JP2019522481A - 自己切断リボザイムを利用したrnaのウイルス送達およびそのcrisprベースの適用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年6月22日に出願された米国仮特許出願第62/353,452号の優先権を主張するものであり、その開示の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)によって授与された助成金第R21 AI115226号の下で政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明の分野は、一般に、自己切断リボザイムを利用したRNAのウイルス送達ならびにそのCRISPRベースの適用に関する。
遺伝子治療は、基礎的な疾患または症状を治療するために、核酸ポリマー(例えば、RNAまたはDNA)を細胞内に送達することと広く関係している。過去数年間にわたって多くの注目を集めているそのような遺伝子治療の1つは、CRISPR/Cas9である。CRISPR/Cas9技術は、宿主ゲノムへの点レベルの突然変異の導入を可能にすることによって、例えば、宿主ゲノムの所望の位置での切断を可能にし、次いで遺伝子の除去または付加を可能にすることによって、ゲノミクスおよび現代医学に革命を起こすことを約束するものである。CRISPR/Cas9システムは、一般に、切断のためにゲノムの適切な個所にガイドRNA(「gRNA」)によって誘導される特定のヌクレアーゼ、典型的にはCas9、の細胞内への送達に依存している。CRISPR/Cas9を送達するための公知のウイルスベクター系、例えばレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)は、エクスビボおよびインビボの両方で細胞をうまく改変してきた;しかしながら、これらのウイルスのDNAベースの複製は、宿主ゲノムへの望まれない組み込みのリスクと、それゆえに遺伝毒性または発癌のリスクを伴っている。この問題および組み込み欠損型レンチウイルスの使用などの技術革新に多くの注意が払われているにもかかわらず、望ましくない組み込みは、依然として注意深く監視されるリスクをはらんでおり、今後の遺伝子治療試験の成功に影響を与える可能性がある。これらの欠点は、断じてCRISPR/Cas9に固有のものではない。したがって、CRISPRベースの技術の送達を含めて、改善されたウイルスベクター送達システムに対する差し迫ったニーズがある。
本開示は、宿主細胞に送達される標的RNAに隣接する、RNAウイルスゲノムに挿入された自己切断リボザイムを利用したRNAのウイルス送達、ならびに特にCRISPRベースの技術におけるその使用に関する。したがって、いくつかの実施態様では、本開示は核酸に関する。いくつかの実施態様では、該核酸は一本鎖RNA(ssRNA)ウイルスのゲノム配列を含む。いくつかの実施態様では、該ゲノム配列はアンチセンスRNAを含む。いくつかの実施態様では、該核酸はアンチゲノム配列を含む。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列はゲノム配列に相補的である。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列はセンスRNAを含む。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列は第1の領域を含む。いくつかの実施態様では、該ゲノム配列は第1の領域を含む。いくつかの実施態様では、第1の領域は、(i)標的セグメント、および(ii)第1の自己切断リボザイムを含む第1のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、第1の領域は、(iii)第2の自己切断リボザイムをコードする第2のセグメントをさらに含む。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントに隣接する。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第2のセグメントのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第2のセグメントのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは自己切断リボザイムのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは自己切断リボザイムのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントと第2のセグメントとに隣接している。いくつかの実施態様では、第1の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第1の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第2の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第2の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムとに隣接している。いくつかの実施態様では、第1の領域はRNA発現カセットを含む。
