JP2021524272A - ガイドｒｎａ分子および／またはガイドｒｎａ分子／ｒｎａ誘導型ヌクレアーゼ複合体の無痕跡送達のための小胞およびその産生方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｇＲＮＡ（複数可）を保有する小胞および／または融合性エンベロープタンパク質により標的細胞に効率的に送達されるＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）について記載する。本発明は、ｇＲＮＡまたはヌクレアーゼと複合体形成したｇＲＮＡがロードされた小胞、および前記小胞の産生方法を開示する。細胞質転写系を使用してｇＲＮＡを細胞質に蓄積させて、小胞へのｇＲＮＡの非常に効率的な組み込みを達成する。このような細胞質転写系は、許容細胞においてのみ作動され得る。

Description

発明の分野
本発明は、標的細胞への直接的なガイドＲＮＡ分子および／またはガイドＲＮＡ分子／ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体送達のための操作された小胞およびその産生方法に関する。

標的細胞へのガイドＲＮＡ（複数可）（ｇＲＮＡ）および／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（複数可）（ＲＮＰ（複数可））の直接送達は、バイオテクノロジー、細胞研究、診断および治療においていくつかの用途を有し得る。このプロセスは、細胞毒性を最小に減少させながら、化学的または物理的方法による細胞質および／または核への所望のｇＲＮＡおよび／またはＲＮＰ分子の導入からなる。現在の方法としては、脂質ベースの試薬、ポリマーベースの試薬またはタンパク質ベースの試薬によるトランスフェクション；エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；細胞透過性ペプチドへの融合；ウイルス様粒子（ＶＬＰ）による導入が挙げられる。研究実践では、これらすべての方法が普及しているが、それらの有効性および毒性プロファイルは、実験において使用される細胞株モデルにより変動する。また、低いカーゴ輸送効率により、これらの技術の大部分は、動物モデルにおけるＲＮＡもしくはＲＮＰのインビボ送達または治療目的に適切ではない。例えば、エレクトロポレーションは高レベルの細胞毒性を引き起こすことが公知であり、送達されるＲＮＰまたはＲＮＡの量の正確な制御を欠く一方、ＶＬＰ媒介性送達は、パッケージングに使用されるウイルスタンパク質の存在により、送達ビヒクルに対する免疫反応の増強に関連し得る。

同じように、細胞への直接送達に使用すべきかなりの量の組換えタンパク質の入手は困難であり得る。組換えタンパク質産生の間に遭遇する問題のいくつかの例は、調製物の収量、組換えタンパク質の溶解性、翻訳後修飾の忠実な再現、元の分子のフォールディングの忠実な再現であり得る。

細胞へのｇＲＮＡおよびＲＮＰの送達に対する別の主な障害は、ＲＮＡ発現のための標準的な方法が適切ではないか、または細胞質由来小胞への特定のタイプの転写産物の組み込みにおいて不十分な効率を示すという事実により表される。また、いくつかのＲＮＡ転写後修飾は、送達すべきｇＲＮＡに対して有害または必要であり得る。結果として、このような小胞にこれらのタイプの転写産物を含有するＲＮＰをパッケージングする場合に、同じ問題が存在する。特に、５’キャップ、３’−ポリ−Ａテールを有しないＲＮＡ、またはスプライシングされていないかもしくはＲＮＡ干渉ｍｉＲＮＡプロセシング機構によりプロセシングされないＲＮＡであって、核内で転写されるＲＮＡは、細胞質に効率的に到達しない。バイオテクノロジー用途に一般に使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなど）から得られた転写産物は、このカテゴリーに該当するので、細胞質由来小胞へのパッケージングが不十分である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写産物は、一般に、翻訳のために細胞質に搬出されるが、核から搬出される前に５’キャッピング、イントロンスプライシング、塩基編集および３’ポリＡテーリングにより修飾され、しかし、このような修飾はいくつかの用途にとって望ましくない場合があり、これらのＲＮＡは、細胞質ゾルの小区画（例えば、ＲＮＡ体）または細胞翻訳機構（例えば、リボソーム）中に頻繁に捕捉される。

細胞質への脱キャップ化および非ポリアデニル化転写産物の発現は、所望の細胞の細胞質において異所性ＲＮＡポリメラーゼを発現させることにより得られ得る。対応するプロモーターを標的転写産物の上流に追加する必要があるが、適切なターミネーター配列の存在により、または線状ＤＮＡテンプレートのランオフ転写により、転写の終了を達成し得る。転写されたＲＮＡは、多くの場合、リボザイム（例えば、ＨＤＶおよびＨＨリボザイム）の存在により、転写産物の一部（例えば、ターミネーター配列）を除去するように自己プロセシングされる。このようなポリメラーゼの例は、Ｔ７プロモーターと組み合わせた、Ｔ７バクテリオファージから得られるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

通常、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写は、標的細胞への直接送達前にまたはインビトロアッセイでＲＮＰ形成のためにタンパク質と頻繁に組み合わされるＲＮＡのインビトロ無細胞転写に使用されている。

細胞へのＲＮＰの直接送達を利用する異なる用途の中で、特に興味深いものは、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓと一般に称されるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３）は、それらの天然形態で、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成する１つまたはそれを超えるＲＮＡ分子を使用して、それらの標的核酸を認識するヌクレアーゼのファミリー（最も有名なものは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９である）である。ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ技術は、基本的および臨床的な用途の両方について大きな潜在性を有する（Ｃｏｎｇら、２０１３；Ｃａｓｉｎｉら、２０１８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により媒介されるゲノム編集の結果は、標的細胞におけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ送達の効率およびその特異性（オフターゲット活性の程度）に大きく依存する。Ｃａｓ９非特異的切断は、レシピエント細胞における高いタンパク質レベルおよび長期発現と相関するので（Ｔｓａｉ＆Ｊｏｕｎｇ ２０１６；Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）、送達戦略は、Ｃａｓ９ゲノム編集の効率および特異性の両方にとって非常に重要である。一貫して、標的細胞におけるＲＮＰの一過性性質は、オフターゲット部位における非特異的切断を減少させるので、ゲノム編集は、好ましくは、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の送達により実施される（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａら、２０１４；Ｚｕｒｉｓら、２０１５；Ｓ．Ｋｉｍら、２０１４）。これらの方法とは反対に、レトロウイルス起源のものを含むウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方でヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ遺伝子の効率的な送達に広く使用されている（Ｌｏｎｇら、２０１６；Ｙａｎｇら、２０１６；Ｄｉａｏら、２０１６）。それにもかかわらず、長期導入遺伝子発現および挿入変異誘発の潜在的リスクにより、これらの送達ツールは、一般に、一過性治療アプローチにとって理想的ではない（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７；Ｃｈｉｃｋら、２０１２）。非組込みウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のものは遺伝子送達に効率的であり、原則として、変異原性組込みを防止するはずである（Ｎａｋａｉら、２００１；Ｌｏｍｂａｒｄｏら、２００７；Ｚａｃｃｈｉｇｎａら、２０１４；Ｒｕｏｚｉら、２０１５）。しかしながら、これらのベクターは（約４ｋｂを超えない）小さな導入遺伝子の長期発現のためにより適切であるので、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼ技術、特に最も使用されているＳｐＣａｓ９およびＡｓＣｐｆ１ヌクレアーゼと完全には適合しない。ウイルス送達効率を保ちながら、レトロウイルスベクターにより生成される遺伝毒性を回避するために、ＳｐＣａｓ９タンパク質がパッケージングされたｇＲＮＡ発現カセットを保有する非組込みレンチウイルス（ＩＤＬＶ）ベクターが開発された（Ｃｈｏｉら、２０１６）。細胞への外因性タンパク質カーゴの完全な無痕跡送達（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に対する主な改善は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発により潜在的に提供される（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１０）。ウイルス起源のＶＬＰは、粒子がウイルスゲノムＤＮＡを保有しない場合であっても、標的細胞の効率的な形質導入を保証するので、シャトルタンパク質およびＲＮＡの迅速なクリアランスを可能にする。過去１０年間に、ＶＬＰは、ワクチン接種目的のために（Ｒａｍｑｖｉｓｔら、２００７）または外因性タンパク質の送達のために（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１０）主に使用されている。ウイルスエレメントを最小化するために、タンパク質カーゴ送達は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質のみで作られた小胞を用いて達成され得る（Ｍａｎｇｅｏｔら、２０１１）。

本開示の目的は、ｇＲＮＡ（複数可）および／またはｇＲＮＡ（複数可）／ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体を標的細胞に一時的方法で送達することができる新規の系を提供することである。

本発明によれば、上記目的は、本開示の不可欠な部分を形成すると理解される以下の特許請求の範囲で具体的に想起される主題により達成される。

本発明は、ｇＲＮＡまたはヌクレアーゼと複合体形成したｇＲＮＡがロードされた小胞、および前記小胞の産生方法を開示する。細胞質転写系を使用してｇＲＮＡを細胞質に蓄積させて、小胞へのｇＲＮＡの非常に効率的な組み込みを達成する。このような細胞質転写系は、許容細胞においてのみ作動され得る。

本発明は、小胞であって、
ｉ）少なくとも１つの膜結合タンパク質に会合する脂質エンベロープ；
ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子；および
ｉｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ
を含み；
以下の特色（ｆｅａｔｕｒｅ）：
−前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、総小胞タンパク質量に対して少なくとも０．２％ｗ／ｗの量で前記小胞内に存在すること；および
−前記小胞が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼも含有する場合、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体形成し、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに対して０．８５：１に等しいかまたはそれを超えるモル比で前記小胞内に存在すること
の少なくとも１つを有する小胞を提供する。

細胞から放出された細胞質由来構造、すなわち小胞内へのｇＲＮＡ分子および／またはヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の効率的なパッケージングを可能にする新たな方法が本明細書に記載される。
本発明によれば、小胞は、以下：
ｉ）パッケージング細胞を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、以下の特色：
ａ）前記細胞が高レベルの直接的な細胞質ゾルの転写に寛容であり、前記細胞寛容が、細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＤＤＸ５８、ＭＤＡ−５、ＩＰＳ−１、ＲＩＰＩ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＴＡＮＫ、ＮＡＰ、ＮＥＭＯ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩＫＫγ、ＴＢＫ１、ＤＤＸ３、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ｐ６５、ｐ５０、ＲＩＰ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３、カスパーゼ−１から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／またはキャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力により決定されること；ならびに
ｂ）前記細胞が、前記細胞質においてＲＮＡポリメラーゼを安定発現または一過性発現すること
を有する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの第１の発現カセット、および少なくとも１つの第２の発現カセット、および必要に応じて少なくとも１つの第３の発現カセットを前記パッケージング細胞にトランスフェクトする工程であって、
ａ）前記第１の発現カセットが、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を転写するための第１のヌクレオチド配列を含み；
ｂ）前記第２の発現カセットが、少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み；および
ｃ）前記第３の発現カセットが、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする第３のヌクレオチド配列を含む工程；
ｉｉｉ）前記パッケージング細胞から前記小胞を産生する工程
を含む方法により産生される。

次に、添付の図面を参照して、単に例示的かつ非限定的な例として、本発明を詳細に説明する。

ＶＥｓｉＣａｓの設計およびゲノム編集活性。 （ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生されたＶＳＶ−Ｇ／ＳｐＣａｓ９小胞を用いたＥＧＦＰ破壊アッセイ。ＥＧＦＰターゲティング（ｓｇＥＧＦＰ５）もしくは対照（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡと一緒にＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９プラスミド）をトランスフェクトすることにより、またはＵ６転写ｓｇＲＮＡを保有するＶＳＶ−Ｇ／ＳｐＣａｓ９小胞を形質導入することにより生成したＥＧＦＰノックアウトＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞のパーセンテージ。示されている場合、ＶＳＶ−Ｇ／ＳｐＣａｓ９小胞処理の前に、ｓｇＥＧＦＰ５またはｓｇＣｔｒをＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞にプレトランスフェクトした（＋ｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ）。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。（ｂ）ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞からのＶＥｓｉＣａｓ産生のスキーム。細胞質ゾルにおいて発現されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターにより細胞質ゾルのｓｇＲＮＡ発現を調節する。ＶＳＶ−Ｇで装飾された小胞はＢＳＲ−Ｔ７／５産生細胞により発現されるが、ｓｇＲＮＡと複合体形成したＳｐＣａｓ９を組み込んでＶＥｓｉＣａｓを形成した。標的細胞では、ＶＥｓｉＣａｓは活性ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を放出し、これが、ＳｐＣａｓ９に導入された２つの核局在化配列を通じて核に入る。（ｃ）ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞上のＢＳＲ−Ｔ７／５において産生されたＶＥｓｉＣａｓのゲノム活性。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５またはｓｇＣｔｒ）と一緒にＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９プラスミド）をトランスフェクトした後の、または示されているとおりｓｇＲＮＡでのプレトランスフェクション有りまたは無しのいずれかでｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５またはｓｇＣｔｒ）を保有するＶＥｓｉＣａｓで処理した後の非蛍光ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞のパーセンテージ。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。（ｄ、ｅ）ＣＸＣＲ４（ｄ）およびＶＥＧＦＡ 部位３（ｅ）ゲノム遺伝子座のＶＥｓｉＣａｓ媒介性編集。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣＸＣＲ４、ｓｇＶＥＧＦＡ 部位３またはｓｇＣｔｒ）と一緒にＳｐＣａｓ９（Ｃａｓ９プラスミド）をトランスフェクトした後に、またはｓｇＲＮＡ（ｓｇＣＸＣＲ４、ｓｇＶＥＧＦＡ 部位３またはｓｇＣｔｒ）を保有するＶＥｓｉＣａｓで３回連続処理した後に、ＴＩＤＥ分析により測定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｉｎｄｅｌ形成のパーセンテージ。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。

ＳｐＣａｓ９送達のためのＶＳＶ−Ｇ小胞の開発。 （ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣａｓ９／ＶＳＶ−Ｇ小胞の産生および送達。産生細胞の細胞抽出物（左パネル）、産生細胞の上清（中央パネル）および形質導入の６時間後の標的細胞（右パネル）におけるＳｐＣａｓ９発現のウエスタンブロット分析。Ｃｔｒは、空の対照プラスミドをトランスフェクトした細胞に対応し、ＳｐＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５）を過剰発現する細胞に対応し、ＳｐＣａｓ９／ＶＳＶ−Ｇは、ＳｐＣａｓ９、ｓｇＥＧＦＰ５およびＶＳＶ−Ｇを過剰発現する細胞に対応する。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。（ｂ）Ｕ６またはＴ７プロモーターｓｇＲＮＡ発現系を使用した異なる細胞株におけるＥＧＦＰ破壊アッセイ。示されているように、Ｕ６またはＴ７プロモーターからのＥＧＦＰターゲティング（ｓｇＥＧＦＰ５）または非ターゲティング（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドと一緒にＥＧＦＰおよびＳｐＣａｓ９発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ２１、ＢＳＲ−Ｔ７／５（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定発現するＢＨＫ２１クローン）およびＶｅｒｏ細胞株から得られた蛍光顕微鏡画像。また、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドをＢＳＲ−Ｔ７／５以外のすべての細胞にコトランスフェクトした。Ｕ６プロモーターにより駆動されるｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５）を発現するすべての細胞株において、ＥＧＦＰノックアウトは様々な強度で検出された（右パネル）。反対に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ系により駆動されるｓｇＲＮＡは、許容細胞（ＢＨＫ−２１、ＢＳＲ−Ｔ７／５およびＶｅｒｏ細胞）においてのみＥＧＦＰノックアウトを誘導することができたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では誘導することができなかった。スケールバー：１００μｍ。データは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。（ｃ）ＢＳＲ−Ｔ７／５（ＶＥｓｉＣａｓ）またはＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞（ＳｐＣａｓ９／ＶＳＶ−Ｇ）の上清において検出されたＳｐＣａｓ９のウエスタンブロット分析。同様の量のＳｐＣａｓ９タンパク質をゲルにロードした。抗ＳｐＣａｓ９または抗チューブリン抗体を用いて、ウエスタンブロットを展開した。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。

