JP2023168355A - 改良された相同組換えおよびその組成物のための方法 - Google Patents

改良された相同組換えおよびその組成物のための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ゲノム編集およびそれに伴う酵素プロセスを強化する手段を提供する。【解決手段】本開示は、相同組換えの効率を改善するための方法、キット、および組成物に関する。特に、本開示は、プロモータートラップ法と短い相同性アームとの組み合わせた使用、核局在化シグナル、および／または１つ以上のＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９によって結合したＴＡＬエフェクタードメインまたは短縮型ガイドＲＮＡ）を特定の部位に結合させることにより、クロマチンを標的遺伝子座において置換もしくは再構築すること、および／または標的遺伝子座へのアクセス可能性を増大させて、酵素修飾を促進することにより、ＤＮＡ分子をゲノムへと直接クローニングするための方法に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、とりわけ、ゲノム編集およびそれに伴う酵素プロセスの強化に有用である。【選択図】なし

Description

本開示は、相同組換えの効率を改善するための方法、キット、および組成物に関する。特に、本開示は、プロモータートラップ法と短い相同性アームとの組み合わせた使用、核局在化シグナル、および／または１つ以上のＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９によって結合したＴＡＬエフェクタードメインまたは短縮型ガイドＲＮＡ）を特定の部位に結合させることにより、クロマチンを標的遺伝子座において置換もしくは再構築すること、および／または標的遺伝子座へのアクセス可能性を増大させて、酵素修飾を促進することにより、ＤＮＡ分子をゲノムへと直接クローニングするための方法に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、とりわけ、ゲノム編集およびそれに伴う酵素プロセスの強化に有用である。
ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集ツールの最近の進歩により、研究者は、哺乳動物のゲノムに二本鎖破断（ＤＳＢ）を効率的に導入できるようになっている。その後、ＤＳＢは、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路または相同性指向修復（ＨＤＲ）経路のいずれかによって、大部分が修復される。哺乳動物細胞では、ＮＨＥＪ経路が優勢であり、誤りがちなものである。しかしながら、ＨＤＲ経路では、姉妹染色分体または外因性ＤＮＡ分子の使用による正確なゲノム編集が可能となる。ＨＤＲ効率を改善するために多くの試みが行われているが、依然として効率は比較的低い。例えば、ＫＵ７０とＤＮＡリガーゼＩＶとの両方をｓｉＲＮＡで同時にノックダウンすると、ＨＤＲ効率が４～５倍向した。Ｃｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：５４３－５４８（２０１５）を参照されたい。Ｃａｓ９ニッカーゼおよび長いＤＮＡドナーテンプレートを使用すると、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）におけるＨＤＲ効率は５％となった。Ｒｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，「Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ ａｎｄ ａ ｌｏｎｇ ＤＮＡ ｄｏｎｏｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ５：２５８－２６０（２０１４）を参照されたい。最近の報告では、ＣＲＩＳＰＲシステムと子宮内エレクトロポレーション技術との併用により、脳のニューロンのβ－アクチン遺伝子へのＥＧＦＰ統合効率が約２％になることが示された。Ｕｅｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ａｎｄ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．６：３５８６１（２０１６）を参照されたい。ヒトＰＯＬＱおよびＬＩＧ４の二重損失により、ランダムな統合が排除することが示された。しかしながら、多数の定義されていない挿入も観察された。Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，「Ｄｕａｌ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＰＯＬＱ ａｎｄ ＬＩＧ４ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１６１１２（２０１７）を参照されたい。感染多重度１０６でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系の使用により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を約４０％の効率でＴＲＡＣ遺伝子座に組み込むことができた。Ｅｙｑｕｅｍ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ＣＡＲ ｔｏ ｔｈｅ ＴＲＡＣ ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）を参照されたい。組換えＡＡＶ系は深刻なヒト疾患の治療に安全であると考えられているが、ＧＭＰグレードのＡＡＶの生産には厳格な品質管理システムの確立が求められる。
伝統的に、比較的大きなＤＮＡ断片を哺乳動物ゲノムに組み込むためには、長い相同性アーム（５００ｂｐ～２ｋｂ）が使用され、これには、効率が低いことおよび組込みがランダムであることに起因して、標的化ベクターの構築および多数の単一細胞コロニーのスクリーニングが必要となる。よって、このプロセスは通常、時間がかかり（約４～６か月）冗漫であり、このことが、組換えタンパク質の発現に哺乳動物細胞を使用するのを妨げている。タンパク質の産生プロセスを加速させるために、一過性の遺伝子発現を使用して、コロニースクリーニングステップを排除することが多い。一過性の発現により高レベルのタンパク質産生が得られるものの、導入遺伝子は限られた期間しか発現されない。したがって、哺乳動物系を使用して組換えタンパク質を産生させるには、費用がかかる。生物薬剤に使用する組換えタンパク質の将来的な市場の需要を満たすために、生産性の高いクローンを迅速かつ効率的に選択するための費用対効果の高い方法が必要とされている。
本開示は、部分的に、核酸分子の編集のための組成物および方法に関する。ゲノムを修飾するための効率的なシステムおよび技術が大いに必要とされている。本明細書では、この必要性および関連する利点に取り組む。具体的には、いくつかの実施形態は、プロモーター捕捉と短い相同性アームとの併用を介して、比較的大きなＤＮＡ分子を哺乳動物ゲノムに直接クローニングするための方法を提供する。効率および特異性が高いため、クローン細胞の単離ステップを避けて、安定した細胞プールを使用して組換えタンパク質を産生させることができる。
本明細書で示す組成物および方法は、遺伝子編集の改善を対象とする。本明細書の他箇所に記載されているように、遺伝子編集効率の増大を可能にするある数の組成物および方法が特定されている。
初期核酸分子における相同組換えのための方法が本明細書で提供され、本方法は、初期核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を産生させることと、切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることと、を含み、初期核酸分子はプロモーターおよび遺伝子を含み、ドナー核酸分子は、（ｉ）長さが１２ｂｐ～２５０ｂｐの５’および３’末端の一致した末端、（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、（ｉｖ）プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子またはプロモーターを持たない選択マーカーのいずれかの側のＬｏｘＰとを連結する自己切断ペプチド、ならびに（ｉｖ）任意選択で、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間のリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子の二本鎖破断は、（ｉ）切断された核酸分子のＮ末端標識化のためのＡＴＧ開始コドンから２５０ｂｐ以下であるか、または（ｉｉ）切断された核酸分子のＣ末端標識化のための停止コドンから２５０ｂｐ以下である。
いくつかの実施形態では、二本鎖破断は、少なくとも１つの核酸切断エンティティまたはエレクトロポレーションによって誘導される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸切断エンティティは、少なくとも１つまたは１つ以上のジンクフィンガータンパク質、１つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体、１つ以上のアルゴノート－核酸複合体、または１つ以上のマクロヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの核酸切断エンティティは、発現ベクター、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＣ）、またはｍＲＮＡを使用して投与される。
いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは、タンパク質、抗生物質耐性選択マーカー、細胞表面マーカー、細胞表面タンパク質、代謝産物、またはそれらの活性断片を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、アンジオポエチン関連成長因子（ＡＧＦ）受容体、または表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。
いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは抗生物質耐性選択マーカーである。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性選択マーカーは組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性選択マーカーはヒトＩｇＧ抗体である。
いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質レポーターを含む。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質レポーターは、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）レポーターまたはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）レポーターである。
いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは、（ｉ）切断された核酸分子のＮ末端標識化のためにレポーター遺伝子の５’末端に連結するか、または（ｉｉ）切断された核酸分子のＣ末端標識化のためにレポーター遺伝子の３’末端に連結する。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子の間にリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間の距離は、３００ｎｔ、２４０ｎｔ、１８０ｎｔ、１５０ｎｔ、１２０ｎｔ、９０ｎｔ、６０ｎｔ、３０ｎｔ、１５ｎｔ、１２ｎｔ、または９ｎｔ以下である。いくつかの実施形態では、距離は６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーはポリグリシンリンカー（例えば、約２～約５個のグリシン残基）である。
いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは自己切断２Ａペプチドである。
いくつかの実施形態では、一致する末端は、ＰＣＲ増幅によりドナー核酸分子の５’および３’末端に付加される。
いくつかの実施形態では、一致した末端は、９５％以上の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、一致する末端は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の５’および３’末端の一致した末端は、１２ｂｐ～２００ｂｐ、１２ｂｐ～１５０ｂｐ、１２ｂｐ～１００ｂｐ、１２ｂｐ～５０ｂｐ、または１２ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する。いくつかの実施形態では、一致する末端は、３５塩基対（ｂｐ）の長さを有する。
いくつかの実施形態では、初期核酸分子は、細胞またはプラスミド中にある。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、または３０ｋｂ以下の長さを含む。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、切断された核酸分子に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＨＤＲは、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である。いくつかの実施形態では、ＨＤＲは１００％である。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の組込み効率は、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の組込み効率は１００％である。
いくつかの実施形態では、本方法は、５’末端、３’末端、または５’および３’末端でドナー核酸分子を修飾することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、５’および３’末端で修飾される。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、少なくとも１つの末端の少なくとも１つの鎖中で１つ以上のヌクレアーゼ耐性基により修飾される。いくつかの実施形態では、１つ以上のヌクレアーゼ耐性基は、１つ以上のホスホロチオエート基、１つ以上のアミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ドナー核酸分子を少なくとも１つの非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤で処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＮＨＥＪ阻害剤は、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＮＡポリメラーゼ１もしくは２（ＰＡＲＰ－１またはＰＡＲＰ－２）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、Ｎｕ７２０６（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ナフトール［１，２－ｂ］ピラン－４－オン）、Ｎｕ７４４１（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン）、Ｋｕ－００６０６４８（４－エチル－Ｎ－［４－［２－（４－モルホリニル）－４－オキソ－４Ｈ－１－ベンゾピラン－８－イル］－１－ジベンゾチエニル］－１－ピペラジンアセトアミド）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，１－ａ］イソキノリン－４－オン）、ＤＭＮＢ（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンズアルデヒド）、ＥＴＰ ４５６５８（３－［１－メチル－４－（４－モルホリニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－６－イルフェノール）、ＬＴＵＲＭ３４（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１，３－ベンゾオキサジン－４－オン）、またはＰｌ１０３塩酸塩（３－［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル］フェノール塩酸塩）である。
いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト、哺乳類実験動物、哺乳類家畜、哺乳類競技動物、または哺乳類愛玩動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
いくつかの実施形態では、細胞またはプラスミドは、本明細書に記載の相同組換えのための方法のいずれかによって作製される。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。
また、有効量の本明細書に記載の細胞のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む細胞療法の方法も、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、プロモーターを持たない選択マーカーはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
また、本明細書に記載の相同組換えの方法のうちのいずれかにより作製された細胞またはプラスミドのプロモーターを活性化して、プロモーターを持たない選択マーカーを産生することを含む、プロモーターを持たない選択マーカーを産生するための方法が、本明細書に記載される。
また、本明細書に記載のプロモーターを持たない選択マーカーを産生するための方法のうちのいずれかにより産生されるプロモーターを持たない選択マーカーを含む組成物が、本明細書に記載される。
また、本明細書に記載のプロモーターを持たない選択マーカーを産生する方法のうちのいずれかにより産生される有効量のプロモーターを持たない選択マーカーを投与することを含む、それを必要とする対象の治療的処置のための方法が、本明細書に記載される。
また、本明細書に記載のプロモーターを持たない選択マーカーを産生するための方法のうちのいずれかにより産生されるプロモーターを持たない選択マーカーを含む薬物スクリーニングアッセイが、本明細書に記載される。
また、選択マーカーのいずれかの側の自己切断ペプチドまたはＬｏｘＰによりレポーター遺伝子に連結したプロモーターを持たない選択マーカーを含む、プロモーターを持たない選択マーカーを生成するためのキットが、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子はＧＦＰまたはＯＦＰである。いくつかの実施形態では、キットには、少なくとも１つの核酸切断エンティティがさらに含まれる。いくつかの実施形態では、キットには、少なくとも１つのＮＨＥＪ阻害剤がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、キットには、１つ以上のヌクレアーゼ耐性基がさらに含まれる。
また、組換え抗体発現カセットが本明細に記載され、本組換え抗体発現カセットには、長さが２５０ｂｐ以下である、カセットの５’および３’末端における一致した末端、プロモーターを持たない選択マーカー、レポーター遺伝子、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子とを連結する自己切断ペプチド、任意選択で、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間のリンカー、が含まれ、プロモーターを持たない選択マーカーは、切断された核酸分子のＮ末端標識化のためにレポーター遺伝子の５’末端で、または切断された核酸分子のＣ末端標識化のためのレポーター遺伝子の３’末端で連結する。
また、細胞内に存在する内因性核酸分子を改変するための組成物および方法が本明細書に記載され、本方法には、ドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）を細胞に導入することを含み、ドナー核酸分子は、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナー核酸分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する。
いくつかの実施形態では、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置は、核、ミトコンドリア、または葉緑体の中である。
いくつかの態様では、少量で細胞に導入された場合でも、細胞内核酸分子の効率的な部位特異的切断を可能にする遺伝子編集タンパク質、および関連する方法が提供される。したがって、低濃度で存在する場合でも高レベルの部位特異的切断を可能にする組成物および方法が提供される。ある数の因子により、発生する細胞内核酸切断の量が影響を受け得る。そのような因子には、（１）切断を意図する遺伝子座に接触する活性遺伝子編集試薬の量、（２）遺伝子編集試薬が示す切断活性のレベル、および（３）切断部位に近接しているドナー核酸の量が含まれる。より一般的に言えば、細胞集団内の特定の細胞内遺伝子座で生じる編集量は、２倍体細胞に関して少なくとも１つの遺伝子座が切断される細胞の割合により決定される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内標的化部分は核局在化シグナルである。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルは、ドナー核酸分子の５’末端に作動可能に連結する。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、少なくとも１つの核酸切断エンティティに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸切断エンティティは、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、１つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体、１つ以上のアルゴノート－核酸複合体、１つ以上のマクロヌクレアーゼ、または１つ以上のメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを含む。
いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、核酸切断エンティティに連結しない。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）は、長さが、約２５～約８，０００ヌクレオチド（例えば、約２５～約８，０００ヌクレオチド、約２５～約５，０００ヌクレオチド、約２５～約３，０００ヌクレオチド、約２５～約２，０００ヌクレオチド、約２５～約１，５００ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約５０～約５００ヌクレオチド、約５０～約２，０００ヌクレオチド、約５０～約８，０００ヌクレオチド、約７５～約２，０００ヌクレオチド、約２５０～約５，０００ヌクレオチドなど）である。短いドナー核酸分子が望ましくあり得る場合の一例は、ＳＮＰの挿入または補正のための場合である。一例として、そのような場合、ドナー核酸分子は、各々１５ヌクレオチドの２つの相同性アームと、標的遺伝子座を改変するための単一ヌクレオチドとを有してもよい。
さらに、ドナー核酸分子は、一本鎖、二本鎖、線状、または環状であってもよい。
加えて、ドナー核酸分子は、少なくとも１つの末端の５０ヌクレオチド内に１つ以上のヌクレアーゼ耐性基を有してもよい。これらのヌクレアーゼ耐性基は、ホスホロチオエート基であってもよい。さらに、２つのホスホロチオエート基は、少なくとも１つの末端の５０ヌクレオチド内に位置してもよい。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、ポジティブ選択可能マーカーおよび／またはネガティブ選択可能マーカーを含む。さらに、ネガティブ選択可能マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであってもよい。
ある特定の実施形態では、ドナー核酸分子は、細胞内に存在する標的遺伝子座との配列相補性の２つの領域を有する。さらに、ポジティブ選択マーカーは、ドナー核酸分子の配列相補性の２つの領域の間に位置してもよい。加えて、ネガティブ選択マーカーは、ドナー核酸分子の配列相補性の２つの領域の間に位置しないことがある。言い換えれば、ネガティブ選択可能マーカーは、配列相補性の２つの領域の外側に位置してもよい。
いくつかの実施形態では、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナーＤＮＡ分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結するドナー核酸分子が、本明細書に示される他の組成物および方法と組み合わせて使用されてもよい。したがって、細胞を、（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、（２）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、または（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、のうちの１つ以上と接触させる方法が、本明細書でさらに提供される。
本明細書の他箇所に示されるように、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤の使用により、相同組換えの効率が向上することが分かっている。このため、細胞がと接触し、特に、１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤がＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤である方法がさらに本明細書で提供される。使用され得る追加の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤には、（１）Ｎｕ７２０６、（２）Ｎｕ７４４１、（３）Ｋｕ－００６０６４８、（４）ＤＭＮＢ、（５）ＥＴＰ ４５６５８、（６）ＬＴＵＲＭ ３４、および（７）Ｐｌ １０３塩酸塩からなる群から選択される１つ以上の化合物が含まれる。
さらに、１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結したドナー核酸分子は、標的遺伝子座で細胞内ＤＮＡを切断するように設計された遺伝子編集試薬の使用と組み合わせて細胞に導入されてもよい。したがって、１つ以上の核酸切断エンティティのうちの少なくとも１つは、（１）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、（２）ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、および（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体からなる群から選択され得る。同様に、（１）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、（２）ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、および（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体からなる群から選択される１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの少なくとも１つの使用が、本発明に含まれる。さらに、１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの少なくとも１つは、使用される場合、標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内で結合するように設計されてもよい。
本発明には、一部には、真核細胞内で相同組換えを行うための方法がさらに含まれ、本方法は、細胞を、（１）ドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）、ならびに（２）（ｉ）核酸切断エンティティ、（ｉｉ）核酸切断エンティティをコードする核酸、または（ｉｉｉ）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分、および核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする核酸と接触させることを含み、ドナー核酸分子は、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナー核酸分子を局在させることができる細胞内標的部分に結合する。
そのような方法には、細胞を、（１）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、（２）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（３）ＤＮＡ結合調節増強剤をコードする１つ以上の核酸、ならびに（４）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分、および１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする核酸、のうちの１つ以上とさらに接触させることが含まれる。
本発明には、一部には、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を含む組成物も含まれ、核酸分子は、１つ以上の細胞内標的化部分に共有結合し、長さが、約２５～約８，０００ヌクレオチド（例えば、約２５～約８，０００ヌクレオチド、約２５～約５，０００ヌクレオチド、約２５～約３，０００ヌクレオチド、約２５～約２，０００ヌクレオチド、約２５～約１，５００ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約５０～約５００ヌクレオチド、約５０～約２，０００ヌクレオチド、約５０～約８，０００ヌクレオチド、約７５～約２，０００ヌクレオチド、約２５０～約５，０００ヌクレオチドなど）である。一部の場合、核酸分子はドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）である。一部の場合、１つ以上の細胞内標的化部分は核局在化シグナルである。さらなる場合には、２つ以上の細胞内標的化部分（例えば、核局在化シグナル、葉緑体標的化シグナル、ミトコンドリア標的化シグナルなど）が核酸分子に共有結合する。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることとが含まれる。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより標的遺伝子座のクロマチンを置換することとが含まれる。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより標的遺伝子座のクロマチンを再構築することとが含まれる。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性が増大する。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、標的遺伝子座のクロマチンが置換される。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、標的遺伝子座のクロマチンが再構築される。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座での調節タンパク質または調節複合体の活性を高める方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む標的遺伝子座のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することが含まれる。かつ、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤を第１のエンハンサー結合配列に結合させ、それにより細胞内の標的遺伝子座で第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体の活性を高める。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座を調節する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む標的遺伝子座の調節因子結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することが含まれる。かつ、（２）第１の調節タンパク質または第１の調節複合体が調節部位を調節することを可能にし、それにより細胞内の標的遺伝子座を調節する。
実施形態では、本方法には、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することができる第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することがさらに含まれる。
実施形態では、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体は、細胞にとって内因性ではない。
実施形態では、標的遺伝子座での相同組換えの速度は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する。
実施形態では、第２のエンハンサー結合配列は、調節因子結合配列によって第１のエンハンサー結合配列に連結する。
実施形態では、本方法には、調節因子結合配列に結合することができる第２の調節タンパク質または第２の調節複合体を導入することがさらに含まれる。
実施形態では、第１の調節タンパク質または第２の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ調節酵素を含む。実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写抑制因子または転写活性化因子である。実施形態では、ＤＮＡ調節酵素は、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼである。
実施形態では、第１の調節タンパク質または第２の調節タンパク質は、ヒストン調節酵素を含む。実施形態では、ヒストン調節酵素は、デアセチラーゼまたはアセチラーゼである。
実施形態では、第１の調節タンパク質は、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。実施形態では、第２の調節タンパク質は、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは第１のヌクレアーゼを含み、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは第２のヌクレアーゼを含む。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、二量体を形成する。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、独立して、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第１のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタードメインを含む。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第２のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第２のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
実施形態では、第１の調節複合体は第１のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第２の調節複合体は第２のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１のリボ核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む。実施形態では、第２のリボ核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む。
実施形態では、第１の調節タンパク質、第１の調節複合体、第２の調節タンパク質、または第２の調節複合体は、該細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１の調節タンパク質および第２の調節タンパク質は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１の複合体および第２の調節複合体は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、該細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、該細胞にとって内因性ではない。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡである。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２の短縮型ｇＲＮＡである。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質である。
実施形態では、第１の調節タンパク質は、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートであり、第２の調節タンパク質は、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。実施形態では、第１の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体であり、第２の調節複合体は、リボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１の調節複合体は、第１のリボ核タンパク質複合体であり、第２の調節複合体は、第２のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１の調節複合体は、リボ核タンパク質複合体であり、第２の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体である。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、モジュレーター結合配列から２００ヌクレオチド未満（例えば、約５～約１８０、約１０～約１８０、約２０～約１８０、約５～約９０、約５～約７０、約５～約６０、約５～約５０、約５～約４０、約５～約３０、約１５～約８０、約１５～約６０、約１５～約５０、約１５～約４０、約２０～約４０、約２０～約４０ヌクレオチドなど）離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、独立して、モジュレーター結合配列から１５０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から１００ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、モジュレーター結合配列から５０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、モジュレーター結合配列から４～３０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、モジュレーター結合配列から７～３０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から、４ヌクレオチド、７ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド離れている。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、調節部位から１０～４０ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列は、独立して、調節部位から３３ヌクレオチド離れている。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号４０の配列を有する。実施形態では、第２のエンハンサー結合配列は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１の配列を有する。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の調節タンパク質、第１の調節複合体、第２の調節タンパク質、または第２の調節複合体の活性を、調節部位で増強する。
一態様では、標的遺伝子座調節複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列、および調節部位を含むモジュレーター結合配列と、（ｉｉ）モジュレーター結合配列に結合した第１の調節タンパク質または第１の調節複合体と、（ｉｉｉ）第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤とが含まれる。
実施形態では、標的遺伝子座には、モジュレーター結合配列によって第１のエンハンサー結合配列に連結した第２のエンハンサー結合配列が含まれる。
実施形態では、細胞には、第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤が含まれる。
一態様では、標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列を含む標的遺伝子座と、（ｉｉ）第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、が含まれ、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、細胞にとって内因性ではなく、かつ第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる。
一態様では、標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（１）（ｉ）第１エンハンサー結合配列、および（ｉｉ）第２のエンハンサー結合配列を含む、標的遺伝子座と、（２）細胞にとって内因性ではない、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、（３）細胞にとって内因性ではない、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤と、が含まれ、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる。
一部の態様では、キットが提供される。本明細書で提供されるキットには、（ｉ）第１の調節タンパク質第１の調節複合体、（ｉｉ）第１のＤＮＡ結合調節増強剤、（ｉｉｉ）１つ以上の核酸分子、（ｉｖ）１つ以上の細胞内標的化部分、および（ｖ）１つ以上の非相同末端接合阻害剤のうちの１つ以上が含まれ得る。
また、Ｃａｓ９タンパク質などの遺伝子編集試薬、および２つ以上（例えば、約２～約１２、約３～約１２、約４～約１２、約５～約１２、約２～約７、約３～約７など）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、非古典的、単節型、および／または双節型のＮＬＳ）を含む、そのような試薬をコードする核酸も本明細書で提供される。例示的なＣａｓ９タンパク質は、２つ以上の双節型核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むものである。さらに、２つ以上の双節型核局在化シグナルのすべてまたは一部は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端などの少なくとも１つの末端の２０アミノ酸内に位置してもよい。本明細書における位置は、末端に最も近いＮＬＳの部分を指す。したがって、ＮＬＳのＣ末端アミノ酸の後に１０個の追加のアミノ酸が続き、最後のアミノ酸がタンパク質のＣ末端である場合には、ＮＬＳはＣ末端から１１アミノ酸のところに位置する。言い換えると、位置の数えは、ＮＬＳの最後のアミノ酸により決定される。
さらに、遺伝子編集試薬（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、アミノ酸配列が異なるか、または同じアミノ酸配列を有するＮＬＳを含んでもよい。また、遺伝子編集試薬（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つ以上（例えば、約１～約５、約１～約４など）の親和性標識を含んでもよい。遺伝子編集試薬と併用されるＮＬＳは、以下のアミノ酸配列：（Ａ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＫ ＲＫＶＥ（配列番号４８）、（Ｂ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＡ ＲＫＶＥ（配列番号４９）、（Ｃ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＫ ＡＫＶＥ（配列番号５０）、（Ｄ）ＫＲＰＡＡ ＴＫＫＡＧ ＱＡＫＫＫ Ｋ（配列番号５１）、および（Ｅ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥＰ ＡＡＫＲＶ ＫＬＤＥ（配列番号５２）のうちの１つ以上を含んでもよい。遺伝子編集試薬と併せて使用されるＮＬＳは、以下の式：（Ａ）ＫＲＸ5-15ＫＫＮ1Ｎ2ＫＶ（配列番号５３）、（Ｂ）ＫＲＸ(5-15)Ｋ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）1-2（配列番号５４）、（Ｃ）ＫＲＸ(5-15)Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）1-2（配列番号５５）のうちの１つ以上の範囲内に入る１つ以上のアミノ酸配列を含んでもよく、式中、Ｘは、長さが５～１５アミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｎ1は、ＬまたはＡであり、Ｎ2は、Ｌ、Ａ、またはＲである。さらに、本明細書に示される組成物および方法で使用され得る特許請求される特定のＣａｓ９タンパク質は、図４１および図４２に示されるアミノ酸配列を含む。
また、本明細書では、１つ以上（例えば、約２～約６、約２～約５、約２～約４、約２～約３、約３～約５など）の異種核局在化シグナル（例えば、単節型ＮＬＳ、双節型ＮＬＳなど）を含みＴＡＬＥタンパク質も本明細書で提供される。いくつかの態様では、８１５～８１６位および８２４～８２５位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙである、図４６のアミノ酸アミノ酸８１１～８３０を含むＴＡＬＥタンパク質と、１０２２～１０２３位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙである、図４６のアミノ酸アミノ酸８１０～１０２９を含むＴＡＬＥタンパク質とが、本明細書で提供される。さらに、本明細書で提供されるＴＡＬＥタンパク質は、図４６のアミノ酸７５２～１０２１を含んでもよい。
いくつかの態様では、２８～２９位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり、１０８～１１０位および８２３～８２４位のアミノ酸がＡｒｇ－Ｇｌｙ－ＡｌａまたはＧｌｎ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒである、図４７のアミノ酸アミノ酸２０～１６５を含むＴＡＬＥタンパク質が本明細書に提供される。さらに、本明細書で提供されるＴＡＬＥタンパク質は、８２７～８２８位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙである、図４７のアミノ酸アミノ酸８２１～８４０を含んでもよい。ＴＡＬＥタンパク質はまた、図４６に対応するアミノ酸を含んでもよい。
本明細書で提供される様々な態様のＴＡＬタンパク質は、４～２５（例えば、約５～約２２、約６～約２２、約８～約２２、約１０～約２２、約１２～約２２、約１２～約２６、約１３～約２０など）の反復単位を含む反復領域を含んでもよい。
細胞内で細胞内核酸を操作する方法も本明細書で提供され、本方法には、１つ以上のＴＡＬＥタンパク質（例えば、上で参照した１つ以上のＴＡＬＥタンパク質）または１つ以上のＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含み、１つ以上のＴＡＬＥタンパク質は、細胞内の標的遺伝子座に結合するように設計される。いくつかの態様では、そのような方法には、１つ以上のドナー核酸分子を細胞に導入することがさらに含まれ、１つ以上のドナー核酸分子は、標的遺伝子座の５０（例えば、約０～約５０、約０～約４０、約０～約３０、約０～約２０、約６～約４０など）ヌクレオチド内の核酸に対する配列相同性の１つ以上の領域を有する。
細胞集団内の切断部位で細胞内核酸分子の相同性組換えを行うための方法が本明細書で提供され、本方法には、（ａ）切断部位で細胞内核酸分子に１つ以上の二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、（ｂ）切断された核酸分子を１つ以上のドナー核酸分子と接触させることと、が含まれ、１つ以上のドナー核酸分子は、切断部位の各側の１００塩基対内に位置する核酸と相同性の少なくとも１０（例えば、約１０～約５００、約１０～約５００、約１０～約４００、約１０～約３００、約１０～約２５０、約２０～約３００、約２５～約３００、約３０～約３５０など）ヌクレオチドまたは塩基対を有し、細胞集団内の細胞の少なくとも９５％（例えば、約９５％～約１００％、約９５％～約９９％、約９６％～約９９％、約９５％～約９８％、約９６％～約９９％など）が、切断部位において１つ以上のドナー核酸分子のうちの少なくとも１つによる相同性指向修復を受ける。一部の場合には、１つ以上のドナー核酸分子には、相同性指向修復後に細胞内核酸分子に存在するプロモーターに作動可能に連結した１つ以上の選択マーカーまたは１つ以上のレポーター遺伝子が含まれる。さらに、１つ以上のドナー核酸分子は、１つ以上のドナー核酸分子ドナー核酸分子が細胞集団の細胞の核に局在化することを可能にする１つ以上の核局在化シグナルに連結してもよい。
いくつかの態様では、細胞集団を、（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、（２）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、および／または（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、のうちの１つ以上と接触させてもよい。さらに、１つ以上のドナー核酸分子のうちの１つ以上は、一本鎖であってもよい。
追加の態様では、細胞集団を、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触させてもよく、その後、細胞集団を１つ以上のドナー核酸分子と接触させてもよい。さらに、細胞集団を１つ以上のドナー核酸分子と接触させてもよく、その後、細胞集団を、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触させてもよい。さらに、細胞集団を１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触させた１～６０分後に、細胞集団を１つ以上のドナー核酸分子と接触させてもよい。逆に、細胞集団を１つ以上のドナー核酸分子と接触させた１～６０分後に、細胞集団を１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触させてもよい。一部の場合には、細胞集団を、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と１つ以上のドナー核酸分子とに同時に接触させてもよい。
上記に関連する追加の態様では、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と、１つ以上のドナー核酸分子とは、エレクトロポレーションによって、一緒にまたは別々に細胞に導入されてもよい。さらに、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子を最初に細胞に導入し、続いて１つ以上のドナー核酸分子のエレクトロポレーションを行ってもよく、あるいは１つ以上のドナー核酸分子を最初に細胞に導入し、続いて１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子のエレクトロポレーションを行ってもよい。
さらなる目的および利点は、一部には以下の説明に記載され、一部には説明から明白になるか、または実践によって習得され得る。目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された要素および組合せによって実現および達成されることになる。
前述の概要および以下の詳細な説明のいずれも、例示および説明に過ぎず、特許請求の範囲を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を例解し、説明とともに、本明細書に記載の原理を説明する役割を果たす。
本明細書で開示される原理、およびそれらの利点をより完全に理解するために、添付の図と関連させた下記の説明を参照する。
プロモーター捕捉および短い相同性アームによるタンパク質標識を示す。図１Ａは、Ｎ末端標識を示す。プロモーターを持たない選択マーカーであるピューロマイシンは、自己切断型２Ａペプチド、続くＰＣＲによる５’末端および３’末端の両方での３５ｎｔ相同性アームの付加を介してエメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）レポーターまたはオレンジ色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）レポーター遺伝子に連結し、る。内因性プロモーターは、ピューロマイシン、レポーター遺伝子、および内因性遺伝子の発現を駆動する。二本鎖切断（ＤＳＢ）は、翻訳開始部位の近くにあるＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲのいずれかにより誘導される。図１Ｂは、Ｃ末端標識を示す。ＥｍＧＦＰまたはＯＦＰレポーター遺伝子は、自己切断２Ａペプチド、続く５’末端および３’末端で３５ｎｔの相同性アームの付加を介してプロモーターを持たない選択マーカーであるピューロマイシンに連結する。内因性プロモーターは、内因性遺伝子、レポーター遺伝子、およびピューロマイシンの発現を駆動する。ＤＳＢは、翻訳停止部位の近くにあるＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲのいずれかにより誘導される。内在性遺伝子とレポーター遺伝子との間の停止コドンは除去される。図１Ａおよび１Ｂでは、ドナーＤＮＡは、相同組換えによりゲノムに挿入される。５’末端および３’末端の接合部は、それぞれ、Ｆ１／Ｒ１およびＦ２／Ｒ２プライマーセットを用いたＰＣＲにより分析される。 同上 ドナーの形式および投与量ならびに相同性アーム長がＨＤＲ効率に与える影響を示す。図２Ａでは、Ｃａｓ９ ＲＮＰおよび３５ｎｔ相同性アームを有する様々な量のドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションを介して２９３ＦＴ細胞に送達した。ｇＲＮＡの非存在下での試料は、対照として機能した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ピューロマイシン選択なしのＯＦＰ陽性細胞の割合を決定した（－）。あるいは、フローサイトメトリー分析の前に、細胞をピューロマイシンで７日間処理した（＋）。図２Ｂでは、様々な相同性アーム長をＰＣＲ増幅により挿入カセットに付加した後、Ｃａｓ９ ＲＮＰで２９３ＦＴ細胞に同時トランスフェクトした。図２Ａについて説明したように、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。図２Ｃおよび２Ｄでは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および約５００ｎｔの相同性アームを有するドナープラスミド、または３５ｎｔの相同性アームを有する一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡドナーを、エレクトロポレーションを介して２９３ＦＴまたはヒト初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリー分析に供した。 同上 同上 同上 ＯＦＰがベータ－アクチン遺伝子座に組み込まれたクローン細胞の特性評価を示す。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および３５ｎｔの相同性アームを有するドナーＤＮＡをエレクトロポレーションにより２９３ＦＴ細胞に送達し、続いて、ピューロマイシン選択後にクローン細胞を単離した。クローン細胞を、１つの内部プライマーと１つの外部プライマーまたは外部プライマーの対とを使用するジャンクションＰＣＲによって分析した。得られたＰＣＲ産物を配列決定により分析した。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、正確なＨＤＲ（１）またはインデルを伴うＨＤＲ（２）のＮ末端およびＣ末端接合部を示す。図３Ａおよび３Ｂの正確なＨＤＲ（１）の矢印は、ゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡまたはＣａｓ９切断部位との接合部を示す。図３Ａおよび３Ｂの太字の配列は、３５ｎｔの相同性アームを示す。斜体ＡＴＧは、ベータアクチンの開始コドンを示す。図３Ａおよび３Ｂのインデルを伴うＨＤＲ（２）は、接合部周辺のインデル形成の例を示す。図３Ｃは、クローン細胞の接合性の特性評価を示す。対立遺伝子１は、両方の接合部で約６８％正確なＨＤＲを有し、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれかまたは両方の末端で３２％のインデルを伴うＨＤＲが生じた。対立遺伝子２は、クローンの約８０％に「Ａ」挿入（∇１ｎｔＡ）、クローンの１８％に２ｎｔ超の欠失（Δ＞２ｎｔ）、および２％の野生型（ｗｔ）を有した。図３Ｄおよび３Ｅは、ＴＡＬＥヌクレアーゼを介したＯＦＰによるベータアクチンのＮ末端標識を示す。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ単独またはドナーＤＮＡを伴うＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を介してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。図３Ｄは、ゲノム編集効率（インデル％）を示し、図３ＥはＯＦＰ陽性細胞の割合（－）およびＯＦＰ陽性ピューロマイシン処理細胞の割合（＋）のフローサイトメトリーによる分析を示す。 同上 同上 同上 同上 Ａ５４９細胞中のＥｍＧＦＰのＬＲＲＫ２へのＮ末端標識化を示す。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、およびプロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＥｍＧＦＰ断片と約３５ｎｔの相同性アームとを含むドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより細胞に送達した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をクローン細胞分離に供した。増殖させた後、クローン細胞を溶解させ、Ｎ末端（図４Ａ）またはＣ末端（図４Ｂ）のいずれかについて、１つの内部プライマーと１つの外部プライマーとを使用するジャンクションＰＣＲにより分析した。あるいは、一対の外部プライマーを使用して、２つの対立遺伝子のゲノム修飾を分析した（図４Ｃ）。得られたＰＣＲ産物を配列決定により分析した。図４Ａおよび４Ｂの太字の配列は、相同性アームを示す。下の矢印は、Ｃａｓ９切断部位またはゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を示す。図４ＣのΔ７ｎｔ＿ｎｏＨＤＲは、ＨＤＲは発生していないが、７ｎｔが欠失していることを示す。 同上 同上 図５Ａ（配列番号５６～６２）、５Ｂ（配列番号６３～６９）、および５Ｃは、ＦＡＫがＥｍＧＦＰでＣ末端標識されている。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および短い相同性アームを有するドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより２９３ＦＴにトランスフェクトした。ピューロマイシン選択後、細胞をクローン細胞分離に供した。接合部をＰＣＲにより増幅した後、Ｎ末端接合部（図５Ａ）またはＣ末端接合部（図５Ｂ）の配列解析を続けた。矢印は、二本鎖切断（ＤＳＢ）、またはゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を示す。正確なＨＤＲの場合、短い相同性アーム（太字）および停止コドン（下線）も示している。インデルを有するＨＤＲの例も、図５Ａおよび５Ｂに示している。図５Ｃは、両方の対立遺伝子のゲノム修飾分析を示す。 同上 同上 ＥＧＦＲを、ＥｍＧＦＰでＣ末端標識した。停止コドンに近いＥＧＦＲのゲノム遺伝子座を標的とするように、ｇＲＮＡを設計した。Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体およびドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより２９３ＦＴ細胞に送達した。ジャンクションＰＣＲおよび配列決定により、クローン細胞を分析した。図６ＡはＮ末端接合部分析（配列番号７０）を示し、図６ＢはＣ末端接合部分析（配列番号７１）を示す。図６Ｃは、各対立遺伝子のゲノム修飾を示す。図６Ｃの∇１ｎｔＡ＿ｎｏＨＤＲは、挿入物のない１つの「Ａ」挿入を指す。 同上 同上 ＤＮＡドナーの末端修飾がＨＤＲ効率に与える効果を示し、図７ＢはＮＨＥＪ阻害剤がＨＤＲ効率に与える効果を示す。図７Ａでは、末端修飾されたＤＮＡプライマーを化学的に合成し、ＰＣＲ増幅によるドナーＤＮＡの調製に使用した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ベータアクチン遺伝子座へのピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＯＦＰ ＤＮＡ断片の挿入効率をフローサイトメトリーアッセイによりモニタリングした。図７Ｂでは、ＮＨＥＪ阻害剤をエレクトロポレーションの直後に培地に加えた。「Ｆ」は順方向プライマーを指し、「Ｒ」は逆方向プライマーを指し、「ＰＳ」はホスホロチオエートを指し、「ＮＨ２」はアミン修飾を指し、「ｓｓＤＮＡ」は一本鎖ＤＮＡを指す。 同上 は、哺乳動物ゲノムにおける組換え抗体のクローニングおよび発現を示す。図８Ａは、プロモーターを持たないピューロマイシン選択マーカー、続く自己切断型２Ａペプチド（配列番号５）を含む抗体発現カセットを示す。ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を、ＣＭＶプロモーターによって駆動した。３５ｎｔの相同性アームをＰＣＲにより追加した。図８Ｂ（配列番号７２～７６）および図８Ｃ（配列番号７７～８２）は、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端接合部分析を示す。二本鎖破断（ＤＳＢ）およびゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を矢印で示している。３５ｎｔの相同性アームおよびいくつかの追加の配列も太字で強調した。ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）および停止コドンを図８Ｃに示している。図８Ｄは、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した、抗体を産生した（＋）または抗体を産生しなかった（－）クローン細胞の相対的割合を示す。 同上 同上 同上 核局在化シグナル（ＮＬＳ）－ドナーＤＮＡ設計（配列番号８３～８４）。ＮＬＳペプチドを接続するために使用したコンジュゲ－ション化学は、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）またはＣＬＩＣＫ－ＩＴ（登録商標）であった。 （配列番号８：８５～９２）。ＮＬＳ－ドナーＤＮＡ構築物で修飾したＨＥＫ２９３系統。左側で、ＧＦＰ遺伝子を、フルオロフォアを構成する６ヌクレオチドの欠失により破壊した。６塩基を含むドナーを追加すると、ＧＦＰ蛍光が回復した。右側は、同様のＢＦＰ遺伝子破壊である。一塩基多型（ＳＮＰ）を有するドナーを追加すると、ＢＦＰコード配列がＧＦＰコード配列に変換された。 ＧＦＰ活性を回復させるための６塩基配列の追加におけるＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴドナーＤＮＡの用量応答。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）連結ＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。 ＰＳまたはＮＬＳオリゴドナーＤＮＡのいずれかを等濃度で使用して編集した細胞のフローサイトメトリー分析。 単一の塩基を編集してＢＦＰ発現細胞をＧＦＰ発現細胞に変換するためのＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。ＳＭＣＣ連結ＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ（ヌクレアーゼなし）構築物の例示的なアーキテクチャの概略図を示す。ヌクレアーゼドメインのないＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ構築物を示す。一部の場合には、ヌクレアーゼドメインは存在し得るが、妨害されていてもよい（例えば、挿入、欠失、および／または置換により）。 ＴＡＬＥＮ結合配列に対して７ｎｔ間隔で設計された「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を追加すると、ＣＭＰＫ１－Ｃ標的でのインデル形成が約２倍改善した。 ＴＡＬＥＮ結合配列に対して最大１００ｎｔ間隔の「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、ＴＡＬＥＮ切断の改善について試験した。 ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ結合配列に対して２０ｎｔ間隔の「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」により、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的でＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰのインデル形成が２０倍超改善した。 「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」により、ＲＮＰがｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９－ＨＦ１またはｅＳｐＣａｓ９のいずれかにより形成されたインデル形成が改善した。 ｓｇＲＮＡおよび「ＣＲ－ＰＡＬ」ｇＲＮＡを作製するためのテンプレートの図解である。 「ＣＲ－ＰＡＬ」の機能の図解である。黒色は、結合能力が１５ｎｔの「ＣＲ－ＰＡＬ」を示し、灰色は、結合能力が２０ｎｔのｓｇＲＮＡを示す。 