本開示の一実施態様は、RNA発現カセットを含むがこれに限定されない、新規核酸に関する。該核酸は一般に、ssRNAウイルス、例えばセンダイウイルス(SeV)、の遺伝的に改変されたゲノムまたは該ゲノムに相補的なアンチゲノムに関連する。パラミクソウイルスおよびSeVを含むがこれらに限定されない、モノネガウイルス目のゲノムはアンチセンスRNAである(すなわち、マイナス極性を有する)。したがって、本明細書が一本鎖RNA(ssRNA)ウイルスのゲノム配列を含む核酸に言及する場合、そのゲノム配列はアンチセンスRNAであると理解される。それゆえに、アンチゲノム配列はセンスRNAである。したがって、例えばセンダイウイルスの、マイナス極性ゲノムから転写されたRNAアンチゲノムはセンスRNAを含むであろう。ssRNAウイルスのゲノムから転写されたmRNAは、翻訳され得るセンスRNAを同様に含むであろう;あるいは、mRNAが1つ以上の自己切断リボザイムに隣接する(例えば、自己切断リボザイムと自己切断リボザイムにはさまれた)標的配列を含む場合には、その自己切断リボザイムは標的配列を遊離させることができるであろう。本開示のアンチゲノムは、マイナス極性ゲノムから転写された生物学的に活性なmRNAと同様に、5'から3'方向に配向するので、本開示の核酸の要素は、典型的には、それらのアンチゲノム成分により言及される。しかしながら、本明細書に記載の発明はアンチゲノム成分だけに明示的に限定されない。というのは、例えば(後述される)本開示のウイルス粒子内に含まれるような、ゲノム成分は、インビトロもしくはインビボでアンチゲノムもしくはそのアンチゲノム要素に転写され得るか、または生物学的に活性な役割を果たすmRNA断片に転写され得る新規核酸を表すからである。
実施例1:センダイウイルスは遺伝子編集用のCRISPR/Cas9を送達する
A. 材料および方法
細胞株
Flp-In T-REx HEK293細胞(Invitrogen社)、Vero細胞(ATCC CCL-81)、BSR-T7細胞(T7ポリメラーゼを安定発現するBHKベースの細胞株)、およびAffinofile細胞(CD4およびCCR5の誘導性過剰発現を示すHEK293ベースの細胞株)は、10%ウシ胎児血清(FBS)(Atlanta Biologicals社)およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen社)中で37℃にて増殖させた。Flp-In T-REx HEK293細胞はメーカーのプロトコルに従ってブラストサイジンとゼオシンの存在下でさらに維持し、BSR-T7細胞はT7導入遺伝子を維持するために1mg/mLのG418中でさらに維持し、Affinofile細胞は50μg/mLのブラストサイジン中でさらに維持した。mCherry誘導性細胞を作成するために、mCherry遺伝子をpcDNA5/FRT/TOに挿入して、親Flp-In T-REx HEK293細胞にpOG44(Flpリコンビナーゼ)と一緒に同時トランスフェクトした。メーカーのプロトコルに従ってハイグロマイシン(ゼオシンを置換)とブラストサイジンで選択すると、mCherryのドキシサイクリン誘導性発現を示す安定な細胞株が得られた。
rSeV-Cas9の基礎は、NからPの遺伝子間領域の複製を介してNとPの遺伝子間にEGFPレポーターが挿入されている組み換えセンダイウイルスであり、トリプシン非依存性増殖を可能にするFおよびM遺伝子に突然変異を有するFushimi株SeV、RGV0に由来した。T7駆動アンチゲノムをコードするプラスミドに対する全ての改変は、Velocity DNAポリメラーゼ(Bioline社)による標準的PCRおよびオーバーラッピングPCRを用いて行い、続いてIn-Fusionライゲーション非依存性クローニング(Clontech社)によりユニーク制限部位で構築物に挿入した。全てのクローニングは、Stbl2大腸菌(Invitrogen社)を用いて30℃で増殖させて行った。FLAGタグ付きのコドン最適化した化膿レンサ球菌(S. pyogenes)Cas9をpx330(Addgene社, カタログ番号42230)から増幅し、P2Aリボソームスキッピング配列
