dev.Comp.Immunol.27:55,2003；imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php)鉴别本公开的CDR。
如本文所用，“CD4”是辅助TCR与抗原呈递细胞通讯的免疫球蛋白辅受体糖蛋白(参见Campbell&Reece,Biology 909(Benjamin Cummings，第六版，2002))。CD4见于免疫细胞(例如辅助T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的表面，并且包括在细胞表面表达的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。在抗原呈递期间，CD4与TCR复合物一起被募集，以结合至MHC II类分子的不同区域(CD4结合MHCIIβ2，而所述TCR复合物结合MHCIIα1/β1)。不希望受理论的束缚，据信与TCR复合物的紧密邻近允许CD4相关激酶分子将在CD3的细胞质结构域上存在的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)磷酸化。此种活动被认为放大了由激活的TCR产生的信号，以产生或招募各种类型的免疫系统细胞(包括辅助T细胞)并促进免疫应答。
在某些实施方式中，TCR见于T细胞(或T淋巴细胞)的表面并与CD3复合物结合。“CD3”为六条链的多蛋白复合物(参见，Abbas和Lichtman，2003；Janeway等，p.172和178，1999)，其与T细胞中的抗原信号转导有关。在哺乳动物中，所述复合物包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链、以及CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3β和CD3ε链为免疫球蛋白超家族的相关细胞表面蛋白，其含有单个免疫球蛋白结构域。CD3γ、CD3β和CD3ε链的跨膜区带负电荷，据信这使得这些链能够与T细胞受体链的带正电荷区域相关联。CD3γ、CD3β和CD3ε链的细胞内尾部各包含单个保守基序，该保守基序称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，而每条CD3ζ链具有三个这样的基序。不希望受理论的束缚，据信ITAM对于TCR复合物的信号转导能力是重要的。本公开中使用的CD3可来自各种动物物种，包括人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
如本文所用，“TCR复合物”是指通过CD3与TCR缔合形成的复合物。例如，TCR复合物可由CD3γ链、CD3β链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRα链和TCRβ链组成。或者，TCR复合物可由CD3γ链、CD3β链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRγ链和TCRβ链组成。
如本文所用，“TCR复合物的组分”是指TCR链(即TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3链(即CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)、或由两条以上的TCR链或CD3链形成的复合物(例如TCRα和TCRβ的复合物、TCRγ和TCRδ的复合物、CD3ε和CD3δ的复合物、CD3γ和CD3ε的复合物，或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两条CD3ε链的亚TCR复合物)。
如本文所用，“嵌合抗原受体”(CAR)是指融合蛋白，其被工程化以包含两个以上的天然存在的氨基酸序列、结构域或基序，它们以不会天然存在或不会天然存在于宿主细胞中的方式连接在一起，当存在于细胞(如T细胞)的表面时，该融合蛋白可作为受体发挥作用。CAR可包含含有抗原结合结构域的细胞外部分(例如从免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子获得或衍生，例如源自或获得自对自身抗原、过敏原或炎性疾病相关抗原而言特异性的TCR的TCR抗原结合结构域，源自或获得自抗体的scFv，或源自或获得自NK细胞杀伤免疫受体的抗原结合域)，所述抗原结合结构域连接至跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号转导结构域(任选地包含共刺激结构域)(参见例如Sadelain等，Cancer Discov.,3(4):388(2013)；也参见Harris和Kranz,Trends Pharmacol.Sci.,37(3):220(2016)；Stone等，Cancer Immunol.Immunother.,63(11):1163(2014)和Walseng等，Scientific Reports 7:10713(2017)，其中CAR构建体及其制造方法以引用的方式并入本文)。
许多多肽(如由多核苷酸序列所编码的)可包含“信号肽”(也称为前导序列、前导肽或转运肽)。信号肽将新合成的多肽靶向至细胞内或外的适当位置。信号肽可在生物合成期间或在多肽的亚细胞定位或细胞外分泌完成之后从多肽中去除。具有信号肽的多肽在本文中被称为“蛋白前体”并且其信号肽被去除的多肽在本文中被称为“成熟”蛋白或多肽。
“接头”是指连接两个蛋白质、多肽、肽、结构域、区域或基序的氨基酸序列，并且可提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保留对靶分子的特异性结合亲和力(例如scTCR)或保留信号转导活性(例如TCR复合物)。在某些实施方式中，接头由约2个至约35个氨基酸或2-35个氨基酸组成，由例如约4个至约20个氨基酸或4-20个氨基酸、约8个至约15个氨基酸或8-15个氨基酸、约15个至约25个氨基酸或15-25个氨基酸组成。示例性的接头包括本领域已知的甘氨酸-丝氨酸接头。
对于特异性识别与本文提供的自身免疫性、过敏性和炎性病症相关的抗原的TCR，本文(包括在实施例和附图中)公开了示例性TCR V区序列和编码所述TCR V区的多核苷酸序列。本文(包括在实施例和附图中)还公开了多肽序列，其包含与本文提供的自身免疫性、过敏性和炎性病症相关的抗原的TCR识别的抗原表位。
“抗原”通常是指激发免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可以涉及特异性结合至抗原的抗体的产生、特定免疫活性细胞(例如T细胞，例如辅助T细胞、T-效应子、Treg等)的激活、或两者。虽然抗原经常被认为是“非自身”结构，宿主免疫系统通过将抗原识别为外来物而对其作出应答，但在本公开内容中，“抗原”并不意在如此限制并且在某些实施方式中还可以包括任何自身抗原，自身抗原指的是宿主免疫系统在自身免疫疾病的情况下可能对其作出不适当反应的“自身的”分子、细胞、器官或组织结构。抗原(免疫原性分子)可为例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见的是，抗原可以人工合成、重组生产、或源自生物样品。可包含一种或多种抗原的示例性生物样品包括组织样品、细胞、生物流体、活检物、原代培养物或其组合。抗原可以由经过修饰或基因工程化以表达抗原的细胞产生，或者由内源(例如，未经人为干预的修饰或基因工程)表达免疫原性的多态性或突变的细胞产生。
在某些实施方式中，本文提供的T细胞可用作宿主细胞，其可被修饰以包括一种或多种异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或编码期望TCR的核酸序列和/或编码如本文所述的全部或部分FoxP3转录因子的核酸序列。已经将用期望的核酸转染/转导T细胞的方法描述(例如，美国专利申请公开号US2004/0087025)为具有使用拥有期望靶标特异性的T细胞的过继性转移程序(例如Schmitt等，Hum.Gen.20:1240,2009；Dossett等，Mol.Ther.17:742,2009；Till等，Blood 112:2261,2008；Wang等，Hum.Gene Ther.18:712,2007；Kuball等，Blood 109:2331,2007；US 2011/0243972；US2011/0189141；Leen等，Ann.Rev.Immunol.25:243,2007)，从而使得基于本文的教导，在考虑之列的是将这些方法适用于本公开的实施方式。特别优选的实施方式涉及通过本文所述的靶向基因编辑对T细胞基因组进行人工修饰。
可使用任何合适的方法来转染或转导细胞(例如T细胞)，或给予本文的方法的多核苷酸或组合物。将多核苷酸递送至宿主细胞的已知方法包括，例如，使用阳离子聚合物、类脂分子和某些商业化产品(例如，IN-VIVO-JET PEI)。其它方法包括离体转导、注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖、超声加载、脂质体介导的转染、受体介导的转导、微粒轰击、转座子介导的转移等。转染或转导宿主细胞的更进一步的方法使用载体，也如本文所述和本领域已知的。
核酸可以包括DNA或RNA并且可为完全或部分合成的。除非上下文另有要求，否则提及本文中列出的核苷酸序列涵盖具有特定序列的DNA分子，并且涵盖其中U被T替换的具有特定序列的RNA分子。如本文所用，术语“分离的多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源或其某些组合的多核苷酸，其中由于其来源，分离的多核苷酸(1)不与多核苷酸的全部或部分相关联，其中，分离的多核苷酸是在自然界中发现的，(2)连接至在自然界中未与其连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分出现。
术语“可操作地连接”是指应用该术语的组分处于允许它们在合适条件下执行其固有功能的关系中。例如，与蛋白质编码序列“可操作地连接”的转录控制序列与其连接，从而使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
如本文所用，术语“控制序列”是指可影响与其连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在特定实施方式中，原核生物的转录控制序列可以包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其它特定的实施方式中，真核生物的转录控制序列可包括包含一个或多个转录因子识别位点、转录增强子序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列的启动子。在某些实施方式中，“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。
在某些实施方式中，本文的airT细胞可以被基因编辑以表达由与组成型启动子可操作地连接的编码FoxP3的核苷酸序列编码的FoxP3基因产物，其中FoxP3基因产物的组成型地表达是指FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平。在某些优选的实施方式中，组成型启动子是MND启动子，并且在某些优选的实施方式中，MND启动子已经通过HDR基因编辑被敲入到天然FOXP3基因座中。在某些实施方式中，组成型活化的启动子被敲入天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。在某些实施方式中，包含与组成型启动子可操作连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子通过HDR基因编辑被敲入天然FOXP3基因座。在某些实施方式中，包含与组成型启动子可操作连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子通过HDR基因编辑被敲入除天然FOXP3基因座以外的染色体位点处，例如TRAC基因座或AAVS1基因座或其它基因座。因此，在这些和相关的实施方式中，本公开第一次教导了与人工基因编辑相关的某些意想不到的优势，籍此FOXP3基因表达由组成型活化的启动子调控，并且在特别优选的实施方式中由组成型活化的MND启动子调控，用于生产目前描述的工程化的人工免疫调控性T(airT)细胞。
本文所提及的术语“多核苷酸”是指单链或双链核酸聚合物。在某些实施方式中，包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。此类修饰可包括碱基修饰(例如溴尿苷)、核糖修饰(例如阿糖胞苷和2',3'-双脱氧核糖)以及核苷酸间连接键修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯或氨基磷酸酯)。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或替换的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸连接键”包括寡核苷酸连接键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯或氨基磷酸酯等。参见例如，LaPlanche等，1986,Nucl.Acids Res.,14:9081；Stec等，1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077；Stein等，1988,Nucl.Acids Res.,16:3209；Zon等，1991,Anti-Cancer Drug Design,6:539；Zon等，1991,OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:APRACTICAL APPROACH,pp.87-108(F.Eckstein编著)，Oxford University Press，OxfordEngland；Stec等，美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman，1990，Chemical Reviews，90:543，其公开内容由此通过引用的方式将其整体明确地并入。寡核苷酸可包括可检测标记以能够检测寡核苷酸或其杂交。
术语“载体”用于指用来将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合宿主细胞的转化并含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。如果存在内含子，表达包括但不限于转录、翻译和RNA剪接等过程。
如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列和较小的工程化的基因片段，它们表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等。技术人员可自然地分离或合成性地修饰此类片段。
本领域技术人员也将认识到，多核苷酸可为单链的(编码或反义)或双链的，并且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子以及不包含内含子的mRNA分子。附加的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本公开的多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不必连接至其它分子和/或支持材料。多核苷酸可包含天然序列或可包含编码此类序列的变体或衍生物的序列。
在其它相关实施方式中，多核苷酸变体可与编码本文所述的免疫调控多肽的多核苷酸序列具有实质同一性。例如，多核苷酸可为使用本文所述的方法(例如，如下所述的使用标准参数的BLAST分析)，与参考多核苷酸序列(例如编码本文所述的抗体的序列)相比，包含至少70％序列同一性的多核苷酸，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性，或在上述百分比中的任意两个限定的范围内的序列同一性。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应的同一性。
通常，多核苷酸变体将包含一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，优选使得能够相对于由本文具体列出的多核苷酸序列编码的多肽，与另一分子进行特异性结合相互作用并由变体多核苷酸编码的给定多肽的多肽变体的结合亲和力不会显著减少。
在某些其它相关实施方式中，多核苷酸片段可包含或基本上由与编码如本文所述的多肽的序列相同或互补的序列的不同长度的连续段组成。例如，所提供的多核苷酸包含以下或基本上由以下组成：至少或至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个、500个或1000个或更多个编码本文公开的多肽或其变体的序列的连续核苷酸，以及其间的所有中间长度。很容易理解的是，在这种背景下，“中间长度”意指所引用值之间的任意长度，例如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500之间的所有整数；500-1,000等。此处描述的多核苷酸序列可在一端或两端被未在天然序列中发现的额外的核苷酸延伸。此额外的序列可由位于编码本文所述多肽的多核苷酸的任一端或编码本文所述多肽的多核苷酸的两端的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸组成。
在另一实施方式中，提供了能够在中等至高度严格条件下与编码本文提供的多肽或其变体的多核苷酸序列、或其片段、或其互补序列杂交的多核苷酸。杂交技术是分子生物学领域众所周知的。出于说明的目的，用于测试本文提供的多核苷酸与其它多核苷酸的杂交的合适的中等严格条件包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃，5X SSC，杂交过夜；然后用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC各自在65℃下洗涤两次，每次20分钟。本领域技术人员将理解可容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一实施方式中，合适的高度严格的杂交条件包括上述那些，不同之处在于杂交温度增加至例如60℃-65℃或65℃至70℃。
本文所述的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，都可与其它DNA序列(例如启动子、聚腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码片段等)组合，使得它们的总长度可能会差异非常大。因此预期可使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受预期的重组DNA方案中制备和使用的容易程度限制。例如，具有总长度为或大约为10,000、5000、3000、2,000、1,000、500、200、100或50个碱基对的长度等(包括所有中间长度)的说明性多核苷酸片段被认为是有用的。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在按如下所述比对最大对应度时相同，则称两个序列是“同一的”。两个序列之间的比较通常通过用来识别和比较序列相似性的局部区域的比较窗内对序列比较来进行。如本文所用，“比较窗”是指至少或至少约20个连续位置、通常为30个至75个或40个至50个连续位置的片段，其中可在两个序列最佳比对后将序列与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。
可使用生物信息学软件的Lasergene套装(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序，使用默认参数进行用于比较的序列的最佳比对。该程序体现了以下参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins–Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(编著)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,Unified Approach toAlignment and Phylogenes,pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.和Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy–the Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730(1983)。
