JP7109547B2 - 真核ゲノム修飾のための操作されたCas9システム - Google Patents
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Description
本願は、2018年2月15日に提出された米国仮出願番号62/631,304、および2018年8月21日に提出された米国仮出願番号62/720,525の利益を請求し、各記載をその全体において出典明示によりここに包含させる。
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体において出典明示によりここに包含させる。2019年2月12日に作成された該ASCIIコピーは、P18_023PCT_SL.txtと名付けられ370,305バイトサイズである。
本開示は、操作されたCas9システム、該システムをコードする核酸、およびゲノム修飾のための該システムを使用する方法に関する。
ゲノム編集ツールとしての細菌クラス2 クラスター化反復短回文配列リピート(CRISPR)およびCRISPR関連(Cas)CRISPR/Casシステムの最近の開発は、真核ゲノム修飾のための部位特異的エンドヌクレアーゼを操作する前例のない簡単さおよび単純さを提供している。しかしながら、各CRISPR/Casシステムは標的DNA結合のための特定のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とするため、各システムはあるゲノム部位に限定される。現在最も広く採用されている化膿連鎖球菌Cas9(SpyCas9)は、頻繁に発生するPAM(5’-NGG-3’)を標的化のために使用するが、真核のゲノム、とりわけ哺乳動物のゲノムおよび植物が、DNA配列において非常に複雑であり不均一であるため、このようなモチーフを欠いている多くのゲノム部位から未だ除外される。さらに、相同組み換え修復(HDR)または塩基エディター、例えばdCas9/シチジンデアミナーゼおよびdCas9/アデノシンデアミナーゼを使用する正確な遺伝子編集は、しばしば、最適な編集結果をなし遂げるために、単一の塩基対の分解能(resolution)でさえ、正確なDNA結合位置を必要とする。したがって、ゲノムのカバレッジ密度を増加させるために標的化のための新規なPAMを使用する新規なCRISPR/Casシステムを開発する必要性が存在する。
本開示の種々の局面の中には、操作されたCas9タンパク質および操作されたガイドRNAを含む操作されたCas9システムであって、各操作されたガイドRNAは、操作されたCas9タンパク質と複合体を形成するように設計され、操作されたガイドRNAは、二本鎖配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された5’ガイド配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対して5’であり、PAMは、表Aに列挙されている配列を有する、操作されたCas9システムを含む。
本開示は、標的DNA結合のために代替PAMを使用し、それによりゲノムのカバレッジ密度を増加させるオーソロガスCas9システムを提供する。例えば、これらの代替PAMのいくつかはAおよび/またはT残基を含み、他の代替PAMSはGCリッチである。そのため、これらの代替PAMを利用する操作されたCas9システムは、以前にアクセスできなかったゲノム遺伝子座の標的化ゲノム編集またはゲノム修飾を可能にする。
本開示の1つの局面は、操作されたCas9タンパク質および操作されたガイドRNAを含む操作されたCas9システムであって、各操作されたガイドRNAは、特定の操作されたCas9タンパク質と複合体を形成するように設計されている、操作されたCas9システムを提供する。各操作されたガイドRNAは、二本鎖配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された5’ガイド配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対して5’であり、PAMは、表Aに列挙されている配列を有する。これらの操作されたCas9システムは、天然に起こらない。
操作されたCas9タンパク質は、その野生型対応物と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。Cas9タンパク質は、種々の細菌に存在するタイプII CRISPRシステムにおける単一のエフェクタータンパク質である。本願明細書に記載されている操作されたCas9タンパク質は、アカリオクロリス(Acaryochloris)種、アセトハロビウム(Acetohalobium)種、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)種、アシドチオバシラス(Acidithiobacillus)種、アシドサーマス(Acidothermus)種、アッカーマンシア(Akkermansia)種、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)種、アロクロマチウム(Allochromatium)種、アモニフィックス(Ammonifex)種、アナベナ(Anabaena)種、アルトロスピラ(Arthrospira)種、バチルス(Bacillus)種、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)種、バークホルデリア(Burkholderiales)種、カルジセルロシルプター(Caldicelulosiruptor)種、カンピロバクター(Campylobacter)種、カンジダタス(Candidatus)種、クロストリジウム(Clostridium)種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種、クロコスフェラ(Crocosphaera)種、シアノテス(Cyanothece)種、エキシグオバクテリウム(Exiguobacterium)種、フィネゴルディア(Finegoldia)種、フランシセラ(Francisella)種、クテドノバクテル(Ktedonobacter)種、ラクノスピラ(Lachnospiraceae)種、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、リングビア(Lyngbya)種、マリノバクター(Marinobacter)種、メタノハロビウム(Methanohalobium)種、ミクロシラ(Microscilla)種、ミクロコレウス(Microcoleus)種、ミクロキスティス(Microcystis)種、マイコプラズマ(Mycoplasma)種、ナトラナエロビウス(Natranaerobius)種、ナイセリア(Neisseria)種、ニトラティフラクター(Nitratifractor)種、ニトロソコッカス(Nitrosococcus)種、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)種、ネンジュモ(Nodularia)種、ネンジュモ(Nostoc)種、オエノコッカス(Oenococcus)種、オスキラトリア(Oscillatoria)種、パラサテレラ(Parasutterella)種、ペロトマキュルム(Pelotomaculum)種、ペトロトーガ(Petrotoga)種、ポラロモナス(Polaromonas)種、プレボテーラ(Prevotella)種、シュードアルテロモナス(Pseudoalteromonas)種、ラルストニア(Ralstonia)種、スタフィロコッカス(Staphylococcus)種、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、ストレプトマイセス(Streptomyces)種、ストレプトスポランギウム(Streptosporangium)種、シネココッカス(Synechococcus)種、サーモシフォ(Thermosipho)種、ベルコミクロビア(Verrucomicrobia)種、およびウォリネラ(Wolinella)種に由来してよい。
Cas9タンパク質は、少なくとも1つの異種ドメインを含むように操作されてよい、すなわち、Cas9は、1つ以上の異種ドメインに融合される。2つ以上の異種ドメインがCas9と融合される状況において、2つ以上の異種ドメインは同じであってよく、またはそれらは異なっていてよい。1つ以上の異種ドメインは、N末端、C末端、内部位置、またはそれらの組合せに融合されてよい。融合は化学結合を介して直接的であってよく、または結合は1つ以上のリンカーを介して間接的であってよい。種々の態様において、異種ドメインは、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、マーカードメイン、クロマチン破壊ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン(例えば、シチジンデアミナーゼドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなど)、転写制御ドメイン、RNAアプタマー結合ドメイン、または非Cas9ヌクレアーゼドメインであってよい。
特定の態様において、操作されたCas9タンパク質は、バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、またはコリネバクテリウム・ジフテリアに由来し、少なくとも1つのNLSに連結される。いくつかの反復において、操作されたCas9タンパク質は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、または30と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%配列同一性を有してよい。1つの態様において、操作されたCas9タンパク質は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、または30と少なくとも約95%配列同一性を有してよい。他の反復において、操作されたCas9タンパク質は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、または30のアミノ酸配列を有する。
操作されたガイドRNAは、特定の操作されたCas9タンパク質と複合体を形成するように設計される。ガイドRNAは、(i)標的配列とハイブリダイズする5’末端でガイド配列を含むCRISPR RNA(crRNA)および(ii)Cas9タンパク質を動員するトランス作用crRNA(tracrRNA)配列を含む。各ガイドRNAのcrRNAガイド配列は、異なっている(すなわち、配列特異的である)。tracrRNA配列は、一般的に、特定の細菌種に由来するCas9タンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドRNAにおいて同じである。
上記詳細な操作されたCas9システムは、新規なPAM配列の上流に位置する二本鎖DNAにおける特定の配列を標的とする。操作されたCas9システムによって好ましいPAM配列は、縮重PAMSのライブラリーを使用してインビトロで同定され(実施例1および図1参照)、ゲノム編集実験後の配列決定により確認した(実施例2参照)。本願明細書に記載されている操作されたCas9システムのそれぞれについてのPAMは、以下の表Aに示されている。
* KはGまたはTであり;MはAまたはCであり;RはAまたはGであり;YはCまたはTであり;NはA、C、G、またはTである。
本開示のさらなる局面は、セクション(I)において上記の操作されたCas9システムをコードする核酸を提供する。システムは、単一の核酸または複数の核酸によってコードされてよい。核酸は、DNAまたはRNA、線状または環状、一本鎖または二本鎖であってよい。RNAまたはDNAは、興味ある真核細胞においてタンパク質への効率的な翻訳のために最適化されたコドンであってよい。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとしてまたは市販の供給源から利用できる。
