KR20220118498A - 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집된 세포의 생체 내 검출을 위한 캐스케이드/dcas3 상보 검정 - Google Patents

핵산-가이드된 뉴클레아제 편집된 세포의 생체 내 검출을 위한 캐스케이드/dcas3 상보 검정 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 핵산 가이드된 편집을 이용할 때 생체 내 편집된 세포를 식별할 수 있게 하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 편집 및 선택 방법을 수행하고, 조성물을 사용하기 위한 자동화된 다중-모듈 기기가 제공된다.

Description

핵산-가이드된 뉴클레아제 편집된 세포의 생체 내 검출을 위한 캐스케이드/DCAS3 상보 검정
관련 출원에 대한 교차 참조
[0001] 이 국제 PCT 출원은 2019년 12월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/949,472에 대한 우선권을 주장하며 참조로 포함된다.
발명의 분야
[0002] 본 개시내용은 핵산 가이드된 편집을 이용할 때 세포에 존재하는 의도된 편집 서열과 같은 특정 핵산 서열의 생체 내 식별을 허용하는 방법 및 조성물은 물론 편집 및 선택 방법을 수행하기 위한 자동화된 다중-모듈 기기에 관한 것이다.
발명의 배경
[0003] 다음 논의에서 배경 및 도입 목적으로 특정 물품 및 방법에 대해 설명될 것이다. 여기에 포함된 어떤 것도 선행 기술의 "인정"으로 해석되어서는 안된다. 출원인은 적절한 경우 여기에 언급된 물품 및 방법이 해당 법률 조항에 따라 선행 기술을 구성하지 않음을 입증할 권리를 명시적으로 보유한다.
[0004] 생 세포의 게놈에 정확하고 표적화된 변화를 만드는 능력은 생물의학 연구 및 개발에서 오랜 목표였다. 최근에, 유전자 서열 및 이에 따른 유전자 기능의 조작을 허용하는 다양한 뉴클레아제가 확인되었다. 뉴클레아제는 핵산-가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 이는 연구원이 생 세포에서 영구적인 편집을 생성할 수 있게 한다. 물론, 생성된 세포 집단에서 적절하게 편집된 세포를 식별할 수 있는 것이 바람직하다; 그러나, 많은 경우에 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집으로 인한 편집된 세포의 백분율은 한 자리수일 수 있다.
[0005] 따라서, 적절하게 편집된 세포의 생체 내 신속하고 정확한 식별을 위해 개선된 방법, 조성물, 모듈 및 기기에 대한 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 기술이 요구된다. 본 개시는 이러한 요구를 다룬다.
발명의 개요
[0006] 이 개요는 하기의 상세한 설명에서 추가로 설명되는 단순화된 형식으로 개념 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 개요는 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 확인하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범위를 제한하기 위한 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부사항, 유용성 및 이점은 첨부된 도면에 예시되고 첨부된 청구범위에 정의된 양태를 포함하는 하기 기록된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
[0007] 본 개시내용은 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집된 세포를 생성하고, 세포의 대부분 - 및 아마도 대다수-이 편집되지 않은 생성된 세포 집단에서 적절하게 편집된 세포를 생체 내에서 식별하도록 하는 방법, 조성물, 모듈 및 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 관한 것이다. 본 방법 및 조성물은 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 사용하는 분할 단백질 리포터 시스템을 사용한다. 분할 단백질 리포터 시스템은 캐스케이드 복합 표적 인식 시 Cas3 (CAS3) 모집의 자연 메커니즘을 활용한다. 캐스케이드 복합체에 대한 Cas3의 모집은 특정 DNA 서열, 이 경우 원하는 편집을 포함하는 DNA 서열에 대한 캐스케이드 복합체의 고충실도 표적화에 특이적인 세포내 신호 증폭 이벤트를 개시한다. 분할 단백질의 절반을 탈활성화된 Cas3(dCas3)에 부착시키고 분할 단백질의 나머지 절반을 캐스케이드의 단백질 구성요소에 부착시킴으로써, 분할 단백질의 두 반쪽은 캐스케이드 복합체(예를 들어, 캐스케이드 및 crRNA)가 구별되는 R-루프를 형성하고 올바른 표적 DNA 서열과 복합체를 형성할 때만 함께 나타나는 시스템이 생성된다. 일 구현예에서, 분할 단백질은 T7 RNA 중합효소(T7 RNAP)이다. 캐스케이드 복합체 융합 및 표적 서열(예를 들어, 의도된 편집)의 인식시 및 탈활성화된 Cas3-N-말단 T7 RNAP 융합 단백질의 모집 시, 분할 T7 RNAP의 두 반쪽이 근접하게 되어 활성 T7 중합효소를 발생시킨다. 활성 T7 중합효소는 예를 들어, T7 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 전사할 수 있으며, 이는 결국 의도된 편집으로 세포 집단의 분리를 허용한다.
[0008] 따라서, 본원의 일 구현예에서, 벡터 백본에서 캐스케이드-T7-RNAP 융합 단백질 코딩 서열; 벡터 백본에서 dCas3-T7-RNAP 융합 단백질 코딩 서열; 벡터 백본에서 편집-구별(또는 "편집-표적화") gRNA에 대한 서열로서, 편집-구별(또는 "편집-표적화") gRNA가 게놈 서열에서 합리적으로 설계되고 편집된 유전자좌는 인식하나, 편집되지 않거나 잘못 편집된 상태의 게놈 서열의 유전자좌는 인식하지 못하는, 편집-구별 gRNA에 대한 서열; 및 T7 프로모터의 제어하에 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템이 제공된다. 일부 양태에서, 캐스케이드-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열은 (타입 I-C 시스템에서) cas5c의 C-말단 또는 (타입 I-E 시스템에서) cse1 또는 casA의 C-말단 및 T7 RNAP의 C-말단 (예를 들어, 아미노산 181-883)을 포함하는 반면, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열은 dCas3의 N-말단 및 T7-RNAP의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 1-179)을 포함한다. 대안적으로 일부 양태에서, 캐스케이드-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열은 (타입 I-C 시스템에서) cas5c의 N-말단 또는 (타입 I-E 시스템에서) cse1 또는 casA의 N-말단 및 T7 RNAP의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 1-179)을 포함하는 반면, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열은 dCas3의 C-말단 및 T7-RNAP의 C-말단 (예를 들어, 아미노산 181-883)을 포함한다. 일부 양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질에 대한 코딩 서열이고, 일부 양태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 또는 청색 형광 단백질이다. 또 다른 양태에서, 리포터 유전자는 루시퍼라제에 대한 코딩 서열이고, 일부 양태에서, 루시퍼라제는 반딧불이 루시퍼라제 또는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제이다. 또 다른 양태에서, 리포터 유전자는 브로콜리 또는 시금치 RNA 앱타머를 인코딩한다. 또 다른 양태에서, 리포터 유전자는 항생제 내성 유전자에 대한 코딩 서열이다. 또 다른 양태에서, 리포터 유전자는 세포 표면 수용체 단백질에 대한 코딩 서열이다.
[0009] 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 일부 양태에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질 코딩 서열, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질 코딩 서열, 편집-구별 gRNA에 대한 서열, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열은 모두 동일한 벡터에 있고, 대안적 양태에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질 코딩 서열, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질 코딩 서열, 편집-구별 gRNA에 대한 서열, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열은 2개 이상의 상이한 벡터에 존재한다.
[0010] 또 다른 구현예는 벡터 백본에서 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질 코딩 서열; 벡터 백본에서 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질 코딩 서열; 벡터 백본에서 편집-구별 gRNA에 대한 서열로서, 편집-구별 gRNA는 게놈 서열에서 합리적으로 설계되고 편집된 유전자좌는 인식하나, 편집되지 않거나 잘못 편집된 상태의 게놈 서열의 유전자좌는 인식하지 못하는, 편집-구별 gRNA에 대한 서열; 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하는 세포를 제공한다.
[0011] 또 다른 구현예는, 핵산-가이드된 뉴클레아제, 게놈 유전자좌에 상동인 gRNA 및 게놈 유전자좌에 상동인 공여자 DNA를 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 구성요소로 세포를 형질전환시키는 단계; 벡터 백본에서 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질 코딩 서열, 벡터 백본에서 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질 코딩 서열, 벡터 백본에서 편집-구별 gRNA에 대한 서열로서, 편집-구별 gRNA는 게놈 서열에서 합리적으로 설계되고 편집된 유전자좌를 인식하나, 편집되지 않거나 잘못 편집된 상태의 게놈 서열의 유전자좌를 인식하지 못하는, 편집-구별 gRNA에 대한 서열, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템으로 세포를 형질전환시키는 단계; 핵산-가이드된 뉴클레아제, gRNA 및 공여자 DNA가 세포에서 게놈 유전자좌를 편집하도록 허용하는 단계; 캐스케이드-T7-RNAP-C 말단 융합 단백질 코딩 서열, 편집-구별 gRNA 및 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질 코딩 서열이 편집된 게놈 유전자좌에 결합하도록 허용하여 T7 RNAP 활성을 재구성하는 단계; 및 T7 RNAP를 T7 프로모터에 결합시키고 활성화시키기 위한 조건을 제공하여 리포터 유전자를 전사하는 단계를 포함하는, 편집된 세포의 생체 내 식별을 위한 방법을 제공한다.
[0012] 본 발명의 이러한 양태 및 다른 특징 및 이점은 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
도면의 간단한 설명
[0013] 본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취해진 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 완전히 이해될 것이다:
[0014] 도 1a는 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질, 편집-구별(또는 "편집-표적화") gRNA 및 리포터 유전자(종합적으로 "분할 단백질 리포터 시스템")를 사용하여 타입 I 핵산-가이드된 뉴클레아제 선택을 수행하기 위한 단순 처리 다이아그램이다. 도 1b는 분활 단백질 시스템의 구성요소의 간략화된 개략도이며, 여기서 편집-구별 (또는 편집-표적화) gRNA와 복합되는 캐스케이드-T7-RNAP-C 말단 단백질은 야생형(예를 들어, 비편집된) 게놈 표적 서열에 결합하지 않는다. 도 1c는 분할 단백질 시스템의 구성요소의 단순화된 개략도이며, 여기서 편집된 게놈 표적 서열이 존재하나, 편집은 원하는 의도된 편집이 아니다. 따라서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합물과 복합되는 편집-구별 gRNA 전사체는 게놈 표적 서열을 인식하여 결합하지 못하며, 캐스케이드 복합체를 형성하지 못하고, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질을 잘못 편집된 표적 게놈 서열에 모집하지 못한다. 도 1d는 분할 단백질 시스템의 구성요소의 단순화된 개략도이며, 여기서 적절하게 편집된 게놈 표적 서열이 존재하며, 적절하게 편집된 게놈 표적 서열과 결합하는 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합물과 복합되는 편집-구별 gRNA 전사체는 활성 R-루프를 형성하고, 이에 의해 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질이 편집된 게놈 서열에 모집된다. dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질의 모집은 T7 RNAP 단백질의 N-말단 및 C-말단 부분이 기능적 근접성을 이루게 한다.
[0015] 도 2a-2c는 분할 단백질 리포터 시스템을 사용하여 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 수행하기 위한 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 3개의 상이한 도면을 묘사한다.
[0016] 도 3a는 본원에 설명된 세포 성장 모듈과 함께 그리고 도 3b-3d와 관련하여 사용하기 위한 회전 성장 바이알의 일 구현예를 묘사한다. 도 3b는 세포 성장 모듈 하우징 내의 회전 성장 바이알의 일 구현예의 사시도를 예시한다. 도 3c는 도 3b로부터의 세포 성장 모듈의 단면도를 묘사한다. 도 3d는 LED, 검출기 및 온도 조절 구성요소에 결합된 도 3b의 세포 성장 모듈을 예시한다.
[0017] 도 4a는 접선 유동 여과 모듈(예를 들어, 세포 성장 및/또는 농축 모듈)에 사용하기 위한 보유물(상단) 및 투과물(하단) 부재뿐만 아니라 접선 유동 조립체로 조립된 보유물 및 투과물 부재(하단)를 도시한다. 도 4b는 접선 유동 여과 모듈의 저장소 조립체의 2개의 측면 사시도를 도시한다. 도 4c-4d는 도 4b에 제시된 저장소 조립체에 적합한 유체 및 공압 포트 및 개스킷을 갖는 예시적인 상부를 도시한다.
[0018] 도 5a는 다중-모듈 세포 처리 기기에 사용될 수 있는 예시적인 조합 시약 카트리지 및 전기천공 장치(예를 들어, 형질전환 모듈)을 묘사한다. 도 5b는 시약 카트리지의 일부일 수 있는 예시적인 관통형(flow-through) 전기천공 장치의 일 구현예의 상부 사시도이다. 도 5c는 시약 카트리지의 일부일 수 있는 예시적인 관통형 전기천공 장치의 일 구현예의 하부 사시도를 묘사한다. 도 5d-5f는 도 2a-2c에 제시된 것과 같은 다중-모듈 자동화 세포 처리 기기에 유용한 FTEP 장치의 상부 사시도, 횡단면의 평면도 및 횡단면의 측면 사시도를 도시한다.
[0019] 도 6a는 고체 벽 장치에서 세포를 단일화하고, 편집하고, 정상화하기 위한 워크플로우의 단순화된 그래픽을 묘사한다. 도 6b는 고체 벽 장치에서 세포를 실질적으로 단일화하고, 편집하고, 정상화하기 위한 워크플로우 변동의 단순화된 그래픽을 묘사한다. 도 6c-6e는 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정상화(SWIIN) 모듈의 구현예를 묘사한다. 도 6f는 히터 및 가열된 커버를 추가로 포함하는 도 6c-6e의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다.
[0020] 도 7은 본원에 기술된 분할 단백질 리포터 시스템이 사용될 수 있는 예시적인 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기의 구현예의 단순화된 처리 다이어그램이다.
[0021] 도 8a - 8d는 E. 콜라이에서 분할 단백질 리포터 시스템을 테스트하기 위한 예시적인 벡터 맵을 포함한다.
[0022] 도면은 반드시 축척에 맞출 필요는 없으며, 유사한 참조 번호는 유사한 특징을 지칭함이 이해되어야 한다.
상세한 설명
[0023] 본원에 설명된 방법, 장치 또는 기기의 일 구현예와 관련하여 설명된 모든 기능은 명시적으로 언급되거나 특징 또는 기능이 추가 구현예와 양립되지 않는 경우를 제외하고는 본원에 설명된 방법, 장치 및 기기의 추가 구현예에 적용 가능하도록 의도된다. 예를 들어, 제공된 특징 또는 기능이 일 구현예와 관련하여 명시적으로 설명되지만 대안적인 구현예와 관련하여 명시적으로 언급되지 않은 경우, 상기 특징 또는 기능은 이러한 특징 또는 기능이 대안적인 구현예와 비양립되지 않는 한 대안적인 구현예와 관련하여 배치되거나, 이용되거나, 구현될 수 있음이 이해되어야 한다.
[0024] 본원에 설명된 기술의 실시는 달리 명시하지 않는 한 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 세포생물학, 생화학, 및 유전 공학 기술의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있으며, 이는 당업자의 기술 범위 내이다. 상기 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., (2017); Neumann, et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, 1989; and Chang, et al., Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, California (1992)]과 같은 표준 실험실 메뉴얼에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 전체내용이 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 기술은, 예를 들어, 문헌[Genome Editing and Engineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery, Appasani and Church (2018); 및 CRISPR: Methods and Protocols, Lindgren and Charpentier (2015)]에서 발견될 수 있으며, 이들 둘 모두는 전체내용이 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.
[0025] 본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것을 유의한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포를 지칭하고, "시스템"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계, 방법 및 장치에 대한 언급을 포함하고, 그 밖에도 마찬가지이다. 또한, 본원에서 사용될 수 있는 "좌측", "우측", "상부", "하부", "전면", "후면", "측면", "높이", "길이", "폭", "상단", "하단", "내부", "외부", "내면", "외면"과 같은 용어는 단지 참조 포인트를 설명하고, 본 발명의 개시의 구현예를 임의의 특정 배향 또는 구성으로 반드시 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 더욱이, "제1", "제2", "제3" 등과 같은 용어는 단지 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 구성요소, 단계, 작업, 기능 및/또는 참조 포인트 중 하나를 식별하고, 마찬가지로 본 발명의 개시의 구현예를 임의의 특정 구성 또는 배향으로 반드시 제한하는 것은 아니다.
[0026] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 이전에 설명된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 제형 및 방법을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 참조로서 포함된다.
[0027] 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 사이에 존재하는 값 및 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 사이에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한이 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
[0028] 하기 설명에서, 본 발명의 더욱 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 본 발명을 불명료하게 하는 것을 피하기 위해 당업자에게 널리 공지된 특징 및 절차는 설명되지 않았다. 본원에서 사용되는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 평범하고 일반적인 의미를 갖는 것으로 의도된다.
[0029] 본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 뉴클레오티드 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 지칭하며, 구체적으로 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결된 티민 또는 우라실 잔기 및 3개의 수소 결합에 의해 연결된 시토신 및 구아닌 잔기와 함께 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 핵산은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성 백분율" 또는 "상동성 백분율"을 갖는 것으로 설명된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개의 뉴클레오티드 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개가 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적임을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TAGCTG-3'의 영역에 100% 상보적이다.
[0030] 용어 "캐스케이드" 또는 "캐스케이드 이펙터"는 타입 I CRISPR-Cas 시스템의 단백질 이펙터 복합체를 지칭한다. 용어 "캐스케이드 복합체"는 crRNA를 추가로 포함하는 캐스케이드 이펙터 복합체를 지칭한다.
[0031] 용어 DNA "조절 서열"은 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 서열, 아데닐중합체형성 신호, 전사 종료 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위, 핵 국소화 서열, 인핸서 등을 집합적으로 나타낸다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, (일부 구성요소의 경우) 번역될 수 있는 한 이들 유형의 조절 서열 모두가 존재할 필요는 없다.
[0032] 본원에서 사용되는 용어 "공여자 DNA" 또는 "공여자 핵산"은 핵산 가이드된 뉴클레아제를 사용한 상동성 재조합에 의해 DNA 서열 변형(삽입, 결실, 치환)을 유전자좌(예를 들어, 표적 게놈 DNA 서열 또는 세포 표적 서열)에 도입하도록 설계된 핵산을 지칭한다. 상동성 지시된 복구를 위해, 공여자 DNA는 "절단 부위" 또는 게놈 표적 서열에서 편집될 부위에 측접한 영역에 대해 충분한 상동성을 가져야 한다. 상동성 아암(들)의 길이는, 예를 들어, 이루어질 변형의 유형 및 크기에 좌우될 것이다. 많은 경우에 바람직하게는, 공여자 DNA는 게놈 표적 유전자좌에 대해 서열 상동성의 2개의 영역(예를 들어, 2개의 상동성 아암)을 가질 것이다. 바람직하게는, "삽입" 영역 또는 "DNA 서열 변형" 영역(세포에서 게놈 표적 유전자좌로 도입되기를 원하는 핵산 변형)은 상동성의 두 영역 사이에 위치될 것이다. DNA 서열 변형은 하나의 특정 부위 또는 다수의 특정 부위에서 표적 게놈 DNA 서열의 하나 이상의 염기를 변경할 수 있다. 변경은 게놈 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 결실 또는 삽입은 게놈 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍의 결실 또는 삽입일 수 있다.
[0033] 용어 "가이드 핵산" 또는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 1) 게놈 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산-가이드된 뉴클레아제와 상호작용하거나 이와 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
[0034] "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 본 발명의 개시의 맥락에서 더욱 흔히 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 게놈 DNA 서열과 어느 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 나타낸다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다.
[0035] "작동 가능하게 연결된"은 이렇게 설명된 구성요소가 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 나타낸다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 사이에 존재하는 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 사실, 상기 서열은 동일한 연속 DNA 분자(즉, 염색체)에 존재할 필요가 없으며, 여전히 상호작용을 가질 수 있어 변경된 조절을 발생시킬 수 있다.
[0036] 본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용된다. 단백질은 전적으로 아미노산으로 구성되거나 구성되지 않을 수 있다.
[0037] "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 RNA 중합효소에 결합하고, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 작은 핵 또는 핵소체 RNA, 가이드 RNA, 또는 임의의 부류의 임의의 RNA 중합효소 I, II 또는 III에 의해 전사되는 임의의 종류의 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 항시성이거나 유도성일 수 있다.
[0038] 본원에 사용된 "리포터 유전자"는 유전자 발현 및 기타 세포 이벤트에 대한 지표로서 사용되는 유전자, 예컨대, 루시퍼라제 또는 형광 단백질을 코딩하는 유전자이다. 현재 문맥에서 리포터 유전자는 게놈 편집을 위한 프록시로 사용된다.
[0039] 본원에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는 세포로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적으로 사용되는 선택 가능한 마커는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 노르세오트리신 N-아세틸 트랜스페라제, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘을 포함하고, G418 또는 다른 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다.
[0040] 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다"는 약 10-7 M, 약 10-8 M, 약 10-9 M, 약 10-10 M, 약 10-11 M, 약 10-12 M, 약 10-13 M, 약 10-14 M 또는 약 10-15 M의 해리 상수로 표현되는 결합 친화성을 갖는 2개의 분자, 예를 들어, 조작된 펩티드 항원 및 결합 표적 사이의 상호작용을 포함한다.
[0041] 용어 "표적 게놈 DNA 서열", "세포 표적 서열", "표적 서열" 또는 "게놈 표적 유전자좌"는 핵산 가이드된 뉴클레아제 편집 시스템을 사용하여 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변화가 요구되는 세포 또는 세포 집단의 시험관 내 또는 생체 내 또는 핵산(예를 들어, 게놈 또는 에피솜) 내의 임의의 유전자좌를 지칭한다. 표적 서열은 게놈 유전자좌 또는 염색체 외 유전자좌일 수 있다. 용어 "편집된 표적 서열" 또는 "편집된 유전자좌"는 편집이 수행된 후 표적 게놈 서열 또는 표적 서열을 나타내며, 여기서 편집된 표적 서열은 원하는 편집을 포함한다.