或者，用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman,Add.APL.Math 2:482(1981)的局部同一性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.,Madison,WI)的计算机化实现或通过检查进行。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个优选实例为BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等，Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。BLAST和BLAST 2.0可用于例如与本文所述的参数一起来确定两个以上的多核苷酸之间的序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(成对的匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)来计算累积分数。在以下情况时，在每个方向的词语命中的延展将停止：累积比对分数从其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的端部。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认的词长(W)为11，且期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对，(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。
在某些实施方式中，“序列同一性百分比”通过在具有至少20个位置的比较窗内比较两个最佳比对序列来确定，其中比较窗中的多核苷酸序列的部分可包含与参考序列(不包含添加或缺失)相比，20％或更少、通常为5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即空位)，以用于两个序列的最佳比对。通过如下计算百分比：确定两个序列中出现的同一核酸碱基的位置的数量，以得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即所述窗的大小)并将结果乘以100来得出序列同一性的百分比。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在编码如本文所述的FoxP3、TCR或抗原肽的许多核苷酸序列，或编码如本文所述的特异性结合至此类肽的抗体的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与编码本文所述的FoxP3、TCR或抗原性多肽的天然或原始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列同一性。尽管如此，由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸被本公开明确考虑。在某些实施方式中，特别考虑的是已对哺乳动物表达进行密码子优化的序列。
因此，在本发明的另一实施方式中，诱变方法(例如位点特异性诱变)可用于制备本文所述的FoxP3、TCR或抗原性多肽的变体和/或衍生物。通过此方法，多肽序列中的特定修饰可通过编码它们的潜在多核苷酸的诱变来进行。这些技术提供了直接的方法来制备和测试序列变体，例如通过将一个或多个核苷酸序列变化引入至多核苷酸中，并入一个或多个前述考量因素。
位点特异性诱变允许通过使用编码期望突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列来在缺失连接被横穿的两侧上形成稳定的双链体。可在所选择的多核苷酸序列中采用突变来改善、改变、减少、修饰或以其它方式改变多核苷酸本身的特性，和/或改变所编码多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
在某些实施方式中，发明人考虑对编码本文公开的FoxP3、TCR或抗原性多肽的多核苷酸序列或其变体进行诱变，以改变所编码多肽的一种或多种特性，例如(比如对于TCR或抗原性肽而言的)所述肽或其变体对同源的配体的结合亲和力，或(比如对于FoxP3而言的)免疫抑制作用。位点特异性诱变技术是本领域公知的并且广泛用于产生多肽和多核苷酸两者的变体。例如，位点特异性诱变常用于改变DNA分子的特定部分。在此类实施方式中，使用包含通常14个至25个核苷酸或约14个至约25个核苷酸左右长度的引物，其中序列连接处两侧的约5个至约10个残基或5个至10个残基被改变。
如本领域技术人员将理解的，位点特异性诱变技术经常使用以单链和双链形式两者存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括例如M13噬菌体的载体。这些噬菌体可容易地商购获得并且它们的用途对于本领域技术人员通常是众所周知的。双链质粒也常用于定点诱变，它消除了将感兴趣的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。
通常，根据本文的定点诱变通过首先获得单链载体或将双链载体的两条链解链分开来进行，该双链载体在其序列中包含编码期望的肽的DNA序列。通常合成地制备荷载有期望的突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与所述单链载体退火，并使之经受DNA聚合酶(例如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)的作用，以完成所述荷载突变的链的合成。因此，形成了异源双链体，其中一条链编码原始的非突变序列且第二条链荷载期望的突变。然后将此异源双链载体用于转化合适的细胞(例如大肠杆菌细胞)，并选择包含荷载突变序列排布的重组载体的克隆。
使用定点诱变制备所选择的编码肽的DNA片段的序列变体提供了产生潜在有用种类的手段，并且不意味着限制，因为存在其它方式可以获得肽和编码其的DNA序列的序列变体。例如，可以对编码期望的肽序列的重组载体进行处理或用诱变剂(例如羟胺)接触，以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节可见于Maloy等，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1991；Kuby，1994；以及Maniatis等，1982的教导，出于该目的，将其各自通过引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”是指模板依赖性过程和载体介导的传送(propagation)，其使得特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加，或使得可检测信号(例如扩增)的浓度增加。如本文所用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”旨在指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语模板依赖性过程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列由众所周知的互补碱基配对规则决定(参见例如Watson，1987)。通常，载体介导的方法涉及将核酸片段引入DNA或RNA载体中、载体的克隆扩增以及经扩增的核酸片段的回收。此类方法的实例由美国专利第4,237,224号提供，通过引用的方式将其整体明确地并入本文。
在用于产生多肽变体的另一方法中，可使用如美国专利第5,837,458号中所述的递归序列重组，以引用的方式将其整体明确地并入。在此方法中，进行重组和筛选或选择的迭代循环以“进化”具有例如增加的结合亲和力的单独的多核苷酸变体。某些实施方式还提供处于质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，所述构建体包含如本文所述的至少一种多核苷酸。
将理解的是，除非相反地特别指出，否则本发明的多个实施方式的实践将采用病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和处于本领域技术内的重组DNA技术中的常规方法，并且其中许多为了说明的目的在下面描述。此类技术在文献中有充分的解释。参见例如Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel等，Short Protocols in MolecularBiology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover编著)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编著，1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编著，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编著，1986)；Perbal,A Practical Guideto Molecular Cloning(1984)，以引用的方式将其整体各自并入本文。
标准技术可被用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述来进行。这些以及相关的技术和程序通常可根据本领域公知的以及如在本申请通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的常规方法进行。除非提供具体定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学关联使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。标准技术可被用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
自身免疫性、过敏性和炎性病症以及相关抗原
如上所述，本文的airT细胞可用于治疗和/或改善某些自身免疫性、过敏性和炎性病症。此类病症的临床体征和症状以及诊断标准是本领域已知的。可以将本文的airT细胞有益地给予至需要抗原特异性免疫抑制的人类患者或其它哺乳动物宿主而用于如下病症，所述患者或宿主可以指在其中可能存在临床上不适当的一系列促炎介质(例如细胞因子、淋巴因子、激素等)和/或局部或全身性升高的炎性细胞水平的个体，此类病症的非限制性实例包括：1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、自身免疫性肝炎、哮喘、过敏(例如对食物、植物、动物、环境、药物、化学品或其它过敏原的特异性超敏反应)、移植耐受诱导(例如胰岛细胞移植)、干细胞(例如造血SC)移植后的移植物抗宿主病(GVHD)等。
与这些病症相关的抗原、并且特别是其中存在被TCR识别的表位的此类抗原中的部分是已知的并且在附图中列出。附图中还列出了TCR的TCR V区序列，所述TCR V区序列基于其识别本文公开的与自身免疫性、过敏性和炎性病症相关的抗原的能力而被描述。
用于鉴定和表征与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原(包括确定自身反应性T细胞表位)的方法是本领域已知的。例如，Cerosaletti等(2017J.Immunol.199:323，通过引用的方式将其整体明确地并入)描述了用于鉴别胰岛自身抗原性多肽的示例性方法，所述多肽包括由来自1型糖尿病(T1D)受试者的T细胞识别的其肽片段。与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的其它多肽抗原(包括自身反应性T细胞表位的确定)在本文中(包括附图中)公开。
Cerosaletti等(2017)还描述了用于确定T细胞受体(TCR)的结构的示例性和非限制性方法，所述T细胞受体(TCR)识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原。对于与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的不同抗原而言特异性的各种TCR，TCR结构特征、包括部分或完整的TCRα链可变(V-α)和/或β链可变(V-β)区氨基酸序列及其编码多核苷酸序列在本文中(包括在附图中)公开。
组合物和使用方法
因此，某些目前公开的实施方式考虑将本文所述的airT细胞作为过继性转移的免疫治疗细胞给予，以针对其中存在过度和/或临床上有害的抗原特异性免疫活性的此种病症提供抗原特异性免疫抑制。例如，作为说明而非限制，根据某些实施方式，考虑了涉及将本公开的airT细胞过继性转移至受试者(例如患有自身免疫性、过敏性或其它炎性病症的患者)的免疫治疗方案。使用未选择的或所选择的T细胞的过继性转移方案是本领域已知的(例如Schmitt等，2009 Hum.Gen.20:1240；Dossett等，2009 Mol.Ther.17:742；Till等，2008 Blood 112:2261；Wang等，2007 Hum.Gene Ther.18:712；Kuball等，2007 Blood 109:2331；US2011/0243972；US2011/0189141；Leen等，2007 Ann.Rev.Immunol.25:243；US2011/0052530；US2010/0310534；Ho等，2006 J.Imm.Meth.310:40；Ho等，2003 Canc.Cell 3:431)，并且可以根据本文的教导进行修改以与包含如本文所述产生的期望的airT细胞的转移细胞群一起使用。
airT细胞的给予可通过用于提供类似的效用的任何接受的试剂给予模式来进行。airT细胞可通过与合适的生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(例如任选地含有合适的盐、缓冲剂和/或稳定剂的水性液体)的组合而制备成药物组合物。airT细胞的给予可通过多种不同途径实现，例如静脉内、肝内、腹膜内、胃内、关节内、鞘内或其它途径，并且在优选的实施方式中通过静脉输注。
优选的给予模式取决于待治疗或预防的病症的性质，在某些实施方式中，其是指有害的或临床上不期望的病症，其程度、严重性、发生的可能性和/或持续时间可根据本文提供的某些方法降低(例如相对于合适的对照情况、例如未处理的对照，以统计学上显著的方式减少)。给予后可检测地减少、抑制或延迟此病症(例如局部或全局水平的自身免疫性、过敏性或其它有害的炎性活性)的量被认为是有效的。相关领域的技术人员将熟悉任意数量的诊断、手术和其它临床标准，这些标准可适用于评估本文所述的免疫调控性airT细胞组合物的过继性转移给予的效果。参见例如Humar等，Atlas of Organ Transplantation,2006,Springer；Kuo等，Comprehensive Atlas of Transplantation,2004 Lippincott,Williams&Wilkins；Gruessner等，Living Donor Organ Transplantation,2007 McGraw-Hill Professional；Antin等，Manual of Stem Cell and Bone MarrowTransplantation,2009Cambridge University Press；Wingard等(编著)，HematopoieticStem Cell Transplantation:A Handbook for Clinicians,2009 American Associationof Blood Banks。
因此，在一些实施方式中，airT细胞可表达抗原特异性T细胞受体(TCR)，所述TCR包含由编码所述TCR多肽的至少一种经转导的多核苷酸所编码的抗原特异性TCR多肽并且能够响应于由如下抗原进行的HLA限制性刺激而进行抗原特异性诱导的免疫抑制，所述抗原由TCR多肽特异性识别。可通过本领域技术人员熟悉的各种标准中的任一种来完成免疫抑制存在的确定。参见例如Sakaguchi等，2020 Ann.Rev.Immunol.38:541，通过引用的方式将其整体明确并入。
例如，作为说明而非限制，已经描述了有助于抑制Treg细胞表型的多种机制，例如CTLA-4免疫检查点、免疫抑制性细胞因子(例如IL-10和TGF-β)的表达、通过穿孔素/颗粒酶途径的靶细胞的细胞毒性、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的诱导和靶细胞中的色氨酸的分解代谢、以及通过表达CD73而进行的腺苷的消耗和与效应T(Teff)细胞竞争IL-2(因为Treg细胞组成型地表达CD25(IL-2高亲和力受体的亚基))。参见例如Verbsky,J.W.和Chatila,T.A.(2014).Chapter 23-Immune Dysregulation Leading to Chronic Autoimmunity.InStiehm’s Immune Deficiencies,K.E.Sullivan和E.R.Stiehm编著，(Amsterdam:AcademicPress),pp.497–516；Campbell等，2020 Cell Metab.31(1):18-25；Dominguez-Villar等，2018 Nat.Immunol.19:665-673；Sakaguchi等，2008 Cell 133(5):775-787。
在一些实施方式中，抗原特异性诱导的免疫抑制因此可包括以下中的一种或多种：(i)对效应T细胞的激活和增殖中任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airTTCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子或抗炎性产物的加工，例如对如下的一种或多种抑制机制的加工，所述抑制机制包括免疫抑制细胞因子或穿孔素/颗粒酶的释放、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的诱导、对IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和通过airT细胞的抑制性受体的表达，以及(iv)对效应T细胞的激活和增殖中任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。
在某些情况下，过继性转移airT细胞免疫疗法剂量(以及任选地，至少一种其它治疗剂剂量)可在30天的期间内在第1天至第14天之间提供。在某些情况下，可在60天的期间内在第1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内提供剂量(以及任选地，至少一种其它治疗剂剂量)。替代方案可适用于个体受试者。合适的剂量为如下的化合物的量，当如上所述给予时，所述量能够可检测地改变或改善症状，或以统计学显著的方式将自身免疫性、过敏性或其它炎性免疫活性的至少一种指标相对于基础(例如未处理的)水平降低至少10％-50％，所述水平可以通过测量血液成分的具体水平来监测，例如循环免疫细胞和/或其它炎性细胞和/或包括促炎细胞因子的可溶性炎性介质的可检测水平。
总体而言，合适的剂量和治疗计划以足以提供治疗和/或预防益处的量来提供airT细胞。与未治疗的受试者相比，可以通在经治疗的受试者中建立改善的临床结果(例如更频繁的缓解、完全或部分或更长的无病生存)来监测此种应答。对与本文提供的自身免疫性、过敏性或其它炎性病症相关的抗原的预先存在的免疫应答的降低(例如与相关对照相比时具有统计学显著性的降低)通常与改善的临床结果相关。此类免疫应答通常可使用标准白细胞和/或淋巴细胞表面标志物或细胞因子表达、增殖、细胞毒性或释放的细胞因子测定来评估，它们在本领域中是常规的并且可使用在治疗前、后从受试者获得的样品来进行。
例如，给予的airT细胞的量足以在自身免疫性疾病的症状方面产生临床相关的减少(例如临床上显著的降低，优选地相对于适当的对照条件能够以统计学显著的方式检测)，所述自身免疫性疾病包括但不限于1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、炎性肠病(IBD)、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、血清阴性脊柱关节病、白塞病、脉管炎或其它自身免疫性疾病。
因此，在一些实施方式中，在将表达TCR的airT细胞过继性转移至T1D患者之后，可鉴别如本领域已知的用于评价1型糖尿病(T1D)的一个或多个相关临床标准的降低，所述TCR特异性识别与T1D关联的自身抗原有关的抗原表位。本文描述了示例性T1D相关抗原和特异性识别此类抗原的TCR结构，所述抗原通常为自身抗原。
第二阶段T1D的常见定义标准可包括在患者中检测到两种以上的胰岛特异性自身抗体以及在口服葡萄糖耐受测试期间的血糖代谢障碍的证据。在一些实施方式中，可将血糖代谢障碍定义为空腹血糖水平为110mg至125mg每分升(6.1mmol至6.9mmol每升)，餐后两小时血糖水平为至少140mg每分升(7.8mmol每升)和低于200mg每分升(11.1mmol每升)，或30分钟、60分钟或90分钟间隔的餐后血糖水平大于200mg每分升。在一些实施方式中，可将临床T1D定义为糖尿病症状的存在(例如与已知没有患T1D的任何风险或不存在T1D的正常受试者相比，口渴增加、排尿增加和/或原因不明的体重减轻)以及血糖水平等于或大于200毫克每分升(mg/dL)，空腹血糖水平等于或大于126mg/dL，或两小时口服葡萄糖耐受测试(OGTT)结果等于或大于200mg/dL或血红蛋白A1c水平为6.5％或更高(例如Khokhar等，2017Clin.Diabetes 35(3):133.)
