BR122021008308B1 - Sistemas de componente crispr-cas, métodos e composições para manipulação de sequência - Google Patents

Sistemas de componente crispr-cas, métodos e composições para manipulação de sequência Download PDF

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Le Cong
David Benjamin Turitz Cox
Patrick Hsu
Wenyan Jiang
Shuailiang LIN
Luciano MARRAFFINI
Randall Jeffrey Platt
Fei RAN
Neville Espi Sanjana
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Abstract

A invenção provê sistemas, métodos, e composições para manipulação de sequências e/ou atividades de sequências alvo. São também providos vetores e sistemas de vetores, alguns dos quais codificam um ou mais componentes de um complexo CRISPR, bem como métodos para o desenho e uso desses vetores. São também proporcionados métodos de dirigir a formação do complexo CRISPR em células eucarióticas e métodos para selecionar células específicas através da introdução de mutações precisas utilizando o sistema CRISPR/Cas.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS E INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0001] Este pedido reivindica prioridade sobre os pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/736,527, 61/748,427, 61/768,959, 61/791,409 e 61/835,931 tendo referência Broad BI-2011/008/WSGR N° de Registro do Procurador 44063-701.101, BI-2011/008/WSGR N° de Registro do Procurador 44063-701.102, referência Broad BI-2011/008/VP N° de Registro do Procurador 44790.01.2003, BI-2011/008/VP N° de Registro do Procurador 44790.02.2003 e BI-2011/008/VP N° de Registro do Procurador 44790.03.2003, respectivamente, todos intitulados SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUÊNCIA depositados a 12 de dezembro, 2012, 2 de janeiro, 2013, 25 de fevereiro, 2013, 15 de março, 2013 e 17 de junho, 2013, respectivamente.
[0002] É feit a referência aos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/758,468; 61/769,046; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 e 61/828,130, cada um intitulado MANIPULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUÊNCIA, depositados a 30 de janeiro, 2013; 25 de fevereiro, 2013; 15 de março, 2013; 28 de março, 2013; 20 de abril, 2013; 6 de maio, 2013 e 28 de maio, 2013, respectivamente. É feita também referência aos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080, 61/836,123 e 61/835,973 cada um depositado a 17 de junho, 2013. É feita também referência ao pedido de patente provisória dos EUA 61/842,322 e pedido de patente dos EUA 14/054,414, tendo cada um referência Broad BI-2011/008A, intitulados SISTEMAS CRISPR- CAS E MÉTODOS PARA ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PRODUTOS DE GENES depositados a 2 de julho, 2013 e 15 de outubro, 2013, respectivamente.
[0003] Os pedidos anteriores, e todos os documentos neles citados ou durante a sua execução ("documentos citados em apln") e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados em apln, e todos os documentos citados ou referenciados aqui ("documentos citados aqui"), e todos os documentos citados ou referenciados em documentos citados aqui, em conjunto com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto, e folhas de produtos para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado por referência aqui, são deste modo incorporados aqui por referência, e podem ser empregues na prática da invenção. Mais especificamente, todos os documentos referenciados são incorporados por referência na mesma extensão como se cada documento individual fosse específica e individualmente indicado como estando incorporado por referência.
ÁREA DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção se relaciona geralmente com sistemas, métodos e composições usados para o controle da expressão de genes envolvendo direcionamento de sequência, tais como perturbação do genoma ou edição de genes, que podem usar sistemas vetores relacionados com Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e seus componentes.
DECLARAÇÃO SOBRE INVESTIGAÇÃO FEDERALMENTE PATROCINADA
[0005] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob NIH Pioneer Award DP1MH10070, galardoado pelos National Institutes of Health. O governo detém certos direitos na invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0006] Avanços recentes em técnicas de sequenciação e métodos de análise do genoma aceleraram significativamente a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados a uma diversa gama de funções biológicas e doenças. Tecnologias de direcionamento do genoma precisas são necessárias para permitir manipulação reversa sistemática de variações genéticas causais permitindo perturbação seletiva de elementos genéticos individuais, bem como para promover aplicações em biologia sintética, biotecnológicas e médicas. Embora técnicas de edição do genoma tais como configuração de dedos de zinco, efetores do tipo ativadores da transcrição (TALEs), ou meganucleases migrantes estejam disponíveis para produção de perturbações do genoma dirigidas continua a existir uma necessidade de novas tecnologias de manipulação do genoma que sejam acessíveis, fáceis de configurar, escalonáveis, e passíveis de direcionamento a múltiplas posições dentro do genoma eucariótico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] Existe uma necessidade premente de sistemas e técnicas alternativos e robustos para direcionamento de sequências com uma ampla matriz de aplicações. Esta invenção atende a esta necessidade e provê vantagens relacionadas. O sistema CRISPR/Cas ou CRISPR-Cas (ambos os termos são usados indistintamente ao longo deste pedido) não requer a geração de proteínas customizadas para se dirigirem a sequências específicas, mas ao invés uma única enzima Cas pode ser programada por uma curta molécula de RNA para reconhecer um alvo de DNA específico, por outras palavras, a enzima Cas pode ser recrutada para um alvo de DNA específico usando a referida curta molécula de RNA. A adição do sistema CRISPR- Cas ao repertório de técnicas de sequenciação e métodos de análise do genoma pode simplificar significativamente a metodologia e acelerar a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados a uma diversa gama de funções biológicas e doenças. Para utilizar eficazmente o sistema CRISPR-Cas para edição do genoma sem efeitos prejudiciais é crítico entender aspectos de manipulação e otimização destas ferramentas de manipulação do genoma, que são aspectos da invenção reivindicada.
[0008] Em um aspecto, a invenção provê um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores. Em algumas formas de realização, o sistema compreende: (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma ou mais sequências guias a montante da sequência tracr mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr; e (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear; em que os componentes (a) e (b) estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente a sequência tracr a jusante da sequência tracr mate sob o controle do primeiro elemento regulador. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o sistema compreende a sequência tracr sob o controle de um terceiro elemento regulador, tal como um promotor de polimerase III. Em algumas formas de realização, a sequência tracr exibe pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr mate quando alinhada otimamente. A determinação do alinhamento ótimo está dentro do alcance de um com perícia na técnica. Por exemplo existem algoritmos e programas de alinhamento pública e comercialmente disponíveis tais como, mas não limitados a, ClustalW, SmithWaterman em matlab, Bowtie, Geneious, Biopython e SeqMan. Em algumas formas de realização, o complexo CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação do referido complexo CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Sem desejar estar limitado pela teoria se acredita que uma sequência de localização nuclear não é necessária para atividade do complexo CRISPR em eucariotas, mas que a inclusão de tais sequências intensifica a atividade do sistema, especialmente no que diz respeito ao direcionamento de moléculas de ácido nucleico no núcleo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes, ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. A enzima pode ser um homólogo ou ortólogo de Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. Em algumas formas de realização, o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. Em algumas formas de realização, o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. Em algumas formas de realização, a sequência guia tem pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotídeos, ou entre 10-30, ou entre 15-25, ou entre 15-20 nucleotídeos de comprimento. Em geral, e ao longo esta especificação, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Os vetores incluem, mas não estão limitados a, moléculas de ácido nucleico que são de fita única, fita dupla, ou parcialmente de fita dupla; moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma ou mais extremidades livres, nenhumas extremidades livres (p.ex., circulares); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA, ou ambos; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidas na técnica. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alsa de DNA de fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos, como por técnicas de clonagem molecular padrão. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que as sequências de DNA ou RNA viralmente derivadas estão presentes no vetor para empacotamento em um vírus (p.ex., retrovírus, retrovírus com replicação defeituosa, adenovírus, adenovírus com replicação defeituosa, e vírus adenoassociados). Os vetores virais incluem polinucleotídeos transportados por um vírus para transfecção em uma célula hospedeira. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (p.ex., vetores de mamíferos não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e são deste modo replicados em conjunto com o genoma do hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos.
[0009] Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operacionalmente ligado" se destina a significar que a sequência de nucleotídeos de interesse é ligada ao(s) elemento(s) regulador(es) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (p.ex., em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira).
[0010] O termo "elemento regulador" se destina a incluir promotores, intensificadores, locais internos de entrada do ribossomo (IRES), e outros elementos de controle de expressão (p.ex., sinais de terminação da transcrição, tais como sinais de poliadenilação e sequências de poli-U). Tais elementos reguladores são descritos, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Os elementos reguladores incluem aqueles que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeira e aqueles que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (p.ex., sequências reguladoras específicas de tecido). Um promotor específico de tecido pode dirigir a expressão principalmente em um tecido desejado de interesse, tal como músculo, neurônio, osso, pele, sangue, órgãos específicos (p.ex., fígado, pâncreas), ou tipos de células particulares (p.ex., linfócitos) . Os elementos reguladores podem também dirigir a expressão em uma forma dependente do tempo, tal como em uma forma dependente do ciclo celular ou dependente da etapa de desenvolvimento, que pode ou não ser também específica de tecido ou tipo de célula. Em algumas formas de realização, um vetor compreende um ou mais promotores de pol III (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores de pol III), um ou mais promotores de pol II (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores de pol II), um ou mais promotores de pol I (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores de pol I), ou suas combinações. Exemplos de promotores de pol III incluem, mas não estão limitados a, promotores U6 e H1. Exemplos de promotores de pol II incluem o, mas não estão limitados ao, promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador RSV), o promotor de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [ver, p.ex., Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor da diidrofolato reductase, o promotor de β- actina, o promotor de fosfoglicerol cinase (PGK) e o promotor de EF1α. Também englobados pelo termo "elemento regulador" estão elementos intensificadores, tais como WPRE; intensificadores de CMV; o segmento R-U5' em LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); intensificador de SV40; e a sequência de íntron entre os éxons 2 e 3 da β-globina de coelho (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981). Será apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão desejado, etc. Um vetor pode ser introduzido em células hospedeiras para deste modo produzir transcritos, proteínas, ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como descrito aqui (p.ex., transcritos de repetições curtas palindrômicas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), proteínas, enzimas, suas formas mutantes, suas proteínas de fusão, etc.).
[0011] Vetores vantajosos incluem lentivírus e vírus adenoassociados, e tipos de tais vetores podem ser também selecionados para direcionamento de tipos particulares de células.
[0012] Em um aspecto, a invenção provê um vetor compreendendo um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear. Em algumas formas de realização, o referido elemento regulador conduz a transcrição da enzima CRISPR em uma célula eucariótica tal que a referida enzima CRISPR se acumule em uma quantidade detectável no núcleo da célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o elemento regulador é um promotor de polimerase II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA.
[0013] Em um aspecto, a invenção provê uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. A enzima pode ser um homólogo ou ortólogo de Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem a capacidade de clivar uma ou mais fitas de uma sequência alvo à qual se liga.
[0014] Em um aspecto, a invenção provê uma célula hospedeira eucariótica compreendendo (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma ou mais sequências guias a montante da sequência tracr mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr; e/ou (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira compreende os componentes (a) e (b) . Em algumas formas de realização, o componente (a) , o componente (b) , ou os componentes (a) e (b) são estavelmente integrados em um genoma da célula eucariótica hospedeira. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente a sequência tracr a jusante da sequência tracr mate sob o controle do primeiro elemento regulador. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira eucariótica compreende adicionalmente um terceiro elemento regulador, tal como um promotor de polimerase III, operacionalmente ligado à referida sequência tracr. Em algumas formas de realização, a sequência tracr exibe pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr mate quando alinhada otimamente. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. A enzima pode ser um homólogo ou ortólogo de Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. Em algumas formas de realização, o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. Em algumas formas de realização, o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. Em algumas formas de realização, a sequência guia tem pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotídeos, ou entre 10-30, ou entre 15-25, ou entre 15-20 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, a invenção provê um organismo eucariótico não humano; preferencialmente um organismo eucariótico multicelular, compreendendo uma célula hospedeira eucariótica de acordo com qualquer uma das formas de realização descritas. Em outros aspectos, a invenção provê um organismo eucariótico; preferencialmente um organismo eucariótico multicelular, compreendendo uma célula hospedeira eucariótica de acordo com qualquer uma das formas de realização descritas. O organismo em algumas formas de realização destes aspectos pode ser um animal; por exemplo um mamífero. Igualmente, o organismo pode ser um artrópode tal como um inseto. O organismo pode ser também uma planta. Adicionalmente, o organismo pode ser um fungo.
[0015] Em um aspecto, a invenção provê um kit compreendendo um ou mais dos componentes descritos aqui. Em algumas formas de realização, o kit compreende um sistema vetor e instruções para se utilizar o kit. Em algumas formas de realização, o sistema vetor compreende (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma ou mais sequências guias a montante da sequência tracr mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr; e/ou (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear. Em algumas formas de realização, o kit compreende os componentes (a) e (b) localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente a sequência tracr a jusante da sequência tracr mate sob o controle do primeiro elemento regulador. Em algumas formas de realização, o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o sistema compreende adicionalmente um terceiro elemento regulador, tal como um promotor de polimerase III, operacionalmente ligado à referida sequência tracr. Em algumas formas de realização, a sequência tracr exibe pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr mate quando alinhada otimamente. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. A enzima pode ser um homólogo ou ortólogo de Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. Em algumas formas de realização, o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. Em algumas formas de realização, o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. Em algumas formas de realização, a sequência guia tem pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotídeos, ou entre 10-30, ou entre 15-25, ou entre 15-20 nucleotídeos de comprimento.
[0016] Em um aspecto, a invenção provê um método de modificar um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando deste modo o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr. Em algumas formas de realização, a referida clivagem compreende clivagem de uma ou duas fitas na localização da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. Em algumas formas de realização, a referida clivagem resulta em transcrição diminuída de um gene alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção, ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. Em algumas formas de realização, a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma proteína expressa a partir de um gene compreendendo a sequência alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente distribuir um ou mais vetores à referida célula eucariótica, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada à sequência tracr mate, e a sequência tracr. Em algumas formas de realização, os referidos vetores são distribuídos à célula eucariótica em um indivíduo. Em algumas formas de realização, a referida modificação tem lugar na referida célula eucariótica em uma cultura de células. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente isolar a referida célula eucariótica de um indivíduo antes da referida modificação. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente retornar a referida célula eucariótica e/ou as células daí derivadas ao referido indivíduo.
[0017] Em um aspecto, a invenção provê um método de modificar a expressão de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo tal que a referida ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do referido polinucleotídeo; em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente distribuir um ou mais vetores às referidas células eucarióticas, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada à sequência tracr mate, e a sequência tracr.
[0018] Em um aspecto, a invenção provê um método de gerar uma célula eucariótica modelo compreendendo um gene de doença mutado. Em algumas formas de realização, um gene de doença é qualquer gene associado a um aumento no risco de ter ou desenvolver uma doença. Em algumas formas de realização, o método compreende (a) introduzir um ou mais vetores em uma célula eucariótica, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr; e (b) permitir que um complexo CRISPR se ligue a um polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do polinucleotídeo alvo dentro do referido gene de doença, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo dentro do polinucleotídeo alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr, gerando deste modo uma célula eucariótica modelo compreendendo um gene de doença mutado. Em algumas formas de realização, a referida clivagem compreende clivagem de uma ou duas fitas na localização da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. Em algumas formas de realização, a referida clivagem resulta em transcrição diminuída de um gene alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção, ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. Em algumas formas de realização, a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma expressão de proteína de um gene compreendendo a sequência alvo.
[0019] Em um aspecto, a invenção provê um método para desenvolver um agente biologicamente ativo que modula um evento de sinalização celular associado a um gene de doença. Em algumas formas de realização, um gene de doença é qualquer gene associado a um aumento no risco de ter ou desenvolver uma doença. Em algumas formas de realização, o método compreende (a) contatar um composto de teste com uma célula modelo de qualquer uma das formas de realização descritas; e (b) detectar uma mudança em uma leitura que é indicativa de uma redução ou um aumento de um evento de sinalização celular associado à referida mutação no referido gene de doença, se desenvolvendo deste modo o referido agente biologicamente ativo que modula o referido evento de sinalização celular associado ao referido gene de doença.
[0020] Em um aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma sequência guia a montante de uma sequência tracr mate, em que a sequência guia, quando expressa, dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo correspondente presente em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a sequência alvo é uma sequência viral presente em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a sequência alvo é um protooncogene ou um oncogene.
[0021] Em um aspecto, a invenção provê um método de selecionar uma ou mais célula(s) procariótica(s) por introdução de uma ou mais mutações em um gene na uma ou mais célula(s) procariótica(s), compreendendo o método: introduzir um ou mais vetores na célula(s) procariótica(s), em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, uma sequência tracr, e um modelo de edição; em que o modelo de edição compreende a uma ou mais mutações que eliminam a clivagem pela enzima CRISPR; permitindo a recombinação homóloga do modelo de edição com o polinucleotídeo alvo na(s) célula(s) a serem selecionadas; permitindo que um complexo CRISPR se ligue a um polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do polinucleotídeo alvo dentro do referido gene, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo no polinucleotídeo alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr, em que a ligação do complexo CRISPR ao polinucleotídeo alvo induz morte celular, permitindo deste modo que uma ou mais célula(s) procariótica(s) nas quais uma ou mais mutações tenham sido introduzidas sejam selecionadas. Em uma forma de realização preferencial, a enzima CRISPR é Cas9. Em outro aspecto da invenção, a célula a ser selecionada pode ser uma célula eucariótica. Aspectos da invenção permitem a seleção de células específicas sem requerer um marcador de seleção ou um processo de dois passos que pode incluir um sistema de contrasseleção.
[0022] Conformemente é um objetivo da invenção não englobar dentro da invenção qualquer produto, processo de fabricação do produto, ou método de uso do produto previamente conhecido tal que os Requerentes reservem o direito e divulguem deste modo uma isenção de responsabilidade de qualquer produto, processo, ou método previamente conhecido. É adicionalmente notado que a invenção não se destina a englobar dentro do escopo da invenção qualquer produto, processo, ou fabricação do produto ou método de uso do produto, que não satisfaça a descrição escrita e requisitos de capacitação do USPTO (35 U.S.C. §112, primeiro parágrafo) ou do EPO (Artigo 83 do EPC), tal que os Requerentes reservem o direito e divulguem deste modo uma isenção de responsabilidade de qualquer produto, processo de fabricação do produto, ou método de uso do produto previamente descrito.
[0023] É notado que, em esta descrição e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos tais como “compreende”, “compreendido”, “compreendendo” e similares podem ter o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos E.U.A.; p.ex., podem significar “inclui”, “incluído”, “incluindo”, e similares; e que termos tais como “consistindo essencialmente em” e “consiste essencialmente em” têm o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos E.U.A., p.ex., permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica prévia ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção. Estas e outras formas de realização são divulgadas ou são óbvias a partir da, e englobadas pela, seguinte Descrição Detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] As características novas da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta formas de realização ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos acompanhantes dos quais:
[0025] A Figura 1 mostra um modelo esquemático do sistema CRISPR. A nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarelo) é dirigida a DNA genômico por um RNA guia sintético (sgRNA) consistindo em uma sequência guia de 20 nt (azul) e um molde (vermelho). A sequência guia emparelha em termos de bases com o DNA alvo (azul) , diretamente a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador 5’-NGG requerido (PAM; magenta), e a Cas9 medeia uma quebra de fita dupla (DSB) ~3 pb a montante do PAM (triângulo vermelho).
[0026] As Figuras 2A-F mostram um sistema CRISPR exemplar, um possível mecanismo de ação, uma adaptação exemplar para expressão em células eucarióticas, e resultados de testes avaliando a localização nuclear e atividade de CRISPR.
[0027] A Figura 3 mostra um cassete de expressão exemplar para expressão de elementos do sistema CRISPR em células eucarióticas, estruturas previstas de sequências guia exemplares, e atividade do sistema CRISPR como medida em células eucarióticas e procarióticas.
[0028] As Figuras 4A-D mostram os resultados de uma avaliação de especificidade de SpCas9 para um alvo exemplar.
[0029] As Figuras 5A-G mostram um sistema vetor exemplar e resultados para seu uso no direcionamento de recombinação homóloga em células eucarióticas.
[0030] A Figura 6 provê uma tabela de sequências protoespaçadoras e resume os resultados da eficácia de modificação para alvos protoespaçadores desenhados com base em sistemas CRISPR de S. pyogenes e S. thermophilus exemplares com PAMs correspondentes contra locais em genomas de humano e de camundongo. As células foram transfectadas com Cas9 e ou pré-crRNA/tracrRNA ou RNA quimérico, e analisadas 72 horas após transfecção. As indels em percentagem são calculadas com base nos resultados do ensaio de Surveyor das linhas celulares indicadas (N=3 para todos os alvos protoespaçadores, os erros são S.E.M., N.D. indicam não detectável usando o ensaio de Surveyor, e N.T. indica não testado em este estudo).
[0031] As Figuras 7A-C mostram uma comparação de diferentes transcritos de tracrRNA para direcionamento de genes mediado por Cas9.
[0032] A Figura 8 mostra um esquema de um ensaio de nuclease de Surveyor para detecção de microinserções e deleções induzidas por quebra da fita dupla.
[0033] As Figuras 9A-B mostram vetores de expressão bicistrônicos exemplares para expressão de elementos do sistema CRISPR em células eucarióticas.
[0034] A Figura 10 mostra um ensaio de transferência de plasmídeo bacteriano, cassetes de expressão e plasmídeos usados nele, e eficácias de transformação de células usadas nele.
[0035] As Figuras 11A-C mostram histogramas de distâncias entre PAM do local 1 de S. pyogenes SF370 (NGG) (Figura 10A) e PAM do local 2 de S. thermophilus LMD9 (NNAGAAW) (Figura 10B) adjacentes no genoma de humano; e distâncias para cada PAM por cromossomo (Chr) (Figura 10C).
[0036] As Figuras 12A-C mostram um sistema CRISPR exemplar, uma adaptação exemplar para expressão em células eucarióticas, e resultados de testes avaliando a atividade de CRISPR.
[0037] As Figuras 13A-C mostram manipulações exemplares de um sistema CRISPR para direcionamento de locais genômicos em células de mamífero.
[0038] As Figuras 14A-B mostram os resultados de uma análise de transferência de processamento de crRNA em células de mamífero.
[0039] A Figura 15 mostra uma seleção exemplar de protoespaçadores nos locais PVALB de humano e Th de camundongo.
[0040] A Figura 16 mostra alvos de sequência protoespaçadora e PAM correspondente do sistema CRISPR de S. thermophilus no local EMX1 de humano.
[0041] A Figura 17 provê uma tabela de sequências para iniciadores e sondas usados para ensaios de Surveyor, RFLP, sequenciação genômica, e transferência de Northern.
[0042] As Figuras 18A-C mostram manipulação exemplar de um sistema CRISPR com RNAs quiméricos e resultados de ensaios de SURVEYOR para atividade do sistema em células eucarióticas.
[0043] As Figuras 19A-B mostram uma representação gráfica dos resultados de ensaios de SURVEYOR para atividade do sistema CRISPR em células eucaróticas.
[0044] A Figura 20 mostra uma visualização exemplar de alguns locais alvo de Cas9 de S. pyogenes no genoma de humano usando o browser do genoma UCSC.
[0045] Figura 21 mostra estruturas secundárias previstas para RNAs quiméricos exemplares compreendendo uma sequência guia, sequência tracr mate, e sequência tracr.
[0046] A Figura 22 mostra vetores de expressão bicistrônicos exemplares para expressão de elementos do sistema CRISPR em células eucarióticas.
[0047] A Figura 23 mostra que a atividade de nuclease de Cas9 contra alvos endógenos pode ser explorada para edição do genoma. (a) Concepção de edição do genoma usando o sistema CRISPR. O constructo de direcionamento de CRISPR dirigiu a clivagem de um local cromossomal e foi cotransformado com um modelo de edição que se recombinou com o alvo para prevenir a clivagem. Os transformantes resistentes a canamicina que sobreviveram ao ataque de CRISPR continham modificações introduzidas pelo modelo de edição. tracr, RNA de CRISPR trans-ativante; aphA-3, gene de resistência à canamicina. (b) Transformação de DNA de crR6M em células R6 8232.5 com nenhum modelo de edição, os modelos de edição srTA de tipo selvagem de R6 ou R6370.1. A recombinação de srtA de R6 ou R6370.1 preveniu a clivagem por Cas9. A eficácia de transformação foi calculada como unidades formadoras de colônias (cfu) por μg de DNA de crR6M; os valores médios com desvios padrões de pelo menos três experiências independentes são mostrados. Foi realizada análise por PCR em 8 clones em cada transformação. “Un.” indica o local srtA não editado da estirpe R68232.5; “Ed.” mostra o modelo de edição. Os alvos de R68232.5 e R6370.1 são distinguidos por restrição com EaeI.
[0048] A Figura 24 mostra análise de sequências PAM e semente que eliminam a clivagem por Cas9. (a) Produtos de PCR com sequências PAM randomizadas ou sequências semente randomizadas foram transformados em células crR6. Estas células expressaram Cas9 carregada com um crRNA que se dirigiu a uma região cromossomal de células R68232.5 (destacado a rosa) que está ausente do genoma de R6. Mais do que 2x105 transformantes resistentes ao cloranfenicol, transportando sequências PAM ou semente inativas, foram combinados para amplificação e sequenciação profunda da região alvo. (b) Proporção relativa do número de leituras após transformação dos constructos de PAM aleatórios em células crR6 (em comparação com o número de leituras em transformantes de R6). A abundância relativa para cada sequência PAM com 3 nucleotídeos é mostrada. As sequências grandemente subrepresentadas (NGG) são mostradas em vermelho; as parcialmente subrepresentadas em laranja (NAG) (c) Proporção relativa do número de leituras após transformação dos constructos de sequência semente aleatórios em células crR6 (em comparação com o número de leituras em transformantes de R6) . A abundância relativa de cada nucleotídeo para cada posição dos primeiros 20 nucleotídeos da sequência protoespaçadora é mostrada. Elevada abundância indica falta de clivagem por Cas9, i.e., uma mutação inativante de CRISPR. A linha cinza mostra o nível da sequência WT. A linha pontilhada representa o nível acima do qual uma mutação perturba significativamente a clivagem (Ver seção "Análise de dados de sequenciação profunda" no Exemplo 5").
[0049] A Figura 25 mostra a introdução de mutações únicas e múltiplas usando o sistema CRISPR em S. pneumoniae. (a) Sequências de nucleotídeos e aminoácidos do bgaA de tipo selvagem e editado (nucleotídeos verdes; resíduos de aminoácidos sublinhados). O protoespaçador, PAM e locais de restrição são mostrados. (b) Eficácia de transformação de células transformadas com constructos de direcionamento na presença de um modelo de edição ou controle. (c) Análise por PCR para 8 transformantes de cada experiência de edição seguida por digestão com BtgZI (R^A) e TseI (NE^AA) . A deleção de bgaA foi revelada como um produto de PCR mais pequeno. (d) Ensaio de Miller para medir a atividade de β- galactosidase de estirpes WT e editadas. (e) Para um único passo, a deleção dupla do constructo de direcionamento continha dois espaçadores (em este caso correspondendo a srtA e bgaA) e foi contransformada com dois modelos de edição diferentes (f) análise por PCR para 8 transformantes para detectar deleções em locais srtA e bgaA. 6/8 transformantes continham deleções de ambos os genes.
[0050] A Figura 26 provê mecanismos subjacentes à edição usando o sistema CRISPR. (a) Um códon de paragem foi introduzido no gene de resistência à eritromicina ermAM para gerar a estirpe JEN53. A sequência de tipo selvagem pode ser restaurada por direcionamento do códon de paragem com o constructo CRISPR::ermAM(paragem), e usando a sequência de tipo selvagem ermAM como um modelo de edição. (b) Sequências ermAM mutantes e de tipo selvagem. (c) Fração de cfu resistentes à eritromicina (ermR) calculada a partir de cfu totais ou resistentes à canamicina (kanR) . (d) Fração de células totais que adquirem tanto o constructo de CRISPR como o modelo de edição. A cotransformação do constructo de direcionamento de CRISPR produziu mais transformantes (teste t, p=0,011) . Em todos os casos, os valores mostram a média±s.d. para três experiências independentes.
[0051] A Figura 27 ilustra a edição do genoma com o sistema CRISPR em E. coli. (a) Um plasmídeo resistente à canamicina transportando a matriz de CRISPR (pCRISPR) se dirigindo ao gene a editar pode ser transformado na estirpe recombineering HME63 contendo um plasmídeo resistente ao cloranfenicol abrigando cas9 e tracr (pCas9) , em conjunto com um oligonucleotídeo especificando a mutação. (b) Uma mutação K42T conferindo resistência à estreptomicina foi introduzida no gene rpsL (c) Fração de cfu resistentes à estreptomicina (strepR) calculada a partir de cfu resistentes à canamicina (kanR) . (d) Fração de células totais que adquirem tanto o plasmídeo pCRISPR como o oligonucleotídeo de edição. A cotransformação do plasmídeo de direcionamento pCRISPR produziu mais transformantes (teste t, p=0,004). Em todos os casos, os valores mostraram a média±s.d. para três experiências independentes.
[0052] A Figura 28 ilustra a transformação de DNA genômico de crR6 leva à edição do local dirigido (a) O elemento IS1167 de S. pneumoniae R6 foi substituído pelo local de CRISPR01 de S. pyogenes SF370 para gerar a estirpe crR6. Este local codifica a nuclease Cas9, uma matriz de CRISPR com seis espaçadores, o tracrRNA que é requerido para biogênese de crRNA e Cas1, Cas2 e Csn2, proteínas não necessárias para direcionamento. A estirpe crR6M contém um sistema CRISPR funcional mínimo sem casl, cas2 e csn2. O gene aphA-3 codifica resistência à canamicina. Os protoespaçadores dos bacteriófagos estreptocócicos Φ8232.5 e Φ370.1 foram fundidos a um gene de resistência ao cloranfenicol (cat) e integrados no gene srtA da estirpe R6 para gerar as estirpes R68232.5 e R6370.1. (b) Painel esquerdo: Transformação de DNA genômico de crR6 e crR6M em R68232.5 e R6370.1 . Como um controle da competência de células foi também transformado um gene resistente à estreptomicina. Painel direito: Análise por PCR de 8 transformantes de R68232.5 com DNA genômico de crR6. Foram usados iniciadores que amplificam o local srtA para PCR. 7/8 das colônias genotipadas substituíram o local srtA de R68232.5 pelo local WT do DNA genômico de crR6.
[0053] A Figura 29 provê cromatogramas de sequências de DNA de células editadas obtidas em este estudo. Em todos os casos, as sequências protoespaçadoras e PAM de tipo selvagem e mutantes (ou seu complemento reverso) são indicadas. Quando relevante é provida a sequência de aminoácidos codificada pelo protoespaçador. Para cada experiência de edição, todas as estirpes para as quais as análises por PCR e restrição corroboraram a introdução da modificação desejada foram sequenciadas. Um cromatograma representativo é mostrado. (a) Cromatograma para a introdução de uma mutação de PAM no alvo R68232.5 (Figura 23d) . (b) Cromatogramas para a introdução das mutações R>A e NE>AA em β-galactosidase (bgaA) (Figura 25c) . (c) Cromatograma para a introdução de uma deleção com 6664 pb dentro da ORF de bgaA (Figuras 25c e 25f) . A linha pontilhada indica os limites da deleção. (d) Cromatograma para a introdução de uma deleção com 729 pb dentro da ORF de srtA (Figura 25f). A linha pontilhada indica os limites da deleção. (e) Cromatogramas para a geração de um códon de paragem prematuro dentro de ermAM (Figura 33) . (f) edição de rpsL em E. coli (Figura 27).
[0054] A Figura 30 ilustra a imunidade de CRISPR contra alvos de S. pneumoniae aleatórios contendo diferentes PAMs. (a) Posição dos 10 alvos aleatórios no genoma de S. pneumoniae R6. Os alvos escolhidos têm diferentes PAMs e estão em ambas as fitas. (b) Espaçadores correspondendo aos alvos foram clonados em uma matriz de CRISPR mínimo no plasmídeo pLZ12 e transformados na estirpe crR6Rc, que fornece a maquinaria de processamento e direcionamento em trans. (c) Eficácia de transformação de diferentes plasmídeos nas estirpes R6 e crR6Rc. Não foram recuperadas nenhumas colônias para a transformação de pDB99-108 (T1-T10) em crR6Rc. A linha tracejada representa o limite de detecção do ensaio.