ＳｐＣａｓ９送達のためのレンチウイルスベースのウイルス様粒子（ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰ）。 （ａ）Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｇａｇ−Ｃａｓ９）および最小Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９（ＭｉｎＧａｇ−Ｃａｓ９）キメラのスキーム。Ｇａｇ、マトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）ならびにペプチドｐ１、ｐ２およびｐ６のドメインが示されている。リンカーペプチドは、ＳｐＣａｓ９からＧａｇを分離する。核局在化シグナル（ＮＬＳ）および３×ＦＬＡＧタグの位置が示されている。ＭｉｎＧａｇ−Ｃａｓ９融合物は、ＭＡのＮ末端ミリスチル化シグナル、ＣＡのＣ末端部分およびｐ２ペプチドを含む。ＮＣをＧＣＮ４ロイシンジッパードメイン（Ｚ）で置換して、粒子集合を維持した。粒子形成について、ＲＳＶ ｐ２ｂペプチドはｐ６を代替する（Ａｃｃｏｌａら、２０００）。（ｂ）Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９およびＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９のウエスタンブロット分析。ＦＬＡＧとリンカーペプチドとの間にメチオニンを含有する（＋Ｍｅｔ）または含有しない（−Ｍｅｔ）Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９および最小Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９（ＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９）をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトした。矢印は、内部Ｍｅｔから開始する翻訳によりおそらく生成された遊離ＳｐＣａｓ９を示す。Ｃｔｒは、空の対照プラスミドをトランスフェクトした細胞に対応する。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。（ｃ）ＥＧＦＰ破壊アッセイにおけるＧａｇ−ＳｐＣａｓ９およびＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９キメラの活性。ＦＬＡＧとリンカーペプチドとの間にメチオニンを有するまたは有しないＧａｇ−ＳｐＣａｓ９またはＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞にトランスフェクトした。また、ｓｇＥＧＦＰ５またはｓｇＣｔｒを細胞にコトランスフェクトした。ＮＴ＝未処理。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。（ｄ）示されているように、ＳｐＣａｓ９、Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９またはＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９の過剰発現後の産生細胞（細胞）および由来上清（ＶＬＰ）のウエスタンブロット分析。Ｃｔｒは、空の対照プラスミドをトランスフェクトした細胞に対応する。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。（ｅ〜ｇ）ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰを用いたゲノム編集。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における（ｅ）ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージ）、（ｆ）ＣＸＣＲ４または（ｇ）ＶＥＧＦＡ 部位３遺伝子座に対してＶＳＶ−Ｇ装飾Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９またはＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９ ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰにより誘導された編集活性。ＴＩＤＥにより、ｉｎｄｅｌのパーセンテージを分析した）。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。

ＶＥｓｉＣａｓの多重化によるゲノム編集 （ａ）ＶＥｓｉＣａｓを使用した遺伝子欠失。Ｍｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓ（左パネル）処理により、または特定のｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５およびｓｇＥＧＦＰＢｉ）と一緒にＳｐＣａｓ９をトランスフェクションすることにより（右パネル）、ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞において得られたＥＧＦＰ遺伝子座欠失のゲル電気泳動分析。デンシトメトリーにより、欠失の量（％）を定量した。矢印は、欠失ＥＧＦＰ遺伝子座のＰＣＲ増幅に対応する予想バンドを示す。（ｂ）ＳｐＣａｓ９ニッカーゼを送達するＶＥｓｉＣａｓの活性。ＥＧＦＰ遺伝子座中の２つの部位に対するｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ３ｇＷおよびｓｇＥＧＦＰＢｉ）またはｓｇＣｔｒをロードしたＳｐＣａｓ９ニッカーゼを保有するＶＥｓｉＣａｓ−ｎとのインキュベーション後のＥＧＦＰノックアウト細胞のパーセンテージ。ＮＴ＝未処理。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。

ＶＥｓｉＣａｓの滴定、および広く使用されているＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ送達方法との比較。 ＶＥｓｉＣａｓまたはＲＮＰエレクトロポレーションにより送達したスカラー量のＳｐＣａｓ９で処理したＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ破壊アッセイ。それぞれインビトロまたはＢＳＲ−Ｔ７／５細胞でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写された同じｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５）をＲＮＰおよびＶＥｓｉＣａの両方にロードした。データは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。

Ｊ−Ｌａｔ−Ａ１およびＨｅＬａ細胞におけるＶＥｓｉＣａｓ媒介性ＥＧＦＰノックアウト。 ＥＧＦＰを安定発現するＪ−Ｌａｔ−Ａ１およびＨｅＬａを、ＥＧＦＰターゲティング（ｓｇＥＧＦＰ５）または対照（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡを保有するＶＥｓｉＣａｓで処理した。グラフは、処理の７日後の非蛍光細胞のパーセンテージを報告する。データは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。

ｉＰＳ細胞およびＥＧＦＰマウスモデルの心臓におけるゲノム編集活性。 （ａ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるＶＥｓｉＣａｓ活性。対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）またはＧＦＰターゲティングガイドＲＮＡ（ｓｇＧＦＰＩ２）のいずれかを保有するＶＥｓｉＣａｓで処理した後の、ＥＧＦＰを安定発現する非蛍光ｉＰＳＣ細胞のパーセンテージ。ＮＴ＝未処理細胞。データは、ｎ＝２の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。（ｂ）ＥＧＦＰマウスの心筋におけるＶＥｓｉＣａｓ媒介性遺伝子破壊。対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）またはＥＧＦＰをターゲティングするガイド（ｓｇＥＧＦＰＢｉ）を保有するＶＥｓｉＣａｓの心臓内注射の１０日後のＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の心臓組織切片の蛍光顕微鏡画像。核対比染色としてＤＡＰＩを使用した。α−アクチニンの免疫染色を実施して、心筋細胞を同定した（下パネル）。ｎ＝５の実験のうちの代表的なサンプルが示されている。スケールバー：１００μｍ。

ＶＥＧＦＡ遺伝子座におけるＶＥｓｉＣａｓにより生成されたオン／オフターゲット活性の分析。 （ａ）ＶＥｓｉＣａｓによるＳｐＣａｓ９の無痕跡送達。ＶＥｓｉＣａｓを形質導入した、またはＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるウエスタンブロット分析によるＳｐＣａｓ９細胞内レベルの経時的分析。報告されている時点は、処理（形質導入またはトランスフェクション）後の分析の時間に対応する。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表的なものである。（ｂ）ｓｇＶＥＧＦＡ 部位３と組み合わせて、ＶＥｓｉＣａｓまたはＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドを使用したゲノム編集特異性に的を絞った比較。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦＡ 部位３遺伝子座および２つのｓｇＶＥＧＦＡ 部位３（以前に検証されたオフターゲット部位（ＯＴ１およびＯＴ３））においてＴＩＤＥにより測定したｉｎｄｅｌ形成のパーセンテージ。破線のバーは、ＴＩＤＥバックグラウンドを表す。（ｃ）ＶＥＧＦＡ 部位３遺伝子座（配列番号１７のヌクレオチド４〜２６）をターゲティングするＶＥｓｉＣａｓのゲノムワイドな特異性。ＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした、またはＶＥｓｉＣａｓで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦＡ 部位３遺伝子座をターゲティングするｓｇＲＮＡのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ分析。黒色の四角は、オンターゲット部位を示す。ライブラリー調製の前に、３つの生物学的複製由来のＤＮＡを混合した。右パネルは、ＳｐＣａｓ９トランスフェクションまたはＶＥｓｉＣａｓ処理を用いてｓｇＶＥＧＦＡ 部位３について同定されたオフターゲットの総数を報告する。

ＶＥｓｉＣａｓ転写調節因子による遺伝子発現の活性化。 ＶＥｓｉＣａｓ活性化因子によるＥＧＦＰ発現の活性化。プロモーター特異的（ｓｇＴｅｔＯ）または対照（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡを送達するＶＥｓｉＣａｓ、およびｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４で処理した、ｐＴＲＥ−ＥＧＦＰレポータープラスミドをトランスフェクトした細胞。グラフは、形質導入の２日後のＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。

ＶＥｓｉＣａｓによるｇＲＮＡ分子の送達。 ＥＧＦＰ遺伝子座をターゲティングする（ｓｇＥＧＦＰＢｉ）またはターゲティングしない（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡを発現する細胞由来のＶＥｓｉＣａｓを、形質導入の２４時間前にＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞に形質導入した。グラフは、形質導入の７日後のＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージを示す。

ミリスチル化ＳｐＣａｓ９をロードしたＶＥｓｉＣａｓの編集有効性。 ミリスチル化ＳｐＣａｓ９（ｍｙｒ−ＶＥｓｉＣａｓ）を組み込み、ｓｇＥＧＦＰＢｉガイドＲＮＡをロードしたＶＥｓｉＣａｓを使用した、ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ破壊アッセイ。処理を用いて得られたＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージはグラフに報告されている。未処理細胞は、バックグラウンド対照として機能する。

Ｕ６小胞およびＶＥｓｉＣａｓの編集有効性の比較。 （ａ）ｓｇＥＧＦＰＢｉガイドＲＮＡをロードしたＵ６小胞またはＶＥｓｉＣａｓのいずれかを使用した、ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰにおけるＥＧＦＰ破壊アッセイ。グラフは、示されているように、各処理を用いて生成されたＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージを報告する。未処理細胞は、バックグラウンド対照として機能する。（ｂ）標的細胞を処理するために使用したＳｐＣａｓ９の総量について（ａ）のデータの正規化により得られたＶＥｓｉＣａｓに関するＵ６小胞の相対的な編集有効性。

ＧｅｓｉｃｌｅおよびＶＥｓｉＣａｓの編集有効性の比較。 それぞれｓｇＥＧＦＰＢｉ ｓｇＲＮＡをロードしたＵ６小胞、ＧｅｓｉｃｌｅまたはＶＥｓｉＣａｓ９によるＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰの処理後に生成されたＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージ。ウエスタンブロットにより測定した場合に、同じ量のＳｐＣａｓ９を含有する各調製物の画分で細胞を処理した。

ＶＥｓｉＣａｓおよびＵ６小胞へのｓｇＲＮＡ組み込みの定量。 （ａ）各小胞調製物に組み込まれたものと同一のインビトロ転写ｓｇＲＮＡを使用して得られたＲＴ−ｑＰＣＲによる絶対的ｓｇＲＮＡ定量に使用した標準曲線。傾向線の式および対応するＲ二乗値はグラフに報告されている。（ｂ）補間のために（ａ）の標準曲線を使用してＲＴ−ｑＰＣＲにより測定したＵ６小胞およびＶＥｓｉＣａｓに組み込まれたｓｇＲＮＡの総量。（ｃ）ウエスタンブロットにより定量した場合に、各産物に存在するＳｐＣａｓ９の総量について（ｂ）のデータの正規化から計算した、ＶＥｓｉＣａｓに対するＵ６小胞により組み込まれたｓｇＲＮＡの相対量。

ＶＥｓｉＣａｓへのＳｐＣａｓ９組み込みの正確な定量。 （ａ）代表的なＶＥｓｉＣａｓ調製物のウエスタンブロット。組換えＳｐＣａｓ９の異なる調製物を用いて得られた２つの異なる標準曲線（標準１および標準２）をサンプルと一緒にロードして、デンシトメトリーによる定量を可能にする。（ｂ〜ｃ）絶対的ＳｐＣａｓ９定量に使用した（ａ）のデータのデンシトメトリー分析から得られた標準曲線。傾向線の式および対応するＲ二乗値は各グラフに報告されている。

発明の詳細な説明
以下の説明では、実施形態の十分な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示されている。実施形態は、具体的な詳細の１つもしくはそれよりも多くを用いずに、または他の場合には他の方法、成分、材料などを用いて実施され得、周知の構造、材料または操作は、実施形態の態様を不明確にすることを回避するため、詳細には示されておらず記載されてもいない。

本明細書を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特色、構造または特徴が少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及するものではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１つまたはそれを超える実施形態において任意の適切な方法で組み合わされ得る。

本明細書で提供される見出しは単に便宜上のものであり、実施形態の範囲や意味を解釈するものではない。

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術は、ゲノム編集およびゲノム調節のための強力なツールである。臨床用途へのその応用は、その特異性（オフターゲット活性の完全な抑止）および送達のさらなる改善に強く依存する。レシピエント細胞におけるヌクレアーゼＲＮＰ（例えば、ｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９）発現の量および時間は、オフターゲット切断の頻度と強く相関するので（Ｔｓａｉ＆Ｊｏｕｎｇ ２０１６；Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７；Ｆｕら、２０１３）、これらはゲノム編集の密接に相互依存する側面である。また、ＳｐＣａｓ９発現の持続性は、インビボで改変細胞に対して有害な免疫反応を生成し得、高度に制御可能な送達方法の需要をさらに強める（Ｃｈｅｗら、２０１６）。ＳｐＣａｓ９の一過性発現は、物理的および化学的（脂質およびポリマーベースの試薬）送達方法（Ｚｕｒｉｓら、２０１５；Ｍｏｕｔ，Ｒａｙ，Ｙｅｓｉｌｂａｇ Ｔｏｎｇａら、２０１７）により得られたが、これらはインビボ用途とって理想的ではない（Ｍｏｕｔ，Ｒａｙ，Ｌｅｅら、２０１７）。インビボ遺伝子送達のための主なツールはウイルスベクターであるが、しかしながら、これは、それらの潜在的な挿入変異誘発リスク（Ｃｈｉｃｋら、２０１２；Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）と、ＳｐＣａｓ９オフターゲット切断の数を増加させ得る永続的な導入遺伝子発現（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）とに由来する深刻な制限を有する。ウイルス組込みに関連する遺伝毒性は、非組込みウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するものを使用することにより部分的に回避され得る（Ｚａｃｃｈｉｇｎａら、２０１４；Ｎａｋａｉら、２００１；Ｒｕｏｚｉら、２０１５）。サイズの制限により、ＳｐＣａｓ９オルソログ、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のもの（Ｒａｎら、２０１５；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄら、２０１５）またはスプリットタンパク質戦略（ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９）は、一般に、ＡＡＶベクターと共に用いられている（Ｔｒｕｏｎｇら、２０１５）。しかしそれでも、ＣＲＩＳＰＲエレメントの分離は高度な複雑性を系に導入し、時折、ＡＡＶ組込みが報告されている（Ｄｅｙｌｅ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００９）。同様に、他の非組込みベクター、例えばインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を用いて報告された予測不可能な挿入変異誘発は、バックグラウンドレベルを超えるヌクレアーゼ活性により増強され得る（Ｇａｂｒｉｅｌら、２０１１；Ｗａｎｇら、２０１５）。自己制限ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓレンチウイルスベクターを使用することにより（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）、またはｇＲＮＡを発現する非組込みレンチウイルスベクターと一緒にプレパッケージングＳｐＣａｓ９を含有するレンチウイルス粒子を操作することにより（Ｃｈｏｉら、２０１６）、ウイルス送達により提供される利点を一過性ＳｐＣａｓ９発現と組み合わせる試みが最近行われた。ＤＮＡフリーの状況におけるウイルス送達特性の活用へのさらなるステップは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発である（Ｍａｎｇｅｏｔら、２０１１；Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１０）。過去１０年間に、ＶＬＰは、ワクチン接種アプローチのために（Ｒａｍｑｖｉｓｔら、２００７）または外因性タンパク質の送達のために（Ｍａｎｇｅｏｔら、２０１１；Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１０）主に使用されている。

公知の技術の特定された上記欠点を解決するために、本発明者らは、予想外のことに、ｇＲＮＡおよび／またはＲＮＰ、例えばｇＲＮＡ分子によりガイドされるヌクレアーゼ（ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）により形成されるものを一時的方法で送達することができる小胞を産生することができ、細胞質発現系を利用して、ｇＲＮＡ成分を小胞に豊富にパッケージングした。新たな驚くべき利点としては、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ−ヌクレアーゼＲＮＰのはるかに効率的な産生および送達が挙げられ、適切な許容細胞において得られる細胞質転写により、小胞にパッケージングされたヌクレアーゼはほぼ完全かつ正確にそれらのｇＲＮＡと結びつけられる。ｇＲＮＡの核発現と比較して、ｇＲＮＡおよびＲＮＰを細胞放出小胞にパッケージングするための本明細書に記載される細胞質ゾルの発現系は数倍より効率的であった。これらの小胞は、小胞形成、産生細胞からの小胞の放出、輸送ｇＲＮＡおよび／またはＲＮＰの送達が起こる必要がある標的細胞への小胞の効率的なターゲティングおよび融合をトリガーするために必要な非常に最小限のエレメント（例えば、ＶＳＶ−ｇ糖タンパク質などのウイルスエレメント）を有するように設計される。

本出願の目的の小胞は、ｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＲＮＰを一時的方法で送達するように設計される。これは、ＤＮＡトランスフェクションまたはウイルスベクター送達による送達とは対照的であり、これらの場合、コードＤＮＡは、ｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを継続的に、または少なくとも細胞によりコードＤＮＡが放出される（細胞分裂後にプラスミドが消失する）まで産生し、そしてこれは、細胞クロマチンへのプラスミド／ウイルスベクター組込み後には起こらない。反対に、ＲＰＮ送達は、いくつかの分野（例えば、遺伝子およびゲノムの編集および治療、遺伝子発現調節、エピジェネティック改変）におけるそれらの用途の特異性、忍容性および安全性の増加をもたらす。一過性送達は、以下のものに起因するリスクを最小化する：小胞に存在する非自己エレメントに対する免疫反応；ｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ−ヌクレアーゼＲＮＰおよび／または小胞に存在する他のそれらの関連エレメントのオフターゲット部位の切断または改変；小胞成分、特にｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ−ヌクレアーゼＲＮＰの存在による毒性効果（これらは、長期間発現される場合には細胞恒常性を変化させ得る）。

本発明は、小胞であって、
ｉ）少なくとも１つの膜結合タンパク質に会合する脂質エンベロープ；
ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子；および
ｉｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ
を含み；
以下の特色：
−前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、総小胞タンパク質量に対して少なくとも０．２％ｗ／ｗの量で前記小胞内に存在すること；および
−前記小胞が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼも含有する場合、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体形成し、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに対して０．８５：１に等しいかまたはそれを超えるモル比で前記小胞内に存在すること
の少なくとも１つを有する小胞に関する。