と連結して、EGFPレポーターの直下でrSeVに挿入した。P2A配列の前にGSGリンカーを配置して、完全なリボソームスキッピングを確実にした。さらなる2個のヌクレオチドをCas9の終止コドンの後に追加し、パラミクソウイルスのゲノム長は効率的な複製を確実にするために正確に6の倍数でなければならないというルール・オブ・シックス(rule of six)を維持した。Cas9は、将来の改変に役立つように、ユニークなNotIおよびFseI制限部位間にはさまれている。ガイドRNAおよびリボザイムのカセットを作成するために、mCherryを標的とする20bp配列をpx330(上記)にクローニングし、次いで完全キメラガイドRNAカセット(SEQ ID NO: 1、下記の表1参照)をPCR増幅した。ハンマーヘッド型リボザイムを後続のPCRにおいて合成プライマー中のオーバーハングを介して組み込んだ。このカセットをPからMの遺伝子間領域の複製を介してPとMの遺伝子間に挿入した;ガイドRNA標的配列の変更を含む将来の改変に役立つように、ユニークなAsiSIおよびSnaBI制限部位が該カセットの両端に隣接している。ガイドRNA標的配列は、MITを通じてオンラインで入手可能なCRISPRデザインツールを用いて予測された高い特異性に基づいて選択された。
qRT-PCRプライマーを、リボザイム1(産物A)、リボザイム2(産物B)、および下流のM遺伝子内部(産物C、全RNAに相当)の両端に隣接するように設計した(図7参照)。rSeV-Cas9-mCherry T7駆動アンチゲノムプラスミドをT7発現性のBSR-T7細胞にトランスフェクトし、2時間後TRIzol(Invitrogen社)中に回収した。サンプルを1mM MgCl2でDNase(Invitrogen社)により処理し、EDTAで処理して、SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen社)を用いて1mM MgCl2で逆転写した。SensiFAST SYBR & Fluoresceinキット(Bioline社)を用いてqRT-PCRを実施し、テンプレートとしてrSeV-Cas9-mCherryアンチゲノムプラスミドを用いて標準曲線によりコピー数を決定した。リボザイム1の切断パーセントを100*((C-A)/C)として求めて、両方のリボザイムを変異させた構築物に対して正規化し、また、リボザイム2の切断パーセントを100*((C-B)/C)として求めて、リボザイム2を変異させた構築物に対して正規化した。
6ウェル中のBSR-T7細胞を、リポフェクタミンLTX(Invitrogen社)をメーカーの推奨に従って用いて、4μgのT7駆動アンチゲノム、1.44μgのT7-N、0.77μgのT7-P、0.07μgのT7-L、および4μgのコドン最適化T7ポリメラーゼでトランスフェクトした。ウイルスのレスキューをEGFP蛍光の出現および広がりによってモニターし、レスキューされたウイルスをBSR-T7細胞でさらに増やした。清澄化したウイルスのストックを-80℃で保存した。ウイルス力価をVero細胞でのタイトレーションによって決定し、個々の感染事象をAcumenプレートリーダー(TTP Labtech社)で感染24時間後にEGFP蛍光により検出して、計数した。
CCR5の染色のために、細胞を採取して、2%FBSを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でブロックした。Alexa 647結合ラット抗ヒトCCR5(BioLegend社, カタログ番号313712)を1:100で4℃にて30分間添加した後、洗浄し、2%パラホルムアルデヒド(PFA)中に再懸濁した。p24の染色(RD1結合マウス抗p24クローンKC57, Beckman Coulter社, カタログ番号6604667, 1:100希釈)のために、細胞をCytofix/Cytopermキット(BD Biosciences社)を用いて固定および透過処理し、その後ブロックした。フローサイトメトリーは、マウント・サイナイ・アイカーン医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)のフローサイトメトリーコア(Flow Cytometry Core)においてBD LSR IIで実施した。
PureLink Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen社)を用いてゲノムDNAを抽出した。Velocity DNAポリメラーゼ(Bioline社)および以下の表2に示されるプライマーを用いて、特定のゲノム座位を増幅した。オフターゲット座位は、CRISPRデザインツールで予測された上位のオフターゲット部位を表す。個々のアレルのサンガー配列決定のために、プライマーは、In-Fusionライゲーション非依存性クローニング(Clontech社)を介してpcDNA3のHindIII部位とXhoI部位の間に挿入するための適切なオーバーハングを含んでいた。PCR産物をゲル抽出し(NucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット, Clontech社)、Stellarコンピテント大腸菌(Clontech社)に形質転換して、アンピシリンLB寒天上で選択した。個々のコロニーを調製して、配列決定した。ディープシーケンシングのために、ゲル抽出した産物をプールし、Genewiz社によるペアエンド(paired-end)2×300bp MiSeq(Illumina社)シーケンシングを介した塩基配列決定のために、さらに調製した。ユニークな配列を、マージ(merge)した配列決定リードから同定して定量した。オンターゲットおよびオフターゲットのそれぞれのアンプリコン参照配列のために、20bpガイドRNA標的配列からちょうど35bpを越えた上流および下流で18bp配列を選択した。これらの18bp配列の両方と完全に一致するユニーク配列を抽出して照合したところ、アンプリコンあたり平均170,432リードが得られた。各アンプリコンについて、参照配列とは異なる長さの配列を、挿入または欠失(インデル)を有するものとして同定した。