[0055] A Figura 31 provê um esquema geral para edição do genoma dirigida. Para facilitar a edição do genoma dirigida, crR6M foi adicionalmente manipulada para conter tracrRNA, Cas9 e somente uma repetição da matriz de CRISPR seguida por marcador de resistência à canamicina (aphA-3), gerando a estirpe crR6Rk. O DNA desta estirpe é usado como um molde para PCR com iniciadores desenhados para introduzir um novo espaçador (caixa verde designada com N) . As PCRs esquerda e direita são montadas usando o método de Gibson para criar o constructo de direcionamento. Ambos os constructos de direcionamento e edição são depois transformados na estirpe crR6Rc, que é uma estirpe equivalente a crR6Rk mas tem o marcador de resistência à canamicina substituído por um marcador de resistência ao cloranfenicol (cat). Cerca de 90 % dos transformantes resistentes à canamicina contêm a mutação desejada.
[0056] A Figura 32 ilustra a distribuição de distâncias entre PAMs. NGG e CCN que são considerados como PAMs válidos. São mostrados dados para o genoma de S. pneumoniae R6 bem como para uma sequência aleatória do mesmo comprimento e com o mesmo conteúdo de GC (39,7 %) . A linha pontilhada representa a distância média (12) entre PAMs no genoma de R6.
[0057] A Figura 33 ilustra a edição mediada por CRISPR do local ermAM usando DNA genômico como constructo de direcionamento. Para usar DNA genômico como constructo de direcionamento é necessário evitar autoimunidade de CRISPR, e portanto tem de ser usado um espaçador contra uma sequência não presente no cromossomo (em este caso, o gene de resistência à eritromicina ermAM) . (a) Sequências de nucleotídeos e aminoácidos do gene ermAM de tipo selvagem e mutado (letras vermelhas). As sequências protoespaçadoras e PAM são mostradas. (b) Um esquema para edição mediada por CRISPR do local ermAM usando DNA genômico. Um constructo transportando um espaçador se dirigindo a ermAM (caixa azul) é fabricado por PCR e montagem de Gibson, e transformado na estirpe crR6Rc, gerando a estirpe JEN37. O DNA genômico de JEN37 foi depois usado como um constructo de direcionamento, e foi cotransformado com o modelo de edição em JEN38, uma estirpe na qual o gene srtA foi substituído por uma cópia de tipo selvagem de ermAM. Os transformantes resistentes à canamicina contém o genótipo editado (JEN43). (c) Número de células resistentes à canamicina obtidas após cotransformação de modelos de direcionamento e edição ou controle. Na presença do modelo de controle foram obtidas 5,4*103 cfu/mL, e 4,3*105cfu/mL quando foi usado o modelo de edição. Esta diferença indica uma eficácia de edição de cerca de 99 % [(4,3*105-5, 4*103)/4,3*105]. (d) Para verificar a presença de células editadas, sete clones resistentes à canamicina e JEN38 foram espalhados em placas de ágar com (erm+) ou sem (erm-) eritromicina. Somente o controle positivo exibiu resistência à eritromicina. O genótipo ermAM mut de um destes transformantes foi também verificado por sequenciação de DNA (Figura 29e).
[0058] A Figura 34 ilustra a introdução sequencial de mutações por edição do genoma mediada por CRISPR. (a) Um esquema para introdução sequencial de mutações por edição do genoma mediada por CRISPR. Em primeiro lugar, R6 é manipulada para gerar crR6Rk. crR6Rk é cotransformada com um constructo de direcionamento de srtA fundido com cat para seleção com cloranfenicol de células editadas, em conjunto com um constructo de edição para uma deleção em grelha ΔsrtA. A estirpe crR6 ΔsrtA é gerada por seleção em cloranfenicol. Subsequentemente, a estirpe ΔsrtA é cotransformada com um constructo de direcionamento de bgaA fundido com aphA-3 para seleção com canamicina, e um constructo de edição contendo uma deleção em grelha ΔbgaA. Finalmente, o local de CRISPR manipulado pode ser eliminado do cromossomo em primeiro lugar por cotransformação de DNA de R6 contendo o local IS1167 de tipo selvagem e um plasmídeo transportando um protoespaçador bgaA (pDB97), e seleção em espectinomicina. (b) Análise por PCR para 8 transformantes resistentes ao cloranfenicol (Cam) para detectar a deleção no local srtA. (c) atividade de β- galactosidase como medida por ensaio de Miller. Em S. pneumoniae, esta enzima está ancorada à parede das células por sortase A. A deleção do gene srtA resulta na liberação de β-galactosidase no sobrenadante. Os mutantes ΔbgaA não mostram atividade. (d) Análise por PCR para 8 transformantes resistentes à espectinomicina (Spec) para detectar a substituição do local de CRISPR por IS1167 de tipo selvagem.
[0059] A Figura 35 ilustra a frequência da mutação de fundo de CRISPR em S. pneumoniae. (a) Transformação dos constructos de direcionamento CRISPR::0 ou CRISPR::erm(paragem) em JEN53, com ou sem o modelo de edição de ermAM. A diferença em CFU kanR entre CRISPR::0 e CRISPR::erm(paragem) indica que a clivagem por Cas9 mata células não editadas. Os mutantes que escapam à interferência de CRISPR na ausência de modelo de edição são observados a uma frequência de 3*10-3. (b) A análise por PCR do local de CRISPR de escapantes mostra que 7/8 têm uma deleção no espaçador. (c) O escapante #2 transporta uma mutação pontual em cas9.
[0060] A Figura 36 ilustra que os elementos essenciais do local de CRISPR 1 de S. pyogenes são reconstituídos em E. coli usando pCas9. O plasmídeo continha tracrRNA, Cas9, bem como uma sequência líder conduzindo a matriz de crRNA. Os plasmídeos pCRISPR continham somente o líder e a matriz. Podem ser inseridos espaçadores na matriz de crRNA entre locais Bsa I usando oligonucleotídeos emparelhados. O desenho dos oligonucleotídeos é mostrado no fundo. pCas9 transportou resistência ao cloranfenicol (CmR) e é baseado na estrutura principal do plasmídeo pACYC184 de baixa cópia. pCRISPR é baseado no plasmídeo pZE21 de elevado número de cópias. Foram requeridos dois plasmídeos porque um plasmídeo pCRISPR contendo um espaçador se dirigindo ao cromossomo de E. coli não pode ser construído usando este organismo como um hospedeiro de clonagem se Cas9 estiver também presente (matará o hospedeiro).
[0061] A Figura 37 ilustra a edição dirigida por CRISPR em E. coli MG1655. Um oligonucleotídeo (W542) transportando uma mutação pontual que confere resistência à estreptomicina e anula a imunidade de CRISPR, em conjunto com um plasmídeo se dirigindo a rpsL (pCRISPR::rpsL) ou um plasmídeo de controle (pCRISPR::0), foi cotransformado na estirpe de E. coli MG1655 de tipo selvagem contendo pCas9. Os transformantes foram selecionados em meios contendo ou estreptomicina ou canamicina. A linha tracejada indica o limite de detecção do ensaio de transformação.
[0062] A Figura 38 ilustra a frequência da mutação de fundo de CRISPR em E. coli HME63. (a) Transformação do plasmídeo pCRISPR::0 ou pCRISPR::rpsL em células competentes HME63. Os mutantes que escapam à interferência de CRISPR foram observados a uma frequência de 2,6x10-4. (b) A amplificação da matriz de CRISPR de escapantes mostrou que 8/8 eliminaram o espaçador.
[0063] As Figuras 39A-D mostram uma representação circular da análise filogenética revelando cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) e dois de Cas9s pequenas (~1100 aminoácidos).
[0064] As Figuras 40A-F mostram uma representação linear da análise filogenética revelando cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) e dois de Cas9s pequenas (~1100 aminoácidos).
[0065] A Figura 41A-M mostra sequências onde os pontos de mutação estão localizados dentro do gene SpCas9.
[0066] A Figura 42 mostra um constructo esquemático no qual o domínio de ativação transcricional (VP64) está fundido com Cas9 com duas mutações nos domínios catalíticos (D10 e H840).
[0067] A Figura 43A-D mostra a edição do genoma através de recombinação homóloga. (a) Esquema de SpCas9 nickase, com mutação D10A no domínio catalítico RuvC I. (b) Esquema representando a recombinação homóloga (HR) no local EMX1 de humano usando oligonucleotídeos de fita simples senso ou antissenso como modelos de reparação. A seta vermelha acima indica o sítio de clivagem de sgRNA; os iniciadores de PCR para genotipagem (Tabelas J e K) são indicados como setas no painel direito. (c) Sequência da região modificada por ensaio de HR. d, SURVEYOR para indels mediadas por SpCas9 de tipo selvagem (wt) e nickase (D10A) no local alvo 1 de EMX1 (n=3) . As setas indicam as posições de tamanhos de fragmentos esperados.
[0068] A Figura 44A-B mostra desenhos de vetores únicos para SpCas9.
[0069] A Figura 45 mostra quantificação da clivagem de constructos NLS-Csn1, Csn1, Csn1-NLS, NLS-Csn1-NLS, NLS- Csn1-GFP-NLS e UnTFN.
[0070] A Figura 46 mostra a frequência de índice de NLS-Cas9, Cas9, Cas9-NLS e NLS-Cas9-NLS.
[0071] A Figura 47 mostra um gel demonstrando que SpCas9 com mutações de nickase (individualmente) não induz quebras de fita dupla.
[0072] A Figura 48 mostra um desenho do DNA de oligo usado como modelo de Recombinação Homóloga (HR) em esta experiência e uma comparação da eficácia de HR induzida por combinações diferentes da proteína Cas9 e modelo de HR.
[0073] A Figura 49A mostra o mapa do vetor de direcionamento Cas9, Rosa26 Condicional.
[0074] A Figura 49B mostra o mapa do vetor de direcionamento Cas9, Rosa26 Constitutivo.
[0075] As Figuras 50A-H mostram as sequências de cada elemento presente nos mapas dos vetores das Figuras 49A-B.
[0076] A Figura 51 mostra um esquema dos elementos importantes nos constructos de Cas9 Constitutivos e Condicionais.
[0077] A Figura 52 mostra a validação funcional da expressão de constructos de Cas9 Constitutivos e Condicionais.
[0078] A Figura 53 mostra a validação da atividade de nuclease de Cas9 por Surveyor.
[0079] A Figura 54 mostra a quantificação da atividade de nuclease de Cas9.
[0080] A Figura 55 mostra o desenho de constructos e estratégia de recombinação homóloga (HR).
[0081] A Figura 56 mostra os resultados da genotipagem por PCR genômico para os constructos constitutivos (Direita) e condicionais (Esquerda) em dois tempos de exposição do gel diferentes (linha do topo durante 3 min e linha do fundo durante 1 min).
[0082] A Figura 57 mostra ativação de Cas9 em mESCs.
[0083] A Figura 58 mostra um esquema da estratégia usada para mediar a inativação de genes através de NHEJ usando uma versão de nickase de Cas9 em conjunto com dois RNAs guia.
[0084] A Figura 59 mostra como a reparação da quebra de fita dupla de DNA (DSB) promove a edição de genes. Na via de junção de extremidades não homólogas propensa a erros (NHEJ), as extremidades de uma DSB são processadas por maquinarias de reparação de DNA endógenas e reunidas em conjunto, o que pode resultar em mutações de inserção/deleção (indel) aleatórias no local da junção. As mutações de indel ocorrendo dentro da região de codificação de um gene pode resultar em deslocamento da grelha e um códon de paragem prematuro, levando à inativação dos genes. Alternativamente, um modelo de reparação na forma de um plasmídeo ou oligodeoxinucleotídeos de fita única (ssODN) pode ser fornecido para alavancar a via de reparação dirigida a homologia (HDR), que permite elevada fidelidade e edição precisa.
[0085] A Figura 60 mostra a linha temporal e visão global de experiências. Passos para desenho dos reagentes, construção, validação, e expansão de linhas celulares. sgRNAs customizados (barras azuis claras) para cada alvo, bem como iniciadores de genotipagem, são desenhados in silico através da nossa ferramenta de desenho online (disponível no website genome-engineering.org/tools). Vetores de expressão de sgRNA são depois clonados em um plasmídeo contendo Cas9 (PX330) e verificados através de sequenciação de DNA. Os plasmídeos completos (pCRISPRs), e modelos de reparação opcionais para facilitação da reparação dirigida a homologia, são depois transfectados em células e avaliados quanto à capacidade de mediar a clivagem dirigida. Finalmente, as células transfectadas podem ser clonalmente expandidas para derivar linhas celulares isogênicas com mutações definidas.
[0086] As Figuras 61A-C mostram seleção de Alvos e preparação de reagentes. (a) Para Cas9 de S. pyogenes, alvos de 20 pb (destacados a azul) têm de ser seguidos por 5’-NGG, que pode ocorrer em qualquer uma das fitas em DNA genômico. Recomendamos que se use a ferramenta online descrita em este protocolo no auxílio da seleção dos alvos (www.genome- engineering.org/tools). (b) Esquema para cotransfecção do plasmídeo de expressão de Cas9 (PX165) e cassete de expressão de sgRNA conduzido por U6 amplificado por PCR. Usando um modelo de PCR contendo promotor U6 e um iniciador direto fixo (U6 Fwd) , o DNA codificando sgRNA pode anexado ao iniciador reverso de U6 (U6 Rev) e sintetizado como um oligo de DNA estendido (Oligos Ultramer da IDT) . Se note que a sequência guia (Ns azuis) em U6 Rev é o complemento reverso da sequência alvo flanqueante 5’-NGG. (c) Esquema para clonagem sem cicatrizes dos oligos da sequência guia em um plasmídeo contendo Cas9 e molde de sgRNA (PX330). Os oligos guia (Ns azuis) contêm saliências para ligação no par de locais BbsI em PS330, com as orientações de fita de topo e fundo correspondendo àquelas do alvo genômico (i.e., o oligo do topo é a sequência de 20 pb precedendo 5’-NGG em DNA genômico). A digestão de PX330 com BbsI permite a substituição dos locais de restrição de Tipo IIs (destaque azul) por inserção direta de oligos emparelhados. Vale a pena notar que uma G extra foi colocada antes da primeira base da sequência guia. Os Requerentes descobriram que uma G extra em frente da sequência guia não afeta adversamente a eficácia de direcionamento. Nos casos quando a sequência guia de 20 nt de escolha não começa com guanina, a guanina extra assegurará que o sgRNA é eficazmente transcrito pelo promotor U6, que prefere uma guanina na primeira base do transcrito.
[0087] As Figuras 62A-D mostram os resultados antecipados para NHEJ multiplex. (a) Esquema do ensaio de SURVEYOR usado para determinar a percentagem de indel. Em primeiro lugar, o DNA genômico da população heterogénea de células dirigidas por Cas9 é amplificado por PCR. Os amplicons são depois reemparelhados lentamente para gerar heterodúplexes. Os heterodúplexes reemparelhados são clivados por nuclease de SURVEYOR, ao passo que os homodúplexes são deixados intactos. A eficácia de clivagem mediada por Cas9 (% indel) é calculada com base na fração de DNA clivado, como determinado por intensidade integrada de bandas de gel. (b) Dois sgRNAs (barras laranjas e azuis) são desenhados para se dirigirem aos locais GRIN2B e DYRK1A de humano. O gel de SURVEYOR mostra modificação em ambos os locais em células transfectadas. As setas coloridas indicaram tamanhos de fragmentos esperados para cada local. (c) Um par de sgRNAs (barras azuis e verdes claras) é desenhado para excisar um éxon (azul escuro) no local EMX1 de humano. As sequências alvo e PAMs (vermelho) são mostradas nas cores respectivas, e os locais de clivagem indicados por triângulo vermelho. A junção prevista é mostrada em baixo. Clones individuais isolados de populações de células transfectadas com sgRNA 3, 4, ou ambos são avaliados por PCR (OUT Fwd, OUT Rev), refletindo uma deleção de ~270 pb. Clones representativos com nenhuma modificação (12/23), monoalélicos (10/23), e bialélicos (1/23) são mostrados. Iniciadores IN Fwd e IN Rev são usados para rastrear eventos de inversão (Fig. 6d) . (d) Quantificação de linhas clonais com deleções do éxon EMX1. Dois pares de sgRNAs (sgRNAs flanqueantes à esquerda 3.1, 3.2; sgRNAs flanqueantes à direita 4.1, 4.2) são usados para mediar deleções de tamanhos variáveis em torno de um éxon EMX1. As células transfectadas são clonalmente isoladas e expandidas para análise de genotipagem quanto a deleções e eventos de inversão. Dos 105 clones são rastreados 51 (49 %) e 11 (10 %) transportando deleções heterozigotas e homozigotas, respectivamente. São dados tamanhos de deleção aproximados uma vez que as junções podem ser variáveis.
[0088] As Figuras 63A-C mostram a aplicação de ssODNs e vetor de direcionamento para mediar HR com Cas9 de tipo selvagem e mutante de nickase em células HEK293FT e HUES9 com eficácias variando de 1,0-27 %.
[0089] A Figura 64 mostra um esquema de um método baseado em PCR para direcionamento de CRISPR rápido e eficaz em células de mamífero. Um plasmídeo contendo o promotor da RNA polimerase II de humano U6 é amplificado por U6 usando um iniciador direto específico de U6 e um iniciador reverso transportando o complemento reverso de parte do promotor U6, o molde de sgRNA(+85) com sequência guia, e 7 nucleotídeos T para terminação transcricional. O produto de PCR resultante é purificado e codistribuído com um plasmídeo transportando Cas9 conduzido pelo promotor CBh.
[0090] A Figura 65 mostra os resultados do Kit de Detecção de Mutação por SURVEYOR da Transgenomics para cada gRNA e controles respectivos. Um resultado de SURVEYOR positivo é uma larga banda correspondendo ao PCR genômico e duas bandas mais pequenas que são o produto da nuclease de SURVEYOR fazendo uma quebra de fita dupla no local de uma mutação. Cada gRNA foi validado na linha celular de camundongo, Neuro-N2a, por cotransfecção transiente lipossomal com hSpCas9. 72 horas pós-transfecção, o DNA genômico foi purificado usando QuickExtract DNA da Epicentre. Foi realizada PCR para amplificar o local de interesse.
[0091] A Figura 66 mostra os resultados de Surveyor para 38 filhotes vivos (linhas 1-38), 1 filhote morto (linha 39) e 1 filhote de tipo selvagem para comparação (linha 40). Os filhotes 1-19 foram injetados com gRNA Chd8.2 e os filhotes 20-38 foram injetados com gRNA Chd8.3. Dos 38 filhotes vivos, 13 foram positivos para uma mutação. O filhote morto teve também uma mutação. Não existiu mutação detectada na amostra de tipo selvagem. A sequência de DNA genômico foi consistente com as descobertas do ensaio de SURVEYOR.
[0092] A Figura 67 mostra um desenho de diferentes constructos de NLS de Cas9. Todas as Cas9 foram a versão de códon otimizado de humano da Sp Cas9. As sequências de NLS são ligadas ao gene cas9 no terminal N ou terminal C. Todas as variantes de Cas9 com diferentes desenhos de NLS foram clonadas em um vetor de estrutura principal contendo tal que seja conduzido pelo promotor EF1a. No mesmo vetor existe um local EMX1 de humano de direcionamento de DNA quimérico conduzido pelo promotor U6, formando em conjunto um sistema de dois componentes.
[0093] A Figura 68 mostra a eficácia de clivagem genômica induzida por variantes de Cas9 transportando diferentes desenhos de NLS. A percentagem indica a porção de DNA genômico de EMX1 de humano que foi clivada por cada constructo. Todas as experiências são de 3 réplicas biológicas. n = 3, o erro indica S.E.M.
[0094] A Figura 69A mostra um desenho do CRISPR-TF (Fator de Transcrição) com atividade de ativação transcricional. O RNA quimérico é expresso pelo promotor U6, enquanto uma versão de códon otimizado de humano, duplo mutante da proteína Cas9 (hSpCas9m), operacionalmente ligada a NLS triplo e um domínio funcional VP64, é expressa por um promotor EF1a. As mutações duplas, D10A e H840A, tornam a proteína cas9 incapaz de introduzir qualquer clivagem mas mantiveram a sua capacidade de se ligar a DNA alvo quando guiada pelo RNA quimérico.
[0095] A Figura 69B mostra a ativação transcricional do gene SOX2 de humano com sistema CRISPR-TF (RNA Quimérico e a proteína de fusão Cas9-NLS-VP64). As células 293FT foram transfectadas com plasmídeos transportando dois componentes: (1) RNAs quiméricos diferentes conduzidos por U6 se dirigindo a sequências de 20 pb dentro ou em torno do local genômico SOX2 de humano, e (2) proteína de fusãohSpCas9m (mutante duplo)-NLS-VP64 conduzida por EF1a. 96 horas pós- transfecção, as células 293FT foram coletadas e o nível de ativação é medido pela indução de expressão de mRNA usando um ensaio pRT-PCR. Todos os níveis de expressão são normalizados contra o grupo de controle (barra cinza), o que representa resultados de células transfectadas com o plasmídeo de estrutura principal CRISPR-TF sem RNA quimérico. As sondas de qRT-PCR usadas para detecção do mRNA de SOX2 é Ensaio de Expressão de Genes de Humano Taqman (Life Technologies) . Todas as experiências representam dados de 3 réplicas biológicas, n=3, as barras de erros mostram s.e.m.
[0096] A Figura 70 ilustra a otimização da arquitetura de NLS para SpCas9.
[0097] A Figura 71 mostra uma representação gráfica QQ para sequências NGGNN.
[0098] A Figura 72 mostra um histograma da densidade de dados com distribuição normal ajustada (linha preta) e quantil .99 (linha pontilhada).
[0099] As Figuras 73A-C mostram repressão guiada por RNA da expressão de bgaA por dgRNA::cas9**. a. A proteína Cas9 se liga ao tracrRNA, e ao RNA de CRISPR precursor que é processado por RNAseIII para formar o crRNA. O crRNA dirige a ligação de Cas9 ao promotor de bgaA e reprime a transcrição. b. Os alvos usados para dirigir Cas9** ao promotor de bgaA são representados. -35, -10 putativos bem como o códon de início de bgaA estão a negrito. c. Atividade de betagalactosidase como medida por ensaio de Miller na ausência de direcionamento e para os quatro alvos diferentes.
[0100] As Figuras 74A-E mostram a caracterização da repressão mediada por Cas9**. a. O gene gfpmut2 e seu promotor, incluindo os sinais -35 e -10, são representados em conjunto com a posição dos diferentes locais alvo usados o estudo. b. Fluorescência relativa após direcionamento da fita codificante. c. Fluorescência relativa após direcionamento da fita não codificante. d. Transferência de Northern com as sondas B477 e B478 em RNA extraído a partir de T5, T10, B10 ou uma estirpe de controle sem um alvo. e. Efeito de um número aumentado de mutações na extremidade 5’ do crRNA de B1, T5 e B10.
[0101] As figuras aqui são para propósitos ilustrativos apenas e não estão necessariamente desenhadas à escala.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0102] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados indistintamente. Se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, tanto desoxirribonucleotídeos como ribonucleotídeos, ou seus análogos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento de gene, locais (local) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (RNAm), RNA de transferência, RNA ribossomal, pequeno RNA de interferência (siRNA), RNA de grampo curto (shRNA), micro- RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, as modificações à estrutura de nucleotídeos podem ser transmitidas antes da ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
[0103] Em aspectos da invenção, os termos "RNA quimérico", "RNA guia quimérico", "RNA guia", "RNA guia único" e "RNA guia sintético" são usados indistintamente e se referem à sequência de polinucleotídeos compreendendo a sequência guia, a sequência tracr e a sequência tracr mate. O termo "sequência guia" se refere à sequência com cerca de 20 pb dentro do RNA guia que especifica o local alvo e pode ser usado indistintamente com os termos "guia" ou "espaçador". O termo "sequência tracr mate" pode ser também usado indistintamente com o termo "repetição(ões) direta(s)".
[0104] Como usado aqui, o termo "tipo selvagem" é um termo da técnica entendido pelos técnicos e significa a forma típica de um organismo, estirpe, gene ou característica como ocorre na natureza como distinta de formas mutantes ou variantes.
[0105] Como usado aqui, o termo "variante" deve ser tomado como significando a exibição de qualidades que têm um padrão que se desvia do que ocorre na natureza.
[0106] Os termos "de ocorrência não natural" ou "manipulada" são usados indistintamente e indicam o envolvimento da mão do homem. Os termos, quando se referem a moléculas de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, significam que a molécula de ácido nucleico ou o polipeptídeo está pelo menos substancialmente isento de pelo menos um outro componente com o qual estão naturalmente associados na natureza e como encontrados na natureza.
[0107] "Complementaridade" se refere à capacidade de um ácido nucleico de formar ligação(ões) de hidrogênio com outra sequência de ácidos nucleicos por emparelhamento de bases de Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. A percentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar pontes de hidrogênio (p.ex., emparelhamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucleicos (p.ex., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, e 100 % complementares) . "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos irão fazer ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucleicos. "Substancialmente complementar" como usado aqui se refere a um grau de complementaridade que é pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou se refere a dois ácidos nucleicos que hibridam sob condições estringentes.
[0108] Como usado aqui, "condições estringentes" para Hibridização se referem a condições sob as quais um ácido nucleico tendo complementaridade com uma sequência alvo predominantemente hibrida com a sequência alvo, e substancialmente não hibrida com sequências não alvo. As condições estringentes são geralmente dependentes da sequência, e variam dependendo de um número de fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, mais elevada a temperatura à qual a sequência hibrida especificamente com a sua sequência alvo. Exemplos não limitantes de condições estringentes são descritos em detalhe em Tijssen (1993) , Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Segundo Capítulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.I.
[0109] "Hibridização" se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação Hoogstein, ou em qualquer outro modo específica à sequência. O complexo pode compreender duas fitas formando uma estrutura em dúplex, três ou mais fitas formando um complexo multifitas, uma fita única auto-hibridante, ou qualquer combinação destes. A reação de hibridização pode constituir um passo em um processo mais vasto, tal como a iniciação de PCR, ou a clivagem de um polinucleotídeo por uma enzima. Uma sequência capaz de hibridizar com uma dada sequência é referida como o "complemento" da dada sequência.
[0110] Como usado aqui, "expressão" se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (tal como em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Os transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto de gene." Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir processamento do mRNA em uma célula eucariótica.
[0111] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente aqui para se referirem polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação. Como usado aqui, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros óticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0112] Os termos "sujeito", "indivíduo", e "paciente" são usados indistintamente aqui para se referirem a um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, símios, humanos, animais de quinta, animais de esporte, e animais de estimação. Tecidos, células e sua descendência de uma entidade biológica obtidos in vivo ou cultivados in vitro são também englobados.
[0113] Os termos "agente terapêutico", "agente capaz terapêutico" ou "agente de tratamento" são usados indistintamente e se referem a uma molécula ou composto que confere algum efeito benéfico após administração a um indivíduo. Os efeitos benéficos incluem capacitação de determinações de diagnóstico; melhoria de uma doença, sintoma, distúrbio, ou condição patológica; redução ou prevenção do início de uma doença, sintoma, distúrbio ou condição; e neutralização geral de uma doença, sintoma, distúrbio ou condição patológica.
[0114] Como usado aqui, "tratamento" ou "tratando", ou "paliação" ou "melhoria" são usados indistintamente. Estes termos se referem a uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados incluindo mas não se limitando a um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico se significa qualquer melhoria terapeuticamente relevante em ou efeito em uma ou mais doenças, condições, ou sintomas sob tratamento. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, condição, ou sintoma particular, ou a um indivíduo relatando um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, embora a doença, condição, ou sintoma possa ainda não se ter manifestado.
[0115] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade de um agente que é suficiente para efetivar resultados benéficos ou desejados. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de um ou mais de: o indivíduo e condição de doença sendo tratados, o peso e idade do indivíduo, a gravidade da condição de doença, o modo de administração e similares, que podem ser prontamente determinados por um com perícia ordinária na técnica. O termo se aplica também a uma dose que proverá uma imagem para detecção por qualquer um dos métodos de imagiologia descritos aqui. A dose específica pode variar dependendo de um ou mais de: o agente particular escolhido, o regime de dosagem a ser seguido, se é administrado em combinação com outros compostos, momento da administração, o tecido a ser visualizado, e o sistema de distribuição física no qual é transportada.
[0116] A prática da presente invenção emprega, a não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de imunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e DNA recombinante, que estão dentro do escopo da técnica. Ver Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).
[0117] Vários aspectos da invenção se relacionam com sistemas vetores compreendendo um ou mais vetores, ou vetores como tais. Os vetores podem ser desenhados para expressão de transcritos de CRISPR (p.ex., transcritos de ácido nucleico, proteínas ou enzimas) em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os transcritos de CRISPR podem ser expressos em células bacterianas tais como Escherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura, ou células de mamífero. Células hospedeiras adequadas são adicionalmente discutidas em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e polimerase T7.
[0118] Os vetores podem ser introduzidos e propagados em um procariota. Em algumas formas de realização, um procariota é usado para amplificar cópias de um vetor a ser introduzido em uma célula eucariótica ou como um vetor intermédio na produção de um vetor a ser introduzido em uma célula eucariótica (p.ex., amplificação de um plasmídeo como parte de um sistema de empacotamento de vetor viral) . Em algumas formas de realização, um procariota é usado para amplificar cópias de um vetor e expressar um ou mais ácidos nucleicos, de modo a prover uma fonte de uma ou mais proteínas para distribuição a uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A expressão de proteínas em procariotas é o mais frequentemente levada a cabo em Escherichia coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína por eles codificada, tal como ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão podem servir um ou mais propósitos, tais como: (i) para aumentar a expressão de proteína recombinante; (ii) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e (iii) para auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligando em purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir separação da proteína recombinante a partir da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enterocinase. Exemplos de vetores de expressão de fusão incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que funde glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação a maltose E, ou proteína A, respectivamente, à proteína recombinante alvo.
[0119] Exemplos de vetores de expressão de E. coli induzíveis, não fusão adequados incluem pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) e pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).
[0120] Em algumas formas de realização, um vetor é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura Saccharomyces cerivisae incluem pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan e Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), e picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
[0121] Em algumas formas de realização, um vetor conduz a expressão de proteínas em células de inseto usando vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em cultura de células de inseto (p.ex., células SF9) incluem a série pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31-39).
[0122] Em algumas formas de realização, um vetor é capaz de conduzir a expressão de uma ou mais sequências em células de mamífero usando um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman, et al. , 1987. EMBO J. 6: 187-195) . Quando usados em células de mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são tipicamente providas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, promotores comummente usados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, vírus de símio 40, e outros divulgados aqui e conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas ver, p.ex., Capítulos 16 e 17 de Sambrook, et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., 1989.
[0123] Em algumas formas de realização, o vetor de expressão recombinante de mamífero é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferencialmente em um tipo de célula particular (p.ex., elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor da albumina (específico do fígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos da linfoide (Calame e Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), em particular promotores de receptores de células T (Winoto e Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e imunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen e Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurônios (p.ex., o promotor dos neurofilamentos; Byrne e Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), e promotores específicos das glândulas mamárias (p.ex., promotor de soro do leite; Pat. dos E.U.A. N°. 4,873,316 e Publicação do Pedido Europeu N°. 264,166). Promotores regulados pelo desenvolvimento são também englobados, p.ex., os promotores hox de murino (Kessel e Gruss, 1990. Science 249: 374-379) e o promotor da a-fetoproteína (Campes e Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546).