「ＣＲ－ＰＡＬ」をＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的でＣａｓ９－ＲＮＰと併用すると、インデル形成が６０倍超増大した。 本図は、「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」のためのＮｏ－ＦｏｋＩ Ｃ末端断片の作製を示す。 本図は、試験「Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬ」（２９３ＦＴ）を示す。標的：ＣＭＰＫ１－Ｃ（配列番号１９）、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ：１００ｎｇ／各、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：７ｎｔ間隔（配列番号１８）、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。反復。 本図はＴＡＬＥＮ上のＢｕｄｄｙ ＴＡＬの試験間隔を示す。標的：ＣＭＰＫ１、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。間隔が重要であるため、ＴＡＬをＴＡＬＥＮのすぐ隣に置くことはできない。間隔（０、４、７、２０ｎｔ）は、ＴＡＬの１８個の塩基認識配列と、最も近いＴＡＬＥＮ対との間の間隔を示す。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲの効率の増強についての試験Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬを示す。間隔は切断効率に影響し得る。ＴＡＬ（灰色の六角形）は、ＴＡＬＥＮ（暗灰色の矢印）から７ｎｔ離れていても２０ｎｔ離れていても違いはない。ＴＡＬおよびＣＲＩＳＰＲ標的（黒丸の断片）では、２０ｎｔ離れたＴＡＬが優れている。 本図は、ＣＲＩＳＰＲによる編集のための反復ＴＡＬ－ｂｕｄｄｙを示す。２９３ＦＴ細胞、ＣＲＩＳＰＲ標的：ＵＳＦＰ２、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：２０ｎｔ間隔、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２。反復。 本図は、低性能変異体における高忠実度Ｃａｓ９－回復活性についての試験ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙを示す。標的：ＵＦＳＰ２、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：２０ｎｔ間隔。ＨＦ－ｃａｓ９には検出可能な活性がなく、分析では、ｅＣａｓ９よりも損傷していることが示唆される。ｅＣａｓ９ １．１には、ＴＡＬなしの検出可能な活性はなかった。ＴＡＬを用いると、ｗｔレベルの活性が得られた。これは、所望の標的部位にのみ局在する高忠実度の活性（超高忠実度）を得るので、重要である。 本図は、標準的な活性ｃａｓ９および短縮型ｇＲＮＡを含む試験ＣＲＩＳＰＲ－ＰＡＬを示す。標的：ＵＦＳＰ２、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２、ＣＲ－ＰＡＬ：１５ｍｅｒのｇＲＮＡ、ＣＲ＿ＰＡＬ－左間隔：３６ｎｔ、ＣＲ＿ＰＡＬ－右間隔：１５ｎｔ。Ｃａｓ９は、短縮型ｇＲＮＡ（１５ｍｅｒ）と結合するが、切断しない。（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｋｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０３８（Ｓｅｐｔ．７，２０１５））。標準的なｇＲＮＡ（２０ｍｅｒ）がより良好に切断できるように、短縮型ｇＲＮＡを使用して切断部位を囲み、ＤＮＡを開く。単独で５％だったものから、１５ｍｅｒで５０％以上となる。Ｃａｓ９ ｖ２＋２０ｍｅｒ ｇＲＮＡ＋Ｌ／Ｒ １５ｍｅｒ ｇＲＮＡ。 本図はＢｕｄｄｙ ＴＡＬ活性化因子の概念を示す。ＴＡＬとＶＰ６４などの活性化ドメインとの結合により、ＤＮＡを開いてヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９など）による編集を増強する活性な遺伝子発現が促進される。 本図はＵ２ＯＳにおけるＨＤＲを示す（配列検証）。ドナーにはＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されている。Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。 本図は、小分子／添加剤がＡ５４９細胞におけるＴＡＬＥＮ編集に与える効果を示す。標的：ＨＴＲ２Ａ－Ｎ、ドナーにＨｉｎｄＩＩＩ部位挿入あり、Ｎｅｏｎ（登録商標）条件：１２００／２０／４、２４時間で培地交換、ＨｉｎｄＩＩＩ切断をグラフに表示。ＮＵ７４４１（ＤＮＡＰＫ阻害剤）およびＢ１８Ｒ（免疫応答抑制因子）。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙの相対位置の例を示す。次に、ＴＡＬＥＮ対は、間隔が標的部位の各側で８塩基である。この例では、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙは、ＴＡＬＥＮから７ｎｔの間隔にある。上の鎖は配列番号２０であり、下の鎖は配列番号２１である。 本図は、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的のＣＲＩＳＰＲ切断部位に近接して設計された「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を示す。Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を１１５０パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いた約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）へのトランスフェクションのために、１００ｎｇの左および右「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」ｍＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ（１０００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および２００ｎｇのｓｇＲＮＡ）とともに加えた。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。上の鎖は配列番号４２であり、下の鎖は配列番号４３である。 本図は、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的のＣＲＩＳＰＲ切断部位に近接するように設計された「ＣＲ－ＰＡＬ」を示す。２００ｎｇのＣＲ－ＰＡＬ＿ＬｔおよびＣＲ－ＰＡＬ＿Ｒｔを、野性型Ｃａｓ９－ＲＮＰとともにインキュベートし、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を１１５０パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いて約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。上の鎖は配列番号４４であり、下の鎖は配列番号４５である。 本図は、試験「Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬ」（２９３ＦＴ）を示す。上の鎖は配列番号４６であり、下の鎖は配列番号４７である。 一対のＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ（本明細書では第１および第２のＤＮＡ結合調節増強剤とも称される）と、一対のＴＡＬ－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体（本明細書では第１および第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートとも称される）との併用の概略図である。図の右側および左側は、左側が左ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合、右側が右ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合を示している。長い実線は、細胞内核酸分子の一部（例えば、本明細書では標的遺伝子座とも称される染色体）を表す。示される核酸分子の領域Ａ（左端および右端に示される）は、２つのＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙタンパク質の結合部位（本明細書では第１および第２のエンハンサー結合配列とも称される）である。領域Ｂは、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合部位（例えば、第１および第２のエンハンサー結合配列）とＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質結合部位（本明細書では第１および第２の結合配列とも称される）との間の距離を表す。領域Ｄは、２つのＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質結合部位間の核酸セグメントを表す。領域Ｄの白いボックスは、ＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質の対によって核酸が切断される部位（本明細書では調節部位とも称される）を表す。領域Ｅは、アクセス可能性が増強される可能性がある核酸分子の部分を表す。 一対のＴＡＬ－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合物の代わりに、単一のＴＡＬ－ＶＰ１６融合物（本明細書では調節タンパク質とも称される）を使用することを除いて、図３６のものと同様の概略図である。表示のない円は、ＶＰ１６動員転写複合体の成分を表す。さらに、単一のＴＡＬ－ＶＰ１６融合物を用いるため、領域Ｃは１つしかない。また、領域Ｂは、領域Ａ（本明細書では第１および第２のエンハンサー結合配列とも称される）と領域Ｃ（本明細書では調節結合配列とも称される）との間に介在する塩基対により形成される形成される。 本明細書に記載の様々な実施形態で使用され得るドナー核酸分子のある数の異なる形式を示す。末端の白丸は、ヌクレアーゼ耐性基を表す。２つの円は、２つの基があることを意味する。黒い領域は、別の核酸分子（例えば、染色体ＤＮＡ）の１つ以上の遺伝子座との配列相同性／相補性の領域を表す。クロスハッチ領域は、核酸セグメントの配列相同性／相補性の領域間に位置する核酸を表す。この図は、本発明の様々な態様で使用され得るドナー核酸分子の様々なバリエーションを示す。 モデルＣａｓ９タンパク質であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に基づく、例示的なＣａｓ９形式の概略図である。この１３６８アミノ酸タンパク質は、本図の一番上の実線で表される。Ｖ１～Ｖ５として指定するＣａｓ９タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を構成要素とする融合タンパク質である。点付きのボックスは単節型ＮＬＳを表し、空白のボックスは双節型ＮＬＳを表す。灰色のボックスは、親和性標識（例えば、６ヒスチジン標識など）を表す。 ＴＡＬ切断遺伝子座とドナーＤＮＡ分子の上の概略図との両方のより詳細な図を加えた、図３６と同様の概略図である。ドナーＤＮＡの線による概略図を左下に示す。実線の直線は、標的遺伝子座との相同性の領域を表す。破線の円形の線は、挿入カセットを表す。「Ｘ」記号は、配列相同性の領域を表す。破線の上下矢印は、ドナーＤＮＡ相同性アームの５’および３’鎖における２つのホスホロチオエート連結を表す。ヌクレアーゼ消化の際、これらのホスホロチオエート連結は、１０ヌクレオチド長の５’オーバーハング末端の生成をもたらすような位置である。左側および右側の空白のボックスは、双節型ＮＬＳを表す。線による概略図の右は、挿入カセットの２つの例である。上部の挿入カセットは、挿入遺伝子座の機能の破壊と、ピューロマイシン耐性マーカーの発現との両方を行うように設計されている。下部の挿入カセットは、上部の挿入カセットに類似しているが、組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子を遺伝子座に挿入するようにも設計されている。 Ｃａｓ９ Ｖ１のアミノ酸配列（配列番号９３）を示す。ＮＬＳおよびＨｉｓ標識は、そのように表示されている。 Ｃａｓ９ Ｖ２のアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。ＮＬＳは、そのように表示されている。 一連のＣａｓ９－ＮＬＳ融合タンパク質の形式を示す。「ＮＰ」は、ヌクレオプラスミンＮＬＳを指す。 異なるＣａｓ９－ＮＬＳと２種類の異なる細胞型とを併用して得られたＧＣＤデータを示す。 同上 一般的なＴＡＬＥ構造形式を示す概略図である。部位１、２、および３は、ＤＮＡの認識および結合に関与すると考えられるＴＡＬＥ領域の外側に位置する。 ＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。このＴＡＬＥＮの形式は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ Ｖ３」と称される。Ｎ末端領域は、Ｖ５エピトープおよび「ＧＧ」リンカーを含み、反復領域の前に１３６アミノ酸領域が続く。１３６アミノ酸領域には、（１）反復領域の個々の反復と何らかの配列相同性を有する一連の反復単位（「Ｒ－３」、「Ｒ－２」、「Ｒ－１」、および「Ｒ０」と表示）と、（２）ＴＡＬＥＮが結合する核酸の５´Ｔ要件を緩和するように改変することができる、「Ｔ－Ｌｅｓｓ Ｂｏｘ」、アミノ酸配列「ＲＧＡ」とが含まれる。反復領域には、３４個のアミノ酸の１６個の反復が含まれる。半反復（「Ｒ１／２」と表示）は、反復領域のＣ末端に近接している。２つの核局在シグナル（「ＮＬＳ」と表示）は、さらに、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの前後にタンパク質のＣ末端の方向に位置する。 ＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９６および９７）を示すが、図を簡素化するために反復領域のアミノ酸配列は削除されている。また、本図に示されているタンパク質には、３つのＮＬＳがある。 実施例８で以下に示すように生成された、３つの異なる細胞型における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出データを示す。 実施例８で以下に示すように生成された、２つの異なる細胞型における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出および相同性指向修復データを示す。 実施例８で以下に示すように生成された、Ａ５４９細胞における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出データを示す。 クロマチンを開き、開いたまま維持するためのＴＡＬのいくつかの使用の概略図である。概略図の上部は、細胞内の核酸領域を示し、核酸はヒストンオクタマーと結合してクロマチンを形成する。ＤＮＡの約１４５の塩基対が各オクタマーに巻き付けられており、約１．６ターンである。ヒストンＨ１はこの概略図には表わされていない。破線の矢印は、Ｂｕｄｄｙ－ＴＡＬ結合遺伝子座を示す。「ＴＢＳ」と表示されている縦線の付いたボックスは、ＴＡＬ結合部位を指す。「ＲＮＡ Ｐｏｌ」は、「プロモーター」から「下流」に核酸を転写するＲＮＡポリメラーゼ分子を指す。 Ｂｕｄｄｙ－ＴＡＬのアミノ酸配列（配列番号１１９）を示し、これは、配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列の発現産物である。このＢｕｄｄｙ－ＴＡＬには２つのＮＬＳ（ボックス内）があり、各々タンパク質のＮ末端およびＣ末端に位置する。さらに、通常はＣ末端付近に存在する転写活性化ドメインが削除されている。下線を引いたタンパク質の中央領域は反復領域である。２つのリンカー（ＧＳおよびＧＧ）もボックス内に示す。
概要
本明細書で示す組成物および方法は、遺伝子編集の改善を対象とする。例として、これらの改善には以下が含まれる。
ｉ．核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）の細胞内核酸分子への挿入。挿入された核酸分子は、細胞内核酸分子に存在するプロモーターに作動可能に連結する。
ｉｉ．遺伝子編集を促進するための非相同末端接合阻害剤の使用。
ｉｉｉ．細胞内標的遺伝子座でまたはその近くで結合するＤＮＡ結合分子（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質／核酸複合体）の使用。ＤＮＡ結合タンパク質は、他のＤＮＡ結合分子への標的遺伝子座でのアクセス可能性の増大を促進する。
ｉｖ．遺伝子編集遺伝子座へのドナーＤＮＡ、および細胞内の様々な位置への他のＤＮＡ分子の細胞内送達（例えば、ミトコンドリアへの送達を伴うプロモーターに作動可能に連結したオープンリーディングフレームを含む線形ＤＮＡ分子）。
上記の改善は、個別に使用してもよく、あるいは上に列挙した他の方法、および追加の方法と組み合わせて使用してもよい。
部分的に、本開示は、選択マーカーのプロモーター捕捉と組換えのための短い相同性アームとの併用により、最大１００％正確なＨＤＲでほぼ１００％の組込み効率を可能にする発見に関する。
０．５ｋｂ～２ｋｂの相同性アームを持つ標的化ベクターを使用する従来の方法とは異なり、短い相同性アームを使用すると、目的の外来ＤＮＡのゲノムへのランダムな組込みの発生が最小限に抑えられるように見受けられる。その上、プロモーターを持たない選択マーカーはＤＮＡ分子がゲノム遺伝子座に正確に挿入されたときにのみ発現するため、選択マーカーのプロモーター捕捉を使用することで、正しく組み込まれた種の選択が可能となる。いくつかの実施形態では、例えばホスホロチオエートもしくはアミン基によるドナーＤＮＡの末端修飾、および／またはＮＨＥＪ阻害剤による処理により、ＨＤＲの効率がさらに改善された。ドナーＤＮＡの組込みの精度は、配列依存性である。一部の遺伝子座では、１００％正確なＨＤＲでの１００％の統合効率が達成可能である。
本開示はまた、一部には、細胞内核酸領域の、これらの領域内の細胞内核酸と相互作用する分子または分子複合体へのアクセス可能性を増大させるための組成物および方法に関する。
本開示はさらに、一部には、核酸分子の細胞内局在化のための組成物および方法に関する。一部の場合、核酸分子はドナーＤＮＡ分子となる。
本開示はまた、遺伝子編集、遺伝子活性化、遺伝子抑制、ＤＮＡメチル化などのプロセスを促進するための上記の様々な組み合わせに関する。
本発明は、部分的には、遺伝子編集の増強するための組成物および方法に関する。ある数の変数が遺伝子編集の効率に影響する。相同性指向修復（ＨＤＲ）に関して、これらの因子には以下が含まれる。
（１）（ｉ）ドナーＤＮＡおよび（ｉｉ）細胞核に局在する部位特異的ヌクレアーゼの量、ならびに核内の部位特異的ヌクレアーゼ活性の量、
（２）部位特異的ヌクレアーゼへの標的遺伝子座のアクセス可能性の程度、
（３）細胞核におけるドナーおよびヌクレアーゼの存在に関連するタイミングの側面、
（４）標的遺伝子座の切断効率、
（５）ＨＤＲ効率（ＨＤＲ：ＮＨＥＪ比を含む）、ならびに
（６）ドナーＤＮＡの構造および組成。
一部の場合、特にＨＤＲに関して、ほぼ１００％の遺伝子編集効率を達成できることが予想される。
遺伝子編集試薬の核への局在化：遺伝子編集効率に影響する因子の多くは濃度依存性機序に基づいていると考えられているため、部位特異的ヌクレアーゼ活性の量が多いほど（ヌクレアーゼの活性レベルと存在するヌクレアーゼの量との組み合わせ）、また核内のドナーＤＮＡの濃度が高いほど、ＨＤＲがＮＨＥＪよりも優位となることが予想される。
核酸分子およびタンパク質は細胞内で生成され得るが（ベクターベースの系など）、多くの場合、遺伝子編集系の成分（例えば、ドナーＤＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合調節増強剤など）が細胞に導入されることになる。そのような細胞導入は、トランスフェクションおよびエレクトロポレーションなどの方法によって達成され得る。
遺伝子編集系の成分が細胞に導入されると、典型的には、核への効率的な局在化が望ましい。これは、遺伝子編集系成分のヌクレアーゼへの効率的な局在化が、細胞質の分解（（ｉ）分解活性と（ｉｉ）細胞質中で費やされた時間との組み合わせ）に少なくとも部分的に関係していると考えられているためである。さらに、（１）遺伝子編集系成分と１つ以上のＮＬＳとの関連付け、（２）使用するＮＬＳ（複数可）の選択、および（３）遺伝子編集系成分のうちの１つ以上（例えば、ドナーＤＮＡ）の化学修飾を含むある数の因子が、核局在化の効率に影響し得る。
多くの場合、本明細書に記載の方法で使用される核酸分子は、化学修飾されていてもよい。化学修飾には、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、ホスホロチオエート基、アミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、およびそれらの組み合わせが含まれる。例として、５’および３’末端ｇＲＮＡ分子での３つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでもよく、かつ／または２’－Ｏ－メチルヌクレオチドであってもよい。ドナーＤＮＡのアミン末端修飾によりＨＤＲが増強することも発見された（例えば、図７Ａおよび７Ｂを参照）。これは、両方の場合において、細胞質内のドナーＤＮＡ分子の安定化に少なくとも部分的に起因すると考えられる。ｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９タンパク質との会合により安定すると考えられている。このため、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に結合すると、ｇＲＮＡの細胞質半減期が増大すると考えられる。
遺伝子編集系成分が細胞質分解に関して安定し、細胞質をとおして核内へと急速に「シャトル」されると、遺伝子編集効率が増大することがデータにより示され、またそのように考えられる。細胞質をとおした遺伝子編集系成分の急速な移動には、多くの場合に有益となる別の効果がある。これにより、低い細胞質遺伝子編集系成分プールと併せて、遺伝子編集系成分活性の一時的な高い核濃度が可能となる。このため、遺伝子編集系成分活性の高い核濃度の枯渇が発生すると、追加の遺伝子編集活性のための細胞質リザーバーがほとんどまたはまったくなくなる。
部位特異的標的遺伝子座切断活性：標的遺伝子座切断効率は、ある数の因子によって決定され、そのいくつかは上で説明した。これらの因子には、本明細書に記載のとおり、（１）遺伝子編集系切断活性、（２）標的遺伝子座にまたはその近くに存在する切断媒介性遺伝子編集系成分の量、および（３）遺伝子編集系切断活性への標的遺伝子座のアクセス可能性が含まれる。
遺伝子編集系切断活性への標的遺伝子座のアクセス可能性は、ゲノムもしくは特定の細胞型、またはその中間のどこかでアクセス可能またはアクセス不能であり得るという点で、自然の影響により様々であり得る。標的遺伝子座の転写活性化をその標的遺伝子座の切断前に誘導することにより、遺伝子座は切断活性によりアクセス可能となり得る。特定の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法は、ＤＮＡ結合調節増強剤を使用することである。
部位特異的な標的遺伝子座切断活性に関する１つの考慮すべき事項は、「標的外」効果である。標的外効果は、ＤＮＡ結合調節増強剤、ｇＲＮＡの高い標的遺伝子座特異性、および忠実度の高い遺伝子編集試薬（例えば、忠実度の高いＣａｓ９）を個別にまたは組み合わせて使用することで最小限に抑えることができる。
標的遺伝子座の改変：一般的に行われる遺伝子編集には、主に２つの種類がある。これらは、核酸分子が標的遺伝子座に挿入される場合と、核酸分子が標的遺伝子座に挿入されないが、標的遺伝子座のヌクレオチド配列が改変される場合である。さらに、標的遺伝子座が切断されて「修復」される場合には、３つの可能性がある。標的遺伝子座は、（１）切断前のヌクレオチド配列と比較して改変されない、（２）ドナー核酸挿入のない１つ以上の塩基の欠失もしくは付加により修飾される、または（３）ドナーＤＮＡ挿入が切断部位でまたはその近くで導入される。これらの可能性の最初の２つは、ＮＨＥＪベースの修復機序に起因することが多い。これらの可能性の３番目は、典型的には、ＨＤＲベースの機序に基づく。多くの場合、特にドナーＤＮＡを標的遺伝子座に挿入することが望ましい場合には、３番目の可能性が好ましい。したがって、ＨＤＲの効率を高め、かつ／またはＮＨＥＪよりもＨＤＲを優先する組成物および方法が、本明細書で提供される。
切断部位でのドナー核酸分子の挿入により効率的なＨＤＲをもたらすある数の因子が発見されている。これらの因子のうちのいくつかは、ドナー核酸分子の特徴に関係する。これらの因子のうちの１つは、ドナーＤＮＡ相同性アームの長さである。多くの場合、ドナーＤＮＡ分子は、ドナーＤＮＡが一本鎖であるか二本鎖であるかに応じて、独立して長さが約２０～約２，０００ヌクレオチドまたは塩基対の範囲にある２つの相同性アームを有することになる。さらに、二本鎖ドナーＤＮＡは、一方または両方の末端に３’オーバーハングを有してもよく、これらのオーバーハング（および５’オーバーハング）の長さは、約１０～約４０ヌクレオチドの範囲であってもよい。また、ドナーＤＮＡ分子の相同性アームの一方または両方の一方または両方の鎖は、アーム内の末端または他の位置に位置する１つ以上のヌクレアーゼ耐性基（本明細書の他箇所で考察する）を含んでもよい。
ＮＨＥＪ修復よりもＨＤＲを優先するための方法はいくつかある。１つの方法は、ＮＨＥＪの１つ以上の阻害剤を用いて、遺伝子編集を受けようとしている細胞を処理することによる（図７Ｂ参照）。もう１つは、細胞内ＮＨＥＪ活性の「ノックダウン」によるものである。これは、例えば、１つ以上のＮＨＥＪ修復経路（例えば、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ、触媒サブユニット；Ｋｕ７０；および／またはＫｕ８０）の発現を阻害するように設計された、アンチセンス、マイクロＲＮＡ、および／またはＲＮＡｉ試薬の使用により達成することができる。
定義
本開示に従って利用されるとき、以下の用語は、別段に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
「核酸」は、一本鎖、二本鎖、または複数鎖の形態のいずれかにある、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマー、またはそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの線形配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、典型的には、ポリヌクレオチドの単一ユニット、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾バージョンであり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡとＲＮＡとの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。核酸は直鎖であることも分岐鎖であることもできる。例えば、核酸はヌクレオチドの直線鎖であることができ、あるいは核酸は、例えばヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐を含むように分岐していることができる。任意選択で、分岐核酸は、繰り返し分岐して、デンドリマーなどのようなより高次の構造を形成する。
この用語はまた、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含し、これらは、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。そのような類似体の例には、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（ホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ－メチルホスホロアミダイト連結を含む、ホスホジエステル誘導体（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照）、ならびにペプチド核酸骨格および連結が非限定的に挙げられる。他の類似体核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ ＆ Ｃｏｏｋ，ｅｄｓに記載されている核酸を含めて、正の骨格；非イオン性骨格、修飾糖、および非リボース骨格（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックされた核酸（ＬＮＡ））を有する核酸が含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸も、核酸の１つの定義に含まれる。リボース－リン酸骨格の修飾は、様々な理由で、例えば、生理学的環境でのそのような分子の安定性および半減期を増大させるため、またはバイオチップ上のプローブとして行われ得る。天然の核酸と類似体との混合物を作製することができ、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体との混合物を作製してもよい。実施形態では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、またはその両方の組み合わせである。
核酸には、非特異的配列が含まれ得る。本明細書で使用する場合、「非特異的配列」という用語は、いずれの他の核酸配列とも相補的であるように設計されていないかまたは部分的にのみ相補的である一連の残基を含む核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触したときに阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。「阻害性核酸」は、標的核酸に結合し（例えば、タンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡ）、標的核酸の転写を減少させることができる（例えば、ＤＮＡからのｍＲＮＡ）、または標的核酸の翻訳を減少させることができる（例えば、ｍＲＮＡ）、または転写産物スプライシングを改変することができる（一本鎖モルホリノオリゴ）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体のポリマー）である。
本明細書で使用する場合、「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドまたは塩基の共有結合した配列を指し（例えば、ＲＮＡのリボヌクレオチドおよびＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドであるが、ＤＮＡが別々の鎖または同じ鎖にあるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含む）、ここでは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位置は、ホスホジエステル連結により、次のヌクレオチドのペントースの５’位置に接合する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。核酸分子は、平滑末端または粘着末端を有するスーパーコイルまたは弛緩形成で線状または環状形態で出現し、「ニック」を含んでもよい。核酸分子は、完全に相補的な一本鎖、または少なくとも１つの塩基不一致を形成する部分的に相補的な一本鎖で構成されてもよい。核酸分子は、任意選択でループ配列により一端で分離した二本鎖ステム領域を形成し得る、２つの自己相補的配列をさらに含んでもよい。二本鎖ステム領域を含む核酸分子の２つの領域は、互いに実質的に相補的であり、その結果、自己ハイブリダイゼーションが生じる。しかしながら、ステムには、１つ以上の不一致、挿入、または欠失が含まれ得る。上述のように、核酸分子は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態の核酸分子またはそれらの組み合わせを含んでもよい。化学的に合成された核酸分子は、典型的には長さ１５０ヌクレオチド長以下（例えば、長さ５～１５０、１０～１００、１５～５０ヌクレオチド）の核酸を指してもよく、一方、酵素的に合成された核酸分子は、本出願の他箇所に記載するより小さな核酸分子およびより大きな核酸分子を含んでもよい。核酸分子の酵素的合成には、酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなど、またはそれらの組み合わせを使用する段階的プロセスが含まれ得てもよい。本明細書で提供される「ゲノム編集」または「遺伝子編集」という用語は、酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなど、またはそれらの組み合わせを伴う段階的プロセスを指す。例えば、遺伝子編集には、核酸分子を切断し、切断部位またはその近傍のヌクレオチドを切除し、新しいヌクレオチドを新たに合成し、切断された鎖をライゲーションするプロセスが含まれてもよい。
核酸分子という用語はまた、例えば「プライマー」または「プローブ」と称されることが多い短い核酸分子も指す。プライマーは、多くの場合、酵素的アセンブリ反応用の一本鎖スターター核酸分子と称されるが、プローブは、典型的には、少なくとも部分的に相補的な核酸分子を検出するために使用され得る。核酸分子のホスホジエステル連結は、置換モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素と３’炭素との間で生じるため、核酸分子は「５’末端」および「３’末端」を有する。新しい連結が５’炭素となる核酸分子の末端は、その５’末端ヌクレオチドである。新しい連結が３’炭素となる核酸分子の末端は、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用する末端ヌクレオチドまたは塩基は、３’または５’末端の末端位置にあるヌクレオチドである。核酸分子配列は、より大きな核酸分子（例えば、核酸分子内の配列領域）の内部にある場合でも、５’および３’末端を有すると言うこともできる。
本明細書で使用される「ベクター」は、遺伝物質を細胞に移すための媒体として使用できる核酸分子である。ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはバクテリオファージ、コスミドもしくは人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはインビトロもしくは宿主細胞において複製する、もしくは複製されることが可能な、または所望の核酸断片を宿主細胞内の所望の場所に移送することが可能な他の配列であり得る。実施形態において、ベクターは、少なくとも１つの複製起点、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、および１つ以上の選択マーカーを保有するＤＮＡ分子を指す。ベクターは、典型的には、骨格領域と、少なくとも１つの挿入物、または導入遺伝子領域、またはＤＮＡ断片もしくはＭＣＳなどの導入遺伝子の挿入用に設計された領域とで構成される。骨格領域には、多くの場合、少なくとも１つの宿主および１つ以上の選択マーカーにおける伝播のための複製起点が含まれる。ベクターは、ベクターの本質的な生物学的機能を損失することなく配列が決定可能な様式で切断され得る、またその複製およびクローニングをもたらすために核酸断片がスプライスされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、２個、３個、４個、５個、７個、１０個等）を有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣＲ用）、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択可能なマーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、組換え、転位、または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸断片の挿入方法（ＰＣＲ断片のウラシルＮグリコシラーゼ（ＵＤＧ）クローニング（参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３４，５７５号および同第５，８８８，７９５号）、Ｔ：Ａクローニング、および同様のものなどであるが、これに限定されない）は、本開示に従って使用されるクローニングベクターに断片をクローニングするためにも適用され得る。実施形態では、ベクターは追加の特徴を含む。このような追加の特徴には、天然または合成のプロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性カセット、または選択マーカー（例えば、ｃｃｄＢまたはｔｓｅ２などの毒素）、検出、操作、または精製用のエピトープまたは標識（例えば、Ｖ５エピトープ、ｃ－ｍｙｃ、血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ（商標）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、足場付着領域（ＳＡＲ）、またはレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼなど）が含まれ得る。実施形態では、ベクターは、標的宿主に挿入されたＤＮＡ断片を単離する、増殖させる、または発現させるために使用される。ベクターは、例えば、クローニングベクター、発現ベクター、機能ベクター、捕獲ベクター、共発現ベクター（１つ超のオープンリーディングフレームの発現用）、ウイルスベクター、またはエピソーム（すなわち、染色体外複製が可能な核酸）などであり得る。
本明細書で使用される「クローニングベクター」には、１つ以上の核酸分子を欠失させる、挿入する、置換する、または組み立てるために使用できる任意のベクターが含まれる。実施形態では、クローニングベクターには、別の導入遺伝子またはＤＮＡ断片によって除去または代置され得るカウンター選択マーカー遺伝子（例えば、ｃｃｄＢまたはｔｓｅ２など）が含まれ得る。実施形態では、クローニングベクターは、ドナーベクター、エントリーベクター、シャトルベクター、デスティネーションベクター、標的ベクター、機能ベクター、または捕捉ベクターと称されてもよい。クローニングベクターには、典型的には、ＤＮＡ断片の除去、挿入、または代置のための一連の固有の制限酵素切断部位（例えば、ＩＩ型またはＩＩＳ型）が含まれる。あるいは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により提供され、本明細書の他箇所でより詳細に説明されるＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで用いられるＴＯＰＯ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇまたは組換えによって、ＤＮＡ断片を代置または挿入することができる。標的宿主における導入遺伝子の発現に使用できるクローニングベクターは、発現ベクターとも称され得る。実施形態では、クローニングベクターを操作して、ＴＡＬエフェクターコンジュゲートを得る。
「発現ベクター」は、導入遺伝子の発現用に設計され、一般に、導入遺伝子の発現を駆動する少なくとも１つのプロモーター配列を保有する。本明細書で使用される発現は、導入遺伝子の転写またはオープンリーディングフレームの転写および翻訳を指し、無細胞発現系などの無細胞環境中または宿主細胞中で起こり得る。実施形態では、オープンリーディングフレームまたは遺伝子の発現により、ポリペプチドまたはタンパク質の産生が生じる。発現ベクターは、典型的には、挿入された導入遺伝子の発現を制御するエンハンサー、プロモーター、ターミネーター領域などの１つ以上の調節配列を含むように設計される。好適な発現ベクターには、プラスミドおよびウイルスベクターが非現実的に含まれる。様々な用途のためのベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの商業供給業者から入手可能である。実施形態では、発現ベクターは、ＴＡＬエフェクター融合物の発現のために設計される。
「ウイルスベクター」は、一般に、修飾されたウイルス核酸配列を含む遺伝子操作された非感染性ウイルスに関する。実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも１つのウイルスプロモーターを含み、１つ以上の導入遺伝子またはＤＮＡ断片の挿入のために設計される。実施形態では、ウイルスベクターは、パッケージングまたは他の機能を提供するヘルパーウイルスとともに標的宿主に送達される。実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を宿主細胞のゲノムに安定して組み込むために使用される。ウイルスベクターは、導入遺伝子の送達および／または発現に使用されてもよい。
ウイルスベクターは、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス（鳥類白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルス）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）またはセンダイウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびＳｅｎｄａｉ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス（セムリキ森林ウイルスなど）などのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスに由来し得る。他のウイルスには、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが、非限定的に含まれる。例えば、遺伝子送達に使用される一般的なウイルスベクターは、比較的大きなパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高効率で安定して形質導入する能力に基づいて、レンチウイルスベクターである。そのようなレンチウイルスベクターは、「組込み型」（すなわち、標的細胞のゲノムに組み込むことができる）または「非組込み型」（すなわち、標的細胞のゲノムに組み込まれていない）であり得る。真核生物ウイルス由来の調節要素を含む発現ベクターは、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、およびＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスに由来するベクターにおいて使用されることが多い。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に効果が示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
「標識核酸またはオリゴヌクレオチド」は、核酸に結合した検出可能な標識の存在を検出することにより、核酸の存在を検出するように、共有結合、リンカーもしくは化学結合、または非共有結合を介して、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して結合するものである。あるいは、高親和性相互作用を使用する方法により、ビオチン、ストレプトアビジンなど、一対の結合パートナーの一方が他方に結合する場合に、同じ結果が達成され得る。実施形態では、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格には、本明細書に開示され、当該技術分野で一般的に既知である検出可能な標識が含まれる。
本明細書で使用される「プローブ」または「プライマー」という用語は、１つ以上の核酸断片であって、その試料への特異的ハイブリダイゼーションが検出可能な核酸断片と定義される。プローブまたはプライマーは、使用目的である特定の技術に応じて、任意の長さにすることができる。例えば、ＰＣＲプライマーは、一般に、長さが１０～４０ヌクレオチドである一方、例えばサザンブロット用の核酸プローブは、長さが１００ヌクレオチド超であり得る。プローブは、標識されていなくても、標的または試料への結合を検出できるように以下に記載のように標識されていてもよい。プローブは、染色体の１つ以上の特定の（事前に選択された）部分、例えば、１つ以上のクローン、単離された染色体全体もしくは染色体断片、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のコレクションに由来する核酸の供給源から生成され得る。標的要素に固定された核酸の長さおよび複雑さは、本発明には重要ではない。当業者であれば、これらの因子を調整して、所与のハイブリダイゼーション手順に最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル産生を提供し、異なる遺伝子またはゲノム位置の間で必要な解決案を提供することができる。
プローブはまた、アレイのように、固体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、溶融シリカスライド）に固定された単離された核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、プローブは、例えば、国際公開第９６／１７９５８号に記載されているように、核酸のアレイのメンバーであってもよい。高密度アレイを生成することができる技術も、この目的に使用可能である（例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７－７７３（１９９１）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１－Ｒ１７４（１９９８）、Ｓｃｈｕｍｍｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８７－１０９２（１９９７）、Ｋｅｒｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０－１２４（１９９７）、米国特許第５，１４３，８５４号を参照されたい）。
「相補的」または「相補性」という言葉は、ポリヌクレオチド内の核酸が第２のポリヌクレオチド内の別の核酸と塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列ＡＧＴは配列ＴＣＡに相補的である。相補性は部分的であってもよく、核酸の一部のみが塩基対合に従って一致するか、または完全であり、すべての核酸が塩基対合に従って一致する場合は完全である。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が自然状態で関連する他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。これは、例えば、均質な状態であり得、乾燥または水溶液中のいずれであってもよい。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。製剤中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製される。
「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。一部の実施形態では、核酸またはタンパク質は、少なくとも５０％純粋、任意選択で少なくとも６５％純粋、任意選択で少なくとも７５％純粋、任意選択で少なくとも８５％純粋、任意選択で少なくとも９５％純粋、および任意選択で少なくとも９９％である。
「単離された」という用語はまた、細胞または試料細胞を指してもよい。単離された細胞または試料細胞は、本来の状態にあるとき、または最初に本来の状態から取り除かれたときに通常細胞に付随する成分の多くを実質的に含まない単一細胞型である。ある特定の実施形態では、単離された細胞試料は、細胞を所望の状態に維持するために必要なその自然状態からの成分を保持する。いくつかの実施形態では、単離された（例えば、精製された、分離された）細胞（単数または複数）は、実質的に試料中の唯一の細胞型である細胞である。精製された細胞試料には、１種類の細胞が、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％含まれ得る。単離された細胞試料は、細胞マーカーまたは細胞マーカーの組み合わせを使用して取得され得るが、そのいずれも未精製細胞試料中の１つの細胞型に固有のものである。いくつかの実施形態では、細胞はセルソーターの使用により単離される。いくつかの実施形態では、細胞タンパク質に対する抗体を使用して、細胞を単離する。
本明細書で使用される「野生型配列」は、後続の反応または修飾のためのテンプレートとして使用することができる任意の所与の配列（例えば、単離された配列）を指す。当業者によって理解されるように、野生型配列は、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの組み合わせなど）またはアミノ酸配列を含んでもよく、あるいは異なる化学的実体から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、野生型配列は、インシリコ配列を指してもよく、これは、それ自体の配列情報、または機械デバイスによって読み取り可能および／もしくは編集可能な形式でコンピューター可読媒体に保存できる配列データであってもよい。野生型配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸記号の所与の順序を反映する）は、例えば、ウェブインターフェイスを介して顧客ポータルに入力することができる。実施形態では、顧客によって最初に提供された配列は、それが基準とする下流プロセスを考慮して、配列自体が天然の配列であるか、修飾された配列であるか、すなわち、それが、別の野生型配列に関して修飾されたか、または完全に人工的であるかに関わらず、野生型配列と見なされる。
実施形態では、野生型配列はまた、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはその組み合わせなど）、またはアミノ酸から構成されるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドなどの物理的分子を指してもよい。化学的、酵素的、または他の手段により野生型配列を取得する方法は、当技術分野で既知である。一実施形態では、物理的核酸野生型配列は、対応するテンプレート領域のＰＣＲ増幅により取得されてもよく、または合成オリゴヌクレオチドのアセンブリに基づいて新たに合成されてもよい。本明細書で使用される野生型配列は、天然の、および人工（例えば、化学的または酵素的に修飾された）の部分または構成要素を包含し得る。野生型配列は、２つまたは複数の配列部分で構成され得る。野生型配列は、例えば、コード領域、オープンリーディングフレーム、発現カセット、エフェクタードメイン、反復ドメイン、プロモーター／エンハンサーまたはターミネーター領域、非翻訳領域（ＵＴＲ）であり得るが、定義された配列モチーフ、例えば、所与の配列内の結合、認識、または切断部位であってもよい。野生型配列は、任意の長さのＤＮＡまたはＲＮＡの両方であることができ、線状、環状、または分枝状であることができ、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。
本明細書で使用する場合、「コンジュゲート」という用語は、原子または分子間の会合を指す。会合は、直接的であっても間接的であってもよい。例えば、本明細書で提供される第１の部分（例えば、ヌクレアーゼドメイン）と第２の部分（ＤＮＡ結合ドメイン）との間のコンジュゲートは、例えば共有結合により直接的であっても、例えば非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（パイ効果）、疎水性相互作用など）により間接的であってもよい。実施形態において、コンジュゲートは、コンジュゲーション化学を使用して形成され、コンジュゲーション化学には、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）が含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、およびＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２で考察されている。実施形態において、第１の部分（例えば、ヌクレアーゼ部分）は、第１の部分（例えば、ヌクレアーゼ部分）の成分と第２の部分（ＤＮＡ結合部分）の成分との間の非共有化学反応を介して、第２の部分（ＤＮＡ結合部分）に非共有結合する。他の実施形態では、第１の部分（例えば、ヌクレアーゼ部分）には、１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載の共有反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）が含まれる。他の実施形態では、第１の部分（例えば、ヌクレアーゼ部分）には、１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載の共有反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）とのリンカーが含まれる。他の実施形態では、第２の部分（ＤＮＡ結合部分）には、１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載の共有反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）が含まれる。他の実施形態では、第２の部分（ＤＮＡ結合部分）には、１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載の共有反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）とのリンカーが含まれる。
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、特定の値を含む値の範囲を意味し、当業者であれば、これを特定の値に理にかなって類似するものとみなすであろう。実施形態では、「約」という用語は、当該技術分野で一般に許容される測定値を使用した標準偏差内であること意味する。実施形態では、約は、指定された値の＋／－１０％に及ぶ範囲を意味する。実施形態では、約は指定された値を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用され、ここで、ポリマーはアミノ酸から構成されない部分にコンジュゲートされてもよい。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに該当する。この用語は、大環状ペプチド、非ペプチド機能で修飾されたペプチド、ペプチド模倣体、ポリアミド、およびマクロラクタムに該当する。「融合タンパク質」は、単一の部分として組換えにより発現される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
「ペプチジル」、「ペプチド部分」、「タンパク質部分」、および「ペプチジル部分」という用語は、一価のペプチドまたはタンパク質を意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然および合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、ならびに後から修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニン、メチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似の様式で機能する化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」および「非天然アミノ酸」という用語は、天然には見られないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、およびアミノ酸模倣物を指す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている１文字コードで言及され得る。
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５’末端）に対する位置に基づいて、参照配列内の各アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を順番に識別する番号により示される。最適なアラインメントを決定する際に考慮しなければならない欠失、挿入、短縮、融合などに起因して、一般に、Ｎ末端から単純に数えることによって決定される試験配列のアミノ酸残基番号は、必ずしも参照配列内のその対応する位置の番号と同じである必要はない。例えば、変異体が整列した参照配列に対して欠失を有する場合、欠失部位の参照配列の位置に対応するバリアントにはアミノ酸が存在しないことになる。整列した参照配列に挿入がある場合、その挿入は参照配列の番号付きアミノ酸位置に対応しないことになる。短縮または融合の場合、参照配列または整列配列のいずれかに、対応する配列のアミノ酸に対応しないアミノ酸の伸長が存在し得る。
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用する場合、「に関連して番号付け」または「に対応する」という用語は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの指定された参照配列の残基の番号付けを指す。
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列との両方に該当する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重を理由に、機能的に同一の多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。このため、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、コードされたポリペプチドを改変することなく、記載された対応するコドンのうちのいずれかにコドンを改変することができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も説明する。核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生成できることを、当業者であれば認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関して説明された各配列において暗黙的である。
アミノ酸配列については、コードされた配列における単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸を改変する、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換される「保存的に修飾されたバリアント」であることを、当業者であれば認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子に加えてのものであり、これらを除外しない。
次の８つのグループは、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウで最適に整列された２つの配列を比較することで決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適な整列について、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、一致する位置の数を得るために両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求めることにより計算される。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するか、または手動アライメントおよび目視検査によって測定した場合、比較ウィンドウにわたって、または指定された領域にわたって最大の対応が得られるように比較および整列されたときに、同一であるか、または同じ特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち、本発明の全ポリペプチド配列または本発明のポリペプチドの個々のドメインの指定された領域にわたって、６０％の同一性、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性）２つ以上の配列または部分配列を指す。こうして、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、試験配列の補完も指す。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドの領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００または１０００ヌクレオチド以上の領域にわたって存在する。
配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用してもよく、あるいは代替のパラメータを指定してもよい。次に、シーケンス比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、例えば、全長配列、または２０～６００、約５０～約２００、もしくは約１００～約１５０個のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる群から選択される連続した位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を含み、これにおいて、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同数の隣接する位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性法の検索により、これらのアルゴリズムのカスタマイズされた実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または手動の整列および目視検査により（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、実施することができる。
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムには、クエリ配列内の長さＷの短い単語を識別することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別し、これは、データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、またはそれを満たすものである。Ｔは、近隣単語スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。単語のヒットは、累積整列スコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（１対の一致する残基の報酬スコア、常に＞０）およびＮ（不一致の残基の罰則スコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、累計スコアは、スコアリングマトリックスを使用して計算される。各方向への単語ヒットの伸びは、次の場合に停止する：累積整列スコアが最大達成値から数量Ｘだけ下降する減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基整列が蓄積することにより、累積スコアがゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の終わりに達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３の語長、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に発生する確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と免疫学的に交差反応性であることである。このため、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子またはそれらの補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
「接触」は、その単純な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種が、反応、相互作用、または物理的に触れるのに十分に近くなるプロセスを指す。しかしながら、得られる反応産物は、添加試薬間の反応から直接、または反応混合物中で産生され得る、添加試薬のうちの１つ以上に由来する中間体から産生され得ることを理解されたい。実施形態では、接触には、例えば、本明細書に記載のリボ核酸をエンドヌクレアーゼおよびエンハンサー剤と相互作用させることが含まれる。
「対照」試料または値は、試験試料と比較するための参照、通常は既知の参照として機能する試料を指す。例えば、試験試料は、例えば試験化合物（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の存在下で試験条件から採取され、例えば、試験化合物の非存在下（陰性対照）、または既知の化合物の存在下（陽性対照）で、既知の条件からの化合物と比較され得る。対照はまた、ある数の試験または結果から収集された平均値を表し得る。当業者であれば、対照は、あらゆる数のパラメータを評定するために設計できることを認識するであろう。当業者は、所定の状況においてどの標準対照が最も適切であるかを理解し、標準対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。標準対照は、データの有意性（統計的有意性）を判断するのにも役立つ。例えば、所与のパラメータの値が標準対照において大きく異なる場合、試験試料における変動は有意であるとはみなされない。
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、およびタンパク質、または標的ペプチドと特異的に反応するペプチドもしくは抗体に放射性標識を組み込むことにより検出可能にできる他のエンティティが含まれる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載されている方法を使用して抗体を標識にコンジュゲートするための当該技術分野で既知である任意の適切な方法が用いられ得る。
「標識タンパク質またはポリペプチド」は、標識タンパク質またはポリペプチドに結合した標識の存在を検出することにより、標識タンパク質またはポリペプチドの存在を検出するように、共有結合、リンカーもしくは化学結合、または非共有結合を介して、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して結合するものである。あるいは、高親和性相互作用を使用する方法により、ビオチン、ストレプトアビジンなど、一対の結合パートナーの一方が他方に結合する場合に、同じ結果が達成され得る。
「生物学的試料」または「試料」は、対象または患者から得られたまたは対象または患者に由来する物質を指す。生物学的試料は、生検および剖検試料などの組織切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。そのような試料には、血液および血液画分または製品（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）などの体液、痰、組織、培養細胞（例えば、初代培養、外植片、形質転換細胞）、便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などが含まれる。生物学的試料は、典型的には、哺乳動物、例えば、霊長類、例えばチンパンジーもしくはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギ；またはトリ；爬虫類；または魚などの真核生物から得られる。