実施形態では、脂質エンベロープは、単層または二層脂質構造、エクソソーム、エンベロープウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ）、エンベロープウイルス様粒子、ミクロソーム、エンドソーム、ナノソーム、液胞から選択される。好ましくは、脂質エンベロープは、エクソソーム、エンベロープウイルスまたはエンベロープウイルス様粒子から選択される。より好ましくは、脂質エンベロープは、エンベロープウイルス様粒子である。

実施形態では、少なくとも１つの膜結合タンパク質は、小胞産生細胞からの小胞形成を刺激し、および／または標的細胞への小胞融合を媒介する。少なくとも１つの膜結合タンパク質は、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＡＬＶエンベロープ、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＨＩＶ ｇｐ１６０、カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、細胞膜との相互作用を有するエンベロープウイルスのマトリックスタンパク質、エボラＶＰ４０、エボラ糖タンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−ｐｏｌレトロウイルスタンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−Ｐｏｌレンチウイルスタンパク質、Ａｒｃタンパク質、ＴＹ３／ジプシーレトロトランスポゾンエンベロープタンパク質、ＨＩＶ−１ Ｖｐｕ、最小−Ｇａｇ、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合物、上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／またはその細胞内ドメインおよび／またはその細胞外ドメインの一部、標的細胞上の表面分子を認識することができる免疫グロブリン可変ドメイン由来の一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質受容体、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質性リガンド、ならびにそれらの類似体から選択される。

実施形態によれば、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡから選択される。

実施形態によれば、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２タイプＩＩ、タイプＶ、タイプＶＩヌクレアーゼおよびアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３およびＡｇｏ２ヌクレアーゼおよびそれらのバリアント；ヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体；ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼ変異体；タンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、細胞透過性ペプチド、およびエンドソーム脱出を可能にするペプチド、転写調節因子、クロマチン調節因子、ＤＮＡ修復をモジュレートするタンパク質またはタンパク質ドメイン、他のタンパク質の翻訳後修飾を可能にするタンパク質またはタンパク質ドメイン、細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチド、タンパク質結合ドメインから選択されるタンパク質ドメインに融合したＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択される。より好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される；さらにより好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。

一実施形態によれば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体と複合体形成する少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は、塩基エディター、転写調節因子またはクロマチン調節因子をコードする他のタンパク質ドメインに融合したアプタマー相互作用タンパク質ドメイン、好ましくはＭＳ２タンパク質との相互作用特性を有するアプタマー、好ましくはＭＳ２アプタマーを含むように操作されている。好ましくは、アプタマーは、適切な位置（例えば、ヘアピン、ネクサス、テトラループ、ステム）で、または少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子の３’末端で、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子内に含められる。

実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ファルネシル化シグナル、ミリストイル化シグナル、膜貫通ドメインの少なくとも１つに融合されている。

小胞は、標的細胞に送達されると、細胞毒性を最小化するために、標的細胞内においてＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡの一過性発現を提供する。

ｇＲＮＡ発現のための標準的な方法は、小胞へのｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＲＮＰ組み込みのそれらの低い効率を考慮すると、本発明の目的の小胞を産生するために適切ではない。効率的なｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ送達は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用したゲノム編集にとって非常に重要である。

したがって、本発明者らは、小胞へのパッケージングのために、細胞質において高濃度のｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＲＮＰを達成することができる本発明の目的の小胞を産生するための新たな方法を開発した。

実際、本発明者らは、驚くべきことに、細胞放出小胞へのｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＲＮＰの効率的なパッケージングが、大量のｇＲＮＡがパッケージング細胞の細胞質に局在することを必要とし、専用の生物工学的解決手段がこの目標を達成するために必要であることを発見した。ｇＲＮＡが５’キャップを含有するべきではなく、ポリＡ配列が細胞機構によりスプライシングされてはならず、および／または核細胞酵素によりプロセシングされてはならない場合（例えば、脱アミノ化、メチル化など）、この要件は極めて重要である。細胞放出小胞への効率的なパッケージングのために高濃度のｇＲＮＡが細胞質に非天然に存在するという要件は、ウイルス、古細菌、細菌または真核細胞起源のｇＲＮＡにかかわらず（特に、細胞核の非存在下またはその外側で複製する真核細胞のバクテリオファージまたはＲＮＡウイルスに由来する場合）コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡのプロセシングに由来するｇＲＮＡを含む任意の種類のｇＲＮＡ分子を伴い得る。この側面は、例えば国際公開第２０１５／１９１９１１号に開示されているように、バイオテクノロジーの目的でＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩとは異なるポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩＩ）により通常転写されるｇＲＮＡの小胞組み込みにとって重大な重要性を有する。本発明者らは、予想外のことに、ｇＲＮＡの標準的な核Ｐｏｌ−ＩＩＩ媒介性発現が、核から細胞質へのそれらの効率的な放出を可能にせず、細胞放出小胞へのそれらの有効な組み込みを可能にすることを観察した。

本発明者らにより本明細書に開示される解決手段は、これらの制限を克服するために、ｇＲＮＡの直接的な細胞質転写および／または局在化を利用する。本発明によるｇＲＮＡは、細胞質において天然または人工の系により発現される。

驚くべきことに、この解決手段は、細胞由来小胞へのパッケージングのために、細胞質において大量のｇＲＮＡ（複数可）および／またはＲＮＰ（複数可）を発現および局在化させるための適切な許容細胞を必要とする。

本発明によれば、小胞は、以下：
ｉ）パッケージング細胞を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、以下の特色：
ａ）前記細胞が、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子ならびに／または少なくとも１つのｇＲＮＡ分子および少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより形成される複合体の高レベルの直接的な細胞質ゾルの転写に寛容であり、前記細胞寛容が、細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＭＤＡ−５、ＩＰＳ−１、ＲＩＰＩ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＴＡＮＫ、ＮＡＰ、ＮＥＭＯ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩＫＫγ、ＴＢＫ１、ＤＤＸ３、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ｐ６５、ｐ５０、ＲＩＰ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３、カスパーゼ−１から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／またはキャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力により決定されること；ならびに
ｂ）前記細胞が、前記細胞質においてＲＮＡポリメラーゼを安定発現または一過性発現すること
を有する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの第１の発現カセット、および少なくとも１つの第２の発現カセット、および必要に応じて少なくとも１つの第３の発現カセットを前記パッケージング細胞にトランスフェクトする工程であって、
ａ）前記第１の発現カセットが、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を転写するための第１のヌクレオチド配列を含み；
ｂ）前記第２の発現カセットが、前記少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み；および
ｃ）前記第３の発現カセットが、前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする第３のヌクレオチド配列を含む工程；
ｉｉｉ）前記パッケージング細胞から前記小胞を産生する工程
を含む方法により産生される。

実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓバクテリオファージｐｈｉＡ１１２２のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバクテリオファージｇｈ−１のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４のＲＮＡポリメラーゼ、ロゼオファージＳＩＯ１のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＹｅ０３−１２のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＫＭＶのＲＮＡポリメラーゼ、腸内細菌バクテリオファージＫ１−５のＲＮＡポリメラーゼ、ビブリオファージＶｐＶ２６２のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１４のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１２７のＲＮＡポリメラーゼおよびＢＡ１５６のＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアントから選択されるバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである。より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＲＮＡポリメラーゼから選択される。さらにより好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

さらなる実施形態では、パッケージング細胞は、ＢＨＫ２１、ＢＳＲ−Ｔ７／５、ＢＨＫ−Ｔ７およびＶｅｒｏ細胞から選択される。

実施形態では、小胞形成を刺激するために、および／または標的細胞への小胞融合を媒介するために有用な少なくとも１つの膜結合タンパク質は、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＡＬＶエンベロープ、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＨＩＶ ｇｐ１６０、カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、細胞膜との相互作用を有するエンベロープウイルスのマトリックスタンパク質、エボラＶＰ４０、エボラ糖タンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−ｐｏｌレトロウイルスタンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−Ｐｏｌレンチウイルスタンパク質、Ａｒｃタンパク質、ＴＹ３／ジプシーレトロトランスポゾンエンベロープタンパク質、ＨＩＶ−１ Ｖｐｕ、最小−Ｇａｇ、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合物、上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／またはその細胞内ドメインおよび／またはその細胞外ドメインの一部、標的細胞上の表面分子を認識することができる免疫グロブリン可変ドメイン由来の一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質受容体、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質性リガンド、ならびにそれらの類似体から選択される。

実施形態によれば、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２タイプＩＩ、タイプＶ、タイプＶＩおよびアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３およびＡｇｏ２ヌクレアーゼおよびそれらのバリアント；ヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体；ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼ変異体；タンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、細胞透過性ペプチド、およびエンドソーム脱出を可能にするペプチド、転写調節因子、クロマチン調節因子、ＤＮＡ修復をモジュレートするタンパク質またはタンパク質ドメイン、他のタンパク質の翻訳後修飾を可能にするタンパク質またはタンパク質ドメイン、細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチド、タンパク質結合ドメインをコードするアミノ酸配列から選択されるタンパク質ドメインに融合したＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択される。より好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される；さらにより好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。

さらなる実施形態によれば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体と複合体形成する少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は、塩基エディター、転写調節因子またはクロマチン調節因子をコードする他のタンパク質ドメインに融合したアプタマー相互作用タンパク質ドメイン、好ましくはＭＳ２タンパク質との相互作用特性を有するアプタマー、好ましくはＭＳ２アプタマーを含むように操作されている。アプタマーは、適切な位置（例えば、ヘアピン、ネクサス、テトラループ、ステム）で、またはｓｇＲＮＡの少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子の３’末端で、ｓｇＲＮＡ構造内に含められ得る。

好ましい実施形態によれば、ｇＲＮＡの直接的な細胞質ゾルの転写への寛容は、（ｉ）細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＭＤＡ−５、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／または（ｉｉ）キャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または（ｉｉｉ）５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力により決定される。より好ましくは、パッケージング細胞は、（ｉ）ＲＩＧ−Ｉ、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／または（ｉｉ）キャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または（ｉｉｉ）５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力を特徴とする。

本発明によれば、小胞を産生するための方法は、工程ｉｉ）において、少なくとも１つのさらなる発現カセットをパッケージング細胞にトランスフェクトすることをさらに提供し、少なくとも１つのさらなる発現カセットは、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＶＳＶ−Ｇ、ＡＬＶエンベロープ、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＴＣＲ−アルファ、ＣＤ４、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、標的細胞上の表面分子を認識する抗体の可変ドメインおよび／または全長抗体から選択される、標的細胞への小胞指向性を変化させるために有用な少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列を含み、ただし、さらなるヌクレオチド配列は、第２の発現カセットに含まれる第２のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つの膜結合タンパク質とは異なる少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードする。好ましくは、少なくとも１つのさらなる発現カセットは、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質、全長ＶＳＶ−Ｇタンパク質、または標的細胞上の表面分子に結合することができる受容体ドメインに融合したＶＳＶ−Ｇタンパク質の細胞質ゾルドメインおよび膜貫通ドメインから選択される少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つのさらなる発現カセットは、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合タンパク質から選択される少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。

以下では、特許請求された特色の定義およびさらなる特徴が提供される。

ガイドＲＮＡ分子
本発明によれば、核酸標的に結合するためにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（複数可）により使用される小胞内に組み込まれる少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）は、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡから選択される。

ｇＲＮＡ分子は、天然もしくは人工単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、または２つもしくはそれを超える転写産物により作られたガイドＲＮＡのいずれかであり得る。

好ましくは、ｇＲＮＡは、以下に記載されているように、１つまたはそれを超えるタンパク質および／または他のｇＲＮＡ分子により結合され得る。

単独でまたは他のｇＲＮＡと組み合わせて使用されるｇＲＮＡは、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびいくつかの実施形態ではさらに他の関連分子を、ｇＲＮＡ分子の「ガイド」部分に少なくとも部分的に相補的な（標的細胞に存在する）目的の核酸標的に結合させかつ標的とすることができる。

ｇＲＮＡ分子のガイド部分と標的核酸との間のヌクレオチド配列のいくつかのミスマッチ（例えば、３０％、２０％、１０％、５％、１％）が存在し得る。ミスマッチの存在は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性に対する効果を有し得る（例えば、ミスマッチの存在は、その切断ではなく標的配列のＲＮＰ結合をトリガーすることにより、または例えば（Ｄａｈｌｍａｎら、２０１５）のように切断速度および親和性に影響を与えることにより、ヌクレアーゼ活性を調節し得る）。

同様に、ＲＮＰ成分、標的配列および／または近隣の領域が関与する異なる親和性およびコンフォメーション変化により、ＲＮＰ関連分子は、ｇＲＮＡと標的核酸との間のミスマッチの存在により厳密に調節されるそれらの酵素機能を有し得る。

ｇＲＮＡ分子は、目的の標的へのヌクレアーゼ親和性をモジュレートするように改変され得る。ｇＲＮＡは、以下に記載されるように（ｉ）親天然または人工ｇＲＮＡと比較して多かれ少なかれ安定であるように、（ｉｉ）標的核酸配列との、ならびに／または１つもしくはそれを超えるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよび／もしくは関連分子との相互作用を抑止、減少または増加させるように、（ｉｉｉ）追跡可能であるように、（ｉｖ）ｇＲＮＡ切断により成熟または不活性化形態でさらに改変されるように、（ｖ）転写後修飾で改変されて新たな機能を元の転写産物に追加するかまたはその成熟を調節するように改変され得る。

ｇＲＮＡは、他の分子およびタンパク質と特異的に会合して、新たな活性をｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ／ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体に導入するように改変され得る。特に、転写活性化または塩基編集は、転写活性化ドメインまたは塩基編集ドメインに融合したＭＳ２タンパク質との結合を生成する、ｇＲＮＡにＭＳ２結合配列に類似のアプタマーを含めることにより得ることができる。転写活性化ドメインの非限定的な例は、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６である。塩基編集ドメインの非限定的な例は、ヌクレオチドデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣなど）またはアデニンデアミナーゼ）である。転写活性化ドメインまたは塩基編集ドメインをＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ標的部位またはその近くにテザーすることにより、標的遺伝子の転写活性化または塩基編集が生成される。

ｇＲＮＡは、ＲＮＡ脱アミノ化、天然および人工ヌクレオチド組み込みにより化学的に改変され得る。

ｇＲＮＡは、さらなるＲＮＡドメインに内部でまたはその５’および３’末端のいずれか（例えば、５’キャップ、ＭＳ２リピート、ＲＮＡヘアピン、蛍光ＲＮＡアプタマー（例えば、ブロッコリー、ホウレンソウ））、リボザイム、ターミネーター、ポリ−Ａ配列で融合され得る。

活性ｇＲＮＡは、塩基対形成または他の化学結合（例えば、共有結合、水素結合、塩結合）により相互作用する異なるＲＮＡ分子の会合、例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼの機能的ｇＲＮＡ分子を形成するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二量体により構成され得る。

足場としても定義されるｇＲＮＡ定常部分は、標的選択に不要なｇＲＮＡの部分であって、しかし、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはその関連分子（例えば、タンパク質、第２のＲＮＡ）による結合に必要なｇＲＮＡの部分である。

ｇＲＮＡ足場は、転写、安定性、フォールディング、および関連分子、例えばＲＮＡ結合タンパク質との相互作用を改善するために最適化され得る（例えば、（Ｔｈｙｍｅら、２０１６）および（Ｄａｎｇら、２０１５））。ＲＮＡ結合タンパク質がＳｐＣａｓ９分子である場合、ｇＲＮＡは単一のｇＲＮＡにより構成され得、（例えば配列番号４４に記載されているヌクレオチド配列を有する）その足場は、（Ｄａｎｇら、２０１５）に記載されているように、例えば配列番号４５および４６に記載されているように変異およびヌクレオチド変化により最適化され得る。

ＳｐＣａｓ９とは異なるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、他のＣａｓ９オルソログ、Ｃｐｆ１またはＣａｓ１３ヌクレアーゼファミリー）については、（例えば、ＲＮＡループのＲＮＡヘアピン構造および／または改変のポリＴストレッチおよび／または改変を遮断するためのＴヌクレオチドの除去または変異による）同族ｇＲＮＡ足場の対応する改変は、共通の一般知識を考慮して当業者により実現され得る。

本発明にしたがって細胞質ｇＲＮＡ転写に使用され得るＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、それらのプロモーターの後に、転写を開始するための開始Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧまたはＧＡ配列を必要とする。したがって、ｇＲＮＡ発現カセットをコードするプラスミドでは、このようなヌクレオチドは、このような酵素による細胞質ゾルの転写を促すように相対発現カセットを改変することにより、本発明によるｇＲＮＡに対応する転写産物の５’末端に追加され得る。転写を開始するための５’末端配列要件は、状況に応じて変更されるという理由により、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼに代えて代替ポリメラーゼを使用して細胞質転写を達成することができる。