[0124] Em algumas formas de realização, um elemento regulador está operacionalmente ligado a um ou mais elementos de um sistema CRISPR de modo a conduzir a expressão do um ou mais elementos do sistema CRISPR. Em geral, CRISPRs (Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas), também conhecidas como SPIDRs (Repetições Diretas Intercaladas Espaçadoras), constituem uma família de locais de DNA que são usualmente específicos de uma espécie bacteriana particular. O local de CRISPR compreende uma classe distinta de repetições de sequências curtas intercaladas (SSRs) que foram reconhecidas em E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; e Nakata et al. , J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]), e genes associados. SSRs intercaladas similares foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena, e Mycobacterium tuberculosis (Ver, Groenen et al. , Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al. , Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; e Mojica et al. , Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Os locais de CRISPR diferem tipicamente de outras SSRs pela estrutura das repetições, que foram denominadas repetições curtas regularmente espaçadas (SRSRs) (Janssen et al. , OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). Em geral, as repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que estão regularmente espaçados por sequências intervenientes únicas com um comprimento substancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Embora as sequências de repetições estejam altamente conservadas entre estirpes, o número repetições interespaçadas e as sequências das regiões espaçadoras diferem tipicamente de estirpe para estirpe (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Os locais de CRISPR foram identificados em mais do que 40 procariotas (Ver, p.ex., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; e Mojica et al., [2005]) incluindo, mas não se limitando a, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema, e Thermotoga.
[0125] Em geral, “sistema CRISPR” se refere coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão de ou direcionamento da atividade de genes associados a CRISPR (“Cas”), incluindo sequências codificando um gene Cas, uma sequência tracr (CRISPR trans- ativante) (p.ex., tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência tracr mate (englobando uma “repetição direta” e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma sequência guia (também referida como um "espaçador" no contexto de um sistema CRISPR endógeno), ou outras sequências e transcritos de um local de CRISPR. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de um sistema CRISPR é derivado de um sistema CRISPR tipo I, tipo II, ou tipo III. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de um sistema CRISPR é derivado de um organismo específico compreendendo um sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também referido como um protoespaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno). No contexto da formação de um complexo CRISPR, “sequência alvo” se refere a uma sequência à qual uma sequência guia é desenhada para ter complementaridade, onde a hibridização entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Complementaridade completa não é necessariamente requerida, contanto que exista complementaridade suficiente para causar hibridização e promover formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, tal como polinucleotídeos de DNA ou RNA. Em algumas formas de realização, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula. Em algumas formas de realização, a sequência alvo pode estar dentro de um organelo de uma célula eucariótica, por exemplo, mitocôndria ou cloroplasto. Uma sequência ou modelo que pode ser usado para recombinação no local dirigido compreendendo as sequências alvo é referido como um "modelo de edição" ou "polinucleotídeo de edição" ou "sequência de edição". Em aspectos da invenção, um polinucleotídeo modelo exógeno pode ser referido como um modelo de edição. Em um aspecto da invenção, a recombinação é recombinação homóloga.
[0126] Tipicamente, no contexto de um sistema CRISPR endógeno, a formação de um complexo CRISPR (compreendendo uma sequência guia hibridizada a uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta na clivagem de uma das ou ambas as fitas na ou próximo da (p.ex., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ou mais pares de bases da) sequência alvo. Sem desejar estar limitado pela teoria, a sequência tracr, que pode compreender ou consistir em toda ou parte de uma sequência tracr de tipo selvagem (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ou mais nucleotídeos de uma sequência tracr de tipo selvagem), pode também formar parte de um complexo CRISPR, tal como por hibridização ao longo de pelo menos uma porção da sequência tracr a toda ou uma parte de uma sequência tracr mate que está operacionalmente ligado à sequência guia. Em algumas formas de realização, a sequência tracr tem complementaridade suficiente com uma sequência tracr mate para hibridizar e participar na formação de um complexo CRISPR. Como com a sequência alvo se acredita que complementaridade completa não é necessária, contanto que seja suficiente para ser funcional. Em algumas formas de realização, a sequência tracr tem pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr mate quando alinhada otimamente. Em algumas formas de realização, um ou mais vetores conduzindo a expressão de um ou mais elementos de um sistema CRISPR são introduzidos em uma célula hospedeira tal que a expressão dos elementos do sistema CRISPR dirija a formação de um complexo CRISPR em um ou mais locais alvo. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr poderiam estar cada uma operacionalmente ligadas para separar elementos reguladores em vetores separados. Alternativamente, dois ou mais dos elementos expressos a partir dos mesmos ou diferentes elementos reguladores, podem ser combinados em um único vetor, com um ou mais vetores adicionais provendo quaisquer componentes do sistema CRISPR não incluídos no primeiro vetor. Os elementos do sistema CRISPR que são combinados em um único vetor podem estar dispostos em qualquer orientação adequada, tal como um elemento localizado em 5’ no que diz respeito a (“a montante” de) ou 3’ no que diz respeito a (“a jusante” de) um segundo elemento. A sequência de codificação de um elemento pode estar localizada na mesma ou em fita oposta da sequência de codificação de um segundo elemento, e orientada na mesma ou na direção oposta. Em algumas formas de realização, um único promotor dirige a expressão de um transcrito codificando uma enzima CRISPR e uma ou mais da sequência guia, sequência tracr mate (opcionalmente operacionalmente ligada à sequência guia), e uma sequência tracr embebida dentro de uma ou mais sequências de íntron (p.ex., cada uma em um íntron diferente, duas ou mais em pelo menos um íntron, ou todas em um único íntron). Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR, sequência guia, sequência tracr mate, e sequência tracr estão operacionalmente ligadas ao e expressas a partir do mesmo promotor.
[0127] Em algumas formas de realização, um vetor compreende um ou mais locais de inserção, tais como uma sequência de reconhecimento de endonuclease de restrição (também referida como um “local de clonagem”). Em algumas formas de realização, um ou mais locais de inserção (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais locais de inserção) estão localizados a montante e/ou a jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Em algumas formas de realização, um vetor compreende um local de inserção a montante de uma sequência tracr mate, e opcionalmente a jusante de um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate, tal que após inserção de uma sequência guia no local de inserção e após expressão da sequência guia dirija a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR para uma sequência alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, um vetor compreende dois ou mais locais de inserção, estando cada local de inserção localizado entre duas sequências tracr mates de modo a permitir a inserção de uma sequência guia em cada local. Em uma tal disposição, as duas ou mais sequências guia podem compreender duas ou mais cópias de uma única sequência guia, duas ou mais sequências guia diferentes, ou combinações destas. Quando são usadas múltiplas sequências guia diferentes, um único constructo de expressão pode ser usado para dirigir a atividade de CRISPR a múltiplas sequências alvo correspondentes, diferentes dentro de uma célula. Por exemplo, um vetor único pode compreender cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ou mais sequências guia. Em algumas formas de realização podem ser providos cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais de tais vetores contendo sequência guia, e opcionalmente distribuídos a uma célula.
[0128] Em algumas formas de realização, um vetor compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR, tal como uma proteína Cas. Exemplos não limitantes de proteínas Cas incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecida como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, seus homólogos, ou suas versões modificadas. Estas enzimas são conhecidas; por exemplo, a sequência de aminoácidos da proteína Cas9 de S. pyogenes pode ser encontrada na base de dados SwissProt sob o número de acesso Q99ZW2. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não modificada tem atividade de clivagem de DNA, tal como Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é Cas9, e pode ser Cas9 de S. pyogenes ou S. pneumoniae. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma das ou ambas as fitas na localização de uma sequência alvo, tal como dentro da sequência alvo e/ou dentro do complemento da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma das ou ambas as fitas dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, ou mais pares de bases a partir do primeiro ou último nucleotídeo de uma sequência alvo. Em algumas formas de realização, um vetor codifica uma enzima CRISPR que é mutada no que diz respeito a uma enzima de tipo selvagem correspondente tal que a enzima CRISPR não tenha capacidade de clivar uma das ou ambas as fitas de um polinucleotídeo alvo contendo uma sequência alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que cliva ambas as fitas em uma nickase (cliva uma fita única). Outros exemplos de mutações que tornam a Cas9 uma nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A, e N863A. Em algumas formas de realização, uma Cas9 nickase pode ser usada em combinação com sequência(s) guia, p.ex., duas sequências guia, que se dirigem respectivamente a fitas senso e antissenso do alvo de DNA. Esta combinação permite que ambas as fitas sejam cortadas e usadas para induzir NHEJ. Os Requerentes demonstraram (dados não mostrados) a eficácia de dois alvos de nickase (i.e., sgRNAs dirigidos à mesma localização mas a diferentes fitas de DNA) na indução de NHEJ mutagênica. Uma única nickase (Cas9-D10A com um único sgRNA) é incapaz de induzir NHEJ e criar indels mas os Requerentes mostraram que nickase dupla (Cas9-D10A e dois sgRNAs dirigidos a diferentes fitas na mesma localização) conseguem fazer tal em células-tronco embriônicas de humano (hESCs). A eficácia é cerca de 50 % de nuclease (i.e., Cas9 regular sem mutação D10) em hESCs.
[0129] Como um exemplo adicional, dois ou mais domínios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II, e RuvC III) podem ser mutados para produzir uma Cas9 mutada não tendo substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA. Em algumas formas de realização, a mutação D10A é combinada com uma ou mais mutações H840A, N854A, ou N863A para produzir uma enzima Cas9 não tendo substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR é considerada para não tendo substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA quando a atividade de clivagem de DNA da enzima mutada é menos do que cerca de 25 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, ou menor no que diz respeito à sua forma não mutada. Outras mutações podem ser úteis; onde a Cas9 ou outra enzima CRISPR é de uma espécie sem ser S. pyogenes, mutações em aminoácidos correspondentes podem ser feitas para se alcançarem efeitos similares.
[0130] Em algumas formas de realização, uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em células particulares, tais como células eucarióticas. As células eucarióticas podem ser aquelas de ou derivadas de um organismo específico, tal como um mamífero, incluindo mas não se limitando a humano, camundongo, rato, coelho, cão, ou primata não humano. Em geral, a otimização de códons se refere a um processo de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos para expressão intensificada nas células hospedeiras de interesse por substituição de pelo menos um códon (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais códons) da sequência nativa por códons que são mais frequentemente ou o mais frequentemente usados nos genes dessa célula hospedeira enquanto se mantém a sequência de aminoácidos nativa. Várias espécies exibem tendência específica para certos códons de um aminoácido específico. A tendência para códons (diferenças no uso de códons entre organismos) se correlaciona frequentemente com a eficiência de tradução de RNA mensageiro (mRNA) , que por sua vez se acredita ser dependente, entre outras coisas, das propriedades dos códons sendo traduzidos e da disponibilidade das moléculas de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons o mais frequentemente usados na síntese de peptídeos. Conformemente, os genes podem ser adaptados para ótima expressão de genes em um dado organismo com base na otimização de códons. Tabelas de uso de códons estão prontamente disponíveis, por exemplo, no “Codon Usage Database”, e estas tabelas podem ser adaptadas em um número de maneiras. Ver Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Algoritmos de computador para otimização de códons de uma sequência particular para expressão em uma célula hospedeira particular estão também disponíveis, tal como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). Em algumas formas de realização, um ou mais códons (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais, ou todos os códons) em uma sequência codificando uma enzima CRISPR correspondem ao códon o mais frequentemente usado para um aminoácido particular.
[0131] Em algumas formas de realização, um vetor codifica uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs), tal como cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR compreende cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs no ou próximo do terminal amino, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs no ou próximo do terminal carboxi, ou uma combinação destas (p.ex., um ou mais NLS no terminal amino e um ou mais NLS no terminal carboxi). Quando está presente mais do que um NLS, cada um pode ser selecionado independentemente dos outros, tal que um único NLS possa estar presente em mais do que uma cópia e/ou em combinação com um ou mais outros NLSs presentes em uma ou mais cópias. Em uma forma de realização preferencial da invenção, a enzima CRISPR compreende no máximo 6 NLSs. Em algumas formas de realização, um NLS é considerado próximo do terminal N ou C quando o aminoácido mais próximo do NLS está dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais aminoácidos ao longo da fita de polipeptídeos a partir do terminal N ou C. Tipicamente, um NLS consiste em uma ou mais curtas sequências de lisinas ou argininas positivamente carregadas expostas à superfície de proteínas, mas outros tipos de NLS são conhecidos. Exemplos não limitantes de NLSs incluem uma sequência de NLS derivada de: o NLS do grande antigênio T do vírus SV40, tendo a sequência de aminoácidos PKKKRKV; o NLS de nucleoplasmina (p.ex., a nucleoplasmina bipartida NLS com a sequência KRPAATKKAGQAKKKK) ; a c-myc NLS tendo a sequência de aminoácidos PAAKRVKLD ou RQRRNELKRSP; a hRNPA1 M9 NLS tendo a sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; a sequência RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV do domínio IBB da importina-alfa; as sequências VSRKRPRP e PPKKARED de proteína T de mioma; a sequência POPKKKPL de p53 de humano; a sequência SALIKKKKKMAP de c-abl IV de camundongo; as sequências DRLRR e PKQKKRK do vírus NS1 da gripe; a sequência RKLKKKIKKL do antigênio delta de vírus da Hepatite; a sequência REKKKFLKRR da proteína Mx1 de camundongo; a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK da poli(ADP-ribose) polimerase de humano; e a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK dos receptores glucocorticoides do hormônio esteroide (humano)
[0132] Em geral, a um ou mais NLSs são de resistência suficiente para conduzir a acumulação da enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Em geral, a resistência de localização da atividade nuclear pode derivar do número de NLSs na enzima CRISPR, na(s) NLS(s) particular(es) usada(s), ou uma combinação destes fatores. A detecção da acumulação no núcleo pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, um marcador detectável pode ser fundido à enzima CRISPR, tal que a localização dentro de uma célula possa ser visualizada, tal como em combinação com um meio para detecção da localização do núcleo (p.ex., uma mancha específica para o núcleo tal como DAPI). Exemplos de marcadores detectáveis incluem proteínas fluorescentes (tais como Proteínas fluorescentes verdes, ou GFP; RFP; CFP), e marcadores de epítopos (marcador HA, marcador flag, marcador SNAP). Os núcleos das células podem ser também isolados a partir de células, os conteúdos dos quais podem ser depois analisados por qualquer processo adequado para detecção de proteína, tal como imunohistoquímica, transferência de Western, ou ensaio de atividade de enzima. A acumulação no núcleo pode ser também determinada indiretamente, tal como por um ensaio do efeito de formação do complexo CRISPR (p.ex., ensaio de clivagem de DNA ou mutação na sequência alvo, ou ensaio para atividade da expressão de genes alterada afetada pela formação do complexo CRISPR e/ou atividade de enzima CRISPR), em comparação com um controle não exposto a uma enzima ou complexo CRISPR, ou exposto a uma enzima CRISPR não tendo a uma ou mais NLSs.
[0133] Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de polinucleotídeos tendo suficiente complementaridade com uma sequência de polinucleotídeos alvo para hibridizar com a sequência alvo e dirigir a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e a sua correspondente sequência alvo, quando alinhada otimamente usando um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 %, ou mais. O alinhamento ótimo pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, exemplos não limitantes do qual incluem o algoritmo de Smith-Waterman, o algoritmo de Needleman- Wunsch, algoritmos baseados no Transformada de BurrowsWheeler (p.ex., o Alinhador de Burrows-Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn), e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas formas de realização, uma sequência guia tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas formas de realização, uma sequência guia tem menos do que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, ou menos nucleotídeos de comprimento. A capacidade de uma sequência guia de dirigir a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser providos a uma célula hospedeira tendo a sequência alvo correspondente, tal como por transfecção com vetores codificando os componentes da sequência CRISPR, seguido por uma avaliação de clivagem preferencial dentro de uma sequência alvo, tal como por ensaio de Surveyor como descrito aqui. Similarmente, a clivagem de uma sequência de polinucleotídeos alvo pode ser avaliada em um tubo de teste provendo a sequência alvo, componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia controle diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações de sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis, e ocorrerão àqueles peritos na técnica.
[0134] Uma sequência guia pode ser selecionada para se dirigir a qualquer sequência alvo. Em algumas formas de realização, a sequência alvo é uma sequência dentro de um genoma de uma célula. Sequências alvo exemplares incluem aquelas que são únicas no genoma alvo. Por exemplo, para a Cas9 de S. pyogenes, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer um) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 de S. pyogenes da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer um) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; X pode ser qualquer um; e W é A ou T) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer um) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 de S. pyogenes, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer um) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um local alvo de Cas9 de S. pyogenes da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG onde NNNNNNNNNNNXGGXG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer um) tem uma única ocorrência no genoma. Em cada destas sequências, “M” pode ser A, G, T, ou C, e não necessita de ser considerado na identificação de uma sequência como única.
[0135] Em algumas formas de realização, uma sequência guia é selecionada para reduzir o grau da estrutura secundária dentro da sequência guia. A estrutura secundária pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotídeos adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia mínima livre de Gibbs. Um exemplo de um tal algoritmo é mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Outro algoritmo de dobragem exemplar é o webserver online RNAfold, desenvolvido no Institute for Theoretical Chemistry na University of Vienna, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (ver, p.ex., A.R. Gruber et al. , 2008, Cell 106(1) : 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62) . Algoritmos adicionais podem ser encontrados no pedido dos E.U.A. N° de Série TBA (registro do procurador 44790.11.2022; Referência Broad BI-2013/004G); incorporado aqui por referência.
[0136] Em geral, uma sequência tracr mate inclui qualquer sequência que tenha complementaridade suficiente com uma sequência tracr para promover uma ou mais de: (1) excisão de uma sequência guia flanqueada por sequências tracr mates em uma célula contendo a correspondente sequência tracr; e (2) formação de um complexo CRISPR em uma sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a sequência tracr mate hibridizada com a sequência tracr. Em geral, grau de complementaridade é com referência ao alinhamento ótimo da sequência tracr mate e sequência tracr, ao longo do comprimento da mais curta das duas sequências. O alinhamento ótimo pode ser determinado por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, e pode adicionalmente considerar estruturas secundárias, tais como autocomplementaridade dentro da sequência tracr ou sequência tracr mate. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre a sequência tracr e a sequência tracr mate ao longo do comprimento da mais curta das duas quando otimamente alinhadas é cerca de ou mais do que cerca de 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 %, ou maior. Ilustrações exemplares de alinhamento ótimo entre uma sequência tracr e uma sequência tracr mate são providas nas Figuras 12B e 13B. Em algumas formas de realização, a sequência tracr tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas formas de realização, a sequência tracr e a sequência tracr mate estão contidas dentro de um único transcrito, tal que a hibridização entre as duas produz um transcrito tendo uma estrutura secundária, tal como um grampo. Sequências formadoras de alças preferenciais para uso em estruturas em grampo têm quatro nucleotídeos de comprimento, e o mais preferencialmente têm a sequência GAAA. No entanto podem ser usadas sequências de alça mais longas ou mais curtas, como o podem sequências alternativas. As sequências incluem preferencialmente um tripleto de nucleotídeos (por exemplo, AAA) , e um nucleotídeo adicional (por exemplo, C ou G). Exemplos de sequências formadoras de alça incluem CAAA e AAAG. Em uma forma de realização da invenção, o transcrito ou sequência de polinucleotídeos transcrita tem pelo menos dois ou mais grampos. Em formas de realização preferenciais, o transcrito tem dois, três, quatro ou cinco grampos. Em uma forma de realização adicional da invenção, o transcrito tem no máximo cinco grampos. Em algumas formas de realização, o único transcrito inclui adicionalmente uma sequência de terminação da transcrição; preferencialmente esta é uma sequência de poliT, por exemplo seis nucleotídeos T. Uma ilustração exemplar de uma tal estrutura em grampo é provida na porção inferior da Figura 13B, onde a porção da sequência 5' da "N" final e a montante da alça corresponde à sequência tracr mate, e a porção da sequência 3' da alça corresponde à sequência tracr. Exemplos não limitantes adicionais de polinucleotídeos únicos compreendendo uma sequência guia, uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr são como se segue (listados 5’ para 3’), onde “N” representa a base de uma sequência guia, o primeiro bloco de letras minúsculas representa a sequência tracr mate, e o segundo bloco de letras minúsculas representa a sequência tracr, e a sequência poli-T final representa o terminador da transcrição: (1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgc agaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcaggg tgttttcgttatttaaTTTTTT; (2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaaga taaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttattt aaTTTTTT (3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaaga taaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggct agtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggct agtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT; and (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagt ccgttatcaTTTTTTTT. Em algumas formas de realização, as sequências (1) a (3) são usadas em combinação com Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus. Em algumas formas de realização, as sequências (4) a (6) são usadas em combinação com Cas9 de S. pyogenes. Em algumas formas de realização, a sequência tracr é um transcrito separado de um transcrito compreendendo a sequência tracr mate (tal como ilustrado na porção de topo da Figura 13B).
[0137] Em algumas formas de realização é também provido um modelo de recombinação. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor como descrito aqui, contido em um vetor separado, ou provido como um polinucleotídeo separado. Em algumas formas de realização, um modelo de recombinação é desenhado para servir como um modelo na recombinação homóloga, tal como dentro ou próximo de uma sequência alvo cortada ou clivada por uma enzima CRISPR como uma parte de um complexo CRISPR. Um polinucleotídeo modelo pode ter qualquer comprimento adequado, tal como cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo. Quando alinhado otimamente, um polinucleotídeo modelo poderá se sobrepor com um ou mais nucleotídeos de uma sequência alvo (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas formas de realização, quando uma sequência modelo e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo são alinhados otimamente, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, ou mais nucleotídeos a partir da sequência alvo.
[0138] Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é parte de uma proteína de fusão compreendendo um ou mais domínios de proteína heterólogos (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais domínios adicionalmente à enzima CRISPR). Uma proteína de fusão da enzima CRISPR pode compreender qualquer sequência de proteína adicional, e opcionalmente uma sequência ligante entre quaisquer dois domínios. Exemplos de domínios de proteína que podem ser fundidos a uma enzima CRISPR incluem, sem limitação, marcadores de epítopo, sequências de genes repórter, e domínios de proteína tendo uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade do fator de liberação da transcrição, atividade de modificação de histonas, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação de ácidos nucleicos. Exemplos não limitantes de marcadores de epítopo incluem marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina da gripe (HA) , marcadores Myc, marcadores VSV-G, e marcadores da tiorredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não estão limitados a, glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de rábano-silvestre (HRP), cloranfenicol- acetiltransferase (CAT), beta-galactosidase, beta glucuronidase, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente ciano (CFP), proteína fluorescente amarela (YFP), e proteínas autofluorescentes incluindo proteína fluorescente azul (BFP). Uma enzima CRISPR pode ser fundida a uma sequência de genes codificando uma proteína ou um fragmento de uma proteína que se liga a moléculas de DNA ou se liga a outras moléculas celulares, incluindo mas não se limitando a proteína de ligação à maltose (MBP), marcador S, fusões de domínio de ligação (DBD) a DNA de Lex A, fusões de domínio de ligação a DNA de GAL4, e fusões de proteína BP16 do vírus herpes simplex (HSV). Domínios adicionais que podem formar parte de uma proteína de fusão compreendendo uma enzima CRISPR são descritos em US20110059502, incorporado aqui por referência. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR marcada é usada para identificar a localização de uma sequência alvo.
[0139] Em alguns aspectos, a invenção provê métodos compreendendo distribuição de um ou mais polinucleotídeos, tal como ou um ou mais vetores como descrito aqui, um ou mais seus transcritos, e/ou uma ou proteínas transcritas a partir daí, a uma célula hospedeira. Em alguns aspectos, a invenção provê adicionalmente células produzidas por tais métodos, e organismos (tais como animais, plantas, ou fungos) compreendendo ou produzidos a partir de tais células. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR em combinação com (e opcionalmente complexada com) uma sequência guia é distribuída a uma célula. Métodos de transferência de genes virais e não virais convencionais podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos em células ou tecidos alvo de mamífero. Tais métodos podem ser usados para administrar ácidos nucleicos codificando componentes de um sistema CRISPR a células em cultura, ou em um organismo hospedeiro. Sistemas de distribuição de vetores não virais incluem plasmídeos de DNA, RNA (p.ex., um transcrito de um vetor descrito aqui), ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veículo de distribuição, tal como um lipossomo. Sistemas de distribuição de vetores virais incluem vírus de DNA e RNA, que têm os genomas epissomais ou integrados após distribuição à célula. Para uma revisão de procedimentos de terapia de genes ver Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., em Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995); e Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
[0140] Métodos de distribuição de ácidos nucleicos não virais incluem lipofecção, microinjeção, biolística, virossomos, lipossomos, imunolipossomos, policátion ou conjugados lipídeo:ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, e captação de DNA intensificada por agente. A lipofecção é descrita em, p.ex., Pat. dos E.U.A. Nos. 5,049,386, 4,946,787; e 4,897,355 e os reagentes de lipofecção são comercialmente vendidos (p.ex., Transfectam™ e Lipofectin™). Lipídeos catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção eficaz de reconhecimento de receptores de polinucleotídeos incluem aqueles de Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024. A distribuição pode ser a células (p.ex., administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos alvo (p.ex., administração in vivo) .
[0141] A preparação de complexos lipídeo:ácido nucleico, incluindo lipossomos dirigidos tais como complexos de imunolipídeos, é bem conhecida de um com perícia na técnica (ver, p.ex., Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al. , Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al. , Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Pat. dos E.U.A. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4, 837,028, e 4, 946, 787) .
[0142] O uso de sistemas baseados em RNA ou DNA viral para a distribuição de ácidos nucleicos tira vantagem dos processos altamente evoluídos para direcionamento de um vírus para células específicas no corpo e tráfego da carga viral para o núcleo. Os vetores virais podem ser administrados diretamente aos pacientes (in vivo) ou podem ser usados para tratar células in vitro, e as células modificadas podem ser opcionalmente administradas aos pacientes (ex vivo). Sistemas baseados em vírus convencionais poderiam incluir vetores retrovirais, de lentivírus, de adenovírus, adenoassociado e vírus herpes simplex para a transferência de genes. A integração no genoma hospedeiro é possível com os métodos de transferência de genes de retrovírus, lentivírus, e vírus adenoassociado, resultando frequentemente em expressão a longo prazo do transgene inserido. Adicionalmente, eficácias de elevada transdução foram observadas em muitos diferentes tipos de células e tecidos alvo.
[0143] O tropismo de um retrovirus pode ser alterado por incorporação de proteínas do envelope estranhas, expandindo a população alvo potencial das células alvo. Vetores lentivirais são vetores retrovirais que são capazes de transduzir ou infetar células não se dividindo e produzem tipicamente elevados títulos virais. A seleção de um sistema de transferência de genes retrovirais dependeria, portanto, do tecido alvo. Os vetores retrovirais são compreendidos por repetições terminais longas de atuação cis com capacidade de empacotamento de até 6-10 kb de sequência estranha. As LTRs de atuação cis mínimas são suficientes para replicação e empacotamento dos vetores, que são depois usadas para integrar o gene terapêutico na célula alvo para prover expressão de transgenes permanente. Vetores retrovirais amplamente usados incluem aqueles baseados em vírus da leucemia murina (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da Imunodeficiência Símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), e suas combinações (ver, p.ex., Buchscher et al. , J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al. , J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al. , J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al. , J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700). Em aplicações onde a expressão transiente é preferencial podem ser usados sistemas baseados em adenovirus. Os vetores baseados em adenovirus são capazes de eficácia de transdução muito elevada em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores foram obtidos títulos e níveis de expressão elevados. Este vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples. Vetores de vírus adenoassociados ("AAV") podem ser também usados para transduzir células com ácidos nucleicos alvo, p.ex., na produção in vitro de ácidos nucleicos e peptídeos, e para procedimentos de terapia de genes in vivo e ex vivo (ver, p.ex., West et al., Virology 160:38-47 (1987); Pat. dos E.U.A. N°. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). A construção de vetores de AAV recombinantes é descrita em um número de publicações, incluindo Pat. dos E.U.A. N°. 5,173,414; Tratschin et al. , Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); e Samulski et al., J. Virol. 63:038223828 (1989).
[0144] Células de empacotamento são tipicamente usadas para formar partículas de vírus que são capazes de infetar uma célula hospedeira. Tais células incluem células 293, que empacotam adenovirus, e células ^2 ou células PA317, que empacotam retrovírus. Os vetores virais usados em terapia de genes são usualmente gerados por produção de uma linha celular que empacota um vetor de ácido nucleico em uma partícula viral. Os vetores contêm tipicamente as sequências virais mínimas requeridas para empacotamento e integração subsequente em um hospedeiro, outras sequências virais a ser substituídas por um cassete de expressão para o(s) polinucleotídeo(s) a ser(em) expresso(s). As funções virais em falta são tipicamente fornecidas em trans pela linha celular de empacotamento. Por exemplo, os vetores AAV usados em terapia de genes possuem somente tipicamente sequências ITR do genoma de AAV que são requeridas para empacotamento e integração no genoma do hospedeiro. O DNA viral é empacotado em uma linha celular, que contém um plasmídeo ajudante codificando os outros genes de AAV, nomeadamente rep e cap, mas não tendo sequências ITR. A linha celular pode ser também infetada com adenovírus como um ajudante. O vírus ajudante promove a replicação do vetor AAV e expressão de genes de AAV do plasmídeo ajudante. O plasmídeo ajudante não é empacotado em quantidades significativas devido a uma ausência das sequências ITR. A contaminação com adenovírus pode ser reduzida por, p.ex., tratamento com calor ao qual o adenovírus é mais sensível do que AAV. Métodos adicionais para a distribuição de ácidos nucleicos a células são conhecidos daqueles peritos na técnica. Ver, por exemplo, US20030087817, incorporado aqui por referência.
[0145] Em algumas formas de realização, uma célula hospedeira é transientemente ou não transientemente transfectada com um ou mais vetores descritos aqui. Em algumas formas de realização, uma célula é transfectada como ocorre naturalmente em um indivíduo. Em algumas formas de realização, uma célula que é transfectada é retirada de um indivíduo. Em algumas formas de realização, a célula é derivada de células retiradas de um indivíduo, tal como uma linha celular. Uma ampla variedade de linhas celulares de cultura de tecidos é conhecida na técnica. Exemplos de linhas celulares incluem, mas não estão limitados a, C8161, CCRF- CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitélio renal de macaco BS-C- 1, fibroblastos de embrião de camundongo BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetais de humano 132-d5; fibroblastos de camundongo 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO- K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL- 60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI- H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW- 145, linhas celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T- 47D, T84, linhas celulares THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, e suas variedades transgênicas. As linhas celulares estão disponíveis de uma variedade de fontes conhecidas daqueles peritos na técnica (ver, p.ex., a American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). Em algumas formas de realização, uma célula transfectada com um ou mais vetores descritos aqui é usada para estabelecer uma nova linha celular compreendendo uma ou mais sequências derivadas de vetores. Em algumas formas de realização, uma célula transientemente transfectada com os componentes de um sistema CRISPR como descrito aqui (tal como por transfecção transiente de um ou mais vetores, ou transfecção com RNA), e modificada através da atividade de um complexo CRISPR, é usada para estabelecer uma nova linha celular compreendendo células contendo a modificação, mas não tendo qualquer outra sequência exógena. Em algumas formas de realização, as células transientemente ou não transientemente transfectadas com um ou mais vetores descritos aqui, ou linhas celulares derivadas de tais células são usadas na avaliação de um ou mais compostos de teste.
[0146] Em algumas formas de realização, um ou mais vetores descritos aqui são usados para produzir um animal transgênico não humano ou planta transgênica. Em algumas formas de realização, o animal transgênico é um mamífero, tal como um camundongo, rato ou coelho. Em certas formas de realização, o organismo ou indivíduo é uma planta. Em certas formas de realização, o organismo ou indivíduo ou planta é alga. Métodos para produção de plantas e animais transgênicos são conhecidos na técnica, e geralmente começam com um método de transfecção de células, tal como descrito aqui.
[0147] Em um aspecto, a invenção provê métodos de modificação de um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando deste modo o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.
[0148] Em um aspecto, a invenção provê um método de modificar a expressão de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo tal que a referida ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do referido polinucleotídeo; em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.