[0042] 용어 "변이체"는 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상이하지만 필수적인 특성을 보유하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 또 다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 상이하다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 보존적으로 변형된 변이체일 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드(예를 들어, 비-천연 아미노산)에 의해 인코딩된 것이거나 아닐 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 천연 발생일 수 있거나, 이는 천연 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다.
[0043] "벡터"는 세포로 전달되고/되거나 세포에서 발현될 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 임의의 다양한 핵산이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 또한 이용 가능하다. 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, 합성 염색체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 방법의 일부 구현예에서, 2개의 벡터 - 뉴클레아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 엔진 벡터 및 gRNA 서열 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 편집 벡터-가 사용된다. 대안적 구현예에서, 뉴클레아제, gRNA 서열 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 모든 편집 구성요소는 모두 동일한 벡터(예를 들어, 조합된 편집/엔진 벡터)에 있다. 일부 구현예에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 단백질, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 단백질, 편집-구별 gRNA, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열은 모두 단일 리포터 벡터에 위치하지만, 다른 구현예에서, 이들 구성요소 중 하나 이상은 엔진 벡터, 편집 벡터, 또는 하나 이상의 상이한 리포터 벡터에 위치할 수 있다.
일반적으로 뉴클레아제-지시된 게놈 편집
[0044] 본원에 설명된 조성물 및 방법은 세포의 집단에 원하는 편집을 도입하기 위해 뉴클레아제-지시된 게놈 편집을 수행하게 하고, 그 후 생체 내 편집된 세포의 신속한 식별을 허용하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 이전 라운드에서 편집된 세포에 대한 연속적인 편집 라운드로 편집이 도입되는 재귀적 세포 편집이 수행된다. 세포에서 적절한 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제는 원하는 위치에서 세포의 게놈을 절단할 수 있다. 가이드 핵산은 핵산-가이드된 뉴클레아제가 특정 표적 서열에서 DNA를 인식하고 절단하는 것을 돕는다. 가이드 핵산의 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써, 핵산-가이드된 뉴클레아제는 적절한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 근처에 있는 한 절단을 위해 임의의 DNA 서열을 표적화하도록 프로그래밍될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템은 가이드 핵산으로서 기능하도록 조합되는 2개의 개별 가이드 핵산 분자, 예를 들어, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 사용할 수 있다. 다른 양태에서, 바람직하게는, 가이드 핵산은 1) 게놈 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산-가이드된 뉴클레아제와 상호작용하거나 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열 둘 모두를 포함하는 단일 가이드 핵산 작제물이다.
[0045] 일반적으로, 가이드 핵산(예를 들어, gRNA)은 양립되는 핵산-가이드된 뉴클레아제와 복합체화될 수 있고, 이후 표적 서열과 하이브리드화될 수 있고, 이에 의해 뉴클레아제를 표적 서열로 향하게 할 수 있다. 가이드 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며; 대안적으로, 가이드 핵산은 DNA 및 RNA 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산은 변형된 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산이 RNA를 포함하는 경우, gRNA는 플라스미드, 선형 작제물과 같은 폴리뉴클레오티드 분자 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 코딩 서열은 편집 카세트 내에 존재할 수 있고, 바람직하게는 존재한다. 편집 카세트를 설계하고 합성하기 위한 방법 및 조성물은 USPN 10,240,167; 10,266,849; 9,982,278; 10,351,877; 10,364,442; 및 10,435,715; 및 2019년 2월 14일에 출원된 USSN 16/275,465에 설명되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다.
[0046] 가이드 핵산은 가이드 서열을 포함하며, 상기 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고, 표적 서열에 대한 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제의 서열 특이적 결합을 지시하도록 하기 위해 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 가이드 서열과 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 초과이다. 최적 정렬은 정렬 서열에 대한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 가이드 서열은 10-30 또는 15-20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다.
[0047] 일반적으로, 표적 서열에서 편집을 생성시키기 위해, gRNA/뉴클레아제 복합체는 가이드 RNA에 의해 결정된 바와 같이 표적 서열에 결합하고, 뉴클레아제는 표적 서열에 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인지한다. 표적 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성이거나, 시험관 내에 존재하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 인코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드, 인트론, PAM, 조절 서열, 또는 정크 DNA)일 수 있다.
[0048] 가이드 핵산은 세포 표적 서열을 표적화하는 공여자 핵산을 인코딩하는 편집 카세트의 일부일 수 있고, 바람직하게는 일부이다. 대안적으로, 가이드 핵산은 편집 카세트의 일부가 아닐 수 있고, 대신 편집 벡터 백본 상에서 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 가이드 핵산을 코딩하는 서열은 먼저 벡터 백본에 조립되거나 삽입된 후, 예를 들어, 편집 카세트에 공여자 핵산이 삽입될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, 편집 카세트 내의 공여자 핵산은 먼저 벡터 백본에 삽입되거나 조립된 후, 가이드 핵산을 코딩하는 서열이 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 가이드 핵산 및 공여자 핵산을 인코딩하는 서열은 합리적으로 설계된 편집 카세트에 함께 위치하고, 갭 복구를 통해 선형 플라스미드 또는 벡터 백본에 동시에 삽입되거나 조립되어 편집 벡터를 생성한다.
[0049] 표적 서열은 gRNA/뉴클레아제 복합체에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열인 프로토-스페이서 돌연변이(PAM)와 관련된다. 상이한 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 정확한 바람직한 PAM 서열 및 길이 요건은 다양하나; PAM은 전형적으로 표적 서열에 인접하거나 근접한 2-7개의 염기쌍 서열이고, 뉴클레아제에 따라 표적 서열에 대해 5' 또는 3'에 존재할 수 있다. 핵산-가이드된 뉴클레아제의 PAM-상호작용 도메인의 조작은 PAM 특이성의 변경을 가능하게 하거나, 표적 부위 인식 충실도를 개선시키거나, 표적 부위 인식 충실도를 감소시키거나, 핵산-가이드된 뉴클레아제의 다능성을 증가시킬 수 있다.
[0050] 대부분의 구현예에서, (예를 들어, 표적 부위가 추가 뉴클레아제 결합에 면역이 되도록) 세포 표적 서열의 게놈 편집은 세포의 세포 표적 서열, 예를 들어, 게놈 DNA에 원하는 DNA 변경을 도입하고, 세포 표적 서열에서 프로토-스페이서 돌연변이(PAM) 영역을 제거하거나, 돌연변이시키거나, 불활성화시킨다. 세포 표적 서열에서 PAM을 불활성화시키는 것은, 예를 들어, 후속 편집 라운드에서 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 후속 노출시 상기 세포 표적 서열에서 세포 게놈의 추가적인 편집을 배제한다. 따라서, 원하는 세포 표적 서열 편집 및 변경된 PAM을 갖는 세포는 세포 표적 서열에 상보적인 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제를 사용함으로써 선택될 수 있다. 첫 번째 편집 사건을 겪지 않은 세포는 절단되어 이중 가닥 DNA 파손을 일으키므로, 계속하여 생존하지 않을 것이다. 원하는 세포 표적 서열 편집 및 PAM 변경을 함유하는 세포는 절단되지 않을 것이며, 이들 편집된 세포는 더 이상 필요한 PAM 부위를 함유하지 않고 계속하여 성장하고 증식할 것이다.
[0051] 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 뉴클레아제 구성요소에 대해서는, 핵산-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 박테리아, 효모 및 포유동물 세포와 같은 특정 세포 유형에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 사용된 핵산-가이드된 뉴클레아제의 선택은 표적 서열에서 어떠한 유형의 편집이 이루어져야 하고 적절한 PAM이 원하는 표적 서열에 가깝게 위치하는지와 같은 많은 요인에 좌우된다. 본원에 설명된 방법에 사용되는 뉴클레아제는 Cas 9, Cas 12/CpfI, MAD2 또는 MAD7, 또는 다른 MADzymes를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
[0052] 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 또 다른 구성요소는 세포 표적 서열에 대한 상동성을 포함하는 공여자 핵산이다. 공여자 핵산은 가이드 핵산과 동일한 벡터 및 심지어는 동일한 편집 카세트에 존재하고, 바람직하게는 편집 gRNA와 동일한 프로모터(즉, 편집 gRNA 및 공여자 핵산 둘 모두의 전사를 유도하는 단일 프로모터)의 제어 하에 있다(그러나 반드시 그러한 것은 아니다). 공여자 핵산은 gRNA/뉴클레아제 복합체의 일부로서 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹(nicking)되거나 절단된 세포 표적 서열과의 상동성 재조합을 위한 주형으로 작용하도록 설계된다. 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 또는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 초과의 뉴클레오티드 길이, 및 2019년 2월 14일 출원된 USSN 16/275,465에 설명된 바와 같이 이중 gRNA 아키텍쳐와 조합되는 경우 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 최대 20 kb의 길이와 같은 임의의 적합한 길이의 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 공여자 핵산은 20-300개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 50-250개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 공여자 핵산은 세포 표적 서열의 일부에 상보적인 영역(예를 들어, 상동성 아암)을 포함한다. 최적으로 정렬되는 경우, 공여자 핵산은, 예를 들어, 약 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상의 뉴클레오티드에 의해 세포 표적 서열과 중첩(이와 상보적)된다. 많은 구현예에서, 공여자 핵산은 공여자 핵산과 세포 표적 서열 사이의 돌연변이 또는 차이에 측접한 2개의 상동성 아암(세포 표적 서열에 상보적인 영역)을 포함한다. 공여자 핵산은 세포 표적 서열과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이 또는 변경, 예를 들어, 세포 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실, 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[0053] gRNA와 관련하여 설명된 바와 같이, 공여자 핵산은 바람직하게는 편집 플라스미드 백본(효모, 바람직하게는 선형 플라스미드 백본)에 삽입되는 합리적으로 설계된 편집 카세트의 일부로서 제공되며, 상기 편집 플라스미드 백본은 편집 카세트가 편집 플라스미드 백본에 삽입되는 경우 편집 gRNA 및 공여자 DNA의 전사를 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 더욱이, 편집 벡터에 삽입된 합리적으로 설계된 편집 카세트에 하나 초과, 예를 들어, 2, 3, 4개 이상의 편집 gRNA/공여자 핵산이 존재할 수 있고; 대안적으로, 단일한 합리적으로 설계된 편집 카세트는 2개 내지 여러 개의 편집 gRNA/공여자 DNA 쌍을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 편집 gRNA는 별개의 상이한 프로모터, 별개의 유사한 프로모터의 제어 하에 있거나, 모든 gRNA/공여자 핵산 쌍은 단일 프로모터의 제어 하에 있는다. 일부 구현예에서, 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 전사를 유도하는(또는 하나 초과의 편집 gRNA/공여자 핵산 쌍을 유도하는) 프로모터는 선택적으로 유도성 프로모터이다.
[0054] 공여자 핵산에 더하여, 편집 카세트는 하나 이상의 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 부위가 편집 카세트의 다른 구성요소 중 하나 이상에 측접하는 경우 프라이머 부위는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 편집 카세트를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 편집 카세트는 바코드를 포함할 수 있다. 바코드는 이러한 바코드가 상응하는 세포 표적 서열에 대해 이루어진 편집을 확인할 수 있도록 하는 공여자 DNA 서열에 상응하는 고유한 DNA 서열이다. 바코드는 전형적으로 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 편집 카세트는 바코드를 보존하면서 공여자 DNA 및 또는 gRNA의 제어된 결실을 가능하게 하는 FLP/FRT 또는 Cre/Lox 재조합 부위 세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 편집 카세트는, 예를 들어, 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 유전자-전체 또는 게놈-전체 라이브러리를 나타내는 편집 gRNA 및 공여자 핵산의 콜렉션 또는 라이브러리를 포함한다. 편집 카세트의 라이브러리는, 예를 들어, 각각의 상이한 공여자 핵산이 상이한 바코드와 연관된 벡터 백본으로 클로닝된다. 또한, 바람직한 구현예에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 구성요소를 인코딩하는 편집 벡터 또는 플라스미드는 특히 뉴클레아제 서열의 요소로서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 핵 국소화 서열(NLS)과 같은 하나 이상의 NLS를 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 조작된 뉴클레아제는 아미노-말단에 또는 그 근처에 NLS, 카르복시-말단에 또는 그 근처에 NLS, 또는 이들의 조합을 포함한다.
분할 단백질 리포터 시스템을 통해 생체 내에서 뉴클레아제-지시된 편집된 세포 식별의 효율 증가
[0055] 본 발명의 개시내용은 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집이 수행된 후 생 세포에 대해 이루어진 편집의 생체내 검출 효율을 증가시키기 위한 것이다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 기술을 사용한 게놈 편집은 편집 벡터와의 상동성 재조합을 통해 뉴클레아제-유도된 DNA 가닥 파손(예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 틈)의 정확한 복구를 필요로 한다. 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의해 야기된 세포의 이중 가닥 DNA 파괴는 1) 파괴가 복구되지 않는 경우 세포 사멸; 2) 상동성 복구 주형 없이 파괴를 복구하여 인델(indel)로 이어지는 비-상동성 말단 결합(NHEJ); 및 3) 파괴를 복구하는 보조(여기서 외인성) 상동성 DNA(예를 들어, 편집 벡터 내에 삽입된 편집 카세트로부터의 공여자 DNA 서열)를 사용하는 상동성 재조합(HR)의 3개의 주요 결과를 갖는다. 본 방법 및 조성물은 HR에 의해 편집된 세포의 생체내 식별에 관한 것이다.
[0056] 본 방법 및 조성물은 상기 기재된 바와 같은 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템에 더하여, 타입 I CRISPR-Cas 시스템, 2개의 융합 작제물, 편집-구별 또는 편집-표적화 gRNA 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자를 포함하는 분할 단백질 리포터 시스템을 활용한다. CRISPR-Cas 유형 및 하위 유형의 핵심 특징은 유전적으로나 기능적으로 매우 다양한 각각 다른 cas 단백질이다. CRISPR-Cas 시스템에는 세 가지 주요 유형이 있으며, 이는 고유한 시그니처 유전자에 의해 서로 구별된다: 타입 I 시스템의 Cas3, 타입 II 시스템의 Cas9 및 타입 III 시스템의 Cas10. 타입 I CRISPR 시스템은 표적 DNA를 분해하기 위해 2-구성요소 구조를 이용하며, 이는 생체 내에서 편집된 세포를 식별하기 위한 핸들을 제공하기 위해 본 방법 및 조성물에서 이용된다. 타입 I 시스템에서 시그니처 유전자, Cas3은 헬리카제 활성을 갖는 큰 단백질을 인코딩한다.
[0057] 타입 I CRISPR-Cas 시스템의 이펙터 복합체는 타입 I-C 시스템에서 Cas5c, Cas7c 및 Cas8c 단백질 서브유닛으로 구성되고, 타입 I-E 시스템에서 CasA/Cse1, Cse2, Cas7e, Cas5e 및 Cas6e으로 구성된 정교한 아키텍처를 드러낸다. Cas5c 서브유닛은 crRNA의 5'-핸들에 결합하고 큰 Cas8c 서브유닛과 상호작용한다. 타입 I-C 캐스케이드 복합체(Cas5c, Cas7c, Cas8C 및 crRNA로 구성됨)는 표적 DNA 서열에 결합하고, RNA 가이드 및 표적 DNA 가닥과 함께 R-루프 복합체를 형성한다. R-루프 형성 후, 캐스케이드 복합체는 Cas3를 모집하며, 이는 비-표적 가닥에 구멍을 내고, 진행성 DNA 분해를 시작한다. 타입 I-C 시스템이 더 작은 크기로 인해 선호되지만, 예를 들어 선택한 세포로의 페이로드 전달이 감소하기 때문에 타입 I-C 또는 타입 I-E 시스템이 사용될 수 있다.
[0058] 본 방법 및 조성물은 특정화된 DNA 서열에 대한 캐스케이드 복합체의 높은 정확도의 표적화에 특이적인 세포내 신호 증폭 이벤트를 개시하기 위해 캐스케이드 복합체 표적 인식 시 Cas3 모집의 자연적 메카니즘에 의해 유도된다. 분할 단백질의 절반을 탈활성화된 Cas3(dCas3)에 부착시키고 분할 단백질의 나머지 절반을 캐스케이드의 단백질 구성요소에 부착시킴으로써, 단백질의 두 분할 부분은 캐스케이드 복합체가 구별되는 R-루프를 형성하고 올바른 표적 DNA 서열과 복합체를 형성할 때만 함께 나타나는 시스템이 생성된다.
[0059] 많은 다양한 단백질은 본 방법에 따라 사용될 수 있다; 그러나, 특히 흥미로운 것은 단백질 상보 검정에 사용하기 위한 이미 검증된 T7 RNA 중합효소(T7 RNAP)이다. (예를 들어, 문헌 [Shis, et al., PNAS, 110: 및 5028-5033(2013)] 및 [Pu, et al., Nat Chem Biol 13:432-438(2017)] 참조). 분할 T7 RNAP의 경우, 바람직한 구현예에서 C-말단 T7 RNAP 단편(예를 들어, 아미노산 181-883)은 (타입-I-C 시스템에서) Cas5c의 C-말단 또는 (타입-I-E 시스템에서) casA/cse1 단백질의 C-말단을 통해 캐스케이드 복합체에 융합되고, T7 RNAP 단편의 N-말단(예를 들어, 아미노산 1-179)은 탈활성화된 dCas3 단백질의 N-말단에 융합된다. T7 RNAP의 C-말단을 포함하는 캐스케이드 단백질은 편집-구별 crRNA와 복합체화되어 캐스케이드 복합체를 형성한다. 캐스케이드 복합체 및 표적 서열(예를 들어, 여기서 표적 서열은 의도된 편집을 포함하고, R-루프가 형성됨)의 인식 시 및 T7 RNAP의 N-말단에 융합된 dCas3의 동원시 분할 T7 RNAP의 2개의 반쪽은 근접하게 되어 활성 T7 중합효소를 발생시킨다. 활성 T7 중합효소는 세포에 도입된 선형 또는 원형 dsDNA 단편을 전사할 수 있다.
[0060] 본 방법에서, T7 중합효소에 의해 전사되는 선형 dsDNA는 T7 프로모터의 제어 하에 예시적인 구현예에서 루시퍼라제 유전자 (또는 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 코딩 서열, 항생제 내성 유전자, 세포 표면 마커를 코딩하는 유전자, 등)와 같은 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 포함한다. 재구성된 T7 중합효소는 T7 프로모터에 결합하고 리포터 유전자 코딩 서열을 전사한다. 리포터 유전자가 루시퍼라제를 코딩하는 경우, 전사된 서열은 루시퍼라제 효소로 번역된다. 루시퍼라제의 기질인 루시페린이 존재하는 경우, 루시퍼라제는 2-단계 산화 과정을 촉매하여 광을 생성할 것이며, 이는 FACS에서 세포를 분류하기에 충분한 형광을 발생시키고, 이는 결국 의도된 편집을 갖는 세포 집단을 분리하게 한다.
[0061] 본 개시내용이 주어지면 당업자는, 비록 본원에서의 논의가 T7 RNAP의 C-말단 부분을 캐스케이드 단백질 복합체의 C-말단(예를 들어, 타입 I-C 시스템에서 cas5c의 C-말단 또는 타입 I-E 시스템에서 cse1 또는 casA의 C-말단)에 및 T7 RNAP의 N-말단 부분을 dCas3의 N-말단에 융합시키는 것에 초점이 맞춰져 있지만, 대안적 구현예는 T7 RNAP의 C-말단 부분을 dCas3의 C-말단에 및 T7 RNAP의 N-말단 부분을 캐스케이드 단백질 복합체의 N-말단(예를 들어, 타입 I-C 시스템에서 cas5c의 N-말단 또는 타입 I-E 시스템에서 cse1 또는 casA의 N-말단)에 융합시킴을 구상한다는 것이 주지되어야 한다. 추가로, 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 사용하는 분할 단백질 리포터 시스템의 다른 조합은, 조합이 표적 DNA 서열의 의도된 편집의 인식 시 캐스케이드 복합체의 형성, R-루프의 형성, dCas3의 모집 및 분할 단백질의 활성의 재구성을 포함하는 한 구상될 수 있다.
[0062] 도 1a는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 통해 적절하게 편집된 세포의 생체 내 검출을 위한 간단한 처리 다이어그램이다. 방법(100)의 첫 번째 단계에서 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물이 합성된다(102). 일단 두 부분이 서로 근접해 있어 재구성된 중합효소를 생성하기 위한 T7 RNAP의 N-말단과 C-말단 부분 사이의 적절한 "분할"은 경험적으로 결정될 수 있다. 캐스케이드 복합체와의 dCas3의 회합으로 인해 물리적 근접성이 없는 T7 RNAP의 N-말단과 C-말단 부분 사이의 자발적인 회합이 없는 지점에서 "분할"된다; 그러나, "분할"은 캐스케이드 복합체와의 dCas3의 회합의 존재하에 중합효소의 N-말단 및 C-말단 부분의 회합 -및 중합효소 활성의 재구성-을 허용해야 한다. 중합효소에 대한 적절한 "분할"이 결정되면, 적절한 캐스케이드-T7-RNAP 융합 및 dCas3-T7-RNAP 융합 작제물이 설계되고 합성될 수 있다. 일 구현예에서, T7 RNAP의 N-말단 부분은 T7 RNAP 단백질의 대략 아미노산 1-179를 포함하며, T7 RNAP의 C-말단 부분은 T7 RNAP 단백질의 대략 아미노산 181-883을 포함한다. 하나의 예시적인 구현예에서, T7 RNAP의 C-말단 부분은 dCas3의 N-말단에 융합되는 경우 T7 RNAP의 N-말단 부분 및 케스캐이드 단백질 복합체의 C-말단(예를 들어, 타입 I-C 시스템에서 cas5c의 C-말단 또는 타입 I-E 시스템에서 cse1 또는 casA의 C-말단)에 융합된다.