本開示の別の局面は、セクション(I)において詳細に説明されている少なくとも1つの操作されたCas9システム、および/または、セクション(II)において詳細に説明されている操作されたCas9タンパク質および/または操作されたガイドRNAをコードする少なくとも1つの核酸を含む真核細胞を含む。
本開示のさらなる局面は、真核細胞における染色体配列を修飾するための方法を含む。一般的に、方法は、興味ある真核細胞に、セクション(I)において詳細に説明されている少なくとも1つの操作されたCas9システム、および/または、セクション(II)において詳細に説明されている該操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を導入することを含む。
上記のとおり、方法は、真核細胞に、少なくとも1つの操作されたCas9システムおよび/または該システムをコードする核酸(および所望のドナーポリヌクレオチド)を導入することを含む。少なくとも1つのシステムおよび/または核酸/ドナーポリヌクレオチドは、種々の手段により興味ある細胞に導入されてよい。
操作されたCas9タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む態様において、方法は、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含んでよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、および/またはRNAまたはDNAであってよい。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、プラスミドベクターであってよい。
種々の真核細胞は、本願明細書に記載されている方法における使用のために適当である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であってよい。いくつかの態様において、細胞は、1つの細胞胚であってよい。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類胚を含む。さらなる他の態様において、細胞は、幹細胞、例えば、胚幹細胞、ES様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などであってよい。1つの態様において、幹細胞は、ヒト胚幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その内容をここに包含されるWO2003/046141またはChung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)に記載されている技術によって作られるものを含んでよい。細胞は、インビトロで(すなわち、培養物において)、エキソビボで(すなわち、生物体から単離された組織内で)、またはインビボで(すなわち、生物体内で)あってよい。例示的な態様において、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞系である。特定の態様において、細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系である。
本願明細書に記載されている組成物および方法は、種々の治療、診断、産業、および研究用途において使用することができる。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および/または研究する、興味ある遺伝的またはエピジェネティック状態を研究する、または種々の疾患または障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物、または植物における興味ある染色体配列を修飾するために使用することができる。例えば、疾患または障害と関連する1つ以上の核酸配列の発現が改変されている疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物を、作成することができる。疾患モデルは、生物体における変異の効果を研究する、疾患の発症および/または進行を研究する、疾患における薬学的に活性な化合物の効果を研究する、および/または起こりうる遺伝子治療戦略の有効性を評価するために使用することができる。
他に定義されていない限り、本願明細書において使用される全ての専門および科学用語は、本願発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本願発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本願明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
以下の実施例は、本開示の特定の局面を説明する。
バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、およびコリネバクテリウム・ジフテリア由来のCas9オルソログは、ヒト細胞において発現のために最適化され、C末端にてSV40大型T抗原核局在化(NLS)でタグ化されたコドンであった(配列番号:1-30;以下の表6参照)。各オルソログの発現は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期エンハンサーおよびプロモーターによって駆動された。各オルソログのためのCRISPR RNA(crRNA)および推定トランス活性化crRNA(tracrRNA)を、単一のガイドRNA(sgRNA)を形成するように互いに結合させた(配列番号:31-45;以下の表6参照)。各sgRNAの発現は、ヒトU6プロモーターによって駆動された。インビトロで転写されたsgRNAは、インビトロ消化用のサプリメントとしてT7プロモータータグ付きPCR鋳型から調製された。