本発明によるｇＲＮＡ改変の例はまた、米国特許出願公開第２０１５／０３７６５８６号に記載されている。

本発明内において有用なｇＲＮＡ分子は、小胞へのパッケージングの前もしくは後に、または標的細胞への小胞の融合の前もしくは後に、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に逆転写され得る。このようなｇＤＮＡは、ターゲティングのためにＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼと対合され得るか、またはドナーＤＮＡとして使用され得る。

本発明によるｇＲＮＡ（複数可）は他の分子に結合して、それらの活性および／または相互作用に相互に影響を与え得る。このような分子としては、限定されないが、タンパク質（例えば、ＭＳ２タンパク質）、ＤＮＡ（例えば、ＨＤＲのためのドナーＤＮＡ分子）および小分子（例えば、リボザイム、ＧＴＰの調節のための小分子、ＲＮＡアプタマーに結合する分子（例えば、３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン（ＤＦＨＢＩ）））が挙げられる。

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（複数可）
ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡにより標的核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）にガイドされる生物学的関連分子であるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに結合する。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ分子との相互作用に機能を追加し得るか、またはそれから機能を獲得し得る。

実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、そのｇＲＮＡと組み合わせて標的配列に単に結合し得るか、またはそのヌクレアーゼ活性および／もしくはヌクレアーゼＲＮＰ（複数可）に関連する１つもしくはそれを超えるさらなる分子の存在にしたがって標的配列への、その隣接へのもしくはその近位への活性をもたらし得る少なくとも１つのタンパク質である（活性の例は、以下に詳細に記載されている）。

本発明によれば、このようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、すなわちバクテリオファージＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、細菌起源のアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたは真核生物起源のアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される。

好ましくは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２タイプＩＩ、タイプＶ、タイプＶＩおよびアルゴノートヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。より好ましくは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、（以下に記載される）Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３およびＡｇｏ２ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される。

ヌクレアーゼＲＮＰ（複数可）の活性は、関連標的分子の一次、二次、三次および四次構造にしたがってｇＲＮＡにより決定された場合に、標的核酸に対して空間的に近接して見出される（２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、３ｍｎ以下、２ｎｍ以下、１ｎｍ以下）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子に対するものであり得る。

標的ヌクレオチド配列への、その隣接へのもしくはその近位へのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（複数可）の活性の例としては、限定されないが、切断、ニッキング、結合、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、リン酸化、脱リン酸化、転写活性化、転写抑制、転写干渉、ビオチン化、脱アミノ化、ヌクレオチド脱アミノ化、シトシン脱アミノ化、グアノシン脱アミノ化、翻訳干渉、ユビキチン化、ユビキチン様改変、酸化、還元が挙げられる。好ましくは、これらの標的は、治療的および／または診断的関連ＤＮＡまたはＲＮＡ標的である。

Ｃａｓ９および／またはＣｐｆ１ヌクレアーゼは、その用語が本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含む部位に局在化（例えば、ターゲティングまたはホーミング）し得るヌクレアーゼを指す。

本発明によれば、様々な種由来のＣａｓ９ヌクレアーゼが、本明細書に記載される方法において使用され得る。本発明の実験セクション内では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用したが（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されているそのアミノ酸配列を有する）、他の種由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは同じ活性を発揮し得る。

本発明内において使用可能なＣａｓ９ヌクレアーゼが得られ得る種の例としては、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ種、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ種、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ種、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ種、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅが挙げられる。好ましくは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、２０１３）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｈｏｕら、２０１３）に由来する。より好ましくは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓに由来する。

本発明において使用され得る天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼとしては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、株ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、株ＬＭＤ−９）、Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ（例えば、株ＳＰＩＮ ２００２６）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（例えば、株ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５）、Ｓ．ｍａｃａｃａｅ（例えば、株ＮＣＴＣ１１５５８）、Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、株ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２０６９）、Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ（例えば、株ＡＴＣＣ ９８１２、ＭＧＣＳ １２４）、Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ（例えば、株ＧＧＳ １２４）、Ｓ．ｂｏｖｉｓ（例えば、株ＡＴＣＣ ７００３３８）、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ（例えば、株Ｆ０２１１）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、株ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例えば、株Ｆ６８５４）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、例えば、株Ｃｌｉｐｌ ｌ２６２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ（例えば、株ＤＳＭ １５９５２）またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（例えば、株１，２３１，４０８）に由来するクラスタ１細菌科のＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。

いくつかの実施形態では、真核生物起源のアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＩＳＣ触媒成分Ａｇｏ２、好ましくは哺乳動物またはヒトＡｇｏ２である。

本発明にしたがって使用され得るＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼバリアントは、以下に開示されている。

実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、例えばＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、本明細書で想起される任意のＣａｓ９ヌクレアーゼ配列または上記種由来の天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼ配列と少なくとも８０％、９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％、９９％または１００％の同一性を有する（およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されているそのアミノ酸配列を有する）アミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、Ｎｕｎｅｚら、２０１６；Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５；Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５；Ｎｉｈｏｎｇａｋｉら、２０１５；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、２０１６；Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、２０１６；伊国特許出願第１０２０１７００００１６３２１号；国際公開第２０１６／２０５６１３号および国際公開第２０１７／０４０３４８号に開示されている操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼ（すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント）であり得る。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ニッカーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されている参照配列に対してＳｐＣａｓ９ Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異体）であるように、または（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されている参照配列に対してアミノ酸位置Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０ＡまたはＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａを変異させて）ＤＮＡを切断することができないように変異され得る。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、新たな機能、局在性、検出可能性、調節活性および当業者に公知の他の効果を提供し得るアミノ酸配列に融合される。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに融合され得るアミノ酸配列は、タンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、細胞透過性ペプチド、およびエンドソーム脱出を可能にするペプチド、転写調節因子、クロマチン調節因子、ＤＮＡ修復をモジュレートするタンパク質またはタンパク質ドメイン、他のタンパク質の翻訳後修飾を可能にするタンパク質またはタンパク質ドメイン、細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチド、タンパク質結合ドメインから選択される。好ましくは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに融合され得るアミノ酸配列は、タンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、転写調節因子、クロマチン調節因子、細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチドから選択される。

これらの改変は、以下の段落で詳述されている。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの検出を容易にするために有用なタンパク質タグ（例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ポリＨｉｓタグ、ＭＢＰタグ、ＳＵＮタグ、ＥＧＦＰタンパク質または類似の蛍光タンパク質の全長または一部）に融合される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、特異性または活性を増加させるためのさらなるヌクレアーゼドメイン（複数可）（例えば、Ｆｏｋ−１または別のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）に融合される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡに対して作用する核酸編集ドメイン、例えばアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ）などに融合される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、細胞透過性ペプチド（例えば、ポリアルギニンペプチド）またはエンドソーム脱出を促す他の分子（例えば、（Ｒｉｔｔｎｅｒら、２００２）に記載されているｐｐＴＧ２１）に融合され得る。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、遺伝子発現に影響を及ぼし得るかまたはＤＮＡ修復を変化させ得る少なくとも１つのタンパク質、例えば転写活性化因子（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰＲ）、転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ）、ＤＮＡ修復の阻害因子（ＧＡＭ、ＵＧＩ））；グアノシルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ１；ＤＮＭＴ３）、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ＲＮＡデメチラーゼアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、ユビキチンリガーゼ、デユビキチナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＮＥＤＤ８−リガーゼ、ｄｅ−ＮＥＤＤｙｌａｓｅ、ＳＵＭＯ−リガーゼ、ｄｅＳＵＭＯｙｌａｓｅ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐ３００）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ）、タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメインまたはＴＡＬＥ）、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２タンパク質）に融合され得る。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの局在性または安定性を調節するさらなるタンパク質ドメインおよび／またはペプチド配列、例えばＧａｇタンパク質の全長または一部、レトロウイルスまたはレンチウイルスＶｐｒタンパク質、シクロフィリンＡタンパク質、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０核局在化シグナル、ｃ−Ｍｙｃ ＮＬＳ、ＰＹ−ＮＬＳ、（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１６）に記載されている双節型核局在化シグナル）、核外輸送シグナル（例えば、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ核外輸送シグナル）、ミトコンドリア局在化シグナル、プラスチド局在化シグナル、細胞内局在化シグナル、膜ターゲティングシグナル（例えば、リーダーペプチド）、脂質化シグナル（例えば、ミリストイル化シグナル（コンセンサス配列：Ｍ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ）、パルミトイル化シグナル、プレニル化シグナル、イソプレニル化シグナル、不安定化デグロンシグナル（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｅｇｒｏｎｓ ｓｉｇｎａｌ）（例えば、ジェミニン破壊ボックスモチーフ）に融合される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、タンパク質結合シグナル、例えば二量体化または多量体化ドメイン、イントラボディ（例えば、抗ＳＵＮタグイントラボディ）、スプリットタンパク質の半分または生物学的テザリングドメイン（例えば、ＭＳ２、Ｃｓｙ４およびラムダＮタンパク質）に融合され得る。

本発明によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、１つまたはそれを超えるその断片から再構成され得る。好ましくは、それにより、インテインまたはタンパク質イントロンまたは二量体化ドメインは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ内に含められる（例えば、（Ｔｒｕｏｎｇら、２０１５））。好ましくは、このような断片は、例えば、（Ｔｒｕｏｎｇら、２０１５）に開示されているように、スプリットＣａｓ９のインテイン二量体化により、触媒的に活性なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質を再構成するように誘導され得る。

いくつかの実施形態では、再構成工程はインビトロで実施され得、他のいくつかの実施形態では、それはインビボで実施され得る（以下の参考文献を参照のこと）。好ましくは、このような断片は、例えば、（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５）および（Ｌｉｕら、２０１６）に開示されているように、スプリットＣａｓ９の二量体化により、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと同様にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを再構成するように誘導され得る。

本発明によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより標的とされるものとは異なるＰＡＭ配列を認識するように操作され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、弛緩したまたは新たなＰＡＭ配列を認識するように操作され得る。Ｃａｓ９バリアントは、米国特許出願公開第２０１６／０３１９２６０号に開示されているように、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されているアミノ酸配列の残基Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＱＶＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＶＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）で１つまたはそれを超えるさらなる変異を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、その特異性を改善する変異も有しながら、新たなまたは弛緩したＰＡＭ配列（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２に開示されているアミノ酸配列に対するＡ２６２Ｔ／Ｒ３２４Ｌ／Ｓ４０９Ｉ／Ｅ４８０Ｋ／Ｅ５４３Ｄ／Ｍ６９４Ｉ／Ｅ１２１９Ｖ変異）を認識するように改変され得る（例えば、（Ｈｕら、２０１８）に開示されているｘＣａｓ９−３．６またはｘＣａｓ９−３．７）。

本発明によれば、許容細胞の細胞質において転写されるｇＲＮＡと結合した異なるＰＡＭをターゲティングする当技術分野で公知の任意の他のＣａｓ９またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼバリアントが使用され得る。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、国際公開第２０１５／１９１９１１号に開示されているように膜またはエンドソームを標的とするように、本発明にしたがってさらに改変され得る。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、限定されないが、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む、ＤＮＡをターゲティングする異なるサブタイプおよびクラスのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼで置換され得る。好ましくは、これらのタイプＶ ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、（Ｓｈｍａｋｏｖら、２０１５）に開示されているＣｐｆ１ヌクレアーゼ（例えば、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１））である。

Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、（（Ｔａｋら、２０１７）に開示されているように）ＤＮＡ切断後に機能するように改変され得る。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼバリアントのいくつかの非限定的な例は、ＤＮＡニッカーゼを得るための変異Ｒ１２２６Ａ（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｕ２ＵＭＱ６に開示されているアミノ酸配列を参照）を含有するＡｓＣｐｆ１；ＤＮＡを切断することができないＬｂＣｐｆ１ Ｄ８３２Ａ／Ｅ９２５Ａ（ＰＤＢ ＩＤ ５ＩＤ６＿Ａに開示されているアミノ酸配列を参照）変異体；例えば（Ｔａｋら、２０１７）に開示されているように、Ｃａｓ９融合物と同様に触媒活性を有するまたは有しない他のポリペプチドとの融合物（例えば、ＶＰＲ、ＫＲＡＳ転写調節因子、ｐ３００アセチラーゼコア、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤなど）である。

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、（（Ｌ．Ｇａｏら、２０１７）に開示されているように）異なるＰＡＭを標的とし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼデッド操作バリアント（Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｄｅａｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）と同様にＤＮＡ切断後に機能する（例えば、アデニンまたはシチジンデアミナーゼなどの他のタンパク質ドメインと組み合わせて使用される）ように改変され得る。

本発明内において有用なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはまた、限定されないが、タイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導型ＲＮａｓｅ Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２として公知）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＣａｓ１３ｄ（Ｙａｎら、２０１８））、およびＲＮＡによりガイドされるアルゴノートヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｍａｒｉｎｉｔｏｇａ ｐｉｅｚｏｐｈｉｌａアルゴノートｇＲＮＡ（Ｌａｐｉｎａｉｔｅら、２０１８）、ＲＩＳＣ触媒成分Ａｇｏ２）を含む、ＲＮＡをターゲティングするＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより表される。

Ｃａｓ９について上述のように、ＲＮＡをターゲティングするＣａｓ１３またはＡｇｏ２ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、（（Ｃｏｘら、２０１７）に開示されているように）ＲＮＡ切断後に機能するように同様に改変され得る。

本発明によるｇＲＮＡ（複数可）およびＲＮＰ（複数可）を送達するためのビヒクル
前記ｇＲＮＡおよびＲＮＰの送達に適切なビヒクルは、本発明にしたがって、細胞による自発的にならびに／または内部および／もしくは外部刺激後に放出される細胞質由来構造である小胞である。

細胞から放出された小胞は、限定されないが、１０００〜５ｎｍの直径を有する、細胞から自然におよび／または人工的に放出された、脂質エンベロープにより囲まれた任意の膜形成小胞であり得る。細胞から放出された膜形成小胞の例は、エクソソーム、エンベロープウイルス（例えば、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ポックスウイルス科、レトロウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科，Ｄ型肝炎ウイルス）、ウイルス様粒子、内因性または祖先ウイルス様粒子、ミクロソーム、エンドソーム、ナノソーム、液胞（ｖａｑｕｏｌｅ）、多小胞体である。

好ましくは、小胞は、１０〜１０００ｎｍ、２０〜５００ｎｍ、４０〜４００ｎｍまたは７０〜３００、より好ましくは８０〜２００ｎｍのサイズを有するエクソソーム様粒子またはウイルス様粒子である。

本発明による小胞は、前記ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ関連ヌクレアーゼを含むように操作される。

本発明による小胞は、総小胞タンパク質量に対して少なくとも０．２％ｗ／ｗの量で小胞内に存在する少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を含有する。

本発明による小胞が少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼも含有する場合、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体形成し、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに対して０．８５：１〜１０：１の範囲のモル比で小胞内に存在する。

ＲＮＡを細胞質ゾルへと蓄積させる細胞質転写系
好ましくは、細胞質へのＲＮＡの直接発現のための転写系は、産生細胞の細胞質に対して外因性である。

これらの系としては、ミトコンドリア、他の真核生物に由来するＲＮＡポリメラーゼだけではなく、産生細胞の病原体または全く無関係の微生物のいずれかに由来し得るウイルスおよび細菌のＲＮＡポリメラーゼも挙げられる。

本発明の選択されるＲＮＡポリメラーゼは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓバクテリオファージｐｈｉＡ１１２２のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバクテリオファージｇｈ−１のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４のＲＮＡポリメラーゼ、ロゼオファージＳＩＯ１のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＹｅ０３−１２のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＫＭＶのＲＮＡポリメラーゼ、腸内細菌バクテリオファージＫ１−５のＲＮＡポリメラーゼ、ビブリオファージＶｐＶ２６２のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１４のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１２７のＲＮＡポリメラーゼおよびＢＡ１５６のＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアントから選択される。

本発明内において使用され得るＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの保存ドメインアーキテクチャ検索ツール（ＣＤＡＲＴ）プログラム（Ｇｅｅｒら、２００２）を使用して、またはモデル配列としてＴ７もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用する類似のもしくは他の予測プログラムにより同定され得る。この方法で同定された酵素の例としては、腸内細菌を含むＴ奇数番号バクテリオファージまたは関連ウイルスが挙げられる。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４のＲＮＡポリメラーゼおよびそれらのバリアントから選択される。より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼおよびそれらのバリアントから選択される。

いくつかの用途では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、発現系にいくつかの明らかな改変（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター配列の変更）を有する別のファージ由来ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）で置換され得る。

Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、それぞれ配列番号４０および４２を有する野生型Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％、好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、それぞれ配列番号４１および４３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

ファージポリメラーゼの変異体は、本発明にしたがって使用され得る。このような変異体は、改変プロモーターから転写する能力、および異なるヌクレオチドから転写する能力を有する（例えば、（Ｅｓｖｅｌｔら、２０１１）に開示されているカノニカルなＧＧまたはＧＧＧに代えてＧＡまたはＡＡから転写を開始するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）。

好ましくは、小胞への転写産物ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ−ヌクレアーゼＲＮＰの組み込みのための本発明の人工細胞質転写は、このような小胞が由来し得る真核細胞（ヒト、哺乳動物、昆虫、植物または酵母細胞）において実施される。しかしながら、本発明による細胞質転写はまた、原核細胞および古細菌細胞において達成され得る。より好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましくは、マウス、ハムスター、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞である。