RA症状的减轻可被证明，例如通过说明而非限制，在如下中的任一种或多种减轻时：疲劳、食欲不振、低烧、腺体肿胀、虚弱、关节肿胀、关节疼痛、晨僵、发热、一触即痛或使用不到一小时关节僵硬、双侧关节疼痛(手指(但非指尖)、手腕、肘部、肩部、臀部、膝盖、脚踝、脚趾、下巴和颈部可能受影响)、受影响的关节的活动范围丧失、胸膜炎、眼灼伤、眼痒、眼分泌物、皮下结节、麻痹、刺痛或手脚灼伤。RA患者的诊断和临床监测标准是相关领域技术人员众所周知的。参见例如Hochberg等，Rheumatology,2010 Mosby；Firestein等，Textbook of Rheumatology,2008 Saunders。对患有RA和/或其它自身免疫性疾病的患者进行诊断和临床监测的标准也是相关领域技术人员众所周知的。参见例如Petrov,Autoimmune Disorders:Symptoms,Diagnosis and Treatment,2011 Nova BiomedicalBooks；Mackay等(编著)，The Autoimmune Diseases-Fourth Edition,2006 AcademicPress；Brenner(编著)，Autoimmune Diseases:Symptoms,Diagnosis and Treatment,2011Nova Science Pub.Inc.。
标准技术可被用于重组DNA、肽和寡核苷酸合成、免疫测定以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述来进行。这些以及相关的技术和程序通常可根据本领域公知的以及如本申请文件通篇引用和讨论的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫学技术中的各种一般性和更具体的参考文献中所述的常规方法进行。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley and Sons,更新于July 2008)；Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:A PracticalApproach,vol.I&II(IRL Press,Oxford Univ.Press USA,1985)；Current Protocols inImmunology(由John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,EthanM.Shevach,Warren Strober编著2001 John Wiley&Sons,NY,NY)；Real-Time PCR:CurrentTechnology and Applications,由Julie Logan、Kirstin Edwards和Nick Saunders编著，2009,Caister Academic Press,Norfolk,UK；Anand,Techniques for the Analysis ofComplex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie和Fink,Guide to YeastGenetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991；OligonucleotideSynthesis(N.Gait编著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编著，1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney编著，1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Next-Generation Genome Sequencing(Janitz,2008 Wiley-VCH)；PCR Protocols(Methods in Molecular Biology)(Park编著，第三版，2010 Humana Press)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press,1986)；the treatise,Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编著，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编著，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir和CC Blackwell编著，1986)；Roitt,Essential Immunology，第六版，(Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Embryonic Stem Cells:Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen编著，2002)；Embryonic Stem Cell Protocols:Volume I:Isolation and Characterization(Methodsin Molecular Biology)(Kurstad Turksen编著，2006)；Embryonic Stem CellProtocols:Volume II:Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen编著，2006)；Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods inMolecular Biology)(Kursad Turksen编著，2006)；Mesenchymal Stem Cells:Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney和Bruce A.Bunnell编著，2008)；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods inMolecular Medicine)(Christopher A.Klug和Craig T.Jordan编著，2001)；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(KevinD.Bunting编著，2008)Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology)(Leslie P.Weiner编著，2008)。
除非提供具体定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学关联使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知的并且常用的那些。标准技术可被用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
除非另有明确说明，否则本说明书中描述的每个实施方式都将对每个其它实施方式加以必要的小修改。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容另有清楚规定，单数形式“一个/一种(a/an)”、和“所述/该(the)”包括复数指代物。在本说明书全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括/含有(comprise)”或诸如“comprises”或“comprising”的变体将被理解为暗示包括所陈述的要素或整数、或者要素或整数的组，但不排除任何其它要素或整数、或者要素或整数的组。除非另有明确说明，否则本说明书中的每个实施方式都将对每个其它实施方式加以必要的小修改。
实施例
实施例1—airT细胞的产生
开发了通过Foxp3基因编辑将常规的人CD4T细胞转化为Treg样细胞来产生稳定的工程化的Treg(edTreg；airT)的平台(图1A、图1B、图1C、图2)。该平台包括使用慢病毒TCR基因转移来产生抗原特异性edTreg。
通过用肽池激活PBMC，然后评价CD154表达来鉴别抗原特异性T细胞。该方法利用单细胞RNA-seq来鉴别在T1D受试者中扩增的TCR克隆型，并用于生成完整的TCR序列(Cerosaletti等，2017J.Immunol.PMID:28566371)。基于从该研究中鉴别的胰岛特异性TCR序列，产生了用于TCR基因转移的慢病毒TCR构建体。这些TCR构建体从胰岛特异性TCR和小鼠TCR恒定区表达人TCR可变区，使得能够改善经转导的人TCR链之间的配对(图5)。使用TCR同源的肽(或无关的肽)与抗原呈递细胞(APC)通过T细胞增殖测定来验证胰岛特异性TCR表达。用胰岛特异性TCR转导的T细胞仅在响应其同源的肽和APC时增殖(图6)。
为了产生抗原特异性airT细胞，在用胰岛TCR转导的CD4 T细胞中编辑Foxp3基因座，这使得成功产生表达胰岛特异性TCR的airT细胞。表达胰岛特异性TCR的airT表现出Treg表型：CD25+、CD127-、CTLA4+、ICOS+(图7)。值得注意的是，通过体外抑制测定，表达胰岛特异性TCR的airT显示出抗原特异性和旁观者抑制功能(图7-图11)。airT细胞还以airT抗原特异性的方式抑制Teff细胞产生炎性细胞因子，例如TNF、IFN-g、IL-17或IL-2(图11)。
研究了与扩增的nTreg相比，airT的Treg表型、生产功效和抑制能力。airT细胞能以多达PBMC输入数量的3倍产生，而扩增10天后的nTreg细胞的数量仅为输入细胞的1％-4％。airT细胞也表现出与nTreg相似的表型，但与nTreg相比，显示出更高的Foxp3、CTLA-4和ICOS表达(图3)。
值得注意的是，airT对效应T细胞增殖具有与扩增的nTreg相似或更好的体外抑制活性(图4)。
实施例2—抗原特异性人T细胞在FOXP3编辑后采用Treg表型，并且在体外具有免
疫抑制作用
作为产生抗原特异性FOXP3编辑的CD4+ T细胞的替代方法，开发了从健康受试者或患有自身免疫性疾病的个体中分离、编辑和扩增抗原特异性效应T细胞的方法。为了研究与抗原特异性人T细胞扩增相关的FOXP3编辑的可行性，在基因编辑之前，在流感(病毒)和破伤风抗原存在的情况下扩增了来自HLA DRB1*0401人供体的CD4+ T细胞。在编辑程序之后，将所述细胞在抗原混合物(cocktail)中进一步扩增4至7天。此时，平均编辑率(GFP+)为28±2.1％(图12)。在用PE偶联的流感和破伤风MHC-II四聚体的混合物标记后，通过FACS纯化抗原特异性细胞。这些四聚体阳性airT(Tmr+airT)概括了用于调控性T细胞的典型标志物的经激活的tTreg的免疫表型：上调FOXP3、CD25、CTLA4和Helios的表达；并且抑制IL-2产生，不不同平行分析的Tmr+空白细胞(图13A)。与Tmr+空白细胞不同，Tmr+airT能够在体外抑制多克隆激活的自体CD4+ Teff，表明具有免疫抑制功能(图13B)。这些结果表明，可通过基于四聚体的流式分选针对靶抗原特异性来富集来自人外周血的CD4+ T细胞，并通过基因编辑进行修饰以赋予tTreg样表型和保留抗原特异性的抑制特性。
这些方法被进一步开发以通过用模型抗原(MP、HA和TT)刺激T细胞来富集抗原特异性T细胞。扩增约2周后，用四聚体对所述细胞染色以鉴别抗原特异性T细胞，然后编辑FoxP3基因座(图14)。使用此方法，产生了抗原特异性Treg，且这些airT细胞以抗原特异性方式表现出体外抑制活性(图15)。此外，使用胰岛特异性肽的池通过肽刺激方法富集胰岛特异性T细胞，并通过四聚体染色分离具有多种特异性的胰岛特异性T细胞。同样，在这些细胞中通过Foxp3基因编辑产生了胰岛特异性airT细胞(图16、图17)。
实施例3—用于产生经双重编辑的人CD4+ T细胞的双等位基因HDR编辑
图18、图19和图110总结了用于证明将两个分隔开的表达盒引入人TRAC基因座中的能力的实验方法(图18)，以及这些研究中使用的构建体(图19)。
使用基于CRISPR的方法，测试了靶向人TRAC基因座的第一外显子的四种新型gRNA的诱导完全TCR敲除的功效(图20)。在RNP递送48小时后使用流式细胞术评估CD3表达，并分别使用gRNA_1和gRNA_4证明了96.8％和84.7％的CD3敲除(图21)。通过ICE(Inference ofCRISPR Edits)测量中靶位点特异性活性，并确认相对于预测的脱靶位点的TRAC中的gRNA_1和gRNA_4的特异性插入缺失的诱导(图22)。接下来，为了测试新型引导的特异性，评价了每个gRNA的前三的脱靶位点(如基于着眼于人类基因组中最相似序列的生物信息学所预测的)。然后通过扩增来自用核酸酶转染的T细胞的脱靶位点，在人T细胞中直接分析这些。通过ICE程序对扩增子进行测序和分析。对候选脱靶位点观察到的切割活性水平为0％切割。与此相反，在同一测定中，在靶TRAC位点处，gRNA_1的中靶位点活性为78％并且gRNA_4的中靶位点活性为66％(图23)。这说明这些新型供体模板对TRAC基因座具有高度特异性。
接下来，使用允许容易追踪成功编辑的细胞的构建体测试双重编辑人CD4+ T细胞的能力。产生了MND-GFP和MND-BFP盒，侧接有与TRAC gRNA_1或gRNA_4匹配的同一300bp同源臂(图24A)，并用于测试产生具有GFP和BFP二者的稳定表达的双等位基因TRAC编辑的T细胞的能力。将细胞扩增、编辑和分析的时间线在图24B中示出，且所得的FACS分析分别证明了使用gRNA_1和gRNA_4的20.3％和10.6％的BFP/GFP双阳性细胞，证实了在诱导单个双链断裂后的两个修复盒的成功整合(图25)。
为了获得足够数量的用于治疗用途的细胞，在某些背景下，在体外选择性扩增工程化细胞可能是有用的。为了在经双重编辑的细胞的背景下做到这一点，产生了分开的IL-2 CISC HDR敲入构建体以用于富集和选择。已经描述了使用IL-2 CISC组分在雷帕霉素或异二聚化雷帕霉素同源物AP21967(rapalog)存在下富集经编辑的CD4+ T细胞的方法。参见例如图108。在此类方法中，FRB-IL2RB和FKBP-IL2RG组分被包含在相同盒中以选择单个整合事件。
对于这些研究，FRB-IL2RB和FKBP-IL2RG组分被分入两个单独的盒，一个包含GFP，而另一个包含mCherry，以允许选择两个独立的整合。构建体在图26中示出且此实验的时间线和编辑条件在图27中示出。尽管这些构建体的初始双重编辑率为1.44％双阳性GFP/mCherry细胞，这可能是由于增加的HDR模板大小，图28，使用rapalog可显著富集经双重编辑的细胞。存在100nM rapalog处理时，GFP/mCherry双阳性细胞在8天内从1.4％增加到9％(图29)。重要的是，GFP单阳性、mCherry单阳性和双阴性细胞百分比在rapalog存在下保持相同，表明扩增只在功能性IL-2 CISC蛋白通过FRB-IL2RB和FKBP-IL2RG的双重表达而存在时发生。正如预期的，在IL-2存在下没有观察到扩增(图30)。
测试了实验之间的再现性和供体之间的差异(图31)。来自先前实验的相同供体的细胞(在图29中示出)被编辑并与来自相似年龄的另外的男性白人供体的细胞进行比较。R003657供体的双重编辑百分比为1.1％，与先前观察到的相似(图29)。第二供体R003471的双等位基因编辑率为6.4％。总体而言，供体之间的编辑率发生了变化，但GFP阳性、mCherry阳性和双阳性细胞之间的比率保持相似，表明可变性可能基于供体能被编辑的程度。重要的是，来自两个供体的经双重编辑的细胞在Rapalog存在下成功富集，对于供体R003657和R003471，分别产生13.8％和28.5％的GFP/mCherry双阳性细胞(图32)。
这些研究的结果表明，在双重HDR编辑中并入分开的IL-2 CISC提供了有效选择和富集经双重编辑的细胞的手段，并且可提供获得治疗用途所必需的经编辑的细胞的数量的方法。
鉴于使用MND-eGFP-FRB-IL2RB和MND-mCherry-FKBP-IL2RG盒的成功的双等位基因编辑、以及使用Rapalog的经双重编辑的细胞的富集，产生了构建体以引入与IL-2 CISC组分组合的FoxP3和胰岛抗原特异性TCR(T1D4)，从而产生抗原特异性Foxp3+airT细胞(图33)。
实施例4：用于产生经双重编辑的鼠CD4+ T细胞的双等位基因靶向
为了进行研究以评价Ag特异性FoxP3 airT在糖尿病或其它自身免疫性病症的动物模型中的功效，生成了用于编辑入鼠Trac基因座中的类似工具。选择鼠Trac基因座的第一外显子内的三个新的gRNA靶序列并测试小鼠(C57/B6)CD4+原代T细胞中的CD3敲除(图34)。如通过转染后2天的mCD3表达的流式分析所测量的，图35示出mTrac_gRNA_2产生87.8％的最佳敲除。与人类构建体一样，产生了MND-GFP和MND-BFP构建体以使得能够方便地追踪经编辑的细胞。该实验的构建体和时间线在图36中示出。与在TRAC基因座处经双重编辑的人细胞的情况一样，鼠细胞中的双重编辑效率相对较低(1.97％)(图37)。
实施例5：多发性硬化症的抗原特异性鼠模型中的airT功能