本明細書で使用される「細胞」は、そのゲノムＤＮＡを保存または複製するのに十分な代謝または他の機能を実行する細胞を指す。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の色素による染色、子孫を産生する能力、または配偶子の場合には第２の配偶子と組み合わさって子孫を産生する能力を含む、当該技術分野で周知の方法によって識別することができる。細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれ得る。原核細胞には細菌が含まるが、これに限定されない。真核細胞には、酵母細胞、および植物および動物に由来する細胞、例えば哺乳動物、昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。
「遺伝子」という用語は、タンパク質の生産に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これには、コード領域の前後の領域（エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびトレーラー）と、個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）が含まれる。エンハンサー、プロモーター、リーダー、トレーラー、およびイントロンには、遺伝子の転写および翻訳中に必要な調節要素が含まれる。さらに、「タンパク質遺伝子産物」は、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。
遺伝子に関して本明細書で使用される「発現」または「発現される」という用語は、その遺伝子の転写産物および／または翻訳産物を意味する。細胞内のＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、または細胞が産生するＤＮＡによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８）。
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、細胞内で一時的にまたは安定して生じ得る。「一時的発現」の間、トランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂中、娘細胞に移されない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限られているため、遺伝子の発現は時間とともに失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定した発現は、遺伝子が、トランスフェクトされた細胞に選択の利点を付与する別の遺伝子と同時トランスフェクトされるときに生じ得る。そのような選択の利点は、細胞に提示されるある特定の毒素に対する耐性であってもよい。
「プラスミド」という用語は、遺伝子および／または遺伝子の発現に必要な調節要素をコードする核酸分子を指す。プラスミドからの遺伝子の発現は、シスまたはトランスで生じ得る。遺伝子がシスで発現される場合、遺伝子および調節要素は同じプラスミドによりコードされる。トランスでの発現は、遺伝子と調節要素とが別々のプラスミドによりコードされる場合を指す。
「エピソーム」という用語は、細胞内のプラスミドの染色体外状態を指す。エピソームプラスミドは、染色体ＤＮＡの一部ではなく、それとは独立して複製する核酸分子である。
「外因性」という用語は、所与の細胞または生物の外部から生じる分子または物質（例えば、核酸またはタンパク質）を指す。逆に、「内因性」という用語は、所与の細胞または生物に固有の、またはその中で生じる分子または物質を指す。
「細胞培養」は、生物の外部にある細胞のインビトロでの植付けである。細胞培養は、細胞バンクもしくは動物から単離した一次細胞、またはこれらの供給源のうちのいずれかに由来し、長期のインビトロ培養用に不死化させた二次細胞から確立することができる。本明細書で提供される細胞培養は、さらに、適切な細胞栄養素を含み、インビトロで細胞を維持することができる環境を指す。この環境は、適切な容器（例えば、細胞培養皿）内の液体環境、固体環境、および／または半固体環境（例えば、寒天、ゲルなど）であってもよい。細胞培地を用いてもよい。本明細書で使用される「細胞培地」は、当該技術分野で一般に受け入れられている意味に従って使用される。細胞培地（当該技術分野および本明細書では「培地」とも称される）には、細胞の成長（例えば、分裂、分化、維持など）を支援するように設計された液体（例えば、成長因子、ミネラル、ビタミンなど）またはゲルが含まれる。実施形態では、実施形態を含む本明細書で提供される組成物は、生理学的に許容される溶液をさらに含む。本明細書で提供される「生理学的に許容される溶液」は、本明細書で提供される組成物がその生物学的特性を失うことなく中に含まれ得る、任意の許容される水溶液（例えば、緩衝液）を指す。実施形態では、生理学的に許容される溶液は細胞培地である。
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトする」、または「形質導入する」は、互換的に使用することができ、核酸分子および／またはタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウイルスまたはウイルスベースの方法を使用して細胞に導入されてもよい。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする配列であり得る。典型的には、核酸ベクターは、タンパク質発現に必要な要素（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む。トランスフェクションの非ウイルス法には、細胞に核酸分子を導入する送達系としてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない、任意の適切な方法が含まれる。例示的な非ウイルストランスフェクション法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）、およびエレクトロポレーションが含まれる。ウイルスベースの方法の場合、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法に使用することができる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、核酸分子は、当該分野で周知の標準手順に従ってレトロウイルスベクターを使用して、細胞に導入される。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語はまた、外部環境から細胞にタンパク質を導入することを指す。典型的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を通過して目的のタンパク質に到達できるペプチドまたはタンパク質の付着に依存する。例えば、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１－４（２００１）およびＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１１９－１２０（２００７）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子（例えば、ＤＮＡ結合増強剤およびエンハンサー結合配列）を指す。
本明細書で提供される「リボ核タンパク質複合体」、「リボ核タンパク質粒子」、「デオキシリボ核タンパク質複合体」、または「デオキシリボ核タンパク質粒子」は、核タンパク質およびリボ核酸またはデオキシリボ核酸を含む複合体または粒子を指す。本明細書で提供される「核タンパク質」は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合することができるタンパク質を指す。核タンパク質がリボ核酸に結合する場合、これは「リボ核タンパク質」と称される。核タンパク質がデオキシリボ核酸に結合する場合、これは「デオキシリボ核タンパク質」と称される。リボ核タンパク質とリボ核酸またはデオキシリボ核タンパク質とデオキシリボ核酸との相互作用は、例えば共有結合により直接的であっても、例えば非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（パイ効果）、疎水性相互作用など）により間接的であってもよい。実施形態では、リボ核タンパク質は、リボ核酸に非共有結合したＲＮＡ結合モチーフを含む。実施形態では、デオキシリボ核タンパク質は、デオキシリボ核酸に非共有結合したＤＮＡ結合モチーフを含む。例えば、ＲＮＡ結合モチーフまたはＤＮＡ結合モチーフの正に帯電した芳香族アミノ酸残基（例えば、リジン残基）は、ＲＮＡまたはＤＮＡの負の核酸リン酸骨格と静電相互作用を形成し、それによりリボ核タンパク質複合体またはデオキシリボ核タンパク質複合体（例えば、本明細書で言及されるアルゴノート複合体）を形成してもよい。リボ核タンパク質の非限定的な例には、リボソーム、テロメラーゼ、ＲＮＡｓｅＰ、ｈｎＲＮＰ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、および小核ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）が含まれる。デオキシリボ核タンパク質の例はアルゴノートである。リボ核タンパク質またはデオキシリボ核タンパク質は酵素であってもよい。実施形態では、リボ核タンパク質またはデオキシリボ核タンパク質はエンドヌクレアーゼである。このため、実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、エンドヌクレアーゼおよびリボ核酸を含む。実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９である。実施形態では、デオキシリボ核タンパク質複合体は、エンドヌクレアーゼおよびデオキシリボ核酸を含む。実施形態では、エンドヌクレアーゼはアルゴノートヌクレアーゼである。
本明細書で提供される「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、核タンパク質に結合し、それによりリボ核タンパク質複合体を形成することができるリボヌクレオチド配列を指す。同様に、本明細書で提供される「ガイドＤＮＡ」または「ｇＤＮＡ」は、核タンパク質に結合し、それによりデオキシリボ核タンパク質複合体を形成することができるデオキシリボヌクレオチド配列を指す。実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子を含む。実施形態では、ガイドＤＮＡは、１つ以上のＤＮＡ分子を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、標的部位に相補的なヌクレオチド配列（例えば、モジュレーター結合配列）を含む。実施形態では、ｇＤＮＡは、標的部位に相補的なヌクレオチド配列（例えば、モジュレーター結合配列）を含む。相補的なヌクレオチド配列は、リボ核タンパク質複合体またはデオキシリボ核タンパク質複合体の該標的部位への結合を媒介し、それにより、リボ核タンパク質複合体またはデオキシリボ核タンパク質複合体の配列特異性を提供し得る。このため、実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、標的核酸（例えば、モジュレーター結合配列）に相補的である。実施形態では、ガイドＲＮＡは標的核酸配列（例えば、モジュレーター結合配列）に結合する。実施形態では、ガイドＤＮＡは標的核酸配列（例えば、モジュレーター結合配列）に結合する。実施形態では、ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ核酸配列に相補的である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡの相補体は、標的核酸（例えば、モジュレーター結合配列）に対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。本明細書で提供される標的核酸配列は、細胞により発現される核酸配列である。実施形態では、標的核酸配列は外因性核酸配列である。実施形態では、標的核酸配列は内因性核酸配列である。実施形態では、標的核酸配列（例えば、モジュレーター結合配列）は、細胞遺伝子の一部を形成する。このため、実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、細胞遺伝子またはその断片に相補的である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、標的核酸配列（例えば、モジュレーター結合配列）に対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、細胞遺伝子の配列に対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、細胞遺伝子配列に結合する。「標的核酸配列」という用語は、本明細書で提供されるモジュレーター結合配列を指す。
実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは一本鎖リボ核酸である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、長さが核酸残基約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれ以上である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、長さが核酸残基約１０～約３０個である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、長さが核酸残基約２０個である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡの長さは、少なくとも核酸残基または糖残基約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、またはそれ以上である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、長さが、残基５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、５～７５、１０～７５、１５～７５、２０～７５、２５～７５、３０～７５、３５～７５、４０～７５、４５～７５、５０～７５、５５～７５、６０～７５、６５～７５、７０～７５、５～１００、１０～１００、１５～１００、２０～１００、２５～１００、３０～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、５５～１００、６０～１００、６５～１００、７０～１００、７５～１００、８０～１００、８５～１００、９０～１００、９５～１００個、またはそれ以上である。実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡは、長さが、残基１０～１５、１０～２０、１０～３０、１０～４０、または１０～５０個である。
ＰＡＭは「プロトスペーサー隣接モチーフ」を指す。これらの部位は、一般に、Ｃａｓ９によって結合されたＤＮＡ配列に隣接する２～６塩基対のＤＮＡ配列である。このため、一部の場合には、Ｃａｓ９以外のＤＮＡ結合調節増強剤を使用してもよく、他の場合には、単一のＣａｓ９／ＲＮＡ複合体をＤＮＡ結合調節増強剤として使用してもよい（単独で、または異なるＤＮＡ結合調節増強剤と併用して）。
本明細書に記載の特定のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、アルゴノート）の場合、指名されたタンパク質には、タンパク質転写因子活性を（例えば、天然タンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性内に）維持する、タンパク質の天然に存在する形態、またはバリアントもしくは相同体のうちのいずれかが含まれる。いくつかの実施形態では、バリアントまたは相同体は、天然に存在する形態と比較して、配列全体にわたって、または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続アミノ酸部分）で、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照により識別されるタンパク質である。他の実施形態では、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照またはその機能的フラグメントもしくは相同体により識別されるタンパク質である。
このため、本明細書で言及される「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」、「Ｃａｓ９」、または「Ｃａｓ９タンパク質」には、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ酵素活性を（例えば、Ｃａｓ９と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性）維持する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの組換え形態もしくは天然に存在する形態、またはそのバリアントもしくは相同体のうちのいずれかが含まれる。いくつかの態様では、バリアントまたは相同体は、天然に存在するＣａｓ９タンパク質と比較して、配列全体にわたって、または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続アミノ酸部分）で、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって識別されるタンパク質またはそれと実質的な同一性を有するバリアントもしくは相同体と実質的に同一である。Ｃａｓ９は、当該技術分野で「ニッカーゼ」としても知られるタンパク質を指す。実施形態では、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の反復）核酸配列に結合する。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は原核生物の核酸配列である。本明細書で提供される本発明に有用なＣａｓ９タンパク質の例には、非限定的に、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（”Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６７３５０１６）によって記載されているＨｉＦｉ Ｃａｓ９などのｃａｓ９変異タンパク質；修飾されたＰＡＭに結合するＣａｓ９タンパク質、ならびにＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）由来のＣＲＩＳＰＲなどのオーソロガスＣａｓ９タンパク質が含まれる。当該技術分野で一般に知られており、説明されている変異型Ｃａｓ９形態のいずれも、本明細書で提供される方法および組成物に使用され得る。本明細書で提供される方法および組成物について企図される変異型Ｃａｓ９タンパク質の非限定的な例は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉａｎ Ｍ．ら（”Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）：ａａｄ５２２７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６６２８６４３）、およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｐ．ら（”Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６７３５０１６）により説明されている。
本明細書で言及される「アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質」、「ＮｇＡｇｏ」、または「Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート」、「Ｎ．ｇｒｅｇｏｒｙｉ ＳＰ２アルゴノート」という用語には、ＮｇＡｇｏエンドヌクレアーゼ酵素活性を（例えば、野生型ＮｇＡｇｏと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性内に）維持する、ＮｇＡｇｏの組換え形態もしくは天然に存在する形態、またはそのバリアントもしくは相同体のうちのいずれかが含まれる。実施形態では、バリアントまたは相同体は、天然に存在するＮｇＡｇｏタンパク質と比較して、配列全体にわたって、または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続アミノ酸部分）で、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ＮｇＡｇｏタンパク質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）タンパク質識別子ＡＦＺ７３７４９．１によって識別されるタンパク質、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するバリアントもしくは相同体と、実質的に同一である。実施形態では、アルゴノートタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわちＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、追加的なＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。
アルゴノートタンパク質はまた、核酸分子に結合する複合体を形成するタンパク質を指す。したがって、１つのアルゴノートタンパク質は、例えば、ガイドＤＮＡに結合してもよく、別のタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。これらはすべて、ＮｇＡｇｏなどの単一タンパク質と同じ機能を果たす複合体の一部として機能するため、アルゴノートタンパク質とみなされる。
本明細書で使用する場合、「アルゴノート系」という用語は、組み合わされると少なくともアルゴノート関連活性（例えば、二本鎖ＤＮＡの標的遺伝子座特異的な二本鎖切断）をもたらすアルゴノートタンパク質および核酸の集合を指す。
本明細書で使用する場合、「アルゴノート複合体」は、互いに関連して機能活性を有する凝集体を形成するアルゴノートタンパク質および核酸（例えばＤＮＡ）を指す。アルゴノート複合体の例は、標的遺伝子座に特異的なガイドＤＮＡに結合した野生型Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）タンパク質である。
実施形態では、本明細書で言及される「アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質」、「ＮｇＡｇｏ」、または「Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート」、「Ｎ．ｇｒｅｇｏｒｙｉ ＳＰ２アルゴノート」という用語には、ＮｇＡｇｏエンドヌクレアーゼ酵素活性を（例えば、野生型ＮｇＡｇｏと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性内に）維持する、ＮｇＡｇｏの組換え形態もしくは天然に存在する形態、またはそのバリアントもしくは相同体のうちのいずれかが含まれる。実施形態では、バリアントまたは相同体は、天然に存在するＮｇＡｇｏタンパク質と比較して、配列全体にわたって、または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続アミノ酸部分）で、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ＮｇＡｇｏタンパク質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）タンパク質識別子ＡＦＺ７３７４９．１によって識別されるタンパク質、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するバリアントもしくは相同体と、実質的に同一である。実施形態では、アルゴノートタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわちＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、追加的なＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。
アルゴノートタンパク質はまた、核酸分子に結合する複合体を形成するタンパク質を指す。したがって、１つのアルゴノートタンパク質は、例えば、ガイドＤＮＡに結合してもよく、別のタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。これらはすべて、ＮｇＡｇｏなどの単一タンパク質と同じ機能を果たす複合体の一部として機能するため、アルゴノートタンパク質とみなされる。
本明細書で使用する場合、「転写調節配列」という用語は、（１）１つ以上の構造遺伝子（例えば、２個、３個、４個、５個、７個、１０個等）のメッセンジャーＲＮＡへの転写、または（２）１つ以上の遺伝子の非翻訳ＲＮＡへの転写を調節するように機能する、核酸分子上に任意の構成または幾何構造で含有される機能的な一連のヌクレオチドを指す。転写調節配列の例は、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、抑制因子等を含む。
本明細書で使用する場合、「核酸標的化能力」という用語は、配列特異性に基づいて核酸を認識する、および／またはそれに関連する分子または分子の複合体の能力を指す。一例として、調節タンパク質または調節複合体のモジュレーター結合配列またはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子上のハイブリダイゼーション領域への結合により、アルゴノート複合体に核酸標的化能力が付与される。
本明細書で使用する場合、本明細書で提供される「ＴＡＬエフェクター」または「ＴＡＬエフェクタータンパク質」は、１つ超のＴＡＬ反復を含み、配列特異的な方法で核酸に結合することができるタンパク質を指す。実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質は、少なくとも６個（例えば、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１７個、約６～約２５、約６～約３５、約８～約２５、約１０～約２５、約１２～約２５、約８～約２２、約１０～約２２、約１２～約２２、約６～約２０、約８～約２０、約１０～約２２、約１２～約２０、約６～約１８、約１０～約１８、約１２～約１８など）のＴＡＬ反復を含む。実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質は、１８または２４または１７．５または２３．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含む。実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質は、１５．５、１６．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、または２４．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含む。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、ＴＡＬ反復を含む領域に隣接する少なくとも１つのポリペプチド領域を含む。実施形態では、隣接領域は、ＴＡＬ反復のアミノおよび／またはカルボキシル末端に存在する。
本明細書で使用される「調節配列」は、転写および／または翻訳開始、ならびに転写産物またはポリペプチド産物の速度、安定性、および／または移動性に影響を及ぼす核酸配列を指す。調節配列には、プロモーター配列または制御要素、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにコード配列内に存在し得る他の調節配列、例えば、スプライス部位、阻害配列要素（一部のウイルスから既知のＣＮＳまたはＩＮＳと称されることが多い）、分泌シグナル、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列、インテイン、翻訳カプラー配列、本明細書の他箇所でより詳細に記載されるプロテアーゼ切断部位が、非限定的に含まれる。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが、翻訳されず、転写産物の開始部位と翻訳開始コドンとの間に位置し、＋１ヌクレオチドを含み得る。３’ＵＴＲは、翻訳終止コドンと転写産物の末端との間に位置し得る。ＵＴＲは、ｍＲＮＡメッセージの安定性の増大または翻訳の減衰など、特定の機能を有し得る。３’ＵＴＲの例には、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。調節配列は、汎用性であっても、宿主または組織特異的であってもよい。
本明細書で使用される「プロモーター」は、それに作動可能に接続されたときに核酸セグメント（例えば、オープンリーディングフレームを含む導入遺伝子）の転写を指示することができる転写調節配列である。プロモーターは、転写開始部位の上流（通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の近く）に位置するヌクレオチド配列である。プロモーターは、典型的には少なくともコアまたは基底モチーフを含み、上流要素（例えば、上流活性化領域（ＵＡＲ））または他の調節配列または合成要素などの少なくとも１つ以上の制御要素を含むかまたは協働し得る。基底モチーフは、転写開始に必要な転写複合体のアセンブリに必要な最小限の配列を構成する。実施形態では、このような最小配列は、転写開始部位から約１５～約３５ヌクレオチド上流に位置し得る「ＴＡＴＡボックス」要素を含む。基礎プロモーターはまた、転写開始部位の上流に約４０～約２００ヌクレオチド、典型的には約６０～約１２０ヌクレオチドに位置することができる「ＣＣＡＡＴボックス」要素（典型的には配列ＣＣＡＡＴ）および／またはＧＧＣＧＧ配列を含み得る。隣接核酸断片の転写は、プロモーター領域において開始される。抑制可能なプロモーターの転写速度は、抑制剤に応じて減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導剤に応じて増加する。構成的プロモーターの転写速度は、特には調節されないが、全般的な代謝状態の影響下で変動し得る。
発現ベクターに含まれるプロモーターの選択は、効率、選択性、誘導性、望ましい発現レベル、および細胞または組織特異性を非限定的に含むいくつかの要因に依存する。例えば、それぞれ、特定の組織、器官、および細胞型においてのみまたは主にそれらにおいて転写を付与する組織、器官、および細胞特異的プロモーターを使用することができる。実施形態では、本質的に種子に特異的なプロモーター（「種子優先プロモーター」）が有用であり得る。実施形態では、特定の種のほとんどまたはすべての組織で転写を促進することができる構成的プロモーターが使用される。プロモーターの他のクラスには、化学物質、発生刺激、または環境刺激などの外部刺激に応答して転写を付与するプロモーターなどの誘導性プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターは、病原体、または寒さ、熱、ＵＶ光、または高イオン濃度などのストレスによって誘導されてもよく、あるいは化学物質によって誘導されてもよい。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加によって誘導される真核生物のメタロチオネインプロモーター、原核生物のｌａｃＬプロモーター。これは、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクト－ピラノシド（ＩＰＴＧ）に応答して誘導される原核生物のｌａｃＬプロモーター、昇温によって誘導される真核生物の熱ショックプロモーターである。本発明とともに使用するのに好適な多数の追加の細菌および真核生物プロモーターは、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９；３ｒｄ ｅｄ．，２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＺＦＰ ａｒｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ，ｅ．ｇ．，Ｅ．ｃｏｌ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｇｅｎｅ ２２：２２９－２３５（１９８３））に記載されている。そのような発現系のキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当業者に周知であり、これも市販されている。
原核生物タンパク質発現の一般的なプロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーターまたはｔｒｃおよびｔａｃプロモーター（ＩＰＴＧ誘導）、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーター（アンヒドロテトラサイクリン誘導）、ＰＰＢＡＤプロモーター（Ｌ－アラビノース誘導）、ｒ／ｚａＰＢＡＤプロモーター（Ｌ－ラムノース誘導）またはファージプロモーター、例えば、ファージプロモーターｐＬ（温度シフト感受性）、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、またはＴ５である。
哺乳動物タンパク質発現の一般的なプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、ワクシニアウイルスプロモーター、ウイルスＬＴＲ（ＭＭＴＶ、ＲＳＶ、ＨＩＶなど）、Ｅ１Ｂプロモーター、構成的に発現する遺伝子のプロモーター（アクチン、ＧＡＰＤＨ）、組織特異的な様式で発現される遺伝子のプロモーター（アルブミン、ＮＳＥ）、誘導性遺伝子のプロモーター（メタロチオネイン、ステロイドホルモン）である。
植物における核酸の発現のための多数のプロモーターが知られており、それらを本発明の実施に使用してもよい。そのようなプロモーターは、構成的、調節可能、および／または組織特異的（例えば、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的など）であってもよい。植物発現に使用され得る例示的なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５ Ｓプロモーターと、次の遺伝子のプロモーターとが含まれる：ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡＣＴ １１およびＣＡＴ ３遺伝子、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのステアロイル－アシル担体タンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ７４７８２）、ならびにトウモロコシのＧＰＣｌ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５９６）およびＧＰＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５８５５）をコードする遺伝子。追加のプロモーターには、トバモウイルスサブゲノムプロモーター、カッサヤ静脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｙａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣＶＭＶ））プロモーター（維管束要素、葉肉細胞、および根端で高い転写活性を呈する）、トウモロコシの乾燥誘導性プロモーター、およびジャガイモ由来の寒さ、乾燥、高塩誘導性プロモーターが含まれる。植物発現に適した多くの追加のプロモーターは、米国特許第８，０６７，２２２号に見られ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの微細藻類の葉緑体での異種発現は、例えばＲａｓａｌａ ｅｔ ａｌ，”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ”，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅｓ ６７４－６８３，（２０１１）に開示されているように、例えば、ｐｓｂＡ欠乏の遺伝的背景（ｐｓｂＡ／Ｄｌ依存性自動減衰のため）にあるｐｓｂＡプロモーター／５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を使用して、または強力な１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターをｐｓｂＡの５’ＵＴＲに、およびａｔｐＡ遺伝子を発現カセットに融合することにより、達成することができる。核酸をコードするＴＡＬエフェクターの発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、ＴＡＬ－エフェクター融合タンパク質の発現および精製には、典型的には、強力な構成的プロモーターが使用される。対照的に、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ融合タンパク質が遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ融合タンパク質および他の因子の特定の用途に応じて、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかを使用することが望ましいことがある。加えて、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ融合タンパク質の投与に好適なプロモーターは、ＨＳＶチミジンキナーゼなどの弱いプロモーター、または同様の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターには、典型的には、トランス活性化に応答性である要素、例えば、低酸素応答要素、Ｇａｌ４応答要素、ｌａｃ抑制因子応答要素、ならびにｔｅｔ調節系およびＲＵ－４８６系などの小分子制御系も含まれ得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ．Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７（１９９２）、Ｏｌｉｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：４９１－４９６（１９９８）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１（１９９７）、Ｎｅｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４７－１１５５（１９９６）、およびＲｅｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５１－１６１（１９９８）を参照されたい）。ＭＮＤＵ３プロモーターも使用でき、これは、ＣＤ３４＋造血幹細胞で優先的に活性である。
「宿主」は、ベクターの複製またはベクター配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの発現を支援する細胞または生物を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、または酵母、真菌、原生動物、高等植物、昆虫、もしくは両生類細胞などの真核細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３、ＣＯＳ－１などの哺乳動物細胞、例えば、培養細胞（インビトロ）、外植片および初代培養（インビトロおよびエクスビボ）、ならびにインビボの細胞であってもよい。
本明細書で使用する場合、「組換えタンパク質」という語句には、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照）、またはその変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片、およびそのバリアントであってもよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０個など）を伴う組換え反応に関与する、切除もしくは組込みタンパク質、酵素、補因子、または関連タンパク質が含まれる。組換えタンパク質の例には、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｈｉ－Ｃ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、ＳｐＣＣＥｌ、およびＰａｒ Ａが含まれる。
本明細書で使用する場合「組換え部位」という語句は、組換えタンパク質による組込み／組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列を指す。組換え部位は、組込みまたは組換えの初期段階で部位特異的組換えタンパク質によって認識および結合される、関与する核酸分子上の核酸の別個のセクションまたはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位はｌｏｘＶであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能する）で構成される３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１－５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。認識配列の他の例には、本明細書に記載のａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびに組換えタンパク質ラムダファージインテグラーゼより、および補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、Ｆｉｓ、および除去酵素（ラムダファージである）により認識されるその変異体、断片、バリアント、および誘導体が含まれる。
本明細書で使用する場合、「認識配列」という語句は、タンパク質、化学化合物、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識および結合する特定の配列を指す。本発明において、認識配列は、通常、組換え部位を指す。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列はｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１－５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素ラムダファージインテグラーゼによって認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２つの９塩基対コア型Ｉｎｔ結合部位と７塩基対重複領域とを含む約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位と、アーム型Ｉｎｔ結合部位と、補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳ、および除去酵素（ラムダファージである）のための部位とを含む、約２４０塩基対の配列である。（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照されたい。）
この文書全体をとおして、文脈が別途求めない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という言葉は、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、いずれの他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外も意味しないことが理解される。
本明細書で使用する場合、「相同組換え」という用語は、類似のヌクレオチド配列を含む２つのＤＮＡ鎖がゲノム物質を交換する、遺伝子組換えの機序を指す。細胞は減数分裂中に相同組換えを使用し、ＤＮＡを再配列して、完全に固有の一倍体染色体のセットを創出する働きをするが、損傷したＤＮＡの修復、特に二本鎖破断の修復にも役立つ。相同組換えの機序は当業者に周知であり、例えば、Ｐａｑｕｅｓ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ（Ｐａｑｕｅｓ Ｆ，Ｈａｂｅｒ Ｊ Ｅ．；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４９－４０４（１９９９））により説明されている。本発明の方法において、相同組換えは、各々が該標的遺伝子座内の連続ＤＮＡ配列に相同である該ドナーＤＮＡ配列のそれぞれ上流（５’）および下流（３’）に配置された該第１および該第２の隣接要素の存在により可能になる。
本明細書で使用する場合、「非相同末端接合」（ＮＨＥＪ）という用語は、相同性からほとんど独立したプロセスを介して二本鎖破断（ＤＳＢ）の２つの末端を接合する細胞プロセスを指す。天然に存在するＤＳＢは、複製フォークが損傷したテンプレートに遭遇したときのＤＮＡ合成の間に、およびＶ（Ｄ）Ｊ組換え、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座でのクラススイッチ組換え、および減数分裂を含む、ある特定の特殊な細胞プロセスの間に、自然に生成される。加えて、電離放射線（Ｘ線およびガンマ線）、ＵＶ光、トポイソメラーゼ毒、または放射性類似薬に細胞をさらすと、ＤＳＢが生成され得る。ＮＨＥＪ（非相同末端接合）経路は、相同性からほとんど独立したプロセスを介してＤＳＢの２つの末端を接合する。ＤＳＢで生成される特定の配列および化学修飾に応じて、ＮＨＥＪは正確であっても、変異原性であってもよい（Ｌｉｅｂｅｒ Ｍ．Ｒ．，Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１）。
本明細書で使用する場合、「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸」は、相同組換えにより遺伝子座に導入されるように設計された核酸を指す。ドナー核酸は、遺伝子座と配列相同性の少なくとも１つ領域を有することになる。実施形態では、ドナー核酸は、遺伝子座と配列相同性の２つの領域を有することになる。これらの相同性の領域は、一方または両方の末端にあっても、ドナー核酸分子の内部にあってもよい。実施形態では、細胞に存在する核酸分子に導入することを望む核酸を有する「挿入」領域は、相同性の２つの領域の間に位置することになる。
ドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）は、二本鎖、一本鎖、または部分的二本鎖および一本鎖であってもよく、このため、一方または両方の末端にオーバーハング末端（例えば、２つの５’オーバーハング、２つの３’オーバーハング、５’および３’オーバーハング、単一の３’オーバーハング、または単一の５’オーバーハング）を有してもよい。さらに、核酸分子は、環状核酸分子の線状核酸分子（閉じた環状またはニックの入った核酸分子）であってもよい。
本明細書で使用する場合、「相同組換え系」または「ＨＲ系」という用語は、相同組換えによって細胞を改変するために使用され得る本明細書に示される系の構成要素を指す。特に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびアルゴノート編集系。
本明細書で使用する場合、「核酸切断エンティティ」という用語は、核酸切断活性（例えば、二本鎖核酸切断活性）を有する単一分子または分子の複合体を指す。例示的な核酸切断エンティティには、アルゴノート複合体、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＣＲＩＳＰＲ複合体、およびホーミングメガヌクレアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、核酸切断エンティティは、それらが核局在化することを可能にする活性を有する（例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む）。
本明細書で使用する場合、「二本鎖破断部位」という用語は、二本鎖破断が生じる核酸分子内の場所を指す。実施形態では、これは、２つの近接した位置（例えば、約３～約５０塩基対、約５～約５０塩基対、約１０～約５０塩基対、約１５～約５０塩基対、約２０～約５０塩基対、約３～約４０塩基対、約５～約４０塩基対、約１０～約４０塩基対、約１５～約４０塩基対、約２０～約４０塩基対など）での核酸分子のニッキングにより生成される。典型的には、ＧＣ含有量が高い核酸領域と比較して、ＡＴ含有量が高い核酸領域では、ニックはさらに離れていてもよい。
本明細書で使用する場合、「一致した末端」という用語は、９０％超の配列同一性を共有する核酸分子の末端を指す。標的遺伝子座でのＤＳ破断の一致した末端は、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。ドナー核酸分子の一致した末端は、一般的には、一本鎖となる。
本明細書で使用する場合、「相同性指向修復」または「ＨＤＲ」は、ＤＮＡの二本鎖破断（ＤＳＢ）を修復するための細胞内の機序である。いくつかの実施形態では、ＨＤＲは、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である。
ＨＤＲの一般的な形態は、類似のヌクレオチド配列を含む２つのＤＮＡ鎖がゲノム物質を交換する、遺伝子組換えの機序を指す。細胞は減数分裂中に相同組換えを使用し、ＤＮＡを再配列して、完全に固有の一倍体染色体のセットを創出する働きをするが、損傷したＤＮＡの修復、特に二本鎖破断の修復にも役立つ。相同組換えの機序は当業者に周知であり、例えば、Ｐａｑｕｅｓ Ｆ．，ＨａｂｅｒＪ．Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４９－４０４（１９９９）により説明されている。いくつかの実施形態では、相同組換えは、各々が切断された核酸分子内の連続ＤＮＡ配列に相同であるドナー核酸配列のそれぞれ上流（５’）および下流（３’）に配置された一致した末端の存在により可能になる。
いくつかの実施形態には、細胞（例えば、真核細胞、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、およびヒト細胞を含む、昆虫細胞および哺乳動物細胞などの植物細胞および動物細胞）における相同組換えの高効率をもたらすように設計された組成物および方法が含まれる。いくつかの実施形態では、相同組換え効率は、集団中の細胞の２０％超が所望の標的遺伝子座（単数または複数）で相同組換えを受けるようなものである。いくつかの実施形態では、相同組換えは、集団中の細胞の１０％～６５％、１５％～６５％、２０％～６５％、３０％～６５％、３５％～６５％、１０％～５５％、２０％～５５％、３０％～５５％、３５％～５５％、４０％～５５％、１０％４５％、２０％～４５％、３０％～４５％、４０％～４５％、３０％～５０％などにおいて生じ得る。
さらに、いくつかの実施形態には、細胞内の相同組換えの効率を増大させるための組成物および方法が含まれる。例えば、ある組の条件下で細胞集団の１０％において、別の組の条件下では細胞集団の４０％において相同組換えが生じる場合には、相同組換えの効率は３００％増加したことになる。いくつかの実施形態では、相同組換えの効率は、１００％～５００％（例えば、１００％～４５０％、１００％～４００％、１００％～３５０％、１００％～３００％、２００％～５００％、２００％～４００％、２５０％～５００％、２５０％～４００％、２５０％～３５０％、３００％～５００％など）増大し得る。
本明細書で使用する場合、「二本鎖破断」または「ＤＳＢ」は、核酸分子の二本鎖破断を指す。多くの実施形態では、ＤＳＢは、２つの近接した位置（例えば、３～５０塩基対、５～５０塩基対、１０～５０塩基対、１５～５０塩基対、２０～５０塩基対、３～４０塩基対、５～４０塩基対、１０～４０塩基対、１５～４０塩基対、２０～４０塩基対など）での核酸分子のニッキングにより生成される。ＧＣ含有量が高い核酸領域と比較して、ＡＴ含有量が高い核酸領域では、ニックはさらに離れていてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖破断は、核酸分子のＮ末端標識化のためのＡＴＧ開始コドンから２５０ｂｐ以下であるか、または核酸分子のＣ末端標識化のための停止コドンから２５０ｂｐ以下である。
本明細書で使用する場合、「ドナー核酸分子」または「ドナーＤＮＡ」は、相同組換えにより切断された核酸分子に導入されるように設計された核酸を指す。ドナー核酸分子は、切断された核酸分子と配列相同性の少なくとも１つの領域を有することになる。多くの実施形態において、ドナー核酸分子は、遺伝子座と配列相同性の２つの領域を有することになる。これらの相同性の領域は、一方または両方の末端にあっても、ドナー核酸分子の内部にあってもよい。
本明細書で使用する場合、「組込み効率」は、目的の外来ＤＮＡのセグメントが初期核酸分子に組み込まれる頻度を指す。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の組込み効率は、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である。
表１は、３つの異なる哺乳類細胞株の４つの異なるゲノム遺伝子座で、ほぼ１００％の組込み効率および最大１００％の正確なＨＤＲが見られたことを示す。一部の遺伝子座では、接合部またはＣａｓ９切断部位での欠失および挿入が観察された。
Figure 2023168355000001
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートまたはアミン基によるドナーＤＮＡの末端修飾、および／または非相同末端接合阻害剤（ＮＨＥＪ）阻害剤による処理により、ＨＤＲの効率をさらに改善することができる。
本明細書で使用する場合、「一致した末端」は、９０％以上の配列同一性を共有する核酸分子の末端を指す。いくつかの実施形態では、５’および３’末端の一致した末端は、１２ｂｐ～２５０ｂｐ、１２ｂｐ～２００ｂｐ、１２ｂｐ～１５０ｂｐ、１２ｂｐ～１００ｂｐ、１２ｂｐ～５０ｂｐ、または１２ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する。いくつかの実施形態では、一致する末端は、３５ｂｐの長さを有する。いくつかの実施形態では、一致した末端は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％、または１００％に等しい配列同一性を共有することになる。標的遺伝子座での二本鎖破断の一致した末端は、二本鎖ＤＮＡであっても、一本鎖ＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子の一致した末端は、一本鎖となる。
一致した末端が標的遺伝子座で核酸と共有する配列同一性の量は、典型的には、相同組換え効率が高い。相同領域がかなり短い場合（例えば、５０塩基）、高レベルの配列同一性が特に所望される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座と一致した末端の間の配列同一性の量は、９０％超（例えば、９０％～１００％、９０％～９９％、９０％～９８％、９５％～１００％、９５％～９９％、９５％～９８％、９７％～１００％など）となる。
本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウで最適に整列された２つの核酸配列を比較することで決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適な整列について、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、配列整列ギャップ）を含み得る。言い換えると、配列整列ギャップは、定量化の目的で除去される。配列同一性の割合は、一致する位置の数を得るために両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求めることにより計算される。
配列同一性値を決定するための１つの方法は、初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴ ２．０スイートのプログラムの使用によるものである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎをとおして公開されている。
いくつかの実施形態では、末端は、相同組換えに関連する１つ以上の特徴が異なってもよい。例えば、標的遺伝子座に対する配列相補性の末端「一致」領域の長さが異なっていてもよい。このため、一方の末端は４０ヌクレオチドの配列相補性を有し、もう一方の末端は１５ヌクレオチドのみの配列相補性を有してもよい。一部の実施形態では、ドナー核酸分子の一方または両方の末端は、部分的または完全に一本鎖となる。
本明細書で使用する場合、「プロモーターを持たない選択マーカー」は、プロモーターを含むゲノム遺伝子座への挿入後にのみ発現するように、プロモーターを有しない目的の外来遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは、タンパク質、抗生物質耐性選択マーカー、細胞表面マーカー、細胞表面タンパク質、代謝産物、またはそれらの活性断片である。いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは標識（例えば、ＥｍＧＦＰまたはＯＦＰ）である。一実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーは、ピューロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素、またはグルタミンシンテターゼである。
プロモーターを持たない選択マーカーは、レポーター遺伝子に直接連結することができ、あるいはドナー核酸分子は、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子間の「リンカー」として作用する追加のアミノ酸配列を含むことができる。リンカーは、ポリペプチドまたは当該技術分野で既知である任意の他の好適なリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、２、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはポリグリシンリンカーである。いくつかの実施形態では、ポリグリシンリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のグリシン残基を含む。一実施形態では、リンカーは６残基ポリグリシンである。いくつかの実施形態では、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間の距離は、３００ｎｔ、２４０ｎｔ、１８０ｎｔ、１５０ｎｔ、１２０ｎｔ、９０ｎｔ、６０ｎｔ、３０ｎｔ、１５ｎｔ、１２ｎｔ、または９ｎｔ以下である。
本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」は、その産物を容易にアッセイすることができる遺伝子を指し、遺伝子発現の調節を研究するための、正常に修飾された細胞をスクリーニングするためのマーカーとして使用でき、あるいは組換え効率を標準化するための対照として機能し得る。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は選択可能なマーカーである。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）レポーターまたはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）レポーターなどの蛍光レポーターである。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（例えば、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（ｐｙｒａｌｉｓｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））などの発光レポーターである。他の一般的に使用されるレポーター遺伝子は、β－グルクロニダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼである。理想的には、レポーター遺伝子は、研究で使用される細胞に存在しないか、遺伝子の天然形態と容易に区別でき、便利にアッセイでき、線形検出範囲が広く、細胞の正常な生理機能および一般的な健康に影響を与えないものであるべきである。
本明細書で使用する「自己切断ペプチド」とは、翻訳時に成分タンパク質に解離するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子を連結し、プロモーターを持たない選択マーカーが、初期核酸分子への組換え後の翻訳中にレポーター遺伝子から解離することを可能にする。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、自己切断２Ａペプチド、または当業者に既知である他の自己切断ペプチドである。
いくつかの実施形態では、「ｌｏｘＰ」または「Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座」は、自己切断ペプチドの代替または追加として、プロモーターを持たない選択マーカーのいずれかの側に配置される。ＬｏｘＰは、プロモーターを持たない選択マーカーの複製を促進するために、組換えのＣｒｅ－ｌｏｘ戦略の一部として使用されてもよい。Ｃｒｅ－ｌｏｘ戦略には、少なくとも２つの成分が必要となる：１）２つのｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒する酵素であるＣｒｅリコンビナーゼ、および２）ｌｏｘＰ部位（例えば、組換えが起こる８ｂｐコア配列と、２つの隣接する１３ｂｐ逆反復からなる配列とからなる配列による特定の３４塩基対）または変異ｌｏｘ部位。（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２：１６０－４（１９９５）、Ｎａｇｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ２６：９９－１０９（２０００）、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０（１９）：ｅ１０３（２００２）、および米国第２０１００２９１６２６Ａ１号を参照されたい）。例示的なｌｏｘＰ部位には、野生型、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、およびｌｏｘ６６が含まれるが、これらに限定されない。ｌｏｘＰにより、後でプロモーターを持たない選択マーカーを除去できるようになる。このようにして、編集された集団を選択し、その後、プロモーターを持たない選択マーカーを除去し得る。これにより、さらに編集が必要な場合は、プロモーターを持たない選択マーカーを追加で使用できるようになる。
本明細書で使用する場合、「非相同末端接合」（ＮＨＥＪ）は、相同性からほとんど独立したプロセスを介して二本鎖破断（ＤＳＢ）の２つの末端を接合する細胞プロセスを指す。天然に存在するＤＳＢは、複製フォークが損傷したテンプレートに遭遇したときのＤＮＡ合成の間に、およびＶ（Ｄ）Ｊ組換え、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座でのクラススイッチ組換え、および減数分裂を含む、ある特定の特殊な細胞プロセスの間に、自然に生成される。加えて、電離放射線（Ｘ線およびガンマ線）、ＵＶ光、トポイソメラーゼ毒、または放射性類似薬に細胞をさらすと、ＤＳＢが生成され得る。ＤＳＢで生成される特定の配列および化学修飾に応じて、ＮＨＥＪは正確であっても、変異原性であってもよい（（Ｌｉｅｂｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１（２０１０））。
本明細書で使用する場合、「非相同末端接合阻害剤」または「ＮＨＥＪ阻害剤」は、非相同末端接合プロセスを阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ドナー核酸分子は、少なくとも１つのＮＨＥＪ阻害剤で処理される。ＮＨＥＪ阻害剤の例には、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＮＡポリメラーゼ１もしくは２（ＰＡＲＰ－１またはＰＡＲＰ－２）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤には、Ｎｕ７２０６（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ナフトール［１，２－ｂ］ピラン－４－オン）、Ｎｕ７４４１（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン）、Ｋｕ－００６０６４８（４－エチル－Ｎ－［４－［２－（４－モルホリニル）－４－オキソ－４Ｈ－１－ベンゾピラン－８－イル］－１－ジベンゾチエニル］－１－ピペラジンアセトアミド）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，１－ａ］イソキノリン－４－オン）、ＤＭＮＢ（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンズアルデヒド）、ＥＴＰ ４５６５８（３－［１－メチル－４－（４－モルホリニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－６－イルフェノール）、ＬＴＵＲＭ３４（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１，３－ベンゾオキサジン－４－オン）、およびＰｌ１０３塩酸塩（３－［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル］フェノール塩酸塩）が含まれる。
本明細書で使用する場合、「標的遺伝子座」は、核酸切断エンティティによって認識および切断される核酸分子内の部位を指す。例えば、単一ＣＲＩＳＰＲ複合体が二本鎖核酸を切断するように設計されている場合には、標的遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される切断部位および周囲の領域である。例えば、２つのＣＲＩＳＰＲ複合体が、近接する二本鎖核酸をニッキングして二本鎖破断を創出するように設計されている場合には、両方のＣＲＩＳＰＥＲ複合体により認識され、破断点を含む、囲繞する領域は、標的遺伝子座と称される。
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ耐性基」は、核酸分子に組み込まれてもよく、この基を含む核酸分子の酵素（エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）分解を阻害できる化学基を指す。そのような基の例には、ホスホロチオエート基、アミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、および５－Ｃ－メチルヌクレオチドが含まれる。ヌクレアーゼ耐性基は、ドナー核酸分子中のある数の場所に位置してもよい。いくつかの実施形態では、細胞ヌクレアーゼは、ドナー核酸分子のこの部分を消化する。これらのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ耐性基によって停止または減速され、それにより、ドナー核酸分子の構造が安定する。
本発明の実施形態には、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７など）のヌクレアーゼ耐性基を含有する核酸分子を含む組成物、ならびにそのようなドナー核酸分子を作製および使用する方法が含まれる。多くの実施形態では、ヌクレアーゼ耐性基は、ドナー核酸分子の一方または両方の末端に位置する。ドナー核酸分子は、一方または両方の末端から内部に基を含んでもよい。多くの実施形態では、そのようなドナー核酸分子の一部またはすべてが細胞内で処理されて、ＤＳ破断部位に一致する末端が生成される。
本明細書で使用する場合、「細胞内標的化部分」という用語は、細胞内位置への局在化を促進する化学エンティティ（例えば、ポリペプチド）を指す。細胞内標的化部分の例には、核局在化シグナル、葉緑体標的化シグナル、およびミトコンドリア標的化シグナルが含まれる。
本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトもしくは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）または植物を指す。
本明細書で使用する場合、「治療する」は、有効量のプロモーターを持たない選択マーカーを対象に投与することにより、対象の疾患、障害、または状態の少なくとも１つの症状を減少させることを指す。