Cas9と自己切断リボザイムが隣接したガイドRNAとを組み込んでいるセンダイウイルスは高力価に複製する
パラミクソウイルスは一本鎖のマイナスセンスRNAゲノムをもつ。複製中に、ウイルス複製複合体(核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、およびラージRNA依存性RNAポリメラーゼ(L))は、完全長アンチゲノム(ゲノムの逆相補体)および個々のキャップおよびポリアデニル化されたmRNAの両方を産生するためのテンプレートとして、ゲノムを使用する(図1A)。アンチゲノムはさらにゲノムに転写され、したがって複製のためのゲノムが増幅される。mRNA産生中は、隣接する遺伝子間領域内の遺伝子開始および遺伝子終止シグナルがmRNA転写産物の両末端を決定する。この原理証明(proof-of-principle)実験のために、NからPの遺伝子間領域の複製を介してN遺伝子とP遺伝子の間にEGFPが挿入されている組み換えSeV(rSeV)を利用した。化膿レンサ球菌Cas9を、P2Aリボソームスキッピング配列を介してEGFPレポーターの下流に挿入した(図1A)。キメラガイドRNA(20bpの標的配列および76bpのトランス活性化型CRISPR RNA)を、PからMの遺伝子間領域の複製を介してP遺伝子とM遺伝子の間に新しいカセットとして挿入した(図1A)。ガイドRNAに正確な末端を提供するために、ガイドRNAには自己切断5'リボザイムと自己切断3'リボザイム、例えばハンマーヘッド型リボザイム、が隣接していた(図1Aおよび1B)。例示的な自己切断5'リボザイムおよび自己切断3'リボザイムの配列は、それらの立体的配向で図1Bに示され、かつ5'から3'の方向で以下のように示される:
最初のrSeV-Cas9は、mCherry遺伝子に特異的なガイドRNAを組み込んでいた(rSeV-Cas9-mCherry)。HEK293ベースのレポーター細胞株をmCherry誘導可能に作成し、この細胞株に、rSeV-Cas9-mCherry、またはCas9を発現するがガイドRNAカセットを欠く対照ウイルス(rSeV-Cas9-対照)のいずれかを感染多重度(MOI)25で感染させた。感染後様々な日数でmCherry発現を誘導すると、経時的なノックアウトの進行が示され、ノックアウトは感染後4日目からより顕著に現れた(図2Aおよび図5)。この時点(4日目の誘導および5日目のフローサイトメトリーのための回収)の定量化は、mCherry蛍光の約80%のノックアウトを示した(図2A)。蛍光顕微鏡により、ノックアウト時のmCherry蛍光の大幅な減少が視覚的に確認された(図2B)。
レポーター細胞株におけるmCherryの単一のアレルとは対照的に、ほとんどの内因性遺伝子のアレルは、細胞あたり2つ以上存在する。より豊富に存在する内因性アレルを標的とするセンダイウイルスベクターの能力を試験するために、ヒトccr5およびefnb2遺伝子のコードエクソンを標的とするrSeV-Cas9ウイルスを作成した。ccr5の機能的破壊をもたらす変異誘発を誘導するrSeV-Cas9-CCR5の能力の予備試験を実施した。HEK293細胞は無視できるレベルのCCR5を発現するのでHEK293細胞を利用したが、それらは、誘導性CD4およびCCR5導入遺伝子を、それらの内因性アレルに加えて含んでいる。CD4およびCCR5は、R5指向性HIV-1による感染に必要な細胞表面受容体であり、CCR5媒介HIV侵入を特徴付けるためにAffinofile細胞が広く使用されている。Affinofile細胞にrSeV-Cas9-CCR5を感染させ、感染後2日目にCD4/CCR5の過剰発現を誘導し、翌日、該細胞にR5指向性HIV-1分離株をさらに感染させた(図3A)。この早い時点で、rSeV-Cas9-CCR5を感染させた細胞は、誘導性ccr5導入遺伝子および内因性ccr5アレルの進行中の変異誘発のために、rSeV-Cas9-対照を感染させた細胞と比較して、より低レベルのCCR5を有すると予想された。さらに2日後、フローサイトメトリーは誘導されたCCR5の効率的なノックアウトを明らかにし、また、より早い時点でのHIV-1感染を示すp24染色は、rSeV-Cas9-対照感染と比較して、幾何平均蛍光強度の43%の減少を示した(図3A)。