図1および表A(上記)に示されるとおり、小さなBsmCas9(1095aa)(配列番号:2)およびLrhCas9(配列番号:4)は、標的DNA結合のために、それぞれ5’-NNNNCAAA-3’PAMおよび5’-NGAAA-3’PAMを使用する。これらの新規なPAMの使用は、ATリッチゲノム部位を標的とする手段を提供する。遺伝子編集を実証するために、ヒトK562細胞(1x106)に5μgのCas9をコードするプラスミドDNAおよび3μgのsgRNA発現プラスミドDNAをヌクレオフェクトした。標的化ゲノム部位は、ヒトチロシン-タンパク質ホスファターゼ非受容体型2(PTN2)遺伝子座、ヒトの空のスピラクル(spiracles)ホメオボックス1(EMX1)遺伝子座、ヒトプログラム細胞死1リガンド1(PD1L1)遺伝子座、ヒトAAVS1セーフハーバー遺伝子座、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座、およびヒト核受容体サブファミリー1グループIメンバー3(CAR)遺伝子座を含む。ゲノムDNAをトランスフェクションの3日後にDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を使用して調製し、標的化ゲノム領域をそれぞれPCR増幅した(JumpStart TaqTM ReadyMixTM)。PCRプライマーは、表1に列挙される。
パラサテレラ・エクスクレメンティホミニスCas9(PexCas9-NLS)(配列番号:6)を、TGSGリンカー(配列番号:109)を使用してN末端でヒトHMGN1ペプチド(配列番号:72)とおよびLEGGGSリンカー(配列番号:108)を使用してC末端でヒトHMGB1ボックスAペプチド(PexCas9-HN1HB1融合物;配列番号:117)またはヒトヒストンH1中央球状ドメインペプチド(PexCas9-HN1H1G;配列番号:118)のいずれかとの融合によって修飾した。
*PAMの決定因子ヌクレオチドは下線を引かれている。
McaCas9の野生型crRNAコード配列は、リピート領域における4つの連続したチミジン残基を含み、crRNAおよびtracrRNAが共にsgRNAを形成するように結合されるとき、4つのチミジン残基のうち3つが推定tracrRNA配列において3つのアデノシン残基と対を形成することが予期される。ヒトRNAポリメラーゼ(Pol)IIIは、転写終結シグナルとしてコードRNA鎖上に4つ以上の連続したチミジン残基を使用することが知られている。ヒト細胞においてMcaCas9 sgRNAの早期の転写終結を防止するため、TからCへの変異および対応するAからGへの変異が、以下の配列を有する修飾されたsgRNAスカフォールドを形成するように、sgRNAスカフォールドに導入された:5’-GUUCUAGUGUUGUACAAUAUUUGGGUGAAAACCCAAAUAUUGUACAUCCUAGAUCAAGGCGCUUAAUUGCUGCCGUAAUUGCUGAAAGCGUAGCUUUCAGUUUUUUU-3’(配列番号:76)、ここで、変異されたヌクレオチドは下線を引かれている。この修飾はまた、sgRNAスカフォールド熱力学的安定性を増加させることが予期された。
*PAMの決定因子ヌクレオチドは下線を引かれている。
McaCas9-NLS、BsmCas9-NLS、およびLrhCas9-NLSタンパク質を、アミノ末端でHMGN1(HN1)およびカルボキシル末端でHMGB1ボックスA(HB1)またはヒストンH1中央球状モチーフ(H1G)のいずれかと連結して、McaCas9-HN1HB1(配列番号:123)、McaCas9-HN1H1G(配列番号:124)、BsmCas9-HN1HB1(配列番号:119)、Bsm-HN1H1G(配列番号:120)、Lrh-HN1HB1(配列番号:121)、LrhCas9-HN1H1G(配列番号:122)を産生することによって、さらなるCas9-CMM融合タンパク質を調製した。実施例3において上記説明されたこれらの融合物およびPexCas9-CMM融合物のヌクレアーゼ活性を、実施例2および3において本質的に上記説明された対応する操作されたCas9タンパク質の活性と比較した。表6は、各Cas9ヌクレアーゼに対する特定の遺伝子座における標的部位(すなわち、下線が引かれた決定的なヌクレオチドを有する太字で示される、プロトスペーサー+PAM)を示す。
Cas9-CMM融合物のオフターゲット活性を評価するために、それぞれの標的部位についての1から5個のトップランクの可能性のあるオフターゲット部位をSurveyor Nucleaseアッセイを使用して分析した。実施例5に上記説明されたCas9およびCas9-CMM融合データに加えて、化膿連鎖球菌Cas9(SpyCas9)、SpyCas9-CMM融合物、ストレプトコッカス・パステウリアヌス(Streptococcus pasteurianus)Cas9(SpaCas9)、Spa-CMM融合物、カンピロバクター・ジェジュニCas9(CjeCas9)、およびCjeCas9-SMM融合物からのデータもまた分析した。アッセイされた合計64の可能性のあるオフターゲット部位から、オフターゲット切断が試験された計21のガイド配列のうちの9のガイド配列によって寄与される11部位にて検出された。11のオフターゲット部位において、オフターゲット切断がコントロールSpyCas9において検出されなかったPOR Spy 1-OT1部位を除いて、コントロールCas9および融合ヌクレアーゼが同時に存在した。概して、融合ヌクレアーゼおよびコントロールCas9間の有意な差異はなかった(図3)。例えば、全11のオフターゲット部位にわたって、HN1H1G融合組合せは平均8.0±6.0%インデルであり、コントロールCas9は平均7.5±5.1%インデルであった。同様に、HN1HB1融合組合せに関連する10のオフターゲット部位にわたって、融合組合せおよびコントロールCas9(6.9±5.7% 対 6.5±5.4%インデル)間の有意な差異はなかった。総合すれば、これらの結果は、HN1H1BおよびHN1H1G融合組合せによるオンターゲット活性増強は、一般的に、オフターゲット活性における増加をもたらさないことを示す。