本明細書で使用する場合、「核酸切断エンティティ」は、核酸切断活性（例えば、二本鎖核酸切断活性）を有する１つ以上の分子、酵素、または分子の複合体を指す。ほとんどの実施形態では、核酸切断エンティティ成分は、タンパク質もしくは核酸、またはこの２つの組み合わせのいずれかであるが、補因子および／または他の分子と関連していてもよい。核酸切断エンティティは、典型的には、標的遺伝子座でのＤＳ破断生成の効率、標的遺伝子座のまたはその近くの好適な位置でＤＳ破断生成を生成する能力、望ましくない遺伝子座でのＤＳ破断生成の可能性の低さ、低毒性、コストの問題など、ある数の因子に基づいて選択されることになる。これらのある数の要因は、用いる細胞および標的遺伝子座によって異なることになる。いくつかの核酸切断エンティティが、当該技術分野で既知である。例えば、いくつかの実施形態では、核酸切断エンティティには、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、アルゴノート－核酸複合体、またはマクロヌクレアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、核酸切断エンティティは、それらが核局在化することを可能にする活性を有する（例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む）。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡドナーは、ニックまたはニックの組み合わせをもって機能し得る。
ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）
本明細書で使用する場合、「ジンクフィンガータンパク質」（ＺＦＰ）は、亜鉛により安定するヌクレアーゼドメインおよび核酸（例えば、ＤＮＡ）結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。個々のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質またはポリペプチドが、少なくとも１本の指、より典型的には２本の指、または３本の指、またはさらには４本もしくは５本の指から、少なくとも６本またはそれ以上の指を有するため、典型的に「フィンガー」と称される。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、３本または４本のジンクフィンガーを含むことになる。各指は、典型的には、２～４つのＤＮＡ塩基対に結合する。各指は、約３０個のアミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合領域を含んでもよい（例えば、米国特許公開第２０１２／０３２９０６７ Ａ１号参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
ヌクレアーゼドメインの一例は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインであり（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６－６０（１９９６））、典型的には５～７塩基対のリンカー配列により分離されている。ＦｏｋＩ切断ドメインの対は、一般に、ドメインの二量化および反対の鎖からの非回文標的配列の切断を可能にするために必要である。個々のＣｙｓ2Ｈｉｓ2 ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３個から６個の間の個々の亜鉛－フィンガー反復を含有し、それぞれ９個から１８個の塩基対を認識し得る。
ＺＦＰに関する１つの問題は、標的外の切断の可能性であり、これはドナーＤＮＡのランダムな組込みをもたらす、または染色体再配置もしくはさらには細胞死をもたらす可能性があり、これは依然として高等生物における適用可能性に関する問題を提起する（Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：７４３－７５３（２０１０））。
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）
本明細書で使用する場合、「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、１つ超のＴＡＬ反復から構成されるタンパク質を指し、配列特異的様式で核酸に結合することができる。ＴＡＬＥは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａなどの植物病原細菌の種により、植物細胞の感染後にそのＩＩＩ型分泌系を介して分泌されるＤＮＡ結合タンパク質のクラスを表す。天然のＴＡＬＥは、植物のプロモーター配列に結合することで、遺伝子発現を調節し、エフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化して、細菌の増殖を促進することが具体的に示されている（Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４５－６４８（２００７）、Ｂｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．４８：４１９－４３６（２０１０）、Ｋａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１（２００７）、Ｋａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３７－４３（２００９））。
天然のＴＡＬＥは、一般に、中央反復ドメインおよびカルボキシル末端核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）により特徴付けられる。中央反復ドメインは、典型的には、半反復と呼ばれる一般により短いカルボキシル末端反復を除いて通常３３～３５残基の長さである１．５から３３．５の間の可変量のアミノ酸反復からなる。反復は、ほとんどの場合同一であるが、ある特定の超可変残基において異なる。ＴＡＬＥのＤＮＡ認識特異性は、典型的には各反復の１２位および１３位、いわゆる反復可変２残基（ＲＶＤ）において超可変残基により媒介され、各ＲＶＤは、所与のＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチドを標的化する。したがって、ＴＡＬタンパク質中の反復の逐次的順序は、所与のＤＮＡ配列内のヌクレオチドの定義された線形順序と相関する傾向がある。いくつかの自然発生ＴＡＬＥの基礎的ＲＶＤコードが特定されており、所与のＤＮＡ配列に結合するために必要な逐次的反復順序の予測が可能となっている（Ｂｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２（２００９）、Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１（２００９））。さらに、新しい反復の組み合わせで生成されたＴＡＬエフェクターは、このコードにより予測された標的配列に結合することが示されている。標的ＤＮＡ配列は、一般に、ＴＡＬタンパク質により認識される５’チミン塩基で開始することが示されている。
ＴＡＬのモジュール構造は、ＤＮＡ結合ドメインとエフェクター分子、例えばヌクレアーゼとの組み合わせを可能にする。特に、ＴＡＬＥヌクレアーゼにより、新たなゲノム工学ツールの開発が可能となる。
いくつかの実施形態で使用するＴＡＬＥは、ＤＳ破断を生成してもよく、またはＤＳ破断を生成するための複合作用を有してもよい。例えば、ＴＡＬ－－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体は、標的遺伝子座でまたはその近くで結合し、２つのＦｏｋＩドメインの会合により二本鎖核酸切断活性を形成するように設計することができる。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、６個以上（例えば、８、１０、１２、１５、もしくは１７以上、または６～２５、６～３５、８～２５、１０～２５、１２～２５、８～２２、１０～２２、１２～２２、６～２０、８～２０、１０～２２、１２～２０、６～１８、１０～１８、１２～１８など）のＴＡＬ反復を含むことになる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、１８または２４または１７．５または２３．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含んでもよい。追加の実施形態では、ＴＡＬＥは、１５．５、１６．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、または２４．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含んでもよい。ＴＡＬＥは、一般に、ＴＡＬ反復を含む領域に隣接する少なくとも１つのポリペプチド領域を有することになる。多くの実施形態では、ＴＡＬ反復のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に隣接領域が存在することになる。例示的なＴＡＬＥは、米国特許公開第２０１３／０２７４１２９ Ａ１号に示されており（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属の細菌に見られる天然に存在するタンパク質の修飾形態であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、核への輸送を可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。
ＣＲＩＳＰＲベース系
「ＣＲＩＳＰＲ」または「クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の反復」という用語は、３種類の系、および系の亜型に適用される一般的用語である。一般に、ＣＲＩＳＰＲという用語は、ＣＲＩＳＰＲ系成分（例えばコードされたｃｒＲＮＡ）をコードする反復領域を指す。それぞれ異なる特徴を有する３種類のＣＲＩＳＰＲ系（表２）が特定されている。
Figure 2023168355000002
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ複合体」は、互いに関連して機能活性を有する凝集体を形成するＣＲＩＳＰＲタンパク質および核酸（例えばＲＮＡ）を指す。ＣＲＩＳＰＲ複合体の例は、標的遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡに結合した野生型Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１と称されることがある）タンパク質である。
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」は、核酸（例えばＲＮＡ）結合ドメイン核酸およびエフェクタードメイン（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９、またはＣＰＦ１ （切断およびポリアデニル化因子１）を含むタンパク質を指す。核酸結合ドメインは、所望の標的核酸（例えばガイドＲＮＡ）にハイブリダイズすることができる領域を有する第１の核酸分子と相互作用するか、または所望の標的核酸（例えばｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズすることができる領域を有する第２の核酸との相互作用を可能にする。ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわちＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、追加的なＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含んでもよい。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、上で参照された第１の核酸分子に結合する複合体を形成するタンパク質を指す。したがって、１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質は、例えば、ガイドＲＮＡに結合してもよく、別のタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。これらは、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１などの単一タンパク質と同じ機能を果たす複合体の一部として機能するため、すべてＣＲＩＳＰＲタンパク質とみなされる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、核への輸送を可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
いくつかの実施形態で使用するＣＲＩＳＰＲは、ＤＳ破断を生成してもよく、またはＤＳ破断を生成するための複合作用を有してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体がＤＳを破断するのを防ぎながら、これらの複合体がＤＮＡにニックを入れることを可能にする突然変異を、ＣＲＩＳＰＲ成分に導入してもよい。二本鎖切断を作製するのではなくＤＮＡにニックを入れるＣａｓ９タンパク質の調製を可能にする変異が、Ｃａｓ９タンパク質で同定されている。このため、いくつかの実施形態には、このタンパク質のヌクレアーゼ活性をニッキング活性に制限するＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメインに変異を有するＣａｓ９タンパク質の使用が含まれる。
本明細書で提供される「ｄＣａｓ９」という用語は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９を指す。実施形態では、ＤＮＡ結合調節増強剤は、ｄＣａｓ９ドメインに結合したガイドＲＮＡであってもよい。他の実施形態では、調節複合体は、ｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ドメインであり、調節複合体は、Ｃａｓ９ドメインに作動可能に連結したＶＰ１６転写活性化ドメインをさらに含む。そのような系は、例えば、哺乳動物細胞における内因性遺伝子の発現を誘導するために使用され得る。当業者であれば、使用されるＤＮＡ結合調節増強剤の種類が細胞型および特定の用途に左右されることを直ちに認識するであろう。
多くの場合、ｄＣａｓ９タンパク質は、タンパク質のヌクレアーゼ活性を不活性化する、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの各々に少なくとも１つの変異を有することになる。
使用され得るＣＲＩＳＰＲ系は大きく異なる。これらの系は、一般に、タンパク質および第１の核酸を含む複合体を形成することができるという機能的活性を有し、この複合体は第２の核酸を認識する。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であり得る。好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６が含まれる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９タンパク質に由来するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）誘導エンドヌクレアーゼとして作用するように設計される。この機能および本明細書に記載の他の機能のためのＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａに由来し得る。
アルゴノート遺伝子編集系
タンパク質のアルゴノートファミリーは、核酸標的を切断するためのガイドとして５’リン酸化一本鎖核酸を使用するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９のようなこれらのタンパク質は、遺伝子発現の抑制および外因性核酸に対する防御に役割を果たすと考えられている。
アルゴノートタンパク質は、いくつかの点でＣａｓ９と異なる。原核生物にのみ存在するＣａｓ９とは異なり、アルゴノートタンパク質は進化的に保存されており、ほぼすべての生物に存在する。いくつかのアルゴノートタンパク質は、一本鎖ＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡ分子を切断することがわかっている。さらに、アルゴノート結合にはガイドの特定のコンセンサス二次構造は必要とされず、またＣＲＩＳＰＲ系ＰＡＭ部位のような配列は必要とされない。Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉのアルゴノートタンパク質は、一本鎖ＤＮＡガイドをもってプログラムでき、哺乳類細胞のゲノム編集として使用できることが示されている（Ｇａｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：７６８－７３（２０１６））。
アルゴノートタンパク質には、長さ約２４ヌクレオチドの５´リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ分子が必要とされる。例えば、表１２の配列番号６にあるアルゴノートのアミノ酸配列を参照されたい。
細胞への物質の導入
細胞への様々な分子の導入は、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、および Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ｖｏｌ．１，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法を含む、ある数の方法で行われ得る。例には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、核穿孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、流体力学的衝撃（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｈｏｃｋ）、および感染が含まれるが、これらに限定されない。
核酸切断エンティティおよび／またはドナー核酸分子の異なる成分は、異なる手段によって細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、単一の型の核酸切断エンティティ分子を細胞に導入してもよいが、いくつかの核酸切断エンティティ分子は細胞内で発現させてもよい。一例は、２つのジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用して、細胞内核酸における二本鎖破断を生成する場合である。一部の場合には、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を１つだけ細胞に導入、他のジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物は細胞内で産生させてもよい。
好適なトランスフェクション薬剤には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質の細胞内への導入を促進するトランスフェクション薬剤が含まれる。例示的なトランスフェクション試薬には、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ（商標）Ｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｃｈａｒｉｏｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰｒｏｔｅｏＪｕｉｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｔｆｘ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｔｆｘ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｔｆｘ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、Ｅｓｃｏｒｔ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥｓｃｏｒｔ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の組成物および方法は、ハイスループットスクリーニング方法に使用することができる。そのような方法の一例は、リバーストランスフェクションである。例解のため、ｇＲＮＡ分子のライブラリおよび対応するＮＬＳとコンジュゲートしたドナーＤＮＡ分子が生成されていると仮定する。さらに、各ライブラリの構成には、（１）細胞ゲノム内の特定の遺伝子座と配列相同性を有するｇＲＮＡ分子と、（２）意図するゲノム切断部位に隣接する相同性領域を有するＮＬＳとコンジュゲートしたドナーＤＮＡ分子とが含まれると仮定する。また、３００のそのようなライブラリ構成２を生成し、これらの構成の各々がスライドガラス上の別々の場所にあると仮定する。最後に、Ｃａｓ９タンパク質を発現する２９３ＦＴ細胞株を、（１）ライブラリ組成の取り込みと、（２）ｇＲＮＡ特異的標的遺伝子座で生じる遺伝子編集とを可能にする条件下で、スライドガラスに重ねる。言うまでもなく、使用する遺伝子編集試薬が異なる場合（例えば、ｇＲＮＡの代わりにＴＡＬ－ＦｏｋＩ ｍＲＮＡ）、およびアレイ形式が異なる場合（例えば、スライドガラス表面の代わりに９６ウェルプレートのウェル）の変形を含む、そのような方法の多数の変形が可能である。
したがって、本発明には、遺伝子編集試薬（例えば、ｇＲＮＡ、ＴＡＬ ｍＲＮＡ、ドナー核酸分子など）のライブラリ、および細胞内の様々な標的遺伝子座を修飾するためのハイスループット法が含まれる。
核酸局在化および遺伝子編集効率
本発明には、遺伝子編集効率を高めるための組成物および方法も含まれる。いくつかの実施形態では、そのような組成物および方法は、遺伝子編集が望まれる細胞内位置に核酸分子を局在させる１つ以上の細胞内標的化部分（例えば、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体など）に接続する核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、細胞内標的化部分を用いて、１つ以上の細胞内位置での核酸分子の局所濃度の増加を促進する。理論に拘束されることを望むものではないが、遺伝子編集効率の増加は、遺伝子編集が望まれる場所でのドナー核酸濃度の増加に起因すると考えられる。
一実施形態を図９に示す。この図は、２つの異なるリンカーを介して一本鎖ドナーＤＮＡ分子に接続した核局在化シグナル（ＮＬＳ）（細胞内標的化部分の例）を示す。この種類の構築物は、核への核酸の送達を促進するために使用され得る。そのような構造の多くの変形が可能である。
図１１および１３に示し、以下の核局在化の例で議論するように、図９に示されるような構築物により、細胞内遺伝子編集の効率が著しく増加し、より少ないドナーの使用が可能となることが分かった。特に、上で言及した日付は、ＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡの使用により、核酸切断部位（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９で切断された染色体座）でのゲノム工学の効率が向上し得ることを実証する。
図１１および１３のデータは、遺伝子編集効率が８０％に近づいていることを示す。さらに、これは、約２×１０5細胞あたり０．０３ピコモルほど少量のＮＬＳドナーＤＮＡコンジュゲートで見られる。このため、実施形態には、特定の標的遺伝子座が細胞の少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９９％、８０％～９７％、８０％～９９％、８０％～９６％、８８％～９８％など）で修飾される、細胞内遺伝子操作のための組成物および方法が含まれる。さらに、いくつかの実施形態には、細胞が２×１０5細胞あたり０．３ピコモル以下（例えば、０．００１～０．３、０．００５～０．３、０．０１～０．３、０．０５～０．３、０．００１～０．２、０．００５～０．２、０．００１～０．１５、０．００１～０．１ピコモルなど）のドナーＤＮＡと接触するときに、反応混合物中のトランスフェクトされた細胞の少なくとも５０％が標的遺伝子座で修飾される、組成物および方法が含まれる。これは、１００％のトランスフェクションを仮定する。例えば、５０％のトランスフェクションでは、細胞の総数の約半分およびトランスフェクトされた細胞の少なくとも７５％が得られる。
いくつかの実施形態は、改変が望まれる細胞内核酸分子が存在する場所（例えば、核）でドナー核酸の局所濃度を増加させるための組成物および方法にも関する。いくつかの実施形態には、細胞内位置での濃度を増加させるために細胞内標的化部分を使用するための組成物および方法が含まれ、ここでは、局在する核酸濃度の増加量は、細胞内標的化部分を使用しない場合よりも、少なくとも１０倍（例えば、１０～１，０００、１０～８００、１０～６００、１０～１，０００、１０～１，０００、１０～１，０００、１０～４００、５０～１，０００、５０～６００、１００～１，０００、１００～７００倍など）高い。例として、核酸分子の細胞内局在化の増加倍率は、例えば、蛍光標識された核酸分子を使用して測定され得る。例解目的で、ＮＬＳとコンジュゲートした核酸分子とコンジュゲートしていない核酸分子との両方が、そのようなアッセイにおいて比較のために使用され得る。
図９に示す構築物の１つの変形は、ＮＬＳが、ドナーＤＮＡ分子の５’末端の代わりに３’末端に位置する、両方の末端に位置する、ドナーＤＮＡ分子の中央に置かれるなどの場合である。さらに、一方または両方の末端に１つ超のＮＬＳが存在してもよい。また、核酸分子は、（１）ＤＮＡまたはＲＮＡ、（２）一本鎖または二本鎖、（３）線形、円形、またはステムもしくはヘアピンループを有する分子、および／あるいは（４）化学修飾されたもの（例えば、ホスホロチオエート連結、２’－Ｏ－メチル塩基などを含むもの）であってもよい。加えて、以下に示すように、ＮＬＳは、核以外の細胞空間への局在化を指示する細胞内標的化部分（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）で代置されてもよい。このため、いくつかの実施形態には、遺伝子編集が望まれる細胞内位置に局在する１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する核酸分子、ならびにそのような核酸分子を使用するための方法（例えば、ゲノム工学）が含まれる。いくつかの実施形態に使用され得るいくつかの例示的な細胞内標的化部分のアミノ酸配列を表３に示す。
Figure 2023168355000003
さらに、細胞内標的化部分（例えば、ポリペプチド）が使用される多くの場合、これらの標的化部分は、細胞内核酸が存在すると予想される位置（例えば核、葉緑体の間質）に核酸分子を局在化するように設計され得る、ミトコンドリアのマトリックスなど）。言い換えれば、多くの場合、細胞内の特定の部分空間への核酸の局在化を指示することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態は、ドナー核酸分子が局在化される細胞内の位置でのゲノム工学反応の効率を高めるためだけでなく、細胞内の位置でドナー核酸分子を局在化するための組成物および方法を含む。
本発明の実施において、任意の数の方法を使用して、細胞内標的化部分を核酸分子に接続し得る。例に示す２つの方法は、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）リンカーおよびＣｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。いずれにせよ、細胞内標的化部分を核酸分子に接続するために使用されるリンカーは、典型的には、ある特定の特性を有し、これらの特性のいくつかは、（１）低い細胞毒性、（２）細胞取込みへの干渉の促進または少なくともその低いレベル、（３）低い分子量（ｍｗｔ）（例えば、５００ｍｗｔ未満）である。核酸分子への細胞内標的化部分の接続は、ＮＬＳとコンジュゲートしたＤＮＡオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ増幅により行われ得る。また、ＮＬＳとコンジュゲートしたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、核酸部分がＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的領域に連結しているユニバーサルプライマーとして働き得る。さらに、細胞内標的化部分の共有結合の代わりに、ＮＬＳとコンジュゲートしたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングで一本鎖ＤＮＡドナーまたは二本鎖ＤＮＡドナーにアニールされ、その後、ドナーを細胞内コンパートメントに運ぶ。
コンジュゲートの核酸分子成分のサイズ、種類、およびその他の特性は、用途によって異なる場合が多く、ＳＮＰ改変は、一般に、コード領域挿入物よりも短い。さらに、内在性核酸との相同性の領域の長さ（存在する場合）も、用途によって異なる。コンジュゲートの核酸分子成分（例えば、ドナーＤＮＡ）は、長さが１～２０００以上（例えば、１５００、１０００、７５０、５００、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１以下）のヌクレオチドまたは塩基対である（それらが一本鎖か二本鎖かによる）。いくつかの実施形態では、核酸分子成分は、長さが、１～５００、１０～４００、２０～３００、３０～２５０、３０～２００、または３０～１００などのヌクレオチドまたは塩基対である。
遺伝子編集タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＴＡＬタンパク質など）を含む組成物および方法も本発明に含まれ、ここでは、遺伝子編集タンパク質は、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナー核酸分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結し、１つ以上の細胞内標的化部分は、遺伝子編集タンパク質と関連付けられる。
本発明の実施に使用し得る核局在化シグナルは、様々な構造を有してもよく、例えば、単節型であっても双節型であってもよい。単節型ＮＬＳは、典型的には、塩基性残基の単一のクラスターからなる。双節型ＮＬＳは、典型的には、１０～１２残基離れた塩基性残基の２つのクラスターからなる。例示的なＮＬＳアミノ酸配列を、表４、５、および６で以下に記載する。
Figure 2023168355000004
Figure 2023168355000005
Figure 2023168355000006
図３９は、ＮＬＳに作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質の一連の概略図を示す。いずれの数および種類のＮＬＳを使用してもよく、タンパク質または核酸分子内でのそれらの位置は、ＮＬＳが連結する分子と意図される目的との両方の仕様により異なる。Ｃａｓ９またはＴＡＬエフェクターなどのタンパク質に関しては、一般に、相当量のタンパク質を細胞に導入し、その後、タンパク質を、タンパク質の大部分が核に局在した状態で、比較的短時間細胞質に保持することが望ましい。これは、タンパク質が細胞質内に長く留まるほど、分解されるタンパク質がより多くなると考えられるためである。言うまでもなくＣａｓ９のすべてが切断活性を有する（例えば、ｇＲＮＡと関連している）と仮定すると、核内のＣａｓ９の濃度が高いほど、切断効率が高くなるとも考えられる。このため、核に「集まる」ＮＬＳ関連タンパク質（および他の分子）の量は、（１）細胞に導入されるタンパク質の量、および（２）タンパク質の核への進行速度に基づく。
図４５は、一般的なＴＡＬＥ構造形式を示す概略図である。多くの場合、ＴＡＬＥは、細胞内の特定の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に存在するＤＮＡを刺激することで機能する。多くの場合、ＤＮＡ認識および結合に関与するＴＡＬＥタンパク質の領域の遮断により、ＤＮＡ認識および／または結合活性（複数可）の低下または排除が生じる。部位１、２、および３は、ＤＮＡの認識および結合に関与すると考えられるＴＡＬＥ領域の外側に位置する。このため、これらは、高レベルの標的ＤＮＡ結合が望まれる場合に、ＮＬＳの配置に好適な部位である。
図４５を基準点として使用すると、部位１でのＮＬＳ配置は、アミノ酸２５の左（Ｎ末端方向）の任意の位置で生じ得る。部位２および３でのＮＬＳの配置は、アミノ酸８１４の右（Ｎ末端方向）の任意の位置で生じ得る。これには、図４５の左のアミノ酸２５および右の８１４を超えて、より長い自然発生ＴＡＬＥタンパク質領域が含まれる場合が含まれる。さらに、部位３はエフェクタードメインのＣ末端に位置する。
１つ以上のＮＬＳは、部位１、２、および／または３のうちの１つ以上に位置してもよい。さらに、複数のＮＬＳが（これらの部位のうちの１つ以上に）存在する場合、それらは同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
多くの場合、ＮＬＳの位置（例えば、図４５の部位１、２、および／または３）および種類は、（１）遺伝子編集試薬の核への局在レベルの高さ、および／または（２）核内の機能的活性レベルの高さをもたらすように選択される。これらの２つの効果は、一般に、核の機能的活性が一般に核局在化の量よりも低いことに関連する。その理由は、多くの場合、核に進入する遺伝子編集試薬のすべてが、それらが特異性を有する標的遺伝子座に結合するわけではなく、結合するものは、それらが設計された対象（例えば、核酸切断、転写の活性化など）において標的遺伝子座核酸に常に作用するとは限らないためである。これについての１つの例示的な理由は、核核酸が、ある細胞型において、別の細胞型よりもアクセス可能性が高くあり得ることである。また、同じ細胞型の細胞内であっても、集団内のある細胞において、同じ集団内の別の細胞における場合よりも、標的遺伝子座のアクセス可能性を上昇させ得るまたは低下させ得る差異が存在する。
核局在化アッセイおよび機能アッセイ（例えば、ゲノム切断検出）の両方が、本明細書の他の箇所に記載されている。標的遺伝子座と細胞型との違いを補正するために、典型的には、同じ標的遺伝子座および細胞型を比較アッセイに使用することになる。
さらに、遺伝子編集効率は、多くの場合、編集対象の遺伝子座および細胞型により異なることになる。これは、遺伝子編集試薬への標的遺伝子座のアクセス可能性および相同性指向修復（ＨＤＲ）に関する細胞型の効率を含む、ある数の因子に起因する。ＨＤＲに関して、ＨＤＲ効率がより高い細胞（例えば、２９３ＦＴおよびＵ２ＯＳ細胞）は、一般に、ＨＤＲ効率のレベルがより低い細胞（例えば、Ａ５４９細胞）よりも高い遺伝子編集率を呈する。
ＮＬＳの位置および種類に関するＴＡＬＥタンパク質のある数の形式を表７で以下に示す。
Figure 2023168355000007
表７に示す例示的なＴＡＬＥ／ＮＬＳ形式は、ＴＡＬＥタンパク質内のＮＬＳの種類およびＮＬＳ位置が異なる。一部の場合、ＴＡＬＥタンパク質は、約１～約１５（例えば、約２～約１４、約３～約１４、約４～約１４、約２～約１０、約２～約８、約２～約６、約３～約５、約３～約４など）を含む。さらに、ＴＡＬＥタンパク質に複数のＮＬＳが存在する場合、これらのＮＬＳは単節型であっても双節型であってもよい。
また、２つ以上のＮＬＳが、ＴＡＬＥタンパク質の同じ領域（例えば、Ｎ末端領域など）に位置してもよい。ＴＡＬＥタンパク質（例えば、ＴＡＬＥタンパク質の同じ領域内）に１つ超のＮＬＳが位置する場合、これらのＮＬＳのうちの２つ以上は、互いから約１～約５０（例えば、約２～約５０、約３～約５０、約５～約５０、約１０～約５０、約１５～約５０、約２～約３０、約５～約５０、約５～約２５など）アミノ酸内に位置し得る。一部の場合には、２つのＮＬＳが２つのアミノ酸によって互いに離れていてもよい。さらに、これらのアミノ酸は、柔軟なリンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒなど）を形成することを意図した種類のアミノ酸であってもよい。
表７は、ＮＬＳの領域位置およびアミノ酸配列に関する６つの特定のＴＡＬＥ／ＮＬＳ形式を示す。もう２つの一般的なＴＡＬＥ／ＮＬＳ形式をさらに示す。このような形式はいくつでも可能である。例えば、ＴＡＬＥタンパク質の様々な領域は、独立して、約１～約５つのＮＬＳを含んでもよい。
図４６および４７は、異なる位置にＮＬＳを有する２つの異なるＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮタンパク質は、分子内に存在するＮＬＳの数、種類、および位置が異なっていてもよい。図４６に示すアミノ酸配列に関して、ＮＬＳが反復領域に対してＮ末端に位置する場合、ＮＬＳは、多くの場合、Ｒ－３領域よりもさらにＮ末端の方に位置することになる。さらに、ＮＬＳが反復領域に対してＣ末端に位置する場合、ＮＬＳは、多くの場合、反復領域とエフェクタードメイン（図４６に示されるアミノ酸配列中のＦｏｋＩ）との間にあるアミノ酸Ｈ Ｒ Ｖ Ａ（図４６のアミノ酸８１１～８１４）よりもさらにＣ末端の方に位置することになる。このため、参考として図４６のアミノ酸配列を使用して、ＮＬＳは、３つの一般的な場所である、（１）反復領域のＮ末端、（２）反復領域とエフェクタードメインの間、および（３）エフェクタードメインの後に位置し得る。
一部の場合には、参考のために図４６に示すアミノ酸配列を使用して、１つ以上のＮＬＳはアミノ酸７６８～８１４の領域に位置し得る。例として、１つ以上のＮＬＳは、図４５のアミノ酸：７６８、７７７、７７９、７８８、および／または７８９のうちの１つ以上の直後に存在してもよい。
特に、図４６は、なかでも、反復領域のＮ末端の左に位置するＴＡＬタンパク質領域（図４６のアミノ酸１８～１５３）を示す。このＴＡＬタンパク質領域は、典型的には、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種の間で保存されており、アミノ酸レベルでの同一性は９０％を超える。さらに、この領域には、ＴＡＬ反復と何らかの配列相同性がある４つの領域（Ｒ０、Ｒ－１、Ｒ－２、およびＲ－３）が含まれる。ＮＬＳは、通常、この領域の外側に位置し、典型的には、さらにＴＡＬタンパク質のＮ末端に向かってさらに配置される。
加えて、例えば、図４６に示されるアミノ酸配列は、反復領域に対してＮ末端に１５３個のアミノ酸しか含まない。このＮ末端領域は、長さが異なってもよく、長さは、例えば、約１４０～４００（例えば、約１５０～約３５０、約１５０～約３００、約１５０～約２５０、約１５０～約２００、約１８０～約３５０、約１８５～約３００、約２００～約３５０、約２００～約３００など）アミノ酸であってもよい。
さらに、アミノ酸の反復領域に対してＣ末端の領域に図４６に示すアミノ酸配列を使用することも、典型的には、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種の間で保存される。ここでも、ＮＬＳは、通常、この領域の外側に位置し、典型的には、さらにＴＡＬタンパク質のＣ末端に向かってさらに配置される。
遺伝子編集分子（例えば、ＴＡＬタンパク質、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ｇＲＮＡなど）の望ましい細胞内レベル、および遺伝子編集活性の望ましい持続時間に応じて、遺伝子編集分子は、ＲＮＡ／ｍＲＮＡとして、またはＲＮＡもしくはタンパク質の遺伝子編集試薬をコードするＤＮＡにより、細胞に導入され得る。さらに、遺伝子編集分子をコードする核酸が細胞内に位置する場合、コード領域は、多くの場合、プロモーター（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターなど）などの発現制御配列に作動可能に連結することになる。
本明細書では、様々な形式のＴＡＬタンパク質（および他の遺伝子編集分子）、これらのタンパク質をコードする核酸分子、およびこれらのタンパク質を使用して細胞のゲノムを修飾する方法が提供される。
タンパク質および他の分子の核内取り込みを測定するためのアッセイは既知である。そのようなアッセイは、核における機能的活性の測定に基づき得る（例えば、実施例１に示すＧＣＤアッセイ）。他のアッセイは、分子の取り込みを直接測定し、これらには、蛍光ベースのアッセイが含まれる。そのようなアッセイでは、典型的には、測定対象の分子が蛍光を呈することが必要である。蛍光は、分子内に自然に存在する場合もあれば、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ、ＯＦＰ、化学標識（例えば、色素）など）との会合から生じる場合もある。
１つの好適なアッセイは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，９６：３８４０－３８４９（２００９）に示されており、本文献では、核輸入を測定するために、二光子蛍光対応顕微鏡法が使用された。これらの方法は、細胞質および核内の複数の点で平均蛍光強度を顕微鏡により測定した後、比率を決定することに基づく。一部の遺伝子編集試薬を膜およびエンドソーム内に捕捉してもよいが、細胞質蛍光レベルをヌクレアーゼ蛍光レベルと比較して、１つ以上の時点で、核への遺伝子編集試薬の進入速度と核内に存在する遺伝子編集試薬の量とを決定してもよい。
Ｗｕらに記載されているような方法を使用して、蛍光標識された遺伝子編集試薬の取り込みと位置に基づく濃度とを測定してもよい。１つの例示的な方法は、二光子蛍光対応顕微鏡法を使用して、Ｃａｓ９タンパク質の核局在化を測定するものである。この方法の図では、一連の異なるＣａｓ９－ＮＬＳ－ＧＦＰ融合タンパク質／ｇＲＮＡ複合体を細胞株に導入し、蛍光測定値を、細胞を用いて、５０地点で、半分が細胞質、半分が核にあるようにして取る。次に、各Ｃａｓ９－ＮＬＳ－ＧＦＰ融合タンパク質／ｇＲＮＡ複合体について、定常状態の核と細胞質との比を決定する。細胞内の遺伝子編集試薬の核対細胞質比が平均して約５～約１２０（例えば、約５～約１００、約１５～約１００、約２０～約１００、約２５～約１００、約３０～約１００、約３５～約１００、約４０～約１００、約５０～約１００、約６０～約１００、約７０～約１００、約４０～約１２０、約５０～約１２０など）である、細胞の生成を可能にする組成物および方法が本明細書で提供される。
また、細胞集団の生成を可能にする組成物および方法が本明細書で提供され、ここでは、二倍体細胞に関して、２つの標的遺伝子座のうちの少なくとも一方が、集団のメンバーの少なくとも９０％（例えば、約９０％～約１００％、約９０％～約９８％、約９０％～約９６％、約９３％～約１００％、約９５％～約１００％、約９２％～約９６％など）において切断される。一部の場合には、上記の切断の割合は、５０，０００（＋／－１０％）が、実施例７に示す条件下で、約０．５～約２００ｎｇ（約～約０．５～約１５０、約～約０．５～約１００、約～約０．５～約９０、約～約０．５～約７５、約～約１～約２００、約～約１．５～約２００、約～約３～約２００、約～約１～約５０ ｎｇ、約～約１０～約４５、約～約１２～約６０など）のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体と接触するように条件を調整すると、適用される。
細胞内標的化部分が用いられる本発明の組成物および方法は、任意の数の方法により、内因性核酸分子を改変するために使用され得る。例えば、これらの組成物および方法は、内因性核酸が「無傷」である場所での相同組換えを促進するために訴えられてもよい。これは、内因性核酸が遺伝子編集試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬ、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物など）によって切断されていないことを意味する。しかしながら、一部の場合には、遺伝子改変のための部位にニックが入るか、または二本鎖切断が生じる。
方法
本明細書で提供される方法および組成物は、とりわけ、クロマチン（ＤＮＡに関連するヒストンタンパク質）、ＤＮＡ、ＤＮＡに結合したタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、標的遺伝子座（例えば、遺伝子、ゲノム領域、または転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー））を調節するのに有用である。本明細書で使用する場合、「標的遺伝子座」という用語は、細胞のゲノム内の領域を指す。標的遺伝子座には、タンパク質または核酸を結合する１つ以上の結合配列を含み、その結合により標的遺伝子座の構造的および／または化学的修飾が生じる。本明細書で提供される方法および組成物を使用して、標的遺伝子座の一部を形成する特定の部位に１つ以上のＤＮＡ結合剤（例えば、第１および第２のＤＮＡ結合調節増強剤）を結合させることにより、標的遺伝子座を構造的または化学的に修飾してもよい。該ＤＮＡ結合剤（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の結合により、例えば、標的遺伝子座でクロマチンが置換または再構築され得、かつ／あるいは追加の内因性または外因性調節剤によるさらなる修飾のために、標的遺伝子座のアクセス可能性が増大し得る。例えば、本明細書で提供される方法は、切断部位でのＤＮＡおよび遺伝子座での周囲配列のアクセス可能性を増大させることにより、ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９）の効率および特異性を増大させるのに有用である。このため、本明細書で提供される方法および組成物は、とりわけ、ゲノム編集およびそれに伴う酵素プロセスの強化に有用である。
よって、一態様では、細胞内の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることとが含まれる。
標的遺伝子座のアクセス可能性は、本明細書で提供されるエンハンサー結合配列の上流または下流で増強され得る。したがって、エンハンサー結合配列の５´および３´に位置するクロマチンは、ＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して、ＤＮＡ結合調節増強剤がエンハンサー結合部位に結合する際に、アクセス可能性が高まり得る。
実施形態では、標的遺伝子座は、標的遺伝子座の複数のエンハンサー結合配列（例えば、２、４、６、８、１０個のエンハンサー結合配列）に結合する複数のＤＮＡ結合調節増強剤を含む。複数のエンハンサー結合配列の各々は、長さが２０～６０ヌクレオチドの配列により互いに離れていてもよい。実施形態において、標的遺伝子座には、第１、第２、第３、第４、第５、および第６のエンハンサー結合配列が含まれ、第１のエンハンサー結合配列は、第２のエンハンサー結合配列を介して第３のエンハンサー結合配列に接続し、第３のエンハンサー結合配列は、第４のエンハンサー結合配列を介して第５のエンハンサー結合配列に接続し、第４のエンハンサー結合配列は、第５のエンハンサー結合配列を介して第６のエンハンサー結合配列に接続する。第１および第２のエンハンサー結合配列、第２および第３のエンハンサー結合配列、第３および第４のエンハンサー結合配列、第４および第５のエンハンサー結合配列、ならびに第５および第６のエンハンサー結合配列は、各々、２０～５０ヌクレオチド離れていてもよい。実施形態では、第１および第２のエンハンサー結合配列、第２および第３のエンハンサー結合配列、第３および第４のエンハンサー結合配列、第４および第５のエンハンサー結合配列、ならびに第５および第６のエンハンサー結合配列は、各々、５０ヌクレオチド離れている。
別の態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより標的遺伝子座のクロマチンを置換することとが含まれる。
別の態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより標的遺伝子座のクロマチンを再構築することとが含まれる。
上記のように、本明細書で提供される方法および組成物は、標的遺伝子座の調節を達成するための１つ以上のＤＮＡ結合剤（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の結合を含んでもよい。よって、別の態様では、細胞内の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性が増大する。本明細書で提供される標的遺伝子座のアクセス可能性を増強する（増大させる）とは、標的遺伝子座の構造的調節を指し、これにより、標的遺伝子座での調節タンパク質または複合体、例えば、酵素（例えば、ヌクレアーゼ）の機能的活性が増強する。標的遺伝子座がクロマチンから排除され、かつ／あるいは標的遺伝子座のＤＮＡが再構成されて、調節タンパク質のより良好な結合および／または増強された活性が可能となる。したがって、標的遺伝子座のアクセス可能性を増強する（増大させる）という用語には、標的遺伝子座の構造を調節して調節タンパク質の活性の増加を可能にすることが含まれ、ここで、活性には、例えば、酵素活性、ＤＮＡ結合活性、転写活性が含まれる。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、標的遺伝子座のクロマチンが置換される。
一態様では、細胞内の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することとが含まれる。（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、（３）第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することが可能となり、それにより、標的遺伝子座のクロマチンが再構築される。
上記のように、本明細書で提供される方法および組成物により、標的遺伝子座のアクセス可能性が増大し、それにより標的遺伝子座の調節活性の動員が可能となり得る。このため、細胞内の標的遺伝子座を調節する方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む標的遺伝子座のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することが含まれる。かつ、（２）第１の調節タンパク質または第１の調節複合体が調節部位を調節することを可能にし、それにより細胞内の標的遺伝子座を調節する。
標的遺伝子座への１つ以上のＤＮＡ結合剤（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の結合に起因して、標的遺伝子座がよりアクセス可能となることで、標的遺伝子座での調節タンパク質または調節複合体の効率および／または特異性の増強が可能となる。例えば、本明細書で提供される方法および組成物を使用すると、例えば相同組換えを介した遺伝子編集反応の効率が増強され得る。実施形態では、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は、１つ以上のＤＮＡ結合剤（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の存在に起因して、標的遺伝子座において増強する。
このため、一態様では、細胞内の標的遺伝子座での調節タンパク質または調節複合体の活性を高める方法が提供される。本方法には、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む標的遺伝子座のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することが含まれる。かつ、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤を第１のエンハンサー結合配列に結合させ、それにより細胞内の標的遺伝子座で第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体の活性を高める。
また、ＤＮＡ結合タンパク質転写活性化因子融合タンパク質を使用して遺伝子編集試薬にアクセスできるクロマチン構造の領域を生成するための組成物および方法も本明細書で提供される。一部の態様では、ＤＮＡ結合タンパク質－転写活性化因子融合タンパク質の使用、およびそのような融合タンパク質をクロマチンのリモデリングに使用して部位特異的核酸切断の増強を可能にするための方法が本明細書で提供される。これのいくつかの態様の変形を図５１に示す。
転写活性化により、クロマチンがリモデリングされ、多くの場合に特定の遺伝子座におけるヌクレオソームの定義されたパターンであるものが破壊されることが分かっている。（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｒａｍｓａｈｏｙｅ，”Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ”，ＢＲＩＥＦＩＮＧＳ ＩＮ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ，４：１２９－１４２（２００５）を参照されたい）。
図５１の上部は、核酸がクロマチン１０ｎｍファイバーの形態である細胞内核酸領域の概略図を示す。図５１の上部は、プロモーター、ヌクレオソーム、所望の編集部位、および潜在的なバディ－ＴＡＬ結合部位を示す。ヌクレオソームの位置は、核酸領域および／または特定の核酸領域が位置する特定の細胞によって異なり得る。例えば、任意の特定の細胞において、プロモーター核酸は、ヌクレオソーム内に完全にまたは部分的に、または全体的に位置し得る。ヌクレオソームの外。さらに、特定の細胞における、ヌクレオソームに関する特定の核酸領域（例えば、編集部位）の位置は、特定の時点、転写状態、細胞周期の段階などの要因によって異なり得る。
説明のために図５１の概略図を使用すると、ＴＡＬ転写活性化因子融合タンパク質は、ＴＡＬ結合部位（「ＴＢＳ」）に結合し、転写活性化をもたらす。これにより、転写される核酸領域および周辺の局所領域でクロマチンのリモデリングが起こります。このクロマチンのリモデリングにより、核酸切断活性を持つ遺伝子編集試薬（たとえば、ＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質）への核酸のアクセス性が向上します。最終結果は、遺伝子編集試薬による核酸切断活性の向上です。
図５１は、「編集サイト」も示している。本明細書で使用される「編集部位」は、ヌクレオチド配列レベルでの遺伝子座の変化（例えば、欠失、挿入および／または置換）のために切断するように設計される１つ以上の遺伝子編集試薬が設計される核酸部位を指す。この回路図では、転写を使用して、編集サイトの遺伝子編集試薬へのアクセスを向上させています。
ＤＮＡ結合調節増強剤とも呼ばれるバディＴＡＬはまた、ＤＮＡ結合タンパク質転写アクチベーター融合タンパク質と組み合わせて使用され得る。これらのバディＴＡＬは、ＤＮＡ結合タンパク質転写活性化因子融合タンパク質のＴＡＬ結合サイト（「ＴＢＳ」）への結合を強化するため、および／または編集サイトへの核酸切断活性を持つ遺伝子編集試薬のアクセス性を強化するために使用できます。したがって、本明細書で提供されるのは、ＤＮＡ結合タンパク質転写アクチベーター融合タンパク質を単独でおよびバディＴＡＬと組み合わせて使用して、核酸切断を増強する組成物および方法である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内の第１の核酸遺伝子座を編集する方法であり、その方法は、（Ａ）核酸転写を可能にする条件下で、第２の核酸遺伝子座をＤＮＡ結合タンパク質転写活性化因子融合タンパク質と接触させる。（Ｂ）第１の核酸遺伝子座での核酸の切断を可能にする条件下で、第１の核酸遺伝子座を核酸切断活性を有する１つ以上の遺伝子編集試薬と接触させ、ここで、核酸の転写は、タンパク質のクロマチン構造を変化させる。最初の核酸遺伝子座。一部の場合には、（ａ）第１の核酸遺伝子座および／または（ｂ）第２の核酸遺伝子座の２００（例えば、約３０～約２００、約５０～約２００、約６０～約２００、約３０～約１８０、約３０～約１３０、約４５～約１５０など）塩基対内で１つ以上の核酸遺伝子座に結合するように設計されている１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤も使用され得る。場合によっては、第２の核酸遺伝子座の上流および／または下流の２００塩基対内の核酸位置に結合するように設計された１つまたは複数のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の核酸遺伝子座を形成する。いくつかの例では、ＤＮＡ結合タンパク質－転写活性化因子融合タンパク質は、ＴＡＬ－転写活性化ドメイン（例えば、ｐ５３、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＶＰ１６、ＶＰ３２、ＶＰ６４など）融合タンパク質であり得る。場合によっては、１つまたは複数のＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つは、ＴＡＬヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、ＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質）であってよい。
ＤＮＡ結合調節増強剤
本明細書で提供される「ＤＮＡ結合調節増強剤」は、細胞内の標的遺伝子座の対応する配列（エンハンサー結合配列）に結合することで、標的遺伝子座を化学的または構造的に調節することができる薬剤である。標的遺伝子座に結合すると、本明細書で提供されるＤＮＡ結合調節増強剤（その実施形態を含む）は、遺伝子座でクロマチンを調節し得る。ＤＮＡ結合調節増強剤の結合時、エンハンサー結合配列の上流（５’）または下流（３’）の密に詰まった異質染色質領域が、それほど密に詰まっていない真正染色質領域に変換され得る。形質転換は、ヒストンが、標的遺伝子座で結合しているＤＮＡから解離すること（クロマチン置換）により達成され得る。あるいは、ヒストンは、標的遺伝子座においてクロマチン内で再配列されてもよい（クロマチン再構築）。標的遺伝子座でクロマチン構造を変更すると、ＤＮＡは、標的遺伝子座の後続の修飾のためにアクセス可能性が高くなる。この効果は、１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤（例えば、第１または第２のＤＮＡ結合調節増強剤）の結合により達成され得る。このため、実施形態では、本明細書に示される方法には、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することができる第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することがさらに含まれる。
本明細書で提供される方法に関して、増強剤および調節タンパク質または複合体は、様々な方法で細胞に導入され得る。増強剤および調節タンパク質または複合体は、増強剤および調節タンパク質または複合体をコードする核酸（ベクター）をトランスフェクトすることにより導入されてもよい。あるいは、増強剤および調節タンパク質または複合体は、増強剤および調節タンパク質または複合体をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすることにより導入されてもよい。増強剤および調節タンパク質または複合体は、さらに、実際の薬剤、調節タンパク質または複合体を直接トランスフェクトすることにより導入されてもよい。当業者であれば、薬剤、調節タンパク質または複合体の細胞内半減期（薬剤が細胞内で活性であるかつ／または発現される時間）は、それらが細胞に送達される物理的形態により決定されることを直ちに認識するであろう。特定の科学理論に拘束されるものではないが、増強剤、調節タンパク質または複合体をコードする核酸の送達により、増強剤、調節タンパク質または複合体は、増強剤および調節タンパク質または複合体が実際のタンパク質または複合体としてトランスフェクトされる場合と比較して、より長く細胞で発現される／存在するようになる。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入が含まれる。
実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入には、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入が含まれる。
実施形態では、第１の調節タンパク質の導入には、第１の調節タンパク質をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第１の調節タンパク質の導入には、第１の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第１の調節タンパク質の導入には、第１の調節タンパク質の導入が含まれる。実施形態では、第１の調節複合体の導入には、第１の調節複合体をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第１の調節複合体の導入には、第１の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第１の調節複合体の導入には、第１の調節複合体の導入が含まれる。
実施形態では、第２の調節タンパク質の導入には、第２の調節タンパク質をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第２の調節タンパク質の導入には、第２の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第２の調節タンパク質の導入には、第２の調節タンパク質の導入が含まれる。実施形態では、第２の調節複合体の導入には、第２の調節複合体をコードするベクターの導入が含まれる。実施形態では、第２の調節複合体の導入には、第２の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる。実施形態では、第２の調節複合体の導入には、第２の調節複合体の導入が含まれる。
本明細書で提供される方法および組成物に有用な例示的なＤＮＡ結合調節増強剤には、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸が含まれる。第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、同じであっても、化学的に異なっていてもよい。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質である。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である。実施形態では、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである。
「短縮型ｇＲＮＡ」または「短縮型ガイドＲＮＡ」は、野生型ガイドＲＮＡに対応するリボ核酸であるが、該野生型ガイドＲＮＡと比較して、含まれるヌクレオチドが少ない。本明細書で提供されるように、短縮型ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に結合してもよい。このため、本明細書で提供される短縮型ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に結合した、モジュレーター結合配列に結合することができるＲＮＡであってもよい。短縮型ｇＲＮＡに結合したＣａｓ９タンパク質は、モジュレーター結合配列を切断することができまない。このため、実施形態では、ＤＮＡ結合調節増強剤は、Ｃａｓ９タンパク質に結合した短縮型ｇＲＮＡである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡに結合したＣａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。本明細書で提供される化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌由来のＣａｓｓ９タンパク質である。
本明細書で提供される短縮型ｇＲＮＡは、長さが１６ヌクレオチド未満であってもよい。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１５ヌクレオチド以下である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０～１５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１１～１５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１２～１５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１３～１５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０～１４ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０～１３ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０～１２ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１６ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１５ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１４ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１４ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１３ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１３ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さがｌ１２ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１２ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１１ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１１ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが１０ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが９未満ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが９ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが８ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが８ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが７ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが７ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが６ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが６ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが５ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが５ヌクレオチドである。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが４ヌクレオチド未満である。実施形態では、短縮型ｇＲＮＡは、長さが４ヌクレオチドである。
エンハンサー結合配列
本明細書で提供される「エンハンサー結合配列」は、標的遺伝子座の一部を形成し、ＤＮＡ結合調節増強剤により結合される核酸配列である。実施形態では、エンハンサー結合配列はＴＡＬ核酸結合カセットである。本明細書で使用する場合、「ＴＡＬ核酸結合カセット」（「ＴＡＬカセット」とも称される）は、該ポリペプチドを含むタンパク質が核酸分子の単一塩基対（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）に結合できるようにするポリペプチドをコードする核酸を指す。実施形態では、タンパク質は、ＴＡＬ核酸結合カセットによってコードされる１つ超のポリペプチドを含む。コードされたマルチマーの個々のアミノ酸配列は「ＴＡＬ反復」と称される。実施形態では、ＴＡＬ反復は、２８～４０アミノ酸長であり、（存在するアミノ酸について）３４アミノ酸配列：ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡ ＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥ ＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣ ＱＡＨＧ（配列番号１１８）と、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、約６０％～約９５％、約６５％～約９５％、約７０％～約９５％、約７５％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％など）の同一性を共有する。