通常はレンチウイルス形質導入に抵抗性である初代ヒトCD14+単球にrSev-Cas9をMOI 50で感染させた。変異誘発時のCCR5発現の減少をよりよく視覚化するために、単球をGM-CSFで刺激して、マクロファージへの分化をCCR5の同時アップレギュレーションと共に誘導した。細胞を感染後5日で回収した;ディープシーケンシングは88%のオンターゲット変異誘発を明らかにした(図4A)。驚くべきことに、切断部位に隣接する2つの単一ヌクレオチド欠失は、合わせると、検出された全てのインデルの78%を占めていた(図4Aおよび図6);対照的に、HEK293細胞では、同じ欠失が、合わせて、検出されたインデルの9%を占め、単一変異が全体の10%超を占めることはなかった(図3Bおよび図6)。独立したドナーからの単球の感染は同様の結果を示し、上記の欠失は変異アレルの約50%(19/38変異、サンガー配列決定による)を占めた;これは細胞型特異的現象を表し得ることを示している。単一の特定の変異がインデル全体のそのような大きな割合を占める場合、ミスマッチに基づくアッセイ、例えば、変異を検出するために高度に可変的な変異誘発に依存するT7E1エンドヌクレアーゼアッセイは、オンターゲット変異誘発の程度を強く過小評価する可能性がある。HEK293細胞と同様に、単球における予測されたオフターゲット座位の検出された変異誘発は無視できるほどであった(図4A)。独立したドナーからの感染した単球のフローサイトメトリーは、同じ時点で細胞表面CCR5のノックアウトを確認した(図4B)。
上記の実施例1に記載したrSeV-Cas9ベクターの温度感受性(ts)変異体を作成した。この変異体は、組み換えセンダイウイルスベクターのP遺伝子(D433A、R434A、K437A)およびL遺伝子(L1558I、N1197S、K1795E)にいくつかの変異を導入することによって作成され、本明細書では「PL変異体」と呼ばれる。PL変異体は許容温度、例えば34℃以下または約34℃の温度で効率的に編集するが、非許容温度、例えば37℃以上の温度、にシフトすると排除される。センダイウイルスのPL変異体は以前に文献で報告されているが、CRISPR-Cas遺伝子編集のためではなかった。PL変異体の作成は、例えば、Ban H. et al. PNAS 2011 Aug 23; 108(34): 14234-14239に見出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。Ban H. et al.において作成されたPL変異体はセンダイウイルスのZ株であったが、用いられる目下のrSeV-Cas9ベクターはFushimi F1R株であった。rSeV-Cas9ベクター(PL変異体)におけるBan H. et al.出典のts変異の概略図を図8Aおよび図9Aに示す。PL変異体の温度感受性表現型を図8Bに示す。
実施例1に記載のrSeV-Cas9ベクターのさらなる欠失変異体を作成したが、それは融合タンパク質を欠いていた(すなわちΔF変異体)。これらはF補完細胞株でのみ増殖することができる。実施例2の温度感受性PL変異体がΔF変異体となるように作成される。2つのgRNAを送達することができるrSeV-Cas9ベクターが作成され、そのベクターを図12に示す。
Claims (41)
- 一本鎖RNA(ssRNA)ウイルスのゲノム配列または該ゲノム配列に相補的なアンチゲノム配列を含む、核酸であって、
該アンチゲノム配列が、
(i)標的セグメント、および
(ii)第1の自己切断リボザイムをコードする第1のセグメント
を含む第1の領域を含み、
該標的セグメントが第1のセグメントに隣接している、前記核酸。 - 前記第1の領域が、(iii)第2の自己切断リボザイムをコードする第2のセグメントをさらに含み、前記標的セグメントが、第1のセグメントと第2のセグメントとに隣接している、請求項1に記載の核酸。
- 前記ゲノム配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記アンチゲノム配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記第1の自己切断リボザイムが3'自己切断リボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の自己切断リボザイムが5'自己切断リボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記アンチゲノム配列が、ヌクレアーゼをコードする第3のセグメントを含む第2の領域をさらに含む、請求項6に記載の核酸。
- 前記第2の領域が、レポーター分子をコードする第4のセグメントをさらに含む、請求項6または7に記載の核酸。
- 前記標的セグメントがガイドRNA(gRNA)を含み、該gRNAが足場配列およびターゲティング配列を有する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ヌクレアーゼがCas9を含む、請求項6〜9のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ヌクレアーゼがCpf1を含む、請求項6〜9のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の自己切断リボザイムがハンマーヘッド型リボザイムを含む、請求項6〜11のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の自己切断リボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルス(HDV)リボザイムの一方を含む、請求項5に記載の核酸。