Claims (40)
- (a)操作されたバチルス・スミスイ(Bacillus smithii)Cas9タンパク質および(b)操作されたガイドRNAを含む真核細胞における染色体配列を修飾するためのシステムであって、操作されたガイドRNAは、操作されたCas9タンパク質と複合体を形成するように設計され、操作されたガイドRNAは、真核細胞の染色体配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された5’ガイド配列を含み、真核細胞の染色体配列における標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対して5’であり、PAMは、配列5’-NNNNCAAA-3’(NはA、C、G、またはTである)を含む、システム。
- 操作されたCas9タンパク質が、その野生型対応物と比較して少なくとも1つの修飾を含む、請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも1つの修飾が、少なくとも1つの異種ドメインの付加を含む、請求項2に記載のシステム。
- 少なくとも1つの異種ドメインが、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、マーカードメイン、クロマチン調節モチーフ、エピジェネティック修飾ドメイン、転写制御ドメイン、RNAアプタマー結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項2または3に記載のシステム。
- 少なくとも1つの修飾が、1つ以上のアミノ酸の置換、1つ以上のアミノ酸の挿入、1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組合せを含む、請求項2に記載のシステム。
- 少なくとも1つの修飾が、RuvCドメイン、HNHドメイン、RECドメイン、PAM相互作用ドメイン、またはそれらの組合せ内にある、請求項5に記載のシステム。
- 操作されたCas9タンパク質が、ヌクレアーゼであり二本鎖配列の両方の鎖を切断するか、ニッカーゼであり二本鎖配列の一本鎖を切断するか、または、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有さない、請求項1から6のいずれかに記載のシステム。
- 操作されたガイドRNAが、単一の分子である、請求項1から7のいずれかに記載のシステム。
- 操作されたガイドRNA配列が、操作されたガイドRNA内で塩基対形成を容易にするように最適化される、操作されたガイドRNA内で塩基対形成を最小限にする、操作されたガイドRNAの安定性を増加させる、真核細胞において操作されたガイドRNAの転写を容易にする、またはそれらの組合せである、請求項1から8のいずれかに記載のシステム。
- 操作されたCas9タンパク質が、配列番号:2、119、または120に示されているアミノ酸配列を有する、請求項1から9のいずれかに記載のシステム。
- 複数の核酸が、操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸、および操作されたガイドRNAをコードする少なくとも1つの核酸を含む、請求項1から10のいずれかに記載のシステムをコードする複数の核酸。
- 操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸がRNAである、請求項11に記載の複数の核酸。
- 操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸がDNAである、請求項11に記載の複数の核酸。
- 操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項11から13のいずれかに記載の複数の核酸。
- 真核細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項14に記載の複数の核酸。
- 操作されたガイドRNAをコードする少なくとも1つの核酸がDNAである、請求項11に記載の複数の核酸。
- 操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸が、インビトロRNA合成または細菌細胞におけるタンパク質発現のためのファージプロモーター配列に作動可能に連結しており、操作されたガイドRNAをコードする少なくとも1つの核酸が、インビトロRNA合成のためのファージプロモーター配列に作動可能に連結している、請求項11から16のいずれかに記載の複数の核酸。
- 操作されたCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸が、真核細胞における発現のための真核プロモーター配列に作動可能に連結しており、操作されたガイドRNAをコードする少なくとも1つの核酸が、真核細胞における発現のための真核プロモーター配列に作動可能に連結している、請求項11から16のいずれかに記載の複数の核酸。
- 請求項11から18のいずれかに記載の複数の核酸を含む、少なくとも1つのベクター。
- ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または自己複製ウイルスRNAレプリコンから選択される、請求項19に記載の少なくとも1つのベクター。
- 請求項1から10のいずれかに定義された操作されたCas9タンパク質および操作されたガイドRNAを含む少なくとも1つのシステム、請求項11から18のいずれかに定義された複数の核酸、または請求項19または20に定義された少なくとも1つのベクター、を含むヒトの胚細胞を除くインビトロでの真核細胞。
- ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、植物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項21に記載の真核細胞。