実施形態では、上記の配列の位置１２および１３にある２つのＸは、核酸分子中の特定の塩基を認識するためのＴＡＬ核酸結合カセットでもあるアミノ酸を表す。
実施形態では、一連の反復の連続のカルボキシル末端に存在する最終ＴＡＬ反復は、カルボキシル末端が欠如し得る（例えば、この最終ＴＡＬ反復のアミノ末端のおよそ１５～２０アミノ酸）という点で、部分的ＴＡＬ反復であることが多い。
実施形態では、エンハンサー結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列またはガイドＤＮＡ結合配列に結合（ハイブリダイズ）することができる核酸配列である。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号４０の配列を有する。実施形態では、第２のエンハンサー結合配列は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１の配列を有する。
調節タンパク質および調節複合体
本明細書で提供される調節タンパク質および調節複合体は、細胞にとって内因性であっても、細胞にとって内因性でなくてもよい。本明細書で提供される「調節タンパク質」および「調節複合体」という用語は、それぞれ、標的遺伝子座を構造的および／または化学的に変化させることができる分子（例えば、タンパク質またはタンパク質コンジュゲート）または分子の複合体（例えば、リボ核タンパク質複合体）を指す。標的遺伝子座構造または化学組成の変化には、標的遺伝子座全体またはその一部の変化が含まれ得る。調節タンパク質の例には、二本鎖ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写活性化因子、転写抑制因子、核酸メチラーゼ、核酸デメチラーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、リガーゼ、メチルトランスフェラーゼ、トランスポザーゼ、グリコシラーゼ、インテグラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、スルフリラーゼ、ポリメラーゼ、蛍光活性、およびリコンビナーゼが、非限定的に含まれる。本明細書で提供される調節複合体の非限定的な例には、リボ核タンパク質複合体およびデオキシリボ核タンパク質複合体が含まれる。
実施形態では、第１の調節タンパク質または第２の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ調節酵素を含む。ＤＮＡ結合タンパク質は、転写抑制因子または転写活性化因子であってもよい。実施形態では、ＤＮＡ調節酵素は、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼである。実施形態では、第１の調節タンパク質または第２の調節タンパク質は、ヒストン調節酵素を含む。実施形態では、ヒストン調節酵素は、デアセチラーゼまたはアセチラーゼである。
実施形態では、第１の調節タンパク質または第２の調節タンパク質には、第１のＤＮＡ修飾ドメインに作動可能に連結した第１のＤＮＡ結合ドメインが含まれる。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬエフェクタードメインであり、第１のＤＮＡ修飾ドメインは転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインである。実施形態では、第１のＤＮＡ修飾ドメインはＶＰ１６ドメインである。実施形態では、第１のＤＮＡ修飾ドメインはＶＰ６４ドメインである。実施形態では、第１のＤＮＡ修飾ドメインは、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ３２ドメイン、またはＶＰ６４転写活性化因子ドメイン（複数可）、またはＫＲＡＢ転写抑制因子ドメインである。
実施形態では、第１の調節タンパク質は、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。実施形態では、第２の調節タンパク質は、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲート」は、核酸切断活性（例えば、二本鎖核酸切断活性）を有する１つ以上の分子、酵素、または分子の複合体を指す。ほとんどの実施形態では、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体成分は、タンパク質もしくは核酸、またはこの２つの組み合わせのいずれかであるが、補因子および／または他の分子と関連していてもよい。ＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、典型的には、標的遺伝子座でのＤＳ破断生成の効率、標的遺伝子座のまたはその近くの好適な位置でＤＳ破断生成を生成する能力、望ましくない遺伝子座でのＤＳ破断生成の可能性の低さ、低毒性、コストの問題など、ある数の因子に基づいて選択されることになる。これらのある数の要因は、用いる細胞および標的遺伝子座によって異なることになる。ある数のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートが当該技術分野で既知である。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体には、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、アルゴノート－核酸複合体、またはマクロヌクレアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、それらが核局在化することを可能にする活性を有する（例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む）。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡドナーは、ニックまたはニックの組み合わせをもって機能し得る。
実施形態では、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、ＴＡＬエフェクター融合体である。本明細書で提供される「ＴＡＬエフェクター融合物」は、天然では自然に関連しない別のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、アルゴノートタンパク質）に接続したＴＡＬエフェクターを指す。実施形態では、ＴＡＬエフェクター融合物の非ＴＡＬ成分は、融合タンパク質に機能活性（例えば、酵素活性）を付与することになる。実施形態では、ＴＡＬエフェクター融合物は、結合活性を有してもよく、または例えばヌクレアーゼ活性などの核酸修飾を直接的または間接的に誘発する活性を有してもよい。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは第１のヌクレアーゼを含み、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは第２のヌクレアーゼを含む。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、二量体を形成する。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、独立して、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、独立して、ＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメイン変異型ＫＫＲシャーキーである。実施形態では、第１のヌクレアーゼおよび第２のヌクレアーゼは、独立して、ＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメイン変異型ＥＬＤシャーキーである。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第１のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタードメイン（例えば、ＴＡＬタンパク質のＤＮＡ結合部分）を含む。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第２のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートは、第２のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む。実施形態では、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。実施形態では、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体は、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
本明細書で使用する場合、「ジンクフィンガータンパク質」という用語は、亜鉛により安定する核酸（例えば、ＤＮＡ）結合ドメインを有するポリペプチドを含むタンパク質を指す。個々のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質またはポリペプチドが、少なくとも１本の指、より典型的には２本の指、または３本の指、またはさらには４本もしくは５本の指から、少なくとも６本またはそれ以上の指を有するため、典型的に「フィンガー」と称される。いくつかの態様では、ジンクフィンガーは、３本または４本のジンクフィンガーを含むことになる。各指は、典型的には、２～４つのＤＮＡ塩基対に結合する。各指は、通常、約３０個のアミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合領域を含む（例えば、米国特許公開第２０１２／０３２９０６７ Ａ１号参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書で提供されるコンジュゲートの一部を形成するヌクレアーゼタンパク質の一例は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインであり（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６－６０（１９９６））、典型的には５～７塩基対のリンカー配列により分離されている。ＦｏｋＩ切断ドメインの対は、一般に、ドメインの二量化および反対の鎖からの非回文標的配列の切断を可能にするために必要である。個々のＣｙｓ2Ｈｉｓ2 ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３個から６個の間の個々の亜鉛－フィンガー反復を含有し、それぞれ９個から１８個の塩基対を認識し得る。
本明細書で使用する場合、「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、１つ超のＴＡＬ反復から構成されるタンパク質を指し、配列特異的様式で核酸に結合することができる。ＴＡＬＥは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａなどの植物病原細菌の種により、植物細胞の感染後にそのＩＩＩ型分泌系を介して分泌されるＤＮＡ結合タンパク質のクラスを表す。天然のＴＡＬＥは、植物のプロモーター配列に結合することで、遺伝子発現を調節し、エフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化して、細菌の増殖を促進することが具体的に示されている（Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４５－６４８（２００７）、Ｂｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．４８：４１９－４３６（２０１０）、Ｋａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１（２００７）、Ｋａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３７－４３（２００９））。
天然のＴＡＬＥは、一般に、中央反復ドメインおよびカルボキシル末端核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）により特徴付けられる。中央反復ドメインは、典型的には、半反復と呼ばれる一般により短いカルボキシル末端反復を除いて通常３３～３５残基の長さである１．５から３３．５の間の可変量のアミノ酸反復からなる。反復は、ほとんどの場合同一であるが、ある特定の超可変残基において異なる。ＴＡＬＥのＤＮＡ認識特異性は、典型的には各反復の１２位および１３位、いわゆる反復可変２残基（ＲＶＤ）において超可変残基により媒介され、各ＲＶＤは、所与のＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチドを標的化する。したがって、ＴＡＬタンパク質中の反復の逐次的順序は、所与のＤＮＡ配列内のヌクレオチドの定義された線形順序と相関する傾向がある。いくつかの自然発生ＴＡＬＥの基礎的ＲＶＤコードが特定されており、所与のＤＮＡ配列に結合するために必要な逐次的反復順序の予測が可能となっている（Ｂｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２（２００９）、Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１（２００９））。さらに、新しい反復の組み合わせで生成されたＴＡＬエフェクターは、このコードにより予測された標的配列に結合することが示されている。標的ＤＮＡ配列は、一般に、ＴＡＬタンパク質により認識される５’チミン塩基で開始することが示されている。
ＴＡＬのモジュール構造は、ＤＮＡ結合ドメインとエフェクター分子、例えばヌクレアーゼとの組み合わせを可能にする。特に、ＴＡＬＥヌクレアーゼにより、新たなゲノム工学ツールの開発が可能となる。いくつかの実施形態で使用するＴＡＬＥは、ＤＳ破断を生成してもよく、またはＤＳ破断を生成するための複合作用を有してもよい。例えば、ＴＡＬ－－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体は、標的遺伝子座でまたはその近くで結合し、２つのＦｏｋＩドメインの会合により二本鎖核酸切断活性を形成するように設計することができる。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、６個以上（例えば、８、１０、１２、１５、もしくは１７以上、または６～２５、６～３５、８～２５、１０～２５、１２～２５、８～２２、１０～２２、１２～２２、６～２０、８～２０、１０～２２、１２～２０、６～１８、１０～１８、１２～１８など）のＴＡＬ反復を含むことになる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、１８または２４または１７．５または２３．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含んでもよい。追加の実施形態では、ＴＡＬＥは、１５．５、１６．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、または２４．５のＴＡＬ核酸結合カセットを含んでもよい。ＴＡＬＥは、一般に、ＴＡＬ反復を含む領域に隣接する少なくとも１つのポリペプチド領域を有することになる。多くの実施形態では、ＴＡＬ反復のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に隣接領域が存在することになる。例示的なＴＡＬＥは、米国特許公開第２０１３／０２７４１２９ Ａ１号に示されており（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属の細菌に見られる天然に存在するタンパク質の修飾形態であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、核への輸送を可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。
本明細書で提供される方法および組成物について、調節タンパク質または調節複合体の核酸標的化能力は、ＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増加する。実施形態では、標的遺伝子座での相同組換えの速度は、ＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する。
実施形態では、第１の調節複合体は第１のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第２の調節複合体は第２のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１のリボ核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む。実施形態では、第２のリボ核タンパク質複合体は、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡである。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２の短縮型ｇＲＮＡである。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、ＴＡＬエフェクタータンパク質である。
実施形態では、第１の調節タンパク質は、第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートであり、第２の調節タンパク質は、第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。実施形態では、第１の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体であり、第２の調節複合体は、リボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１の調節複合体は、第１のリボ核タンパク質複合体であり、第２の調節複合体は、第２のリボ核タンパク質複合体である。実施形態では、第１の調節複合体は、リボ核タンパク質複合体であり、第２の調節タンパク質は、ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体である。
本明細書で提供される薬剤は、それらを発現する細胞にとって内因性であっても内因性でなくてもよい。このため、実施形態では、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１の調節タンパク質、第１の調節複合体、第２の調節タンパク質、または第２の調節複合体は、該細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１の調節タンパク質および第２の調節タンパク質は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１の複合体および第２の調節複合体は、細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、該細胞にとって内因性ではない。実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、該細胞にとって内因性ではない。
出願人らは、驚くべきことに、モジュレーター結合配列に対する第１および／または第２のエンハンサー結合部位の距離が、ＤＮＡ結合調節増強剤が調節タンパク質または調節複合体の活性に及ぼす効果に影響することを発見した。第１のエンハンサー結合部位とモジュレーター結合配列との間の距離は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の最も３’にあるヌクレオチドとモジュレーター結合配列の最も５’にあるヌクレオチドとを接続するヌクレオチドの数である。同様に、第２のエンハンサー結合部位とモジュレーター結合配列との間の距離は、モジュレーター結合配列の最も３’にあるヌクレオチドとモジュレーター結合配列と第１のＤＮＡ結合調節増強剤の最も５’にあるヌクレオチドとを接続するヌクレオチドの数である。モジュレーター結合配列は、タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質）または核酸（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）によって結合してもよい。モジュレーター結合配列に含まれる調節部位は、調節タンパク質または調節複合体によって認識され、モジュレーター結合配列の残りの部分への結合が加水分解されるヌクレオチドに対応する、モジュレーター結合配列中のヌクレオチドの位置である。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から２００ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から１５０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から１００ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から５０ヌクレオチド未満離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から４～３０ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から７～３０ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から４ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から１２ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から２０ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れている。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、調節部位から１０～４０ヌクレオチド離れている。実施形態では、第１のエンハンサー結合配列または第２のエンハンサー結合配列は、調節部位から３３ヌクレオチド離れている。
実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列から１９ヌクレオチド離れている。さらなる実施形態では、第１のエンハンサー結合配列および第２のエンハンサー結合配列は、独立して、長さが１８ヌクレオチドである。別のさらなる実施形態では、モジュレーター結合配列は、第１の結合配列および第２の結合配列を含み、第１の結合配列および第２の結合配列は、独立して、長さが１８ヌクレオチドであり、１６ヌクレオチド配列離れている。
実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤または第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の調節タンパク質、第１の調節複合体、第２の調節タンパク質、または第２の調節複合体の活性を、調節部位で増強する。
細胞内に存在する他の成分（例えば、ドナーＤＮＡ分子、調節タンパク質、調節複合体など）への標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させるための複数の形式が本明細書で提供される。アクセス可能性は、標的遺伝子座の特定のＤＮＡ配列（エンハンサー結合配列）に結合する調節増強剤の結合により増大する。ＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡまたはＴＡＬエフェクタードメインであってもよい。実施形態では、２つのＤＮＡ結合調節増強剤（例えば、第１および第２のＤＮＡ結合調節増強剤）が標的遺伝子座に結合する。２つのＤＮＡ結合調節増強剤（例えば、２つのＴＡＬエフェクタードメインまたは２つの短縮型ｇＲＮＡ）が標的遺伝子座に結合する場合、それらは、例えば、ヌクレアーゼ切断部位を含む調節配列に隣接してもよい。ＤＮＡ結合調節増強剤のそれぞれのエンハンサー結合配列への結合により、標的遺伝子座の調節配列は、ＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較してよりアクセスしやすくなり得る。
本発明は、とりわけ、それぞれの結合配列（エンハンサー結合配列）に各々結合した２つのＴＡＬエフェクタードメインを含む標的遺伝子座を提供し、エンハンサー結合配列は、調節部位（例えば、ヌクレアーゼ切断部位）を有するモジュレーター結合配列に隣接する。エンハンサー結合配列がモジュレーター結合配列に隣接する場合、第１のエンハンサー結合配列は、モジュレーター結合配列を介して第２のエンハンサー結合配列に連結する。このため、５’から３’の方向では、標的遺伝子座は、第２のエンハンサー結合配列に接続したモジュレーター結合配列に接続した第１のエンハンサー結合配列をコードし得る。２つのＴＡＬエフェクタードメインがそれぞれの結合配列（エンハンサー結合配列）に結合することにより、とりわけモジュレーター結合配列での２つのＴＡＬＥＮコンジュゲートによって結合および／または修飾される標的遺伝子座のアクセス可能性が増大する。２つのエンハンサー結合配列の各々は、モジュレーター結合配列から、例えば７ヌクレオチド離れていてもよい。２つのエンハンサー結合配列の各々がモジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れている場合、第１のエンハンサー結合配列の最も３’にあるヌクレオチド（すなわち、最後のヌクレオチド）は、７つの連続したヌクレオチドの配列を介して、モジュレーター結合配列の最も５’にあるヌクレオチド（すなわち、最初のヌクレオチド）に連結する。同様に、第２のエンハンサー結合配列の最も５’にあるヌクレオチド（すなわち、最初のヌクレオチド）は、７つの連続したヌクレオチドの配列を介して、モジュレーター結合配列の最も３’にあるヌクレオチド（すなわち、最後のヌクレオチド）に連結する。２つの調節タンパク質もしくは調節複合体またはそれらの組み合わせがモジュレーター結合配列に結合する場合、それらは、それぞれ、独立した結合配列、第１の結合配列、および第２の結合配列に結合することにより、結合し得る。第１の結合配列はモジュレーター結合配列の５’部分に含まれてもよく、一方、第２の結合配列はモジュレーター結合配列の３’部分の一部を形成してもよい。したがって、５’から３’の方向では、モジュレーター結合配列は、少なくとも１つのヌクレオチドによって第２の結合配列に接続した第１の結合配列を含んでもよい。実施形態において、モジュレーター結合配列の最も５’にあるヌクレオチド（すなわち、最初のヌクレオチド）は、第１の結合部位の最も５’にあるヌクレオチドであり、モジュレーター結合配列の最も３’にあるヌクレオチド（すなわち、最後のヌクレオチド）は、第１の結合部位の最も３’にあるヌクレオチドである。
さらに、２つのエンハンサー結合配列の各々は、切断部位（調節部位）から３３ヌクレオチド離れていてもよい。２つのエンハンサー結合配列の各々が調節部位から３３ヌクレオチド離れている場合、第１のエンハンサー結合配列の最も３’にあるヌクレオチドは、連続した３３個の連続したヌクレオチドの配列を介して、調節部位のヌクレオチド５’に連結する。同様に、第２エンハンサー結合配列の最も５’にあるヌクレオチドは、３３個の連続したヌクレオチドの配列を介して、調節部位のヌクレオチド３’に連結する。
このため、一実施形態では、標的遺伝子座には、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第１のエンハンサー結合配列と、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第２のエンハンサー結合配列と、第１の結合部位でモジュレーター結合配列に結合する、第１のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインからなる第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートと、第２の結合部位でモジュレーター結合配列に結合する、第２のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインからなる第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートと、が含まれる。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れている。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列の第１の結合配列から７ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列の第２の結合配列から７ヌクレオチド離れている。別のさらなる実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は調節部位から３３ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列は調節部位から３３ヌクレオチド離れている。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から１２ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から１２ヌクレオチド離れている。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から４ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から４ヌクレオチド離れている。
一実施形態では、標的遺伝子座には、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第１のエンハンサー結合配列と、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第２のエンハンサー結合配列と、第１の結合部位でモジュレーター結合配列に結合する、第１のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインからなる第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートと、第２の結合部位でモジュレーター結合配列に結合する、第２のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインからなる第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートと、が含まれる。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から１９ヌクレオチド離れている。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列の第１の結合配列から３０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列の第２の結合配列から１９ヌクレオチド離れている。別のさらなる実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、長さが１８ヌクレオチドであり、第２のエンハンサー結合配列は、長さが１８ヌクレオチドである。さらなる一実施形態では、モジュレーター結合配列の第１の結合配列は、モジュレーター結合配列の第２の結合配列から１６ヌクレオチド離れている。
一実施形態では、標的遺伝子座には、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第１のエンハンサー結合配列と、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第２のエンハンサー結合配列と、モジュレーター結合配列に結合した、ガイドＲＮＡに結合したＣａｓ９ドメインからなるリボ核タンパク質複合体と、が含まれる。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から７ヌクレオチド離れている。他の一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から２０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から２０ヌクレオチド離れている。
一実施形態では、標的遺伝子座には、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第１のエンハンサー結合配列と、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質に結合した第２のエンハンサー結合配列と、モジュレーター結合配列に結合した、転写活性化因子ドメインに作動可能に連結したＴＡＬエフェクタードメインからなるＤＮＡ結合コンジュゲートと、が含まれる。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れている。別のさらなる実施形態では、第１のエンハンサー結合配列は、長さが１８ヌクレオチドであり、第２のエンハンサー結合配列は、長さが１８ヌクレオチドである。さらなる一実施形態では、モジュレーター結合配列は、長さが１８ヌクレオチドである。
他の一実施形態では、標的遺伝子座には、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第１の短縮型ガイドＲＮＡに結合した第１のエンハンサー結合配列と、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第２の短縮型ガイドＲＮＡに結合した第２のエンハンサー結合配列と、モジュレーター結合配列に結合した、ガイドＲＮＡに結合したＣａｓ９ドメインからなるリボ核タンパク質複合体と、が含まれる。さらなる一実施形態では、第１のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から３０ヌクレオチド離れており、第２のエンハンサー結合配列はモジュレーター結合配列から１５ヌクレオチド離れている。
一実施形態では、モジュレーター結合配列は、長さが５２ヌクレオチドである。他の一実施形態では、第１の結合配列は、長さが１８ヌクレオチドである。他の一実施形態では、第２の結合配列は、長さが１８ヌクレオチドである。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、短縮型ｇＲＮＡである。さらなる一実施形態では、短縮型ｇＲＮＡはＣａｓ９タンパク質に結合する。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２の短縮型ｇＲＮＡである。さらなる一実施形態では、第１の短縮型ｇＲＮＡは、第１のＣａｓ９タンパク質に結合し、第２の短縮型ｇＲＮＡは、第２のＣａｓ９タンパク質に結合する。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は第２のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第１の調節タンパク質は、第１のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインからなる第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートであり、第２の調節タンパク質は、第２のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインからなる第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、調節タンパク質複合体は、ガイドＲＮＡに結合したＣａｓ９ドメインである。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第１の短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第２の短縮型ｇＲＮＡであり、調節タンパク質複合体は、ガイドＲＮＡに結合したＣａｓ９ドメインである。
一実施形態では、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第１の短縮型ｇＲＮＡであり、第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、Ｃａｓ９タンパク質に結合した第２の短縮型ｇＲＮＡであり、第１の調節タンパク質は、第１のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインからなる第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートであり、第２の調節タンパク質は、第２のＴＡＬＥＮに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインからなる第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである。
細胞内改変のための核酸分子
ドナー核酸分子（例えば、ドナーＤＮＡ分子）は、典型的には、標的遺伝子座にあるまたはその近くにある核酸に対応する少なくとも１つの相同性の領域と、標的遺伝子座の修飾のために設計された不活性領域とを含む。相同組換えのために設計されたドナー核酸分子は、多くの場合、次の順序で少なくとも３つの領域を有する：（１）標的遺伝子座にあるまたはその近くにある核酸に対応する第１の相同性の領域、（２）挿入領域、および（３）標的遺伝子座にあるまたはその近くにある核酸に対応する第２の相同性の領域（図３８参照）。さらに、ドナー核酸分子は、一本鎖（ＳＳ）であっても二本鎖（ＤＳ）であってもよく、一方または両方の末端が平滑末端であってもよく、あるいは一方または両方の末端にオーバーハングがあってもよい。オーバーハングは、存在する場合、５´、３´、または３´および５´であってもよい。また、オーバーハングの長さは異なり得る。ドナー核酸分子は、多くの場合、約１ヌクレオチド～約数千ヌクレオチドであってもよい「挿入」領域も含む。
上記のように、オーバーハングは、存在する場合、サイズが様々であってもよい。オーバーハングは、約１～約１，０００ヌクレオチド（例えば、約１～約１，０００、約５～約１，０００、約１０～約１，０００、約２５～約１，０００、約３０～約１，０００、約４０～約１，０００、約５０～約１，０００、約６０～約１，０００、約７０～約１，０００、約８０～約１，０００、約１００～約１，０００、約１～約８００、約１～約７００、約１～約５００、約１～約４００、約１～約３００、約１０～約６００、約１０～約４００、約１０～約２５０、約３０～約７００、約５０～約６００、約５０～約２５０、約７５～約８００、約８０～約５００、約１００～約８００、約１００～約６００などのヌクレオチド）であってもよい。
ドナー核酸分子の一方または両方の末端が、それが導入されるように設計されている二本鎖切断の末端と「一致する」場合、相同組換えの効率が高まる。さらに、細胞への進入時に（および細胞への進入前に）、ドナー核酸分子は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなど）にさらされてもよい。ドナー核酸分子の改変に関するエンドヌクレアーゼの作用を制限するために、１つ以上のヌクレアーゼ耐性基が存在してもよい。
改変が意図される細胞内核酸分子は、染色体、核プラスミド、葉緑体ゲノム、およびミトコンドリアゲノムを含む、任意の細胞内核酸分子であり得る。さらに、修飾が意図される細胞内核酸分子は、細胞内のどこに位置してもよい。
図３８は、本明細書に示される方法で使用され得るドナー核酸分子のある数の異なる変形を示す。末端の白丸は、ヌクレアーゼ耐性基を表す。そのような基は、ドナー核酸分子のある数の場所に位置し得る。ドナー核酸分子番号６は、ヌクレアーゼ耐性基を過ぎて位置する下部鎖の３’末端領域を示す。一部の場合には、細胞ヌクレアーゼは、ドナー核酸分子のこの部分を消化する。これらのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ耐性基によって停止または減速され、それにより、下部鎖の３’領域の末端の構造が安定する。
１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つなど）のヌクレアーゼ耐性基を含有する核酸分子を含む組成物は、本明細書に記載の方法の実施に使用され得る。多くの場合、ヌクレアーゼ耐性基は、ドナー核酸分子の一方または両方の末端に位置する。ドナー核酸分子は、一方または両方の末端から内部に基を含んでもよい。多くの場合、そのようなドナー核酸分子の一部またはすべてが細胞内で処理されて、二本鎖破断部位に一致する末端が生成される。
相同性領域は長さが異なっていてもよく、標的遺伝子座の核酸との配列同一性の量が異なっていてもよい。典型的には、相同組換え効率は、相同領域の長さおよび配列同一性の増大とともに増大する。採用される相同領域の長さは、大きな核酸分子の脆弱性、トランスフェクション効率、相同領域を含む核酸分子の生成の容易さなどの要因によって決定されることが多い。
相同性領域は、全長が、約２０塩基～約１０，０００塩基（例えば、約２０塩基～約１００塩基、約３０塩基～約１００塩基、約４０塩基～約１００塩基、約５０塩基～約８，０００塩基、約５０塩基～約７，０００塩基、約５０塩基～約６，０００塩基、約５０塩基～約５，０００塩基、約５０塩基～約３，０００塩基、約５０塩基～約２，０００塩基、約５０塩基～約１，０００塩基、約５０塩基～約８００塩基、約５０塩基～約６００塩基、約５０塩基～約５００塩基、約５０塩基～約４００塩基、約５０塩基～約３００塩基、約５０塩基～約２００塩基、約１００塩基～約８，０００塩基、約１００塩基～約２，０００塩基、約１００塩基～約１，０００塩基、約１００塩基～約７００塩基、約１００塩基～約６００塩基、約１００塩基～約４００塩基、約１００塩基～約３００塩基、約１５０塩基～約１，０００塩基、約１５０塩基～約５００塩基、約１５０塩基～約４００塩基、約２００塩基～約１，０００塩基、約２００塩基～約６００塩基、約２００塩基～約４００塩基、約２００塩基～約３００塩基、約２５０塩基～約２，０００塩基、約２５０塩基～約１，０００塩基、約３５０塩基～約２，０００塩基、約３５０塩基～約１，０００塩基など）であってもよい。
一部の場合には、長さが２００塩基未満の配列相同性の領域を使用することが望ましくあり得る。これは、ドナー核酸分子が小さな挿入物（例えば、約３００塩基未満）を含む場合、および／またはドナー核酸分子が二本鎖破断部位と一致する１つまたは２つのオーバーハング末端を有する場合に言える。
オーバーハング末端は様々な長さであってもよく、同じドナー核酸分子の各末端において異なる長さであってもよい。多くの場合、これらのオーバーハングは、配列相同性の領域を形成する。図３８は、例えば、３０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する一連のドナー核酸分子を示す。これらのドナー核酸分子は、一本鎖および二本鎖として示される。図３８のドナー核酸分子番号１は、意図される二本鎖破断部位との３０ヌクレオチドの配列相同性、３０ヌクレオチドの挿入物、および各末端に２つのヌクレアーゼ耐性基を有する、一本鎖分子である。
相同性領域が標的遺伝子座で核酸と共有する配列同一性の量は、典型的には、相同組換え効率が高い。相同領域がかなり短い場合（例えば、５０塩基）、高レベルの配列同一性が特に所望される。典型的には、標的遺伝子座と相同領域との間のシークエンサー同一性の量は、９０％超（例えば、約９０％～約１００％、約９０％～約９９％、約９０％～約９８％、約９５％～約１００％、約９５％～約９９％、約９５％～約９８％、約９７％～約１００％など）となる。
ドナー核酸分子の挿入領域は、それが意図される用途に応じて、様々な長さであり得る。多くの場合、ドナー核酸分子は、長さが約１～約４，０００塩基（例えば、約１～３，０００、約１～２，０００、約１～１，５００、約１～１，０００、約２～１，０００、約３～１，０００、約５～１，０００、約１０～１，０００、約１０～４００、約１０～５０、約１５～６５、約２～１５などの塩基）となる。
少数の塩基（例えば、約１～約１０、約１～約６、約１～約５、約１～約２、約２～約１０、約２～約６、約３～約８など）を細胞内核酸に導入するための組成物および方法も本明細書で提供される。例示の目的で、長さが５１塩基対であるドナー核酸分子が調製され得る。このドナー核酸分子は、挿入領域が単一塩基対である、長さ２５塩基対の２つの相同性領域を有してもよい。標的遺伝子座を取り巻く核酸が、塩基対の介在しない相同性の領域と本質的に一致する場合、相同組換えにより、標的遺伝子座に単一塩基対が導入される。このような相同組換え反応を用いて、例えば、タンパク質をコードするリーディングフレームを破壊し、細胞内核酸にフレームシフトを導入することができる。このため、本発明は、１つまたは少数の塩基を細胞内核酸分子に導入するための組成物および方法を提供する。
本発明は、細胞内核酸分子中の短いヌクレオチド配列を改変するための組成物および方法をさらに提供する。この一例は、単一ヌクレオチド位置の変化であり、一例は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の修正または改変である。ＳＮＰ改変を例示目的で使用して、ドナー核酸分子は、長さ２５塩基対の２つの相同性領域により設計され得る。これらの相同性の領域の間には、本質的に細胞内核酸分子中の対応する塩基対の「不一致」である単一塩基対が位置する。このため、相同組換えは、塩基対を野生型とみなされるものまたは別の塩基（例えば、異なるＳＮＰ）とみなされるもののいずれかに変更することにより、ＳＮＰを改変するために用いられ得る。相同組換えが正しく行われた細胞は、後の標的遺伝子座の配列決定により同定され得る。
本発明には、ＳＮＰ改変を含む、治療用途にゲノムを改変するための組成物および方法も含まれる。例示の目的で、ＳＮＰ改変に起因する２つの遺伝病を以下に示す。
鎌状赤血球貧血に関連する最も一般的なＳＮＰはｒｓ３３４であり、これはＧＡＧからＧＴＧへの単一コドンの変化の改変をもたらす。この変化により、グルタミン酸残基がバリン残基で代置される。本明細書に示される組成物および方法は、特にＳＮＰ ｒｓ３３４の個々のホモ接合体において、このＳＮＰをＧＴＧからＧＡＧに改変するのに好適である。これらの理由のうちの１つは、毒性関連効果を含む、細胞への核酸分子の導入に関する。さらに、これらの効果は、細胞に導入される核酸の量とともに増加するという点で、段階的である。以下の例に示すように、ゲノム挿入の効率は、細胞に導入する必要があるドナーＤＮＡが比較的少量であるようなものである（例えば、図１１および１３のドナーＤＮＡ－ＮＬＳコンジュゲートデータを参照）。
患者のＳＮＰ ｒｓ３３４を改変するためのひとつの例示的なエクスビボでのワークフローには、患者からの骨髄組織の除去、ＳＮＰ ｒｓ３３４の改変、それに続く編集細胞の患者への再導入が含まれる。
嚢胞性線維症に関連する最も一般的なゲノムの改変の１つは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の３塩基対の欠失（ＳＮＰ ｒｓ１９９８２６６５２）に基づき、これにより、５０８位のアミノ酸フェニルアラニンが欠失する。
患者のＳＮＰ ｒｓ１９９８２６６５２を改変するためのインビボでのワークフローには、ＳＮＰ ｒｓ１９９８２６６５２を修正するために３塩基対挿入が発生する条件下で、患者の気道細胞にドナーＤＮＡ分子を送達することが含まれる。
効率的な遺伝子編集に必要な低用量のドナー核酸は、全身送達にも有用である。これは、用量の低さが毒性の減少と相関するためである。修飾された核酸分子（例えば、ホスホロチオエート連結を有する核酸分子）が使用される場合、低いドナーＤＮＡ分子レベルは特に重要である。
ドナー核酸分子は、細胞外標的化部分だけでなく、細胞内標的化部分にもコンジュゲートされ得る。「細胞外標的化部分」は、ドナー核酸分子を１つ以上の細胞型に向ける分子である。そのような部分には、細胞表面受容体リガンドおよび抗体が含まれる。緑膿菌のドメインＩＩは、細胞膜を横断する転座に関与することが示されている。（Ｊｉｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３２０３－１３２０７（１９８８））。このため、生物の細胞内位置に核酸分子を送達するための１つの例示的なシステムには、以下の成分：（１）ドナーＤＮＡ分子、（２）核コンジュゲーションシグナル（ＮＬＳ）、ならびに（３）緑膿菌外毒素の細胞表面受容体およびドメインＩＩに結合する抗体を含む融合タンパク質が関与し、ここで、ＮＬＳおよび融合タンパク質は、ドナーＤＮＡ分子に共有結合する。この種類のドナーＤＮＡ分子により、ドナーＤＮＡ分子の全身送達が可能となり、ドナーＤＮＡ分子は、細胞表面受容体を含む細胞内の細胞内位置に送達される。
上記の２つの例の各々において、患者が実質的な利益を享受するために、改変する必要がある対立遺伝子のコピーは１つのみである。しかしながら、多くの細胞では、ＳＮＰの両方のコピーが改変される。このため、本発明には、ホモ接合性およびヘテロ接合性両方の遺伝子成分から得られる病気の治療が含まれる。
ドナー核酸分子はまた、機能的なコード領域染色体オープンリーディングフレームを導入するように設計されてもよい。この一例は、オープンリーディングフレームの末端における停止コドンの除去である。そのような終止コドンは、野生型オープンリーディングフレームに存在しないため（すなわち、「野生型」からの改変を表す）、またはオープンリーディングフレームの末端に自然に存在し得るため、除去されてもよい。また、コード領域に停止コドンを導入してもよい。これは、オープンリーディングフレームを破壊しようとする場合に特に有用である。
さらに、標識コード領域は、タンパク質発現から標識されたタンパク質が得るように、導入してもよい。そのような標識は、標識が、タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、または内部のうちの１つ以上に存在するように、細胞内核酸に導入されてもよい。標識の例には、エピトープ標識（例えば、Ｈｉｓ標識、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）標識、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）標識、およびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識など）および酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識など）が含まれる。
このため、本発明には、非天然タンパク質をコードする核酸分子をクローニングすることなく非天然タンパク質を産生させるための組成物および方法が含まれる。これらの方法は、一部には、融合タンパク質が修飾された細胞内核酸分子によりコードされるようになる場所で、ポリペプチドコード領域を細胞内核酸分子の位置に導入し、その後、コードされた融合タンパク質を発現させ、融合タンパク質を細胞から分離することに基づく。
培養細胞
本明細書で提供される細胞（その実施形態を含む）には、細胞内のゲノム遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる複合体が含まれる。提供される複合体は、遺伝子座での調節タンパク質へのアクセス可能性を増大させるエンハンサータンパク質を含めることにより、ゲノム（標的）遺伝子座での調節タンパク質または複合体の活性を増強し得る。例えば、本明細書で提供されるＤＮＡ結合調節増強剤がゲノム遺伝子座（標的遺伝子座）に結合すると、遺伝子座は、ヌクレアーゼまたは他の酵素活性によりアクセスしやすくなり、それにより、該ヌクレアーゼまたは他の酵素活性の効率および有効性が増強する。
一態様では、標的遺伝子座調節複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列、および調節部位を含むモジュレーター結合配列と、（ｉｉ）モジュレーター結合配列に結合した第１の調節タンパク質または第１の調節複合体と、（ｉｉｉ）第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤とが含まれる。
実施形態では、標的遺伝子座には、モジュレーター結合配列によって第１のエンハンサー結合配列に連結した第２のエンハンサー結合配列が含まれる。
実施形態では、細胞には、第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤が含まれる。
一態様では、標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列を含む標的遺伝子座と、（ｉｉ）第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、が含まれ、第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、細胞にとって内因性ではなく、かつ第１のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる。
一態様では、標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞が提供される。複合体には、（１）（ｉ）第１エンハンサー結合配列、および（ｉｉ）第２のエンハンサー結合配列を含む、標的遺伝子座と、（２）細胞にとって内因性ではない、標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、（３）細胞にとって内因性ではない、標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤と、が含まれ、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤は、第１のＤＮＡ結合調節増強剤および第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる。
本発明の組成物および方法を使用して、あらゆる数の目的に有用な細胞株を生成することができる。例えば、単一の遺伝子座または複数の遺伝子座が改変されてもよい。生成され得る細胞株の一例は、ヒト化抗体を産生させるために使用されるＣＨＯ細胞株である。そのような細胞株を産生するためには、ヒト化抗体配列をコードするドナー核酸分子を、ＣＨＯ細胞ゲノムへの挿入が起こるように設計されている条件下でＣＨＯ細胞株に導入する。典型的には、選択可能なマーカーもゲノムに導入して、修飾細胞の選択を可能にする。言うまでもなく、あらゆる好適な細胞株および本質的にあらゆる望ましいコード配列を使用することができる。このため、本発明には、遺伝子産物（例えば、タンパク質）の生物生産に有用な細胞を生成するための組成物および方法が含まれる。
本発明の組成物および方法はまた、初代細胞または癌細胞の均一なプールを生成するために使用されてもよい。これらの方針に沿って、高効率の遺伝子編集により、「下流」用途に直接または最小限の選択後に使用され得る細胞の改変が可能となる。
１つの例示的なワークフローには、シンバスタチン前駆体であるモナコリンＪの合成が伴う。シンバスタチン前駆体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓにより産生される真菌ポリケチドであるロバスタチンのアルカリ加水分解を伴う多段プロセスにより化学的に作製することができる。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに見られるロバスタチンヒドロラーゼが同定され、特徴付けられている。このヒドロラーゼは、ロバスタチンのモナコリンＪへの加水分解に非常に効率的であるが、シンバスタチンについては検出可能な活性はない（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｊ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１０９－１１４（２０１７）を参照されたい）。
このワークフローでは、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓゲノムにＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍロバスタチンヒドロラーゼを安定的に導入することにより、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ生産細胞株を成長させる。ロバスタチンはＡ．ｔｅｒｒｅｕｓによって生産される天然のポリケチド産物であるため、操作された細胞は、その後、細胞内でロバスタチンをモナコリンＪに変換する。このため、１つのワークフローは、本明細書で示される方法を使用してＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ細胞を操作する場合であり、ここでは、細胞集団をモナコリンＪ産生に直接使用できるのに十分な割合（例えば、６０％超）の細胞集団がロバスタチンヒドロラーゼを発現する。代替的なワークフローは、操作されたＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ細胞の選択または操作されたＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ細胞に対する選択が使用前に生じるワークフローである。
上記と同様のワークフローを使用して、スクリーニングアッセイで使用するための細胞（例えば、初代哺乳動物細胞、不死化哺乳動物細胞など）を生成してもよい。一例は、初代肝細胞を修飾した後、薬物関連肝毒性のスクリーニングに使用する場合である。
キット
本発明はまた、一部には核酸分子のアセンブリおよび／または保存のため、ならびに細胞ゲノムの編集のためのキットを提供する。これらのキットの一部として、核酸分子のアセンブリと、キット構成要素の保管および使用のための反応混合物の調製との両方のため、材料および指示が提供される。
本発明のキットには、多くの場合、次の構成要素のうちの１つ以上が含まれてもよい。
１．１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤（例えば、ＴＡＬエフェクタータンパク質、またはＣａｓ９タンパク質に結合した短縮型ｇＲＮＡ）
２．１つ以上の調節タンパク質（例えば、ヌクレアーゼに連結したＴＡＬエフェクタードメインを含むＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲート）
３．１つ以上の調節複合体（例えば、ｇＲＮＡに結合した１つ以上のＣａｓ９ドメイン、ガイドＤＮＡに結合したアルゴノートタンパク質ドメインなど）
４．キット構成要素の使用方法の説明書。
キット試薬は、任意の好適な容器中で提供されてもよい。キットでは、例えば、１つ以上の反応または保管緩衝液が提供されてもよい。試薬は、特定の反応で使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態で（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態で）提供されてもよい。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨが約７～約１０である。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を説明するために提供されており、決して本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。実施例は、以下の実験が実行したすべてかつ唯一の実験であることを表すようには意図されない。使用された数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別途明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるかまたは大気圧に近い。
実施例１：プロモーターの挿入
材料
ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、２９３ＦＴ細胞、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ、２％ Ｅ－Ｇｅｌ（登録商標）ＥＸ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌｓ、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｐｒｏ Ｑｕｉｃｋ９６ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ＲＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １０ μＬ Ｋｉｔ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、組換えヒトＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２） ＣＴＳ（商標）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標） Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ、ＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ）Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ポリクローナルベータアクチン抗体、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）抗体、およびＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからであった。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＮＵ ７０２６は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから注文した。この研究で使用したＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびドナーＤＮＡの配列は表１２に列挙した。
ｇＲＮＡの合成
ｇＲＮＡ合成に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびプライマーは、ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌにより設計した。次に、ｇＲＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して合成した。ｇＲＮＡの濃度を、ＱＵＢＩＴ（登録商標）ＲＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにより決定さした。
非対称ＰＣＲによる長い一本鎖ＤＮＡの生成
まず、ドナーＤＮＡテンプレートを順方向プライマーおよびビオチン化逆方向プライマーで増幅した。得られたＰＣＲ産物（２０ｎｇ）を、総容量５０μｌの０．２μＭ順方向プライマーおよび０．０１μＭビオチン化逆方向プライマーを含むＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに加えた。合計２４の反応をセットし、次のＰＣＲプログラムを使用した：１サイクルについて３０秒間９８°Ｃ、その後、合計２４サイクルについて、５秒間９８°Ｃ、１０秒間５５°Ｃ、および４５秒間７２℃。最終伸長を７２℃で３分間インキュベートした。二本鎖ＤＮＡテンプレートを除去するために、ＰＣＲ産物を組み合わせて、穏やかに回転させながら室温で２０分間、３００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１とともにインキュベートした。磁石で磁気ビーズを除去し、上清を４カラムのＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ精製に供し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃを使用して濃縮した。約５μｇの一本鎖ＤＮＡを得た。
ゲノム切断および検出アッセイ
ゲノム切断効率を、製造元の指示に従ってＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）により決定した。各ゲノム遺伝子座のＰＣＲ増幅のためのプライマー配列を表１２に記載する。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を分析した。切断効率を相対アガロースゲルバンド強度に基づいて計算し、これを、ＡｌｐｈａＶｉｅｗ（登録商標）、Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．４．０．０．ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅを実行するＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（登録商標）ゲルドキュメンテーションシステム（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して定量化した。
ヒト初代Ｔ細胞の単離
製造元の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配を使用して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を末梢血から単離した。次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔを使用して、ヒト初代Ｔ細胞を単離し、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭを使用して拡大した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８キットを使用して、ヒトＴ細胞の活性化および拡大を行った。活性化の３日目に、トランスフェクションのためにＴ細胞を採取した。
細胞トランスフェクション
２９３ＦＴまたはＡ５４９細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で維持した。トランスフェクションの当日、細胞を培養フラスコから剥離させ、計数した。各エレクトロポレーションについて、１．５μｇのＣａｓ９タンパク質および３６０ｎｇのｇＲＮＡをＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒに加えて、最終体積を７μｌにしたが、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡとの合計量は１μｌ未満であった。混合したら、試料を室温で５～１０分間インキュベートして、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を形成させた。一方、１×１０6細胞のアリコートをＣａ2+およびＭｇ2+を含まないＤＰＢＳで１回洗浄し、細胞ペレットを５０μｌのＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒに再懸濁した。次に、細胞懸濁液の５μｌのアリコートを７μｌのＣａｓ９ ＲＮＰと混合した後、１μｌの指示量のドナーＤＮＡを添加した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーを含む１０μｌの細胞懸濁液をＮｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）に適用し、電圧を１１５０Ｖ、パルス幅を２０ｍｓ、パルス数を２に設定した。エレクトロポレーションした細胞を、０．５ｍｌの培地を含む４８ウェルプレートに移した。ｇＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含まない試料を対照として使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。あるいは、ゲノム遺伝子座を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイを使用して分析した。編集した細胞をさらに限界希釈した後、クローン細胞を単離した。クローン細胞を、Ｎ末端接合部およびＣ末端接合部両方のＰＣＲ増幅と配列決定とによって特性評価した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）１１．５ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、配列データを分析した。