[0063] 일단 합성되면, 적절한 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 벡터(104) 내로 삽입되어 선택 세포 내로 형질전환된다(110). 이러한 예시적 구현예에서, 선택 세포는 T7 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자의 코딩 서열을 포함하며, 편집-구별 또는 편집-표적화 gRNA에 대한 서열을 포함한다. 그러나, 대안적 구현예에서, T7 프로모터의 제어 하의 리포터 유전자의 코딩 서열 및/또는 편집-구별 gRNA는 융합 작제물(하기 기술된 바와 같음)을 갖는 리포터 벡터 또는 엔진 또는 편집 벡터(여기서 이들 벡터는 하기에 간략하게 설명됨)에 위치할 수 있다. 또한, 이러한 예시적 구현예에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 핵산-가이드된 뉴클레아제 코딩 서열을 갖는 엔진 벡터에 위치한다. 대안적 구현예에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 (T7 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자 및/또는 편집-구별 gRNA에 대한 코딩 서열과 함께) 엔진 벡터와 별개의 단일 리포터 벡터에 함유될 수 있으며, 여기서 두 융합 작제물 모두는 동일한 프로모터의 제어 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 또 다른 구현예에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 별도의 리포터 벡터에 함유될 수 있다(예를 들어, 도 8a-8d 참조). 또 다른 대안에서, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물 중 하나 또는 둘 모두는 세포 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다.
[0064] 본원에 구상된 바와 같은 리포터 유전자는 적절한 게놈 편집의 지표로서 사용된 유전자이며, T7 프로모터의 제어 하에 있다. T7 프로모터는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터이며, 이는 19개 염기 쌍 길이이다. 리포터 유전자는 분자 생물학에서 유전자 발현과 세포 이벤트 연구에 널리 사용된다. 전형적으로, 리포터 유전자는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 그 후 이는 세포 내로 형질전환 또는 형질감염된다. 그 후, 세포는 리포터, 예컨대 형광 단백질 예컨대, GFP, RFP 및 BFP, 세포 표면 마커 또는 항생제 내성을 갖는 시스템에서와 같이 리포터 단백질 자체를 직접적으로 측정함으로써, 또는 기질(예를 들어, 루시퍼라제) 상의 리포터 단백질의 효소 활성을 측정하거나 예를 들어, RNA 앱타머가 있는 시스템과 같은 형광원의 존재 하에 화합물의 형광을 측정함으로써 리포터의 존재에 대해 검정될 수 있다.
[0065] 본 방법 및 조성물에서, 리포터 유전자는 T7 프로모터의 제어 하에 있으며, 리포터 유전자는 캐스케이드 복합체가 편집된 표적 유전자좌를 인식하고 결합하는 경우 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물과 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물의 근접성을 통해 T7 RNAP의 활성을 재구성할 때에만 전사된다. 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 및 청색 형광 단백질이 사용될 수 있지만, 일부 구현예에서, 조성물은 루시퍼라제 리포터 검정을 사용하며, 이는 형광 단백질에 비해 증가된 감도, 동적 범위 및 다양성을 제공한다. 대안적으로, 시금치 및 브로콜리와 같은 RNA 앱타머는 또한 T7 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자로서 발현될 수 있으며, DFHBI((5Z)-5-[(3,5-디플루오로-4-하이드록시페닐)메틸렌]-3,5-디하이드로-2-메틸-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-이미다졸-4-온)의 존재하에 형광을 나타낸다. 생물발광 리포터 검정은 10-1,000배 더 높은 검정 감도를 전달한다는 점에서 형광 검정에 비해 이점을 갖는다. 본원에서 사용될 수 있는 루시퍼라제 리포터 기술은 효소 루시퍼라제(코딩 서열로서, 이에 대한 "리포터 유전자"임)와 생물발광 과정에 의해 광을 방출하는 발광 기질 루시페린의 상호작용을 기반으로 한다. 일반적으로 사용되는 두 가지 루시퍼라제는 번역 후 변형이 필요하지 않은 61kDa 효소인 반딧불이 루시퍼라제 및 또한, 번역 후 변형이 필요하지 않은 36 kDa 효소인 레닐라(Renilla) 루시퍼라제이다. T7 프로모터를 루시퍼라제 유전자의 코딩 서열에 커플링함으로써, C-말단 T7 RNAP 융합체를 갖는 캐스케이드 복합체 및 T7 RNAP 활성을 재구성하기 위해 편집된 표적 유전자좌에 대한 dCas3-N-말단 T7 RNAP의 결합이 검출될 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 리포터 유전자는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있어 편집된 세포는 항생제 내성에 의해 식별될 수 있거나, 리포터 유전자는 세포 표면 마커 단백질을 포함하여 세포는 세포 표면 마커 단백질에 대한 항체를 통해 분류될 수 있다.
[0066] 분할 단백질 리포터 시스템의 네 번째 구성요소는 편집-구별 gRNA이다. 편집-구별 gRNA는 적절하게 편집된 표적 서열에 결합하고, 편집되지 않거나(예를 들어, 야생형) 또는 잘못 편집된 서열에는 결합하지 않도록 특정하게 조작된다. 이 경우, 편집-구별 gRNA는 공여자 DNA(또는 상동성 아암)를 포함하는 편집 카세트의 일부가 아니다. 편집-구별 gRNA가 dCas3을 캐스케이드 복합체에 동원하는데 사용되며; 즉, 편집-구별 gRNA는 서열 인식에 사용되며, 편집을 용이하게 하기 위한 것은 아니다.
[0067] 따라서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 구성요소 및 분할 단백질 리포터 시스템 구성요소는 관심 세포 내로 형질전환 또는 형질감염되어야 한다. 형질전환은 외인성 핵산 서열(예를 들어, 엔진 및/또는 편집 벡터)을 표적 세포로 도입하기 위한 다양한 당 분야에 인정된 기술을 포함하는 것으로 의도되며, 본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 모든 형질전환 및 형질감염 기술을 포함한다. 상기 방법은 전기천공, 리포펙션, 옵토포레이션(optoporation), 주입, 미세침전, 미세주입, 리포솜, 입자 봄바드먼트(particle bombardment), 소노포레이션(sonoporation), 레이저-유도 천공, 비드 형질감염, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, 또는 DEAE-덱스트란-매개 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 수크로스, 소르비톨 또는 글리세롤 세척을 사용한 벡터 흡수를 위해 세포가 또한 제조될 수 있다. 또한, 기계적 및 화학적 형질감염 방법의 능력을 이용하는 하이브리드 기술, 예를 들어, 화학적 형질감염과 기계적 방법을 조합하는 형질감염 방법인 마그네토펙션(magnetofection)이 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 양이온성 지질은 유전자 총 또는 전기천공기와 조합하여 배치될 수 있다. 표적 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위한 적합한 물질 및 방법은, 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014]에서 찾을 수 있다. 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기를 사용하는 본 발명의 자동화된 방법은 도 5b 내지 5f에 제시된 예시적인 장치와 같은 관통형 전기천공을 이용한다.
[0068] 동시에 또는 다음으로, 편집 카세트 라이브러리가 설계된다(106). 편집 카세트를 설계하고 합성하기 위한 방법 및 조성물은 USPN 10,240,167; 10,266,849; 9,982,278; 10,351,877; 10,364,442; 및 10,435,715; 및 2019년 2월 14일에 출원된 USSN 16/275,465에 설명되어 있다. 2019년 2월 14일 출원된 USSN 16/275,465는 본원에 설명된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서 사용되는 화합물 편집 카세트가 설명되어 있다. 화합물 편집 카세트는 하나 초과의 gRNA 및 하나 초과의 공여자 DNA를 포함하는 편집 카세트이다. 일단 설계되고 합성되면(106), 편집 카세트의 라이브러리는 증폭되고, 정제되고, 편집 벡터에 삽입되어(108) 편집 벡터의 라이브러리를 생성한다. 그런 다음 편집 벡터 라이브러리는 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물(110)로 이미 형질전환된 세포로 형질전환된다. 대안적인 구현예에서, 편집 벡터, 엔진 벡터 및 리포터 벡터(들)는 동시에 세포 내로 형질전환될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분할 단백질 리포터 시스템을 위한 구성요소 중 하나 이상이 세포 게놈 내로 통합될 수 있다.
[0069] [0069] 일단 형질전환되면, 세포는 회복될 수 있고 임의적으로 리포터 벡터(들), 엔진 벡터 및/또는 편집 벡터로 형질전환된 세포를 선택하기 위해 선택이 수행되며, 이들 모두는 가장 흔히 선택가능한 마커를 포함한다. 상기 설명된 바와 같이, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 노르세오트리신 N-아세틸 트랜스퍼라제, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘 및 G418과 같은 약물 선택 가능 마커, 또는 다른 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다. 다음 단계에서, 편집이 발생하도록 하는 조건이 제공된다(112). 예를 들어, 뉴클레아제 또는 gRNA/공여자 DNA 카세트 중 하나 또는 둘 모두와 같은 편집 구성요소 중 임의의 것이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 유도성 프로모터(들)를 활성화시키는 조건이 제공된다. 일단 세포가 편집되면(112), 이번에는 예를 들어 발광을 통해 세포가 선택(예를 들어, 분류)(114)된다. 세포가 편집된 세포에 대해 풍부화되도록 세포가 분류되면 편집된 세포를 연구에 사용하거나 원하는 OD로 성장시켜 다시 전기적격으로 만든 다음 또 다른 편집 라운드를 수행할 수 있다.
[0070] 도 1b는 gRNA가 야생형(예를 들어, 편집되지 않은) 게놈 표적 서열에 결합하지 않는 분할 단백질 시스템의 구성요소의 단순화된 개략도이다. 도 1b의 상단에는 T7 프로모터의 제어 하에 있는 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자가 있다. 또한 편집-구별 또는 편집-표적화 gRNA, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물 및 dCas3-C-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물이 제시되어 있다. 이 경우 표적 게놈 서열은 "야생형" 또는 편집되지 않은 서열이며, 이는 편집-구별 gRNA에 의해 인식되지 않는다. 편집-구별 gRNA가 야생형 게놈 서열을 인식하지 못하기 때문에 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물과 편집-구별 gRNA는 해당 게놈 유전자좌에서 R-루프 복합체를 형성하지 못한다. 해당 게놈 유전자좌에서 R-루프가 형성되지 않으면 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물이 관심 유전자좌로 모집되지 않고, T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 가까워지지 않는다. T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 근접하지 않으면 T7 RNAP의 활성이 재구성되지 않고, T7 프로모터가 활성화되지 않으며 리포터 유전자가 전사(또는 번역)되지 않는다. 즉, 캐스케이드 복합체와 dCas3가 T7 RNAP가 "재구성"되고 활성화될 수 있도록 게놈 표적 서열에 결합하지 못하기 때문에 리포터가 침묵한다.
[0071] 도 1c는 분할 단백질 시스템의 구성요소의 단순화된 개략도이며, 여기서 편집된 게놈 표적 서열이 존재하나, 편집된 게놈 표적 서열은 올바른 또는 요망하는 편집이 아니다. 이 경우, 편집-구별 gRNA는 잘못 편집된 게놈 표적 서열에 결합하지 않는다. 도 1b와 같이 도 1c의 상단에는 T7 프로모터의 제어 하에 있는 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자가 있다. 또한 gRNA, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물 및 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물이 제시되어 있다. 여기에서, 표적 게놈 서열은 예를 들어, 정확하고 요망되는 편집을 유도하는 상동성 재조합(HR)에 의해서기 보다는 상동성 복구 없이 표적 게놈에서 이중 가닥 파손을 수복하는 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 야기된 편집으로부터 발생하는 "인델" 또는 잘못 편집된 서열을 포함한다. 야생형 게놈 표적 서열과 같은 인델(예를 들어, 잘못된 편집)은 편집-구별 gRNA에 의해 인식되지 않는다. 편집-구별 gRNA는 잘못 편집된 게놈 서열을 인식하지 못하기 때문에 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물 및 gRNA는 게놈 유전자좌에서 R-루프 복합체를 형성하지 못한다. 관심 유전자좌에서 R-루프 복합체가 형성되지 않으면, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 관심 유전자좌로 모집되지 않고, T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 가까워지지 않는다. T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 근접하지 않으면 T7 RNAP의 활성이 재구성되지 않고, T7 프로모터가 활성화되지 않으며 리포터 유전자가 전사(또는 번역)되지 않는다. 즉, 도 1b에 묘사된 과정과 같이, 캐스케이드 복합체와 dCas3가 T7 RNAP가 "재구성"되고 활성화될 수 있도록 게놈 표적 서열에 결합하지 못하기 때문에 리포터가 침묵한다.
[0072] 도 1d는 적절하게 편집된 게놈 표적 서열이 존재하고 리포터 유전자가 활성화된 분할 단백질 시스템의 구성요소의 단순화된 개략도이다. 도 1d의 상단에는 T7 프로모터의 제어 하에 있는 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자가 있다. 또한 편집-구별 gRNA, 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물 및 게놈 표적 서열에 결합된 dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물이 제시되어 있다. 이 경우 표적 게놈 서열은 편집-구별 gRNA에 의해 인식되는 적절하게 편집된 서열이다. 이제 편집-구별 gRNA와 캐스케이드-T7-RNAP-C-말단 융합 작제물은 표적 게놈 유전자좌에서 R-루프 복합체를 형성할 수 있고, dCas3-T7-RNAP-N-말단 융합 작제물은 이제 표적 게놈 유전자좌에 모집되어 T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 기능적 근접성을 띠게 할 수 있다. T7 RNAP의 N-말단 및 C-말단 부분이 기능적으로 근접하게 되면, T7 RNAP의 활성이 재구성되고, T7 프로모터가 활성화되어, 이 구현예에서 루시퍼라제인 리포터 유전자를 전사한다. 또한 도 1d에는 D-루시페린(기질)의 검출 가능한 발광으로의 전환을 촉매하는 전사된(및 번역된) 루시퍼라제 효소를 예시하는 개략도가 제시되어 있다.
세포에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집을 수행하기 위한 자동화된 세포 편집 기기 및 모듈
자동화된 세포 편집 기기
[0073] 도 2a는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 분할 단백질 리포터 시스템을 포함하는 예시적인 워크플로우 중 하나를 수행하기 위한 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)를 도시한다. 예를 들어, 기기(200)는 실험실 환경 내에서 사용하기 위한 독립형 데스크톱 기기로서 설계될 수 있으며, 바람직하게는 설계된다. 기기(200)는 인간 개입 없이 세포에서 자동화된 게놈 절단 및/또는 편집을 수행하는 데 있어서 다양한 통합 공정을 수행하기 위한 재사용 가능 및 일회용 구성요소의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 개입 없이 다수의 모듈 사이의 세포 처리를 허용하는 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는, 예를 들어, 자동화된(즉, 로봇식) 액체 핸들링 시스템(258)에 XYZ 축 모션 제어를 공급하는 자동화된 기계적 모션 시스템(액추에이터)(제시되지 않음)을 제공하는 갠트리(202)가 예시된다. 일부 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서, 공기 변위 피펫터(232)는 갠트리(202)에 의해 이동되고, 다양한 모듈 및 시약 카트리지는 정지 상태로 남아 있으나; 다른 구현예에서, 액체 핸들링 시스템(258)은 다양한 모듈 및 시약 카트리지가 이동되는 동안 정지 상태를 유지할 수 있다. 또한, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)에는 저장소(212) 및 형질전환 모듈(230)(예를 들어, 도 5b-5f와 관련하여 상세히 설명된 바와 같은 관통형 전기천공 장치)뿐만 아니라 세척 저장소(206), 세포 투입 저장소(251) 및 세포 산출 저장소(253)를 포함하는 시약 카트리지(210)가 포함된다. 세척 저장소(206)는 큰 튜브, 예를 들어, 세척 용액 또는 반복적인 공정 전체에 걸쳐 자주 사용되는 용액을 수용하도록 구성될 수 있다. 2개의 시약 카트리지(210)가 도 2a에서 세척 저장소(206)를 포함하지만, 세척 저장소가 대신 세척 카트리지에 포함될 수 있으며, 여기서 시약 및 세척 카트리지는 별도의 카트리지이다. 그러한 경우에, 시약 카트리지(210) 및 세척 카트리지(204)는 그 안에 삽입된 소모품(시약 또는 다양한 삽입물 내에 함유된 다른 구성요소)을 제외하고는 동일할 수 있다.
[0074] 일부 구현에서, 시약 카트리지(210)는 자동화된 다중-모듈 세포 처리/편집 기기(200)에서 사용하기 위한 시약 및 세포를 포함하는 일회용 키트이다. 예를 들어, 사용자는 세포 처리를 활성화하기 전에 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 섀시 내에 다양한 원하는 삽입물 및 시약을 포함하는 시약 카트리지(210)의 각각을 개방하고 위치시킬 수 있다. 또한, 각각의 시약 카트리지(210)는 그 안에 함유된 시약에 적절한 상이한 온도 구역을 갖는 섀시의 리셉터클에 삽입될 수 있다.
[0075] 또한, 갠트리(202) 및 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)이 도 2a에 예시된다. 일부 예에서, 로봇식 핸들링 시스템(258)은 Mannedorf, Switzerland의 Tecan Group Ltd., Reno, NV의 Hamilton Company(예를 들어, WO2018015544A1 참조) 또는 Fort Collins, CO의 Beckman Coulter, Inc.(예를 들어, US20160018427A1 참조)에 의해 제조된 것들과 같은 자동화된 액체 핸들링 시스템을 포함할 수 있다. 피펫 팁은 공기 변위 피펫터(232)와 함께 사용하기 위해 피펫 이송 팁 공급부(미도시됨)에 제공될 수 있다.
[0076] 일부 구현에서, 시약 카트리지(210)의 삽입물 또는 구성요소는 로봇식 핸들링 시스템(258)에 의한 인식을 위해 바코드와 같은 기계 판독가능 표시(제시되지 않음)로 표시된다. 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)은 내용물을 확인하기 위해 각각의 시약 카트리지(210) 내의 하나 이상의 삽입물을 스캔할 수 있다. 다른 구현에서, 기계-판독가능 표시는 각각의 시약 카트리지(210)에 표시될 수 있고, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 처리 시스템(제시되지 않았지만, 도 2b의 요소(237) 참조)은 기계-판독 가능 표시를 기반으로 저장된 물질 맵을 확인할 수 있다. 도 2a에 예시된 구현예에서, 세포 성장 모듈은 세포 성장 바이알(218)을 포함한다(도 3a-3d와 관련하여 하기에 더 상세히 설명됨). TFF 모듈(222)이 추가로 관찰된다(도 4a-4e와 관련하여 상기에서 상세히 설명됨). 또한, 도 2a의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 일부로서도, 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258) 및 공기 변위 피펫터(232)에 의해 제공되는 도 6c-6f와 관련하여 본원에 설명된 단일화 모듈(240)(예를 들어, 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정상화 장치(SWIIN 장치)가 여기에 제시됨)이 예시된다. 추가적으로 선택 모듈(220)이 제시된다. 또한, 3개의 히트싱크(heatsink)(255)의 배치에 유의한다.
[0077] 도 2b는 도 2a에 도시된 예시적인 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 내용물의 단순화된 표현이다. 예를 들어, 카트리지-기반 소스 물질(예를 들어, 시약 카트리지(210)에서)은 공기 변위 피펫터(232)에 의한 접근을 위해 기기(200)의 데크 상의 지정된 영역에 위치될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 데크는 기기(200)의 임의의 모듈로부터 흘러 내리거나, 떨어지거나, 넘쳐나는 오염물이 보호 싱크의 립 내에 포함되도록 보호 싱크를 포함할 수 있다. 또한, 상이한 영역에 적절한 온도 구역을 생성할 수 있는 열 조립체(211)와 함께 배치된 것으로 제시된 시약 카트리지(210)가 관찰된다. 시약 카트리지 중 하나는 또한 FTEP 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(231)에 의헤 제공되는 관통형 전기천공 장치(230)(FTEP)를 포함한다는 점에 유의한다. 또한, 인접한 열 조립체(225)를 갖는 TFF 모듈(222)이 관찰되며, 여기서 TFF 모듈은 TFF 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(233)에 의해 제공된다. 열 조립체(225, 235 및 245)는 펠티에 장치뿐만 아니라 히트싱크, 팬 및 냉각기와 같은 열 전기 장치를 포함한다. 회전 성장 바이알(218)은 성장 모듈(234) 내에 있으며, 여기서 성장 모듈은 2개의 열 조립체(235)에 의해 제공된다. 선택 모듈은 (220)에서 제시된다. 또한, SWIIN 카트리지(241)를 포함하는 SWIIN 모듈(240)이 관찰되며, 여기서 SWIIN 모듈은 또한 열 조립체(245), 조명(243)(본 구현예에서, 백라이팅), 증발 및 응축 제어장치(249)를 포함하고, 여기서 SWIIN 모듈은 SWIIN 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(247)에 의해 제공된다. 또한, 터치 스크린 디스플레이(201), 디스플레이 작동기(203), 조명(205)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나) 및 카메라(239)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나의 조명 장치)가 본 도면에서 관찰된다. 마지막으로, 요소(237)는 회로 제어 보드, 고-전압 증폭기, 전원 공급장치 및 전원 입력과 같은 전자 장치뿐만 아니라 펌프, 밸브 및 센서와 같은 공압장치를 포함한다.
