KR20190038479A - 유전자 조작된 세포 및 그의 제조방법 - Google Patents

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KR20190038479A
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grna molecule
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블리쓰 세이더
지. 그랜트 웰스테드
데이비드 에이. 범크롯
아리 이. 프리드랜드
존 존스
모건 엘. 매더
크리스 나이
유제니오 마르코 루비오
루쓰 살먼
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
에디타스 메디신, 인코포레이티드
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Abstract

표적 핵산 서열의 편집 또는 표적 핵산 서열의 발현의 조절을 위한 CRISPR/CAS-관련 방법, 조성물 및 구성성분, 및 조작된 T 세포 또는 T 세포 전구체의 입양 전달을 포함하는 암 면역요법과 관련된 그의 적용법이 제공된다.

Description

유전자 조작된 세포 및 그의 제조 방법
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은, 각각의 내용이 본 명세서에서 전문에 대해 참조로 포함되는 것으로, "유전자 조작된 세포 및 그의 제조 방법"이라는 명칭 하에 2016년 5월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/333,144호 및 "암 면역요법을 위한 CRISPR-CAS-관련 방법, 조성물 및 성분"이라는 명칭 하에 2016년 5월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/332,657호로부터의 우선권을 주장한다.
서열목록의 참조 포함
본 출원은 전자문서 형식의 서열목록과 함께 출원 계류 중이다. 서열목록은 2017년 5월 4일자로 생산된 735042006440SEQLIST.TXT라는 파일명의 파일로서 제공되며, 그 크기는 12,031,926 바이트이다. 전자문서 형식의 서열목록 내의 정보는 그 전문이 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 표적 핵산 서열을 편집하거나, 또는 표적 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 CRISPR/CAS-관련 방법, 조성물 및 성분, 및 이들의, 조작된(engineered) T 세포 또는 T 세포 전구체의 입양 전달(adoptive transfer)을 포함하는 암 면역요법과 관련된 적용에 관한 것이다.
입양 요법을 위한 조작된 세포의 생산 및 투여를 위한 다양한 전략이 이용 가능하다. 예를 들어, CAR과 같은 유전자 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포의 조작 및 세포에서 유전자 발현의 억제 또는 저해를 위한 전략이 이용 가능하다. 예를 들어, 대상체에의 투여 시에 효과기 기능의 억제를 피하고, 세포의 활성 및/또는 생존을 개선함으로써, 세포의 효능을 개선하기 위한 개선된 전략이 필요하다. 이러한 필요를 충족시키는 방법, 세포, 조성물, 키트, 및 시스템이 제공된다.
예를 들어, 대상체에서 질병 및/또는 질환을 치료하기 위해, 예컨대 입양 세포 요법에서 사용하기 위한 것으로, 재조합 수용체를 함유하는 조작된 면역 세포 및 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴 또는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 이러한 조성물 또는 세포를 생산시키거나, 발생시키기 위한 방법, 이러한 조성물 또는 세포를 이용하는 세포, 세포 집단, 조성물, 및 방법이 제공된다. 이러한 조성물 및 세포는 일반적으로, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴 또는 발현의 저해 또는 감소, 또는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 포함한다. 또한, 예를 들어, 대상체에서 질병 및/또는 질환을 치료하기 위한 입양 세포 요법을 위해, 제공되는 조성물, 유전자 조작된(재조합) 세포 표면 수용체를 발현하고, PDCD1유전자의 유전자 붕괴를 함유하는 세포 집단 또는 세포, 예컨대 이러한 방법에 의해 생산된 것을 대상체에 투여하기 위한 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 함유하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/유도하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일부 구현예에서, 조성물은, 그의 표면에 재조합 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; and (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 함유하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 함유하는 조성물이 제공되고, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시키고, 조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 또는 약 90% 초과가 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자를 함유하지 않고, PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나, 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 또는 약 90% 초과가 유전자 붕괴를 함유하고, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체로서, 재조합 수용체와 상기 항원의 결합시, 조작된 면역 세포가 세포독성, 증식 및/또는 사이토카인의 분비를 유도할 수 있는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 함유하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 함유하는 조성물이 제공되고, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시킬 수 있고, 선택적으로 상기 방지 또는 감소는 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포의 집단을 함유하는 세포 집단을 함유하는 조성물이 제공되고, 각각은 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 함유하고, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시킬 수 있고, 조작된 면역 세포는 평균적으로, 각각, 조성물 중, 재조합 수용체를 함유하고, 유전자 붕괴를 함유하지 않는 다른 세포에서 상기 재조합 수용체의 평균 발현 및/또는 표면 발현 수준과 비교하여, 동일하거나, 대략적으로 동일하거나, 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타내거나, 조작된 면역 세포는 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 평균적으로, 각각, 조성물 중, 재조합 수용체를 함유하고, PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 세포에서 평균 발현 및/또는 표면 수준과 비교하여, 동일하거나, 대략적으로 동일하거나, 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는, 항원, 항원을 발현하는 세포, 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 조작된 T 세포를 활성화시키거나, 자극할 수 있거나, 면역 세포에 의한 세포독성을 유도할 수 있거나, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있고, 이는, 선택적으로 시험관내 분석, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 함유하는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는, 항원, 항원을 발현하는 세포, 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있고, 이는, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 함유하고, 선택적으로, 면역 세포를 PD-L1-발현 세포에 노출시키는 단계를 함유하거나, 함유하지 않는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같다.
일부 구현예에서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비의 수준 또는 정도 또는 범위 또는 지속기간은, 동일한 조건 하에 평가하는 경우, 재조합 수용체를 함유하나, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 함유하지 않는 면역 세포에서 검출되거나, 관찰된 것과 비교하여, 동일하거나, 대략적으로 동일하거나, 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비는 선택적으로, 회수 및 항원, 항원-발현 세포, 및/또는 물질에의 재노출 후, 시험관내 분석에서 측정된 바와 같다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 백혈구, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포를 함유하는 복수의 T 세포를 함유하고, 단리된 CD8+ 세포를 함유하거나, CD8+ T 세포에 대해 농화(enriching)되고, 단리된 CD4+ T 세포를 함유하거나, CD4+ 세포에 대해 농화되고/농화되거나, 나이브 세포(naive cell), 효과기 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 효과기 기억 세포 및 장기-생존 효과기 기억 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 이들의 하위세트에 대해 농화된다. 일부 구현예에서, 조성물 중, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는 T 세포 또는, 수용체를 발현하고, 유전자 붕괴를 함유하는 T 세포의 백분율은, 조성물과 동일하거나, 실질적으로 동일하나, 유전자 붕괴를 함유하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포 집단과 동일하거나, 실질적으로 동일하다.
일부 구현예에서, 조성물 중, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율은, 선택적으로 면역 세포를 PD-L1에 접촉시키거나, 노출시키는 단계의 부재 또는 존재 하에 비교하여, 동일한 조건 하에서 평가하는 경우, 조성물 중, 재조합 수용체를 함유하나, PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 함유하지 않는 T 세포를 함유하는 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율과 비교하여, 동일하거나, 대략적으로 동일하거나, 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 표현형은 약 또는 37℃± 2℃에서 적어도 12시간, 24시간, 48시간, 96시간, 6일, 12일, 24일, 36일, 48일 또는 60일 동안 조성물의 인큐베이션 후, 평가된 바와 같다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 시험관내에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 자극제의 존재 하에 수행되고, 적어도 일부는 선택적으로 최대 1시간, 6시간, 24시간, 또는 48시간의 인큐베이션 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제이다. 일부 구현예에서, 자극제는 CD3 항체에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 함유하는 T 세포는 CCR7+, 4-1BB+(CD137+), TIM3+, CD27+, CD62L+, CD127+, CD45RA+, CD45RO-, t-betlow, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ 또는 LFA-1+로부터 선택되는 하나 이상의 표현형 마커를 함유한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 예컨대 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체에 함유된 항체 단편은 단일 사슬 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 단편은 scFv를 함유한다.
일부 구현예에서, 항원은 질병 또는 장애, 예컨대 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암과 관련된 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체가 결합하는 항원은 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린(mesothelin), CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스(Wilms) 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1) 또는 인터루킨 12로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 ITAM을 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역, 예컨대 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 함유하는 공자극 신호전달 영역을 추가로 함유한다.
일부 구현예에서, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제는 (a) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA) 또는 (b) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 적어도 하나를 함유한다. 일부 구현예에서, 제제는 PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 함유한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(5' anti-Reverse Cap Analog)(ARCA) 캡을 함유한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 함유하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 함유하는 표적화 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 S. 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9이다. 일부 조성물에서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 함유하는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 함유하는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다.
본 명세서에서 제공되는 구현예 중 일부에서, 유전자 붕괴는 PDCD1 유전자에 이중 가닥 파손을 생산하고, 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선하여, 삽입 및 결실(삽입결실(indel))을 야기하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있다.
일부 구현예에서, 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 세포는, 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포에 대해 농화되지 않거나, 선택되지 않는다.
일부 구현예에서, 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포에서 평균적으로 2개 이하, 5개 이하 또는 10개 이하의 다른 유전자가 붕괴되어 있거나, 제제에 의해 붕괴되며, 예컨대 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포의 다른 유전자가 세포 내에서 붕괴되어 있지 않거나, 제제에 의해 붕괴되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물 중 임의의 것은 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 추가로 함유한다.
또한 본 명세서에서는 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 이는 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 면역 세포 내로 도입시키는 단계; 및 (b) (i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 면역 세포 내로 도입시키는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 이는 (i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를, 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포 내로 도입시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함한다.
일부 구현예에서, 도입은 시험관내에서 세포와 제제 또는 그의 일부를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제의 도입은 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 세포와 제제의 접촉 단계 전에, 그동안 또는 그 후에 또는 전기천공 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, (a)에서의 도입은 형질도입을 포함하고, 도입은 형질도입 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 (i) IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인, 및/또는 (ii) 선택적으로 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 자극제 또는 활성화제 또는 제제들의 존재 하에 이루어진다. 일부 구현예에서, (a)에서의 도입은 형질도입 전에, 20 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 100 U/mL의 농도의 IL-2; 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 약 10 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 형질도입 후에, 10 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 50 U/mL의 농도의 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 선택적으로 약 0.5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 독립적으로 최대 또는 대략 24, 36, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일, 예컨대 24시간 내지 48시간 또는 36시간 내지 48시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000개의 세포당 대략 1 마이크로그램의 비율로 제제와 접촉된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 30℃± 2℃ 내지 39℃± 2℃의 온도에서 이루어지거나; 인큐베이션은 적어도 또는 적어도 약 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃의 온도에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃± 2℃에서 이루어지며, 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃± 2℃에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 이 방법은 (a)에서의 도입과 (b)에서의 도입 사이에 세포를 휴지시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 구현예 59 내지 78에서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 포함하는 표적화 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 S. 아우레우스 Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, 유전자 붕괴는 PDCD1 유전자에 이중 가닥 파손을 생산하고, 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선하여, 삽입 및 결실(삽입결실)을 야기하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 단일 사슬 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 질병 또는 장애, 예컨대 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암과 관련된 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체가 결합하는 것은 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1) 또는 인터루킨 12로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역, 예컨대 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 함유하는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 벡터를 인코딩하는 핵산은 도입은 형질도입에 의해 이루어지며, 이는 선택적으로 레트로바이러스 형질도입이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 백혈구, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 T 세포이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것은 복수의 면역 세포에서 수행한다.
일부 구현예에서, 제제를 도입하고, 재조합 수용체를 도입한 후, (a) 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 세포를 농화시키거나, 이를 선택한다. 일부 구현예에서, 이 방법 중 임의의 것은 (a) 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 농화하거나, 이를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 방법 중 임의의 것은 약 또는 37℃± 2℃에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 일괄하여, 약 또는 1시간 내지 약 또는 96시간, 약 또는 4시간 내지 약 또는 72시간, 약 또는 8시간 내지 약 또는 48시간, 약 또는 12시간 내지 약 또는 36시간, 약 또는 6시간 내지 약 또는 24시간, 약 또는 36시간 내지 약 또는 96시간의 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 인큐베이션의 일부는 자극제의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 CD3 항체에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것은 이 방법에 의해 생산된 세포를 약제학적으로 허용 가능한 완충액 중에 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것은 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 1) 유전자 붕괴를 포함하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 포함하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나; 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 유전자 붕괴를 포함하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포의 집단을 생산한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것은 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/이거나; 재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과가 유전자 붕괴를 포함하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포의 집단을 생산한다.
본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있다.
일부 구현예에서, 또한 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 또한 본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 복수의 유전자 조작된 면역 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 1) 유전자 붕괴를 포함하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 포함하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나; 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 유전자 붕괴를 포함하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 이러한 유전자 조작된 면역 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/이거나; 재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과가 유전자 붕괴를 포함하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 복수의 유전자 조작된 면역 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 또한 본 명세서에서 제공되는 유전자 조작된 면역 세포 중 임의의 것 또는 본 명세서에서 제공되는 복수의 유전자 조작된 면역 세포 중 임의의 것 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 또한 질병 또는 질환을 가진 대상체에 본 명세서에서 제공되는 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환, 예컨대 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병과 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 또한 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 데 사용하기 위해, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물 중 임의의 것이 제공된다.
일부 구현예에서, 사용하기 위한 약제학적 조성물 중 임의의 것에서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환, 예컨대 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병과 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서는 T 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포를 변경시키는 방법이 제공되고, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것이다. 일부 예에서, 암은 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프모구 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신장 세포 암종(RCC), 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑생종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, T 세포는, 암을 가지거나, 그렇지 않으면, PDCD1 유전자의 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이로부터 이점을 얻을 수 있는 대상체로부터 유래한 것이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 접촉은 생체외에서 수행된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것이고, 접촉은 생체외에서 수행되며, 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 접촉 전에 형성된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 구현예에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 그의 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다.
일부 양태에서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함한다. 일부 경우에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조되었다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니다. 일부 경우에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기 천공을 통해 T 세포 내로 전달된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 일부 예에서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다. 일부 예에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, 단일 gRNA 분자는 다음의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함한다: GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514); CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582); 또는 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723).
일부 구현예에서, Cas9 분자는 닉카제(nickase)이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다. 일부 경우에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 예에서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함한다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CUACAACUGGGCUGGCGGCC(SEQ ID NO: 766); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); 또는 ACCGCCCAGACGACUGGCCA(SEQ ID NO: 581) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511). 일부 경우에서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함한다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ I GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511).D NO:510); 또는 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자(들)는 모듈 gRNA 분자(들)이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)이다.
일부 구현예에서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 60%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 80%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 90%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 5개 미만의 비표적(off-target)을 생산한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개 미만의 엑손 비표적을 생산한다. 일부 양태에서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인된다. 일부 예에서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인된다.
본 명세서에서는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 제공되고, gRNA 분자는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유하고, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나, 3' 폴리A 꼬리를 함유한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 예에서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 경우에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 함유하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니다. 일부 예에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드이다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다. 일부 예에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 경우에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514); CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582); 또는 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723).
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다. 일부 경우에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 예에서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CUACAACUGGGCUGGCGGCC(SEQ ID NO: 766); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); 또는 ACCGCCCAGACGACUGGCCA(SEQ ID NO: 581) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511). 일부 예에서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); 또는 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511).
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 함유한다.
본 명세서에서는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유하는 gRNA 분자가 제공되고, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나, 3' 폴리A 꼬리를 함유한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있다. 일부 경우에서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 양태에서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함한다. 일부 예에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드를 함유하는 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드를 함유하는 3' 폴리A 꼬리를 함유한다.
일부 구현예에서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된다. 일부 예에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 함유하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니다. 일부 경우에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드이다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 S. 피오게네스 gRNA 분자이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514); CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582); 또는 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723). 일부 경우에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514); 또는 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723). 일부 예에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); ACCGCCCAGACGACUGGCCA(SEQ ID NO: 581) 및 CUACAACUGGGCUGGCGGCC(SEQ ID NO: 766). 일부 예에서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택된다: GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); CUACAACUGGGCUGGCGGCC(SEQ ID NO: 766).
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자이다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 함유한다.
본 명세서에서는 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 이식을 위한 세포를 제조하는 방법이 제공되고, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유한다. 일부 경우에서, gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 함유하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 일부 양태에서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 그의 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 예에서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함한다. 일부 경우에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 경우에서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조되었다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니다. 일부 경우에서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드이다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기천공을 통해 세포 내로 전달된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, 단일 gRNA 분자는 다음의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 함유한다: GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514); CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582); 또는 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723).
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, Cas9 분자는 닉카제이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는 S. 피오게네스 Cas9 분자이다. 일부 예에서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함한다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 576); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CUACAACUGGGCUGGCGGCC(SEQ ID NO: 766); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511); UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579) 및 GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(SEQ ID NO: 512); 또는 ACCGCCCAGACGACUGGCCA(SEQ ID NO: 581) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511).
일부 예에서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함한다: CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508); CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGGCGGUGCUACAACUGGGC(SEQ ID NO: 510); 또는 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(SEQ ID NO: 511).
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자(들)는 모듈 gRNA 분자(들)이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)이다. 일부 예에서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 함유한다. 일부 예에서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 함유한다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 60%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 80%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 90%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시킨다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 5개 미만의 비표적을 생산한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개 미만의 엑손 비표적을 생산한다. 일부 양태에서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인된다. 일부 예에서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인된다.
우선 도면을 간략하게 설명한다.
도 1a 내지 도 1g는 몇몇 예시적인 gRNA의 대표 예이다.
도 1a는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes(S. 피오게네스))로부터 부분적으로 유래된(또는 부분적으로 서열 상에서 모델링된) 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 42 및 43);
도 1b는 이중가닥 구조로서 S. 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자(또는 키메라) gRNA 분자를 도시한다(SEQ ID NO: 44);
도 1c는 이중가닥 구조로서 S. 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(SEQ ID NO: 45);
도 1d는 이중가닥 구조로서 S. 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(SEQ ID NO: 46);
도 1e는 이중가닥 구조로서 S. 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(SEQ ID NO: 47);
도 1f는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus(S. 써모필루스))로부터 부분적으로 유래된 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 48 및 49);
도 1g는 S. 피오게네스및 S. 써모필루스의 모듈 gRNA 분자의 정렬을 도시한다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 50 내지 53).
도 2a 내지 도 2g는 문헌[Chylinski et al., RNA Biol. 2013; 10(5): 726-737]으로부터의 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "y"로 표시한다. 다른 2개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "b"로 표시한다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고 "g"로 표시한다. Sm: S. 뮤탄스(S. mutans)(SEQ ID NO: 1); Sp: S. 피오게네스(SEQ ID NO: 2); St: S. 써모필루스(SEQ ID NO: 3); Li: L. 이노큐아(L. innocua)(SEQ ID NO: 4). 모티프: 이는 4개의 서열에 기반한 모티프이다: 4개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 한 글자 아미노산 약어로 표시되고; "*"는 4개 서열 중 어떤 것의 상응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하며; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 임의의 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시한다.
도 3a 내지 3b는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 54 내지 103). 도 3b의 마지막 선은 4개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 104 내지 177). 도 4b의 마지막 선은 3개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 178 내지 252). 도 5c의 마지막 선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 6a 내지 6b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 SEQ ID NO: 253 내지 302). 도 6b의 마지막 선은 3개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 7a 내지 7b는 S. 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis(N. 메닌기티디스))로부터 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "Y"로 표시된다. 다른 2개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "B"로 표시된다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "G"로 표시된다. Sp: S. 피오게네스; Nm: N. 메닌기티디스. 모티프: 이는 2개의 서열에 기반한 모티프이고: 2개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 단일 아미노산 표기로 표시되며; "*"는 임의의 2개의 서열의 상응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하고; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하며, "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하거나, 없음을 표시한다.
도 8은 N. 메닌기티디스의 Cas9를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 303)을 나타낸다. "R"로 표시되는 서열은 SV40 NLS이고; "G"로 표시되는 서열은 HA 태그이며; "O"으로 표시되는 서열은 합성 NLS 서열이고; 남아있는(표시 없음) 서열은 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame: ORF)이다.
도 9a는 Cas9의 2개의 로브(lobe)(인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브)에 대해 아미노산 위치를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9의 도메인 조직화 및 Cas9 도메인의 조직화의 개략적 표현을 나타낸다.
도 9b는 S. 피오게네스 Cas9의 도메인 조직화의 개략적 표현 및 83개의 Cas9 오솔로그에 걸친 각각의 도메인의 백분율 상동성을 나타낸다.
도 10a는 이중가닥 구조로서 S. 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(SEQ ID NO: 40).
도 10b는 이중가닥 구조로서 S. 아우레우스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(SEQ ID NO: 41).
도 11은 S. 아우레우스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 TRBC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293은 2개의 플라스미드(하나는 S. 아우레우스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRBC2 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 요약한다.
도 12는 S. 피로게네스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 TRBC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293개 세포는 2개의 플라스미드(하나는 S. 피오게네스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRBC1과 TRBC2 좌위 둘 모두에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 13은 S. 아우레우스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293개 세포는 2개의 플라스미드(하나는 S. 아우레우스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 14는 S. 피오게네스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293개 세포는 2개의 플라스미드(하나는 S. 피오게네스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 15는 S. 아우레우스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293개 세포는 2개의 플라스미드(하나는 S. 아우레우스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 16은 S. 피오게네스 Cas9를 이용하여 293개 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293개 세포는 2개의 플라스미드(하나는 S. 피오게네스 Cas9를 인코딩하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 인코딩함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중 반복 실험용 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c는 S. 피오게네스Cas9 mRNA 및 TRBC 및 TRAC 유전자 특이적 gRNA의 전달에 기인하는 CD4+ T 세포에서 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 17a는 S. 피오게네스Cas9 mRNA 및 표시된 gRNA(TRBC-210 (GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(SEQ ID NO: 413), TRAC-4(GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(SEQ ID NO: 453) 또는 AAVS1(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(SEQ ID NO: 51201))로 전기천공되고, APC-CD3 항체를 이용하여 염색되고, FACS에 의해 분석된 CD4+ T 세포를 나타내다. 세포는 전기천공법 후 제2일 및 제3일에 분석하였다.
도 17b는 (A)에서 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 17c는TRBC2 및TRAC 좌위 상에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도 18a 내지 도 18c는 S. 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC 유전자의 전달에 기인하는 주카트(Jurkat) T 세포의 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 18a는 S. 아우레우스 Cas9/gRNA TRAC-233(GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA)(SEQ ID NO: 474) RNP 표적화 TRAC 유전자를 이용하여 전기천공되고, APC-CD3 항체로 염색되며, FACS에 의해 분석된 주카트 T 세포를 나타낸다. 세포를 전기천공법 후 제1일, 제2일 및 제3일에 분석하였다.
도 18b는 (A)에서 플롯으로부터 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 18c는 TRAC 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도19는 5' ARCA 캡의 구조를 나타낸다.
도 20은 Cas9 mRNA 및 AAVS1 gRNA를 이용하는 전기천공법 후 살아있는 주카트 T 세포의 정량화로부터의 결과를 도시한다. 주카트 T 세포는 S. 피오게네스Cas9 mRNA 및 각각의 변형된 gRNA를 이용하여 전기천공되었다. 전기천공법 후 24시간에, 1 x 105개 세포를 15분 동안 실온에서 FITC-컨쥬게이팅된 아넥신-V(Annexin-V) 특이적 항체를 이용하여 염색한 다음, 유세포 분석에 의한 분석 직전에 요오드화 프로피디움을 이용하여 염색하였다. 아넥신-V 또는 PI 중 하나에 대해 염색하지 않은 세포의 백분율을 막대 그래프로 제시한다.
도 21a 내지 도 21c는 S. 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC의 전달에 기인하는 나이브 CD3+ T 세포에서의 CD3 발현의 상실을 도시한다.
도 21a는 S. 아우레우스 Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(SEQ ID NO: 474)를 지님)) RNP 표적화 TRAC을 이용하여 전기천공된 나이브 CD3+ T 세포가 APC-CD3 항체로 염색되고, FACS에 의해 분석된 것을 도시한다. 세포를 전기천공법 후 제4일에 분석하였다. 음성 대조군은 기능성 Cas9가 없는 표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(SEQ ID NO: 474)를 지니는 gRNA를 지니는 세포이다.
도 21b는 도 21a에서의 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 도시한다.
도 21c는 TRAC 좌위에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 도시한다.
도 22는 S. 피오게네스Cas9 mRNA 및 PDCD1 gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)을 지님) 또는 S. 피오게네스Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)을 지님) RNP 표적화 PDCD1의 전달 후 주카트 T 세포 내 PDCD1 좌위에서의 게놈 편집을 도시한다. 24시간, 48시간 및 72시간에 PDCD1 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과의 정량화. 더 고수준의 NHEJ%를 청구된 예시적 표적 gRNA(SEQ ID NO: 508)를 사용하여, RNP 대 mRNA 전달에 의해 검출하였다.
도 23은 PDCD1 좌위를 표적화하는 상이한 표지 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 일차 T 세포를 전기천공한 후 PD-1 표면 발현에 음성인 세포의 백분율을 도시한다.
도 24a는 PDCD1을 표적화하는 S. 피오게네스 Cas9/gRNA RNP의 전달 후, 활성화된 일차 T 세포에서 PDCD1 좌위에서의 유전자 편집을 도시한다. 다수의 건강한 공여체로부터 단리된 일차 CD4 T 세포를 동일한 RNP로 처리하고, PDCD1 발현을 재활성화 후 유동 세포계측에 의해 평가하였다. 다수의 실험으로부터의 PDCD1 음성 세포의 백분율의 평균을 도시하고, 표준 편차를 오차 막대로 도시하였다.
도 24b는 PDCD1 좌위 또는 대조군 AAVS1 좌위를 표적화하는 상이한 표지 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP에 의한 전기천공 후, 일차 CD4+ T 세포에서의 CD4 및 PD-1의 표면 발현을 도시한다.
도 25는 PDCD1 좌위 또는 대조군 AAVS1 좌위를 표적화하는 상이한 표지 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP에 의한 전기천공 후, 일차 CD8+ T 세포에서의 CD45RA 및 CD62L의 표면 발현을 도시한다.
도 26은PDCD1 좌위(PD-1KO)를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP, AAVS1 대조군(AAVS1-KO) 또는 비처리 대조군을 표적화하는 Cas9/gRNA RNP에 의한 전기천공 후, 항-CD19 CAR 또는 모의 형질도입 대조군(모의)에 의해 형질도입된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에서의 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 발현에 대한 PD-1 및 대용 마커(EGFRt)의 표면 발현을 도시한다.
도 27a 및 도 27b는 PDCD1 좌위(PD-1KO)를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP, 또는 AAVS1 대조군(AAVS1-KO)를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP에 의한 전기천공 후, 항-CD19 CAR(CAR) 또는 모의 형질도입 대조군(모의)에 의해 형질도입된 CD8+(도 27a) 또는 CD4+(도 27b) T 세포에서의 T 세포 표면 마커 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 표면 마커 CD45RA, CD69, 41BB, CCR7, CD27, CD25, CD62L, TIM3, 및 CD45RO의 MFI가 도시되어 있다.
도 28a는 PDCD1 좌위(PD-1KO)를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP 또는 AAVS1 대조군(AAVS1-KO)를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP에 의한 전기천공 후, 항-CD19 CAR(CAR+) 또는 모의 형질도입 대조군(모의)에 의해 형질도입된 T 세포의 PDCD1 좌위에서 삽입결실을 함유하는 세포의 백분율을 도시한다. 도 28b는 사용된 PDCD1 gRNA와 대비하여, 각각의 위치에서 결실 또는 삽입을 함유하는 MiSeq 서열분석 분석으로부터의 상대적 판독결과 수를 도시한다. 가이드 RNA의 위치는 x-축 상의 위치 60 주위에 진한 수직선으로 도시되어 있다.
도 29는 항-CD19 CAR(CAR+) 또는 모의 형질도입 대조군(모의)에 의해 형질도입되고, PDCD1 좌위를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP, 또는 AAVS1 대조군을 표적화하는 Cas9/gRNA RNP에 의해 전기천공된 일차 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 T 세포 증식을 도시한다. CD19-발현 세포 또는 ROR-1-발현 대조군 세포와의 공동 배양 후, T 세포 증식을 평가하였으며, 이는 CellTrace™ 바이올렛을 사용하여 측정된 바와 같다.
도 30a 내지 도 30c는 CD19-발현 세포 또는 ROR-1-발현 대조군 세포와의 공동 배양 후, 항-CD19 CAR(CAR+) 또는 모의 형질도입 대조군(모의)에 의해 형질도입되고, PDCD1 좌위를 표적화하는 Cas9/gRNA RNP, 또는 AAVS1 대조군을 표적화하는 Cas9/gRNA RNP에 의해 전기천공된 일차 T-세포의 세포 상청액 내의 사이토카인 분비를 도시한다. 도 30a는 세포 상청액 내의 IFN-γ를 도시한다. 도 30b는 세포 상청액 내의 인터루킨-2(IL-2) 분비를 도시한다. 도 30c는 세포 상청액 내의 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 분비를 도시한다.
도 31은 S. 피오게네스D10A 또는 N863A 닉카제 RNP의 쌍으로 처리된 활성화된 CD4 T 세포를 도시한다. PMA/IO에 의한 재자극 후, PDCD1의 발현을 PE-접합된 항-PDCD1 항체를 사용하여 유동 세포계측에 의해 평가하였다. PDCD1 음성 세포의 백분율을 이중 반복 실험용 샘플의 표준 편차를 나타내는 오차 막대에 의한 그래프로 나타내었다. 샘플 25 및 26은 음성 대조군으로 작용하는 단일 gRNA를 갖는 D10A 및 N863A이며, 샘플 27은 양성 대조군으로 작용하는 단일 gRNA을 갖는 야생형 Cas9이다.
I. 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 PD-1 넉아웃의 표적화
트랜스제닉 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포, 예컨대 T 세포 및 NK 세포를 포함하는 세포 및 세포 조성물이 제공된다. 세포는 일반적으로, 이러한 재조합 수용체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 산물의 도입에 의해, 조작된다. 특히, 이러한 재조합 수용체는 활성화, 자극 및 공자극 CAR을 포함하는 조작된 TCR 및 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이들의 조합을 포함하는 유전자 조작된 항원 수용체이다. 제공되는 세포는 또한 프로그래밍된 사멸-1(PD-1) 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 갖는다. 또한, 이러한 유전자 조작된 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 및 조성물은 입양 세포 요법, 예를 들어 입양 면역요법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공되는 세포, 조성물 및 방법은 프로그래밍된 사멸-1(PD-1)과 그의 리간드 PD-L1 사이의 저해 상호작용에 관여하는 T 세포 저해 경로 또는 신호의 효과를 변경시키거나, 감소시킨다. 일부 구현예에서, 공자극 저해 수용체 또는 그의 리간드 중 하나 또는 둘 모두의 상향 조절 및/또는 발현은 T 세포 활성화 및 T 세포 기능을 음성적으로 제어할 수 있다. PD-1(각각 SEQ ID NO: 51207 및 51208에 제시된 예시적 아미노산 및 인코딩 핵산 서열)은, B7:CD28 공자극 분자 부류에 속하고, 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2와 반응하여, T 세포 기능을 저해하는 면역 저해 수용체이다. PD-L1(각각 SEQ ID NO: 51209 및 51210에 제시된 예시적 아미노산 및 인코딩 핵산 서열; 또한 GenBank 수탁번호 AF233516 참조)은 주로, 항원 제시 세포 또는 암 세포에서 발현되는 것으로 보고되었으며, 여기서 T-세포 발현 PD-1과 상호작용하여, T 세포의 활성화를 저해한다. 일부 경우에서, PD-L1은 또한 T 세포에 발현되는 것으로 보고된 바 있다. 일부 경우에서, PD-1과 PD-L1의 상호작용은 세포독성 T 세포의 활성을 억제하며, 일부 양태에서, 종양 면역을 저해하여, 종양 세포의 면역 탈출을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 종양 미세환경에서의 PD-1 및 PD-L1의 발현은 입양 T 세포 요법의 역가 및 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 이러한 저해 경로는 달리는, 입양 세포 요법과 관련된 요망되는 특정 효과기 기능을 손상시킬 수 있다. 종양 미세환경에서 종양 세포 및/또는 세포는 종종 PD-1의 리간드(예컨대, PD-L1 및 PD-L2)를 상향 조절하고, 결과적으로 PD-1을 발현하는 종양-특이적 T 세포에서의 PD-1의 결찰을 유도하여, 저해 신호를 전달한다. PD-1은 또한 종종, 종양 미세환경에서 T 세포, 예를 들어 종양-침윤 T 세포에서 상향 조절되어, 항원 수용체를 통한 후속 신호전달 또는 다른 특정 활성화 신호를 발생시킬 수 있다.
일부 경우에서, 이러한 사건은, PD-L1을 발현하는 다른 세포의 근위에 존재하는 경우와 같이, 유전자 조작된(예를 들어, CAR+) T 세포가 고갈된 표현형을 획득하는 데 기여함으로써, 결과적으로, 감소된 기능성을 야기할 수 있다. T 세포의 고갈은 T 세포 기능의 진행성 상실 및/또는 세포의 결실을 야기할 수 있다(문헌[Yi et al.(2010) Immunology, 129:474-481]). T 세포 고갈 및/또는 T 세포 지속의 결여는 입양 세포 요법의 효능 및 치료 결과의 한계이며, 임상 시험은 항원 수용체(예를 들어,CAR)-발현 세포에 대한 더 강력하고/강력하거나, 더 장기간의 노출 정도와 치료 결과 사이의 상관관계를 밝혀내었다.
특정 방법은 암 요법과 관련하여 PD-1 신호 전달을 차단하거나, T 세포에서 PD-1 발현을 붕괴하는 것을 목적으로 하였다. 이러한 차단 또는 붕괴는 차단 항체, 소분자 또는 저해 펩타이드의 투여를 통하거나, T 세포, 예를 들어 입양에 의해 전달된 T 세포에서 PD-1의 발현의 넉아웃 또는 감소를 통해 이루어질 수 있다. 그러나, 전달된 T 세포에서 PD-1의 붕괴는 전적으로 충분한 것이 아닐 수 있다. 일부 경우에서, PD-1을 인코딩하는 유전자의 붕괴가 영구적이지 않아서, 세포 표면에서의 PD-1 발현의 제거가 단지 일시적인 것일 수 있다. 다른 양태에서, 세포에서의 유전자 붕괴 효율이 충분히 높지 않음으로써, 붕괴를 위해 표적화된 세포 중 상대적으로 많은 수가 표적화된 유전자의 발현을 보유한다. 일부 경우에서, CRISPR/Cas9를 사용하는 것과 같은 특정 붕괴 방법은 제한된 절단 특이성으로 인해 비표적 효과를 유발할 수 있으며, 이는 비 표적 유전자 또는 유전자들의 비특이적 붕괴를 야기할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 문제는, 유전자(예를 들어, PD-1)의 붕괴가 요망되는 조작된 세포의 효능을 제한할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공되는 세포, 조성물 및 방법은 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서, PDCD1의 발현의 감소, 결실, 제거, 넉아웃 또는 붕괴를 유발한다. 일부 양태에서, 이러한 붕괴는, 예컨대, 붕괴되는 PD-1 유전자(PDCD1)에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 다발형의 규칙적으로 산재된 짧은 앞뒤역순상동서열의 핵산(CRISPR)-Cas 시스템과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용한 유전자 편집에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, PDCD1 좌위 영역을 표적화하는 표적화 도메인을 함유하는 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9를 함유하는 제제를 세포 내로 도입시킨다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 PDCD1-표적화된 표적화 도메인을 함유하는 gRNA 및 Cas9의 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 시험관내에서 제제 또는 그의 일부와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 최대 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일 동안 세포 및 제제를 재배하거나, 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도입은 세포 내로의 제제의 전달을 유발하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 방법, 조성물 및 세포는, 예를 들어 전기천공에 의해 세포 내로의 Cas9 및 gRNA의 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 직접 전달을 사용한다. 일부 구현예에서, RNP 복합체는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함하도록 변형된 gRNA를 포함한다. 일부 경우에서, 변형될 세포의 전기천공은 세포를 전기천공한 후, 예를 들어 32℃에서 세포를 저온-충격한 다음, 플레이팅하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공되는 방법은 제제와 세포의 접촉 단계 전에, 그동안 또는 그 후에 및/또는 전달을 유발하는 단계(예를 들어, 전기천공) 전에, 그동안 또는 그 후에, 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 증식을 유도할 수 있는 사이토카인, 자극제 및/또는 제제의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는, CD3 항체에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 포함하는 자극제의 존재 하에 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및 IL-15 중 하나 이상의 존재 하에 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 전기천공 전 또는 후에 최대 8일의 시간 동안, 예컨대 최대 24시간, 36시간 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28) 및/또는 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15)의 존재 하의 인큐베이션은 전기천공 전에 최대 24시간, 25시간 또는 48시간 동안 이루어진다.
일부 양태에서, 제공되는 조성물 및 방법은 PDCD1 유전자의 넉아웃 또는 유전자 붕괴를 위한 제제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포의조성물 중 세포의 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과가 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 방법, 조성물 및 세포는 PDCD1 유전자의 넉아웃 또는 유전자 붕괴를 위한 제제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포의 조성물 중 세포의 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과가, 예컨대 세포의 표면에 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, PDCD1 유전자의 넉아웃 또는 유전자 붕괴를 위한 제제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포의 조성물 중 세포의 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과가 두 대립유전자 모두에서 넉아웃되고, 즉, 이러한 백분율의 세포에서 이대립유전자성 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, PDCD1 유전자 또는 그 부근(예를 들어, 커팅(cutting) 부위의 상류 또는 하류의 100개의 염기쌍 내 또는 그 부근 내, 50개의 염기쌍 내 또는 그 부근 내, 25개의 염기쌍 내 또는 그 부근 내, 10개의 염기쌍 내 또는 그 부근 내)의 Cas9-매개 절단 효율(삽입결실%)이 PDCD1 유전자의 넉아웃 또는 유전자 붕괴를 위한 제제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포의 조성물 중 세포의 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과인 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공되는 세포, 조성물 및 방법은 PDCD1 유전자의 넉아웃 또는 유전자 붕괴를 위한 제제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포의 조성물 중 세포의 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과에서 면역 체크포인트 분자 PD-1을 통해 전달된 신호의 감소 또는 붕괴를 유발한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 갖도록 조작된 세포를 포함하고, PD-1의 발현의 감소, 결실, 제거, 넉아웃 또는 붕괴(예를 들어, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴)를 포함하는 제공된 개시내용에 따른 조성물은, 동일한 조건 하에 평가하는 경우, 이렇게 재조합 수용체를 갖도록 조작되었으나, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 상응 또는 기준 조성물의 조작된 세포에서 발현된 재조합 수용체와 비교하여, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 기능성 특성 또는 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 항원과의 특이적 결합을 보유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 항원 결합시, 세포에서 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비를 유도하는 활성화 활성 또는 자극 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제공되는 조성물 중의 조작된 세포는, 동일한 조건 하에 평가하는 경우, 이렇게 재조합 수용체를 갖도록 조작되었으나, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 세포를 포함하는 상응 또는 기준 조성물과 비교하여, 기능성 특성 또는 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 세포는 이러한 상응 또는 기준 조성물과 비교하여, 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비를 보유한다.
일부 구현예에서, 조성물 중 세포는 동일한 조건 하에 평가하는 경우, 상응 또는 기준 조성물 중의 세포의 표현형과 비교하여, 면역 세포 또는 세포들의 표현형을 보유한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포는 나이브 세포, 효과기 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 효과기 기억 세포 및 장기-생존 효과기 기억 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포, 또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하고, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 T 세포의 백분율은, 재조합 수용체를 갖도록 조작되었으나, 유전자 붕괴를 함유하거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 상응 또는 기준 집단 또는 조성물과 동일하거나, 실질적으로 동일한 비-활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 CCR7+, 4-1BB+(CD137+), TIM3+, CD27+, CD62L+, CD127+, CD45RA+, CD45RO-, t-betlow, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ 또는 LFA-1+로부터 선택되는 하나 이상의 표현형 마커 및 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 포함하는 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 특성, 활성 또는 표현형은, 예컨대 항원, 항원을 발현하는 세포 및/또는 항원-수용체 활성화 물질의 존재 하에 세포를 인큐베이션함으로써, 시험관내 분석에서 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 또는 37℃± 2℃에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 최대 또는 최대 약 12, 24, 36, 48 또는 60시간 동안 이루어질 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-15 및/또는 IL-17)의 존재 하에 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 평가된 활성, 특성 또는 표현형 중 임의의 것은 전기천공 또는 제제의 별도의 도입 후, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7일 후 또는 상기 일수까지 다양한 날에 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 활성, 특성 또는 표현형은, 동일한 조건 하에 평가하는 경우, 재조합 수용체를 갖도록 조작되었으나, PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않는 조작된 세포를 함유하는 상응 조성물의 활성과 비교하여, 조성물 중 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%에 의해 보유된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상응 조성물" 또는 "상응 세포 집단"(또한, "기준 조성물" 또는 "기준 세포 집단"으로 일컬어짐)에 대한 참조는, T 세포 또는 T 세포의 집단에 제제가 도입되지 않은 것을 제외하고, 동일하거나, 실질적으로 동일한 조건 하에 획득되고, 단리되고, 발생되고, 생산되고/생산되거나, 인큐베이션된 T 세포 또는 세포들을 지칭한다. 일부 양태에서, 이러한 세포 또는 T 세포는, 제제의 도입이 함유되지 않은 것을 제외하고, 세포의 활성 또는 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 하나 이상의 조건이 제제의 도입 이외에, 세포간에 다르지 않거나, 실질적으로 다르지 않도록, 제제가 도입된 T 세포 또는 세포들과 동일하거나, 실질적으로 동일하게 처리된다. 예를 들어, 하나 이상의 저해 분자(예를 들어, PD-1)의 발현의 감소 및/또는 상향 조절의 저해의 평가를 위해, 제제의 도입을 함유하는 T 세포 및 제제의 도입을 함유하지 않은 T 세포를, T 세포에서 하나 이상의 저해 분자의 발현 및 상향 조절을 야기하는 것으로 공지된 것과 동일한 조건 하에 인큐베이션한다.
저해 분자, 예컨대 PD-1을 포함하는 T 세포 마커의 발현 및/또는 수준을 평가하기 위한 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 마커의 검출을 위한 항체 및 시약은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 용이하게 입수 가능하다. 이러한 마커를 검출하기 위한 분석 및 방법은 세포내 유동세포계측을 포함한 유동세포계측, ELISA, ELISPOT, 세포계측 비드 어레이 또는 다른 다중복합 방법, 웨스턴 블롯 및 다른 면역친화도-기반 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항원 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포를 유동세포계측 또는 다른 면역친화도 기반 방법에 의해, 이러한 세포에 고유한 마커의 발현에 대해 검출할 수 있으며, 그 후, 이러한 세포를 또 다른 T 세포 표면 마커 또는 마커들, 예컨대 저해 분자(예를 들어, PD-1)로 공동 염색할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 세포를 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 비-면역원성 선택 에피토프로서 절두된 EGFR(EGFRt)을 함유하는 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포를 발생시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 8,802,374호 참조).
일부 구현예에서, 이러한 세포, 조성물 및 방법은, 입양에 의해 전달될 면역 세포(예를 들어, T 세포)(예컨대, CAR 또는 트랜스제닉 TCR을 발현하도록 조작된 세포)에서 PD-1의 발현의 결실, 넉아웃, 붕괴 또는 감소를 제공한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 대상체로부터의 일차 세포, 예컨대 일차 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 생체외에서 수행한다. 일부 양태에서, 이렇게 유전자 조작된 T 세포를 생산시키거나, 발생시키는 방법은 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 함유하는 세포 집단 내로 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및 면역 저해 분자 PD-1을 인코딩하는 유전자를 붕괴할 수 있는 제제 또는 제제들을 도입시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "도입"은 시험관내 또는 생체내에서 세포 내로 DNA를 도입하는 다양한 방법을 포괄하며, 이러한 방법은 형질전환, 형질도입, 형질감염(예를 들어, 전기천공) 및 감염을 포함한다. 벡터는 세포 내로 분자를 인코딩하는 DNA의 도입에 유용하다. 가능한 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 다른 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 벡터를 포함한다.
T 세포를 함유하는 세포의 집단은 대상체로부터 획득된, 예컨대, 말초 혈액 단분자 세포(PBMC) 샘플, 비분획화된 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 산물, 또는 백혈구성분채집술 산물로부터 획득된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 양성 또는 음성 선택 및 농화 방법을 사용하여, 집단 내에 T 세포를 농화시키기 위해, 분리되거나, 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 집단은 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 단계 및 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)에서의 도입 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어, CAR) 및 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)에서의 도입에 후속하여, 세포의 확장 및/또는 증식을 자극하는 조건 하에 세포를 배양하거나, 인큐베이션한다.
따라서, 예컨대, 시간 경과에 따라, 전달된 세포의 지속 또는 그에 대한 노출을 유지하면서, 투여된 유전자 조작된(예를 들어, CAR+) 세포의 활성 및 역가를 증가시킴으로써, 개선된 효능을 제공하는 것을 포함하여, 입양 세포 요법에서 면역 세포, 예컨대 T 세포 기능을 향상시키는 세포, 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포, 예컨대 CAR-발현 T 세포는, 이용 가능한 특정 방법과 비교하여, 생체내에서 대상체에 투여되는 경우, 증가된 확장 및/또는 지속을 나타낸다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체-발현 세포, 예컨대 CAR-발현 세포를 함유하는 제공된 조성물은 생체내에서 대상체에 투여되는 경우, 증가된 지속을 나타낸다. 일부 구현예에서, 투여 시, 대상체에서의 유전자 조작된 세포, 예컨대 CAR-발현 T 세포의 지속은, T 세포에 PD-1-을 인코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나, 붕괴하는 제제가 도입되지 않는 방법에 의해 유전자 조작된 세포의 투여를 포함하는 것과 같은 대안적 방법에 의해 달성되는 것과 비교하여, 더 강력하다. 일부 구현예에서, 지속은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상만큼 증가한다.
일부 구현예에서, 대상체에 투여한 후, 투여된 세포의 지속 정도 또는 범위를 검출하거나, 정량화할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 혈액 또는 혈청 또는 기관 또는 조직(예를 들어, 질병 부위)에서 재조합 수용체(예를 들어, CAR-발현 세포)를 발현하는 세포의 양을 평가하기 위해, 정량적 PCR(qPCR)을 사용한다. 일부 양태에서, DNA의 마이크로그램당 수용체, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 DNA 또는 플라스미드의 복제물 또는, 예를 들어 혈액 또는 혈청 샘플의 마이크로리터당 또는 말초 혈액 단분자 세포(PBMC) 또는 백혈구의 총 수당 수용체-발현, 예를 들어 CAR-발현 세포 또는 샘플의 마이크로리터당 T 세포의 수로서 지속을 정량화한다. 일부 구현예에서, 일반적으로, 수용체에 특이적인 항체를 사용하여, 수용체를 발현하는 세포를 검출하는 유동세포계측 분석을 또한 수행할 수 있다. 또한, 세포 기반 분석을 사용하여, 질병 또는 질환의 세포와 결합할 수 있고/있거나, 이에 대한 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 중화시킬 수 있고/있거나, 유도할 수 있거나, 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현할 수 있는 세포와 같은 기능성 세포의 수 또는 백분율을 검출할 수 있다. 이러한 구현예 중 임의의 것에서, 재조합 수용체와 결합된 또 다른 마커(예를 들어, CAR-발현 세포)의 발현의 정도 또는 수준을 사용하여, 대상체에서 내인성 세포와 투여된 세포를 구별할 수 있다.
또한, 예컨대 암 치료의 입양 요법에서의 방법 및 세포의 용도가 제공된다. 또한, 세포를 조작하고, 제조하고, 생산하기 위한 방법, 세포를 함유하는 조성물 및 세포를 함유하고, 이를 사용하고, 생산하고, 투여하기 위한 키트 및 장치가 제공된다. 또한, 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 제공된다. 세포 단리, 유전자 조작 및 유전자 붕괴를 위한 방법이 제공된다. 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하고/인코딩하거나, 붕괴를 유발하기 위한 제제를 인코딩하는 작제물, 예들 들어 바이러스 벡터와 같은 핵산 및 예컨대 형질도입에 의해 세포 내로 이러한 핵산을 도입시키기 위한 방법이 제공된다. 또한, 조작된 세포를 함유하는 조성물 및 예컨대 입양 세포 요법을 위해, 대상체에 세포 및 조성물을 투여하기 위한 방법, 키트 및 장치가 제공된다. 일부 양태에서, 대상체로부터 세포를 단리하고, 조작하여, 동일한 대상체에 투여한다. 다른 양태에서, 이를 하나의 대상체로부터 단리하고, 조작하여, 또 다른 대상체에 투여한다.
