CN114829607A - 用于体内检测核酸引导的核酸酶编辑的细胞的Cascade/dCas3互补测定 - Google Patents

用于体内检测核酸引导的核酸酶编辑的细胞的Cascade/dCas3互补测定 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及允许人们在采用核酸引导的编辑时鉴定体内编辑的细胞的方法和组合物。另外提供了用于执行编辑和选择方法以及使用组合物的自动化多模块仪器。

Description

用于体内检测核酸引导的核酸酶编辑的细胞的Cascade/ dCas3互补测定
相关申请的交叉引用
本国际PCT申请要求2019年12月18日提交的美国临时专利申请第62/949,472号的优先权，并通过引用并入。
发明领域
本公开内容涉及允许体内鉴定特定核酸序列，诸如当采用核酸的引导编辑时存在于细胞中的预期编辑序列的方法和组合物，以及用于执行编辑和选择方法的自动化多模块仪器。
发明背景
在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的物品和方法不构成现有技术的权利。
对活细胞的基因组进行精确的、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近，已经鉴定出允许操纵基因序列并从而操纵基因功能的多种核酸酶。核酸酶包括核酸引导的核酸酶，其使研究人员能够在活细胞中产生永久性编辑。当然，期望能够鉴定所得的细胞群体中已被正确编辑的细胞；然而，在许多情况下，由核酸引导的核酸酶编辑产生的编辑的细胞的百分比可以在个位数。
因此，在核酸引导的核酸酶编辑领域中存在对用于快速和准确的体内鉴定已正确编辑的细胞的改进的方法、组合物、模块和仪器的需要。本公开内容解决了此需要。
发明概述
提供本概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势将是从下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面明显的。
本公开内容涉及允许人们产生核酸引导的核酸酶编辑的细胞和在体内鉴定所得的细胞群体中已被正确编辑的细胞的方法、组合物、模块和自动化多模块细胞处理仪器，在所得的细胞群体中大多数——并且也许是绝大多数——细胞没有被编辑。本发明的方法和组合物采用了使用I型CRISPR-Cas系统的脱落蛋白报告物系统(split protein reportersystem)。脱落蛋白报告物系统利用了Cascade复合物靶识别时Cas3(CAS3)募集的天然机制。将Cas3募集到Cascade复合物启动了所述Cascade复合物对特定DNA序列(在这种情况下，包含期望的编辑的DNA序列)的高保真度靶向特异性的细胞内信号放大事件。通过将脱落蛋白的一半附接到失活的Cas3(dCas3)并将脱落蛋白的另一半附接到Cascade的蛋白组分，产生了这样一个系统，在该系统中，只有当Cascade复合物(例如，Cascade和crRNA)形成了鉴别性R-环并与正确的靶DNA序列复合时，脱落蛋白的两半才在一起。在一种实施方案中，脱落蛋白是T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)。在识别Cascade复合物融合和靶序列(例如，预期的编辑)时和在募集失活的Cas3-N末端T7 RNAP融合蛋白时，脱落的T7 RNAP的两半接近，产生活性的T7聚合酶。活性的T7聚合酶能够在T7启动子的控制下转录例如报告基因的编码序列，这继而允许分离具有预期的编辑的细胞群体。
因此，在本文的一种实施方案中提供了核酸引导的核酸酶编辑系统，包括：载体骨架中的Cascade-T7-RNAP融合蛋白编码序列；载体骨架中的dCas3-T7-RNAP融合蛋白编码序列；载体骨架中的用于鉴别编辑的(或“靶向编辑的”)gRNA的序列(sequence for an edit-discriminating(or“edit-targeting”)gRNA)，其中鉴别编辑的(或“靶向编辑的”)gRNA识别基因组序列中合理设计的编辑的基因座，但不识别未编辑或不正确编辑条件下的基因组序列中的基因座；以及在T7启动子控制下的报告基因的编码序列。在一些方面，Cascade-T7RNAP融合蛋白编码序列包括cas5c的C末端(在I-C型系统中)或者cse1或casA的C末端(在I-E型系统中)和T7 RNAP的C末端(例如，氨基酸181-883)，而dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列包括dCas3的N末端和T7-RNAP的N末端(例如氨基酸1-179)。可选地，在一些方面，Cascade-T7 RNAP融合蛋白编码序列包括cas5c的N末端(在I-C型系统中)或者cse1或casA的N末端(在I-E型系统中)和T7 RNAP的N末端(例如氨基酸1-179)，而dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列包括dCas3的C末端和T7-RNAP的C末端(例如氨基酸181-883)。在一些方面，报告基因是荧光蛋白的编码序列，并且在一些方面，荧光蛋白是绿色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。在又其他方面，报告基因是萤光素酶的编码序列，并且在一些方面，萤光素酶是萤火虫萤光素酶或海肾(Renilla)萤光素酶。在又其他方面，报告基因编码西兰花或菠菜RNA适配体。在又其他方面，报告基因是抗生素抗性基因的编码序列。在又其他方面，报告基因是细胞表面受体蛋白的编码序列。
在核酸引导的核酸酶编辑系统的一些方面，Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列、dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白编码序列、用于鉴别编辑的gRNA的序列和在T7启动子控制下的报告基因的编码序列都在同一载体上，并且在可选的方面，Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列、dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白编码序列、用于鉴别编辑的gRNA的序列和在T7启动子控制下的报告基因的编码序列在两个或更多个不同的载体上。
又另一种实施方案提供了包含以下的细胞：载体骨架中的Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列；载体骨架中的dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白编码序列；载体骨架中的用于鉴别编辑的gRNA的序列，其中所述鉴别编辑的gRNA识别基因组序列中合理设计的编辑的基因座，但不识别未编辑或不正确编辑条件下的基因组序列中的基因座；以及在T7启动子控制下的报告基因的编码序列。
又其他实施方案提供了用于在体内鉴定编辑的细胞的方法，包括：用核酸引导的核酸酶编辑组分转化细胞，所述核酸引导的核酸酶编辑组分包括核酸引导的核酸酶、与基因组基因座同源的gRNA和与基因组基因座同源的供体DNA；用核酸引导的核酸酶编辑系统转化细胞，所述核酸引导的核酸酶编辑系统包括载体骨架中的Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列、载体骨架中的dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白编码序列、载体骨架中的用于鉴别编辑的gRNA的序列，其中鉴别编辑的gRNA识别基因组序列中合理设计的编辑的基因座，但不识别未编辑或不正确编辑条件下的基因组序列中的基因座，以及在T7启动子控制下的报告基因的编码序列；允许核酸引导的核酸酶、gRNA和供体DNA编辑细胞中的基因组基因座；允许Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列、鉴别编辑的gRNA和Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白编码序列与编辑的基因组基因座结合，从而重建T7 RNAP活性；和为T7RNAP结合和激活T7启动子从而转录报告基因提供条件。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。
附图简述
从以下对说明性实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点，在附图中：
图1A是用于使用Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白、dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白、鉴别编辑的(或“靶向编辑的”)gRNA和报告基因(统称为“脱落蛋白报告物系统”)进行I型核酸引导的核酸酶选择的简单过程图。图1B是其中与鉴别编辑的(或靶向编辑的)gRNA复合的Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白不与野生型(例如，未编辑的)基因组靶序列结合的脱落蛋白系统的组分的简化示意图。图1C是其中存在编辑的基因组靶序列，但编辑不是期望的、预期的编辑的脱落蛋白系统的组分的简化示意图。因此，与Cascade-T7-RNAP-C末端融合物复合的鉴别编辑的gRNA转录物不识别和结合基因组靶序列、形成Cascade复合物以及将dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白募集到不正确编辑的靶基因组序列。图1D是其中存在正确编辑的基因组靶序列、与Cascade-T7-RNAP-C末端融合物复合的鉴别编辑的gRNA转录物的脱落蛋白系统的组分的简化示意图，所述gRNA转录物结合正确编辑的基因组靶序列，形成活性的R-环，并且从而将dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白募集到编辑的基因组序列。dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白的募集使T7 RNAP蛋白的N末端部分和C末端部分形成功能性接近。
图2A-图2C描绘了用于采用脱落蛋白报告物系统执行核酸引导的核酸酶编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器的三个不同视图。
图3A描绘了用于与本文并且关于图3B-图3D描述的细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一种实施方案。图3B图示了在细胞生长模块壳体中的旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长模块的剖视图。图3D图示了与LED、检测器和温度调节组件耦合的图3B的细胞生长模块。
图4A描绘了用于在切向流过滤模块(例如，细胞生长和/或浓缩模块)中使用的渗余物(上图)和渗透物(下图)构件，以及组装成切向流组件(下图)的渗余物和渗透物构件。图4B描绘了切向流过滤模块的储库组件的两个侧面透视图。图4C-图4D描绘了示例性的顶部，其具有流体和气动端口以及适合于图4B所示的储库组件的密封垫。
图5A描绘了可以在多模块细胞处理仪器中使用的示例性组合试剂筒和电穿孔装置(例如，转化模块)。图5B是示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的顶部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5C描绘了示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的底部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5D-图5F描绘了可用于诸如图2A-图2C中所示的多模块自动化细胞处理仪器中的FTEP装置的顶部透视图、横截面的顶部视图和横截面的侧面透视图。
图6A描绘了在固体壁装置中用于大体上使细胞单个化(singulating)、编辑细胞和使细胞标准化的工作流程的简化图。图6B描绘了在固体壁装置中用于大体上使细胞单个化、编辑细胞和使细胞标准化的工作流程变化形式的简化图。图6C-图6E描绘了固体壁分离培养和标准化(solid wall isolation incubation and normalization，SWIIN)模块的一种实施方案。图6F描绘了图6C-图6E中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括加热器和加热盖。
图7是其中可以使用本文描述的脱落蛋白报告物系统的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化过程图。
图8A-图8D包括用于在大肠杆菌中测试脱落蛋白报告物系统的示例性载体图谱。
应当理解，附图不必按比例绘制，并且相同的附图标记是指相同的特征。
详细描述
除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合本文描述的方法、装置或仪器的一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的方法、装置和仪器的另外的实施方案。例如，在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及该特征或功能的情况下，应当理解，除非该特征或功能与替代实施方案不兼容，否则该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。
除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和遗传工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第四版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2014)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人.编著,(2017)；Neumann等人,Electroporation and Electrofusion in CellBiology,Plenum Press,New York,1989；和Chang等人,Guide to Electroporation andElectrofusion,Academic Press,California(1992)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸引导的核酸酶技术可以见于，例如，Genome Editing andEngineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery,Appasani和Church(2018)；以及CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier,2015；这两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“细胞”是指一个或更多个细胞，并且提及“该系统”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤、方法和装置，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的设备、制剂和方法的目的，本文提及的所有的出版物通过引用并入。
在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，未描述本领域技术人员熟知的特征和程序。本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。
如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此形成氢键的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-TAGCTG-3’的区域是100％互补的。
术语“Cascade”或“Cascade效应物”是指I型CRISPR-Cas系统的蛋白效应物复合物。术语“Cascade复合物”是指还包含crRNA的Cascade效应物复合物。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。
如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸引导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座(例如，靶基因组DNA序列或细胞靶序列)的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点侧翼的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。
术语“引导核酸”或“引导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见地是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被对齐。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置数而变化。