初代Ｔ細胞のトランスフェクションには、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションあたり１×１０5個の細胞を使用し、それぞれ、電圧を１７００Ｖ、パルス幅を２０ｍｓ、パルス数を１に設定した。化学修飾がＨＤＲ効率に与える影響を評価するために、化学合成中にオリゴヌクレオチドの特定の位置にホスホロチオエートまたはアミン修飾ヌクレオチドを加えた。次いで、得られた修飾オリゴヌクレオチドを使用して、ドナーＤＮＡを増幅した。ＮＵ ７０２６阻害剤による細胞処理では、細胞を上記のようにトランスフェクトし、３０μＭのＮｕ ７０２６を含む細胞培地に加えた。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に分析した。
タンパク質標識化の戦略
タンパク質標的化により、タンパク質の細胞内局在化を視覚化し、それらの機能を研究することができるようになる。内因性細胞タンパク質を標識するための戦略を図１に示す。プロモーターを持たないピューロマイシン選択マーカーは、自己切断型２Ａペプチドを介してレポーター遺伝子に連結する。ピューロマイシン遺伝子は、Ｎ末端標識化の場合は融合タンパク質の５’末端に、Ｃ末端標識化の場合は３’末端に配置する。３５ｎｔ相同性アームを、ＰＣＲ増幅によりドナーＤＮＡの５’末端および３’末端に付加する。ピューロマイシンの発現を内因性プロモーターにより駆動し、一方でレポーター遺伝子はインフレームで内因性遺伝子に融合させる。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲは、Ｎ末端標識の場合はＡＴＧ開始コドン近く、またはＣ末端標識の場合は停止コドン近くのゲノム遺伝子座を標的とするように設計する。得られたＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲとドナーＤＮＡとを、脂質媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを介して細胞に送達する。トランスフェクションの４８時間後、細胞をピューロマイシンで７日間処理し、蛍光顕微鏡により視覚化するか、またはジャンクションＰＣＲおよび配列決定により分析する。
Ｎ末端タンパク質標的化の例
内因性タンパク質の標的化の戦略を評価するために、ＯＦＰ遺伝子をベータアクチンのＮ末端に融合させた。ベータアクチンは、真核生物中で最も豊富なタンパク質のうちの１つであるため、蛍光顕微鏡を使用したモニタリングが容易である。ｇＲＮＡを、ＡＴＧ開始コドンの近くにあるベータアクチンのゲノム遺伝子座を標的とするように設計および合成し（表１２）、その後、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体化させてＲＮＰを形成した。関連する３５ｎｔの相同性アームを、ＰＣＲ増幅により、配列が確認されたプロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＯＦＰ ＤＮＡ断片に付加した。得られたドナーＰＣＲ断片をＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した後、ｓｐｅｅｄ－ｖａｃを使用して濃縮して、約１μｇ／μｌの最終濃度にした。ドナー投与量がＨＤＲ効率に与える影響を検査するため、Ｃａｓ９ ＲＮＰの量を一定に保ち、ドナーＤＮＡの量を変化させた。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより２９３ ＦＴにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を蛍光顕微鏡により分析した。細胞をＣａｓ９ ＲＮＰ単独またはドナーＤＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質でトランスフェクトした場合、ＯＦＰ陽性細胞は検出されなかったが、細胞をＣａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡでトランスフェクトした場合には、ＯＦＰ陽性細胞が観察された。ＯＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリー分析により決定した。選択なしでは、ドナーＤＮＡの量を２５ｎｇから５００ｎｇに増加させた場合、ＯＦＰ陽性細胞の割合が約５％から２０％に増加した（図２Ａ）。ドナーＤＮＡの最適量は、反応ごとに約５００ｎｇであった。一方で、トランスフェクト細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシンで７日間処理した後では、細胞の約８０％がＯＦＰ陽性であった。異なる量のドナーＤＮＡ間でＯＦＰ陽性細胞の割合に有意差はなかった（図２Ａ）。次に、相同性アーム長がＨＤＲ効率に与える影響を検査した。様々な長さの相同性アームを、ＰＣＲ増幅により、プロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＯＦＰ ＤＮＡ断片に付加した。図２Ｂに示すように、相同性アーム長さを１２ｎｔから８０ｎｔに増加させると、ＯＦＰ陽性細胞の割合は、増加した後、約３５ｎｔでプラトーとなった。
従来、プラスミドドナーは、ゲノムに大きなＤＮＡ分子を組み込むために使用されていた。比較のため、約５００ｎｔの相同性アームを含むドナープラスミドを構築した。また、非対称ＰＣＲを介して３５ｎｔの相同性アームを保有する長い一本鎖ＤＮＡドナーを調製した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよび様々な形態のドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションを介して、２９３ＦＴ細胞またはヒト初代Ｔ細胞のいずれかに送達した。トランスフェクションの４８時間後、フローサイトメトリーを使用して、ＯＦＰ陽性細胞の割合を分析した。図１Ｃおよび１Ｄに示すように、３５ｎｔの相同性アームを有する一本鎖（ｓｓ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ）断片を使用するＯＦＰ陽性細胞の割合は、２９３ＦＴおよび初代Ｔ細胞の両方において、長い相同性アームを有するドナープラスミドを使用する場合よりも有意に高かった。ｓｓＤＮＡドナーを使用した効率は、初代Ｔ細胞ではｄｓＤＮＡドナーを使用した効率よりも高かったが、２９３ＦＴでは同様の効率であった。
統合部位の同一性を検査するために、Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡでトランスフェクトした細胞を、ピューロマイシン選択、限界希釈、およびクローン細胞分離に供した。合計４８個のコロニーを、ジャンクションＰＣＲ分析のためにランダムに選択した。４８のコロニーのうち、ＰＣＲ産物の成長および産生に失敗したコロニーは１つだけであった。他の４７個のコロニーはすべて、１つの外部プライマーおよび１つの内部プライマーを使用した場合、Ｎ末端接合部およびＣ末端接合部の両方でＰＣＲ産物を生じた。ＰＣＲ産物は、外部プライマーの対を、挿入物のないゲノムＤＮＡ断片に対応する約４２０ｂｐのサイズで使用したときにも観察された。挿入物を含む大きなＰＣＲ産物が観察されなかった理由は、挿入物のない小さなＤＮＡ断片が優先的に増幅されたためである。ＰＣＲ産物の配列決定分析により、Ｎ末端接合部の約８２％がゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部で正確なＨＤＲを呈したことが確認された（図３Ａ（１））。クローン細胞の他の１８％も挿入物を含んだが、接合部に変異を有した（図３Ａ（２））。変異の大部分は欠失および挿入であった。部分長または全長の相同性アームの重複配列が接合部に挿入されたことがあった。Ｃ末端接合部では、クローン細胞の約７８％が正確なＨＤＲを保有しているのに対し（図３Ｂ（１））、その他の２２％の細胞では、接合部でインデルが形成された（図３Ｂ（２））。まれに、比較的大きなドナーＤＮＡ片（最大１６５ｎｔ）がＣ末端接合部で欠失した。全体として、すべてのクローン細胞が、対立遺伝子のうちの１つにおける正しいゲノム遺伝子座にドナーＤＮＡのコピーを１つ含んでおり、細胞の６８％がＮ末端およびＣ末端の両方で正確なＨＤＲを保有し、細胞の３２％がＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両方で不完全なＨＤＲを保有した。他の対立遺伝子には、いずれの挿入物も含まれなかった。代わりに、クローンの約８０％がＣａｓ９切断部位に１つの「Ａ」挿入を有し、クローンの２０％が２ｎｔ超の欠失を保有した。第２の対立遺伝子では、野生型クローン１つのみが検出された（図３Ｃ）。クローンの大部分は、ウエスタンブロット分析で確認して、野生型ベータアクチンとベータアクチンのＯＦＰ融合物との両方を発現した。
ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）は、哺乳動物ゲノムに二本鎖切断を導入する代替アプローチである。ベータアクチンのＡＴＧコドン付近の領域を標的とする３対のＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを設計および合成した。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ単独またはドナーＤＮＡを伴うＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、１１５０ボルト、２０ミリ秒（ｍｓ）、および２パルスを使用するＮｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションにより、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させて、ゲノム編集効率を測定するか（図３Ｄ）、またはフローサイトメトリーにより分析し（図３Ｅ）、ＯＦＰ陽性細胞の割合を決定した（－）。あるいは、細胞を、フローサイトメトリー分析の前にピューロマイシンで７日間処理した（＋）（図３Ｅ）。図３Ｄに示すように、ピューロマイシン選択なしでは、Ｔ１およびＴ３標的は約６０％および３５％のインデル頻度を生じたが、ＯＦＰ陽性細胞の割合は非常に低かった。しかしながら、ピューロマイシン選択の際には、ＯＦＰ陽性の割合は、３つの異なる標的すべてについて約６０％まで上昇した（図３Ｅ）。
ベータアクチンに加えて、異なる細胞株の異なるタンパク質も評価した。ＬＲＲＫ２タンパク質は、パーキンソン病に関連しており、分子量は約２８０ｋｄである。開始コドンに近いＬＲＲＫ２のゲノム遺伝子座を標的とするように、ｇＲＮＡを設計した。約３５ｎｔの相同性アームを、ＰＣＲ増幅を介して、配列が確認されたプロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＥｍＧＦＰ ＤＮＡ断片に付加した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを、１０５０ボルト、３０ミリ秒、および２パルスを使用するＮｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションにより、Ａ５４９細胞に同時送達した。ＬＲＲＫ２は比較的少量のタンパク質であるため、細胞内でＥｍＧＦＰシグナルを検出することはできなかった。また、いくつかの市販の抗体では、ウエスタンブロットによる全細胞溶解物中の内因性野生型ＬＲＲＫ２タンパク質の検出に失敗した。組込み効率を検査するために、細胞をトランスフェクションの４８時間後に０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで７日間処理し、続いて限界希釈を行い、クローン細胞を単離した。接合部を、１つの内部プライマーおよび１つの外部プライマー、または１対の外部プライマーを使用したＰＣＲにより分析した。得られたＰＣＲ産物を配列決定により分析し、組込みの精度を決定した。驚くべきことに、８６個のコロニーすべてに少なくとも１つの挿入物のコピーが含まれた。すべてのコロニーについて、Ｎ末端およびＣ末端の両方が、ゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の正しい接合部を有する正確なＨＤＲを保有した（図４Ａおよび４Ｂ）。ゲノムＤＮＡを分離すると、ヘテロ接合体について２つのＰＣＲ産物、およびホモ接合体について１つの大きなＰＣＲ産物を検出することができた。配列決定分析に基づくと、コロニーの約２０％は、両方の対立遺伝子にドナーＤＮＡが正確に組み込まれているのに対し、残りの８０％のコロニーの第２の対立遺伝子には挿入物が含まれず、７ｎｔの欠失のみがあった（図４Ｃ）。これらの結果により、１００％正確なＨＤＲでの１００％の統合効率が達成可能であることが示された。
Ｃ末端タンパク質標識化の例
Ｃ末端タンパク質標識化のためのプロモーター捕捉戦略は、プロモーターを持たない選択マーカーをＣ末端標識化のためのレポーター遺伝子の後に置くＮ末端タンパク質標識化とはわずかに異なり、ここでは、これをＮ末端標識化のためのレポーター遺伝子の前に置く（図１）。例として、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のＣ末端にＥｍＧＦＰ標識を融合させた。停止コドンに近いＦＡＫのゲノム遺伝子座を標的とするように、ｇＲＮＡを設計および合成した。短い相同性アームを、ＰＣＲにより、配列確認済みのＥｍＧＦＰ－２Ａ－ピューロマイシンカセットに付加した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーションにより２９３ＦＴ細胞に送達した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで７日間選択し、続いて限界希釈を行い、クローン細胞単離した。接合部を、ＰＣＲおよび配列決定により分析した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、クローンの約９５％および８５％は、それぞれ、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに補正接合部を有した。他のクローンも挿入カセットを含んだが、接合部またはＣａｓ９切断部位にインデルが形成された。ここでも、部分長または全長の相同性アームの重複配列がゲノムに挿入されたことが観察された。全体として、検査したすべてのクローンには、ドナーＤＮＡのコピーが少なくとも１つ含まれ、クローンの約７０％がＮ末端とＣ末端との両方に正確なＨＤＲを保有し、残りの３０％のクローンは対立遺伝子のうちの１つに不正確なＨＤＲを含んだ。クローン細胞の約３０％は、両方の対立遺伝子にドナーが組み込まれた。細胞の約７０％は、第２の対立遺伝子に挿入物はなかったが、Ｃａｓ９切断部位の接合部にインデルが形成された。第２の対立遺伝子において、野生型クローン１つのみが検出された（図５Ｃ）。
ＦＡＫの他に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などの他のタンパク質も検査した。ＥＧＦＲにはいくつかのアイソフォームがある。この研究では、ＥｍＧＦＰをＥＧＦＲアイソフォーム１のＣ末端に融合させた。停止コドン近くのＥＧＦＲのゲノム遺伝子座を切断するように、ｇＲＮＡを設計した。短い相同性アームを、ＰＣＲにより挿入カセットに付加した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを２９３ＦＴ細胞にエレクトロポレーションした。ピューロマイシン選択後、細胞をクローン分離に供した。驚くべきことに、１９のコロニーすべてが対立遺伝子のうちの１つに挿入カセットを保有し、Ｎ末端とＣ末端との両方の接合部は１００％正しかった。コロニーの約１７％には両対立遺伝子の組込みがあったが、コロニーの８３％は、２番目の対立遺伝子に挿入物を含まなかったものの、Ｃａｓ９切断部位のみに「Ａ」挿入を有した（図６）。ＥｍＧＦＰを用いたＥＧＦＲのゲノム修飾は、ウエスタンブロット法により検出した。
ＤＮＡドナーおよびＮＨＥＪ阻害剤の末端修飾がＨＤＲ効率に与える影響
線形ｄｓまたはｓｓＤＮＡドナーは、エキソヌクレアーゼによってインビボで分解され得る。ドナーＤＮＡの末端修飾により、ドナーＤＮＡの分解を防止することができる可能性がある。この仮説を検証するために、ＤＮＡプライマーを５’末端に様々な修飾を加えて化学合成した（表１２）。次いで、修飾したＤＮＡプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅により、プロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＯＦＰ断片を含むドナーＤＮＡを調製した。得られたＰＣＲ産物を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃを使用して濃縮した。ベータアクチンのゲノム遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰを、エレクトロポレーションを介して、様々な形態のドナーＤＮＡとともに初代Ｔ細胞に同時送達した。トランスフェクションの４８時間後、ＯＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリー分析により決定した。図７Ａに記載されているように、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡドナーは、非修飾ドナーＤＮＡと比較した場合、ＨＤＲ効率を約２倍増加した。興味深いことに、アミン修飾ドナーも、特にアンチセンス鎖の５’末端を修飾する修飾を逆方向プライマーに行った場合に、ＨＤＲ効率が向上した。両端をアミン修飾したドナーＤＮＡを使用すると、ＯＦＰ陽性細胞の割合が約４倍増加した。ｓｓＤＮＡドナーの末端修飾により、ＨＤＲ効率も向上した。しかしながら、アミン修飾ｄｓＤＮＡドナーを使用した場合の効率は、修飾ｓｓＤＮＡドナーを使用した場合の効率より約２倍高かった。
ＮＨＥＪ修復経路の破壊によりＨＤＲ効率が向上することが知られている。ここでは、これらのＮＨＥＪ阻害剤が、比較的大きなＤＮＡ分子のヒト初代Ｔ細胞への組込みにどのように影響するのかを検査した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを初代Ｔ細胞にエレクトロポレーションした直後に、細胞を、３０μＭのＮｕ７０２６を含む培地に移した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。図７Ｂに示すように、Ｎｕ７０２６を用いた細胞の処理により、ＯＦＰ陽性細胞の割合は、非修飾ドナーＤＮＡでは約５倍、アミン修飾ドナーＤＮＡでは約２倍増加した。Ｎｕ７４４１およびＫｕ－００６０６４８を含む他のＤＮＡＰＫ阻害剤でも、同様の結果が得られた。
可能性のある用途
上記の方法を使用すると、ほぼ１００％の組込み効率で大きなＤＮＡ片を哺乳動物ゲノムに容易に組み込むことができ、これにより、目的の外来ＤＮＡを哺乳動物ゲノムに直接クローニングし、治療用途のタンパク質を発現させることができるようになる。
レジ的な発現カセット
例として、プロモーターを持たない選択マーカー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、およびＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）を含む、約４．２ｋｂのヒトＩｇＧ発現カセットを調製した。ＣＭＶプロモーターは、２Ａ自己切断型ペプチドを介して連結するＩｇＧの重鎖および軽鎖の発現を駆動する（図８Ａ）。３５ｎｔの短い相同性アームを、ＰＣＲにより発現カセットに付加した後、ＰＣＲカラム精製を行った。上記のように、発現カセットを２９３ＦＴ細胞のベータアクチン遺伝子座に挿入した。７日間のピューロマイシン選択後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、安定した細胞プールでのＩｇＧ産生の力価を測定した。対照として、ＩｇＧ重鎖および軽鎖発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを一時的に細胞に同時トランスフェクトした。培地をトランスフェクション後５日目に採取した。操作した細胞プール内のＩｇＧの発現レベルは約０．５グラム／リットルであり、一方で一時的プラスミド発現系におけるＩｇＧのレベルは約０．３グラム／リットルであった。
安定したプール内の各クローン細胞を特性評するために、限界希釈およびクローン細胞の単離を行った。組込みの接合部を、ＰＣＲおよび配列決定により分析した。図８Ｂおよび８Ｃに示すように、クローン細胞の約８８％がＮ末端接合部に正確な組み込みを保有したのに対し、クローン細胞の１２％は接合部にいくつかの余分な配列が挿入されていた。一方で、クローン細胞の約４１％がＣ末端に正しい接合部を有したのに対し、クローン細胞の５９％は接合部に小さな変異を保有した。例えば、塩基置換が観察され、ＷＰＲＥ ｐｏｌｙＡ尾部領域で１つまたはいくつかのヌクレオチド挿入が生じた。小さな変異が停止コドンの後に起きたが、これはＩｇＧの発現には影響しなかった可能性がある。これを確認するために、各クローン細胞のＩｇＧの力価を検査した。図８Ｄに示すように、クローン細胞の約７０％が抗体を産生することができた。
この研究では、内因性タンパク質を標識した。キメラタンパク質の発現レベルは、細胞内部の内因性タンパク質の量に左右される。ベータアクチンなどの豊富なタンパク質の場合、キメラ融合タンパク質は、従来の広視野蛍光顕微鏡を使用して容易に検出された。しかしながら、ＬＲＲＫ２などのあまり豊富でないタンパク質の場合、従来の広視野蛍光顕微鏡法は検出には不十分であった。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）および連続波超音波切替式蛍光（ＣＷ－ＵＳＦ）などの高分解能蛍光技術の使用により、空間および時間分解能が向上した生細胞内部の蛍光分子の可視化が可能となる（Ｓｅｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６０：６２９－３３（２００３）、およびＣｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ－ｄｅｅｐ ｔｉｓｓｕｅ ｐｈａｎｔｏｍｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔｓ」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１１：ｅ０１６５９６３（２０１６））。ある対立遺伝子におけるキメラタンパク質の発現レベルが別の野生型対立遺伝子の発現レベルよりも有意に低い理由は完全には理解されていないが、導入遺伝子がゲノムに挿入されると、いくつかの転写または翻訳調節要素が破壊される可能性がある。
実施例２：ドナーＤＮＡへの核局在化シグナルの付着を介した哺乳動物細胞における相同性に基づく編集率の増大。
ドナーＤＮＡ（一本鎖または二本鎖、線状または環状）の核への送達により、編集が行われる場所の近くでドナーＤＮＡの局所濃度が増大し、したがって、ＮＨＥＪよりもこのドナーＤＮＡの使用に修復が偏ると仮定した。
Ｚａｎｔａ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：９１－９６（１９９９）では、ＤＮＡセグメントにコンジュゲートしたＮＬＳにより、ＤＮＡセグメントの核への送達が増加し得ることが実証されている。このため、核へのドナーｓｓＤＮＡの送達を増強するために、同様のアプローチを使用し得ること、および核内のドナーＤＮＡの増加により、「切断部位」でのドナーＤＮＡの組込み頻度が増加し得ることが推論された。
ＮＬＳについては、進化したＳＶ４０ ＮＬＳを使用した（ＢＰ－ＳＶ４０、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＥＧＧ）（配列番号１３）。Ｈｏｄｅｌ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２）：１３１７－１３２５（２００１）では、この配列が核に効率的に局在することが報告されている。ＮＬＳペプチドをｓｓＤＮＡドナー配列にコンジュゲートさせるために、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）またはＣｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）化学の両方を使用した。得られたＮＬＳ－オリゴコンジュゲートをＨＰＬＣにより精製した。ＮＬＳ－オリゴの質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより決定した。図９に示す２つの構築物を作製した。図１０に示すように、これらのドナーＤＮＡにより、蛍光によるスクリーニングが可能となる。
第１部：ＮＬＳとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドドナーを使用する６塩基欠失ＧＦＰの機能的ＧＦＰへの変換。
ＮＬＳペプチドＢＰ－ＳＶ４０のカルボキシ末端（配列番号１３）を、ＣＬＩＣＫ－ＩＴ（登録商標）化学により、オリゴヌクレオチドの５’末端にコンジュゲートさせた：
５´ＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＧ
ＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧ－３´（配列番号１４）。得られたＮＬＳ－オリゴヌクレオチドコンジュゲートをＨＰＬＣにより精製した。ＮＬＳ－オリゴヌクレオチドの質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより決定した。
トランスフェクションの前日に、破壊されたＥｍＧＦＰ ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３細胞株を、２４ウェルプレートにウェルあたり１×１０5の細胞密度で播種した。トランスフェクションの当日、０．５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡと、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子（ＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧ）（配列番号１５）を標的とする１５０ｎｇのｇＲＮＡとを、滅菌試験管内の２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）に加えた。ＮＬＳ－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを水に溶解させ、様々な量のＮＬＳ－オリゴヌクレオチドを、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含む試験管に加えた。対照として、オリゴヌクレオチドの５’末端に２つのホスホロチオエート、３’末端に２つのホスホロチオエートを有するホスホロチオエート修飾（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを使用した。別の試験管中、１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）を２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地に加えた。次に、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）を、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および指示量のＮＬＳ－オリゴヌクレオチドまたはＰＳ－オリゴヌクレオチドを含む試験管に移した。室温で５分間インキュベートした後、混合物を、０．５ｍｌの成長培地を含む２４ウェルに加えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析して、ＥｍＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。
図１１に示すように、ＮＬＳ－ドナーにより、細胞株の編集は著しく上昇した。細胞の最大５２％が０．１ピコモルの最適用量のＮＬＳ－ドナーでＧＦＰ陽性であり、これと比較して、標準的なＰＳ－ドナーは、最大３６％の最適な編集に、３０倍の材料である３ピコモルを必要とした。図１２は、０．０３ピコモルの等しい低用量で、ＧＦＰ＋細胞への変換がＮＬＳ－ドナーについて極めて高いことを実証している。要約すると、ＮＬＳ－ドナーではるかに低い用量のＧＦＰ陽性細胞により測定して、編集のより高い変換が見られた。
第２部：ＮＬＳとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドドナーを使用する単一の塩基を変更することによるＢＦＰの機能的なＧＦＰへの変換。
ＮＬＳペプチドＢＰ－ＳＶ４０のカルボキシ末端（配列番号１３）を、ＳＭＣＣ化学により、オリゴヌクレオチドの５’末端にコンジュゲートさせた：
５´－ＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴ
ＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡ－３´
（配列番号１６）。得られたＮＬＳ－オリゴコンジュゲートをＨＰＬＣにより精製した。ＮＬＳ－オリゴの質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより決定した。
トランスフェクションの前日に、ｅＢＦＰ ２９３ ＦＴ安定細胞株を、２４ウェルプレートにウェルあたり１×１０5の細胞密度で播種した。トランスフェクションの当日、０．５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡと、ｅＢＦＰ遺伝子（ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＧＧ）（配列番号１７）を標的とする１５０ｎｇのｇＲＮＡとを、滅菌試験管内の２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）に加えた。ＮＬＳ－オリゴヌクレオチドを水に溶解させ、様々な量のＮＬＳ－オリゴヌクレオチドを、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含む試験管に加えた。修飾していないオリゴヌクレオチドを対照として使用した。別の試験管中、１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）を２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地に加えた。次に、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）を、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および指示量のＮＬＳ－オリゴまたは非修飾オリゴヌクレオチドを含む試験管に移した。室温で５分間インキュベートした後、混合物を、０．５ｍｌの成長培地を含む２４ウェルに加えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。
図１３に示すように、ここでも、ＮＬＳ－ドナーにより、細胞株の編集は著しく上昇した。細胞の最大７６％が０．３ピコモルの最適用量でＢＦＰからＧＦＰ陽性に変換され、これと比較して、対照ＰＳオリゴヌクレオチドは１０ピコモルで５８．５％であった。ここでも、３０倍低い用量のＮＬＳ－ドナーでより高い編集が見られた。用量を下げると、対照ＰＳオリゴヌクレオチドでは０．０３ピコモルで６％であったのに対し、ＮＬＳ－オリゴヌクレオチドで高レベルの編集を維持することができ、０．０１ピコモルで２１％の細胞が編集された。
本明細書に記載の方法は、細胞工学、細胞療法、および生物生産などに幅広い用途がある。一時的なプラスミド発現とは異なり、生物生産のため、比較的大きな発現カセットを特定の遺伝子座でゲノムに直接挿入することができる。所望の相対強度の内因性プロモーターを使用して、避難領域を標的化することができる。反復領域も、ペイロードの複数のコピーを組み込んで、より高い発現レベルを得るために、標的化できる可能性がある。選択マーカーとは無関係に、強力なプロモーターを使用して、目的の外来遺伝子の発現を駆動することができる。組込み効率および特異性が高いことに起因し、クローン細胞の単離を必要とせずに、安定した細胞プールを直接タンパク質産生に使用することができ、時間およびコストが削減される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における組換え抗体産生に使用される。
参考文献
Ｌｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇＲＮＡ，Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ」，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４１：１３６－１４６（２０１７）．
実施例３標的ｄｓＤＮＡ破断の近くでのＤＮＡの結合により、クロマチンの置換および／またはＤＮＡ巻き戻しが促進され、デザイナーヌクレアーゼのアクセスが向上し得る。
「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」は、１８反復ＴＡＬバインダーで構成される。「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、デザイナーヌクレアーゼ結合領域に近接して、各側に１つずつ設計した（左＝Ｌｔ、右＝Ｒｔ、ＴＡＬＥＮ対およびＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合配列を表１２に列挙する）。ＢｓａＩを使用するＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ反応を介して、Ｔ７プロモーター、および転写／翻訳開始要素、およびＴＡＬのアミノ末端断片を含む、Ｎ末端断片と、６つのＴＡＬ ＲＶＤ二量体と、Ｃ末端ドメイン、核局在化シグナル、および停止コドンを含む、Ｃ末端断片と、をアセンブリルすることにより、「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を作製した。「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」（ＣＭＰＫ１－ＴＡＬＥＮ２＿７ｎｔ＿ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ＿Ｌｔ）ヌクレオチド配列の例を配列番号３５に列挙する。ＣＭＰＫ１－Ｃ標的の隣接ゲノム配列を配列番号３６に示し、ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ Ｂｕｄｄｙの相対位置を配列番号２０および配列番号２１に示す。この例のさらなる説明は、図１４～１８、２２、および３２～３６で提供する。
全長「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、プライマー対ＴＤ１－Ｆ２およびＴＤ８－Ｒ２（配列番号２２～２３）を使用する増幅により富化し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｍＲＮＡを作製するためのテンプレートとしてさらに使用した。Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１３００パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いた約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）へのトランスフェクションのために、０、２５、５０、または１００ｎｇのＬｔおよびＲｔ「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」ｍＲＮＡを、１００ｎｇのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ対とともに加えた。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。（図１５）
ＴＡＬのアセンブリに使用し得る方法の一群には、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅプロセスがある。
Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅでは、アセンブリおよびクローニングは、１つ以上のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを用いた切断により生成される「スティッキー」末端を有する核酸セグメントを生成し、典型的には、その後、アセンブリした核酸分子を好適な宿主細胞に導入することに基づく。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを使用する理由は、これらが非対称配列を認識し、認識部位から定義された距離でこれらの配列を切断するためである。さらに、断片の消化により酵素認識部位が除去され、相補的なオーバーハングが生成されるように、ＤＮＡ分子の末端にＩＩｓ型制限部位が隣接するように設計することができる。そのような末端を継ぎ目なくライゲーションすることで、元の部位または傷跡のない接合部を創出することができる。
さらに、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターの反復領域を生成するために使用されてもよく、そのように使用されてきた。また、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、好適な末端タンパク質コード核酸をＴＡＬエフェクター反復領域の両脇に接続し、ＴＡＬエフェクターコード領域を追加の核酸分子（例えば、ＴＡＬエフェクターコード核酸がプロモーターに作動可能に連結する場合には、ベクター）に接続するために使用されてもよい。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＴＡＬエフェクターのアセンブリ方法は、例えば、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥ－ｔｙｐｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：５７９０－９（２０１１）」記載されている。
結果：「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」をＴＡＬＥＮ結合配列に対して７ｎｔ（すなわち、ＴＡＬＥＮ切断部位に対して３３ｎｔ）間隔で設計すると、ＣＭＰＫ１－Ｃ標的でのインデル形成が約２倍改善した（図１５）。
実施例４．「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」をＴＡＬＥＮ結合配列に対して異なる間隔に設計し（表１２）、実施例３に記載したものと同じ方法を使用して２９３ＦＴ細胞中で試験した。
結果：ＴＡＬＥＮ結合配列に対して７～３０ｎｔ間隔の場合、「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」は機能性であった（図１６）。ＴＡＬ－ｂｕｄｄｙがＴＡＬＥＮから４～３０ｎｔ離れている場合に、ＴＡＬＥＮ切断が最も良く向上した。ＴＡＬ－ｂｕｄｄｙをＴＡＬＥＮのすぐ隣にするまたは５０ｎｔ超離すと、ＴＡＬＥＮ切断は向上しなかった（図１６および図１７）。
実施例５．ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡに近接した「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ結合配列に対して７ｎｔまたは２０ｎｔの間隔で設計した。
ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的のゲノム配列を、配列番号２５および配列番号４３に列挙する。
結果：「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を不振なＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ結合配列に対して７ｎｔまたは２０ｎｔ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ切断部位に対してそれぞれ２３ｎｔおよび３７ｎｔ）の間隔で設計すると、インデル形成が１０～２０倍増加した。結果を図１７に示す。
実施例６．野生型ＳｐＣａｓ９の標的外の影響を最小限に抑えるために、変異形態を試験した。
ＤＮＡ標的遺伝子座の利用可能性を増大させるために、不振なｃａｓ９タンパク質（例えば、ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（”Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６７３５０１６、修飾されたＰＡＭに結合するＣａｓ９タンパク質、ならびにＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）由来のＣＲＩＳＰＲなどの他のオーソロガスＣａｓ９タンパク質の活性を増大させ得る。当技術分野で一般に知られており、説明されている変異型Ｃａｓ９形態のいずれも、本明細書で提供される方法および組成物に使用し得る。本明細書で提供される方法および組成物について企図される変異型Ｃａｓ９タンパク質の非限定的な例は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉａｎ Ｍ．ら（”Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）：ａａｄ５２２７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６６２８６４３）、およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（”Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６７３５０１６）に記載されており、これらの全体は、すべての目的で参照により組み込まれる。これら２つの変異形態の標的内切断効率も低下した。ｓｇＲＮＡ結合配列に対して２０ｎｔ間隔の「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、ｓｇＲＮＡとｅＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９－ＨＦ１とで形成されたＲＮＰと組み合わせて試験した。Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１１５０パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いた約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）へのトランスフェクションのために、１００ｎｇの左および右「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」ｍＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ（１０００ｎｇのＳｐＣａｓ９－ＨＦ１またはｅＳｐＣａｓ９タンパク質のいずれか、および２００ｎｇのｓｇＲＮＡ）とともに加えた。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。
結果：ｓｇＲＮＡ結合配列に対して２０ｎｔ間隔での「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を加えた場合に、ｓｇＲＮＡ、およびＳｐＣａｓ９－ＨＦ１またはｅＳｐＣａｓ９のいずれかを用いて形成したＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰについて、それぞれ、インデル形成が５倍および１４倍となった（図１８）。
実施例７．長さ１５ｎｔの短縮型ｇＲＮＡ（「ＣＲ－ＰＡＬ」）は、ｄｓＤＮＡ結合活性を示したが、野生型Ｃａｓ９が存在する場合は切断活性を示さなかった。
ｓｇＲＮＡおよび「ＣＲ－ＰＡＬ」を作製するためのテンプレートのアーキテクチャを図１９に示す。ＣＲ－ＰＡＬの機能を図２０に示す。ＣＲＩＳＰＲ切断部位の近位にある１５ｍｅｒのｇＲＮＡ（「ＣＲ－ＰＡＬ」）を、インビトロ転写によって設計および作製した。ゲノムＤＮＡ配列および全長ｓｇＲＮＡ結合配列の相対位置を、配列番号４４および配列番号４５に列挙する。図１９および図２０。
結果：左（Ｌｔ）および右（Ｒｔ）ＣＲ＿ＰＡＬの両方で、インデル形成が６０倍を超えて増加した（図２１および図３４）。
実施例８：Ｃａｓ９ ＮＬＳバリアント
Ｃａｓ９ ｖ２（ＢＰｓｖ４０標的／ヌクレオプラスミン）、ＩＤＴ（カタログ番号１０７４１８１）、およびＣａｓ９ ｖ１（－／３ｘ ｓｖ４０）を、Ａ５４９細胞中で、２つの標的（ＨＰＲＴおよびＰＲＫＣＧ）と比較し、４倍希釈系列を成して、機能的性能がタンパク質濃度によって受ける影響を決定した。ＨＰＲＴは修飾が簡単な標的と考えられているが、ＰＲＫＣＧは修飾がより困難となっている。
ＲＮＰ複合体を、１μｇのＣａｓ９タンパク質（様々な供給源に由来）および２５０ｎｇのｇＲＮＡ（ＨＰＲＴまたはＰＲＫＣＧのいずれか）を使用して形成した。１０分間のインキュベーション後、初期濃度を適量のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）中で希釈することにより、ＲＮＰ複合体の４倍希釈系列を作製した。各希釈系列を、マニュアルに従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭａｘ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）と混合した後、約５０，０００個の２９３ＦＴ細胞に加えた。トランスフェクトした細胞を３日間増殖させ、編集効率をＧｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイにより測定した。
様々なＮＬＳまたは親和性標識をＮ末端またはＣ末端に加えて、多数の異なる形式のスパイＣａｓ９骨格バリアントも試験した（図４３を参照、データ割愛）。
図４４に示すデータに表されている３つの形式のうち、Ｃａｓ９ ｖ２は、活性が希釈範囲にわたって顕著に最も高い。
実施例９：切断および相同性指向修復のＴＡＬＥＮ効率
図４８～５０で示すデータを生成するために使用した標的についての以下に示すＴＡＬＥＮ設計を、以下で表８に示す。図４８～５０の生成に使用したデータは、以下で表９～１１に示す。
Figure 2023168355000008
９６ウェル培養プレートで成長させた各５０，０００個の細胞について、１００ｎｇの順方向ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇの逆方向ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ、ならびに／または中央に６ヌクレオチドのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位、および５’末端と３’末端との両方に３５ヌクレオチドの相同性アームを含む１０ｐｍｏｌのドナー一本鎖オリゴ。５’末端と３’末端との両方にある２つの遠位末端ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解からの保護のためにホスホロチオエート結合を有する。
トランスフェクション当日に、調製細胞を次のように調製した：（１）必要な細胞の総数を計算し（各５０，０００個の細胞）、（２）細胞を分離させ、細胞数を計数し、（３）所望の数の細胞を１，０００ｒｐｍで５分間遠沈し、（４）細胞ペレットを単回ＤＰＢＳで洗浄した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠沈し、（５）細胞ペレットを、５０，０００細胞あたり５μｌのＮｅｏｎ（登録商標）再懸濁緩衝液Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １００μＬ Ｋｉｔ、カタログ番号ＭＰＫ１００９６）に再懸濁し、（６）１００ｎｇの順方向ＴＡＬＥＮプライマー、１００ｎｇの逆方向ＴＡＬＥＮプライマー、１０ｐｍｏｌのドナー一本鎖オリゴ、および５μｌのＲ緩衝液を、各５μｌのＲ緩衝液中の細胞に加えた。
１０μｌのＮｅｏｎ（登録商標）ピペットをエレクトロポレーションに使用した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）。エレクトロポレーション条件は次のとおりであった：２９３ＦＴ細胞について、１３００（パルス電圧）、２０（パルス幅）、２（パルス数）；Ｕ２ＯＳ細胞について、１４００（パルス電圧）、２０（パルス幅）、２（パルス数）；Ａ５４９細胞について、１１５０（パルス電圧）、３０（パルス幅）、２（パルス数）。
次に、エレクトロポレーションした細胞を、９６ウェル培養プレート中の１００μｌの予熱した増殖培地に移した。細胞をトランスフェクションの４８～７２時間後に採集し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ切断検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を使用して切断効率を分析し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化を使用してＨＤＲ効率を決定した。
Figure 2023168355000009
Figure 2023168355000010
Figure 2023168355000011
アミノ酸およびヌクレオチド配列の説明
表１２は、本明細書で参照されるある特定の配列のリストを提供する。
Figure 2023168355000012
Figure 2023168355000013
Figure 2023168355000014
Figure 2023168355000015
Figure 2023168355000016
Figure 2023168355000017
Figure 2023168355000018
Figure 2023168355000019
Figure 2023168355000020
Figure 2023168355000021
本明細書で提供される表題、見出し、および小見出しは、本開示の様々な態様を限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、以下に定義されている用語は、その全体が、本明細書を参照することにより、より十分に定義される。
別途規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい。本明細書に記載されるものと類似または同等のいずれの方法、デバイス、および材料も、本発明の実施に使用することができる。定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために本明細書で提供されるものであり、本開示の範囲を限定することは意図していない。
本出願において、「または」の使用は、別途記載されない限り、「および／または」を含む。複数の従属請求項の文脈において、「または」の使用は、選択的にのみ、１つ超の先行する独立または従属請求項に戻って参照する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の任意の単数使用には、明確かつ疑いの余地なく１つの指示対象に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことにさらに留意されたい。本明細書で使用されるとき、「含む」という用語およびその文法的異形は、リスト中の項目の列挙が、列挙される項目と置き換えられるか、またはそこに追加され得る他の同様の項目を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。
本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、または整数範囲は、別途指示のない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
単位、接頭辞、および記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）承認形式で示される。数値範囲には、範囲を定義する数が含まれる。測定値は、有効数字および測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。
上述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。上述の説明および実施例は特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良の様式を説明する。しかしながら、上述の内容がいかに詳述されていても、実施形態は多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその等価物に従って解釈されるべきである。本明細書および例示的な実施形態は、限定的なものとして捉えられるべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的において、別途示されない限り、数量、割合、または比率を表す全ての数、ならびに明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、全ての場合において、それらが修正されすぎない程度まで「約」という用語によって修正されているものとして理解されるべきである。したがって、反対が示されない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲に対する均等の原則の適用を限定することを企図しないように、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有意な数字の数に照らして、且つ通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。
「以下」または「以上」などの用語が数値または範囲のリストに先行する場合、これらの用語はリストに提供されているすべての値または範囲を修飾する。いくつかの実施形態では、数値は最も近い整数または有効数字に丸められる。
本発明の例示的な主題を、以下の項によって表す。
項１．初期核酸分子における相同組換えのための方法であって、（ａ）初期核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を産生させることと、（ｂ）切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることと、を含み、初期核酸分子がプロモーターおよび遺伝子を含み、ドナー核酸分子が、（ｉ）長さが１２ｂｐ～２５０ｂｐの５’および３’末端の一致した末端、（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、（ｉｖ）プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子またはプロモーターを持たない選択マーカーのいずれかの側のＬｏｘＰとを連結する自己切断ペプチド、ならびに（ｉｖ）任意選択で、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間のリンカー、を含む、方法。
項２．核酸分子の二本鎖破断が、（ｉ）切断された核酸分子のＮ末端標識化のためのＡＴＧ開始コドンから２５０ｂｐ以下であるか、または（ｉｉ）切断された核酸分子のＣ末端標識化のための停止コドンから２５０ｂｐ以下である、項１に記載の方法。
項３．二本鎖破断が、少なくとも１つの核酸切断エンティティまたはエレクトロポレーションによって誘導される、項１に記載の方法。
項４．少なくとも１つの核酸切断エンティティが、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、１つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体、１つ以上のアルゴノート－核酸複合体、または１つ以上のマクロヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを含む、項３に記載の方法。
項５．少なくとも１つの核酸切断エンティティが、発現ベクター、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＣ）、またはｍＲＮＡを使用して投与される、項３に記載の方法。
項６．プロモーターを持たない選択マーカーが、タンパク質、抗生物質耐性選択マーカー、細胞表面マーカー、細胞表面タンパク質、代謝産物、またはそれらの活性断片を含む、項１に記載の方法。
項７．プロモーターを持たない選択マーカーがタンパク質である、項６に記載の方法。
項８．タンパク質が、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、アンジオポエチン関連成長因子（ＡＧＦ）受容体、または表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である、項７に記載の方法。
項９．プロモーターを持たない選択マーカーが抗生物質耐性選択マーカーである、項６に記載の方法。
項１０．抗生物質耐性選択マーカーが組換え抗体である、項９に記載の方法。
項１１．抗生物質耐性選択マーカーがヒトＩｇＧ抗体である、項９に記載の方法。
項１２．レポーター遺伝子が蛍光タンパク質レポーターを含む、項１に記載の方法。
項１３．蛍光タンパク質レポーターが、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）レポーターまたはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）レポーターである、項１２に記載の方法。
項１４．プロモーターを持たない選択マーカーが、（ｉ）切断された核酸分子のＮ末端標識化のためにレポーター遺伝子の５’末端に連結するか、または（ｉｉ）切断された核酸分子のＣ末端標識化のためにレポーター遺伝子の３’末端に連結する、項１に記載の方法。
項１５．ドナー核酸分子が、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子の間にリンカーを含む、項１に記載の方法。
項１６．プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間の距離が、３００ｎｔ、２４０ｎｔ、１８０ｎｔ、１５０ｎｔ、１２０ｎｔ、９０ｎｔ、６０ｎｔ、３０ｎｔ、１５ｎｔ、１２ｎｔ、または９ｎｔ以下である、項１５に記載の方法。
項１７．距離が６ｎｔである、項１６に記載の方法。
項１８．リンカーがポリグリシンリンカーである、項１５に記載の方法。
項１９．自己切断ペプチドが自己切断２Ａペプチドである、項１に記載の方法。
項２０．一致する末端が、ＰＣＲ増幅によりドナー核酸分子の５’および３’末端に付加される、項１に記載の方法。
項２１．一致した末端が、９５％以上の配列同一性を共有する、項１に記載の方法。
項２２．一致した末端が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む、項１に記載の方法。
項２３．ドナー核酸分子の５’および３’末端の一致した末端が、１２ｂｐ～２００ｂｐ、１２ｂｐ～１５０ｂｐ、１２ｂｐ～１００ｂｐ、１２ｂｐ～５０ｂｐ、または１２ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する、項１に記載の方法。
項２４．一致する末端が３５ｂｐの長さを有する、項２３に記載の方法。
項２５．初期核酸分子が、細胞またはプラスミド中にある、項１に記載の方法。
項２６．ドナー核酸分子が、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、または３０ｋｂ以下の長さを含む、項１に記載の方法。
項２７．ドナー核酸分子が、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、切断された核酸分子に組み込まれる、項１に記載の方法。
項２８．ＨＤＲが、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である、項２７に記載の方法。
項２９．ドナー核酸分子の組込み効率が、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％以上である、項１に記載の方法。
項３０．５’末端、３’末端、または５’および３’末端でドナー核酸分子を修飾することをさらに含む、項１に記載の方法。
項３１．ドナー核酸分子が５’および３’末端で修飾される、項３０に記載の方法。
項３２．ドナー核酸分子が、少なくとも１つの末端の少なくとも１つの鎖中で１つ以上のヌクレアーゼ耐性基により修飾される、項３０に記載の方法。
項３３．１つ以上のヌクレアーゼ耐性基が、１つ以上のホスホロチオエート基、１つ以上のアミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む、項３２に記載の方法。
項３４．ドナー核酸分子を少なくとも１つの非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤で処理することをさらに含む、項１に記載の方法。
項３５．少なくとも１つのＮＨＥＪ阻害剤が、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＮＡポリメラーゼ１もしくは２（ＰＡＲＰ－１またはＰＡＲＰ－２）、またはそれらの組み合わせである、項３４に記載の方法。
項３６．ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が、Ｎｕ７２０６（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ナフトール［１，２－ｂ］ピラン－４－オン）、Ｎｕ７４４１（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン）、Ｋｕ－００６０６４８（４－エチル－Ｎ－［４－［２－（４－モルホリニル）－４－オキソ－４Ｈ－１－ベンゾピラン－８－イル］－１－ジベンゾチエニル］－１－ピペラジンアセトアミド）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，１－ａ］イソキノリン－４－オン）、ＤＭＮＢ（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンズアルデヒド）、ＥＴＰ ４５６５８（３－［１－メチル－４－（４－モルホリニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－６－イルフェノール）、ＬＴＵＲＭ３４（８－（４－ジベンゾチエニル）－２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－１，３－ベンゾオキサジン－４－オン）、またはＰｌ１０３塩酸塩（３－［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル］フェノール塩酸塩）である、項３５に記載の方法。
項３７．哺乳動物が、ヒト、哺乳類実験動物、哺乳類家畜、哺乳類競技動物、または哺乳類愛玩動物である、項１に記載の方法。
項３８．哺乳動物がヒトである、項３７に記載の方法。
項３９．項１に記載の方法により作製された細胞またはプラスミド。
項４０．細胞が真核細胞である、項３９に記載の細胞。
項４１．真核細胞が哺乳動物細胞である、項４０に記載の細胞。
項４２．有効量の項４１に記載の細胞をそれを必要とする対象に投与することを含む、細胞療法の方法。
項４３．細胞がＴ細胞であり、プロモーターを持たない選択マーカーがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項４２に記載の方法。
項４４．項１に記載の方法により作製された細胞またはプラスミドのプロモーターを活性化して、プロモーターを持たない選択マーカーを産生することを含む、プロモーターを持たない選択マーカーを産生するための方法。
項４５．項４４に記載の方法により産生されたプロモーターを持たない選択マーカーを含む、組成物。
項４６．有効量の項４４に記載の方法により産生されたプロモーターを持たない選択マーカーを投与することを含む、治療的処置を、それを必要とする対象に行うための方法。
項４７．項４４に記載の方法により産生されたプロモーターを持たない選択マーカーを含む、薬物スクリーニングアッセイ。
項４８．選択マーカーのいずれかの側の自己切断ペプチドまたはＬｏｘＰによりレポーター遺伝子に連結したプロモーターを持たない選択マーカーを含む、プロモーターを持たない選択マーカーを生成するためのキット。
項４９．レポーター遺伝子がＧＦＰまたはＯＦＰである、項４８に記載のキット。
項５０．少なくとも１つの核酸切断エンティティをさらに含む、項４８に記載のキット。
項５１．少なくとも１つのＮＨＥＪ阻害剤をさらに含む、項４８に記載のキット。
項５２．１つ以上のヌクレアーゼ耐性基をさらに含む、項４８に記載のキット。
項５３．組換え抗体発現カセットであって、（ｉ）長さが２５０ｂｐ以下である、カセットの５’および３’末端における一致した末端、（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、（ｉｖ）プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子とを連結する自己切断ペプチド、（ｖ）任意選択で、プロモーターを持たない選択マーカーとレポーター遺伝子との間のリンカー、を含み、プロモーターを持たない選択マーカーが、切断された核酸分子のＮ末端標識化のためにレポーター遺伝子の５’末端で、または切断された核酸分子のＣ末端標識化のためのレポーター遺伝子の３’末端で連結する、組換え抗体発現カセット。
項５４．細胞中の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることと、を含む、方法。
項５５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項５４に記載の方法。
項５６．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項５４に記載の方法。
項５７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項５４に記載の方法。
項５８．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項５４に記載の方法。
項５９．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項５４に記載の方法。
項６０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項５４に記載の方法。
項６１．該第１のエンハンサー結合配列が、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号４０の配列を有する、項５４に記載の方法。
項６２．細胞中の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む該細胞に、該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより該標的遺伝子座のクロマチンを置換することと、を含む、方法。
項６３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項６２に記載の方法。
項６４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項６２に記載の方法。
項６５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項６２に記載の方法。
項６６．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項６２に記載の方法。
項６７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項６２に記載の方法。
項６８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項６２に記載の方法。
項６９．細胞中の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより該標的遺伝子座のクロマチンを再構築することと、を含む、方法。