II. 유전자 조작된 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 세포를 생산하는 방법
입양 세포 요법, 예를 들어 입양 면역요법을 위한 세포 및 이러한 세포를 생산시키거나, 발생시키는 방법이 제공된다. 세포는 면역 세포, 예컨대 T 세포를 포함한다. 세포는 일반적으로 하나 이상의 유전자 조작된 핵산 또는 그의 산물을 도입시킴으로써, 조작된다. 특히, 이러한 산물은 활성화, 자극 및 공자극 CAR을 포함하는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이들의 조합을 포함하는 유전자 조작된 항원 수용체이다. 일부 구현예에서, 또한, 면역 저해 분자 PD-1을 인코딩하는 유전자를 붕괴할 수 있는 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)와 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산을 동시에 또는 순차적으로 세포에 도입시킨다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)에서의 도입 전에, 그동안 및/또는 그 후에 세포(예를 들어, T 세포)를 인큐베이션하거나, 재배할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자의 도입 전에, 그동안 또는 그 후에, 예컨대 재조합 수용체를 인코딩하는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)에 의한 세포의 형질도입 전에, 그동안 또는 그 후에 세포(예를 들어, T 세포)를 인큐베이션하거나, 재배할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)에서의 도입 전에, 그동안 또는 그 후에, 예컨대 세포와 제제의 접촉 전에, 그동안 또는 그 후에 또는, 예를 들어 전기천공을 통한 세포 내로의 제제의 전달 전에, 그동안 또는 그 후에 세포(예를 들어, T 세포)를 인큐베이션하거나, 재배할 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자의 도입 및 제제, 예를 들어 Cas9/gRNA RNP의 도입 상황에서 둘 모두에 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 항-CD3/항-CD28 항체와 같이, 세포의 증식 또는 활성화를 유도하는 자극 또는 활성화제의 존재 하에 또는 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 또는 IL-15의 존재 하에 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 및 제제, 예를 들어, Cas9/gRNA RNP의 도입 전에 자극 또는 활성화제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체)에 의해 세포를 활성화시키거나, 자극하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 또한 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어, 1 U/ML 내지 500 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 200 U/mL, 예를 들어 적어도 또는 약 50 U/mL 또는 100 U/mL), IL-7(예를 들어, 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 5 ng/mL 또는 10 ng/mL) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL)의 존재 하에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 형질도입을 통해) 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 도입하기 전에 6시간 내지 96시간, 예컨대 24시간 내지 48시간 또는 24시간 내지 36시간 동안 세포를 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, Cas9/gRNA RNP의 도입은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자의 도입 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 제제의 도입 전에, 예를 들어 임의의 자극 또는 활성화제를 제거함으로써, 세포를 휴지시킨다. 일부 구현예에서, 제제의 도입 전에, 자극 또는 활성화제 및/또는 사이토카인을 제거하지 않는다.
일부 구현예에서, 핵산 분자의 도입 및/또는 제제, 예를 들어, Cas9/gRNA의 도입 후에, 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어, 1 U/ML 내지 500 U/mL, 예컨대 1 U/mL 내지 100 U/mL, 예를 들어 적어도 또는 약 25 U/mL 또는 50 U/mL), IL-7(예를 들어, 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL 또는 1 ng/mL)의 존재 하에 세포를 인큐베이션하거나, 재배하거나, 배양한다.
일부 구현예에서, 임의의 일부 과정 또는 전 과정 동안의 인큐베이션은 30℃± 2℃ 내지 39℃± 2℃, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃의 온도에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃± 2℃에서 이루어지며, 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃± 2℃에서 이루어진다.
A. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포의 제조
PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는PDCD1 유전자의 유전자 편집을 위한 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP) 및 특이적 항원에 결합하는 재조합 수용체를 매우 다양한 세포 내로 도입시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 조작하고/하거나, PDCD1 표적 유전자를 생체외에서 조작하고, 생산된 유전자 조작된 세포를 대상체에 투여한다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원은, 예를 들어 대상체의 혈액, 대상체의 제대혈, 또는 대상체의 골수를 포함할 수 있다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원은 또한, 예를 들어 이종성 공여체 혈액, 제대혈, 또는 골수를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포는 진핵생물 세포, 예컨대 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래한 것으로, 선천적 또는 적응 면역의 세포와 같은 면역 시스템의 세포, 예를 들어 림프구, 통상적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 골수 또는 림프구 세포이다. 다른 예시적인 세포는 유도된 만능 줄기세포(iPSC)를 포함하여, 다능성 및 만능 줄기세포와 같은 줄기세포를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 인간 세포이다. 치료될 대상과 관련하여, 세포는 동종 및/또는 자가 유래일 수 있다. 세포는 통상적으로 대상체로부터 직접 단리되고/단리되거나, 대상체로부터 단리되어, 동결된 것과 같은 일차 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 조절 T 세포(Treg), 줄기세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포, 조혈 줄기세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵 세포 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 또는, iPS 세포, 예를 들어 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 변경하거나(예를 들어, 표적 유전자에서 돌연변이를 유도하거나) 또는 발현을 조작하도록 조작된 대상체로부터 발생된 iPS 세포로부터 유도되고, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포 또는 조혈 줄기세포로 분화된 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이들의 부분집합의 하나 이상의 하위세트, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화, 확장, 재순환, 국소화 및/또는 지속 용량의 잠재력, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획 내의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 규정되는 것을 포함한다.
특히, T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위 유형 및 부분집합은 나이브 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이들의 하위 유형, 예컨대 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), 또는 최종적으로 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 비변이 T(MAIT) 세포, 천연 유래 및 적응 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포이다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 이를 제조하고, 이를 가공하고, 이를 배양하고/배양하거나, 이를 조작하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 기재된 바와 같은 조작을 위한 세포는 생물학적 샘플과 같은 샘플, 예를 들어 대상체로부터 획득하거나, 이로부터 유래한 샘플로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리된 대상체는 질병 또는 질환을 가지거나, 세포 요법이 필요하거나, 세포 요법이 투여될 자이다. 일부 구현예에서, 대상체는, 세포가 단리되고, 가공되고/가공되거나, 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정의 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 세포는 일부 구현예에서, 일차 세포, 예를 들어 일차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 유체 및 대상으로부터 직접 채취한 다른 샘플뿐만 아니라, 분리, 원심분리, 유전자 조작(예를 들어, 바이러스 벡터에 의한 형질도입), 세척 및/또는 인큐베이션과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생산된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원 또는 가공된 샘플로부터 직접 얻은 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 이로부터 유래한 가공 샘플을 포함하여, 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 장기 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 세포가 유래하거나, 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 산물로부터 유래한 것일 수 있다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 다른 림프계 조직, 간, 폐, 위, 장, 직장, 신장, 췌장, 유방, 골, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 기관 및/또는 이로부터 유래한 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법과 관련하여, 자가 유래 및 동종 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예컨대 T 세포주로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 세포는 이종성 공급원, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 획득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포를 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척하고, 원심분리하고/하거나, 인큐베이션하여, 요망되지 않는 성분을 제거하고, 요망되는 성분에 대해 농화하고, 특정 시약에 민감성인 세포를 용해시키거나, 제거한다. 일부 예에서, 밀도, 부착성, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성을 기반으로 하여 세포를 분리한다.
일부 예에서, 대상체의 순환혈로부터의 세포는, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 획득된다. 샘플은, 일부 양태에서, T 세포를 포함하는 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 함유하고, 일부 양태에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 채집된 혈액 세포를 세척하여, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고, 후속 가공 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치한다. 일부 구현예에서, 세포를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수 또는 모든 2가 양이온이 부재한다. 일부 양태에서, 세척 단계는 반자동 "관류" 원심 분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일부 양태에서, 세척 단계는 접선 유동 여과(TFF)에 의해 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일부 구현예에서, 세포를 세척 후 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 무함유 PBS에 재현탁한다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 적혈구를 용해시키고, Percoll 또는 Ficoll 구배를 통해 원심분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특이적 분자의 세포에서의 발현 또는 존재를 기반으로 한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커를 기반으로 한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도 또는 면역친화도 기반이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 단리는, 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션한 후, 일반적으로, 세척 단계를 거쳐, 항체 또는 결합 파트너에 결합한 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 분리함으로써, 하나 이상의 마커, 통상적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준을 기반으로 하여, 세포 및 세포 집단을 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 분리 단계는, 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택 및/또는 추가 사용을 위해, 시약에 결합한 세포가 유지되는 양성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두를 추가 사용을 위해 유지시킨다. 일부 양태에서, 음성 선택은, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 확인하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용하여, 요망되는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커를 기반으로 하여 분리를 수행하는 것이 가장 바람직하다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농화 또는 제거를 결과로 할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농화는 이러한 세포의 수 또는 백분율의 증가를 지칭하나, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 결과로 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율의 저하를 지칭하나, 이러한 세포 모두의 완전한 제거를 결과로 할 필요는 없다.
일부 예에서, 하나의 단계로부터 양성적으로 또는 음성적으로 선택된 분획이 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 적용되는 다회 분리 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는, 예컨대, 각각 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 대해 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션함으로써, 다수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써, 다수의 세포 유형을 동시에 양성적으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 T 세포 집단을, 하나 이상의 특정 마커, 예컨대 표면 마커에 대해 양성(마커+)이거나, 이를 고 수준으로 발현(마커고)하는 세포 또는 하나 이상의 마커에 대해 음성(마커-)이거나, 이를 상대적으로 저 수준으로 발현(마커저)하는 세포에 대해 농화하거나, 이를 고갈시킨다. 예를 들어, 일부 양태에서, 하나 이상의 표면 마커에 대해 양성이거나, 이를 고 수준으로 발현하는 세포와 같은 T 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특이적 부분집합을 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 단리한다. 일부 경우에서, 이러한 마커는 T 세포(예컨대, 비-기억 세포)의 특정 집단이 부재하거나, 이를 상대적으로 저 수준으로 발현하나, T 세포(예컨대, 기억 세포)의 다른 특정 집단이 존재하거나, 이를 상대적으로 더 고 수준으로 발현하는 것이다. 일 구현예에서, 세포(예컨대, CD8+ 세포 또는 T 세포, 예를 들어 CD3+ 세포)를, CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나, 이를 고 표면 수준으로 발현하는 세포에 대해 농화(즉, 양성적 선택)하고/농화하거나, CD45RA에 대해 양성이거나, 이를 고 표면 수준으로 발현하는 세포를 고갈(예를 들어, 음성적 선택)시킨다. 일부 구현예에서, 세포를, CD122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Rα(CD127)에 대해 양성이거나, 이를 고 표면 수준으로 발현하는 세포에 대해 농화하거나, 이를 고갈시킨다. 일부 예에서, CD8+ T 세포를 CD45RO에 대해 양성(또는 CD45RA에 대해 음성)이고, CD62L에 대해 양성인 세포에 대해 농화한다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포를 CD3/CD28 접합 자기 비드(예를 들어, DYNA비드®M-450 CD3/CD28 T 세포 확장기)를 사용하여 양성적으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포를, 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14에서 발현되는 마커의 음성 선택에 의해, PBMC 샘플로부터 분리한다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 사용하여, CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리한다. 하나 이상의 나이브, 기억, 및/또는 효과기 T 세포 부분집합에서 발현되거나, 상대적으로 더 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해, 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단을 부분집합으로 추가로 분류할 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포를, 예컨대 각각의 부분집합과 관련된 표면 항원을 기반으로 한 양성 또는 음성 선택에 의해, 나이브, 중심 기억, 효과기 기억, 및/또는 중심 기억 줄기세포에 대해 추가로 농화하거나, 이를 고갈시킨다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포에 대한 농화를 수행하여, 투여 후, 장기 생존, 확장 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같이, 효능을 증가시키며, 일부 양태에서, 이는 이러한 부분집합에서 특히 강력하다. 문헌[Terakura et al.(2012) Blood.1:72-82; Wang et al.(2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농화된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 향상시킨다.
구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 모두에 존재한다. PBMC를, 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농화하거나, 이를 고갈시킬 수 있다.
일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 부분집합, 예를 들어 중심 기억(TCM) 세포에 대해 농화된 부분집합. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포에 대한 농화는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD 127의 양성 또는 고 표면 발현을 기반으로 하며; 일부 양태에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나, 이를 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택을 기반으로 한다. 일부 양태에서, CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농화에 의해 TCM 세포에 대해 농화된 CD8+ 집단의 단리를 수행한다. 일 양태에서, CD4 발현을 기반으로 하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여, 이를, CD14 및 CD45RA의 발현을 기반으로 한 음성 선택 및 CD62L을 기반으로 한 양성 선택에 적용함으로써, 중심 기억 T(TCM) 세포에 대한 농화를 수행한다. 일부 양태에서, 이러한 선택을 동시에 수행하며, 다른 양태에서는 이를 임의의 순서로 순차적으로 수행한다. 일부 양태에서, 또한, CD8+ 세포 집단 또는 부분집합의 제조에 사용되는 것과 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계를 사용하여, CD4+ 세포 집단 또는 부분집합을 생산함으로써, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 둘 모두를 유지시키고, 선택적으로, 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계 후, 이 방법의 후속 단계에 사용한다.
특정 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플을 CD4+ 세포의 선택에 적용하고, 음성 및 양성 분획 둘 모두를 유지시킨다. 그 후, 음성 분획을 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현을 기반으로 한 음성 선택 및 중심 기억 T 세포, 예컨대 CD62L 또는 CCR7의 마커 특성을 기반으로 한 양성 선택에 적용하고, 양성 및 음성 선택을 임의의 순서로 수행한다.
세포 표면 항원을 가진 세포 집단을 확인함으로써, CD4+ T 헬퍼 세포를 나이브, 중심 기억, 및 효과기 세포로 분류한다. 표준 방법에 의해, CD4+ 림프구를 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO이다.
일 예에서, 음성 선택에 의해, CD4+ 세포에 대해 농화하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너를, 양성 및/또는 음성 선택에 의한 세포의 분리를 가능하게 하는 자기 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역자기(또는 친화도자기) 분리 기법(문헌[Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]의 방법에서 고찰됨)을 사용하여, 세포 및 세포 집단을 분리하거나, 단리한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 전에 또는 이와 연계하여, 세포를 인큐베이션하고/인큐베이션하거나, 배양한다. 인큐베이션 단계는 배양, 재배, 자극, 활성화 및/또는 번식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포를 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션한다. 이러한 조건은 집단 내 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고/모방하거나, 재조합 항원의 도입과 같은 유전자 조작을 위한 세포를 준비하도록 설계된 조건을 포함한다.
이러한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화하도록 설계된 임의의 다른 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는, TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 제제는 T 세포 내의 TCR/CD3 세포내 신호전달계를 작동시키거나, 개시시킨다. 이러한 제제는, 하나 이상의 사이토카인 및/또는 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체에 결합하는 TCR 성분 및/또는 공자극 수용체에 특이적인 것과 같은 항체를 포함할 수 있다. 선택적으로, 확장 방법은(예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도의) 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 자극제는 적어도 약 10 단위/mL의 농도의 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, IL-2를 포함한다.
일부 양태에서, 미국 특허 제 6,040,1 77, 문헌[Riddell et al, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al.(2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al.(2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기재된 것과 같은 기법에 따라 인큐베이션을 수행한다.
일부 구현예에서, 배양-개시 조성물 지지 세포(feeder cell), 예컨대 비-분열 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 첨가하고(예를 들어, 생산된 세포 집단이 확장될 초기 집단 내의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40개 이상의 PBMC 지지 세포를 함유하도록 함); 및 (예를 들어, T 세포의 수의 확장을 위해 충분한 시간 동안)배양물을 인큐베이션함으로써, T 세포를 확장시킨다. 일부 양태에서, 비-분열 지지 세포는 감마선이 조사된 PBMC 지지세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 분열을 방지하기 위해, 약 3000 rads 내지 3600 rads의 범위의 감마선을 PBMC에 조사한다. 일부 양태에서, T 세포 집단의 첨가 전에, 지지 세포를 배양 배지에 첨가한다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25 섭씨온도, 일반적으로 적어도 약 30도, 및 일반적으로 약 또는 37 섭씨온도를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 지지 세포로서 비-분열 EBV-형질전환된 림프아구성 세포(LCL)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 약 6000 rads 내지 10,000 rads의 범위의 감마선을 LCL에 조사할 수 있다. 일부 양태에서, LCL 지지 세포는 임의의 적합한 양으로, 예컨대 적어도 약 10:1의 LCL 지지 세포 대 초기 T 림프구의 비율로 제공된다.
일부 구현예에서, 이러한 제조 방법은 단리, 인큐베이션 및/또는 조작 전 또는 그 후에, 세포의 동결, 예를 들어 저온보존을 위한 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 후 해동 단계는 세포 집단 내의 과립구 및 일정 정도의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위해, 세척 단계 후, 동결 용액 중에 세포를 현탁시킨다. 일부 양태에서, 다양한 공지된 동결 용액 및 매개변수 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 일 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 단계를 포함한다. 그 후, 이를 배지와 1:1로 희석하고, DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 한다. 그 후, 세포를 일반적으로, 분당 1°의 속도로 -80℃까지 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 저온보존 전 또는 그 후에 동일한 환자 내에 조작된 세포를 재-도입시키는 단계를 포함한다.
B. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 재조합 수용체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및 이러한 핵산의 유전자 조작된 산물을 포함한다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 형질도입을 통해) 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입시킴으로써, 세포를 생산시키거나, 발생시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉, 예를 들어, 조작된 세포 내에서 일반적으로 발견되지 않는 또 다른 유기체 또는 세포 및/또는 이러한 세포가 유래한 유기체로부터 획득된 것과 같이, 세포로부터 획득된 샘플 또는 세포에 일반적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 다수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이, 천연 유래가 아니다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 하나 이상의 표적 항원, 예컨대 하나 이상의 종양 항원에 결합하도록 변경시킨다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산무수화효소 9(CAIX), tEGFR, Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자,(L1-CAM), 흑색종-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선적 발현 항원(PRAME), 서바이빈(survivin), TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 및 다용성 태그와 관련된 항원으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를, 예를 들어 TCR 또는 CAR에 의해, 다음의 종양 항원 중 하나 이상과 결합하도록 변경시켰다. 종양 항원은 AD034, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, 피불린-1(Fibulin-1), HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/갈렉틴9(Galectin9), HOM-MEEL-40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB1, KM-HN-3, KM-KN-1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a, MPP11, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK11, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, OGFr, PLU-1, Rab38, RBPJ카파, RHAMM, SCP1, SCP-1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B, 또는 티로시나제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
1. 항원 수용체
a) 키메라 항원 수용체(CAR)
이러한 세포는 일반적으로 재조합 수용체, 예컨대 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 항원 수용체, 및 다른 항원-결합 수용체, 예컨대 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 또한 특히, 수용체는 다른 키메라 수용체이다.
CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체 및 조작하고, 이러한 수용체를 세포 내로 도입하는 방법은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제 WO200014257호, 제 WO2013126726호, 제 WO2012/129514호, 제 WO2014031687호, 제 WO2013/166321호, 제 WO2013/071154호, 제 WO2013/123061호, 미국 특허 출원 공개 제 US2002131960호, 제 US2013287748호, 제 US20130149337호, 미국 특허 제 6,451,995호, 제 7,446,190호, 제 8,252,592호, 제 8,339,645호, 제 8,398,282호, 제 7,446,179호, 제 6,410,319호, 제 7,070,995호, 제 7,265,209호, 제 7,354,762호, 제 7,446,191호, 제 8,324,353호, 및 제 8,479,118호 및 유럽 특허 출원 제 EP2537416호에 기재된 것 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것을 포함한다. 일부 양태에서, 항원 수용체는 미국 특허 제 7,446,190호에 기재된 것 및 국제 특허 출원 공개 제 WO/2014055668 A1호에 기재된 것과 같은 CAR을 포함한다. CAR의 예는 전술된 공개, 예컨대 제 WO2014031687호, 제 US 8,339,645호, 제 US 7,446,179호, 제 US 2013/0149337호, 미국 특허 제 7,446,190호, 미국 특허 제 8,389,282호, 문헌[Kochenderfer et al, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276(2013); Wang et al.(2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al, Sci Transl Med. 2013 5(177)] 중 임의의 것에 개시된 것과 같은 CAR을 포함한다. 또한 제 WO2014031687호, 제 US 8,339,645호, 제 US 7,446,179호, 제 US 2013/0149337호, 미국 특허 제 7,446,190호, 및 제 미국 특허 제 8,389,282호를 참조한다. 키메라 수용체, 예컨대 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 분자의 일부분, 일반적으로 항체의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역, 예를 들어 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 이러한 항원은, 정상 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질병 또는 질환의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에 선택적으로 발현되거나, 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고/발현되거나, 조작된 세포에서 발현된다.
수용체에 의해 표적화될 수 있는 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H6, 탄산무수화효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 일컬어짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 일컬어짐), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절두된 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린e 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; 또한 Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로 일컬어짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드(ganglioside) GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erbB2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-AI), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1CAM), CE7 L1-CAM의 에피토프, 8과 구성원 A를 함유하는 류신 풍부 반복부(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 태아 종양 항원, 흑색종의 우선적 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(RORl), 서바이빈, 영양아층 당단백질(TPBG 또한 5T4로 일컬어짐), 종양-연관 당단백질 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 및 병원체-특이적 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은, 일부 구현예에서, 고아 티로신 키나제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1(CCNA1), 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 종양 연관 항원, 예를 들어 CD19, CD20, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CD171, CEA, ERBB2, GD2, 알파-엽산 수용체, 루이스 Y 항원, 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 종양 연관 당단백질 72(TAG72)에 대해 결합 특이성을 갖는다.
일부 구현예에서, CAR은 병원체-특이적 항원과 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 바이러스 항원(예컨대, HIV, HCV, HBV 등), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원에 특이적이다.
특히, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 키메라 수용체, 예컨대 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 분자의 일부분, 일반적으로 항체의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역, 예를 들어 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 양태에서, 불변 영역의 일부분은 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv와 막관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로 작용한다. 스페이서는, 스페이서가 부재하는 경우와 비교하여, 항원 결합 후, 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이일 수 있다. 예시적 스페이서, 예를 들어 힌지 영역은 국제 특허 출원 공개 제 WO2014031687호에 기재된 것을 포함한다. 일부 예에서, 스페이서는 약 또는 12개의 아미노산 길이이고, 12개 이하의 아미노산 길이이다. 예시적 스페이서는 적어도 약 10개 내지 229개의 아미노산, 약 10개 내지 200개의 아미노산, 약 10개 내지 175개의 아미노산, 약 10개 내지 150개의 아미노산, 약 10개 내지 125개의 아미노산, 약 10개 내지 100개의 아미노산, 약 10개 내지 75개의 아미노산, 약 10개 내지 50개의 아미노산, 약 10개 내지 40개의 아미노산, 약 10개 내지 30개의 아미노산, 약 10개 내지 20개의 아미노산, 또는 약 10개 내지 15개의 아미노산을 가지고, 열거된 범위 중 임의의 것의 한계점 사이의 임의의 정수를 포함하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적 스페이서는 단지 IgG4 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다.
예시적 스페이서는 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin . Cancer Res., 19:3153] 또는 국제 특허 출원 공개 제 WO2014031687호에 기재된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51213에 제시된 서열을 가지고, SEQ ID NO: 51212에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51214에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51215에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51216에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51213, 51214, 51215 또는 51216 중 임의의 것에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 항원 인식 도메인은 일반적으로, CAR의 경우, TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 활성화 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR 내의 도메인 중 하나와 자연 발생적으로 연관된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해, 이러한 도메인과, 동일하거나, 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인의 결합을 피하기 위한 것으로 선택되거나, 아미노산 치환에 의해 변형된다.
막관통 도메인은 일부 구현예에서, 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연의 것인 경우, 도메인은 일부 양태에서, 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래한 것을 포함한다(즉, 적어도 그의 막관통 영역(들)을 포함함). 대안적으로, 막관통 도메인은 일부 구현예에서, 합성된 것이다. 일부 양태에서, 합성 막관통 도메인은 주로, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 프립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서, 및/또는 막관통 도메인(들)에 의해 이루어진다.
특히, 세포내 신호전달 도메인은 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체만을 통한 신호를 모방하거나, 이와 유사한 것이다. 일부 구현예에서, 글리신 및 세린을 함유하는 것, 예를 들어 글리신-세린 이중체와 같은 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어, 2개 내지 10개의 아미노산 길이의 링커가 존재하고, CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는, T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 다른 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적 분자의 일부분을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 상황에서, CAR은 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 분자 또는 항원 수용체 성분의 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분을 무손상 면역자극 사슬 대신에, 예를 들어, 이것이 효과기 기능 신호를 형질도입시키는 경우에 사용한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 도메인은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열, 및 일부 양태에서, 또한 자연 발생적 상황에서, 이러한 수용체와 함께, 항원 수용체 맞물림 후 신호 형질도입을 개시시키는 작용을 하는 공수용체 및/또는 이러한 분자의 임의의 유도체 또는 변이체의 세포질 서열 및/또는 동일한 기능성 역량을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
자연 발생적 TCR과 관련하여, 전체 활성화에는 일반적으로, TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라, 공자극 신호가 요구된다. 따라서, 일부 구현예에서, 전체 활성화를 촉진하기 위해, 이차 또는 공자극 신호의 발생을 위한 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호의 발생을 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 추가적 CAR이 동일한 세포에서 발현되며, 이차 또는 공자극 신호의 발생을 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서, TCR을 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시시키는 세포질 신호전달 서열(일차 세포질 신호전달 서열), 및 항원-독립적 방식으로, 이차 또는 공자극 신호를 제공하는 작용을 하는 세포질 신호전달 서열(이차 세포질 신호전달 서열)의 2개의 종류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 기재된다. 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은, TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 일컬어지는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 엡실론으로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내의 세포질 신호전달 분자(들)는 세포질 신호전달 도메인, 그의 일부분 또는 CD3 제타로부터 유래한 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS와 같은 공자극 수용체의 신호전달 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공자극 성분 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되며, 공자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은, 둘 모두 동일한 세포에서 발현되는 활성화 또는 자극 CAR, 공자극 CAR을 포함한다(제 WO2014/055668호 참조). 일부 양태에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는, 질병 또는 질환과 관련되고/관련되거나, 이에 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은 저해 CAR(iCAR, 문헌[Fedorov et al, Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013)] 참조)을 포함하며, 질병-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는 저해 CAR과 그의 리간드의 결합에 의해 감축되거나, 저해되어, 예를 들어 비표적 효과를 감소시킨다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질의 일부분에 하나 이상의, 예를 들어 2개 이상의 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 일차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 항원 수용체는, 세포 표면 수용체의 절두된 버전, 예컨대 절두된 EGFR(tEGFR)과 같은 수용체를 발현하도록 하는 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는 데 사용될 수 있는 세포 표면 마커와 같은 마커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 마커는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부(예를 들어, 절두된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열과 같은 링커 서열, 예를 들어 T2A를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 제 WO2014031687호를 참조한다. 일부 구현예에서, T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 인코딩하는 작제물의 도입은 동일한 작제물로부터 2개의 단백질을 발현시킴으로써, 이러한 작제물을 발현하는 세포의 검출을 위한 마커로서, EGFRt가 사용될 수 있도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은 공개 출원 제 WO2014031687호에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는, 선택적으로, 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 연결된 절두된 EGFR(tEGFR)일 수 있다. 절두된 EGFR(예를 들어, tEGFR)의 예시적 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 51218에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51218에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 예시적 T2A 링커 서열은 SEQ ID NO: 51217에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51217에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연 발생적으로 발견되지 않거나, T 세포의 표면에서 자연 발생적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질 또는 그의 일부분이다.
일부 구현예에서, 분자는 비-자기 분자, 예를 들어 비-자기 단백질, 즉, 세포가 입양에 의해 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자기"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료적 기능을 발휘하지 않고/않거나, 유전자 조작, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포의 선택을 위한 마커로서 사용되는 것 이외에 다른 효과를 생산하지 않는다. 다른 구현예에서, 마커는 생체내에서 조우되는 세포의 리간드, 예컨대, 입양 전달 및 리간드와의 조우시, 세포의 반응을 강화시키고/강화시키거나, 완충시키는 공자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은 치료용 분자 또는, 요망되는 동일한 효과를 다른 방식으로 발휘하는 분자일 수 있다.
일부 경우에서, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR을 지칭한다. 일부 양태에서, 제1 세대 CAR은, 항원 결합시, 단지 CD3-사슬 유도 신호만을 제공하고; 일부 양태에서, 제2 세대 CAR은 이러한 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것이며; 일부 양태에서, 제3 세대 CAR은 상이한 공자극 수용체의 다수의 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함하고, 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 도메인 및 막관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.　일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이와 같은 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 그의 기능성 변이체이거나, 이를 함유하는 막관통 도메인 및 CD28의 신호전달 부분 또는 그의 기능성 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 그의 기능성 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 그의 기능성 변이체이거나, 이를 함유하는 막관통 도메인 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 그의 기능성 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 그의 기능성 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 이러한 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부분, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지를 함유하는 스페이서, 예컨대 힌지 단독 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR의 막관통 도메인은 인간 CD28의 막관통 도메인 또는 그의 변이체, 예를 들어 인간 CD28(수탁 번호: P10747.1)의 27개의 아미노산 막관통 도메인이거나, SEQ ID NO: 51219에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51219에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이거나; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부분을 함유하는 막관통-도메인은 SEQ ID NO: 51220에 제시된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD28의 세포내 공자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부분, 예컨대 천연 CD28 단백질의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 그의 위치 186 내지 187에서 LL에서 GG로 치환된 이러한 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 51221 또는 51222에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51221 또는 51222에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 41BB의 세포내 공자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부분, 예컨대 인간 4-1BB(수탁 번호 Q07011.1)의 42개의 아미노산 세포질 도메인 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부분, 예컨대 SEQ ID NO: 51223에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51223에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능성 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ(수탁 번호: P20963.2)의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인 또는 미국 특허 제 7,446,190호 또는 미국 특허 제 8,911,993호에 기재된 바와 같은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 51224, 51225 또는 51226에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 51224, 51225 또는 51226에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역 단독, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독, 예컨대 SEQ ID NO: 51213에 제시된 힌지 단독 스페이서를 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어 및 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 396에 제시된 것과 같은, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 51214에 제시된 것과 같은, CH3 도메인만에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 다른 가요성 링커, 예컨대 공지된 가요성 링커이거나, 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 항원과 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편, 스페이서, 예컨대 스페이서를 함유하는 Ig-힌지 중 임의의 것, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, CAR은 항원과 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편, 스페이서, 예컨대 스페이서를 함유하는 Ig-힌지 중 임의의 것, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 이러한 CAR 작제물은 T2A 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skip element) 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR의 하류를 추가로 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 상호호환적으로 사용되며, 최소 길이에 제한되지 않는다. 제공된 수용체 및 다른 폴리펩타이드, 예를 들어 링커 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비 천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한, 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는, 단백질이 요망되는 활성을 유지하는 한, 천연 또는 자연 발생 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 이들 변형은 부위 특이적 돌연변이 유발을 통한 것으로 고려될 수 있거나, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우연히 이루어질 수 있다.
b) T 세포 수용체
일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 천연 유래 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다.　따라서, 일부 구현예에서, 표적 세포를 특이적 T 세포 수용체(TCR) 유전자(예를 들어, TRAC 및 TRBC 유전자를 함유하도록 변경시켰다. TCR 또는 그의 항원-결합 부분은, 종양 항원, 바이러스 또는 자가면역 단백질과 같은 표적 폴리펩타이드의 T 세포 에피토프 또는 펩타이드 에피토프를 인식하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR은 종양 연관 항원, 예를 들어 암배아 항원(CEA), GP100, T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART1), 흑색종 항원 A3(MAGEA3), NYESO1 또는 p53에 대한 결합 특이성을 갖는다.
일부 구현예에서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(또한 각각 TCRα 및 TCRβ로 일컬어짐) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(또한 각각 TCRγ 및 TCRδ로 일컬어짐), 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ형이다. 통상적으로, αβ 및 γδ형에 존재하는 TCR은 일반적으로 유사한 구조를 가지나, 이를 발현하는 T 세포는 별도의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. 일반적으로, TCR은, 일반적으로 주 조직 적합성 복합체(MHC) 분자와 결합한 항원의 인식에 관여하는 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에 발현되거나, 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 전장의 TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ형 및 γδ형을 포함하여, 무손상 또는 전장의 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은, 전장 미만의 TCR이나, MHC 분자 내에 결합한 특이적 펩타이드에 결합하는, 예컨대, MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에서, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 무손상 TCR의 구조 도메인의 일부분만을 함유할 수 있으나, 여전히, 전장의 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 항원-결합 부분은, 특이적 MHC-펩타이드 복합체와의 결합을 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은, 일반적으로 항원 인식 및 결합능 및 특이성의 일차 원인인 초가변 루프 또는 CDR을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR은 소정의 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전체 또는 실질적인 전체를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로, CDR과 비교하여, 일반적으로 TCR 분자 사이에 적은 가변성을 나타내는 프레임워크 영역(framework region)(FR)에 의해 분리된다(예를 들어, 문헌[Jores et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . U.S.A . 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 문헌[Lefranc et al., Dev . Comp. Immunol . 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성의 원인이 되는 주요 CDR이며, 소정의 TCR 가변 영역의 3개의 CDR 중, 항원 인식 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과의 상호작용을 위해 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 그의 인식의 원인이 되는 일차 CDR이거나, 이에 가장 크게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은, 일반적으로 초항원 결합에는 관여하나, 항원 인식에는 관여하지 않는 추가의 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있다(문헌[Kotb(1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426]).
일부 구현예에서, TCR은 가변 알파 도메인(Vα) 및/또는 가변 베타 도메인(Vβ) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR의 α사슬 및/또는 β-사슬은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 구현예에서, α 사슬 불변 도메인은 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 인코딩되거나, 그의 변이체이다. 일부 구현예에서, β 사슬 불변 영역은 TRBC1 또는 TRBC2 유전자(IMGT 명명법)에 의해 인코딩되거나, 그의 변이체이다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 세포 막에 인접한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 2개의 사슬에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인, 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유하며, 각각의 가변 도메인은 CDR을 함유한다.
TCR의 다양한 도메인 또는 영역의 결정 또는 확인은 당업자의 수준 내이다. 일부 양태에서, TCR의 잔기는 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 넘버링 시스템에 따라 일컬어지거나, 확인될 수 있다(예를 들어, www.imgt.org 참조; 또한, 문헌[Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 2&;55-77; and The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001] 참조). 이 시스템을 사용하는 경우, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR1 서열은 일괄하여 잔기 번호 27 내지 38 사이에 존재하는 아미노산에 상응하고, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR2 서열은 일괄하여 잔기 번호 56 내지 65 사이에 존재하는 아미노산에 상응하며, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR1 서열은 일괄하여 잔기 번호 105 내지 117 사이에 존재하는 아미노산에 상응한다.
일부 구현예에서, TCR은, 예컨대 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2개의 사슬 α 및 β(또는 선택적으로, γ 및 δ)의 이형이량체일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR의 불변 도메인은, 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성함으로써, TCR의 2개의 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬 내에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있음으로써, TCR은 불변 도메인 내에 2개의 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 불변 및 가변 도메인은 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, 기재된 바와 같은 세포의 조작을 위한 TCR은, 실질적으로 전장의 코딩 서열을 쉽게 이용할 수 있는 Vα,β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 발생된 것이다. 세포 공급원으로부터의 V 사슬 서열을 포함한 전장의 TCR 서열을 획득하기 위한 방법은 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 핵산은, 예컨대, 소정의 세포 또는 세포들로부터 단리되거나, 그 내부의 TCR 인코딩 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의하거나, 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해, 다양한 공급원으로부터 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), T-세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 획득한다. 일부 구현예에서, T-세포는 생체내에서 단리된 세포로부터 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, T- 세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 TCR 서열 정보로부터 합성에 의해 발생시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)을 위한 고 친화도 T 세포를 환자로부터 확인하고, 단리하여, 세포 내로 도입시킨다.　일부 구현예에서, 표적 항원을 위한 TCR 클론을 인간 면역 시스템 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템, 또는 HLA)에 의해 조작된 트랜스제닉 마우스에서 발생시켰다. 예를 들어, 종양 항원을 참조한다(예를 들어, 문헌[Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 and Cohen et al. (2005) J Immunol . 175:5799-5808] 참조).　일부 구현예에서, 파지 디스플레이를 사용하여, 표적 항원에 대한 TCR을 단리한다(예를 들어, 문헌[Varela-Rohena et al.(2008) Nat Med . 14:1390-1395 and Li(2005) Nat Biotechnol. 23:349-354] 참조).
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형되거나, 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 유도 진화 방법을 사용하여, 예컨대 특이적 MHC-펩타이드 복합체에 대해 더 고 친화도를 갖는 변경된 특성의 TCR을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(문헌[Holler et al.(2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al.(2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92]), 파지 디스플레이(문헌[Li et al.(2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54]), 또는 T 세포 디스플레이(문헌[Chervin et al.(2008) J Immunol Methods, 339, 175-84])를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 공지의 모체 또는 기준 TCR의 조작 또는 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에서, CDR의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키고, 요망되는 표적 항원에 대한 더 고 친화도와 같은 요망되는 변경된 특성을 같는 돌연변이체를 선택하여, 돌연변이가 유발된 TCR을 생산하기 위한 주형으로서 야생형 TCR을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 기재된 바와 같이, TCR은 도입된 이황화 결합 또는 결합들을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 천연 시스테인(예를 들어, α 사슬 및 β 사슬의 불변 도메인 내) 중 하나 이상을 세린 또는 알라닌과 같은 또 다른 잔기로 치환시킨다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 α 사슬 및 β 사슬의 불변 도메인과 같은 알파 및 베타 사슬 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써, 형성시킬 수 있다. TCRDML 예시적 비-천연 이황화 결합이 공개된 국제특허 PCT 제 WO2006/000830호 및 제 WO2006037960호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, α 사슬의 잔기 Thr48 및 β 사슬의 Ser57, α 사슬의 잔기 Thr45 및 β 사슬의 Ser77, α 사슬의 잔기 Tyr10 및 β 사슬의 Ser17, α 사슬의 잔기 Thr45 및 β 사슬의 Asp59 및/또는 α 사슬의 잔기 Ser15 및 β 사슬의 Glu15에 시스테인을 도입시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR 내의 비-천연 시스테인 잔기의 존재(예를 들어, 하나 이상의 비-천연 이황화 결합을 생산시킴)는, 이것이 천연 TCR 사슬을 함유하는 미스매칭된 TCR 쌍의 발현시 도입되는 경우, 세포 내의 요망되는 재조합 TCR의 생산에 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 양태에서, TCR의 각각의 사슬(예를 들어, 알파 또는 베타)은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-말단의 짧은 세포질 꼬리를 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은, 예를 들어 세포질 꼬리를 통해, 신호 형질도입의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 비변이체 단백질과 연관된다. 일부 경우에서, 이러한 구조는 TCR이 CD3과 유사한 다른 분자 및 그의 하위단위와 결합하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막 내에 단백질을 고정하고, CD3 신호전달 기구 또는 복합체의 비변이체 하위단위와 결합할 수 있다. CD3 신호전달 하위단위(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포 내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 전장의 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR(sc-TCR)이다. TCR은 세포-결합되거나, 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공되는 방법을 위해, TCR은 세포의 표면에 발현된 세포-결합 형태이다.
일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합되어 있는 제1 폴리펩타이드 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합되어 있는 제2 폴리펩타이드를 함유하며, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 이 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬간 이황화 결합에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 TCR 내에는 사슬간 이황화 결합이 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인을 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 내에 혼입시킬 수 있다. 일부 경우에서, 천연 및 비-천연 이황화 결합 둘 모두가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정된 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C 말단에 부착된 제1 이량체화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C 말단에 부착된 제1 이량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 제1 및 제2 이량체화 모티프는 용이하게 상호작용하여, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 연결하는, 제1 이량체화 모티프 내의 아미노산과 제2 이량체화 모티프 내의 아미노산 사이의 공유결합을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 MHC-펩타이드 복합체에 결합할 수 있는 α 사슬 및 β 사슬을 함유하는 단일 아미노산 가닥인 scTCR이다. 통상적으로, scTCR은 당업자에 공지된 방법을 사용하여 발생시킬 수 있으며, 예를 들어 공개된 국제특허 PCT 제 WO 96/13593호, 제 WO 96/18105호, 제 WO99/18129호, 제 WO04/033685호, 제 WO2006/037960호, 제 WO2011/044186호; 미국 특허 제 7,569,664호; 및 문헌[Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859(1996)]을 참조한다.
일부 구현예에서, scTCR은 TCR　α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성된 제1 절편, TCR　β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR　β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성된 제2 절편 및 제1 절편의 C 말단을 제2 절편의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 TCR　β 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성된 제1 절편, TCR　α 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR　α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성된 제2 절편 및 제1 절편의 C 말단을 제2 절편의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제1 절편 및 서열 β 사슬 세포외 불변의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제2 절편 및 막관통 서열, 및, 선택적으로, 제1 절편의 C 말단을 제2 절편의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제1 절편 및 서열 α 사슬 세포외 불변의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제2 절편 및 막관통 서열, 및, 선택적으로, 제1 절편의 C 말단을 제2 절편의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 결합하는 scTCR의 경우, α 및 β 사슬이 쌍을 형성하여, 그의 가변 영역 서열이 이러한 결합을 위해 배향되어야 한다. scTCR의 α 및 β의 쌍 형성을 촉진하는 다양한 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬을 연결하여, 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성하는 링커 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 α 사슬의 C 말단과 β 사슬의 N 말단 사이의 거리의 범위에 충분한 길이를 가져야 하거나, 그 반대의 경우도 그러하며, 또한, 링커 길이는 scTCR과 표적 펩타이드-MHC 복합체의 결합을 차단하거나, 감소시킬 만큼 길지 않을 것이 보장되어야 한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 절편을 연결하는 scTCR의 링커는 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있고, TCR 결합 특이성을 보유할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은, 예를 들어, have 화학식 -P-AA-P-을 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고, AA는 아미노산 서열을 나타내며, 아미노산은 글리신 및 세린이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 절편은 쌍을 형성하여, 그의 가변 영역 서열이 이러한 결합을 위해 배향된다. 따라서, 일부 경우에서, 링커는 제1 절편의 C 말단과 제2 절편의 N 말단 사이의 거리의 범위에 충분한 길이를 갖거나, 그 반대의 경우도 그러하나, scTCR과 표적 리간드의 결합을 차단하거나, 감소시킬 만큼 너무 길지 않은 것이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 또는 10개 내지 45개의 아미노산, 예컨대 10개 내지 30개의 아미노산 또는 26개 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG)5-P- 또는 -PGGG-(SGGGG)6-P-을 가지고, 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이며, S는 세린이다(SEQ ID NO: 51227 또는 51228). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO: 51229)을 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은, 일부 경우에서, 단일 사슬 분자의 α와 β 영역 사이의 쌍 형성의 안정성을 촉진할 수 있는, 단일 아미노산 가닥의 잔기 사이의 이황화 결합을 함유한다(예를 들어, 미국 특허 제 7,569,664호 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 단일 사슬 분자의 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 이황화 공유결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 이황화 결합은 천연 dTCR에 존재하는 천연 이황화 결합에 상응한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR 내에는 이황화 결합이 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 이황화 결합은, 예를 들어, 하나 이상의 시스테인을 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 사슬 영역의 불변 영역 세포외 서열 내로 혼입시킴으로써, 도입된 비-천연 이황화 결합이다. 예시적 시스테인 돌연변이는 상기에 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 일부 경우에서, 천연 및 비-천연 이황화 결합 둘 모두가 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, scTCR은, 그의 C 말단에 융합된 이종성 류신 지퍼(zipper)가 사슬 결합을 촉진시키는 비-이황화 연결된 절두된 TCR이다(예를 들어, 공개된 국제특허 PCT 제 WO99/60120호 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해, TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예를 들어 공개된 국제특허 PCT 제 WO99/18129호 참조).
일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은, T 세포의 표면에 활성 TCR을 생산시키는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면에 발현된다. 일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 Cα 또는 Cβ 막관통 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 비-TCR 유래일 수 있으며, 예를 들어, CD3z, CD28 또는 B7.1로부터의 막관통 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3z 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 단편은, 표적 항원의 평형 결합 상수가 약 또는 10-5 M 내지 10-12 M 및 모든 개별 값 및 그 내부의 범위인 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는, 하나 이상의 특성, 예컨대 결합 특성이 변경된 그의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유류 중 하나로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 벡터를 발생시키기 위해, α 및 β 사슬을 관심대상 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 전체 cDNA로부터 PCR 증폭시켜, 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 합성에 의해 발생시킬 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 알파 및 베타 사슬을 단리하여, 유전자 발현 벡터 내로 클로닝한다. 일부 구현예에서, IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 이중 시스트론 단위로서 전사 단위를 조작할 수 있으며, 이는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해, (예를 들어, α 및 β 사슬을 인코딩하는) 유전자 산물의 공동 발현을 가능하게 한다. 대안적으로, 일부 경우에서, 단일 프로모터가, 단일 개방형 리딩 프레임(ORF), 자기-절단 펩타이드(예를 들어, T2A)를 인코딩하는 서열에 의해 서로 분리된 (예를 들어, α 및 β 사슬을 인코딩하는) 다수의 유전자 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 퓨린)를 함유하는 RNA의 발현을 유도할 수 있다. ORF는 따라서 단일 폴리단백질을 인코딩하며, 이는 번역 동안(T2A의 경우) 또는 그 후에 개별 단백질로 절단된다. 일부 경우에서, 펩타이드, 예컨대 T2A는 리보솜에 의한 2A 요소의 C 말단의 펩타이드 결합의 합성의 스키핑(리보솜 스키핑)을 야기함으로써, 2A 서열의 말단과 하류의 다음 펩타이드 사이의 분리를 초래할 수 있다. 리보솜 스키핑을 유도할 수 있는 것을 포함하여, 2A 절단 펩타이드의 예로는 T2A, P2A, E2A 및 F2A이 있다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬을 상이한 벡터 내로 클로닝한다. 일부 구현예에서, 발생된 α 및 β 사슬을 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 내로 혼입시킨다.
일부 구현예에서, TCR 알파 및 베타 유전자를 피코르나바이러스(picornavirus) 2A 리보솜 스키핑 펩타이드를 통해 연결시켜, 두 사슬 모두가 공동발현되도록 한다.　일부 구현예에서, TCR의 유전자 전달을 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통하거나, 전이인자를 통해 달성한다(예를 들어, 문헌[Baum et al.(2006) Molecular Therapy: Journal of American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al.(2010) Molecular Therapy: Journal of American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; Hackett et al.(2010) Molecular Therapy: Journal of American Society of Gene Therapy. 18:674-683] 참조).
2. 벡터 및 조작 방법
제공되는 방법은 이러한 결합 분자를 발현하는 유전자 조작된 세포의 생산을 위해, CAR 또는 TCR을 포함하는 재조합 수용체를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 조작은 일반적으로, 예를 들어 레트로바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의한 세포 내로의 재조합 또는 조작된 성분을 인코딩하는 핵산의 도입을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정되는 바와 같이, 예컨대, 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극 인자와 세포를 조합시킴으로써, 제1 단계로서, 세포를 자극한 후, 활성화된 세포를 형질도입시키고, 배양에서, 임상 적용에 충분한 수로 확장시킴으로써, 유전자 전달을 달성한다.
유전자 조작된 성분, 예를 들어 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 도입을 위한 다양한 방법이 잘 공지되어 있으며, 제공되는 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 전이인자, 및 전기천공을 통한 것을 포함하여, 수용체를 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터 또는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적절한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적절한 숙주의 형질전환 또는 형질감염에 사용될 수 있다. 적절한 벡터는, 플라스미드 및 바이러스와 같이, 번식 및 확장 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 적절한 경우, 벡터가 도입될 숙주의 유형(예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 당업자에 공지된 다른 프로모터가 또한 고려된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래한 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여, 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여, T 세포 내로 전달된다(예를 들어, 문헌[Koste et al.(2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al.(2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al.(2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복부 서열(LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식성 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(SFFV), 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터를 가질 수 있다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래한 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 양쪽성이며, 이는 이들이 인간을 포함하는 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적 레트로바이러스 시스템이 기재된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 제 5,219,740호; 제 6,207,453호; 제 5,219,740호; 문헌[Miller and Rosman(1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D.(1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al.(1991) Virology 180:849-852; Burns et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin(1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]).
렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적 방법은, 예를 들어 문헌[Wang et al.(2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; Cooper et al.(2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al.(2009) Methods Mol Biol . 506: 97-114; 및 Cavalieri et al.(2003) Blood.　102(2): 497-505]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam et al,(2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al.(2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포지션(transposition)를 통해 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, 문헌[Manuri et al.(2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al.(2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang et al.(2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하여, 발현시키는 다른 방법으로는 인산칼륨 형질감염(예를 들어, 존 윌리 앤드 손(미국 뉴욕주 뉴욕 소재)의 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜 매개 형질감염; 텅스텐 입자 촉진 미립자 충격(문헌[Johnston, Nature, 346: 776-777(1990)]); 및 스트론튬 인산염 DNA 공-침전(문헌[Brash et al, Mol. Cell Biol, 7: 2031-2034(1987)])을 포함한다.
재조합 산물을 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터에는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제 WO2014055668호 및 미국 특허 제 7,446,190호에 기재된 것이 있다.
일부 상황에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현은 대상체에게 유독할 수 있다. 따라서, 일부 상황에서, 조작된 세포는 입양 면역 요법에서의 투여 시와 같이, 생체내에서 세포가 음성 선택에 민감성이 되도록 하는 유전자 절편을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 세포는 세포가 투여되는 환자의 생체내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 조작된다. 음성적으로 선택 가능한 표현형은 투여된 제제, 예를 들면 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입에 기인할 수 있다. 음성적으로 선택 가능한 유전자로는 간시클로비르(ganciclovir) 민감성을 부여하는 단순 포진 바이러스 I형 티미딘 키나제(HSV-1 TK) 유전자(문헌[Wigler et al., Cell II: 223, 1977]); 세포내 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(cellular hypoxanthine phosphribosyltransferase)(HPRT) 유전자, 세포내 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자, 박테리아 시토신 데아미나제(문헌[Mullen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33(1992)])를 포함한다.
일부 양태에서, 세포는 사이토카인 또는 다른 인자의 발현이 촉진되도록 추가로 조작된다.