“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。
如本文使用的，术语“蛋白”和“多肽”可互换地使用。蛋白可能完全由氨基酸组成，也可能不完全由氨基酸组成。
“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、引导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型的。
如本文使用的，“报告基因”是用作基因表达和其他细胞事件指示物的基因，诸如例如，编码萤光素酶或荧光蛋白的基因。在本发明的上下文中，报告基因用作基因组编辑的代表物。
如本文使用的术语“选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的选择标记是本领域普通技术人员熟知的并包括氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、诺尔丝菌素N-乙酰基转移酶、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418，或者可采用其他选择标记。
如本文使用的术语“特异性结合”包括两个分子例如工程化肽抗原和结合靶之间具有由以下解离常数表示的结合亲和力的相互作用：约10-7M、约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M、约10-13M、约10-14M或约10-15M。
术语“靶基因组DNA序列”、“细胞靶序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组或附加体)中的期望使用核酸引导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。术语“编辑的靶序列”或“编辑的基因座”是指已进行编辑后的靶基因组序列或靶序列，其中编辑的靶序列包含期望的编辑。
术语“变体”可以指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一参考多肽有差异。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可以相差一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。多肽的变体可以是保守修饰的变体。取代的或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基(例如，非天然氨基酸)。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未知的天然存在的变体。
“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。在本发明方法的一些实施方案中，使用两种载体——包含核酸酶编码序列的引擎载体以及包含gRNA序列和供体DNA序列的编辑载体。在替代实施方案中，包括核酸酶、gRNA序列和供体DNA序列的所有编辑组分都在同一载体(例如，组合的编辑/引擎载体)上。在一些实施方案中，Cascade-T7-RNAP-C末端融合蛋白、dCas3-T7-RNAP-N末端融合蛋白、鉴别编辑的gRNA和在T7启动子控制下的报告基因的编码序列全部在单个报告载体上，但在其他实施方案中，这些组分中的一个或更多个可以位于引擎载体、编辑载体或一个或更多个不同的报告载体上。
核酸酶指导的基因组编辑概述
采用本文描述的组合物和方法以允许人们进行核酸酶指导的基因组编辑，以将期望的编辑引入细胞群体，并且然后允许人们快速在体内鉴定编辑的细胞。在一些实施方案中，进行递归细胞编辑，其中在连续轮的编辑中将编辑引入前几轮中已经编辑的细胞。与适当的合成的引导核酸在细胞中复合的核酸引导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。引导核酸有助于核酸引导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵引导核酸的核苷酸序列，核酸引导的核酸酶可以被编程为靶向任何DNA序列用于裂解，只要适当的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)在附近。在某些方面，核酸引导的核酸酶编辑系统可以使用组合起来发挥引导核酸的作用的两个分开的引导核酸分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面并且优选地，引导核酸是包含以下二者的单个引导核酸构建体：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列，和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
通常，引导核酸(例如，gRNA)可以与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶指导至靶序列。引导核酸可以是DNA或RNA；可选地，引导核酸可以包含DNA和RNA二者。在一些实施方案中，引导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在引导核酸包含RNA的情况下，gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以并且优选地确实驻留在编辑盒内。用于设计和合成编辑盒的方法和组合物描述于USPN 10,240,167；USPN 10,266,849；USPN 9,982,278；USPN 10,351,877；USPN 10,364,442；和USPN 10,435,715；和2019年2月14日提交的USSN 16/275,465，所有这些通过引用并入本文。
引导核酸包含引导序列，其中引导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸引导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。引导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，引导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，引导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由引导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM、控制序列或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。
引导核酸可以是且优选地是编码靶向细胞靶序列的供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，引导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码引导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码引导核酸的序列。优选地，编码引导核酸和供体核酸的序列一起位于合理设计的编辑盒中，并经由缺口修复同时插入或组装到线性质粒或载体骨架中，以产生编辑载体。
靶序列与前间区突变(PAM)相关，前间区突变(PAM)是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸引导的核酸酶的精确优选的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。核酸引导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性、改进靶位点识别保真度、降低靶位点识别保真度或增加核酸引导的核酸酶的多功能性。
在大多数实施方案中，细胞靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入细胞靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除细胞靶序列中的前间区突变(PAM)区、使细胞靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活(例如，使靶位点对另外的核酸酶结合免疫)。使细胞靶序列处的PAM失活排除了对该细胞靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续轮的编辑中随后暴露于与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶时。因此，具有期望的细胞靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以通过使用与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶来选择，所述合成的引导核酸与细胞靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的细胞靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。
至于核酸引导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸引导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞类型，诸如细菌、酵母和哺乳动物细胞中表达。待采用的核酸引导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas 9、Cas 12/CpfI、MAD2或MAD7或其他MAD酶(MADzyme)。
核酸引导的核酸酶系统的另一个组分是包含与细胞靶序列的同源性的供体核酸。供体核酸在与引导核酸相同的载体上，甚至在与引导核酸相同的编辑盒中，并且优选地(但不必需是)在与编辑gRNA相同的启动子(即，驱动编辑gRNA和供体核酸二者转录的单个启动子)的控制下。供体核酸被设计成用作与细胞靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸引导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如长度为约或大于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸，并且如果与如2019年2月14日提交的USSN 16/275,465中描述的双重gRNA结构组合，则长度多达2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb和多达20kb。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与细胞靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与细胞靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和细胞靶序列之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与细胞靶序列互补的区域)。供体核酸包含与细胞靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与细胞靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。
如关于gRNA描述的，供体核酸优选地作为合理设计的编辑盒的一部分提供，该编辑盒被插入编辑质粒骨架(在酵母中，优选地线性质粒骨架)中，其中编辑质粒骨架可包含启动子，以在编辑盒被插入编辑质粒骨架中时驱动编辑gRNA和供体DNA的转录。此外，在编辑载体中可以插入多于一个，例如两个、三个、四个或更多个编辑gRNA/供体核酸的合理设计的编辑盒；可选地，单个合理设计的编辑盒可以包含两个到若干个编辑gRNA/供体DNA对，其中每个编辑gRNA在分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有gRNA/供体核酸对在单个启动子的控制下。在一些实施方案中，驱动编辑gRNA和供体核酸(或驱动多于一个编辑gRNA/供体核酸对)转录的启动子任选地是诱导型启动子。
除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应细胞靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。此外，编辑盒可包括一组使得能够在保存条形码的同时使供体DNA和/或gRNA受控地缺失的FLP/FRT或Cre/Lox重组位点。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如编辑gRNA和供体核酸的全基因或全基因组文库的编辑gRNA和供体核酸的文库或集合。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。此外，在优选实施方案中，编码核酸引导的核酸酶系统的组分的编辑载体或质粒还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)，诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS(特别是作为核酸酶序列的元件)的核酸引导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。
经由脱落蛋白报告物系统增加核酸酶指导的编辑的细胞的体内鉴定效率
本公开内容旨在增加已经进行核酸引导的核酸酶编辑后的对活细胞进行的编辑的体内检测的效率。使用核酸引导的核酸酶编辑技术进行基因组编辑要求经由与编辑载体同源重组来精确修复核酸酶诱导的DNA链断裂(例如，双链断裂或单链切口)。由核酸引导的核酸酶引起的细胞中的双链DNA断裂有三个主要结果：1)如果断裂未被修复，细胞死亡；2)非同源末端连接(NHEJ)，它在没有同源修复模板的情况下修复断裂，通常导致插入缺失(indel)；和3)同源重组(HR)，它使用辅助的(这里是外源的)同源DNA(例如，来自插入到编辑载体中的编辑盒的供体DNA序列)来修复断裂。本发明的方法和组合物旨在在体内鉴定已经通过HR编辑的细胞。
本发明的方法和组合物除了如上所述的核酸引导的核酸酶编辑系统外，还利用包括I型CRISPR-Cas系统、两个融合构建体、鉴别编辑的或靶向编辑的gRNA和在T7启动子控制下的报告基因的脱落蛋白报告物系统。CRISPR-Cas类型和亚型的核心特征是不同的cas蛋白，它们在遗传和功能上高度多样化。CRISPR-Cas系统有三种主要类型，它们通过独特的特征基因彼此区别开：I型系统中的Cas3、II型系统中的Cas9和III型系统中的Cas10。I型CRISPR系统利用双组分结构来降解靶DNA，其在本发明的方法和组合物中被利用来提供用于在体内鉴定编辑的细胞的手柄(handle)。在I型系统中，特征基因Cas3编码具有解旋酶活性的大蛋白。
I型CRISPR-Cas系统的效应复合物展示复杂的结构，在I-C型系统中由Cas5c、Cas7c和Cas8c蛋白亚基组成，并且在I-E型系统中由CasA/Cse1、Cse2、Cas7e、Cas5e和Cas6e组成。Cas5c亚基结合crRNA的5’-手柄，并与Cas8c大亚基相互作用。I-C型Cascade复合物(由Cas5c、Cas7c、Cas8C和crRNA组成)与靶DNA序列结合，并与RNA引导(RNA guide)和靶DNA链形成R-环复合物。在R-环形成后，Cascade复合物募集使非靶链产生切口的Cas3并开始进行性(processive)DNA降解。可以利用I-C型或I-E型系统，尽管I-C型系统是优选的，因为它们的尺寸较小，例如导致向选择的细胞的有效载荷递送减少。
本发明的方法和组合物是针对Cascade复合物靶识别时募集Cas3以启动对Cascade复合物对特定DNA序列的高保真靶向特异性的细胞内信号放大事件的天然机制。通过将脱落蛋白的一半附接到失活的Cas3(dCas3)并将脱落蛋白的另一半附接到Cascade的蛋白组分，创建产生了这样一个系统，在该系统中，只有当Cascade复合物形成了鉴别性R-环并与正确的靶DNA序列复合时，蛋白的两个脱落部分才在一起。
根据本发明的方法可以使用许多不同的蛋白；然而，其中一个特别感兴趣的是T7RNA聚合酶(T7 RNAP)，它在蛋白互补测定中的使用已经被验证。(参见例如，Shis等人,PNAS,110:和5028–5033(2013)；和Pu等人,Nat Chem Biol 13:432–438(2017))。在脱落的T7 RNAP的情况下，在优选的实施方案中，C末端T7 RNAP片段(例如氨基酸181-883)经由Cas5c的C末端(在I-C型系统中)或casA/cse1蛋白的C末端(在I-E型系统中)与Cascade复合物融合，并且T7 RNAP片段的N末端(例如氨基酸1-179)与失活的dCas3蛋白的N末端融合。包括T7 RNAP的C末端的Cascade蛋白与鉴别编辑的crRNA复合形成Cascade复合物。在Cascade复合物和靶序列(例如，其中靶序列包括预期的编辑并形成R-环)之间识别时，并且在募集融合到T7 RNAP的N末端的dCas3时，脱落的T7 RNAP的两半接近，产生活性的T7聚合酶。活性T7聚合酶能够转录引入细胞的线性或环状dsDNA片段。