为了研究抗原特异性体内环境中的airT功能，从髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽片段35-55(MOG)-特异性TCR-转基因小鼠(C57Bl/6-Tg(Tcra2D2，Tcrb2D2)1Kuch，缩写为2D2)中选择用于编辑的T细胞。2D2转基因小鼠的MOG攻击引发实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(多发性硬化症的小鼠模型)。2D2小鼠中的EAE不受中枢神经系统(CNS)内存在的内源2D2tTreg的控制，可能是由于致病性Teff产生的高水平炎性细胞因子。抗原特异性2D2 airT的过继性转移可能会在这些激活的效应物迁移到CNS之前抑制外周Teff的扩增(图38)。为了验证这一假设，TALEN和AAV供体模板试剂被设计为密切模仿用于产生GFP+人airT的GFP敲入编辑策略。在用于鼠T细胞刺激和mRNA电穿孔的改善的程序被设计后，用编码对小鼠Foxp3的第一编码外显子而言特异性的TALEN对的mRNA转染鼠T细胞。转导后7到9天，基于PCR扩增的gDNA的集落测序，大约80％的等位基因包含插入缺失(图39)，表明有效的靶位点切割。克隆了AAV供体模板，用小鼠Foxp3同源臂置换了先前HDR实验中使用的人类序列；同源性与小鼠TALEN结合位点接近但不重叠。通过对用于人CD4+ T细胞编辑的条件的轻微修改，包括使用AAV5衣壳进行供体模板转导，使用从脾和淋巴结(LN)中分离的2D2mCD4+ T细胞始终实现约25％-30％(GFP+细胞)的编辑率。GFP+细胞在表型上是FOXP3+CD25+CTLA-4(图40)。CD4+T细胞也从2D2neg同窝小鼠(C57BL/6)中分离出来并被编辑，产生了用于与2D2 airT比较的具有TCR特异性的多克隆池的airT。接下来，将来自2D2小鼠的3.0×104CD4+ Teff细胞连同3.0×104空白或airT过继性转移至淋巴细胞减少的Rag1-/-小鼠中。受者小鼠用处于佐剂中的MOG35-55肽攻击，然后用百日咳毒素破坏血脑屏障。图41示出了细胞转移、免疫和细胞分析的实验时间线。在该模型中，受者动物在细胞转移后大约7-10天开始出现EAE症状(下垂尾巴发展出尾巴麻痹，然后是后肢发展出麻痹)。为了评价效应T细胞致敏，在转移后第7天对受者小鼠实施安乐死，并收集腹股沟和腋窝LN。抗原特异性2D2 airT的受者中的LNCD45+CD4+ T细胞百分比比空白编辑的细胞的受者低2倍，且比多克隆C57Bl/6 airT的受者低1.7倍。与空白对照相比，两个airT群组中的CD4+CD45+ T细胞的绝对数量显著减少，2D2airT和C57Bl/6 airT的CD4+CD45+ T细胞分别减少49倍和18倍。在所有群组中，大多数CD45+CD4+细胞为GFP-，且来自接受2D2 edTreg的小鼠的较少的GFP-T细胞表达炎性标志物CD25和IFN-γ(图42)。为了确定观察到的效果是否归因于Teff增殖减少，在处死前2小时向一部分动物注射胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)，并在“点击”反应后通过流式细胞术检测到其掺入gDNA(图43)。与用空白或多克隆airT处理的组相比，2D2 airT将掺入EdU的GFP-细胞的总体百分比分别降低了22％和18％。重要的是，来自2D2 airT(～25％)和在较少程度上来自C57Bl/6airT(～10％)受者群组的GFP+细胞掺入了EdU，这与响应于自身抗原刺激的tTreg在体内增殖的能力一致。这些综合发现表明，与多克隆airT相比，鼠airT在体内发挥抑制致病性Teff致敏的功能，并且抗原特异性airT表现出更高的活性和扩增。
实施例6：1型糖尿病(T1D)的抗原特异性鼠模型中的airT功能
为了研究抗原特异性airT细胞在自身免疫性T1D的体内模型中的功效，使用BDC2.5NOD-NSG过继性转移模型作为工具来确定Foxp3编辑的抗原特异性T细胞是否可以延迟或逆转疾病的发病。NOD小鼠：(NOD/ShiLtJ系)用作自身免疫性1型糖尿病(T1D)的多基因模型。在该模型中，糖尿病的发病以中度糖尿和高于250mg/dl的非空腹血糖为标志。糖尿病小鼠为低胰岛素血症型和高胰高血糖素血症型，表明胰岛β细胞的选择性破坏。它是目前研究自发性T1D的最广泛使用的多克隆自身免疫性动物模型。BDC2.5NOD小鼠：[NOD.Cg-Tg(TcraBDC2.5,TcrbBDC2.5)1Doi/DoiJ]携带来自细胞毒性CD4+ T细胞克隆BDC-2.5的重排TCRα和β基因。这些小鼠中的成熟T细胞仅表达BDC2.5 TCR。在NOD背景下，与NOD/ShiLtJ对照相比，携带转基因的小鼠的糖尿病发病率降低。然而，将CD4+CD25-BDC-2.5T细胞转移至免疫缺陷的受者小鼠后，受者小鼠将迅速发展出明显的糖尿病。在先前公开的研究中，相对于来自多克隆WT NOD小鼠的nTreg，来自抗原特异性BDC2.5NOD小鼠的nTreg有效地预防和逆转了NOD小鼠中的自身免疫性糖尿病。因此，在这些实验中，这些动物模型被用作确定与来自WT NOD的nTreg相比，Foxp3编辑的抗原特异性T细胞是否可以延迟或逆转自身免疫性T1D发病的工具。测试了在NOD小鼠中产生airT的能力。先前的研究证明了使用Foxp3基因座的HDR编辑在来自B6小鼠的鼠CD4+ T细胞中产生airT细胞的能力(WO 2018/080541和US2019/0247443，各自通过引用的方式将其整体并入)。在此，这些研究得到扩展并示出相同的AAV供体模板在NOD鼠CD4+ T细胞中具有相似的NHEJ和HDR效率(图44)。重要的是，与空白细胞相比，Foxp3编辑的BDC2.5NOD CD4+ T细胞具有表达增加的Foxp3和较少的炎性细胞因子的Treg表型(图45)。
NSG过继性转移模型中的抗原特异性airT细胞功能在延迟或逆转自身免疫性T1D发病方面可能比非抗原特异性airT细胞更有效。nTreg被包括在这项研究中，因为这一群体以前已被证明可以减少T1D的发病。输入的Teff、airT和nTreg细胞的实验设计和表型在图46中示出。与nTreg一样，与空白airT或仅接受Teff的动物相比，airT引起糖尿病百分比降低(图47)。重要的是，与多克隆NOD airT相比，BDC airT的给予使得糖尿病百分比在统计学上显著降低。这一发现表明，与多克隆airT相比，Ag特异性airT更有效地预防糖尿病的发展。值得注意的是，先前的研究表明，N-末端GFP-FOXP3融合蛋白作为亚等位基因起作用，并且可在免疫活性NOD背景下实际上加速自身免疫性糖尿病。与此构思一致，虽然在这些研究中抗原特异性nTreg的表现优于抗原特异性airT，但用表达GFP-FOXP3融合蛋白的airT仍然观察到了显著的抑制作用。测试没有N-末端GFP融合的、表达FOXP3的airT(包括表达临床相关的顺式连接LNGFR选择标志物的airT细胞；见下文)，将预期到改善的保护效果。
综上所述，这些发现清楚地表明，在BDC2.5 NOD T细胞进入NSG过继性转移模型中，与多克隆airT相比，Ag特异性airT起到预防糖尿病发展的作用。
实施例7：工程化AAV供体模板设计以产生具有LNGFR选择标志物的airT产物
编辑后富集鼠细胞的能力对于产生足够数量的经编辑的细胞以在不分选的情况下进行体内实验是重要的。为了解决这一点，开发了顺式连接的LNGFR选择性标志物，用于纯化鼠edTeg产物。图48示出了用于鼠Foxp3编辑中的修复模板的设计。各模板包含LNGF.P2A敲入(ki)，但在启动子方面有所不同。此外，用MND启动子测试了07UCOE的存在和不存在。在B6 CD4+ T细胞中转染RNP+AAV5#1331(MND-GFP)、#3189(MND-LNGFR)和#3227(PGK-LNGFR)后，GFP和LNGFR KI的编辑效率非常相似(图49、图50)。此外，使用抗LNGFR微珠和磁场分离证明了LNGFR+细胞的8.7倍富集(图51)。这些数据表明LNGFR可成功地用作鼠CD4+ T细胞的选择和富集方法。
实施例8—方法
Foxp3编辑
使用MACS CD4+ T细胞分离试剂盒从PBMC中分离CD4+ T细胞，并用CD3/CD28激活剂珠(珠与细胞之比1:1)以及IL-2、IL-7和IL-15激活。激活48小时后移除珠且将细胞再静置16-24小时。对于使用Cas9/CRISPR的Foxp3编辑，通过电穿孔用结合Cas9和向导RNA的RNP复合物转染细胞，然后用AAV模板(AAV FOXP3 ex1.MND-LNGFRki)转导。对于使用TALEN核酸酶的Foxp3编辑，通过电穿孔用靶向FOXP3的TALEN RNA转染细胞，然后用AAV模板(AAVFOXP3 ex1.MND-GFPki)转导。编辑后，将细胞在具有IL-2的培养基中扩增。
具有胰岛TCR的airT细胞的产生
从PBMC中分离CD4+ T细胞并用CD3/CD28激活剂珠以及IL-2、IL-7和IL-15激活。编码GAD65或IGRP特异性TCR(4.13、T1D2、T1D4、T1D5-1或T1D5-2)的慢病毒载体的转导在激活24小时后用硫酸鱼精蛋白以MOI 10进行。从最初的激活起孵育总共48小时后将珠移除。将细胞再静置16-24小时，然后进行编辑。对于Foxp3编辑，将细胞用结合Cas9和向导RNA的RNP复合物进行电穿孔，然后用AAV FOXP3 ex1.MND-LNGFRki模板转导。将细胞在编辑后用IL-2在培养基中扩增，且编辑率和TCR转导在编辑后3-4天测量。使用MACSelect LNGFR珠通过LNGFR表达来富集airT细胞，等分并冷冻以用于未来的实验。
抗原特异性airT细胞的产生
为了产生对流感或破伤风而言特异性的T细胞，从PBMC中分离出CD4+CD25-细胞，并在存在IL-2时与APC(经辐照的自体CD4-CD25+细胞)以及MP、HA和TT肽共培养。将CD4+ T细胞用肽和APC刺激两次，持续9天，然后用CD3/CD28珠激活，以用于使用TALEN和AAV FOXP3ex1.MND-GFPki模板的Foxp3编辑。编辑后3天，通过流式分选并用CD3/CD28珠扩增GFP+细胞。扩增7天后移除珠，且再孵育4天后收集airT细胞用于抑制测定。
为了通过肽刺激产生胰岛特异性T细胞，从PBMC中分离CD4+CD25-细胞，并与APC和胰岛特异性抗原的池(来自IGRP、GAD65和PPI的总共9种肽)共培养。扩增2周后，收获细胞并用对9种胰岛肽具有特异性的四聚体进行染色以用于分选。用CD3/CD28激活剂珠激活经分选的胰岛特异性CD4+ T细胞，以用于使用Cas9/CRISPR和AAV FOXP3 ex1.MND-LNGFRki模板的Foxp3编辑。将细胞通过四聚体进行染色并在编辑后3天通过流式来分析。
可用于本文提供的实施方式的某些核酸序列在图145描述的表格中列出。
实施例9—airT与表达经慢病毒(LV)递送的FOXP3的T细胞的比较
将FOXP3 cDNA表达盒的LV转移至常规T细胞中已表现出在体外和体内赋予Treg样表型和抑制特性(Allan等，Mol Ther 16:194-202(2008)；Passerini等，Sci Transl Med5:215ra174(2013))。作为与目前公开的编辑策略的比较，产生LV构建体以递送编码由airT细胞制造的相同的GFP-FOXP3融合蛋白的cDNA(图52A)。基因编辑和病毒转导程序产生相似比例的GFP+FOXP3+细胞(图52A)。LV处理的细胞(LV Treg)对每个GFP+细胞基因组平均有3.0个慢病毒拷贝；在这个实验中，airT对每个细胞具有仅一个靶向插入，来自男性供体的经编辑的T细胞。尽管它们的拷贝数存在差异，但LV Treg中的GFP+细胞的MFI始终低于airT中的(图52B)，这与相比于cDNA背景的来自基因组的更有效的表达或在转录较少允许(transcriptionally less permissive)的基因座中的LV整合一致。推动FOXP3表达的两种方法都使Teff向tTreg表型倾斜，包括CD25、CTLA-4和Helios的上调，以及IL-2、TNF-α和IFN-γ的下调(图52C)。除FOXP3外，表达调控性T细胞标志物的细胞百分比以及每个细胞的平均表达(如通过MFI评价的)在airT和LV Treg之间相似。airT和LV Treg表现出相似的在体外抑制多克隆Teff增殖的能力(图52D)。然而，重要的是，与airT相比，FACS纯化的LV Treg细胞在培养5周内丧失GFP表达(图52E；两者的起始GFP+％>99％)。后一发现证明，与使用相同的启动子构建体的LV递送相比，HDR编辑更有效地维持了高水平的FOXP3表达。基于使用FOXP3的LV递送的先前报告，这些发现是出乎意料的，并且支持FOXP3基因座的HDR编辑为FOXP3在CD4 T细胞中的持续表达提供更稳定的平台的构思。
实施例10——双重编辑策略
图53提供了HDR基因编辑策略的概述，开发该策略以通过仅HDR编辑的方法产生抗原特异性airT。这些新方法消除了使用LV用于TCR递送的要求，并且被设计为产生同时具有以下的airT：a)缺乏内源TCR表达；b)表达胰岛特异性T1D(或另一疾病相关的抗原特异性TCR)；以及c)可使用新型CISC/DISC IL-2平台在体外和体内富集。如图53所示，通过靶向单基因座(TRAC)或双基因座(TRAC和FOXP3)开发了实现上述目标的策略。这两种策略的成功应用如下所示。
图54提供了在下文描述的研究中使用的每个AAV HDR供体构建体的示意性概述和构建体数字标号，所述构建体用于产生具有或没有IL2-CISC/DISC选择能力的Ag特异性edTreg的单基因座和双基因座双重编辑方法。
人CD4+ T细胞的双重编辑—单基因座方法的实例
图55和图56涉及实验之间的可再现性和供体之间的差异。用AAV#3207(MND.GFP.FRB-IL2RG)和#3208(MND.mCherry.FKBP-IL2RG)对两个供体进行编辑，其用于先前的实验中并将重复实验与原始数据进行比较。在这些实验中，两个HDR修复模板都被靶向至TRAC基因座的第一外显子内的单个sgRNA切割位点。供体R003657的双重编辑的百分比(将GFP和mCherry分开的CISC盒并入单个细胞中)为2.75％(图55)，这与在两个先前的数据集(对于供体R003657，为1.44％和1.1％)中观察到的结果相似。第二供体(R003471)的双重编辑百分比为6.78％(图56)，也与在原始数据集中观察到的6.4％相似。两名供体都是男性、年龄相仿的白人。总体而言，供体之间的编辑率不同，但每个供体在实验之间具有相似的编辑率，表明可变性是基于供体可被编辑的程度，而不是相同供体的不同实验之间的差异。重要的是，在异二聚体诱导的雷帕霉素类似物(Rapalog，AP21967)存在下，使用源自两个人供体的经编辑的T细胞成功地富集经双重编辑的细胞至与先前观察到的水平相似的水平。在Rapalog富集7天后，对于供体R003657和R003471，该研究分别产生了44.7％和46.1％的GFP/mCherry双阳性细胞(图55，图56)。正如预期的，在IL-2存在下，没有富集。
这些研究的结果证明双重HDR编辑策略中的IL-2分开的CISC的并入提供了有效选择和富集经双重编辑的细胞的手段，其在供体和重复实验之间是可再现的。在使用MND.GFP.FRB.IL2RB(#3207)和MND.mCherry.FKBP.IL2RG(#3208)盒成功进行双重编辑并使用Rapalog对经双重编辑的细胞进行富集后，产生了如下的构建体，该构建体可用于引入HA标记的FOXP3以及与IL-2 CISC组分(分别为#3240和3243)组合的胰岛抗原特异性TCR(T1D4)以产生抗原特异性FOXP3+edTreg细胞(图57)。
在分别用T1D4替换GFP和用HA标记的FOXP3替换mCherry之后，将MND.HA.FOXP3.FKBP.IL2RG(#3240)和MND.T1D4.FRB.IL2RB(#3243)构建体用于测试表达T1D4阳性人edTreg的FOXP3的初始编辑率和扩增。将构建体在图57(A)中示出，并将本实验的时间线和编辑条件在图57(B)中示出。尽管与使用GFP/mCherry-CISC构建体相比初始编辑率较低(图55、图56)，2.75％和6.37％双阳性GFP/mCherry细胞相比于0.65％双阳性FOXP3/T1D4细胞(图57)，但双阳性FOXP3/T1D4细胞可被显著富集。在存在Rapalog时，相较于用IL-2处理的1.1％(图57(C)，处理8天后的FOXP3/T1D4阳性细胞从0.65％富集到11％。与包含GFP和mCherry(#3207和#3208)的分开的CISC构建体相比，这些构建体的初始编辑率的降低可能是由于T1D4 HDR模板的大小增加。MND.T1D4.FRB.IL2RB(#3243)为4.3kb，显著大于MND.mCherry.FKBP.IL2RB(#3208)的2.7kb。
为了获得足够数量的经编辑的细胞以用于治疗用途，增加编辑率和/或富集FOXP3/TCR双阳性细胞可能很重要。为了提高初始编辑率，在编辑阶段期间通过改变血清浓度来修改条件。图58和图59示出了如下的双重编辑实验的结果：该实验使用AAV构建体MND.HA.FOXP3.FKBP.IL2RG(#3240)和MND.T1D4.FRB.IL2RB(#3243)并比较了人CD4+ T细胞编辑阶段期间的四种不同浓度的血清。所得的FACS分析证明，初始编辑率从具有20％FBS的1.8％提高到低血清或无血清的3.96％-4.75％(图58)。重要的是，在2.5％FBS中恢苏的细胞中产生的富集接近10倍，相比于用IL-2处理的1.97％，在Rapalog处理7天后双阳性细胞从1.8％增加到17.6％(图59)。
总之，图55-图59证明了在TRAC基因座处实现有效水平的双重HDR编辑的能力使得产生了使用IL-2 CISC平台表现出富集的抗原特异性airT。
人CD4+ T细胞的双重编辑——双基因座方法的实例
作为用于产生含有IL-2 CISC组分的抗原特异性airT产物的替代的双重编辑策略，开发了靶向TRAC和FOXP3基因座的构建体以用于双基因座编辑。如图53的示意图中所示，并非具有靶向TRAC基因座的两个构建体，而是一个构建体靶向TRAC基因座，而另一构建体靶向FOXP3基因座。此方法可能产生提高的双重编辑率，并且还允许协调使用多种现有策略来介导持续的FOXP3表达。为了测试这一点，开发了使得能够容易地追踪成功编辑的细胞的构建体。将分别具有FOXP3和TRAC同源臂的MND.mCherry.FKBP.IL2RG(#3251)和MND.GFP.FKB.IL2RB(#3207)盒用于测试产生具有连接至IL-2 CISC的mCherry和GFP两者的稳定表达的经双重编辑的细胞的能力。将所使用的构建体和用于编辑、细胞扩增和分析的时间线在图60中示出。对于此实验，比较了高血清和低血清编辑条件，因为单基因座编辑表明较低的血清浓度引起较高的双重编辑率(图58)。所得的FACS分析证明了以两种血清条件使用双基因座策略的成功编辑(图61)。与单基因座编辑一样，编辑阶段期间的2.5％血清培养基显著改善了第3天的双重编辑(20％血清的编辑率为4.99％vs.2.5％血清为11.0％)。然后将在含有2.5％血清的培养基中编辑的细胞用IL2或Rapalog(AP21967)扩增10天。图62示出了在Rapalog存在下对总共59％mCherry/GFP双阳性细胞的稳健富集。