특히, 추가적인 핵산, 예를 들어 도입을 위한 유전자는, 예컨대 전달되는 세포의 생존 및/또는 기능을 촉진시킴으로써, 요법의 효능을 개선시키는 것; 예컨대 생체내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 예를 들어, 문헌[Lupton S. D. et al., Mol . and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이, 생체내에서 음성 선택에 민감성인 세포를 제조함으로써, 안전성을 개선하기 위한 유전자이며; 또한 우성 양성 선택 가능 마커와 음성 선택 가능 마커의 융합으로부터 유래한 2기능성 선택 가능 융합 유전자의 사용을 기술하고 있는 Lupton 등에 의한 제 PCT/US91/08442호 및 제 PCT/US94/05601호의 공보물을 참조한다. 예를 들어, Riddell 등의 미국 특허 제 6,040,177호, 컬럼 14 내지 17을 참조한다.
C. PDCD1의 유전자 편집
본 명세서에서 제공되는 임의의 구현예에서, 유전자 변경 또는 유전자 편집에 적용될 수 있으며, 이는 조작된 면역 세포는, 면역조절에 관여하는 유전자를 인코딩하는 좌위에 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집을 위한 표적 좌위는 프로그래밍된 세포 사멸(PD-1) 단백질을 인코딩하는 프로그래밍된 세포 사멸 1(PDCD1) 좌위이다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 표적화된 좌위에서의 삽입 또는 결실 또는 표적화된 좌위의 "넉아웃" 및 인코딩된 단백질의 발현의 제거를 유발한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, 비상동성 말단 결합(NH더에 의해 달성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 분자가 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제, Cas9 닉카제, 효소적으로 불활성인 Cas9 또는 이들의 변이체와 함께 사용된다. gRNA 분자(들) 및 Cas9 분자(들)의 예시적 특성이 하기에 기재된다.
1. 가이드 RNA( gRNA ) 분자
일부 구현예에서, 이러한 제제는 PDCD1 좌위의 영역을 표적화하는 gRNA를 포함한다. "gRNA 분자"는 세포의 게놈 DNA 상의 좌위와 같이, 표적 핵산으로의 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산을 지칭한다. gRNA 분자는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있으며, 때때로 본 명세서에서 "키메라" gRNA, 또는 모듈(하나 초과 및 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자 포함)로서 지칭된다.
도메인이 표시된 몇몇 예시적 gRNA 구조가 도1에 제공된다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 3차원 형태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내- 또는 가닥간 상호작용에 대해, 고 상보성 영역은 때때로 도1에서 이중가닥 및 본 명세서에 제공된 다른 도시로서 나타낸다.
일부 경우에서, gRNA는 5'에서 3'으로 PDCD1 유전자로부터의 서열(SEQ ID NO: 51208에 제시된 코딩 서열)과 같은 표적 핵산에 상보성인 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 상보성임); 근위 도메인; 및 선택적으로, 꼬리 도메인을 포함하는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
다른 경우, gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함하는 모듈 gRNA이다. 이들 경우, 제1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3'으로 표적화 도메인(SEQ ID NO: 51208에 제시된 코딩 서열인 PDCD1 유전자로부터의 서열과 같은 표적 핵산에 상보성임) 및 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제2 가닥은 일반적으로 5'에서 3'으로 선택적으로, 5' 연장 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 선택적으로, 꼬리 도메인을 포함한다.
이들 도메인은 하기에서 간략하게 논의된다:
a) 표적화 도메인
도 1은 표적화 도메인의 대체의 예를 제공한다.
표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보성, 예를 들어 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보성, 예를 들어 완전히 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 표적 핵산의 "상보성 가닥"으로서 지칭된다. 표적화 도메인의 선택에 대한 지침은, 예를 들어 문헌[Fu Y et al, Nat Biotechnol 2014(doi: 10.1038/nbt.2808) 및 Sternberg SH et al, Nature 2014(doi: 10.1038/nature13011)]에서 찾아 볼 수 있다.
표적화 도메인은 RNA 분자의 부분이며, 따라서 염기 우라실(U)을 포함하는 한편, gRNA 분자를 인코딩하는 임의의 DNA는 염기 티민(T)을 포함할 것이다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 구현예에서, 표적 서열을 지니는 표적화 도메인의 상보성은 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 표적 핵산과의 상호작용의 특이성이 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인 내 우라실 염기는 표적 서열 내 아데닌 염기와 쌍을 이룬다는 것이 이해된다. 구현예에서, 표적 도메인 그 자체는 5'에서 3' 방향으로 선택적 2차 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보성이다. 일 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 5개 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 표적화 도메인과 상보적인 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 상보적 가닥으로서 지칭된다. 도메인의 뉴클레오타이드 중 일부 또는 전부는, 예를 들어 분해에 덜 민감성이 되도록 하고, 생체 적합성을 개선하는 등의 변형을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적 도메인의 백본은 포스포로티오에이트, 또는 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 일부 경우에서, 표적화 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화, 또는 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 표적화 도메인은 16개 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이이다(즉, 이는 16개의 뉴클레오사이드 길이, 또는 17개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이임).
예시적 표적화 도메인
일부 구현예에서, 표적 서열(표적 도메인)은 SEQ ID NO: 51208에 제시된 PDCD1 코딩 서열의 임의의 일부분과 같은 PDCD1 좌위 또는 그 부근이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인에 상보성인 표적 핵산은 PDCD1과 같은 관심대상 유전자의 초기 코딩 영역에 위치한다. 초기 코딩 영역의 표적화를 사용하여, 관심대상 유전자를 넉아웃시킬 수 있다(즉, 그의 발현을 제거할 수 있음). 일부 구현예에서, 관심대상 유전자의 초기 코딩 영역은 출발 코돈(예를 들어, ATG) 직후 또는 500 bp 내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 또는 10 bp 미만)의 서열을 포함한다. 특정 예에서, 표적 핵산은 출발 코돈의 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 내이다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 PDCD1 좌위 내의 표적 핵산과 같은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보성, 예를 들어 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보성, 예를 들어 완전히 상보성이다.
일부 구현예에서, PDCD1의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 481 내지 3748 또는 14657 내지 21037 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. 피오게네스 Cas9 또는 N. 메닌기티디스 Cas9를 사용하여, PDCD1 유전자를 넉아웃시키기 위한 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. 피오게네스 Cas9를 사용하여, PDCD1을 넉아웃시키기 위한 것을 포함한다. 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 닉카제)을 발생시키는 S. 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 이중 표적화는 반대쪽 DNA 가닥에 상보성인 2개의 표적화 도메인을 갖는 S. 피오게네스 Cas9 닉카제를 사용함으로써, 반대쪽 DNA 가닥에 2개의 닉(nick)을 생산시키기 위해 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA가 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는 PAM이 외부로 향하고, gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 DNA 상에 배향된다. 일 구현예에서, 예를 들어, 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍을 사용하여, 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하기 위해, 2개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2개의 Cas9 닉카제를 표적화하는 데, 2개의 gRNA가 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 Cas9 닉카제는 HNH 활성을 갖는 분자, 예를 들어 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10에서의 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자, RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840에서의 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자, 또는 RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 N863에서의 돌연변이, 예를 들어 N863A를 갖는 Cas9 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 2개의 gRNA는 D10A Cas9 닉카제와 복합체화된다.
일부 구현예에서, 2개의 표적화 도메인은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 갖는 gRNA와 쌍을 형성할 수 있는 그룹 A의 임의의 서열이거나, 이를 포함하는 표적화 도메인을 갖는 gRNA를 포함할 수 있다(표 1a). 일부 구현예에서, 그룹 C로부터의 표적화 도메인을 갖는 gRNA는 그룹 D로부터의 임의의 표적화 도메인을 갖는 gRNA와 쌍을 형성할 수 있다(표 1a).
[표 1a]
Figure pct00001
일부 구현예에서, 2개의 표적화 도메인은 그룹 F로부터의 임의의 표적화 도메인을 갖는 gRNA와 쌍을 형성할 수 있는 그룹 E의 임의의 서열이거나, 이를 포함하는 표적화 도메인을 갖는 gRNA를 포함할 수 있다(표 1b).
[표 1b]
Figure pct00002
일부 구현예에서, 2개의 표적화 도메인은 표 1c의 다음의 쌍으로부터의 gRNA 쌍을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍은, 각각 D10A Cas9 닉카제와 복합체화된 표 1c로부터의 gRNA 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍은 각각 N863A Cas9 닉카제와 복합체화된 표 1c로부터의 gRNA 쌍을 포함한다.
[표 1c]
Figure pct00003
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 FAS, BID, CTLA4 , CBLB , PTPN6 , TRAC 및/또는TRBC 중 하나 이상으로부터의 좌위로의 추가적 또는 대안적 표적화에 의한 유전자 변경, 또는 유전자 편집에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 및TRBC 유전자 중 하나 이상이, 예를 들어 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 주기 위해, 표적화된 넉아웃 또는 넉다운으로서 표적화된다. 일 구현예에서, 상기 접근법은 하나의 T 세포 발현 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자)의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 2개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 3개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 3개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 4개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB, PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 4개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 5개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 5개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 6개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 6개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 7개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자 중 7개의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 접근법은 8개의 T 세포 발현 유전자, 예를 들어 각각의 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1, CBLB , PTPN6 , TRAC 및TRBC 유전자의 넉아웃 또는 넉다운을 포함한다.
일부 구현예에서, FAS의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 8460 내지 10759 또는 27729 내지 32635 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, BID의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 10760 내지 13285 또는 40252 내지 45980 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA4의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 13286 내지 14656 또는 45981 내지 49273 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CBLB의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 6119 내지 8639 또는 32636 내지 40251 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, PTPN6의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 3749 내지 6118 또는 21038 내지 27728 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, TRAC의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 49274 내지 49950 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, TRBC의 넉아웃 또는 넉다운을 위한 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 49951 내지 51200 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
b) 제1 상보성 도메인
도 1a 내지 도 1g는 제1 상보성 도메인의 예를 제공한다. 제1 상보성 도메인은 하기에 기재된 제2 상보성 도메인과 상보적이고, 일반적으로, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 제2 상보성 도메인과 이중가닥 영역을 형성하기에 충분한 상보성을 가진다. 제1 상보성 도메인은 통상적으로 5개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이이고, 5개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 7개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 7개 내지 22개의 뉴클레오타이드 길이, 7개 내지 18개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 7개 내지 15개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이이다.
통상적으로, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인 표적과 정확한 상보성을 갖는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드와 상보성이 아닌 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 상보성 도메인의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개(예를 들어, 3개)의 뉴클레오타이드의 절편은 이중가닥 내에서 쌍을 형성하지 않을 수 있으며, 비이중가닥 또는 외부로 루프가 형성된 영역을 형성할 수 있다. 일부 예에서, 비쌍 또는 외부로 루프가 형성된 영역, 예를 들어 3개의 뉴클레오타이드의, 외부로 형성된 루프가 제2 상보성 도메인에 존재한다. 이러한 비쌍 영역은 선택적으로, 제2 상보성 도메인의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개, 예를 들어 4개째의 뉴클레오타이드에서 시작된다.
제1 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인, 중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3개의 서브도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 5' 서브도메인은 4개 내지 9개, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 중앙 서브도메인은 1, 2, 또는 3, 예를 들어 1개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 3' 서브도메인은 3개 내지 25개, 예를 들어 4개 내지 22개, 4개 내지 18개, 또는 4개 내지 10, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥인 경우, 예를 들어 gRNA 서열 내에 11개 쌍의 뉴클레오타이드를 포함한다(쌍을 형성하는 하나의 가닥은 밑줄 표시되어 있고, 하나는 볼드체임): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 5).
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥인 경우, 예를 들어 gRNA 서열 내에 15개 쌍의 뉴클레오타이드를 포함한다(쌍을 형성하는 하나의 가닥은 밑줄 표시되어 있고, 하나는 볼드체임): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 27).
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥인 경우, 예를 들어 gRNA 서열 내에 16개 쌍의 뉴클레오타이드를 포함한다(쌍을 형성하는 하나의 가닥은 밑줄 표시되어 있고, 하나는 볼드체임): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 28).
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥인 경우, 예를 들어 gRNA 서열 내에 21개 쌍의 뉴클레오타이드를 포함한다(쌍을 형성하는 하나의 가닥은 밑줄 표시되어 있고, 하나는 볼드체임): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 29).
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는, 예를 들어 gRNA 서열에서 폴리-U자관을 제거하기 위해 교환된다(밑줄 표시된 뉴클레오타이드가 교환됨): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 30); NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 31); 및 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAUGCUGUAUUGGAAACAAUACAGCAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 32).
제1 상보성 도메인은 천연 유래 제1 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나, 이로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제1 상보성 도메인, 예를 들어 S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌그티디스 또는 S. 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
제1 상보성 도메인의 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 심지어 모두는 변형, 예를 들어 표적화 도메인에 대해 상기에서 논의된 줄에 따른 변형을 가질 수 있다.
c) 연결 도메인
도 1a 내지 도 1g는 연결 도메인의 예를 제공한다.
단분자 또는 키메라 gRNA에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인을 단분자 gRNA의 제2 상보성 도메인과 연결하는 작용을 한다. 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 또는 비공유적으로 연결할 수 있다. 일 구현예에서, 연결은 공유적으로 이루어진다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 결합시키며, 예를 들어 도 1b 내지 도 1e를 참조한다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인 사이에 개재된 공유 결합이거나, 이를 포함한다. 통상적으로 연결 도메인은 하나 이상의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함하나, 다양한 구현예에서, 링커는 20, 30, 40, 50 또는 심지어 100개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
모듈 gRNA 분자에서, 2개의 분자는 상보성 도메인의 혼성화에 의해 결합되며, 연결 도메인은 존재할 수 없다. 예를 들어 도 1a를 참조한다.
매우 다양한 연결 도메인은 단분자 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 연결 도메인은 공유 결합으로 이루어질 수 있거나, 하나 또는 소수의 뉴클레오타이드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이만큼 짧을 수 있다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 2개 내지 50개, 2개 내지 40개, 2개 내지 30개, 2개 내지 20개, 2개 내지 10개 또는 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 천연 유래 서열, 예를 들어 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 tracrRNA의 서열과 상동성을 공유하거나, 이로부터 유래한다. 일 구현예에서, 연결 도메인은 본 명세서에 개시된 연결 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
제1 상보성 도메인과 관련하여, 상기에서 논의된 바와 같이, 연결 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형을 포함할 수 있다.
d) 5' 연장 도메인
일부 경우에서, 모듈 gRNA는 본 명세서에서 5' 연장 도메인으로 지칭되는 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 추가적인 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 도 1a를 참조한다. 일 구현예에서, 5' 연장 도메인은 2개 내지 10개, 2개 내지 9개, 2개 내지 8개, 2개 내지 7개, 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 또는 2개 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 5' 연장 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다.
e) 제2 상보성 도메인
도 1a 내지 도 1g는 제2 상보성 도메인의 예를 제공한다. 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보성이고, 일반적으로, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 제2 상보성 도메인과 이중가닥 영역을 형성하기에 충분한 상보성을 가진다. 일부 경우에서, 예를 들어 도 1a내지도 1b에 나타낸 바와 같이, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과의 상보성이 결여된 서열, 예를 들어 이중가닥 영역으로부터 외부로 루프가 형성된 서열을 포함할 수 있다.
제2 상보성 도메인은 5개 내지 27개의 뉴클레오타이드 길이이며, 일부 경우에서, 제1 상보성 영역보다 더 길 수 있다. 예를 들어, 제2 상보성 도메인은 7개 내지 27개의 뉴클레오타이드 길이, 7개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 7개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 7개 내지 17개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 더욱 일반적으로, 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일 구현예에서, 제2 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인, 중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3개의 서브도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 5' 서브도메인은 3개 내지 25개, 예를 들어 4개 내지 22개, 4개 내지 18개, 또는 4개 내지 10개, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 중앙 서브도메인은 1, 2, 3, 4 또는 5개, 예를 들어 3개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 3' 서브도메인은 4개 내지 9개, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 5' 서브도메인 및 3' 서브도메인은 각각, 제2 상보성 도메인의 3' 서브도메인 및 5' 서브도메인과 상보성이며, 예를 들어 완전히 상보성이다.
제2 상보성 도메인은 천연 유래 제2 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나, 이로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제2 상보성 도메인, 예를 들어 S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌그티디스 또는 S. 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
제2 상보성 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는, 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에 개진된 변형을 가질 수 있다.
f) 근위 도메인
도 1a내지도 1g는 근위 도메인의 예를 제공한다.
일 구현예에서, 근위 도메인은 5개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 근위 도메인은 천연 유래 근위 도메인과 상동성을 공유하거나, 이로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 근위 도메인, 예를 들어 S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌그티디스 또는 S. 써모필루스 근위 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
근위 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어 상기에 기재된 줄에 따른 변형을 가질 수 있다.
g) 꼬리 도메인
도 1a 내지 도 1g는 꼬리 도메인의 예를 제공한다.
도 1a 및 도 1b 내지 도 1f에서 꼬리 도메인의 조사에 의해 알 수 있는 바와 같이, 광범위한 꼬리 도메인이 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 다양한 구현예에서, 꼬리 도메인은 0(부재함), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 구현예에서, 꼬리 도메인 뉴클레오타이드는 천연 유래 꼬리 도메인의 5' 말단으로부터의 서열로부터 유래하거나, 이와 상동성을 공유하며, 예를 들어 도 1d또는도 1e를 참조한다. 꼬리 도메인은 또한 선택적으로, 서로에 대해 상보성이고, 적어도 일부 생리적 조건 하에서, 이중가닥 영역을 형성하는 서열을 포함한다.
꼬리 도메인은 천연 유래 근위 꼬리 도메인과 상동성을 공유하거나, 이로부터 유래할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시내용의 다양한 구현예에 따른 소정의 꼬리 도메인은 본 명세서에 개시된 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌그티디스 또는 S. 써모필루스 꼬리 도메인과 적어도 50% 상동성을 공유할 수 있다.
특정 경우, 꼬리 도메인은 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단의 뉴클레오타이드를 포함한다. T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용되는 경우, 이들 뉴클레오타이드는 DNA 주형의 3' 말단 앞에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 이들 뉴클레오타이드는 서열 UUUUUU일 수 있다. 대안의 pol-III 프로모터가 사용되는 경우, 이들 뉴클레오타이드는 다양한 수 또는 우라실 염기일 수 있거나, 대안의 염기를 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 다양한 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은 합쳐서, 다음의 서열을 포함한다:
AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(SEQ ID NO: 33),
AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC(SEQ ID NO: 34),
AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAUC(SEQ ID NO: 35),
AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(SEQ ID NO: 36),
AAGGCUAGUCCGUUAUCA(SEQ ID NO: 37), 또는
AAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO: 38).
일 구현예에서, 예를 들어, U6 프로모터가 전사에 사용되는 경우, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUUUU를 포함한다.
일 구현예에서, 예를 들어 H1 프로모터가 전사에 사용되는 경우, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUU를 포함한다.
일 구현예에서, 꼬리 도메인은, 예를 들어 사용된 pol-III 프로모터프로모터의 종결 신호에 따라서 3' U의 가변 수를 포함한다.
일 구현예에서, 꼬리 도메인은 T7 프로모터가 사용되는 경우, DNA 주형으로부터 유래한 가변 3' 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 꼬리 도메인은, 예를 들어 시험관내 전사가 RNA 분자를 발생시키기 위해 사용되는 경우, DNA 주형으로부터 유래한 가변 3' 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 꼬리 도메인은, 예를 들어 pol-II 프로모터가 전사를 구동시키기 위해 사용되는 경우, DNA 주형으로부터 유래한 가변 3' 서열을 포함한다.
일 구현예에서, gRNA는 다음 구조를 갖는다:
5' [표적화 도메인]-[제1 상보성 도메인]-[연결 도메인]-[제2 상보성 도메인]-[근위 도메인]-[꼬리 도메인]-3'
여기서, 표적화 도메인은 코어 도메인 및 선택적으로 제2 도메인을 포함하고, 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이고;
제1 상보성 도메인은 5개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 제1 기준 상보성 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 가지고;
연결 도메인은 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이이고;
근위 도메인은 5개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이이고, 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 기준 근위 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 가지며;
꼬리 도메인은 부재하거나, 뉴클레오타이드 서열은 1개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이고, 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 기준 꼬리 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 가진다.
h) 예시적 키메라 gRNA
일 구현예에서, 단분자, 또는 키메라 gRNA는 바람직하게는 5'에서 3'으로, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인(표적 핵산에 상보성임); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 상보성임); 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기서, (a) 근위 및 꼬리 도메인은, 합쳐서, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함하거나; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 존재하거나; (c) 제1 상보성 도메인의 그의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 존재한다.
일 구현예에서, (a), (b), 또는 (c)로부터의 서열은, 천연 유래 gRNA의 상응하는 서열, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은, 합쳐서, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 존재한다. 일 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 그의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 존재한다. 일 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 이를 가지거나, 이로 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 단분자, 또는 키메라 gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및, 선택적으로, 꼬리 도메인 포함)는, 표적화 도메인이 20개의 N으로서 도시되나, 임의의 서열일 수 있고, 16개 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이의 범위이고, gRNA 서열 이후, U6 프로모터의 종결 신호로서 작용하나, 부재하거나, 6개보다 더 소수일 수 있는 6개의 U가 후행하는 다음 서열을 포함한다: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU(SEQ ID NO: 40). 일 구현예에서, 단분자, 또는 키메라 gRNA 분자는 S. 피오게네스 gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, 단분자, 또는 키메라 gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및, 선택적으로, 꼬리 도메인 포함)는, 표적화 도메인이 20개의 N으로서 도시되나, 임의의 서열일 수 있고, 16개 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이의 범위이고, gRNA 서열 이후, U6 프로모터의 종결 신호로서 작용하나, 부재하거나, 6개보다 더 소수일 수 있는 6개의 U가 후행하는 다음 서열을 포함한다: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU(SEQ ID NO: 41). 일 구현예에서, 단분자, 또는 키메라 gRNA 분자는 S. 아우레우스 gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, 예시적 키메라 gRNA의 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 481 내지 3748 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다..
일부 구현예에서, 예시적 키메라 gRNA의 표적화 도메인은 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723) 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)이거나, 이를 포함한다.
예시적 키메라 gRNA의 서열 및 구조가 또한 도 10a 내지 도 10b에 도시되어 있다.
i) 예시적 모듈 gRNA
일 구현예에서, 모듈 gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3'으로, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제2 가닥은 바람직하게는 5'에서 3'으로 선택적으로 5' 연장 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기서: (a) 근위 및 꼬리 도메인은, 합쳐서, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함하고; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 존재하거나; (c) 제1 상보성 도메인의 그의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 존재한다.
일 구현예에서, (a), (b), 또는 (c)로부터의 서열은 천연 유래 gRNA의 상응하는 서열, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 상보성을 갖는다. 일 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은, 합쳐서, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 그의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 존재한다.
일 구현예에서, 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 존재한다.
일 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적 뉴클레오타이드)를 갖거나, 이로 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 예시적 모듈 gRNA 내의 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 481-3748 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적 모듈 gRNA 내의 표적화 도메인은 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723) 중 임의의 것으로부터 선택된 서열이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579)이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)이거나, 이를 포함한다.
2. gRNA의 설계 방법
표적화 도메인의 선택, 설계 검증 방법을 포함하여, gRNA의 설계 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 예시적 표적화 도메인이 또한 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 논의되는 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
비표적 분석뿐만 아니라, 표적 서열의 선택 및 검증을 위한 방법이, 예를 들어 문헌[Mali et al, 2013 Science 339(6121): 823-826; Hsu et al. Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu et al, 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al, 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al, 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al, 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 소프트웨어 툴은 사용자의 표적 서열 내의 gRNA 선택을 최적화하기 위해, 예를 들어 게놈에 걸친 총 비표적 활성을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 비표적 활성은 절단이 아닌 다른 것일 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스Cas9를 이용하는 각각의 가능한 gRNA 선택을 위해, 소프트웨어 툴은 미스매칭된 염기 쌍의 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)까지를 함유하는 게놈에 걸쳐 모든 잠재적 비표적 서열(NAG 또는 NGG PAM 중 하나에 선행함)을 확인할 수 있다. 각각의 비표적 서열에서 절단 효율은, 예를 들어 실험적으로 유래한 가중치법(weighting scheme)을 이용하여 예측될 수 있다. 이어서, 각각의 가능한 gRNA는 예측된 그의 총 비표적 절단에 따라 랭크되며; 상위 랭크된 gRNA는 최대 표적내 및 최소 비표적 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어 gRNA 벡터 작제물을 위한 자동화된 시약 설계, 표적내 서베이어(Surveyor) 분석에 대한 프라이머 설계, 및 차세대 서열분석을 통한 비표적 절단의 고속 대량 검출 및 정량화를 위한 프라이머 설계가 또한 툴 내에 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, S. 피오게네스, S. 아우레우스 및 N. 메닌기티디스 Cas9와 사용하기 위한 gRNA를 DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여, 예를 들어 공공 툴 cas-offinder를 기반으로 한 커스텀 gRNA 설계 소프트웨어를 사용하여 확인한다(문헌[Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475]). 커스텀 gRNA 설계 소프트웨어는 그들의 게놈 전체의 비표적 경향성을 계산한 후에 가이드들을 스코어링한다. 통상적으로 완전한 매칭으로부터 7개의 미스매칭까지의 범위에 있는 매칭은 17개 내지 24개의 길이의 범위에 있는 가이드에 대해 고려된다. 일부 양태에서, 비표적 부위가 컴퓨터에 의해 결정된 경우, 각각의 가이드에 대한 총 스코어가 계산되고, 웹-인터페이스를 이용하여 테이블 형식의 산출물로 정리된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택되는 gRNA 부위로부터 1, 2, 3개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 유전자에 대한 g게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우저로부터 얻고, 공개적으로 이용 가능한 리피트마스커(RepeatMasker) 프로그램을 이용하여 반복 요소에 대한 서열을 스크리닝할 수 있다. 리피트마스커는 낮은 복잡성의 반복 요소 및 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복부의 상세한 주석이다.
확인 후, 표적 부위에 대한 그들의 거리, 그들의 직교성 및 5' G의 존재(적절한 PAM, 예를 들어 S. 피오게네스의 경우에 NGG PAM, S. 아우레우스의 경우에 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 N. 메닌그티디스의 경우에, NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈에서 거의 매칭된 것의 확인을 기반으로 함) 중 하나 이상을 기반으로 하여, gRNA를 티어들로 랭크할 수 있다. 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매칭을 함유하는 인간 게놈 내 서열 수를 지칭한다. "고수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은, 예를 들어, 의도된 표적 이외에는 인간 게놈에서 동일한 서열을 갖지 않거나, 표적 서열에서 1 또는 2개의 미스매칭을 함유하는 임의의 서열을 갖지 않는 20량체 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인은 비표적 DNA 절단을 최소화하도록 선택된다. 이는 비제한적 예이며, S. 피오게네스, S. 아우레우스 및 N. 메닌기티디스 또는 다른 Cas9 효소와 함께 사용하기 위한 gRNA를 확인하기 위해 다양한 전략이 활용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, S. 피오게네스Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 ZiFiT 서버를 이용하여 확인할 수 있다(문헌[Fu et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 2014 Jan 26. doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574], 본래의 참고문헌에 대해, 문헌[Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605; Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8] 참조). PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택되는 gRNA 부위로부터 1, 2, 3개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 일부 양태에서, 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우저로부터 얻고, 공개적으로 이용 가능한 리피트마스커 프로그램을 이용하여 반복 요소에 대한 서열을 스크리닝할 수 있다. 리피트마스커는 낮은 복잡성의 반복 요소 및 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복부의 상세한 주석이다.
확인 후, S. 피오게네스Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 티어, 예를 들어 5개의 티어로 랭크할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 티어 gRNA 분자의 표적화 도메인을 표적 부위에 대한 그들의 거리, 그들의 직교성 및 5' G의 존재(NGG PAM을 함유하는 인간 게놈에서 거의 매칭된 것의 ZiFiT 확인을 기반으로 함)를 기반으로 하여, 선택한다. 일부 구현예에서, 17량체 및 20량체 gRNA 둘 모두를 표적에 대해 설계한다. 일부 양태에서, 또한 단일-gRNA 뉴클레아제 커팅 및 이중 gRNA 닉카제 전략 둘 모두에 대해, gRNA를 선택한다. gRNA를 선택하기 위한 기준 및 gRNA가 이러한 전략을 위해 사용될 수 있는지를 결정하기 위한 기준은 몇몇 고려사항을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중-gRNA 쌍의 "닉카제" 전략 둘 모두에 대한 gRNA를 확인한다. 일부 구현예에서, gRNA가 이중-gRNA 쌍의 "닉카제" 전략에 사용될 수 있는지에 대한 결정을 포함하여, gRNA를 선택하는 경우, PAM이 외부로 향하고, D10A Cas9 닉카제에 의한 커팅이 5' 돌출부를 야기하도록 gRNA 쌍이 DNA 상에서 배향되어야 한다. 일부 양태에서, 이중 닉카제 쌍에 의한 절단이 합리적 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 유발할 것으로 추정할 수 있다. 그러나, 이중 닉카제 쌍에 의한 절단은 또한 gRNA 중 단지 하나의 부위에서 종종 삽입결실 돌연변이를 유발할 수 있다. 후보 쌍 구성원이 하나의 gRNA 부위에서 단지 삽입결실 돌연변이를 야기하는 것에 대해 전체 서열을 효율적으로 제거하는 방법에 대해, 이를 시험할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 티어 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치에 대한 합리적인 거리, 예를 들어 출발 코돈 하류의 코딩 서열의 처음 500 bp 이내 및 (2) 고수준의 직교성 및 (3) 5' G의 존재를 기반으로 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 티어 gRNA의 선택의 경우, 5' G의 필요성이 제거될 수 있으나, 거리 제한은 여구되며, 고수준의 직교성이 필요하였다. 일부 구현예에서, 제3 티어 선택에는 동일한 거리 제한 및 5' G의 필요성이 사용되나, 양호한 직교성의 필요성은 제거된다. 일부 구현예에서, 제4 티어 선택에는 동일한 거리 제한이 사용되나, 양호한 직교성 및 5'G에 의한 출발의 필요성이 제거된다. 일부 구현예에서, 제5 티어 선택에는 양호한 직교성 및 5'G의 필요성이 제거되고, 더 긴 서열(예를 들어, 나머지 코딩 서열, 예를 들어, 전사 표적 부위의 상류 또는 하류의 추가의 500 bp)이 스캐닝된다. 특정 예에서, gRNA는 특정 티어 기준을 기반으로 확인되지 않는다.
일부 구현예에서, 이중-gRNA 쌍 "닉카제" 전략뿐만 아니라, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단에 대해 gRNA를 확인한다.
일부 양태에서, N. 메닌기티디스 및 S. 아우레우스 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 PAM 서열의 존재에 대해 게놈 DNA 서열을 스캐닝함으로써 수동으로 확인할 수 있다. 이들 gRNA는 2개의 티어로 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 티어 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 티어 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 (처음 500 bp의 하류의) 잔여 코딩 서열 내에서 선택된다. 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준을 기반으로 확인되지 않는다.
일부 구현예에서, S. 피오게네스, S. 아우레우스 및 N. 메닌그티디스 Cas9와 함께 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 확인하기 위한 또 다른 전략에 DNA 서열 검색 알고리즘이 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 가이드 RNA 설계는 공공 툴 cas-offinder를 기반으로 한 커스텀 가이드 RNA 설계 소프트웨어를 사용하여 실시한다(참조: Cas-OFFinder: Cas9 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 잠재적 비표적 부위를 검색하는 빠른 범용 알고리즘, 문헌[Bioinformatics.　2014 Feb 17. Bae S,　Park J,　Kim JS.　PMID:24463181]). 상기 커스텀 가이드 RNA 설계 소프트웨어는 그들의 게놈 전체의 비표적 경향성을 계산한 후에 가이드들을 스코어링한다. 통상적으로 완전한 매칭으로부터 7개의 미스매칭까지의 범위에 있는 매칭은 17개 내지 24개의 길이의 범위에 있는 가이드에 대해 고려된다. 비표적 부위가 컴퓨터에 의해 결정된 경우, 각각의 가이드에 대한 총 스코어가 계산되고, 웹-인터페이스를 이용하여 테이블 형식의 산출물로 정리된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택되는 gRNA 부위로부터 1, 2, 3개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 일부 구현예에서, 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우저로부터 얻고, 공개적으로 이용 가능한 리피트마스커 프로그램을 이용하여 반복 요소에 대한 서열을 스크리닝한다. 리피트마스커는 낮은 복잡성의 반복 요소 및 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복부의 상세한 주석이다.
일부 구현예에서, 확인 후에, 표적 부위에 대한 그들의 거리, 그들의 직교성(적절한 PAM, 예를 들어 S. 피오게네스의 경우에 NGG PAM, S. 아우레우스의 경우에 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 N. 메닌그티디스의 경우에, NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈에서 밀접한 매칭의 확인에 기반함)에 기반하여 gRNA를 티어들로 랭크한다. 일부 양태에서, 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인은 비표적 DNA 절단을 최소화하도록 선택된다.
예로서, S. 피오게네스 및 N. 메닌그티디스 표적에 대해, 17량체, 또는 20량체 gRNA가 설계될 수 있다. 다른 예로서, S. 아우레우스 표적에 대해, 18량체, 19량체, 20량체, 21량체, 22량체, 23량체 및 24량체 gRNA가 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중-gRNA 쌍의 "닉카제" 전략의 gRNA를 확인한다. 일부 구현예에서, gRNA가 이중-gRNA 쌍의 "닉카제" 전략에 사용될 수 있는지에 대한 결정을 포함하여, gRNA를 선택하는 경우, PAM이 외부로 향하고, D10A Cas9 닉카제에 의한 커팅이 5' 돌출부를 야기하도록 gRNA 쌍이 DNA 상에서 배향되어야 한다. 일부 양태에서, 이중 닉카제 쌍에 의한 절단이 합리적 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 유발할 것으로 추정할 수 있다. 그러나, 이중 닉카제 쌍에 의한 절단은 또한 gRNA 중 단지 하나의 부위에서 종종 삽입결실 돌연변이를 유발할 수 있다. 후보 쌍 구성원이 하나의 gRNA 부위에서 단지 삽입결실 돌연변이를 야기하는 것에 대해 전체 서열을 효율적으로 제거하는 방법에 대해, 이를 시험할 수 있다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, S. 피오게네스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 그들의 표적 부위에 대한 거리 및 그들의 직교성(PAM은 NGG임)에 기반하여 선택된다. 일부 경우에서, 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치에 대한 합리적인 거리, 예를 들어 출발 코돈 하류의 코딩 서열의 처음 500 bp 이내 및 (2) 고수준의 직교성에 기반하여 선택된다. 일부 양태에서, 티어 2 gRNA의 선택에 대해, 고수준의 직교성은 필요하지 않다. 일부 경우에서, 티어 3 gRNA는 양호한 직교성의 필요가 제거되고, 더 긴 서열(예를 들어, 코딩 서열의 나머지)이 스캐닝될 수 있다.. 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않는다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, N. 메닌그티디스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. N. 메닌그티디스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. N. 메닌그티디스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 500 bp 하류의 코딩 서열의 나머지 내에서 선택되었다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1회 열거됨). 특정 예에서,gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않았다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인을 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 2 grNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, 이는 NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 하류의 코딩 서열의 나머지 내에서 선택되고, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 4 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되고, NNGRRV PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 5 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 하류의 코딩 서열의 나머지 내에서 선택되고, NNGRRV PAM을 함유한다. 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않는다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, S. 피오게네스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 고수준의 직교성을 갖는다. 일부 구현예에서, S. 피오게네스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 높은 직교성이 필요하지 않는다. 일부 구현예에서, S. 피오게네스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않는다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, N. 메닌그티디스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 고수준의 직교성을 갖는다. 일부 구현예에서, N. 메닌그티디스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되고, 높은 직교성이 필요하지 않는다. 일부 구현예에서, N. 메닌그티디스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않는다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되고, 고수준의 직교성을 가지며, PAM은 NNGRRT이다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 4 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되고, PAM은 NNGRRV이다. 일부 구현예에서, S. 아우레우스에 대한 티어 5 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 확인되지 않는다.
3. Cas9
다양한 종의 Cas9 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌기티디스 및 S. 써모필루스 Cas9 분자는 본 명세서에 개시한 상당수 개시 내용의 대상이지만, 본 명세서에 열거된 다른 종의 Cas9 단백질의, 또는 이로부터 유래되거나, 또는 이에 기반한 Cas9 분자가 마찬가지로 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서의 상당수의 기재가 S. 피오게네스, S. 아우레우스, N. 메닌기티디스 및 S. 써모필루스 Cas9 분자를 사용하지만, 다른 종으로부터의 Cas9 분자는 그들을 대체할 수 있다. 이와 같은 종은 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실러스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp .), 사이클리필러스 데니트리피칸스(Cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans),바실러스 세레우스(Bacillus cereus),바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 트루린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.),블라스토피레룰라 마리나(Blastopirellula marina),브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp .), 브레비바실러스 라테로스포러스(Brevibacillus laterosporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis),헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus),킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp .), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris),네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닌기티디스, 네이세리아 종(Neisseria sp .), 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp .), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii),로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris),로도불룸 종(Rhodovulum sp .), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri),스핑고모나스 종(Sphingomonas sp .), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp .), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp .) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 귀소하거나 또는 편재화되는분자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 해당 용어로서 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는, 기준 서열, 예를 들어 가장 유사한 천연 유래 Cas9 분자 또는 표2a의 서열과, 예를 들어 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 상이한 천연 유래 Cas9 분자 및 조작, 변경 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
a) Cas9 도메인
결정 구조는 2 종의 상이한 천연 유래 박테리아 Cas9 분자에 대해(문헌[Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014]) 그리고 가이드 RNA(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA의 합성 융합)를 이용하여 S. 피오게네스Cas9에 대해 결정되었다(문헌[Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579]).
천연 유래 Cas9 분자는 2개의 로브(인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브)를 포함하며; 이들 각각은 본 명세서에 기재된 도메인을 추가로 포함한다. 도 8a 및 도 8b는 1차 구조에서 중요한 Cas9 도메인 조직화의 개략도를 제공한다. 본 개시 내용 전체적으로 사용되는 도메인 명명 및 각각의 도메인에 의해 포함된 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Nishimasu et al]에 기재된 바와 같다. 아미노산 잔기의 넘버링은 S. 피오게네스로부터의 Cas9를 참조로 한다.
REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다. REC 로브는 다른 공지된 단백질과의 구조적 유사성을 공유하지 않는데, 이는 그것이 Cas9-특이적 기능성 도메인이라는 것을 나타낸다. BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, S. 피오게네스Cas9 서열의 아미노산 60 내지 93을 포함한다. REC1 도메인은 반복부:안티-반복부 이중가닥의, 예를 들어 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요하며, 따라서 표적 서열을 인식함으로써 Cas9 활성에 중요하다. REC1 도메인은 S. 피오게네스Cas9의 서열의 아미노산 94 내지 179 및 308 내지 717에서 2개의 REC1 모티프를 포함한다. 이들 2개의 REC1 도메인은, 선형 1차 구조에서 REC2 도메인에 의해 분리되기는 하지만, 3차 구조로 조립되어 REC1 도메인을 형성한다. REC2 도메인 또는 이의 부분은 또한 반복부:안티-반복부 이중가닥의 인식에서 어떤 역할을 할 수 있다. REC2 도메인은 S. 피오게네스Cas9 서열의 아미노산 180 내지 307을 포함한다.
NUC 로브는 RuvC 도메인(또한 본 명세서에서 RuvC-유사 도메인으로서 지칭됨), HNH 도메인(또한 본 명세서에서 HNH-유사 도메인으로서 지칭됨), 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제 상과 구성원에 대해 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보성 가닥을 절단한다. RuvC 도메인은 S. 피오게네스Cas9의 서열의 아미노산 1 내지 59, 718 내지 769 및 909 내지 1098에서 각각 3개의 분할 RuvC 모티프(종종 당업계에서 RuvCI 도메인, 또는 N-말단 RuvC 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서 통상적으로 지칭되는 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII)로부터 조립된다. REC1 도메인과 유사하게, 3개의 RuvC 모티프는 1차 구조에서 다른 도메인에 의해 선형으로 분리되지만, 그러나, 3차 구조에서, 3개의 RuvC 모티프는 RuvC 도메인을 조립하고 형성한다. HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 놓이며, S. 피오게네스Cas9 서열의 아미노산 775 내지 908을 포함한다. PI 도메인은 표적 핵산 분자의 PAM과 상호작용하며, S. 피오게네스Cas9 서열의 아미노산 1099 내지 1368을 포함한다.
(1) RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인 및 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 절단 활성은 RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인에 따른다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다: RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 이하에 기재하는 RuvC-유사 도메인, 및/또는 HNH-유사 도메인, 예를 들어 이하에 기재하는 HNH-유사 도메인을 포함한다.
(2) RuvC-유사 도메인
일 구현예에서, RuvC-유사 도메인은 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보성 가닥을 절단한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나 초과의 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 1개, 2개, 3개 이상의 RuvC-유사 도메인)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5개, 6개, 7개, 8개의 아미노산이지만, 길이로 20개, 19개, 18개, 17개, 16개 또는 15개 이하의 아미노산이다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 약 10개 내지 20개의 아미노산, 예를 들어 길이로 약 15개의 아미노산의 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
(3) N-말단 RuvC-유사 도메인
일부 천연 유래 Cas9 분자는 하나 초과의 RuvC-유사 도메인을 포함하며, 절단은 N-말단 RuvC-유사 도메인에 의존적이다. 따라서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 N-말단 RuvC-유사 도메인은 이하에 기재된다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 I의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO: 8),
여기서,
X1는 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2는 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되고(예를 들어, A 또는 N);
X4는 S, Y, N 및 F로부터 선택되며(예를 들어, S);
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되고);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L로부터 선택되며(예를 들어, W);
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되고(예를 들어, A 및 S로부터 선택되고);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되며(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 및
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(△로 표기)(예를 들어, T, V, I, L, △, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나, 또는, 예를 들어,T, V, I, L 및 △로부터 선택됨).
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 SEQ ID NO: 8의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 절단 적격이다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 절단 부적격이다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 II의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-S-X5-G-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO: 9),
식 중,
X1은 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2은 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되고(예를 들어, A 또는 N으로부터 선택되고);
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되며(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되며);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L로부터 선택되고(예를 들어, W);
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되며(예를 들어, A 및 S로부터 선택되며);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되고(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 그리고
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, △, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나 또는, 예를 들어 T, V, I, L 및 △로부터 선택된다).
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 SEQ ID NO: 9의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 하기식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-X2-X3-S-V-G-W-A-X8-X9(SEQ ID NO: 10),
여기서
X2은 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되고(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되고);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되며(예를 들어, A 또는 N);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되고(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 그리고
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, △, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나 또는, 예를 들어 T, V, I, L 및 △로부터 선택된다).
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 SEQ ID NO: 10의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 하기 식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-T-N-S-V-G-W-A-V-X(SEQ ID NO: 11),
식 중
X는 비극성 알킬 아미노산 또는 하이드록실 아미노산이고, 예를 들어 X는 V, I, L 및 T로부터 선택된다(예를 들어, eaCas9 분자는 도 2a 내지 도 2g에 나타낸 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다(Y로서 도시함)).
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 SEQ ID NO: 11의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 3a 및 도 3b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다. 일 구현예에서, 도 3a 및 도 3b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 확인된 고도로 보존된 잔기 중 1개, 2개 또는 모두 3개가 존재한다.
일 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 4a 및 도 4b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다. 일 구현예에서, 도 4a 및 도 4b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 확인된 고도로 보존된 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 모두 4개가 존재한다.
(4) 추가적인 RuvC-유사 도메인
N-말단 RuvC-유사 도메인에 추가로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 2개의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5개의 아미노산, 예를 들어 길이로 15개 미만의 아미노산, 예를 들어 길이로 5개 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 길이로 8개의 아미노산이다.
추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
I-X1-X2-E-X3-A-R-E(SEQ ID NO: 12),
여기서
X1은 V 또는 H이고,
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이며;
X3은 M 또는 T이다.
일 구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
I-V-X2-E-M-A-R-E(SEQ ID NO: 13),
여기서,
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이다(예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g 또는 도 7a 내지 도 7b에 나타낸 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다(B로서 도시함)).
추가적인 RuvC-유사 도메인은 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
H-H-A-X1-D-A-X2-X3(SEQ ID NO: 14),
여기서,
X1은 H 또는 L이고;
X2는 R 또는 V이며;
X3은 E 또는 V이다.
일 구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 아미노산 서열: H-H-A 내지 H-D-A-Y-L(SEQ ID NO: 15)을 포함한다.
일 구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 SEQ ID NO: 12, 13, 14 또는 15의 서열과 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일부 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인에 측접하는 서열은 하기 식 V의 서열이다:
K-X1'-Y-X2'-X3'-X4'-Z-T-D-X9'-Y(SEQ ID NO: 16),
여기서,
X1'은 K 및 P로부터 선택되고,
X2'는 V, L, I 및 F로부터 선택되며(예를 들어, V, I 및 L);
X3'은 G, A 및 S로부터 선택되고(예를 들어, G),
X4'은 L, I, V 및 F로부터 선택되며(예를 들어, L);
X9'은 D, E, N 및 Q로부터 선택되고; 그리고
Z는, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 N-말단 RuvC-유사 도메인이다.
(5) HNH-유사 도메인
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 단일 가닥 상보성 도메인, 예를 들어 이중 가닥 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. 일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 길이로 적어도 15개, 20개, 25개의 아미노산이지만, 길이로 40개, 35개 또는 30개 이하의 아미노산, 예를 들어 길이로 20개 내지 35개의 아미노산, 예를 들어 길이로 25개 내지 30개의 아미노산이다. 예시적인 HNH-유사 도메인은 이하에 기재된다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VI의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-N-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N(SEQ ID NO: 17),
여기서,
X1는 D, E, Q 및 N로부터 선택되고(예를 들어, D 및 E);
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L로부터 선택되며(예를 들어, A, I 및 V);
X5는 V, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L);
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X7은 S, A, D, T 및 K로부터 선택되고(예를 들어, S 및 A);
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되며(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되고;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되며;
X11은 D, S, N, R, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, D);
X12는 D, N 및 S로부터 선택되며;
X13은 S, A, T, G 및 R로부터 선택되고(예를 들어, S);
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H로부터 선택되며(예를 들어, I, L 및 F);
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X16은 K, L, R, M, T 및 F(예를 들어, L, R 및 K)로부터 선택되며;
X17은 V, L, I, A 및 T로부터 선택되고;
X18은 L, I, V 및 A로부터 선택되며(예를 들어, L 및 I);
X19는 T, V, C, E, S 및 A로부터 선택되고(예를 들어, T 및 V);
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되며;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되고;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되며; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 SEQ ID NO: 17과 적어도 1개만큼 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 적격이다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 부적격이다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-X19-X20-X21-X22-X23-N(SEQ ID NO: 18),
여기서,
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L로부터 선택되며(예를 들어, A, I 및 V);
X5는 V, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L);
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되고(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되며;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되고;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H로부터 선택되며(예를 들어, I, L 및 F);
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X19는 T, V, C, E, S 및 A로부터 선택되며(예를 들어, T 및 V);
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되고;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되며;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되고; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열과 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-V-X3-H-I-V-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-T-X20-X21-X22-X23-N(SEQ ID NO: 19),
여기서,
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X3은 D 및 E로부터 선택되며;
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L 및 W로부터 선택되고;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되며(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되고;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되며;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H(예를 들어, I, L 및 F)로부터 선택되고;
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되며;
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되고;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되며;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되고; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 SEQ ID NO: 19의 서열과 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 화학식 VIII의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
D-X2-D-H-I-X5-P-Q-X7-F-X9-X10-D-X12-S-I-D-N-X16-V-L-X19-X20-S-X22-23-N(SEQ ID NO: 20),
여기서,
X2는 I 및 V로부터 선택되고;
X5는 I 및 V로부터 선택되며;
X7은 A 및 S로부터 선택되고;
X9는 I 및 L로부터 선택되며;
X10은 K 및 T로부터 선택되고;
X12는 D 및 N으로부터 선택되며;
X16은 R, K 및 L로부터 선택되고; X19는 T 및 V로부터 선택되며;
X20은 S 및 R로부터 선택되고;
X22는 K, D 및 A로부터 선택되며; 그리고
X23은 E, K, G 및 N으로부터 선택된다(예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 HNH-유사 도메인을 포함할 수 있다).
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 SEQ ID NO: 20의 서열과 1개만큼 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 IX의 아미노산 서열을 포함한다:
L-Y-Y-L-Q-N-G-X1'-D-M-Y-X2'-X3'-X4'-X5'-L-D-I-X6'-X7'-L-S-X8'-Y-Z-N-R-X9'-K-X10'-D-X11'-V-P(SEQ ID NO: 21),
여기서,
X1'은 K 및 R로부터 선택되고;
X2'는 V 및 T로부터 선택되며;
X3'은 G 및 D로부터 선택되고;
X4'은 E, Q 및 D로부터 선택되며;
X5'은 E 및 D로부터 선택되고;
X6'는 D, N 및 H로부터 선택되며;
X7'은 Y, R 및 N으로부터 선택되고;
X8'은 Q, D 및 N으로부터 선택되며; X9'은 G 및 E로부터 선택되고;
X10'은 S 및 G로부터 선택되고;
X11'은 D 및 N으로부터 선택되며;
Z는, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 HNH-유사 도메인이다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 21의 서열과 1개만큼 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, HNH-유사 도메인은 본 명세서에,예를 들어 도 5a 내지 도 5c 또는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 HNH-유사 도메인과 1개만큼 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 도 5a 내지 도 5c 또는 도 7a 내지 도 7b에서 확인된 고도로 보존된 잔기 중 1개 또는 둘 모두가 존재한다.