[0149] Com avanços recentes na genômica de culturas, a capacidade de usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edição e manipulação de genes eficaz e rentável permitirá a rápida seleção e comparação de manipulações genéticas únicas e multiplexadas para transformar tais genomas para produção melhorada e traços intensificados. A este respeito é feita referência a patentes e publicações dos EUA: Patente dos EUA N°. 6,603,061 - Método de Transformação de Plantas Mediado por Agrobacterium; patente dos EUA N°. 7,868,149 - Sequências do Genoma de Plantas e Seus Usos e US 2009/0100536 - Plantas Transgênicas com Traços Agronômicos Intensificados, todos os conteúdos e divulgação de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Na prática da invenção, os conteúdos e divulgação de Morrell et al. "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 29 dez 2011; 13 (2): 85-96, são também aqui incorporados por referência na sua totalidade. Em uma forma de realização vantajosa da invenção, o sistema CRISPR/Cas9 é usado para manipular microalgas (Exemplo 15) . Conformemente, a referência aqui a células animais pode também se aplicar, mutatis mutandis, a células de plantas a não ser que de outro modo aparente.
[0150] Em um aspecto, a invenção provê métodos de modificação de um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica, que pode ser in vivo, ex vivo ou in vitro. Em algumas formas de realização, o método compreende amostragem de uma célula ou população de células a partir de um animal humano ou não humano ou planta (incluindo microalgas), e modificação da célula ou células. A cultura pode ocorrer em qualquer etapa ex vivo. A célula ou células podem ser mesmo reintroduzidas no animal não humano ou planta (incluindo microalgas).
[0151] Em plantas, os patógenos são frequentemente específicos do hospedeiro. Por exemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causa murchidão do tomateiro, mas ataca somente o tomate, e F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici ataca somente o trigo. As plantas têm defesas existentes e induzidas para resistir à maioria dos patógenos. Mutações e eventos de recombinação ao longo das gerações de plantas levam a variabilidade genética que dá origem a suscetibilidade, especialmente dado que os patógenos se reproduzem com mais frequência do que as plantas. Em plantas pode existir resistência não ao hospedeiro, p.ex., o hospedeiro e patogênio são incompatíveis. Pode existir ainda Resistência Horizontal, p.ex., resistência parcial contra todas as raças de um patógeno, tipicamente controlada por muitos genes e Resistência Vertical, p.ex., resistência completa a algumas raças de um patógeno mas não as outras raças, tipicamente controlada por alguns genes. Em um nível Gene-para-Gene, as plantas e patógenos evoluem em conjunto, e as alterações genéticas em um equilibram mudanças no outro. Conformemente, usando Variabilidade Natural, os criadores combinam os genes mais úteis para Rendimento, Qualidade, Uniformidade, Dureza, Resistência. As fontes de genes de resistência incluem Variedades nativas ou estranhas, Variedades Herdadas, Relativos de Plantas Selvagens, e Mutações Induzidas, p.ex., tratamento de material da planta com agentes mutagênicos. Usando a presente invenção, os criadores de plantas são providos com uma nova ferramenta para induzir mutações. Conformemente, um perito na técnica pode analisar o genoma de fontes de genes de resistência, e em Variedades tendo características ou traços desejados empregar a presente invenção para induzir o surgimento de genes de resistência, com mais precisão do que agentes mutagênicos prévios e consequentemente acelerar e melhorar programas de melhoramento de plantas.
[0152] Em um aspecto, a invenção provê kits contendo qualquer um ou mais dos elementos divulgados nos métodos e composições acima. Em algumas formas de realização, o kit compreende um sistema vetor e instruções para se utilizar o kit. Em algumas formas de realização, o sistema vetor compreende (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma sequência guias a montante da sequência tracr mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridizada com a sequência tracr; e/ou (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear. Os elementos podem ser providos individualmente ou em combinações, e podem ser proporcionados em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco, uma garrafa, ou um tubo. Em algumas formas de realização, o kit inclui instruções em uma ou mais línguas, por exemplo em mais do que uma língua.
[0153] Em algumas formas de realização, um kit compreende um ou mais reagentes para uso em um processo utilizando um ou mais dos elementos descritos aqui. Os reagentes podem ser providos em qualquer recipiente adequado. Por exemplo, um kit pode prover um ou mais tampões de reação ou armazenamento. Os reagentes podem ser providos em uma forma que seja usável em um ensaio particular, ou em uma forma que requeira adição de um ou mais outros componentes antes do uso (p.ex., em forma concentrada ou liofilizada). Um tampão pode ser qualquer tampão, incluindo, mas não se limitando a um tampão de carbonato de sódio, um tampão de bicarbonato de sódio, um tampão de borato, um tampão Tris, um tampão de MOPS, um tampão HEPES, e suas combinações. Em algumas formas de realização, o tampão é alcalino. Em algumas formas de realização, o tampão tem um pH de cerca de 7 a cerca de 10. Em algumas formas de realização, o kit compreende um ou mais oligonucleotídeos correspondendo a uma sequência guia para inserção em um vetor de modo a ligar operacionalmente a sequência guia e um elemento regulador. Em algumas formas de realização, o kit compreende um polinucleotídeo modelo de recombinação homóloga.
[0154] Em um aspecto, a invenção provê métodos para usar um ou mais elementos de um sistema CRISPR. O complexo CRISPR da invenção provê um meio eficaz para modificar um polinucleotídeo alvo. O complexo CRISPR da invenção tem uma ampla gama de utilidades incluindo modificação (p.ex., deleção, inserção, translocação, inativação, ativação) de um polinucleotídeo alvo em uma multiplicidade de tipos de células. Como tal, o complexo CRISPR da invenção tem um amplo espetro de aplicações em, p.ex., terapia de genes, rastreio de fármacos, diagnóstico de doenças, e prognóstico. Um complexo CRISPR exemplar compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada a uma sequência alvo dentro do polinucleotídeo alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate, a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.
[0155] O polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode ser qualquer polinucleotídeo endógeno da ou exógeno à célula eucariótica. Por exemplo, o polinucleotídeo alvo pode ser um polinucleotídeo residindo no núcleo da célula eucariótica. O polinucleotídeo alvo pode ser uma sequência codificando um produto de gene (p.ex., uma proteína) ou uma sequência não codificante (p.ex., um polinucleotídeo regulador ou um DNA lixo). Sem desejar estar limitado pela teoria se acredita que a sequência alvo deve ser associada a um PAM (motivo adjacente ao protoespaçador); isto é, uma sequência curta reconhecida pelo complexo CRISPR. Os requisitos específicos de sequência e comprimento para o PAM diferem dependendo da enzima CRISPR usada, mas os PAMs são tipicamente sequências com 2-5 pares de bases adjacentes ao protoespaçador (isto é, a sequência alvo). Exemplos de sequências PAM são dadas na seção de exemplos em baixo, e o técnico será capaz de identificar sequências PAM adicionais para uso com uma dada enzima CRISPR.
[0156] O polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode incluir um número de genes e polinucleotídeos associados a doenças bem como genes e polinucleotídeos associados a vias bioquímicas de sinalização como listado nos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/736,527 e 61/748,427 tendo referência Broad BI-2011/008/WSGR N°. de Registro do Procurador 44063-701.101 e BI-2011/008/WSGR N°. de Registro do Procurador 44063-701.102, respectivamente, ambos intitulados SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUEÊNCIA depositados a 12 de dezembro, 2012 e 2 de janeiro, 2013, respectivamente, os conteúdos de todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[0157] Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, p.ex., um gene ou polinucleotídeo associado a via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem um gene ou polinucleotídeo associado a doenças. Um gene ou polinucleotídeo "associado a doenças" se refere a qualquer gene ou polinucleotídeo que esteja originando produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou em uma forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença em comparação com tecidos ou células de um controle de não doença. Pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente baixo, onde a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado a doenças se refere também a um gene possuindo mutação(ões) ou variação genética que são diretamente responsáveis ou estão em desequilíbrio de ligação com um gene(s) que é(são) responsável(eis) pela etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e podem estar a um nível normal ou anormal.
[0158] Exemplos de genes e polinucleotídeos associados a doenças estão disponíveis do McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) e National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), disponíveis na World Wide Web.
[0159] Exemplos de genes e polinucleotídeos associados a doenças estão listados nas Tabelas A e B. Informação especifica das doenças está disponível de McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) e National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), disponíveis na World Wide Web. Exemplos de genes e polinucleotídeos associados a vias bioquímicas de sinalização estão listados na Tabela C.
[0160] Mutações em estes genes e vias podem resultar na produção de proteínas impróprias ou proteínas em quantidades impróprias que afetam a função. Exemplos adicionais de genes, doenças e proteínas são deste modo incorporados por referência a partir dos Pedidos provisórios dos EUA 61/736, 527 depositado a 12 de dezembro, 2012 e 61/748,427 depositado a 2 de fevereiro, 2013. Tais genes, proteínas e vias podem ser o polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR.
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[0161] Formas de realização da invenção se relacionam também com métodos e composições relacionados com inativação de genes, amplificação de genes e reparação de mutações particulares associadas a instabilidade de repetições de DNA e distúrbios neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edição, Academic Press, 13 de out, 2011 - Medical). Se descobriu que aspectos específicos de sequências de repetição em tandem são responsáveis por mais do que vinte doenças humanas (New insights into repeat instability: role of RNA^DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. set-out 2010;7(5):551-8). O sistema CRISPR-Cas pode ser aproveitado para corrigir estes defeitos de instabilidade genômica.
[0162] Um aspecto adicional da invenção se relaciona com utilização do sistema CRISPR-Cas para corrigir de defeitos nos genes EMP2A e EMP2B que foram identificados como estando associados à doença de Lafora. A doença de Lafora é uma condição autossomal recessiva que é caracterizada por epilepsia mioclonia progressiva que pode começar como convulsões epilépticas na adolescência. Alguns casos da doença podem ser causados por mutações em genes ainda não identificados. A doença causa convulsões, espasmos musculares, dificuldade em caminhar, demência, e eventualmente morte. Não existe correntemente nenhuma terapia que tenha provado ser eficaz contra a progressão da doença. Outras anormalidades genéticas associadas à epilepsia podem ser também dirigidas pelo sistema CRISPR-Cas e a genética subjacente é adicionalmente descrita em Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009.
[0163] Ainda em outro aspecto da invenção, o sistema CRISPR-Cas pode ser usado para corrigir defeitos oculares que surgem a partir de várias mutações genéticas adicionalmente descritas em Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edição, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.
[0164] Vários aspectos adicionais da invenção se relacionam com correção de defeitos associados a uma ampla gama de doenças genéticas que são adicionalmente descritos no website dos National Institutes of Health sob a subseção com o tópico Genetic Disorders (website em health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). As doenças cerebrais genéticas podem incluir, mas não estão limitadas, a Adrenoleucodistrofia, Agenesia do Corpo Caloso, Síndrome de Aicardi, Doença de Alpers, Doença de Alzheimer, Síndrome de Barth, Doença de Batten, CADASIL, Degeneração Cerebelar, Doença de Fabry, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Doença de Huntington e outros Distúrbios de Repetições Triplas, Doença de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Doença de Menkes, Miopatias Mitocondriais e Colpocefalia NINDS. Estas doenças são adicionalmente descritas no website dos National Institutes of Health sob a subseção Genetic Brain Disorders.
[0165] Em algumas formas de realização, a condição pode ser neoplasia. Em algumas formas de realização, onde a condição é neoplasia, os genes a serem dirigidos são qualquer um daqueles listados na Tabela A (em este caso, PTEN e assim por diante) . Em algumas formas de realização, a condição pode ser Degeneração Macular relacionada com a Idade. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio Esquizofrênico. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio de Repetição de Trinucleotídeos. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Síndrome do X Frágil. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio Relacionado com Secretase. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio relacionado com Príon. Em algumas formas de realização, a condição pode ser ALS. Em algumas formas de realização, a condição pode ser dependência de drogas. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Autismo. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Doença de Alzheimer. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Inflamação. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Doença de Parkinson.
[0166] Exemplos de proteínas associadas à doença de Parkinson incluem, mas não estão limitados a a-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkina, UCHL1, Sinfilina-1, e Nurr1.
[0167] Exemplos de proteínas relacionadas com dependência podem incluir ABAT, por exemplo.
[0168] Exemplos de proteínas relacionadas com inflamação podem incluir a proteína quimioatrativa de monócitos-1 (MCP1) codificada pelo gene Ccr2, o receptor tipo 5 de quimiocina C-C (CCR5) codificado pelo gene CCR5, o receptor IIB de IgG (FCGR2b, também denominado CD32) codificado pelo gene Fcgr2b, ou a proteína R1g (FCER1g) Fc épsilon codificada pelo gene Fcerlg, por exemplo.
[0169] Exemplos de proteínas associadas a doenças cardiovasculares podem incluir IL1B (interleucina-1, beta), XDH (xantina desidrogenase), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintase), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoietina 1), ABCG8 (cassete de ligação a ATP, subfamília G (WHITE), membro 8), ou CTSK (catepsina K), por exemplo.
[0170] Exemplos de proteínas associadas à doença de Alzheimer podem incluir a proteína do receptor de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDLR) codificada pelo gene VLDLR, a enzima de ativação modificadora tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada pelo gene UBA1, ou a enzima ativadora de NEDD8 proteína da subunidade catalítica E1 (UBE1C) codificada pelo gene UBA3, por exemplo.
[0171] Exemplos de proteínas associadas Distúrbio do Espectro do Autismo podem incluir a proteína associada ao receptor de benzodiazepina (periférico) (BZRAP1) codificada pelo gene BZRAP1, proteína do membro 2 da família AF4 2/FMR2 (AFF2) codificada pelo gene AFF2 (também denominado MFR2), a proteína 1 homóloga autossomal de atraso mental do X frágil (FXR1) codificada pelo gene FXR1, ou a proteína 2 homóloga autossomal de atraso mental do X frágil (FXR2) codificada pelo gene FXR2, por exemplo.
[0172] Exemplos de proteínas associadas Degeneração Macular podem incluir o cassete de ligação a ATP, a proteína membro 4 da subfamília A (ABC1) (ABCA4) codificada pelo gene ABCR, a proteína apolipoproteína E (APOE), codificada pelo gene APOE, ou a quimiocina (motivo C-C) proteína ligante 2 (CCL2) codificada pelo gene CCL2, por exemplo.
[0173] Exemplos de proteínas associadas Esquizofrenia podem incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, Disc1, GSK3B, e suas combinações.
[0174] Exemplos de proteínas envolvidas na supressão tumoral podem incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), a ATR (ataxia telangiectasia e Rad3 relacionados), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), ERBB2 (homólogo 2 do oncogene viral da leucemia eritroblástica v- erb-b2), ERBB3 (homólogo 3 do oncogene viral da leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB4 (homólogo 4 do oncogene viral da leucemia eritroblástica v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3, ou Notch 4, por exemplo.
[0175] Exemplos de proteínas associadas a um distúrbio da secretase podem incluir PSENEN (homólogo 2 do intensificador da presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora da beta amiloide (A4)), APH1B (homólogo B defeituoso da faringe anterior (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (doença de Alzheimer 4)), ou BACE1 (enzima 1 de clivagem de APP de local beta), por exemplo.
[0176] Exemplos de proteínas associadas à Esclerose Lateral Amiotrófica podem incluir SOD1 (superóxido dismutase 1), ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2), FUS (fundida no sarcoma) , TARDBP (proteína de ligação a DNA de TAR) , VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A), VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B), e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C) , e qualquer sua combinação.
[0177] Exemplos de proteínas associadas a doenças de príon podem incluir SOD1 (superóxido dismutase 1), ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2), FUS (fundida no sarcoma), TARDBP (proteína de ligação a DNA de TAR), VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A), VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B), e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C) , e qualquer sua combinação.
[0178] Exemplos de proteínas relacionadas com condições neurodegenerativas em distúrbios de príon podem incluir A2M (alfa-2-macroglobulina), AATF (Fator de transcrição antagonizante da apoptose), ACPP (Fosfatase ácida próstata), ACTA2 (actina alfa 2 músculo liso aorta), ADAM22 (domínio de metalopeptidase de ADAM), ADORA3 (Receptor A3 de adenosina), ou ADRA1D (Receptor adrenérgico Alfa-1D para adrenorreceptor Alfa-1D), por exemplo.
[0179] Exemplos de proteínas associadas a Imunodeficiência podem incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase]; ABCA1 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 1]; ABCA2 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 2]; ou ABCA3 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 3]; por exemplo.
[0180] Exemplos de proteínas associadas a Distúrbios de Repetição de Trinucleotídeos incluem AR (receptor de androgênio), FMR1 (atraso mental 1 do X frágil), HTT (huntingtina), ou DMPK (proteína cinase da distrofia miotônica), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por exemplo.
[0181] Exemplos de proteínas associadas a Distúrbios da Neurotransmissão incluem SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintase 1 (neuronal)), ADRA2A (adrenérgico, alfa-2A- , receptor), ADRA2C (adrenérgico, alfa-2C-, receptor) , TACR1 (receptor da taquiquinina 1), ou HTR2c (5- hidroxitriptamina (serotonina) receptor 2C), por exemplo.
[0182] Exemplos de sequências associadas ao neurodesenvolvimento incluem A2BP1 [proteína 1 de ligação a ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferase], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase], ABAT [4- aminobutirato aminotransferase], ABCA1 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 1], ou ABCA13 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 13], por exemplo.
[0183] Exemplos adicionais de condições preferenciais tratáveis com o presente sistema incluem podem ser selecionados de: Síndrome de Aicardi-Goutières; Doença de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Distúrbios Relacionados com POLG; Alfa-Manosidose (Tipo II e III); Síndrome de Alstrom; Síndrome de Angelman; Ataxia Telangiectasia; Ceroides Lipofuscinoses Neuronais; Beta- Talassemia; Atrofia Ótica Bilateral e Atrofia Ótica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Doença de Canavan; Síndrome Cérebro-óculo-fácio-esquelético 1 [COFS1]; Xantomatose Cerebrotendínea; Síndrome de Cornelia de Lange; Distúrbios Relacionados com MAPT; Doenças de Príon Genéticas; Síndrome de Dravet; Doença de Alzheimer Precoce Familiar; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidose; Distrofia Muscular Congênita de Fukuyama; Galactosialidose; Doença de Gaucher; Acidemias Orgânicas; Linfohistiocitose Hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidose II; Doença do Armazenamento de Ácido Siálico Livre Infantil; Neurodegeneração Associada a PLA2G6; Síndrome de Jervell e Lange-Nielsen; Epidermólise Bolhosa Juncional; Doença de Huntington; Doença de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh Associado a DNA Mitocondrial e NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Associada a LIS1; Síndrome de Lowe; Doença da Urina do Xarope de Bordo; Síndrome de Duplicação MECP2; Distúrbios do Transporte de Cobre Relacionado com ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada com LAMA2; Deficiência em Arilsulfatase A; Mucopolissacaridose Tipo I, II ou III; Distúrbios de Biogênese do Peroxissomo, Espectro do Síndrome de Zellweger; Neurodegeneração com Distúrbios de Acumulação de Ferro no Cérebro; Deficiência em Ácido Esfingomielinase; Doença de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatia da Glicina; Distúrbios Relacionados com ARX; Distúrbios do Ciclo da Ureia; Osteogênese Imperfeita Relacionada com COL1A1/2; Síndromes de Deleção de DNA Mitocondrial; Distúrbios Relacionados com PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Doença de Armazenamento de Glicogênio Tipo II (Doença de Pompe) (Infantil); Distúrbios Relacionados com MAPT; Distúrbios Relacionados com MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Doença de Sandhoff; Doença de Schindler Tipo 1; Deficiência em Adenosinadesaminase; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinhal; Ataxia Espinocerebelar de Início Infantil; Deficiência em Hexosaminidase A; Displasia Tanatofórica Tipo 1; Distúrbios Relacionados com Colagênio Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congênita; Síndrome de Wolf- Hirschhorn; Deficiência em Lipase Ácida Lisossomal; e Xeroderma Pigmentoso.
[0184] Como será aparente se prevê que o presente sistema possa ser usado para se dirigir a qualquer sequência de polinucleotídeos de interesse. Alguns exemplos de condições ou doenças que poderiam ser utilmente tratadas usando o presente sistema estão incluídos nas Tabelas acima e exemplos de genes correntemente associados a estas condições são também providos nelas. No entanto, os genes exemplificados não são exaustivos.
EXEMPLOS
[0185] Os seguintes exemplos são dados para a propósito de ilustração de várias formas de realização da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção de qualquer modo. Os presentes exemplos, em conjunto com os métodos descritos aqui, são presentemente representativos de formas de realização preferenciais, são exemplares, e não se pretendem como limitações no escopo da invenção. Alterações neles e outros usos que sejam englobados dentro do espírito da invenção como definido pelo escopo das reivindicações ocorrerão àqueles peritos na técnica.
Exemplo 1: Atividade do Complexo CRISPR no Núcleo de uma Célula Eucariótica
[0186] Um sistema CRISPR tipo II exemplar é o local de CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contém um agrupamento de quatro genes Cas9, Cas1, Cas2, e Csn1, bem como dois elementos de RNA não codificante, tracrRNA e um conjunto característico de sequências repetitivas (repetições diretas) interespaçadas por trechos curtos de sequências não repetitivas (espaçadores, cerca de 30 pb cada um) . Em este sistema, a quebra de fita dupla (DSB) de DNA dirigido é gerada em quatro passos sequenciais (Figura 2A). Em primeiro lugar, dois RNAs não codificantes, a matriz de pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos a partir do local de CRISPR. Em segundo lugar, o tracrRNA hibrida com as repetições diretas de pré-crRNA, que é depois processado em crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Em terceiro lugar, o complexo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 para o alvo de DNA consistindo no protoespaçador e no PAM correspondente através da formação de heterodúplex entre a região espaçadora do crRNA e do DNA protoespaçador. Finalmente, a Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo a montante de PAM para criar uma DSB dentro do protoespaçador (Figura 2A). Este exemplo descreve um processo exemplar para adaptar este sistema de nuclease programável por RNA para dirigir a atividade do complexo CRISPR nos núcleos das células eucarióticas.
[0187] Cultura e transfecção de células
[0188] A linha celular de rim embriônico de humano (HEK) HEK 293FT (Life Technologies) foi mantida em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10 % (HyClone), GlutaMAX a 2 mM (Life Technologies), penicilina a 100 U/mL, e estreptomicina a 100 μg/mL a 37 °C com incubação em CO2 a 5 %. A linha celular neuro2A de camundongo (N2A) (ATCC) foi mantida com DMEM suplementado com soro fetal de bovino a 5 % (HyClone) , GlutaMAX a 2 mM (Life Technologies), penicilina a 100 U/mL, e estreptomicina a 100 μg/mL a 37 °C com CO2 a 5 %.
[0189] As células HEK 293FT ou N2A foram inoculadas em placas de 24 poços (Corning) um dia antes da transfecção a uma densidade de 200.000 células por poço. As células foram transfectadas usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para cada poço da placa de 24 poços foi usado um total de 800 ng de plasmídeos.
[0190] Ensaio de Surveyor e análise de sequenciação para modificação do genoma
[0191] As células HEK 293FT ou N2A foram transfectadas com DNA de plasmídeo como descrito acima. Após transfecção, as células foram incubadas a 37 °C durante 72 horas antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico foi extraído usando o kit de extração de DNA QuickExtractt (Epicentre) seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, as células foram ressuspensas em solução QuickExtract e incubadas a 65 °C durante 15 minutos e 98 °C durante 10 minutos. O DNA genômico extraído foi imediatamente processado ou armazenado a -20 °C.
[0192] A região genômica rodeando um local de CRISPR alvo para cada gene foi amplificada por PCR, e os produtos foram purificados usando Coluna QiaQuick Spin (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. Um total de 400 ng dos produtos de PCR purificados foi misturado com 2 μL de 10X tampão de PCR de Taq polimerase (Enzymatics) e água ultrapura até um volume final de 20 μL, e submetido a um processo de reemparelhamento para permitir formação de heterodúplexes: 95 °C durante 10 min, 95 °C a 85 °C com rampa a - 2 °C/s, 85 °C a 25 °C a - 0,25 °C/s, e 25 °C mantidos durante 1 minuto. Após reemparelhamento, os produtos foram tratados com nuclease de Surveyor e intensificador S de Surveyor (Transgenomics) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, e analisados em géis de poliacrilamida Novex TBE a 4-20 % (Life Technologies). Os géis foram corados com corante de DNA SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos e visualizados com um sistema de visualização em gel Gel Doc (Bio-rad) . A quantificação foi baseada em intensidades de bandas relativas, como uma medida da fração de DNA clivado. A Figura 8 provê uma ilustração esquemática deste ensaio de Surveyor.
[0193] Ensaio de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição para detecção da recombinação homóloga.
[0194] As células HEK 293FT e N2A foram transfectadas com DNA de plasmídeo, e incubadas a 37 °C durante 72 horas antes da extração de DNA genômico como descrito acima. A região genômica alvo foi amplificada por PCR usando iniciadores fora dos braços de homologia do modelo de recombinação homóloga (HR) . Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose a 1 % e extraídos com Kit MinElute GelExtraction (Qiagen). Os produtos purificados foram digeridos com HindIII (Fermentas) e analisados em um gel de poliacrilamida Novex TBE a 6 % (Life Technologies).
[0195] Previsão e análise da estrutura secundária de RNA
[0196] A previsão da estrutura secundária de RNA realizada usando o webserver RNAfold desenvolvido no Institute for Theoretical Chemistry na University of Vienna, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (ver, p.ex., A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1) : 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151 62).
[0197] Ensaio de interferência da transformação de plasmídeo bacteriano
[0198] Elementos do local de CRISPR 1 de S. pyogenes suficientes para a atividade de CRISPR foram reconstituídos em E. coli usando plasmídeo pCRISPR (esquematicamente ilustrado na Figura 10A) . pCRISPR continha tracrRNA, SpCas9, e uma sequência líder conduzindo a matriz de crRNA. Espaçadores (também referidos como "sequências guia") foram inseridos na matriz de crRNA entre locais BsaI usando oligonucleotídeos emparelhados, como ilustrado. Plasmídeos de desafio usados no ensaio de interferência foram construídos por inserção da sequência protoespaçadora (também referida como uma "sequência guia") em conjunto com uma sequência motivo de CRISPR adjacente (PAM) em pUC19 (ver Figura 10B). O plasmídeo de desafio continha resistência à ampicilina. A Figura 10C provê uma representação esquemática do ensaio de Surveyor. Estirpes de E. coli quimicamente competentes já transportando pCRISPR e o espaçador apropriado foram transformadas com o plasmídeo de desafio contendo a sequência protoespaçadora-PAM correspondente. pUC19 foi usado para avaliar a eficácia de transformação de cada estirpe competente transportando pCRISPR. A atividade de CRISPR resultou na clivagem do plasmídeo pPSP transportando o protoespaçador, excluindo resistência à ampicilina de outro modo conferida por pUC19 não tendo o protoespaçador. A Figura 10D ilustra a competência de cada estirpe de E. coli transportando CRISPR usada em ensaios ilustrados na Figura 4C.
[0199] Purificação de RNA
[0200] As células HEK 293FT foram mantidas e transfectadas como indicado acima. As células foram coletadas por tripsinização seguida por lavagem em salino tamponado com fosfato (PBS). O RNA celular total foi extraído com reagente TRI (Sigma) seguindo o protocolo do fabricante. O RNA total extraído foi quantificado usando Nanodrop (Thermo Scientific) e normalizado até à mesma concentração.
[0201] Análise de transferência de Northern de expressão de crRNA e tracrRNA em células de mamífero
[0202] Os RNAs foram misturados com volumes iguais de 2X tampão de carga (Ambion), aquecidos até 95 °C durante 5 min, resfriados em gelo durante 1 min, e depois carregados em géis de poliacrilamida desnaturantes a 8 % (SequaGel, National Diagnostics) após pré-correr o gel durante pelo menos 30 minutos. As amostras foram sujeitas a eletroforese durante 1,5 horas a limite de 40 W. De seguida, o RNA foi transferido para membrana Hybond N+ (GE Healthcare) a 300 mA em um dispositivo de transferência semisseco (Bio-rad) à temperatura ambiente durante 1,5 horas. O RNA foi reticulado à membrana usando botão de autorreticulação em Stratagene UV Crosslinker the Stratalinker (Stratagene). A membrana foi pré-hibridizada em Tampão de Hibridização ULTRAhyb-Oligo (Ambion) durante 30 min com rotação a 42 °C, e sondas foram depois adicionadas e hibridizadas durante a noite. As sondas foram encomendadas da IDT e marcadas com [gama-32P] ATP (Perkin Elmer) com polinucleotídeo cinase T4 (New England Biolabs) . A membrana foi lavada uma vez com 2xSSC pré- aquecido (42 °C), SDS a 0,5 % durante 1 min seguido por duas lavagens de 30 minutos a 42 °C. A membrana foi exposta a um rastreio de fósforo durante uma hora ou durante a noite à temperatura ambiente e depois rastreada com um fosforimageador (Typhoon).
[0203] Construção e avaliação do sistema CRISPR bacteriano
[0204] Elementos do local de CRISPR, incluindo tracrRNA, Cas9, e líder foram amplificados por PCR a partir de DNA genômico de Streptococcus pyogenes SF370 com braços de homologia flanqueantes para Montagem de Gibson. Dois locais BsaI tipo IIS foram introduzidos entre duas repetições diretas para facilitar a inserção fácil de espaçadores (Figura 9) . Os produtos de PCRs foram clonados em pACYC184 digerido por EcoRV a jusante do promotor tet usando Mistura Principal de Montagem de Gibson (NEB). Outros elementos do sistema CRISPR endógeno foram omitidos, com a exceção dos últimos 50 pb de Csn2. Oligos (Integrated DNA Technology) codificando espaçadores com saliências complementares foram clonados no vetor digerido com Bsa I pDC000 (NEB) e depois ligados com ligase T7 (Enzymatics) para gerar plasmídeos pCRISPR. Plasmídeos de desafio contendo espaçadores com sequências PAM (também referidas aqui como “sequências motivo de CRISPR”) foram criados por ligação de oligos hibridados transportando saliências compatíveis (Integrated DNA Technology) em pUC19 digerido por BamHI. A clonagem para todos os constructos foi realizada na estirpe de E. coli JM109 ZZymo Research).
[0205] As células transportando pCRISPR foram tornadas competentes usando o Kit e Conjunto de Tampão de Transformação de E. coli Z-Competente (Zymo Research, T3001) de acordo com as instruções do fabricante. No ensaio de transformação, alíquotas de 50 uL de células competentes transportando pCRISPR foram descongeladas em gelo e transformadas com 1 ng de plasmídeo espaçador ou pUC19 em gelo durante 30 minutos, seguido por choque de calor de 45 segundos a 42 °C e 2 minutos em gelo. Subsequentemente, 250 uL de SOC (Invitrogen) foram adicionados seguido por incubação com agitação a 37 °C durante 1 hr, e 100 uL do crescimento extra pós-SOC foram plaqueados em placas de seleção dupla (cloranfenicol a 12,5 ug/mL, ampicilina a 100 ug/mL). Para se obterem cfu/ng de DNA, os números de colônias totais foram multiplicados por 3.
[0206] Para melhorar a expressão de componentes de CRISPR em células de mamífero, dois genes do local 1 de SF370 de Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) foram otimizados quanto aos códons, Cas9 (SpCas9) e RNase III (SpRNase III) . Para facilitar a localização nuclear, um sinal de localização nuclear (NLS) foi incluído no terminal amino (N) ou carboxila (C) de SpCas9 e SpRNase III (Figura 2B) . Para facilitar a visualização da expressão de proteínas, um marcador de proteína fluorescente foi também incluído no terminal N ou C de ambas as proteínas (Figura 2B) . Uma versão de SpCas9 com um NLS anexado a ambos os terminais N e C (2xNLS-SpCas9) foi também gerada. Constructos contendo SpCas9 e SpRNase III fundidas com NLS foram transfectados em células de rim embriônico de humano (HEK) 293FT, e se descobriu que o posicionamento relativo do NLS em relação a SpCas9 e SpRNase III afetava a sua eficácia de localização nuclear. Ao passo que o NLS C-terminal foi suficiente para dirigir SpRNase III ao núcleo, a anexação de uma única cópia destes NLSs particulares ao terminal N ou C de SpCas9 foi incapaz de alcançar localização nuclear adequada em este sistema. Em este exemplo, o NLS C-terminal foi aquele da nucleoplasmina (KRPAATKKAGQAKKKK), e o NLS C-terminal foi aquele do grande antigênio T de SV40 (PKKKRKV). Das versões de SpCas9 testadas, somente 2xNLS-SpCas9 exibiu localização nuclear (Figura 2B).