测试了实验之间的再现性并探索了替代的编辑条件以试图进一步提高初始编辑率。图63概述了编辑条件以及编辑、细胞扩增和分析的时间线。对于此实验，在所有条件下的编辑阶段均使用含2.5％血清的培养基。以体积计的病毒百分比在反应中变化，并在存在和不存在HDR增强子(HDR-E)的情况下，使用AAV#3207和#3251对编辑进行比较。图64示出了编辑后3天每个条件下的流式数据的直方图。相比于图61中示出的先前实验，本研究中用含2.5％血清的培养基的编辑率相似(15.4％双阳性GFP/mCherry细胞分别与11％双阳性细胞相比)。此外，经双重编辑的群体的Rapalog富集产生54％GFP/mCherry双阳性细胞(图65)，类似于先前的数据并证明了实验之间的再现性。尽管HDR-E的存在不影响初始编辑率，但反应中的病毒％确实影响了编辑结果(图64)。结果表明，与15％培养体积的各病毒或与总计30％病毒的任何其它组合相比，10％培养体积的各病毒是最佳的。
这些研究的结果证明，目前公开的双基因座双重编辑策略可用于引入IL-2分开的CISC盒并使用Rapalog产生经双重编辑细胞的有效富集。已成功使用此方法产生和富集经双重编辑的细胞，通过分别靶向FOXP3和TRAC基因座设计并克隆了构建体以用于表达与IL-2 CISC组分组合的胰岛抗原特异性TCR(T1D4)和FOXP3。将这些和一系列其它HDR供体用于产生抗原特异性FOXP3 airT细胞(图66)。
作为双重编辑策略的框内TRAC敲入
作为对我们的双重编辑策略的额外的修改/改善，通过靶向TRAC基因座的第一外显子，建立了用于框内敲入包含IL-2 CISC组分的无启动子TCR盒的方法(图67)。这种编辑策略通过内源TRAC基因座的启动子/增强子活性驱动抗原特异性TCR的表达。此方法的优点包括消除内源TCR的表达(以及与所递送的TCR组分不正确配对的可能性)和伴随的自身抗原特异性TCR表达的近内源水平。为了建立此方法，用概念验证的包含mCherry IL-2 CISC的构建体(#3253)测试了基因编辑和外源基因表达(图68)。63.8％的细胞为mCherry阳性，具有伴随的CD3的丧失(从仅AAV中的99.9％降至P2A.mCherry.FRB.IL2RB(#3253)编辑细胞中的3.01％)。基因编辑后，通过流式细胞术很容易检测mCherry的表达。正如预期的，与使用MND启动子表达盒(MND.mCherry.FKBP.IL2RG(#3208)在相同基因座中编辑的T细胞中的mCherry表达相比，P2A.mCherry.FRB.IL2RB(#3253)编辑细胞中的mCherry表达的MFI较低(图69)。因此，这种HDR方法通过内源TRAC基因座的启动子/增强子活性成功地允许转基因表达。
在后续研究中，将两个不同的HDR供体盒用于实现TRAC的双重编辑(和内源启动子的捕获)和/或TRAC和FOXP3基因座二者的编辑。HDR供体引入IL-2 CISC的分开的组分，以允许通过cDNA表达或通过锁定内源FOXP3的表达，在递送Ag特异性TCR(处于TRAC启动子下)和FOXP3表达的同时富集双重编辑的细胞。使用用于编辑入FOXP3基因座中的、与MND.GFP.FKBP.IL2RG(#3273)配对的具有内源TRAC启动子(P2A.mCherry.FRB.IL2RB(#3253))的mCherry分开的CISC测试了双基因座双重编辑。来自两个不同启动子的IL-2分开的CISC的两个组分的表达可影响整体CISC功能，因此还使用用于驱使IL-2 CISC的两个组分脱离内源TRAC启动子的P2A.mCherry.FRB.IL2RB(#3253)和P2A.GFP.FKBP.IL2RG(#3292)测试了单基因座双重编辑(图70)。
在成功的双等位基因编辑(使用无启动子的mCherry/GFP构建体中的一者或两者并使用Rapalog富集经双重编辑的细胞)后，产生的构建体可用于将与IL-2 CISC组分组合的抗原特异性TCR(T1D4)和FOXP3引入作为产生抗原特异性FOXP3+airT细胞的替代方法。(参见图70)。将使用这些策略产生的airT与其中抗原特异性TCR由外源MND启动子驱动的细胞进行比较。
使用诱饵-CISC(分开的-DISC)构建体的双重编辑
尽管表达CISC的细胞在异二聚化Rapalog(AP21967)存在下有效扩增，但FDA批准的药物雷帕霉素可优选地用于临床应用。雷帕霉素与其靶标mTOR的细胞内结合对T细胞增殖具有充分证明的抑制作用。通过利用在表达CISC的细胞中细胞内表达的裸“诱饵”FRB结构域来解决该问题的构建体和方法在WO2019210057中公开，以引用的方式将其整体并入。表达裸FRB结构域和CISC的构建体被命名为“诱饵-CISC”或“DISC”。
为了确定DISC是否适用于双重编辑方法，含有CISC的构建体被修饰以包含位于CISC受体3′的额外的裸FRB结构域(图70、图71)。具有额外的FRB结构域以及CISC组分的构建体被命名为“诱饵-CISC”或“DISC”。当在双重编辑方法中使用时，构建体被命名为分开的DISC。使用分开的DISC，裸FRB结构域与mTOR的内源FRB结构域竞争结合雷帕霉素，从而通过分开的CISC组分引起雷帕霉素介导的信号转导而没有细胞生长的相关抑制。
如图71所示，用包含添加的FRB结构域的mCherry CISC构建体(mCherry DISC，#3280)和GFP CISC构建体(#3207)进行双重编辑的T细胞表达7.07％双阳性GFP/mCherry细胞。正如用DISC构建体所预测的，用雷帕霉素或Rapalog(AP21967)(分别为79.5％和86.4％)处理后双阳性GFP/mCherry细胞富集至相似的水平(图72)。
进行实验以确定在用雷帕霉素处理的NSG小鼠中的GFP/mCherry-分开的DISC编辑的细胞的体内富集/植入。经双重编辑的GFP/mCherry细胞表现出增加的体内植入/富集。这些研究使用包含FOXP3和T1D4的构建体进行扩增，以评价体内胰岛特异性airT的植入和扩增。图73所示的DISC构建体(MND.FOXP3.FKBP.IL2RG.FRB，#3262)与现有的#3243MND.T1D4.FRB.IL2RB配对以双重编辑到TRAC基因座中，用于可使用雷帕霉素在体内富集的胰岛特异性airT的开发。
实施例11—Ag特异性鼠airT的体外和体内的功能活性
鼠airT产物的体外表征：
实施了被设计为鉴别有利的HDR供体模板设计(用于从具有抑制性Treg样表型的鼠CD4+ T细胞产生airT产物)的研究。这些研究解决的问题包括：a)哪些经测试的启动子/增强子构建体在体外并最终在体内提供了最佳的airT性能，以及b)使用临床相关的顺式连接的选择性标志物LNGFR是否允许以适合GMP生产的方式富集airT。图74至图80示出如下实验的结果：(1)评估临床相关的顺式连接的选择性标志物LNGFR作为在编辑后富集鼠细胞的方法的用途；(2)测试了多种候选启动子(除了MND启动子)；(3)在供体模板中测试了不同大小的两个Foxp3同源臂；以及(4)比较了具有和不具有UCOE元件的供体模板(作为限制Foxp3基因座内经引入的启动子的沉默的潜在手段)。
首先，评价了将MND.LNGFR.P2A供体模板的同源臂从Foxp3基因的0.6kb延伸至1.0kb对C57BL/6小鼠CD4+ T细胞中的编辑效率的影响(图76)。这些研究表明，与包含0.6kb臂的MND.LNGFR.P2A#3189相比，包含1.0kb臂的MND.LNGFR.P2A#3261具有略高的编辑效率。该改善为～10％，并且编辑效率的提高在实验之间可再现，这使得在其余研究中能够选择AAV#3261作为MND.LNGFR.P2A airT鼠细胞的期望的靶向供体模板。还测试了使用具有替代启动子的AAV供体模板富集C57BL/6 edTreg后的编辑效率和纯度(图76)。这表明富含LNGFR+的细胞的整体编辑和纯度在包含MND、PGK和EF-1α启动子的AAV供体模板之间相似。此外，LNGFR+细胞和GFP+细胞富集后的纯度相当，进一步证明LNGFR可用作鼠CD4+ T细胞的选择和富集方法。
尽管使用具有不同启动子的AAV供体模板的经编辑的细胞的编辑效率和纯度相似，但重要的是，FOXP3表达水平因启动子而异。图77示出了中空白编辑的、MND.GFP.KI-(#1331)和PGK.GFP.KI-(#3209)C57BL/6编辑的CD4+ T细胞中的GFP和FOXP3表达的评价。结果表明，与PGK.GFP.KI(#3209)相比，使用MND.GFP.KI(#1331)编辑的细胞中的FOXP3 MFI显著更高。PGK.GFP.KI-(#3209)编辑的CD4+细胞中的FOXP3表达水平与脾nTreg中观察到的FOXP3表达相似。这些研究证明了将替代启动子引入内源Foxp3基因座以控制airT产物中的FOXP3整体水平的能力。这可为产物生成提供灵活性，并可产生具有不同功能特性的airT。FOXP3表达水平与体外和体内功能之间的关系在图79和图85中描述的研究中进一步探索(见下文)。还测试了遍在染色质开放元件(UCOE)稳定FOXP3表达的能力(图77)。该元件可起到减少沉默和限制启动子元件的潜在负面影响的作用。这些研究表明FOXP3在具有或不具有UCOE时都是稳定的，并且包含UCOE元件不会对FOXP3的相对表达水平产生负面影响(MND.GFP.KI#1331相比于具有UCOE#3213的MND.GFP.KI)，表明UCOE保护的供体有效地工作，并且包含该元件可能在airT产物中有用，因为它可保护体内表达或随着时间的推移提供功能活性的改善的持续期。
进行额加的研究以评价：(a)表达LNGFR的airT细胞的体外功能活性；以及(b)确定驱动内源FOXP3表达的启动子是否对Treg功能活性显示出任何影响。图78中概述的体外抑制测定用于分析在存在和不存在分选的MND.GFP.KI-和MND.LNGFR.P2A-airT时的Teff细胞增殖；将这些效果与纯化的鼠nTreg的活性进行了比较。图79中示出的结果证明了鼠airT(用MND.GFP.KI或MND.LNGFR.P2A HDR供体产生)和nTreg表现出相当的、稳健的体外抑制功能。这些发现还证明了airT细胞表达LNGFR选择性标志物(MND.LNGFR.P2A#3261)可成功地用作鼠CD4+细胞的选择和增强方法，而不会丧失功能活性，并且可用于模拟利用相同的临床相关的选择标志物的人airT产物的体外和体内功能活性的建模。
使用相同的体外抑制测定，探索不同强度的启动子的功能活性以确定FOXP3表达水平(在图77中评价)是否与功能活性相关。图80示出了利用MND、PGK和EF-1α启动子(分别为MND.LNGFR.P2A、PGK.LNGFR.P2A和EF-1a.LNGFR.P2A)的LNGFR构建体与MND.GFP.KIC57BL/6编辑的CD4+ T细胞和nTreg的比较。结果表明，具有MND启动子的鼠airT表现出与nTreg相当的抑制功能。与MND启动子构建体相反，利用PGK启动子的airT细胞仅表现出部分体外抑制功能，而利用EF-1α启动子的airT未能抑制。有趣的是，虽然PGK.GFP.KI编辑的细胞表达与nTreg相似的FOXP3水平(图77)，但nTreg的体外抑制活性显著高于PGK.LNGFR.P2A编辑的细胞。这些发现表明了令人惊讶的结果，即经编辑的CD4+ T细胞中的FOXP3表达的阈值水平可能是提供适当的重编程和有效的体外功能活性所必需的。下面描述的结果也清楚地证明了MND启动子对于减少体内糖尿病是有效的。
edTreg产物的体内功能表征：
以上总结的实验表明，含有临床相关的顺式连接的LNGFR选择性标志物的鼠airT细胞在体外保留了功能活性，并且与替代启动子相比，MND启动子具有优异的体外抑制活性。这些研究被扩展以在NSG过继性转移糖尿病模型中评价胰岛特异性airT产物，其中胰岛特异性NOD(鼠)CD4+ T细胞转移到成年受者NSG小鼠中触发糖尿病的快速发病。
使用该模型，评价源自NOD BDC2.5小鼠的胰岛特异性MND.LNGFR.P2A airT延迟或预防糖尿病发展的能力。尽管图76-图80中描述的体外实验利用通过细胞分选而富集的细胞，但分选过程既费时又费钱。此外，分选可能会严重影响体内过继性转移后的细胞的植入和/或存活。为了能够有效富集可在体内使用的鼠基因编辑的airT，比较了使用替代方法纯化的airT的纯化和功能活性：(1)通过流式细胞术进行细胞分选的LNGFR+细胞富集和(2)使用LNGFR柱分离的LNGFR+细胞富集。图82-图83示出了使用分选和柱富集进行的纯化之前和之后的流式图。虽然使用分选方法的纯化产生了稍微更纯的LNGFR+细胞群，但柱富集产生了～84％的纯细胞群，显著节省了时间和资源。重要的是，柱富集的LNGFR+airT和分选的细胞延迟或预防了糖尿病的发病(图84)。
综上，图82至图84中的数据证明了使用LNGFR柱分离和通过FACS分选产生高度纯化的胰岛特异性的经编辑的细胞的能力。两种产物均表达高水平的LNGFR/FOXP3，并通过在体内减少或预防糖尿病来显示出Treg样表型。
最后，图85示出了NSG过继性转移模型中的胰岛特异性airT产物的功能活性依据用于驱动内源FOXP3的启动子而变化。用MND.GFP.KI和nTreg编辑的细胞都延迟了糖尿病的发病或预防了糖尿病，但PGK.GFP.KI airT没有。该结果与图80所示的体外抑制数据一致，表明启动子的选择在最佳功能中起作用。重要的是，与对糖尿病的保护一致，胰岛特异性airT细胞归巢至胰脏并在具有稳定的FOXP3表达的NSG模型中持续存在(图86)。
这些数据证明了对来自Teff细胞的小鼠airT进行工程化以用于体外和体内研究的能力。与人T细胞中的发现一致，MND启动子有效地将小鼠Teff转化为具有高水平的FOXP3表达及与nTreg相当的稳健体外抑制活性的airT细胞。重要的是，鼠胰岛特异性MND airT和nTreg：(1)表现出相当的、稳健的体外抑制功能；(2)阻断受者小鼠中由胰岛特异性Teff激发的糖尿病。此外，所述数据示出：(3)表达LNGFR选择性标志物的airT细胞可在体外富集而不会丧失功能活性，并且可以在体内发挥功能，以及(4)MND airT的性能优于用替代启动子(包括PGK和EF1A)产生的airT，证明启动子的选择在改善功能方面发挥了作用。
所描述的NSG过继性转移糖尿病模型允许快速评价鼠airT的关键功能特征，包括：LN运输、扩增、激活状态和限制初始Teff激活的能力。将这些方法用于比较T1D的免疫活性NOD小鼠模型中的抗原特异性的、富含LNGFR的airT的功能活性。
用于产生鼠T细胞编辑的细胞的Rosa26基因座处的编辑
为了扩展用于评价Ag特异性FOXP3 airT在糖尿病或其它自身免疫性病症的动物模型中的功效的工具集，设计并测试了靶向鼠Rosa26基因座的gRNA。这一良好表征的安全港基因座历来被用于小鼠模型中整合的转基因的稳定表达。选择靠近已公开的gRNA靶位点的Rosa26内含子区域内的两个新的gRNA靶序列，并在RNP递送至原代小鼠CD4+ T细胞后通过ICE(Inference of CRISPR Edits)测量中靶位点特异性活性。ICE证实了Rosa26中的R26_gRNA_1的特异性插入缺失的诱导(图87)。
接下来，测试了使用允许容易追踪成功编辑的细胞的构建体来编辑鼠T细胞的能力。产生MND-GFP盒，侧接有与R26_gRNA_1(#3245)匹配的同一300碱基对Rosa26同源臂，并用于产生具有稳定表达的GFP的Rosa26编辑的T细胞。细胞扩增、编辑和分析的时间线在图88中示出。所得的FACS分析证明了，在编辑后3天，与单独用AAV#3245的0.02％相比，用AAV#3245以及RNP的11.4％高GFP细胞，证实MND-GFP修复盒成功整合到Rosa26基因座中(图89)。在编辑后8天进行的FACS分析示出了相似的GFP+细胞百分比(10.8％)，表明GFP表达是稳定的(图90)。
使用MND-GFP盒在Rosa26基因座处实现了编辑鼠T细胞，开发了包含具有LNGFR标志物(用于纯化)的mFoxp3 CDS和替代候选启动子(除了MND启动子)的修复模板，以进一步产生在小鼠细胞中该安全港基因座中具有FOXP3的稳定表达的构建体(图91)。将这些构建体用于探索小鼠细胞中的双重编辑，以生成表达鼠抗原特异性FOXP3的airT，用于小鼠自身免疫性模型中。将突变的FOXP3变体进行测试，预期具有增高的稳定性。这包括4x CDK磷酸化突变体，其中用于细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化的一组4个靶残基已被丙氨酸替换，阻止了与蛋白质降解联系的磷酸化事件。
这些数据证明Rosa26安全港基因座可用于小鼠T细胞中的HDR编辑。此进展允许与人类T细胞并行工作的对小鼠T细胞的双重编辑研究，促进Ag特异性airT的非临床动物建模。
使用CISC元件开发用于扩增鼠细胞的工具
人抗原特异性airT平台的重要特征是使用例如IL-2-CISC系统在体外和体内扩展airT的潜力。为了评价含有IL-2-CISC盒的airT在免疫活性动物疾病模型中的功能，进行了实验以测试含有CISC/DISC盒的人IL-2R序列是否可促进用Rapalog/雷帕霉素进行的鼠细胞在体外和体内的选择性扩增。这些数据证明了使用慢病毒构建体#1272的概念验证，该构建体包含MND启动子驱动的mCherry报告子和顺式连接的人IL-2 CISC元件。图92示出了慢病毒盒的示意图以及T细胞转导、扩增和分析的时间线。在该研究中，经转导的细胞被置于以下的任一者中：(a)IL-2、IL-7和IL-15；(b)仅Rapalog；或(c)Rapalog以及转导2天后的额外的CD3/CD28珠刺激。图93表明了在8.85％的经转导细胞中的mCherry表达，并在Rapalog处理3天后进一步富集。当同时用Rapalog以及额外的CD3/CD28珠刺激处理经转导的T细胞时，富集最大(46.1％)。
这些数据表明可使用IL-2 CISC技术富集鼠CD4+ T细胞，并且表明人CISC在小鼠系统中是有功能的。这些发现证明了在非临床动物模型中使用分开的CISC/分开的DISC方法检查鼠Ag特异性airT的富集和功能的研究的可行性。
实施例12—抗原特异性edTreg的产生和测试
从RA患者中鉴别的RA抗原特异性TCR
从分离自RA患者的T细胞克隆中鉴别RA抗原特异性TCR。基于这些序列，产生了用于TCR基因转移的慢病毒TCR构建体。表1列出了所产生的编码RA抗原特异性TCR的慢病毒构建体、它们的表位特异性和HLA限制。靶T细胞表位序列包括瓜氨酸修饰。识别瓜氨酸-波形蛋白、-聚集蛋白聚糖、-CILP和-烯醇酶的TCR从先前分离自RA患者的T细胞克隆中鉴别。