注目すべきことに、本発明による小胞の産生細胞は、細胞質ゾルの転写系（例えば、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）により産生される転写産物の発現に寛容でなければならない。転写産物のこのような異所性産生は毒性であり得、産生細胞において、異所性転写ならびにさらには産生細胞における内因性転写および翻訳にとって有害な抗ウイルス細胞応答（例えば、インターフェロン応答）をトリガーし得る。実際、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、非自己特色を有する脱キャップ化５’三リン酸転写産物（例えば、５’二リン酸ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）を産生する。このような転写産物は、ほとんどの細胞タイプにおいて自然細胞性免疫により検出され、結果として非許容抗ウイルス状態を誘導し、さらなる細胞質転写を抑制し、いくつかのタンパク質の翻訳を遮断し、細胞の生理学的状態を大きく変化させる。抗ウイルス経路の１つまたはそれよりも多くが欠損した細胞のみをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは関連酵素と組み合わせて使用して、大量の目的の転写産物を哺乳動物または真核細胞の細胞質に蓄積させ得る。

上記を考慮して、本発明にしたがって有用なパッケージング細胞は、（ｉ）ＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＭＤＡ−５、ＩＰＳ−１、ＲＩＰＩ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＴＡＮＫ、ＮＡＰ、ＮＥＭＯ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩＫＫγ ＴＢＫ１、ＤＤＸ３、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ｐ６５、ｐ５０、ＲＩＰ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３、カスパーゼ−１から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／または（ｉｉ）キャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または（ｉｉｉ）５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力を特徴とする。好ましくは、パッケージング細胞は、（ｉ）ＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＭＤＡ−５、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／または（ｉｉ）キャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または（ｉｉｉ）５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力を特徴とする。より好ましくは、パッケージング細胞は、（ｉ）ＲＩＧ−Ｉ、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／または（ｉｉ）キャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または（ｉｉｉ）５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力を特徴とする。

これは、細胞質転写により産生されたＲＮＡおよびＲＮＰを含有する小胞の効率的な産生細胞として使用するために適切な細胞の必須要件である。これらのタンパク質が関与する経路に欠陥がある細胞であって、したがって、非自己細胞質ゾルの転写産物の蓄積により影響を受けないかまたは影響を受けにくい細胞の存在が当技術分野で公知である。

上記ＲＮＡウイルス感知経路の少なくとも１つが欠損する細胞の例は、ＢＨＫ２１、ＢＳＲ−Ｔ７／５、ＢＨＫ−Ｔ７（Ｅａｔｏｎら、２０１７）およびＶＥＲＯ細胞である。

これらの細胞は、細胞質転写系を安定発現または一過性発現するように改変され得る（Ｅａｔｏｎら、２０１７）。

本発明による小胞の産生細胞を得るための再現可能な方法は、当業者に公知の明白な分子生物学手順にしたがって、ＢＨＫ２１またはＶＥＲＯ細胞に、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼおよび必要に応じて選択可能マーカー（例えば、プロマイシン耐性またはＥＧＦＰ）をコードするプラスミドをトランスフェクトするか、またはそれらをコードするウイルスベクターを形質導入することである。

他の一般的な哺乳動物、ニワトリおよび昆虫細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｈｅｌａ、Ｕ２ＯＳ、ｉＰＳＣ、ＤＴ４０、Ｈｉｇｈ５、Ｓｆ９）は、（ｉ）（例えば、標的ヌクレアーゼを使用した）遺伝子ノックアウト、（ｉｉ）転写干渉（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、または（ｉｉｉ）非自己およびウイルス転写産物への反応に関与することが公知の上記経路およびタンパク質の薬理学的阻害（例えば、インターフェロン阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、ＩκＢ／ＩＫＫ阻害剤）により、効率的な細胞質転写に許容性であるように処理または改変され得る。昆虫細胞はいくつかの利点を示す。特に、それらは望ましくないヒトタンパク質を欠き、それらの培養は動物血清を必要としない。

細胞質ゾルにおいて１つまたはそれを超えるキャッピング酵素を発現するように産生細胞を操作することにより、上記ＲＮＡウイルス感知経路が欠損する許容細胞の要件を回避することも可能である。このようなキャッピング酵素は、細胞質ゾルの転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼに直接的または間接的に融合され得る。１つの非限定的な例は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとアフリカブタ熱ウイルスＮＰ８６８Ｒキャッピング酵素との融合物（Ｅａｔｏｎら、２０１７）である。別の非限定的な例は、キャッピングタンパク質を発現させるためのワクシニア感染の非存在下では低許容性の細胞においてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる細胞質ゾルのＲＮＡ転写を可能にするワクシニアウイルス酵素のキャッピング酵素活性（キャップ−０構造を形成するためのＤ１およびＤ１２、ならびにキャップ−１構造を形成するためのＶＰ３９）である（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ＆Ｍｏｓｓ ２００１；Ｆｕｃｈｓら、２０１６）。しかしながら、非許容細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３）では、非常に高レベルの効率的に５’キャップ化細胞質ゾルのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現転写産物を得ることは、細胞質において直接発現されたＲＮＡ上でキャップ−１構造を形成することができる酵素を有する生ワクシニアウイルスの感染を必要とする（Ｗｅｉ＆Ｍｏｓｓ １９７５）。

細胞質ゾルの転写に寛容な細胞はまた、５’−三リン酸細胞質ゾルの転写産物の脱リン酸化を実施する５’−ホスファターゼの発現により得られ得る。

小胞形成を刺激するための方法
小胞は細胞により自発的に放出されるが、しかしながら、この天然プロセスが産生する小胞力価は、通常、信頼性のある産業的利用にとっては非常に低い。

本発明による小胞の産生を人工的に増強して、本発明によるｇＲＮＡおよびＲＮＡ関連ヌクレアーゼを組み込んだ粒子をはるかに効率的に得ることができる。

小胞を放出するための細胞の刺激は、小胞内への少なくとも１つの膜結合タンパク質の組み込み、物理的方法および／または化合物から選択される小胞誘導手段を用いることにより実現され得る。

一実施形態によれば、既存の細胞放出小胞の形成の増加または新たな細胞放出小胞の産生の誘導は、少なくとも１つの膜結合タンパク質の発現により達成され得、少なくとも１つの膜結合タンパク質は、本明細書に開示される小胞産生方法のトランスフェクション工程ｉｉ）において使用される第２の発現カセットに含まれる第２のヌクレオチド配列によりコードされる。

第２の発現カセットによりコードされる少なくとも１つの膜結合タンパク質の非限定的なリストとしては、小胞形成に関与する細胞タンパク質（例えば、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ）；エンベロープウイルスのウイルス構造タンパク質（例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＡＬＶエンベロープ、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＨＩＶ ｇｐ１６０；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、細胞膜との相互作用を有するエンベロープウイルスのマトリックスタンパク質；エボラＶＰ４０、エボラ糖タンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−ｐｏｌレトロウイルスタンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−Ｐｏｌレンチウイルスタンパク質）；内因性または祖先レトロウイルス様タンパク質（Ａｒｃタンパク質、ＴＹ３／ジプシーレトロトランスポゾンｅｎｖタンパク質）；ウイルス非構造タンパク質（ＨＩＶ−１ Ｖｐｕ）；人工タンパク質（最小−Ｇａｇ（Ａｃｃｏｌａら、２０００）、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合物（Ｓｃｈｏｄｅｒｂｏｅｃｋら、２０１５））；上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／もしくはその細胞内ドメインおよび／もしくはその細胞外ドメインの一部、または標的細胞上の表面分子を認識することができる免疫グロブリン可変ドメイン由来の一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）もしくはタンパク質受容体もしくはタンパク質性リガンドが挙げられる。好ましくは、少なくとも１つの膜結合タンパク質は、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、エボラＶＰ４０エンベロープタンパク質、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープタンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質、上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／またはその細胞内ドメインおよび／またはその細胞外ドメインの一部から選択される。より好ましくは、少なくとも１つの膜結合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、エボラＶＰ４０エンベロープタンパク質、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープタンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質から選択され；さらにより好ましくは、少なくとも１つの膜結合タンパク質はＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質である。

加えて、いくつかの種類の細胞損傷化学的または物理的処理は、本発明によるｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをパッケージングするために使用され得る細胞からの細胞外小胞の放出をトリガーするために使用され得る。このような物理的および／または化学的方法の非限定的なリストとしては、光線力学的刺激（すなわち、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）ｍ−ＴＨＰＣ（５，１０，１５，２０−テトラ（３−ヒドロキシフェニル）クロリン）および（Ａｕｂｅｒｔｉｎら、２０１６）に記載されているものと同様の光刺激）、電離放射線、熱ストレス（Ｂｅｗｉｃｋｅ−Ｃｏｐｌｅｙら、２０１７）、培養条件、カルシウムおよび／または塩濃度の変更、ドキソルビシン（Ａｕｂｅｒｔｉｎら、２０１６）、シスプラチン（Ｓａｍｕｅｌら、２０１８）が挙げられる。

本発明による小胞におけるｇＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ／ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体のローディングを富化するための方法。

本発明によるｇＲＮＡは、原形質膜に近接した、またはゴルジ、ＥＲ、核、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、エンドソーム膜（これらの場所では、細胞により放出される小胞が頻繁に形成される）に近接した細胞質ゾルにおいて局所的に富化され得る場合、より効率的に細胞放出小胞にパッケージされ得る。

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、本発明にしたがってｇＲＮＡ分子を捕捉するように、および細胞質ゾルの細胞内区画または領域におけるそれらの相対存在量を富化するように操作され得る。当技術分野では、細胞膜の近くのタンパク質局在性を富化するための方法が記載されている（例えば、国際公開第２０１５／１９１９１１号を参照のこと）。このような方法としては、膜ターゲティングまたは膜親和性シグナル（すなわち、１つまたはそれを超えるファルネシル化および／またはミリストイル化シグナル、１つまたはそれを超える膜貫通ドメインまたはエンドソームとの直接融合）の使用が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、とりわけ国際公開第２０１５／１９１９１１号に開示されているように膜貫通ドメインまたはエンドソームを標的とするように改変され得る。

タンパク質がｇＲＮＡに結合する場合、それは、小胞へのｇＲＮＡローディングを増加させるために使用され得る。ｇＲＮＡと膜ターゲティングタンパク質との間の相互作用は直接的であり得るか、またはタンパク質担体もしくは因子により媒介され得る（すなわち、国際公開第２０１４２００６５９号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７２００号に記載されている方法）。

小胞の精製および富化
本発明による小胞は、精製後に、または産生細胞と標的細胞との共培養により投与され得る（小胞の通過を可能にするために選択的サイズ排除膜と接触されるかまたはそれにより分離される）。加えて、小胞産生細胞をヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、魚類生物に移植して、小胞をインビボで直接放出させ得る。

精製工程は、結果のセクションに非限定的に記載されている。細胞放出小胞およびウイルスの富化のためのいくつかの公開されているプロトコールは、小胞精製に適用され得る：すなわち、０．４５または０．２２ｕｍ細孔フィルタによる濾過、小胞表面上に存在するアフィニティータグまたはタンパク質（ビオチン−ストレプトアビジン、Ａｇ−ｍＡｂ）の使用、スクロースクッション（すなわち、２０％スクロース、１０％スクロース、５％スクロース）の非存在下または存在下における遠心分離、スクロース勾配（５〜６０％、１０〜６０％、２０〜６０％）、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ６０００）の使用。

細胞ターゲティングおよび融合特性
本発明による小胞の細胞ターゲティングおよび／または融合は、上記「小胞形成を刺激するための方法」のセクションで論考されているように、小胞内に少なくとも１つの膜結合タンパク質を組み込むことにより達成され得る。

小胞の細胞ターゲティングおよび／または融合特性（すなわち、小胞指向性および細胞融合特性）を増加させるために、小胞は、少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質を含有し得る。このような少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質は、本明細書に開示される小胞産生方法のトランスフェクション工程ｉｉ）において使用されるさらなる発現カセットにより発現される。さらなる発現カセットは、少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列を含有するが、ただし、このような少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質は、第２の発現カセットに含まれる第２のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つの膜結合タンパク質とは異なる。

少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質は、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＶＳＶ−Ｇ、ＡＬＶエンベロープ、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４から選択される。小胞を目的の標的細胞に誘導するために適切なさらなる膜結合タンパク質は、膜受容体および／またはリガンド（例えば、ＴＣＲ−アルファ、ＣＤ４、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ）、細胞膜に直接的または間接的に連結された標的細胞上の表面分子を認識する抗体の可変ドメインおよび／または全長抗体（すなわち、単一特異性および二重特異性抗体、ＳＩＰ、ミニボディ、ナノボディ、重鎖抗体、単一ドメイン抗体）である。好ましくは、少なくとも１つのさらなる膜結合タンパク質は、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＶＳＶ−Ｇ、ＡＬＶエンベロープ、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＴＣＲ−アルファ、ＣＤ４、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩから選択される。

本発明による小胞の出芽、ターゲティングおよび融合活性は、単一（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ）または複数の異なるタンパク質の活性（すなわち、天然または人工シュードタイプウイルスおよびベクターを模倣する）から生じ得る。

本発明による小胞は、送達されるｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＲＮＰが生物学的効果を有し得る事実上任意の細胞をターゲティングし得る。好ましくは、このような効果は、標的細胞に存在する核酸の結合および／または切断を伴う。

好ましい実施形態
以下では、本説明の好ましい実施形態についての論考が提供され、小胞（ＶＥｓｉＣａｓと命名される）は、小胞エンベロープを構成する膜結合タンパク質としてＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分を送達することができる。このようなデータは、係属中の一群の特許請求の範囲において特許請求されている本発明の実際の範囲に関して限定するものではない。

本発明者らは、ＳｐＣａｓ９と組み合わせてＶＳＶ−Ｇタンパク質を組み込んだ小胞に、ＳｐＣａｓ９タンパク質が十分にロードされたことを発見した。しかしながら、ｓｇＲＮＡ合成のための核Ｕ６ベースの転写を使用して標準的な実験条件下で産生された小胞は低いゲノム編集活性を示したが、これは、組み込まれたｓｇＲＮＡの量が不十分であることを示唆している。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより駆動される細胞質ｓｇＲＮＡ合成により産生細胞におけるｓｇＲＮＡとのＳｐＣａｓ９タンパク質集合を促すことにより、この制限を回避した。この目的のために、本発明者らは、高レベルの脱キャップ化５’−三リン酸細胞質ＲＮＡであるＢＳＲ−Ｔ７／５（Ｈａｂｊａｎら、２００８）により誘導される細胞毒性に対して耐性の細胞を用いた。この細胞株は、ＲＮＡ感知ＲＩＧ−Ｉ経路が欠損しているのでインターフェロン活性化をもたらし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するように安定的にトランスフェクトされる。

ＶＥｓｉＣａｓアプローチにより提供される顕著な利点は、送達されるＳｐＣａｓ９の一過性的性質である。この研究で実証されているように、ＶＥｓｉＣａｓ処理の１２時間後すぐに減少したＳｐＣａｓ９の迅速なクリアランスは、ゲノム編集に関連するオフターゲット活性を大きく低下させたが、対照的に、プラスミドトランスフェクトしたＳｐＣａｓ９により生成された非特異的切断は高レベルであった。本データはまた、Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体の送達において、ＶＥｓｉＣａｓがエレクトロポレーションよりも効率的であることを証明している。実際、本系は、必要とするＳｐＣａｓ９タンパク質が少ないので、編集された細胞に対する免疫反応の潜在的な有害効果の防止において明らかな利点を提供する（Ｃｈｅｗら、２０１６）。最後に、ＶＥｓｉＣａｓは、ｓｇＲＮＡペアの組み込みを必要とするより複雑なゲノム編集アプローチ、例えばＣａｓ９ニッカーゼの使用に容易に適合され得る（Ｋｏｍｏｒら、２０１７）。

全体として、ＶＥｓｉＣａｓアプローチによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の効率的かつ無痕跡な送達は、より安全なインビボゲノム編集へのさらなる進歩に相当する。