[0207] O tracrRNA do local de CRISPR de S. pyogenes SF370 tinha dois locais de início transcricional, dando origem a dois transcritos de 89 nucleotídeos (nt) e 171 nt que são subsequentemente processados em tracrRNAs maduros com 75 nt. O tracrRNA de 89 nt mais curto foi selecionado para expressão em células de mamífero (constructos de expressão ilustrados na Figura 7A, com funcionalidade como determinada por resultados do ensaio de Surveyor mostrado na Figura 7B). Os locais de início da transcrição são marcados como +1, e o terminador da transcrição e a sequência sondada por transferência de Northern são também incluídos. A expressão de tracrRNA processado foi também confirmada por transferência de Northern. A Figura 7C mostra os resultados de uma análise de transferência de Northern de RNA total extraído das células 293FT transfectadas com constructos de expressão U6 transportando tracrRNA longo ou curto, bem como SpCas9 e DR-EMX1(1)-DR. Os painéis direito e esquerdo são de células 293FT transfectadas sem ou com SpRNase III, respectivamente. U6 indica controle de carga manchado com uma sonda se dirigindo a snRNA de U6 de humano. A transfecção do constructo de expressão de tracrRNA curto leva a níveis abundantes da forma processada de tracrRNA (~75 pb) . Quantidades muito baixas de tracrRNA longo são detectadas na transferência de Northern.
[0208] Para promover início da transcrição precisa, o promotor U6 baseado em RNA polimerase III foi selecionado para conduzir a expressão de tracrRNA (Figura 2C) . Similarmente, um constructo baseado no promotor U6 foi desenvolvido para expressar uma matriz de pré-crRNA consistindo em um único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DRs, também englobadas pelo termo “sequências tracr mates”; Figura 2C) . O espaçador inicial foi desenhado para se dirigir a um local alvo com 33 pares de bases (pb) (protoespaçador com 30 pb mais uma sequência motivo (PAM) de CRISPR com 3 pb satisfazendo o motivo de reconhecimento NGG de Cas9) no local EMX1 de humano (Figura 2C), um gene-chave no desenvolvimento do córtex cerebral.
[0209] Para testar se a expressão heteróloga do sistema CRISPR (SpCas9, SpRNase III, tracrRNA, e pré-crRNA) em células de mamífero pode alcançar clivagem dirigida de cromossomos de mamífero, as células HEK 293FT foram transfectadas com combinações de componentes de CRISPR. Uma vez que as DSBs em núcleos de mamífero são parcialmente reparadas pela via da junção de extremidades não homólogas, o que leva à formação de indels, o ensaio de Surveyor foi usado para detectar a atividade de clivagem potencial no local EMX1 alvo (Figura 8) (ver, p.ex., Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247) . A cotransfecção de todos os quatro componentes de CRISPR foi capaz de induzir até 5,0 % de clivagem no protoespaçador (ver Figura 2D) . A cotransfecção de todos os componentes de CRISPR menos SpRNase III induziu também até 4,7 % de indel no protoespaçador, sugerindo que possam existir RNases de mamífero endógenas que são capazes de ajudar a maturação de crRNA, tal como por exemplo as enzimas Dicer e Drosha relacionadas. A remoção de qualquer um dos três componentes restantes eliminou a atividade de clivagem do genoma do sistema CRISPR (Figura 2D). A sequenciação de Sanger de amplicons contendo o local alvo verificou a atividade de clivagem: em 43 clones sequenciados foram encontrados 5 alelos mutados (11,6 %) . Experiências similares usando uma variedade de sequências guia produziram percentagens de indel tão elevadas quanto 29 % (ver Figuras 4-7, 12, e 13). Estes resultados definem um sistema de três componentes para modificação do genoma mediada por CRISPR eficaz em células de mamífero. Para otimizar a eficácia de clivagem, os Requerentes testaram também se diferentes isoformas de tracrRNA afetavam a eficácia de clivagem e descobriram que, em este sistema exemplar, somente a forma de transcrito curta (89 pb) foi capaz de mediar a clivagem do local genômico EMX1 de humano (Figura 7B).
[0210] A Figura 14 provê uma análise de transferência de Northern adicional do processamento de crRNA em células de mamífero. A Figura 14A ilustra um esquema mostrando o vetor de expressão para um único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DR-EMX1(1)-DR). O espaçador de 30 pb se dirigindo ao protoespaçador do local EMX1 de humano 1 (ver Figura 6) e as sequências de repetição direta são mostrados na sequência por baixo da Figura 14A. A linha indica a região cuja sequência de complemento reverso foi usada para gerar sondas de transferência de Northern para detecção de crRNA de EMX1(1). A Figura 14B mostra uma análise de transferência de Northern de RNA total extraído das células 293FT transfectadas com constructos de expressão U6 transportando DR-EMX1(1)-DR. Os painéis direito e esquerdo são de células 293FT transfectadas sem ou com SpRNase III, respetivamente. DR-EMX1(1)-DR foi processado em crRNAs maduros somente na presença de SpCas9 e tracrRNA curto e não estava dependente da presença de SpRNase III. O crRNA maduro detectado a partir do RNA total de 293FT transfectado tem ~33 pb e é mais curto do que o crRNA maduro de 39-42 pb de S. pyogenes. Estes resultados demonstram que um sistema CRISPR pode ser transplantado em células eucarióticas e reprogramado para facilitar a clivagem de polinucleotídeos alvo de mamíferos endógenos.
[0211] A Figura 2 ilustra o sistema CRISPR bacteriano descrito em este exemplo. A Figura 2A ilustra um esquema mostrando o local de CRISPR 1 de Streptococcus pyogenes SF370 e um mecanismo proposto de clivagem de DNA mediada por CRISPR por este sistema. CrRNA maduro processado a partir da matriz de repetição direta-espaçador dirige Cas9 para alvos genômicos consistindo em protoespaçadores complementares e um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM). Após emparelhamento de bases alvo-espaçador, Cas9 medeia uma quebra de fita dupla no DNA alvo. A Figura 2B ilustra a manipulação de Cas9 (SpCas9) e RNase III (SpRNase III) de S. pyogenes com sinais de localização nuclear (NLSs) para permitir importação para o núcleo de mamíferos. A Figura 2C ilustra a expressão em mamíferos de SpCas9 e SpRNase III conduzida pelo promotor EF1a constitutivo e matriz de tracrRNA e pré-crRNA (DR-Espaçador-DR) conduzido pelo promotor U6 de RNA Pol3 para promover o início e terminação da transcrição precisos. Um protoespaçador do local Emxl de humano com uma sequência PAM satisfatória é usado como o espaçador na matriz de pré-crRNA. A Figura 2D ilustra o ensaio de nuclease de Surveyor para inserções e deleções menores mediadas por SpCas9. SpCas9 foi expressa com e sem SpRNase III, tracrRNA, e uma matriz de pré-crRNA transportando o espaçador com alvo EMX1. A Figura 2E ilustra uma representação esquemática de emparelhamento de bases entre local alvo e crRNA se dirigindo a EMX1, bem como um cromatograma exemplar mostrando uma microdeleção adjacente ao local de clivagem SpCas9. A Figura 2F ilustra alelos mutados identificados a partir da análise de sequenciação de 43 amplicons clonais mostrando uma variedade de microinserções e deleções. Os traços indicam bases eliminadas, e as bases não alinhadas ou não correspondidas indicam inserções ou mutações. Barra de escala = 10 μm.
[0212] Para simplificar adicionalmente o sistema de três componentes, um desenho de híbrido crRNA-tracrRNA quimérico foi adaptado, onde um crRNA maduro (compreendendo uma sequência guia) é fundida com um tracrRNA parcial através de uma haste-alça para mimetizar o dúplex crRNA:tracrRNA natural (Figura 3A) . Para aumentar a eficácia de codistribuição, um vetor de expressão bicistrônico foi criado para conduzir a coexpressão de um RNA quimérico e SpCas9 em células transfectadas (Figuras 3A e 8) . Em paralelo, os vetores bicistrônicos foram usados para expressar um pré-crRNA (DR-sequência guia-DR) com SpCas9, para induzir processamento em crRNA com um tracrRNA separadamente expresso (comparar Figura 13B topo e fundo). A Figura 9 provê ilustrações esquemáticas de vetores de expressão bicistrônicos para matriz de pré-crRNA (Figura 9A) ou crRNA quimérico (representado pela linha curta a jusante do local de inserção da sequência guia e a montante do promotor EF1α na Figura 9B) com hSpCas9, mostrando localização de vários elementos e o ponto de inserção da sequência guia. A sequência expandida em torno da localização do local de inserção da sequência guia na Figura 9B mostra também uma sequência de DR parcial (GTTTAGAGCTA) e uma sequência de tracrRNA parcial (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT). As sequências guia podem ser inseridas entre locais BbsI usando oligonucleotídeos emparelhados. O desenho de sequências para os oligonucleotídeos é mostrado em baixo das ilustrações esquemáticas na Figura 9, com os adaptadores de ligação adequados indicados. WPRE representa o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite Woodchuck. A eficácia de clivagem mediada por RNA quimérico foi testada por direcionamento do mesmo local EMX1 descrito acima. Usando o ensaio de Surveyor e sequenciação de Sanger dos amplicons, os Requerentes confirmaram que o desenho do RNA quimérico facilita a clivagem do local EMX1 de humano com aproximadamente uma taxa de modificação de 4,7 % (Figura 4).
[0213] A generalização da clivagem mediada pela CRISPR em células eucarióticas foi testada por direcionamento dos locais genômicos adicionais em células de humano e de camundongo por desenho de múltiplos locais de direcionamento de RNA quimérico em EMX1 e PVALB de humano, bem como os locais Th de camundongo. A Figura 15 ilustra a seleção de alguns protoespaçadores dirigidos adicionais em PVALB de humano (Figura 15A) e Th de camundongo (Figura 15B) . São providos esquemas dos locais de genes e da localização de três protoespaçadores dentro do último éxon. As sequências sublinhadas incluem 30 pb da sequência protoespaçadora e 3 pb na extremidade 3’ correspondendo às sequências PAM. Os protoespaçadores na fita senso e antissenso são indicados em cima e em baixo das sequências de DNA, respectivamente. Uma taxa de modificação de 6,3 % e 0,75 % foi alcançada para os locais de PVALB de humano e Th de camundongo, respectivamente, demonstrando a ampla aplicabilidade do sistema CRISPR na modificação de diferentes locais ao longo de múltiplos organismos (Figuras 3B e 6). Embora a clivagem tenha sido somente detectada com um de três espaçadores para cada local usando os constructos quiméricos, todas as sequências alvo foram clivadas com eficácia de produção de indels alcançando 27 % quando se usou a disposição de pré- crRNA coexpresso (Figura 6) .
[0214] A Figura 13 provê uma ilustração adicional de que SpCas9 pode ser reprogramada para se dirigir a múltiplos locais genômicos em células de mamífero. A Figura 13A provê um esquema do local EMX1 de humano mostrando a localização de cinco protoespaçadores, indicados pelas sequências sublinhadas. A Figura 13B provê um esquema do complexo pré- crRNA/trcrRNA mostrando hibridização entre a região de repetição direta do pré-crRNA e tracrRNA (topo), e um esquema de um desenho de RNA quimérico compreendendo uma sequência guia de 20 pb, e sequências tracr mates e tracr consistindo em sequências de repetição direta parciais e tracrRNA hibridizadas em uma estrutura em grampo (fundo). Os resultados de um ensaio de Surveyor comparando a eficácia de clivagem mediada por Cas9 em cinco protoespaçadores no local EMX1 de humano são ilustrados na Figura 13C. Cada protoespaçador é dirigido usando o complexo pré- crRNA/tracrRNA (crRNA) processado ou RNA quimérico (chiRNA).
[0215] Uma vez que a estrutura secundária do RNA pode ser crucial para as interações moleculares, um algoritmo de previsão de estrutura baseado na energia mínima livre e conjunto da estrutura ponderada de Boltzmann foi usado para comparar a estrutura secundária putativa de todas as sequências guia usadas na experiência de direcionamento genômico (Figura 3B) (ver, p.ex., Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). A análise revelou que, na maioria dos casos, as sequências guia efetivas no contexto de crRNA quimérico estavam substancialmente isentas de motivos da estrutura secundária, ao passo que era mais provável que as sequências guia não efetivas formassem estruturas secundárias internas que pudessem prevenir o emparelhamento de bases com o DNA de protoespaçador alvo. É assim possível que a variabilidade na estrutura secundária do espaçador possa impactar a eficácia de interferência mediada por CRISPR quando se usa um crRNA quimérico.
[0216] A Figura 3 ilustra vetores de expressão exemplares. A Figura 3A provê um esquema de um vetor bicistrônico para condução da expressão de uma quimera crRNA- tracrRNA sintética (RNA quimérica) bem como SpCas9. O RNA guia quimérico contém uma sequência guia com 20 pb correspondendo ao protoespaçador no local alvo genômico. A Figura 3B provê um esquema mostrando sequências guias se dirigindo aos locais EMX1, PVALB de humano, e Th de camundongo, bem como suas estruturas secundárias previstas. A eficácia de modificação em cada local alvo é indicado em baixo do desenho da estrutura secundária do RNA (EMX1, n = 216 leituras de sequenciação de amplicon; PVALB, n = 224 leituras; Th, n = 265 leituras) . O algoritmo de dobragem produziu um resultado com cada base colorida de acordo com a sua probabilidade de assumir a estrutura secundária prevista, como indicado por uma escala em arco-íris que é reproduzida na Figura 3B em escala de cinza. Desenhos de vetores adicionais para SpCas9 são mostrados na Figura 44, que ilustra vetores de expressão únicos incorporando um promotor U6 ligado a um local de inserção para um oligo guia, e um promotor Cbh ligado à sequência de codificação de SpCas9. O vetor mostrado na Figura 44b inclui uma sequência de codificação de tracrRNA ligada a um promotor H1.
[0217] Para testar se espaçadores contendo estruturas secundárias são capazes de funcionar em células procarióticas onde as CRISPRs operam naturalmente, a interferência de transferência de plasmídeos transportando protoespaçadores foram testados em uma estirpe de E. coli heterologamente expressando o local de CRISPR 1 de S. pyogenes SF370 (Figura 10) . O local de CRISPR foi clonado em um vetor de expressão de E. coli de baixa cópia e a matriz de crRNA foi substituída por um único espaçador flanqueado por um par de DRs (pCRISPR) . As estirpes de E. coli abrigando diferentes plasmídeos pCRISPR foram transformadas com plasmídeos de desafio contendo as sequências protoespaçadoras e PAM correspondentes (Figura 10C) . No ensaio bacteriano, todos os espaçadores facilitaram a interferência de CRISPR eficaz (Figura 4C). Estes resultados sugerem que podem existir fatores adicionais afetando a eficácia da atividade de CRISPR em células de mamífero.
[0218] Para investigar a especificidade da clivagem mediada por CRISPR, o efeito de mutações de nucleotídeo único na sequência guia na clivagem por protoespaçador no genoma de mamífero foi analisado usando uma série de crRNAs quiméricos se dirigindo a EMX1 com mutações de ponto único (Figura 4A). A Figura 4B ilustra os resultados de um ensaio de nuclease de Surveyor comparando a eficácia de clivagem por Cas9 quando emparelhada com diferentes RNAs quiméricos mutantes. As não correspondências de base única até 12 pb 5' do PAM anularam substancialmente a clivagem genômica por SpCas9, ao passo que espaçadores com mutações em posições mais a montante retiveram a atividade contra o alvo de protoespaçador original (Figura 4B). Adicionalmente ao PAM, SpCas9 tem especificidade de base única dentro dos últimos 12 pb do espaçador. Além do mais, CRISPR é capaz de mediar a clivagem genômica tão eficazmente como um par de nucleases TALE (TALEN) se dirigindo ao mesmo protoespaçador de EMX1. A Figura 4C provê um esquema mostrando o desenho de TALENs se dirigindo a EMX1, e a Figura 4D mostra um gel de Surveyor comparando a eficácia de TALEN e Cas9 (n=3).
[0219] Tendo estabelecido um conjunto de componentes para alcançar edição de genes mediada por CRISPR em células de mamífero através do mecanismo NHEJ propenso a erros foi testada a capacidade de CRISPR de estimular a recombinação homóloga (HR), uma via de reparação de genes de elevada fiabilidade para fazer edições precisas no genoma. A SpCas9 de tipo selvagem é capaz de mediar DSBs sítio-específicas, que podem ser reparadas através de NHEJ e HR. Adicionalmente, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de SpCas9 foi manipulada para converter a nuclease em uma nickase (SpCas9n; ilustrada na Figura 5A) (ver, p.ex., Sapranausaks et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), tal que o DNA genômico cortado seja submetido a reparação dirigida por homologia de elevada fidelidade (HDR). O ensaio de Surveyor confirmou que SpCas9n não gera indels no alvo protoespaçador de EMX1. Como ilustrado na Figura 5B, a coexpressão de crRNA quimérico se dirigindo a EMX1 com SpCas9 produziu indels no local alvo, ao passo que a coexpressão com SpCas9n não (n=3) . Além do mais, a sequenciação de 327 amplicons não detecta quaisquer indels induzidas por SpCas9n. O mesmo local foi selecionado para testar HR mediada por CRISPR por cotransfecção de células HEK 293FT com o RNA quimérico se dirigindo a EMX1, hSpCas9 ou hSpCas9n, bem como um modelo de HR para introduzir um par de locais de restrição (HindIII e NheI) próximo do protoespaçador. A Figura 5C provê uma ilustração esquemática da estratégia de HR, com localizações relativas de pontos de recombinação e sequências iniciadoras de emparelhamento (setas). SpCas9 e SpCas9n catalisaram de fato a integração do modelo de HR no local EMX1. A amplificação por PCR da região alvo seguida de digestão por restrição com HindIII revelou produtos de clivagem correspondendo a tamanhos de fragmentos esperados (setas na análise por gel de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, mostrada na Figura 5D) , com SpCas9 e SpCas9n mediando níveis similares de eficácias de HR. Os Requerentes verificaram adicionalmente a HR usando sequenciação de Sanger de amplicons genômicos (Figura 5E) . Estes resultados demonstram a utilidade de CRISPR para facilitar a inserção de genes dirigida no genoma de mamíferos. Dada a especificidade do alvo de 14 pb (12 pb a partir do espaçador e 2 pb do PAM) de SpCas9 de tipo selvagem, a disponibilidade de uma nickase pode reduzir significativamente a probabilidade de modificações fora do alvo, uma vez que quebras de fita única não são substratos para a via NHEJ propensa a erros.
[0220] Constructos de expressão mimetizando a arquitetura natural dos locais de CRISPR com espaçadores dispostos (Figura 2A) foram construídos para se testar a possibilidade de direcionamento de sequência multiplexada. Usando uma única matriz de CRISPR codificando um par de espaçadores se dirigindo a EMX1 e PVAL foi detectada clivagem eficaz em ambos os locais (Figura 4F, mostrando um desenho esquemático da matriz de crRNA e uma transferência de Surveyor mostrando mediação de clivagem eficaz). A deleção dirigida de regiões genômicas maiores através de DSBs simultâneas usando espaçadores contra dois alvos dentro de EMX1 espaçados por 119 pb foi também testada, e foi detectada uma eficácia de deleção de 1,6 % (3 de 182 amplicons; Figura 4G) . Isto demonstra que o sistema CRISPR consegue mediar a edição multiplexada dentro de um único genoma.
Exemplo 2: Modificações e alternativas do sistema CRISPR
[0221] A capacidade de usar RNA para programar clivagem de DNA específica à sequência define uma nova classe de ferramentas de manipulação do genoma para uma variedade de aplicações de investigação e industriais. Vários aspectos do sistema CRISPR podem ser adicionalmente melhorados para aumentar a eficácia e versatilidade do direcionamento de CRISPR. A atividade de Cas9 ótima pode depender da disponibilidade de Mg2+ livre em níveis mais elevados do que aqueles presentes no núcleo de mamíferos (ver, p.ex., Jinek et al., 2012, Science, 337:816), e a preferência para um motivo NGG imediatamente a jusante do protoespaçador restringe a capacidade de se dirigir em média a cada 12 pb no genoma de humano (Figura 11, avaliando ambas as fitas mais e menos de sequências cromossomais de humano). Algumas destas limitações podem ser superadas por exploração da diversidade de locais de CRISPR ao longo do metagenoma microbiano (ver, p.ex., Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9:467) . Outros locais de CRISPR podem ser transplantados no meio celular de mamíferos por um processo similar àquele descrito no Exemplo 1. Por exemplo, a Figura 12 ilustra a adaptação do sistema CRISPR Tipo II a partir de CRISPR 1 de Streptococcus thermophilus LMD-9 para expressão heteróloga em células de mamífero para alcançar edição do genoma mediada por CRISPR. A Figura 12A proporciona uma Ilustração esquemática de CRISPR 1 de S. thermophilus LMD- 9. A Figura 12B ilustra o desenho de um sistema de expressão para o sistema CRISPR de S. thermophilus. hStCas9 de códon otimizado de humano é expresso usando um promotor EF1α constitutivo. Versões maduras de tracrRNA e crRNA são expressas usando o promotor U6 para promover o início da transcrição precisa. Sequências do crRNA e tracrRNA maduros são ilustradas. Uma base única indicada pela letra minúscula "a" na sequência de crRNA é usada para remover a sequência de poliU, que serve como um terminador transcricional de RNA polIII. A Figura 13C provê um esquema mostrando sequências guias se dirigindo ao local EMX1 de humano, bem como suas estruturas secundárias previstas. A eficácia de modificação em cada local alvo é indicada em baixo das estruturas secundárias de RNA. O algoritmo gerando as estruturas colora cada base de acordo com a sua probabilidade de assumir a estrutura secundária prevista, que é indicada por uma escala em arco-íris reproduzida na Figura 12C em escala de cinza. A Figura 12D mostra os resultados de clivagem mediada por hStCas9 no local alvo usando o ensaio de Surveyor. Espaçadores guia de RNA 1 e 2 induziram 14 % e 6,4 %, respectivamente. A análise estatística da atividade de clivagem ao longo de réplicas biológicas em estes dois locais protoespaçadores é também provida na Figura 6. A Figura 16 provê um esquema de alvos de sequência protoespaçadora adicional e PAM correspondente adicionais do sistema CRISPR de S. thermophilus no local EMX1 de humano. Duas sequências protoespaçadoras são destacadas e suas sequências PAM correspondentes satisfazendo o motivo NNAGAAW estão indicadas por sublinhado de 3' no que diz respeito à sequência destacada correspondente. Ambos os protoespaçadores se dirigem à fita antissenso.
Exemplo 3: Algoritmo de seleção de sequências de amostra alvo
[0222] Um programa de software é desenhado para identificar sequências alvo de CRISPR candidatas em ambas as fitas de uma sequência de DNA de entrada com base no comprimento da sequência guia desejado e uma sequência do motivo de CRISPR (PAM) para uma enzima CRISPR especificada. Por exemplo, locais alvo para Cas9 de S. pyogenes, com sequências NGG de PAM, podem ser identificados por procura de 5'-Nx-NGG-3' tanto na sequência de entrada como no complemento reverso da entrada. Do mesmo modo, locais alvo para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, com sequência NNAGAAW de PAM, podem ser identificados por procura de 5'- Nx-NNAGAAW-3', tanto na sequência de entrada como no complemento reverso da entrada. Do mesmo modo, locais alvo para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus, com sequência NGGNG de PAM, podem ser identificados por procura de 5'-Nx-NGGNG- 3', tanto na sequência de entrada como no complemento reverso da entrada. O valor "x" em Nx pode ser fixado pelo programa ou especificado pelo usuário, tal como 20.
[0223] Uma vez que múltiplas ocorrências no genoma do local alvo do DNA podem levar a edição do genoma não específica, após identificação de todos os locais potenciais, o programa filtra as sequências com base no número de vezes que aparecem no genoma de referência relevante. Para aquelas enzimas CRISPR para as quais a especificidade de sequência é determinada por uma sequência "semente", tal como o 11-12 pb 5' a partir da sequência PAM, incluindo a própria sequência PAM, o passo de filtragem pode ser baseado na sequência semente. Assim, para evitar edição em locais genômicos adicionais, os resultados são filtrados com base no número de ocorrências da sequência semente:PAM no genoma relevante. Se pode permitir que o usuário escolha o comprimento da sequência semente. Se pode também permitir que o usuário especifique o número de ocorrências da sequência semente:PAM em um genoma para propósitos de passagem do filtro. O padrão é rastrear sequências únicas. O nível de filtragem é alterado por mudança tanto do comprimento da sequência semente como do número de ocorrências da sequência no genoma. O programa pode adicional ou alternativamente prover a sequência de uma sequência guia complementar da(s) sequência(s) alvo relatada(s) provendo o complemento reverso da(s) sequência(s) alvo identificada(s).
[0224] Detalhes adicionais de métodos e algoritmos para otimizar a seleção de sequências podem ser encontrados no pedido dos E.U.A. N°. de Série 61/836.080 (registro do procurador 44790.11.2022; Referência Broad BI-2012/084); incorporado aqui por referência.
Exemplo 4: Avaliação de múltiplos híbridos crRNA- tracrRNA quiméricos
[0225] Este exemplo descreve os resultados obtidos para RNAs quiméricos (chiRNAs; compreendendo uma sequência guia, uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr em um único transcrito) tendo sequências tracr que incorporam diferentes comprimentos da sequência de tracrRNA de tipo selvagem. A Figura 18a ilustra um esquema de um vetor de expressão bicistrônico para RNA quimérico e Cas9. Cas9 é conduzida pelo promotor CBh e o RNA quimérico é conduzida por um promotor U6. O RNA guia quimérico consiste em uma sequência guia com 20 pb (Ns) unida à sequência tracr (compreendido entre o primeiro "U" da fita inferior até à extremidade do transcrito), que é truncada em várias posições como indicado. As sequências guia e tracr são separadas pela sequência tracr mate GUUUUAGAGCUA seguida pela sequência em alça GAAA. Os resultados de ensaios de SURVEYOR para indels mediadas por Cas9 em locais EMX1 e PVALB de humano são ilustrados nas Figuras 18b e 18c, respectivamente. As setas indicam os fragmentos de SURVEYOR esperados. Os chiRNAs são indicadas pela sua designação "+n", e crRNA se refere a um RNA híbrido onde as sequências guia e tracr são expressas como transcritos separados. A quantificação destes resultados, realizada em triplicado, é ilustrada por histograma nas Figuras 19a e 19b, correspondendo às Figuras 18b e 18c, respectivamente ("N.D." indica nenhumas indels detectadas). IDs dos protoespaçadores e seus alvos genômicos correspondentes, sequência protoespaçadora, sequência PAM, e localização da fita são providos na Tabela D. As sequências guias foram desenhadas para serem complementares à sequência protoespaçadora inteira no caso de transcritos separados no sistema híbrido, ou apenas à porção sublinhada no caso de RNAs quiméricos. Tabela D:
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[0226] Cultura e transfecção de células
[0227] A linha celular de rim embriônico de humano (HEK) 293FT (Life Technologies) foi mantida em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10 % (HyClone), GlutaMAX a 2 mM (Life Technologies), penicilina a 100 U/mL, e estreptomicina a 100 μg/mL a 37 °C com incubação em CO2 a 5 %. As células 293FT foram inoculadas em placas de 24 poços (Corning) 24 horas antes da transfecção a uma densidade de 150.000 células por poço. As células foram transfectadas usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para cada poço da placa de 24 poços foi usado um total de 500 ng de plasmídeos.
[0228] Ensaio de SURVEYOR para modificação do genoma
[0229] As células 293FT foram transfectadas com DNA de plasmídeo como descrito acima. As células foram incubadas a 37 °C durante 72 horas pós-transfecção antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico foi extraído usando a Solução de Extração de DNA QuickExtractt (Epicentre) seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, as células peletizadas foram ressuspensas em solução QuickExtract e incubadas a 65 °C durante 15 minutos e 98 °C durante 10 minutos. A região genômica flanqueando o local de CRISPR alvo para cada gene foi amplificado por PCR (iniciadores listados na Tabela E), e os produtos foram purificados usando Coluna QiaQuick Spin (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. Um total de 400 ng dos produtos de PCR purificados foi misturado com 2 μL de 10X tampão de PCR de Taq DNA Polimerase (Enzymatics) e água ultrapura até um volume final de 20 μL, e submetido a um processo de reemparelhamento para permitir formação de heterodúplexes: 95 °C durante 10 min, 95 °C a 85 °C com rampa a -2 °C/s, 85 °C a 25 °C a -0,25 °C/s, e 25 °C mantidos durante 1 minuto. Após reemparelhamento, os produtos foram tratados com nuclease de SURVEYOR e intensificador S de SURVEYOR (Transgenomics) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, e analisados em géis de poliacrilamida Novex TBE a 4-20 % (Life Technologies). Os géis foram corados com corante de DNA SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos e visualizados com um sistema de visualização em gel Gel Doc (Bio-rad) . A quantificação foi baseada em intensidades de bandas relativas. Tabela E:
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[0230] Identificação computacional de locais alvo de CRISPR únicos
[0231] Para identificar locais alvo únicos para a enzima Cas9 de S. pyogenes SF370 (SpCas9) no genoma de humano, rato, peixe-zebra, fruta da mosca, e C. elegans desenvolvemos um pacote de software para rastrear ambas as fitas de uma sequência de DNA e identificar todos os possíveis locais alvo de SpCas9. Para este exemplo, cada local alvo de SpCas9 foi operacionalmente definido como uma sequência de 20 pb seguida por uma sequência protoespaçadora adjacente (PAM) NGG, e identificámos todas as sequências satisfazendo esta definição de 5’-N20-NGG-3’ em todos os cromossomos. Para prevenir edição do genoma não específica, após identificação de todos os locais potenciais, todos os locais alvo foram filtrados com base no número de vezes que aparecem no genoma de referência relevante. Para tirar vantagem de especificidade de sequência da atividade de Cas9 conferida por uma sequência "semente", que pode ser, por exemplo, sequência com aproximadamente 11-12 pb 5’ a partir da sequência PAM, sequências 5’-NNNNNNNNNN-NGG-3’ foram selecionadas como sendo únicas no genoma relevante. Todas as sequências genômicas foram baixadas do Browser do Genoma UCSC (Genoma de humano hg19, Genoma de camundongo mm9, Genoma de rato rn5, Genoma de peixe-zebra danRer7, Genoma de D. melanogaster dm4 e Genoma de C. elegans ce10). Os resultados de pesquisa completa estão disponíveis para procurar usando informação do Browser do Genoma UCSC. Uma visualização exemplar de alguns locais alvo no genoma de humano é provida na Figura 21.
[0232] Inicialmente, três locais dentro do local EMX1 em células HEK 293FT humanas foram dirigidos. A eficácia de modificação do genoma de cada chiRNA foi avaliada usando o ensaio de nuclease de SURVEYOR, que detecta mutações resultando de quebra de fita dupla de DNA (DSBs) e sua reparação subsequente pela via de reparação de danos de DNA por junção das extremidades não homóloga (NHEJ). Os constructos designados chiRNA(+n) indicam que até ao nucleotídeo +n de tacrRNA de tipo selvagem é incluído no constructo de RNA quimérico, com valores de 48, 54, 67, e 85 usados para n. Os RNAs quiméricos contendo fragmentos mais longos de tracrRNA de tipo selvagem (chiRNA(+67) e chiRNA(+85)) mediaram a clivagem de DNA em todos os três locais alvo EMX1, com chiRNA(+85) demonstrando em particular níveis significativamente mais elevados de clivagem de DNA do que os híbridos crRNA/tracrRNA correspondentes que expressaram sequências guia e tracr em transcritos separados (Figuras 18b e 19a) . Dois locais no local PVALB que não originaram clivagem detectável usando o sistema híbrido (sequência guia e sequência tracr expressas como transcritos separados) foram também dirigidos usando chiRNAs. chiRNA(+67) e chiRNA(+85) foram capazes de mediar clivagem significativa nos dois protoespaçadores de PVALB (Figuras 18c e 19b).