項７０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項６９に記載の方法。
項７１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項６９に記載の方法。
項７２．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項６９に記載の方法。
項７３．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項６９に記載の方法。
項７４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項６９に記載の方法。
項７５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項６９に記載の方法。
項７６．細胞中の標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させる方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）該細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、（３）該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤または該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることと、を含む、方法。
項７７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項７６に記載の方法。
項７８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項７６に記載の方法。
項７９．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項７６に記載の方法。
項８０．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項７６に記載の方法。
項８１．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項７６に記載の方法。
項８２．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項７６に記載の方法。
項８３．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項７６に記載の方法。
項８４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項７６に記載の方法。
項８５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項７６に記載の方法。
項８６．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である、項７６に記載の方法。
項８７．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである、項７６に記載の方法。
項８８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である、項７６に記載の方法。
項８９．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡである、項７６に記載の方法。
項９０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２の短縮型ｇＲＮＡである、項７６に記載の方法。
項９１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質である、項７６に記載の方法。
項９２．該第１のエンハンサー結合配列が、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号４０の配列を有する、項７６に記載の方法。
項９３．該第２のエンハンサー結合配列が、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１の配列を有する、項７６に記載の方法。
項９４．細胞中の標的遺伝子座のクロマチンを置換する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）該細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、（３）該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより、該標的遺伝子座のクロマチンを置換することと、を含む、方法。
項９５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項９４に記載の方法。
項９６．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項９４に記載の方法。
項９７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項９４に記載の方法。
項９８．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項９４に記載の方法。
項９９．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項９４に記載の方法。
項１００．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項９４に記載の方法。
項１０１．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項９４に記載の方法。
項１０２．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項９４に記載の方法。
項１０３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項９４に記載の方法。
項１０４．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である、項９４に記載の方法。
項１０５．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである、項９４に記載の方法。
項１０６．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である、項９４に記載の方法。
項１０７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡである、項９４に記載の方法。
項１０８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２の短縮型ｇＲＮＡである、項９４に記載の方法。
項１０９．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質である、項９４に記載の方法。
項１１０．該第１のエンハンサー結合配列が、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号４０の配列を有する、項９４に記載の方法。
項１１１．該第２のエンハンサー結合配列が、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１の配列を有する、項９４に記載の方法。
項１１２．細胞中の標的遺伝子座のクロマチンを再構築する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）該細胞にとって内因性ではない第１のＤＮＡ結合調節増強剤、および（ｉｉ）該細胞にとって内因性ではない第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、（３）該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が該標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより、該標的遺伝子座のクロマチンを再構築することと、を含む、方法。
項１１３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１６．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１７．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１８．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項１１２に記載の方法。
項１１９．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項１１２に記載の方法。
項１２０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項１１２に記載の方法。
項１２１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項１１２に記載の方法。
項１２２．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である、項１１２に記載の方法。
項１２３．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである、項１１２に記載の方法。
項１２４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１１２に記載の方法。
項１２５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡである、項１１２に記載の方法。
項１２６．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２の短縮型ｇＲＮＡである、項１１２に記載の方法。
項１２７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１１２に記載の方法。
項１２８．細胞内の標的遺伝子座で調節タンパク質または調節複合体の活性を増強する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む該標的遺伝子座のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が該第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより細胞内の標的遺伝子座で該第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体の活性を増強することと、を含む、方法。
項１２９．該標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することができる第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することをさらに含む、項１２８に記載の方法。
項１３０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１３１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１３２．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１３３．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入を含む、項１２９に記載の方法。
項１３４．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１２９に記載の方法。
項１３５．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項１２９に記載の方法。
項１３６．該第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項１２８に記載の方法。
項１３７．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項１２８に記載の方法。
項１３８．該第２のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列によって該第１のエンハンサー結合配列に連結する、項１２９に記載の方法。
項１３９．該モジュレーター結合配列に結合することができる第２の調節タンパク質または第２の調節複合体を導入することをさらに含む、項１２８に記載の方法。
項１４０．該第１の調節タンパク質の導入が、該第１の調節タンパク質をコードするベクターの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４１．該第１の調節タンパク質の導入が、該第１の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４２．該第１の調節タンパク質の導入が、第１の調節タンパク質の導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４３．該第１の調節複合体の導入が、該第１の調節複合体をコードするベクターの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４４．該第１の調節複合体の導入が、該第１の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４５．該第１の調節複合体の導入が、第１の調節複合体の導入を含む、項１２８に記載の方法。
項１４６．該第２の調節タンパク質の導入が、該第２の調節タンパク質をコードするベクターの導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１４７．該第２の調節タンパク質の導入が、該第２の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１４８．該第２の調節タンパク質の導入が、第２の調節タンパク質の導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１４９．該第２の調節複合体の導入が、該第２の調節複合体をコードするベクターの導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１５０．該第２の調節複合体の導入が、該第２の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１５１．該第２の調節複合体の導入が、第２の調節複合体の導入を含む、項１３９に記載の方法。
項１５２．該第１の調節タンパク質または該第２の調節タンパク質が、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ調節酵素を含む、項１３９に記載の方法。
項１５３．該ＤＮＡ結合タンパク質が、転写抑制因子または転写活性化因子である、項１５２に記載の方法。
項１５４．該ＤＮＡ調節酵素が、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼである、項１５２に記載の方法。
項１５５．該第１の調節タンパク質または該第２の調節タンパク質が、ヒストン調節酵素を含む、項１２８に記載の方法。
項１５６．該ヒストン調節酵素が、デアセチラーゼまたはアセチラーゼである、項１５５に記載の方法。
項１５７．該第１の調節タンパク質が、第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートである、項１２８に記載の方法。
項１５８．該第２の調節タンパク質が、第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートである、項１３９に記載の方法。
項１５９．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが第１のヌクレアーゼを含み、該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが第２のヌクレアーゼを含む、項１５８に記載の方法。
項１６０．該第１のヌクレアーゼおよび該第２のヌクレアーゼが二量体を形成する、項１５９に記載の方法。
項１６１．該第１のヌクレアーゼおよび該第２のヌクレアーゼが、独立して、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、項１５９に記載の方法。
項１６２．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタードメインを含む、項１５９に記載の方法。
項１６３．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項１５９に記載の方法。
項１６４．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第２のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項１５９に記載の方法。
項１６５．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第２のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項１５９に記載の方法。
項１６６．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項１５９に記載の方法。
項１６７．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項１５９に記載の方法。
項１６８．該第１の調節複合体が第１のリボ核タンパク質複合体である、項１２８に記載の方法。
項１６９．該第２の調節複合体が第２のリボ核タンパク質複合体である、項１３９に記載の方法。
項１７０．該第１のリボ核タンパク質複合体が、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む、項１６８に記載の方法。
項１７１．該第２のリボ核タンパク質複合体が、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む、項１６９に記載の方法。
項１７２．該第１の調節タンパク質、該第１の調節複合体、該第２の調節タンパク質、または該第２の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項１３９に記載の方法。
項１７３．該第１の調節タンパク質および該第２の調節タンパク質が、該細胞にとって内因性ではない、項１３９に記載の方法。
項１７４．該第１の調節複合体および該第２の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項１３９に記載の方法。
項１７５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤または該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該細胞にとって内因性ではない、項１６８に記載の方法。
項１７６．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤および該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該細胞にとって内因性ではない、項１２９に記載の方法。
項１７７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項１２８に記載の方法。
項１７８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項１２８に記載の方法。
項１７９．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である、項１３９に記載の方法。
項１８０．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである、項１２９に記載の方法。
項１８１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１２９に記載の方法。
項１８２．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡである、項１２９に記載の方法。
項１８３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２の短縮型ｇＲＮＡである、項１２９に記載の方法。
項１８４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１２９に記載の方法。
項１８５．該第１の調節タンパク質が第１のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートであり、該第２の調節タンパク質が第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートである、項１３９に記載の方法。
項１８６．該第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体であり、該第２の調節複合体がリボ核タンパク質複合体である、項１３９に記載の方法。
項１８７．該第１の調節複合体が第１のリボ核タンパク質複合体であり、該第２の調節複合体が第２のリボ核タンパク質複合体である、項１３９に記載の方法。
項１８８．該第１の調節複合体がリボ核タンパク質複合体であり、該第２の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体である、項１３９に記載の方法。
項１８９．該第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列が、該調節因子結合配列から、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満離れている、項１２９に記載の方法。
項１９０．該第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列が、該調節因子結合配列から、４～３０ヌクレオチドまたは７～３０ヌクレオチド離れている、項１２９に記載の方法。
項１９１．該第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列が、該調節因子結合配列から、４ヌクレオチド、７ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド離れている、項１２９に記載の方法。
項１９２．該第１のエンハンサー結合配列および／または第２のエンハンサー結合配列が、該調節因子結合配列から、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満離れている、項１２９に記載の方法。
項１９３．該第１のエンハンサー結合配列および／または該第２のエンハンサー結合配列が、該調節部位から、１０～４０ヌクレオチド離れている、項１２９に記載の方法。
項１９４．該第１のエンハンサー結合配列および／または該第２のエンハンサー結合配列が、該調節部位から、３３ヌクレオチド離れている、項１２９に記載の方法。
項１９５．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤または該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該第１の調節タンパク質、該第１の調節複合体、該第２の調節タンパク質、または該第２の調節複合体の活性を、該調節部位で増強する、項１３９に記載の方法。
項１９６．細胞内の標的遺伝子座を調節する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む該標的遺伝子座の調節因子結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）該標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）該第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体が該調節部位を調節することを可能にし、それにより細胞内の標的遺伝子座を調節することと、を含む、方法。
項１９７．該標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することができる第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することをさらに含む、項１９６に記載の方法。
項１９８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、細胞に、（１）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクター、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡ、または（３）第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することを含む、項１９６に記載の方法。
項１９９．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、細胞に、（１）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクター、（２）該第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡ、または（３）第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することを含む、項１９７に記載の方法。
項２００．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１９９に記載の方法。
項２０１．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の導入が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸の導入を含む、項１９７に記載の方法。
項２０２．該第１の調節タンパク質または該第１の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項１９６に記載の方法。
項２０３．該標的遺伝子座での相同組換えの速度が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して増大する、項１９６に記載の方法。
項２０４．該第２のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列によって該第１のエンハンサー結合配列に連結する、項１９７に記載の方法。
項２０５．該モジュレーター結合配列に結合することができる第２の調節タンパク質または第２の調節複合体を導入することをさらに含む、項１９６に記載の方法。
項２０６．該第１の調節タンパク質の導入が、該第１の調節タンパク質をコードするベクターの導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２０７．該第１の調節タンパク質の導入が、該第１の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２０８．該第１の調節タンパク質の導入が、第１の調節タンパク質の導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２０９．該第１の調節複合体の導入が、該第１の調節複合体をコードするベクターの導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２１０．該第１の調節複合体の導入が、該第１の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２１１．該第１の調節複合体の導入が、第１の調節複合体の導入を含む、項１９６に記載の方法。
項２１２．該第２の調節タンパク質の導入が、該第２の調節タンパク質をコードするベクターの導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１３．該第２の調節タンパク質の導入が、該第２の調節タンパク質をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１４．該第２の調節タンパク質の導入が、第２の調節タンパク質の導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１５．該第２の調節複合体の導入が、該第２の調節複合体をコードするベクターの導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１６．該第２の調節複合体の導入が、該第２の調節複合体をコードするｍＲＮＡの導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１７．該第２の調節複合体の導入が、第２の調節複合体の導入を含む、項２０５に記載の方法。
項２１８．該第１の調節タンパク質または該第２の調節タンパク質が、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ調節酵素を含む、項２０５に記載の方法。
項２１９．該ＤＮＡ結合タンパク質が、転写抑制因子または転写活性化因子である、項２１８に記載の方法。
項２２０．該ＤＮＡ調節酵素が、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼである、項２１８に記載の方法。
項２２１．該第１の調節タンパク質または該第２の調節タンパク質が、ヒストン調節酵素を含む、項２０５に記載の方法。
項２２２．該ヒストン調節酵素が、デアセチラーゼまたはアセチラーゼである、項２２１に記載の方法。
項２２３．該第１の調節タンパク質が、第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートである、項１９６に記載の方法。
項２２４．該第２の調節タンパク質が、第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートである、項２０５に記載の方法。
項２２５．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが第１のヌクレアーゼを含み、該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが第２のヌクレアーゼを含む、項２２４に記載の方法。
項２２６．該第１のヌクレアーゼおよび該第２のヌクレアーゼが二量体を形成する、項２２５に記載の方法。
項２２７．該第１のヌクレアーゼおよび該第２のヌクレアーゼが、独立して、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、項２２５に記載の方法。
項２２８．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタードメインを含む、項２２５に記載の方法。
項２２９．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第１のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項２２８に記載の方法。
項２３０．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第２のヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項２２７に記載の方法。
項２３１．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第２のＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結した第２のＴＡＬエフェクタードメインを含む、項２３０に記載の方法。
項２３２．該第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項１９６に記載の方法。
項２３３．該第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートが、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、項２０５に記載の方法。
項２３４．該第１の調節複合体が第１のリボ核タンパク質複合体である、項１９６に記載の方法。
項２３５．該第２の調節複合体が第２のリボ核タンパク質複合体である、項１９７に記載の方法。
項２３６．該第１のリボ核タンパク質複合体が、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む、項２３４に記載の方法。
項２３７．該第２のリボ核タンパク質複合体が、ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ドメインまたはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合したアルゴノートタンパク質ドメインを含む、項２３５に記載の方法。
項２３８．該第１の調節タンパク質、該第１の調節複合体、該第２の調節タンパク質、または該第２の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項２０５に記載の方法。
項２３９．該第１の調節タンパク質および該第２の調節タンパク質が、該細胞にとって内因性ではない、項２０５に記載の方法。
項２４０．該第１の調節複合体および該第２の調節複合体が、該細胞にとって内因性ではない、項２０５に記載の方法。
項２４１．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤または該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該細胞にとって内因性ではない、項１９７に記載の方法。
項２４２．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤および該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該細胞にとって内因性ではない、項１９７に記載の方法。
項２４３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＤＮＡ結合タンパク質または第１のＤＮＡ結合核酸である、項１９６に記載の方法。
項２４４．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質または第１の短縮型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項１９６に記載の方法。
項２４５．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＤＮＡ結合タンパク質または第２のＤＮＡ結合核酸である、項１９７に記載の方法。
項２４６．該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質または短縮型ｇＲＮＡである、項１９７に記載の方法。
項２４７．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１のＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２のＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１９７に記載の方法。
項２４８．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質であり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡである、項１９７に記載の方法。
項２４９．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、第１の短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、第２の短縮型ｇＲＮＡである、項１９７に記載の方法。
項２５０．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、短縮型ｇＲＮＡであり、該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、ＴＡＬエフェクタータンパク質である、項１９７に記載の方法。
項２５１．該第１の調節タンパク質が第１のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートであり、該第２の調節タンパク質が第２のＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼコンジュゲートである、項２０５に記載の方法。
項２５２．該第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ複合体であり、該第２の調節複合体がリボ核タンパク質複合体である、項２０５に記載の方法。
項２５３．該第１の調節複合体が第１のリボ核タンパク質複合体であり、該第２の調節複合体が第２のリボ核タンパク質複合体である、項２５２に記載の方法。
項２５４．該第１の調節複合体がリボ核タンパク質複合体であり、該第２の調節タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ複合体である、項２０５に記載の方法。
項２５５．該第１のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、２００ヌクレオチド未満、１５０未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満離れている、項１９６に記載の方法。
項２５６．該第１のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、４～３０ヌクレオチドまたは７～３０ヌクレオチド離れている、項１９６に記載の方法。
項２５７．該第１のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、４ヌクレオチド、７ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド離れている、項１９６に記載の方法。
項２５８．該第２のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満離れている、項１９７に記載の方法。
項２５９．該第２のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、４～３０ヌクレオチドまたは７～３０ヌクレオチド離れている、項１９７に記載の方法。
項２６０．該第２のエンハンサー結合配列が、該モジュレーター結合配列から、４ヌクレオチド、７ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド離れている、項１９７に記載の方法。
項２６１．該第１のエンハンサー結合配列または該第２のエンハンサー結合配列が、該調節部位から、１０～４０ヌクレオチド離れている、項１９７に記載の方法。
項２６２．該第１のエンハンサー結合配列または該第２のエンハンサー結合配列が、該調節部位から、３３ヌクレオチド離れている、項１９７に記載の方法。
項２６３．該第１のＤＮＡ結合調節増強剤または該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該第１の調節タンパク質、該第１の調節複合体、該第２の調節タンパク質、または該第２の調節複合体の活性を、該調節部位で増強する、項１９７に記載の方法。
項２６４．標的遺伝子座調節複合体をコードする核酸を含む細胞であって、該複合体が、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列、および調節部位を含むモジュレーター結合配列と、（ｉｉ）モジュレーター結合配列に結合した第１の調節タンパク質または第１の調節複合体と、（ｉｉｉ）該第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、を含む、細胞。
項２６５．該標的遺伝子座が、該モジュレーター結合配列によって該第１のエンハンサー結合配列に連結する第２のエンハンサー結合配列をさらに含む、項２６４に記載の方法。
項２６６．該第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤を含む、項２６４に記載の細胞。
項２６７．標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞であって、該複合体が、（ｉ）第１のエンハンサー結合配列を含む標的遺伝子座と、（ｉｉ）該第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、を含み、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、該細胞にとって内因性ではなく、かつ該第１のＤＮＡ結合調節増強剤が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる、細胞。
項２６８．標的遺伝子座複合体をコードする核酸を含む細胞であって、該複合体が、（１）（ｉ）第１のエンハンサー結合配列および（ｉｉ）第２のエンハンサー結合配列を含む、標的遺伝子座と、（２）該細胞にとって内因性ではない、該標的遺伝子座の該第１のエンハンサー結合配列に結合した第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、（３）該細胞にとって内因性ではない、該標的遺伝子座の該第２のエンハンサー結合配列に結合した第２のＤＮＡ結合調節増強剤と、を含み、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤および該第２のＤＮＡ結合調節増強剤が、該第１のＤＮＡ結合調節増強剤および該第２のＤＮＡ結合調節増強剤の非存在時と比較して該標的遺伝子座のアクセス可能性を増大させることができる、細胞。
項２６９．（ｉ）第１の調節タンパク質または第１の調節複合体と、（ｉｉ）第１のＤＮＡ結合調節増強剤と、を含む、キット。
項２７０．細胞内に存在する内因性核酸分子を改変する方法であって、ドナーＤＮＡ分子を細胞に導入することを含み、ドナーＤＮＡ分子は、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナーＤＮＡ分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する、方法。
項２７１．内因性核酸分子が位置する細胞内の位置が、核、ミトコンドリア、または葉緑体の中である、項２７０に記載の方法。
項２７２．１つ以上の細胞内標的部分が核局在化シグナルである、項２７０に記載の方法。
項２７３．ドナーＤＮＡ分子が、約２５～約８，０００ヌクレオチド長である、項２７０に記載の方法。
項２７４．ドナーＤＮＡ分子が、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である、項２７０に記載の方法。
項２７５．ドナーＤＮＡ分子が、少なくとも１つの末端の５０ヌクレオチド内に１つ以上のヌクレアーゼ耐性基を有する、項２７０に記載の方法。
項２７６．ヌクレアーゼ耐性基が、ホスホロチオエート基、アミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせである、項２７５に記載の方法。
項２７７．２つのホスホロチオエート基が存在し、少なくとも１つの末端の５０ヌクレオチド内に位置する、項２７６に記載の方法。
項２７８．ドナーＤＮＡ分子が、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む、項２７０に記載の方法。
項２７９．ネガティブ選択マーカーが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである、項２７８に記載の方法。
項２８０．ドナーＤＮＡ分子が、細胞内に存在する標的遺伝子座との配列相補性の２つの領域を有する、項２７０に記載の方法。
項２８１．ポジティブ選択マーカーが、ドナーＤＮＡ分子の配列相補性の２つの領域の間に位置する、項２７８に記載の方法。
項２８２．ネガティブ選択マーカーが、ドナーＤＮＡ分子の配列相補性の２つの領域の間に位置しない、項２７８に記載の方法。
項２８３．細胞を、（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、（２）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、または（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、のうちの１つ以上と接触させる、項２７０に記載の方法。
項２８４．１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤がＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤である、項２８３に記載の方法。
項２８５．１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤のうちの少なくとも１つが、（１）Ｎｕ７２０６、（２）Ｎｕ７４４１、（３）Ｋｕ－００６０６４８、（４）ＤＭＮＢ、（５）ＥＴＰ ４５６５８、（６）ＬＴＵＲＭ ３４、および（７）Ｐｌ １０３塩酸塩からなる群から選択される、項２８４に記載の方法。
項２８６．１つ以上の核酸切断エンティティのうちの少なくとも１つが、（１）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、（２）ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、および（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体からなる群から選択される、項２８３に記載の方法。
項２８７．１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの少なくとも１つが、（１）ジンクフィンガータンパク質（例えば、異種ヌクレアーゼドメインを有しないジンクフィンガータンパク質）、（２）ＴＡＬエフェクタータンパク質（例えば、異種ヌクレアーゼドメインを有しないＴＡＬＥタンパク質）、および（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体）からなる群から選択される、項２８３に記載の方法。
項２８８．１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの少なくとも１つが、標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内で結合するように設計される、項２８７に記載の方法。
項２８９．真核細胞内で相同組換えを行うための方法であって、細胞を、（１）ドナーＤＮＡ分子、ならびに（２）（ｉ）核酸切断エンティティ、（ｉｉ）核酸切断エンティティをコードする核酸、または（ｉｉｉ）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分、および核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする核酸と接触させることを含み、ドナーＤＮＡ分子は、内因性核酸分子が位置する細胞内の位置にドナーＤＮＡ分子を局在させることができる細胞内標的部分に結合する、方法。
項２９０．細胞を、（１）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、（２）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（３）ＤＮＡ結合調節増強剤をコードする１つ以上の核酸、ならびに（４）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分、および１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする核酸、のうちの１つ以上とさらに接触させる、項２８９に記載の方法。
項２９１．ＤＮＡ分子を含む組成物であって、ＤＮＡ分子が１つ以上の細胞内標的化部分に共有結合し、ＤＮＡ分子が約２５ヌクレオチド約８，０００ヌクレオチド長である組成物。
項２９２．ＤＮＡ分子がドナーＤＮＡ分子である、項２９１に記載の組成物。
項２９３．１つ以上の細胞内標的化部分が核局在化シグナルである、項２９１に記載の組成物。
項２９４．２つ以上の細胞内標的化部分が、ＤＮＡ分子に共有結合している、項２９１に記載の組成物。
項２９５．１つ以上の細胞内標的化部分が、（１）核局在化シグナル、（２）葉緑体標的化シグナル、および（３）ミトコンドリア標的化シグナルからなる群から選択される、項２９１に記載の組成物。
項２９６．２つ以上の双節型核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質。
項２９７．２つ以上の双節型核局在化シグナルが、少なくとも１つの末端の２０アミノ酸内に位置する、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項２９８．２つ以上の双節型核局在化シグナルが、タンパク質のＮ末端およびＣ末端の２０アミノ酸内に個々に位置する、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項２９９．２つ以上の双節型核局在化シグナルが、異なるアミノ酸配列を含む、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３００．少なくとも１つの単節型核局在化シグナルをさらに含む、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３０１．親和性標識をさらに含む、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３０２．核局在化シグナルののうちの少なくとも１つが、（Ａ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＫ ＲＫＶＥ（配列番号４８）、（Ｂ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＡ ＲＫＶＥ（配列番号４９）、（Ｃ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥ ＳＰＫＫＫ ＡＫＶＥ（配列番号５０）、（Ｄ）ＫＲＰＡＡ ＴＫＫＡＧ ＱＡＫＫＫ Ｋ（配列番号５１）、および（Ｅ）ＫＲＴＡＤ ＧＳＥＦＥＰ ＡＡＫＲＶ ＫＬＤＥ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３０３．核局在化シグナルのうちの少なくとも１つが、（Ａ）ＫＲＸ(515)ＫＫＮ1Ｎ2ＫＶ（配列番号５３）、（Ｂ）ＫＲＸ(5-15)Ｋ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）1-2（配列番号５４）、（Ｃ）ＫＲＸ(5-15)Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）12（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘが、長さ５～１５アミノのアミノ酸配列であり、Ｎ1が、ＬまたはＡであり、Ｎ2が、Ｌ、Ａ、またはＲである、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３０４．図４２に示されるアミノ酸配列を含む、項２９６に記載のＣａｓ９タンパク質。
項３０５．図４６のアミノ酸アミノ酸８１１～８３０を含むＴＡＬＥタンパク質であって、８１５～８１６位および８２４～８２５位のアミノ酸が、Ｇｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、ＴＡＬＥタンパク質。
項３０６．図４６のアミノ酸アミノ酸８１０～１０２９を含み、１０２２～１０２３位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、請求項３０５に記載のＴＡＬＥタンパク質。
項３０７．図４６のアミノ酸アミノ酸７５２～１０２１を含む、請求項３０５に記載のＴＡＬＥタンパク質。
項３０８．図４７のアミノ酸アミノ酸２０～１６５を含み、２８～２９位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであってもよく、１０８～１１０位および８２３～８２４位のアミノ酸がＡｒｇ－Ｇｌｙ－ＡｌａまたはＧｌｎ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒであってもよい、ＴＡＬＥタンパク質。
項３０９．図４７のアミノ酸アミノ酸８２１～８４０を含むＴＡＬＥタンパク質であって、８２７～８２８位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであってもよい、ＴＡＬＥタンパク質。
項３１０．図４６に対応するアミノ酸を含む、請求項３０８に記載のＴＡＬＥタンパク質。
項３１１．４～２５の反復単位を含む反復領域を含む、請求項３０８に記載のＴＡＬＥタンパク質。
項３１２．細胞内で細胞内核酸を操作する方法であって、項３０６に記載のＴＡＬＥタンパク質または項２に記載のＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含み、ＴＡＬＥタンパク質が細胞内の標的遺伝子座に結合するように設計される、方法。
項３１３．ドナー核酸分子を細胞に導入することをさらに含み、ドナー核酸分子が、標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内の核酸との配列相同性の１つ以上の領域を有する、項３１２に記載の方法。
項３１４．細胞集団内の切断部位で細胞内核酸分子の相同性組換えを行うための方法であって、（ａ）切断部位で細胞内核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、（ｂ）切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることと、を含み、ドナー核酸分子が、切断部位の各側の１００塩基対内に位置する核酸と相同性の少なくとも１０ヌクレオチドまたは塩基対を有し、集団内の細胞の少なくとも９５％が、切断部位においてドナー核酸分子による相同性指向修復を受ける、方法。
項３１５．ドナー核酸分子が、相同性指向修復後に細胞内核酸分子に存在するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む、項３１４に記載の方法。
項３１６．ドナー核酸分子は、ドナー核酸分子ドナー核酸分子が細胞集団の細胞の核に局在化することを可能にする１つ以上の核局在化シグナルに連結する、項３１４に記載の方法。
項３１７．細胞集団を、（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、（２）核酸切断エンティティの少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の少なくとも１つの成分をコードする１つ以上の核酸分子、または（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤、のうちの１つ以上と接触させる、項３１４に記載の方法。
項３１８．ドナー核酸分子が、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である、項３１４に記載の方法。
項３１９．細胞集団が、１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触し、その後、細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、項３１４に記載の方法。
項３２０．細胞集団が１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触した５～６０分後に、細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、項３１９に記載の方法。
項３２１．細胞内の標的遺伝子座で調節タンパク質または調節複合体の活性を増強する方法であって、（１）標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、（ｉ）調節部位を含む標的遺伝子座の第１のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および（ｉｉ）標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第１のＤＮＡ結合調節増強剤が第１のエンハンサー結合配列に結合することを可能にし、それにより細胞内の標的遺伝子座で第１の調節タンパク質または第１の調節複合体の活性を増強することと、を含む、方法。
項３２２．第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入が含まれる、項３２１に記載の方法。
項３２３．第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる、項３２１に記載の方法。
項３２４．第１のＤＮＡ結合調節増強剤が第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである、項３２１に記載の方法。
項３２５．（１）細胞に第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、（２）第２のＤＮＡ結合調節増強剤が標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、をさらに含む、項３２１に記載の方法。
項３２６．第１のエンハンサー結合配列および第２のエンハンサー結合配列が、互いの１８０塩基対以内に位置する、項３２４に記載の方法。
項３２７．第１のエンハンサー結合配列および第２のエンハンサー結合配列が、モジュレーター結合配列の反対側に位置する、項３２４に記載の方法。
項３２８．第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、項３２１に記載の方法。
項３２９．ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、項３２８に記載の方法。
項３３０．第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、項３２１に記載の方法。
項３３１．第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、項３３０に記載の方法。
項３３２．調節部位を含む標的遺伝子座の第２のモジュレーター結合配列に結合することができる、第２の調節タンパク質または第１の調節複合体を、細胞に導入することをさらに含む、項３２１に記載の方法。
項３３３．第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、項３３２に記載の方法。
項３３４．ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、項３３３に記載の方法。
項３３５．第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、項３３４に記載の方法。
項３３６．第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、項３３５に記載の方法。