結果
ＶＳＶ−ＧエンベロープＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ小胞ＶＥｓｉＣａｓの設計および開発
ＶＳＶ−Ｇ誘導小胞は、さらなるウイルス成分の非存在下でタンパク質輸送を媒介することが報告された（Ｍａｎｇｅｏｔら、２０１１）。本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ小胞をＳｐＣａｓ９およびｓｇＲＮＡのＤＮＡフリー送達に適合させ得るかを試験した。ＳｐＣａｓ９およびＥＧＦＰコード配列へ向かうｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＳＶ−Ｇと一緒に発現させ、派生馴化清澄化培地（ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｃｌａｒｉｆｉｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を蛍光レポーター細胞株ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰに適用した。これらの条件では、ＥＧＦＰの発現はほとんど変化せず、ゲノム編集が非効率的であることが示されたが、ｓｇＲＮＡと一緒にＳｐＣａｓ９をトランスフェクトすることにより効率的な編集が観察された（図１ａ）。小胞および標的細胞は両方ともＳｐＣａｓ９陽性であったので、限定的な編集活性は、送達されたタンパク質の欠如によって説明されなかった（図２ａ）。これらの結果から、本発明者らは、小胞活性に対する制限要因が、組み込まれたｓｇＲＮＡの不十分な量であり得るかどうかを評価した。この目的のために、ＳｐＣａｓ９を保有するＶＳＶ−Ｇ小胞による処理の前に、ｓｇＥＧＦＰ５を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ標的細胞にトランスフェクトした。これらの実験条件では、本発明者らは、ＳｐＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞において観察されたものに近い編集レベルを得た（図１ａ、グラフの６列目および２列目の比較）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９／ＶＳＶ−Ｇ調製物を用いて観察された限定的な編集が、ｓｇＲＮＡの非効率的な送達によるものであったことを明らかに示唆していた。本発明者らは、不十分なｓｇＲＮＡ送達が、小胞産生の間のＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の非効率的な形成によるものであり得ると推測した。特に、核におけるＰｏｌ ＩＩＩ合成ｓｇＲＮＡは細胞質ＳｐＣａｓ９と不十分に結合して、新生ＶＳＶ−Ｇ小胞に近い細胞周辺でＲＮＰを形成する可能性がある。この仮説を試験するために、本発明者らは、細胞質におけるＲＮＡ合成を触媒するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ駆動転写系（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、１９９９；Ｈａｂｊａｎら、２００８）を用いた（図１ｂに図式化されている）。ｓｇＲＮＡをＴ７プロモーターの下流にクローニングし、５’ＨＤＶリボザイムをｓｇＲＮＡコード配列とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターとの間に導入して、未改変３’定常領域を有する成熟ｓｇＲＮＡの形成を誘導した（Ｎｉｓｓｉｍら、２０１４）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定発現し、この転写系により生成された高レベルの脱キャップ化５’−三リン酸細胞質ＲＮＡにより誘導される毒性に対して耐性の細胞株において、ＶＳＶ−ＧエンベロープＳｐＣａｓ９小胞を産生した（Ｈａｂｊａｎら、２００８；Ｄ．−Ｈ．Ｋｉｍら、２００４；Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、２００６）（図２ｂ）。ｓｇＥＧＦＰ５を発現するＢＳＲ−Ｔ７／５細胞において産生された派生ＶＳＶ−ＧエンベロープＳｐＣａｓ９小胞ＶＥｓｉＣａｓを、ＳｐＣａｓ９組み込みについて検証した（図２ｃ）。これらのＶＥｓｉＣａｓは、ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞においてＥＧＦＰ蛍光の少なくとも５０％の喪失を誘導したので、ｓｇＥＧＦＰ５をプレトランスフェクトした細胞のＶＳＶ−Ｇ／ＳｐＣａｓ９小胞処理を用いて観察されたノックアウトと非常に類似する（図１ｃ）。次いで、両遺伝子座にｉｎｄｅｌを生成する、Ｃａｓ９を伴うゲノム編集実験におけるベンチマークとして一般に使用される２つのゲノム遺伝子座ＣＸＣＲ４およびＶＥＧＦＡに対して、ＶＥｓｉＣａｓを試験した（図１ｄ、ｅ）。

また、レンチウイルスベースのウイルス様粒子（ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰ）を使用して、ＳｐＣａｓ９偽形質導入を試験した。ＨＩＶ−１ Ｇａｇドメインまたはその低減部分（最小Ｇａｇ）は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成することが報告されており、タンパク質カーゴをレシピエント細胞に効率的に輸送すると記載されている（Ａｃｃｏｌａら、２０００）。Ｇａｇまたは最小Ｇａｇに融合したＳｐＣａｓ９は、ＥＧＦＰ遺伝子座に対するゲノム編集活性において機能的に活性であった（図３ａ〜ｃ）。２つのＳｐＣａｓ９キメラを使用して、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞においてレンチウイルスベースのＶＬＰ（ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰ）を産生し、これが、ＥＧＦＰ、ＣＸＣＲ４およびＶＥＧＦＡ遺伝子座において高い割合のｉｎｄｅｌを産生した（図３ｄ〜ｇ）。しかしながら、ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰを用いてゲノム編集の劇的な改善は得られなかったので、以下では、ＶＳＶ−Ｇウイルスエレメントのみを保有するＶＥｓｉＣａを使用した。

全体として、本発明者らのデータは、ＶＥｓｉＣａｓが、ウイルス起源のコードＤＮＡまたはさらなるエレメントを含まないＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ ＲＮＰを効率的に送達することを明らかに示した。非常に効率的なゲノム編集粒子を得るための重要な要因は、産生細胞の核から細胞質へのｓｇＲＮＡ発現の再配置であり、これは、細胞質Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより適切な許容細胞において得られた。

多重化ＶＥｓｉＣａｓ
標的ゲノム欠失などのゲノム編集用途は、１つを超えるｓｇＲＮＡの同時送達を必要とし得るので、本発明者らは、複数のガイドをＶＥｓｉＣａｓに組み込む可能性を評価した（Ｍｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓ）。２つのＴ７駆動ＥＧＦＰターゲティングｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５およびｓｇＥＧＦＰＢｉ）を発現するＢＳＲ−Ｔ７／５細胞において、Ｍｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓが産生された。両ターゲティングｓｇＲＮＡを保有するＭｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓと共にＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰレポーター細胞をインキュベートすることにより、約１７％の効率でＥＧＦＰ遺伝子座において予想された欠失が生成したが、これは、ＳｐＣａｓ９および対応するｓｇＲＮＡをコードするプラスミドの一過性トランスフェクションを用いて得られたものと同様であった（約１４％）（図４ａ）。反対に、それぞれ個々のｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５またはｓｇＥＧＦＰＢｉのいずれか）を保有するＶＥｓｉＣａは、いかなる検出可能な欠失も標的遺伝子座にもたらすことができなかった（図４ａ）。ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９−ｎ、Ｄ１０Ａ変異体）（Ｒａｎら、２０１３）を組み込んで、ＥＧＦＰコード配列をターゲティングする２つの密接に配置したガイドを保有するＶＥｓｉＣａｓ−ｎを生成することにより、ＶＥｓｉＣａｓ送達プラットフォームの柔軟性をさらに実証した。個々のｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰＢｉまたはｓｇＥＧＦＰ３ｇＷ）を用いて、または組み合わせのｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰＢｉおよびｓｇＥＧＦＰ３ｇＷ）を用いて、ＶＥｓｉＣａｓ−ｎを調製した。両ｓｇＲＮＡを保有するＶＥｓｉＣａｓ−ｎによるＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞の処理は、蛍光細胞の数のロバストな減少をもたらしたのに対して（５０％）、個々のｓｇＲＮＡを送達するＶＥｓｉＣａｓ−ｎは、予想どおり、ＥＧＦＰ発現をダウンレギュレートしなかった（図４ｂ）。これらのデータは、ＶＥｓｉＣａｓにより、１つより多くのｓｇＲＮＡを同時に送達し得ることを示しているので、欠失を生成してＳｐＣａｓ９ニッカーゼを送達するそれらの適用性を実証している。

細胞およびインビボにおけるＶＥｓｉＣａｓ編集効率
ＶＥｓｉＣａｓの量の増加は、編集活性の比例的な増加をもたらした（図５）。また、ゲノム編集のためにＣａｓ９を細胞に送達するために頻繁に使用されるエレクトロポレーションプロトコールとの並行比較は、ＶＥｓｉＣａｓがより効率的であることを明らかにした。実際、同様の割合のＥＧＦＰノックアウト細胞を得るために必要であったＶＥｓｉＣａｓを介して送達されたＳｐＣａｓ９の量は、エレクトロポレーションと比較して少なかった（図５）。接着細胞（ＨｅＬａ）、懸濁細胞（Ｊ−Ｌａｔ−Ａ１）を含む異なる細胞株において、およびＥＧＦＰを発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において、ＶＥｓｉＣａｓの有効性を試験したところ、すべての試験モデルにおいて蛍光細胞の数のロバストな減少が示された（図６および図７ａ）。最後に、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの心筋において、ＶＥｓｉＣａｓを試験した。ＶＥｓｉＣａｓを５日齢のマウスの心臓に注射し、処置の１０日後にＥＧＦＰ蛍光のレベルについて分析した。α−アクチニンに対する抗体を使用して処置動物の心臓組織を染色して、心筋細胞におけるＥＧＦＰ蛍光を特異的に評価した。図７ｂに示されているように、ＶＥｓｉＣａｓ注射部位の近くにおいて、広範囲の非蛍光心筋細胞が観察された（ＥＧＦＰ陰性細胞の約３０％）。

これらのデータは、ＶＥｓｉＣａｓが、培養細胞およびインビボにおけるゲノム編集のためにＳｐＣａｓ９ＲＮＰを送達するための効率的なツールであることを示している。

ＶＥｓｉＣａｓにより送達されるＳｐＣａｓ９による限定的なオフターゲット活性
Ｃａｓ９により産生されるオフターゲット活性は依然として、その治療用途の主な制限の１つである。標的細胞におけるヌクレアーゼの一過性発現は、非特異的切断を制限することが示されている（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７；Ｓ．Ｋｉｍら、２０１４）。この点に対処するために、トランスフェクトしたプラスミドにより発現されるヌクレアーゼの量と比較して、ＶＥｓｉＣａｓにより送達されるＳｐＣａｓ９細胞内レベルの動態を調べた。ＶＥｓｉＣａｓ由来のＳｐＣａｓ９は、形質導入の６時間後に標的細胞において検出され、その後１８時間以内に徐々に消失した（図８ａ）。反対に、発現プラスミドにより産生されたヌクレアーゼ細胞内レベルは、トランスフェクションの１２時間後に明らかに検出され、その後次第に蓄積した（図８ａ）。ＶＥｓｉＣａｓによりまたはトランスフェクションにより送達されたＳｐＣａｓ９により生成されたオフターゲット活性の程度を評価するために、ＶＥＧＦＡ遺伝子座の編集に関連する２つの以前に検証されたオフターゲット部位（ＶＥＧＦＡ ＯＴ１およびＯＴ３）において、ｉｎｄｅｌ形成を測定した（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）。分解によるｉｎｄｅｌの追跡（ＴＩＤＥ）分析（Ｂｒｉｎｋｍａｎら、２０１４）は、ＶＥｓｉＣａｓにより送達されたＳｐＣａｓ９が、両オフターゲット部位においてバックグラウンドレベルのｉｎｄｅｌを引き起こしながら、トランスフェクトしたＳｐＣａｓ９よりも高いレベルのオンターゲット活性を産生したことを明らかにした（図８ｂ）。驚くべきことに、ＶＥｓｉＣａｓは、オンターゲット切断と比べてそれぞれＯＴ１およびＯＴ３において少なくとも１７倍および２２倍少ないｉｎｄｅｌを産生したが、トランスフェクトしたＳｐＣａｓ９は、オンターゲット部位と同様にＯＴ１を切断し、ＯＴ３は、意図した標的のわずか５分の１に編集された。ゲノムワイドなアプローチであるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（Ｔｓａｉら、２０１４）により、ＶＥＧＦＡ遺伝子座のより深いオフターゲット分析を実施した（図８ｃ）。分析は、ＶＥｓｉＣａｓ形質導入細胞では、オンターゲットよりも数百個少ないＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリードを有する１つのみのオフターゲット部位が見られ得ることを明らかにした（オンターゲットで３５５個のリードおよびオフターゲットで１１個のリード）。対照的に、トランスフェクトしたプラスミドから発現されたＳｐＣａｓ９は、このオンターゲット部位および関連オフターゲット部位を同様の効率で切断した（２５３個のオンターゲットおよび２９１個のオフターゲットＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリード）。また、トランスフェクトしたプラスミドから発現されたＳｐＣａｓ９は、オンターゲットを用いて得られたものよりも多数のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリード（４１７〜１０２６個）を特徴とする４つのさらなるオフターゲット部位を生成した。

結論として、ＳｐＣａｓ９特異性の評価の絶対的基準であるＶＥＧＦＡ遺伝子座に対して実施したオフターゲット分析は、ＶＥｓｉＣａｓが、標的細胞からのヌクレアーゼの迅速なクリアランスと相関するより特異的なゲノム改変をもたらしたことを明らかにした。

遺伝子発現のＶＥｓｉＣａｓ活性化因子。
遺伝子発現の無痕跡調節は、インビトロ基礎研究からインビボ疾患処置までのいくつかの目的にとって望ましいものであり得る。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、特にデッドＳｐＣａｓ９（ｄＳｐＣａｓ９）と、転写活性化因子、抑制因子またはクロマチン改変因子（例えば、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＫＲＡＢ、ｐ３００）とのいくつかの異なる融合物を用いて、遺伝子発現を人工的に制御した（Ｖｏｒａら、２０１６；Ｙ．Ｇａｏら、２０１６）。このような技術をＶＥｓｉＣａｓに含めることの実現可能性を実証するために、ｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４転写活性化因子およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＢＳＲ−Ｔ７／５細胞の上清から粒子を精製した。ＶＥｓｉＣａｓ活性化因子での形質導入の前に、最小ＣＭＶプロモーターの制御下のＥＧＦＰ遺伝子をコードするモデルプラスミドを標的細胞にトランスフェクトした（これは、さらなる転写因子が近隣配列のプロモーターに結合する場合にのみＥＧＦＰを発現する）。図９に示されているように、ｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４と、プロモーター配列（ｓｇＴｅｔＯ）の近くをターゲティングするｓｇＲＮＡとを含有するＶＥｓｉＣａｓ−活性化因子は、細胞の７％においてレポーターモデルからのＥＧＦＰ発現をアップレギュレートしたが、非ターゲティング（ｓｇＣｔｒ）ＶＥｓｉＣａｓ活性化因子による処理後に、ＥＧＦＰ陽性細胞は観察されなかった。このデータは、遺伝子調節の目的で、ｄＳｐＣａｓ９融合タンパク質およびｓｇＲＮＡにより形成されたＲＮＰのＶＥｓｉＣａｓによる送達の可能性を明らかに示している。

ＲＮＡのＶＥｓｉＣａｓ送達。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより細胞質において高発現されるＲＮＡは、ＶＥｓｉＣａｓにパッケージングすることができるはずである。実際、Ｃａｓ９分子の存在は、ＶＥｓｉＣａｓによるｓｇＲＮＡ送達に必要とされなかった。図１０では、ＥＧＦＰ陽性標的細胞にＳｐＣａｓ９プラスミドをプレトランスフェクトし、続いて、ＳｐＣａｓ９ではなくｓｇＲＮＡを発現する産生細胞から収集したＶＥｓｉＣａｓを形質導入した。予想どおり、ＳｐＣａｓ９トランスフェクト細胞は、ターゲティングｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰＢｉ）を形質導入した場合には、ゲノム編集によりＥＧＦＰ陰性細胞の数のロバストな増加（１８％）を有していたが、対照処理サンプル（ｓｇＣｔｒ）では、ほぼバックグラウンドレベルの非蛍光細胞（４％）が観察された。これらのデータは、ＳＰＣａｓ９の存在により、ＲＮＡ、特にｓｇＲＮＡが独立してＶＥｓｉＣａｓによりパッケージされかつ送達され得、標的細胞への所望の活性を有し得ることを示している。

ミリスチル化ＳｐＣａｓ９を組み込んだＶＥｓｉＣａｓの編集活性
ＶＥｓｉＣａｓによるヌクレアーゼ組み込みをさらに増加させるために、本発明者らは、タンパク質のミリスチル化により原形質膜へのＳｐＣａｓ９結合を誘導する可能性を評価した。この目的のために、本発明者らは、ＨＩＶ−１マトリックスのミリスチル化シグナル（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｉｎｉａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４ Ｏｃｔ；６８（１０）：６６４４−６６５４；Ｕｎｉｐｒｏｔ ＫＢ ＩＤ Ｐ０４５９１）をＳｐＣａｓ９のＮ末端に融合し、この構築物を使用して、ＶＥｓｉＣａｓ（ｍｙｒ−ＶＥｓｉＣａｓ）を産生させた。次いで、本発明者らは、ＨＥＫ２９３−ＧＦＰにおけるＥＧＦＰ遺伝子座をターゲティングし、２７．６％のＥＧＦＰ陰性細胞を得ることにより、編集効率を測定した（図１１）。これらのデータは、Ｎ末端ミリスチル化シグナルに融合したＳｐＣａｓ９が触媒的に活性であり、ＶＥｓｉＣａｓに正しく組み込まれ、標的細胞においてゲノム改変を誘導することができることを実証している。

材料および方法
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド。ＶＳＶ−Ｇ小胞産生の初期実験に使用した、Ｕ６プロモーターからｓｇＲＮＡを転写するｐＵＣ１９ ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、以前に公開されたものであった（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）。Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９（配列番号４７）は、Ｇａｇコード配列と、以前に公開されたｐＸ−ＳｐＣａｓ９プラスミド（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）によりコードされる３ＸＦＬＡＧ−ＳｐＣａｓ９との融合により得た。ｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４は、以前に公開されたｐｃＤＮＡ−ｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら、２０１３）から発現させた。ｐＴＲＥ−ＥＧＦＰは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の断片ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩをｐＴＲＥ−ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングすることにより得た。