表1
CD4+ T细胞被分离，用CD3/CD28珠激活，并用慢病毒RA Ag特异性TCR转导。流式图示出了转导后第9天CD4+细胞上受门控的mTCRb表达(图117A)。将用RA Ag特异性TCR转导的CD4+ T细胞用CTV进行标记并与APC(经辐照的PBMC)及其同源的肽或DMSO共培养3天。流式图示出了作为CTV稀释度的细胞增殖(图117B)。使用与TCR和抗原呈递细胞(APC)同源的肽，通过T细胞增殖测定验证RA特异性的TCR表达。RA特异性TCR(波形蛋白、聚集蛋白聚糖、CILP和烯醇酶)转导的T细胞响应于其同源的肽和APC而增殖。
烯醇酶特异性edTreg的抑制活性
通过对已用烯醇酶TCR转导的CD4 T细胞中的Foxp3基因座进行编辑来产生抗原特异性Treg。这使得成功产生了烯醇酶特异性edTreg。图118A描述了在第7天表达Enol326-TCR的经编辑的细胞(Enol326编辑的)和没有LV转导的经编辑的细胞(Untd编辑的)中的mTCRb表达和LNGFR/Foxp3表达的流式图。edTreg细胞在第10天通过LNGFR表达富集并且将LNGFR-细胞用作抑制测定的空白细胞。经转导的Enol326-TCR对烯醇酶326-340的表位具有特异性。
图118B描述了使用烯醇酶特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。烯醇酶特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV Enol326-TCR转导产生并扩增15天。对于多克隆测定，随着无Treg、untd edTreg、Enol326 edTreg或空白细胞，将Enol326 Teff与抗CD3/CD28珠以1:30的珠与细胞之比孵育。对于抗原特异性抑制测定，在存在无Treg、未转导(untd)edTreg、Enol326 edTreg或空白细胞的情况下，将Enol326 Teff细胞与APC和Enol326肽共培养。对于所有抑制测定的设置，将Teff和edTreg或空白细胞分别用CTV和EF670标记，并以1:1的比例共培养。共培养4天后，对细胞进行染色并分析作为CTV稀释度的Teff增殖。图118C描述了由图118B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和烯醇酶肽(灰色)存在下由无Treg、untd edTreg、Enol edTreg或空白对Teff增殖的抑制百分比的图。通过体外抑制测定，烯醇酶特异性edTreg表现出抗原特异性T效应细胞的抗原特异性和多克隆抑制功能。
CILP特异性edTreg的抑制活性
确定了CILP特异性edTreg的抑制活性。图119A描述了在分别用无LV和LVCILP297-1-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的edTreg和CILP297-1 edTreg中的mTCRb表达的流式图。CILP297-1 TCR对CILP297-311表位具有特异性。图119B描述了使用CILP特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。CILP特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV CILP297-1-TCR转导产生并扩增15天。对于多克隆测定，随着无Treg、untd edTreg、CILP edTreg或空白细胞，CILP Teff与抗CD3/CD28珠一起孵育。对于抗原特异性抑制测定，在存在无Treg、untd edTreg、CILP edTreg或空白细胞的情况下，将CILP Teff细胞与APC和CILP297肽共培养。图119C描述了由图119B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和CILP肽(灰色)存在下由无Treg、untd edTreg、CILPedTreg或空白细胞对CILP Teff增殖的抑制百分比的图。使用CILP特异性的edTreg也看到了相似的结果。通过体外抑制测定，CILP特异性edTreg表现出抗原特异性T效应细胞的抗原特异性和多克隆抑制功能。
波形蛋白特异性edTreg的抑制活性
确定波形蛋白特异性edTreg的抑制活性。图120A描述了在分别用无LV和LVVim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的edTreg和Vim418edTreg中的mTCRb表达的流式图。Vim418 TCR对表位波形蛋白418-431具有特异性。
图120B描述了使用波形蛋白特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。波形蛋白特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV Vim418 TCR转导产生并扩增15天。对于多克隆测定，随着无Treg、untd edTreg、Vim edTreg或空白细胞，将Vim Teff与抗CD3/CD28珠一起孵育。对于抗原特异性抑制测定，在存在无Treg、untd edTreg、Vim edTreg或空白细胞的情况下，将Vim Teff细胞与APC和Vim418肽共培养。图120C描述了由图120B中的增殖百分比计算的在a-CD3/CD28(黑色)或APC和波形蛋白肽(灰色)存在下由无Treg、untdedTreg、Vim edTreg或空白对Vim Teff增殖的抑制百分比的图。通过体外抑制测定，波形蛋白特异性edTreg表现出抗原特异性T效应细胞的抗原特异性和多克隆抑制功能。
聚集蛋白聚糖特异性Teff的抗原特异性和旁观者抑制
聚集蛋白聚糖特异性Teff的抗原特异性抑制和旁观者抑制分别用聚集蛋白聚糖特异性edTreg和波形蛋白特异性edTreg证明。
图121A描述了示出在分别用无LV、LV Agg520-TCR和LV Vim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的、Agg520和Vim418 edTreg中的mTCRb表达的流式图。Agg520 TCR对表位聚集蛋白聚糖520-539具有特异性。图121B描述了使用Agg520Teff和edTreg或者对Agg520或Vim418而言特异性的空白的多克隆抑制测定。聚集蛋白聚糖特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV Agg520-TCR转导产生并扩增15天。随着无Treg、edTreg或空白，将Agg520 Teff与抗CD3/CD28珠一起孵育。图121C描述了由图121B中的增殖百分比计算的无Treg、untd edTreg、Agg edTreg/空白、或Vim edTreg/空白对Agg520 Teff增殖的抑制百分比的图。图121D描述了使用Agg520 Teff和edTreg或者对Agg520或Vim418而言特异性的空白的抗原特异性和旁观者抑制测定。在APC和Agg520肽或Agg520+Vim418肽存在下，将Agg520 Teff细胞与无Treg、edTreg或空白共培养。图121E描述了由图121D中的增殖百分比计算的无Treg、edTreg或空白对Agg520 Teff增殖的抑制百分比的图。有意义的是，证明了波形蛋白特异性edTreg对聚集蛋白聚糖特异性Teff的旁观者抑制。
CILP特异性Teff的抗原特异性和旁观者抑制
分别用CILP特异性edTreg和波形蛋白特异性edTreg证明了CILP特异性Teff的抗原特异性抑制和旁观者抑制。图122A描述了分别用无LV、LV CILP297-1-TCR和LV Vim418-TCR转导的经编辑细胞中的LNGFR+Foxp3+上受门控的未转导的、CILP297-1和Vim418edTreg中的mTCRb表达的流式图。图122B描述了使用CILP297-1 Teff和edTreg或者对CILP297或Vim418而言特异性的空白的多克隆抑制测定。CILP特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV CILP297-1-TCR转导产生并扩增15天。随着无Treg、edTreg或空白，将CILP297-1Teff与抗CD3/CD28珠一起孵育。图122C描述了由图122B中的增殖百分比计算的无Treg、untd edTreg、CILP edTreg或空白、或Vim edTreg或空白对CILP Teff增殖的抑制百分比的图。图122D描述了使用对CILP297和Vim418具有特异性的edTreg和CILP297-1 Teff的抗原特异性和旁观者抑制测定。在APC和CILP297肽或CILP297+Vim418肽存在下，将CILP297-1Teff细胞与无Treg、edTreg或空白共培养。图122E描述了由图122D中的增殖百分比计算的无Treg、edTreg或空白对CILP Teff增殖的抑制百分比的图。有意义的是，证明了VimedTreg对CILP297-1特异性Teff的旁观者抑制。
SLE特异性edTreg及其抑制活性
产生了SLE特异性edTreg。将CD4 T细胞用先前从狼疮患者中鉴别的SLE3 TCR转导，并对Foxp3基因座进行编辑。
图123A描述了在第7天表达SLE3-TCR的经编辑细胞中的mTCRb表达和LNGFR/Foxp3表达的流式图。SLE3-TCR先前从狼疮患者中鉴别。edTreg细胞在第10天通过LNGFR表达富集，并且将LNGFR-细胞用作空白细胞以用于抑制测定。SLE3-TCR对表位SmD1 65-80具有特异性。图123B描述了使用SLE特异性edTreg的多克隆抑制测定和抗原特异性抑制测定。SLE特异性Teff细胞由CD4+ T细胞的LV SLE3-TCR转导产生并扩增15天。对于多克隆测定，随着无Treg、SLE3 edTreg或空白细胞，将SLE3 Teff与抗CD3/CD28珠一起孵育。对于抗原特异性抑制测定，在存在无Treg、SLE3 edTreg或空白细胞的情况下，将SLE3 Teff与APC和SmD1肽共培养。经编辑的细胞表达SLE-TCR并具有多克隆和抗原特异性抑制活性。
至少该实施例中的数据证明了产生具有抑制活性的T1D、RA和SLE抗原特异性edTdreg的能力，表明了抗原特异性edTreg疗法在广泛的自身免疫性疾病谱中的潜在用途。
实施例13—人CD4+ T细胞的双重编辑
将人CD4+ T细胞进行双重编辑来产生edTreg以具有内源TCR敲除/失活、成为抗原特异性的和/或药物选择性的。
单基因座方法
IL-2分开的CISC系统用于双重HDR编辑策略以提供具有内源TCR敲除的双重编辑细胞的有效选择和富集。双重编辑方法的挑战是获得足够数量的用于治疗用途的经编辑细胞的能力。该研究旨在提高扩增阶段期间的细胞生存力。所使用的TRAC靶向AAV HDR供体构建体在图124A中描述。AAV HDR供体构建体被设计为使用单基因座双重编辑方法将分开的CISC元件引入TRAC基因座。CISC组分在2个构建体之间分开，并与HA-FOXP3或T1D4 TCR(分别为#3240和#3243)共表达。修复模板侧接有与靶向TRAC基因座的gRNA匹配的同源臂。只有并入了两种表达盒的经编辑的CD4+ T细胞才被预测在Rapalog暴露下选择性地扩增。
CD4+ T细胞的双重AAV编辑和用Rapalog扩增的关键步骤的时间线在图124B中描述。扩增方案从AP21967(雷帕霉素类似物)中的10天扩增调整为AP21967中的7天扩增及后随的含有IL-2的培养基中的3天恢复。简而言之，使用人TRAC gRNA_4以及#3240(MND.HA.FOXP3.FKBP.IL2RG)和#3243(MND.T1D4.FRB.IL2RB)AAV构建体(单基因座双重编辑)编辑人CD4+ T细胞。电穿孔后立即将所述细胞置于含有2.5％FBS的培养基(恢复培养基)中～24小时，然后在实验的其余时间内保持在含有20％FBS的培养基中。在第3天进行FACS分析以确定编辑率，并在IL-2或Rapalog存在下将经编辑的群体再培养7天以富集双FOXP3/T1D4阳性细胞。在第14天的FACS分析之前，使细胞在含有IL-2的培养基中恢复3天。
在人TRAC基因座内使用FOXP3和T1D4分开的CISC构建体对人CD4+ T细胞进行的双重编辑产生FOXP3/T1D4双阳性细胞并且破坏了TCR表达。图125A描述了示出在编辑后第3天的空白编辑、经单编辑和经双重编辑的细胞(使用10％体积的#3243和#3240 AAV两者)中的T1D4和FOXP3表达的流式图。#3243和#3240的病毒滴度分别为4.2E11和1.3E12。图125B描述了示出空白编辑和混合编辑的细胞中的T1D4和CD4表达的流式图。图125C描述了示出经双重编辑的细胞内的双阴性、FOXP3-HA阳性、T1D4阳性和FOXP3/T1D4双阳性细胞的百分比的直方图。图125D描述了示出相比于空白编辑细胞的FOXP3/T1D4双重编辑细胞中的CD3敲除百分比的直方图。FACS分析证明，相比于空白编辑细胞中的0％以及经双重编辑的细胞中CD3敲除(KO)的70％，T1D4/FOXP3双重编辑的细胞中的初始编辑率为1.6％。
用AP21967处理经双重编辑的细胞观察到经双重编辑的FOXP3/T1D4表达细胞的稳健富集和增加的CTLA4表达。TRAC基因座双重编辑如图124A和图124B所示进行。图126A描述了示出用50ng/mL IL-2(上子图)或100nM Rapalog(AP21967；下子图)处理7天的经双重编辑细胞的生存力以及T1D4和FOXP3表达的流式图。图126B描述了示出用50ng/mL IL-2(上子图)或100nM Rapalog(AP21967；下子图)处理7天的T1D4/FOXP3双阳性vs.双阴性细胞群的CTLA4表达的流式图。第7天富集后的FACS分析示出了FOXP3/T1D4双阳性细胞随时间稳定增加，相较于IL-2中的1.47％，AP21967中第7天双阳性细胞为19.1％。
与用50ng/mL IL-2处理的细胞相比，AP21967中的细胞生存力下降(分别为11％生存力vs.95％生存力)(图126A)。为了提高AP21967处理后的细胞生存力，在AP21967中7天后，将细胞在含有50ng/mL IL-2的培养基中培养。对于在IL-2中恢复后用AP21967处理的细胞，观察到经双重编辑的FOXP3/T1D4表达细胞的提高的生存力和持续的富集。TRAC基因座双重编辑如图124A和图124B所示进行。在含有IL-2的培养基中恢复3天后，在第10天分析细胞。图127A描述的流式图示出了在IL-2培养基中恢复后用50ng/mL IL-2(上图)vs.100nMAP21967(下图)处理后的经双编辑的细胞中的生存力(右图)以及T1D4和FOXP3表达(左图)。图127B描述了示出在最后3天处于含有IL-2的复苏培养基中的10天期间内用50ng/mL IL-2或100nMRapalog(AP21967)处理的双阳性T1D4/FOXP3细胞的富集倍数的图。在IL-2中恢复后，总体生存力从11％增加到20.7％(图126A，图127A)并且双阳性FOXP3/T1D4细胞的百分比继续增加到24.9％。综上，双阳性抗原特异性Treg群体在该研究过程中富集了大约15倍(图127B)，表明这可能是提高生存力和扩增的方法。
为了进一步表征表达T1D4/FOXP3的细胞，测量了CTLA4的表达，CTLA4是表达FOXP3的天然的调控性T细胞(nTreg)的标志物。图126B示出，同与Treg样表型一致的双阴性群体相比，双阳性T1D4/FOXP3表达细胞表现出增加的CTLA4表达。
此研究进一步证明双重编辑可用于引入候选TCR和IL2分开的CISC盒两者，并用于使用Rapalog的富集和抗原特异性edTreg的产生。
使用诱饵-CISC(分开的DISC)构建体的双重编辑
雷帕霉素可用于使用表达CISC的edTreg的临床研究。测试了用于使用雷帕霉素或AP21967的有效富集的“诱饵-CISC”(DISC)构建体。分开的DISC构建体用于确定经双重编辑的T细胞的富集和扩增。评价了通过在gREX烧瓶中扩增经编辑的CD4+ T细胞来扩大生产以获得足够用于动物研究的细胞数量的能力。尤其是，研究了使用分开的DISC构建体的人CD4+ T细胞的双重编辑和富集。简而言之，图128A描述了用于在Rapalog或雷帕霉素中选择经双重编辑的细胞的分开的IL-2 DISC HDR敲入构建体(#3280)。为了产生分开的诱饵-CISC(分开的DISC)，将用于细胞质雷帕霉素螯合的游离的FRB结构域添加至MND.mCherry.FKBP.IL2RG构建体，以产生(MND.mCherry.FKBP.IL2RG.FRB(#328))。每个修复模板(#3280和#3207)侧接有与靶向TRAC基因座的gRNA匹配的同一同源臂。预测包含并入各构建体的一个拷贝的经编辑CD4+ T细胞在Rapalog或雷帕霉素处理下选择性地扩增。图128B描述了使用AAV#3280和#3207对CD4+ T细胞进行双重AAV编辑、用Rapalog/雷帕霉素扩增以及分析富集的细胞的步骤的时间线。将细胞在编辑前珠刺激(CD3/CD28)3天。电穿孔后立即将所述细胞置于含有2.5％FBS的培养基(恢复培养基)中～24小时，然后在实验的其余时间保持在含有20％FBS的培养基中。编辑后三天，通过流式分析细胞的GFP和mCherry表达，然后在含有50ng/mL人IL-2或100nMRapalog的培养基中扩增。
使用诱饵-CISC(分开的DISC)构建体的人CD4+ T细胞的双重编辑和用AP21967富集使得双阳性细胞稳健扩增。图129A描述了示出编辑后四天的经双重编辑细胞(分别为10％培养体积的#3280和#3207 AAV供体)中的mCherry和GFP表达的流式图。#3280和#3207的病毒滴度分别为3.30E+12和3.1E+10。图129B描述了示出在gREX中接种760万个经编辑细胞并在AP21967存在下扩增7天后使得双阳性细胞扩增32倍的生存力(上子图)以及GFP和mCherry表达(下子图)的流式图。FACS分析证实mCherry/GFP双阳性细胞的初始编辑率为4.47％，并在AP21967存在下在gREX中扩增7天后mCherry/GFP双阳性细胞富集到66％。结果表明，在AP21967中的7天处理期间，双阳性细胞扩增了32倍，使得从接种到gREX的初始的340,000个细胞产生了总计1110万个双阳性细胞。