[0078] 도 2c는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 데스크탑 버전으로 사용하기 위한 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 전방 사시도를 예시한다. 예를 들어, 섀시(290)는 약 24-48 인치의 폭, 약 24-48 인치의 높이 및 약 24-48 인치의 깊이를 가질 수 있다. 섀시(290)는 자동화된 세포 처리에 사용되는 모든 모듈 및 일회용 소모품을 보유하고, 인간 개입 없이 필요한 모든 공정을 수행하도록 설계될 수 있고 바람직하게는 설계되고; 즉, 섀시(290)는 통합된 독립형 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기를 제공하도록 구성된다. 도 2c에 예시된 바와 같이, 섀시(290)는 내부 팬(제시되지 않음)을 통한 공기 흐름을 허용하는 터치 스크린 디스플레이(201), 냉각 화격자(264)를 포함한다. 터치 스크린 디스플레이는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 처리 상태에 관한 정보를 사용자에게 제공하고, 세포 처리를 수행하기 위해 사용자로부터의 입력을 수용한다. 이러한 구현예에서, 섀시(290)는 조정 가능한 피트(270a, 270b, 270c 및 270d)에 의해 들어 올려진다(피트(270a-270c)는 이러한 도 2c에 제시되어 있다). 예를 들어, 조정 가능한 피트(270a-270d)는 섀시(290) 아래에 추가 공기 흐름을 허용한다.
[0079] 일부 구현에서, 섀시(290) 내부에 도 2a 및 2b와 관련하여 설명된 구성요소의 대부분 또는 전부가 존재할 것이며, 이는 갠트리를 따라 배치된 로봇식 액체 핸들링 시스템, 관통형 전기천공 장치를 포함하는 시약 카트리지(210), 세포 성장 모듈(234) 내의 회전 성장 바이알(218), 접선 유동 여과 모듈(222), SWIIN 모듈(240)뿐만 아니라 다양한 모듈을 위한 인터페이스 및 작동기를 포함한다. 또한, 섀시(290)는 제어 회로, 액체 핸들링 튜브, 공기 펌프 제어, 밸브, 센서, 열 조립체(예를 들어, 가열 및 냉각 유닛) 및 다른 제어 메커니즘을 수용한다. 다중-모듈 세포 편집 기기의 예에 대해서는 2019년 4월 09일에 발행된 USPN 10,253,316; 2019년 6월 25에 발행된 10,329,559; 2019년 6월 18일 발행된 10,323,242; 2019년 9월 24일 발행된 10,421,959; 2019년 11월 5일 발행된 10,465,185; 및 2019년 5월 14일 출원된 USSN 16/412,195; 2019년 9월 14일 출원된 16/571,091; 및 2019년 10월 29일 출원된 16/666,964를 참조하며, 이들 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
회전 세포 성장 모듈
[0080] 도 3a는 본원에 설명된 세포 성장 장치와 함께 그리고 자동화 다중-모듈 세포 처리 기기에서 사용하기 위한 회전 성장 바이알(300)의 일 구현예를 제시한다. 회전 성장 바이알(300)은 액체 배지 및 세포를 수용하기 위한 개방 단부(304), 세포 성장을 위한 1차 용기를 정의하는 중앙 바이알 영역(306), 적어도 하나의 광 경로(310)를 정의하는 테이퍼-수축 영역(tapered-to-constricted region)(318), 폐쇄 단부(316), 및 구동 결합 메커니즘(312)을 갖는 광학적으로 투명한 용기이다. 회전 성장 바이알(300)은 바이알이 회전하는 중심 종축(320)을 가지며, 광 경로(310)는 일반적으로 바이알의 종축에 수직이다. 제1 광 경로(310)는 테이퍼-수축 영역(318)의 하부 수축 부분에 위치한다. 선택적으로, 회전 성장 바이알(300)의 일부 구현예는 테이퍼-수축 영역(318)의 테이퍼 영역에 제2 광 경로(308)를 갖는다. 본 구현예에서 둘 모두의 광 경로는 세포 배양물(세포 + 성장 배지)로 지속적으로 채워지고 성장 바이알의 회전 속도에 의해 영향을 받지 않는 회전 성장 바이알의 영역에 위치한다. 제1 광 경로(310)는 제2 광 경로(308)보다 짧아서 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 높은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 공정에서 이후) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 하는 반면, 제2 광 경로(308)는 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 낮은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 공정에서 더 이전) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 한다.
[0081] 구동 결합 메커니즘(312)은 바이알을 회전시키기 위해 모터(제시되지 않음)와 결합한다. 일부 구현예에서, 모터는 회전 성장 바이알(300)이 한 방향으로만 회전하도록 구동 결합 메커니즘(312)을 구동하고, 다른 구현예에서, 회전 성장 바이알(300)은 제1 시간 또는 주기성 동안 제1 "방향으로" 회전되고, 제2 시간 또는 주기성 동안 제2 방향(즉, 반대 방향)으로 회전되고, 이러한 공정은 회전 성장 바이알(300)(및 세포 배양 내용물)이 진동 운동에 적용되도록 반복될 수 있다. 또한, 배양물이 진동에 적용되는지의 여부 및 이에 따른 주기성의 선택은 사용자에 의해 선택될 수 있다. 제1 시간 및 제2 시간은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 시간의 양은 1초, 2초, 3초, 4초, 5초 이상이거나, 1분, 2분, 3분, 4분 이상일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포 성장의 초기 단계에서, 회전 성장 바이알(400)은 제1 주기성(예를 들어, 60초마다)으로 진동될 수 있고, 이후 세포 성장의 후기 단계에서 회전 성장 바이알(300)은 제1 주기성과 상이한 제2 주기성(예를 들어, 1초마다)으로 진동될 수 있다.
[0082] 회전 성장 바이알(300)은 재사용 가능할 수 있거나, 바람직하게는, 회전 성장 바이알은 소모품이다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은 소모품이고, 성장 배지로 미리 채워진 채로 사용자에게 제공되며, 여기서 바이알은 호일 밀봉으로 개방 단부(304)에서 기밀적으로 밀봉된다. 이러한 방식으로 패키징된 배지-충전된 회전 성장 바이알은 독립형 세포 성장 장치 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템의 일부인 세포 성장 모듈과 함께 사용하기 위한 키트의 일부일 수 있다. 바이알에 세포를 도입하기 위해, 사용자는 원하는 부피의 세포를 피펫팅하고, 바이알의 호일 밀봉을 천공하기 위해 페펫 팁을 사용하기만 하면 된다. 개방 단부(304)는 세포 성장 장치와 중첩하고 결합하기 위해 연장된 립(402)을 선택적으로 포함할 수 있다. 자동화 시스템에서, 회전 성장 바이알(400)은 자동화 시스템의 일부인 스캐너 또는 카메라(제시되지 않음)에 의해 판독될 수 있는 바코드 또는 다른 식별 수단으로 태깅될 수 있다.
[0083] 회전 성장 바이알(300)의 부피 및 세포 배양물의 부피(성장 배지 포함)는 크게 변할 수 있지만, 회전 성장 바이알(300)의 부피는 특정된 총 세포 수를 생성하기에 충분히 커야 한다. 실제로, 회전 성장 바이알(400)의 부피는 1-250 mL, 2-100 mL, 5-80 mL, 10-50 mL 또는 12-35 mL 범위일 수 있다. 마찬가지로, 세포 배양물(세포 + 성장 배지)의 부피는 회전 성장 바이알(400)에서 적절한 통기 및 혼합을 허용하기에 적절해야 한다. 적절한 통기는 성장 배지 내에서 균일한 세포 호흡을 촉진한다. 따라서, 세포 배양물의 부피는 성장 바이알 부피의 대략 5-85% 또는 성장 바이알 부피의 20-60%이어야 한다. 예를 들어, 30 mL 성장 바이알의 경우, 세포 배양물의 부피는 약 1.5 mL 내지 약 26 mL, 또는 6 mL 내지 약 18 mL일 것이다.
[0084] 회전 성장 바이알(300)은 바람직하게는 생체-적합성의 광학적으로 투명한 물질로 제조되거나, 광 경로(들)을 포함하는 바이알의 적어도 일부가 투명하다. 추가로, 회전 성장 바이알이 제조되는 물질은 온도 기반 세포 검정 및 저온에서의 장기 저장 둘 모두를 수용하기 위해 약 4℃ 이하로 냉각되고 약 55℃ 이상으로 가열될 수 있어야 한다. 또한, 바이알을 제조하는 데 사용되는 물질은 회전하는 동안 변형 없이 최대 55℃의 온도를 견딜 수 있어야 한다. 적합한 물질은 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 유리, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함한다. 바람직한 물질은 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 또는 폴리스티렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은, 예를 들어, 사출 성형 또는 압출에 의해 저렴하게 제조된다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은, 예를 들어, 사출 성형 또는 압출에 의해 저렴하게 제조된다.
[0085] 도 3b는 세포 성장 장치(330)의 일 구현예의 사시도이다. 도 3c는 도 3b로부터의 세포 성장 장치(330)의 단면도를 도시한다. 둘 모두의 도면에서, 회전 성장 바이알(300)은 메인 하우징(336) 내부에 위치하는 것으로 관찰되며, 회전 성장 바이알(300)의 연장된 립(302)은 메인 하우징(336) 위로 연장된다. 추가로, 단부 하우징(352), 하부 하우징(332) 및 플랜지(334)는 둘 모두의 도면에 표시된다. 플랜지(334)는 세포 성장 장치(330)를 가열/냉각 수단 또는 다른 구조(제시되지 않음)에 부착하는 데 사용된다. 도 3c는 추가 세부사항을 도시한다. 도 3c에서, 상부 베어링(342) 및 하부 베어링(340)은 메인 하우징(336) 내에 위치하는 것으로 제시된다. 상부 베어링(342) 및 하부 베어링(340)은 회전 성장 바이알(300)의 수직 하중을 지지한다. 하부 하우징(332)은 구동 모터(338)를 포함한다. 도 3c의 세포 성장 장치(330)는 제1 광 경로(344) 및 제2 광 경로(350)의 2개의 광 경로를 포함한다. 광 경로(344)는 회전 성장 바이알(300)의 테이퍼-수축 부분의 수축된 부분에 위치된 경 경로(310)에 해당하고, 광 경로(350)는 회전 성장 바이알(316)의 테이퍼-수축 부분의 테이퍼 부분 내의 광 경로(308)에 해당한다. 광 경로(310 및 308)는 도 3c에 제시되지 않았지만 도 3a에서 관찰될 수 있다. 광 경로(344 및 340)에 더하여, 광 경로(들)를 조명하기 위한 방출 보드(348), 및 회전 성장 바이알(300)에서 세포 배양 액체를 통해 광이 이동한 후 광을 검출하기 위한 검출기 보드(346)가 있다.
[0086] 모터(338)는 구동 메커니즘(312)과 결합되고, 회전 성장 바이알(300)을 회전시키는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 모터(338)는 0 내지 약 3000 RPM의 일정한 분 당 회전수(RPM)를 유지하도록 설정될 수 있는 내장 구동 제어장치를 갖는 브러시리스(brushless) DC 유형 구동 모터이다. 대안적으로, 스테퍼(stepper), 서보(servo), 브러시 DC 등과 같은 다른 모터 유형이 사용될 수 있다. 선택적으로, 모터(338)는 또한 회전 방향의 반전을 허용하는 방향 제어장치, 및 실제 RPM을 감지하고 보고하는 타코미터를 가질 수 있다. 모터는, 예를 들어, 프로세서 및/또는 사용자 입력에 프로그래밍된 표준 프로토콜에 따라 프로세서(제시되지 않음)에 의해 제어되고, 모터는 세포 배양물의 축방향 전진을 유발하여 혼합을 향상시키고, 예를 들어, 세포 응집을 방지하고, 통기를 증가시키고, 세포 호흡을 최적화시키기 위해 RPM을 변화시키도록 구성될 수 있다.
[0087] 세포 성장 장치(330)의 메인 하우징(336), 단부 하우징(352) 및 하부 하우징(332)은 임의의 적합한 알루미늄, 스테인리스 강철을 포함하는 견고한 물질, 및 플라스틱을 포함하는 다른 열 전도성 물질로 제조될 수 있다. 이들 구조 또는 이의 부분은 다양한 기술, 예를 들어, 금속 제조, 사출 성형, 융합되는 구조 층의 생성 등을 통해 생성될 수 있다. 회전 성장 바이알(300)이 일부 구현예에서 재사용 가능하지만 바람직하게는 소모품인 것으로 구상되는 반면, 세포 성장 장치(330)의 다른 구성요소는 바람직하게는 재사용 가능하고 독립형 벤치탑 장치로서 또는 다중-모듈 세포 처리 시스템에서 모듈로서 기능한다.
[0088] 세포 성장 장치(330)의 프로세서(제시되지 않음)는 성장 세포 배양물에 대한 "블랭크" 또는 대조군으로서 사용될 정보로 프로그래밍될 수 있다. "블랭크" 또는 대조군은 세포 성장 배지만을 함유하는 용기이며, 이는 100% 투과율 및 0 OD를 생성하는 반면, 세포 샘플은 광선을 편향시키고 더 낮은 투과율 및 더 높은 OD를 가질 것이다. 세포가 배지에서 성장하고 밀도가 높아짐에 따라, 투과율이 감소하고 OD가 증가할 것이다. 세포 성장 장치(330)의 프로세서(제시되지 않음)는 세포 배양(예를 들어, 포유류 세포, 박테리아 세포, 동물 세포, 효모 세포 등)에서 전형적으로 사용되는 성장 배지에 상응하는 블랭크에 대한 파장 값을 사용하도록 프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 제2 분광광도계 및 용기가 세포 성장 장치(330)에 포함될 수 있으며, 여기서 제2 분광광도계는 지정된 간격으로 블랭크를 판독하는 데 사용된다.
[0089] 도 3d는 광원(390), 검출기(392) 및 열 구성요소(394)에 결합된 도 3b의 세포 성장 장치(330)를 포함하는 조립체의 일부로서 세포 성장 장치(330)를 예시한다. 회전 성장 바이알(300)은 세포 성장 장치에 삽입된다. 광원(390) 및 검출기(392)의 구성요소(예를 들어, 5-로그를 커버하는 획득 제어를 갖는 포토다이오드)는 세포 성장 장치의 메인 하우징에 결합된다. 회전 성장 바이알(300)을 회전시키는 모터를 수용하는 하부 하우징(332)이 예시되며, 이는 세포 성장 장치(330)를 조립체에 고정시키는 플랜지(334) 중 하나이다. 또한, 예시된 열 구성요소(394)는 펠티에 장치 또는 열전기 냉각기이다. 이러한 구현예에서, 열 제어는 하부 하우징(332)의 베이스 상의 플랜지(334)를 통해 열 구성요소(394)에 대한 세포 성장 장치(330)의 부착 및 전기적 통합에 의해 달성된다. 열전기 냉각기는 전류 흐름의 방향에 따라 표면을 냉각시키거나 표면을 가열하여 접합의 양측으로 열을 "펌핑"할 수 있다. 일 구현예에서, 서미스터(thermistor)가 사용되어 메인 하우징의 온도를 측정한 후, 표준 전자 비례-적분-미분(PID) 제어기 루프를 통해, 회전 성장 바이알(300)은 대략 +/- 0.5℃로 제어된다.
[0090] 사용시, 세포는 호일 밀봉 또는 필름을 관통함으로써 회전 성장 바이알(300)의 사전 충전된 성장 배지에 접종된다(예를 들어, 세포는 자동화된 액체 핸들링 시스템으로부터 또는 사용자에 의해 피펫팅될 수 있다). 세포 성장 장치(330)의 프로그래밍된 소프트웨어는 성장을 위한 제어 온도, 전형적으로 30℃를 설정한 후, 회전 성장 바이알(300)의 회전을 천천히 시작한다. 세포/성장 배지 혼합물은 회전 성장 바이알(300)이 혼합물의 넓은 표면적을 정상적인 산소 환경에 노출시키는 것을 가능하게 하는 원심력으로 인해 벽 위로 천천히 수직으로 이동한다. 성장 모니터링 시스템은 사전 설정된 또는 사전 프로그래밍된 시간 간격으로 OD 또는 OD 측정값을 연속적으로 판독한다. 이들 측정은 내부 메모리에 저장되며, 요청시 소프트웨어는 시간 대비 측정을 플롯팅하여 성장 곡선을 표시한다. 예를 들어, 성장 조건을 최적화하기 위해 향상된 혼합이 요구되는 경우, 바이알 회전 속도는 액체의 축방향 전진을 야기하도록 변경될 수 있고/있거나 완전한 방향 변화가 프로그래밍된 간격으로 수행될 수 있다. 성장 모니터링은 사전 결정된 OD에서 성장 단계를 자동으로 종결시킨 후, 혼합물을 더 낮은 온도로 신속하게 냉각시켜 추가 성장을 억제하도록 프로그래밍될 수 있다.
[0091] 세포 성장 장치(330)에 대한 한 가지 응용은 성장 세포 배양물의 광학 밀도를 지속적으로 측정하는 것이다. 설명된 세포 성장 장치의 한 가지 이점은 광학 밀도가 연속적으로(동역학적 모니터링) 또는 특정 시간 간격, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60초마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10분마다 측정될 수 있다는 점이다. 세포 성장 장치(330)가 성장 세포 배양물의 광학 밀도(OD)를 측정하는 맥락에서 설명되었지만, 본 발명의 명세서의 교시내용을 고려할 때 다른 세포 성장 파라미터가 세포 배양 OD에 더하여 또는 이를 대신하여 측정될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 상기 설명된 고체 벽 장치 또는 모듈과 관련된 세포 성장의 선택적 측정과 마찬가지로, 가시 광선, UV 또는 근적외선(NIR) 광을 사용하는 분광법은 세포 배양물 내의 영양소 및/또는 폐기물의 농도를 모니터링하는 것을 가능하게 하고, 다른 분광 측정이 이루어질 수 있고, 즉, 다른 스펙트럼 특성이, 예를 들어, 유전 임피던스 분광법, 가시 형광, 형광 분극 또는 발광을 통해 측정될 수 있다. 또한, 세포 성장 장치(430)는, 예를 들어, 용존 산소, 이산화탄소, pH, 전도도 등을 측정하기 위한 추가 센서를 포함할 수 있다. 회전 성장 바이알 및 세포 성장 장치에 관한 추가 세부사항에 대해서는, 2019년 3월 21일에 출원된 USSN 16/360,404; 및 2019년 3월 21일 출원된 16/360,423을 참조한다.
세포 농축 모듈
[0092] 회전 성장 바이알 및 세포 성장 모듈과 관련하여 상기 설명된 바와 같이, 형질전환 또는 형질감염을 위한 적절한 수의 세포를 획득하기 위해, 세포는 전형적으로 관심 세포의 성장에 적절한 배지에서 특정 광학 밀도로 성장되나; 효과적인 형질전환 또는 형질감염을 위해, 세포의 부피를 감소시킬뿐만 아니라 완충액 또는 배지 교환을 통해 세포를 적격으로 만드는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 열거된 공정을 위한 세포 처리 시스템에서 요구되는 하나의 하위-구성요소 또는 모듈은 세포를 성장시키고/시키거나, 완충액 교환을 수행하고/하거나, 세포를 농축시킬 수 있고, 이들이 세포의 게놈을 조작하거나 편집하는 데 필요한 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있도록 이들을 적격으로 만드는 모듈 또는 구성요소이다.
[0093] 도 4a는 보유물 부재(422)(상단), 투과물 부재(420)(중간) 및 보유물 부재(422), 막(424)(도 4a에서 제시되지 않음) 및 투과물 부재(420)(또한 제시되지 않음)를 포함하는 접선 유동 조립체(410)(하단)를 제시한다. 도 4a에서, 보유물 부재(422)는 보유물 부재(422)의 하나의 하부 코너에서(특히, 보유물 포트(428)에서) 시작하고, 보유물 부재(422)를 가로질러 횡단하고 이의 위 및 이후 아래로 가로질러 제2 보유물 포트(428)에서 보유물 부재(422)의 다른 하부 코너에서 종료하는 구불구불한 구성을 갖는 접선 유동 채널(402)을 포함한다. 또한, 보유물 부재(422)에는 막 또는 필터(이러한 도 4a에 제시되지 않음)가 안착되는 영역의 경계를 제한할 뿐만 아니라 채널(402)의 영역 사이에 맞물리는 에너지 디렉터(491)가 관찰된다. 이러한 구현예에서, 에너지 디렉터(491)는 투과물/여과물 부재(420)(우측) 상의 에너지 디렉터 구성요소(491)를 통해 투과물/여과물 부재(420)와 보유물 부재(422)의 초음파 용접 또는 결합과 짝을 이루고 이를 촉진하는 역할을 한다. 추가로, 카운터싱크(423)가 관찰될 수 있는데, 2개는 보유물 부재(422)의 하부에, 1개는 상부 중간에 존재한다. 카운터싱크(423)는 접선 유동 조립체(410)를 저장소 조립체(이러한 도 4a에는 제시되지 않지만 도 4b 참조)에 결합시키는 데 사용된다.
[0094] 투과물/여과물 부재(420)는 도 4a의 중간에서 제시되며, 에너지 디렉터(491)에 더하여 각각의 하단 코너에서 보유물 포트(428)에 대한 관통-홀(이는 보유물 부재(422)의 하단 코너에서 보유물 포트(428)에 대한 관통-홀과 짝을 이룸)뿐만 아니라 접선 유동 채널(402) 및 투과물 부재(420)의 상부 및 중간에 위치된 2개의 투과물/여과물 포트(426)를 포함한다. 본 구현예에서 접선 유동 채널(402) 구조는 구불구불한 구성 및 물결 모양의 기하학적 구조를 갖지만, 다른 기하학적 구조가 사용될 수 있다. 투과물 부재(420)는 또한 보유물 부재(420) 상의 카운터싱크(423)와 일치하는 카운터싱크(423)를 포함한다.