ｐＸ−ＳｐＣａｓ９由来のＳｐＣａｓ９コード配列と、以前に公開されたプラスミドΔ−Ｚｗｔ−ｐ２ｂ（Ａｃｃｏｌａら、２０００）由来の最小Ｇａｇとをサブクローニングすることにより、ｐＣＤＮＡ３において最小Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９（配列番号４８）をアセンブルした。その後、部位特異的変異誘発によりｐＸ−Ｃａｓ９由来のリンカーペプチド中のメチオニン（配列番号４９の位置５１７および配列番号５０の位置１６４）を除去することにより、両構築物の追加バージョンを得た（これは、非融合ＳｐＣａｓ９産生をもたらす）（図３）。

ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞におけるＶＬＰおよびＶＥｓｉＣａｓ産生のために、Ｔ７プロモーター駆動カセットを有するｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡ発現プラスミドからｓｇＲＮＡを転写し、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位を使用してｐＶＡＸプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。配列番号５１は、ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡプラスミドを得るためにＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位を使用してｐＶＡＸプラスミドに挿入した転写ユニットを表す。ｓｇＲＮＡ定常部分の前に挿入した二重ＢｓｍＢＩ部位を使用して、ｓｇＲＮＡオリゴをｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡにクローニングした（ｓｇＲＮＡをクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドのリストは表１に提供されている）。
表１．ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡ発現プラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチドの配列および相対的な標的部位の配列

（＊）小文字は、ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡプラスミドへのクローニングに使用した付着末端を示す。
（＊＊）ミスマッチおよびＰＡＭは太字である。標的部位周辺のコンテキスト配列は小文字である。

ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡは、Ｔ７ターミネーター（配列番号５１のヌクレオチド２６６〜３６４）を含有するｓｇＲＮＡの３’末端およびリボザイムそれ自体を切断するように設計された５’ＨＤＶリボザイム（配列番号５１のヌクレオチド１３２〜２１９）（Ｎｉｓｓｉｍら、２０１４）を含んでいた。Ｄ１０Ａ変異をＳｐＣａｓ９コード配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２）に挿入することにより、Ｃａｓ９−ニッカーゼ構築物を得た。プライマーＴ７ ｆｗ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２１）およびＴ７ ｒｅｖ−ＸｂａＩ（配列番号２２）を使用して、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞のゲノムからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼコード配列（配列番号４０）を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位を使用してＥＧＦＰに代えてｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングして、ｐＫＡＮＡ−Ｔ７−ＲＮＡ−Ｐｏｌプラスミドを得た。サンガーシークエンシングにより、プラスミドを検証した。

細胞培養およびトランスフェクション。（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、１９９９）に開示されているように、Ｔ７ポリメラーゼを安定発現するＢＨＫ２１由来産生細胞（ＢＳＲ−Ｔ７／５）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ構築物を保持する細胞を選択するために、１継代おきに培地に１μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手した。ｐＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−プロマイシンプラスミド（Ｐｕｒｏｍｉｃｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ）（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）の安定トランスフェクションによりＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞を生成し、１μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて選択した。ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−８１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２）およびすべての上記細胞株を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｊ−Ｌａｔ−Ａ１は、ＥＧＦＰをコードするＨＩＶ−１ベクターにより潜在的に形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｏｒｄａｎら、２００３）である。Ｊ−Ｌａｔ−Ａ１を、１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質を補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。１０ｎＭ ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）処理を用いて、ＥＧＦＰ発現を２４時間誘導した。ＨｅＬａ−ＥＧＦＰを得るために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培養培地における約１０日間の選択の後、高レベルのＥＧＦＰを発現する細胞をＦＡＣＳ選別により富化し、多クローン性細胞集団として繁殖させた。ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞（約９５％のＥＧＦＰ陽性細胞）のストック培養物を、２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補充した培養培地中で維持した。ＥＢＮＡベースのエピソーム系を使用して、ＣＤ３４＋臍帯血に元々由来する市販のヒトエピソームｉＰＳＣ株（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から、ＧＦＰを構成的に発現するトランスジェニックヒトｉＰＳＣを得た。ｐＧＺ−ＣＭＶ−ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の感染により、ユビキタスサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でｃｏｐＧＦＰを安定発現するヒトｉＰＳＣクローンを生成した。感染の７２時間後に、ゼオシンベースのクローン選択を７日間開始した。耐性コロニーを手作業で採集し、クローン拡大し、それらの多能性能力について特徴付けた。フィーダーフリーＧｅｌｔｒｅｘコートディッシュ上でヒトｉＰＳＣ株を成長させ、ＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ ＸＦ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養した。すべての細胞株がマイコプラズマフリーであることを検証した（ＰｌａｓｍｏＴｅｓｔ，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。

製造業者の指示にしたがってＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）試薬を使用して、２５０〜１０００ｎｇの各プラスミドを含む１２〜２４マルチウェルプレートでトランスフェクション実験を実施した。トランスフェクションの２〜４日後に、または記載されているように、細胞を収集した。

ＶＳＶ−Ｇ／ＳｐＣａｓ９小胞、ｌｅｎｔｉ−ＶＬＰおよびＶＥｓｉＣａｓの産生。ＶＳＶ−Ｇ／Ｃａｓ９小胞の産生については、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法（Ｃａｓｉｎｉら、２０１５）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコンフルエントな１００ｍｍディッシュに、１５μｇのｐｘＣａｓ９、Ｇａｇ−ＳｐＣａｓ９またはｐＣＤＮＡ３−ＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９、１５μｇの所望のｐＵＣ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡおよび３μｇのＶＳＶ−Ｇプラスミドをトランスフェクトした。ＲＮＡガイド発現のためにｐＵＣ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡをｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡプラスミドに置き換えた以外は上記に報告されている条件を使用して、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞において、その後の産生を実施した。欠失実験中のＭｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓについては、ＥＧＦＰをターゲティングする７．５μｇの各ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ５およびｓｇＥＧＦＰＢｉ）を使用した。ＶＥｓｉＣａｓ−ｎの産生については、１５μｇのＣａｓ９−ニッカーゼプラスミドならびに７．５μｇの各ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＥＧＦＰＢｉおよびｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＥＧＦＰ３ｇＷを使用した。ＶＥｓｉＣａｓ転写調節因子については、１５μｇのｐｃＤＮＡ−ｄＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４および１５μｇの対照（ｓｇＣｔｒ）またはプロモーターターゲティング（ｓｇＴｅｔＯ）ｐＶＡＸ−Ｔ７プラスミド発現ｓｇＲＮＡをＢＳＲ−Ｔ７／５細胞にトランスフェクトした。ＳｐＣａｓ９なしでＲＮＡ分子を送達するＶＥｓｉＣａｓについては、示されているｓｇＲＮＡを発現する１５μｇのｐＶＡＸプラスミドのみを細胞にトランスフェクトした。１２時間のインキュベーションの後、培地を新鮮完全ＤＭＥＭと交換し、４８時間後に上清を収集し、４００×ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍ ＰＥＳフィルタで濾過した。次いで、ＶＬＰおよびＶＥｓｉＣａを富化し、１５００００×ｇ（４℃）における２時間の超遠心分離により２０％スクロースクッションで精製し、マウス注射のために適切な量の完全培地（標的細胞に応じてＤＭＥＭ、ＲＰＭＩまたはＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ ＸＦ培地）または１×ＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。標準として精製ＳｐＣａｓ９を使用してウエスタンブロット分析により、ＶＳＶ−Ｇ小胞中に産生されたＳｐＣａｓ９またはＧａｇ−ＳｐＣａｓ９およびＭｉｎＧａｇ−ＳｐＣａｓ９キメラの量を評価した。特に指示がない限り、各単一形質導入実験については、約１μｇのＳｐＣａｓ９を含有する小胞を使用した。（Ｇａｇｎｏｎら、２０１４）にしたがって細菌において参照組換えＳｐＣａｓ９タンパク質を産生し（以下を参照のこと）、クーマシー染色により定量した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により定量したＶＥｓｉＣａｓ調製物中のタンパク質の総量に対する標準として既知濃度の組換えタンパク質を使用してウエスタンブロットにより測定したＳｐＣａｓ９組み込み量を計算することにより、ＶＥｓｉＣａｓへのＳｐＣａｓ９組み込みの効率を取得した。最適化ｓｇＲＮＡ足場のためのフォワードプライマー５’−ＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号５２）（ｇＲＮＡ ｆｏｒ）およびリバースプライマー５’−ＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡ−３’（配列番号５３）（ｇＲＮＡ ｒｅｖ）ならびに標準的なｓｇＲＮＡ足場のためのフォワードプライマー５’−ＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号５４）（ｇＲＮＡｏｐｔ ｆｏｒ）およびリバースプライマー５’−ＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡ−３’（配列番号５５）（ｇＲＮＡｏｐｔ ｒｅｖ）（Ｚｈａｎｇら、２０１６）を使用して標準的なｑＲＴ−ＰＣＲ手順により、ｇＲＮＡ組み込みの効率を評価した。両ｓｇＲＮＡ構成について、リバースプライマーは共通であることに留意する。

標的細胞における送達。形質導入の前日に、１×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ、ＨｅＬａ−ＥＧＦＰまたはＪ−ＬＡＴ−Ａ１を２４ウェルプレートに播種した。１６００×ｇ、２０℃で２時間（ヒトｉＰＳＣについては１０００×ｇおよび２４℃で３０分間）スピノキュレートし、続いて、３７℃で一晩インキュベートすることにより、ＶＥｓｉＣａｓおよびＶＬＰを標的細胞に送達した。ＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によりＪ−Ｌａｔ−Ａ１細胞を誘導し、最後の形質導入の３日後にゲノム編集について、または処理の少なくとも７日後にＥＧＦＰ減少について分析した。ＶＥＧＦＡおよびＣＸＣＲ４遺伝子座については、三重形質導入実験を実施した。各形質導入の２４時間後に細胞をトリプシン処理し；ゲノム分析のために細胞の２／３を収集し、次の処理のために１／３を４８時間毎に１回継代培養した。最後の処理の３日後に、最終分析のために細胞を収集した。

ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのエレクトロポレーション。（Ｇａｇｎｏｎら、２０１４）にしたがって、細菌において組換えＳｐＣａｓ９タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２）を産生した。簡潔に言えば、ｐＥＴ−２８ｂ−Ｃａｓ９−Ｈｉｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４７３２７）を使用して、大腸菌ロゼッタ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてＳｐＣａｓ９を発現させ、これを３７℃で１２時間成長させ、続いて、１８℃で２４時間誘導した。ｈｉｓ−ｔａｇ樹脂（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製を実施し、２０ｍＭトリスｐＨ８、３０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌでカラムを洗浄し、２０ｍＭトリスｐＨ８、５００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出させた。２０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２への透析の後、単回使用用アリコートを−８０℃で保存した。インビトロ転写ｓｇＲＮＡを産生するために、本発明者らは、最初に、プライマーＴ７プロモーターｆｗおよびｇＲＮＡ ｅｎｄ ｒｅｖを用いて、ｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＥＧＦＰＢｉおよびｐＶＡＸ−Ｔ７−ｓｇＣｔｒをＰＣＲ増幅した（表２）。
表２．ＰＣＲ増幅に使用したオリゴヌクレオチドの配列

製造業者の指示にしたがってＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７高収量ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したインビトロ転写のために、Ｔ７プロモーターおよびｓｇＲＮＡの完全配列を含有するこのＰＣＲ産物を使用した。イソプロパノールで沈殿させて７５％エタノールで洗浄したＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）精製ｓｇＲＮＡをアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。

エレクトロポレーションの直前に、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールおよび１ｍＭ ＤＴＴ中で１２．４μｇのＳｐＣａｓ９を３．１μｇのｓｇＲＮＡ（または、４：１のタンパク質対ＲＮＡ間質量比で示される）と共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより、精製ｓｇＲＮＡを組換えＳｐＣａｓ９と混合した。Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩを使用して、１２０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、５ｍＭ ＫＣｌ中で、Ｑ００１プロトコールを使用して、２．５×１０^５個のＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞をヌクレオフェクトした。エレクトロポレーションの７日後に、ＥＧＦＰ喪失について細胞を分析した。

ＳｐＣａｓ９誘導性変異の検出。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｔａｌｉ（商標）イメージベースのサイトメーターにより、ＥＧＦＰ発現を分析した。エレクトロポレーションしたＲＮＰとの比較分析では、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ＥＧＦＰ発現細胞の分析を実施した。ＣＸＣＲ４およびＶＥＧＦＡ遺伝子座におけるｉｎｄｅｌを検出するために、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、精製ゲノムＤＮＡのＰＣＲを実施した。表２に掲載されているオリゴヌクレオチドを使用して、サンプルを増幅した。シークエンシングしてＴＩＤＥツール^３６を適用することにより、精製ＰＣＲ産物を分析した。オリゴヌクレオチドＥＧＦＰ ｆｗおよびＥＧＦＰ ｒｅｖを使用するＰＣＲ増幅により、Ｍｕｌｔｉ−ＶＥｓｉＣａｓ処理後のＥＧＦＰ遺伝子座における欠失の検出が示された。

ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ。２５０ｎｇのＶＥＧＦＡ 部位３ ｓｇＲＮＡコードプラスミドまたは空のｐＵＣ１９プラスミド（両方とも（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）に記載されている）、両末端にホスホロチオエート結合を含有する１０ｐｍｏｌのベイトｄｓＯＤＮ（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑプロトコールと同じように設計されている）（Ｔｓａｉら、２０１４）、ならびにＥＧＦＰおよびプロマイシン耐性遺伝子の両方を発現する５０ｎｇのｐＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏプラスミド（Ｐｅｔｒｉｓら、２０１７）と一緒に、７５０ｎｇのＣａｓ９発現プラスミドを２×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｄｓＯＤＮおよびＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏコードプラスミドのトランスフェクションの６時間後にスピノキュレーションにより、ＶＥＧＦＡ 部位３をターゲティングするＶＥｓｉＣａｓを送達した。翌日、細胞をトリプシン処理し、再プレーティングした。この手順を４８時間ごとに繰り返した。最後の処理後、細胞を剥離し、２μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて４８時間選択した。次いで、細胞を収集し、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ超音波処理デバイス（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて５００ｂｐの平均長に剪断した。以前の研究（Ｔｓａｉら、２０１４）にしたがってアダプターおよびプライマーを用いて、ライブラリー調製を実施した。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライブラリーを定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ試薬キットＶ２−３００サイクル（２×１５０ｂｐペアエンド）を使用してＭｉＳｅｑシークエンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシークエンシングした。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑコンピューターパイプライン（Ｔｓａｉら、２０１６）を使用して、生のシークエンシングデータ（ＦＡＳＴＱファイル）を分析した。脱多重化後、推定ＰＣＲ複製物を単一リードに統合した。ＢＷＡ−ＭＥＭ３７を使用して、統合したリードをヒト参照ゲノムＧｒＣｈ３７にマッピングし；５０未満のマッピングクオリティを有するリードを除外した。アラインメントデータにおいて二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を組込んだゲノム領域を同定する際、標的に対して多くとも８つのミスマッチが存在し、バックグラウンド対照において存在しない場合には、オフターゲット部位を保持した。アライメントしたオフターゲット部位の視覚化は、色分けされた配列グリッドとして利用可能である。

ウエスタンブロット。収集した細胞またはＶＳＶ−Ｇ小胞を含有する上清を、１％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を補充したＮＥＨＮバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール）で溶解させた。標準的な分子量マーカーとしてＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓタンパク質標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質抽出物を分離した。電気泳動の後、サンプルを０．２２μｍ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。膜を、Ｇａｇ−Ｃａｓ９、ＭｉｎＧａｇ−Ｃａｓ９およびＳｐＣａｓ９検出用のマウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、マウス抗α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）、ならびにＥＣＬ検出用の適切なＨＲＰ結合ヤギ抗マウス（ＫＰＬ）二次抗体と共にインキュベートした。Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ（商標）Ｃａｓ９モノクローナル抗体（クローンＴＧ８Ｃ１−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、参照として組換えＳｐＣａｓ９を使用したウエスタンブロッティングにより、ＳｐＣａｓ９を定量した。画像を取得し、ＵＶＩｔｅｃ Ａｌｌｉａｎｃｅ検出系を使用してバンドを定量した。