使用与上述基本相似的方案进行第二项研究。使用诱饵-CISC(分开的DISC)构建体的人CD4+ T细胞的双重编辑和用AP21967富集使得双阳性细胞稳健扩增。图130A描述了示出编辑后四天的经双重编辑细胞(分别为10％培养体积的#3280和#3207 AAV供体)中的mCherry和GFP表达的流式图。#3280和#3207的病毒滴度分别为3.30E+12和3.1E+10。图130B描述了示出在gREX中接种760万个经编辑细胞并在AP21967存在下扩增7天后使得双阳性细胞扩增32倍的生存力(上子图)以及GFP和mCherry表达(下子图)的流式图。
使用诱饵-CISC(分开的DISC)构建体的经双重编辑的人CD4+ T细胞的稳健扩增是可再现的。图130A描述了使用AAV#3280和#3207对CD4+ T细胞进行双重AAV编辑、用Rapalog扩增和分析富集的细胞的关键步骤的时间线。将细胞在编辑前珠刺激(CD3/CD28)3天。编辑后三天，通过流式分析细胞的GFP和mCherry表达，然后在含有100nMRapalog的培养基中再扩增7天。图130B描述了示出经双重编辑的细胞(10％#3280和10％#3207 AAV)中的mCherry和GFP表达的流式图。#3280MND.mCherry.FKBP.IL2RG.FRB和#3207pAAV.MND.GFP.FRB.IL2RB的病毒滴度分别为3.30E+12和3.1E+10。
使用具有AP21967的诱饵-CISC(分开的DISC)构建体对经双重编辑的人CD4+ T细胞进行扩增使得富集的细胞增加45倍。如图130A所描述的对细胞进行双重编辑。图131描述的流式图示出了将经编辑的细胞接种到gREX中并在AP21967存在下扩增7天后的生存力以及GFP和mCherry表达。在第7天gREX中的双阳性细胞总数为970万，比初始接种的216,000个双阳性细胞增加了～45倍。
重要的是，这些研究证明使用分开的DISC构建体的进入TRAC基因座中的双重编辑策略提供了经双重编辑细胞的至少～45倍的扩增。这一扩增水平类似于在单编辑事件中使用一体式DISC构建体所观察到的扩增水平。因此，此方法为体内移植研究和最终的临床应用提供了经双重编辑细胞的有效富集。
Ag特异性Treg小鼠研究
为了评价小鼠Ag特异性edTreg细胞的功能活性，建立了抗原特异性体外抑制测定。评价了BCD2.5(胰岛抗原特异性的)Teff的增殖。在存在和不存在表达BCD2.5的MND.LNGFR.P2A edTreg或表达nTreg的纯化的BCD2.5 TCR的情况下，将BCD2.5(胰岛抗原特异性的)Teff通过BDC肽激活。简而言之，图132A描述了使用小鼠edTreg或nTreg的体外抑制测定。将MND.LNGFR.p2A(#3261)编辑的Treg在编辑后的第2天通过抗LNGFR柱进行富集，并重新悬浮到含有10％FBS的RPMI培养基中。通过柱富集从8至10周龄NOD BDC2.5+小鼠的脾脏和淋巴结细胞中分离出nTreg(CD4+CD25+)、Teff(CD4+CD25+)和抗原呈递细胞(CD4+CD25+)。将富集的5×106Teff重新悬浮在2mL PBS中，并在37℃下用cell trace violet标记15分钟，然后在将其加入抑制测定前进行洗涤并重新悬浮在培养基中，为了设置该测定，在具有总体积250μL培养基的U型底96孔组织培养板中，将2.0×105个经辐照的APC(2500rad)与0.25μg/Ml BDC肽以及0.5×105Teff和滴定数量的BDC2.5+nTreg或edTreg一起上样。细胞在37℃下于CO2孵育箱中孵育四天。在第4天，将细胞用PBS洗涤两次并用活/死、抗CD4、抗CD45和CD25染色，并通过FACS(LSRII)分析Treg对Teff增殖的抑制。图132B描述了获得的代表性流式数据，示出了在BDC2.5+edTreg细胞存在下BDC2.5+Teff增殖减少。这证明了在edTreg存在下对肽激活的Teff细胞的抑制。
观察到鼠BDC2.5+nTreg和edTreg的体外抑制功能。图133描述了示出在来自NODBDC2.5+小鼠的空白、MND.LNGFR.p2A(#3261)编辑的Treg或nTreg存在和不存在下的celltrace violet标记的CD4+ T细胞的流式细胞图。每个流式图中的数字分别表示增殖比起非增殖细胞的比例。鼠edTreg和nTreg表现出稳健的体外抑制功能。这些数据证明，表达LNGFR选择性标志物(MND.LNGFR.P2A#3261)的edTreg细胞在体外表现出抗原特异性抑制活性。
edTreg的体内活性用与实施例6和实施例11中的那些基本相似的方法进行检查。尤其是，在NSG过继性转移模型中检查抗原特异性T细胞功能，其中对nTreg和柱富集的edTreg进行比较。将工程化的BDC2.5+抗原特异性(BDC)edTreg或抗原特异性nTreg输注入小鼠体内，然后输注抗原特异性Teff细胞。对小鼠监测糖尿病长达49天。图134描述了示出在接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑的、MND.LNGFR.P2A编辑的或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比的图。柱富集的Ag特异性MND.LNGFR.P2A edTreg完全预防了NSG小鼠的糖尿病，并表现出与nTreg相当的功能。
在另一项研究中，将工程化的BDC2.5+抗原特异性(BDC)edTreg或抗原特异性nTreg输注入小鼠中，然后输注抗原特异性Teff细胞。对小鼠监测糖尿病长达33天。图135描述了示出在接受效应细胞以及来自NOD BDC2.5小鼠的指定的空白编辑的、MND.LNGFR.P2A编辑的或nTreg细胞后的糖尿病小鼠的百分比的图。柱富集的Ag特异性MND.LNGFR.P2AedTreg完全预防了NSG小鼠中的糖尿病，并表现出与nTreg相当的功能。引人注目的是，柱富集的LNGFR+BDC2.5 edTreg完全预防了NSG小鼠中的糖尿病，并且在两个分开的实验中表现出与BDC2.5 nTreg相当的功能(图134和图135)。
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Claims (70)
1.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：
(a)叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰，其中，经修饰的所述基因组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及
(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
2.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞通过CD4+CD25ˉT细胞中的叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰以及至少一个经转导的多核苷酸而获得，其中，所述人工修饰使得airT细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
3.如权利要求1或2所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因存在于包含内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的FOXP3基因座中，所述TSDR具有多个胞嘧啶-鸟嘌呤(CG)二核苷酸，其中，每个CG二核苷酸包含甲基化胞嘧啶(C)核苷酸，所述甲基化胞嘧啶(C)核苷酸位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处。
4.如权利要求3所述的airT细胞，其中，位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处的TSDR C核苷酸的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被甲基化。
5.如权利要求1-4中任一项所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在体外维持CD4+CD25+表型至少21天的水平表达。
6.如权利要求1-5中任一项所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在过继性转移至需要抗原特异性免疫抑制的免疫相容性哺乳动物宿主后在体内维持CD4+CD25+表型至少60天的水平表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的airT细胞，其中，所述细胞包含选自以下的一种或多种中的表型：(i)HeliosLo、(ii)CD152+、(iii)CD127ˉ和(iv)ICOS+。
8.如权利要求1-7中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包括所述细胞中的天然FOXP3基因座的敲除。
9.如权利要求1-8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子，其中，所述启动子定位于所述FOXP3基因中以能够促进FOXP3基因座的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录。
10.如权利要求9所述的airT细胞，其中，所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。
11.如权利要求10所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
12.如权利要求11所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
13.如权利要求9-12中任一项所述的airT细胞，其中，包含所述组成型活化的启动子的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。
14.如权利要求9-13中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。
15.如权利要求1-8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含与位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。
16.如权利要求15所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。
17.如权利要求16所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
18.如权利要求17所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与CISC诱导物分子特异性结合。
19.如权利要求15-18中任一项所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。
20.如权利要求15-19中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。
21.如权利要求1-8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包括在除所述细胞的天然FOXP3基因座以外的染色体位点处的核酸分子的插入，所述核酸分子包含与组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。
22.如权利要求21所述的airT细胞，其中，所述airT细胞的至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸替换。
23.如权利要求22所述的airT细胞，其中，被敲除的所述至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。
24.如权利要求21-23中任一项所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。
25.如权利要求24所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
26.如权利要求25所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
27.如权利要求21-26中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。
28.如权利要求21-27中任一项所述的airT细胞，其中，除天然FOXP3基因座之外的所述染色体位点位于所述细胞的T细胞受体α链(TRAC)基因座内，并且在所述染色体位点处插入包含外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子，所述外源的编码FOXP3的多核苷酸与所述组成型活化的启动子可操作地连接。
29.如权利要求1-28中任一项所述的airT细胞，其中，在所述airT细胞中，至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸替换。
30.如权利要求29所述的airT细胞，其中，被敲除的所述至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。
31.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：
(a)编码外源叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因产物的经转导的核酸序列，其中，所述细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及
(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽；
其中，编码所述外源FOXP3基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合；并且
其中，编码所述外源TCR基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
32.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：
(a)已被敲除的天然FOXP3基因座，并通过同源定向修复将FOXP3基因座插入以下的任一项中：(i)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子能够促进FOXP3基因的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录，或(ii)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子与编码外源FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接，并且所述核酸分子组成型地表达所述FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的所述FOXP3表达水平，其中，编码所述组成型活化的启动子或编码与编码外源FoxP3蛋白或其功能衍生物的所述核苷酸序列可操作地连接的所述组成型活化的启动子的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合；以及
(b)已被敲除的天然的T细胞受体α链(TRAC)基因座，并通过同源定向修复将TRAC基因座插入编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸，其中，编码所述外源TCR多肽的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
33.如权利要求31或32所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的核酸序列和编码所述第二CISC组分的核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
34.如权利要求1-33中任一项所述的airT细胞，所述细胞包含各自编码抗原特异性TCR多肽的至少第一经转导的多核苷酸和第二经转导的多核苷酸，其中，所述第一经转导的多核苷酸编码TCR V-α多肽并且所述第二经转导的多核苷酸编码TCR V-β多肽，其中，所述V-α多肽和所述V-β多肽包含能够特异性识别抗原的功能性TCR。
35.如权利要求1-34中任一项所述的airT细胞，所述细胞表达包含抗原特异性TCR多肽的抗原特异性T细胞受体(TCR)，所述TCR多肽由编码所述TCR多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸编码，并且所述TCR能够响应于通过由所述TCR多肽特异性识别的抗原引起的HLA限制性刺激来进行抗原特异性诱导的免疫抑制。
36.如权利要求35所述的airT细胞，其中，所述抗原特异性诱导的免疫抑制包括以下中的一种或多种：(i)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过所述airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子、穿孔素/颗粒酶或抗炎性产物的加工，或在所述airT细胞中诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和抑制性受体的表达中的至少一种，以及(iv)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。