[0095] 도 4a의 좌측에는 도 4a에서 제시된 보유물 부재(422) 및 투과물 부재(420)를 포함하는 접선 유동 조립체(410)가 있다. 이러한 도면에서, 보유물 부재(422)는 도면의 "상단"에 있고, 막(조립체의 이러한 도면에서 제시되지 않음)은 보유물 부재(422)에 인접하고 그 아래에 있을 것이며, 투과물 부재(420)(또한 조립체의 이러한 도면에서 제시되지 않음)는 막에 인접하고 그 아래에 있다. 다시, 카운터싱크(423)가 관찰되며, 여기서 보유물 부재(422) 및 투과물 부재(420)의 카운터싱크는 일치하고 저장소 조립체에 배치된 카운터싱크에 대한 스레드(thread) 또는 짝지음(mating) 요소와 짝을 이루도록 구성된다(도 4a에 제시되지 않았지만 도 4b 참조).
[0096] 막 또는 필터는 보유물 및 투과물 부재 사이에 배치되며, 여기서 유체는 막을 통해 유동할 수 있지만, 세포는 유동할 수 없고, 따라서 보유물 부재에 배치된 유동 채널에 보유된다. TFF 장치/모듈에 사용하기에 적절한 필터 또는 막은 용매 내성이고, 여과 동안 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있는 것들이다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 포어 크기는 0.2 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형의 경우, 포어 크기는 20 μm만큼 클 수 있다. 실제로, TFF 장치/모듈에 유용한 포어 크기는 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μμm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론, 유리 섬유, 또는 레이저 또는 전기화학 에칭의 경우에서와 같이 금속 기판을 포함하는 임의의 적합한 비-반응성 물질로 제조될 수 있다.
[0097] 채널 구조(402)의 길이는 성장될 세포 배양물의 부피 및 농축될 세포 배양물의 광학 밀도에 따라 달라질 수 있다. 채널 구조의 길이는 전형적으로 60 mm 내지 300 mm, 또는 70 mm 내지 200 mm, 또는 80 mm 내지 100 mm이다. 유동 채널(402)의 횡단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 변을 갖는 또 다른 형상인 경우, 횡단면은 약 10 μm 내지 1000 μm 폭, 또는 200 μm 내지 800 μm 폭, 또는 300 μm 내지 700 μm 폭, 또는 400 μm 내지 600 μm 폭; 약 10 μm 내지 1000 μm 높이, 또는 200 μm 내지 800 μm 높이, 또는 300 μm 내지 700 μm 높이, 또는 400 μm 내지 600 μm 높이일 수 있다. 유동 채널(102)의 횡단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 50 μm 내지 1000 μm 수력 반경, 또는 5 μm 내지 800 μm 수력 반경, 또는 200 μm 내지 700 μm 수력 반경, 또는 300 μm 내지 600 μm 수력 반경, 또는 약 200 내지 500 μm 수력 반경일 수 있다. 또한, 보유물(422) 및 투과물(420) 부재의 채널의 부피는 각각의 부재의 채널의 깊이에 따라 상이할 수 있다.
[0098] 도 4b는 도 4a에 제시된 접선 유동 조립체(410)와 함께 사용되도록 구성된 저장소 조립체(450)의 전방 사시도(우측) 및 후방 사시도(좌측)를 제시한다. 전방 사시도(예를 들어, 도 4a에 제시된 접선 유동 조립체(410)에 결합된 저장소 조립체(450) 측면인 "전방")에서 투과물 저장소(454)의 양 측에 있는 보유물 저장소(452)가 관찰된다. 투과물 포트(426), 보유물 포트(428), 및 카운터싱크(423)(카운터싱크(423)는 이러한 도 4b에 제시되지 않음)에 대한 3개의 스레드 또는 짝지음 요소(425)가 또한 관찰된다. 카운터싱크(423)에 대한 스레드 또는 짝지음 요소(425)는 접선 유동 조립체(410)(도 4a에 제시됨)를 저장소 조립체(450)에 짝을 이루거나 결합시키도록 구성된다. 대안적으로 또는 추가로, 패스너, 음파 용접 또는 열 스테이크가 접선 유동 조립체(410)를 저장소 조립체(450)에 짝을 이루거나 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 저장소 조립체(450)의 상부를 덮는 개스킷(445)이 관찰된다. 개스킷(445)은 도 4e와 관련하여 상세히 설명된다. 도 4b의 좌측은 저장소 조립체(1250)의 후방 사시도이고, 여기서 "후방"은 접선 유동 조립체에 결합되지 않은 저장소 조립체(450)의 측면이다. 보유물 저장소(452), 투과물 저장소(454) 및 개스킷(445)이 관찰된다.
[0099] TFF 장치는 스테인리그 강철, 실리콘, 유리, 알루미늄, 또는 플라스틱, 예를 들어, 사이클릭-올레핀 공중합체(COC), 사이클로-올레핀 중합체(COP), 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰, 및 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 채널(및 채널 분지)이 밀링될 수 있는 임의의 견고한 물질로 제조될 수 있다. TFF 장치/모듈이 일회용인 경우, 바람직하게는 이는 플라스틱으로 제조된다. 일부 구현예에서, TFF 장치/모듈을 제조하는 데 사용되는 물질은 열 전도성이어서 세포 배양물이 원하는 온도로 가열되거나 냉각될 수 있다. 특정 구현예에서, TFF 장치는 정밀 기계 가공, 레이저 가공, 전기 방전 가공(금속 장치의 경우); 습식 또는 건식 에칭(실리콘 장치의 경우); 건식 또는 습식 에칭, 분말 또는 샌드블라스팅(sandblasting), 광구조화(유리 장치의 경우); 또는 이러한 대량 생산 기술에 적합한 상기 언급된 물질을 사용한 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공(플라스틱 장치의 경우)에 의해 형성된다.
[00100] 도 4c는 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)의 상부 평면도를 도시한다. 도 4d는 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)에 대한 커버(444)를 도시하고, 4e는 작동 중에 도 4b에 제시된 저장소 조립체(450)의 커버(444) 상에 배치되는 개스킷(445)을 도시한다. 도 4c는 투과물 저장소(454)의 양측에 하나씩 있는 2개의 보유물 조장소(452)의 상부를 제시하는 저장소 조립체(450)의 상부 평면도이다. 또한, 공압 포트(제시되지 않음)와 짝을 이룰 그루브(432), 및 투과물 부재(420) 및 막(424)(제시되지 않음) 내의 보유물 포트에 대한 관통-홀을 통해 보유물 저장소(452)와 보유물 포트(428)(제시되지 않음)를 유체적으로 결합시키는 보유물 저장소(452)의 하부에 존재하는 유체 채널(434)이 관찰된다. 도 4d는 저장소 조립체(450)의 상부에 배치되도록 구성된 커버(444)를 도시한다. 커버(444)는 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)의 상부에 둥근 컷-아웃(cut-out)을 갖는다. 다시, 보유물 저장소(452)의 하부에서, 유체 채널(434)이 관찰될 수 있으며, 여기서 유체 채널(434)은 보유물 저장소(452)를 보유물 포트(428)(제시되지 않음)와 유체적으로 결합시킨다. 또한, 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 공압 포트(430)가 제시된다. 도 4e는 저장소 조립체(450)의 커버(444) 위에 배치되도록 구성된 개스킷(445)을 도시한다. 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 유체 전달 포트(442)가 관찰된다. 다시, 각각의 보유물 저장소(452) 및 투과물/여과물 저장소(454)에 대한 3개의 공압 포트(430)가 제시된다.
[00101] 세포 성장을 위한 전체 작업 흐름은 성장될 세포 배양물을 제1 보유물 저장소에 로딩하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 적절한 기체를 버블링하고, 투과물 포트(406) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 배지 또는 완충액을 수집하는 동안 세포 배양물을 제1 보유물 포트를 통해 그리고 이후 TFF 채널 구조를 통해 접선으로 통과시키거나 유동시키고, 제2 보유물 포트(404)를 통해 세포 배양물을 제2 보유물 저장소로 수집하고, 선택적으로 세포 배양물에 추가의 또는 상이한 배지를 첨가하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 기체를 버블링시키고, 이후 모두, 예를 들어, 보유물 저장소에서 연속적으로 또는 원하는 간격으로 세포 배양물의 광학 밀도를 측정하는 한편 상기 과정을 반복하는 것을 포함한다. 프로그래밍된 시간 간격에서 광학 밀도(OD)의 측정은 성장하는 세포를 함유하는 보유물 저장소(들)로 광학계를 통해 컬럼화된 600 nm 발광 다이오드(LED)를 사용하여 달성된다. 광은 수집 광학계를 통해 (디지털) 이득-제어 실리콘 포토다이오드로 구성된 검출 시스템으로 계속된다. 일반적으로, 광학 밀도는 광학 감쇠기의 전력 전송 계수의 밑이 10인 로그의 절대값으로 제시된다: OD = -log10 (파워 아웃(Power out)/파워 인(Power in)). OD는 광 감쇠(즉, 흡수, 산란 및 반사의 합)의 척도이기 때문에, TFF 장치 OD 측정은 전체 전력 전송을 기록하므로, 세포가 성장하고 집단의 밀도가 높아짐에 따라 OD(신호 손실)가 증가한다. OD 시스템은 측정 프로그램에 의해 접근할 수 있는 온-보드(on-board) 메모리에 저장된 이들 값으로 OD 표준에 대해 사전 보정된다.
[00102] 채널 구조에서, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면(보유물 측면(422))에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 여과물 또는 투과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(420))으로 유동하도록 한다. 세포 배양을 통한 버블링 공기 또는 다른 적절한 기체는 둘 모두가 세포 성장을 향상시키기 위해 배양물을 통기시키고 혼합한다. 공정 동안, 채널 구조를 통한 유동 동안 제거되는 배지는 투과물/여과물 포트(406)를 통해 제거된다. 대안적으로, 세포는 한 저장소에서 다른 저장소로 TFF 채널을 통해 세포를 통과시키지 않고 버블링 또는 교반과 함께 한 저장소에서 성장될 수 있다.
[00103] TFF 장치/모듈을 사용하는 세포 농축에 대한 전체 작업 흐름은 채널 구조를 통해 접선 방향으로 세포 배양물 또는 세포 샘플을 유동시키는 것을 포함한다. 세포 성장 공정에서와 같이, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 투과물/여과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(420))으로 유동하도록 한다. 이러한 공정에서, 세포 샘플이 보유물 포트(404) 중 하나에 수집될 때까지 배지 또는 완충액 내의 세포의 고정된 부피가 장치를 통해 구동되고, 막을 통과한 배지/완충액은 투과물/여과물 포트(406) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 수집된다. 모든 유형의 원핵생물 및 진핵생물 세포(부착성 및 비-부착성 세포 둘 모두)는 TFF 장치에서 성장될 수 있다. 부착성 세포는 TFF 장치를 통해 유동하는 배지에 현탁된 비드 또는 다른 세포 스캐폴드에서 성장될 수 있다.
[00104] 세포 농축 장치/모듈에서 세포를 현탁시키는 데 사용되는 배지 또는 완충액은 LB, SOC, TPD, YPG, YPAD, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액(Hank), PBS 및 링거액과 같은 형질전환되거나 형질감염되는 세포의 유형에 대한 임의의 적합한 배지 또는 완충액일 수 있으며, 여기서 배지는 키트의 일부로서 시약 카트리지에 제공될 수 있다. 부착 세포의 배양을 위해, 세포는 비드, 마이크로캐리어 또는 배지에 현탁된 다른 유형의 스캐폴드에 배치될 수 있다. 조혈계에서 유래한 세포를 제외한 대부분의 정상적인 포유동물 조직 유래된 세포는 고정 의존적이며 정상적인 증식을 위해 표면 또는 세포 배양 지지대를 필요로 한다. 본원에 기술된 회전 성장에서, 마이크로캐리어 기술이 활용된다. 특정 용도의 마이크로캐리어는 일반적으로 직경이 100-300 μm이고, 배양 배지의 밀도보다 약간 더 큰 밀도를 가지지만(따라서 예를 들어, 배지 교환을 위해 세포와 배지의 용이한 분리를 가능하게 함) 밀도 또한 세포에 대한 유체역학적 손상을 방지하기 위해 최소 교반 속도로 담체의 완전한 현탁을 허용하도록 충분히 낮아야 한다. 많은 다양한 유형의 마이크로캐리어가 입수가능하며, 다양한 마이크로캐리어는 다양한 유형의 세포에 최적화된다. 양으로 하전된 담체, 예컨대 Cytodex 1(덱스트란 기반, GE Healthcare), DE-52(셀룰로스 기반, Sigma-Aldrich Labware), DE-53(셀룰로스 기반, Sigma-Aldrich Labware) 및 HLX 11-170(폴리스티렌 기반); Cytodex 3(덱스트란 기반, GE Healthcare) 또는 HyQ-스피어 Pro-F 102-4(폴리스티렌 기반, Thermo Scientific)와 같은 콜라겐 또는 ECM(세포외 기질) 코팅된 담체; HyQ-스피어 P 102-4(Thermo Scientific)와 같은 비하전 캐리어; 또는 젤라틴(Cultisphere, Percell Biolytica) 또는 셀룰로스(Cytopore, GE Healthcare)를 기반으로 하는 거대다공성 담체가 존재한다.
[00105] 세포 성장 및 농축 공정 둘 모두에서, 세포 샘플을 TFF 장치를 통해 통과시키고 보유물 포트(404) 중 하나에서 세포를 수집하는 한편 투과물/여과물 포트(406) 중 하나에서 배지를 수집하는 것은 세포 샘플의 "1회 통과"로 간주된다. 보유물 저장소 사이의 이동은 배양물을 "플립(flip)"시킨다. 제공된 통과에 대해 각각 세포 및 배지를 수집하는 보유물 및 투과물 포트는 보유물 및 투과물/여과물 면에 대해 2개의 별개의 별개의 유동 층이 존재하도록 배열된 유체 연결이 있는 TFF 장치/모듈의 동일한 말단에 존재하나, 보유물 포트(404)가 장치/모듈의 보유물 부재에 존재하는 경우(즉, 세포가 막 위의 채널을 통해 구동되고, 여과물(배지)이 막 아래의 채널 부분으로 통과함), 투과물/여과물 포트(406)는 장치/모듈의 투과물 부재에 존재하거나 그 반대일 것이다(즉, 세포 샘플이 막 아래의 채널을 통해 구동되는 경우, 여과물(배지)은 막 상의 채널 부분으로 통과함). TFF 장치의 유동 채널을 통해 세포 배양물 및 유체를 전달하는 데 사용되는 고압으로 인해, 중력의 영향은 무시할 수 있다.
[00106] 성장 및 농축 공정 중 어느 하나에서 "통과"의 종료시, 세포 샘플은 보유물 포트(404)를 통해 보유물 저장소(제시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 또 다른 "통과"를 개시하기 위해, 세포 샘플은 TFF 장치를 통해 다시 통과되며, 이번에는 첫 번째 통과와 반대되는 유동 방향으로 통과된다. 세포 샘플은 보유물 포트(404)를 통해 첫 번째 통과 동안 세포를 수집하기 위해 사용된 보유물 포트(404)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 보유물 저장소(제시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 마찬가지로, 제2 통과에서 막을 통과하는 배지/완충액은 제1 통과 동안 여과물을 수집하는 데 사용된 투과물 포트(406)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 투과물 포트(406)를 통해 또는 둘 모두의 포트를 통해 수집된다. 보유물(농축된 세포 샘플)을 장치/모듈을 통해 통과시키는 이러한 교대 공정은 세포가 원하는 광학 밀도로 성장되고/되거나 원하는 부피로 농축될 때까지 반복되며, 둘 모두의 투과물 포트(즉, 하나 초과가 존재하는 경우)는 작업 시간을 감소시키기 위해 통과 동안 개방될 수 있다. 또한, 완충액 교환은 또 다른 "통과"를 개시하기 전에 원하는 완충액(또는 신선한 배지)을 보유물 저장소의 세포 샘플에 첨가하고, 오래된 배지 또는 완충액이 희석되고 여과될 때까지 이러한 과정을 반복함으로써 수행될 수 있으며, 세포는 신선한 배지 또는 완충액에 존재한다. 완충액 교환 및 세포 성장은 동시에 발생할 수 있고(전형적으로 동시에 발생하고), 완충액 교환 및 세포 농축은 동시에 발생할 수 있음(전형적으로 동시에 발생함)을 유의한다. TFF에 대한 추가 정보 및 대안적 구현예에 대해서는, 예를 들어, 2018년 9월 07일에 출원된 USSN 62/728,365; 2019년 6월 05일 출원된 62/857,599; 및 2019년 6월 27일 출원된 62/867,415를 참조한다.
세포 형질전환 모듈
[00107] 도 5a는 TFF 모듈과 함께 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 사용될 수 있는 예시적인 조합 시약 카트리지 및 전기천공 장치(500)("카트리지")를 도시한다. 또한, 특정 구현예에서, 카트리지를 제조하는데 사용되는 물질은 열 전도성이며, 특정 구현예에서, 카트리지(500)는 시약 저장소 또는 저장소(504)에서 시약을 가열하거나 냉각시키는 열 장치(미제시됨), 예컨대 펠티에 장치 또는 열전 냉각기와 접촉한다. 시약 저장소 또는 저장소(504)는 도 5a에 도시된 바와 같이 시약의 개별 튜브가 삽입되는 저장소일 수 있거나, 시약 저장소는 삽입된 튜브 없이 시약을 보유할 수 있다. 또한 시약 카트리지의 저장소는 튜브, 공동 결합된 튜브 및 시약의 직접 충전의 임의의 조합을 위해 구성될 수 있다.
[00108] 일 구현예에서, 시약 카트리지(500)의 시약 저장소 또는 저장소(504)는 예를 들어, 250 ml 튜브, 25 ml 튜브, 10 ml 튜브, 5 ml 튜브, 및 에펜도르프 또는 마이크로원심분리기 튜브를 포함하는 다양한 크기의 튜브를 유지하도록 구성된다. 또 다른 구현예에서, 모든 저장소는 동일한 크기의 튜브, 예를 들어 5 ml 튜브를 유지하도록 구성될 수 있으며, 저장소 삽입물은 시약 저장소에 더 작은 튜브를 수용하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 특히 시약 카트리지가 일회용인 구현예에서, 시약 저장소는 삽입된 튜브 없이 시약을 보유한다. 이 일회용 구현예에서, 시약 카트리지는 키트의 일부일 수 있으며, 여기서 시약 카트리지는 시약으로 미리 충전되고, 리셉터클 또는 저장소는 예를 들어 호일, 열 밀봉 아크릴 등으로 밀봉되어 소비자에게 제공되며, 그 후 시약 카트리지는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 사용될 수 있다. 당업자는 본 개시내용을 고려할 때, 시약 카트리지에 함유된 시약이 워크플로우에 따라 다양할 것임을 이해할 것이며; 즉, 시약은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 세포가 처리되는 공정, 예를 들어, 단백질 생산, 세포 형질전환 및 배양, 세포 편집 등에 따라 달라질 것이다.
[00109] 시약, 예컨대 세포 샘플, 효소, 완충액, 핵산 벡터, 발현 카세트, 단백질 또는 펩티드, 반응 구성요소(예컨대, MgCl2, dNTP, 핵산 조립체 시약, gap 수복 시약 등), 세척 용액, 에탄올, 및 핵산 정제 및 분리를 위한 자석 비드 등이 공지된 위치에서 시약 카트리지에 위치할 수 있다. 카트리지(500)의 일부 구현예에서, 카트리지는 시약을 분배하기 위한해 프로세서(미도시)에 의해 판독 가능한 스크립트(미도시)를 포함한다. 또한, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 하나의 구성요소인 카트리지(500)는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 의해 수행될 2, 3, 4, 5, 10개 이상의 공정을 지정하는 스크립트를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 시약 카트리지는 일회용이며, 특정 세포 처리 프로토콜, 예를 들어 게놈 편집 또는 단백질 생산을 수행하도록 맞춤화된 시약으로 사전 포장되어 있다. 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기 또는 시스템의 구성요소/모듈은 그렇지 않을 수 있지만 시약 카트리지 함유물은 다양하기 때문에 특정 시약 카트리지와 연결된 스크립트는 사용된 시약 및 수행된 세포 공정과 매칭된다. 따라서, 예를 들어, 시약 카트리지는 게놈 편집을 위한 시약 및 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 게놈 편집을 수행하기 위한 공정 단계를 지정하는 스크립트, 또는 예를 들어, 단백질 발현을 위한 시약 및 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 단백질 발현을 수행하기 위한 공정 단계를 지정하는 스크립트와 함께 사전 포장될 수 있다.
[00110] 예를 들어, 시약 카트리지는 저장소로부터의 적격 세포를 피펫팅하고, 세포를 형질전환 모듈에 옮기고, 시약 카트리지의 또 다른 저장소로부터의 발현 카세트가 있는 벡터를 포함하는 핵산 용액을 피펫팅하고, 핵산 용액을 형질전환 모듈로 옮기고, 지정된 시간 동안 형질전환 공정을 시작한 다음 형질전환된 세포를 시약 카세트의 또 다른 저장소 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 세포 성장 모듈과 같은 또 다른 모듈에 옮기기 위한 스크립트를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 시약 카트리지는 시약 카세트의 저장소로부터의 벡터를 포함하는 핵산 용액, 시약 카세트의 저장소에서 편집 올리고뉴클레오티드 카세트를 포함하는 핵산 용액, 및 또 다른 저장소로부터의 핵산 조립체 혼합물을 존재하는 경우 핵산 조립체/탈염 모듈에 전달하기 위한 스크립트를 포함할 수 있다. 스크립트는 또한 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 다른 모듈에 의해 수행된 공정 단계를 지정할 수 있다. 예를 들어, 스크립트는 핵산 조립체/탈염 저장소가 30분 동안 50℃로 가열되어 조립된 생성물을 생성하고; 일련의 피펫 전달 및 자성 비드, 에탄올 세척액 및 완충액의 혼합을 포함하는 자성 비드 기반 핵산 정제를 통해 조립된 생성물을 탈염시키고, 재현탁하는 것을 지정할 수 있다.