ＶＥｓｉＣａｓのインビボ送達。ＩＣＧＥＢ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎによるおよびＩｔａｌｉａｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによる承認を得て、国内および国際法ならびに政策（ｎａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｌａｗｓ ａｎｄ ｐｏｌｉｃｉｅｓ）（ＥＥＣ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ８６／６０９，ＯＪＬ ３５８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １２，１９８７ ａｎｄ Ｄ．ｌｇｓ １１６／９２）に従う施設ガイドラインに準拠して、動物の管理および処置を行った。ＥＧＦＰを発現する生後５日目のトランスジェニックマウス（雄）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ）を、ガーゼをその子マウスの下に置いて氷との直接接触を避けて約３〜５分間氷上で体温異常降下させることにより、麻酔した。小さなハサミを使用して、胸の下半分を横切る皮膚横切開を実施し、続いて、鈍的切開を使用することにより、下層筋肉から皮膚を穏やかに分離した。心臓を視覚化するために、第四肋間隙に小切開を行うことにより、側方開胸を作った。対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）またはＥＧＦＰをターゲティングするガイド（ｓｇＥＧＦＰＢｉ）を保有するＶＥｓｉＣａｓ（４μｇのＳｐＣａｓ９に対応する５マイクロリットル）を、３１Ｇ針を使用して左心室前壁に注射した。胸壁切開を閉鎖するために、８−０非吸収性プロレン縫合糸を使用して、肋骨および皮膚を一緒に縫合した。新生仔を、回復するまで数分間にわたって熱ランプ下で急速に温め、母親に再導入した。１０日後、心臓を収集し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡分析のためにイソペンタン／液体窒素で急速凍結した。

免疫蛍光。凍結切片をＰＢＳで３回洗浄し、０，５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で３０分間透過処理し、１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングした。５％ヤギ血清中１：１００の抗サルコメアα−アクチニン抗体（Ａｂｃａｍ）で切片を４℃で一晩染色した。室温における０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００による５分間の２回の洗浄工程の後、１０％ヤギ血清中１：２００のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５９４結合抗マウス二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で切片を室温で４５分間〜１時間インキュベートした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）溶液（Ｓｉｇｍａ）で核を染色した。

比較例
ＶＥｓｉＣａｓおよび他の現在の技術水準の系の並行評価
ＶＥｓｉＣａｓの優れた編集性能を実証するために、本発明者らは、現在の技術水準、すなわちｓｇＲＮＡのためのＵ６ベースの核転写系を使用して産生した小胞（Ｕ６小胞）との並行比較を行った。Ｕ６小胞は、ｓｇＲＮＡのＵ６駆動核転写にすべて依拠するので、当技術分野に既に存在するすべての技術の優れた代理物と考えられ得る。本発明者らは、ＥＧＦＰコード配列（ｓｇＲＮＡ ＥＧＦＰＢｉ）に対するｓｇＲＮＡを組み込んだＶＥｓｉＣａｓおよびＵ６小胞のバッチを産生し、ＥＧＦＰを安定発現するレポーター細胞株（ＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ）においてＥＧＦＰノックアウトを測定した。生の結果は図１２ａに報告されており、形質導入に使用したＳｐＣａｓ９の量についてデータを正規化したグラフは図１２ｂに示されている。方法に記載されているように、ウエスタンブロットにより、各サンプル中のＳｐＣａｓ９含有量の定量を達成した。ＶＥｓｉＣａｓは、より高いレベルのＥＧＦＰノックアウトを示し、編集細胞の総数の全体的な増加は１，６倍であった。

本発明者らの比較をさらに拡大するために、本発明者らはまた、（国際公開第２０１５／１９１９１１Ａ２号に開示されている）Ｇｅｓｉｃｌｅ（ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を送達することができるＴａｋａｒａ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより配布されている市販の小胞系）およびＵ６小胞と並行してＶＥｓｉＣａｓの編集有効性を評価した。本発明者らは、ＧｅｓｉｃｌｅおよびＵ６小胞と一緒にＶＥｓｉＣａｓを産生し、ＥＧＦＰＢｉ ｓｇＲＮＡを３つすべての調製物に組み込んだ。本発明者らは、同じ量の組み込まれたＳｐＣａｓ９（４０ｎｇ）を含有する異なる小胞調製物の画分を使用してＨＥＫ２９３−ＥＧＦＰ細胞を処理し、蛍光の減少を測定した。図１３に示されているように、ＶＥｓｉＣａｓは、予想どおりＵ６小胞（１．６倍もの編集有効性）およびＧｅｓｉｃｌｅ（１．５倍増加したノックアウト）の両方を上回っているが、これは、最高レベルのＥＧＦＰノックアウトを実証している。興味深いことに、Ｕ６小胞およびＧｅｓｉｃｌｅを用いて得られた編集レベルは類似しているが、これは、ｓｇＲＮＡが産生細胞において転写される方法が、小胞それ自体の他の技術的特徴よりも、小胞調製物の編集有効性を決定する基本となるという概念をさらに裏付けている。全体として、使用したＳｐＣａｓ９タンパク質の量は同じであるので、標準的な方法と比較したＶＥｓｉＣａｓの活性の増加は、小胞に組み込まれたｓｇＲＮＡの量の増加により引き起こされるはずである。

ＶＥｓｉＣａｓおよび現在の技術水準の系によるｓｇＲＮＡ組み込みの評価
本発明者らのＴ７駆動細胞質転写系の有効性をよりよく特徴付けるために、本発明者らは、Ｕ６小胞に組み込まれたｓｇＲＮＡ（核Ｐｏｌ ＩＩＩ発現ｓｇＲＮＡ）のレベルを、ＶＥｓｉＣａｓに組み込まれたもの（細胞質Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ由来ｓｇＲＮＡ）のレベルと比較した。使用したガイドＲＮＡは、ＥＧＦＰコード配列を標的とするように設計されている（ＥＧＦＰＢｉ ｓｇＲＮＡ）。本発明者らは、方法のセクションで報告されているように、ＲＴ−ｑＰＣＲベースのアッセイを使用して、各タイプの小胞調製物のｓｇＲＮＡ含有量を評価した。製造業者のプロトコールにしたがってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ｍｉＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、小胞調製物から全ＲＮＡを抽出した。両小胞調製物に組み込まれたものと同一のインビトロ転写ｓｇＲＮＡ分子を使用して、絶対定量の標準曲線を作成した（図１４ａ）。図１４ｂに示されているように、Ｖｅｓｉｃａでは、Ｕ６小胞と比較して多くのｇＲＮＡが測定された（１．６倍も多い）。（方法のセクションに示されているように測定した）小胞に組み込まれたＳｐＣａｓ９の総量を考慮して、産生バイアスについて補正することにより、この値をさらに補正し得る。これらの計算は、Ｔ７転写ｓｇＲＮＡのより多くの組み込みがＵ６駆動発現の比を１．７倍に増加させることを確認した（図１４ｃ）。

ＶＥｓｉＣａｓにおけるＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡとの間のモル比の評価
組み込まれたｓｇＲＮＡの量はより高い編集効率と相関するので、本発明者らは、ＶＥｓｉＣａｓの予想外の利点が、そのｓｇＲＮＡと複合体形成して小胞に組み込まれたＳｐＣａｓ９のレベルの増加により表されると推論した。組み込まれたＳｐＣａｓ９と組み込まれたｓｇＲＮＡとの間のモル比を測定するために、本発明者らは、ＶＥｓｉＣａｓ調製物に存在する２つの分子を定量した。ＳｐＣａｓ９の定量については、本発明者らは、方法のセクションで報告されているように、ウエスタンブロットを使用した（図１５ａ）。測定の信頼性を増加させるために、本発明者らは、組換えＳｐＣａｓ９の２つの異なる調製物を用いて得られた２つの異なる標準曲線をロードした（図１５ｂ〜ｃに示されている）。表３に示されているように、２つの曲線を使用した定量は一致している。
表３．反復標準曲線を使用した、ＶＥｓｉＣａｓに組み込まれたＳｐＣａｓ９の絶対的定量

次に、本発明者らは、ＶＥｓｉＣａｓ調製物から全ＲＮＡを抽出し、方法および先の段落に記載されているＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用することにより、ｓｇＲＮＡの量を定量した。これらの絶対的定量から、本発明者らは、ヌクレアーゼにより組み込まれたｓｇＲＮＡの量と意図され得る２つの分子間のモル比を得た。表４で報告されているように、比は１：０．８５に等しいが、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼベースの細胞質転写系による高い複合体形成効率を示している。
表４．ＶＥｓｉＣａｓにおけるＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡとの間のモル比

参考文献

Claims (19)

1. 小胞であって、
   ｉ）少なくとも１つの膜結合タンパク質に会合する脂質エンベロープ；
   ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子；および
   ｉｉｉ）必要に応じて少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ
   を含み；
   以下の特色：
   −前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、総小胞タンパク質量に対して少なくとも０．２％ｗ／ｗの量で前記小胞内に存在すること；および
   −前記小胞が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼも含有する場合、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体形成し、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに対して０．８５：１に等しいかまたはそれを超えるモル比で前記小胞内に存在すること
   の少なくとも１つを有する、小胞。
2. 前記脂質エンベロープが、単層または二層脂質構造、エクソソーム、エンベロープウイルス、エンベロープウイルス様粒子、ミクロソーム、エンドソーム、ナノソーム、液胞、好ましくはエクソソームまたはエンベロープウイルス様粒子から選択される、請求項１に記載の小胞。
3. 前記少なくとも１つの膜結合タンパク質が小胞産生細胞からの小胞形成を刺激し、および／または標的細胞への小胞融合を媒介する、請求項１または請求項２に記載の小胞。
4. 前記少なくとも１つの膜結合タンパク質が、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＡＬＶエンベロープ、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＨＩＶ ｇｐ１６０；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、細胞膜との相互作用を有するエンベロープウイルスのマトリックスタンパク質；エボラＶＰ４０、エボラ糖タンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−ｐｏｌレトロウイルスタンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−Ｐｏｌレンチウイルスタンパク質、Ａｒｃタンパク質、ＴＹ３／ジプシーレトロトランスポゾンエンベロープタンパク質、ＨＩＶ−１ Ｖｐｕ、最小−Ｇａｇ、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合物、上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／またはその細胞内ドメインおよび／またはその細胞外ドメインの一部、標的細胞上の表面分子を認識することができる免疫グロブリン可変ドメイン由来の一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質受容体、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質性リガンド、ならびにそれらの類似体から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の小胞。
5. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の小胞。
6. 前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲクラス２タイプＩＩ、タイプＶおよび／もしくはタイプＶＩヌクレアーゼまたはアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびにそれらのバリアントから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の小胞。
7. 前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３およびＡｇｏ２ヌクレアーゼおよびそれらのバリアント；ヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体；ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼ変異体；ならびにタンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、細胞透過性ペプチド、エンドソーム脱出を可能にするペプチド、転写調節因子、クロマチン調節因子、ＤＮＡ修復をモジュレートするタンパク質またはタンパク質ドメイン、他のタンパク質の翻訳後修飾を可能にするタンパク質またはタンパク質ドメイン、前記細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチド、タンパク質結合ドメインから選択されるタンパク質ドメインに融合したＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択される、請求項６に記載の小胞。
8. Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼおよびそれらのバリアントまたはヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体と複合体形成する前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、塩基エディター、転写調節因子またはクロマチン調節因子をコードする他のタンパク質ドメインに融合したアプタマー相互作用タンパク質ドメイン、好ましくはＭＳ２タンパク質との相互作用特性を有するアプタマー、好ましくはＭＳ２アプタマーを含むように操作されている、請求項７に記載の小胞。
9. 前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ファルネシル化シグナル、ミリストイル化シグナル、膜貫通ドメインの少なくとも１つに融合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の小胞。
10. 標的細胞に送達されると、細胞毒性を最小化するために、前記標的細胞内において前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡの一過性発現を提供する、前記請求項のいずれか一項に記載の小胞。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の小胞を産生するための方法であって、以下：
    ｉ）パッケージング細胞を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、以下の特色：
    ａ）前記細胞が高レベルの直接的な細胞質ゾルの転写に寛容であり、前記細胞寛容が、細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ様タンパク質、ＭＤＡ−５、ＩＰＳ−１、ＲＩＰＩ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＴＡＮＫ、ＮＡＰ、ＮＥＭＯ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩＫＫγ、ＴＢＫ１、ＤＤＸ３、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ｐ６５、ｐ５０、ＲＩＰ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ１、ＩＮＦ−γ２、ＩＮＦ−γ３、カスパーゼ−１、ＴＬＲ８から選択される少なくとも１つのＲＮＡウイルス感知経路の発現の欠如；および／またはキャッピング酵素の発現により少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子をキャップする細胞能力；および／または５’−三リン酸転写産物を脱リン酸化するために５’−ホスファターゼを発現する細胞能力により決定されること；ならびに
    ｂ）前記細胞が、前記細胞質においてＲＮＡポリメラーゼを安定発現または一過性発現すること
    を有する工程；
    ｉｉ）少なくとも１つの第１の発現カセット、および少なくとも１つの第２の発現カセット、および必要に応じて少なくとも１つの第３の発現カセットを前記パッケージング細胞にトランスフェクトする工程であって、
    ａ）前記第１の発現カセットが、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を転写するための第１のヌクレオチド配列を含み；
    ｂ）前記第２の発現カセットが、少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み；および
    ｃ）前記第３の発現カセットが、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする第３のヌクレオチド配列を含む工程；
    ｉｉｉ）前記パッケージング細胞から前記小胞を産生する工程
    を含む、方法。
12. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓバクテリオファージｐｈｉＡ１１２２のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバクテリオファージｇｈ−１のＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４のＲＮＡポリメラーゼ、ロゼオファージＳＩＯ１のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＹｅ０３−１２のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉＫＭＶのＲＮＡポリメラーゼ、腸内細菌バクテリオファージＫ１−５のＲＮＡポリメラーゼ、ビブリオファージＶｐＶ２６２のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１４のＲＮＡポリメラーゼ、ＢＡ１２７のＲＮＡポリメラーゼおよびＢＡ１５６のＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアントから選択されるバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記パッケージング細胞が、ＢＨＫ２１、ＢＳＲ−Ｔ７／５、ＢＨＫ−Ｔ７およびＶｅｒｏ細胞から選択される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
14. 前記少なくとも１つの膜結合タンパク質が、クラトリンアダプター複合体ＡＰ１、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、ＴＳＡＰ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、ＡＬＶエンベロープ、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２エンベロープタンパク質、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープタンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４、ＨＩＶ ｇｐ１６０；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、細胞膜との相互作用を有するエンベロープウイルスのマトリックスタンパク質；エボラＶＰ４０、エボラ糖タンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−ｐｏｌレトロウイルスタンパク質、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ−Ｐｏｌレンチウイルスタンパク質、Ａｒｃタンパク質、ＴＹ３／ジプシーレトロトランスポゾンエンベロープタンパク質、ＨＩＶ−１ Ｖｐｕ、最小−Ｇａｇ、ＳＡＤＢ１９−ＶＳＶ−Ｇ融合物、上記エンベロープタンパク質の１つと融合したＶＳＶ−Ｇ膜貫通ドメインおよび／またはその細胞内ドメインおよび／またはその細胞外ドメインの一部、標的細胞上の表面分子を認識することができる免疫グロブリン可変ドメイン由来の一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質受容体、標的細胞上の表面分子を認識することができるタンパク質性リガンド、ならびにそれらの類似体から選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲクラス２タイプＩＩ、タイプＶおよびタイプＶＩヌクレアーゼならびにアルゴノートＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３およびＡｇｏ２ヌクレアーゼおよびそれらのバリアント；ヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体；ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼ変異体；タンパク質タグ、さらなるヌクレアーゼドメイン、核酸編集ドメイン、細胞透過性ペプチド、およびエンドソーム脱出を可能にするペプチド、転写調節因子、クロマチン調節因子、ＤＮＡ修復をモジュレートするタンパク質またはタンパク質ドメイン、他のタンパク質の翻訳後修飾を可能にするタンパク質またはタンパク質ドメイン、前記細胞内のタンパク質安定性および／または局在性を調節するタンパク質ドメインまたはペプチド、タンパク質結合ドメインをコードするアミノ酸配列から選択されるタンパク質ドメインに融合したＣａｓ９およびＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ活性を有するまたは有しないＣａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ１３ヌクレアーゼ変異体と複合体形成する前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、塩基エディター、転写調節因子またはクロマチン調節因子から選択されるタンパク質ドメインとの相互作用特性を有するアプタマー、好ましくはＭＳ２アプタマーを含むように操作されている、請求項１６に記載の方法。
18. 前記工程ｉｉ）が、少なくとも１つのさらなる発現カセットを前記パッケージング細胞にトランスフェクトすることを提供し、前記少なくとも１つのさらなる発現カセットが、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＶＳＶ−Ｇ、ＡＬＶエンベロープ、エボラ糖タンパク質、ＢＲＬエンベロープ糖タンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザＮＡ／ＨＡ／Ｍ２、ＭｕＬＶ両種指向性エンベロープ、バキュロウイルスｇｐ６４、ＴＣＲ−アルファ、ＣＤ４、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、標的細胞上の表面分子を認識する抗体の可変ドメインおよび／または全長抗体から選択される、標的細胞への小胞指向性を変化させるために有用な少なくとも１つの膜結合タンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列を含み、
    ただし、前記さらなる発現カセットに含まれる前記さらなるヌクレオチド配列によりコードされる前記少なくとも１つの膜結合タンパク質が、前記第２の発現カセットに含まれる前記第２のヌクレオチド配列によりコードされる前記少なくとも１つの膜結合タンパク質とは異なる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする前記第３のヌクレオチド配列が、ファルネシル化シグナル、ミリストイル化シグナル、膜貫通ドメインの少なくとも１つをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含有する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

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