在本发明的方法中，将被T7聚合酶转录的线性dsDNA包含在T7启动子控制下的报告基因，例如在示例性实施方案中，萤光素酶基因(或荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白编码序列、抗生素抗性基因、编码细胞表面标志物的基因等)的编码序列。重构的T7聚合酶结合T7启动子并转录报告基因编码序列。在报告基因编码萤光素酶的情况下，转录的序列被翻译成萤光素酶。如果萤光素酶的底物萤光素存在，萤光素酶将催化一个两步氧化过程以产生光，这导致足够的荧光以在FACS中分选细胞，这继而允许分离具有预期的编辑的细胞群体。
应当注意，考虑到本公开内容，本领域普通技术人员，尽管本文的讨论集中于将T7RNAP的C末端部分与Cascade蛋白复合物的C末端(例如，I-C型系统中的cas5c的C末端或I-E型系统中的cse1或casA的C末端)融合和将T7 RNAP的N末端部分与dCas3的N末端融合，替代实施方案设想将T7 RNAP的C末端部分与dCas3的C末端融合和将T7 RNAP的N末端部分与Cascade蛋白复合物的N末端(例如，I-C型系统中的cas5c的N末端或I-E型系统中的cse1或casA的N末端)融合。此外，可以设想利用I型CRISPR-Cas系统的脱落蛋白报告物系统的其他组合，只要这些组合涉及在识别靶DNA序列中的预期的编辑时形成Cascade复合物、形成R-环、募集dCas3和重建脱落蛋白的活性。
图1A是用于在体内检测已经经由核酸引导的核酸酶编辑正确编辑的细胞的简单的流程图。在方法100的第一步骤中，合成102Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体。T7 RNAP的N末端部分和C末端部分之间的正确“脱落”以在这两个部分彼此接近时产生重构的聚合酶可以根据经验确定。聚合酶在这样的点处被“脱落”，在该点，T7 RNAP的N末端部分和C末端部分之间在不存在由于dCas3与Cascade复合物的缔合的物理接近的情况下没有自发缔合；然而，在存在dCas3与Cascade复合物缔合的情况下，“脱落”必须允许聚合酶的N末端部分和C末端部分缔合以及聚合酶活性的重建。在确定了聚合酶的合适“脱落”后，可以设计和合成适当的Cascade-T7-RNAP融合构建体和dCas3-T7-RNAP融合构建体。在一种实施方案中，T7 RNAP的N末端部分包含T7 RNAP蛋白的约氨基酸1-179，而T7 RNAP的C末端部分包含T7 RNAP蛋白的约氨基酸181-883。在一种示例性实施方案中，T7 RNAP的C末端部分被融合到Cascade蛋白复合物的C末端(例如，I-C型系统中的cas5c的C末端或I-E型系统中的cse1或casA的C末端)，并且T7 RNAP的N末端部分被融合到dCas3的N末端。
在被合成后，适当的Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体被插入载体104中，以将其转化110到选择的细胞中。在该示例性实施方案中，选择的细胞包含在T7启动子控制下的报告基因的编码序列，并包含用于鉴别编辑的或靶向编辑的gRNA的序列。然而，在替代实施方案中，在T7启动子控制下的报告基因的编码序列和/或鉴别编辑的gRNA可以位于具有融合构建体的报告载体上(如下所述)，或者位于引擎或编辑载体上(其中这些载体在下面简要描述)。同样在该示例性实施方案中，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体位于具有核酸引导的核酸酶编码序列的引擎载体上。在替代实施方案中，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体可以被包含在与引擎载体分离的单个报告载体上(与例如在T7启动子控制下的报告基因的编码序列和/或鉴别编辑的gRNA一起)，其中两个融合构建体在相同启动子的控制下或在不同启动子的控制下。在又另一种实施方案中，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体可被包含在分开的报告载体上(例如，参见图8A-图8D)。在又另一种选择中，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体中的一个或两者可以稳定地整合到细胞基因组中。
本文所设想的报告基因是用作正确基因组编辑指示物的基因，并且在T7启动子的控制下。T7启动子是噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子，它的长度是19个碱基对。报告基因在分子生物学中广泛应用于基因表达和细胞事件研究。通常，报告基因被克隆到表达载体中，表达载体然后被转化或转染到细胞中。然后，可以通过以下来测定细胞中报告物的存在：直接测量报告蛋白本身，例如在具有报告物诸如荧光蛋白诸如GFP、RFP和BFP、细胞表面标志物或抗生素抗性的系统中，或者通过测量报告蛋白对底物(例如萤光素酶)的酶促活性，或者在存在荧光团(fluorogen)的情况下测量化合物的荧光，例如在具有例如RNA适配体的系统中。
在本发明的方法和组合物中，报告基因在T7启动子的控制下，并且只有当Cascade复合物识别并结合到编辑的靶基因座时，经由Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体的接近重建T7 RNAP的活性，报告基因才被转录。尽管可以采用荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白，但在一些实施方案中，该组合物采用萤光素酶报告物测定，其提供了比荧光蛋白增加的灵敏度、动态范围和多功能性。可选地，诸如菠菜和西兰花的RNA适配体也可以在T7启动子控制下作为报告基因表达，并在存在DFHBI((5Z)-5-[(3,5-二氟-4-羟基苯基)亚甲基]-3,5-二氢-2-甲基-3-(2,2,2-三氟乙基)-4H-咪唑-4-酮)的情况下显示荧光。生物发光报告物测定比荧光测定有优势，因为它们提供10-1,000倍高的测定灵敏度。本文可采用的萤光素酶报告物技术是基于酶萤光素酶(其编码序列为“报告基因”)和发光底物萤光素的相互作用，萤光素通过生物发光过程释放光。两种常用的萤光素酶是萤火虫萤光素酶，一种61kDa的酶，不需要翻译后修饰；另一种是海肾萤光素酶，一种36kDa的酶，也不需要翻译后修饰。通过将T7启动子偶联到萤光素酶基因的编码序列，可以检测重建T7 RNAP活性的具有C末端T7 RNAP融合的Cascade复合物和dCas3-N末端T7 RNAP与编辑的靶基因座的结合。此外，如上所述，报告基因可以包括抗生素抗性基因，使得编辑的细胞可以通过抗生素抗性来鉴定，或者报告基因可以包括细胞表面标志物蛋白，使得细胞可以经由针对细胞表面标志物蛋白的抗体来分选。
脱落蛋白报告物系统的第四个组分是鉴别编辑的gRNA。鉴别编辑的gRNA被特异地工程化成与已正确编辑的靶序列结合，而不与未编辑(例如，野生型)或不正确编辑的序列结合。在这种情况下，鉴别编辑的gRNA不是包含供体DNA(或同源臂)的编辑盒的一部分。而是，鉴别编辑的gRNA被用来将dCas3募集到Cascade复合物；也就是说，鉴别编辑的gRNA用于序列识别而不是促进编辑。
因此，核酸引导的核酸酶编辑组分和脱落蛋白报告物系统组分必须转化或转染到感兴趣的细胞中。转化意在包括各种本领域公认的用于将外源核酸序列(例如，引擎和/或编辑载体)引入靶细胞的技术，并且如本文使用的术语“转化”包括所有的转化和转染技术。这样的方法包括但不限于，电穿孔、脂质转染、光穿孔、注射、微沉淀、微注射、脂质体、粒子轰击、声穿孔、激光诱导的穿孔、珠转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀或DEAE-葡聚糖介导的转染。也可以使用例如蔗糖、山梨醇或甘油洗剂(wash)制备用于载体摄取的细胞。此外，可以使用利用机械和化学转染方法能力的混合技术，例如，磁转染，一种将化学转染与机械方法组合的转染方法。在另一个实例中，阳离子脂质可以与基因枪或电穿孔仪组合部署。用于转化或转染靶细胞的合适材料和方法可见于，例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,2014)中。使用自动化多模块细胞处理仪器的本发明自动化方法利用流通式电穿孔，诸如在图5B-图5F中示出的示例性装置。
同时或接下来，设计106编辑盒文库。用于设计和合成编辑盒的方法和组合物描述于USPN 10,240,167；USPN 10,266,849；USPN 9,982,278；USPN 10,351,877；USPN 10,364,442；和USPN 10,435,715；和2019年2月14日提交的USSN 16/275,465。2019年2月14日提交的USSN 16/275,465描述了在本文描述的组合物和方法的一些实施方案中使用的复合编辑盒(compound editing cassette)。复合编辑盒是包含多于一个gRNA和多于一个供体DNA的编辑盒。在设计和合成106后，编辑盒文库被扩增、纯化并插入108到编辑载体中以产生编辑载体文库。然后将编辑载体文库转化到已经用Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体转化110的细胞中。在替代实施方案中，编辑载体、引擎载体和一个或更多个报告载体可以同时转化到细胞中。在又其他实施方案中，脱落蛋白报告物系统的一个或更多个组分可整合到细胞基因组中。
在转化后，允许细胞恢复，并且任选地进行选择以选择用一个或更多个报告载体、引擎载体和/或编辑载体转化的细胞，所有这些载体通常都包括选择标记。如上所述，可以采用药物选择标记诸如氨苄西林/羧苄西林、卡那霉素、氯霉素、诺尔丝菌素N-乙酰基转移酶、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418或其他选择标记。在下一步骤，提供条件使得编辑发生112。例如，如果任何编辑组分诸如例如核酸酶或gRNA/供体DNA盒中的一个或两个是在诱导型启动子的控制下，则提供激活一个或更多个诱导型启动子的条件。在细胞已经被编辑112后，细胞被选择(例如，分选)114，这一次经由例如发光。在对细胞进行了分选，使得细胞富集编辑的细胞后，编辑的细胞可以用于研究，或者可以生长到期望的OD以再次使其成为电穿孔感受态，随后进行另一轮编辑。
图1B是其中gRNA不与野生型(例如，未编辑的)基因组靶序列结合的脱落蛋白系统组分的简化示意图。在图1B的上方是在T7启动子的控制下的报告基因，诸如萤光素酶。还可见鉴别编辑的或靶向编辑的gRNA、Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-C-T7-RNAP-N末端融合构建体。在这种情况下，靶基因组序列是“野生型”或未编辑的序列，它不被鉴别编辑的gRNA识别。由于鉴别编辑的gRNA不识别野生型基因组序列，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和鉴别编辑的gRNA不能在感兴趣的基因组基因座处形成R-环复合物。如果在感兴趣的基因组基因座处没有形成R-环，则dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体不会被募集到感兴趣的基因座，并且T7 RNAP的N末端部分和C末端部分不会接近。如果不使T7 RNAP的N末端部分和C末端部分接近，则T7 RNAP的活性不会重建，T7启动子不会被激活，并且报告基因也不会转录(或翻译)。也就是说，报告物沉默是因为Cascade复合物和dCas3未能结合基因组靶序列以使T7 RNAP可以被“重构”和激活。
图1C是其中存在编辑的基因组靶序列，但编辑的基因组靶序列不是正确的或期望的编辑的脱落蛋白系统的组分的简化示意图。在这种情况下，鉴别编辑的gRNA不与不正确编辑的基因组靶序列结合。在图1C的上方，如同图1B，是在T7启动子的控制下的报告基因，诸如萤光素酶。还可见gRNA、Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体。在此，靶基因组序列包含由例如由非同源末端连接(NHEJ)引起的编辑而产生的“插入缺失”或不正确编辑的序列，非同源末端连接在没有同源修复的情况下修复靶基因组中的双链断裂，而不是通过同源重组(HR)，同源重组导致精确的、期望的编辑。与野生型基因组靶序列一样，插入缺失(例如，不正确的编辑)不被鉴别编辑的gRNA识别。由于鉴别编辑的gRNA不识别不正确编辑的基因组序列，Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和gRNA不能在感兴趣的基因组基因座处形成R-环复合物。如果在感兴趣的基因座处没有形成R-环复合物，则dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体不会被募集到感兴趣的基因座，并且T7 RNAP的N末端部分和C末端部分不会接近。如果不使T7 RNAP的N末端部分和C末端部分接近，则T7RNAP的活性不会重建，T7启动子不会被激活，并且报告基因也不会转录(或翻译)。也就是说，如同图1B中描述的过程，报告物沉默是因为Cascade复合物和dCas3未能结合基因组靶序列以使T7 RNAP可以被“重构”和激活。
图1D是其中存在正确编辑的基因组靶序列，并且报告基因被激活的脱落蛋白系统组分的简化示意图。在图1D的上方是在T7启动子的控制下的报告基因，诸如萤光素酶。还可见结合到基因组靶序列的鉴别编辑的gRNA、Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体和dCas3-C-T7-RNAP-N末端融合构建体。在这种情况下，靶基因组序列是正确编辑的序列，它被鉴别编辑的gRNA识别。现在，鉴别编辑的gRNA和Cascade-T7-RNAP-C末端融合构建体可以在靶基因组基因座处形成R-环复合物，并且dCas3-T7-RNAP-N末端融合构建体现在可以被募集到靶基因组基因座，从而使T7 RNAP的N末端部分和C末端部分形成功能性接近。在使T7 RNAP的N末端部分和C末端部分形成功能性接近的情况下，T7 RNAP的活性被重建并且T7启动子被激活，从而转录报告基因，报告基因在本实施方案中为萤光素酶。在该图1D中还可以看到，图示转录的(和翻译的)萤光素酶催化D-萤光素(底物)转化为可检测的发光的示意图。
在细胞中进行核酸引导的核酸酶编辑的自动化细胞编辑仪器和模块
自动化细胞编辑仪器
图2A描绘了进行例如包括如本文描述的脱落蛋白报告物系统的示例性工作流程之一的示例性自动化多模块细胞处理仪器200。例如，仪器200可以并且优选地被设计为在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器200可以包括可重复使用部件和一次性部件的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行各种集成的过程而无人工干预。图示了机架(gantry)202，机架202提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化(即，机器人)液体操作系统258提供XYZ轴运动控制，该自动化液体操作系统258包括例如空气置换移液器232，这允许多个模块之间的细胞处理而无人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器232由机架202移动，并且各种模块和试剂筒保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统258可以保持静止而各种模块和试剂筒移动。自动化多模块细胞处理仪器200中还包括试剂筒210，其包括储库212和转化模块230(例如，参照图5B-图5F详细描述的流通式电穿孔装置)，以及洗涤储库206、细胞输入储库251和细胞输出储库253。洗涤储库206可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。尽管在图2A中，两个试剂筒210包括洗涤储库206，但是洗涤储库也可以被包括在洗涤筒中，其中试剂筒和洗涤筒是分开的筒。在这样的情况下，除了插入其中的消耗品(包含在各种插入物中的试剂或其他组分)之外，试剂筒210和洗涤筒204可以是相同的。
在一些实施方式中，试剂筒210是用于在自动化多模块细胞处理/编辑仪器200中使用的包含试剂和细胞的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器200的机箱(chassis)内打开和定位每个包含各种期望的插入物和试剂的试剂筒210。此外，每个试剂筒210可以插入机箱中的容器(receptacle)中，该容器具有适合于容纳在其中的试剂的不同温度区。
图2A中还图示了机器人液体操作系统258，包括机架202和空气置换移液器232。在一些实例中，机器人操作系统258可以包括自动化液体操作系统，诸如由Mannedorf,Switzerland的Tecan Group Ltd.、Reno,NV的Hamilton Company(参见，例如，WO2018015544A1)或Fort Collins,CO.的Beckman Coulter,Inc.(参见，例如，US20160018427A1)制造的那些。移液器吸头可以在移液器转移吸头供应装置(未示出)中提供，用于与空气置换移液器232一起使用。