[00111] 하기 도 5b 및 5c와 관련하여 설명된 바와 같이, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 사용하기 위한 예시적인 시약 카트리지는 하나 이상의 전기천공 장치, 바람직하게는 FTEP(관통형 전기천공) 장치를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 시약 카트리지는 형질전환 모듈로부터 분리된다. 전기천공은 전기 자극으로 세포막에 일시적으로 기공을 생성하여 작동하는 세포막의 투과성을 위해 널리 사용되는 방법이다. 전기천공의 적용에는 DNA, RNA, siRNA, 펩티드, 단백질, 항체, 약물 또는 기타 물질을 포유동물 세포(인간 세포 포함), 식물 세포, 고세균, 효모, 기타 진핵 세포, 박테리아 및 다른 세포 유형과 같은 다양한 세포에 전달하는 것이 포함된다. 전기 자극은 또한 하이브리도마 또는 다른 융합 세포의 생산에서 세포 융합에 사용될 수 있다. 전형적인 전기천공 절차 동안, 세포는 세포 생존에 유리한 완충액 또는 배지에 현탁된다. 박테리아 세포 전기천공의 경우, 물, 글리세롤 용액 등과 같은 낮은 전도도 매질은 일시적 고전류에 의한 열 생성을 줄이기 위해 종종 사용된다. 전통적인 전기천공 장치에서 세포 내로 전기천공될 세포와 물질(총칭하여 "세포 샘플")은 방전을 위한 두 개의 평평한 전극이 내장된 큐벳에 넣는다. 예를 들어 Bio-Rad(Hercules, CA)는 큐벳의 세포를 전기천공하기 위한 GENE PULSER XCELL™ 제품 라인을 만든다. 전통적으로 전기천공은 높은 전계 강도를 필요로 한다; 그러나 시약 카트리지에 포함된 관통형 전기천공 장치는 낮은 독성으로 고효율 세포 전기천공을 달성한다. 본 개시내용의 시약 카트리지는 공기 치환 피펫터와 같은 자동화된 기기 및 시스템에서 일반적으로 사용되는 로봇식 액체 취급 기구와의 특히 용이한 통합을 허용한다. 이러한 자동화 기기에는 Tecan(Mannedorf, Switzerland), Hamilton(Reno, NV), Beckman Coulter(Fort Collins, CO) 등의 기성품 자동 액체 처리 시스템이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
[00112] 도 5b 및 5c는 각각 도 5a의 시약 카트리지(500)의 일부(예를 들어, 이의 구성요소)일 수 있거나 독립형 모듈, 즉, 시약 카트리지 또는 기타 모듈의 일부가 아닐 수 있는 예시적 FTEP 장치(550)의 상부 사시도 및 하부 사시도이다. 도 5b는 FTEP 장치(550)를 도시한다. FTEP 장치(550)는 세포 샘플 입구(552) 및 세포 샘플 출구(554)를 정의하는 웰을 갖는다. 도 5c는 도 5b의 FTEP 장치(550)의 하부 사시도이다. 이러한 도면에서 입구 웰(552) 및 출구 웰(554)이 관찰될 수 있다. 또한, 도 5c에는 웰(552)에 상응하는 입구(562)의 하부, 출구 웰(554)에 상응하는 출구(564)의 하부, 정의된 유동 채널(566)의 하부 및 유동 채널(566)의 양측면 상의 2개의 전극(568)의 하부가 관찰된다. FTEP 장치는 다중-통과 전기천공 절차를 허용하는 푸쉬-풀(push-pull) 공압 수단을 포함할 수 있고; 즉, 전기천공될 세포는 전기천공의 1회 통과를 위해 입구로부터 출구를 향해 "당겨질" 수 있고, 이후 FTEP 장치의 출구 단부로부터 입구 단부로 "밀어"져서 전기천공의 또 다른 통과에 대해 다시 전극 사이를 통과할 수 있다. 또한, 이러한 공정은 1회 내지 여러 번 반복될 수 있다. FTEP 장치에 관한 추가 정보에 대해서는, 예를 들어, 2018년 9월 28일 출원된 USSN 16/147,120; 2018년 9월 28일 출원된 16/147,353; 2019년 5월 30일 출원된 16/426,310; 및 2018년 9월 30일 출원된 16/147,871; 및 2019년 6월 18일 발행된 USPN 10,323,258를 참조한다. 또한, 시약 카트리지의 다른 구현예는 2018년 8월 22일에 출원된 USSN 16/109,156에 설명된 것과 같이 FTEP 장치로 구성되지 않은 전기천공 장치를 제공하거나 수용할 수 있다. 본 발명의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 유용한 시약 카트리지에 대해서는, 예를 들어, 2019년 8월 13일에 발행된 USPN 10,376,889; 및 2019년 6월 25일 출원된 16,451,601을 참조한다.
[00113] FTEP 장치의 추가 세부사항은 도 5d-5f에 예시된다. 도 5d-5f의 FTEP 장치에서 전극은 제1 전극이 유동 채널의 입구와 좁아진 영역 사이에 배치되고, 제2 전극이 유동 채널의 좁아진 영역과 출구 사이에 배치되도록 배치됨에 유의한다. 도 5d는 세포 및 외인성 물질을 함유하는 유체를 FTEP 장치(550)에 도입하기 위한 입구(552) 및 천기천공 후 FTEP로부터 형질전환된 세포를 제거하기 위한 출구(554)를 갖는 FTEP 장치(550)의 상부 평면도를 제시한다. 전극(568)은 장치의 채널(제시되지 않음)을 통해 도입된다. 도 5e는 입구(552), 출구(554), 및 유동 채널(566)과 관련하여 위치된 전극(568)을 갖는 FTEP 장치(550)의 상부로부터의 단면도를 제시한다. 도 5f는 입구(552) 및 입구 채널(572), 및 출구(554) 및 출구 채널(574)을 갖는 FTEP 장치(550)의 측단면도를 제시한다. 전극(568)은 유동 채널(566)과 유체 연통하지만, 유동 채널(566)을 통해 이동하는 세포의 경로에 직접적으로 있지 않도록 전극 채널(576)에 위치된다. 제1 전극은 유동 채널의 입구와 좁아진 영역 사이에 배치되고, 제2 전극은 유동 채널의 좁아진 영역과 출구 사이에 배치된다는 점에 유의한다. 장치의 이러한 양태에서 전극(568)은 일반적으로 유동 채널(566)에 수직인 전극 채널(576)에 위치하여 세포 및 외인성 물질을 함유하는 유체가 유동 채널(566)을 통해 입구 채널(572)로부터 출구 채널(574)로 유동하고, 상기 공정에서 유체는 전극 채널(376)로 유동하여 전극(568)과 접촉된다. 이러한 양태에서, 입구 채널, 출구 채널 및 전극 채널은 모두 장치의 동일한 평면 측으로부터 유래한다. 그러나, 특정 양태에서, 전극은 입구 및 출구 채널과는 상이한 FTEP 장치의 평면 측으로부터 도입될 수 있다.
[00114] 본 발명의 개시의 FTEP 장치에서, 형질전환의 독성 수준은 세포 유형 및 세포에 도입되는 핵산에 따라 전기천공 후 30% 초과의 살아 있는 세포, 바람직하게는 형질전환 후 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 초과의 살아 있는 세포를 발생시킨다.
[00115] FTEP 장치의 하우징은 FTEP 장치가 재사용되는지, 오토클레이브되는지 또는 일회용인지에 따라 스테인리스 강철, 실리콘, 유리, 수지, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 많은 물질로 제조될 수 있다. 유사하게, 장치 내의 채널의 벽은 실리콘, 수지, 유리, 유리 섬유, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 바람직한 물질은 결정 스티렌, 사이클로-올레핀 중합체(COP) 및 사이클릭 올레핀 공중합체(COC)를 포함하며, 이는 전극 및, 예를 들어, 존재시 하부 밀봉 필름을 제외하고는 한 조각으로 사출 성형함으로써 장치가 완전히 형성될 수 있도록 한다.
[00116] 본원에 설명된 FTEP 장치(또는 FTEP 장치의 일부)는, 예를 들어, 전체 장치로서 또는 융합되거나 달리 결합되는 구조적 층의 생성에 의해 다양한 기술을 통해 생성되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 금속 FTEP 장치의 경우, 제조는 정밀 기계 가공 또는 레이저 가공을 포함할 수 있으며; 실리콘 FTEP 장치의 경우, 제조는 건식 또는 습식 에칭을 포함할 수 있고; 유리 FTEP 장치의 경우, 제조는 건식 또는 습식 에칭, 파우더블라스팅(powderblasting), 샌드블라스팅(sandblasting) 또는 광구조화를 포함할 수 있고; 플라스틱 FTEP 장치의 경우, 제조는 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공을 포함할 수 있다. FTEP 장치의 구성요소는 별도로 제조된 후 조립될 수 있거나, FTEP 장치의 특정한 구성요소(또는 심지어 전극을 제외한 전체 FTEP 장치)는 단일한 존재물로서 제조(예를 들어, 3D 프린팅 사용) 또는 성형(예를 들어, 사출 성형 사용)될 수 있고, 다른 구성요소는 성형 후에 추가된다. 예를 들어, 하우징 및 채널은 FTEP 유닛을 형성시키기 위해 나중에 추가되는 전극과 함께 단일 존재물로서 제조되거나 성형될 수 있다. 대안적으로, FTEP 장치는 또한 개별적으로 제조되고/되거나 성형되고 제조 후에 조립되는 2개 이상의 평행한 층, 예를 들어, 수평 채널 및 필터를 갖는 층, 수직 채널을 갖는 층, 및 입구 및 출구 포트를 갖는 층으로 형성될 수 있다.
[00117] 특정 양태에서, FTEP 장치는 회로 기판 상에 원하는 구성으로 형성된 전극, 필터 및/또는 유동 채널을 갖는 베이스로서의 회로 기판, 및, 예를 들어, 이후에 회로 기판상에 밀봉되는 별도 층으로서 형성되는 하나 이상의 입구 및 출구 채널 및/또는 유동 채널을 포함하는 장치의 나머지 하우징을 사용하여 제조될 수 있다. 회로 기판 상으로의 하우징의 상부의 밀봉은 본 발명의 개시의 FTEP 장치의 상이한 요소의 원하는 구성을 제공한다. 또한, 2개 내지 다수의 FTEP 장치가 단일 기판 상에 제조된 후, 이후 서로 분리되거나 병렬로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, FTEP 장치는 재사용 가능하고, 일부 구현예에서, FTEP 장치는 일회용이다. 추가 구현예에서, FTEP 장치는 오토클레이브 가능할 수 있다.
[00118] 전극(408)은 구리, 스테인리스 강철, 티타늄, 알루미늄, 황동, 은, 로듐, 금 또는 백금, 또는 흑연과 같은 임의의 적합한 금속으로 형성될 수 있다. 하나의 바람직한 전극 물질은 합금 303 (UNS330300) 오스테나이트계 스테인리스 강철이다. 적용된 전기장은 알루미늄과 같음 금속으로 제조된 전극을 파괴할 수 있다. 일회용, 1회-사용 관통형 FTEP 장치와 반대로 다중-사용(즉, 비-일회용) 관통형 FTEP 장치가 바람직한 경우, 전극 판은 전기화학적 부식에 내성이 있는 금속으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 금과 같은 귀금속과 같은 전도성 코팅이 전극 판을 보호하기 위해 사용될 수 있다.
[00119] 언급된 바와 같이, FTEP 장치는 다중-통과 전기천공 절차를 허용하는 푸쉬-풀 공압 수단을 포함할 수 있고; 즉, 전기천공될 세포는 전기천공의 1회 통과를 위해 입구로부터 출구를 향해 "당겨질" 수 있고, 이후 관통형 FTEP 장치의 출구 단부로부터 입구 단부로 "밀어"져서 전기천공의 또 다른 통과에 대해 다시 전극 사이를 통과할 수 있다. 이러한 공정은 1회 내지 여러 번 반복될 수 있다.
[00120] 전기천공될 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모, 포유류) 및 전극의 구성에 따라, 유동 채널 내의 전극 사이의 거리는 광범위하게 변할 수 있다. 예를 들어, 유동 채널의 폭이 감소하는 경우, 유동 채널은 10 μm 내지 5 mm, 또는 25 μm 내지 3 mm, 또는 50 μm 내지 2 mm, 또는 75 μm 내지 1 mm로 좁아질 수 있다. 유동 채널에서 전극 사이의 거리는 1 mm 내지 10 mm, 또는 2 mm 내지 8 mm, 또는 3 mm 내지 7 mm, 또는 4 mm 내지 6 mm일 수 있다. FTEP 장치의 전체 크기는 3 cm 내지 15 cm 길이, 또는 4 cm 내지 12 cm 길이, 또는 4.5 cm 내지 10 cm 길이일 수 있다. FTEP 장치의 전체 폭은 0.5 cm 내지 5 cm, 또는 0.75 cm 내지 3 cm, 또는 1 cm 내지 2.5 cm, 또는 1 cm 내지 1.5 cm일 수 있다.
[00121] 좁아진 유동 채널의 영역은 적어도 2개의 세포가 좁아진 부분에 나란히 끼워질 수 있도록 충분히 넓다. 예를 들어, 전형적인 박테리아 세포는 직경이 1 μm이고; 따라서, 상기 박테리아 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 FTEP 장치의 유동 채널의 좁아진 부분은 적어도 2 μm 폭일 것이다. 또 다른 예에서, 포유류 세포의 직경이 대략 50 μm인 경우, 상기 포유류 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 FTEP 장치의 유동 채널의 좁아진 부분은 적어도 100 μm 폭일 것이다. 즉, FTEP 장치의 좁아진 부분은 형질전환될 세포를 물리적으로 뒤틀거나 "압착"하지 않을 것이다.
[00122] 저장소가 세포 및 외인성 물질을 FTEP 장치에 도입하기 위해 사용되는 FTEP 장치의 구현예에서, 저장소는 100 μL 내지 10 mL, 또는 500 μL 내지 75 mL, 또는 1 mL 내지 5 mL의 부피 범위이다. FTEP의 유량은 분 당 0.1 mL 내지 5 mL, 또는 분 당 0.5 mL 내지 3 mL, 또는 분 당 1.0 mL 내지 2.5 mL 범위이다. FTEP 장치의 압력은 1-30 psi, 또는 2-10 psi, 또는 3-5 psi 범위이다.
[00123] 전극 사이의 상이한 전계 강도를 피하기 위해, 전극은 병렬로 배열되어야 한다. 또한, 전극의 표면은 핀 홀 또는 피크 없이 가능한 한 평탄해야 한다. 1 내지 10 μm의 거칠기 Rz를 갖는 전극이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 관통형 전기천공 장치는 FTEP 장치에 접지 전위를 적용하는 적어도 하나의 추가 전극을 포함한다. 관통형 전기천공 장치(독립형 기기로서 또는 자동화된 다중-모듈 시스템에서 모듈로서)는, 예를 들어, 2018년 9월 28일 출원된 USSN 16/147,120; 2018년 9월 28일 출원된 16/147,353; 2018년 9월 30일 출원된 16/147,865; 및 2019년 5월 30일 출원된 16/426,310; 및 2019년 6월 18일 발행된 USPN 10,323,258에 설명되어 있다.
세포 단일화 및 풍부화 장치
[00124] 도 6a는 고체 벽 장치(6050) 및 고체 벽 장치의 마이크로웰에서 세포를 단일화하기 위한 워크플로우를 도시한다. 도 (i)의 좌측 상단에는, 마이크로웰(6052)을 갖는 고체 벽 장치(6050)가 도시된다. 기판(6050)의 섹션(6054)은 (ii)에 제시되어 있으며, 또한 마이크로웰(6052)을 도시한다. (iii)에서, 고체 벽 장치(6050)의 횡단면이 제시되고, 마이크로웰(6052)이 로딩되었으며, 여기서, 본 구현예에서, 포아송 또는 실질적인 포아송 로딩이 발생하였고; 즉, 각각의 마이크로웰은 하나의 세포를 갖거나 갖지 않으며, 어느 하나의 마이크로웰이 하나 초과의 세포를 가질 가능성이 낮다. (iv)에서, 워크플로우(6040)가 예시되며, 여기서 마이크로웰(6052)을 갖는 기판(6050)은 마이크로웰 당 하나의 세포를 갖는 마이크로웰(6056), 마이크로웰에 세포가 없는 마이크로웰(6057), 및 마이크로웰에 2개의 세포가 있는 하나의 마이크로웰(6060)을 나타낸다. 단계(6051)에서, 마이크로웰의 세포는 클론 콜로니(v)를 형성시키기 위해 대략 2-150배로 배가되도록 허용된 후, 편집이 발생하도록 허용된다(6053).
[00125] 편집(6053) 후, 편집된 세포의 콜로니의 많은 세포가 활성 편집에 의해 유발된 이중 가닥 절단의 결과로서 사멸하고, 생존하지만 편집 후 복구 및 회복되어야 하는 편집된 세포의 성장 지연이 있으며(마이크로웰(6058)), 여기서 편집을 겪지 않은 세포가 번성한다(마이크로웰(6059))(vi). 모든 세포는 계속해서 성장하여 콜로니를 확립하고 정상화될 수 있으며, 여기서 마이크로웰(6058)의 편집된 세포의 콜로니는 크기 및/또는 세포 수에 있어서 편집을 겪지 않은 마이크로웰(6059)의 세포를 따라 잡는다(vii). 일단 세포 콜로니가 정상화되면, 마이크로웰 내의 모든 세포의 풀링(pooling)(6060)이 발생할 수 있으며, 이 경우 비-편집 세포로부터의 편향 및 편집으로부터의 적합화 효과를 제거함으로써 세포는 편집된 세포에 대해 풍부화되고; 대안적으로, 마이크로웰에서의 콜로니 성장은 편집 후에 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니(예를 들어, 마이크로웰(6058) 내의 세포)가 확인되고 선택되어(6061)(예를 들어, "체리 피킹(cherry picked)") 편집된 세포의 훨씬 더 큰 풍부화를 발생시킨다.
[00126] 세포 성장에서, 사용되는 배지는 물론 편집되는 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유류)에 좌우될 것이다. 예를 들어, 효소 세포 성장을 위한 배지는 LB, SOC, TPD, YPG, YPAD, MEM 및 DMEM을 포함한다.
[00127] 도 6b는 고체 벽 장치(6050) 및 고체 벽 장치의 마이크로웰에서 세포를 실질적으로 단일화하기 위한 워크플로우를 도시한다. 도 (i)의 좌측 상단에는, 마이크로웰(6052)을 갖는 고체 벽 장치(350)가 도시된다. 기판(6050)의 섹션(6054)은 (ii)에 제시되어 있으며, 또한 마이크로웰(6052)을 도시한다. (iii)에서, 고체 벽 장치(6050)의 횡단면이 도시되고, 마이크로웰(6052)이 로딩되었으며, 여기서 이 구현예에서 실질적인 푸아송 로딩이 발생하였고; 즉, 일부 마이크로웰(6057)에는 세포가 없고, 일부 마이크로웰(6076, 6078)에는 몇 개의 세포가 있다. 도 6b에서, 활성 gRNA가 있는 세포는 흑색 원으로 표시되고, 비활성 gRNA가 있는 세포는 흰색 원으로 표시된다. (iv)에서, 마이크로웰(6052)을 갖는 기질(6050)이 모두 활성 gRNA를 갖는 여러 세포가 있는 3개의 마이크로웰(6076), 세포가 없는 마이크로웰(6057), 및 활성 gRNA를 갖는 일부 세포 및 불활성 gRNA를 갖는 일부 세포가 있는 2개의 마이크로웰(6078)을 나타내는 워크플로우(6070)가 예시되어 있다. 단계(6071)에서, 마이크로웰의 세포는 클론 콜로니를 형성시키기 위해 대략 2-150배로 배가되도록 허용된 후(v), 편집이 발생하도록 허용된다(6073).
[00128] 편집(6073) 후, 편집된 세포의 콜로니의 많은 세포가 활성 편집에 의해 유발된 이중 가닥 절단의 결과로서 사멸하고, 생존하지만 편집 후 복구 및 회복되어야 하는 편집된 세포는 성장 지연이 있으며(마이크로웰(6076)), 여기서 편집을 겪지 않은 세포가 번성한다(마이크로웰(6078))(vi). 따라서, 활성 gRNA가 있는 세포(흑색 원으로 표시된 세포)만 있는 마이크로웰(6076)에서는 대부분의 세포가 죽는다; 그러나 비활성 gRNA가 있는 세포(흰색 원으로 표시된 세포)를 함유하는 마이크로웰(6078)에서 세포는 계속 성장하며 활성 편집의 영향을 받지 않는다. 각 마이크로웰(6076 및 6078)의 세포는 계속 성장하여 콜로니를 확립하고 정상화하며, 여기서 마이크로웰(6076)의 편집된 세포 콜로니는 크기 및/또는 세포 수에 있어서 편집을 거치지 않은 마이크로웰(6078)의 비편집된 세포를 따라 잡는다(vii). 이 워크플루오(6070)에서, 마이크로웰의 세포 콜로니는 클론이 아니다; 즉, 웰의 모든 세포가 단일 세포로부터 발생하는 것은 아니다. 대신, 웰의 세포 콜로니는 혼합된 콜로니일 수 있으며, 2개에서 여러 개의 다양한 세포로부터 많은 웰에서 발생한다. 일단 세포 콜로니가 정상화되면, 마이크로웰 내의 모든 세포의 풀링(6090)이 발생할 수 있으며, 이 경우 비-편집 세포로부터의 편향 및 편집으로부터의 적합화 효과를 제거함으로써 세포는 편집된 세포에 대해 풍부화되고; 대안적으로, 마이크로웰에서의 콜로니 성장은 편집 후에 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니(예를 들어, 마이크로웰(6076) 내의 세포)가 확인되고 선택되어(6091)(예를 들어, "체리 피킹(cherry picked)") 편집된 세포의 훨씬 더 큰 풍부화를 발생시킨다.