일 구현예에서, HNH -유사 도메인은 본 명세서에,예를 들어 도 6a 내지 도 6b 또는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 HNH-유사 도메인의 서열과 1개만큼 그러나 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기만큼 상이하다. 일 구현예에서, 도 6a 및 6b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 확인된 고도로 보존된 잔기 중 1개, 2개, 모두 3개가 존재한다.
b) Cas9 활성
(1) 뉴클레아제 및 헬리카제 활성
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 통상적으로 야생형 Cas9 분자는 표적 핵산 분자의 가닥을 둘 모두 절단한다. Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 절단(또는 다른 특성)을 변경하기 위해, 예를 들어 닉카제이거나 또는 표적 핵산을 절단하는 능력이 없는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하기 위해 조작될 수 있다. 표적 핵산 분자를 절단할 수 있는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본 명세서에서 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드로서 지칭된다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다:
닉카제 활성, 즉, 단일 가닥을 절단하는 능력, 예를 들어 핵산 분자의비-상보성 가닥 또는 상보성 가닥;
이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 구현예에서 2개의 닉카제 활성의 존재 하에 이중 가닥 핵산의 가닥을 절단하고 이중 가닥 파손을 생산하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성; 및
헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
일 구현예에서, 효소적으로 활성인 또는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 가닥을 둘 모두 절단하며, 이중 가닥 파손을 초래한다. 일 구현예에서, eaCas9 분자는 하나의 가닥만을, 예를 들어 gRNA가 혼성화하는 가닥 또는 gRNA와 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥을 절단한다. 일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서,eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성 및 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성, 또는 절단 적격 HNH-유사 도메인 및 비활성, 또는 절단 부적격 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인 및 활성, 또는 절단 적격 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
일부 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 가지며,gRNA 분자와 함께 코어 표적 도메인에 대해 국소화되지만, 표적 핵산을 절단할 수 없거나, 또는 효율적인 비율로 절단할 수 없다. 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 없는Cas9 분자는 본 명세서에서 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드로서 지칭된다. 예를 들어, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 없을 수 있고, 예를 들어 기준 Cas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다.
(2) 표적화 및 PAM
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 가이드 RNA(gRNA) 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 국소화될 수 있는 폴리펩타이드이다.
일 구현예에서, 표적 핵산과 상호작용하고 절단하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드의 능력은 PAM 서열 의존적이다. PAM 서열은 표적 핵산의 서열이다. 일 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열로부터 상류에서 일어난다. 상이한 박테리아 종으로부터의 EaCas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어, PAM 서열)를 인식할 수 있다. 일 구현예에서, S. 피오게네스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식하고, 해당 서열로부터의 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826] 참조. 일 구현예에서, S. 써모필루스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T)를 인식하고, 이들 서열로부터의 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170, 및 Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 일 구현예에서, S. 뮤탄스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G))를 인식하며, 이 서열로부터 상류의 코어 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 일 구현예에서, S. 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일 구현예에서, S. 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRT(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일 구현예에서, S. 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRV(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일 구현예에서, N. 메닌기티디스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT 또는 NNNGCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6] 참조. PAM 서열을 인식하는 Cas9 분자의 능력은, 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012 337:816]에 기재된 형질전환 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 앞서 언급한 구현예에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어 임의의 A, G, C 또는 T일 수 있다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, Cas9 분자는 Cas9 분자의 PAM 특이성을 변경하도록 조작될 수 있다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013; 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 내지 78 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다. 예는 S. 피오게네스(예를 들어, 균주 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), S. 써모필루스(예를 들어, 균주 LMD-9), S. 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어, 균주 SPIN 20026), S. 뮤탄스(예를 들어, 균주 UA159, NN2025), S. 마카카에(S. macacae)(예를 들어, 균주 NCTC11558), S. 갈로리티쿠스(S. gallolyticus)(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), S. 에쿠이네스(S. equines)(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), S. 디스달락티애(S. dysdalactiae)(예를 들어, 균주 GGS 124), S. 보비스(S. bovis)(예를 들어, 균주 ATCC 700338), S. 안기노서스(S. anginosus)(예를 들어, 균주 F0211), S. 아갈락티애(S. agalactiae)(예를 들어, 균주 NEM316, A909), L. 모노사이토게네스(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(리스테리아 이노큐아, 예를 들어 균주 Clip11262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어, 균주 DSM 15952) 또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)(예를 들어, 균주 1,231,408)의 Cas9 분자를 포함한다. 다른 예시적인 Cas9 분자는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자(Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6)이다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 임의의 Cas9 분자 서열, 또는 천연 유래 Cas9 분자서열, 예를 들어 본 명세서에 열거되거나 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6; SEQ ID NO: 1 내지 4]에 기재된 종으로부터의 Cas9 분자에 대해:
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나;
비교할 때 아미노산 잔기의 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이하만큼 상이하거나;
적어도 1개, 2개, 5개, 10개 또는 20개 아미노산만큼이지만, 100개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개 또는 30개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: 닉카제 활성; 이중 가닥 절단 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; 또는 gRNA 분자와 함께, 표적 핵산으로 귀소하는 능력.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g의 공통 서열의 아미노산 서열을 포함하되, "*"는 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 및 L. 이노쿠아의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 상응하는 위치에서 발견된 임의의 아미노산을 나타내고, "-"은 임의의 아미노산을 나타낸다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 서열과 적어도 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 7a 내지 도 7b의 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하되, "*"는 S. 피오게네스, 또는 N. 메닌기티디스의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 상응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내고, "-"는 임의의 아미노산을 나타내며, "-"는 임의의 아미노산 또는 부재를 나타낸다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 SEQ ID NO: 6 또는 7의 서열과 적어도 1개만큼, 그러나 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
다수의 Cas9 분자의 서열의 비교는 특정 영역이 보존된다는 것을 나타낸다. 이들은 하기와 같이 확인된다:
영역 1(잔기 1 내지 180, 또는 영역 1'잔기 120 내지 180의 경우에)
영역 2(잔기 360 내지 480);
영역 3(잔기 660 내지 720);
영역 4(잔기 817 내지 900); 및
영역 5(잔기 900 내지 960);
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 생물학적 활성 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기 위한 충분한 추가적인 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1 내지 5를 포함한다. 일 구현예에서, 각각의 영역 1 내지 6은 독립적으로 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 상응하는 잔기, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g로부터의 또는 도 7a 내지 도 7b로부터의 서열과 50%, 60%, 70% 또는 80% 상동성을 가진다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 영역은 하기와 같은 영역 1로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(넘버링은 도 2a 내지 2g에서 모티프 서열에 따르며; 도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열의 잔기 중 52%는 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180과 적어도 1개, 2개, 5개, 10개 또는 20개의 아미노산, 그러나 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개 또는 30개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 1 내지 180에 대해 동일하다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 1'로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 적어도 1개, 2개 또는 5개 아미노산만큼, 그러나 35개, 30개, 25개, 20개 또는 10개의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 120 내지 180과 동일하다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 2로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 360 내지 480과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%가 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360 내지 480과 적어도 1개, 2개 또는 5개의 아미노산, 그러나 35개, 30개, 25개, 20개 또는 10개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 360 내지 480과 동일하다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 3으로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 56%가 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 적어도 1개, 2개 또는 5개의 아미노산, 그러나 35개, 30개, 25개, 20개 또는 10개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 동일하다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 4로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 적어도 1개, 2개 또는 5개의 아미노산, 그러나 35개, 30개, 25개, 20개 또는 10개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 동일하다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 5로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 60%가 보존됨);
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 적어도 1개, 2개 또는 5개의 아미노산, 그러나 35개, 30개, 25개, 20개 또는 10개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스 또는 L. 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 동일하다.
c) 조작된 또는 변경된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자는 닉카제 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; gRNA 분자와 기능적으로 연관된 능력; 및 핵산 상의 부위를 표적화하는(또는 이 부위에 대해 국소화하는) 능력(예를 들어, PAM 인식 및 특이성)을 포함하는 임의의 다수의 특성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 이들 특성의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 통상적인 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 가지며, gRNA 분자와 협력하여, 핵산 내 부위에 대해 국소화한다. 다른 활성, 예를 들어 PAM 특이성, 절단 활성 또는 헬리카제 활성은 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드에서 더 크게 변할 수 있다.
Cas9 분자는 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다(본 내용에서 사용되는 바와 같은 조작된은 단지 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 기준 서열과 상이하고, 과정 또는 유래의 제한이 없다는 것을 의미하는 것을 의미한다). 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 변경된 효소적 특성, 예를 들어 변경된 뉴클레아제 활성, (천연 유래 또는 다른 기준 Cas9 분자에 비해) 또는 변경된 헬리카제 활성을 포함할 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 닉카제 활성을 가질 수 있다(이중 가닥 뉴클레아제 활성과 대조적). 일 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 예를 들어 하나 이상의, 또는 임의의 Cas9 활성에 대한 상당한 효과 없이, 그의 크기를 변경시키는 변경, 예를 들어 그의 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 Cas9 분자는 내인성 야생형 PI 도메인에 의해 인식되는 것 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 서열에서 천연 유래 Cas9 분자와 상이할 수 있지만, 하나 이상의 Cas9 활성의 상당한 변경을 가지지 않는다.
목적으로 하는 특성을 지니는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 목적으로 하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하도록다수의 방법으로, 예를 들어 모, 예를 들어 천연 유래, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 변경에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 모 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 또는 조작된 Cas9 분자에 대한 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함한다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 기준, 예를 들어 모, Cas9 분자에 대해 하나 이상의 돌연변이 또는 차이, 예를 들어 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 돌연변이, 그러나 200개, 100개 또는 80개 미만의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 갖지 않는다. 일 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 가진다.
(1) 비절단 및 변형된 절단 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음과 같은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스의 Cas9 분자와 상이할 수 있다: 예를 들어,천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, S. 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 핵산의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가시키는 능력(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, S. 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 핵산의 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자의 비-상보성 가닥 또는 핵산 분자의 상보성 가닥의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가된 그의 능력(닉카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
(2) 변형된 절단 eaCas9 분자 및 eaCas9 폴리펩타이드
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성 및 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성, 또는 절단 적격, HNH-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 HNH-유사 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 21) 및 비활성, 또는 절단 부적격, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 N-말단 RuvC-유사 도메인은 N-말단 RuvC-유사 도메인 내 아스파르트산, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 위치 9에서 아스파르트산 또는 SEQ ID NO: 7의 위치 10에서 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어 알라닌으로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, N-말단 RuvC-유사 도메인에서의 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20, 10%, 5%, 1% 또는 .1% 미만으로 절단된다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 S. 피오게네스, 또는 S. 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
일 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 N-말단 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16)을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 다음 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있으며: HNH-유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 856에 나타낸 히스티딘(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음); HNH-유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 870에서 및/또는 도 2a 내지 도 2g의 위치 879에 나타낸 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음). 일 구현예에서, eaCas9는 HNH-유사 도메인 내 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 S. 피오게네스, 또는 S. 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 N-말단 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16)을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 다음 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다: HNH-유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 856에 나타낸 히스티딘(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음); 및 HNH-유사 도메인 내 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 870에 및/또는 도 2a 내지 도 2g의 위치 879에 나타낸 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음). 일 구현예에서, eaCas9는 HNH-유사 도메인 내 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 S. 피오게네스, 또는 S. 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
d) 표적 핵산의 가닥 중 하나 또는 둘 모두를 절단하는 능력의 변형
일 구현예에서, 예시적인 Cas9 활성은 PAM 특이성, 절단 활성, 및 헬리카제 활성 중 하나 이상을 포함한다. 돌연변이(들)는, 예를 들어 하나 이상의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사 도메인; HNH-유사 도메인; RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 외부의 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 HNH-유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 RuvC-유사 도메인 둘 모두에, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사 도메인과 HNH-유사 도메인에 존재한다.
S.피오게네스 서열을 참조하여 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인에서 생산될 수 있는 예시적인 돌연변이는 다음을 포함한다:D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 기준Cas9 분자에 비교하여 RuvC 도메인에서 및/또는 HNH 도메인에서 하나 이상의 차이를 포함하는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드이고, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 핵산을 절단하지 않거나, 또는 야생형보다 상당히 더 적은 효율로 절단하고, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 절단 분석에서 야생형과 비교할 때, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 기준 Cas9 분자의 50%, 25%, 10% 또는 1% 미만으로 커팅한다.
특정 서열, 예를 들어 치환이 하나 이상의 활성, 예컨대 표적화 활성, 절단 활성 등에 영향을 미칠 수 있든 아니든, 예를 들어 돌연변이가 보존적인지의 여부를 평가함으로써 또는 부문 IV에 기재된 방법에 의해 평가 또는 예측될 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자와 관련하여 사용된 바와 같은 "비필수" 아미노산 잔기는 Cas9 활성(예를 들어, 절단 활성)을 없애는 일 없이 또는 더 바람직하게는 실질적으로 변경시키는 일 없이 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 eaCas9 분자의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기를 바꾸는 것은 활성(예를 들어, 절단 활성)의 실질적인 손실을 초래한다.
일 구현예에서, Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음과 같이 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 아우레우스, S. 피오게네스 또는 C. 제주니의 Cas9 분자와 상이할 수 있다: 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, S. 아우레우스, S. 피오게네스 또는 C. 제주니의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 파손(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성)의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소된 또는 증가된 그의 능력; 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, S. 아우레우스, S. 피오게네스 또는 C. 제주니의 Cas9 분자)에 비해, 핵산의 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자(닉카제 활성)의 핵산 분자 또는 상보성 가닥의 비-상보성 가닥의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가된 그의 능력; 또는 핵산 분자, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다: RuvC 도메인과 연관된 절단 활성; HNH 도메인과 연관된 절단 활성; HNH 도메인과 연관된 절단 활성 및 RuvC 도메인과 연관된 절단 활성.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자 중 하나)를 절단하지 않거나 또는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 핵산 분자를 절단하는 eiCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스, C. 제주니 또는 N. 메닌기티디스의 Cas9 분자일 수 있다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 일 구현예에서, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 RuvC 도메인과 연관된 실질적인 절단 활성 및 HNH 도메인과 연관된 절단 활성이 없다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에 나타낸 S. 피오게네스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열 또는 SEQ ID NO: 7에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2개, 3개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개 아미노산 잔기)에서 S. 피오게네스의 아미노산 서열이 상이한(예를 들어, 치환을 갖는) 하나 이상의 아미노산을 가진다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 상응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하고; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 S. 써모필루스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2개, 3개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개의 아미노산 잔기)에서 S. 써모필루스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 상응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 써모필루스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 써모필루스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 S. 뮤탄스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2개, 3개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개의 아미노산 잔기)에서 S. 뮤탄스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 상응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 뮤탄스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 S. 뮤탄스Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 L. 이노쿨라(L. innocula)의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2개, 3개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 50개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개의 아미노산 잔기)에서 L. 이노쿨라의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 상응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 L. 이노쿨라Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 상응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 L. 이노쿨라Cas9 분자의 상응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
일 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자는, 예를 들어 2개 이상의 상이한 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의, 예를 들어 상이한 종의 2개 이상의 천연 유래 Cas9 분자의 융합일 수 있다. 예를 들어, 하나의 종의 천연 유래 Cas9 분자의 단편은 제2 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다. 예로서, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함하는 S. 피오게네스의 Cas9 분자의 단편은 HNH-유사 도메인을 포함하는 S. 피오게네스(예를 들어, S. 써모필루스) 이외의 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다.
(1) 변경된 PAM 인식을 지니거나 또는 PAM 인식이 없는 Cas9 분자
천연 유래 Cas9 분자는, 예를 들어 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 뮤탄스, S. 아우레우스 및 N. 메닌기티디스에 대해 상기 기재한 특이적 PAM 서열, 예를 들어 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 동일한 PAM 특이성을 가진다. 다른 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 연관되지 않은 PAM 특이성, 또는 가장 밀접한 서열 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 연관되지 않은 PAM 특이성을 가진다. 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식을 변경하기 위해, 예를 들어 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 비표적 부위를 감소시키고/감소시키거나 특이성을 개선시키는 것을 인식하는 PAM 서열을 변경하기 위해 변경될 수 있거나; 또는 PAM 인식 필요를 제거한다. 일 구현예에서, Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식 서열의 길이를 증가시키기 위해 그리고/또는 고수준의 동일성으로 Cas9 특이성을 개선시키기 위해, 예를 들어 비표적 부위를 감소시키고 특이성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 일 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 길이로 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 15개의 아미노산이다.
상이한 PAM 서열을 인식하고/인식하거나 감소된 비표적 활성을 갖는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 유도 진화를 이용하여 발생시킬 수 있다. Cas9 분자의 유도 진화를 위해 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은, 예를 들어 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재된다. 후보 Cas9 분자는, 예를 들어 부문 IV에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
PAM 인식을 매개하는 PI 도메인의 변경은 이하에 논의된다.
e) 변경된 PI 도메인을 지니는 합성 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
현재의 게놈-편집 방법은 이용되는 Cas9 분자에 의해 인식되는 PAM 서열에 의해 표적화될 수 있는 표적 서열의 다양성이 제한된다. 본 명세서에서 사용되는 용어로서 합성 Cas9 분자(또는 Syn-Cas9 분자), 또는 합성 Cas9 폴리펩타이드(또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드)는 하나의 박테리아 종으로부터의 Cas9 코어 도메인 및 기능성 변경된 PI 도메인, 즉, 예를 들어 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 코어 도메인과 자연적으로 연관된 것 이외의 PI 도메인을 포함하는 Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
일 구현예에서, 변경된 PI 도메인은Cas9 코어 도메인이 유래된 천연 유래 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열과 상이한 PAM 서열을 인식한다. 일 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 코어 도메인으로부터 유래되지만, 상이한 친화도 또는 특이성을 지니는 천연 유래 Cas9에 인식되는 동일한 PAM 서열을 인식한다. Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 각각 Syn-eaCas9 분자 또는 Syn-eaCas9 폴리펩타이드 또는 Syn-eiCas9 분자 Syn-eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다.
예시적인 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 하기 a) 및 b)를 포함한다:
a) Cas9 코어 도메인, 예를 들어표2a 또는표2b,으로부터의 Cas9 코어 도메인, 예를 들어 S. 아우레우스, S. 피오게네스, 또는 C. 제주니Cas9 코어 도메인; 및
b) 표4 및 표5으로부터 선택되는 종 X Cas9 서열로부터의 변경된 PI 도메인.
일 구현예에서, 상기 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프(PAM 결합 모티프)는 Cas9 코어 도메인과 연관된 천연 또는 내인성 PI 도메인의 RKR 모티프 서열과 비교하여,1, 2 또는 3개 아미노산 잔기의 차이; 제1, 제2 또는 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이; 제1과 제2 위치, 제1과 제3 위치, 또는 제2와 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이를 포함한다.
일 구현예에서, Cas9 코어 도메인은 표2a로부터의 종 X Cas9로부터의 Cas9 코어 도메인을 포함하고, 상기 변경된 PI 도메인은 표2a로부터의 종 Y Cas9로부터의PI 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 종 X Cas9의 RKR 모티프는 종 Y Cas9의 RKR 모티프가 아니다.
일 구현예에서, 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프는 XXY, XNG 및 XNQ로부터 선택된다.
일 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 표2a로부터의 상기 종 Y의 천연 유래 PI 도메인의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성을 가진다.
일 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 표2a로부터의 상기 제2의 천연 유래 PI 도메인의 아미노산 서열로부터의 50개, 40개, 30개, 25개, 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
일 구현예에서, Cas9 코어 도메인은 S. 아우레우스 코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 A. 데니트리피칸스(A. denitrificans) PI 도메인; C. 제주니 PI 도메인; H. 무스텔라(H. mustelae) PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표5로부터 선택된다.
일 구현예에서, Cas9 코어 도메인은 S. 피오게네스코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 A. 데니트리피칸스 PI 도메인; C. 제주니 PI 도메인; H. 무스텔라 PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표5로부터 선택된다.
일 구현예에서, Cas9 코어 도메인은 C. 제주니 코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 A. 데니트리피칸스 PI 도메인; H. 무스텔라 PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표5로부터 선택된다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 추가로 상기 Cas9 코어 도메인과 상기 변경된 PI 도메인 사이에 배치된 링커를 포함한다.
일 구현예에서, 링커는 Cas9 코어 도메인과 이종성 PI 도메인 사이에 배치된 본 명세서의 다른 곳에 기재된 링커를 포함한다. 적합한 링커는 부문 V에서 추가로 기재된다.
Syn-Cas9 분자에서 사용하기 위한예시적인 변경된 PI 도메인은 표4 및 5에 기재되어 있다. 표4 및 5에 언급된 83개의 Cas9 오솔로그에 대한 서열은 표2a에서 제공된다. 표3은 공지된 PAM 서열 및 상응하는 RKR 모티프를 지니는Cas9 오솔로그를 제공한다.
일 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 또한 크기-최적화될 수 있고, 예를 들어 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 결실, 및 선택적으로 결실에 측적하는 아미노산 잔기 사이에 배치된 하나 이상의 링커를 포함한다. 일 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 REC 결실을 포함한다.
f) 크기-최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드는분자의 크기를 감소시키는 결실을 포함하는 한편, 여전히 목적으로 하는 Cas9 특성, 예를 들어 본질적으로 천연의 입체구조, Cas9 뉴클레아제 활성, 및/또는 표적 핵산 분자 인식을 보유하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 하나 이상의 결실 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 제공되되, 링커는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 기준 Cas9 분자에서 적합한 결실을 확인하는 방법, 결실 및 링커를 지니는 Cas9 분자를 발생시키는 방법, 및 이러한 Cas9 분자를 이용하는 방법은 이 문헌의 검토 시 당업자에게 명확할 것이다.
결실을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 S. 아우레우스, S. 피오게네스 또는 C. 제주니 Cas9 분자는 더 작으며, 예를 들어 상응하는 천연 유래 Cas9 분자보다 감소된 수의 아미노산을 가진다. 더 작은 크기의 Cas9 분자는 전달 방법에 대해 증가된 유연성을 허용하며, 이에 의해 게놈-편집을 위한 유용성을 증가시킨다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 얻어진 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 또는 감소시키지 않는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드에 보유된 활성은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
닉카제 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어 비-상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 구현예에서 2개의 닉카제 활성의 존재에 있는 이중 가닥 핵산의 가닥을 둘 모두 절단하고 이중 가닥 파손을 생산하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성;
헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력;
및 핵산 분자, 예를 들어 표적 핵산 또는 gRNA의 인식 활성.
본 명세서에 기재된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성은 본 명세서에 또는 당업계에 기재된 활성 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
(1) 결실에 적합한 영역의 확인
결실을 위한 Cas9 분자의 적합한 영역은 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 다양한 박테리아 종, 예를 들어 표2a에 열거된 것 중 임의의 하나로부터의 천연 유래 오솔로그 Cas9 분자는 S. 피오게네스Cas9의 결정 구조로 모델링되어(문헌[Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014]) 단백질의 3차원 입체구조에 대해 선택되는 Cas9 오솔로그에 걸친 보존 수준을 시험할 수 있다. Cas9 활성에 연루된 영역으로부터 떨어져서 공간적으로 위치된, 예를 들어,표적 핵산 분자 및/또는 gRNA와 경계를 이루는 덜 보존된 또는 비보존된 영역은 영역 또는 도메인이 Cas9 활성에 실질적으로 영향을 미치거나 또는 감소시키는 일 없이 결실에 대한 후보가 된다는 것을 나타낸다.
(2) REC-최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에서 사용되는 용어로서 REC-최적화된 Cas9 분자, 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 도메인 및 RE1CT 도메인 중 하나 또는 둘 모두에서의 결실(총괄적으로 REC 결실)을 포함하는 Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭하되, 결실은 동족 도메인에서 아미노산 잔기의 적어도 10%를 포함한다. REC-최적화된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드, 또는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다. 예시적인 REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 하기를 포함한다:
a) 하기 i) 내지 iii)으로부터 선택되는 결실:
i) REC2결실;
ii) REC1CT 결실; 또는
iii) REC1SUB 결실.
선택적으로, 링커는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 단지 하나의 결실, 또는 단지 2개의 결실을 포함한다. Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1CT 결실을 포함할 수 있다. Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1SUB 결실을 포함할 수 있다.
일반적으로, 결실은 그의 동족 도메인 내 아미노산의 적어도 10%를 함유하며, 예를 들어 REC2 결실은 REC2 도메인 내 아미노산의 적어도 10%를 포함할 것이다. 결실은 그의 동족 도메인의 아미노산 잔기의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%; 그의 동족 도메인의 모든 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인 외부의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인 외부의 복수의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대한 N 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 C 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족에 대해 N 말단 바로 옆의 아미노산 잔기 및 그의 동족 도메인에 대해 C 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 N 말단의 복수의, 예를 들어 5개, 10개, 15개 또는 20개까지의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 C 말단의 복수의, 예를 들어 5개, 10개, 15개 또는 20개까지의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 N 말단의 복수의, 예를 들어 5개, 10개, 15개 또는 20개까지의 아미노산 잔기 및 그의 동족 도메인에 대해 C 말단의 복수의, 예를 들어 5개, 10개, 15개 또는 20개까지의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 결실은 그의 동족 도메인; 그의 동족 도메인의 N 말단 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인의 C 말단 아미노산 잔기 이상으로 연장되지 않는다.
REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된 링커를 포함할 수 있다. REC-최적화된 Cas9 분자에서의 REC 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에서 사용하기 위한 적합한 링커는 부문 V에 개시된다.
구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas9, 예를 들어 표2a에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 S. 아우레우스 Cas9 분자, S. 피오게네스Cas9 분자, 또는 C. 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas9, 예를 들어 표2a에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 S. 아우레우스 Cas9 분자, S. 피오게네스Cas9 분자, 또는 C. 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개 또는 25개 아미노산 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas9, 예를 들어 표2a에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 S. 아우레우스 Cas9 분자, S. 피오게네스Cas9 분자, 또는 C. 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이하만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 배열이 설계되며, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대안의 매개변수가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기반하여 기준 서열에 비교한 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, by the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 계산된 실행에 의해(위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 2개의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘인데, 이들은 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수 가능하다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 추가로, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용 가능) 내 GAP 프로그램에 포함된 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
예시적인 REC 결실을 위한 서열 정보는 표2a에서 83개의 천연 유래 Cas9 오솔로그에 대해 제공된다. 상이한 박테리아 종으로부터의 예시적인 Cas9 분자의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
[표 2a]
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
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Figure pct00012
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Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
[표 2b]
Figure pct00025
[표 3]
Figure pct00026
PI 도메인이 표 4 및 표 5에서 제공된다.
[표 4]
Figure pct00027
[표 5]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
g) Cas9 분자를 인코딩하는 핵산
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821]에 기재되어 있다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 다른 예시적인 핵산은 도8에서 검정색으로 나타낸다.
일 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 예시적인 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 mRNA는 다음 특성 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 가진다: 이는 캡핑, 폴리아데닐화, 5-메틸시티딘 및/또는 슈도유리딘으로 치환된다.
추가로 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있고, 예를 들어 적어도 하나의 비-통상적 코돈 또는 덜 통상적인 코돈은 통상적인 코돈에 의해 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 최적화된 전령 mRNA의 합성을 지시하며, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포유류 발현 시스템에서 발현을 위해 최적화될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 포함할 수 있다. 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있다.
SEQ ID NO: 22는 S. 피오게네스의 Cas9 분자를 인코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다. SEQ ID NO: 23은 S. 피오게네스 Cas9 분자의 상응하는 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 24는 N. 메닌기티디스의 Cas9 분자를 인코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다. SEQ ID NO: 25는 N. 메닌기티디스 Cas9 분자의 상응하는 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 26은 S. 아우레우스 Cas9 분자의 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 39는 S. 아우레우스 Cas9의 Cas9 분자를 인코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다..
임의의 상기Cas9 서열이 C-말단에서 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합된다면, 중단 코돈은 제거된다는 것이 이해된다.
h) 다른 Cas 분자 및 Cas 폴리펩타이드
다양한 유형의 Cas 분자 또는 Cas 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실행을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, II형 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, I형 또는 III형 Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)은, 예를 들어 문헌[Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60 and Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기재되어 있으며, 이들 참고문헌 둘 모두의 내용은 본 명세서에 전체가 참고로 포함된다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)을 또한 표600에 나타낸다.
[표 600]
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
4. 게놈 편집 방법 및 전달 방법
a) 게놈 편집 접근
일반적으로, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 임의의 유전자의 변경은 임의의 메커니즘에 의해 매개될 수 있으며, 임의의 방법은 특정 메커니즘에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 유전자의 변경과 연관될 수 있는 예시적인 메커니즘은 비-상동성 말단 결합(예를 들어, 통상의 것 또는 대안적인 것), 마이크로 상동성(microhomology)-매개 말단 결합(MMEJ), 상동성 직접 수선(예를 들어, 내인성 공여체 주형 매개), 합성 의존적 가닥 어닐링(SDSA), 단일 가닥 어닐링, 단일 가닥 침투, 단일 가닥 파손 수선(SSBR), 미스매치 수선(MMR), 염기 절제 수선(BER), 가닥간 교차연결(ICL), 손상통과 합성(Translesion synthesis)(TLS) 또는 오류 없는 복제후 수선(PRR)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에는 단백질 PD-1을 인코딩하는 PDCD1의 하나 또는 두 대립유전자 모두의 표적화된 넉아웃의 예시적인 방법이 기재되어 있다.
(1) 유전자 표적화에 대한 NHEJ 접근
본 명세서에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도 비-상동성 말단-결합 (NHEJ)은 유전자-특이적 넉아웃을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제, 유도 NHEJ는 또한 관심 대상의 유전자에서 서열 삽입물을 제거하기 위해(예를 들어, 결실시키기 위해) 사용될 수 있다.
이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 연관된 게놈 변형은 뉴클레아제-유도 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류 유발 특성에 의존한다고 여겨진다. NHEJ는 2개의 말단과 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수선하고; 그러나, 일반적으로, 본래의 서열은 2개의 적합성 말단이 그들이 이중 가닥 파손에 의해 형성됨에 따라 완전히 결찰되어야만 복구된다. 이중-가닥 파손의 DNA 말단은 빈번하게는 효소적 가공 대상이며 말단의 재결합 전에 하나 또는 둘 모두의 가닥에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 초래한다. 이는 NHEJ 수선 부위에서 DNA 서열에서 삽입 및/또는 결실(삽입결실)의 존재를 초래한다. 이들 돌연변이 통상적으로 중 2/3는 리딩 프레임을 변경시키며, 따라서, 비기능성 단백질을 생산한다. 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당한 양의 서열을 삽입 또는 결실시키는 돌연변이는 단백질의 기능성을 붕괴할 수 있다. 이는 중요한 기능적 도메인의 돌연변이가 단백질의 비중요 영역에서의 돌연변이보다 덜 용인될 가능성이 있기 때문에 좌위 의존적이다. NHEJ에 의해 발생된 삽입결실 돌연변이는 천연에서 예측 불가능하지만; 그러나, 주어진 파손 부위에서 특정 삽입결실 서열이 선호되며 집단에서 지나치게 표시되는데, 이는 마이크로 상동성의 소 영역에 기인할 가능성이 있다. 결실의 길이는 가장 통상적으로는 1 bp 내지 50 bp 범위에서 크게 다를 수 있지만, 그들은 100 bp 내지 200 bp 초과로 용이하게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧게 되는 경향이 있으며, 종종 파손 부위를 바로 둘러싸는 서열의 짧은 중복을 포함한다. 그러나, 이는 큰 삽입을 얻을 수 있고, 이 경우에 삽입된 서열은 종종 게놈의 다른 영역에 대해 또는 세포 내에 존재하는 플라스미드 DNA에 대해 추적되었다.
NHEJ는 돌연변이유발 과정이기 때문에, 이는 또한 특이적 최종 서열의 발생이 필요하지 않다면, 작은 서열 모티프를 결실시키는 데 사용될 수 있다. 이중-가닥 파손이 짧은 표적 서열 근처에서 표적화된다면, NHEJ 수선에 의해 야기되는 결실 돌연변이는 종종 걸쳐서 이어지고, 따라서 원치않는 뉴클레오타이드를 제거한다. 더 큰 DNA 절편의 결실을 위해, 2개의 이중-가닥 파손을 도입시키는 것은(서열의 각각의 측면 상에서 하나씩) 전체 개재 서열의 제거에 의해 말단들 사이에 NHEJ를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 쌍을 사용하여, 2개의 이중 가닥 파손을 도입함으로써, 2개의 파손 사이에 개재 서열의 결실을 생산할 수 있다.
이들 접근은 둘 모두 특이적 DNA 서열을 결실시키기 위해 사용될 수 있고; 그러나, NHEJ의 오류-유발 특성은 여전히 수선 부위에서 삽입결실 돌연변이를 생산할 수 있다.
eaCas9 분자를 절단하는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 모두, 또는 닉카제, eaCas9 분자는 NHEJ-매개 삽입결실을 발생시키기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 유전자에 표적화된 NHEJ-매개 삽입결실, 예를 들어 코딩 영역, 예를 들어 관심 대상 유전자의 초기 코딩 영역은 관심 대상의 유전자를 넉아웃시키기 위해(즉, 유전자의 발현을 제거하기 위해) 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 초기 코딩 영역은 코딩 서열의 제1 엑손 내에서, 또는 전사 시작 부위의 500 bp 내에서(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만) 전사 시작 부위 바로 다음에 서열을 포함한다.
일 구현예에서, NHEJ-매개 삽입결실을 PDCD1과 같은 하나 이상의 T 세포 발현 유전자 내로 도입한다. 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 닉카제와 함께 제공된다.
(2) 표적 위치에 대한 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손의 배치
일 구현예에서, gRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도하는 목적을 위해 이중 가닥 파손을 발생시키는 경우, gRNA, 예를 들어 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA 분자는 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대한 근위에 가깝게 하나의 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 일 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp 내지 30 bp만큼 떨어져 있다(예를 들어, 표적 위치로부터 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만).
일 구현예에서, Cas9 닉카제와 복합체화된 2개의 gRNA가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도할 목적을 위해 2개의 단일 가닥 파손을 유도하는 경우, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 NHEJ 수선 표적 위치의 뉴클레오타이드를 제공하기 위한 2개의 단일-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 일 구현예에서, gRNA는 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방하는 상이한 가닥 상에서, 동일한 위치에서 또는 서로의 소수의 뉴클레오타이드 내에서 커팅을 위치시키도록 구성된다. 일 구현예에서, 더 가까운 닉은 표적 위치로부터 0 bp 내지 30 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만)만큼 떨어져 있고, 2개의 닉은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다. 일 구현예에서, gRNA는 표적 위치의 뉴클레오타이드 중 측면 중 하나 상에 단일 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다.
eaCas9 분자를 절단시키는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 모두, 또는 닉카제, eaCas9 분자는 표적 위치의 측면 둘 모두에 파손을 발생시키기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이중 가닥 또는 짝지어진 단일 가닥 파손은 2개의 커팅 사이의 핵산 서열을 제거하기 위해(예를 들어, 두 파손 사이의 영역은 결실됨) 표적 위치의 양 측면 상에서 발생될 수 있다. 일 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양 측면 상에서 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 대안의 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, cas9 뉴클레아제와 하나의 gRNA 복합체) 및 2개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 닉카제와의 2개의 gRNA 복합체)을 위치시키도록 구성된다. 다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 2개의 쌍(즉, Cas9 닉카제와 2개의 gRNA 복합체의 2개의 쌍)을 발생시키도록 구성된다. 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 2개의 단일 가닥 닉 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp 내에 있을 것이다(예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하). 닉카제가 사용될 때, 쌍에서 2개의 닉은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
b) 표적화된 넉다운
DNA 수준에서 유전자를 돌연변이시킴으로써 발현을 영구적으로 제거 또는 감소시키는 CRISPR/Cas-매개 유전자 넉아웃과 달리, CRISPR/Cas 넉다운은 인공 전사 인자의 사용을 통해 유전자 발현을 일시적으로 감소시킨다. Cas9 단백질의 DNA 절단 도메인 둘 모두에서 중요한 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10A 및 H840A 돌연변이)는 촉매적 불활성 Cas9(사멸 Cas9 또는 dCas9로서도 알려진 eiCas9)의 발생을 초래한다. 촉매적 불활성 Cas9는 gRNA와 복합체화하고, gRNA의 표적화 도메인에 의해 구체화되는 DNA 서열을 국소화하지만, 그러나, 이는 표적 DNA를 절단하지 않는다. 효과기 도메인, 예를 들어 전사 억제 도메인에 대한 dCas9의 융합은 gRNA에 의해 구체화된 임의의 DNA부위에 대한 효과기의 동원을 가능하게 한다. eiCas9 그 자체는 코딩 서열 내 초기 영역에 동원될 때 전사를 차단할 수 있는 것으로 나타났지만, 더 강한 억제는 전사 억제 도메인(예를 들어, KRAB, SID 또는 ERD)을 Cas9에 융합시킴으로써 그리고 그것을 유전자의 프로모터 영역에 동원함으로써 달성될 수 있다. 프로모터의 표적화 DNAseI 과민감 영역을 표적화하는 것은 이들 영역이 Cas9 단백질에 접근 가능하게 될 가능성이 더 많고 또한 내인성 전사 인자에 대한 부위를 보유할 가능성이 더 많기 때문에 더 효율적인 유전자 억제 또는 활성화를 수득할 수 있는 가능성이 있다. 특히 유전자 억제를 위해, 본 명세서에서 내인성 전사 인자의 결합 부위를 차단하는 것은 유전자 발현을 하향조절하는 데 도움을 준다는 것이 상정된다. 다른 구현예에서, eiCas9는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상태를 변경시키는 것은 표적 유전자의 감소된 발현을 초래할 수 있다.
일 구현예에서, gRNA 분자는 공지된 전사 반응 구성요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 공지된 상류의 활성화 서열(UAS) 및/또는 표적 DNA의 발현을 제어할 수 있는 것으로 의심되는 알려지지 않은 또는 알려진 기능의 서열에 표적화될 수 있다.
일 구현예에서, CRISPR/Cas-매개 유전자 넉다운은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 2 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 둘을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 유전자를 둘 모두 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 3 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 셋을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 셋의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 4 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 넷을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 넷의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 5 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 다섯을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 다섯의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 6 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB 또는 PTPN6 각각을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 여섯의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다.
c) 단일-가닥 어닐링
단일 가닥 어닐링(SSA)은 표적 핵산 중에 존재하는 2개의 반복부 서열 사이의 이중 가닥 파손을 수선하는 다른 DNA 수선이다. SSA 경로에 의해 이용되는 반복부 서열은 일반적으로 길이로 30개 초과의 뉴클레오타이드이다. 파손 말단에서 절단은 표적 핵산의 가닥 둘 모두에 대해 반복부 서열을 나타내도록 일어난다. 절단 후, 반복부 서열을 함유하는 단일 가닥 돌출부는 반복부 서열이, 예를 들어 그 자체에 대해 부적절하게 어닐링되는 것을 방지하기 위해 RPA 단백질로 코팅된다. RAD52는 돌출부 상의 각각의 반복부 서열에 결합하고, 상보성 반복부 서열의 어닐링을 가능하게 하는 서열을 정렬한다. 어닐링 후에, 돌출부의 단일 가닥 플랩(flap)은 절단된다. 새로운 DNA 합성은 임의의 갭을 채우고, 결찰은 DNA 이중가닥을 복원한다. 가공의 결과로서, 2개의 반복부 사이의 DNA 서열은 결실된다. 결실 길이는 이용되는 2개의 반복부의 위치를 포함하는 다수의 인자 및 절단 경로 또는 진행도에 의존할 수 있다.
HDR 경로와 대조적으로, SSA는 표적 핵산 서열을 변경 또는 수정하기 위한 주형 핵산을 필요로 하지 않는다. 대신에, 상보성 반복부 서열이 이용된다.
d) 다른 DNA 수선 경로
(1) SSBR(단일 가닥 파손 수선)
게놈 내 단일 가닥 파손(SSB)은 상기 논의된 DSB 수선 메커니즘과 별도의 메커니즘인 SSBR 경로에 의해 수선된다. SSBR 경로는 4 가지 주요 단계를 가진다: SSB 검출, DNA 말단 가공, DNA 갭 채우기, 및 DNA 결찰. 더 상세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
제1 단계에서, SSB 형태일 때, PARP1 및/또는 PARP2는 파손을 인식하고 수선 기작을 동원한다. DNA 파손에서 PARP1의 결합 및 활성은 일시적이며, 손상부에서의 소상 축적 또는 SSBr 단백질 복합체의 안정성을 촉진함으로써 SSBr을 가속화하는 것으로 여겨진다. 거의 틀림없이 가장 중요한 이들 SSBr 단백질은 XRCC1인데, 이는 DNA 3' 및 5' 말단을 세정하는 것을 초래하는 단백질을 포함하는 SSBr 가공의 다수의 효소적 성분과 상호작용하고, 안정화시키며, 자극하는 분자 스캐폴드로서 작용한다. 예를 들어, XRCC1은 말단 가공을 촉진하는 몇몇 단백질(DNA 중합효소 베타, PNK, 및 3개의 뉴클레아제, APE1, APTX 및 APLF)과 상호작용한다. APE1은 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. APLF는 엔도뉴클레아제 및 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. APTX는 엔도뉴클레아제 및 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진다.
이 말단 가공은 전부는 아니라도 대부분의 SSB의3'- 및/또는 5'-말단이 '손상'되기 때문에 SSBR의 중요한 단계이다. 말단 가공은 일반적으로 손상된 3'-말단을 하이드록실화된 상태로 및/또는 손상된 5' 말단을 인산염 모이어티로 복구하는 것을 수반하며, 따라서 말단은 결찰 적격이 된다. 손상된 3' 말단을 가공할 수 있는 효소는 PNKP, APE1 및 TDP1을 포함한다. 손상된 5' 말단을 가공할 수 있는 효소는 PNKP, DNA 중합효소 베타 및 APTX를 포함한다. LIG3(DNA 리가제 III)는 Ehh한 말단 가공에 참여할 수 있다. 일단 말단이 정화되면(cleaned), 갭 채우기가 일어날 수 있다.
DNA 갭 채우기 단계에서, 통상적으로 존재하는 단백질은 PARP1, DNA 중합효소 베타, XRCC1, FEN1(플랩 엔도뉴클레아제 1), DNA 중합효소 델타/엡실론, PCNA 및 LIG1이다. 2가지 방법의 갭 채우기, 즉, 짧은 패치 수선 및 긴 패치 수선이 있다. 짧은 패치 수선은 빠져있는 단일 뉴클레오타이드의 삽입을 수반한다. 일부 SSB에서, "갭 채우기"는 2개 이상의 뉴클레오타이드를 대체하는 것을 계속할 수 있다(12개까지의 염기의 대체가 보고되었다). FEN1은 대체된 5'-잔기를 제거하는 엔도뉴클레아제이다. Pol β를 포함하는 다중 DNA 중합효소는 SSB의 공급원 및 유형에 의해 영향받는 DNA 중합효소의 선택에 의해 SSB의 수선에 수반된다.
제4 단계에서, DNA 리가제, 예컨대 LIG1(리가제 I) 또는 LIG3(리가제 III)은 말단의 결합을 촉진한다. 짧은 패치 수선은 리가제 III을 이용하고, 긴 패치 수선은 리가제 I을 이용한다.
때때로, SSBR은 복제 결합된다. 이 경로는 CtIP, MRN, ERCC1 및 FEN1 중 하나 이상을 수반할 수 있다. SSBR을 촉진시킬 수 있는 추가적인 인자는 aPARP, PARP1, PARP2, PARG, XRCC1, DNA 중합효소 b, DNA 중합효소 d, DNA 중합효소, PCNA, LIG1, PNK, PNKP, APE1, APTX, APLF, TDP1, LIG3, FEN1, CtIP, MRN 및 ERCC1을 포함한다.
(2) MMR(미스매치 수선)
세포는 3개의 절제 수선 경로를 함유한다: MMR, BER 및 NER. 절제 수선 경로는 그들이 통상적으로 DNA의 한 가닥 상에서 손상부를 인식하고, 이어서 엑소/엔도뉴클레아제가 손상부를 제거하고 DNA 중합효소에 의해 하부에 순차적으로 채워지고 최종적으로 리가제에 의해 봉합되는 1 내지 30개의 뉴클레오타이드 갭을 남긴다는 점에서 통상적인 특징을 가진다. 더 많은 완전한 그림은 문헌[Li, Cell Research (2008) 18:85-98]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
미스매치 수선(MMR)은 잘못 짝지어진 DNA 염기상에서 작용한다.
MSH2/6 또는 MSH2/3 복합체는 둘 모두 미스매치 인식 및 수선의 개시에서 중요한 역할을 하는 ATP분해효소 활성을 가진다. MSH2/6은 염기-염기 미스매치를 우선적으로 인식하며, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드의 미스매치를 확인하는 반면, MSH2/3은 더 큰 ID 미스매치를 우선적으로 인식한다.
hMLH1은 hPMS2와 이형이량체화하여 ATP분해효소 활성을 갖고 MMR의 다수의 단계에 대해 중요한 hMutLα를 형성한다. 이는 EXO1을 수반하는 3' 닉-지정 MMR에서 중요한 역할을 하는 PCNA/복제 인자 C (RFC)-의존적 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. (EXO1은 HR과 MMR 둘 모두에 참여한다.) 이는 미스매치 유발 절제의 종결을 조절한다. 리가제 I은 이 경로에 적절한 리가제이다. MMR을 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 EXO1, MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2, MLH3, DNA Pol d, RPA, HMGB1, RFC,및 DNA 리가제 I을 포함한다.
(3) 염기 절제 수선(BER)
염기 절제 수선(BER) 경로는 세포주기 전체적으로 활성이며; 이는 게놈으로부터 작은 비-나선-뒤틀림 염기 손상부를 제거하는 것을 주로 초래한다. 대조적으로, 관련된 뉴클레오타이드 절제 수선 경로(다음 부문에서 논의함)는 큰 나선-뒤틀림 손상부를 수선한다. 더 상세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
DNA 염기 손상 시, 염기 절제 수선(BER)이 개시되고 5개의 주요 단계로 단순화될 수 있다: (a) 손상된 DNA 염기의 제거; (b) 후속 염기 부위의 절개(incision); (c) DNA 말단 정화; (d) 정확한 뉴클레오타이드의 수선 갭 내로의 삽입; 및 (e) DNA 백본 내 남아있는 닉의 결찰. 이들 마지막 단계는 SSBR과 유사하다.
제1 단계에서, 손상-특이적 DNA는 당 인산화 백본에 대해 염기를 연결하는 N-글리코사이드의 절단을 통해 손상된 염기를 절제한다. 이어서, AP 엔도뉴클레아제-1(APE1) 또는 리아제 활성과 연관된 2기능성 DNA 글리코실라제는 포스포디에스테르 백본을 절개하여 DNA 단일 가닥 파손(SSB)을 생산한다. BER의 제3 단계는 DNA 말단 정화를 수반한다. BER에서 제4 단계는 수선 갭 내로 새로운 상보성 뉴클레오타이드를 첨가하는 Pol β에 의해 수행되고, 최종 단계에서 XRCC1/리가제 III은 DNA 백본에 남아있는 닉을 봉합한다. 이는 대다수의(대략 80%)의 손상된 DNA 염기가 수선되는 짧은 패치 BER 경로를 완전하게 한다. 그러나, 단계 3에서 5'-말단이 말단 가공 활성에 대해 저항성이라면, Pol β에 의한 하나의 뉴클레오타이드 삽입 후에, 복제 DNA 중합효소인 Pol δ/ε에 대한 중합효소 전환이 있으며, 이어서 DNA 수선 갭 내로 대략 2개 내지 8개 더 많은 뉴클레오타이드를 첨가한다. 이는 5'-플랩 구조를 생산하는데, 이는 진행도 인자 증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen: PCNA)과 연관된 플랩 엔도뉴클레아제-1(FEN-1)에 의해 인식되고 절제된다. 이어서, DNA 리가제 I은 DNA 백본에 남아있는 닉을 봉합하고, 롱패치(long-patch) BER을 완전하게 한다. BER 경로를 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 DNA 글리코실라제, APE1, Polb, Pold, Pole, XRCC1, 리가제 III, FEN-1, PCNA, RECQL4, WRN, MYH, PNKP 및 APTX를 포함한다.
(4) 뉴클레오타이드 절제 수선(NER)
뉴클레오타이드 절제 수선(NER)은 DNA로부터 큰 나선-뒤틀림 손상을 제거하는 중요한 절제 메커니즘이다. NER에 관한 추가적인 상세한 설명은 문헌[Marteijn et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 465-481 (2014)]에서 제공되고, 본 명세서에서 요약이 제공된다. NER은 2개의 더 작은 경로를 포함하는 더 넓은 경로이다: 전반적 게놈 NER(global genomic NER: GG-NER) 및 전사 결합 수선 NER(TC-NER). GG-NER 및 TC-NER은 DNA 손상을 인식하기 위한 상이한 인자를 사용한다. 그러나, 그들은 손상부 절개, 수선 및 결찰을 위한 동일한 기작을 이용한다.
일단 손상이 인식되면, 세포는 손상부를 함유하는 짧은 단일 가닥 DNA 절편을 제거한다. 엔도뉴클레아제 XPF/ERCC1 및 XPG(ERCC5에 의해 인코딩됨)는 손상부의 측면 중 하나 상에서 손상된 가닥을 커팅함으로써 손상부를 제거하여, 22개 내지 30개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 갭을 생산한다. 다음에, 세포는 DNA 갭 채우기 합성 및 결찰을 수행한다. 이 과정에 PCNA, RFC, DNA Pol δ, DNA Pol ε 또는 DNA Pol κ, 및 DNA 리가제 I 또는 XRCC1/리가제 III이 수반된다. 복제 세포는 DNA pol ε 및 DNA 리가제 I를 사용하는 경향이 있는 반면, 비-복제 세포는 결찰 단계를 수행하기 위해 DNA Pol δ, DNA Pol κ, 및 XRCC1/ 리가제 III 복합체를 사용하는 경향이 있다.