在一些实施方式中，试剂筒210的插入物或组件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统258识别。例如，机器人液体操作系统258可以扫描每个试剂筒210内的一个或更多个插入物以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个试剂筒210上，并且自动化多模块细胞编辑仪器200的处理系统(未示出，但参见图2B的元件237)可以基于机器可读标记鉴定存储材料地图。在图2A中图示的实施方案中，细胞生长模块包括细胞生长瓶218(下文结合图3A-图3D更详细描述)。另外看到的是TFF模块222(上文结合图4A-图aE进行了详细描述)。作为图2A的自动化多模块细胞处理仪器200的一部分，还图示了在本文结合图6C-图6F描述的单个化模块240(例如，此处示出的固体壁分离、孵育和标准化装置(SWIIN装置))，该单个化模块240由例如机器人液体处理系统258和空气置换移液器232提供服务。另外看到的是选择模块220。还注意三个散热器255的放置。
图2B是图2A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器200的内容物的简化展示。例如，基于筒的源材料(诸如在试剂筒210中)可以被定位于仪器200的平台(deck)上的指定区域中，以供空气置换移液器232获取(access)。多模块细胞处理仪器200的平台可以包括保护槽，使得从仪器200的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。还看到试剂筒210，其显示为设置有热组件211，热组件211可以产生适合不同区域的温度区。注意，试剂筒之一还包括流通式电穿孔装置230(FTEP)，由FTEP接口(例如歧管臂(manifold arm))和致动器231供应。还看到与热组件225相邻的TFF模块222，其中TFF模块由TFF接口(例如歧管臂)和致动器233提供服务。热组件225、235和245包含热电装置，诸如Peltier装置，以及散热器、风扇和冷却器。旋转生长瓶218在生长模块234内，其中生长模块由两个热组件235提供服务。在220看到选择模块。还看到SWIIN模块240，其包括SWIIN筒241，其中SWIIN模块还包括热组件245、照明243(在该实施方案中为背光)、蒸发和冷凝控制249，并且其中SWIIN模块由SWIIN接口(例如，歧管臂)和致动器247提供服务。在该视图中还看到触摸屏显示器201、显示器致动器203、照明205(多模块细胞处理仪器200两侧各一个)和照相机239(多模块细胞处理仪器200两侧各一个照明装置)。最后，元件237包括电子器件，诸如电路控制板、高压放大器、电源和电源输入；以及气动器件(pneumatics)，诸如泵、阀和传感器。
图2C图示了用作自动化多模块细胞编辑仪器200的桌面版本的多模块细胞处理仪器200的前透视图。例如，机箱290可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱290可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的所有模块和一次性供应装置，并且在没有人工干预的情况下执行所需的所有过程；即，机箱290被配置成提供集成的、独立的自动化多模块细胞处理仪器。如图2C中图示的，机箱290包括触摸屏显示器201、冷却格栅264，冷却格栅264允许空气经由内部风扇(未示出)流动。触摸屏显示器向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器200的处理状态的信息，并接受来自使用者的输入用于进行细胞处理。在该实施方案中，机箱290由可调节的支脚270a、270b、270c和270d提升(支脚270a-270c在该图2C中示出)。例如，可调节的支脚270a-270d允许在机箱290下方的另外的气流。
在一些实施方式中，机箱290内部是关于图2A和图2B描述的大部分或全部部件，包括沿着机架设置的机器人液体处理系统、包括流通式电穿孔装置的试剂筒210、细胞生长模块234中的旋转生长瓶218、切向流过滤模块222、SWIIN模块240以及各种模块的接口和致动器。此外，机箱290容纳控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、传感器、热组件(例如，加热单元和冷却单元)和其他控制机构。有关多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日颁发的USPN 10,253,316；2019年6月25日颁发的USPN 10,329,559；2019年6月18日颁发的USPN 10,323,242；2019年9月24日颁发的USPN 10,421,959；2019年11月5日颁发的USPN10,465,185；以及2019年5月14日提交的USSN 16/412,195；2019年9月14日提交的USSN 16/571,091；和2019年10月29日提交的USSN 16/666,964，这些全部通过引用以其整体并入本文。
旋转细胞生长模块
图3A示出了与本文描述的细胞生长装置一起使用并在自动化多模块细胞处理仪器中使用的旋转生长瓶300的一种实施方案。旋转生长瓶300是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端304、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区306、限定至少一个光路310的锥形至收缩区(tapered-to-constricted region)318、封闭端316和驱动接合机构312。旋转生长瓶300具有中心纵轴320，瓶围绕该中心纵轴320旋转，并且光路310通常垂直于瓶的纵轴。第一光路310被定位于锥形至收缩区318的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶300的一些实施方案在锥形至收缩区318的锥形区中具有第二光路308。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶的不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)的区中，并且不受生长瓶旋转速度的影响。第一光路310比第二光路308短，在瓶中细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)允许OD值的灵敏测量，而第二光路308在瓶中细胞培养物的OD值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)，允许OD值的灵敏测量。
驱动接合机构312与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构312，使得旋转生长瓶300仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶300在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶300(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。此外，使用者可以选择培养物是否经历振荡及用于其的周期性。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶400可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶300可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。
旋转生长瓶300可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并预先填充有生长培养基地提供至使用者，其中瓶在开口端304处用箔密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理系统一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要用移液器吸出期望体积的细胞，并且使用移液器吸头刺穿瓶的箔密封件。开口端304可以任选地包括延伸边缘402，以与细胞生长装置重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶400可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化系统的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。
旋转生长瓶300的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶300的体积必须足够大，以产生指定总数量的细胞。在实践中，旋转生长瓶400的体积范围可以为1-250mL、2-100mL、5-80mL、10-50mL或12-35mL。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶400中适当通气和混合。适当的通气促进了生长培养基内均匀的细胞呼吸。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约5％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于30mL的生长瓶，细胞培养物的体积会是约1.5mL至约26mL或6mL至约18mL。
旋转生长瓶300优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，以及加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存二者。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，而在旋转时不会变形。合适的材料包括环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。
图3B是细胞生长装置330的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长装置330的剖视图。在两幅图中，可见旋转生长瓶300被定位于主壳体336内，其中旋转生长瓶300的延伸边缘302在主壳体336上方延伸。此外，两幅图中都示出了端壳体352、下壳体332和凸缘334。凸缘334用于将细胞生长装置330附接至加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图3C描绘了另外的细节。在图3C中，上轴承342和下轴承340被示出定位于主壳体336中。上轴承342和下轴承340支持旋转生长瓶300的垂直装载。下壳体332容纳驱动马达338。图3C的细胞生长装置330包括两条光路：主光路344和次光路350。光路344对应于定位于旋转生长瓶300的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路310，并且光路350对应于旋转生长瓶316的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路308。光路310和光路308未在图3C中示出，但是可见于图3A中。除了光路344和光路340之外，还存在照亮一条或更多条光路的发射板348，以及在光穿过旋转生长瓶300中的细胞培养液后检测光的检测器板346。
马达338与驱动机构312接合，并用于使旋转生长培养瓶300旋转。在一些实施方案中，马达338是具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为保持0RPM和约3000RPM之间的恒定每分钟转数(RPM)。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式DC等。任选地，马达338还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际RPM的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。
细胞生长装置330的主壳体336、端壳体352和下壳体332可以由任何合适的稳健材料，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料制成。这些结构或其部分可以通过各种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层，等等。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶300是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，细胞生长装置330的其他部件优选地是可重复使用的，并且发挥作为独立台式装置或多模块细胞处理系统中的模块的功能。
细胞生长装置330的处理器(未示出)可以被编程为具有待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0OD，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的OD。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且OD会增加。细胞生长装置330的处理器(未示出)可以被编程为使用与细胞培养(不论，例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长装置330中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。
图3D图示了作为组装的一部分的细胞生长装置330，包括与光源390、检测器392和热部件394耦合的图3B的细胞生长装置330。将旋转生长瓶300插入细胞生长装置中。光源390和检测器392的部件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长设备的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶300旋转的马达的下壳体332，以及将细胞生长装置330固定至组件的凸缘334之一。同样，图示的热部件394是Peltier装置或热电冷却器。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体332的基部上的凸缘334将细胞生长装置330附接至热部件394并与热部件394电一体化来实现。热电冷却器能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(PID)控制器回路，将旋转生长瓶300控制在约+/-0.5℃。
在使用时，通过刺穿箔密封件或膜，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶300的预先填充生长培养基中。细胞生长装置330的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶300的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶300将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取OD或OD测量。这些测量值存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量值对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的OD时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。
细胞生长装置330的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(OD)的上下文中描述了细胞生长装置330，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物OD之外或者代替细胞培养物OD，可以测量其他细胞生长参数。如同上文关于固体壁装置或模块描述的细胞生长的任选测量，使用可见光、UV或近红外(NIR)光的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废物的浓度，并且可以进行其他光谱学测量；即，可以经由例如介电阻抗光谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量其他光谱特性。此外，细胞生长装置430可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH、电导率等的另外的传感器。有关旋转生长瓶和细胞生长装置的另外详细信息，参见2019年3月21日提交的USSN 16/360,404和2019年3月21日提交的USSN 16/360,423。
细胞浓缩模块
如上文关于旋转生长瓶和细胞生长模块描述的，为了获得足够数量的用于转化或转染的细胞，细胞通常在适合感兴趣的细胞生长的培养基中生长至特定的光密度；然而，为了有效转化或转染，期望减少细胞体积，并经由缓冲液或培养基交换使细胞为感受态。因此，在用于以上所列的过程的细胞处理系统中所期望的一个子部件或模块是能够生长、进行缓冲液交换和/或浓缩细胞并使它们为感受态从而可以用工程化或编辑细胞基因组所需的核酸转化或转染它们的模块或部件。