[00129] 도 6a 및 6b에 도시된 방법을 수행하는 데 유용한 모듈은 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정상화(SWIIN) 모듈이다. 도 6c는 분해된 상부 사시도로부터의 SWIIN 모듈(650)의 구현예를 도시한다. SWIIN 모듈(650)에서, 보유물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 상부의 하부에 형성되고, 투과물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 하부의 상부에 형성된다.
[00130] 도 6c의 SWIIN 모듈(650)은 위에서 아래로 저장소 개스킷 또는 커버(658), 보유물 부재(604)(여기서, 보유물 유동 채널은 이러한 도 6c에서 관찰될 수 없음), 필터로 스웨이징(swaged)된 천공된 부재(601)(필터는 도 6c에서 관찰될 수 없음), 통합된 저장소(투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654))를 포함하는 투과물 부재(608), 및 투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654)의 하부를 밀봉하는 2개의 저장소 밀봉(662)을 포함한다. 투과물 채널(660a)은 구불구불한 채널(660a)의 융기 부분(676)에 의해 정의되는 투과물 부재(608)의 상부에 배치된 것이 관찰될 수 있고, 초음파 탭(664)이 또한 투과물 부재(608)의 상부에 배치된 것이 관찰될 수 있다. 천공된 부재(601) 상의 웰을 형성하는 천공은 이러한 도 6c에서 관찰되지 않지만; 초음파 탭(664)을 수용하기 위한 관통-홀(666)이 관찰된다. 또한, SWIIN 모듈(650)을 지지하고, 투과물 저장소로부터 구불구불한 채널(660a)로의 유체 경로 또는 보유물 저장소로부터 구불구불한 채널(660b)로의 유체 경로(어느 유체 경로도 이러한 도 6c에서 관찰되지 않음)로의 기포 또는 공기 진입을 최소화하기 위해 저장소(652 및 654) 위로 투과물 부재(608) 및 보유물 부재(604)를 상승시키기 위해 SWIIN 모듈(650)의 어느 한 단부에 지지체(670)가 배치된다.
[00131] 이러한 도 6c에서, 투과물 부재(608)의 상부에 배치되는 구불구불한 채널(660a)은 투과물 저장소(652) 및 보유물 저장소(654)를 포함하는 투과물 부재(608)의 일부를 제외하고 투과물 부재(608)의 대부분의 길이 및 투과물 부재(608)의 대부분의 폭에 대해 투과물 부재(608)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 길이"는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 폭"은 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다.
[00132] SWIIN 모듈의 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 투과물 부재 상에 배치된 초음파 탭을 수용하기 위한 관통-홀을 포함한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 스테인리스 강철로 제조되고(316), 천공은 마이크로웰의 벽을 형성하는 반면, 필터 또는 막은 마이크로웰의 하부를 형성하는 데 사용된다. 전형적으로, 천공(마이크로웰)은 대략 150 μm-200 μm 직경이고, 천공된 부재는 대략 125 μm 깊이이며, 그 결과 대략 총 200,000 마이크로웰을 갖는 대략 2.5 nl의 부피를 갖는 마이크로웰이 생성된다. 마이크로웰 사이의 거리는 중심에서 중심까지 대략 279 μm이다. 여기서, 마이크로웰은 대략 2.5 nl의 부피를 갖지만, 마이크로웰의 부피는 1 내지 25 nl, 또는 바람직하게는 2 내지 10 nl, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 4 nl일 수 있다. 필터 또는 막의 경우, 이전에 설명된 필터와 마찬가지로, 사용하기에 적절한 필터는 용매 내성이고, 여과 동안 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 포어 크기는 0.10 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형(예를 들어, 포유류 세포의 경우)의 경우, 포어 크기는 10.0 μm - 20.0 μm 이상만큼 클 수 있다. 실제로, 세포 농축 장치/모듈에 유용한 포어 크기는 0.10 μm, 0.11 μm, 0.12 μm, 0.13 μm, 0.14 μm, 0.15 μm, 0.16 μm, 0.17 μm, 0.18 μm, 0.19 μm, 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μμm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론 또는 유리 섬유를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다.
[00133] 짝을 이룬 구불구불한 채널의 횡단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 측면을 갖는 또 다른 형상인 경우, 횡단면은 약 2 mm 내지 15 mm 폭, 또는 3 mm 내지 12 mm 폭, 또는 5 mm 내지 10 mm 폭일 수 있다. 짝을 이룬 구불구불한 채널의 횡단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 3 mm 내지 20 mm 수력 반경, 또는 5 mm 내지 15 mm 수력 반경, 또는 8 mm 내지 12 mm 수력 반경일 수 있다.
[00134] 구불구불한 채널(660a 및 660b)은 대략 동일한 부피 또는 상이한 부피를 가질 수 있다. 예를 들어, 구불구불한 채널의 각각의 "측면" 또는 부분(660a, 660b)은, 예를 들어, 2 mL의 부피를 가질 수 있거나, 투과물 부재(608)의 구불구불한 채널(660a)은 2 mL의 부피를 가질 수 있고, 보유물 부재(604)의 구불구불한 채널(660b)은, 예를 들어, 3 mL의 부피를 가질 수 있다. 구불구불한 채널의 유체 부피는 약 2 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 4 mL 내지 60 mL, 또는 5 mL 내지 40 mL, 또는 6 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있다(이들 부피는, 예를 들어, 50-500K 천공 부재를 포함하는 SWIIN 모듈에 적용됨을 유의). 저장소의 부피는 5 mL 내지 50 mL, 또는 7 mL 내지 40 mL, 또는 8 mL 내지 30 mL 또는 10 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있고, 모든 저장소의 부피는 동일할 수 있거나, 저장소의 부피는 상이할 수 있다(예를 들어, 투과물 저장소의 부피는 보유물 저장소의 것보다 크다).
[00135] 투과물 부재(608) 및 보유물 부재(604)의 구불구불한 채널 부분(660a 및 660b)은 각각 대략 200 mm 길이, 130 mm 폭 및 4 mm 두께이지만, 다른 구현예에서, 보유물 및 투과물 부재는 75 mm 내지 400 mm 길이, 또는 100 mm 내지 300 mm 길이, 또는 150 mm 내지 250 mm 길이; 50 mm 내지 250 mm 폭, 또는 75 mm 내지 200 mm 폭, 또는 100 mm 내지 150 mm 폭; 및 2 mm 내지 15 mm 두께, 또는 4 mm 내지 10 mm 두께, 또는 5 mm 내지 8 mm 두께일 수 있다. 구현예: 보유물(및 투과물) 부재는 PMMA(폴리(메틸 메타크릴레이트)로 제조될 수 있거나, 폴리카르보네이트, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 유리, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 다른 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 보유물 부재는 세포가 시각화될 수 있도록 투명한 물질로 제조된다(예를 들어, 도 6f 및 이의 설명 참조). 예를 들어, 비디오 카메라는, 예를 들어, 위상차를 갖는 빈 웰의 이미지에 기초한 밀도 변화 측정에 의해, 또는, 예를 들어, 발색성 단백질과 같은 발색성 마커가 세포에 구별 가능한 색상을 추가하기 위해 사용되는 경우에 세포 성장을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 블리첸 블루(blitzen blue), 드레이델 틸(dreidel teal), 버지니아 바이올렛(virginia violet), 빅센 퍼플(vixen purple), 프란서 퍼플(prancer purple), 틴셀 퍼플(tinsel purple), 마카비 퍼플(maccabee purple), 도너 마젠타(donner magenta), 큐피드 핑크(cupid pink), 세라피나 핑크(seraphina pink), 스쿠루지 오렌지(scrooge orange), 및 레오르 오렌지(and leor orange)(Chromogenic Protein Paintbox, 모두 ATUM(Newark, CA)로부터 이용 가능함)와 같은 발색성 마커는 형광을 사용할 필요성을 제거하지만, 형광 세포 마커, 형광 단백질 및 화학발광 세포 마커가 또한 사용될 수 있다.
[00136] 보유물 부재가 바람직하게는 투명하기 때문에, SWIIN 모듈에서의 콜로니 성장은 JoVE(ScanLag™ system, Cambridge, MA)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 장치에 의해 모니터링될 수 있다(또한 문헌 [Levin-Reisman, et al., Nature Methods, 7:737-39 (2010)] 참조). 예를 들어, 포유동물 세포에 대한 세포 성장은 예를 들어, IncuCyte (Ann Arbor, MI)에 의해 판매되는 성장 모니터에 의해 모니터링될 수 있다 (또한, 문헌 [Choudhry, PLos One, 11(2):e0148469 (2016)] 참조). 또한, 예를 들어, TECAN (Pickolo™ system, Mannedorf, Switzerland); Hudson Inc.(RapidPick™, Springfield, NJ); Molecular Devices(QPix 400™ system, San Jose, CA); 및 Singer Instruments(PIXL™ system, Somerset, UK)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 콜로니 피커(picker)가 사용될 수 있다.
[00137] SWIIN 모듈의 가열 및 냉각으로 인해, 응축물이 보유물 부재에 축적되어 성장하는 세포 콜로니의 정확한 시각화를 방해할 수 있다. SWIIN 모듈(650)의 응축은, 예를 들어, SWIIN 모듈(650)의 상부(예를 들어, 보유물 부재) 위로 가열된 공기를 이동시키거나, 보유물 부재(604)의 적어도 구불구불한 채널 부분(660b) 위에 투명한 가열된 뚜껑을 적용함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 도 6f 및 이의 설명을 하기에서 참조한다.
[00138] SWIIN 모듈(650)에서, 세포 및 배지(천공된 부재의 마이크로웰에서 세포의 포아송 또는 실질적인 포아송 분포에 적절한 희석에서)는 보유물 부재(604)의 포트로부터 구불구불한 채널(660b)로 유동하고, 배지가 필터를 통해 투과물 부재(608)의 구불구불한 채널(660a)로 통과하는 동안 세포는 마이크로웰에 침전된다. 세포는 필터(603)를 통해 이동할 수 없기 때문에 천공된 부재(601)의 마이크로웰에 세포가 유지된다. 적절한 배지가 투과물 포트(611)를 통해 투과물 부재(608)에 도입될 수 있다. 배지는 천공된 부재(601)의 마이크로웰(천공) 내의 세포에 영양을 공급하기 위해 필터(603)를 통해 위쪽으로 유동한다. 추가로, 완충액 교환은 보유물 및 투과물 부재를 통해 배지를 순환시킴으로써 수행될 수 있다. 작업시, 세포는 마이크로웰에 침착되고, 초기, 예를 들어, 2-100배가 동안 성장되고, 편집은, 예를 들어, 온도-유도성 프로모터를 유도하기 위해 SWIIN의 온도를 42℃로 상승시키거나, 투과물 부재로부터 성장 배지를 제거하고, 성장 배지를 유도성 프로모터를 유도하는 화학적 성분을 포함하는 배지로 대체함으로써 유도될 수 있다.
[00139] 일단 편집이 발생하면, SWIIN의 온도는 감소될 수 있거나, 유도 배지가 제거되고, 화학적 성분이 없는 신선한 배지로 대체되어 유도성 프로모터를 비활성화시킬 수 있다. 이후, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 정상화될 때까지 세포는 SWIIN 모듈(650)에서 계속 성장한다. 정상화 프로토콜의 경우, 일단 콜로니가 정상화되면, 콜로니는 유체 또는 공기 압력(또는 둘 모두)을 투과물 부재의 구불구불한 채널(660a) 및 이에 따라 필터(603)에 적용하여 마이클로웰로부터 플러싱되고, 풀링된다. 대안적으로, 체리 피킹이 필요한 경우, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니가 직접 선택되거나; 빠르게 성장하는 콜로니가 제거된다.
[00140] 도 6d는 부분 횡단면에서 보유물 및 천공된 부재를 갖는 SWIIN 모듈의 상부 사시도이다. 이러한 도 6d에서, 구불구불한 채널(660a)이 투과물 부재(608)의 상부에 배치되고, 상승된 부분(676)에 의해 정의되고, 투과물 및 보유물 저장소(단지 하나의 보유물 저장소(652)가 관찰될 수 있음에 유의)를 포함하는 투과물 부재(608)의 부분을 제외하고는 투과물 부재(608)의 길이 및 폭 대부분에 대해 투과물 부재(608)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 좌측에서 우측으로 이동하면, 저장소 개스킷(658)은 보유물 부재(604)의 통합된 저장소 커버(678)(커버는 이러한 도 6d에서 관찰되지 않음) 상에 배치된다. 개스킷(658)은 저장소 접근 구멍(632a, 632b, 632c 및 632d)뿐만 아니라 공압 포트(633a, 633b, 633c 및 633d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측 끝에는 지지물(670)이 있다. 투과물 저장소(652) 하에 배치된 것으로 2개의 저장소 밀봉부(662) 중 하나가 관찰될 수 있다. 보유물 부재가 횡단면에 있는 것에 추가하여, 천공된 부재(601) 및 필터(603)(필터(603)는 이러한 도 6d에서 관찰되지 않음)가 횡단면에 있다. 천공된 부재(601)의 관통-홀(666)을 통해 연장되는 초음파 탭(664)을 포함하는 SWIIN 모듈(650)의 우측 단부 및 구불구불한 채널(660a)의 채널 턴을 정의하는 상승된 부분(676) 상에 배치된 다수의 초음파 탭(664)이 존재하는 것을 유의한다. 투과물 부재(608)의 말단 원위 저장소(652, 654)에 지지체(670)가 또한 존재한다.
[00141] 도 6e는 우측으로부터 좌측으로 보유물 부재(604)의 통합된 저장소 커버(678)(관찰되지 않음) 상에 배치된 저장소 개스킷(658)을 포함하는 조립된 SWIIIN 모듈(650)의 측면 사시도이다. 개스킷(658)은 고무, 실리콘, 니트릴 고무, 폴리테트라플루오로에틸렌, 플라스틱 중합체, 예를 들어, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 또는 다른 유연한, 압축성 물질로 제조될 수 있다. 개스킷(658)은 저장소 접근 구멍(632a, 632b, 632c 및 632d)뿐만 아니라 공압 포트(633a, 633b, 633c 및 633d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측에 단부에는 투과물 부재(608)의 지지체(670)가 있다. 또한, 투과물 저장소(652)뿐만 아니라 하나의 저장소 밀봉부(662)가 관찰될 수 있다. 맨 우측 단부에는 제2 지지체(670)가 있다.
[00142] SWIIN의 웰에서 성장하는 세포 콜로니의 영상화는, 예를 들어, 세포 성장 및 장치 성능 둘 모두를 모니터링하기 위한 대부분의 구현에서 바람직하며, 체리-피킹 구현을 위해 영상화가 필요하다. SWIIN에서 세포 성장을 실시간으로 모니터링하는 것은 백라이팅, 보유물 플레이트(상부 플레이트) 응축 관리 및 온도 제어, 기류 및 열 관리에 대한 시스템-수준 접근법을 필요로 한다. 일부 구현에서, 영상화는 개별 웰을 영상화시킬 수 있을만큼 충분한 해상도를 갖는 카메라 또는 CCD 장치를 사용한다. 예를 들어, 일부 구성에서, 9-픽셀 피치를 갖는 카메라가 사용된다(즉, 각각의 웰에 대해 중심에서 중심으로 9 픽셀이 존재함). 일부 구현에서, 이미지를 처리하는 것은 그레이스케일로 이미지를 판독하여 각 픽셀을 낮음에서 높음으로 평가하는 것을 활용할 수 있으며, 여기서 세포가 없는 웰은 가장 밝아질 것이고(백라이트로부터 전체 또는 거의 전체 광 투과로 인함), 세포를 갖는 웰은 어두워질 것이다(백라이트로부터 광 투과를 차단하는 세포로 인함). 이미지를 처리한 후, 어느 픽셀이 "밝음" 또는 "어두움"으로 언급될 지 결정하기 위해 스레시홀딩(thresholding)이 수행되고, 밝은 픽셀을 찾아서 블록으로 이들을 배열하기 위해 스폿 찾기가 수행된 후, 스폿이 스폿에 해당하는 픽셀의 육각 격자에 배열된다. 일단 배열되면, 각각의 웰의 강도 측정은, 예를 들어, 스폿의 중간에 있는 하나 이상의 픽셀을 보고, 무작위 또는 사전 설정된 위치에서 여러 픽셀 내지 많은 픽셀을 보거나, 스폿에서 X개의 픽셀을 평균화함으로써 추출된다. 또한, 배경 강도가 공제될 수 있다. 스레시홀딩은 다시 각각의 웰을 양성(예를 들어, 세포 함유) 또는 음성(예를 들어, 웰에 세포가 없음)으로 호출하는 데 사용된다. 영상화 정보는 세포 성장을 모니터링하기 위한 시점에서 이미지를 찍는 것을 포함하여 여러 방식으로 사용될 수 있다. 세포 성장 모니터링은, 예를 들어, 빠르게 성장하는 세포의 "머핀 상부(muffin top)"를 제거한 후 모든 세포를 제거하거나 상기 설명된 바와 같이 "원형" 세포를 제거하거나, 특정 웰로부터 세포(예를 들어, 느리게 성장하는 세포 콜로니)를 회수하는 데 사용될 수 있고; 대안적으로, 빠르게 성장하는 세포를 함유하는 웰은 확인될 수 있고, 빠르게 성장하는 세포 콜로니를 커버하는 UV 광 영역은 SWIIN에 투사(또는 셔터로 래스터링(rastered))되어 이들 세포를 조사하거나 이의 성장을 억제할 수 있다. 영상화는 또한 구불구불한 채널(660)에서 적절한 유체 유동을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
[00143] 도 6f는 히터 및 가열된 커버를 포함하는 열 관리 시스템을 추가로 포함하는 도 6a-6e의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다. 히터 커버는 영상화에 필요한 응축 관리를 촉진한다. 조립체(698)는 횡단면이 길이 방향으로 관찰되는 SWIIN 모듈(650)을 포함하며, 여기서 하나의 투과물 저장소(652)가 관찰된다. SWIIN 모듈(650) 바로 위에는 커버(694)가 배치되고, SWIIN 모듈(650) 바로 아래에는 영상화를 가능하게 하는 백라이트(680)가 배치된다.. 백라이트 및 SWIIN 모듈 아래에 인접하게 절연체(682)가 존재하며, 이는 히트싱크(684) 위에 배치된다. 이러한 도 6f에서, 히트싱크의 핀은 페이지의 내외부(in-out)에 존재할 것이다. 또한, 축류 팬(686) 및 히트싱크(688)뿐만 아니라 2개의 열전기 냉각기(692), 및 공압, 열전기 냉각기, 팬, 솔레노이드 밸브 등을 제어하기 위한 제어기(690)가 또한 존재한다. 화살표는 유닛으로 들어오는 냉각 공기 및 유닛에서 제거되는 고온의 공기를 나타낸다. 가열의 제어는 많은 상이한 유형의 세포(원핵 세포 및 진핵 세포)뿐만 아니라, 예를 들어, 온도에 민감한 세포의 균주 등의 성장을 허용하고, 온도에 민감한 프로모터의 사용을 허용한다는 점에 유의해야 한다. 온도 제어는 형질전환 효율, 세포 성장 및 생존력의 차이를 고려하여 프로토콜이 조정되는 것을 허용한다. 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정상화 장치에 대한 보다 상세한 설명은 2019년 4월 30일에 출원된 USSN 16/399,988; 2019년 6월 26일 출원된 16/454,865; 및 2019년 8월 14일 출원된 16/540,606을 참조한다. 대안 분리, 인큐베이션 및 정상화 모듈에 있어서는 2019년 8월 08일 출원된 USSN 16/536,049를 참조한다.
세포 선택 모듈
[00144] 본원에 기술된 분할 단백질 리포터 시스템은 적절하게 편집된 세포에 대한 판독으로 형광 또는 생물발광 세포를 제공한다. 적절하게 편집된 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 편집되지 않았거나 부적절하게 편집된 세포로부터 분류될 수 있다. FAC는 향상된 수준의 기능을 추가하는 유세포 분석의 유도법이다. FAC를 사용하여 살아있는 세포의 외생성 혼합물을 다른 집단으로 분류될 수 있다. FAC는 내부 염색 또는 세포 내 단백질 발현을 기반으로 세포를 분리하는 유일하게 이용가능한 정제 기술이며, 크기, 입도 및 형광을 기반으로 개별 세포의 정제를 허용한다. 현탁액의 세포는 소적의 스트림으로 전달되며, 각 소적은 관심 있는 단일 세포를 함유한다. 소적은 레이저 앞을 지나간다. 광학 검출 시스템은 소정의 광학 파라미터(예를 들어, 형광 또는 생물발광 파라미터)를 기반으로 하는 관심 세포를 검출한다. 기기는 관심 세포를 함유하는 소적에 전하를 가하고, 정전기 편향 시스템은 하전된 소적을 적절한 튜브 또는 웰로 수집하는 것을 용이하게 한다. 순도 및 수율 요건에 따라 분류 파라미터를 조정할 수 있다. 분할 단백질 리포터 시스템을 사용하여 적절하게 편집된 세포는 생물발광이고, 부적절하거나 편집되지 않은 세포는 생물발광이 아니다; 따라서 요망되는 세포는 원치 않는 세포로부터 용이하게 분류된다.