NER은 다음의 인자를 수반할 수 있다: XPA 내지 G, POLH, XPF, ERCC1, XPA 내지 G 및 LIG1. 전사 결합된 NER(TC-NER)은 다음의 인자를 수반할 수 있다: CSA, CSB, XPB, XPD, XPG, ERCC1, 및 TTDA. NER 수선 경로를 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 XPA 내지 G, POLH, XPF, ERCC1, XPA 내지 G, LIG1, CSA, CSB, XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, TTDA, UVSSA, USP7, CETN2, RAD23B, UV-DDB, CAK 서브복합체, RPA 및 PCNA을 포함한다.
(5) 가닥내 교차연결(Intrastrand Crosslink: ICL)
ICL 수선 경로 수선으로 불리는 전용 경로가 교차연결된다. 가닥간 교차연결 또는 상이한 DNA 가닥 내 염기 사이의 공유적 교차연결은 복제 또는 전사 동안 일어날 수 있다. ICL 수선은 다중 수선 과정, 특히 핵산분해 활성, 손상통과 합성(translesion synthesis: TLS) 및 HDR의 동조(coordination)를 수반한다. 뉴클레아제는 교차연결된 염기의 측면 중 하나 상에서 ICL을 절제하기 위해 동원되는 반면, TLS 및 HDR은 커팅 가닥을 수선하도록 동조된다. ICL 수선은 다음의 인자: 엔도뉴클레아제, 예를 들어 XPF 및 RAD51C, 엔도뉴클레아제, 예컨대 RAD51, 손상통과 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소 제타 및 Rev1), 및 판코니 빈혈(Fanconi anemia: FA) 단백질, 예를 들어 FancJ을 수반할 수 있다.
(6) 다른 경로
몇몇 다른 DNA 수선 경로가 포유류에서 존재한다.
손상통과 합성(TLS)은 결함 복제 사건 후에 남은 단일 가닥 파손의 수선을 위한 경로이며, 손상통과 중합효소, 예를 들어 DNA pol□ 및 Rev1을 수반한다.
오류 없는 복제후 수선(PRR)은 결함 복제 사건 후 남아있는 단일 가닥 파손을 수선하기 위한 다른 경로이다.
e) 게놈 편집 방법에서 gRNA의 예
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 분자 중 임의의 것은 표적 핵산의 서열을 변경시키는 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손, 예를 들어 표적 위치 또는 표적 유전자 서명을 발생시키는 임의의 Cas9 분자에 의해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 표적 핵산은 임의의 기재된 바와 같은 PDCD1 좌위 또는 그 부근에 존재한다. 일부 구현예에서, 리보핵산 분자, 예컨대 gRNA 분자 및 단백질, 예컨대 Cas9 단백질 또는 이들의 변이체를 본 명세서에 제공된 조작된 세포 중 임의의 것에 도입한다. 이들 방법에서 유용한 gRNA 분자는 이하에 기재한다.
일 구현예에서, gRNA, 예를 들어 키메라 gRNA는 그것이 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다;
a) 이것은, 예를 들어 이중 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때,이중 가닥 파손을, (i) 표적 위치의 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 또는 500개의 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가까이 위치시킬 수 있고;
b) 이것은 적어도 16개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16개, (ii) 17개, (iii) 18개, (iv) 19개, (v) 20개, (vi) 21개, (vii) 22개, (viii) 23개, (ix) 24개, (x) 25개, 또는 (xi) 26개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며; 그리고
c)
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스, 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스gRNA의 상응하는 서열 또는 그것과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 gRNA의 상응하는 서열 또는 그것으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있고;
(iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인의 상응하는 부분의 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA, 예를 들어 키메라 gRNA는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다;
a) gRNA 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때,(i) 표적 위치의 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 또는 500개의 뉴클레오타이드 내이거나, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절단 영역 내에 있도록 충분히 가까운, 단일 가닥 파손을 위치시킬 수 있으며;
b) 하나 또는 둘 모두 적어도 16개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16개, (ii) 17개, (iii) 18개, (iv) 19개, (v) 20개, (vi) 21개, (vii) 22개, (viii) 23개, (ix) 24개, (x) 25개, 또는 (xi) 26개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지고; 그리고
c)
(i) 근위 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 및 근위 도메인으로부터의 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이들로부터의 뉴클레오타이드와 1개, 2개, 3개, 4개, 5; 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 gRNA의 상응하는 서열 또는 이들과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열부터의 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개 뉴클레오타이드가 있거나;
(iii) 제1 상보성 도메인의 제2 상보성 도메인 상응 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 gRNA의 상응하는 서열, 또는 이들과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열로부터의 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있거나;
(iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인으로부터의 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 뉴클레오타이드, 또는 이들과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인의 상응하는 부분의 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 HNH 활성을 갖는 Cas9 닉카제 분자, 예를 들어 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10에서 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일 구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 닉카제 분자, 예를 들어 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840에서 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일 구현예에서, 제1 gRNA 및 제2 gRNA를 포함하는 한 쌍의 gRNA, 예를 들어 한 쌍의 키메라 gRNA는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) gRNA 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, 단일 가닥 파손을 (i) 표적 위치의 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 또는 500개의 뉴클레오타이드 내에서 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가깝게 위치시킬 수 있고;
b) 하나 또는 둘 모두는 적어도 16개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16개, (ii) 17개, (iii) 18개, (iv) 19개, (v) 20개, (vi) 21개, (vii) 22개, (viii) 23개, (ix) 24개, (x) 25개, 또는 (xi) 26개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며;
c) 하나 또는 둘 모두는:
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 gRNA의 상응하는 서열 또는 그것과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 31개, 35개, 40개, 45개, 49개, 50개 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스gRNA의 상응하는 서열 또는 그것으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16개, 19개, 21개, 26개, 31개, 32개, 36개, 41개, 46개, 50개, 51개 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있고;
(iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 S. 피오게네스, S. 써모필루스, S. 아우레우스 또는 N. 메닌기티디스 꼬리 도메인의 상응하는 부분의 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다;
d) gRNA는 표적 핵산에 혼성화될 때, 그들이 0개 내지 50개, 0개 내지 100개, 0개 내지 200개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개 또는 적어도 50개의 뉴클레오타이드만큼 분리되도록 구성되고;
e) 제1 gRNA 및 제2 gRNA에 의해 만들어진 파손은 상이한 가닥 상에 있으며; 그리고
f) PAM은 외부로 향한다.
일 구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 모두는 다음 특성: a 및 b(i)을 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(ii)을 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(iii)을 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(i), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(i), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(i), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iv), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iv), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(iv), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(v), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(v), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(v), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vi), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vi), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vi), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(vii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(viii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(viii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(viii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ix), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ix), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(ix), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(x), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(x), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(x), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(xi), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(xi), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 모두는 특성: a(i), b(xi), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
일 구현예에서, gRNA는 HNH 활성를 갖는 Cas9 닉카제 분자, 예를 들어 비활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10에서 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일 구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 닉카제 분자, 예를 들어 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840에서 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다. 일 구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 닉카제 분자, 예를 들어 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 N863에서 돌연변이, 예를 들어 N863A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
(1) 유전자 편집을 위한 제제의 기능성 분석
당업계에 공지된 방법에 의하거나, 본 명세서에 기재된 바와 같이, Cas9 분자, gRNA 분자, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 중 임의의 것을 평가할 수 있다. 예를 들어, Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하기 위한 예시적 방법이, 예를 들어 문헌[Jinek et al, Science 2012, 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
(a) 결합 및 절단 분석: Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성의 시험
표적 핵산에 결합하여, 이를 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 플라스미드 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, 합성 또는 시험관내 전사 gRNA 분자를 95℃까지 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 반응 전에 사전 어닐링한다. 천연 또는 제한 분해-선형화 플라스미드 DNA(300 ng (약 8 nM))를 10 mM MgCl2의 존재 또는 부재 하에 Cas9 플라스미드 절단 완충액(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) 중에서 정제된 Cas9 단백질 분자(50 nM 내지 500 nM) 및 gRNA(50 nM 내지 500 nM, 1:1)와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 5X DNA 로딩 완충액(30% 글리세롤, 1.2% SDS, 250 mM EDTA)를 이용하여 반응을 중단시키고, 0.8% 또는 1% 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 브롬화에티듐 염색에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 Cas9 분자가 DNA 가닥을 둘 모두, 또는 두 가닥 중 단지 하나를 절단하는지의 여부를 나타낸다. 예를 들어, 선형 DNA 산물은 DNA 가닥 둘 모두의 절단을 나타낸다. 닉 개방 원형 산물은 두 가닥 중 하나만이 절단된 것을 나타낸다.
대안적으로, 표적 핵산에 결합하여, 이를 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 올리고뉴클레오타이드 DNA 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, DNA 올리고뉴클레오타이드(10 pmol)를 50 ㎕ 반응물 중에서 37℃에서 30분 동안 1X T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 반응 완충액 중의 5 단위 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 약 3 pmol 내지 6 pmol(약 20 mCi 내지 40 mCi)[γ-32P]-ATP와 함께 인큐베이션시킴으로써 방사성 표지한다. 열 불활성화 후에(65℃에서 20분 동안), 혼입되지 않은 표지를 제거하기 위해 칼럼을 통해 반응물을 정제한다. 95℃에서 3분 동안 등몰량의 비표지 상보성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표지된 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한 후에, 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 이중가닥 기질(100 nM)을 발생시킨다. 절단 분석을 위해, gRNA 분자는 95℃로 30분 동안 가열함으로써 어닐링한 후에 실온으로 서서히 냉각시킨다. Cas9(500 nM 최종 농도)는 총 용적 9 ㎕ 중에서 절단 분석 완충액(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% 글리세롤) 중에서 어닐링된 gRNA 분자(500 nM)와 함께 사전 인큐베이션시킨다. 1 ㎕ 표적 DNA(10 nM)의 첨가에 의해 반응을 개시하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 20 ㎕의 로딩 염료(5 mM EDTA, 0.025% SDS, 포름아미드 중에서 5% 글리세롤)의 첨가에 의해 반응을 퀀칭시키고, 95℃로 5분 동안 가열한다. 7 M 유레아를 함유하는 12% 변성 폴리아클릴아미드 겔 상에서 절단 산물을 분해하고, 인광 영상화에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 상보적 가닥, 비상보적 가닥 또는 둘 모두가 절단되는지의 여부를 나타낸다.
이들 분석 중 하나 또는 둘 모두는 제공된 gRNA 분자 또는 Cas9 분자의 적합성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
(b) 결합 분석: 표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합 시험
표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합을 평가하는 예시적인 방법은, 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)에서, 표적 DNA 이중가닥은 탈이온수 중에서 각각의 가닥(10 nmol)을 혼합하고, 95℃로 3분 동안 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 형성된다. 모든 DNA를 8% 천연 겔 함유 1X TBE 상에서 정제한다. DNA 밴드를 UV 투영법에 의해 시각화한 다음, 절제하고, DEPC-처리 H2O 중에 겔 조각을 침지시킴으로써 용리시킨다. 용리된 DNA는 에탄올 침전되고, DEPC-처리된 H2O 중에 용해된다. DNA 샘플을 37℃에서 30분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 이용하여 [γ-32P]-ATP로 5' 말단 표지한다. 폴리뉴클레오타이드 키나제를 65℃에서 20분 동안 열 변성시키고, 칼럼을 이용하여 비혼입 방사성 표지를 제거한다. 총 용적 10 ㎕로 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 중에서 결합 분석을 수행한다. Cas9 단백질 분자는 등몰량의 사전 어닐링된 gRNA 분자에 의해 프로그래밍되고, 100 pM 내지 1 μM로 적정된다. 방사성 표지된 DNA를 최종 농도 20 pM로 첨가한다. 샘플을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 4℃에서 1X TBE 및 5 mM MgCl2를 함유하는 8% 천연 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해한다. 겔은 건조되고, DNA는 인광 영상화에 의해 시각화된다.
(c) Cas9 / gRNA 복합체의 열 안정성 측정 기법
Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 열 안정성을 시차주사 형광측정법(DSF) 및 다른 기법에 의해 검출할 수 있다. 단백질의 열 안정성은 결합 RNA 분자, 예를 들어 gRNA의 첨가와 같이, 바람직한 조건 하에서 증가할 수 있다. 따라서, 복합체가 안정한지를 결정하기 위해서는 Cas9/gRNA 복합체의 열 안정성과 관련된 정보가 유용하다.
(d) 시차주사 형광측정법( DSF )
Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 열 안정성은 DSF를 통해 측정될 수 있다. 하기에 기재된 바와 같이, RNP 복합체는 리보뉴클레오타이드, 예컨대 RNA 또는 gRNA, 및 단백질, 예컨대 Cas9 단백질 또는 이들의 변이체의 서열을 포함한다. 이 기법은 결합 RNA 분자, 예를 들어 gRNA의 첨가와 같은 바람직한 조건 하에서 증가될 수 있는 단백질의 열 안정성을 측정한다.
이 분석은 다양한 방식으로 적용될 수 있다. 예시적인 프로토콜로는 RNP 형성을 위해 요망되는 용액 조건을 결정하기 위한 프로토콜(분석 1, 하기 참조), 요망되는 gRNA:Cas9 단백질의 화학량론 비율을 시험하기 위한 프로토콜(분석 2, 하기 참조), Cas9 분자, 예를 들어 야생형 또는 돌연변이 Cas9 분자에 대한 효과적인 gRNA 분자를 스크리닝하기 위한 프로토콜(분석 3, 하기 참조), 및 표적 DNA의 존재 하에 RNP 형성을 시험하기 위한 프로토콜(분석 4)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 이 분석은 최적의 gRNA:Cas9 단백질의 화학량론 비율을 시험하기 위한 프로토콜과 RNP 형성을 위한 최적의 용액 조건을 결정하기 위한 다른 프로토콜의 2개의 프로토콜을 사용하여 수행된다.
RNP 복합체를 형성하기 위한 최적의 용액을 결정하기 위해, 물+10x SYPRO Orange®(Life Techonologies cat#S-6650) 중의 Cas9의 2 uM 용액을 384 웰 플레이트에 분주한다. 이어서, 다양한 pH 및 염을 지니는 용액 중에 희석시킨 등몰량의 gRNA를 첨가한다. 실온에서 10 초 동안 인큐베에션하고, 잠시 동안 원심분리하여, 임의의 거품을 제거한 후에, Bio-Rad CFX 매니저 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기(Thermal Cycler)를 사용하여 10초마다 온도를 1° 증가시키면서, 20℃ 내지 90℃의 구배로 구동시킨다.
제2 분석은 상기 분석 1로부터의 최적의 완충액 중의 2 uM Cas9와 다양한 농도의 gRNA를 혼합하는 단계 및 384 웰 플레이트에서 10초 동안 실온에서 인큐베이션시키는 단계로 이루어진다. 동일한 용적의 최적의 완충액 + 10x SYPRO Orange®(Life Techonologies cat#S-6650)를 첨가하고, 플레이트를 Microseal® B 접착제(MSB-1001)로 밀봉한다. 잠시 동안 원심분리하여, 임의의 거품을 제거한 후에, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기를 사용하여 10초마다 온도를 1° 증가시키면서, 20℃ 내지 90℃의 구배로 구동시킨다.
제3 분석에서, 대상 Cas9 분자(예를 들어, Cas9 단백질, 예를 들어 Cas9 변이체 단백질)를 정제한다. 변이체 gRNA 분자의 라이브러리를 합성하고, 20 μM의 농도로 재현탁한다. Cas9 분자를 각각, 5x SYPRO Orange®(Life Technologies cat#S-6650)의 존재 하에 소정의 완충액 중에서 1 μM의 최종 농도로 gRNA 분자와 인큐베이션한다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여, 임의의 거품을 제거한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기를 사용하여 10초마다 온도를 1℃ 증가시키면서, 20℃ 내지 90℃의 구배로 구동시킨다.
제4 분석에서, 다음의 샘플에 의해, DSF 실험을 수행한다: Cas9 단백질 단독, gRNA와 Cas9 단백질, gRNA 및 표적 DNA와 Cas9 단백질, 및 표적 DNA와 Cas9 단백질. 성분을 혼합하는 순서는 다음과 같다: 반응 용액, Cas9 단백질, gRNA, DNA, 및 SYPRO Orange. 반응 용액은 MgCl2의 부재 또는 존재 하에, 10 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl을 함유한다. 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여, 임의의 거품을 제거한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기를 사용하여 10 초마다 온도를 1° 증가시키면서, 20℃ 내지 90℃의 구배로 구동시킨다.
5. 표적 세포
Cas9 분자 및 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포를 조작하기 위해, 예를 들어 매우 다양한 세포에서 표적 핵산을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 세포는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 유전자를 편집함으로써(예를 들어, 하나 이상의 표적 유전자에서 돌연변이를 유도함으로써) 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자)의 발현은 조절된다. 다른 구현예에서, 세포는 하나 이상의 표적 유전자를 편집하고(예를 들어, 하나 이상의 표적 유전자에서 돌연변이를 유도하고) 그리고/또는 하나 이상의 표적 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는 TRBC 유전자의 발현을 조절함으로써 생체외에서 조작되고, 대상체에게 투여된다. 생체외 조직을 위한 표적 세포의 공급원은, 예를 들어 대상체의 혈액, 대상체의 제대혈, 또는 대상체의 골수를 포함할 수 있다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원은 또한, 예를 들어 이종성 공여체 혈액, 제대혈, 또는 골수를 포함한다.
본 명세서에 기재된 Cas9 및 gRNA 분자는 표적 세포에 전달될 수 있다. 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 조절 T 세포(Treg), 줄기 세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 또는 수지상 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유도된 세포, 예를 들어 하나 이상의 표적 유전자, 예를 들어FAS , BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB , PTPN6 , TRAC 또는TRBC 유전자의 발현을 변경하거나(예를 들어, 표적 유전자에서 돌연변이를 유도하거나) 또는 발현을 조작하도록 조작된 대상체로부터 발생된 iPS 세포로부터 유도되고, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포 (예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포로 분화된 세포이다.
일 구현예에서, 표적 세포는 특이적 T 세포 수용체(TCR) 유전자(예를 들어, TRAC 및 TRBC 유전자)를 함유하도록 변경되었다. 다른 구현예에서, TCR은 종양 연관 항원, 예를 들어 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), GP100, T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART1), 흑색종 항원 A3(MAGEA3), NYESO1 또는 p53에 대해 결합 특이성을 가진다.
일 구현예에서, 표적 세포는 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 함유하도록 변경되었다. 일 구현예에서, CAR은 종양 연관 항원, 예를 들어 CD19, CD20, 탄산 무수화효소 IX(CAIX), CD171, CEA, ERBB2, GD2, 알파-엽산염 수용체, 루이스 Y 항원, 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 종양 연관 당단백질 72(TAG72)에 대한 결합 특이성을 가진다.
다른 구현예에서, 표적 세포는, 예를 들어 TCR 또는 CAR에 의해 다음의 종양 항원 중 하나 이상에 결합하도록 변경되었다. 종양 항원은 AD034, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, 피불린-1, HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/갈렉틴9(갈렉틴9), HOM-MEEL-40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB1, KM-HN-3, KM-KN-1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a,MPP11, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK11, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, OGFr, PLU-1, Rab38, RBPJ카파, RHAMM, SCP1, SCP-1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B, 또는 티로시나제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
a) 표적 세포에 대한 성분의 생체외 전달 방법
성분, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA 분자는 다양한 전달 방법 및 제형을 이용하여 다양한 형태로 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 표6 및 표 7 참조. Cas9 또는 gRNA 성분이 전달을 위해 DNA로서 인코딩될 때, DNA는 필수적으로는 아니지만 통상적으로 발현을 달성하기 위해, 예를 들어 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 수 있다. Cas9 분자 서열에 대한 유용한 프로모터는, 예를 들어 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터를 포함한다. gRNA에 대한 유용한 프로모터는, 예를 들어 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터를 포함한다. 유사한 또는 비유사한 강도를 지니는 프로모터는 성분의 발현을 조율하도록 선택될 수 있다. Cas9 분자를 인코딩하는 서열은 핵 국소화 신호(NLS), 예를 들어 SV40 NLS를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 도입된 RNP 복합체는 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제이다. RNP 복합체는 리보뉴클레오타이드, 예컨대 RNA 또는 gRNA 분자, 및 단백질, 예컨대 Cas9 단백질 또는 그의 변이체의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 본 명세서에 제공되는 Cas9 단백질 및 본 명세서에 제공되는 gRNA 분자, 예를 들어 PDCD1에 표적화된 gRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 전달된다. 일부 구현예에서, 기재된 임의의 것과 같은 PDCD1에 표적화된 하나 이상의 gRNA 분자 및 Cas9 효소 또는 그의 변이체를 포함하는 RNP는 물리적 전달(예를 들어, 전기천공, 입자총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축 또는 스퀴징(squeezing)), 리포솜 또는 나노입자를 통해, 세포 내로 직접 도입된다. 특정 구현예에서, RNP는 전기천공법을 통해 도입된 PDCD1에 표적화된 하나 이상의 gRNA 분자 및 Cas9 효소 또는 이들의 변이체를 포함한다.
표6은 성분이 표적 세포에 전달될 수 있는 형태의 예를 제공한다.
[표 6]
Figure pct00036
표7은 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas 시스템의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및 gRNA 분자 성분을 위한 다양한 전달 방법을 요약한다.
[표 7]
Figure pct00037
Figure pct00038
(1) Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 DNA-기반 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자) 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 DNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-인코딩 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는, 예를 들어 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용), 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다.
벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어 Cas9 분자 서열에 융합된 (예를 들어, 핵 국소화, 인 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위해) 단일 펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 인코딩하는 서열에 융합된 (예를 들어, SV40으로부터의) 핵 국소화 서열을 포함할 수 있다.
하나 이상의 조절/제어 구성요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(내부 리보솜 진입 부위: IRES), 2A 서열, 및 스플라이스 수증체(acceptor) 또는 공여체가 벡터 내에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다.
일 구현예에서, 벡터는 또는 전달 비히클은 (예를 들어, 재조합 바이러스의 발생에 대해) 바이러스 벡터이다. 일 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는, 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스이다.
일 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 분열 세포와 비분열 세포를 둘 모두 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대해 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적 발현을 야기한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 장기간 지속, 예를 들어 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적 발현을 야기한다. 바이러스의 패키징 능력은, 예를 들어 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어 적어도 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb로 다를 수 있다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는, 예를 들어 숙주 게놈 내로 통합되게 하는 역전사효소를 포함한다. 일 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는, 예를 들어 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필수적인 유전자에 대해 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 또는 결실된, 복제-결함이다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된이다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 세포 내로 그의 게놈을 혼입시킬 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV), 예를 들어 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 가닥 둘 모두를 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 AAV 혈청형은, AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형된 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형된 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh 10, 및 위형 AAV를 포함하고, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달된다.
패키징 세포를 사용하여 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293개 세포, 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생산자 세포주에 의해 발생된다. 벡터는 통상적으로 패키징 및 (적용 가능하다면) 숙주 또는 표적 세포 내로의 후속적 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 인코딩하는 발현 카세트, 예를 들어 Cas9에 의해 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열만을 가진다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 도중에 공급된다. 이후로, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열은 없는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결실에 기인하여 상단한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 인식 능력을 가진다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안의 바이러스 외피 당단백질로 위형을 만들 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체에 의해 공학 처리되며(예를 들어, 표적화 리간드, 예컨대 펩타이드 리간드, 단쇄 항체, 성장인자를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변형); 그리고/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 다른 말단(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-바이오틴 및 화학적 컨쥬게이션)을 지니는 이중 특이성이 있는 분자 브릿지를 갖도록 조작된다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 특이적 표적 세포에서만 이식유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 작제될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 이식유전자 발현의 마이크로RNA-의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 융합-적격 혈구응집소(HA)는 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 세포 내로 혼입될 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 가진다. 예를 들어, (세포 분할 동안) 핵 막의 붕괴를 필요로 하고 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않을 바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질 내 핵 국소화 펩타이드를 혼입시키도록 변경될 수 있고, 이에 의해 비증식 세포의 형질도입을 가능하게 한다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 비벡터 기반 방법에 의해(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용하여) 전달된다. 예를 들어, DNA는, 예를 들어 유기적으로 변형된 실리카 또는 실리케이트(오르모실(Ormosil)), 전기천공법, 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재되어 있음), 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 지질-매개 형질감염, 덴드리머, 무기 나노입자, 인산칼슘, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 세포를 Cas9-및/또는 gRNA-인코딩 DNA와 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 세포가 Cas9-및/또는 gRNA-인코딩 DNA와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
일 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 벡터 기반 방법과 비벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 바이로좀은 비활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 조합된 리포좀을 포함하는데, 이는 바이러스 또는 리포좀 방법 단독 중 하나보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있다.
일 구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스 벡터이다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는, 예를 들어 자기 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2) 및 실리카를 포함한다. 나노입자의 외면은 페이로드의 부착(예를 들어, 컨쥬게이션 또는 포착)을 가능하게 하는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)과 컨쥬게이팅될 수 있다. 일 구현예에서, 비바이러스 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질및 지질로 코팅된 프로타민-핵산 복합체와 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포좀을 포함한다.
유전자 전달을 위한 예시적인 지질은 이하의 표8에 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00039
Figure pct00040
유전자 전달을 위한 예시적인 중합체를 표9에 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00041
일 구현예에서, 비히클은 나노입자 및 리포좀의 표적 세포 흡수를 증가시키기 위한 표적화 변형, 예를 들어 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단쇄 항체, 앱타머, 중합체, 당 및 세포 침투 펩타이드를 가진다. 일 구현예에서, 비히클은 융합생산 및 엔도좀-탈안정화 펩타이드/중합체를 이용한다. 일 구현예에서, 비히클은 (예를 들어, 화물의 엔도좀 탈출을 가속화시키기 위해) 산-촉발 입체구조적 변화를 겪는다. 일 구현예에서, 자극-절단성 중합체는, 예를 들어 세포의 격막에서의 방출을 위해 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단된 이황화-기반 양이온성 중합체가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스 전달 비히클이다. 일 구현예에서, 비히클은 약독화된 박테리아(예를 들어, 천연으로 또는 침습성이 되도록 인공적으로 공학 처리되었지만 발병을 예방하고 이식유전자(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스, 특정 살모넬라 균주(Salmonella strains), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 발현시키도록 약독화됨, 표적 특이적 세포에 대해 영양적 및 조직 특이적 향성을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경시키도록 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아)이다. 일 구현예에서, 비히클은 유전자 변형된 박테리오파지이다(예를 들어, 거대 패키징 능력을 갖는 조작된 파지, 덜 면역원성, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하고 혼입된 표적화 리간드를 가짐). 일 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 (예를 들어, "빈" 입자의 정제 후에 목적으로 하는 화물을 지니는 바이러스의 생체외 조립체에 의해) 발생될 수 있다. 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 공학 처리될 수 있다. 일 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포좀이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포로부터 유래된 인지질 기반 입자이다(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구체 구조로 분해된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음), 또는 식균 작용 유래의(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생산될 수 있고, 따라서 표적화 리간드에 대한 필요없이 세포에 의해 취해질 수 있음) 분비 엑소솜-대상체 유래 막-결합 나노소수포(30 nm 내지 100 nm)).
일 구현예에서, Cas 시스템의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자)가 전달된다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 성분 중 하나 이상이 전달됨과 동시에 전달된다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 성분이 전달되기 (예를 들어, 약 30분 미만, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 1주, 2주 또는 4주) 전에 또는 후에 전달된다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 성분 중 하나 이상과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기천공법에 의해 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 TRAC 유전자, TRBC 유전자 또는 CAR 유전자를 인코딩한다.
(2) Cas9 분자를 인코딩하는 RNA의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-인코딩 및/또는 gRNA-인코딩 RNA는, 예를 들어 미량주사법, 전기천공법, 일시적 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 RNA와 세포를 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 RNA와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
(3) Cas9 단백질 및 리보뉴클레오단백질(RNP)의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는, 예를 들어 미량주사법, 전기천공법, 일시적 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 인코딩하는 DNA 또는 gRNA에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 본 명세서에 제공되는 Cas9 단백질 및 본 명세서에 제공되는 gRNA 분자, 예를 들어 PDCD1에 표적화된 gRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 전달된다. 일부 구현예에서, RNP 복합체는 리보뉴클레오타이드, 예컨대 RNA 또는 gRNA 분자, 및 단백질, 예컨대 Cas9 단백질 또는 그의 변이체의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 기재된 임의의 것과 같은 PDCD1에 표적화된 하나 이상의 gRNA 분자 및 Cas9 효소 또는 그의 변이체를 포함하는 RNP는 물리적 전달(예를 들어, 전기천공, 입자총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축 또는 스퀴징), 리포솜 또는 나노입자를 통해, 세포 내로 직접 도입된다. 특정 구현예에서, RNP는 전기천공법을 통해 도입된 것으로, 기재된 임의의 것과 같은 PDCD1에 표적화된 하나 이상의 gRNA 분자 및 Cas9 효소 또는 이들의 변이체를 포함한다.
일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 gRNA 분자와 함께 또는 gRNA 분자 없이 세포를 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 gRNA 분자와 함께 또는 gRNA 분자 없이 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
6. 변형된 뉴클레오사이드 , 뉴클레오타이드 , 및 핵산
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵산, 예를 들어 특히 gRNA뿐만 아니라 RNA의 다른 형태, 예를 들어 mRNA, RNAi, 또는 siRNA에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 5탄당 분자(펜토즈 또는 리보스) 또는 이의 유도체, 및 유기 염기, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 이의 유도체를 포함하는 화합물로서 정의된다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드로서 정의된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 포스포디에스테르 백본 연결에서 비결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어 대체;
(ii) 리보스 당, 예를 들어 리보스 당에서 2' 하이드록실의 성분의 변경, 예를 들어 대체;
(iii) "데포스포" 링커를 지니는 포스페이트 모이어티의 대량 대체;
(iv) 천연 유래 핵염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형;
(vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티의 컨쥬게이션; 및
(vii) 당의 변형.
상기 열거된 변형은 조합되어 2개, 3개, 4개 이상의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되어 있으며, 예를 들어 모든 염기는 변형된 포스페이트기를 가지고, 예를 들어 모든 변형된 포스페이트기는 포스포로티오에이트기이다. 일 구현예에서, 단분자 또는 모듈 gRNA 분자의 포스페이트기의 전부, 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트기로 대체된다.
일 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형을 가지는 뉴클레오타이드는, 핵산, 예를 들어 "변형된 핵산"으로 포함된다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 1개, 2개, 3개 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산에서 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%)가 변형된 뉴클레오타이드이다.
변형되지 않은 핵산은, 예를 들어 세포 뉴클레아제에 의해 분해되는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하여, 예를 들어 뉴클레아제에 대하여 안정성을 도입할 수 있다.
a) 포스페이트 백본 변형
(1) 포스페이트기
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트로 비변형 포스페이트 모이어티를 대량 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본의 변형은 비하전된 링커 또는 하전된 링커 중 어느 하나가 비대칭 전하 분포를 갖도록 하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본 모이어티에서 비가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 다음의 기 중 임의의 것으로 대체될 수 있다: 황(S), 셀레늄(Se), BR3(여기서, R은, 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), C(예를 들어, 알킬기, 아릴기 등), H, NR2(여기서, R은, 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), 또는 OR(여기서, R은, 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음). 비변형 포스페이트기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 상기 원자 또는 원자 그룹 중 하나로 비가교 산소 중 하나를 대체하는 것은 인 원자를 키랄로 만들 수 있으며; 다시 말하면 이러한 방식으로 변형된 포스페이트기에서 인 원자가 입체 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배열(본 명세서에서는 Rp) 또는 "S" 배열(본 명세서에서는 Sp)을 가질 수 있다.
포스포로디티오에이트는 비가교 산소 둘 모두 황으로 대체된다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고리보뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 불가능하게 하는 아키랄이다. 일부 구현예에서, 비가교 산소 하나 또는 둘 모두의 변형은 또한 S, Se, B, C, H, N, 및 OR(R은, 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음)로부터 독립적으로 선택되는 기로 비가교 산소를 대체하는 것을 포함할 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 가교 산소(즉, 뉴클레오사이드에 포스페이트를 연결하는 산소)를 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 어느 하나 또는 연결 산소의 둘 모두에서 일어날 수 있다.
(2) 포스페이트기의 대체
포스페이트기는 비-인 함유 커넥터(non-phosphrous containing connector)에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전 포스페이트기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸렌하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
(3) 리보포스페이트 백본의 대체
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체되는, 핵산을 모사할 수 있는 스캐폴드가 또한 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대용물 백본에 의해 테터링될 수 있다. 예는, 제한없이, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함할 수 있다.
b) 당 변형
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당기에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드록실은 더 이상 탈양자화되지 않아 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 있으므로, 2' 하이드록실기에의 변형은 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다. 2'-알콕사이드는 링커 인 원자 상에서 분자내 친핵성 공격에 의한 분해를 촉진시킬 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기서, R은, 예를 들어 H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있음)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 "잠금(locked)" 핵산(LAN)을 포함할 수 있으며, 여기서 2' 하이드록실은, 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE)(OCH2CH2OCH3, 예를 들어 PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 예를 들어 부분적으로 ds RNA의 돌출된 부분에서); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디아킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 본 명세서에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당기는 또한 리보스 중 상응하는 탄소와 반대의 위치화학 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은, 당으로서 예를 들어 아라비노스를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 "단량체"는 당의 1' 위치에서 알파 연결, 예를 들어 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 변형된 핵산은 또한 "비염기성" 당을 포함할 수 있으며, 상기 비염기성 당은 C-1'에서 핵염기가 없다. 이러한 비염기성 당은 또한 구성하는 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L-뉴클레오사이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, RNA는 당기 리보스를 포함하며, 당기 리보스는 산소를 가지는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오사이드는 제한없이 리보스 중 산소의 (예를 들어, 황(S), 셀레늄(Se), 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌으로의) 대체;이중 결합의 첨가(예를 들어, 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체); 리보스의 고리 축소(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 가지는 6원- 또는 7-원 고리, 예를 들어 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 모르폴리노(이는 또한 포스포르아미데이트 백본을 가짐) 형성)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 멀티사이클릭 형태(예를 들어, 트리사이클로); 및 "비잠금(unlocked)" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위에 의해 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸르노실-(3'→2')로 대체됨)을 포함할 수 있다.
c) 핵염기 상의 변형
변형된 핵산으로 포함될 수 있는, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는, 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데신(A), 구아닌(G), 사이토신 (c), 및 우라실(U)을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들 핵염기는 변형되거나 완전히 대체되어 변형된 핵산에 포함될 수 있는 변형된 뉴클로오타이드 및 변형된 뉴클레오사이드를 제공할 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를들어 자연-생산되고 합성된 염기의 유도체를 포함할 수 있다.
(1) 우라실
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 슈도유리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-유리딘, 6-아자-유리딘, 2-티오-5-아자-유리딘, 2-티오-유리딘(s2U), 4-티오-유리딘(s4U), 4-티오-슈도유리딘, 2-티오-슈도유리딘, 5-하이드록시-유리딘(ho5U), 5-아미노알릴-유리딘, 5-할로-유리딘(예를 들어, 5-요오도-유리딘 또는 5-브로모-유리딘), 3-메틸-유리딘(m3U), 5-메톡시-유리딘(mo5U), 유리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 유리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카르복시메틸-유리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도유리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-유리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-유리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-유리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-유리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-유리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-유리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-유리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-유리딘(mnm5se2U), 5-카르바모일메틸-유리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-유리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-유리딘(cmnm 5s2U), 5-프로피닐-유리딘, 1-프로피닐-슈도유리딘, 5-타우리노메틸-유리딘(τcm5U), 1-타우리노메틸-슈도유리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-유리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도유리딘, 5-메틸-유리딘(m5U, 즉 핵염기 데옥시티민을 가짐), 1-메틸-슈도유리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-유리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도유리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도유리딘, 3-메틸-슈도유리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도유리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도유리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도유리딘, 디하이드로유리딘(D), 디하이드로슈도유리딘, 5,6-디하이드로유리딘, 5-메틸-디하이드로유리딘(m5D), 2-티오-디하이드로유리딘, 2-티오-디하이드로슈도유리딘, 2-메톡시-유리딘, 2-메톡시-4-티오-유리딘, 4-메톡시-슈도유리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도유리딘, N1-메틸-슈도유리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)유리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도유리딘(acp3ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)유리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-유리딘(inm5s2U), α-티오-유리딘, 2'-O-메틸-유리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-유리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도유리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-유리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-유리딘(mcm 5Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-유리딘(ncm 5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-유리딘(cmnm 5Um), 3,2'-O-디메틸-유리딘(m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-유리딘(inm 5Um), 1-티오-유리딘, 디옥시티미딘, 2'-F-아라-유리딘, 2'-F-유리딘, 2'-OH-아라-유리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 유리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)유리딘, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 잔틴, 및 하이포잔틴을 포함한다.
(2) 사이토신
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 사이토신이다. 변형된 사이토신을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 5-아자-사이티딘, 6-아자-사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘(m3C), N4-아세틸-사이티딘(act), 5-포르밀-사이티딘(f5C), N4-메틸-사이티딘(m4C), 5-메틸-사이티딘(m5C), 5-할로-사이티딘(예를 들어, 5-요오도-사이티딘), 5-하이드록시메틸-사이티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소사이티딘, 피롤로-사이티딘, 피롤로-슈도이소사이티딘, 2-티오-사이티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-사이티딘, 4-티오-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-사이티딘, 2-메톡시-5-메틸-사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, 라이시딘(k2C), α-티오-사이티딘, 2'-O-메틸-사이티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-사이티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-사이티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-사이티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-사이티딘(f 5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-사이티딘(m4 2Cm), 1-티오-사이티딘, 2'-F-아라-사이티딘, 2'-F-사이티딘, 및 2'-OH-아라-사이티딘을 포함한다.
(3) 아데닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는, 제한없이, 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신, 7-데아자-8-아자-아데노신, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데노신(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m6 2A), N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데노신, 2-메틸티오-아데노신, 2-메톡시-아데노신, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m6Am), N6-메틸-2'-데옥시아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m6 2Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사논아데실)-아데노신을 포함한다.
(4) 구아닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 와이오신(imG), 메틸와이오신(mimG), 4-데메틸-와이오신(imG-14), 이소와이오신(imG2), 와이부토신(yW), 퍼옥시와이부토신(o2yW), 하이드록시와이부토신(OHyW), 저변형 하이드록시와이부토신(OHyW*), 7-데아자-구아노신, 케오신 (Q), 에폭케오신(oQ), 갈락토실-케오신(galQ), 만노실-케오신(manQ), 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 아케오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m'G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m2 2G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2, N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2 2Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m'Gm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m'Im), O6-페닐-2'-디옥시이노신, 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸-구아노신, O6-메틸-2'-데옥시구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신을 포함한다.
d) 예시적인 변형된 gRNA
일부 구현예에서, 변형된 핵산은 변형된 gRNA일 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 gRNA는 본 부문에 따라 변형될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 논의된 바와 같은, 일시적으로 발현된 또는 전달된 핵산은, 예를 들어 세포의 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA는 뉴클레아제에 안정성을 도입한 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 것과 변형된 다른 gRNA는 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포와 같은 순환 세포)에 의해 향상된 안정성을 나타내며, 이것이 관찰된 개선의 원인일 수 있는 것으로 사료된다.
예를 들어, 본 명세서에서 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 gRNA의 5' 말단이 진핵생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체의 포함에 의해 변형될 때, 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포)에서 유전자의 생체외 편집에서의 개선을 알 수 있었다. 본 발명은 5' 캡핑 gRNA에 의해 관찰된 개선이 동일한 유형의 구조적 또는 기능성 결과를 달성하기 위한 다른 방법에서(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 포함에 의해, 또는 시험관내 전사 gRNA가 5' 트리포스페이트기를 제거하기 위해 송아지 장 알칼리성 포스파타제와 같은 포스파타제에 의한 처리에 의해 변형될 때) 변형된 gRNA로 연장될 수 있다는 인식을 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA는, (예를 들어, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 및/또는 3' 폴리A 꼬리의 혼입에 의해) 뉴클레아제에 안정성을 도입시키는 하나 이상의 변형(예를 들어, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드)을 함유할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 그의 5' 말단 또는 그 근처(예를 들어, 그의 5' 말단의 1개 내지 10개, 1개 내지 5개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 내)에서 변형된 gRNA를 사용함으로써, 특정 세포의 유전자 편집(예를 들어, 생체외 유전자 편집)을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 5' 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 표적화 도메인을 포함하고, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 표적화 도메인을 포함하고, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 캡을 포함한다.
일 구현예에서, gRNA의 5' 말단을 진핵생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체(예를 들어, 제한 없이 G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체, 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체(ARCA))의 혼입에 의해 변형시킨다. 특정 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00042
여기서:
각각의 B1 및 B1'는 독립적으로
Figure pct00043
이고,
각각의 R1은 독립적으로 선택적으로 페닐 또는 6-원 헤테로아릴에 의해 치환된 C1-4 알킬이고;
각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, F, OH, 또는 O-C1-4 알킬이고;
각각의 X, Y, 및 Z는 독립적으로 O 또는 S이고;
각각의 X' 및 Y'는 독립적으로 O 또는 CH2이다.
일 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이다.
일 구현예에서, R1은 -CH3이다.
일 구현예에서, B1'는
Figure pct00044
이다.
일 구현예에서, 각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, OH, 또는 O-CH3이다.
일 구현예에서, 각각의 X, Y, 및 Z는 O이다.
일 구현예에서, X' 및 Y'는 O이다.
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00045
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00046
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00047
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00048
일 구현예에서, X는 S이고, Y 및 Z는 O이다.
일 구현예에서, Y는 S이고, X 및 Z는 O이다.
일 구현예에서, Z는 S이고, X 및 Y는 O이다.
일 구현예에서, 포스포로티오에이트는 Sp 부분입체이성질체이다.
일 구현예에서, X'는 CH2이고, Y'는 O이다.
일 구현예에서, X'는 O이고, Y'는 CH2이다.
일 구현예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 테트라포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00049
여기서:
각각의 B1 및 B1'는 독립적으로
Figure pct00050
이고,
각각의 R1은독립적으로 선택적으로 페닐 또는 6-원 헤테로아릴에 의해 치환된 C1-4 알킬이고;
각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, F, OH, 또는 O-C1-4 알킬이고;
각각의 W, X, Y, 및 Z는 독립적으로 O 또는 S이고;
각각의 X', Y', 및 Z'는 독립적으로 O 또는 CH2이다.
일 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이다.
일 구현예에서, R1은 -CH3이다.
일 구현예에서, B1'는
Figure pct00051
일구현예에서, 각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, OH, 또는 O-CH3이다.
일 구현예에서, 각각의 W, X, Y, 및 Z는 O이다.
일 구현예에서, 각각의 X', Y', 및 Z'는 O이다.
일 구현예에서, X'는 CH2이고, Y' 및 Z'는 O이다.
일 구현예에서, Y'는 CH2이고, X' 및 Z'는 O이다.
일 구현예에서, Z' is CH2이고, X' 및 Y'는 O이다.
일 구현예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 펜타포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, gRNA 분자의 5' 말단은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure pct00052
여기서:
각각의 B1 및 B1'는 독립적으로
Figure pct00053
이고,
각각의 R1은 독립적으로 선택적으로 페닐 또는 6-원 헤테로아릴에 의해 치환된 C1-4 알킬이고;
각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, F, OH, 또는 O-C1-4 알킬이고;
각각의 V, W, X, Y, 및 Z는 독립적으로 O 또는 S이고;
각각의 W', X', Y', 및 Z'는 독립적으로 O 또는 CH2이다.
일 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이다.
일 구현예에서, R1은 -CH3이다.
일 구현예에서, B1'는
Figure pct00054
이다.
일 구현예에서, 각각의 R2, R2', 및 R3'는 독립적으로 H, OH, 또는 O-CH3이다.
일 구현예에서, 각각의 V, W, X, Y, 및 Z는 O이다.
일 구현예에서, 각각의 W', X', Y', 및 Z'는 O이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "5' 캡"은 통상적인 mRNA 5' 캡 구조이나, 또한 그의 유사체를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 상기에 제시된 화학적 구조에 의해 포괄되는 5' 캡 구조에 추가하여, 예를 들어, 메틸렌-bis(포스포네이트) 모이어티를 갖는 테트라포스페이트 유사체(예를 들어, 문헌[Rydzik, A M et al,(2009) Org Biomol Chem 7(22):4763-76] 참조), 비 가교 산소의 황 치환을 갖는 유사체(예를 들어, 문헌[Grudzien-Nogalska, E. et al,(2007) RNA 13(10): 1745-1755] 참조), N7- 벤질화된 디뉴클레오사이드 테트라포스페이트 유사체(예를 들어, 문헌[Grudzien, E. et al,(2004) RNA 10(9): 1479-1487]), 또는 안티 리버스 캡 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 7,074,596호 및 문헌[Jemielity, J. et al,(2003) RNA 9(9): 1 108-1 122 및 Stepinski, J. et al,(2001) RNA 7(10):1486-1495] 참조)가 사용될 수 있다. 본 출원은 또한 OH 또는 OMe 대신에 할로겐 기를 갖는 캡 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 8,304,529호 참조); 적어도 하나의 포스포로티오에이트(PS) 연결을 갖는 캡 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 8,153,773호 및 문헌[Kowalska, J. et al,(2008) RNA 14(6): 1 1 19-1131] 참조); 및 적어도 하나의 보라노포스페이트 또는 포스포로셀레노에이트 연결을 갖는 캡 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 8,519,110호 참조); 및 알키닐-유도체화된 5' 캡 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 8,969,545호 참조)의 사용을 포괄한다.
일반적으로, 5' 캡은 gRNA의 화학적 합성 또는 시험관내 전사 동안 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 5' 캡을 사용하지 않고, 대신에, 포스파타제(예를 들어, 소의 장내 알칼리 포스파타제)에 의해 처리하여, 5' 트리포스페이트기를 제거함으로써, gRNA(예를 들어, 시험관내에서 전사된 gRNA)를 변형시킨다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 또한, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA에 의한 유전자 편집을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 gRNA는, 예를 들어, gRNA 분자 전구체를 시험관내에서 전사시킨 후, 폴리아데노신 중합효소를 사용하여, gRNA 분자 전구체에 폴리A 꼬리를 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 폴리A 꼬리는 E. 콜라이 폴리A 중합효소(E-PAP)와 같은 중합효소를 사용하여, 효소작용에 의해 첨가할 수 있다. 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA는 또한, DNA 주형으로부터 시험관내 전사함으로써, 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 소정의 길이의 폴리A 꼬리를 DNA 주형에 인코딩시키고, RNA 중합효소(예컨대, T7 RNA 중합효소)를 통해, gRNA에 의해 전사시킨다. 폴리A 꼬리를 갖는 gRNA는 또한, gRNA 분자 전구체에 상보성인 고정된 DNA 올리고뉴클레오타이드 및 폴리A 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재 하에, RNA 리가제 또는 DNA 리가제를 사용하여, 시험관내에서 전사한 후, 폴리A 올리고뉴클레오타이드를 gRNA 분자 전구체에 결찰시킴으로써, 제조할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 소정의 길이의 폴리A 꼬리를 합성 올리고뉴클레오타이드로서 합성하고, 가이드 RNA에 상보성인 고정된 DNA 올리고뉴클레오타이드 및 폴리A 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재 하에, RNA 리가제 또는 DNA 리가제에 의해, gRNA의 3' 말단에 결찰시킨다. 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA를 또한 합성에 의해 하나 또는 수개의 조각으로 제조하고, 하나 이상의 고정된 DNA 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재 하에, RNA 리가제 또는 DNA 리가제에 의해 함께 결찰시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리A 꼬리는 50개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 예를 들어, 45개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 40개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 35개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 30개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 25개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드 또는 20개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리는 5개 내지 50개의 아데닌 뉴클레오타이드, 예를 들어 5개 내지 40개의 아데닌 뉴클레오타이드, 5개 내지 30개의 아데닌 뉴클레오타이드, 10개 내지 50개의 아데닌 뉴클레오타이드, 또는 15개 내지 25 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 또한, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA를 사용한 유전자 편집(예를 들어, 생체외 유전자 편집)을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 부문에서 논의되는 예시적 변형 중 일부가 gRNA 서열 내의 임의의 위치에 포함될 수 있으나, 일부 구현예에서, gRNA는 그의 5' 말단 또는 그 근처(예를 들어, 그의 5' 말단의 1개 내지 10개, 1개 내지 5개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 내)에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 그의 3' 말단 또는 그 근처(예를 들어, 그의 3' 말단의 1개 내지 10개, 1개 내지 5개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 내)에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 그의 5' 말단 또는 그 근처의 변형 및 그의 3' 말단 또는 그 근처의 변형 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, gRNA 분자(예를 들어, 시험관내전사된 gRNA)는, 진핵 세포에서 발현되는 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있고, 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. gRNA 분자는, 예를 들어, 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있을 수 있다(예를 들어, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있음). 일 구현예에서, gRNA(예를 들어, 시험관내에서 전사된 gRNA)는 포스파타제(예를 들어, 소의 장내 알칼리 포스파타제)에 의해 처리하여, 5' 트리포스페이트기를 제거함으로써, 변형되며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. gRNA 분자는 대안적으로, 5' 캡을 포함할 수 있다(예를 들어, 표적화 도메인의 5' 말단은 5' 캡을 포함함). 일 구현예에서, gRNA(예를 들어, 시험관내에서 전사된 gRNA)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 5' 캡 구조 또는 캡 유사체 및 3' 폴리A 꼬리 둘 모두를 함유한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같음). 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리는 5개 내지 50개의 아데닌 뉴클레오타이드, 예를 들어 5개 내지 40개의 아데닌 뉴클레오타이드, 5개 내지 30개의 아데닌 뉴클레오타이드, 10개 내지 50개의 아데닌 뉴클레오타이드, 15개 내지 25개의 아데닌 뉴클레오타이드, 30개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 25개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드 또는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 진핵 세포에서 발현되는 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 제공하고, gRNA 분자는, 30개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드(예를 들어, 25개 미만의 아데닌 뉴클레오타이드, 15개 내지 25개의 아데닌 뉴클레오타이드, 또는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드)로 구성된 3' 폴리A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 추가로 변형된다(예를 들어, gRNA 분자는 포스파타제에 의해 처리하여, 5' 트리포스페이트기를 제거함으로써 변형되거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 5' 캡을 포함하도록 변형됨).