图4A示出了渗余物构件422(上图)、渗透物构件420(中图)和切向流组件410(下图)，切向流组件410包括渗余物构件422、膜424(未见于图4A中)和渗透物构件420(也是未见的)。在图4A中，渗余物构件422包括切向流动通道402，该切向流动通道402具有蛇形构造，该蛇形构造从渗余物构件422的一个下角(具体地，在渗余物端口428处)开始横穿并向上然后向下并横穿渗余物构件422，终止于第二渗余物端口428处的渗余物构件422的另一个下角。在渗余物构件422上还看到能量导向器491，该能量导向器491围绕膜或过滤器(未见于该图4A中)所处的区域，并且在通道402的区域之间相互交叉。在该实施方案中，能量导向器491经由渗透物/滤液构件420上的能量导向器部件491(在右侧)与渗余物构件422和渗透物/滤液构件420配合，并用于促进渗余物构件422与渗透物/滤液构件420的超声波焊接或结合。另外，可以看到埋头孔423，两个在渗余物构件422的底部，一个在渗余物构件422的顶部中间。埋头孔423用于将切向流组件410耦合到储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)。
渗透物/滤液构件420在图4A的中部可见，并且除了能量导向器491之外，渗透物/滤液构件420还包括用于每个底角处的渗余物端口428的通孔(其与渗余物构件422的底角处的渗余物端口428的通孔配合)，以及位于渗透物构件420的顶部和中心的切向流动通道402和两个渗透物/滤液端口426。该实施方案中的切向流动通道402结构具有蛇形构造和波状几何形状，尽管也可以使用其他几何形状。渗透物构件420还包括埋头孔423，与渗余物构件420上的埋头孔423一致。
在图4A的左侧是切向流组件410，其包括在该图4A中看到的渗余物构件422和渗透物构件420。在该视图中，渗余物构件422在视图的“顶部”，膜(未见于组件的该视图中)将邻近渗余物构件422并在其下方，并且渗透物构件420(未见于组件的该视图中)邻近膜并在其下方。再次看到埋头孔423，其中渗余物构件422和渗透物构件420中的埋头孔一致并配置成与设置在储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)上的埋头孔的螺纹或配合元件配合。
膜或过滤器设置在渗余物构件和渗透物构件之间，其中流体可以流过膜，但是细胞不能，并因此被保留在设置在渗余物构件中的流动通道中。适用于TFF装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至20μm。事实上，可用于TFF装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。
通道结构402的长度可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构的长度通常为60mm至300mm，或70mm至200mm，或80mm至100mm。流动通道402的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或另一种具有大体上直边的形状，截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道102的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。此外，渗余物422和渗透物420构件中的通道的体积可以根据每个构件中通道的深度而不同。
图4B示出了配置成与图4A中所见的切向流组件410一起使用的储库组件450的前透视图(右)和后透视图(左)。在前透视图中看到的(例如，“前”是储库组件450耦合到图4A中所见的切向流组件410的一侧)是渗透物储库454任一侧上的渗余物储库452。还看到渗透物端口426、渗余物端口428和用于埋头孔423的三个螺纹或配合元件425(埋头孔423未见于该图4B中)。埋头孔423的螺纹或配合元件425被配置成将切向流组件410(见于图4A中)配合或耦合到储库组件450。可选地或另外，紧固件、声波焊接或热融柱(heat stakes)可用于将切向流组件410配合或耦合到储库组件450。此外，看到覆盖储库组件450顶部的密封垫445。图4E详细描述了密封垫445。在图4B的左侧是储库组件1250的后部透视图，其中“后”是储库组件450的未耦合到切向流组件的一侧。看到的是渗余物储库452、渗透物储库454和密封垫445。
TFF装置可以由可以在其中磨铣通道(和通道分支)的包括以下的任何稳健材料制成：不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果TFF装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造TFF装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，TFF装置使用上文提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。
图4C描绘了图4B所示的储库组件450的俯视图。图4D描绘了用于图4B所示的储库组件450的盖444，并且图4E描绘了在操作中设置在图4B所示的储库组件450的盖444上的密封垫445。图4C是储库组件450的俯视图，示出了两个渗余物储库452的顶部，一个在渗透物储库454的一侧。还看到凹槽432和流体通道434，凹槽432与气动端口(未示出)配合，流体通道434位于渗余物储库452的底部，流体通道434经由渗透物构件420和膜424(也未示出)中的渗余物端口的通孔将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。图4D描绘了被配置成设置在储库组件450顶部的盖444。盖444在渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的顶部具有圆形开孔。同样，在渗余物储库452的底部可以看到流体通道434，其中流体通道434将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。还示出了用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。图4E描绘了密封垫445，该密封垫445被配置成设置在储库组件450的盖444上。可见用于每个渗余物储库452和用于渗透物/滤液储库454的三个流体传输端口442。同样，示出了用于每个渗余物储库452和用于渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。
用于细胞生长的总工作流程包括将待生长的细胞培养物装载到第一渗余物储库中，任选地使空气或合适的气体鼓泡通过细胞培养物，使细胞培养物通过或流经第一渗余物端口，然后切向通过TFF通道结构，同时通过渗透物端口406之一或二者收集培养基或缓冲液，通过第二渗余物端口404将细胞培养物收集到第二渗余物储库中，任选地向细胞培养物中添加另外的或不同的培养基，并任选地使空气或气体鼓泡通过细胞培养物，然后重复所述过程，全部同时连续地或以期望的间隔测量例如渗余物储库中细胞培养物的光密度。使用600nm发光二极管(LED)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含生长细胞的一个或更多个渗余物储库中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度显示为光衰减器的功率传输因子(power transmissionfactor)的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，TFF装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。
在通道结构中，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧(渗余物侧422)，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液或渗透物侧(例如，渗透物构件420)。将空气或其他合适的气体鼓泡通过细胞培养物，既能通气又能混合培养物以促进细胞生长。在该过程期间，在流过通道结构期间被去除的培养基通过渗透物/滤液端口406去除。可选地，细胞可以在鼓泡或搅拌下在一个储库中生长，而不使细胞从一个储库通过TFF通道到达另一个储库。
用于使用TFF装置/模块的细胞浓缩的总工作流程涉及使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。如同细胞生长过程，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的渗透物/滤液侧(例如，渗透物构件420)。在该过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口404中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个渗透物/滤液端口406收集。所有类型的原核细胞和真核细胞——黏附细胞和非黏附细胞二者——均可以在TFF装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过TFF装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。
用于将细胞悬浮在细胞浓缩装置/模块中的培养基或缓冲液可以是用于被转化或转染的细胞类型的任何合适的培养基或缓冲液，诸如LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks氏、PBS和林格氏溶液，其中培养基可以提供在作为套件的一部分的试剂筒中。对于黏附细胞的培养，细胞可以置于珠、微载体或悬浮在培养基中的其他类型的支架上。大多数正常的哺乳动物组织来源的细胞——除了那些来自造血系统的细胞——是锚定依赖性的，并且需要表面或细胞培养支持物才能正常增殖。在本文描述的旋转生长瓶中，利用了微载体技术。特定用途的微载体通常具有100-300μm的直径，并且具有略大于培养基密度的密度(因此便于细胞和培养基的容易分离，例如用于培养基交换)，然而密度也必须足够低，以允许载体在最小搅拌速率完全悬浮，从而避免对细胞的流体动力损伤。有许多不同类型的微载体可用，并且不同的微载体针对不同类型的细胞进行了优化。有带正电荷的载体，诸如Cytodex 1(基于葡聚糖，GE Healthcare)、DE-52(基于纤维素，Sigma-AldrichLabware)、DE-53(基于纤维素，Sigma-Aldrich Labware)和HLX 11-170(基于聚苯乙烯)；胶原蛋白或ECM-(细胞外基质)涂层载体，诸如Cytodex 3(基于葡聚糖，GE Healthcare)或HyQ-sphere Pro-F 102-4(基于聚苯乙烯，Thermo Scientific)；无电荷载体，如Hyq-sphere P 102-4(Thermo Scientific)；或基于明胶(Cultisphere，Percell Biolytica)或纤维素(Cytopore，GE Healthcare)的大孔载体。
在细胞生长和浓缩过程二者中，使细胞样品通过TFF装置并在一个渗余物端口404中收集细胞，同时在一个渗透物/滤液端口406中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和渗透物端口位于TFF装置/模块的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和渗透物/滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口404位于装置/模块的渗余物构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，渗透物/滤液端口406会位于装置/模块的渗透物构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。由于用于通过TFF装置的流动通道转移细胞培养物和流体的高压，重力的影响可以忽略不计。
在生长和浓缩过程的任一种“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了启动另一次“通过”，细胞样品再次通过TFF装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集，该储库位于装置/模块与渗余物端口404相对的一端上，渗余物端口404在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过渗透物端口406或通过两个端口收集，所述渗透物端口406位于装置/模块与渗透物端口406相对的一端上，所述渗透物端口406在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的交替过程，直至细胞已经生长至期望的光密度，和/或浓缩到期望的体积，并且两个渗透物端口(即，如果存在多于一个)可以在通过期间打开以减少操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后启动另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞生长可以(并且通常确实)同时发生，并且缓冲液交换和细胞浓缩可以(并且通常确实)同时发生。关于TFF的进一步信息和替代实施方案，参见例如2018年9月7日提交的USSN 62/728,365；2019年6月5日提交的USSN 62/857,599；和2019年6月27日提交的USSN62/867,415。
细胞转化模块
图5A描绘了可与TFF模块一起用于自动化多模块细胞处理仪器中的示例性组合试剂筒和电穿孔装置500(“筒”)。此外，在某些实施方案中，用于制造筒的材料是导热的，因为在某些实施方案中，筒500接触加热或冷却试剂储库或储库504中的试剂的热装置(未示出)，诸如Peltier装置或热电冷却器。试剂储库或储库504可以是如图5A所示的单个试剂管插入其中的储库，或者试剂储库可以在没有插入管的情况下容纳试剂。此外，试剂筒中的储库可以被配置用于管、共同连接的管和试剂的直接填充的任何组合。
在一种实施方案中，试剂筒500的试剂储库或储库504被配置成容纳各种尺寸的管，包括例如250ml管、25ml管、10ml管、5ml管和Eppendorf管或微量离心管。在又另一种实施方案中，所有储库可以被配置为容纳相同尺寸的管，例如5ml管，并且储库插入物可以用于容纳试剂储库中的较小管。在又另一种实施方案中，特别是在试剂筒是一次性的实施方案中，试剂储库在没有插入管的情况下容纳试剂。在该一次性实施方案中，试剂筒可以是套件的一部分，其中试剂筒预先填充有试剂，并且容器或储库用例如箔、热封丙烯酸树脂等密封，并呈现给消费者，然后其中试剂筒可以用于自动化多模块细胞处理仪器中。考虑到本公开内容，如本领域普通技术人员将理解的，包含在试剂筒中的试剂将根据工作流程而变化；即，试剂将根据细胞在自动化多模块细胞处理仪器中经受的过程例如蛋白产生、细胞转化和培养、细胞编辑等而变化。
试剂，诸如细胞样品、酶、缓冲液、核酸载体、表达盒、蛋白或肽、反应组分(诸如例如MgCl2、dNTP、核酸组装试剂、缺口修复试剂等)、洗涤溶液、乙醇和用于核酸纯化和分离的磁珠等，可以定位于试剂筒中已知的位置。在筒500的一些实施方案中，筒包括处理器(未示出)可读的用于分配试剂的脚本(未示出)。此外，作为自动化多模块细胞处理仪器中的一个部件的筒500可以包括指定要由自动化多模块细胞处理仪器执行的两个、三个、四个、五个、十个或更多个过程的脚本。在某些实施方案中，试剂筒是一次性的，并且预包装有定制为执行特定细胞处理方案(例如，基因组编辑或蛋白产生)的试剂。因为试剂筒内容物不同，而自动化多模块细胞处理仪器或系统的部件/模块可以不变，所以与特定试剂筒关联的脚本与所使用的试剂和所执行的细胞处理相匹配。因此，例如，试剂筒可以预包装有用于基因组编辑的试剂和指定用于在自动化多模块细胞处理仪器中执行基因组编辑的过程步骤的脚本，或者例如用于蛋白表达的试剂和指定用于在自动化多模块细胞处理仪器中执行蛋白表达的过程步骤的脚本。
例如，试剂筒可以包括用于以下的脚本：从储库吸移感受态细胞，将细胞转移到转化模块，从试剂筒中的另一个储库吸移包含具有表达盒的载体的核酸溶液，将核酸溶液转移到转化模块，启动转化过程特定时间，然后将转化的细胞移动到试剂筒中的又另一个储库或自动化多模块细胞处理仪器中的另一个模块，诸如细胞生长模块。在另一个实例中，试剂筒可以包括用于以下的脚本：从试剂筒中的储库转移包含载体的核酸溶液，转移试剂盒中的储库中包含编辑寡核苷酸盒的核酸溶液，以及将核酸组装混合物从另一个储库转移到核酸组装/脱盐模块(如果存在)。脚本还可以指定由自动化多模块细胞处理仪器中的其他模块执行的过程步骤。例如，脚本可以指定，将核酸组装/脱盐储库加热至50℃30分钟以产生组装的产物；以及经由基于磁珠的核酸纯化使组装的产物脱盐和重悬，涉及一系列移液管转移以及磁珠、乙醇洗涤和缓冲液的混合。