자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 사용
[00145] 본원에 기술된 방법을 수행할 수 있는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 일 구현예가 도 7에 도시되어 있다. 세포 처리 기기(700)는 하우징, 예를 들어 세포가 형질전환될 시약 카트리지 내의 세포 저장소(704)를 포함할 수 있다. 세포는 저장소에서 세포 성장 및 농축 모듈(708)로 전달될다. 이 구현예에서, 세포 성장 및 농축 모듈은 TFF와 같은 단일 모듈이다; 그러나, 다른 구현예에서, 세포 성장 및 농축 모듈은 분리될 수 있으며, 예를 들어 회전식 성장 모듈을 포함하는 세포 성장 모듈 및 TFF를 포함하는 세포 농축 장치가 있다. 처리될 세포는 예를 들어, 시약 카트리지의 저장소로부터 세포가 표적 OD에 도달할 때까지 배양될 세포 성장 모듈(708)로 옮겨진다. 일단 세포가 목표 OD에 도달하면, 세포 성장 모듈은 이후 처리를 위해 세포를 냉각하거나 세포가 완충제 또는 배지 교환이 수행되는 세포 농도로 직접 진행될 수 있고, 세포는 적격화 되고, 세포의 부피는 형질전환 모듈(710)에서 세포 형질전환에 최적인 부피로 감소된다. 형질전환 모듈(710)은 예를 들어, 관통형 전기천공 장치일 수 있다.
[00146] 세포를 저장하기 위한 저장소에 더하여, 시약 카트리지는 편집 카세트를 포함하는 편집 벡터(706)를 저장하기 위한 저장소 및 예를 들어 뉴클레아제에 대한 코딩 서열 및 캐스케이드-C-말단 T7 RNAP 융합 작제물 및 dCas3-N-말단 T7 RNAP 융합 작제물에 대한 코딩 서열을 포함하는 엔진 벡터(702)를 저장하기 위한 저장소를 포함할 수 있다. 도 1a와 관련하여 상기 설명된 바와 같이, 캐스케이드-C-말단 T7 RNAP 융합 작제물 및 dCas3-N-말단 T7 RNAP 융합 작제물은 엔진 벡터(예를 들어, 뉴클레아제에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터)에 위치할 수 있으며, 캐스케이드-C-말단 T7 RNAP 융합 작제물과 dCas3-N-말단 T7 RNAP 융합 작제물은 둘 모두 T7 프로모터의 제어 하의 리포터 유전자와 함께 단일 리포터 벡터에 위치하거나, 분할 단백질 시스템의 다양한 구성요소가 상이한 리포터 벡터, 편집 벡터 및/또는 엔진 벡터에 있을 수 있다. 편집 벡터, 엔진 벡터 및 리포터 벡터(분리된 경우, 도시되지 않음)는 이후 세포 내로 전기천공될 형질전환 모듈(710)로 전달된다.
[00147] 일단 세포가 형질전환되면, 세포는 편집 모듈(712), 예컨대 편집을 위해 전술한 바와 같은 SWIIN 모듈에 전달될 수 있다. 또한, 변형 모듈과 편집 모듈 사이의 별도의 모듈에서 선택이 수행될 수 있거나, 편집 모듈에서 선택이 수행될 수 있다. 이 경우 선택은, 선택 마커를 포함하는 벡터로 적절하게 형질전환된 세포를 선택하여 세포가 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 및 적절한 편집 보고 둘 모두를 위한 모든 벡터를 수용하였음을 확인하는 것을 나타낸다. 선택 후, 편집을 위한 조건이 제공된다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 구성요소가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 편집을 위해 유도성 프로모터를 활성화하기 위한 조건이 제공된다. 세포가 편집되는 동안 분할 단백질 리포터 시스템은 활성화될 수 있으며, 여기서 적절하게 편집된 세포는 빛을 방출한다; 대안적으로, 융합 작제물(예를 들어, 캐스케이드-C-말단 T7 RNAP 융합 작제물 또는 dCas3-N-말단 T7 RNAP 융합 작제물) 및/또는 편집-구별 gRNA 중 하나 또는 둘 모두가 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 분할 단백질 리포터 시스템은 세포가 편집될 때까지 활성화되지 않는다. 편집 중 또는 편집 후에, 분할 단백질 리포터 시스템은 활성화되면 생물발광을 통해 적절하게 편집된 세포를 식별하게 한다. 편집 후, 세포는 세포가 분류될 수 있는 선택 모듈(714)로 전달된다.
[00148] 그 후, 분할 단백질 리포터 시스템이 활성화되어 있고(예를 들어, 발광 세포) 발광하지 않는 세포로부터 분리된 세포는 성장하고 또 다른 편집 라운드를 위해 준비될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기는 하나 이상의 스크립트의 지시에 따라, 또는 사용자 입력 또는 스크립트의 조합으로 사용자 입력을 기반으로 기기를 작동하도록 구성된 프로세서(716)에 의해 제어된다. 프로세서(716)는 기구(700)의 다양한 모듈의 타이밍, 기간, 온도 및 동작, 및 시약 카트리지로부터 시약의 분배를 제어할 수 있다. 프로세서는 사용자가 선택할 수 있는 표준 프로토콜 파라미터로 프로그래밍될 수 있고, 사용자가 하나 이상의 파라미터를 수동으로 지정할 수 있거나 시약 카트리지와 관련된 하나 이상의 스크립트가 하나 이상의 작업 및/또는 반응 파라미터를 지정할 수 있다. 또한, 프로세서는 사용자에게 (예를 들어, 스마트 폰 또는 기타 장치에 대한 애플리케이션을 통해) 세포가 목표 OD에 도달하였고, 적격화되고 농축되었음을 알리고/거나 다중-모듈 기기의 다양한 모듈에서 세포의 진행에 대해 사용자를 업데이트할 수 있다.
[00149] 다중-모듈 세포 편집 기기의 예에 대해서는 2019년 4월 09일에 발행된 USPN 10,253,316; 2019년 6월 25에 발행된 10,323,559; 2019년 6월 18일 발행된 10,323,242; 2019년 9월 24일 발행된 10,421,959; 2019년 11월 5일 발행된 10,465,185; 및 2019년 5월 14일 출원된 USSN 16/412,195; 2019년 9월 14일 출원된 16/571,091; 및 2019년 10월 29일 출원된 16/666,964를 참조하며, 이들 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
[00150] 설명된 공정은 재귀적이고 다중화될 수 있다는 것이 본 발명의 개시를 고려하여 당업자에게 명백해야 하며; 즉, 세포는 도 7과 관련하여 설명된 워크플로우를 거칠 수 있고, 이후 생성된 편집된 배양물은 상이한 편집 벡터를 사용하여 또 다른(또는 여러번 또는 더 많은) 라운드의 추가 편집(예를 들어, 재귀적 편집)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 1라운드 편집으로부터의 세포가 희석될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 B와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 C와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 D와 조합될 수 있고, 제2 라운드의 편집에 대해 마찬가지이다. 2라운드 후, 각각의 이중 편집된 세포의 분취량은 제3 라운드의 편집에 적용될 수 있으며, 여기서, 예를 들어, AB-, AC-, AD-편집된 세포 각각의 분취량은 추가 편집 벡터, 예를 들어, 편집 벡터 X, Y 및 Z와 조합된다. 즉, 이중 편집된 세포 AB는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 편집된 세포 ABX, ABY 및 ABZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AC는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ACX, ACY 및 ACZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AD는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ADX, ADY 및 ADZ를 생성할 수 있고, 그 밖에도 마찬가지이다. 이러한 과정에서, 편집의 많은 순열 및 조합이 실행될 수 있으며, 이는 매우 다양한 세포 집단 및 세포 라이브러리로 이어진다.
[00151] 임의의 재귀적 공정에서, 이전 엔진 및 편집 벡터(또는 단일 벡터 시스템에서 단일 엔진 + 편집 벡터)를 "치유"시키는 것이 유리하다. "치유"는 이전 라운드의 편집에서 사용된 하나 이상의 벡터가 형질전환된 세포로부터 제거되는 공정이다. 치유는, 예를 들어, 치유 플라스미드를 사용하여 벡터(들)를 절단하여 이에 의해 편집 및/또는 엔진 벡터(또는 단일, 조합된 엔진/편집 벡터)가 비기능성이 되도록 하고; 세포 성장을 통해 세포 집단에서 벡터(들)을 희석시키거나(즉, 세포가 더 많은 성장 주기를 거칠수록, 더 적은 딸 세포가 편집 또는 엔진 벡터(들)를 보유할 것임), 예를 들어, 편집 또는 엔진 벡터(또는 조합된 엔진 + 편집 벡터)에서 열-민감성 복제 기점을 사용함으로써 달성될 수 있다. 치유 조건은 치유에 사용되는 메커니즘, 즉, 이러한 예에서, 치유 플라스미드가 편집 및/또는 엔진 벡터를 절단하는 방법에 좌우될 것이다.
실시예
[00152] 하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자가 이들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하거나 이들이 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내거나 암시하고자 함이 아니다. 광범위하게 설명된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 특정 양태에 제시된 바와 같이 본 발명에 대해 다수의 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 인지될 것이다. 따라서, 본 발명의 양태는 모든 점에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예 I: 완전 자동화된 싱글플렉스 RGN-지시된 편집 실행
[00153] MAD7 뉴클레아제를 사용한 싱글플렉스 자동화 게놈 편집은 본 발명의 개시의 자동화 다중-모듈 기기로 성공적으로 수행되었다. 미국 특허 번호 9,982,279; 및 2018년 6월 30일 출원된 USSN 16/024,831; 2018년 6월 30일 출원된 16/024,816; 2018년 9월 28일 출원된 16/147,353; 2018년 9월 30일 출원된 16/147,865; 및 2018년 6월 30일 출원된 16/147,871을 참조한다.
[00154] ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_F172* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 기기에 포함된 등온 핵산 조립 모듈 내의 "편집 벡터"로 조립하였다. lacZ_F172는 lacZ 유전자를 기능적으로 넉아웃시킨다. "lacZ_F172*"는 편집이 lacZ 아미노산 서열의 172번째 잔기에서 발생함을 나타낸다. 조립 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 조립된 편집 벡터 및 재조합 준비가 된 전기적격 E. 콜라이 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로르암페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 회복시켰다. 회복 후, 세포를 사용자에 의해 회수될 때까지 4℃에서 유지하였다.
[00155] 자동화된 공정 및 회수 후, 세포의 분취량을 락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카르베니실린으로 보충된 MacConkey 아가 베이스에 플레이팅하고, 콜로니가 나타날 때까지 성장시켰다. 백색 콜로니는 기능적으로 편집된 세포를 나타내고, 자주색 콜로니는 편집되지 않은 세포를 나타냈다. 모든 액체 이동은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.
[00156] 자동화된 처리의 결과는 대략 1.0E-03개의 총 세포가 형질전환되었고(전통적인 벤치탑 결과와 동등함), 편집 효율은 83.5%였다. 백색 콜로니에서의 lacZ_172 편집은 세포 게놈의 편집된 영역의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 또한, 자동화된 세포 처리 단계는 웹캠에 의해 원격으로 관찰되었고, 자동화된 처리 절차의 상태를 업데이트하기 위해 문자 메세지가 전송되었다.
실시예 II: 완전 자동화된 재귀적 편집 실행
[00157] 재귀적 편집은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템을 사용하여 성공적으로 달성되었다. ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_V10* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 시스템에 포함된 등온 핵산 조립 모듈 내의 "편집 벡터"로 조립하였다. lacZ_F172 편집과 유사하게, lacZ_V10 편집은 기능적으로 lacZ 유전자를 넉아웃시킨다. "lacZ_V10"은 편집이 lacZ 아미노산 서열의 아미노산 위치 10에서 발생함을 나타낸다. 조립 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 첫 번째 조립된 편집 벡터 및 재조합 준비가 된 전기적격 E. 콜라이 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로르암페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리기 모듈로 옮긴 후, 배지 교환을 수행하였다. 세포를 클로르암페니콜 및 카르베니실린을 함유하는 TB에 재현탁시키고, 여기서 세포를 2.7의 OD600으로 성장시킨 후, 농축시키고, 전기적격이 되도록 하였다.
[00158] 세포 성장 동안, 등온 핵산 조립 모듈에서 제2 편집 벡터를 제조하였다. 제2 편집 벡터는 카나마이신 내성 유전자를 포함하였고, 편집 카세트는 galK Y145* 편집을 포함하였다. 성공적인 경우, galK Y145* 편집은 세포에 갈락토스를 흡수하고 대사하는 능력을 부여한다. galK Y154* 카세트에 의해 생성된 편집은 154번째 아미노산 잔기에서 정지 코돈을 도입하여 티로신 아미노산을 정지 코돈으로 변경한다. 이러한 편집은 galK 유전자 생성물을 비-기능성으로 만들고, 세포가 갈락토스를 대사할 수 있는 것을 억제한다. 조립 후, 제2 편집 벡터 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 조립 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 조립된 제2 편집 벡터 및 전기적격 E. 콜라이 세포(제1 편집 벡터로 형질전환되고 선택됨)를 상기 상세히 설명된 바와 같이 동일한 파라미터를 사용하여 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 전기천공 후, 세포를 회복 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 카르베니실린을 함유하는 SOC 배지에서 회복되도록 하였다. 회복 후, 세포를 회수할 때까지 4℃에서 유지시킨 후, 세포 분취량을 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 LB 아가에 플레이팅하였다. lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 정량화하기 위해, 복제 패치 플레이트를 1) 락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 아가 베이스, 및 2) 갈락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 아가 베이스의 2개의 배지 유형에서 생성시켰다. 모든 액체 이동은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.
[00159] 이러한 재귀적 편집 실험에서, 스크리닝된 콜로니의 41%는 lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 가졌고, 그 결과는 "벤치탑" 또는 수동 접근법을 사용하여 획득된 이중 편집 효율과 동등하였다.
실시예 III: 집단에서 특정 유전자형을 갖는 세포의 분리
[00160] 자동화된 싱글플렉스 또는 반복적 편집 실행에 따라 완전한 의도된 편집, 불완전한 편집, 편집되지 않은 또는 야생형 세포에 해당하는 여러 특정 유전자형을 함유하는 세포 집단을 생성하였다. 완전한 의도된 편집만을 식별하고 분리하기 위해 분할 T7 RNAP의 두 반쪽(예를 들어, 분할 단백질 리포터 시스템의 부분)이 캐스케이드 복합체 및 탈활성화된 cas3 뉴클레아제에 각각 융합된 변형된 타입 I CRISPR 시스템을 사용하였다. 편집-구별 crRNA를 이용하여 캐스케이드 복합체 사이에 R-루프의 형성을 통한 완전한 의도된 편집을 구별하여 인식한 후, 탈활성화된 cas3 융합 단백질은 R-루프 부위에 모집되어 캐스케이드 복합체에 결합하였다. 이 결합 이벤트는 분할 T7 RNAP의 두 반쪽이 근접하게 되어 활성 T7 중합효소를 형성하였다. 그 후, 활성 T7 중합효소는 리포터 유전자를 전사하였다.
[00161] T7 C-말단 단편에 융합된 T. 푸스카 XY 캐스케이드 복합체는 재조합적으로 발현되었으며, LB 배지에서 성장한 E. 콜라이 BL21 세포에서 3개 플라스미드 공동발현 시스템을 통해 정제하였다. 제1 플라스미드는 클로르암페니콜 내성을 함유하는 pTAC-MAT-Tag1(Sigma Aldrich) 벡터 상의 20aa 가요성 GlySer 링커로 C-말단 상에 융합된 T7 RNAP 중합효소의 C-말단 단편(아미노산 181-883)과의 T. 푸스카 XY 캐스케이드 복합체의 cse1 단백질을 함유하였다(도 8a 참조). 암피실린 내성이 있는 pTAC-MAT-Tag1 벡터 상의 제2 플라스미드는 37℃에서 R-루프 형성을 촉진하기 위해 cse2에 N23A 돌연변이가 있는 나머지 캐스케이드 복합체 유전자 cse2-cas7-NLS-cas5e-cas6e 및 cas7 유전자의 C-말단 상의 SV40 NLS 신호를 함유하여 pTAC-cse2-cas7-NLS-cas5e-cas6e를 만든다(도 8b 참조). 제3 플라스미드는 pTAC-crRNA-GFP를 만들기 위해 합성 CRISPR 어레이로부터 발현된 crRNA를 함유하였다(도 8c). 모두 3개의 플라스미드를 함유하는 E. 콜라이 BL21 세포를 0.6의 OD로 성장시키고, 세포를 밤새 성장시키기 전에 0.5 mM 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 그 후, 세포를 수확하고, 리소자임을 사용하여 용해하고, 융합된 T7-C-말단 RNAP와의 캐스케이드 복합체를 제조업체의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 아가로스(Qiagen)로 정제하였다.
[00162] 별도로, 탈활성화된 T. 푸스카 XY cas3을 재조합으로 발현시키고 정제하였다. T7 RNAP(아미노산 1-179)의 N-말단 융합에 이어 14aa 유연한 GlySer 링커 및 C-말단 SV40 NLS 및 6xHis 태그를 갖는 T. 푸스카 XY cas3 D84A D481A를 pTAC-MAT-Tag1(Sigma Aldrich) 내에 클로닝하여 pTAC-T7-Nterm-cas3-NLS-His를 만들었다(도 8d). 플라스미드를 함유하는 E. 콜라이 BL21 세포를 0.6의 OD로 성장시키고, 세포를 18℃에서 밤새 성장시키기 전에 1 mM 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 그런 다음 세포를 용해하고 탈활성화된 cas3-T7-N-말단 융합물을 Ni-NTA Agarose(Qiagen)로 정제하였다.
[00163] 이전에 편집된 HEK293T-GFP 세포의 풀(pool)은 Neon Transfection 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 전기천공하였다. 편집된 세포를 트립신 처리하고, 1X DPBS(ThermoFisher)로 세척하고, Neon Buffer R에 재현탁하였다. 80 pmol의 캐스케이드-T7-C-말단, 20 pmol의 cas3-T7-N-말단, 및 T7 프로모터에 의해 구동되는 5 mol의 F30-2xD브로콜리(pJin141)를 완충제 R에서 약 1.0E05 세포와 혼합하였다. 혼합물을 10μl 네온 팁(1100V, 20ms, 2펄스)으로 전기천공하고 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 72시간 후, 캐스케이드 crRNA에 의해 프로그래밍된 완전한 의도된 편집을 함유하는 세포만을 회수하기 위해 가장 높은 형광을 기반으로 하여 BD FACSMelodyTM 세포 분류기에서 세포를 분류하였다.
[00164] 본 발명은 본 발명의 바람직한 구현예와 관련하여 상세히 설명된 바와 같이 많은 상이한 형태의 구현예에 의해 만족되지만, 본 발명의 개시는 본 발명의 원리의 예시로서 간주되어야 하며, 본 발명을 본원에 예시되고 설명된 특정 구현예로 제한하고자 하는 것이 아님이 이해된다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 당업자에 의해 다수의 변화가 이루어질 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해 측정될 것이다. 요약 및 제목은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이의 목적은 적절한 권위자뿐만 아니라 일반 대중이 본 발명의 일반적인 특성을 신속하게 결정할 수 있도록 하기 위한 것이다. 하기의 청구범위에서, 용어 "수단"이 사용되지 않는 한, 여기에 언급된 특징 또는 요소는 35 U.S.C. §112,¶6에 따라 수단 및 기능 제한으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (20)

  1. 벡터 백본에서 캐스케이드-T7-RNAP 융합 단백질 코딩 서열;
    벡터 백본에서 dCas3-T7-RNAP 융합 단백질 코딩 서열;
    벡터 백본에서 gRNA에 대한 서열로서, gRNA가 게놈 서열에서 합리적으로 설계되고 편집된 유전자좌는 인식하나, 편집되지 않거나 잘못 편집된 상태의 게놈 서열의 유전자좌는 인식하지 못하는, gRNA에 대한 서열; 및
    T7 프로모터 제어 하의 리포터 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 캐스케이드-T7-RNAP 융합 단백질 코딩 서열이 T7 RNAP의 C-말단을 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  3. 제2항에 있어서, T7 RNAP의 C-말단이 T7 RNAP의 아미노산 잔기 181-883을 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  4. 제2항에 있어서, T7-RNAP의 C-말단이 cse1/casA 또는 Cas5의 C-말단에 융합되는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  5. 제1항에 있어서, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열이 T7 RNAP의 N-말단을 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  6. 제5항에 있어서, T7 RNAP의 N-말단이 T7 RNAP의 아미노산 잔기 1-179를 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  7. 제5항에 있어서, T7 RNAP의 N-말단이 dCas3의 N-말단에 융합되는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 리포터 유전자가 형광 단백질에 대한 코딩 서열인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 리포터 유전자가 항생제 내성 유전자에 대한 코딩 서열인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 리포터 유전자가 세포 표면 마커 단백질에 대한 코딩 서열인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 리포터 유전자가 루시퍼라제에 대한 코딩 서열인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 루시퍼라제가 반딧불이 루시퍼라제인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  13. 제11항에 있어서, 루시퍼라제가 레닐라(Renilla) 루시퍼라제인, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 캐스케이드-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열, gRNA에 대한 서열, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열이 모두 동일한 벡터에 있는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  15. 제1항에 있어서, 캐스케이드-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열, gRNA에 대한 서열, 및 T7 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자에 대한 코딩 서열이 2개 이상의 상이한 벡터에 있는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  16. 제1항의 벡터 백본을 포함하는 세포.
  17. 제1항에 있어서, 캐스케이드-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열이 T7 RNAP의 N-말단을 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  18. 제17항에 있어서, T7-RNAP의 N-말단이 cse1/casA 또는 Cas5의 N-말단에 융합되는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  19. 제1항에 있어서, dCas3-T7 RNAP 융합 단백질 코딩 서열이 T7 RNAP의 C-말단을 포함하는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
  20. 제19항에 있어서, T7 RNAP의 C-말단이 dCas3의 C-말단에 융합되는, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템.
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