[0233] Para todos os cinco alvos nos locais EMX1 e PVALB foi observado um aumento consistente na eficácia de modificação do genoma com comprimento da sequência tracr crescente. Sem desejar estar limitado por qualquer teoria, a estrutura secundária formada pela extremidade 3' do tracrRNA pode desempenhar um papel na intensificação da taxa de formação do complexo CRISPR. Uma ilustração de estruturas secundárias previstas para cada um dos RNAs usados em este exemplo é provida na Figura 21. A estrutura secundária foi prevista usando RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin/RNAfold.cgi) usando algoritmo de energia mínima livre e função de partição. A pseudocor para cada base (reproduzida em escala de cinza) indica a probabilidade de emparelhamento. Porque os chiRNAs com sequências tracr mais longas foram capazes de clivar alvos que não foram clivados por híbridos crRNA/tracrRNA de CRISPR nativos é possível que o RNA quimérico possa ser carregado em Cas9 mais eficazmente do que a sua contraparte híbrida nativa. Para facilitar a aplicação de Cas9 para edição do genoma sítio-específica em células e organismos eucarióticos, todos os locais alvo únicos previstos para a Cas9 de S. pyogenes foram computacionalmente identificados nos genomas de humano, camundongo, rato, peixe-zebra, C. elegans, e D. melanogaster. RNAs quiméricos podem ser desenhados para enzimas Cas9 de outros micróbios para expandir o espaço alvo de nucleases programáveis por RNA de CRISPR.
[0234] A Figura 22 ilustra um vetor de expressão bicistrônico exemplar para expressão de RNA quimérico incluindo até ao nucleotídeo +85 de sequência de RNA tracr de tipo selvagem, e SpCas9 com sequências de localização nuclear. SpCas9 é expressa a partir de um promotor CBh e terminada com o sinal de poliA bGH (bGH pA) . A sequência expandida ilustrada imediatamente em baixo do esquema corresponde à região rodeando o local de inserção da sequência guia, e inclui, de 5’ para 3’ , porção 3’ do promotor U6 (primeira região sombreada), locais de clivagem de BbsI (setas), repetição direta parcial (sequência tracr mate GTTTTAGAGCTA, sublinhada) , sequência em alça GAAA, e sequência tracr +85 (sequência sublinhada após sequência em ansa) . Uma inserção de sequência guia exemplar é ilustrada em baixo do local de inserção da sequência guia, com nucleotídeos da sequência guia para um alvo selecionado representado por um "N".
[0235] As sequências descritas nos exemplos acima são como se segue (as sequências de polinucleotídeos são 5’ para 3’):
[0236] U6-tracrRNA curto (Streptococcus pyogenes SF370):
[0237] GAG GGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATAC GATA CAAG GCTGT TAGAGAGATAAT T GGAAT TAAT T T GAC T G TAAACACAAAGATAT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGT TTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATAT CTTGT GGAAAGGAC GAAACACCGGAACCAT TCAAAACAGCATAGCAAGTTAAA ATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC TTTTT T (negrito = sequência de tracrRNA; sublinhado = sequência terminadora)
[0238] U6-tracrRNA longo (Streptococcus pyogenes SF370):
[0239] GAGGGCC TAT TTCC CAT GAT TCCTT CATAT T T GCATATAC GATA CAAG GCTGT TAGAGAGATAAT T GGAAT TAAT T T GAC T G TAAACACAAAGATAT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGT TTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATAT CTTGT GGAAAGGAC GAAACACCGG TAGTAT TAAG TAT TGTTTTATGGCT GATA AATTTCTTTGAATTTCTCCTTGATTATTTGTTATAAAAGTTATAAAATAATCTTGTTGG AACCATT CAAAACAG CATAG CAAG T TAAAATAAG GCTAGTCCGTTAT CAAC T T GAAAAA GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0240] U6-DR-estrutura principal de BbsI-DR (Streptococcus pyogenes SF370):
[0241] GAG GGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATAC GATA CAAG GCTGT TAGAGAGATAAT T GGAAT TAAT T T GAC T G TAAACACAAAGATAT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGT TTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTC CCAAAACGGGTCTTCGAGAAGACGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC
[0242] U6-RNA quimérico-estrutura principal de BbsI (Streptococcus pyogenes SF370)
[0243] GAG GGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATAC GATA CAAG GCTGT TAGAGAGATAAT T GGAAT TAAT T T GAC T G TAAACACAAAGATA TTAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGT TTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATATCTTGT GGAAAGGAC GAAACAC CGGGTCTTC GAGAAGAC CTGTTT TAGAG CTAG AAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
[0244] NLS-SpCas9-EGFP:
[0245] MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAADKKY SIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRL KRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDS FFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVD KLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNL IALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGY AGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGE LHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWN FEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRK PAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYH DLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRR RYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQV SGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQK GQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDIN RLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKL IREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEF VYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNG ETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDW DPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAK GYKEVKKDLIIKLPKYSL FELENGRKRMLASAGELQKGNE LAL P S KYVN FLYLAS HYEK LKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDL SQLGGDAAAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIR HNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAA GITLGMDELYK
[0246] SpCas9-EGFP-NLS:
[0247] MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIK KNLIGALL FDSGE TAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEE SFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMI KFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRR LENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLA QIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALV RQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDL LRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLAR GNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYE YFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECF DSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEE RLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNF MQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMG RHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKL YLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNV PSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITK HVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAY LNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFK TEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFS KESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLG ITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGN ELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILA DANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEV LDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDAAAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVS GEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMP EGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSH NVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSAL SKDPNE KRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYKKRPAATKKAGQAKKKK
[0248] NLS-SpCas9-EGFP-NLS:
[0249] MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAADKKY SIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRL KRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDS FFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVD KLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNL IALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGY AGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGE LHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWN FEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRK PAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYH DLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRR RYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQV SGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQK GQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDIN RLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKL IREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEF VYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNG ETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDW DPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAK GYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNE LAL P S KYVN FLYLAS HYEK LKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDL SQLGGDAAAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIR HNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAA GITLGMDELYKKRPAATKKAGQAKKKK
[0250] NLS-SpCas9-NLS:
[0251] MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAADKKY SIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRL KRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDS FFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVD KLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNL IALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGY AGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGE LHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWN FEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRK PAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYH DLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRR RYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQV SGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQK GQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDIN RLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKL IREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEF VYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNG ETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDW DPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAK GYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELAL P S KYVN FLYLAS HYEK LKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDL SQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
[0252] NLS-mCherry-SpRNase3:
[0253] MFLFLSLTSFLSSSRTLVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVN GHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDY LKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTM GWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLD ITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGSKQLEELLSTSFDIQFNDLTLLETAFT HTSYANEHRLLNVSHNERLEFLGDAVLQLIISEYLFAKYPKKTEGDMSKLRSMIVREES LAGFSRFCSFDAYIKLGKGEEKSGGRRRDTILGDLFEAFLGALLLDKGIDAVRRFLKQV MIPQVEKGNFERVKDYKTCLQE FLQTKGDVAIDYQVISEKGPAHAKQFEVSIVVNGAVL SKGLGKSKKLAEQDAAKNALAQLSEV
[0254] SpRNase3-mCherry-NLS:
[0255] MKQLEELLSTSFDIQFNDLTLLETAFTHTSYANEHRLLNVSHNE RLEFLGDAVLQLIISEYLFAKYPKKTEGDMSKLRSMIVREESLAGFSRFCSFDAYIKLG KGEEKSGGRRRDTILGDLFEAFLGALLLDKGIDAVRRFLKQVMIPQVEKGNFERVKDYK TCLQEFLQTKGDVAIDYQVISEKGPAHAKQFEVSIVVNGAVLSKGLGKSKKLAEQDAAK NALAQLSEVGSVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTA KLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGG VVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIK QRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRH STGGMDELYKKRPAATKKAGQAKKKK
[0256] NLS-SpCas9n-NLS (a mutação de nickase D10A está em minúsculas):
[0257] MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAADKKY SIGLaIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRL KRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDS FFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVD KLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNL IALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGY AGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGE LHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWN FEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRK PAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYH DLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRR RYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQV SGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQK GQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDIN RLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKL IREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEF VYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNG ETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDW DPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAK GYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEK LKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDL SQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
[0258] hEMXl-Modelo de HR-HindII-NheI:
[0259] GAATGCTGCCCTCAGACCCGCTTCCTCCCTGTCCTTGTCTGTCC AAGGAGAATGAGGTCTCACTGGTGGATTTCGGACTACCCTGAGGAGCTGGCACCTGAGG GACAAGGCCCCCCACCTGCCCAGCTCCAGCCTCTGATGAGGGGTGGGAGAGAGCTACAT GAGGTTGCTAAGAAAGCCTCCCCTGAAGGAGACCACACAGTGTGTGAGGTTGGAGTCTC TAGCAGCGGGTTCTGTGCCCCCAGGGATAGTCTGGCTGTCCAGGCACTGCTCTTGATAT AAACACCACCTCCTAGTTATGAAACCATGCCCATTCTGCCTCTCTGTATGGAAAAGAGC ATGGGGCTGGCCCGTGGGGTGGTGTCCACTTTAGGCCCTGTGGGAGATCATGGGAACCC ACGCAGTGGGTCATAGGCTCTCTCATTTACTACTCACATCCACTCTGTGAAGAAGCGAT TATGATCTCTCCTCTAGAAACTCGTAGAGTCCCATGTCTGCCGGCTTCCAGAGCCTGCA CTCCTCCACCTTGGCTTGGCTTTGCTGGGGCTAGAGGAGCTAGGATGCACAGCAGCTCT GTGACCCTTTGTTTGAGAGGAACAGGAAAACCACCCTTCTCTCTGGCCCACTGTGTCCT CTTCCTGCCCTGCCATCCCCTTCTGTGAATGTTAGACCCATGGGAGCAGCTGGTCAGAG GGGACCCCGGCCTGGGGCCCCTAACCCTATGTAGCCTCAGTCTTCCCATCAGGCTCTCA GCTCAGCCTGAGTGTTGAGGCCCCAGTGGCTGCTCTGGGGGCCTCCTGAGTTTCTCATC TGTGCCCCTCCCTCCCTGGCCCAGGTGAAGGTGTGGTTCCAGAACCGGAGGACAAAGTA CAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGGCTCCC ATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAAGCAGGCCAATGGGGAGGACATCGATGTC ACCTCCAATGACaagcttgctagcGGTGGGCAACCACAAACCCACGAGGGCAGAGTGCT GCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGCCCAAGCTGGACTCTGGCCACTCCCTGGCC AGGCTTTGGGGAGGCCTGGAGTCATGGCCCCACAGGGCTTGAAGCCCGGGGCCGCCATT GACAGAGGGACAAGCAATGGGCTGGCTGAGGCCTGGGACCACTTGGCCTTCTCCTCGGA GAGCCTGCCTGCCTGGGCGGGCCCGCCCGCCACCGCAGCCTCCCAGCTGCTCTCCGTGT CTCCAATCTCCCTTTTGTTTTGATGCATTTCTGTTTTAATTTATTTTCCAGGCACCACT GTAGTTTAGTGATCCCCAGTGTCCCCCTTCCCTATGGGAATAATAAAAGTCTCTCTCTT AATGACACGGGCATCCAGCTCCAGCCCCAGAGCCTGGGGTGGTAGATTCCGGCTCTGAG GGCCAGTGGGGGCTGGTAGAGCAAACGCGTTCAGGGCCTGGGAGCCTGGGGTGGGGTAC TGGTGGAGGGGGTCAAGGGTAATTCATTAACTCCTCTCTTTTGTTGGGGGACCCTGGTC TCTACCTCCAGCTCCACAGCAGGAGAAACAGGCTAGACATAGGGAAGGGCCATCCTGTA TCTTGAGGGAGGACAGGCCCAGGTCTTTCTTAACGTATTGAGAGGTGGGAATCAGGCCC AGGTAGTTCAATGGGAGAGGGAGAGTGCTTCCCTCTGCCTAGAGACTCTGGTGGCTTCT CCAGTTGAGGAGAAACCAGAGGAAAGGGGAGGATTGGGGTCTGGGGGAGGGAACACCAT TCACAAAGGCTGACGGTTCCAGTCCGAAGTCGTGGGCCCACCAGGATGCTCACCTGTCC TTGGAGAACCGCTGGGCAGGTTGAGACTGCAGAGACAGGGCTTAAGGCTGAGCCTGCAA CCAGTCCCCAGTGACTCAGGGCCTCCTCAGCCCAAGAAAGAGCAACGTGCCAGGGCCCG CTGAGCTCTTGTGTTCACCTG
[0260] NLS-StCsnl-NLS:
[0261] MKRPAATKKAGQAKKKKSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEII HKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLN PYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQL ETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNP QITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPD EFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYI AKLLSC DVADIKGYRIDKS GKAEIHT FEAYRKMKTLE TLDIEQMDRETL DKLAYVL T LN TEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYE TSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEY GDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGH KQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVY ATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRK KFIERNLVDTRYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYH HHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHF VDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYT QDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKY KEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFN KTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLV KDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLG KSNISIYKVRTDVLGNQH11KNEGDKPKL D FKRPAATKKAGQAKKKK
[0262] U6-St_tracrRNA (7-97):
[0263] GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATA CAAG GCTGT TAGAGAGATAAT T GGAAT TAAT T T GAC T G TAAACACAAAGATAT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGT TTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATAT CTTGT GGAAAGGAC GAAACACCGT TAC T TAAAT C T TGCAGAAG C TACAAAGAT AAGGCTTCATGCCGAAATCAACACCCTGTCATTTTATGGCAGGGTGTTTTCGTTATTTA A
[0264] U6-DR-espaçador-DR (S. pyogenes SF370)
[0265] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccgg gttttagagctatgctgttttgaatggtc ccaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttttagagctatgctgttttg aatggtcccaaaacTTTTTTT (sublinhado em minúsculas = repetição direta; N = sequência guia; negrito = terminador)
[0266] RNA Quimérico contendo RNA de tracr +48 (S. pyogenes SF370)
[0267] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacac cNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgTTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0268] RNA Quimérico contendo RNA de tracr +54 (S. pyogenes SF370)
[0269] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacac cNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0270] RNA Quimérico contendo RNA de tracr +67 (S. pyogenes SF370)
[0271] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacac cNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0272] RNA Quimérico contendo RNA de tracr +85 (S. pyogenes SF370)
[0273] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacac cNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagt cggtgcTTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0274] CBh-NLS-SpCas9-NLS
[0275] CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCA ACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG ACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTAC GTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCC CATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTG CAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAG GGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCG AAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGC GGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTC GCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACG GCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTG GTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCA GGTTGGaccggtgccacc ATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGA TATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTA TCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAAC TCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGT GCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACC AGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGT GGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGC ACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTAC CCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCG GCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGG GCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACC TACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCAT CCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCG GCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCC AACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACAC CTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGT TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAAC AC C GAGAT CAC CAAG GCCCCCCT GAG CGCCTCTATGAT CAAGAGATAC GAC GAG CAC CA CCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAG AGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGC CAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGA ACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACG GCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAA GATTTT TAC C CAT TCCT GAAG GACAAC CGG GAAAAGAT C GAGAAGAT CCT GAC CTTCCG CATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCA GAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCT TCCGCC CAGAG CTTCATC GAG CGGAT GAC CAAC TTC GATAAGAAC CTGCC CAAC GAGAA GGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCA AAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAA AAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAA AGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAG ATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAG GACTTCCTG GACAAT GAG GAAAAC GAG GACATTCTG GAAGATAT CGTGCT GAC CCT GAC ACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCG ACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGC CGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCT GAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGA CCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAG CACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAA GGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCG AAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATG AAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGT GGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGG ATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCAT ATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAG CGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGA AGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAAT CTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAG ACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGA T GAACAC TAAG TAC GAC GAGAATGACAAG C T GAT CCGG GAAG T GAAAG TGAT CAC CCTG AAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGAT CAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGA TCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGAC GTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTT CTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGA TCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAG GGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAA AAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACA GCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGAC AGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAA GAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCG AGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTG ATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCT GGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGA ACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAG CAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGAT CAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCG CCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTG TTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGA CCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCA TCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACTTTCTTTTT CTTAGCTTGACCAGCTTTCTTAGTAGCAGCAGGACGCTTTAA (sublinhado = NLS-hSpCas9-NLS)
[0276] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0277] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGA AAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcat tttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0278] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0279] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcag aagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg ttttcgttatttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0280] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0281] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gtttttgtactctca GAAAt gcag aagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg tTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0282] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0283] gttattgtactctcaagatttataaatcttgcagaagctacaaa gataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttat ttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0284] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0285] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcag aagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg ttttcgttatttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0286] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0287] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttattgtactctca GAAAt gcag aagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg tTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0288] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0289] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttattgtactctcaagatttaGA AAtaaatcttgcagaagctacaatgataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcat tttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0290] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0291] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttattgtactctca GAAAt gcag aagctacaatgataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg ttttcgttatttaaTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0292] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NNAGAAW)
[0293] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcag aagctacaatgataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtg tTTTTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0294] RNA quimérico exemplar para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus LMD-9 (com PAM de NGGNG)
[0295] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttttagagctgtg GAAAc acagc gagttaaaataaggcttagtccgtactcaacttgaaaaggtggcaccgattcggtgtTT TTTT (N = sequência guia; primeiro sublinhado = sequência tracr mate; segundo sublinhado = sequência tracr; negrito = terminador)
[0296] Versão otimizada quanto a códons de Cas9 de local de CRISPR3 de S. thermophilus LMD-9 (com uma NLS em ambas as extremidades 5’ e 3‘)
[0297] ATGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAA GAAAAAGACCAAGCCCTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAATAGCGTGGGCTGGG CCGTGACCACCGACAACTACAAGGTGCCCAGCAAGAAAATGAAGGTGCTGGGCAACACC TCCAAGAAGTACATCAAGAAAAACCTGCTGGGCGTGCTGCTGTTCGACAGCGGCATTAC AGCCGAGGGCAGACGGCTGAAGAGAACCGCCAGACGGCGGTACACCCGGCGGAGAAACA GAATCCTGTATCTGCAAGAGATCTTCAGCACCGAGATGGCTACCCTGGACGACGCCTTC TTCCAGCGGCTGGACGACAGCTTCCTGGTGCCCGACGACAAGCGGGACAGCAAGTACCC CATCTTCGGCAACCTGGTGGAAGAGAAGGCCTACCACGACGAGTTCCCCACCATCTACC ACCTGAGAAAGTACCTGGCCGACAGCACCAAGAAGGCCGACCTGAGACTGGTGTATCTG GCCCTGGCCCACATGATCAAGTACCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGAGTTCAACAG CAAGAACAACGACATCCAGAAGAACTTCCAGGACTTCCTGGACACCTACAACGCCATCT TCGAGAGCGACCTGTCCCTGGAAAACAGCAAGCAGCTGGAAGAGATCGTGAAGGACAAG ATCAGCAAGCTGGAAAAGAAGGACCGCATCCTGAAGCTGTTCCCCGGCGAGAAGAACAG CGGAATCTTCAGCGAGTTTCTGAAGCTGATCGTGGGCAACCAGGCCGACTTCAGAAAGT GCTTCAACCTGGACGAGAAAGCCAGCCTGCACTTCAGCAAAGAGAGCTACGACGAGGAC CTGGAAACCCTGCTGGGATATATCGGCGACGACTACAGCGACGTGTTCCTGAAGGCCAA GAAGCTGTACGACGCTATCCTGCTGAGCGGCTTCCTGACCGTGACCGACAACGAGACAG AGGCCCCACTGAGCAGCGCCATGATTAAGCGGTACAACGAGCACAAAGAGGATCTGGCT CTGCTGAAAGAGTACATCCGGAACATCAGCCTGAAAACCTACAATGAGGTGTTCAAGGA CGACACCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCAAGACCAACCAGGAAGATTTCT ATGTGTACCTGAAGAAGCTGCTGGCCGAGTTCGAGGGGGCCGACTACTTTCTGGAAAAA ATCGACCGCGAGGATTTCCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCTA CCAGATCCATCTGCAGGAAATGCGGGCCATCCTGGACAAGCAGGCCAAGTTCTACCCAT TCCTGGCCAAGAACAAAGAGCGGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCTTACTAC GTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCGATTTTGCCTGGTCCATCCGGAAGCGCAATGA GAAGATCACCCCCTGGAACTTCGAGGACGTGATCGACAAAGAGTCCAGCGCCGAGGCCT TCATCAACCGGATGACCAGCTTCGACCTGTACCTGCCCGAGGAAAAGGTGCTGCCCAAG CACAGCCTGCTGTACGAGACATTCAATGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGCGGTTTAT CGCCGAGTCTATGCGGGACTACCAGTTCCTGGACTCCAAGCAGAAAAAGGACATCGTGC GGCTGTACTTCAAGGACAAGCGGAAAGTGACCGATAAGGACATCATCGAGTACCTGCAC GCCATCTACGGCTACGATGGCATCGAGCTGAAGGGCATCGAGAAGCAGTTCAACTCCAG CCT GAG CACATAC CAC GAC CTGCT GAACAT TAT CAAC GACAAAGAAT TTCT GGAC GAC T CCAG CAAC GAGGCCAT CATC GAAGAGAT CATC CACAC CCT GAC CATCTTT GAG GACCGC GAGAT GAT CAAGCAG CGGCT GAGCAAG TTC GAGAACAT CTTC GACAAGAG CGTGCT GAA AAAGCTGAGCAGACGGCACTACACCGGCTGGGGCAAGCTGAGCGCCAAGCTGATCAACG GCATCCGGGACGAGAAGTCCGGCAACACAATCCTGGACTACCTGATCGACGACGGCATC AGCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACGCCCTGAGCTTCAAGAAGAAGAT CCAGAAGGCCCAGATCATCGGGGACGAGGACAAGGGCAACATCAAAGAAGTCGTGAAGT CCCTGCCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGAATCCTGCAGAGCATCAAGATCGTGGAC GAGCTCGTGAAAGTGATGGGCGGCAGAAAGCCCGAGAGCATCGTGGTGGAAATGGCTAG AGAGAACCAGTACAC CAAT CAGGGCAAGAGCAACAGCCAGCAGAGACTGAAGAGAC T GG AAAAGTCCCTGAAAGAGCTGGGCAGCAAGATTCTGAAAGAGAATATCCCTGCCAAGCTG TCCAAGATCGACAACAACGCCCTGCAGAACGACCGGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAA TGGCAAGGACATGTATACAGGCGACGACCTGGATATCGACCGCCTGAGCAACTACGACA T C GAC CATAT TATCCCC CAG GCCTTCCT GAAAGACAACAG CATT GACAACAAAG TGCTG GTGTCCTCCGCCAGCAACCGCGGCAAGTCCGATGATGTGCCCAGCCTGGAAGTCGTGAA AAAGAGAAAGACCTTCTGGTATCAGCTGCTGAAAAGCAAGCTGATTAGCCAGAGGAAGT TCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCCCTGAAGATAAGGCCGGCTTC ATCCAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCAGACTGCTGGA TGAGAAGTTTAACAACAAGAAGGACGAGAACAACCGGGCCGTGCGGACCGTGAAGATCA TCACCCTGAAGTCCACCCTGGTGTCCCAGTTCCGGAAGGACTTCGAGCTGTATAAAGTG CGCGAGATCAATGACTTTCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTGGTGGCTTC CGCCCTGCTGAAGAAGTACCCTAAGCTGGAACCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACCCCA AGTACAACTCCTTCAGAGAGCGGAAGTCCGCCACCGAGAAGGTGTACTTCTACTCCAAC ATCATGAATATCTTTAAGAAGTCCATCTCCCTGGCCGATGGCAGAGTGATCGAGCGGCC CCTGATCGAAGTGAACGAAGAGACAGGCGAGAGCGTGTGGAACAAAGAAAGCGACCTGG CCACCGTGCGGCGGGTGCTGAGTTATCCTCAAGTGAATGTCGTGAAGAAGGTGGAAGAA CAGAACCACGGCCTGGATCGGGGCAAGCCCAAGGGCCTGTTCAACGCCAACCTGTCCAG CAAGCCTAAGCCCAACTCCAACGAGAATCTCGTGGGGGCCAAAGAGTACCTGGACCCTA AGAAGTACGGCGGATACGCCGGCATCTCCAATAGCTTCACCGTGCTCGTGAAGGGCACA ATCGAGAAGGGCGCTAAGAAAAAGATCACAAACGTGCTGGAATTTCAGGGGATCTCTAT CCTGGACCGGATCAACTACCGGAAGGATAAGCTGAACTTTCTGCTGGAAAAAGGCTACA AGGACATTGAGCTGATTATCGAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAACTGAGCGACGGC TCCAGACGGATGCTGGCCTCCATCCTGTCCACCAACAACAAGCGGGGCGAGATCCACAA GGGAAACCAGATCTTCCTGAGCCAGAAATTTGTGAAACTGCTGTACCACGCCAAGCGGA TCTC CAACAC CAT CAAT GAGAAC CAC CGGAAATAC GTG GAAAAC CACAAGAAAGA GTTT GAGGAACTGTTCTACTACATCCTGGAGTTCAACGAGAACTATGTGGGAGCCAAGAAGAA CGGCAAACTGCTGAACTCCGCCTTCCAGAGCTGGCAGAACCACAGCATCGACGAGCTGT GCAGCTCCTTCATCGGCCCTACCGGCAGCGAGCGGAAGGGACTGTTTGAGCTGACCTCC AGAGGCTCTGCCGCCGACTTTGAGTTCCTGGGAGTGAAGATCCCCCGGTACAGAGACTA CACCCCCTCTAGTCTGCTGAAGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCGTGACCGGCCTGT ACGAAACCCGGATCGACCTGGCTAAGCTGGGCGAGGGAAAGCGTCCTGCTGCTACTAAG AAAGCT GGTCAAGCTAAGAAAAAGAAATAA Exemplo 5: Edição guiada por RNA de genomas bacterianos usando sistemas CRISPR-Cas
[0298] Os Requerentes usaram a endonuclease Cas9 associada a CRISPR para introduzir mutações precisas nos genomas de Streptococcus pneumoniae e Escherichia coli. A abordagem se baseou em clivagem dirigida por Cas9 no local dirigido para matar células não mutadas e contornou a necessidade de marcadores selecionáveis ou sistemas de contrasseleção. A especificidade de Cas9 foi reprogramada por mudança da sequência de curto RNA de CRISPR (crRNA) para fabricar mudanças de nucleotídeos únicos e múltiplos transportadas em modelos de edição. O uso simultâneo de dois crRNAs permitiu mutagênese de múltiplexes. Em S. pneumoniae, quase 100 % das células que sobreviveram à clivagem por Cas9 continha a mutação desejada, e 65 % quando usada em combinação com recombineering em E. coli. Os Requerentes analisaram exaustivamente os requisitos de alvo de Cas9 para definir a gama de sequências dirigíveis e mostraram estratégias para edição de locais que não cumpriam estes requisitos, sugerindo a versatilidade desta técnica para manipulação do genoma bacteriano.
[0299] O entendimento da função de genes depende da possibilidade de alterar sequências de DNA dentro da célula de um modo controlado. A mutagênese sítio-específica em eucariotas é alcançada pelo uso de nucleases específicas à sequência que promovem a recombinação homóloga de um DNA modelo contendo a mutação de interesse. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs), efetores do tipo ativadores da transcrição (TALENs) e meganucleases migrantes podem ser programados para clivarem genomas em localizações específicas, mas estas abordagens requerem manipulação de novas enzimas para cada sequência alvo. Em organismos procarióticos, os métodos de mutagênese ou introduzem um marcador de seleção no local editado ou requerem um processo de dois passos que inclui um sistema de contrasseleção. Mais recentemente, proteínas de recombinação de fagos foram usadas para recombineering, uma técnica que promove a recombinação homóloga de DNA ou oligonucleotídeos lineares. No entanto, porque não existe seleção de mutações, a eficácia de recombineering pode ser relativamente baixa (0,1-10 % para mutações pontuais até 10 5-10-6 para modificações maiores), requerendo em muitos casos o rastreio de um grande número de colônias. Portanto, novas tecnologias que sejam acessíveis, fáceis de usar e eficazes são ainda necessárias para a manipulação genética de organismos eucarióticos e procarióticos.
[0300] Trabalho recente sobre o sistema imune adaptativo de CRISPR (repetições curtas palindrômicas, agrupadas, regularmente interespaçadas) de procariotas tem levado à identificação de nucleases cuja especificidade de sequência é programada por pequenos RNAs. Os locais CRISPR são compostos por uma série de repetições separadas por sequências "espaçadoras" que correspondem aos genomas de bacteriófagos e outros elementos genéticos móveis. O conjunto repetição-espaçador é transcrito como um longo precursor e processado dentro de sequências de repetição para gerar pequeno crRNA que especifica as sequências alvo (também conhecidas como protoespaçadores) clivadas por sistemas CRISPR. A presença de um motivo de sequência imediatamente a jusante da região alvo, conhecida como o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) é essencial para a clivagem. Os genes associados a CRISPR (cas) flanqueiam geralmente o conjunto repetição-espaçador e codificam a maquinaria enzimática responsável por biogênese e direcionamento de crRNA. Cas9 é uma dsDNA endonuclease que usa um guia de crRNA para especificar o local de clivagem. A carga do guia de crRNA em Cas9 ocorre durante o processamento do precursor de crRNA e requer um pequeno RNA antissenso ao precursor, o tracrRNA, e RNAse III. Em contraste à edição do genoma com ZFNs ou TALENs, a mudança da especificidade do alvo de Cas9 não requer manipulação de proteínas mas somente o desenho do curto guia de crRNA.
[0301] Os Requerentes mostraram recentemente em S. pneumoniae que a introdução de um sistema CRISPR se dirigindo a um local cromossomal leva à morte das células transformadas. Foi observado que os sobreviventes ocasionais continham mutações na região alvo, sugerindo que a atividade de dsDNA endonuclease de Cas9 contra alvos endógenos poderia ser usada para edição do genoma. Os Requerentes mostraram que mutações sem marcador podem ser introduzidas através da transformação de um fragmento de DNA modelo que se recombinará no genoma e eliminará o reconhecimento do alvo de Cas9. O direcionamento da especificidade de Cas9 com vários crRNAs diferentes permite a introdução de múltiplas mutações ao mesmo tempo. Os Requerentes caracterizaram também em detalhe os requisitos de sequência para direcionamento de Cas9 e mostram que a abordagem pode ser combinada com recombineering para edição do genoma em E. coli.
[0302] RESULTADOS: Edição do genoma por clivagem por Cas9 de um alvo cromossomal
[0303] A estirpe de S. pneumoniae crR6 contém um sistema CRISPR baseado em Cas9 que cliva uma sequência alvo presente no bacteriófago Φ8232.5. Este alvo foi integrado no local cromossomal srtA de uma segunda estirpe R68232-5 . Uma sequência alvo alterada contendo uma mutação na região PAM foi integrada no local srtA de uma terceira estirpe R6370.1, tornando esta estirpe "imune" à clivagem por CRISPR (Figura 28a) . Os Requerentes transformaram células R68232.5 e R6370.1 com DNA genômico a partir de células crR6, esperando que a transformação bem-sucedida de células R68232.5 deva levar a clivagem do local alvo e morte celular. Ao contrário desta expetativa, os Requerentes isolaram transformantes de R68232.5, embora com aproximadamente 10 vezes menos eficácia do que transformantes R6370.1 (Figura 28b) . A análise genética de oito transformantes de R68232.5 (Figura 28) revelou que a grande maioria é o produto de um evento de recombinação dupla que elimina a toxicidade do direcionamento de Cas9 por substituição do alvo Φ8232.5 pelo local srtA de tipo selvagem do genoma de crR6, que não contém o protoespaçador requerido para reconhecimento de Cas9. Estes resultados foram prova de que a introdução simultânea de um sistema CRISPR se dirigindo a um local genômico (o constructo de direcionamento) em conjunto com um modelo para recombinação no local dirigido (o modelo de edição) levou a edição do genoma dirigida (Figura 23a).