如下文关于图5B和图5C描述的，用于自动化多模块细胞处理仪器的示例性试剂筒可以包括一个或更多个电穿孔装置，优选地流通式电穿孔(FTEP)装置。在又其他实施方案中，试剂筒与转化模块分离。电穿孔是广泛使用的细胞膜透化方法，通过用电刺激在细胞膜中暂时产生孔来实现。电穿孔的应用包括将DNA、RNA、siRNA、肽、蛋白、抗体、药物或其他物质递送到各种细胞，诸如哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、古生菌、酵母、其他真核细胞、细菌和其他细胞类型。电刺激也可用于杂交瘤或其他融合细胞的产生中的细胞融合。在典型的电穿孔程序期间，将细胞悬浮在有利于细胞存活的缓冲液或培养基中。对于细菌细胞电穿孔，通常使用低电导介质诸如水、甘油溶液等降低瞬时高电流产生的热量。在传统的电穿孔装置中，细胞和待电穿孔到细胞中的材料(统称为“细胞样品”)被放置在嵌有两个用于放电的扁平电极的比色皿中。例如，Bio-Rad(Hercules,Calif.)制造了GENE PULSERXCELLTM系列产品，以对比色皿中的细胞进行电穿孔。传统上，电穿孔需要高场强；然而，包含在试剂筒中的流通式电穿孔装置实现了高效细胞电穿孔与低毒性。本公开内容的试剂筒允许特别容易地与机器人液体操作仪器成一体，该机器人液体操作仪器通常用于自动化仪器和系统，诸如空气置换移液器。这样的自动化仪器包括但不限于来自Tecan(Mannedorf,Switzerland)、Hamilton(Reno,NV)、Beckman Coulter(Fort Collins,CO)等的现成的自动化液体操作系统。
图5B和图5C分别是示例性FTEP装置550的顶部透视图和底部透视图，该装置可以是图5A中的试剂筒500的一部分(例如，其中的部件)，或者可以是独立的模块；即，不是试剂筒或其他模块的一部分。图5B描绘了FTEP装置550。FTEP装置550具有限定细胞样品入口552和细胞样品出口554的孔。图5C是图5B的FTEP装置550的底部透视图。在该视图中可以看到入口孔552和出口孔554。在图5C中还看到对应于孔552的入口562的底部、对应于出口孔554的出口564的底部、限定的流动通道566的底部以及流动通道566两侧上的两个电极568的底部。FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多道电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后对于另一次电穿孔，细胞从FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过。此外，该过程可以重复一次至许多次。有关FTEP装置的另外的信息，参见，例如，2018年9月28日提交的USSN 16/147,120；2018年9月28日提交的USSN 16/147,353；2019年5月30日提交的USSN 16/426,310；和2018年9月30日提交的USSN 16/147,871；及2019年6月18日颁发的USPN 10,323,258。此外，试剂筒的其他实施方案可以提供或容纳未被配置为FTEP装置的电穿孔装置，诸如在2018年8月22日提交的USSN16/109,156中描述的那些。对于在本发明的自动化多模块细胞处理仪器中有用的试剂筒，参见，例如，2019年8月13日颁发的USPN 10,376,889；和2019年6月25日提交的USSN 16,451,601。
FTEP装置的另外细节在图5D-图5F中图示。注意，在图5D-图5F的FTEP装置中，电极被放置成使得第一电极被放置在入口和流动通道的狭窄区域之间，并且第二电极被放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。图5D示出了FTEP装置550的俯视平面图，该装置具有用于将含有细胞和外源物质的流体引入FTEP装置550的入口552和用于在电穿孔后从FTEP取出转化的细胞的出口554。电极568通过装置中的通道(未示出)引入。图5E示出了从FTEP装置550的顶部的剖视图，其中入口552、出口554和电极568相对于流动通道566定位。图5F示出了具有入口552和入口通道572以及出口554和出口通道574的FTEP装置550的侧面剖视图。电极568定位于电极通道576中，使得它们与流动通道566流体连通，但不直接位于细胞穿过流动通道566的路径中。注意，第一电极放置在入口和流动通道的狭窄区域之间，并且第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。在该装置的这一方面中的电极568定位于电极通道576中，电极通道576通常垂直于流动通道566，使得包含细胞和外源物质的流体从入口通道572通过流动通道566流到出口通道574，并且在该过程中，流体流入电极通道376以与电极568接触。在这方面，入口通道、出口通道和电极通道都源自装置的同一平面侧。然而，在某些方面，电极可以从与入口通道和出口通道不同的FTEP装置的平面侧引入。
在本公开内容的FTEP装置中，转化的毒性水平产生电穿孔后大于30％的存活细胞，优选地转化后大于35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的存活细胞，这取决于细胞类型和引入细胞的核酸。
FTEP装置的壳体可以由许多材料制成，这取决于FTEP装置是要重复使用、高压灭菌还是一次性使用，材料包括不锈钢、硅、玻璃、树脂、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。类似地，装置中通道的壁可以由任何合适的材料制成，包括硅酮、树脂、玻璃、玻璃纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括结晶苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)，这允许除了电极和例如底部密封膜(如果存在)之外，该装置可以通过注射成型整体形成。
本文描述的FTEP装置(或FTEP装置的部分)可以经由各种技术产生或制造，例如作为整个装置或通过产生熔合或以其他方式耦合的结构层。例如，对于金属FTEP装置，制造可以包括精密机械加工或激光加工；对于硅FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻；对于玻璃FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻、喷粉(powderblasting)、喷砂或光结构化；以及对于塑料FTEP装置，制造可以包括热成型、注射成型、热压花或激光加工。FTEP装置的部件可以单独制造并且然后组装，或者FTEP装置的某些部件(或者甚至除了电极之外的整个FTEP装置)可以作为单个实体制造(例如，使用3D打印)或模制(例如，使用注射成型)，在模制之后添加其他部件。例如，壳体和通道可以被制造或模制成单个实体，电极随后被添加以形成FTEP单元。可选地，FTEP装置也可以形成为两个或更多个平行层，例如，具有水平通道和过滤器的层、具有垂直通道的层以及具有入口端口和出口端口的层，这些层被单独制造和/或模制并在制造之后组装。
在特定方面，可以使用电路板作为基底来制造FTEP装置，其中电极、过滤器和/或流动通道以期望的配置形成在电路板上，并且包含例如一个或更多个入口通道和出口通道和/或流动通道的装置的剩余壳体作为单独的层形成，然后密封到电路板上。将壳体的顶部密封到电路板上提供了本公开内容的FTEP装置的不同元件的期望配置。此外，可以在单个基底上制造两个至许多个FTEP装置，然后彼此其后分离或者并行使用。在某些实施方案中，FTEP装置是可重复使用的，并且在一些实施方案中，FTEP装置是一次性的。在另外的实施方案中，FTEP装置可以是可高压灭菌的。
电极408可以由任何合适的金属诸如铜、不锈钢、钛、铝、黄铜、银、铑、金或铂或石墨形成。一种优选的电极材料是合金303(UNS330300)奥氏体不锈钢。施加的电场可以破坏由金属(如铝)制成的电极。如果期望多次使用(即，非一次性)流通式FTEP装置，不同于一次性的一次使用流通式FTEP装置，电极板可以涂有对电化学腐蚀耐受的金属。导电涂层，如贵金属，例如金，可用于保护电极板。
如提及的，FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多次(multi-pass)电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后对于另一次电穿孔，细胞从流通式FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过。这个过程可以重复一次至许多次。
根据待电穿孔的细胞类型(例如细菌、酵母、哺乳动物)和电极的配置，流动通道中电极之间的距离可以变化很大。例如，在流动通道宽度减小的情况下，流动通道可以窄至10μm和5mm之间，或者25μm和3mm之间，或者50μm和2mm之间，或者75μm和1mm之间。流动通道中电极之间的距离可以在1mm和10mm之间，或者在2mm和8mm之间，或者在3mm和7mm之间，或者在4mm和6mm之间。FTEP装置的总尺寸可是3cm至15cm长，或4cm至12cm长，或4.5cm至10cm长。FTEP装置的总宽度可以是0.5cm到5cm，或者0.75cm到3cm，或者1cm到2.5cm，或者1cm到1.5cm。
流动通道变窄的区域足够宽，使得至少两个细胞可以适于并排在变窄的部分中。例如，典型的细菌细胞直径为1μm；因此，用于转化这样的细菌细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少2μm宽。在另一个实例中，如果哺乳动物细胞直径为约50μm，则用于转化这样的哺乳动物细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少100μm宽。即，FTEP装置的变窄部分不会物理扭曲或“挤压”被转化的细胞。
在FTEP装置的实施方案中，其中储库用于将细胞和外源物质引入FTEP装置，储库的体积范围为100μL至10mL，或500μL至75mL，或1mL至5mL。FTEP中的流速范围为每分钟0.1mL至5mL，或每分钟0.5mL至3mL，或每分钟1.0mL至2.5mL。FTEP装置中的压力范围为1-30psi，或2-10psi，或3-5psi。
为了避免电极之间的场强不同，电极应当平行排列。此外，电极的表面应当尽可能光滑，而无针孔或峰。具有1μm至10μm的粗糙度Rz的电极是优选的。在本发明的另一种实施方案中，流通式电穿孔装置包括至少一个另外的电极，该电极向FTEP装置施加地电位。流通式电穿孔装置(作为独立仪器或作为自动化多模块系统中的模块)描述于，例如，2018年9月28日提交的USSN 16/147,120；2018年9月28日提交的USSN 16/147,353；2018年9月30日提交的USSN 16/147,865；和2019年5月30日提交的USSN 16/426,310；及2019年6月18日颁发的USPN 10,323,258。
细胞单个化和富集装置
图6A描绘了固体壁装置6050和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞单个化的工作流程。在图(i)的左上方，描绘了具有微孔6052的固体壁装置6050。基底6050的部分6054在(ii)示出，还描绘了微孔6052。在(iii)，示出了固体壁装置6050的侧截面，并且已经对微孔6052进行了装载，其中在该实施方案中已经发生了泊松装载(Poisson loading)或大致上泊松装载；即，每个微孔具有一个细胞或不具有细胞，并且任何一个微孔具有多于一个细胞的可能性低。在(iv)，图示了工作流程6040，其中具有微孔6052的基底6050显示出每个微孔具有一个细胞的微孔6056、微孔中没有细胞的微孔6057以及微孔中具有两个细胞的一个微孔6060。在步骤6051，允许微孔中的细胞倍增约2-150倍以形成克隆集落(v)，然后允许进行编辑6053。
在编辑6053后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑(activeediting)引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞存在生长延滞(微孔6058)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔6059)(vi)。允许所有细胞继续生长以建立集落并且标准化，其中微孔6058中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上没有经历编辑的微孔6059中的细胞(vii)。在细胞集落被标准化后，微孔中所有细胞的任一汇集6060就可以发生，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞(non-edited cells)和来自编辑的适应度效应的偏倚，针对编辑的细胞富集细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择6061(例如“择优选取(cherry picked)”)缓慢生长的集落(例如微孔6058中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。
在使细胞生长时，所使用的培养基当然取决于被编辑的细胞类型例如细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于酵母细胞生长的培养基包括LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM和DMEM。
图6B描绘了固体壁装置6050和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞大体上单个化的工作流程。在图(i)的左上方，描绘了具有微孔6052的固体壁装置350。基底6050的部分6054在(ii)示出，还描绘了微孔6052。在(iii)，示出了固体壁装置6050的侧截面，并且已经对微孔6052进行了装载，其中在该实施方案中已经发生了大致上泊松装载；即有些微孔6057不具有细胞，并且有些微孔6076、6078具有少量细胞。在图6B中，具有活性gRNA的细胞显示为实心圆，而具有无活性gRNA的细胞显示为空心圆。在(iv)，图示了工作流程6070，其中具有微孔6052的基底6050示出了三个若干细胞都具有活性gRNA的微孔6076，没有细胞的微孔6057，以及两个一些细胞具有活性gRNA并且一些细胞具有无活性gRNA的微孔6078。在步骤6071，允许微孔中的细胞倍增大约2-150倍以形成克隆集落(v)，然后进行编辑6073。
在编辑6073后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞存在生长延滞(微孔6076)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔6078)(vi)。因此，在只有具有活性gRNA的细胞(由实心圆描绘的细胞)驻留的微孔6076中，大多数细胞死亡；然而，在含有具有无活性gRNA的细胞(由空心圆描绘的细胞)的微孔6078中，细胞继续生长，并且不受有效编辑的影响。允许每个微孔(6076和6078)中的细胞继续生长以建立集落并且标准化，其中微孔6076中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上没有经历编辑的微孔6078中的未编辑细胞(vii)。注意，在该工作流程6070中，微孔中的细胞集落不是克隆的；即，孔中并不是所有的细胞都来自单个细胞。而是，孔中的细胞集落可以是混合的集落，在许多孔中由两个至若干个不同的细胞产生。在细胞集落被标准化后，微孔中所有细胞的任一汇集6090就可以发生，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞和来自编辑的适应度效应的偏倚，细胞富集了编辑的细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择6091(例如“择优选取”)缓慢生长的集落(例如微孔6076中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。
可用于执行图6A和图6B中描绘的方法的模块是固体壁分离、孵育和标准化(SWIIN)模块。图6C由分解顶部透视图描绘了SWIIN模块650的实施方案。在SWIIN模块650中，渗余物构件形成在SWIIN模块部件顶部的底端，并且渗透物构件形成在SWIIN模块部件底部的顶端。
图6C中的SWIIN模块650自上而下包括储库密封垫或盖658、渗余物构件604(其中渗余物流动通道不可见于该图6C中)、与过滤器(过滤器未见于图6C中)锻造的穿孔构件601、包括集成储库(渗透物储库652和渗余物储库654)的渗透物构件608、以及密封渗透物储库652和渗余物储库654底部的两个储库密封件662。可以看到渗透物通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由蛇形通道660a的凸起部分676限定，还可以看到超声波突出部(ultrasonic tabs)664设置在渗透物构件608的顶部。在该图6C中看不到在穿孔构件601上形成孔的穿孔；然而，看到容纳超声波突出部664的通孔666。此外，支持物670设置在SWIIN模块650的任一端，以支持SWIIN模块650，并将渗透物构件608和渗余物构件604提升到储库652和654上方，以使进入从渗透物储库到蛇形通道660a的流体路径或从渗余物储库到蛇形通道660b的流体路径(在该图6C中看不到这两个流体路径)的气泡或空气最小化。