- 第5のセグメントを含む第3の領域をさらに含み、該第5のセグメントが変異型P遺伝子を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸。
- 第6のセグメントを含む第4の領域を含む第4の領域をさらに含み、該第6のセグメントが変異型L遺伝子を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルス粒子。
- 請求項6〜13のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルス粒子。
- 請求項14または15に記載の核酸を含むウイルス粒子。
- モノネガウイルス目(order mononegavirales)に含まれる、請求項16または17に記載のウイルス粒子。
- パラミクソウイルス科(family paramyxoviridae)に含まれる、請求項16〜18のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
- センダイウイルス(SeV)である、請求項16〜19のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
- ニューカッスル病ウイルス(NDV)である、請求項16〜19のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
- 温度感受性変異体である、請求項18に記載のウイルス粒子。
- 宿主におけるインターフェロン(IFN)産生を刺激しない、請求項23に記載のウイルス粒子。
- 以下の段階を含む、標的RNAを宿主細胞に導入する方法:
(i)請求項16〜24のいずれか一項に記載のウイルス粒子を宿主細胞と接触させる段階;ならびに
(ii)(a)標的RNAの産生、および
(b)転写された第1の領域から第1の自己切断リボザイムが標的RNAを遊離させる、標的RNAの遊離
を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階。 - 前記宿主細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、および真核細胞からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記宿主細胞が幹細胞である、請求項26に記載の方法。
- 以下の段階を含む、宿主細胞中の標的DNAに部位特異的改変を導入する方法:
(i)請求項16〜24のいずれか一項に記載のウイルス粒子を宿主細胞と接触させる段階;
(ii)(a)5'自己切断リボザイムに隣接しているgRNAおよびヌクレアーゼの産生、
(b)5'自己切断リボザイムがgRNAを遊離させる、gRNAの遊離、
(c)ヌクレアーゼの発現、
(d)gRNAの足場配列がヌクレアーゼに結合する、ヌクレアーゼとgRNAの複合体の形成、および
(e)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する標的DNA上の配列にgRNAのターゲティング配列が結合する、標的DNAと複合体との接触
を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階;ならびに
(iii)標的DNAに部位特異的改変を導入する段階。 - 部位特異的改変が、挿入、欠失、フレームシフト、および点変異のうちの1つである、請求項28に記載の方法。
- 前記DNAがゲノムである、請求項28または29に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、および真核細胞からなる群より選択される、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸をコードするDNAを含むベクター。
- プラスミドである、請求項32に記載のベクター。
- 請求項32または33に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 幹細胞である、請求項34に記載の細胞。
- 細菌細胞である、請求項34に記載の細胞。
- 大腸菌(E. coli)である、請求項34または36に記載の細胞。
- 請求項26または27に記載のベクターを含むキット。
- 薬学的に許容される防腐剤をさらに含む、請求項38に記載のキット。
- ゲノム配列または該ゲノム配列に相補的なアンチゲノム配列をコードするDNAを発現させるための試薬をさらに含む、請求項38または39に記載のキット。
- 前記試薬がT7 RNAポリメラーゼを含む、請求項40に記載のキット。
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