[0304] Para criar um sistema simplificado para edição do genoma, os Requerentes modificaram o local de CRISPR na estirpe crR6 por deleção de casl, cas2 e csn2, genes que se mostrou que eram dispensáveis para direcionamento de CRISPR, originando a estirpe crR6M (Figura 28a) . Esta estirpe reteve as mesmas propriedades de crR6 (Figura 28b). Para aumentar a eficácia de edição baseada em Cas9 e demonstrar que um DNA modelo de escolha pode ser usado para controlar a mutação introduzida, os Requerentes cotransformaram células R68232.5 com produtos de PCR do gene srtA de tipo selvagem ou o alvo R6370.1 mutante, qualquer um dos quais deve ser resistente a clivagem por Cas9. Isto resultou em um aumento de 5 a 10 vezes da frequência de transformação em comparação com DNA genômico de crR6 sozinho (Figura 23b) . A eficácia de edição foi também substancialmente aumentada, com 8/8 transformantes testados contendo uma cópia de srtA de tipo selvagem e 7/8 contendo a mutação de PAM presente no alvo R6370.1 (Figura 23b e Figura 29a) . Tomados em conjunto, estes resultados mostraram o potencial de edição do genoma auxiliada por Cas9.
[0305] Análise de requisitos do alvo de Cas9: Para introduzir mudanças específicas no genoma se tem de usar um modelo de edição transportando mutações que eliminam a clivagem mediada por Cas9, prevenindo deste modo a morte de células. Isto é fácil de alcançar quando a deleção do alvo ou sua substituição por outra sequência (inserção de genes) é almejada. Quando o objetivo é produzir fusões de genes ou gerar mutações de nucleotídeo único, a eliminação da atividade de nuclease de Cas9 será somente possível por introdução de mutações no modelo de edição que alteram as sequências PAM ou protoespaçadoras. Para determinar as restrições da edição mediada por CRISPR, os Requerentes realizaram uma análise exaustiva de mutações de PAM e protoespaçador que anulam o direcionamento de CRISPR.
[0306] Estudos prévios propuseram que Cas9 de S. pyogenes requer um PAM de NGG imediatamente a jusante do protoespaçador. No entanto, porque somente um número muito limitado de mutações inativantes de PAM foi descrito até agora, os Requerentes conduziram uma análise sistemática para encontrar todas as sequências com 5 nucleotídeos após o protoespaçador que eliminam a clivagem por CRISPR. Os Requerentes randomizaram oligonucleotídeos para gerar todas as 1.024 sequências PAM possíveis em um produto de PCR heterogéneo que foi transformado em células crR6 ou R6. Se esperava que os constructos transportando PAMs funcionais fossem reconhecidos e destruídos por Cas9 em células crR6, mas não R6 (Figura 24a) . Mais do que 2x105 colônias foram agrupadas em conjunto para extrair DNA para uso como modelo para a coamplificação de todos os alvos. Os produtos de PCR foram sequenciados de modo profundo e se descobriu que continham todas as 1.024 sequências, com abrangência variando de 5 a 42.472 leituras (Ver seção "Análise de dados de sequenciação profunda"). A funcionalidade de cada PAM foi estimada pela proporção relativa das suas leituras na amostra de crR6 em relação à amostra de R6. A análise das primeiras três bases do PAM, considerando a média das duas últimas bases, mostrou claramente que o padrão NGG estava subrepresentado em transformantes de crR6 (Figura 24b). Além do mais, as próximas duas bases não tiveram efeito detectável no PAM NGG (Ver seção "Análise de dados de sequenciação profunda"), demonstrando que a sequência NGGNN era suficiente para licenciar a atividade de Cas9. Foi observado direcionamento parcial para sequências PAM NAG (Figura 24b) . Também o padrão NNGGN inativou parcialmente o direcionamento de CRISPR (Tabela G) , indicando que o motivo BGG consegue ser ainda reconhecido por Cas9 com eficácia reduzida quando mudado para 1 pb. Estes dados lançaram luz sobre o mecanismo molecular do reconhecimento do alvo por Cas9, e revelaram que sequências NGG (ou CCN na fita complementar) são suficientes para direcionamento de Cas9 e que mutações NGG em NAG ou NNGGN no modelo de edição devem ser evitadas. Devido à elevada frequência destas sequências de trinucleotídeos (uma vez a cada 8 pb) , isto significa que quase qualquer posição do genoma pode ser editada. De fato, os Requerentes testaram dez alvos aleatoriamente escolhidos transportando vários PAMs e se descobriu que todos eram funcionais (Figura 30).
[0307] Outra maneira de perturbar a clivagem mediada por Cas9 é introduzir mutações na região protoespaçadora do modelo de edição. Se sabe que mutações pontuais dentro da "sequência semente" (os nucleotídeos protoespaçadores 8 a 10 imediatamente adjacentes ao PAM) conseguem eliminar a clivagem por nucleases de CRISPR. No entanto, o comprimento exato desta região não é conhecido, e não é claro se mutações em qualquer nucleotídeo na semente conseguem perturbar o reconhecimento do alvo por Cas9. Os Requerentes seguiram a mesma abordagem de sequenciação profunda descrita acima para randomizar a sequência protoespaçadora inteira envolvida em contatos de pares de bases com o crRNA e para determinar todas as sequências que perturbam o direcionamento. Cada posição dos 20 nucleotídeos correspondentes (14) no alvo spcl presente em células R68232.5 (Figura 23a) foi randomizada e transformada em células crR6 e R6 (Figura 24a) . Consistente com a presença de uma sequência semente, somente mutações nos 12 nucleotídeos imediatamente a montante do PAM anularam a clivagem por Cas9 (Figura 24c) . No entanto, diferentes mutações exibiram efeitos marcadamente diferentes. As posições distais (a partir do PAM) da semente (12 a 7) toleraram a maioria das mutações e somente uma substituição de base particular anulou o direcionamento. Em contraste, mutações em qualquer nucleotídeo nas posições proximais (6 a 1, exceto 3) eliminaram a atividade de Cas9, embora a diferentes níveis para cada substituição particular. Na posição 3, somente duas substituições afetaram atividade de CRISPR e com diferente resistência. Os Requerentes concluíram que, embora mutações na sequência semente possam prevenir direcionamento de CRISPR, existem restrições no que diz respeito às mudanças de nucleotídeos que podem ser feitas em cada posição da semente. Além do mais, estas restrições podem o mais provavelmente variar para diferentes sequências espaçadoras. Portanto, os Requerentes acreditam que mutações na sequência PAM, se possível, devem ser a estratégia de edição preferencial. Alternativamente, múltiplas mutações na sequência semente podem ser introduzidas para prevenir a atividade de nuclease de Cas9.
[0308] Edição do genoma mediada por Cas9 em S. pneumonia: Para desenvolver um método rápido e eficaz para edição do genoma dirigida, os Requerentes manipularam a estirpe crR6Rk, uma estirpe na qual espaçadores podem ser facilmente introduzidos por PCR (Figura 33). Os Requerentes decidiram editar o gene da β-galactosidase (bgaA) de S. pneumoniae, cuja atividade pode ser facilmente medida. Os Requerentes introduziram substituições de alanina de aminoácidos no local ativo desta enzima: mutações R481A (R^A) e N563A,E564A (NE^AA). Para ilustrar diferentes estratégias de edição, os Requerentes desenharam mutações da sequência PAM e da semente protoespaçadora. Em ambos os casos foi usado o mesmo constructo de direcionamento com um crRNA complementar a uma região do gene da β-galactosidase que é adjacente a uma sequência PAM TGG (CCA na fita complementar, Figura 2 6). O modelo de edição R^A criou uma não correspondência de três nucleotídeos na sequência semente protoespaçadora (CGT em GCA, introduzindo também um local de restrição de BtgZI). No modelo de edição NE^AA, os Requerentes introduziram simultaneamente uma mutação sinônima que criou um PAM inativo (TGG em TTG) em conjunto com mutações que estão 218 nt a jusante da região protoespaçadora (AAT GAA em GCT GCA, gerando também um local de restrição de TseI). Esta última estratégia de edição demonstrou a possibilidade de usar um PAM remoto para fazer mutações em lugares onde um alvo apropriado pode ser difícil de escolher. Por exemplo, embora o genoma de S. pneumoniae R6, que tem um conteúdo de GC de 39,7 %, conter em média um motivo PAM a cada 12 pb, alguns motivos PAM estão separados por até 194 pb (Figura 33). Adicionalmente, os Requerentes desenharam uma deleção em grelha ΔbgaA de 6.664 pb. Em todos os três casos, a cotransformação dos modelos de direcionamento e edição produziu 10 vezes mais células resistentes à canamicina do que a cotransformação com um modelo de edição de controle contendo sequências de bgaA de tipo selvagem (Figura 25b) . Os Requerentes genotiparam 24 transformantes (8 para cada experiência de edição) e descobriram que todos exceto um incorporaram a mudança desejada (Figura 25c). A sequenciação de DNA confirmou também não só a presença das mutações introduzidas mas também a ausência de mutações secundárias na região alvo (Figura 29b,c). Finalmente, os Requerentes mediram a atividade de β- galactosidase para confirmar que todas as células editadas exibiram o fenótipo esperado (Figura 25d).
[0309] A edição mediada por Cas9 pode ser também usada para gerar múltiplas mutações para o estudo de vias biológicas. Os Requerentes decidiram ilustrar isto para a via dependente de sortase que fixa as proteínas da superfície ao envelope de bactérias Gram-positivas. Os Requerentes introduziram uma deleção de sortase por cotransformação de um constructo de direcionamento resistente ao cloranfenicol e um modelo de edição ΔsrtA (Figura 33a,b), seguido por uma deleção ΔbgaA usando um constructo de direcionamento resistente à canamicina que substituiu o anterior. Em S. pneumoniae, a β-galactosidase está covalentemente ligada à parede celular por sortase. Portanto, a deleção de srtA resulta na liberação da proteína da superfície no sobrenadante, ao passo que a deleção dupla não tem atividade de β-galactosidase detectável (Figura 34c). Uma tal seleção sequencial pode ser iterada tantas vezes quanto requerido para gerar múltiplas mutações.
[0310] Estas duas mutações podem ser também introduzidas ao mesmo tempo. Os Requerentes desenharam um constructo de direcionamento contendo dois espaçadores, um correspondendo a srtA e o outro correspondendo a bgaA, e o cotransformaram com ambos os modelos de edição ao mesmo tempo (Figura 25e). A análise genética dos transformantes mostrou que a edição ocorreu em 6/8 casos (Figura 25f) . Notavelmente, os dois clones restantes continham cada um uma deleção ΔsrtA ou ΔbgaA, sugerindo a possibilidade de realizar mutagênese combinatorial usando Cas9. Finalmente, para eliminar as sequências de CRISPR, os Requerentes introduziram um plasmídeo contendo o alvo bgaA e um gene de resistência à espectinomicina em conjunto com DNA genômico da estirpe de tipo selvagem R6. Os transformantes resistentes à espectinomicina que retêm o plasmídeo eliminaram as sequências CRISPR (Figura 34a,d).
[0311] Mecanismo e eficácia da edição: Para entender os mecanismos subjacentes à edição do genoma com Cas9, os Requerentes desenharam uma experiência na qual a eficácia de edição foi medida independentemente da clivagem por Cas9. Os Requerentes integraram o gene de resistência à eritromicina ermAM no local srtA, e introduziram um códon de paragem prematura usando edição mediada por Cas9 (Figura 33) . A estirpe resultante (JEN53) contém um alelo ermAM(paragem) e é sensível à eritromicina. Esta estirpe pode ser usada para avaliar a eficácia à qual o gene ermAM é reparado por medição da fração de células que restaura a resistência a antibióticos com ou sem o uso de clivagem por Cas9. JEN53 foi transformada com um modelo de edição que restaura o alelo de tipo selvagem, em conjunto com um constructo de CRISPR resistente à canamicina se dirigindo ao alelo ermAM(paragem) (CRISPR::ermAM(paragem)) ou um constructo de controle sem um espaçador (CRISPR::0) (Figura 26a,b). Na ausência de seleção por canamicina, a fração de colônias editadas foi na ordem de 10-2 (cfu resistentes à eritromicina/cfu totais) (Figura 26c), representando a frequência de linha de base de recombinação sem seleção mediada por Cas9 contra células não editadas. No entanto, se a seleção por canamicina for aplicada e o constructo de CRISPR de controle for cotransformado, a fração de colônias editadas aumentou até cerca de 10-1 (cfu resistentes à canamicina e eritromicina/cfu resistentes à canamicina) (Figura 26c). Este resultado mostra que a seleção quanto à recombinação do local de CRISPR cosselecionou para a recombinação no local ermAM independentemente da clivagem por Cas9 do genoma, sugerindo que uma subpopulação de células é mais propensa a transformação e/ou recombinação. A transformação do constructo CRISPR::ermAM(paragem) seguida por seleção por canamicina resultou em um aumento da fração de células editadas, resistentes à eritromicina até 99 % (Figura 26c). Para determinar se este aumento é causado pela morte de células não editadas, os Requerentes compararam as unidades formadoras de colônias (cfu) resistentes à canamicina obtidas após cotransformação de células JEN53 com o constructo CRISPR::ermAM(paragem) ou CRISPR::0.
[0312] Os Requerentes contaram 5,3 vezes menos colônias resistentes à canamicina após transformação do constructo ermAM(paragem) (2,5x104/4,7x103, Figura 35a), um resultado que sugere que de fato o direcionamento de um local cromossomal por Cas9 leva à morte de células não editadas. Finalmente, porque se sabe que a introdução de quebras de dsDNA no cromossomo bacteriano desencadeia mecanismos de reparação que aumentam a taxa de recombinação do DNA danificado, os Requerentes investigaram se a clivagem por Cas9 induz recombinação do modelo de edição. Os Requerentes contaram 2,2 vezes mais colônias após cotransformação com o constructo CRISPR::erm(paragem) do que com o constructo CRISPR::0 (Figura 26d), indicando que existiu uma indução modesta da recombinação. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a cosseleção de células transformáveis, indução de recombinação por clivagem mediada por Cas9 e seleção contra células não editadas contribuíram cada uma para a elevada eficácia da edição do genoma em S. pneumoniae.
[0313] Como a clivagem do genoma por Cas9 deve matar células não editadas não se esperaria recuperar quaisquer células que receberam o cassete de Cas9 contendo resistência à Canamicina, mas não o modelo de edição. No entanto, na ausência do modelo de edição, os Requerentes recuperaram muitas colônias resistentes à canamicina após transformação do constructo CRISPR::ermAM(paragem) (Figura 35a) . Estas células que "escapam" à morte induzida por CRISPR produziram um fundo que determinou um limite do método. Esta frequência de fundo pode ser calculada como a razão de cfu de CRISPR::ermAM(paragem)/CRISPR::0, 2,6x10-3 (7,1x101/2,7x104) em esta experiência, significando que, se a frequência de recombinação do modelo de edição for menor do que este valor, a seleção por CRISPR pode não recuperar eficazmente os mutantes desejados acima do fundo. Para entender a origem destas células, os Requerentes genotiparam 8 colônias de fundo e descobriram que 7 continham deleções do espaçador de direcionamento (Figura 35b) e uma abrigava uma mutação presumivelmente inativante em Cas9 (Figura 35c).
[0314] Edição do genoma com Cas9 em E. coli: A ativação de direcionamento de Cas9 através da integração cromossomal de um sistema CRISPR-Cas é somente possível em organismos que são altamente recombinogênicos. Para desenvolver um método mais geral que seja aplicável a outros micróbios, os Requerentes decidiram realizar edição do genoma em E. coli usando um sistema CRISPR-Cas baseado em plasmídeo. Foram construídos dois plasmídeos: um plasmídeo pCas9 transportando o tracrRNA, Cas9 e um cassete de resistência ao cloranfenicol (Figura 36), e um plasmídeo pCRISPR resistente à canamicina transportando a matriz de espaçadores de CRISPR. Para medir a eficácia de edição independentemente da seleção por CRISPR, os Requerentes almejaram introduzir uma transversão A em C no gene rpsL que confere resistência à estreptomicina. Os Requerentes construíram um plasmídeo pCRISPR::rpsL abrigando um espaçador que guiaria a clivagem por Cas9 do alelo rpsL de tipo selvagem, mas não o mutante (Figura 27b). O plasmídeo pCas9 foi em primeiro lugar introduzido em E. coli MG1655 e a estirpe resultante foi cotransformada com o plasmídeo pCRISPR::rpsL e W542, um oligonucleotídeo de edição contendo a mutação A em C. Somente as colônias resistentes à estreptomicina após transformação do plasmídeo pCRISPR::rpsL foram recuperadas, sugerindo que a clivagem por Cas9 induz recombinação do oligonucleotídeo (Figura 37). No entanto, o número de colônias resistentes à estreptomicina foi duas ordens de magnitude mais baixo do que o número de colônias resistentes à canamicina, que são presumivelmente células que escapam à clivagem por Cas9. Portanto, em estas condições, a clivagem por Cas9 facilitou a introdução da mutação, mas com uma eficácia que não foi suficiente para selecionar as células mutantes acima do fundo de "escapantes".
[0315] P ara melhorar a eficácia de edição do genoma em E. coli, os Requerentes aplicaram o seu sistema CRISPR com recombineering, usando morte celular induzida por Cas9 para selecionar as mutações desejadas. O plasmídeo pCas9 foi introduzido na estirpe recombineering HME63 (31), que contém as funções Gam, Exo e Beta dos fagos vermelhos. A estirpe resultante foi cotransformada com o plasmídeo pCRISPR::rpsL (ou um controle de pCRISPR::0) e o oligonucleotídeo W542 (Figura 27a). A eficácia de recombineering foi 5,3x10-5, calculada como a fração de células totais que se tornaram resistentes à estreptomicina quando o plasmídeo de controle foi usado (Figura 27c). Em contraste, a transformação com o plasmídeo pCRISPR::rpsL aumentou a percentagem de células mutantes até 65 ± 14 % (Figuras 27c e 29f). Os Requerentes observaram que o número de cfu foi reduzido por cerca de três ordens de magnitude após transformação do plasmídeo pCRISPR::rpsL em relação ao plasmídeo de controle (4,8x105/5,3x102, Figura 38a), sugerindo que a seleção resulta de morte induzida por CRISPR de células não editadas. Para medir a taxa à qual a clivagem por Cas9 era inativada, um parâmetro importante do método dos Requerentes, os Requerentes transformaram células com pCRISPR::rpsL ou o plasmídeo de controle sem o oligonucleotídeo de edição W542 (Figura 38a) . Este fundo de "escapantes" de CRISPR, medido como a razão de cfu de pCRISPR::rpsL/pCRISPR::0, foi 2,5x10- 4 (1,2x102/4,8x 105) . A genotipagem de oito destes escapantes revelou que em todos os casos existiu uma deleção do espaçador de direcionamento (Figura 38b) . Este fundo foi mais elevado do que a eficácia de recombineering da mutação rpsL, 5,3x10-5, o que sugeriu que, para se obterem 65 % de células editadas, a clivagem por Cas9 tem de induzir a recombinação de oligonucleotídeos. Para confirmar isto, os Requerentes compararam o número de cfu resistentes à canamicina e estreptomicina após transformação de pCRISPR::rpsL ou pCRISPR::0 (Figura 27d). Como no caso para S. pneumoniae, os Requerentes observaram uma indução modesta da recombinação, cerca de 6,7 vezes (2,0x10-4/3,0x10-5). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que o sistema CRISPR proveu um método para selecionar mutações introduzidas por recombineering.
[0316] Os Requerentes mostraram que podem ser usados sistemas CRISPR-Cas para edição do genoma dirigida em bactérias pela cointrodução de um constructo de direcionamento que matou células de tipo selvagem e um modelo de edição que eliminou a clivagem por CRISPR e introduziu as mutações desejadas. Podem ser gerados diferentes tipos de mutações (inserções, deleções ou substituições de nucleotídeo único sem cicatrizes). Múltiplas mutações podem ser introduzidas ao mesmo tempo. A especificidade e versatilidade de edição usando o sistema CRISPR se baseou em várias propriedades únicas na endonuclease Cas9: (i) a sua especificidade de alvo pode ser programada com um pequeno RNA, sem a necessidade de recombinação de enzima, (ii) a especificidade de alvo foi muito elevada, determinada por uma interação RNA-DNA de 2 0 pb com baixa probabilidade de reconhecimento não alvo, (iii) quase qualquer sequência pode ser dirigida, sendo o único requisito a presença de uma sequência NGG adjacente, (iv) quase qualquer mutação na sequência NGG, bem como mutações na sequência semente do protoespaçador, elimina o direcionamento.
[0317] Os Requerentes mostraram que a manipulação do genoma usando o sistema CRISPR trabalhou não só em bactérias altamente recombinogênicas tais como S. pneumoniae, mas também em E. coli. Os resultados em E. coli sugeriram que o método pode ser aplicável a outros microrganismos para os quais podem ser introduzidos plasmídeos. Em E. coli, a abordagem complementa a recombineering de oligonucleotídeos mutagênicos. Para usar esta metodologia em micróbios onde a recombineering não é possível, a maquinaria de recombinação homóloga do hospedeiro pode ser usada provendo o modelo de edição em um plasmídeo. Adicionalmente, porque a evidência acumulada indica que a clivagem mediada por CRISPR do cromossomo leva a morte celular em muitas bactérias e arqueobactérias, é possível prever o uso de sistemas CRISPR- Cas endógena para propósitos de edição.
[0318] Tanto em S. pneumoniae como em E. coli, os Requerentes observaram que, embora a edição tenha sido facilitada por uma cosseleção de células transformáveis e uma pequena indução da recombinação no local alvo por clivagem por Cas9, o mecanismo que contribuiu mais para a edição foi a seleção contra células não editadas. Portanto, a maior limitação do método foi a presença de um fundo de células que escapam à morte celular induzida por CRISPR e não têm a mutação desejada. Os Requerentes mostraram que estes "escapantes" surgiram principalmente através da deleção do espaçador de direcionamento, presumivelmente após a recombinação das sequências de repetição que flanqueiam o espaçador de direcionamento. Melhorias futuras podem se focar na manipulação de sequências flanqueantes que podem ainda apoiar a biogênese de crRNAs funcionais mas que sejam suficientemente diferentes umas das outras para eliminar a recombinação. Alternativamente, a transformação direta de crRNAs quiméricos pode ser explorada. No caso particular de E. coli, a construção do sistema CRISPR-Cas não era possível se este organismo fosse também usado como um hospedeiro de clonagem. Os Requerentes resolveram esta questão colocando Cas9 e o tracrRNA em um diferente plasmídeo do que a matriz de CRISPR. A manipulação de um sistema induzível pode também contornar esta limitação.
[0319] Embora novas tecnologias de síntese de DNA provenham a capacidade de criar rentavelmente qualquer sequência com uma elevada produtividade permanece um desafio integrar DNA sintético em células vivas para criar genomas funcionais. Recentemente se mostrou que a estratégia de cosseleção MAGE melhora a eficácia de mutação de recombineering por seleção de uma subpopulação de células que tenha uma probabilidade aumentada de alcançar recombinação em ou em torno de um dado local. Em este método, a introdução de mutações selecionáveis é usada para aumentar as probabilidades de gerar mutações não selecionáveis próximas. Em oposição à seleção indireta provida por esta estratégia, o uso do sistema CRISPR torna possível selecionar diretamente a mutação desejada e recuperá-la com uma elevada eficácia. Estas tecnologias são um acrescento à caixa de ferramentas de manipulares genéticos, e, em conjunto com síntese de DNA, podem fazer avançar substancialmente tanto a capacidade de decifrar função dos genes como manipular organismos para propósitos biotecnológicos. Dois outros estudos se relacionam também com manipulação ajudada por CRISPR de genomas de mamífero. Se espera que estas tecnologias de edição do genoma dirigida por crRNA possam ser amplamente úteis nas ciências básicas e médicas.
[0320] Estirpes e condições de cultura. A estirpe de S. pneumoniae foi provida pelo Dr. Alexander Tomasz. A estirpe crR6 foi gerada em um estudo prévio. Cultura líquidas de S. pneumoniae foram cultivadas em meio THYE (ágar Todd- Hewitt a 30 g/L, extrato de levedura a 5 g/L) . As células foram plaqueadas em ágar tríptico de soja (TSA) suplementado com sangue de ovelha desfibrinado a 5 %. Quando apropriado foram adicionados antibióticos como se segue: canamicina (400 μg/mL), cloranfenicol (5 μg/mL), eritromicina (1 μg/mL), estreptomicina (100 μg/mL) ou espectinomicina (100 μg/mL). As medições da atividade de β-galactosidase foram feitas usando o ensaio de Miller como previamente descrito.
[0321] As estirpes de E. coli MG1655 e HME63 (derivadas de MG1655, Δ(argF-lac) U169 À cI857 Δcro-bioA galK tyr 145 UAG mutS<>amp) (31) foram providas por Jeff Roberts e Donald Court, respectivamente. Culturas líquidas de E. coli foram cultivadas em meio LB (Difco) . Quando apropriado foram adicionados antibióticos como se segue: cloranfenicol (25 μg/mL), canamicina (25 μg/mL) e estreptomicina (50 μg/mL).
[0322] Transformação de S. pneumoniae. Células competentes foram preparadas como previamente descrito (23) . Para todas as transformações de edição do genoma, as células foram gentilmente descongeladas em gelo e ressuspensas em 10 volumes de meio M2 suplementado com 100 ng/mL de peptídeo estimulador da competência CSP1(40), e seguidas por adição de constructos de edição (os constructos de edição foram adicionados a uma concentração final entre 0,7 ng/μL a 2,5 μg/uL). As células foram incubadas 20 min a 37 °C antes da adição de 2 μL de constructos de direcionamento e depois incubadas 40 min a 37 °C. Diluições em série de células foram plaqueadas no meio apropriado para se determinar a contagem de unidades formadoras de colônias (cfu).
[0323] Recombineering Lamba-vermelho de E. coli. A estirpe HME63 foi usada para todas as experiências de recombineering. As células de recombineering foram preparadas e manuseadas de acordo com um protocolo previamente publicado (6) . Brevemente, uma cultura durante a noite de 2 mL (meio LB) inoculada a partir de uma única colônia obtida de uma placa foi cultivada a 30 °C. A cultura durante a noite foi diluída 100 vezes e cultivada a 30 °C com agitação (200 rpm) e a OD600 é de 0,4-0,5 (aproximadamente 3 hrs). Para indução Lambda-vermelho, a cultura foi transferida para banho de água a 42 °C para agitar a 200 rpm durante 15 min. Imediatamente após indução, a cultura foi rodada em uma pasta de água gelada e resfriada em gelo durante 5-10 min. As células foram depois lavadas e aliquotadas de acordo com o protocolo. Para a eletrotransformação, 50 μL de células foram misturados com 1 mM de oligos isentos de sal (IDT) ou 100-150 ng de DNA de plasmídeo (preparados pelo Kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). As células foram eletroporadas usando cuvete Gene Pulser de 1 mm (Bio-rad) a 1,8 kV e foram imediatamente ressuspensas em 1 mL de meio LB à temperatura ambiente. As células foram recuperadas a 30 °C durante 1-2 hrs antes de serem plaqueadas em ágar LB com resistência a antibióticos apropriada e incubadas a 32 °C durante a noite.
[0324] Preparação de DNA genômico de S. pneumoniae. Para propósitos de transformação, DNA genômico de S. pneumoniae foi extraído usando o Kit de Purificação de DNA genômico Wizard, seguindo as instruções providas pelo fabricante (Promega). Para propósitos de genotipagem, 700 uL de culturas de S. pneumoniae durante a noite foram peletizados, ressuspensos em 60 uL de solução de enzima (2 mg/mL) e incubados 30 min a 37 °C. O DNA genômico foi extraído usando Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen).
[0325] Construção de estirpes. Todos os iniciadores usados em este estudo são providos na Tabela G. Para gerar S. pneumoniae crR6M, uma estirpe intermédia, LAM226, foi fabricada. Em esta estirpe, o gene aphA-3 (provendo resistência à canamicina) adjacente à matriz de CRISPR da estirpe S. pneumoniae foi substituído por um gene cat (provendo resistência ao cloranfenicol) . Brevemente, DNA genômico de crR6 foi amplificado usando os iniciadores L448/L444 e L447/L481, respectivamente. O gene cat foi amplificado a partir do plasmídeo pC194 usando os iniciadores L445/L446. Cada produto de PCR foi purificado em gel e todos os três foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L448/L481. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae crR6 competentes e transformantes resistentes ao cloranfenicol foram selecionados. Para gerar S. pneumoniae crR6M, DNA genômico de S. pneumoniae crR6 foi amplificado por PCR usando os iniciadores L409/L488 e L448/L481, respectivamente. Cada produto de PCR foi purificado em gel e foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L409/L481. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae LAM226 competentes e transformantes resistentes à canamicina foram selecionados.
[0326] Para gerar S. pneumoniae crR6Rc, DNA genômico de S. pneumoniae crR6M foi amplificado por PCR usando os iniciadores L430/W286, e DNA genômico de S. pneumoniae LAM226 foi amplificado por PCR usando os iniciadores W288/L481. Cada produto de PCR foi purificado em gel e foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L430/L481. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae crR6M competentes e transformantes resistentes ao cloranfenicol foram selecionados.
[0327] Para gerar S. pneumoniae crR6Rk, DNA genômico de S. pneumoniae crR6M foi amplificado por PCR usando os iniciadores L430/W286 e W287/L481, respectivamente. Cada produto de PCR foi purificado em gel e foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L430/L481. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae crR6Rc competentes e transformantes resistentes à canamicina foram selecionados.
[0328] Para gerar JEN37, DNA genômico de S. pneumoniae crR6Rk foi amplificado por PCR usando os iniciadores L430/W356 e W357/L481, respectivamente. Cada produto de PCR foi purificado em gel e foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L430/L481. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae crR6Rc competentes e transformantes resistentes à canamicina foram selecionados.
[0329] Para gerar JEN38, DNA genômico de R6 foi amplificado usando os iniciadores L422/L461 e L459/L426, respectivamente. O gene ermAM (especificando resistência à eritromicina) foi amplificado a partir do plasmídeo pFW15 43 usando os iniciadores L457/L458. Cada produto de PCR foi purificado em gel e todos os três foram fundidos por SOEing PCR com os iniciadores L422/L426. O produto de PCR resultante foi transformado em células de S. pneumoniae crR6Rc competentes e transformantes resistentes à eritromicina foram selecionados.
[0330] S. pneumoniae JEN53 foi gerada em dois passos. Em primeiro lugar, JEN43 foi construída como ilustrado na Figura 33. JEN53 foi gerada por transformação de DNA genômico de JEN25 em células JEN43 competentes e seleção em cloranfenicol e eritromicina.
[0331] Para gerar S. pneumoniae JEN62, DNA genômico de S. pneumoniae crR6Rk foi amplificado por PCR usando os iniciadores W256/W365 e W366/L403, respectivamente. Cada produto de PCR foi purificado e ligado por montagem de Gibson. O produto de montagem foi transformado em células de S. pneumoniae crR6Rc competentes e transformantes resistentes à canamicina foram selecionados.
[0332] Construção de plasmídeos. pDB97 foi construído através de fosforilação e emparelhamento de oligonucleotídeos B296/B297, seguido por ligação em pLZ12spec digerido por EcoRI/BamHI. Os Requerentes sequenciaram completamente pLZ12spec e depositaram a sua sequência no genebank (acesso: KC112384).
[0333] pDB98 foi obtido após clonagem da sequência líder de CRISPR foi clonado em conjunto com uma unidade de repetição-espaçador-repetição em pLZ12spec. Isto foi alcançado através de amplificação de DNA de crR6Rc com os iniciadores B298/B320 e B299/B321, seguida por SOEing PCR de ambos os produtos e clonagem em pLZ12spec com locais de restrição BamHI/EcoRI. Deste modo, a sequência espaçadora em pDB98 foi manipulada para conter dois locais de restrição BsaI em direções opostas que permite a clonagem sem cicatrizes de novos espaçadores.
[0334] pDB99 a pDB108 foram construídos por emparelhamento dos oligonucleotídeos B300/B301 (pDB99), B302/B303 (pDB100), B304/B305 (pDB101), B306/B307 (pDB102), B308/B309 (pDB103), B310/B311 (pDB104), B312/B313 (pDB105), B314/B315 (pDB106), B315/B317 (pDB107), B318/B319 (pDB108), seguido por ligação em pDB98 cortada por BsaI.