在该图6C中，可以看到，设置在渗透物构件608顶部的蛇形通道660a在渗透物构件608的大部分长度以及渗透物构件608的大部分宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物储库652和渗余物储库654的部分之外。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分长度”意指渗余物构件或渗透物构件长度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件长度的约90％、85％、80％、75％或70％。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分宽度”意指渗余物构件或渗透物构件宽度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件宽度的约90％、85％、80％、75％或70％。
在SWIIN模块的该实施方案中，穿孔构件包括通孔，以容纳设置在渗透物构件上的超声波突出部。因此，在该实施方案中，穿孔构件由316不锈钢制成，并且穿孔形成微孔的壁，而过滤器或膜用于形成微孔的底部。通常，穿孔(微孔)直径为约150μm-200μm，并且穿孔构件为约125μm深，导致微孔具有约2.5nl的体积，总共约200,000个微孔。微孔之间的距离是中心至中心约279μm。虽然此处微孔具有约2.5nl的体积，但微孔的体积可以是1nl至25nl，或优选地2nl至10nl，并且甚至更优选地2nl至4nl。至于过滤器或膜，像前面描述的过滤器一样，适合使用的过滤器是耐溶剂的、在过滤期间无污染，并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.10μm，然而对于其他细胞类型(例如，诸如对于哺乳动物细胞)，孔径可以高至10.0μm-20.0μm或更大。事实上，可用于细胞浓缩装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.10μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙或玻璃纤维。
配合的蛇形通道的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或具有大体上直边的另一种形状，截面可以是约2mm到15mm宽，或者3mm到12mm宽，或者5mm到10mm宽。如果配合的蛇形通道的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形，通道的半径可以是以水力半径约3mm到20mm，或者以水力半径5mm到15mm，或者以水力半径8mm到12mm。
蛇形通道660a和660b可以具有大致相同的体积或不同的体积。例如，蛇形通道的每个“侧面”或部分660a、660b可以具有例如2mL的体积，或者渗透物构件608的蛇形通道660a可以具有2mL的体积，并且渗余物构件604的蛇形通道660b可以具有例如3mL的体积。蛇形通道中的流体体积范围可以是约2mL至约80mL、或约4mL至60mL、或5mL至40mL、或6mL至20mL(注意，这些体积适用于包括例如50-500K穿孔构件的SWIIN模块)。储库的体积范围可以是5mL至50mL、或7mL至40mL、或8mL至30mL或10mL至20mL，并且所有储库的体积可以相同或储库的体积可以不同(例如，渗透物储库的体积大于渗余物储库的体积)。
渗透物构件608和渗余物构件604的蛇形通道部分660a和660b分别为约200mm长、130mm宽和4mm厚，尽管在其他实施方案中，渗余物构件和渗透物构件的长度可为75mm至400mm，或长度可为100mm至300mm，或长度可为150mm至250mm；宽度可为50mm至250mm，或宽度可为75mm至200mm，或宽度可为100mm至150mm；以及厚度可为2mm至15mm，或厚度可为4mm至10mm，或厚度可为5mm至8mm。实施方案渗余物(和渗透物)构件可以由PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))制成，或者可以使用其他材料，包括聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚砜、聚氨酯以及这些和其他聚合物的共聚物。优选地，至少渗余物构件由透明材料制成，使得细胞可以被可视化(例如，参见图6F及其描述)。例如，通过例如基于具有相差的空孔图像的密度变化测量，或者如果例如使用发色标记(chromogenicmarker)，诸如发色蛋白，来给细胞添加可区分的颜色，摄像机可以用于监测细胞生长。尽管也可以使用荧光细胞标记(fluorescent cell markers)、荧光蛋白和化学发光细胞标记(chemiluminescent cell markers)，但发色标记诸如blitzen蓝、dreidel蓝绿、virginia紫、vixen紫、prancer紫、tinsel紫、maccabee紫、donner品红、cupid粉、seraphina粉、scrooge橙和leor橙(Chromogenic Protein Paintbox，均可从ATUM(Newark,CA)获得)避免了使用荧光的需要。
因为渗余物构件优选地是透明的，所以SWIIN模块中的集落生长可以通过自动化装置，诸如JoVE(ScanLagTM system,Cambridge,MA)销售的装置进行监测(也参见Levin-Reisman等人,Nature Methods,7:737-39(2010))。例如哺乳动物细胞的细胞生长可以通过例如由IncuCyte(Ann Arbor,MI)销售的生长监测器来监测(也参见，Choudhry,PLos One,11(2):e0148469(2016))。此外，可以采用自动化集落选取仪，诸如由例如TECAN(PickoloTMsystem,Mannedorf,Switzerland)；Hudson Inc.(RapidPickTM,Springfield,NJ)；Molecular Devices(QPix 400TM system,San Jose,CA)；以及Singer Instruments(PIXLTMsystem,Somerset,UK)销售的那些。
由于SWIIN模块的加热和冷却，冷凝物可能积聚在渗余物构件上，这可能干扰正在生长的细胞集落的精确可视化。SWIIN模块650的冷凝可以通过例如在SWIIN模块650的顶部(例如渗余物构件)上移动加热的空气，或者通过在渗余物构件604的至少蛇形通道部分660b上应用透明加热盖来控制。参见例如图6F及下文对其的描述。
在SWIIN模块650中，细胞和培养基——以适于穿孔构件的微孔中细胞的泊松或大致上泊松分布的稀释度——从渗余物构件604中的端口流入蛇形通道660b，并且细胞在微孔中沉淀，同时培养基穿过过滤器进入渗透物构件608中的蛇形通道660a。由于细胞不能穿过过滤器603，细胞被保留在穿孔构件601的微孔中。合适的培养基可以通过渗透物端口611引入渗透物构件608。培养基向上流过过滤器603，以滋养穿孔构件601的微孔(穿孔)中的细胞。此外，缓冲液交换可以通过循环培养基通过渗余物和渗透物构件来实现。在操作中，细胞被沉积到微孔中，生长初始的例如2-100倍增，编辑通过例如将SWIIN的温度升高到42℃以诱导温度诱导型启动子来诱导，或者通过从渗透物构件中去除生长培养基并用包含诱导诱导型启动子的化学组分的培养基替换生长培养基来诱导。
在编辑已经发生后，可以降低SWIIN的温度，或者可以去除诱导培养基并用缺乏化学组分的新鲜培养基替换，从而使诱导型启动子失活。然后，细胞在SWIIN模块650中继续生长，直到微孔中细胞集落的生长被标准化。对于标准化方案，在集落被标准化后，通过向渗透物构件蛇形通道660a施加并从而向过滤器603施加流体或空气压力(或二者)，将集落从微孔中冲洗出来并汇集。可选地，如果期望择优选取，监测微孔中细胞集落的生长，并直接选择缓慢生长的集落；或者，快速生长的集落被消除。
图6D是具有渗余物构件和穿孔构件的SWIIN模块的部分横截面的顶部透视图。在该图6D中，可以看到，蛇形通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由凸起部分676限定，并且在渗透物构件608的大部分长度和宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物和渗余物储库的部分之外(注意，只能看到一个渗余物储库652)。从左向右移动，储库密封垫658设置在渗余物构件604的集成储库盖678(盖未见于该图6D中)上。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。在最左端还有支持物670。可以看到设置在渗透物储库652下方的两个储库密封件662中的一个。除了渗余物构件在横截面中，穿孔构件601和过滤器603(过滤器603未见于该图6D中)也是横截面。注意，在SWIIN模块650的右端和限定蛇形通道660a的通道转弯的凸起部分676上设置有多个超声波突出部664，包括延伸穿过穿孔构件601的通孔666的超声波突出部664。在渗透物构件608的末端远端储库652、654处也有支持物670。
图6E是组装的SWIIN模块650的侧面透视图，从右至左包括设置在渗余物构件604的集成储库盖678(未示出)上的储库密封垫658。密封垫658可以由橡胶、硅酮、丁腈橡胶、聚四氟乙烯、诸如聚三氟氯乙烯的塑料聚合物或其他柔性可压缩材料制成。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。渗透物构件608的支持物670也在最左端。此外，可以看到渗透物储库652以及一个储库密封件662。在最右端是第二支持物670。
在大多数实施方式中，期望对生长在SWIIN的孔中的细胞集落进行成像，例如，以监测细胞生长和装置性能二者，并且成像对于择优选取实施方式是必要的。实时监测SWIIN中的细胞生长需要背光、渗余物板(顶板)冷凝管理和系统水平的温度控制、气流和热管理手段。在一些实施方式中，成像采用具有足够分辨率的照相机或CCD器件，以能够对单个孔成像。例如，在一些配置中，使用具有9像素间距的相机(即，每个孔的中心到中心有9个像素)。在一些实施方式中，处理图像可以利用灰度读取图像，从低到高对每个像素进行评级，其中没有细胞的孔会是最亮的(由于来自背光的完全或接近完全的光透射)，并且具有细胞的孔会是暗的(由于细胞阻挡来自背光的光透射)。在处理图像之后，进行阈值处理(thresholding)以确定哪些像素会被识别为(called)“亮”或“暗”，进行斑点寻找以找到亮像素并将它们排列成块，并且然后将斑点排列在对应于斑点的六边形像素网格上。在排列后，通过例如观察斑点中间的一个或更多个像素、在随机或预设位置观察若干个至许多像素、或者对斑点中的X个像素取平均值来提取每个孔的强度度量。此外，可以减去背景强度。阈值处理再次用于将每个孔识别为阳性(例如，含有细胞)或阴性(例如，孔中没有细胞)。成像信息可以以若干方式使用，包括在监测细胞生长的时间点拍摄图像。监测细胞生长可用于，例如，去除快速生长细胞的“松饼顶部(muffin tops)”，然后去除所有细胞或如上文描述地按“轮”去除细胞，或从特定孔(例如，缓慢生长的细胞集落)中回收细胞；可选地，可以鉴定包含快速生长细胞的孔，并且可以将覆盖快速生长细胞集落的UV区域投射(或用快门光栅化)到SWIIN上，以照射或抑制这些细胞的生长。成像也可用于确保蛇形通道660中的适当流体流动。
图6F描绘了图6A-图6E中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括热管理系统，该热管理系统包括加热器和加热盖。加热器盖促进成像所需的冷凝管理。组件698包括截面中纵向可见的SWIIN模块650，其中可以看到一个渗透物储库652。盖694紧邻SWIIN模块650上方设置，并且背光680紧邻SWIIN模块650下方设置，这允许成像。在背光和SWIIN模块的下方和邻近是绝缘体682，其设置在散热器684上。在该图6F中，散热器的散热片在页面的外面。此外，还有轴流风扇686和散热器688，以及两个热电冷却器692和控制气动器件、热电冷却器、风扇、电磁阀等的控制器690。箭头表示进入单元的冷空气和从单元移除的热空气。应注意，加热控制允许许多不同类型的细胞(原核和真核)以及例如对温度敏感的细胞株的生长，并且允许使用温度敏感的启动子。温度控制允许调整方案以解决转化效率、细胞生长和生存力的差异。关于固体壁分离孵育和标准化装置的更多细节，参见2019年4月30日提交的USSN 16/399,988；2019年6月26日提交的USSN 16/454,865；和2019年8月14日提交的USSN 16/540,606。关于替代的分离、培养和标准化模块，参见2019年8月8日提交的USSN16/536,049。
细胞选择模块
本文描述的脱落蛋白报告物系统提供荧光或生物发光细胞作为正确编辑的细胞的读出。经由荧光激活的细胞分选(FACS)可以将正确编辑的细胞与非编辑或不当编辑的(improperly-edited)细胞分选开。FACs是流式细胞术的衍生物，其增加了增强功能的程度。使用FACs，活细胞的异种混合物可以被分选为不同的群体。FACs是唯一可用的基于内部染色或细胞内蛋白表达来分离细胞的纯化技术，并允许基于大小、粒度和荧光来纯化单个细胞。悬浮液中的细胞以液滴中的流通过，并且每个液滴包含单个感兴趣的细胞。将液滴在激光前面通过。光学检测系统基于预定的光学参数(例如，荧光或生物发光参数)检测感兴趣的细胞。该仪器将电荷施加到包含感兴趣细胞的液滴，并且静电偏转系统有助于将带电荷的液滴收集到适当的管或孔中。分选参数可根据纯度和产率的要求进行调整。使用脱落蛋白报告物系统，正确编辑的细胞是生物发光的，并且不当编辑的细胞或未编辑的细胞不是生物发光的；因此，期望的细胞容易地与不需要的细胞分选开。
自动化多模块细胞处理仪器的使用
图7中示出了能够执行本文描述方法的自动化多模块细胞处理仪器的一种实施方案。细胞处理仪器700可以包括壳体、例如试剂筒中的细胞的储库，在那里细胞将被转化704。将细胞从储库转移到细胞生长和浓缩模块708。在本实施方案中，细胞生长和浓缩模块是单个模块，诸如TFF；然而，在其他实施方案中，细胞生长和浓缩模块可以是分开的，诸如，包括旋转生长模块的细胞生长模块和包括TFF的细胞浓缩装置。将待处理的细胞从例如试剂筒中的储库转移到细胞生长模块708进行培养直到细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，细胞生长模块可以冷却细胞以供后续处理，或者细胞可以直接进行到细胞浓缩，在那里执行缓冲液或培养基交换，使细胞成为感受态，并且细胞的体积减小到最适合于在转化模块710中细胞转化的体积。转化模块710可以是例如流通式电穿孔装置。
除了用于储存细胞的储库之外，试剂筒还可以包括用于储存包含编辑盒的编辑载体706的储库，和用于储存引擎载体702的储库，所述引擎载体702包含例如核酸酶的编码序列以及Cascade-C末端T7 RNAP融合构建体和dCas3-N末端T7 RNAP融合构建体的编码序列。如上文关于图1A描述的，Cascade-C末端T7 RNAP融合构建体和dCas3-N末端T7 RNAP融合构建体可以位于引擎载体(例如，包含核酸酶编码序列的载体)上，Cascade-C末端T7 RNAP融合构建体和dCas3-N末端T7 RNAP融合构建体二者可以在T7启动子的控制下与报告基因一起位于单个报告载体上，或者脱落蛋白系统的各种组分可以位于不同的报告载体、编辑载体和/或引擎载体上。编辑载体、引擎载体和报告载体(如果是分开的，未示出)然后被转移到转化模块710，以被电穿孔到细胞中。
在细胞已经被转化后，细胞可以被转移到编辑模块712，诸如如上描述的SWIIN模块，以进行编辑。此外，可以在转化模块和编辑模块之间的单独模块中执行选择，或者可以在编辑模块中执行选择。在这种情况下，选择是指选择已经用包含选择标记的载体正确转化的细胞，从而确保细胞已经接受用于核酸引导的核酸酶编辑和用于报告正确编辑的所有载体。选择后，提供用于编辑的条件。如果核酸引导的核酸酶编辑系统的任何组分在诱导型启动子的控制下，则提供激活诱导型启动子的条件用于编辑。当细胞进行编辑时，脱落蛋白报告物系统可以是活性的，其中已经被正确编辑的细胞发射光；可选地，融合构建体(例如，Cascade-C末端T7 RNAP融合构建体或dCas3-N末端T7 RNAP融合构建体)和/或鉴别编辑的gRNA中的一个或二者可以在诱导型启动子的控制下，并且脱落蛋白报告物系统直到细胞已经被编辑后才被激活。无论是在编辑期间还是编辑后，脱落蛋白报告物系统在有活性时都允许经由生物发光来鉴定已经正确编辑的细胞。在编辑之后，细胞被转移到选择模块714，在选择模块714中可以对细胞进行分选。
然后可以使其中脱落蛋白报告物系统是活性的并且已经与不发光的细胞分离的细胞(例如，发光细胞)生长并将其制备用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器716控制，该处理器716被配置成基于使用者输入、按由一个或更多个脚本指导或者按使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器716可以控制仪器700的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂从试剂筒的分配。处理器可以被编程为具有使用者可以从中选择的标准方案参数，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒关联的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用)细胞已经达到靶OD，已经成为感受态和被浓缩，和/或向使用者更新多模块仪器中的各个模块中的细胞的进程。