- 真核細胞に、請求項1から10のいずれかに定義された操作されたCas9タンパク質および操作されたガイドRNAを含む少なくとも1つのシステム、請求項11から18のいずれかに定義された複数の核酸、または請求項19または20に定義された少なくとも1つのベクター、および所望により、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを導入することを含む、ヒトの胚細胞を除く真核細胞における染色体配列を修飾するためのインビトロでの方法であって、少なくとも1つの操作されたガイドRNAは、染色体配列の修飾が起こるように染色体配列における標的部位に少なくとも1つの操作されたCas9タンパク質をガイドする、インビトロでの方法。
- 修飾が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの変換、少なくとも1つのヌクレオチドの修飾、少なくとも関連したヒストンタンパク質の修飾、またはそれらの組合せを含む、請求項23に記載のインビトロでの方法。
- 操作されたCas9タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有し、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入されず、修飾が少なくとも1つのインデルを含む、請求項23または24に記載のインビトロでの方法。
- 修飾が染色体配列の不活性化を含む、請求項25に記載のインビトロでの方法。
- 操作されたCas9タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有し、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入され、修飾が染色体配列における少なくとも1つのヌクレオチドの変化を含む、請求項23または24に記載のインビトロでの方法。
- 少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドが、染色体配列における標的部位付近の配列と比較して少なくとも1つのヌクレオチド変化を有するドナー配列である、請求項27に記載のインビトロでの方法。
- 少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドが、外因性配列に対応するドナー配列を含む、請求項27に記載のインビトロでの方法。
- ドナー配列が、染色体配列における標的部位の上流および下流に位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する配列に隣接している、請求項28または29に記載のインビトロでの方法。
- ドナー配列が、少なくとも1つの操作されたCas9タンパク質により生成されるオーバーハングと適合性のある短いオーバーハングに隣接している、請求項28または29に記載のインビトロでの方法。
- 真核細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、植物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項23から31のいずれかに記載のインビトロでの方法。
- 少なくとも1つのクロマチン調節モチーフに連結したCas9タンパク質を含む融合タンパク質であって、Cas9タンパク質は、バチルス・スミスイのCas9タンパク質である、融合タンパク質。
- 少なくとも1つのクロマチン調節モチーフが、高移動度グループ(HMG)ボックス(HMGB)DNA結合ドメイン、HMGヌクレオソーム結合(HMGN)タンパク質、ヒストンH1変異体に由来する中央球状ドメイン、クロマチンリモデリング複合体タンパク質に由来するDNA結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項33に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つのクロマチン調節モチーフが、HMGB1ボックスAドメイン、HMGN1タンパク質、HMGN2タンパク質、HMGN3aタンパク質、HMGN3bタンパク質、ヒストンH1中央球状ドメイン、模倣スイッチ(ISWI)タンパク質DNA結合ドメイン、クロモドメイン-ヘリカーゼ-DNAタンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項33または34に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つのクロマチン調節モチーフが、Cas9タンパク質に、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組合せで連結している、請求項33から35のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つのクロマチン調節モチーフが、Cas9タンパク質に、そのN-末端、C-末端、内部位置、またはそれらの組合せで連結している、請求項33から36のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項33から37のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つの、少なくとも1つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも1つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項33から38のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、配列番号:119または120に示されているアミノ酸配列を有する、請求項33から39のいずれかに記載の融合タンパク質。
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