일부 구현예에서, gRNA는 3' 말단 U 리보스에서 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 5' 말단 및 3' 말단 U 리보스가 변형된다(예를 들어, gRNA는 포스파타제에 의해 처리하여, 5' 트리포스페이트기를 제거함으로써 변형되거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 5' 캡을 포함하도록 변형됨). 예를 들어, U 리보스의 2개의 말단의 하이드록실 기는 알데하이드기로 산화될 수 있고, 동시에 리보스 고리를 개방하여 이하에 나타내는 바와 같은 변형된 뉴클레오사이드를 얻을 수 있다:
Figure pct00055
식 중, "U"는 비변형 또는 변형된 유리딘일 수 있다.
다른 구현예에서, 3' 말단의 U는 이하에 나타내는 바와 같은 2'3' 사이클릭 포스페이트에 의해 변형될 수 있다:
Figure pct00056
식 중, "U"는 비변형 또는 변형된 유리딘일 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA 분자는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 혼입함으로써, 분해에 대해 안정화될 수 있는 3' 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이 구현예에서, 예를 들어 유리딘은 변형된 유리딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 유리딘, 및 5-브로모 유리딘으로, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 변형된 유리딘으로 대체될 수 있고; 아데노신 및 구아노신은 변형된 아데노신 및 구아노신으로, 예를 들어 8-위치에서의 변형, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 변형된 아데노신 또는 구아노신으로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 그의 5'에서 또는 근처에서의 변형과 그의 3'에서 또는 근처에서의 변형을 둘 모두 포함한다. 일 구현예에서, 시험관내 전사 gRNA는 5' 캡 구조 또는 캡 유사체와 3' 폴리A 꼬리를 둘 모두 함유한다. 일 구현예에서, 시험관내 전사 gRNA는 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)에 의한 처리에 의해 변형되어 5' 트리포스페이트기를 제거하고, 3' 폴리A 꼬리를 포함한다.
앞의 언급은 말단 변형에 중점을 두었지만, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 gRNA 서열 내의 하나 이상의 비-말단 위치 및/또는 하나 이상의 말단 위치에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA를 이용할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 당 변형 리보뉴클레오타이드는 gRNA 내로 혼입될 수 있되, 예를 들어 2' OH-기는 H, -OR, -R(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 할로, -SH, -SR(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); 또는 사이아노(-CN)로부터 선택되는 기에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포스포티오에이트기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 각각 독립적으로, 예를 들어 2'-F 또는 2'-O-메틸, 아데노신(A), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 시티딘 (c), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 유리딘(U), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 구아노신(G), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo) 및 이들의 임의의 조합을 포함하는, 2'-당 변형, 예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-플루오로 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 "잠긴" 핵산(LNA)일 수 있으며, 이때 2' OH-기는, 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시 또는 O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 멀티사이클릭(예를 들어, 트리사이클로; 및 "비잠금" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서, 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체됨), 또는 트레오스 핵산(TNA, 여기서, 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨)인 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, gRNA 분자는 산소를 갖는 5-원 고리인 당기 리보스를 포함한다. 예시적인 변형된 gRNA는 리보스에서의 산소의 치환(예를 들어, 황(S), 셀레늄(Se) 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌); 이중결합의 첨가(예를 들어, 리보스의 사이클로펜텐일 또는 사이클로헥센일로의 치환); 리보스의 고리 축소(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6 또는 7원 고리, 예를 들어 또한 포스포르아미데이트 백본을 갖는 무수헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥산일, 사이클로헥센일 및 몰폴리노의 형성)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 대다수의 당 유사체 변경은 2' 위치로 국소화되지만, 다른 부위가 4' 위치를 포함하는 변형을 할 수 있다. 일 구현예에서, gRNA는 4'-S, 4'-Se 또는 4'-C-아미노메틸-2'-O-Me 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신은 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, O- 및 N-알킬화된 뉴클레오타이드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신은 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 내 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 모두는 데옥시뉴클레오타이드이다.
e) miRNA 결합 부위
마이크로RNA(또는 miRNA)는 천연 유래 세포의 19 내지 25개 뉴클레오타이드 길이 비코딩 RNA이다. 그들은, 예를 들어 mRNA의 3' UTR에서 적절한 miRNA 결합 부위를 갖는 핵산 분자에 결합하고, 유전자 발현을 하향조절한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 하향 조절은 핵산 분자 안정성을 감소시키거나 또는 번역을 저해하는 것에 의한다는 것이 여겨진다. 본 명세서에 개시된 RNA 종, 예를 들어 Cas9를 인코딩하는 mRNA는, 예를 들어 그의 3'UTR에서 miRNA 결합 부위를 포함할 수 있다. miRNA 결합 부위는 선택되는 세포 유형에서의 발현의 하향 조절을 촉진시키기 위해 선택될 수 있다. 예로서, 간에서 흔한 마이크로RNA인 miR-122에 대한 결합 부위의 혼입은 간에서 관심대상의 유전자의 발현을 저해할 수 있다.
D. Cas9 시스템의 활성을 제한하기 위한 지배적인 gRNA 분자 및 이의 용도
Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 DNA를 사용하거나 또는 포함하는 방법 및 조성물은 추가로 "지배적인 gRNA 분자"를 이용하거나 또는 포함할 수 있다. 지배적인 gRNA는 세포 또는 대상체 내로 도입된 다른 CRISPR/Cas 성분의 활성을 제한할 수 있다. 일 구현예에서, gRNA 분자는 세포 또는 대상체 내로 도입된 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 상의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 (a) Cas9 분자를 인코딩하는 핵산 상에서; (b) FAS, BID, CTLA4 , PDCD1 , CBLB, PTPN6 , TRAC 또는TRBC 유전자(표적 유전자 gRNA)를 표적화하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA를 인코딩하는 핵산 상에서; 또는 CRISPR/Cas 성분, 예를 들어 (a)와 (b) 둘 모두를 인코딩하는 하나 초과의 핵산 상에서 표적 서열과 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 지배적인 gRNA 분자는 시스템의 성분을 비활성화하도록 Cas9 분자와 복합체화될 수 있다. 일 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 Cas9 분자를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 비활성화한다. 일 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 표적 유전자 gRNA 분자를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 비활성화한다. 일 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 Cas9 분자/표적 유전자 gRNA 분자 복합체의활성에 대한일시적, 발현 수준 또는 다른 제한을 둔다. 일 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 비표적 또는 요망되지 않는 다른 활성을 감소시킨다. 일 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 음성으로 조절될 CRISPR/Cas 시스템 성분에 대한 코딩 서열 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터를 표적화한다. 예를 들어, 지배적인 gRNA는 Cas9 분자 코딩 서열, 또는 둘 사이에 배치된 서열의 발현을 조절하는 Cas9 분자, 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터에 대한 코딩 서열을 표적화할 수 있다. 일 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 표적 유전자 gRNA에 대한 코딩 서열, 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터를 표적화한다. 일 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA-표적화, 지배적인 gRNA 분자, 또는 그것을 인코딩하는 핵산은 그것을 인코딩하는 Cas9 분자 또는 핵산과 별도로, 예를 들어 이후에 도입된다. 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산 및 하나 이상의 표적 유전자 gRNA 분자를 도입할 수 있고, 제2 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA 표적화, gRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 도입할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 벡터는 제1 벡터 다음에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA 표적화, 지배적인 gRNA 분자, 또는 그것을 인코딩하는 핵산은 Cas9 분자 또는 그것을 인코딩하는 핵산과 함께, 예를 들어 동시에 또는 동일한 벡터에서, 그러나, 예를 들어 후기에 활성화되는 전사 제어 구성요소, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 하에서, 일정 시간 후에 Cas9의 전사가 감소되도록, 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 전사 제어 구성요소는 본질적으로 활성화된다. 구현예에서, 전사 구성요소는 외부 트리거(trigger)에서의 도입을 통해 활성화된다.
통상적으로 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산은 부정적으로 조절하는 성분, 예를 들어 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산과 상이한 제어 영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있다. 일 구현예에서, "상이한 제어 영역"은 단순히, 제어된 서열 둘 모두에 기능적으로 결합된 하나의 제어 영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있지 않음을 지칭한다. 일 구현예에서, 상이한은 종류 또는 유형이 "상이한 제어 영역"을 말한다. 예를 들어 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 인코딩하는 서열은 제어 영역, 예를 들어 부정적으로 조절되는 성분을 인코딩하는 서열, 예를 들어 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산보다 더 낮은 수준으로 발현되거나, 상기 서열보다 이후에 발현되는 제어영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있다.
예로서, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 인코딩하는 서열은, 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어 인간 U6 소형 핵 프로모터, 또는 인간 H1 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 구현예에서, 부정적으로 조절하는 성분을 인코딩하는 서열, 예를 들어 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어, CMV, EF-1a, MSCV, PGK, CAG 제어 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
III. 조성물 및 제형
또한, 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 특정 유형의 세포, 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포가 조성물 중 총 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 구성하게 되도록, 이러한 세포를 함유하고/함유하거나, 이러한 세포에 대해 농화된 이러한 세포의 집단이 제공된다. 조성물 중에는, 예컨대 입양 세포 요법에서의 투여를 위한 약제학적 조성물 및 제형이 존재한다. 또한, 세포 및 조성물을 대상체, 예를 들어 환자에 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
또한, 일정한 투여량 또는 그의 분획 중에 투여하기 위한 세포의 수를 포함하는 단위 투여량 형태 조성물과 같은 약제학적 조성물 및 제형을 포함하여, 투여하기 위한 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적 치료제를 포함한다.
용어 "약제학적 제형"은, 내부에 함유된 활성 구성분의 생물학적 활성이 이러한 형태 내에서 유효하도록 하고, 제형이 투여되는 대상체에 허용 가능하지 않을 정도로 유독한 추가의 성분을 함유하지 않은 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 대상체에 유독하지 않은, 활성 구성분 이외의 약제학적 제형 중 구성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 담체의 선택은 부분적으로는, 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 유독하지 않은 것이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대, 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 조성물 중에 완충제가 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약제학적 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어, 문헌[Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(May 1, 2005)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한, 각각의 활성이 서로 유해한 영향을 주지 않는 것으로, 세포에 의해 치료되는 특정 적응증, 질병 또는 질환에 유용한 1종 초과의 활성 구성분, 바람직하게는, 세포에 상보성인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 활성 구성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합물 중에 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴 및/또는 빈크리스틴과 같은 다른 약제학적 활성 제제를 추가로 포함한다.
약제학적 조성물은 일부 구현예에서, 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 유효한 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방법적 유효량의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 대상체의 주기적 평가에 의해, 치료 또는 예방법적 효능을 모니터링한다. 요망되는 투여량은 세포의 단일 볼루스 투여, 세포의 다회 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 또는 이종의 것일 수 있다. 예를 들어, 면역반응 세포 또는 전구세포는 하나의 대상체로부터 얻어질 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상용 가능한 상이한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈 유래 면역반응 세포 또는 그의 전구세포(예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)는 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하여, 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변형된 면역반응 세포를 함유하는 약제학적 조성물)의 투여 시, 이는 일반적으로 단위 투여량의 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 유제)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌제 투여용의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해, 말초 전신 전달을 사용하여, 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은, 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 용이하다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 접촉 시간을 연장하기 위해 적절한 점성 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
용매, 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균 수, 생리 염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 세포를 혼입시킴으로써, 멸균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 요망되는 제조물에 따라, 보조 물질, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 강화 첨가제, 보존제, 착향료 및/또는 착색제를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 적절한 제조물을 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참고할 수 있다.
항균 보존제, 산화방지제, 킬레이트제 및 완충액을 포함하여, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의해, 미생물의 작용을 확실히 방지할 수 있다. 주사 가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유도할 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된 것이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
IV. 투여 방법 및 입양 세포 요법에서의 용도
세포, 집단, 및 조성물의 투여 방법 및 암을 포함한 질병, 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위한 이러한 세포, 집단, 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포, 집단, 및 조성물은, 예를 들어 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해, 치료될 특정 질병 또는 질환을 가진 대상체 또는 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 다른 처리 방법 후, 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 예컨대 조작된 조성물 및 최종 생산 조성물은, 대상체, 예컨대 질병 또는 질환을 갖거나, 그러한 위험이 있는 대상체에 투여된다. 일부 양태에서, 따라서, 이 방법은, 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서 종양 존재량을 감소시킴으로써, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어 개선한다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공되는 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은, 예를 들어 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공개 제 2003/0170238호; Rosenberg 등의 미국 특허 제 4,690,915호; 문헌[Rosenberg(2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al.(2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al.(2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al.(2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유류이며, 통상적으로 인간이다. 일부 구현예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어, 환자는 포유류, 통상적으로 인간과 같은 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성이 될 수 있으며, 유아, 아동, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여, 임의의 적절한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 비-영장류 포유류이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 문법적 변형)는 질병 또는 질환 또는 장애 또는 이와 관련된 증상 또는 부작용 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적 개선 또는 감소를 지칭한다. 요망되는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행률 저하, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 질병의 완전한 완치 또는 모든 증상 또는 결과에 대한 임의의 증상 또는 효과(들)의 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "질병의 발병의 지연"은 질병(예컨대, 암)의 발병을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 보류를 의미한다. 이러한 지연은 치료되는 질병 및/또는 개체의 병력에 따라, 다양한 길이의 시간의 것일 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분하거나 현저한 지연은, 개체에서 질병이 발병되지 않는다는 점에서, 실질적으로 예방을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 전이의 발병과 같은 후기 암이 지연될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예방"은 질병의 소인이 있는 체질일 수 있으나, 아직 질병이 진단되지는 않은 대상체에서 질병의 발생 또는 재발에 관한 예방의 제공을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공되는 세포 및 조성물은 질환의 발병을 지연시키거나, 질병의 진행을 둔화시키기 위해, 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능 또는 활성의 "억제"는, 관심대상 조건 또는 매개변수를 제외하고, 그 외에는 동일한 조건과 비교하거나, 대안적으로, 또 다른 조건과 비교한 경우의 기능 또는 활성의 감소이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 세포의 부재 하의 종양 성장률과 비교하여, 종양 성장률을 감소시킨다.
투여와 관련하여, 제제, 예를 들어 약제학적 제형, 세포, 또는 조성물의 "유효량"은 치료 또는 예방법적 결과와 같은 요망되는 결과의 달성에 필요한 투여량/양 및 시기 동안의 유효량을 지칭한다.
제제, 예를 들어 약제학적 제형 또는 세포의 "치료 유효량"은 질병, 질환 또는 장애의 치료 및/또는 치료의 약동학 또는 약역학적 효과와 같은 요망되는 치료 결과의 달성에 필요한 투여량 및 시기 동안의 유효량을 지칭한다. 치료 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별 또는 중량 및 투여되는 세포 집단과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 제공되는 방법은 유효량, 예를 들어 치료 유효량의 세포 및/또는 조성물의 투여 단계를 포함한다.
"예방법적 유효량"은 요망되는 예방법적 결과의 달성에 필요한 투여량 및 시기 동안의 유효량을 지칭한다. 통상적이나, 반드시 그러하지는 않으나, 예방법적 투여량은 질병의 초기 이전에 또는 이때에 대상체에 사용되므로, 예방법적 유효량은 치료적 유효량보다 소량일 것이다. 더 낮은 종양 존재량과 관련하여, 일부 양태에서, 예방법적 유효량은 치료적 유효량보다 더 높을 것이다.
일부 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 화학요법, 방사선 치료 및/또는 조혈 줄기세포 이식(HSCT), 예를 들어, 동종이계 HSCT를 포함하는 또 다른 치료적 개입에 의한 치료 후에 지속성 또는 재발성 질병을 가진 자이다. 일부 구현예에서, 이러한 투여는 대상체가 또 다른 치료에 내성이 되었음에도 불구하고, 효과적으로 대상체를 치료한다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공되는 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은, 예를 들어 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공개 제 2003/0170238호; Rosenberg 등의 미국 특허 제 4,690,915호; 문헌[Rosenberg(2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al.(2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al.(2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al.(2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은, 세포가 세포 요법을 받을 대상체 또는 이러한 대상체로부터 유래한 샘플로부터 단리되고/되거나, 그렇지 않으면 그로부터 제조되는 자가 전달에 의해 수행된다. 따라서, 일부 양태에서, 세포는 대상체, 예를 들어 치료 및 세포가 필요한 환자로부터 유래하며, 단리 및 처리 후, 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법은, 세포가 세포 요법을 받을 예정이거나, 종국적으로 세포 요법을 받는 대상체가 아닌 대상체, 예를 들어 제1 대상체로부터 단리되고/단리되거나, 그렇지 않으면 그로부터 제조되는 동종이계 전달에 의해 수행된다. 이러한 구현예에서, 그 후, 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 종류 또는 슈퍼타입(supertype)을 발현한다.
일부 구현예에서, 대상체는, 세포 또는, 세포를 함유하는 조성물의 투여 전에, 질병 또는 질환, 예를 들어, 종양을 표적으로 하는 치료제에 의해 치료된 적이 있다. 일부 양태에서, 대상체는 다른 치료제에 대해 불응성 또는 비-반응성이다. 일부 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 화학요법, 방사선 치료 및/또는 조혈 줄기세포 이식(HSCT), 예를 들어, 동종이계 HSCT를 포함하는 또 다른 치료적 개입에 의한 치료 후에 지속성 또는 재발성 질병을 가진 자이다. 일부 구현예에서, 이러한 투여는 대상체가 또 다른 치료에 내성이 되었음에도 불구하고, 효과적으로 대상체를 치료한다.
일부 구현예에서, 대상체는 다른 치료제에 반응하고, 이러한 치료제에 의한 치료는 질병 존재량을 감소시킨다. 일부 양태에서, 대상체는 이러한 치료제에 초기에 반응하나, 시간 경과에 따라 질병 또는 질환의 재발이 나타난다. 일부 구현예에서, 대상체는 재발하지 않았다. 일부 이러한 구현예에서, 대상체는 재발 위험이 있는 것으로 결정되고, 예를 들어, 재발 위험이 높은 것으로 결정되므로, 예를 들어, 재발의 가능성을 감소시키거나, 이를 예방하기 위해, 이러한 세포를 예방법적으로 투여한다.
일부 양태에서, 대상체는 이전에 또 다른 치료제로 치료를 받지 않았다.
특히, 제공되는 조성물, 세포, 방법 및 용도에 의한 치료를 위한 질병, 질환 및 장애는 고형 종양, 혈액학적 악성종양 및 흑색종를 포함하는 종양, 및 감염성 질병, 예컨대 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, 및 기생충 질병에 의한 감염이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 종양, 암, 악성종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질병 또는 장애이다. 이러한 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종(Ewing sarcoma), 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 감염성 질병 또는 질환, 예컨대, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아, 및 원충 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스(polyomavirus)이나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질환, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티즘성 관절염(RA), I형 당뇨병, 전신 홍반성 낭창(SLE), 염증성 장 질병, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질병, 그레이브스병(Grave's disease), 크론병(Crohn's disease) 다발성 경화증, 천식, 및/또는 이식 관련 질병 또는 질환이다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 질환과 관련된 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산무수화효소 9(CAIX), tEGFR, Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, (L1-CAM), 흑색종-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선적 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA),, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 고아 티로신 키나제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는, 일부 양태에서, 세포 또는 세포 유형(들)의 요망되는 투여량 또는 수 및 세포 유형의 요망되는 비율을 포함하여, 요망되는 투여량으로 투여된다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 세포의 총수(또는 체중 kg당 수) 및 CD4+ 대 CD8+ 비율과 같은 개별 집단 또는 아형의 요망되는 비율을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단 또는 개별 세포 유형 중의 세포의 요망되는 총수(또는 체중 kg당 수)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여량은 세포의 요망되는 총수, 요망되는 비율 및 개별 집단 내의 세포의 요망되는 총수와 같은 이러한 특성의 조합을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 아형은 T 세포의 요망되는 투여량과 같은 총 세포의 요망되는 투여량의 허용 격차 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 양태에서, 요망되는 투여량은 요망되는 수 또는, 세포가 투여되는 대상체의 단위 체중당 세포의 요망되는 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 양태에서, 요망되는 투여량은 최소 세포 수 또는, 단위 체중당 최소 세포 수 이상이다. 일부 양태에서, 요망되는 투여량으로 투여된 총 세포 중에서, 개별 집단 또는 아형은, 예를 들어 이러한 비율의 특정 허용 격차 또는 오차 내의 요망되는 산출물 비율(예컨대, CD4+ 대 CD8+ 비율) 또는 그 부근으로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 요망되는 투여량 및/또는 CD8+ 세포의 요망되는 투여량과 같은 세포의 집단 또는 아형 중 하나 이상의 요망되는 투여량의 허용 격차 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 양태에서, 요망되는 투여량은 아형 또는 집단의 세포의 요망되는 수 또는, 세포가 투여되는 대상체의 단위 체중당 이러한 세포의 요망되는 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 양태에서, 요망되는 투여량은 집단 또는 아형의 최소 세포 수 또는, 단위 체중당 집단 또는 아형의 최소 세포 수 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 요망되는 소정의 투여량 및 요망되는 비율을 기반으로 하고/하거나, 개별 아형 또는 부분집합 중 하나 이상, 예를 들어 각각의 요망되는 소정의 투여량을 기반으로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 요망되는 소정의 또는 최소 투여량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 요망되는 비율을 기반으로 하고/하거나, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 요망되는 소정의 또는 최소 투여량을 기반으로 한다.
특정 구현예에서, 세포 또는, 세포의 아형의 개별 집단은, 예를 들어 1 x 106개 내지 약 50 x 109개의 세포(예를 들어, 약 5 x 106개의 세포, 약 25 x 106개의 세포, 약 500 x 106개의 세포, 약 1 x 109개의 세포, 약 5 x 109개의 세포, 약 20 x 109개의 세포, 약 30 x 109개의 세포, 약 40 x 109개의 세포, 또는 전술된 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위), 예컨대 약 10 x 106개 내지 약 100 x 109개의 세포(예를 들어, 약 20 x 106개의 세포, 약 30 x 106개의 세포, 약 40 x 106개의 세포, 약 60 x 106개의 세포, 약 70 x 106개의 세포, 약 80 x 106개의 세포, 약 90 x 106개의 세포, 약 10 x 109개의 세포, 약 25 x 109개의 세포, 약 50 x 109개의 세포, 약 75 x 109개의 세포, 약 90 x 109개의 세포, 또는 전술된 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위), 및 일부 경우에서, 약 100 x 106개의 세포 내지 약 50 x 109개의 세포(예를 들어, 약 120 x 106개의 세포, 약 250 x 106개의 세포, 약 350 x 106개의 세포, 약 450 x 106개의 세포, 약 650 x 106개의 세포, 약 800 x 106개의 세포, 약 900 x 106개의 세포, 약 3 x 109개의 세포, 약 30 x 109개의 세포, 약 45 x 109개의 세포) 이들 범위 내의 임의의 값과 같은 약 1 x 106개 내지 약 100 x 109개의 세포의 범위로 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 총 세포의 투여량 및/또는 세포의 개별 부분집합의 투여량은 약 또는 104 내지 약 또는 109 세포/킬로그램(kg) 체중, 예컨대 105 내지 106 세포/kg 체중, 예를 들어, 약 또는 1 x 105 세포/kg, 1.5 x 105 세포/kg, 2 x 105 세포/kg, 또는 1 x 106 세포/kg 체중의 범위 내이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 약 또는 104 내지 약 또는 109 T 세포/킬로그램(kg) 체중, 예컨대 105 내지 106 T 세포/kg 체중, 예를 들어, 약 또는 1 x 105 T 세포/kg, 1.5 x 105 T 세포/kg, 2 x 105 T 세포/kg, 또는 1 x 106 T 세포/kg 체중의 특정 오차 범위 또는 그 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 약 또는 104 내지 약 또는 109의 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/킬로그램(kg) 체중, 예컨대 105 내지 106의 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중, 예를 들어, 약 또는 1 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 1.5 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 2 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 또는 1 x 106 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중의 특정 오차 범위 또는 그 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 적어도 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106, 또는 약 9 x 106개의 CD4+ 세포, 및/또는 적어도 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106, 또는 약 9 x 106개의 CD8+ 세포, 및/또는 적어도 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106, 또는 약 9 x 106개의 T 세포 및/또는 그 초과의 특정 오차 범위 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 108개 내지 1012개 또는 약 1010개 내지 1011개의 T 세포, 약 108개 내지 1012개 또는 약 1010개 내지 1011개의 CD4+ 세포, 및/또는 약 108개 내지 1012개 또는 약 1010개 내지 1011개의 CD8+ 세포의 특정 오차 범위 또는 그 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 아형, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 아형의 요망되는 산출물 비율의 허용 범위 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 양태에서, 요망되는 비율은 특정 비율일 수 있거나, 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 요망되는 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 약 또는 5:1 내지 약 또는 5:1(또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만), 또는 약 또는 1:3 내지 약 또는 3:1(또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만), 예컨대 약 또는 2:1 내지 약 또는 1:5(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예컨대 약 또는 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 양태에서, 허용 격차는 이들 범위 내의 임의의 값을 포함하여, 요망되는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 내이다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지, 이전 치료, 대상체의 임상 기록 및 세포 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구현예에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적절하게 투여된다.
예를 들어, 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단일 볼루스 투여에 의해 소정의 투여량이 투여된다. 일부 구현예에서, 이는, 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐, 세포의 다회의 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체, 세포 독성 또는 치료제와 같은 제제와 같은 또 다른 치료적 개입과의 조합 치료의 일부로서, 예컨대 그화 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 또 다른 치료적 개입과 관련하여, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공동 투여된다. 일부 상황에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나, 그 반대의 경우도 그러하도록, 충분히 근접한 시간에 또 다른 치료와 공동 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는, 예를 들어 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 화학요법 제제의 투여를 포함한다.
세포의 투여 후에, 일부 구현예에서, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성을, 예를 들어 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정한다. 생체내의 경우, 예를 들어 영상화에 의해, 또는 생체외의 경우, 예를 들어 ELISA 또는 유동 세포계측에 의해 평가할 매개변수는 조작되거나, 천연의 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 붕괴시키는 능력은, 예를 들어 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 분석과 같이, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여, 측정할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD 107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정한다. 일부 양태에서, 생물학적 활성은 종양 존재량 또는 하중의 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정한다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 치료적 또는 예방법적 효능을 증가시키는 임의의 많은 방법으로 추가로 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al, J. Drug Targeting 3: 1 1 1(1995)] 및 미국 특허 제 5,087,616호를 참조한다.
V. 정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)"은 당업자에게 용이하게 인식되는, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "대략적인" 값 또는 매개변수로 언급되는 경우, 그 값 또는 매개변수 자체로 유도되는 구현예를 포함(및 기재)한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수형("a" 또는 "an")은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 청구 대상의 다양한 양태가 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재내용은 단지 편의 및 간략화를 위한 것이며, 청구 대상의 범위에 대한 불변의 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재내용은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값 및 언급된 범위 내의 임의의 명시 또는 개재 값이 청구 대상 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 더 작은 이들 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한, 명시 범위 내에서 특별히 배제된 임의의 한도에 따라, 청구 대상 내에 포괄될 수 있다. 명시 범위가 한도 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 이들 한도 중 어느 하나 또는 둘 모두가 배제된 범위가 또한 청구 대상에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "도메인"은 단백질 또는 핵산의 절편을 기재하는 데 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 도메인은 임의의 특정 기능성을 가질 필요는 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대해 사용되는 경우, "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)" 및 "동일성 퍼센트"는, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환이 고려되지 않은 것으로서, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입시킨 후, 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 스트렙타비딘 뮤테인) 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내의 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열에 걸쳐, 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
2개의 서열 사이의 상동성 또는 서열 동일성(이 용어는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용됨)의 계산을 다음과 같이 수행한다. 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬한다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해, 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입시킬 수 있으며, 비교 목적을 위해 비상동성 서열은 무시될 수 있음). 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 프레임 이동 갭 페널티 5로 Blossum 62 스코어링 매트릭스에 의한 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여, 최고 스코어로서 최적의 정렬을 결정한다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유된 경우, 그 후, 이 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드 내의 하나의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 아미노산은 일반적으로 다음의 일반적인 측쇄 특성에 따라 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비 보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원이 또 다른 부류로 교체된 것을 포함할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조절인자(modulator)"는 객체, 예를 들어 대상 분자 또는 유전자 서열의 활성(예를 들어, 효소 활성, 전사 활성 또는 번역 활성), 양, 분포 또는 구조를 변경시킬 수 있는 약물을 지칭한다. 일 구현예에서, 조절은 절단, 예를 들어 공유 또는 비공유 결합의 파손, 또는 공유 또는 비공유 결합의 형성, 예를 들어 대상 분자에 대한 모이어티의 부착을 포함한다. 일 구현예에서, 조절인자는 대상 분자의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조를 변경시킨다. 조절인자는 대상 활성을 증가, 저하, 개시 또는 제거할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "거대 분자"는 분자량이 적어도 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 kD인 분자를 지칭한다. 거대 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 생물물질 및 탄수화물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"는 100개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 일 구현예에서, 이는 50, 20, 또는 10개 미만의 아미노산 잔기를 가진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비상동성 말단 결합" 또는 "NHEJ"는, 예를 들어 정규 NHEJ(cNHEJ), 대안의 NHEJ(altNHEJ), 마이크로 상동성-매개 말단 결합(MMEJ), 단일-가닥 어닐링(SSA), 및 합성-의존적 마이크로 상동성-매개 말단 결합(SD-MMEJ)을 포함하는 결찰 매개 수선 및/또는 비-주형 매개 수선을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기준 분자(reference molecule)", 예를 들어 기준 Cas9 분자 또는 기준 gRNA는 대상 분자, 예를 들어 대상 gRNA 분자의 대상 Cas9 분자, 예를 들어 변형 또는 후보 Cas9 분자가 비교되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, Cas9 분자는 기준 Cas9 분자의 뉴클레아제 활성의 10% 이하를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 기준 Cas9 분자의 예는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 S. 피오게네스, S. 아우레우스, 또는 S. 써모필루스의 Cas9 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 이것이 비교되는 Cas9 분자와 가장 근사한 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 일 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 서열, 예를 들어 변화, 예를 들어 돌연변이가 만들어지는 모 형태인 천연 유래 또는 공지된 서열이다.
분자의 변형과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대체", 또는 "대체되는"은 처리 제한이 요구되지 않으나, 단지 대체 객체가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "소분자"는 분자량이 약 2 kD 미만, 예를 들어 약 2 kD 미만, 약 1.5 kD 미만, 약 1 kD, 또는 약 0.75 kD 미만인 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 임의의 살아 있는 유기체, 예컨대 인간 또는 다른 포유류를 포함한다. 포유류는 인간 및 농장 동물, 경기용 동물, 설치류 및 애완동물을 포함하는 비인간 동물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 포유류(예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트 또는 햄스터), 토끼, 기니피그, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 가금류이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여, 2개 이상의 산물, 물질, 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비 수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭하는 경우, "농화"는, 예컨대, 집단 또는 세포에 의해 발현되는 마커를 기반으로 한 양성 선택 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포에 존재하지 않는 마커를 기반으로 한 음성 선택에 의해, 예를 들어 조성물 내 세포의 총수 또는 그 용적과 비교하거나, 다른 세포 유형에 대비하여, 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭한다. 이 용어는 조성물로부터의 다른 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 요구하지는 않으며, 이렇게 농화된 세포가 농화된 조성물 중에 100% 또는 심지어 그 부근으로 존재할 것을 요구하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 언급은 세포 상 또는 세포 내의 특정 마커, 통상적으로는 표면 마커의 검출 가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 지칭하는 경우, 이 용어는, 유동 세포계측에 의해, 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여, 상기 항체를 검출함으로써, 검출되는 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 염색은 유동 세포계측에 의해, 이소형-매칭 대조군 또는 형광 마이너스 1(fluorescence minus one)(FMO) 게이팅 대조군(gating control)과 동일한 절차를 그 외에는 동일한 조건 하에 실시한 경우 검출되는 염색을 실질적으로 초과하는 수준 및/또는 마커에 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 수준과 실질적으로 유사한 수준 및/또는 마커에 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서 검출 가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 언급은 세포 상 또는 세포 내의 특정 마커, 통상적으로는 표면 마커의 실질적인 검출 가능한 존재의 부재를 지칭한다. 표면 마커를 지칭하는 경우, 이 용어는 유동 세포계측에 의해, 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 염색하여, 상기 항체를 검출함으로써, 검출되는 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 염색은 유동 세포계측에 의해, 이소형-매칭 대조군 또는 형광 마이너스 1(FMO) 게이팅 대조군과 동일한 절차를 그 외에는 동일한 조건 하에 실시한 경우 검출되는 염색을 실질적으로 초과하는 수준 및/또는 마커에 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 수준보다 실질적으로 더 낮은 수준 및/또는 마커에 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 수준과 비교하여, 실질적으로 유사한 수준으로 검출되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 도입된 숙주 세포의 게놈 내에 혼입된 벡터뿐만 아니라, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본 명세서에서 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 바와 같이, "X"는 달리 명시하지 않는 한, 임의의 아미노산(예를 들어, 20개의 천연 아미노산 중 임의의 아미노산)을 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 분야의 모든 용어, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구 대상이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미의 용어는 본 명세서에서 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된 경우에는 반드시, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 출원에 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함하는 모든 공보물은, 각각의 개별 공보물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개 출원 및 다른 공보물에 제시된 정의와 상반되거나, 달리는 불일치하는 경우, 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 정의에 우선한다.
본 명세서에 사용되는 부문 표제는 단지 체계적인 목적을 위한 것이며, 기재 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
VI. 예시적 구현예
특히 다음의 구현예가 제공된다:
1. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 조성물.
2. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 조성물.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 조작된 면역 세포는 그의 표면에 재조합 수용체를 발현하는, 조성물.
4. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시키고,
조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 또는 약 90% 초과가 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자를 함유하지 않고, PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나, 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 또는 약 90% 초과가 유전자 붕괴를 함유하고, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 조성물.
5. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체로서, 재조합 수용체와 상기 항원의 결합시, 조작된 면역 세포가 세포독성, 증식 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시킬 수 있고, 선택적으로 상기 방지 또는 감소는 조성물 중 세포 및/ㄸ또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 또는 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과 또는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 초과에서 이루어지는 조성물.
6. 조작된 면역 세포의 집단을 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 각각이 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하고, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나, 감소시킬 수 있고,
조작된 면역 세포는 평균적으로 재조합 수용체를 포함하고 유전자 붕괴를 포함하지 않는 조성물 중의 다른 세포에서 상기 재조합 수용체의 평균 발현 및/또는 표면 발현 수준과 각각 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타내거나,
조작된 면역는 세포 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 평균적으로, 재조합 수용체를 포함하고 PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 조성물의 세포에서 평균 발현 및/또는 표면 수준과 각각 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타내는, 조성물.
7. 구현예 1 내지 4 및 6 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는, 선택적으로 시험관내 분석, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 포함하는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 항원, 항원을 발현하는 세포 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션 시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 조작된 T 세포를 활성화시키거나 자극할 수 있거나, 면역 세포에 의해 세포독성을 유도할 수 있거나, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는, 조성물.
8. 구현예 1 내지 4, 6 및 7 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포는, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 포함하고, 선택적으로, 면역 세포를 PD-L1-발현 세포에 노출시키는 단계를 포함하거나, 포함하지 않는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 항원, 항원을 발현하는 세포 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션 시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는, 조성물.
9. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비의 수준 또는 정도 또는 지속기간은, 동일한 조건하에 평가하는 경우, 재조합 수용체를 포함하나 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않는 면역 세포에 대해 검출되거나 관찰된 것과 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
10. 구현예 6 및 8 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비는, 선택적으로 회수 및 항원, 항원-발현 세포 및/또는 물질에 재 노출 후 시험관내 분석에서 측정된 바와 같은, 조성물.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포인, 조성물.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 인간 세포인, 조성물.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 백혈구인, 조성물.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 NK 세포 또는 T 세포인, 조성물.
15. 구현예 14에 있어서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포를 포함하는 복수의 T 세포를 포함하거나, 단리된 CD8+ 세포를 포함하거나 CD8+ T 세포에 대해 농화되거나, 단리된 CD4+ T 세포를 포함하거나 CD4+ 세포에 대해 농화되고/농화되거나, 나이브 세포, 효과기 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 효과기 기억 세포 및 장기-생존 효과기 기억 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 이들의 하위세트에 대해 농화된, 조성물.
16. 구현예 14 또는 구현예 15에 있어서, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는, T 세포, 또는 조성물 중 수용체를 발현하고 유전자 붕괴를 포함하는 T 세포의 백분율은, 상기 조성물과 동일하거나 실질적으로 동일하지만 유전자 붕괴를 함유하지 않거나 또는 PD-1 폴리펩티드를 발현하는 세포의 집단과 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율은, 선택적으로 면역 세포를 PD-L1에 접촉시키거나 노출시키는 단계의 부재 또는 존재 시와 비교하여, 동일한 조건하에서 평가하는 경우, 조성물 중, 재조합 수용체를 포함하나 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않는 T 세포를 포함하는 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율과 비교하여 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
18. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 표현형은 37℃± 2℃ 또는 약 37℃± 2℃에서 적어도 12시간, 24시간, 48시간, 96시간, 6일, 12일, 24일, 36일, 48일 또는 60일 동안 조성물의 인큐베이션 후, 평가된 바와 같은, 조성물.
19. 구현예 18에 있어서, 인큐베이션은 시험관내에서 이루어지는, 조성물.
20. 구현예 18 또는 구현예 19에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부분은 자극제의 존재 하에 수행되고, 적어도 일부분은 선택적으로 최대 1시간, 6시간, 24시간, 또는 48시간의 인큐베이션 동안 이루어지는, 조성물.
21. 구현예 20에 있어서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는, 조성물.
22. 구현예 20 또는 구현예 21에 있어서, 자극제는 CD3 항체에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 포함하는, 조성물.
23. 구현예 16 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체를 포함하는 T 세포는 CCR7+, 4-1BB+(CD137+), TIM3+, CD27+, CD62L+, CD127+, CD45RA+, CD45RO-, t-betlow, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ 또는 LFA-1+로부터 선택되는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하는, 조성물.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 조성물.
25. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조성물.
26. 구현예 25에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
27. 구현예 26에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 조성물.
28. 구현예 26 또는 구현예 27에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 조성물.
29. 구현예 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 조성물.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 조성물.
31. 구현예 30에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 조성물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 조성물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 조성물.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
35. 구현예 34에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 조성물.
36. 구현예 34 또는 구현예 35에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 조성물.
37. 구현예 36에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
38. 구현예 1 내지 3 및 7 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 제제는 (a) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (b) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
39. 구현예 1 내지 3 및 7 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제제는, PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 포함하는, 조성물.
40. 구현예 38 또는 구현예 39에 있어서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
41. 구현예 40에 있어서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있는, 조성물.
42. 구현예 41에 있어서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함하는, 조성물.
43. 구현예 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9인, 조성물.
44. 구현예 38 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
45. 구현예 38 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
46. 구현예 38 내지 45 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
47. 구현예 39 내지 46 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 S. 아우레우스 Cas9 분자인, 조성물.
48. 구현예 39 내지 46 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9인, 조성물.
49. 구현예 39 내지 48 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있는, 조성물.
50. 구현예 39 내지 46, 48 및 49 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
51. 구현예 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물:
Figure pct00057
52. 구현예 39 내지 46 및 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
53. 구현예 52에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물:
Figure pct00058
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 유전자 붕괴는PDCD1 유전자에 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선되어 삽입 및 결실(삽입결실)을 초래하는 이중 가닥 파손을 생성을 포함하는, 조성물.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서,
조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
56. 구현예 4 또는 구현예 55에 있어서,
조성물 중 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서,
선택적으로 유동 세포계에 의해 평가되는 바와 같이, 조성물 중 세포 또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 또는 적어도 약 90%는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있는, 조성물.
59. 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포는, 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포에 대해 농화되거나, 선택되지 않는, 조성물.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포에서 평균적으로 2개 이하, 5개 이하 또는 10개 이하의 다른 유전자가 붕괴되어 있거나, 제제에 의해 붕괴되는, 조성물.
61. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포의 어떤 다른 유전자도 세포 내에서 붕괴되지 않거나 제제에 의해 붕괴되지 않는, 조성물.
62. 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 추가로 포함하는, 조성물.
63. 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로 질병 또는 질환을 가진 대상체에 조성물을 투여한 이후 시점에,
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 재조합 수용체를 발현하고 PD-1을 발현하지 않는 세포가 검출 가능하고;
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하는 세포가 검출 가능하고;
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하고 재조합 수용체를 발현하는 세포가 검출 가능한, 조성물.
64. 구현예 63에 있어서, 시점은 투여 후 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주째 또는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주째인, 조성물.
65. 구현예 63 또는 64에 있어서, 혈액 또는 샘플에서 검출 가능한 상기 세포는 혈액 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터의 농도로 존재하고/하거나, 혈액 중 T 세포의 적어도 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이상에 상당하는, 조성물.
66. 구현예 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 조성물을 투여한 후,
조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하는 세포는, 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및 또는 지속되고,
조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하고 재조합 수용체를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나, 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되는, 조성물.
67. 구현예 66에 있어서, 속도 또는 시간은 적어도 1.5배 또는 2배 또는 3배를 초과하거나 적어도 약 1.5배 또는 2배 또는 3배를 초과하는, 조성물.
68. 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법으로서,
(a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 면역 세포 내로 도입시키는 단계; 및
(b) (i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 면역 세포 내로 도입시키는 단계
를 포함하는, 방법.
69. 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법으로서,
(i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를, 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는, 방법.
70. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 제제는 PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 포함하는, 방법.
71. 구현예 68 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
72. 구현예 71에 있어서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있는, 방법.
73. 구현예 68 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함하는, 방법.
74. 구현예 68 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 도입은 시험관내에서 세포와 제제 또는 그의 일부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
75. 구현예 68 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 제제의 도입은 전기천공을 포함하는, 방법.
76. 구현예 74 또는 구현예 75에 있어서, 도입은 세포와 제제의 접촉 단계 전에, 그동안 또는 그 후에 또는 전기천공 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
77. 구현예 68 내지 76 중 어느 하나에 있어서, (a)에서의 도입은 형질도입을 포함하고, 도입은 형질도입 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
78. 구현예 76 또는 구현예 77에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 (i) IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인, 및/또는 (ii) 선택적으로 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 자극제 또는 활성화제 또는 제제들의 존재 하에 이루어지는, 방법.
79. 구현예 77 또는 구현예 78에 있어서, (a)에서의 도입은
형질도입 전에, 20 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 100 U/mL의 농도의 IL-2; 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 약 10 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
형질도입 후에, 10 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 50 U/mL의 농도의 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 선택적으로 약 0.5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 방법.
80. 구현예 76 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 독립적으로 최대 24, 36, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 또는 대략 24, 36, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 동안 수행되는, 방법.
81. 구현예 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 독립적으로 24시간 내지 48시간 또는 36시간 내지 48시간 동안 수행되는, 방법.
82. 구현예 74 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 세포는 100,000, 200,000, 300,000, 400,000 또는 500,000개의 세포당 대략 1 마이크로그램의 비율로 제제와 접촉되는, 방법.
83. 구현예 76 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
인큐베이션은 30℃± 2℃ 내지 39℃± 2℃의 온도에서 이루어지거나;
인큐베이션은 적어도 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃ 또는 적어도 약 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃의 온도에서 이루어지는, 방법.
84. 구현예 76 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃± 2℃에서 이루어지며, 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃± 2℃에서 이루어지는, 방법.
85. 구현예 68 내지 84 중 어느 하나에 있어서, (a)에서의 도입과 (b)에서의 도입 사이에 세포를 휴지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
86. 구현예 70 내지 85 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9인, 방법.
87. 구현예 68 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
88. 구현예 68 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
89. 구현예 68 내지 79 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
90. 구현예 70 내지 89 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 S. 아우레우스 Cas9 분자인, 방법.
91. 구현예 70 내지 90 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9인, 방법.
92. 구현예 70 내지 91 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있는, 방법.
93. 구현예 70 내지 89, 91 및 92 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
94. 구현예 89 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00059
.
95. 구현예 70 내지 89 및 91 내지 94 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
96. 구현예 94에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00060
.
97. 구현예 68 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 유전자 붕괴는 PDCD1 유전자에 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선되어 삽입 및 결실(삽입결실)을 초래하는 이중 가닥 파손의 생성을 포함하는, 방법.
98. 구현예 68 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
99. 구현예 68 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
100. 구현예 99에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
102. 구현예 100 또는 구현예 101에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
103. 구현예 100 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
104. 구현예 100 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
105. 구현예 104에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
106. 구현예 68 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
107. 구현예 68 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
108. 구현예 68 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
109. 구현예 108에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
110. 구현예 108 또는 구현예 109에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
111. 구현예 110에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
112. 구현예 68 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터인, 방법.
113. 구현예 112에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 방법.
114. 구현예 112 또는 구현예 113에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
115. 구현예 68 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 재조합 벡터를 인코딩하는 핵산의 도입은 형질도입에 의해 이루어지며, 이는 선택적으로 레트로바이러스 형질도입인, 방법.
116. 구현예 68 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포인, 방법.
117. 구현예 68 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 인간 세포인, 방법.
118. 구현예 68 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 백혈구인, 방법.
119. 구현예 68 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 NK 세포 또는 T 세포인, 방법.
120. 구현예 119에 있어서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 T 세포인, 방법.
121. 구현예 68 내지 120, 복수의 면역 세포에서 수행되는, 방법.
122. 구현예 68 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 제제를 도입하고 재조합 수용체를 도입한 후, 세포는 (a) 유전자 붕괴를 함유하거나 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 농화되지 않거나 선택되는, 방법.
123. 구현예 68 내지 122 중 어느 하나에 있어서, (a) 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 농화하거나 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
124. 구현예 68 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 37℃± 2℃ 또는 약 37℃± 2℃에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
125. 구현예 124에 있어서, 인큐베이션은 1시간 내지 96시간 또는 약 1시간 내지 96시간, 4시간 내지 72시간 또는 약 4시간 내지 72시간, 8시간 내지 48시간 또는 약 8시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간 또는 약 12시간 내지 36시간, 6시간 내지 24시간 또는 약 6시간 내지 24시간, 36시간 내지 96시간 또는 약 36시간 내지 약 또는 96시간까지의 시간 동안 수행되는, 방법.
126. 구현예 125에 있어서, 인큐베이션 또는 인큐베이션의 일부는 자극제의 존재 하에 수행되는, 방법.
127. 구현예 126에 있어서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제인, 방법.
128. 구현예 126 또는 구현예 127에 있어서, 자극제는 CD3에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 포함하는, 방법.
129. 구현예 68 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 방법에 의해 생산된 세포를 약제학적으로 허용 가능한 완충액 중에 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
130. 구현예 68 내지 129 중 어느 하나에 있어서,
세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나;
재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는
세포의 집단을 생산하는, 방법.
131. 구현예 68 내지 130 중 어느 하나에 있어서,
세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/이거나;
재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는
세포의 집단을 생산하는, 방법.
132. 구현예 68 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있는, 방법.
133. 구현예 68 내지 132 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포.
134. 구현예 68 내지 132 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
135. 구현예 134에 있어서,
세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나;
재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
136. 구현예 134 또는 구현예 135에 있어서,
세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/둘 모두이거나;
재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과가 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
137. 구현예 133의 유전자 조작된 면역 세포 또는 구현예 134 내지 136 중 어느 하나의 복수의 유전자 조작된 면역 세포, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 조성물.
138. 구현예 1 내지 67 및 137 중 어느 하나의 조성물을 질병 또는 질환을 가진 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
139. 구현예 138에 있어서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
140. 구현예 138 또는 구현예 139에 있어서, 질병 또는 질환은 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병인, 방법.
141. 구현예 140에 있어서, 암 또는 종양은 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종 암, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종인, 방법.
142. 구현예 139 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 항원은 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
143. 구현예 139 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 항원은 CD19 또는 BCMA인, 방법.
144. 구현예 138 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 투여된 조작된 세포는 투여한 지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 후, PD-1의 발현을 감소시키고/감소시키거나 제거하는, 방법.
145. 구현예 138 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 투여된 조작된 세포는 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 동안 대상체에서 지속되는, 방법.
146. 구현예 138 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 조성물을 투여한 이후 시점에,
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 재조합 수용체를 발현하고 PD-1을 발현하지 않는 세포가 검출 가능하고;
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하는 세포가 검출 가능하고;
대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하고 재조합 수용체를 발현하는 세포가 검출 가능한, 방법.
147. 구현예 138 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 시점은 투여 후 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주째 또는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주째인, 방법.
148. 구현예 138 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 혈액 또는 샘플에서 검출 가능한 상기 세포는 혈액 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터의 농도로 존재하고/존재하거나 혈액 중 T 세포의 적어도 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%에 상당하는, 방법.
149. 구현예 138 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 조성물을 투여한 후,
조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하지 않으나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되고,
조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하고, 재조합 수용체를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하지 않으나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되는, 방법.