关于多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日颁发的USPN 10,253,316；2019年6月25日颁发的USPN 10,329,559；2019年6月18日颁发的USPN 10,323,242；2019年9月24日颁发的USPN 10,421,959；2019年11月5日颁发的USPN 10,465,185；以及2019年5月14日提交的USSN 16/412,195；2019年9月14日提交的USSN 16/571,091；和2019年10月29日提交的USSN 16/666,964，这些全部通过引用以其整体并入本文。
鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历关于图7描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑载体的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体B组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体C组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体D组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使双重编辑的细胞中的每一种的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将AB编辑的、AC编辑的、AD编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑载体(诸如编辑载体X、Y和Z)组合。即，双重编辑的细胞AB可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；并且双重编辑细胞AD可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ADX、ADY和ADZ，等等。在该过程中，可以执行编辑的许多排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。
在任何递归过程中，“处治(cure)”先前的引擎载体和编辑载体(或者单个载体系统中的单个引擎+编辑载体)都是有利的。“处治”是其中将在先前一轮编辑中使用的一个或更多个载体从转化的细胞消除的过程。处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一个或更多个载体从而使编辑载体和/或引擎载体(或单个载体、合二为一的引擎/编辑载体)无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的一个或更多个载体(即细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体或引擎载体(或合二为一的引擎载体+编辑载体)上的热敏感复制起点。用于处治的条件将取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑和/或引擎载体。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意在限制发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有的实验。本领域的技术人员应该明白，可以在对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。
实施例I：全自动化单重RGN指导的编辑运行
用本公开内容的自动化多模块仪器成功地进行了使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑。参见美国专利第9,982,279号；和2018年6月30日提交的USSN 16/024,831；2018年6月30日提交的USSN 16/024,816；2018年9月28日提交的USSN 16/147,353；2018年9月30日提交的USSN 16/147,865；以及2018年6月30日提交的USSN 16/147,871。
经由Gibson
Figure BDA0003701247340000541
将ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒组装成包括在自动化仪器中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。lacZ_F172功能性敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的第172个残基处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将组装的编辑载体和重组工程化就绪(recombineering-ready)的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，并且允许其在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且允许细胞恢复另外2小时。恢复后，将细胞保持在4℃，直至由使用者取回。
在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺板在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基础上，并且使其生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理装置进行。
自动化处理的结果是约1.0E03个总细胞被转化(与常规台式的结果相当)，并且编辑效率是83.5％。通过对细胞基因组的编辑的区域测序确认白色集落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察自动化细胞处理的步骤，并且发送文本消息来更新自动化处理程序的状态。
实施例II：全自动化递归编辑运行
使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。经由Gibson
Figure BDA0003701247340000551
将ampR质粒骨架和lacZ_V10*编辑盒组装成包括在自动化系统中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。与lacZ_F172编辑类似，lacZ_V10编辑功能性敲除lacZ基因。“lacZ_V10”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的氨基酸位置10处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许其在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且使细胞生长另外2小时。然后将细胞转移至离心模块中，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬在包含氯霉素和羧苄青霉素的TB中，使细胞在TB中生长至2.7的OD600，然后将其浓缩并且并使其成为电感受态。
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果成功，galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galK Y154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galK基因产物为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。使用与以上详述的相同参数，将组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体选择)转移到转化模块进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在其在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺板在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了定量lacZ和galK编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基础，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基础。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体处理装置进行。
在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacZ和galK编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。
实施例III：群体中具有特定基因型的细胞的分离
在自动化单重或递归编辑运行之后，产生包含对应于完整预期编辑、不完整编辑和未编辑或野生型细胞的多个特定基因型的细胞群体。为了鉴定和分离仅完整的预期编辑，利用修饰的I型CRISPR系统，其中脱落的T7 RNAP的两半(例如，脱落蛋白报告物系统的部分)分别融合到Cascade复合物和失活的cas3核酸酶。在经由在Cascade复合物与鉴别编辑的crRNA之间形成R-环来鉴别性识别完整的预期编辑后，失活的cas3融合蛋白被募集到R-环的位点并结合Cascade复合物。该结合事件使脱落的T7 RNAP的两半接近，形成活性的T7聚合酶。活性T7聚合酶然后转录报告物基因。
经由三质粒共表达系统，将与T7 C末端片段融合的褐色嗜热裂孢菌(T.fusca)XYCascade复合物于在LB培养基上生长的大肠杆菌BL21细胞中重组表达和纯化。第一个质粒含有褐色嗜热裂孢菌XY Cascade复合物的cse1蛋白，与融合在C末端上的T7 RNAP聚合酶的C末端片段(氨基酸181-883)，与含有氯霉素抗性的pTAC-MAT-Tag1(Sigma Aldrich)载体上的20aa柔性GlySer接头(参见图8A)。第二个质粒在具有氨苄青霉素抗性的pTAC-MAT-Tag1载体上，含有剩余的Cascade复合物基因cse2-cas7-NLS-cas5e-cas6e，其具有cse2上的N23A突变以促进在37℃形成R-环，以及在cas7基因的C末端的SV40 NLS信号以制备pTAC-cse2-cas7-NLS-cas5e-cas6e(参见图8B)。第三个质粒含有从合成的CRISPR阵列表达的cRNA，以制备pTAC-crRNA-GFP(图8C)。将含有所有三个质粒的大肠杆菌BL21细胞培养到0.6的OD，并且通过添加IPTG至0.5mM的浓度来诱导表达，之后使细胞生长过夜。然后收获细胞，用溶菌酶裂解，并且用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)根据制造商的方案纯化具有融合的T7-C末端RNAP的Cascade复合物。
另外，重组表达并纯化了失活的褐色嗜热裂孢菌XY cas3。将具有T7 RNAP的N末端融合物(氨基酸1-179)、然后是14aa柔性GlySer接头和C末端SV40 NLS和6xHis标签的褐色嗜热裂孢菌XY cas3 D84A D481A克隆到pTAC-MAT-Tag1(Sigma Aldrich)中，以制备pTAC-T7-Nterm-cas3-NLS-His(图8D)。使含有该质粒的大肠杆菌BL21细胞生长至0.6的OD，并且通过添加IPTG至1mM的浓度来诱导表达，之后在18℃将细胞培养过夜。然后裂解细胞，并且用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化失活的cas3-T7-N末端融合物。
用Neon转染系统(ThermFisher)对先前编辑的HEK293T-GFP细胞的池进行电穿孔。将编辑的细胞进行胰蛋白酶处理，用1X DPBS(ThermoFisher)洗涤，并在Neon缓冲液R中重悬。在缓冲液R中将80pmol Cascade-T7-C末端、20pmol cas3-T7-N末端和5pmol由T7启动子驱动的F30-2xdBroccoli(pJin141)与约1.0E05个细胞混合。用10μL Neon尖将混合物电穿孔(1100V，20ms，2脉冲)，并在24孔板中铺板。72小时后，在BD FACSMelodyTM细胞分选仪上基于最高荧光对细胞进行分选，只回收包含由Cascade crRNA编程的完整预期编辑的细胞。
虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的优选的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,
Figure BDA0003701247340000581
的手段加功能的限定。

Claims (20)

1.一种核酸引导的核酸酶编辑系统，包括：
载体骨架中的Cascade-T7-RNAP融合蛋白编码序列；
载体骨架中的dCas3-T7-RNAP融合蛋白编码序列；
载体骨架中的用于gRNA的序列，其中所述gRNA识别基因组序列中合理设计的编辑的基因座，但不识别未编辑或未正确编辑条件下的基因组序列中的基因座；和
在T7启动子控制下的报告基因的编码序列。
2.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述Cascade-T7-RNAP融合蛋白编码序列包括T7 RNAP的C末端。
3.根据权利要求2所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7 RNAP的C末端包含T7 RNAP的氨基酸残基181-883。
4.根据权利要求2所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7-RNAP的C末端与Cas5或cse1/casA的C末端融合。
5.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列包括T7 RNAP的N末端。
6.根据权利要求5所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7 RNAP的N末端包含T7 RNAP的氨基酸残基1-179。
7.根据权利要求5所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7 RNAP的N末端与dCas3的N末端融合。
8.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述报告基因是荧光蛋白的编码序列。
9.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述报告基因是抗生素抗性基因的编码序列。
10.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，所述报告基因是细胞表面标志物蛋白的编码序列。
11.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述报告基因是萤光素酶的编码序列。
12.根据权利要求11所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶。
13.根据权利要求11所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述萤光素酶是海肾萤光素酶。
14.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述Cascade-T7 RNAP融合蛋白编码序列、所述dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列、所述用于gRNA的序列和在T7启动子控制下的报告基因的编码序列全部在同一载体上。
15.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述Cascade-T7 RNAP融合蛋白编码序列、所述dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列、所述用于gRNA的序列和在T7启动子控制下的报告基因的编码序列在两个或更多个不同的载体上。
16.一种细胞，所述细胞包含权利要求1所述的载体骨架。
17.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述Cascade-T7-RNAP融合蛋白编码序列包括T7 RNAP的N末端。
18.根据权利要求17所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7-RNAP的N末端与Cas5或cse1/casA的N末端融合。
19.根据权利要求1所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述dCas3-T7 RNAP融合蛋白编码序列包括T7 RNAP的C末端。
20.根据权利要求19所述的核酸引导的核酸酶编辑系统，其中所述T7 RNAP的C末端与dCas3的C末端融合。
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