37.如权利要求1-36中任一项所述的airT细胞，其中，所述TCR特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原。
38.如权利要求37所述的airT细胞，其中：
(i)所述自身免疫性病症选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、自身免疫性肝炎、牛皮癣、干燥综合征、或乳糜泻；
(ii)所述过敏性病症选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎；以及
(iii)所述炎性病症选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症。
39.如权利要求38所述的airT细胞，其中：
(i)与所述自身免疫性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的自身抗原，
(ii)与所述过敏性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的过敏性抗原，以及
(iii)与所述炎性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141-图144中任一者或多者中列出的炎症相关抗原。
40.如权利要求1-39中任一项所述的airT细胞，所述细胞包含编码TCR多肽的至少一个经转导的多核苷酸序列，所述TCR多肽以人HLA限制性方式特异性地结合至：选自图141-图144的任一者或多者中列出的所述抗原性多肽序列中的任一项的氨基酸序列或由图139-图140的任一者或多者中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列的不超过35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个连续氨基酸的抗原性多肽表位。
41.如权利要求40所述的airT细胞，所述细胞包含分别编码TCR的TCR V-α多肽和TCRV-β多肽的至少第一经转导的多核苷酸序列和第二经转导的多核苷酸序列，所述TCR以人HLA限制性方式特异性地结合至选自图141-图144的任一者或多者中列出的所述抗原性多肽序列中的任一项的氨基酸序列的不超过35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个连续氨基酸的抗原性多肽表位，或包含图136-图140的任一者或多者中列出的任一TCR-α多肽序列或由图139-图140的任一者或多者中列出的核苷酸序列编码的任一TCR-α多肽序列。
42.如权利要求40所述的airT细胞，所述细胞包含分别编码TCR的TCR V-α多肽和TCRV-β多肽的至少第一经转导的多核苷酸序列和第二经转导的多核苷酸序列，所述TCR以人HLA限制性方式特异性地结合至抗原性多肽，其中，所述TCR V-α多肽和V-β多肽包含选自图143-图144的任一者或多者中列出的任一成对的TCR V-α和V-β多肽序列的成对的序列。
43.如权利要求1-42中任一项所述的airT细胞，其中，相对于在没有抗原的MHC限制性刺激的情况下由airT细胞表现出的Treg生物活性的对照水平，所述细胞表现出响应于由至少一个经转导的多核苷酸编码的TCR多肽识别的抗原对所述airT细胞的MHC限制性刺激而增加的Treg生物活性的诱导水平，其中，所述Treg生物活性包括以下中的一项或多项：(i)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过所述airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子、穿孔素/颗粒酶或抗炎性产物的加工，或在所述airT细胞中诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和抑制性受体的表达中的至少一种，或(iv)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。
44.如权利要求37所述的airT细胞，其中，(1)所述与自身免疫性病症的发病机制相关的抗原为IGRP(241-270)肽，其中，所述自身免疫性病症为1型糖尿病，并且其中，所述TCR为以HLA DRB1*0404限制性方式识别所述IGRP(241-270)肽的TCR T1D4，或(2)所述与自身免疫性病症的发病机制相关的抗原为IGRP(305-324)肽，其中，所述自身免疫性病症为1型糖尿病，并且其中，所述TCR为以HLA DRB1*0404限制性方式识别IGRP(305-324)肽的TCRT1D5。
45.用于治疗、抑制或改善如下的用途中的如权利要求1-43中任一项所述的airT细胞：自身免疫性病症，例如选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎中的一种；过敏性病症，例如选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎中的一种；或炎性病症，例如选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症中的一种。
46.如权利要求45所述的airT细胞，其中，所述TCR多肽结合至与选自以下的紊乱相关的抗原：1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。
47.如权利要求46所述的airT细胞，其中，所述抗原选自于由以下所组成的组：波形蛋白、聚集蛋白聚糖、软骨中间层蛋白(CILP)、前胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、以及烯醇酶。
48.如权利要求46或47所述的airT细胞，其中，所述抗原包含选自于由Enol326、CILP297-1、Vim418、Agg520和SLE3所组成的组中的表位。
49.如权利要求46-48中任一项所述的airT细胞，其中，所述抗原包含具有SEQ ID NO：1363-SEQ ID NO：1376和SEQ ID NO：1408-SEQ ID NO：1415中任一项的氨基酸序列的表位。
50.如权利要求45-49中任一项所述的airT细胞，其中，所述TCR多肽包含：
CD3α多肽，所述CD3α多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项的氨基酸序列；和/或
CD3β多肽，所述CD3β多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项的氨基酸序列。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-50中任一项所述的airT细胞以及药学上可接受的赋形剂。
52.权利要求1-50中任一项所述的airT细胞作为药物的用途。
53.一种产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：
(a)在足以敲除细胞中的天然FOXP3基因座和插入全部或部分FOXP3基因座供体模板核酸的条件和时间下，向CD4+T细胞中引入：(1)FOXP3向导RNA(gRNA)或编码所述FOXP3 gRNA的核酸，所述gRNA包含与所述细胞中的天然叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因内的序列互补的间隔区序列；(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的FOXP3 gRNA形成复合物；以及(3)FOXP3基因座供体模板，所述FOXP3基因座供体模板选自(i)包含能够促进所述FOXP3基因的内源的编码FOXP3的核苷酸序列转录的组成型活化的启动子的核酸分子，和(ii)包含与编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接的组成型活化的启动子的核酸分子；以及
(b)与(a)同时或依次以及以任意顺序，用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸转导所述CD4+T细胞。
54.如权利要求53所述的方法，其中，步骤(b)选自：
(i)用包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的多核苷酸的至少一个逆转录病毒载体转导所述CD4+T细胞，以及
(ii)在足以敲除所述细胞中的所述天然TRAC基因座和插入全部或部分TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向所述CD4+T细胞中引入：(1)T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码TRAC gRNA的核酸，所述gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的序列互补的间隔区序列；(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的TRAC gRNA形成复合物；以及(3)TRAC基因座供体模板，所述TRAC基因座供体模板包含编码所述抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。
55.一种产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：
(a)在足以敲除细胞中的天然TRAC基因座和插入全部或部分第一TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向CD4+T细胞引入：(1)第一T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码第一TRAC gRNA的核酸，所述第一TRAC gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的第一序列互补的第一间隔区序列；(2)第一DNA核酸内切酶或编码所述第一DNA核酸内切酶的核酸，所述第一DNA核酸内切酶能够与(1)的所述第一TRAC gRNA形成复合物；以及(3)第一TRAC基因座供体模板，所述第一TRAC基因座供体模板选自(i)包含编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列的核酸分子，和(ii)包含与编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接的组成型活化的启动子的核酸分子；以及
(b)与(a)同时或依次以及以任意顺序，在足以敲除细胞中的天然TRAC基因座并插入全部或部分第二TRAC基因座供体模板核酸的条件和时间下，向所述CD4+T细胞中引入：(1)第二T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码第二TRAC gRNA的核酸，所述第二TRAC gRNA包含与TRAC基因内的第二序列互补的第二间隔区序列，其中，所述第二间隔区序列与所述第一间隔区序列不同；(2)第二DNA核酸内切酶或编码所述第二DNA核酸内切酶的核酸，所述第二DNA核酸内切酶能够与(1)的第二TRAC gRNA形成复合物，其中，所述第二DNA核酸内切酶选自与第一DNA核酸内切酶相同的DNA核酸内切酶以及与所述第一DNA核酸内切酶不同的DNA核酸内切酶；以及(3)第二TRAC基因座供体模板，所述第二TRAC基因座供体模板包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。
56.一种产生人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括：
在足以敲除细胞中的天然TRAC基因座和通过同源定向修复插入全部或部分TRAC基因座供体模板的条件和时间下，向CD4+T细胞中引入：
(1)T细胞受体α链(TRAC)向导RNA(gRNA)或编码TRAC gRNA的核酸，所述TRAC gRNA包含与所述细胞中的天然TRAC基因座内的序列互补的间隔区序列；
(2)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，所述DNA核酸内切酶能够与(1)的所述TRAC gRNA形成复合物；以及
(3)TRAC基因座供体模板，所述TRAC基因座供体模板包含编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个多核苷酸。
57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中，所述插入供体模板中的第一个进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合，并且
其中，所述插入供体模板中的第二个进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所述第一插入供体模板和所述第二插入供体模板中的至少一个进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。
59.如权利要求53-58中任一项所述的方法，其中，以下中的一项或多项：
(a)所述DNA核酸内切酶选自CRISPR/Cas、TALEN、大范围核酸酶、megaTAL或锌指核酸酶，
(b)所述组成型活化的启动子为MND，
插入通过选自同源定向修复和非同源末端连接的机制进行，
(d)所述第一CISC组分和所述第二CISC组分以相互排斥的方式从IL2RB和IL2RG中选择，
(e)所述第三CISC组分为FKBP，以及
(f)所述CISC诱导物分子为雷帕霉素。
60.一种产生权利要求1-50中任一项所述的人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞的方法，所述方法包括实施权利要求53-59中任一项所述的方法。
61.一种用于治疗或改善患有需要抗原特异性免疫抑制的病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的多个权利要求43所述的人工免疫调控性T(airT)细胞，其中，所述airT细胞表达至少一种T细胞受体(TCR)，所述TCR特异性地识别需要抗原特异性免疫抑制的抗原。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述需要抗原特异性免疫抑制的病症为自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症。
63.如权利要求62所述的方法，其中：
(i)所述自身免疫性疾病选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎；
(ii)所述过敏性疾病选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎；以及
(iii)所述炎性病症选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症。
64.如权利要求63所述的方法，其中：
(i)与所述自身免疫性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图144中任一者或多者列出的自身抗原，
(ii)与所述过敏性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图143中任一者或多者列出的过敏性抗原，以及
(iii)与所述炎性病症的发病机制相关的抗原选自图141-图144中任一者或多者列出的炎症相关抗原。
65.一种治疗或改善患有紊乱的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予权利要求1-50中任一项所述的人工免疫调控性T(airT)细胞。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述紊乱选自于由如下所组成的组：1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮或自身免疫性肝炎；过敏性病症，例如选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎中的一种；或炎性病症，例如选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症中的一种。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中，所述TCR多肽结合至与选自1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)的紊乱相关的抗原。
68.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中，所述TCR多肽与选自于由以下所组成的组中的抗原结合：波形蛋白、聚集蛋白聚糖、软骨中间层蛋白(CILP)、前胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、以及烯醇酶。
69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，其中，所述TCR多肽与包含表位的抗原结合，所述表位具有SEQ ID NO：1363-SEQ ID NO：1376和SEQ ID NO：1408-SEQ ID NO：1415中任一项所述的氨基酸序列。
70.如权利要求65-69中任一项所述的方法，其中，所述TCR多肽包含：
CD3α多肽，所述CD3α多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项所述的氨基酸序列；和/或
CD3β多肽，所述CD3β多肽具有SEQ ID NO：1377-SEQ ID NO：1390中任一项所述的氨基酸序列。
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