150. 구현예 149에 있어서, 속도 또는 시간은 적어도 1.5배 또는 2배 또는 3배 더 큰 적어도 약 1.5배 또는 2배 또는 3배 더 큰, 방법.
151. 구현예 140 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 종양은 고형 종양인, 방법.
152. 구현예 140 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 종양은 B 세포-유래 종양이 아니고/아니거나, 백혈병이 아니고/아니거나, 림프종이 아닌, 방법.
153. 구현예 140 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 종양 또는 그의 세포는 PD-1에 대한 리간드를 발현하거나, 발현하는 것으로 관찰된, 방법.
154. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나 감소시키고, 조작된 세포는 대상체에 투여하기 전에 PD-1의 감소되고/감소되거나 제거된 발현의 표현형을 가지며 상기 세포는 대상체에 투여한 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 동안 상기 표현형을 유지하는, 약제학적 조성물.
155. 대상체에서 질병 또는 질환의 치료에 사용하기 위한 구현예 1 내지 67, 137 및 154 중 어느 하나의 조성물.
156. 구현예 155에 있어서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는, 상기 용도를 위한 조성물.
157. 구현예 155 또는 구현예 156에 있어서, 질병 또는 질환은 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병인, 상기 용도를 위한 조성물.
158. 구현예 155 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 질병 또는 질환은 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종 암, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종인 암 또는 종양인, 상기 용도를 위한 조성물.
159. 구현예 155 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 항원은 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 용도를 위한 조성물.
160. 구현예 155 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 항원은 CD19 또는 BCMA인, 상기 용도를 위한 조성물.
161. 구현예 155 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 조성물을 투여한 후,
투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상의 시점에, 유전자 붕괴를 함유하고, 선택적으로 재조합 수용체를 함유하는 하나 이상의 세포가 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에 지속되고/지속되거나, 검출 가능하고/검출 가능하거나;
투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상의 시점에, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 조직에서 검출 가능한 T 세포, 또는 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 또는 90%가 유전자 붕괴를 함유하는, 상기 용도를 위한 조성물.
162. T 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포를 변경시키는 방법으로서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 방법.
163. T 세포와 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포를 변경시키는 방법으로서, 각각의 복합체는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 방법.
164. 구현예 162 또는 구현예 163에 있어서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것인, 방법.
165. 구현예 164에 있어서, 암은 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프모구 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신장 세포 암종(RCC), 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
166. 구현예 162 내지 165 중 어느 하나에 있어서, T 세포는, 암을 가지거나, 그렇지 않으면, PDCD1 유전자의 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이로부터 이점을 얻을 수 있는 대상체로부터 유래한 것인,방법.
167. 구현예 162 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 접촉은 생체외에서 수행되는, 방법.
168. 구현예 162 내지 167 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 재조합 수용체를 포함하는, 방법.
169. 구현예 162 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 조건 하에 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산과 T 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
170. 구현예 168 또는 구현예 169에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
171. 구현예 168 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
172. 구현예 171에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
173. 구현예 172에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
174. 구현예 172 또는 구현예 173에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
175. 구현예 172 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
176. 구현예 172 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
177. 구현예 176에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
178. 구현예 168 내지 177 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
179. 구현예 171 내지 178 중 어느 하나에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
180. 구현예 168 내지 179 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
181. 구현예 180에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
182. 구현예 180 또는 구현예 181에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
183. 구현예 182에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
184. 구현예 164 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀되는, 방법.
185. 구현예 162 내지 184 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것이며, 접촉은 생체외에서 수행되고, 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀되는, 방법.
186. 구현예 162 내지 185 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 접촉 전에 형성되는, 방법.
187. 구현예 163 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 접촉 전에 형성되는, 방법.
188. 구현예 162 내지 187 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, 방법
189. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
190. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
191. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
192. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
193. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
194. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
195. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
196. 구현예 188에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
197. 구현예 162 내지 196 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 그들의 5' 말단에서 변형되거나 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
198. 구현예 162 내지 196 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 그들의 5' 말단에서 변형되고 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
199. 구현예 197 또는 구현예 198에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 방법.
200. 구현예 197 또는 구현예 198에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함하는, 방법.
201. 구현예 200에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
202. 구현예 200에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
203. 구현예 197 내지 202 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
204. 구현예 197 내지 202 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
205. 구현예 203 또는 구현예 204에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 방법.
206. 구현예 205에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, 방법.
207. 구현예 205에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 방법.
208. 구현예 162 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기 천공을 통해 T 세포 내로 전달되는, 방법.
209. 구현예 163 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기 천공을 통해 T 세포 내로 전달되는, 방법.
210. 구현예 162 내지 209 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단하는, 방법.
211. 구현예 210에 있어서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
212. 구현예 162 내지 211 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
213. 구현예 212에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
214. 구현예 162 내지 213 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음으로부터 선택되는, 방법:
Figure pct00061
215. 구현예 162 내지 211 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
216. 구현예 215에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
217. 구현예 162 내지 216 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, 방법.
218. 구현예 162 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00062
219. 구현예 162 내지 218 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 방법.
220. 구현예 219에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00063
221. 구현예 162 내지 220 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 모듈gRNA 분자(들)인, 방법.
222. 구현예 162 내지 220 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)인, 방법.
223. 구현예 222에 있어서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
224. 구현예 222 또는 구현예 223에 있어서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
225. 구현예 210 내지 224 중 어느 하나에 있어서, 적어도 60%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
226. 구현예 210 내지 224 중 어느 하나에 있어서, 적어도 80%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
227. 구현예 210 내지 224 중 어느 하나에 있어서, 적어도 90%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
228. 구현예 210 내지 227 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 5개 미만의 비표적을 특징으로 하는, 방법.
229. 구현예 210 내지 228 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 2개 미만의 엑손 비표적을 특징으로 하는, 방법.
230. 구현예 228 또는 구현예 229에 있어서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인되는, 방법.
231. 구현예 228 또는 구현예 229에 있어서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인되는, 방법.
232. Cas9 분자/gRNA 분자 복합체로서, gRNA 분자는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
233. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체
234. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
235. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
236. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
237. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
238. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
239. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
240. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
241. 구현예 232에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
242. 구현예 232 내지 241 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
243. 구현예 242에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
244. 구현예 242에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
245. 구현예 244에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
246. 구현예 244에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
247. 구현예 232 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
248. 구현예 232 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
249. 구현예 247 또는 구현예 248에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
250. 구현예 249에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
251. 구현예 249에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
252. 구현예 232 내지 251 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
253. 구현예 252에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
254. 구현예 232 내지 253 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
Figure pct00064
255. 구현예 232 내지 251 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
256. 구현예 255에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
257. 구현예 232 내지 구현예 256 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
258. 구현예 232 내지 구현예 257 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
Figure pct00065
.
259. 구현예 232 내지 256 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
260. 구현예 259에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
Figure pct00066
.
261. 구현예 232 내지 260 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
262. 구현예 232 내지 261 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
263. 구현예 262에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
264. 구현예 262 또는 구현예 263에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
265. 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 복합체를 포함하는 조성물로서, 각각의 복합체는, PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는, 조성물.
266. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
267. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
268. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
269. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
270. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
271. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
272. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
273. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
274. 구현예 265에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
275. 구현예 265 내지 741 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, 조성물.
276. 구현예 275에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 조성물.
277. 구현예 275에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
278. 구현예 277에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
279. 구현예 277에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
280. 구현예 265 내지 279 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 조성물.
281. 구현예 265 내지 279 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 조성물.
282. 구현예 280 또는 구현예 281에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 조성물.
283. 구현예 282에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아
Figure pct00067
cm닌 뉴클레오타이드가 아닌, 조성물.
284. 구현예 282에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 조성물.
285. 구현예 265 내지 284 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
286. 구현예 285에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
287. 구현예 265 내지 286 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, 조성물:
Figure pct00068
.
288. 구현예 265 내지 287 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
289. 구현예 288에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
290. 구현예 265 내지 289 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, 조성물.
291. 구현예 265 내지 290 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, 조성물:
Figure pct00069
.
292. 구현예 265 내지 291 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 조성물.
293. 구현예 292에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, 조성물:
Figure pct00070
.
294. 구현예 265 내지 293 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, 조성물.
295. 구현예 265 내지 294 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, 조성물.
296. 구현예 295에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 조성물.
297. 구현예 295 또는 구현예 296에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 조성물.
298. PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자로서, 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자.
299. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
300. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
301. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
302. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
303. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
304. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
305. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
306. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
307. 구현예 298에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
308. 구현예 298 내지 94 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, gRNA 분자.
309. 구현예 308에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, gRNA 분자.
310. 구현예 308에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, gRNA 분자.
311. 구현예 310에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA 분자.
312. 구현예 310에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA 분자.
313. 구현예 298 내지 312 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, gRNA 분자.
314. 구현예 298 내지 312 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, gRNA 분자.
315. 구현예 313 또는 314에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, gRNA 분자.
316. 구현예 315에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, gRNA 분자.
316. 구현예 315에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
317. 구현예 298 내지 316 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 S. 피오게네스 gRNA 분자인, gRNA 분자.
318. 구현예 298 내지 317 중 어느 하나에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, gRNA 분자:
Figure pct00071
.
319. 구현예 318에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, gRNA 분자:
Figure pct00072
.
320. 구현예 318에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, gRNA 분자:
Figure pct00073
.
321. 구현예 318에 있어서, 표적화 도메인은 다음 그룹의 표적화 도메인으로부터 선택되는, gRNA 분자:
Figure pct00074
.
322. 구현예 298 내지 321 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, gRNA 분자.
323. 구현예 298 내지 322 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, gRNA 분자.
324. 구현예 323에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
325. 구현예 323 또는 구현예 324에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
326. 이식을 위한 세포를 제조하는 방법으로서, 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하고, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
327. 구현예 326에 있어서, gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
328. 구현예 327에 있어서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
329. 구현예 326 내지 328 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
330. 구현예 326 내지 328 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 그의 5' 말단에서 변형되거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
331. 구현예 329 또는 구현예 330에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 방법.
332. 구현예 329 또는 구현예 330에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함하는, 방법.
333. 구현예 332에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해, gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
334. 구현예 332에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
335. 구현예 329 내지 334 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
336. 구현예 329 내지 334 중 어느 하나에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
337. 구현예 335 또는 구현예 336에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 방법.
338. 구현예 337에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, 방법.
339. 구현예 337에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는, 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 방법.
340. 구현예 326 내지 339 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기천공을 통해 세포 내로 전달되는, 방법.
341. 구현예 326 내지 340 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
342. 구현예 341에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
343. 구현예 326 내지 342 중 어느 하나에 있어서, 단일 gRNA 분자는 다음의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00075
.
344. 구현예 326 내지 343 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어, 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
345. 구현예 326 내지 344 중 어느 하나에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
346. 구현예 326 내지 345 중 어느 하나에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00076
.
347. 구현예 326 내지 346 중 어느 하나에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 방법.
348. 구현예 347에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
Figure pct00077
.
349. 구현예 326 내지 348 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 모듈 gRNA 분자(들)인, 방법.
350. 구현예 326 내지 349 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)인, 방법.
351. 구현예 350에 있어서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
352. 구현예 350 또는 구현예 351에 있어서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
353. 구현예 326 내지 352 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 60%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
354. 구현예 326 내지 352 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 80%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
355. 구현예 326 내지 352 중 어느 하나에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여, 적어도 90%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
356. 구현예 326 내지 355 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 5개 미만의 비표적을 생산하는, 방법.
357. 구현예 326 내지 356 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개 미만의 엑손 비표적을 생산하는, 방법.
358. 구현예 356 또는 구현예 357에 있어서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인되는, 방법.
359. 구현예 356 또는 구현예 357에 있어서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인되는, 방법.
360. 구현예 326 내지 359 중 어느 하나에 있어서, 접촉은 생체외에서 수행되는, 방법.
361. 구현예 326 내지 360 중 어느 하나에 있어서, 세포는 면역 세포인, 방법.
362. 구현예 361에 있어서, 세포는 림프구 또는 항원 제시 세포인, 방법.
363. 구현예 362에 있어서, 세포는 T 세포, B 세포 또는 항원 제시 세포인, 방법.
364. 구현예 326 내지 363 중 어느 하나에 있어서, 세포는 T 세포인, 방법.
365. 구현예 326 내지 364 중 어느 하나에 있어서, 세포는 재조합 수용체를 포함하는, 방법.
366. 구현예 326 내지 365, 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 조건 하에 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산과 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
367. 구현예 365 또는 구현예 366에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
368. 구현예 365 내지 367 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
369. 구현예 368에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
370. 구현예 369에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
371. 구현예 369 또는 구현예 370에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
372. 구현예 369 내지 371 중 어느 하나에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
373. 구현예 369 내지 372 중 어느 하나에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
374. 구현예 373에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
375. 구현예 365 내지 374 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
376. 구현예 369 내지 375 중 어느 하나에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
377. 구현예 365 내지 376 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
378. 구현예 377에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
379. 구현예 377 또는 378에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
380. 구현예 379에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
381. 구현예 162 내지 231 및 326 내지 380 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 T 세포.
382. 구현예 232 내지 264 중 어느 하나의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 포함하는 T 세포.
383. 구현예 265 내지 297 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 T 세포.
384. 구현예 381 내지 383 중 어느 하나의 T 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 치료하는 방법.
385. 요법에 사용하기 위한 구현예 232 내지 264 중 어느 하나의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체, 구현예 265 내지 297 중 어느 하나의 조성물 또는 구현예 381 내지 383 중 어느 하나의 T 세포.
386. 암 치료를 위한 약제의 제조에서의 구현예 232 내지 264 중 어느 하나의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체, 또는 구현예 265 내지 297 중 어느 하나의 조성물의 용도.
VII. 실시예
다음의 실시예는 단지 예시 목적으로 포함되며, 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 일차 T 세포에서의 PDCD1 에 대한 gRNA의 스크리닝
PDCD1(프로그래밍된 사멸-1, PD-1을 인코딩하는 유전자)을 표적화하는 특정 gRNA를 평가하기 위해, PDCD1 좌위를 표적화하는 상이한 표지의 gRNA를 포함하는 Cas9(RNP) 및 gRNA의 리보뉴클레오단백질 복합체를 발생시키고, 전기천공에 의해 활성화된 일차 T 세포에 전달하였다. 필수적으로 PCT 공개 출원 제 WO2015161276호에 기재된 바와 같이 정제된 S. 피오게네스 Cas9 단백질을 gRNA에 따라, 1:1, 1:1.25 또는 1:5 Cas9:gRNA 비율로 적어도 15분 동안 시험관내에서 전사된 각각의 gRNA(필수적으로 PCT 공개 출원 제 WO2015161276호에 기재된 바와 같이 제조됨)에 의해 복합체화하였다.
시차 주사 형광계(DSF)를 사용하여, 단백질이 gRNA와 완전히 복합체화되었음을 검증한 후, 전기천공을 사용하여, 건강한 인간 공여체로부터의 활성화된 CD4+ T 세포에 RNP를 투여하였다. 96-웰 형에서, 전기천공을 사용하여, RNP를 500,000개의 세포에 1 μg의 RNP/100,000 세포의 투여량으로 첨가하였다. IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 배지에서 세포를 전기천공 후 배양하였다.
PDCD1 넉아웃의 효율을 평가하기 위해, T 세포를 48시간 동안 T 세포 배지에서 배양하면서, 항-CD3/항-CD28 비드를 사용하여, 재활성화하였다. 전기천공 7일 후, 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이, PE-접합된 항-PD1 항체를 사용하여, 세포를 유동 세포계측에 의해 분석하였다. PD-1 음성 세포의 백분율이 도 23에 도시되어 있다. 표 1000은, 이러한 방식으로 확인된 PDCD1 넉아웃 효율의 45%를 초과하는 6개의 예시적 RNP로부터의 gRNA의 표적화 도메인의 서열을 제공한다.
[표 1000]
Figure pct00078
상기에서 확인된 각각의 6개의 gRNA의 특이성을 일차 T 세포에서 GUIDE-seq에 의해 평가하였다(본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는 문헌[Nature Biotechnology 33:187-197, 2015] 참조). 2개의 개별 실험으로부터 유래한 4개의 독립적인 gDNA 샘플의 결과가 표 2000에 정리되어 있다. 4개의 샘플 중 적어도 하나에 양방향 판독결과가 존재하거나, 4개의 샘플 중 적어도 2개에 단방향 판독결과가 존재하는 경우, 비표적로 칭하였다. GUIDE-seq 결과를 확인하기 위해, 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)의 gRNA를 사용하여 제조된 S. 피오게네스 RNP에 의해 처리된 T 세포로부터의 6개의 독립적인 gDNA에서 Amp-seq를 수행하였다. Amp-seq 결과는 GUIDE-seq 결과와 유사하였으며, (a) 확인된 비표적 및 (b) GUIDE-seq에 의해 발생된 가이드의 랭크 순서 둘 모두를 확인시켰다.
[표 2000]
Figure pct00079
실시예 2: 다수의 공여체에 대한 PDCD1 넉아웃 효율의 평가
다수의 공여체에 대한 커팅 효율을 평가하기 위해, 표적화 도메인 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)의 gRNA를 사용하여 제조된 PDCD1을 표적화하는 RNP를 다수의 공여체로부터의 활성화된 일차 CD4+ T 세포 내로 전기천공시켰다. 대조군으로서, AAVS1 표적화 도메인(SEQ ID NO: 387)의 gRNA를 사용하여 제조된 대조군 RNP를 사용하여 제조된 RNP를 활성화된 일차 CD4+ T 세포 내로 전기천공시켰다. 그 후, PD-1 발현을 PE-접합된 항-PD-1 항체를 사용하여, 유동 세포계측(FACS)에 의해 평가하였다.
사전에 건강한 공여체로부터 단리된 일차 CD4+ T 세포를 해동시키고, IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 배지에서 배양하면서, 항-CD3/항-CD28 비드를 사용하여, 활성화하였다. 활성화 48시간 후, 세포로부터 비드를 제거하고, 추가적으로 24시간 동안 재배한 후, RNP에 의해 1μg/100,000 세포의 투여량으로 전기천공시켰다. 수일의 재배(3일 내지 4일) 후, 세포를 항-CD3/항-CD28 비드 또는 PMA/이오노마이신(PMA/IO)에 의해 재 자극시켰다. 항-CD3/항-CD28 활성화의 경우, 세포를 48시간 동안 비드와 함께 인큐베이션하고, 24시간 후에 FACS에 의해 PD-1 발현에 대해 평가하였다. PMA/IO 활성화의 경우, 세포를 PMA/IO의 존재 하에 24시간 동안 배양한 후, FACS에 의해 PD-1 발현에 대해 평가하였다. 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되고, BioLegend website: www.biolegend.com/media_assets/support_protocol/BioLegend_Surface_Staining_Flow_Protocol_091012.pdf에서 입수 가능한 "세포 표면 면역형광 염색 프로토콜"에 따라, PE-접합된 항-PD-1 항체(미국 캘리포니아주 소재의 BioLegend로부터 입수 가능)를 사용하여 PD-1 발현을 평가하였다. T 세포 분류를 위한 게이팅 매개변수는 문헌에 기재된 바와 같이 하나 이상의 채널 및 전방 및 측방 산란의 형광 신호를 기반으로 설정하였으며, 예를 들어 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는 문헌[D. Davies, Cell Sorting by Flow Cytometry, pp. 257-276 in Flow Cytometry: Principles and Applications, Edited by: M. G. Macey, 2007 (Humana Press Inc., Totowa, NJ)]을 참조한다. 활성화 조건에 관계없이, PD-1의 발현을 AAVS1 편집 또는 비처리 대조군 집단에서 평가하였다.
도 24a에서, PDCD1 넉아웃을 갖는 세포의 백분율이 다수의 공여체에 대한 표준 편차를 나타내는 오차 막대로 도시되어 있다. 전술된 실험에서 FACS(유동 세포계측)에 의해 검출된 바와 같은 PD-1 발현의 예가 도 24b에 도시되어 있다. AAVS1 편집 또는 비처리 대조군 집단에서 PD-1의 상향 조절이 관찰되었다. PDCD1을 표적화 하는 RNP로 처리된 세포에서, 조성물은 대략 90% PD-1 음성 T 세포를 함유하는 것으로 관찰되었고, 일부 공여체로부터 발생된 세포에서 90% 초과의 PD-1 음성 세포가 관찰되었다.
실시예 3: PDCD1 넉아웃은 T 세포 배양의 조성물을 변경시키지 않는다
PDCD1의 결실이 CD8+ T 세포 배양의 조성물에 변화를 유발하는지를 평가하기 위해, 표적화 도메인 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)의 gRNA를 사용하여 제조된 PDCD1을 표적화하는 RNP를 CD4+/CD8+ T 세포의 공동 배양에 전달하였다. AAVS1 표적화 도메인(SEQ ID NO: 387)의 gRNA를 사용하여 제조된 RNP로 처리된 CD8+ T 세포를 대조군으로서 사용하였다.
단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 항-CD3/항-CD28 비드로 활성화시키고, IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 배지에서 배양하였다. 활성화 48시간 후, 활성화 비드를 제거하고, 세포를 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 PDCD1- 또는 AAVS1-표적화 RNP로 전기천공시키고, IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 배지에서 배양하였다.
항-CD3/항-CD28 비드에 의한 재 활성화 후, 유동 세포계측에 의해, PD-1 발현 수준을 평가하기 위해, 세포의 하위세트를 4일째에 분할하였다. 나머지 세포(비 활성화된 세포)를 T 세포 동결 배지에서 동결시켰다. 세포 조성물이 PDCD1의 결실에 의해 변경되었는지를 결정하기 위해, AAVS1 가이드- 및 PDCD1 가이드-처리 세포를 IL-2, IL-7, IL-15를 함유하는 T 세포 배지에 해동시켰다. 그 후, CD8+ 세포 집단 내의 부분집합(예를 들어, 나이브, 중심 기억, 효과기 기억 및 최종 분화된 효과기 기억 포함)을 평가하기 위해, 세포를 CD8, CD62L 및 CD45RA에 대한 항체로 염색하였다. 살아 있는(전방/측방 산란 기반) CD8+ 세포에서 검출된 CD62L 및 CD45RA 표면 발현 수준이 도 25에 도시되어 있다. 이들 2개의 마커의 발현을 기반으로 한 부분집합을 각 사분면의 표지된 세포의 백분율에 의한 등고선 도식의 사분면에 표시하였다. 이 도식은 대조군 AAVS1-표적화 RNP로 처리된 세포와 비교하여, PDCD1-표적화 RNP로 처리된 세포 집단에서 주요 변화가 관찰되지 않았다는 것을 보여준다.
실시예 4: 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 조작된 세포에서 PDCD1의 유전자 붕괴
일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 면역친화도-기반 선택에 의해, 건강한 공여체로부터 얻은 인간 PBMC 샘플로부터 단리하였다. 생산된 세포를 37℃에서 인간 혈청, IL-2(100 U/mL), IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(5 ng/mL)를 함유하는 배지에서 항-CD3/항-CD28 시약과 함께 배양함으로써, 자극한 후, 24시간 내지 48시간 동안 렌티바이러스 형질도입에 의해 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작하였다. 세포를 형질도입을 위한 대용 마커로서 사용하기 위해, 예시적 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산 분자 및 절두된 EGFR(EGFRt)을 인코딩하는 핵산을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 형질도입시키고, T2A 리보솜 스위치를 인코딩하는 서열에 의해 분리하였다. CAR은 항-CD19 scFv, Ig-유래 스페이서, 인간 CD28-유래 막관통 도메인, 인간 4-1BB-유래 세포내 신호전달 도메인 및 인간 CD3 제타-유래 신호전달 도메인을 포함하였다. 모의 형질도입을 음성 대조군으로서 사용하였다.
형질도입 후, 세포를 인간 혈청 및 IL-2(50 U/mL), IL-7(5 ng/mL) 및 IL-15(0.5 ng/mL)를 함유하는 배지에서 36시간 내지 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 표적화 도메인 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)의 PDCD1-표적화된 gRNA(또는 표적화 도메인 GUCCCCUCCACCCCACAGUG(SEQ ID NO: 387)의 AAVS1 대조군 gRNA)를 사용하여 제조된 RNP에 의해 전기천공시킨 후, S. 피오게네스 Cas9. 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 동일한 배지에서 밤새 동일한 농도에서 30℃에서 배양한 다음, 전기천공 후 12일 내지 15일 사이에 37℃에서 배양하였다.
A. CAR 및 PD-1 발현
항-CD3/항-CD28 항체와 접합된 비드에 의한 재 자극 24시간 후, 전기천공 후 12일째에 PD-1의 세포 표면 발현 및 CAR 발현(대용 마커를 통해 표시된 바와 같음)을 평가하였다. 유동 세포계측에 의해, 표면 상의 CAR 발현(대용 마커, EGFRt의 표면 발현에 의해 표시된 바와 같음) 및 PD-1 발현을 검증하기 위해, 세포를 항-EGFR 항체 또는 항-PD1 항체로 염색하였다. 결과는 도 26에 도시되어 있다.
도 18에 도시된 바와 같이, 이들 조건 하에 PDCD1-표적화 RNP에 의한 전기천공에 적용된 CD8+ T 세포 중 90% 초과 및 CD4+ T 세포 중 90% 초과가 CAR-발현 집단(EGFRt 마커에 의해 표시된 바와 같음)을 포함하여, PD-1의 표면 발현에 대해 음성인 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는, CAR-형질도입 및 비-CAR-발현 CD8+ 및 CD4+ 세포 둘 모두에서 두 대립유전자 모두에서의 PDCD1의 효율적인 결실에 의한 바와 일치하였다. 또한 대조군 및 PD-1-음성 세포 둘 모두에서 대용 마커의 표면 발현이 관찰되었으며, 이는 PD-1 넉아웃이 재조합 대용 마커 단백질의 표면 발현을 방지하지 않았음을 시사한다.
B. CAR+ PD-1 KO 세포의 표현형 평가
또한 표현형, 분화 상태 및/또는 활성화 상태의 지표가 되는 것을 포함하여, 다양한 마커의 표면 발현을 평가하는 유동 세포계측에 의해, 변형된 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 표현형 특징을 평가하였다. 상기에 기재된 바와 같이, PD-1 및 EGFRt 마커(CAR 발현의 대용)를 인식하는 것에 추가하여, CCR7, 41BB, TIM3, CD27, CD45RA, CD45RO, Lag3, CD62L, CD25 및 CD69에 특이적인 항체에 의해 세포를 염색하였다. 각각의 T 세포 아형 CD4+ 및 CD8+의 각각의 부분집합(CAR+/PD1+; CAR+/PD1-; CAR-/PD1+; 및 CAR-/PD1-)에서의 각각의 마커에 대해 검출된 평균 형광 강도를 결정하였다.
도 27a(CD4+) 및 도 27b(CD8+)에 제시된 결과는, 시험 조건 하에서, PD-1-음성 CAR-발현 세포(CAR+/PD1-) 및 PD-1-양성 CAR-발현 세포(CAR+/PD1+) 사이에, 다양한 마커의 발현 수준이 유사함을 나타내었다.
C. CAR-T 세포에서의 PDCD1 결실
뉴클레아제-유도 비-상동성 말단-결합(NHEJ)에 의한 PDCD1 좌위의 붕괴는 NHEJ 수선 부위의 DNA 서열에 삽입 및/또는 결실(삽입결실) 돌연변이의 존재를 생산할 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이 조작되고, 결실에 적용된 T 세포를 MiSeq 서열분석기(Illumina)에 의해, 일차 확장 20일 후 및 이차 확장 10일 후에 삽입결실의 존재에 대해 분석하였다. PDCD1 좌위에서의 삽입결실의 수 및 PDCD1 표적화된 gRNA에 의해 도입된 PDCD1 커팅 부위와 비교한 이들의 상대 위치를 결정하였다.
도 28a에 도시된 바와 같이, PDCD1-표적화된 Cas9/gRNA RNP에 의해 전기천공된 CAR+ T 세포 및 모의 형질도입된 T 세포 중 90% 초과가 일차 및 이차 확장 후 PDCD1 좌위에 삽입결실을 함유하였다. 비교해 보면, 대조군 gAASV1-표적화된 Cas9/gRNA RNP에 의해 전기천공된 세포에서는 PDCD1 삽입결실이 관찰되지 않았다. 도 28b에 도시된 바와 같이, PDCD1 표적화된gRNA에 의해 유도된 커팅 부위 또는 그 부근(즉, 상류 또는 하류의 50개의 염기쌍 이내)에 삽입 및 결실이 유발되었다. 이러한 결과는 이들 조건 하에 PDCD1 표적화된 gRNA가 CAR-발현 T 세포 중 90% 초과에서, PDCD1 의 유전자 붕괴를 유발하였으며, 이러한 붕괴는 다회의 확장 전반에 걸쳐 안정하였음을 나타내었다.
실시예 5: PDCD1 -결실된 CAR-발현 T 세포의 기능성 활성
실시예 4에 기재된 바와 같이 생산된 것으로, PD-1 유전자의 발현이 넉아웃되고, 예시적 항-CD19 CAR을 발현하는 유전자 조작된 인간 T 세포(CD8+ 또는 CD4+)를 다양한 기능성 반응에 대해 평가하였다.
A. 세포 용해 활성
형질도입(및 모의 형질도입) 및 PDCD1(또는 대조군) 결실을 상기의 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 후, CD19 항원(K562-CD19)를 발현하는 K562 표적 세포 또는 대조군 항원(ROR1)(K562-ROR)을 발현하는 비-특이적 CD19-음성 K562 대조군 세포에 대한 세포 용해 활성에 대해 세포를 평가하였다. T 세포를 NucRed 염료의 존재 하에 표적 세포(K562-CD19 또는 K562-ROR1)와 함께 4:1 효과기:표적 비율로 인큐베이션하였다. 70시간에 걸쳐, Incucyte 정량적 세포 분석 시스템(Essen BioScience)을 사용하여, NucRed 염료에 대한 세포의 염색 강도를 평가함으로써, 표적 세포의 용해를 측정하였다. 용해가 이루어진 세포는 염료에 대한 감소된 염색 강도를 나타내었다.
결과는 CAR-발현 T 세포(예를 들어, CAR+/PD1+, CAR+/PD1- 및 CAR+/AAVS1-)가 표적 항원 특이적 방식으로 CD19-발현 표적 세포를 유사한 정도로 사멸시킬 수 있었음을 보여주었다. 비 특이적 항원을 발현하는 표적 세포와 함께 인큐베이션한 후에는, 이들 세포 중 어느 것에서도 세포 용해가 관찰되지 않았다. 결과는, 이들 조건 하에 PDCD1의 결실이 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 CAR-매개 세포독성 활성에 영향을 주지 않았음을 나타내었다.
B. T 세포 확장
CD19-발현 표적 세포와의 인큐베이션 후의 T 세포의 증식을 유동 세포계측에 의해 평가하였다. 상기에 기재된 바와 같이 발생된 PDCD1을 표적화하는 가이드(또는 AAVS1 대조군)와의 RNP를 사용하여 결실에 적용된 CD8+ 또는 CD4+ CAR-발현 T 세포(또는 모의 대조군)를 CellTrace™ 바이올렛(ThermoFisher) 세포 증식 분석 염료로 표지하였다. 세포를 세척하고, 96시간 동안 동일한 표적 세포(K562-CD19 또는 K562-ROR)와 함께 1:1 효과기:표적 비율로 삼중 반복 실험으로 인큐베이션하였다. 살아 있는 T 세포의 분열이 CellTrace™ 바이올렛 염료 희석에 의해 나타났으며, 이는 유동 세포계측에 의해 평가되는 바와 같다.
도 29에 도시된 바와 같이, 항-CD19 CAR을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포(PDCD1 결실이 존재하거나, 부재함)는 K562-CD19와의 공동 배양 후, 항원 특이적 방식으로 유사한 정도로 증식하였다. 따라서, 이러한 결과는, 이들 조건 하에서 CAR+ T 세포가 PDCD1의 결실 후, CAR 항원 특이적 방식으로 증식할 수 있었음을 나타내었다.
C. 사이토카인 방출
또한, 다양한 세포를 항원-발현 및 대조군 표적 세포와 인큐베이션한 후, 사이토카인 방출을 평가하였다. 상기에 기재된 바와 같이 발생된 것으로, PDCD1-표적화된 또는 AAVS1-표적화된 결실 또는 비 형질담염(UT)에 적용된 CAR-발현 T 세포(및 모의 대조군)를 표적 세포(K562-CD19 또는 K562-ROR)와 함께 4:1 효과기:표적 비율로 삼중 반복 실험으로 공동 배양하였다. 공동 배양된 세포를 약 24시간 동안 인큐베이션한 후, 다중복합 사이토카인 면역분석(Meso Scale Discovery)을 사용한 IFN-γ, TNF-α 또는 IL-2의 측정을 위해, 상청액을 수집하였다.
결과는 도 30a(IFN-γ), 도 30b(TNF-α) 및 도 30c(IL-2)에 제시되어 있다. 이러한 결과는, 이들 조건 하에, PDCD1-결실 및 대조군 CAR-발현 T 세포가 CD19-발현 표적 세포와의 인큐베이션 후, 항원 특이적 방식으로 유사한 수준의 사이토카인을 분비하였음을 보여주었다.
실시예 6: gRNA의 클로닝 및 초기 스크리닝
후보 gRNA의 적합성을 본 실시예에 기재하는 바와 같이 평가할 수 있다. 키메라 gRNA에 대해 기재하였지만, 모듈 gRNA를 평가하기 위한 접근을 또한 사용할 수 있다.
벡터 내로 gRNA의 클로닝
각각의 gRNA에 대해, 중복 올리고뉴클레오타이드의 쌍을 설계하고 얻는다. 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하고, 상류의 U6 프로모터를 함유하는 분해된 벡터 백본 및 긴 키메라 gRNA의 남아있는 서열 내로 결찰시킨다. 플라스미드를 서열 확인하고, 충분한 양의 형질감염 품질 DNA를 발생시키도록 준비한다. 대안의 프로모터를 사용하여 생체내 전사(예를 들어, H1 프로모터) 또는 시험관내 전사(예를 들어, T7 프로모터)를 유발할 수 있다.
선형 dsDNA 분자( STITCHR )에서 gRNA의 클로닝
각각의 gRNA에 대해, 단일 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 얻는다. U6 프로모터 및 gRNA 스캐폴드(예를 들어 표적화 도메인, 예를 들어 crRNA 및 tracrRNA로부터 유래된 서열을 포함하는, 예를 들어 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 표적화 도메인을 제외한 모든 것을 포함함)를 별도로 PCR 증폭시키고, dsDNA 분자로서 정제한다. gRNA-특이적 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응에서 사용하여 올리고뉴클레오타이드에서 구체화된 표적화 도메인에 의해 연결된 U6 및 gRNA 스캐폴드와 함께 봉합한다. 얻어진 dsDNA 분자(STITCHR 산물)를 형질감염을 위해 정제한다. 대안의 프로모터를 사용하여 생체내 전사(예를 들어, H1 프로모터) 또는 시험관내 전사(예를 들어, T7 프로모터)를 유발할 수 있다. 임의의 gRNA 스캐폴드를 사용하여 임의의 박테리아 종으로부터의 Cas9에 적합한 gRNA를 생산할 수 있다.
초기 gRNA 스크리닝
시험할 각각의 gRNA를 Cas9를 발현시키는 플라스미드 및 소량의 GFP-발현 플라스미드와 함께 인간 세포 내로 형질감염시킨다. 예비 실험에서, 이들 세포는 불멸 인간 세포주, 예컨대 293T, K562 또는 U2OS일 수 있다. 대안적으로, 1차 인간 세포를 사용할 수 있다. 이 경우에, 세포를 종국적 치료 세포 표적(예를 들어, 적혈구 세포)에 적합할 수 있다. 잠재적 치료 세포 집단과 유사한 1차 세포의 사용은 내인성 염색질 및 유전자 발현에서 유전자 표적률에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다.
형질감염은 지질 형질감염(예컨대 리포펙타민 또는 퓨겐(Fugene))을 이용하여 또는 전기천공법(예컨대 론자 뉴클레오펙션(Lonza Nucleofection))에 의해 수행할 수 있다. 형질감염 후, GFP 발현은 형광 현미경에 의해 또는 유세포 분석에 의해 결정하여 일정한 그리고 고수준의 형질감염을 확인할 수 있다. 이들 예비 형질감염은 gRNA/gRNA의 조합이 가장 큰 활성을 제공한다는 것을 결정하기 위해 상이한 gRNA 및 상이한 표적화 접근(17량체, 20량체, 뉴클레아제, 이중-닉카제 등)을 포함할 수 있다.
각각의 gRNA에 의한 절단 효율을 T7E1-형 분석에 의해 또는 서열분석에 의해 표적 좌위에서 NHEJ-유도 삽입결실 형성을 측정함으로써 평가할 수 있다. 대안적으로, 다른 미스매치-민감 효소, 예컨대 CelI/서베이어 뉴클레아제를 또한 사용할 수 있다.
T7E1 분석을 위해, PCR 앰플리콘은 대략 500 bp 내지 700 bp이며, 의도된 커팅 부위는 앰플리콘 내에서 비대칭적으로 위치된다. PCR 산물의 증폭, 정제 및 크기 확인 후에, 95℃까지 가열함으로써 DNA를 변성시키고, 재혼성화시키고, 이어서 서서히 냉각시킨다. 이어서, 혼성화된 PCR 산물을 완전하지 않게 매칭된 DNA를 인식하고 절단하는 T7 엔도뉴클레아제 I(또는 다른 미스매치 민감 효소)로 분해시킨다. 삽입결실이 본래의 주형 DNA에 존재한다면, 앰플리콘이 변성되고 재어닐링될 때, 이는 상이한 삽입결실을 보유하는 DNA 가닥의 혼성화를 초래하며, 따라서, 완전하게 매칭되지 않는 이중 가닥 DNA를 야기한다. 분해 산물은 겔전기영동에 의해 또는 모세관 전기영동에 의해 시각화할 수 있다. 절단된 DNA의 분획(절단된 산물의 밀도를 절단 및 비절단의 밀도로 나눔)을 다음의 식을 이용하여 NHEJ%를 추정하는 데 사용할 수 있다: %NHEJ = (1-(1-절단된 분획)1/2). T7E1 분석은 약 2% 내지 5% NHEJ에 이르기까지 민감하다.
T7E1 분석 대신에, 또는 추가로 서열분석을 사용할 수 있다. 생어(Sanger) 서열분석을 위해, 정제된 PCR 앰플리콘을 플라스미드 백본 내로 클로닝하고 나서, 형질전환시키고, 미니프렙하고 나서, 단일 프라이머를 이용하여 서열분석한다. T7E1에 의한 NHEJ 비율을 결정한 후에 삽입결실의 정확한 특성을 결정하기 위하여 생어 서열분석을 사용할 수 있다.
차세대 서열분석 기법을 이용하여 서열분석을 또한 수행할 수 있다. 차세대 서열분석을 이용할 때, 앰플리콘은 비대칭적으로 놓인 의도된 커팅 부위를 지니고 300 bp 내지 500 bp일 수 있다. PCR 후에, 차세대 서열분석 어댑터 및 바코드(예를 들어, 일루미나 멀티플렉스 어댑터 및 지수(Illumina multiplex adapters and indexe))를 앰플리콘의 말단에, 예를 들어 고속대량 서열분석(예를 들어, Illumina MiSeq 상에서)에 첨가할 수 있다. 이 방법은 매우 낮은 NHEJ 비율의 검출을 가능하게 한다.
실시예 7: NHEJ에 의한 유전자 표적화의 평가
유전자 표적화 효율의 추가적인 평가를 위해 초기 시험에서 가장 큰 수준의 NHEJ를 유도하는 gRNA를 선택할 수 있다. 이 경우에, 세포는 질환 대상체로부터 유래되며, 따라서 적절한 돌연변이를 보유한다.
형질감염 후(보통 형질감염 후 2일 내지 3일), 게놈 DNA를 형질감염 세포의 큰 집단으로부터 단리시킬 수 있고, PCR을 사용하여 표적 영역을 증폭시킬 수 있다. PCR 후에, 목적으로 하는 돌연변이(표적 유전자의 넉아웃 또는 표적 서열 모티프의 제거)를 발생시키는 유전자 표적화 효율을 서열분석에 의해 결정할 수 있다. 생어 서열분석을 위해, PCR 앰플리콘은 500 bp 내지 700 bp 길이일 수 있다. 차세대 서열분석을 위해, PCR 앰플리콘은 300 bp 내지 500 bp 길이일 수 있다. 목적이 유전자 기능의 넉아웃이라면, 서열분석을 이용하여 대립유전자의 백분율이 유전자 기능을 붕괴하는 것으로 예상된 프레임시프트 또는 큰 결실 또는 삽입을 야기하는 NHEJ-유도 삽입결실을 겪은 대립유전자%를 평가할 수 있다. 목적이 특이적 서열 모티프를 제거하는 것이라면, 서열분석을 이용하여 이 서열에 걸쳐있는 NHEJ 유도 결실을 겪은 대립유전자%를 평가할 수 있다.
실시예 8: 293개 세포에서 gRNA의 스크리닝
T 세포 수용체 베타( TRBC )에 p대한 gRNA의 스크리닝
가장높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 확인하기 위해, 42개의 S. 피오게네스및 27개의 S. 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 3000). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 발생시켰다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 인코딩하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293개 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48시간 내지 72시간에 세포로부터 단리시켰다. T 세포 수용체 베타 유전자(TRBC)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 4000에 열거한 프라이를 이용하는 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게, 이 분석은 PCR 산물의 용융 다음에 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난다면, 삽입 또는 결실의 일부 빈도에 기인하여 완전한 매칭이 아닌 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서 T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 커팅 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 커팅으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 이 분석의 결과를 도11 및 도 12에 나타낸다.
[표 3000]
Figure pct00080
Figure pct00081
[표 4000]
Figure pct00082
T 세포 수용체 알파( TRAC )에 대한 gRNA의 스크리닝
가장 높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 확인하기 위해, 18개의 S. 피오게네스및 13개의 S. 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 5000). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 발생시켰다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 인코딩하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293개 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48 내지 72시간에 세포로부터 단리시켰다. T 세포 수용체 알파 유전자(TRAC)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 6000에 열거한 프라이를 이용하는 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게, 이 분석은 PCR 산물의 용융 다음에 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난다면, 삽입 또는 결실의 일부 빈도에 기인하여 완전한 매칭이 아닌 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서 T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 커팅 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 커팅으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 이 분석의 결과를 도13 및 도 14에 나타낸다.
[표 5000]
Figure pct00083
Figure pct00084
[표 6000]
Figure pct00085
PDCD1 유전자에 대한 gRNA의 스크리닝
가장 높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 확인하기 위해, 48개의 S. 피오게네스및 27개의 S. 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 7000a 및 표 7000b 참조). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 발생시켰다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(S. 피오게네스또는 S. 아우레우스)를 인코딩하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293개 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48시간 내지 72시간에 세포로부터 단리시켰다. PD-1 유전자(PDCD1)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 7000c에 열거한 프라이를 이용하는 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게, 이 분석은 PCR 산물의 용융 다음에 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난다면, 삽입 또는 결실의 일부 빈도에 기인하여 완전한 매칭이 아닌 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 커팅 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 커팅으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 표 7000a에 나타낸 gRNA에 대한 분석의 결과를 도15 및 도 16에 나타낸다. 표 7000b에 나타낸 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 다른 gRNA를 이용하여 유사한 실험을 수행할 수 있다.
[표 7000a]
Figure pct00086
Figure pct00087
[표 7000b]
Figure pct00088
[표 7000c]
Figure pct00089
실시예 9: 1차 T 세포에 대한 gRNA의 효소적 합성 및 전달
RNA 분자로서 Cas9 mRNA 및 gRNA의T 세포에 대한 전달
1차 CD4+ T 세포에서 Cas9-매개 커팅을 결정하기 위해, TCR 베타쇄(TRBC-210 (GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(SEQ ID NO: 413)) 또는 TCR 알파쇄(TRAC-4 (GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(SEQ ID NO: 453))에 대해 설계한 S. 피오게네스Cas9 및 gRNA를 전기천공법을 통해 T 세포에 RNA 분자로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9와 gRNA는 둘 모두 T7 중합효소를 이용하여 시험관내로 전사시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA 종 둘 모두에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 E. 콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후에 첨가하였다. TRBC1 및 TRBC2 좌위에서 변형된 CD4+ T 세포를 발생시키기 위해, 10 ㎍의 Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 TRBC-210(GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(SEQ ID NO: 413) gRNA를 전기천공법에 의해 세포에 도입하였다. 동일한 실험에서, 본 발명자들은 또한 10 ㎍의 TRAC-4(GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(SEQ ID NO: 453) gRNA와 함께 10 ㎍의 Cas9 mRNA를 도입함으로써 TRAC 유전자를 표적화하였다. AAVS1 (GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(SEQ ID NO: 51201) 게놈 부위를 표적화하는 gRNA를 실험 대조군으로서 사용하였다. 전기천공법 전에, T 세포를 10% FBS 및 재조합 IL-2로 보충한 RPMI 1640에서 배양시켰다. 세포를 CD3/CD28 비드를 이용하여 활성화시키고, 적어도 3일 동안 확장시켰다. 활성화된 T 세포에 대한 mRNA의 도입에 후속적으로, 세포에 대한 CD3 발현을 CD3에 특이적인 플루오레세인(APC) 컨쥬게이팅 항체를 이용하는 유세포분석에 의해 전기천공법 후 24시간, 48시간 및 72시간에 모니터링하였다. 72시간에, CD3 음성 세포 집단을 관찰하였다(도17a 및 도 17b). CD3 음성 세포의 발생이 TRBC 좌위에서 게놈 편집의 결과였다는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRBC2 좌위 및 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인한다(도 17c).
T 세포에 대한 Cas9 / gRNA RNP의 전달
주카트 T 세포에서 Cas9-매개 커팅을 결정하기 위해, TCR 알파 쇄(TRAC-233(GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA)(SEQ ID NO: 474))에 대해 설계한 S. 아우레우스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 E. 콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 인코딩하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10 mL 종균 배양물을 4개의 콜로니로 접종하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1 L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정한 LM10 Microfluidizer®를 통해 2회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 로딩하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH 7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10 mM Hepes pH7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 로딩하기 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5 mg/ml로 농축시켰다.
gRNA를 T7 중합효소를 이용하여 시험관내 전사에 의해 발생시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 E. 콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 세포 내로 도입 전, 정제한 Cas9 및 gRNA를 혼합하고 나서, 10분 동안 복합체가 형성되게 하였다. RNP 용액을 후속적으로 전기천공법에 의해 주카트 T 세포 내로 도입하였다. 전기천공법 전에 그리고 전기천공법 후에, 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. CD3에 특이적인 플루오레세인 컨쥬게이팅된 항체를 이용하여 세포 상의 CD3 발현을 유세포분석에 의한 전기천공법 후 24시간, 48시간 및 72시간에 모니터링하였다. 48시간 및 72시간에, CD3 음성 세포의 집단을 관찰하였다(도18a 및 도18b). CD3 음성 세포의 발생이 TRAC 좌위에서 게놈 편집의 결과라는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하였고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도18c).
실시예 10: T 세포 생존도에 대한 gRNA 변형의 효과 평가
gRNA 변형이 T 세포 생존도에 영향을 미치는 방법을 평가하기 위해, S. 피오게네스Cas9 mRNA를 변형과 함께 또는 변형 없이 AAVS1 gRNA(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(SEQ ID NO: 387)과 조합하여 주카트 T 세포에 전달하였다. 특이적으로, 4 종의 상이한 변형 조합물을 분석하였다. (1) 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 지니는 gRNA(도19 참조) 및 폴리A 꼬리, (2) 5' ARCA 캡만을 지니는 gRNA, (3) 폴리A 꼬리만을 지니는 gRNA, (4) 임의의 변형이 없는 gRNA. 변형된 gRNA의 앞서 언급한 형태의 모두 넷을 발생시키기 위해, DNA 주형은 T7 프로모터, AAVS1 gRNA 표적 서열(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(SEQ ID NO: 387), 및 S. 피오게네스TRACR 서열을 포함한다. 모든 gRNA에 대해, T7 중합효소를 이용하여 7.5 mM UTP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP의 존재 하에 gRNA를 발생시켰다. 5' ARCA 캡을 지니는 gRNA를 변형시키기 위해, ARCA 유사체의 6.0 mM을 NTP 풀에 첨가하였다. 결과적으로, 1.5 mM의 GTP만을 첨가한 반면, NTP 풀의 나머지는 동일한 농도로 남아있었다: 7.5 mM UTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP. gRNA에 폴리A 꼬리를 첨가하기 위해, 시험관내 중합효소 반응이 종결된 후에 E. 콜라이로부터 정제한 재조합 폴리A 중합효소를 사용하여 전사 gRNA의 말단에 대해서와 같이 연속해서 첨가하였다. DNase I를 이용하여 DNA 주형을 제거함으로써 종결을 달성하였다. 폴리A 꼬리 반응을 대략 40분 동안 수행하였다. gRNA 변형에도 불구하고, 모든 gRNA 제조물을 페놀:클로로포름 추출 다음에 이소프로판올 침전에 의해 정제하였다. 일단 gRNA가 발생되면, S. 피오게네스Cas9 mRNA(5' ARCA 캡 및 폴리A 꼬리로 변형) 및 4 종의 상이한 변형된 AAVS1-특이적 gRNA 중 하나를 이용하여 주카트 T 세포를 전기천공시켰다. 전기천공법 후에 아넥신-V 및 요오드화 프로피디움 이중 염색을 수행함으로써 세포 생존도를 결정하였다. 아넥신-V 및 PI에 대한 염색이 아닌 살아있는 세포의 분획을 유세포분석에 의해 결정하였다. 결과를 도20에서 정량화하였다. 살아있는 세포의 분획에 기반하여, 5' ARCA 캡과 폴리A 꼬리를 둘 모두에 의해 변형된 gRNA는 전기천공법에 의해 도입될 때 주카트 T 세포에 대해 적어도 독성이라는 결론을 내렸다.