プロモーター捕捉および短い相同性アームによるタンパク質標識を示す。図１Ａは、Ｎ末端標識を示す。プロモーターを持たない選択マーカーであるピューロマイシンは、自己切断型２Ａペプチド、続くＰＣＲによる５’末端および３’末端の両方での３５ｎｔ相同性アームの付加を介してエメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）レポーターまたはオレンジ色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）レポーター遺伝子に連結し、る。内因性プロモーターは、ピューロマイシン、レポーター遺伝子、および内因性遺伝子の発現を駆動する。二本鎖切断（ＤＳＢ）は、翻訳開始部位の近くにあるＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲのいずれかにより誘導される。図１Ｂは、Ｃ末端標識を示す。ＥｍＧＦＰまたはＯＦＰレポーター遺伝子は、自己切断２Ａペプチド、続く５’末端および３’末端で３５ｎｔの相同性アームの付加を介してプロモーターを持たない選択マーカーであるピューロマイシンに連結する。内因性プロモーターは、内因性遺伝子、レポーター遺伝子、およびピューロマイシンの発現を駆動する。ＤＳＢは、翻訳停止部位の近くにあるＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲのいずれかにより誘導される。内在性遺伝子とレポーター遺伝子との間の停止コドンは除去される。図１Ａおよび１Ｂでは、ドナーＤＮＡは、相同組換えによりゲノムに挿入される。５’末端および３’末端の接合部は、それぞれ、Ｆ１／Ｒ１およびＦ２／Ｒ２プライマーセットを用いたＰＣＲにより分析される。 同上 ドナーの形式および投与量ならびに相同性アーム長がＨＤＲ効率に与える影響を示す。図２Ａでは、Ｃａｓ９ ＲＮＰおよび３５ｎｔ相同性アームを有する様々な量のドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションを介して２９３ＦＴ細胞に送達した。ｇＲＮＡの非存在下での試料は、対照として機能した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ピューロマイシン選択なしのＯＦＰ陽性細胞の割合を決定した（－）。あるいは、フローサイトメトリー分析の前に、細胞をピューロマイシンで７日間処理した（＋）。図２Ｂでは、様々な相同性アーム長をＰＣＲ増幅により挿入カセットに付加した後、Ｃａｓ９ ＲＮＰで２９３ＦＴ細胞に同時トランスフェクトした。図２Ａについて説明したように、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。図２Ｃおよび２Ｄでは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および約５００ｎｔの相同性アームを有するドナープラスミド、または３５ｎｔの相同性アームを有する一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡドナーを、エレクトロポレーションを介して２９３ＦＴまたはヒト初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリー分析に供した。 同上 同上 同上 ＯＦＰがベータ－アクチン遺伝子座に組み込まれたクローン細胞の特性評価を示す。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および３５ｎｔの相同性アームを有するドナーＤＮＡをエレクトロポレーションにより２９３ＦＴ細胞に送達し、続いて、ピューロマイシン選択後にクローン細胞を単離した。クローン細胞を、１つの内部プライマーと１つの外部プライマーまたは外部プライマーの対とを使用するジャンクションＰＣＲによって分析した。得られたＰＣＲ産物を配列決定により分析した。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、正確なＨＤＲ（１）またはインデルを伴うＨＤＲ（２）のＮ末端およびＣ末端接合部を示す。図３Ａおよび３Ｂの正確なＨＤＲ（１）の矢印は、ゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡまたはＣａｓ９切断部位との接合部を示す。図３Ａおよび３Ｂの太字の配列は、３５ｎｔの相同性アームを示す。斜体ＡＴＧは、ベータアクチンの開始コドンを示す。図３Ａおよび３Ｂのインデルを伴うＨＤＲ（２）は、接合部周辺のインデル形成の例を示す。図３Ａは、出現順に配列番号１３０～１３４をそれぞれ開示する。図３Ｂは、出現順に配列番号１３５～１３９をそれぞれ開示する。図３Ｃは、クローン細胞の接合性の特性評価を示す。対立遺伝子１は、両方の接合部で約６８％正確なＨＤＲを有し、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれかまたは両方の末端で３２％のインデルを伴うＨＤＲが生じた。対立遺伝子２は、クローンの約８０％に「Ａ」挿入（∇１ｎｔＡ）、クローンの１８％に２ｎｔ超の欠失（Δ＞２ｎｔ）、および２％の野生型（ｗｔ）を有した。図３Ｄおよび３Ｅは、ＴＡＬＥヌクレアーゼを介したＯＦＰによるベータアクチンのＮ末端標識を示す。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ単独またはドナーＤＮＡを伴うＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を介してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。図３Ｄは、ゲノム編集効率（インデル％）を示し、図３ＥはＯＦＰ陽性細胞の割合（－）およびＯＦＰ陽性ピューロマイシン処理細胞の割合（＋）のフローサイトメトリーによる分析を示す。 同上 同上 同上 同上 Ａ５４９細胞中のＥｍＧＦＰのＬＲＲＫ２へのＮ末端標識化を示す。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、およびプロモーターを持たないピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＥｍＧＦＰ断片と約３５ｎｔの相同性アームとを含むドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより細胞に送達した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をクローン細胞分離に供した。増殖させた後、クローン細胞を溶解させ、Ｎ末端（図４Ａ）またはＣ末端（図４Ｂ）のいずれかについて、１つの内部プライマーと１つの外部プライマーとを使用するジャンクションＰＣＲにより分析した。図４Ａは配列番号１４０を開示する。図４Ｂは配列番号１４１を開示する。あるいは、一対の外部プライマーを使用して、２つの対立遺伝子のゲノム修飾を分析した（図４Ｃ）。得られたＰＣＲ産物を配列決定により分析した。図４Ａおよび４Ｂの太字の配列は、相同性アームを示す。下の矢印は、Ｃａｓ９切断部位またはゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を示す。図４ＣのΔ７ｎｔ＿ｎｏＨＤＲは、ＨＤＲは発生していないが、７ｎｔが欠失していることを示す。 同上 同上 図５Ａ（配列番号５６～６２）、５Ｂ（配列番号６３～６９）、および５Ｃは、ＦＡＫがＥｍＧＦＰでＣ末端標識されている。Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および短い相同性アームを有するドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより２９３ＦＴにトランスフェクトした。ピューロマイシン選択後、細胞をクローン細胞分離に供した。接合部をＰＣＲにより増幅した後、Ｎ末端接合部（図５Ａ）またはＣ末端接合部（図５Ｂ）の配列解析を続けた。矢印は、二本鎖切断（ＤＳＢ）、またはゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を示す。正確なＨＤＲの場合、短い相同性アーム（太字）および停止コドン（下線）も示している。インデルを有するＨＤＲの例も、図５Ａおよび５Ｂに示している。図５Ｃは、両方の対立遺伝子のゲノム修飾分析を示す。 同上 同上 ＥＧＦＲを、ＥｍＧＦＰでＣ末端標識した。停止コドンに近いＥＧＦＲのゲノム遺伝子座を標的とするように、ｇＲＮＡを設計した。Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体およびドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより２９３ＦＴ細胞に送達した。ジャンクションＰＣＲおよび配列決定により、クローン細胞を分析した。図６ＡはＮ末端接合部分析（配列番号７０）を示し、図６ＢはＣ末端接合部分析（配列番号７１）を示す。図６Ｃは、各対立遺伝子のゲノム修飾を示す。図６Ｃの∇１ｎｔＡ＿ｎｏＨＤＲは、挿入物のない１つの「Ａ」挿入を指す。 同上 同上 ＤＮＡドナーの末端修飾がＨＤＲ効率に与える効果を示し、図７ＢはＮＨＥＪ阻害剤がＨＤＲ効率に与える効果を示す。図７Ａでは、末端修飾されたＤＮＡプライマーを化学的に合成し、ＰＣＲ増幅によるドナーＤＮＡの調製に使用した。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナーＤＮＡを、エレクトロポレーションにより初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ベータアクチン遺伝子座へのピューロマイシン－Ｐ２Ａ－ＯＦＰ ＤＮＡ断片の挿入効率をフローサイトメトリーアッセイによりモニタリングした。図７Ｂでは、ＮＨＥＪ阻害剤をエレクトロポレーションの直後に培地に加えた。「Ｆ」は順方向プライマーを指し、「Ｒ」は逆方向プライマーを指し、「ＰＳ」はホスホロチオエートを指し、「ＮＨ２」はアミン修飾を指し、「ｓｓＤＮＡ」は一本鎖ＤＮＡを指す。 同上 は、哺乳動物ゲノムにおける組換え抗体のクローニングおよび発現を示す。図８Ａは、プロモーターを持たないピューロマイシン選択マーカー、続く自己切断型２Ａペプチド（配列番号５）を含む抗体発現カセットを示す。ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を、ＣＭＶプロモーターによって駆動した。３５ｎｔの相同性アームをＰＣＲにより追加した。図８Ｂ（配列番号７２～７６）および図８Ｃ（配列番号７７～８２）は、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端接合部分析を示す。二本鎖破断（ＤＳＢ）およびゲノムＤＮＡとドナーＤＮＡとの間の接合部を矢印で示している。３５ｎｔの相同性アームおよびいくつかの追加の配列も太字で強調した。ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）および停止コドンを図８Ｃに示している。図８Ｄは、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した、抗体を産生した（＋）または抗体を産生しなかった（－）クローン細胞の相対的割合を示す。 同上 同上 同上 核局在化シグナル（ＮＬＳ）－ドナーＤＮＡ設計（配列番号８３及び１２７並びに８４及び１２８）。ＮＬＳペプチドを接続するために使用したコンジュゲ－ション化学は、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）またはＣＬＩＣＫ－ＩＴ（登録商標）であった。 （配列番号８：８５～９２）。ＮＬＳ－ドナーＤＮＡ構築物で修飾したＨＥＫ２９３系統。左側で、ＧＦＰ遺伝子を、フルオロフォアを構成する６ヌクレオチドの欠失により破壊した。６塩基を含むドナーを追加すると、ＧＦＰ蛍光が回復した。右側は、同様のＢＦＰ遺伝子破壊である。一塩基多型（ＳＮＰ）を有するドナーを追加すると、ＢＦＰコード配列がＧＦＰコード配列に変換された。 ＧＦＰ活性を回復させるための６塩基配列の追加におけるＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴドナーＤＮＡの用量応答。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）連結ＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。 ＰＳまたはＮＬＳオリゴドナーＤＮＡのいずれかを等濃度で使用して編集した細胞のフローサイトメトリー分析。 単一の塩基を編集してＢＦＰ発現細胞をＧＦＰ発現細胞に変換するためのＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。ＳＭＣＣ連結ＮＬＳ修飾ドナーＤＮＡと比較したＰＳオリゴドナーＤＮＡの用量応答。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ（ヌクレアーゼなし）構築物の例示的なアーキテクチャの概略図を示す。ヌクレアーゼドメインのないＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ構築物を示す。一部の場合には、ヌクレアーゼドメインは存在し得るが、妨害されていてもよい（例えば、挿入、欠失、および／または置換により）。 ＴＡＬＥＮ結合配列に対して７ｎｔ間隔で設計された「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を追加すると、ＣＭＰＫ１－Ｃ標的でのインデル形成が約２倍改善した。 ＴＡＬＥＮ結合配列に対して最大１００ｎｔ間隔の「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を、ＴＡＬＥＮ切断の改善について試験した。 ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ結合配列に対して２０ｎｔ間隔の「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」により、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的でＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰのインデル形成が２０倍超改善した。 「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」により、ＲＮＰがｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９－ＨＦ１またはｅＳｐＣａｓ９のいずれかにより形成されたインデル形成が改善した。 ｓｇＲＮＡおよび「ＣＲ－ＰＡＬ」ｇＲＮＡを作製するためのテンプレートの図解である。 「ＣＲ－ＰＡＬ」の機能の図解である。黒色は、結合能力が１５ｎｔの「ＣＲ－ＰＡＬ」を示し、灰色は、結合能力が２０ｎｔのｓｇＲＮＡを示す。 「ＣＲ－ＰＡＬ」をＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的でＣａｓ９－ＲＮＰと併用すると、インデル形成が６０倍超増大した。 本図は、「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」のためのＮｏ－ＦｏｋＩ Ｃ末端断片の作製を示す。 本図は、試験「Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬ」（２９３ＦＴ）を示す。標的：ＣＭＰＫ１－Ｃ（配列番号１９）、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ：１００ｎｇ／各、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：７ｎｔ間隔（配列番号１８）、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。反復。 本図はＴＡＬＥＮ上のＢｕｄｄｙ ＴＡＬの試験間隔を示す。標的：ＣＭＰＫ１、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。間隔が重要であるため、ＴＡＬをＴＡＬＥＮのすぐ隣に置くことはできない。間隔（０、４、７、２０ｎｔ）は、ＴＡＬの１８個の塩基認識配列と、最も近いＴＡＬＥＮ対との間の間隔を示す。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲの効率の増強についての試験Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬを示す。間隔は切断効率に影響し得る。ＴＡＬ（灰色の六角形）は、ＴＡＬＥＮ（暗灰色の矢印）から７ｎｔ離れていても２０ｎｔ離れていても違いはない。ＴＡＬおよびＣＲＩＳＰＲ標的（黒丸の断片）では、２０ｎｔ離れたＴＡＬが優れている。 本図は、ＣＲＩＳＰＲによる編集のための反復ＴＡＬ－ｂｕｄｄｙを示す。２９３ＦＴ細胞、ＣＲＩＳＰＲ標的：ＵＳＦＰ２、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：２０ｎｔ間隔、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２。反復。 本図は、低性能変異体における高忠実度Ｃａｓ９－回復活性についての試験ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙを示す。標的：ＵＦＳＰ２、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ：２０ｎｔ間隔。ＨＦ－ｃａｓ９には検出可能な活性がなく、分析では、ｅＣａｓ９よりも損傷していることが示唆される。ｅＣａｓ９ １．１には、ＴＡＬなしの検出可能な活性はなかった。ＴＡＬを用いると、ｗｔレベルの活性が得られた。これは、所望の標的部位にのみ局在する高忠実度の活性（超高忠実度）を得るので、重要である。 本図は、標準的な活性ｃａｓ９および短縮型ｇＲＮＡを含む試験ＣＲＩＳＰＲ－ＰＡＬを示す。標的：ＵＦＳＰ２、細胞：２９３ＦＴ、Ｎｅｏｎ（登録商標）：１１５０／２０／２、ＣＲ－ＰＡＬ：１５ｍｅｒのｇＲＮＡ、ＣＲ＿ＰＡＬ－左間隔：３６ｎｔ、ＣＲ＿ＰＡＬ－右間隔：１５ｎｔ。Ｃａｓ９は、短縮型ｇＲＮＡ（１５ｍｅｒ）と結合するが、切断しない。（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｋｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０３８（Ｓｅｐｔ．７，２０１５））。標準的なｇＲＮＡ（２０ｍｅｒ）がより良好に切断できるように、短縮型ｇＲＮＡを使用して切断部位を囲み、ＤＮＡを開く。単独で５％だったものから、１５ｍｅｒで５０％以上となる。Ｃａｓ９ ｖ２＋２０ｍｅｒ ｇＲＮＡ＋Ｌ／Ｒ １５ｍｅｒ ｇＲＮＡ。 本図はＢｕｄｄｙ ＴＡＬ活性化因子の概念を示す。ＴＡＬとＶＰ６４などの活性化ドメインとの結合により、ＤＮＡを開いてヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９など）による編集を増強する活性な遺伝子発現が促進される。 本図はＵ２ＯＳにおけるＨＤＲを示す（配列検証）。ドナーにはＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されている。Ｎｅｏｎ（登録商標）：１３００／２０／２。 本図は、小分子／添加剤がＡ５４９細胞におけるＴＡＬＥＮ編集に与える効果を示す。標的：ＨＴＲ２Ａ－Ｎ、ドナーにＨｉｎｄＩＩＩ部位挿入あり、Ｎｅｏｎ（登録商標）条件：１２００／２０／４、２４時間で培地交換、ＨｉｎｄＩＩＩ切断をグラフに表示。ＮＵ７４４１（ＤＮＡＰＫ阻害剤）およびＢ１８Ｒ（免疫応答抑制因子）。 本図は、ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙの相対位置の例を示す。次に、ＴＡＬＥＮ対は、間隔が標的部位の各側で８塩基である。この例では、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙは、ＴＡＬＥＮから７ｎｔの間隔にある。上の鎖は配列番号２０であり、下の鎖は配列番号２１である。 本図は、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的のＣＲＩＳＰＲ切断部位に近接して設計された「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」を示す。Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を１１５０パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いた約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）へのトランスフェクションのために、１００ｎｇの左および右「ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ」ｍＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ（１０００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および２００ｎｇのｓｇＲＮＡ）とともに加えた。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。上の鎖は配列番号４２であり、下の鎖は配列番号４３である。 本図は、ＵＦＳＰ２－ＳＮＰ標的のＣＲＩＳＰＲ切断部位に近接するように設計された「ＣＲ－ＰＡＬ」を示す。２００ｎｇのＣＲ－ＰＡＬ＿ＬｔおよびＣＲ－ＰＡＬ＿Ｒｔを、野性型Ｃａｓ９－ＲＮＰとともにインキュベートし、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーション装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ５０００）を１１５０パルス電圧、２０パルス幅、２パルス数で用いて約５０，０００個の２９３ヒト胎児腎細胞（２９３ＦＴ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８～７２時間後に細胞を採取し、溶解させた。インデル形成を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２４３７２）を用いて分析した。上の鎖は配列番号４４であり、下の鎖は配列番号４５である。 本図は、試験「Ｂｕｄｄｙ ＴＡＬ」（２９３ＦＴ）を示す。上の鎖は配列番号４６であり、下の鎖は配列番号４７である。 一対のＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ（本明細書では第１および第２のＤＮＡ結合調節増強剤とも称される）と、一対のＴＡＬ－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体（本明細書では第１および第２のＤＮＡ結合ヌクレアーゼコンジュゲートとも称される）との併用の概略図である。図の右側および左側は、左側が左ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合、右側が右ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合を示している。長い実線は、細胞内核酸分子の一部（例えば、本明細書では標的遺伝子座とも称される染色体）を表す。示される核酸分子の領域Ａ（左端および右端に示される）は、２つのＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙタンパク質の結合部位（本明細書では第１および第２のエンハンサー結合配列とも称される）である。領域Ｂは、ＴＡＬ－Ｂｕｄｄｙ結合部位（例えば、第１および第２のエンハンサー結合配列）とＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質結合部位（本明細書では第１および第２の結合配列とも称される）との間の距離を表す。領域Ｄは、２つのＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質結合部位間の核酸セグメントを表す。領域Ｄの白いボックスは、ＴＡＬ－ＦｏｋＩ融合タンパク質の対によって核酸が切断される部位（本明細書では調節部位とも称される）を表す。領域Ｅは、アクセス可能性が増強される可能性がある核酸分子の部分を表す。 一対のＴＡＬ－ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合物の代わりに、単一のＴＡＬ－ＶＰ１６融合物（本明細書では調節タンパク質とも称される）を使用することを除いて、図３６のものと同様の概略図である。表示のない円は、ＶＰ１６動員転写複合体の成分を表す。さらに、単一のＴＡＬ－ＶＰ１６融合物を用いるため、領域Ｃは１つしかない。また、領域Ｂは、領域Ａ（本明細書では第１および第２のエンハンサー結合配列とも称される）と領域Ｃ（本明細書では調節結合配列とも称される）との間に介在する塩基対により形成される形成される。 本明細書に記載の様々な実施形態で使用され得るドナー核酸分子のある数の異なる形式を示す。末端の白丸は、ヌクレアーゼ耐性基を表す。２つの円は、２つの基があることを意味する。黒い領域は、別の核酸分子（例えば、染色体ＤＮＡ）の１つ以上の遺伝子座との配列相同性／相補性の領域を表す。クロスハッチ領域は、核酸セグメントの配列相同性／相補性の領域間に位置する核酸を表す。この図は、本発明の様々な態様で使用され得るドナー核酸分子の様々なバリエーションを示す。 モデルＣａｓ９タンパク質であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に基づく、例示的なＣａｓ９形式の概略図である。この１３６８アミノ酸タンパク質は、本図の一番上の実線で表される。Ｖ１～Ｖ５として指定するＣａｓ９タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を構成要素とする融合タンパク質である。点付きのボックスは単節型ＮＬＳを表し、空白のボックスは双節型ＮＬＳを表す。灰色のボックスは、親和性標識（例えば、６ヒスチジン標識（配列番号１２９）など）を表す。 ＴＡＬ切断遺伝子座とドナーＤＮＡ分子の上の概略図との両方のより詳細な図を加えた、図３６と同様の概略図である。ドナーＤＮＡの線による概略図を左下に示す。実線の直線は、標的遺伝子座との相同性の領域を表す。破線の円形の線は、挿入カセットを表す。「Ｘ」記号は、配列相同性の領域を表す。破線の上下矢印は、ドナーＤＮＡ相同性アームの５’および３’鎖における２つのホスホロチオエート連結を表す。ヌクレアーゼ消化の際、これらのホスホロチオエート連結は、１０ヌクレオチド長の５’オーバーハング末端の生成をもたらすような位置である。左側および右側の空白のボックスは、双節型ＮＬＳを表す。線による概略図の右は、挿入カセットの２つの例である。上部の挿入カセットは、挿入遺伝子座の機能の破壊と、ピューロマイシン耐性マーカーの発現との両方を行うように設計されている。下部の挿入カセットは、上部の挿入カセットに類似しているが、組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子を遺伝子座に挿入するようにも設計されている。 Ｃａｓ９ Ｖ１のアミノ酸配列（配列番号９３）を示す。ＮＬＳおよびＨｉｓ標識は、そのように表示されている。 Ｃａｓ９ Ｖ２のアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。ＮＬＳは、そのように表示されている。 一連のＣａｓ９－ＮＬＳ融合タンパク質の形式を示す。「ＮＰ」は、ヌクレオプラスミンＮＬＳを指す。図４３は、配列番号１２９として「６ｈｉｓ」を開示する。 異なるＣａｓ９－ＮＬＳと２種類の異なる細胞型とを併用して得られたＧＣＤデータを示す。 同上 一般的なＴＡＬＥ構造形式を示す概略図である。部位１、２、および３は、ＤＮＡの認識および結合に関与すると考えられるＴＡＬＥ領域の外側に位置する。 ＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。このＴＡＬＥＮの形式は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ Ｖ３」と称される。Ｎ末端領域は、Ｖ５エピトープおよび「ＧＧ」リンカーを含み、反復領域の前に１３６アミノ酸領域が続く。１３６アミノ酸領域には、（１）反復領域の個々の反復と何らかの配列相同性を有する一連の反復単位（「Ｒ－３」、「Ｒ－２」、「Ｒ－１」、および「Ｒ０」と表示）と、（２）ＴＡＬＥＮが結合する核酸の５´Ｔ要件を緩和するように改変することができる、「Ｔ－Ｌｅｓｓ Ｂｏｘ」、アミノ酸配列「ＲＧＡ」とが含まれる。反復領域には、３４個のアミノ酸の１６個の反復が含まれる。半反復（「Ｒ１／２」と表示）は、反復領域のＣ末端に近接している。２つの核局在シグナル（「ＮＬＳ」と表示）は、さらに、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの前後にタンパク質のＣ末端の方向に位置する。 ＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９６および９７）を示すが、図を簡素化するために反復領域のアミノ酸配列は削除されている。また、本図に示されているタンパク質には、３つのＮＬＳがある。 実施例８で以下に示すように生成された、３つの異なる細胞型における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出データを示す。 実施例８で以下に示すように生成された、２つの異なる細胞型における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出および相同性指向修復データを示す。 実施例８で以下に示すように生成された、Ａ５４９細胞における３つの異なるゲノム遺伝子座についてのゲノム切断検出データを示す。 クロマチンを開き、開いたまま維持するためのＴＡＬのいくつかの使用の概略図である。概略図の上部は、細胞内の核酸領域を示し、核酸はヒストンオクタマーと結合してクロマチンを形成する。ＤＮＡの約１４５の塩基対が各オクタマーに巻き付けられており、約１．６ターンである。ヒストンＨ１はこの概略図には表わされていない。破線の矢印は、Ｂｕｄｄｙ－ＴＡＬ結合遺伝子座を示す。「ＴＢＳ」と表示されている縦線の付いたボックスは、ＴＡＬ結合部位を指す。「ＲＮＡ Ｐｏｌ」は、「プロモーター」から「下流」に核酸を転写するＲＮＡポリメラーゼ分子を指す。 Ｂｕｄｄｙ－ＴＡＬのアミノ酸配列（配列番号１４３）を示し、これは、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列の発現産物である。このＢｕｄｄｙ－ＴＡＬには２つのＮＬＳ（ボックス内）があり、各々タンパク質のＮ末端およびＣ末端に位置する。さらに、通常はＣ末端付近に存在する転写活性化ドメインが削除されている。下線を引いたタンパク質の中央領域は反復領域である。２つのリンカー（ＧＳおよびＧＧ）もボックス内に示す。
図９に示す構築物の１つの変形は、ＮＬＳが、ドナーＤＮＡ分子の５’末端の代わりに３’末端に位置する、両方の末端に位置する、ドナーＤＮＡ分子の中央に置かれるなどの場合である。さらに、一方または両方の末端に１つ超のＮＬＳが存在してもよい。また、核酸分子は、（１）ＤＮＡまたはＲＮＡ、（２）一本鎖または二本鎖、（３）線形、円形、またはステムもしくはヘアピンループを有する分子、および／あるいは（４）化学修飾されたもの（例えば、ホスホロチオエート連結、２’－Ｏ－メチル塩基などを含むもの）であってもよい。加えて、以下に示すように、ＮＬＳは、核以外の細胞空間への局在化を指示する細胞内標的化部分（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）で代置されてもよい。このため、いくつかの実施形態には、遺伝子編集が望まれる細胞内位置に局在する１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する核酸分子、ならびにそのような核酸分子を使用するための方法（例えば、ゲノム工学）が含まれる。いくつかの実施形態に使用され得るいくつかの例示的な細胞内標的化部分のアミノ酸配列を表３に示す。
Figure 2023168355000093
本発明の実施に使用し得る核局在化シグナルは、様々な構造を有してもよく、例えば、単節型であっても双節型であってもよい。単節型ＮＬＳは、典型的には、塩基性残基の単一のクラスターからなる。双節型ＮＬＳは、典型的には、１０～１２残基離れた塩基性残基の２つのクラスターからなる。例示的なＮＬＳアミノ酸配列を、表４、５、および６で以下に記載する。
Figure 2023168355000094
Figure 2023168355000095
Figure 2023168355000096
ＮＬＳの位置および種類に関するＴＡＬＥタンパク質のある数の形式を表７で以下に示す。
Figure 2023168355000097
図４６および４７は、異なる位置にＮＬＳを有する２つの異なるＴＡＬＥＮタンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮタンパク質は、分子内に存在するＮＬＳの数、種類、および位置が異なっていてもよい。図４６に示すアミノ酸配列に関して、ＮＬＳが反復領域に対してＮ末端に位置する場合、ＮＬＳは、多くの場合、Ｒ－３領域よりもさらにＮ末端の方に位置することになる。さらに、ＮＬＳが反復領域に対してＣ末端に位置する場合、ＮＬＳは、多くの場合、反復領域とエフェクタードメイン（図４６に示されるアミノ酸配列中のＦｏｋＩ）との間にあるアミノ酸Ｈ Ｒ Ｖ Ａ（図４６のアミノ酸８１１～８１４）（配列番号９５の残基８１１～８１４として開示される「Ｈ Ｒ Ｖ Ａ」）よりもさらにＣ末端の方に位置することになる。このため、参考として図４６のアミノ酸配列を使用して、ＮＬＳは、３つの一般的な場所である、（１）反復領域のＮ末端、（２）反復領域とエフェクタードメインの間、および（３）エフェクタードメインの後に位置し得る。
図４８～５０で示すデータを生成するために使用した標的についての以下に示すＴＡＬＥＮ設計を、以下で表８に示す。図４８～５０の生成に使用したデータは、以下で表９～１１に示す。
Figure 2023168355000098
項３３６．第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、項３３５に記載の方法。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕細胞内に存在する内因性核酸分子を改変する方法であって、ドナーＤＮＡ分子を細胞に導入することを含み、
前記ドナーＤＮＡ分子は、前記内因性核酸分子が位置する前記細胞内の位置に前記ドナーＤＮＡ分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する、方法。
〔２〕前記内因性核酸分子が位置する前記細胞内の位置が、核、ミトコンドリア、または葉緑体の中である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記１つ以上の細胞内標的部分が核局在化シグナルである、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記ドナーＤＮＡ分子が、約２５～約８，０００ヌクレオチド長である、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記ドナーＤＮＡ分子が一本鎖である、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕前記ドナーＤＮＡ分子が、１つ以上の末端の５０ヌクレオチド内に１つ以上のヌクレアーゼ耐性基を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕前記ヌクレアーゼ耐性基が、ホスホロチオエート基、アミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記ドナーＤＮＡが、二本鎖または部分的に二本鎖である、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕前記ドナーＤＮＡ分子が、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１０〕前記ネガティブ選択マーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする核酸である、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記ドナーＤＮＡ分子が、前記細胞内に存在する標的遺伝子座との配列相補性の２つの領域を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔１２〕前記選択マーカーが、前記ドナーＤＮＡ分子の前記配列相補性の２つの領域の間に位置する、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記細胞が、以下のうちの１つ以上と接触する、前記〔１〕に記載の方法：
（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、
（２）核酸切断エンティティの１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、
（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、
（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、または
（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤。
〔１４〕前記１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤がＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記１つ以上の核酸切断エンティティのうちの１つ以上が、以下からなる群から選択される、前記〔１３〕に記載の方法：
（１）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
（２）ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、および
（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体。
〔１６〕前記１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの１つ以上が、以下からなる群から選択される、前記〔１３〕に記載の方法：
（１）ジンクフィンガータンパク質、
（２）ＴＡＬＥタンパク質、および
（３）ＣＲＩＳＰＲ複合体。
〔１７〕前記ＴＡＬＥタンパク質が異種ヌクレアーゼドメインを有しない、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記ＣＲＩＳＰＲ複合体がｄＣａｓ９タンパク質を含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕前記１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの１つ以上が、標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内で結合するように設計される、前記〔１３〕に記載の方法。
〔２０〕図４６のアミノ酸アミノ酸８１１～８３０を含むＴＡＬＥタンパク質であって、８１５～８１６位および８２４～８２５位のアミノ酸が、Ｇｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、ＴＡＬＥタンパク質。
〔２１〕図４６のアミノ酸アミノ酸８１０～１０２９を含み、１０２２～１０２３位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、前記〔２０〕に記載のＴＡＬＥタンパク質。
〔２２〕図４６のアミノ酸アミノ酸７５２～１０２１を含む、前記〔２０〕に記載のＴＡＬＥタンパク質。
〔２３〕図４７のアミノ酸アミノ酸２０～２７、３０～１０７、および１１１～１６５を含み、２８～２９位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり、１０８～１１０位のアミノ酸がＡｒｇ－Ｇｌｙ－ＡｌａまたはＧｌｎ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒである、ＴＡＬＥタンパク質。
〔２４〕図４７のアミノ酸アミノ酸８２１～８２６および８２９～８４０を含み、８２７～８２８位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙである、ＴＡＬＥタンパク質。
〔２５〕図４７に対応するアミノ酸を含む、前記〔２４〕に記載のＴＡＬＥタンパク質。
〔２６〕４～２５の反復単位を含む反復領域を含む、前記〔２４〕に記載のＴＡＬＥタンパク質。
〔２７〕細胞内で細胞内核酸を操作するための方法であって、前記〔２３〕に記載のＴＡＬＥタンパク質または前記〔２３〕に記載のＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入することを含む、方法。
〔２８〕ドナー核酸分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記ドナー核酸分子が、前記標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内に位置する核酸との配列相同性の１つ以上の領域を有する、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕２つ以上の双節型核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質。
〔３０〕前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、１つ以上の末端の２０アミノ酸内に位置する、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質。
〔３１〕前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、前記タンパク質のＮ末端およびＣ末端の２０アミノ酸内に個々に位置する、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質。
〔３２〕前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、異なるアミノ酸配列を含む、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質。
〔３３〕１つ以上の単節型核局在化シグナルをさらに含む、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質。
〔３４〕親和性標識をさらに含む、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質。
〔３５〕細胞内で細胞内核酸を操作する方法であって、前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質または前記〔２９〕に記載のＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入することを含み、前記Ｃａｓ９タンパク質が前記細胞内の標的遺伝子座に結合するように設計される、方法。
〔３６〕前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕ドナー核酸分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記ドナー核酸分子が、前記標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内に位置する核酸との配列相同性の１つ以上の領域を有する、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３８〕細胞集団内の切断部位における細胞内核酸分子の相同組換えのための方法であって、
（ａ）前記切断部位で前記細胞内核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、
（ｂ）前記切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることであって、前記ドナー核酸分子が、前記切断部位の各側の１００塩基対内に位置する核酸と相同性の少なくとも１０ヌクレオチドまたは塩基対の相同性を有する、接触させることと、を含み、
前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも９５％が、前記切断部位で前記ドナー核酸分子との相同性指向修復を受ける、方法。
〔３９〕前記ドナー核酸分子が、相同性指向修復後に前記細胞内核酸分子に存在するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕前記ドナー核酸分子は、前記ドナー核酸分子前記ドナー核酸分子が前記細胞集団の細胞の核に局在化することを可能にする１つ以上の核局在化シグナルに連結する、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４１〕前記細胞集団が、以下のうちの１つ以上と接触する、前記〔３８〕に記載の方法：
（１）１つ以上の核酸切断エンティティ、
（２）核酸切断エンティティの１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、
（３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、
（４）ＤＮＡ結合調節増強剤の１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、または
（５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤。
〔４２〕前記ドナー核酸分子が一本鎖である、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４３〕前記ドナーＤＮＡ分子が、１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結する、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４４〕前記細胞集団が、前記１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触し、続いて前記細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４５〕前記細胞集団が１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触した５～６０分後に、前記細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、前記〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕初期核酸分子における相同組換えのための方法であって、
（ａ）前記初期核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、
（ｂ）前記切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることと、を含み、
前記初期核酸分子がプロモーターおよび遺伝子を含み、
前記ドナー核酸分子が、（ｉ）長さが１２ｂｐ～２５０ｂｐの５’および３’末端の一致した末端、（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、（ｉｖ）前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子または前記プロモーターを持たない選択マーカーのいずれかの側のｌｏｘＰのいずれも連結する自己切断ペプチド、ならびに（ｉｖ）任意選択で、前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子との間のリンカーを含む、方法。
〔４７〕前記核酸分子の前記二本鎖破断が、（ｉ）前記切断された核酸分子のＮ末端標識化のための前記ＡＴＧ開始コドンから２５０ｂｐ以下であるか、または（ｉｉ）前記切断された核酸分子のＣ末端標識化のための前記停止コドンから２５０ｂｐ以下である、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕前記二本鎖切断が１つ以上の核酸切断エンティティによって誘導される、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４９〕前記少なくとも１つの核酸切断エンティティが、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、１つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体、１つ以上のアルゴノート－核酸複合体、または１つ以上のマクロヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを含む、前記〔４８〕に記載の方法。
〔５０〕前記少なくとも１つの核酸切断エンティティが、発現ベクター、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＣ）、またはｍＲＮＡを使用して投与される、前記〔４８〕に記載の方法。
〔５１〕前記プロモーターを持たない選択マーカーが、タンパク質、抗生物質耐性選択マーカー、細胞表面マーカー、細胞表面タンパク質、代謝産物、またはそれらの活性断片を含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５２〕前記自己切断ペプチドが自己切断２Ａペプチドである、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５３〕前記一致した末端が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５４〕前記ドナー核酸分子の５’および３’末端の前記一致した末端が、１２ｂｐ～２００ｂｐ、１２ｂｐ～１５０ｂｐ、１２ｂｐ～１００ｂｐ、１２ｂｐ～５０ｂｐ、または１２ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５５〕前記ドナー核酸分子が、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、前記切断された核酸分子に組み込まれる、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５６〕５’末端、３’末端、または５’および３’末端で前記ドナー核酸分子を修飾することをさらに含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔５７〕前記ドナー核酸分子が５’および３’末端で修飾される、前記〔５６〕に記載の方法。
〔５８〕前記ドナー核酸分子が、１つ以上の末端の１つ以上の鎖中で１つ以上のヌクレアーゼ耐性基により修飾される、前記〔５６〕に記載の方法。
〔５９〕前記１つ以上のヌクレアーゼ耐性基が、１つ以上のホスホロチオエート基、１つ以上のアミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む、前記〔５８〕に記載の方法。
〔６０〕前記ドナー核酸分子を１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤で処理することをさらに含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔６１〕前記〔４６〕に記載の方法によって作製される核酸分子。
〔６２〕組換え抗体発現カセットであって、
（ｉ）長さ２５０ｂｐ以下である、前記カセットの５’および３’末端にある一致した末端、
（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、
（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、
（ｉｖ）前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子とを連結する自己切断ペプチド、および
（ｖ）任意選択で、前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子との間のリンカー、を含み、
前記プロモーターを持たない選択マーカーが、切断された核酸分子のＮ末端標識化のために前記レポーター遺伝子の５’末端で、または切断された核酸分子のＣ末端標識化のために前記レポーター遺伝子の３’末端で連結する、組換え抗体発現カセット。
〔６３〕細胞内の標的遺伝子座での調節タンパク質または調節複合体の活性を高める方法であって、
（１）前記標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、
（ｉ）調節部位を含む前記標的遺伝子座の第１のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および
（ｉｉ）前記標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤、を導入することと、
（２）前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤を前記第１のエンハンサー結合配列に結合させ、それにより細胞内の標的遺伝子座で前記第１の調節タンパク質または前記第１の調節複合体の活性を高めることと、を含む、方法。
〔６４〕前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入が含まれる、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６６〕前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤が第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６７〕（１）前記細胞に第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、
（２）前記第２のＤＮＡ結合調節増強剤が前記標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、をさらに含む、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６８〕前記第１のエンハンサー結合配列および前記第２のエンハンサー結合配列が、互いの１８０塩基対以内に位置する、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６９〕前記第１のエンハンサー結合配列および前記第２のエンハンサー結合配列が、前記モジュレーター結合配列の反対側に位置する、前記〔６４〕に記載の方法。
〔７０〕前記第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、前記〔６３〕に記載の方法。
〔７１〕前記ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、前記〔７０〕に記載の方法。
〔７２〕前記第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、前記〔６３〕に記載の方法。
〔７３〕前記第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、前記〔７２〕に記載の方法。
〔７４〕前記調節部位を含む前記標的遺伝子座の第２のモジュレーター結合配列に結合することができる、第２の調節タンパク質または第１の調節複合体を、前記細胞に導入することをさらに含む、前記〔６３〕に記載の方法。
〔７５〕前記第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、前記〔７４〕に記載の方法。
〔７６〕前記ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕前記第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、前記〔７６〕に記載の方法。
〔７８〕前記第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、前記〔７７〕に記載の方法。

Claims (78)

  1. 細胞内に存在する内因性核酸分子を改変する方法であって、ドナーＤＮＡ分子を細胞に導入することを含み、
    前記ドナーＤＮＡ分子は、前記内因性核酸分子が位置する前記細胞内の位置に前記ドナーＤＮＡ分子を局在させることができる１つ以上の細胞内標的化部分に作動可能に連結する、方法。
  2. 前記内因性核酸分子が位置する前記細胞内の位置が、核、ミトコンドリア、または葉緑体の中である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つ以上の細胞内標的部分が核局在化シグナルである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ドナーＤＮＡ分子が、約２５～約８，０００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ドナーＤＮＡ分子が一本鎖である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ドナーＤＮＡ分子が、１つ以上の末端の５０ヌクレオチド内に１つ以上のヌクレアーゼ耐性基を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ヌクレアーゼ耐性基が、ホスホロチオエート基、アミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ドナーＤＮＡが、二本鎖または部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ドナーＤＮＡ分子が、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ネガティブ選択マーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする核酸である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記細胞内に存在する標的遺伝子座との配列相補性の２つの領域を有する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記選択マーカーが、前記ドナーＤＮＡ分子の前記配列相補性の２つの領域の間に位置する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記細胞が、以下のうちの１つ以上と接触する、請求項１に記載の方法：
    （１）１つ以上の核酸切断エンティティ、
    （２）核酸切断エンティティの１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、
    （３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、
    （４）ＤＮＡ結合調節増強剤の１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、または
    （５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤。
  14. 前記１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤がＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記１つ以上の核酸切断エンティティのうちの１つ以上が、以下からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法：
    （１）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
    （２）ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、および
    （３）ＣＲＩＳＰＲ複合体。
  16. 前記１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの１つ以上が、以下からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法：
    （１）ジンクフィンガータンパク質、
    （２）ＴＡＬＥタンパク質、および
    （３）ＣＲＩＳＰＲ複合体。
  17. 前記ＴＡＬＥタンパク質が異種ヌクレアーゼドメインを有しない、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＣＲＩＳＰＲ複合体がｄＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤のうちの１つ以上が、標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内で結合するように設計される、請求項１３に記載の方法。
  20. 図４６のアミノ酸アミノ酸８１１～８３０を含むＴＡＬＥタンパク質であって、８１５～８１６位および８２４～８２５位のアミノ酸が、Ｇｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、ＴＡＬＥタンパク質。
  21. 図４６のアミノ酸アミノ酸８１０～１０２９を含み、１０２２～１０２３位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり得る、請求項２０に記載のＴＡＬＥタンパク質。
  22. 図４６のアミノ酸アミノ酸７５２～１０２１を含む、請求項２０に記載のＴＡＬＥタンパク質。
  23. 図４７のアミノ酸アミノ酸２０～２７、３０～１０７、および１１１～１６５を含み、２８～２９位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙであり、１０８～１１０位のアミノ酸がＡｒｇ－Ｇｌｙ－ＡｌａまたはＧｌｎ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒである、ＴＡＬＥタンパク質。
  24. 図４７のアミノ酸アミノ酸８２１～８２６および８２９～８４０を含み、８２７～８２８位のアミノ酸がＧｌｙ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｇｌｙである、ＴＡＬＥタンパク質。
  25. 図４７に対応するアミノ酸を含む、請求項２４に記載のＴＡＬＥタンパク質。
  26. ４～２５の反復単位を含む反復領域を含む、請求項２４に記載のＴＡＬＥタンパク質。
  27. 細胞内で細胞内核酸を操作するための方法であって、請求項２３に記載のＴＡＬＥタンパク質または請求項２３に記載のＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入することを含む、方法。
  28. ドナー核酸分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記ドナー核酸分子が、前記標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内に位置する核酸との配列相同性の１つ以上の領域を有する、請求項２７に記載の方法。
  29. ２つ以上の双節型核局在化シグナルを含むＣａｓ９タンパク質。
  30. 前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、１つ以上の末端の２０アミノ酸内に位置する、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質。
  31. 前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、前記タンパク質のＮ末端およびＣ末端の２０アミノ酸内に個々に位置する、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質。
  32. 前記２つ以上の双節型核局在化シグナルが、異なるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質。
  33. １つ以上の単節型核局在化シグナルをさらに含む、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質。
  34. 親和性標識をさらに含む、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質。
  35. 細胞内で細胞内核酸を操作する方法であって、請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質または請求項２９に記載のＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入することを含み、前記Ｃａｓ９タンパク質が前記細胞内の標的遺伝子座に結合するように設計される、方法。
  36. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、請求項３５に記載の方法。
  37. ドナー核酸分子を前記細胞に導入することをさらに含み、前記ドナー核酸分子が、前記標的遺伝子座の５０ヌクレオチド内に位置する核酸との配列相同性の１つ以上の領域を有する、請求項３５に記載の方法。
  38. 細胞集団内の切断部位における細胞内核酸分子の相同組換えのための方法であって、
    （ａ）前記切断部位で前記細胞内核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、
    （ｂ）前記切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることであって、前記ドナー核酸分子が、前記切断部位の各側の１００塩基対内に位置する核酸と相同性の少なくとも１０ヌクレオチドまたは塩基対の相同性を有する、接触させることと、を含み、
    前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも９５％が、前記切断部位で前記ドナー核酸分子との相同性指向修復を受ける、方法。
  39. 前記ドナー核酸分子が、相同性指向修復後に前記細胞内核酸分子に存在するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ドナー核酸分子は、前記ドナー核酸分子前記ドナー核酸分子が前記細胞集団の細胞の核に局在化することを可能にする１つ以上の核局在化シグナルに連結する、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記細胞集団が、以下のうちの１つ以上と接触する、請求項３８に記載の方法：
    （１）１つ以上の核酸切断エンティティ、
    （２）核酸切断エンティティの１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、
    （３）１つ以上のＤＮＡ結合調節増強剤、
    （４）ＤＮＡ結合調節増強剤の１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸分子、または
    （５）１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤。
  42. 前記ドナー核酸分子が一本鎖である、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記ドナーＤＮＡ分子が、１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結する、請求項３８に記載の方法。
  44. 前記細胞集団が、前記１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触し、続いて前記細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、請求項３８に記載の方法。
  45. 前記細胞集団が１つ以上の核酸切断エンティティまたは１つ以上の核酸切断エンティティをコードする１つ以上の核酸分子と接触した５～６０分後に、前記細胞集団が１つ以上のドナー核酸分子と接触する、請求項４４に記載の方法。
  46. 初期核酸分子における相同組換えのための方法であって、
    （ａ）前記初期核酸分子に二本鎖破断を生じさせて、切断された核酸分子を生成することと、
    （ｂ）前記切断された核酸分子をドナー核酸分子と接触させることと、を含み、
    前記初期核酸分子がプロモーターおよび遺伝子を含み、
    前記ドナー核酸分子が、（ｉ）長さが１２ｂｐ～２５０ｂｐの５’および３’末端の一致した末端、（ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子、（ｉｖ）前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子または前記プロモーターを持たない選択マーカーのいずれかの側のｌｏｘＰのいずれも連結する自己切断ペプチド、ならびに（ｉｖ）任意選択で、前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子との間のリンカーを含む、方法。
  47. 前記核酸分子の前記二本鎖破断が、（ｉ）前記切断された核酸分子のＮ末端標識化のための前記ＡＴＧ開始コドンから２５０ｂｐ以下であるか、または（ｉｉ）前記切断された核酸分子のＣ末端標識化のための前記停止コドンから２５０ｂｐ以下である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記二本鎖切断が１つ以上の核酸切断エンティティによって誘導される、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記少なくとも１つの核酸切断エンティティが、１つ以上のジンクフィンガータンパク質、１つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体、１つ以上のアルゴノート－核酸複合体、または１つ以上のマクロヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記少なくとも１つの核酸切断エンティティが、発現ベクター、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＣ）、またはｍＲＮＡを使用して投与される、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記プロモーターを持たない選択マーカーが、タンパク質、抗生物質耐性選択マーカー、細胞表面マーカー、細胞表面タンパク質、代謝産物、またはそれらの活性断片を含む、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記自己切断ペプチドが自己切断２Ａペプチドである、請求項４６に記載の方法。
  53. 前記一致した末端が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む、請求項４６に記載の方法。
  54. 前記ドナー核酸分子の５’および３’末端の前記一致した末端が、１２ｂｐ～２００ｂｐ、１２ｂｐ～１５０ｂｐ、１２ｂｐ～１００ｂｐ、１２ｂｐ～５０ｂｐ、または１２ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する、請求項４６に記載の方法。
  55. 前記ドナー核酸分子が、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、前記切断された核酸分子に組み込まれる、請求項４６に記載の方法。
  56. ５’末端、３’末端、または５’および３’末端で前記ドナー核酸分子を修飾することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  57. 前記ドナー核酸分子が５’および３’末端で修飾される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ドナー核酸分子が、１つ以上の末端の１つ以上の鎖中で１つ以上のヌクレアーゼ耐性基により修飾される、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記１つ以上のヌクレアーゼ耐性基が、１つ以上のホスホロチオエート基、１つ以上のアミン基、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ドナー核酸分子を１つ以上の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）阻害剤で処理することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  61. 請求項４６に記載の方法によって作製される核酸分子。
  62. 組換え抗体発現カセットであって、
    （ｉ）長さ２５０ｂｐ以下である、前記カセットの５’および３’末端にある一致した末端、
    （ｉｉ）プロモーターを持たない選択マーカー、
    （ｉｉｉ）レポーター遺伝子、
    （ｉｖ）前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子とを連結する自己切断ペプチド、および
    （ｖ）任意選択で、前記プロモーターを持たない選択マーカーと前記レポーター遺伝子との間のリンカー、を含み、
    前記プロモーターを持たない選択マーカーが、切断された核酸分子のＮ末端標識化のために前記レポーター遺伝子の５’末端で、または切断された核酸分子のＣ末端標識化のために前記レポーター遺伝子の３’末端で連結する、組換え抗体発現カセット。
  63. 細胞内の標的遺伝子座での調節タンパク質または調節複合体の活性を高める方法であって、
    （１）前記標的遺伝子座をコードする核酸を含む細胞に、
    （ｉ）調節部位を含む前記標的遺伝子座の第１のモジュレーター結合配列に結合することができる、第１の調節タンパク質または第１の調節複合体、および
    （ｉｉ）前記標的遺伝子座の第１のエンハンサー結合配列に結合することができる第１のＤＮＡ結合調節増強剤、を導入することと、
    （２）前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤を前記第１のエンハンサー結合配列に結合させ、それにより細胞内の標的遺伝子座で前記第１の調節タンパク質または前記第１の調節複合体の活性を高めることと、を含む、方法。
  64. 前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするベクターの導入が含まれる、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤の導入に、前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤をコードするｍＲＮＡの導入が含まれる、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記第１のＤＮＡ結合調節増強剤が第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである、請求項６３に記載の方法。
  67. （１）前記細胞に第２のＤＮＡ結合調節増強剤を導入することと、
    （２）前記第２のＤＮＡ結合調節増強剤が前記標的遺伝子座の第２のエンハンサー結合配列に結合することを可能にすることと、をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記第１のエンハンサー結合配列および前記第２のエンハンサー結合配列が、互いの１８０塩基対以内に位置する、請求項６４に記載の方法。
  69. 前記第１のエンハンサー結合配列および前記第２のエンハンサー結合配列が、前記モジュレーター結合配列の反対側に位置する、請求項６４に記載の方法。
  70. 前記第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、請求項６３に記載の方法。
  71. 前記ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、請求項６３に記載の方法。
  73. 前記第１の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記調節部位を含む前記標的遺伝子座の第２のモジュレーター結合配列に結合することができる、第２の調節タンパク質または第１の調節複合体を、前記細胞に導入することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  75. 前記第１の調節タンパク質がＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ融合タンパク質がＴＡＬＥ－ＦｏｋＩ融合タンパク質である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ複合体である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記第２の調節複合体が、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体である、請求項７７に記載の方法。
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