실시예 11: 나이브 T 세포에 대한 Cas9 / gRNA RNP의 전달
나이브 T 세포에서 Cas9 매개 커팅을 입증하기 위해, 표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(SEQ ID NO: 474)을 지니는 TCR 알파쇄에 대해 설계한 S. 아우레우스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 E. 콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 인코딩하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10 mL 종균 배양물을 4개의 콜로니로 접종하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1 L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정한 LM10 Microfluidizer®를 통해 2회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 로딩하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10 mM Hepes pH7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 로딩하기 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5 mg/ml로 농축시켰다.
표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(SEQ ID NO: 474)를 지니는 gRNA를 T7 중합효소를 이용하는 시험관내 전사에 의해 발생시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 E. 콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 이 구현예에서, T 세포를 피콜(Ficoll) 구배 다음에 CD3 자기 비드를 이용하는 양성 선택에 의해 새로운 제대혈로부터 단리시켰다. 세포를 후속적으로 10% FBS, IL-7(5ng/ml) 및 IL-15(5ng/ml)로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 단리 후 24시간에, 정제한 Cas9 및 gRNA를 10분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 발생된 RNP 용액을 이용하여 세포를 전기천공시켰다. CD3에 특이적인 플루오레세인 컨쥬게이팅된 항체를 이용하여 세포 상의 CD3 발현을 유세포분석에 의한 전기천공법 후 96시간에 모니터링하였다. CD3 음성 세포 집단을 gRNA 및 비-기능성 Cas9를 받은 음성 대조군에 비하여 기능성 RNP 복합체가 제공된 세포에서 관찰하였다(도21a 및 도 21b). CD3 음성 세포의 발생이 TRAC 좌위에서 게놈 편집의 결과라는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하였고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도21c).
실시예 12: RNA 분자로서 또는 Cas9 / gRNA RNP로서 Cas9 mRNA 및 gRNA의 주카트 T 세포에 대한 전달에 의한 PDCD1 좌위의 표적화
RNA 분자로서 Cas9 mRNA 및 gRNA 주카트 T 세포에 대한 전달
주카트 T 세포 내 PDCD1 좌위에서 Cas9-매개 커팅을 입증하기 위해, PDCD1 좌위에 대해 설계한 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)을 지니는 S. 피오게네스Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해T 세포에 RNA 분자로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9와 gRNA를 둘 모두 T7 중합효소를 이용하여 시험관내로 전사시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 E. 콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. PDCD1 좌위에서 변형된 주카트 T 세포를 발생시키기 위해, 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)를 지니는 10 ㎍의 Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 gRNA를 전기천공법에 의해 세포에 도입하였다. 전기천공법 전에, T 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI 1640에서 배양시켰다. 24시간, 48시간 및 72시간에, 게놈 DNA를 단리시키고, T7E1 분석을 PDCD1 좌위에서 수행하였다. 사실, 상기 데이터는 PDCD1 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인한다(도22).
주카트 T 세포에 대한 Cas9 / gRNA RNP의 전달
주카트 T 세포 내 PDCD1 좌위에서 Cas9-매개 커팅을 입증하기 위해, 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)을 지니는 PDCD1 좌위에 대해 설계한 S. 피오게네스Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 E. 콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 인코딩하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10 mL 종균 배양물을 4개의 콜로니로 접종하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1 L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정한 LM10 Microfluidizer®를 통해 2회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 로딩하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 로딩하기 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5mg/ml로 농축시켰다.
표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508)를 지니는 gRNA를 T7 중합효소를 이용하는 시험관내 전사에 의해 발생시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 E. 콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 세포 내로 도입하기 전에, 정제한 Cas9 및 gRNA를 혼합하고 10분 동안 복합체가 형성되게 하였다. RNP 용액을 후속적으로 전기천공법에 의해 주카트 T 세포 내로 도입하였다. 전기천공법 전에 그리고 전기천공법 후에, 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 24시간, 48시간 및 72시간에, 게놈 DNA를 단리시키고, PDCD1 좌위에서 T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 PDCD1 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도22).
실시예 13: S. 피오게네스Cas9 단백질의 정제
Cas9를 E. 콜라이에서 발현시켜, 정제하였다. 구체적으로 Cas9를 인코딩하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4) 내에 형질전환시키고, 선택을 위해, 적절한 항생제가 함유된 LB 플레이트 상에 플레이팅하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 적절한 항생제가 함유된 Brain Heart Infusion Broth(Teknova # B9993)의 10 mL 종균 배양물에 4개의 콜로니를 접종하고, 37℃에서 220 rpm으로 진탕시키면서, 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후, 적절한 항생제와 보충제가 함유된 Terrific Broth Complete(Teknova #T7060) 1 L에 종균 배양물을 첨가하고, 37℃에서 220 rpm으로 진탕시키면서, 성장시켰다. OD600이 2.0을 초과하는 경우, 온도를 서서히 18℃까지 감소시키고, IPTG를 0.5 mM에 첨가하여, 유전자의 발현을 유도하였다. 밤새 계속하여 유도한 후, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, TG300(50 mM Tris pH8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에 재현탁하고, -80℃에 저장하였다.
동결된 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정된 LM10 Microfluidizer®를 통해 2회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸에 의해 관심대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 로딩하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH 7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔로 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 로딩하기 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5 mg/ml로 농축시켰다. 분취량을 -80℃에 저장하였다.
실시예 14: gRNA의 시험관내 전사
변형된 T7 프로모터, gRNA 표적 서열 및 키메라 S. 피오게네스 gRNA 스캐폴드를 인코딩하는 DNA 주형을 PCR에 의해 조립하였다. PCR에 사용된 5' 센스 프라이머는 변형된 T7 프로모터, gRNA 표적화 서열(요망되는 표적 부위를 기반으로 하여, 각각의 gRNA에 대해 변형됨), 및 S. 피오게네스 gRNA tracr 서열(GTTTTAGAGCTAGAAATA(SEQ ID NO: 51205))의 5' 말단으로부터의 서열로 구성되었다. 3' 항-센스 프라이머(AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATA(SEQ ID NO: 51206))는 S. 피오게네스 gRNA tracr 서열의 3' 말단에 대한 역방향 보체였다. PCR 반응을 위한 DNA 주형은 S. 피오게네스 gRNA tracr 서열을 함유하는 플라스미드였다. 따라서, 표적 특이적 gRNA의 시험관내 전사를 위한 DNA 주형으로 사용된 증폭된 PCR 산물은 다음을 인코딩하였다: 변형된 T7 프로모터-gRNA 표적 서열-S. 피오게네스 키메라 gRNA 스캐폴드(즉, 변형된 T7 프로모터 이후 gRNA).
T7 RNA 중합효소가 전사를 개시하기 위해 G를 필요로 한다고 가정하면, T7 프로모터는 통상적으로, 프로모터의 하류의 전체 RNA 서열의 전사를 보장하기 위해, 그의 3' 말단에 2개의 G를 갖는다. 그러나, 결과적으로는, 생산된 전사체는 프로모터 서열로부터의 G 둘 모두가 아닌, 이중 적어도 하나를 함유할 수 있으며, 이는 gRNA 특이성 또는 gRNA와 Cas9 단백질 사이의 상호작용을 변경할 수 있다. gRNA 표적 서열이 G로 시작하는 경우에, 이러한 문제를 해소하기 위해, 다음의 변형된 T7 프로모터 서열: TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO: 51203)을 포함하는 5' 센스 프라이머를 사용하여, gRNA PCR 주형에서 T7 프로모터 서열 TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO: 51202)로부터 2개의 GG를 제거하였다. G로 시작하지 않는 gRNA 표적 서열의 경우, gRNA PCR 주형으로 인코딩되는 T7 프로모터 서열을 변형시켜, 다음의 변형된 T7 프로모터 서열: TAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO: 51204)을 포함하는 5' 센스 프라이머를 사용하여, T7 프로모터의 3' 말단의 G 중 하나만이 제거되도록 하였다. Message Machine® T7 Ultra 전사 키트(Ambion)에 의해, DNA 주형을 시험관내에서 전사시킴으로써, gRNA를 발생시켰다. 실시예 10에서, 시험관내 전사 과정에서 gRNA의 5' 말단에 ARCA 캡을 첨가한 후, gRNA 서열의 말단에 폴리 A 꼬리가 첨가된 E-PAP로 처리하여, 실시예 10에서 사용된 모든 gRNA를 5' 말단에서는 ARCA 캡으로, 3' 말단에서는 폴리A 꼬리로 변형시켰다. 실시예 11 내지 13에 기재된 모든 실험에서, 변형된 T7 프로모터, gRNA, 및 gRNA에 대해 3'의 폴리A 꼬리(20A)를 인코딩하는 gRNA PCR 주형으로부터 gRNA를 시험관내에서 전사시켰다. 시험관내 전사 과정에서, gRNA의 5' 말단에 ARCA 캡을 첨가함으로써, 실시예 11 내지 13의 모든 gRNA를 5' 말단에서는 ARCA 캡으로, 3' 말단에서는 폴리A 꼬리로 변형시켰다.
변형된 T7 프로모터 서열은 본 명세서에 기재된 서열에 제한되지 않는다. 예를 들어, T7 프로모터 서열(및 그의 변형)은 표준 생물학적 부품 등록소 (다음의 http:// address: parts.igem.org/Promoters/Catalog/T7에 위치함)의 "프로모터/카탈로그/T7"에 언급된 서열 중 적어도 하나일 수 있다. 본 발명의 gRNA가, 3' 말단 G 중 하나 이상이 제거된(예를 들어, 서열 TAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO: 51204)가, 그의 5' 말단에 G가 부재하는 표적 서열의 바로 상류에 위치하거나, 서열 TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO: 51203)가, 그의 5' 말단에 G를 갖는 표적 서열의 바로 상류에 위치함), 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T7 프로모터를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조되는 방법을 포괄한다는 것이 이해되어야 한다. 이들 변형된 T7 프로모터에 대한 다른 변형은 표준 생물학적 부품 등록소 (다음의 http:// address: parts.igem.org/Promoters/Catalog/T7에 위치하며, 본 명세서에서 그 전체가 참조로 포함됨)의 "프로모터/카탈로그/T7"에 언급된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 다른 T7 프로모터 서열을 기반으로 하여, 당업자에 의해 인식될 것이다.
실시예 15: PDCD1 표적화 gRNA 쌍의 확인
S. 피오게네스 닉카제가 고 백분율의 PDCD1 음성 T 세포를 발생시키기 위해 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, D10A 및 N863A의 닉카제 둘 모두를 실시예 8의 방법에 따라, E. 콜라이로부터 정제하였다. 소프트웨어 툴을 사용하여, PDCD1 gRNA를 확인하고, PDCD1의 좌위에 맵핑(mapping)하였다. gRNA 쌍을 2개의 주 기준을 기반으로 하여, 추가의 평가를 위해 선택하였다: 1) 2개의 gRNA의 PAM 서열이 외부로 향하고, 2) 예측된 커팅 부위(PAM으로부터 4 bp만큼 이격됨) 사이의 거리가 30 pb 초과, 90 bp 미만이다. 선택된 gRNA를 실시예 9에서 기재된 바와 같이, T7-기반의 시험관내 전사 반응을 사용하여 발생시켰다. 각각의 gRNA를 D10A 닉카제 또는 N863A 닉카제와 복합체화하였다. DSF(본 명세서의 부문 IV의 방법 참조)를 사용하여, 복합체화가 완료되었는지를 점증한 후, 열거된 쌍에 상응하는 2개의 적절한 RNP를 1:1 비율로 조합하고, 1 ug 총 RNP/100,000 세포의 투여량에서 세포 내에 전기천공하였다. RNP를 96-웰 형(이중 반복 실험용)에서 250,000개의 활성화된 CD4 T 세포 내로 전기천공하고, 후속하여, IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 T 세포 배지에서 배양하였다. 배양 3일 후, 세포를 PMA/IO로 24시간 동안 활성화시키고, PDCD1 발현을 PE-접합된 항-인간-PDCD1 항체를 사용하여, 유동 세포계측에 의해 평가하였다. PDCD1 음성 세포의 백분율이 도 31에 도시되어 있다. 수개의 D10A 닉카제 쌍의 전달은 90% 초과의 PDCD1 음성 세포에서 야기되었으며, N863A 닉카제와 복합체화된 경우, 동일한 gRNA 쌍이 낮은 수준이나, 검출 가능한 수준의 PDCD1 넉아웃을 유발시켰다. 단일 닉카제 RNP는 PDCD1 발현의 경미한 손실을 야기하였으며, 야생형 S. 피오게네스와 복합체화된 단일 gRNA는 예측된 바와 같이, 고 수준의 넉아웃을 야기하였다. 표 8000a 및 표 8000b는 각각의 gRNA 쌍에 대해 사용된 표적화 도메인에 대한 세부사항을 제공한다.
[표 8000a]
Figure pct00090
[표 8000b]
Figure pct00091
실시예 16: Nalm -6 파종성 종양 모델에서의 PDCD1 -결실된 CAR-발현 T 세포의 생체내 활성의 평가
A PD-L1을 과발현하는 alm-6 종양 주 세포를 NOD/Scid/gc-/-(NSG) 마우스에 주사함으로써, 파종된 종양 이종이식 마우스 모델을 발생시켰다. 구체적으로, 영(0)일째에, PD-L1을 과발현하는 Nalm6 인간 B 세포 전구체 백혈병 세포주의 5 x 105개의 세포를 마우스에 정맥내(i.v.) 주사하고, 녹색 형광 단백질 및 반딧불이 루시퍼라제(Nalm6-PD-L1-ffluc-GFP)로 형질감염시켰다. 4일 동안 종양 생착이 이루어지도록 하고, 생물발광 영상화를 사용하여 검증하였다. 4일째에, 각각의 여덟(8)개의 연구 그룹의 마우스를 비처리하거나, 다음과 같이, 다양한 투여량/유형 중 하나에서 조작된 세포(필수적으로, 실시예 4에 기재된 바와 같이 발생됨)를 1회 정맥내(i.v.) 주사하였다: (1) 투여된 세포 없음(종양 단독), (2) 모의 대조군 벡터로 형질도입된 1 x 106개의 AAVS1-결실된 T 세포; (3) 항-CD19 CAR+ T 세포를 발현하는 5 x 105개의 AAVS1-결실된 세포; (4) 1 x 106개의AAVS1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포; (5) 모의 대조군 벡터로 형질도입된 1 x 106개의 PDCD1-결실된 T 세포; (6) 5 x 105개의 PDCD1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포; (7) 1 x 106개의PDCD1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포; 및 (8) 모의 전기천공 대조군에 적용된 1 x 106개의 항-CD19 CAR+ T 세포.
A. 항-종양 활성
처리 후, 시간 경과에 따른 종양 성장을 생물발광 영상화에 의해 모니터링하고, 평균 광도(p/s/cm2/sr)를 대략 5일 내지 7일마다 28일째까지 측정하였다. 생물발광 영상화의 경우, PBS 중에 재현탁된 루시페린(luciferin) 기질(CaliperLife Sciences, 미국 매사추세츠주 홉킨톤 소재)의 복강내(i.p.) 주사(15 ㎍/g 체중)를 마우스에 제공하였다. 도 32에 도시된 바와 같이, 대조군 마우스 내의 종양(종양 단독 및 모의 대조군-형질도입되고, AAVS1-결실된 T 세포 또는 모의 대조군-형질도입되고, PDCD1-결실된 T 세포로 처리된 것)은 연과 과정 동안 계속하여 성장시켰다. 이와 달리, 다양한 투여량으로 PDCD1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포를 포함하는 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 투여한 마우스는 시험된 모든 치료 후 시점에서 평균 광도의 양의 감소를 나타내었다. 결과는 PDCD1 결실된 CAR+ T 세포가 마우스 암 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있고, PDCD1 결실이 CAR+ T 세포의 생체내 항 종양 기능을 손상시키지 않음을 나타내었다.
B. 생체내에서 PDCD1 넉아웃 세포의 확장 및 지속성
제1 위성 그룹 및 대조군의 마우스로부터 얻은 골수 샘플을 분석하여, 투여된 PDCD1-결실된 세포의 생체내 확장 및 지속성을 평가하였다. 절대 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수(도 33a 및 도 33b) 및 절대 PD1+ T 세포 수(도 34a, 도 34b 및 도 34c)를 유동 세포계측에 의해 결정하였다.
9일째에 골수에서 순환하는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 수에 대한 결과가 각각 도 33a 및 도 33b에 도시되어 있다. 결과는 PDCD1-결실된 CAR+ T 세포가 투여 후 마우스 모델에서 CAR+ 대조군(AAVS1-결실되고, 모의 전기천공된) 세포와 비교하여, 유사한 속도로 확장되고, 지속하였음을 나타내었다. 9일째에 골수에서 관찰된 PD1+ T 세포(CD3+, CD4+ 및 CD8+)의 수가 각각 도 34a, 도34b 및 도34c에 도시되어 있다. 결과는 PDCD1의 PDCD1 결실이 CAR-표적화된 항원을 발현하는 종양을 가진 동물에 투여하고, 생체내에서 확장시킨 후, CAR+ 세포에서 유지되었으며, PD-1-넉아웃 CAR+ T 세포가 투여 후 생체내에서 지속하였다는 결론과 일치하였다.
실시예 17: A549 피하 종양 모델에서 PDCD1 -결실된 CAR-발현 T 세포의 생체내 활성의 평가
NOD/Scid/gc-/-(NSG) 마우스에 높은 수준의 인간 CD19를 발현하도록 조작 된 A549 폐 선암종 세포를 주사함으로써 피하 종양 이종이식 마우스 모델을 발생시켰다. 이 연구에서, 이종이식 모델에서 이들 세포에서의 인간 CD19의 과발현은 고형 종양의 상황에서 CD19-특이적 PDCD1 CAR+ T 세포의 평가를 가능하게 하였다. 추가적으로, A549 폐 선암종 세포가 인터페론 감마 자극에 반응하여 PD-L1을 상향 조절할 수 있다는 별도의 관찰을 기반으로 하여, 이 모델은 종양 환경에서 IFN-감마에 반응하여 PD-L1을 발현할 수 있는 CD19-특이적 PDCD1 CAR+ T 세포의 평가를 가능하게 하였다. 영(O)일째에, A549-huCD19hi 세포를 면역 결핍 NSG 마우스 내에 피하 이식하였다.
시험관내 연구는 CD19 표적 항원과의 상호작용시, T 세포 음성 조절 분자인 PD-1이 항-CD19 CAR-발현 세포를 포함하는 CAR T 세포에서 상향 조절된다는 것을 나타낸다. CD19-발현 종양 세포 상의 PD-L1과 CAR T 세포 상의 PD-1의 상호작용은 CAR T 세포의 활성을 제한할 수 있다. 종양 생착 후, 세 가지(3)의 상이한 치료 그룹의 마우스에 실시예 4에 기재된 바와 같이 발생시킨 다양한 4 x 106개의 항-CD19 CAR-발현 T 세포 집단의 단일 정맥내(i.v.) 주사를 제공하였다: (1) AAVS1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포; (2) PDCD1-결실된 항-CD19 CAR+ T 세포; 및 (3) 결실 또는 전기천공에 적용되지 않은 항-CD19 CAR+ 세포. 어떠한 조작된 T 세포도 주사하지 않은 마우스(종양 단독)를 음성 대조군으로 평가하였다. CAR-T 세포 투여 후 11, 14, 19, 23 및 26일째에 종양 용적을 측정하였다. 그 결과는 도 35에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 각각의 CAR+ 세포 조성물의 투여는 비처리 대조군에서 관찰된 것과 비교하여, 이러한 CD19-과발현 폐 선암종 모델에서 종양 성장을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
본 발명은, 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제공되는 특정의 개시된 구현예에 대한 범위 내로 제한하려는 의도는 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형이 본 명세서의 기재내용 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시내용의 진정한 범위 및 사상을 벗어남이 없이 실시될 수 있으며, 본 개시내용의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

Claims (386)

  1. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는, 조성물.
  2. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 제제는 조성물 중 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 90% 초과에서 상기 유전자 붕괴를 유도하고/하거나, PD-1 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조작된 면역 세포는 그의 표면에 재조합 수용체를 발현하는, 조성물.
  4. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나 감소시키고,
    조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 약 90% 초과는 유전자 붕괴를 함유하고; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접 PDCD1 유전자를 함유하지 않고, PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나, 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
    조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 약 90% 초과는 유전자 붕괴를 함유하고, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
  5. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체로서, 재조합 수용체와 상기 항원의 결합시, 조작된 면역 세포가 세포독성, 증식 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있고, 선택적으로 상기 방지 또는 감소는 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 또는 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과 또는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 초과에서 이루어지는, 조성물.
  6. 조작된 면역 세포의 집단을 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 각각이 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하고, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있고,
    조작된 면역 세포는 평균적으로, 재조합 수용체를 포함하고 유전자 붕괴를 포함하지 않는 조성물 중의 다른 세포에서 상기 재조합 수용체의 평균 발현 및/또는 표면 발현 수준과 각각 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타내거나,
    조작된 면역 세포는 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 평균적으로, 재조합 수용체를 포함하고 PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 조성물의 세포에서 평균 발현 및/또는 표면 수준과 각각 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 수준의 수용체의 발현 및/또는 표면 발현을 나타내는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는, 선택적으로 시험관내 분석, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 포함하는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 항원, 항원을 발현하는 세포 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션 시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 조작된 T 세포를 활성화시키거나 자극할 수 있거나, 면역 세포에 의해 세포독성을 유도할 수 있거나, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 면역 세포는, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재하에, 선택적으로 12, 24, 36, 48, 또는 60시간 동안의 인큐베이션을 선택적으로 포함하고, 선택적으로, 면역 세포를 PD-L1-발현 세포에 노출시키는 단계를 포함하거나 포함하지 않는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 항원, 항원을 발현하는 세포 및/또는 항원-수용체 활성화 물질과의 인큐베이션 시, 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비를 유도할 수 있는, 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비의 수준 또는 정도 또는 지속기간은, 동일한 조건하에 평가하는 경우, 재조합 수용체를 포함하나 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않는 면역 세포에 대해 검출되거나 관찰된 것과 비교하여, 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
  10. 제6항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 결합, 세포독성, 증식, 생존 및/또는 사이토카인 분비는, 선택적으로 회수 및 항원, 항원-발현 세포 및/또는 물질에 재 노출 후 시험관내 분석에서 측정된 바와 같은, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 인간 세포인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 백혈구인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 NK 세포 또는 T 세포인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포를 포함하는 복수의 T 세포를 포함하거나, 단리된 CD8+ 세포를 포함하거나 CD8+ T 세포에 대해 농화되거나, 단리된 CD4+ T 세포를 포함하거나 CD4+ 세포에 대해 농화되고/되거나, 나이브 세포(naive cell), 효과기 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 효과기 기억 세포 및 장기-생존 효과기 기억 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 이들의 하위세트에 대해 농화된, 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는, T 세포, 또는 조성물 중 수용체를 발현하고 유전자 붕괴를 포함하는 T 세포의 백분율은, 상기 조성물과 동일하지만 유전자 붕괴를 함유하지 않거나 또는 PD-1 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 집단과 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중, 비 활성화된 장기-생존 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율은, 선택적으로 면역 세포를 PD-L1에 접촉시키거나 노출시키는 단계의 부재 또는 존재 시와 비교하여, 동일한 조건하에서 평가하는 경우, 조성물 중, 재조합 수용체를 포함하나 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하지 않는 T 세포를 포함하는 표현형을 나타내는 T 세포의 백분율과 비교하여 동일하거나 대략적으로 동일하거나 실질적으로 동일한, 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 표현형은 37℃± 2℃ 또는 약 37℃± 2℃에서 적어도 12시간, 24시간, 48시간, 96시간, 6일, 12일, 24일, 36일, 48일 또는 60일 동안 조성물의 인큐베이션 후, 평가된 바와 같은, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 인큐베이션은 시험관내에서 이루어지는, 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 자극제의 존재 하에 수행되고, 적어도 일부는 선택적으로 최대 1시간, 6시간, 24시간, 또는 48시간의 인큐베이션 동안 이루어지는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제인, 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 자극제는 CD3에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나, 이를 포함하는, 조성물.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 포함하는 T 세포는 CCR7+, 4-1BB+(CD137+), TIM3+, CD27+, CD62L+, CD127+, CD45RA+, CD45RO-, t-betlow, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ 또는 LFA-1+로부터 선택되는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린(mesothelin), CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스(Lewis) Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스(Wilms) 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
  38. 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 (a) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (b) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  39. 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 포함하는, 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(5' anti-Reverse Cap Analog)(ARCA) 캡을 포함하는, 조성물.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9인, 조성물.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 닉카제(nickase)이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 S. 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자인, 조성물.
  48. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9인, 조성물.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있는, 조성물.
  50. 제39항 내지 제46항, 제48항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물:
    Figure pct00092
  52. 제39항 내지 제46항 및 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물:
    Figure pct00093
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 붕괴는 PDCD1 유전자에 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선되어 삽입 및 결실(삽입결실(indel))을 초래하는 이중 가닥 파손의 생산을 포함하는, 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 중 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
    조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
  56. 제4항 또는 제55항에 있어서,
    조성물 중 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나;
    조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 유동 세포계에 의해 평가되는 바와 같이, 조성물 중 세포 또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 90% 또는 적어도 약 90%는 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 조성물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있는, 조성물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포는, 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포에 대해 농화되거나 선택되지 않는, 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포에서 평균적으로 2개 이하, 5개 이하 또는 10개 이하의 다른 유전자가 붕괴되어 있거나, 제제에 의해 붕괴되는, 조성물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 각각의 세포 또는, 조성물 중, 재조합 수용체를 발현하는 각각의 세포의 어떤 다른 유전자도 세포 내에서 붕괴되지 않거나 제제에 의해 붕괴되지 않는, 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 추가로 포함하는, 조성물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 질병 또는 질환을 가진 대상체에 조성물을 투여한 이후 시점에,
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 재조합 수용체를 발현하고 PD-1을 발현하지 않는 세포가 검출 가능하고;
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하는 세포가 검출 가능하고;
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하고 재조합 수용체를 발현하는 세포가 검출 가능한, 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 시점은 투여 후 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주째 또는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주째인, 조성물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 혈액 또는 샘플에서 검출 가능한 상기 세포는 혈액 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 100 세포/마이크로리터의 농도로 존재하고/존재하거나, 혈액 중 T 세포의 적어도 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이상에 상당하는, 조성물.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 조성물을 투여한 후,
    조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되고,
    조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하고 재조합 수용체를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되는, 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 속도 또는 시간은 적어도 1.5배 또는 2배 또는 3배를 초과하거나 적어도 약 1.5배 또는 2배 또는 3배를 초과하는, 조성물.
  68. 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법으로서,
    (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 면역 세포 내로 도입시키는 단계; 및
    (b) (i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를 면역 세포 내로 도입시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  69. 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 방법으로서,
    (i) PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 적어도 하나의 gRNA 또는 (ii) 적어도 하나의 gRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 중 하나를 포함하는 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 유도할 수 있는 제제를, 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 제제는 PDCD1 유전자의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 gRNA 및 Cas9 분자의 적어도 하나의 복합체를 포함하는, 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 제1 상보성 도메인, 제1 상보성 도메인에 상보성인 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은 연결 도메인에 의해 결합되어 있는, 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' 안티 리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함하는, 방법.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 도입은 시험관내에서 세포와 제제 또는 그의 일부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 도입은 전기천공을 포함하는, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 도입은 세포와 제제의 접촉 단계 전에, 그동안 또는 그 후에 또는 전기천공 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서의 도입은 형질도입을 포함하고, 도입은 형질도입 전에, 그동안 또는 그 후에 시험관내에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 (i) IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인, 및/또는 (ii) 선택적으로 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 자극제 또는 활성화제 또는 제제들의 존재하에 이루어지는, 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, (a)에서의 도입은
    형질도입 전에, 20 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 100 U/mL의 농도의 IL-2; 1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 약 10 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
    형질도입 후에, 10 U/mL 내지 200 U/mL, 선택적으로 약 50 U/mL의 농도의 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 약 5 ng/mL의 농도의 IL-7 및/또는 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 선택적으로 약 0.5 ng/mL의 농도의 IL-15와 세포를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션은 독립적으로 최대 24, 36, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 또는 대략 24, 36, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 동안 수행되는, 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션은 독립적으로 24시간 내지 48시간 또는 36시간 내지 48시간 동안 수행되는, 방법.
  82. 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 100,000, 200,000, 300,000, 400,000 또는 500,000개의 세포당 대략 1 마이크로그램의 비율로 제제와 접촉되는, 방법.
  83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    인큐베이션은 30℃± 2℃ 내지 39℃± 2℃의 온도에서 이루어지거나;
    인큐베이션은 적어도 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃ 또는 적어도 약 30℃± 2℃, 32℃± 2℃, 34℃± 2℃ 또는 37℃± 2℃의 온도에서 이루어지는, 방법.
  84. 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃± 2℃에서 이루어지며, 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃± 2℃에서 이루어지는, 방법.
  85. 제68항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서의 도입과 (b)에서의 도입 사이에 세포를 휴지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9인, 방법.
  87. 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQ ID NO: 508), GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQ ID NO: 514), CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQ ID NO: 1533), UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQ ID NO: 579), CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582) 및 CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQ ID NO: 723)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  88. 제68항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 gRNA는 서열 CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQ ID NO: 582)를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  89. 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  90. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 S. 아우레우스 Cas9 분자인, 방법.
  91. 제70항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9인, 방법.
  92. 제70항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 활성 RuvC 도메인 또는 활성 HNH 도메인이 결여되어 있는, 방법.
  93. 제70항 내지 제89항, 제91항 및 제92항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00094
  95. 제70항 내지 제89항 및 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 포함하는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  96. 제94항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00095
  97. 제68항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 붕괴는PDCD1 유전자에 비 상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 수선되어 삽입 및 결실(삽입결실(indel))을 초래하는 이중 가닥 파손의 생성을 포함하는, 방법.
  98. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
  99. 제68항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  100. 제99항에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
  106. 제68항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
  107. 제68항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
  108. 제68항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  112. 제68항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 방법.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
  115. 제68항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 벡터를 인코딩하는 핵산의 도입은 형질도입에 의해 이루어지며, 이는 선택적으로 레트로바이러스 형질도입인, 방법.
  116. 제68항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 대상체로부터의 일차 세포인, 방법.
  117. 제68항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 인간 세포인, 방법.
  118. 제68항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 백혈구인, 방법.
  119. 제68항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 NK 세포 또는 T 세포인, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 면역 세포는 비분획화된 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 T 세포인, 방법.
  121. 제68항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 면역 세포에서 수행되는, 방법.
  122. 제68항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제제를 도입하고 재조합 수용체를 도입한 후, 세포는 (a) 유전자 붕괴를 함유하거나 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 농화되지 않거나 선택되는, 방법.
  123. 제68항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 유전자 붕괴를 함유하거나 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포, (b) 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 (a) 및 (b) 둘 모두에 대해 농화하거나 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  124. 제68항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 37℃± 2℃ 또는 약 37℃± 2℃ 에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 인큐베이션은 1시간 내지 96시간 또는 약 1시간 내지 96시간, 4시간 내지 72시간 또는 약 4시간 내지 72시간, 8시간 내지 48시간 또는 약 8시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간 또는 약 12시간 내지 36시간, 6시간 내지 24시간 또는 약 6시간 내지 24시간, 36시간 내지 96시간 또는 약 36시간 내지 약 또는 96시간까지의 시간 동안 수행되는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 인큐베이션 또는 인큐베이션의 일부는 자극제의 존재하에 수행되는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 자극제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제인, 방법.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 자극제는 CD3 항체에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나 이를 포함하는, 방법.
  129. 제68항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 세포를 약제학적으로 허용 가능한 완충액 중에 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  130. 제68항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나;
    재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는
    세포의 집단을 생산하는, 방법.
  131. 제68항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/이거나;
    재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는
    세포의 집단을 생산하는, 방법.
  132. 제68항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 내의 유전자의 두 대립유전자 모두가 붕괴되어 있는, 방법.
  133. 제68항 내지 제132항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포.
  134. 제68항 내지 제132항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
  135. 제134항에 있어서,
    세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이거나;
    재조합 수용체를 발현하는 세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서,
    세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 1) 유전자 붕괴를 함유하고/함유하거나; 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고/않거나; 인접 PDCD1 유전자, PDCD1 유전자, 및/또는 기능성 PDCD1 유전자를 함유하지 않고/않거나; PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고, 2) 재조합 수용체를 발현하는 둘 모두이고/둘 모두이거나;
    재조합 수용체를 발현하는 세포의 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 초과는 유전자 붕괴를 함유하거나, 내인성 PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나, PD-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 복수의 유전자 조작된 면역 세포.
  137. 제133항의 유전자 조작된 면역 세포 또는 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항의 복수의 유전자 조작된 면역 세포, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 조성물.
  138. 제1항 내지 제67항 및 제137항 중 어느 한 항의 조성물을 질병 또는 질환을 가진 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  139. 제138항에 있어서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
  140. 제138항 또는 제139항에 있어서, 질병 또는 질환은 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병인, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 암 또는 종양은 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종 암, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종(Ewing sarcoma), 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종인, 방법.
  142. 제139항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  143. 제139항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 CD19 또는 BCMA인, 방법.
  144. 제138항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여된 조작된 세포는 투여한 지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 후, PD-1의 발현을 감소시키고/감소시키거나 제거하는, 방법.
  145. 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여된 조작된 세포는 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 동안 대상체에서 지속되는, 방법.
  146. 제138항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 투여한 이후 시점에,
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 재조합 수용체를 발현하고 PD-1을 발현하지 않는 세포가 검출 가능하고;
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하는 세포가 검출 가능하고;
    대상체의 혈액 또는 대상체로부터의 혈액 유래 샘플 또는 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에서 유전자 붕괴를 함유하고 재조합 수용체를 발현하는 세포가 검출 가능한, 방법.
  147. 제138항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 시점은 투여 후 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주째 또는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주째인, 방법.
  148. 제138항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 또는 샘플에서 검출 가능한 상기 세포는 혈액 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 100 세포/마이크로리터의 농도로 존재하고/존재하거나 혈액 중 T 세포의 적어도 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%에 상당하는, 방법.
  149. 제138항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 투여한 후,
    조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되고,
    조성물 중, 유전자 붕괴를 포함하고 재조합 수용체를 포함하는 세포는, 적어도 조성물 중 유전자가 붕괴되지 않은 T 세포의 확장 및/또는 지속 및/또는 T 세포가 재조합 수용체를 발현하나 결실을 포함하지 않는 참조 조성물의 T 세포의 확장 및/또는 지속만큼 우수한, 선택적으로는 이를 초과하는 속도로 및/또는 시간 동안 대상체에서 확장 및/또는 지속되는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 속도 또는 시간은 적어도 1.5배 또는 2배 또는 3배 더 큰 또는 적어도 약 1.5배 또는 2배 또는 3배 더 큰, 방법.
  151. 제140항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 고형 종양인, 방법.
  152. 제140항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 B 세포-유래 종양이 아니고/아니거나, 백혈병이 아니고/아니거나, 림프종이 아닌, 방법.
  153. 제140항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 그의 세포는 PD-1에 대한 리간드를 발현하거나 발현하는 것으로 관찰된, 방법.
  154. (a) 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 PDCD1 유전자의 유전자 붕괴를 포함하는 조작된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 유전자 붕괴는 상기 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 방지하거나 감소시키고, 조작된 세포는 대상체에 투여하기 전에 PD-1의 감소되고/감소되거나 제거된 발현의 표현형을 가지며 상기 세포는 대상체에 투여한 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 동안 상기 표현형을 유지하는, 약제학적 조성물.
  155. 대상체에서 질병 또는 질환의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제67항, 제137항 및 제154항 중 어느 한 항의 조성물.
  156. 제155항에 있어서, 재조합 수용체는 질병 또는 질환과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는, 상기 용도를 위한 조성물.
  157. 제155항 또는 제156항에 있어서, 질병 또는 질환은 암, 종양, 자가면역 질병 또는 장애, 또는 감염성 질병인, 상기 용도를 위한 조성물.
  158. 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 질환은 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종 암, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종인 암 또는 종양인, 상기 용도를 위한 조성물.
  159. 제155항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 용도를 위한 조성물.
  160. 제155항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 CD19 또는 BCMA인, 상기 용도를 위한 조성물.
  161. 제155항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 조성물을 투여한 후,
    투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상의 시점에, 유전자 붕괴를 함유하고, 선택적으로 재조합 수용체를 함유하는 하나 이상의 세포가 대상체의 조직 또는 생물학적 샘플에 지속되고/지속되거나 검출 가능하고/검출 가능하거나;
    투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 1개월, 2개월 이상의 시점에, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 조직에서 검출 가능한 T 세포, 또는 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 또는 90%가 유전자 붕괴를 함유하는, 상기 용도를 위한 조성물.
  162. T 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포를 변경시키는 방법으로서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 방법.
  163. T 세포와 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포를 변경시키는 방법으로서, 각각의 복합체가 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 방법.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것인, 방법.
  165. 제164항에 있어서, 암은 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프모구 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신장 세포 암종(RCC), 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  166. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는, 암을 가지거나 그렇지 않으면, PDCD1 유전자의 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이로부터 이점을 얻을 수 있는 대상체로부터 유래한 것인, 방법.
  167. 제162항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 생체외에서 수행되는, 방법.
  168. 제162항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 재조합 수용체를 포함하는, 방법.
  169. 제162항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 조건하에 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산과 T 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  170. 제168항 또는 제169항에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
  171. 제168항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  172. 제171항에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  173. 제172항에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
  174. 제172항 또는 제173항에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
  175. 제172항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
  176. 제172항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
  177. 제176항에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
  178. 제168항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
  179. 제171항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
  180. 제168항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  181. 제180항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  182. 제180항 또는 제181항에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
  183. 제182항에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  184. 제164항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀되는, 방법.
  185. 제162항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래한 것이며, 접촉은 생체외에서 수행되고 변경된 T 세포는 접촉 단계 후 대상체의 체내로 복귀되는, 방법.
  186. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 접촉 전에 형성되는, 방법.
  187. 제163항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 접촉 전에 형성되는, 방법.
  188. 제162항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  189. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  190. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  191. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  192. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  193. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  194. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  195. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  196. 제188항에 있어서, gRNA 분자(들)는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  197. 제162항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 그들의 5' 말단에서 변형되거나 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
  198. 제162항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 그들의 5' 말단에서 변형되고 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
  199. 제197항 또는 제198항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 방법.
  200. 제197항 또는 제198항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함하는, 방법.
  201. 제200항에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  202. 제200항에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  203. 제197항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
  204. 제197항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
  205. 제203항 또는 제204항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 방법.
  206. 제205항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, 방법.
  207. 제205항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 방법.
  208. 제162항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기 천공을 통해 T 세포 내로 전달되는, 방법.
  209. 제163항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기 천공을 통해 T 세포 내로 전달되는, 방법.
  210. 제162항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  211. 제210항에 있어서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
  212. 제162항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  213. 제212항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  214. 제162항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00096
  215. 제162항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  216. 제215항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  217. 제162항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, 방법.
  218. 제162항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00097
  219. 제162항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 방법.
  220. 제219항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00098
  221. 제162항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 모듈 gRNA 분자(들)인, 방법.
  222. 제162항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)인, 방법.
  223. 제222항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
  224. 제222항 또는 제223항에 있어서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
  225. 제210항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 60%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
  226. 제210항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 80%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
  227. 제210항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 90%의 절단 효율을 특징으로 하는, 방법.
  228. 제210항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 5개 미만의 비표적(off-target)을 특징으로 하는, 방법.
  229. 제210항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 2개 미만의 엑손 비표적을 특징으로 하는, 방법.
  230. 제228항 또는 제229항에 있어서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인되는, 방법.
  231. 제228항 또는 제229항에 있어서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인되는, 방법.
  232. Cas9 분자/gRNA 분자 복합체로서, gRNA 분자는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  233. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  234. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  235. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  236. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  237. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  238. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  239. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  240. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  241. 제232항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  242. 제232항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  243. 제242항에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  244. 제242항에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  245. 제244항에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  246. 제244항에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  247. 제232항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  248. 제232항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  249. 제247항 또는 제248항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  250. 제249항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  251. 제249항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  252. 제232항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  253. 제252항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  254. 제232항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
    Figure pct00099
  255. 제232항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  256. 제255항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  257. 제232항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  258. 제232항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
    Figure pct00100
  259. 제232항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  260. 제259항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체:
    Figure pct00101
  261. 제232항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  262. 제232항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  263. 제262항에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  264. 제262항 또는 제263항에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체.
  265. 적어도 2개의 Cas9 분자/gRNA 복합체를 포함하는 조성물로서, 각각의 복합체는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  266. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  267. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  268. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  269. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  270. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  271. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  272. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  273. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  274. 제265항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 조성물.
  275. 제265항 내지 제741항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, 조성물.
  276. 제275항에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 조성물.
  277. 제275항에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
  278. 제277항에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  279. 제277항에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  280. 제265항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 조성물.
  281. 제265항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 조성물.
  282. 제280항 또는 제281항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 조성물.
  283. 제282항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, 조성물.
  284. 제282항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 조성물.
  285. 제265항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
  286. 제285항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
  287. 제265항 내지 제286항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00102
  288. 제265항 내지 제287항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 조성물.
  289. 제288항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 조성물.
  290. 제265항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는, 조성물.
  291. 제265항 내지 제290항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00103
  292. 제265항 내지 제291항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 조성물.
  293. 제292항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00104
  294. 제265항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, 조성물.
  295. 제265항 내지 제294항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, 조성물.
  296. 제295항에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 조성물.
  297. 제295항 또는 제296항에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 조성물.
  298. PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자로서, 그의 5' 말단에서 변형되어 있고/있거나, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자.
  299. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 555, 563 내지 1516, 1517 내지 3748, 14657 내지 16670, 및 16671 내지 21037 중 임의의 것으로부터의 표적화 도메인과 동일하거나, 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  300. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 563 내지 1516으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  301. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1517 내지 3748로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  302. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 14657 내지 16670으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  303. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 16671 내지 21037로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  304. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 481 내지 500 및 508 내지 547로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  305. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 501 내지 507 및 548 내지 555로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  306. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 514, 576, 579, 582, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  307. 제298항에 있어서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 508, 510, 511, 512, 514, 576, 579, 581, 582, 766, 및 723으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  308. 제298항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 그의 5' 말단에서 변형되어 있는, gRNA 분자.
  309. 제308항에 있어서, gRNA 분자는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, gRNA 분자.
  310. 제308항에 있어서, gRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, gRNA 분자.
  311. 제310항에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA 분자.
  312. 제310항에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA 분자.
  313. 제298항 내지 제312항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, gRNA 분자.
  314. 제298항 내지 제312항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, gRNA 분자.
  315. 제313항 또는 제314항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, gRNA 분자.
  316. 제315항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, gRNA 분자.
    [청구항 316]
    제315항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
  317. 제298항 내지 제316항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 S. 피오게네스 gRNA 분자인, gRNA 분자.
  318. 제298항 내지 제317항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, gRNA 분자:
    Figure pct00105
  319. 제318항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, gRNA 분자:
    Figure pct00106
  320. 제318항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, gRNA 분자:
    Figure pct00107
  321. 제318항에 있어서, 표적화 도메인은 다음의 표적화 도메인 그룹으로부터 선택되는, gRNA 분자:
    Figure pct00108
  322. 제298항 내지 제321항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인, gRNA 분자.
  323. 제298항 내지 제322항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, gRNA 분자.
  324. 제323항에 있어서, gRNA 분자는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  325. 제323항 또는 제324항에 있어서, gRNA 분자는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, gRNA 분자.
  326. 이식을 위한 세포를 제조하는 방법으로서, 세포와 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하고, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 내의 gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  327. 제326항에 있어서, gRNA 분자(들)는 PDCD1 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여 적어도 40%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
  328. 제327항에 있어서, 절단 효율은 표지된 항-PDCD1 항체 및 유동 세포계측 분석을 사용하여 측정되는, 방법.
  329. 제326항 내지 제328항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 말단에서 변형되거나 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
  330. 제326항 내지 제328항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 그들의 5' 말단에서 변형되고 3' 폴리A 꼬리를 포함하는, 방법.
  331. 제329항 또는 제330항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있는, 방법.
  332. 제329항 또는 제330항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5' 캡을 포함하는, 방법.
  333. 제332항에 있어서, 5' 캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 gRNA 분자의 나머지에 연결된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  334. 제332항에 있어서, 5' 캡은 선택적으로 변형된 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 연결된 2개의 선택적으로 변형된 구아닌 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  335. 제329항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 10개 내지 약 30개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
  336. 제329항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리는 약 20개의 아데닌 뉴클레오타이드로 구성된, 방법.
  337. 제335항 또는 제336항에 있어서, 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 gRNA 분자(들)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조된, 방법.
  338. 제337항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드이고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아닌, 방법.
  339. 제337항에 있어서, 표적화 도메인의 5' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드가 아니고, DNA 주형은 표적화 도메인에 상응하는 서열의 바로 상류에 위치한 T7 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터 서열의 3' 뉴클레오타이드는 구아닌 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드의 하류에 존재하는 구아닌 뉴클레오타이드인, 방법.
  340. 제326항 내지 제339항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 전기천공을 통해 세포 내로 전달되는, 방법.
  341. 제326항 내지 제340항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 단일 gRNA 분자에 의해 가이드되어 단일 이중 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  342. 제341항에 있어서, Cas9 분자는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  343. 제326항 내지 제342항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 gRNA 분자는 다음의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00109
  344. 제326항 내지 제343항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 닉카제이고, 2개의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되어 표적 도메인의 반대쪽 가닥에 2개의 단일 가닥 파손을 갖는 표적 도메인을 절단하는, 방법.
  345. 제326항 내지 제344항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 D10A 돌연변이를 갖는 S. 피오게네스 Cas9 분자인, 방법.
  346. 제326항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00110
  347. 제326항 내지 제346항 중 어느 한 항에 있어서, S. 피오게네스 Cas9 분자는 N863A 돌연변이를 갖는, 방법.
  348. 제347항에 있어서, 2개의 gRNA 분자는 다음 쌍의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는, 방법:
    Figure pct00111
  349. 제326항 내지 제348항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 모듈 gRNA 분자(들)인, 방법.
  350. 제326항 내지 제349항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 키메라 gRNA 분자(들)인, 방법.
  351. 제350항에 있어서, gRNA 분자(들)는 5'에서 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
  352. 제350항 또는 제351항에 있어서, gRNA 분자(들)는 25개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 연결 도메인 및, 합쳐서 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이의 근위 및 꼬리 도메인을 포함하는, 방법.
  353. 제326항 내지 제352항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여 적어도 60%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
  354. 제326항 내지 제352항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여 적어도 80%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
  355. 제326항 내지 제352항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자(들)는 Cas9 분자를 가이드하여 적어도 90%의 절단 효율로 표적 도메인을 절단시키는, 방법.
  356. 제326항 내지 제355항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 5개 미만의 비표적을 생성하는, 방법.
  357. 제326항 내지 제356항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 2개 미만의 엑손 비표적을 생성하는, 방법.
  358. 제356항 또는 제357항에 있어서, 비표적은 GUIDE-seq에 의해 확인되는, 방법.
  359. 제356항 또는 제357항에 있어서, 비표적은 Amp-seq에 의해 확인되는, 방법.
  360. 제326항 내지 제359항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 생체외에서 수행되는, 방법.
  361. 제326항 내지 제360항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 면역 세포인, 방법.
  362. 제361항에 있어서, 세포는 림프구 또는 항원 제시 세포인, 방법.
  363. 제362항에 있어서, 세포는 T 세포, B 세포 또는 항원 제시 세포인, 방법.
  364. 제326항 내지 제363항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포인, 방법.
  365. 제326항 내지 제364항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 재조합 수용체를 포함하는, 방법.
  366. 제326항 내지 제365항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 조건하에 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산과 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  367. 제365항 또는 제366항에 있어서, 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR인, 방법.
  368. 제365항 내지 제367항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  369. 제368항에 있어서, CAR은 항체 또는 항체 단편인 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  370. 제369항에 있어서, 항체 단편은 단일 사슬 단편인, 방법.
  371. 제369항 또는 제370항에 있어서, 항체 단편은 가요성 면역글로불린 링커에 의해 결합된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
  372. 제369항 내지 제371항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
  373. 제369항 내지 제372항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 질병 또는 장애와 관련된 것인, 방법.
  374. 제373항에 있어서, 질병 또는 장애는 감염성 질병 또는 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암인, 방법.
  375. 제365항 내지 제374항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하는, 방법.
  376. 제369항 내지 제375항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아 종양 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1), BCMA 및 인터루킨 12로부터 선택되는, 방법.
  377. 제365항 내지 제376항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  378. 제377항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  379. 제377항 또는 제378항에 있어서, 재조합 수용체는 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는, 방법.
  380. 제379항에 있어서, 공자극 신호전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  381. 제162항 내지 제231항 및 제326항 내지 제380항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 T 세포.
  382. 제232항 내지 제264항 중 어느 한 항의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 포함하는 T 세포.
  383. 제265항 내지 제297항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 T 세포.
  384. 제381항 내지 제383항 중 어느 한 항의 T 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  385. 요법에 사용하기 위한, 제232항 내지 제264항 중 어느 한 항의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체, 제265항 내지 제297항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제381항 내지 제383항 중 어느 한 항의 T 세포.
  386. 암 치료를 위한 약제의 제조에서의 제232항 내지 제264항 중 어느 한 항의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 또는 제265항 내지 제297항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
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