[0335] O plasmídeo pCas9 foi construído como se segue. Elementos de CRISPR essenciais foram amplificados a partir de DNA genômico de Streptococcus pyogenes SF370 com braços de homologia flanqueantes para Montagem de Gibson. O tracrRNA e Cas9 foram amplificados com os oligos HC008 e HC010. As sequências líder e CRISPR foram amplificadas HC011/HC014 e HC015/HC009, tal que dois locais BsaI tipo IIS fossem introduzidos entre duas repetições diretas para facilitar inserção fácil de espaçadores.
[0336] pCRISPR foi construído por subclonagem da matriz de CRISPR de pCas9 em pZE21-MCS1 através da amplificação com os oligos B298+B299 e restrição com EcoRI e BamHI. O espaçador de direcionamento de rpsL foi clonado por emparelhamento dos oligos B352+B353 e clonagem no pCRISPR cortado por Bsal dando pCRISPR::rpsL.
[0337] Geração de constructos de direcionamento e edição. Os constructos de direcionamento usados para edição do genoma foram feitos por montagem de Gibson de PCRs Esquerdas e PCRs Direitas (Tabela G) . Os constructos de edição foram feitos por SOEing PCR fundindo os produtos de PCR A (PCR A), produtos de PCR B (PCR B) e produtos de PCR C (PCR C) quando aplicável (Tabela G) . Os constructos de direcionamento CRISPR::0 e CRISPR::ermAM(paragem) foram gerados por amplificação por PCR de DNA genômico de JEN62 e crR6, respectivamente, com os oligos L409 e L481.
[0338] Geração de alvos com sequências PAM ou protoespaçadoras randomizadas. Os 5 nucleotídeos após o alvo espaçador 1 foram randomizados através de amplificação de DNA genômico de R68232.5 com os iniciadores W377/ L426. Este produto de PCR foi depois montado com o gene cat e a região a montante srtA que foram amplificados a partir do mesmo modelo com os iniciadores L422/W376. 80 ng do DNA montado foram usados para transformar as estirpes R6 e crR6. As amostras para os alvos randomizados foram preparadas usando os seguintes iniciadores: B280-B290/L426 para randomizar as bases 1-10 do alvo e B269-B278/L426 para randomizar as bases 10-20. Os iniciadores L422/B268 e L422/B279 foram usados para amplificar o gene cat e a região a montante srtA a serem montados com o primeiro e últimos 10 produtos de PCR, respectivamente. Os constructos montados foram agrupados em conjunto e 30 ng foram transformados em R6 e crR6. Após transformação, as células foram plaqueadas em seleção por cloranfenicol. Para cada amostra, mais do que 2x105 células foram agrupadas em conjunto em 1 mL de THYE e o DNA genômico foi extraído com Kit Promega Wizard. Os iniciadores B250/B251 foram usados para amplificar a região alvo. Os produtos de PCR foram marcados e operados em uma linha com extremidades emparelhadas Illumina MiSeq usando 300 ciclos.
[0339] Análise de dados de sequenciação profunda.
[0340] PAM randomizado: Para a experiência de PAM randomizado, 3.429.406 leituras foram obtidas para crR6 e 3.253.998 para R6. Se espera que somente metade delas corresponderá ao alvo de PAM enquanto a outra metade sequenciará a outra extremidade do produto de PCR. 1.623.008 das leituras de crR6 e 1.537.131 das leituras de R6 transportaram uma sequência alvo isenta de erros. A ocorrência de cada PAM possível entre estas leituras é mostrada em ficheiro suplementar. Para estimar a funcionalidade de um PAM, a sua proporção relativa na amostra de crR6 em relação à amostra de R6 foi computorizada e é denotada rijklm onde I,j,k,l,m são uma das 4 bases possíveis. Foi construído o seguinte modelo estatístico:
[0341] log(rijkim) = μ + b2i + b3j + b4k + b2b3i,j + b3b4j,k+ Eijklm,
[0342] onde ε é o erro residual, b2 é o efeito da 2a base do PAM, b3 do terceiro, b4 do quarto, b2b3 é a interação entre as segunda e terceira bases, b3b4 entre as terceira e quarta bases. Foi realizada uma análise da variância:
[0343] Foi realizada uma análise da variância:
Figure img0051
[0344] Quando adicionados a este modelo, b1 ou b5 não parece ser significativo e outras interações do que aquelas incluídas podem ser também descartadas. A escolha do modelo foi feita através de comparação sucessivas de modelos mais ou menos completos usando o método anova em R. O teste de significância honesta de Tukey foi usado para determinar se as diferenças par a par entre efeitos são significativas.
[0345] Os padrões GGNN são significativamente diferentes de todos os outros padrões e transportam o efeito mais forte (ver tabela em baixo).
[0346] De modo a mostrar que as posições 1, 4 ou 5 não afetam o padrão NGGNN, os Requerentes olharam somente para estas sequências. O seu efeito parece estar normalmente distribuído (ver representação gráfica QQ na Figura 71), e comparações de modelos usando o método anova em R mostram que o modelo nulo é o melhor, i.e., não existe papel significativo de b1, b4 e b5.
[0347] Comparação de modelos usando o método anova em R para as sequências NGGNN
Figure img0052
[0348] Interferência parcial de padrões NAGNN e NNGGN
[0349] Os padrões NAGNN são significativamente diferentes de todos os outros padrões mas transportam um efeito muito mais pequeno do que NGGNN (ver teste de significância honesta de Tukey).
[0350] Finalmente, os padrões NTGGN e NCGGN são similares e mostram significativamente mais interferência de CRISPR do que os padrões NTGHN e NCGHN (onde H é A,T ou C), como mostrado por um teste de Student par a par ajustado por Bonferroni.
[0351] Comparações par a par do efeito de b4 em sequências NYGNN usando testes t com SD agrupados
Figure img0053
[0352] Tomados em conjunto, estes resultados permitem concluir que os padrões NNGGN em geral produzem ou uma interferência completa no caso de NGGGN, ou uma interferência parcial no caso de NAGGN, NTGGN ou NCGGN.
[0353] Comparações múltiplas de Tukey das médias: 95 % de nível de confiança família a família
Figure img0054
Figure img0055
[0354] Alvo randomizado
[0355] Para a experiência de alvo randomizado, 540.726 leituras foram obtidas para crR6 e 753.570 para R6. Como antes se espera que somente metade das leituras sequenciem a extremidade interessante do produto de PCR. Após filtragem quanto a leituras que transportam um alvo que está isento de erros ou com uma mutação pontual única, 217.656 e 353.141 leituras permaneceram para crR6 e R6, respectivamente. A proporção relativa de cada mutante na amostra de crR6 em relação à amostra de R6 foi computorizada (Figura 24c). Todas as mutações fora da sequência semente (13-20 bases a partir do PAM) mostram interferência completa. Aquelas sequências foram usadas como uma referência para determinar se se poderia dizer que outras mutações dentro da sequência semente perturbavam significativamente a interferência. Uma distribuição normal foi ajustada a estas sequências usando a função fitdistr do pacote MASS R. O quantil 0,99 da distribuição ajustada é mostrado como uma linha pontilhada na Figura 24c. A Figura 72 mostra um histograma da densidade de dados com distribuição normal ajustada (linha preta) e quantil .99 (linha pontilhada).
[0356]Tabela F. Médi a da abundância relativa de sequências PAM nas amostras de crR6/R6 ao longo das bases 1
Figure img0056
[0357] Tabela G. Iniciadores usados em este estudo.
Figure img0057
Figure img0058
Figure img0059
[0358] Tabela H. Desenho de constructos de direcionamento e edição usados em este estudo.
Figure img0060
Exemplo 6: Otimização do RNA guia para Cas9 de Streptococcus pyogenes (referida como SpCas9).
[0359] Os Requerentes mutaram o tracrRNA e sequências de repetição direta, ou mutaram o RNA guia quimérico para intensificar os RNAs em células.
[0360] A otimização é baseada na observação de que existiam trechos de timinas (Ts) no tracrRNA e RNA guia, o que poderia levar a terminação precoce da transcrição pelo promotor pol 3. Portanto, os Requerentes geraram as seguintes sequências otimizadas. O tracrRNA otimizado e repetição direta otimizada correspondente são apresentados em pares:
[0361] tracrRNA otimizado 1 (mutação sublinhada):
[0362] GGAACCATTCAtAACAGCATAGCAAGTTAtAATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT
[0363] Repetição direta otimizada 1 (mutação sublinhada):
[0364] GTTaTAGAGCTATGCTGTTaTGAATGGTCCCAAAAC
[0365] tracrRNA otimizado 2 (mutação sublinhada):
[0366] GGAACCATTCAAtACAGCATAGCAAGTTAAtATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT
[0367] Repetição direta otimizada 2 (mutação sublinhada):
[0368] GTaTTAGAGCTATGCTGTaTTGAATGGTCCCAAAAC
[0369] Os Requerentes otimizaram também o RNA guia quimérico para atividade ótima em células eucarióticas.
[0370] RNA guia original:
[0371] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0372] Sequência de RNA guia quimérico otimizado 1:
[0373] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAT TAGAGCTAGAAATAGCAAGT TAATATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0374] Sequência de RNA guia quimérico otimizado 2:
[0375] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGGA AACAAAACAG CATAG CAAG T TAAAATAAG GCTAGTCCGTTAT CAAC T T GAAAAAG TGGC ACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0376] Sequência de RNA guia quimérico otimizado 3:
[0377] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTATTAGAGCTATGCTGTATTGGA AACAATACAGCATAGCAAGTTAATATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGC ACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0378] Os Requerentes mostraram que o RNA guia quimérico otimizado trabalha melhor como indicado na Figura 3. A experiência foi conduzida por cotransfecção de células 293FT com Cas9 e um cassete de RNA DNA guia U6 para expressar as quatro formas de RNA mostradas acima. O alvo do RNA guia é o mesmo local alvo no local Emx1 de humano: “GT CAC CTC CAAT GAC TAG GG”
Exemplo 7: Otimização de Cas9 de CRISPR de Streptococcus thermophilus LMD-9 (referida como St1pCas9) .
[0379] Os Requerentes desenharam RNAs guia quiméricos como mostrado na Figura 4.
[0380] Os RNAs guia de St1Cas9 podem ser submetidos ao mesmo tipo de otimização como para RNAs guia de SpCas9, por quebra dos trechos de politiminas (Ts).
Exemplo 8: Diversidade e mutações de Cas9
[0381] O sistema CRISPR-Cas é um mecanismo imune adaptativo contra invasão de DNA exógeno empregue por diversas espécies ao longo de bactérias e arqueobactérias. O sistema CRISPR-Cas9 tipo II consiste em um conjunto de genes codificando proteínas responsáveis pela "aquisição" de DNA estranho no local de CRISPR, assim como um conjunto de genes codificando a "execução" do mecanismo de clivagem de DNA; estes incluem a DNA nuclease (Cas9), um cr-RNA trans- ativante não codificante (tracrRNA), e uma matriz de espaçadores derivados de DNA estranho flanqueados por repetições diretas (crRNAs). Após maturação por Cas9, o dúplex de tracRNA e crRNA guia a nuclease Cas9 para uma sequência de DNA alvo especificado pelas sequências guia espaçadoras, e medeia quebras de fita dupla no DNA próximo de um motivo de sequência curto no DNA alvo que é requerido para clivagem e específico para cada sistema CRISPR-Cas. Os sistemas CRISPR-Cas tipo II são encontrados ao longo do reino bacteriano e altamente diversos em sequência e tamanho da proteína Cas9, sequência de repetição direta de tracrRNA e crRNA, organização do genoma destes elementos, e o requisito de motivo para clivagem do alvo. Uma espécie pode ter múltiplos sistemas CRISPR-Cas distintos.
[0382] Os Requerentes avaliaram 207 Cas9s putativas de espécies bacterianas identificadas com base em homologia de sequência com Cas9s conhecidas e estruturas ortólogas com subdomínios conhecidos, incluindo o domínio HNH da endonuclease e os domínios RuvC da endonuclease [Informação de Eugene Koonin e Kira Makarova]. A análise filogenética baseada na conservação da sequência da proteína deste conjunto revelou cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) e dois de Cas9s pequenas (~1100 aminoácidos) (Figuras 39 e 40A-F).
[0383] Em este exemplo, os Requerentes mostram que as seguintes mutações conseguem converter SpCas9 em uma enzima de corte: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A, D986A.
[0384] Os Requerentes proveem sequências mostrando onde os pontos de mutação estão localizados dentro do gene SpCas9 (Figura 41) . Os Requerentes mostram também que as nickases são ainda capazes de mediar a recombinação homóloga (Ensaio indicado na Figura 2). Além do mais, os Requerentes mostram que SpCas9 com estas mutações (individualmente) não induz quebra de fita dupla (Figura 47).
Exemplo 9: Suplemento à especificidade de direcionamento de DNA da nuclease Cas9 guiada por RNA
[0385] Cultura e transfecção de células
[0386] A linha celular de rim embriônico de humano (HEK) 293FT (Life Technologies) foi mantida em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10 % (HyClone), GlutaMAX a 2 mM (Life Technologies), penicilina a 100 U/mL, e estreptomicina a 100 μg/mL a 37 °C com incubação em CO2 a 5 %.
[0387] As células 293FT foram inoculadas em placas de 6 poços, placas de 24 poços, ou placas de 96 poços (Corning) 24 horas antes da transfecção. As células foram transfectadas usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) a confluência de 80-90 % seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para cada poço de uma placa de 6 poços foi usado um total de 1 ng de plasmídeo Cas9+sgRNA. Para cada poço de uma placa de 24 poços foi usado um total de 1 ng de plasmídeo Cas9+sgRNA a não ser que indicado de outro modo. Para cada poço de uma placa de 96 poços, 65 ng de plasmídeo de Cas9 foram usados a uma razão molar 1:1 em relação ao produto de PCR U6-sgRNA.
[0388] A linha de células-tronco embriônicas de humano HUES9 (núcleo do Harvard Stem Cell Institute) foi mantida em condições isentas de alimentação em GelTrex (Life Technologies) em meio mTesR (Stemcell Technologies) suplementado com Normocina a 100 ug/mL (InvivoGen). As células HUES9 foram transfectadas com Kit Amaxa P3 Primary Cell 4-D Nucleofector (Lonza) seguindo o protocolo do fabricante.
[0389] Ensaio de nuclease de SURVEYOR para modificação do genoma
[0390] As células 293FT foram transfectadas com DNA de plasmídeo como descrito acima. As células foram incubadas a 37 °C durante 72 horas pós-transfecção antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico foi extraído usando a Solução de Extração de DNA QuickExtractt (Epicentre) seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, as células peletizadas foram ressuspensas em solução QuickExtract e incubadas a 65 °C durante 15 minutos e 98 °C durante 10 minutos.
[0391] A região genômica flanqueando o local de CRISPR alvo para cada gene foi amplificado por PCR (iniciadores listados nas Tabelas J e K), e os produtos foram purificados usando Coluna QiaQuick Spin (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. Um total de 400 ng dos produtos de PCR purificados foi misturado com 2 μL de 10X tampão de PCR de Taq DNA Polimerase (Enzymatics) e água ultrapura até um volume final de 2 0 μL, e submetido a um processo de reemparelhamento para permitir formação de heterodúplexes: 95 °C durante 10 min, 95 °C a 85 °C com rampa a - 2 °C/s, 85 °C a 25 °C a - 0,25 °C/s, e 25 °C mantidos durante 1 minuto. Após reemparelhamento, os produtos foram tratados com nuclease de SURVEYOR e intensificador S de SURVEYOR (Transgenomics) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, e analisados em géis de poliacrilamida Novex TBE a 4-20 % (Life Technologies). Os géis foram corados com corante de DNA SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos e visualizados com um sistema de visualização em gel Gel Doc (Bio-rad) . A quantificação foi baseada em intensidades de bandas relativas.
[0392] Análise de transferência de Northern da expressão de tracrRNA em células de humano
[0393] As transferências de Northern foram realizadas como previamente descrito. Brevemente, os RNAs foram aquecidos até 95 °C durante 5 min antes de carga em géis de poliacrilamida desnaturantes a 8 % (SequaGel, National Diagnostics). De seguida, o RNA foi transferido para uma membrana Hybond N+ pré-hibridizada (GE Healthcare) e reticulada com Reticulante Stratagene UV (Stratagene). As sondas foram marcadas com [gama-32P] ATP (Perkin Elmer) com polinucleotídeo cinase T4 (New England Biolabs). Após lavagem, a membrana foi exposta a rastreio de fósforo durante uma hora e rastreada com fosforimageador (Typhoon).
[0394] Sequenciação por bissulfito para avaliar estado de metilação do DNA
[0395] As células HEK 293FT foram transfectadas com Cas9 como descrito acima. O DNA genômico foi isolado com o Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) e o bissulfito convertido com Kit EZ DNA Methylation-Lightning (Zymo Research) . PCR com bissulfito foi conduzida usando DNA Polimerase KAPA2G Robust HotStart (KAPA Biosystems) com iniciadores desenhados usando o Bisulfite Primer Seeker (Zymo Research, Tabelas J e K). Os amplicons de PCR foram purificados por gel, digeridos com EcoRI e HindIII, e ligados em uma estrutura principal de pUC19 antes da transformação. Os clones individuais foram depois sequenciados por Sanger para avaliar o estado de metilação do DNA.
[0396] Ensaio de transcrição e clivagem in vitro
[0397] As células HEK 293FT foram transfectadas com Cas9 como descrito acima. Lisatos de células inteiras foram depois preparados com um tampão de lise (HEPES a 20 mM, KCl a 100 mM, MgCl2 a 5 mM, DTT a 1 mM, glicerol a 5 %, Triton X-100 a 0,1 %) suplementado com Cocktail Inibidor de Protease (Roche). sgRNA conduzido por T7 foi transcrito in vitro usando oligos customizados (Exemplo 10) e Kit de Transcrição In Vitro HiScribe T7 (NEB) , seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para preparar locais alvo metilados, o plasmídeo pUC19 foi metilado por M.SssI e depois linearizado por Nhel. O ensaio de clivagem in vitro foi realizado como se segue: para uma reação de clivagem de 20 uL, 10 uL de lisato de células com incubados com 2 uL de tampão de clivagem (HEPES a 100 mM, KCl a 500 mM, MgCl2 a 25 mM, DTT a 5 mM, glicerol a 25 %), o RNA transcrito in vitro, e 300 ng de DNA de plasmídeo pUC19.
[0398] Sequenciação profunda para avaliar a especificidade de direcionamento
[0399] As células HEK 293FT plaqueadas em placas de 96 poços foram transfectadas com DNA de plasmídeo de Cas9 e cassete de PCR de RNA (sgRNA) 72 horas antes da extração de DNA genômico (Fig. 72). A região genômica flanqueando o local alvo de CRISPR para cada gene foi amplificada (Fig. 74, Fig. 80 (Exemplo 10)) por um método de PCR de fusão para anexar os adaptadores Illumina P5 bem como códigos de barras específicos da amostra únicos para os amplicons alvo (esquema descrito na Fig. 73). Os produtos de PCR foram purificados usando Placas de Filtro de 96 poços EconoSpin (Epoch Life Sciences) seguindo o protocolo recomendado do fabricante.
[0400] As amostras de DNA com código de barras e purificadas foram quantificadas por Kit de Ensaio de dsDNA Quant-iT PicoGreen ou Fluorômetro Qubit 2.0 (Life Technologies) e agrupadas em uma razão equimolar. Bibliotecas de sequenciação foram depois sequenciadas de modo profundo com o Sequenciador Illumina MiSeq Personal (Life Technologies).
[0401] Análise de dados de sequenciação e detecção de indel
[0402] As leituras de MiSeq foram filtradas requerendo uma qualidade Phred média (pontuação Q) de pelo menos 23, bem como correspondências de sequências perfeitas a códigos de barras e iniciadores diretos de amplicons. Leituras dos locais no e fora do alvo foram analisadas por realização em primeiro lugar de alinhamentos de SmithWaterman contra sequências de amplicon que incluíram 50 nucleotídeos a montante e a jusante do local alvo (um total de 120 pb) . Os alinhamentos, entretanto, foram analisados quanto a indels a partir de 5 nucleotídeos a montante do local alvo (um total de 30 pb) . As regiões alvo analisadas foram descartadas se parte do seu alinhamento estivesse fora da própria leitura MiSeq, ou se os pares de bases correspondidos compreendessem menos do que 85 % do seu comprimento total.
[0403] Controles negativos para cada amostra proveram uma bitola para a inclusão ou exclusão de indels como eventos de corte putativos. Para cada amostra, uma indel foi contada somente se a sua pontuação de qualidade excedesse μ — a, onde μ foi a pontuação de qualidade média do controle negativo correspondendo a essa amostra e o foi o desvio padrão do mesmo. Isto originou taxas de indel da região alvo inteiras tanto para o controle negativo como para as suas amostras correspondentes. Usando a taxa de erros por região alvo e por leitura do controle negativo, q, a contagem de indel observada da amostra n, e sua contagem de leituras R, uma estimativa de probabilidade máxima para a fração de leituras tendo regiões alvo com indels verdadeiras, p, foi derivada por aplicação de um modelo de erro binomial, como se segue.
[0404] Deixando o número (desconhecido) de leituras em uma amostra tendo regiões alvo incorretamente contadas como tendo pelo menos 1 sendo E podemos escrever (sem fazer quaisquer assunções sobre o número de indels verdadeiras)
Figure img0061
[0405] uma vez R(1 — P) é o número de leituras tendo regiões alvo sem indels verdadeiras. Entretanto, porque o número de leituras observadas como tendo indels é n, n = E + Rp, por outras palavras o número de leituras tendo regiões alvo com erros mas nenhumas indels verdadeiras mais o número de leituras cujas regiões alvo têm corretamente indels. Podemos reescrever o acima
Figure img0062
[0406] Considerando todos os valores da frequência de regiões alvo com indels verdadeiros p como sendo igualmente prováveis a priori, Prob(π|p) α Prob(p|n) . A estimativa de probabilidade máxima (MLE) para a frequência de regiões alvo com indels verdadeiras foi portanto definida como o valor p que maximizava Prob(n|p) . Isto foi numericamente avaliado.
[0407] De modo a colocar fronteiras de erros nas frequências de leitura de indels verdadeiras nas próprias bibliotecas de sequenciação foram calculados intervalos de pontuação de Wilson (2) para cada amostra, dada a estimativa de MLE para regiões alvo com indels verdadeiras, Rp, e o número de leituras R. Explicitamente, a fronteira inferior l e a fronteira superior u foram calculadas como
Figure img0063
[0408] onde z, a pontuação padrão para a confiança requerida na distribuição normal da variância 1, foi definida para 1,96, significando uma confiança de 95 %. As fronteiras superiores máximas e as fronteiras inferiores mínimas para cada réplica biológica são listadas nas Figs. 80-83.
[0409] Análise por RT-PCR da expressão relativa de Cas9 e sgRNA
[0410] As células 293FT plaqueadas em placas de 24 poços foram transfectadas como descrito acima. 72 horas pós- transfecção, o RNA total foi coletado com Kit miRNeasy Micro (Qiagen) . A síntese de fita reversa para sgRNAs foi realizada com kit qScript Flex cDNA (VWR) e iniciadores sintéticos de primeira fita customizados (Tabelas J e K). Análise por qPCR foi realizada com Mistura Principal Fast SYBR Green (Life Technologies) e iniciadores customizados (Tabelas J e K), usando GAPDH como um controle endógeno. A quantificação relativa foi calculada pelo método ΔΔCT.
[0411] Tabela I | Sequências de locais alvo. Locais alvo testados para sistema CRISPR tipo II de S. pyogenes com o PAM requerido. As células foram transfectadas com Cas9 e ou crRNA-tracrRNA ou sgRNA quimérico para cada alvo.
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Figure img0065
[0412] Tabela J Sequências de iniciadores Ensaio de SURVEYOR
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qRT-PCR para expressão de Cas9 e sgRNA
Figure img0067
Figure img0068
PCR por bissulfitos e sequenciação
Figure img0069
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[0413] Tabela K | Sequências para iniciadores para testar arquitetura de sgRNA. Os iniciadores hibridam com a fita reversa do promotor U6 a não ser que indicado de outro modo. O local de iniciação U6 está em itálico, a sequência guia é indicada como um trecho de Ns, a sequência de repetição direta está destacada em negrito, e a sequência de tracrRNA sublinhada. A estrutura secundária de cada arquitetura de sgRNA é mostrada na Fig. 43.
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[0414] Tabela L | Locais alvo com PAMs alternativos para teste da especificidade quanto a PAM de Cas9. Todos os locais alvo para teste da especificidade quanto a PAM são encontrados dentro do local EMX1 de humano.
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Figure img0074
Exemplo 10: Sequências Suplementares
[0415] Todas as sequências estão na direção 5’ para 3’ . Para transcrição por U6, o fio de Ts sublinhadas serve como o terminador transcricional.
[0416] > U6-tracrRNA curto (Streptococcus pyogenes SF370)
[0417] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAA ATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
[0418] (sequência de tracrRNA em negrito)
[0419] >U6-DR-sequência guia-DR (Streptococcus pyogenes SF370)
[0420] Gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggttttagagctatgctgttttgaatggtc ccaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN gttttagagctatgctgttttg aatggtcccaaaacTTTTTTT
[0421] (a sequência de repetição direta está destacada em cinza e a sequência guia está em Ns em negrito)
[0422] > sgRNA contendo +48 tracrRNA (Streptococcus pyogenes SF370)
[0423] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaa tagcaagttaaaataaggctagtccgTTTTTTT
[0424] (a sequência guia está em Ns em negrito e o fragmento de tracrRNA está em negrito)
[0425] > sgRNA contendo +54 tracrRNA (Streptococcus pyogenes SF370)
[0426] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaa tagcaagttaaaataaggctagtccgtta tcaTTTTTTTT
[0427] (a sequência guia está em Ns em negrito e o fragmento de tracrRNA está em negrito)
[0428] > sgRNA contendo +67 tracrRNA (Streptococcus pyogenes SF370)
[0429] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT
[0430] (a sequência guia está em Ns em negrito e o fragmento de tracrRNA está em negrito)
[0431] > sgRNA contendo +85 tracrRNA (Streptococcus pyogenes SF370)
[0432] gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgata caaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtac aaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgt tttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttt atatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagct agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagt cggtgcTTTTTTT
[0433] (a sequência guia está em Ns em negrito e o fragmento de tracrRNA está em negrito)
[0434] > CBh-NLS-SpCas9-NLS
[0435] cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccca acgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaataggg actttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtaca tcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctac gtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccc catctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtg cagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgag gggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccg aaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgc ggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctc gcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacg gcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttg gttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttca ggttGGaccggtgccac cAT GGAC TATAAGGACCACGACGGAGAC TACAAGGAT CATGA TATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTA TCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAAC TC TGTGGGC TGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGT GCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACC AGACGGAAGAACCGGATCTGC TATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGT GGACGACAGC T TC TTCCACAGACTGGAAGAGTCC TTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGC ACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTAC CCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCG GCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGG GCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACC TACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCAT CC TGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGC TGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCG GCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCC AAC TTCAAGAGCAAC T TCGACC TGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGC TGAGCAAGGACAC CTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGT TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAAC ACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCA CCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAG AGAT TTTCT TCGACCAGAGCAAGAACGGC TACGCCGGC TACATTGACGGCGGAGCCAGC CAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGA AC TGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACC TGC TGCGGAAGCAGCGGACC TTCGACAACG GCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAA GAT TTT TACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCC TGACCT TCCG CATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCA GAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCT TCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAA GGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTAC TTCACCGTGTATAACGAGCTGACCA AAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAA AAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAA AGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAG ATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAAT TATCAAGGACAAG GACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGAC ACTGTT TGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACC TGTTCG ACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGC CGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCT GAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGA CCTT TAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAG CACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCAT TAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAA GGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCG AAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATG AAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGT GGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGG ATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCAT ATCGTGCCTCAGAGC TTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGC TGACCAGAAG CGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGA AGAAC TACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGAT TACCCAGAGAAAGTTCGACAAT CTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGC T TCATCAAGAG ACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGA TGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTG AAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGAT CAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGA TCAAAAAGTACCC TAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGAC TACAAGGTGTACGAC GTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTT C T TCTACAGCAACATCATGAACTTT TTCAAGACCGAGAT TACCCTGGCCAACGGCGAGA TCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAG GGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAA AAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGC TTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACA GCGATAAGC TGATCGCCAGAAAGAAGGAC TGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGC TTCGAC AGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAA GAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCG AGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGC TACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTG ATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCT GGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGA ACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAG CAGAAACAGCTGT TTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGAT CAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCG CCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTG TTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGA CCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCA TCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACTTTCTTTTT C T TAGCTTGACCAGC TTTCT TAGTAGCAGCAGGACGC T T TAA
[0436] (NLS-hSpCas9-NLS está destacado em negrito)
[0437] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.1, 1.14, 1.17
[0438] CCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAGGGTGGG CAACCACAAACCCACGAGGGCAGAGTGCTGCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGC CCAAGCTGGACTCTGGCCAC
[0439] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.2, 1.16
[0440] CGAGCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCA TTGCCACGAAGCAGGCCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAGGGTGGG CAACCACAAACCCACGAG
[0441] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.3, 1.13, 1.15
[0442] GGAGGACAAAGTACAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCT GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAA GCAGGCCAATGGGGAGGACATCGAT
[0443] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.6
[0444] AGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAG GGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAAGCAGGCCAATGGGGAGGACAT CGATGTCACCTCCAATGACTAGGGTGG
[0445] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.10
[0446] CCTCAGTCTTCCCATCAGGCTCTCAGCTCAGCCTGAGTGTTGAG GCCCCAGTGGCTGCTCTGGGGGCCTCCTGAGTTTCTCATCTGTGCCCCTCCCTCCCTGG CCCAGGTGAAGGTGTGGTTCCA
[0447] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.11, 1.12
[0448] TCATCTGTGCCCCTCCCTCCCTGGCCCAGGTGAAGGTGTGGTTC CAGAACCGGAGGACAAAGTACAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCGA GCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACA
[0449] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.18, 1.19
[0450] CTCCAATGACTAGGGTGGGCAACCACAAACCCACGAGGGCAGAG TGCTGCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGCCCAAGCTGGACTCTGGCCACTCCCT GGCCAGGCTTTGGGGAGGCCTGGAGT
[0451] > Amplicon de sequenciação para guias de EMX1 1.20
[0452] CTGCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGCCCAAGCTGGACT CTGGCCACTCCCTGGCCAGGCTTTGGGGAGGCCTGGAGTCATGGCCCCACAGGGCTTGA AGCCCGGGGCCGCCATTGACAGAG
[0453] >iniciador F do promotor T7 para emparelhamento com fita alvo
[0454] gaaatTAATACGACTCACTATAGGG
[0455] >oligo contendo local alvo 1 de pUC19 para metilação (T7 reverso)
[0456] aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacgga ctagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacaacgacgagcgtgacaccacc ctatagtgagtcgtattaatttc
[0457] >oligo contendo local alvo 2 de pUC19 para metilação (T7 reverso)
[0458] aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacgga ctagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacgcaacaattaatagactggac ctatagtgagtcgtattaatttc
Exemplo 11: Recombinação Homóloga induzida por Cas9 mediada por Oligos
[0459] O teste de recombinação homóloga com oligos é uma comparação da eficácia ao longo de diferentes variantes de Cas9 e diferente modelo de HR (oligo vs. plasmídeo) .
[0460] Foram usadas células 293FT. SpCas9 = Cas9 de Tipo Selvagem e SpCas9n = nickase Cas9 (D10A) . O alvo de RNA quimérico é o mesmo Alvo Protoespaçador 1 de EMX1 como nos Exemplos 5, 9 e 10 e oligos sintetizados por IDT usando purificação PAGE.
[0461] A Figura 44 ilustra um desenho do DNA de oligo usado como modelo de Recombinação Homóloga (HR) em esta experiência. Os oligos longos contêm homologia de 100 pb com o local EMX1 e um local de restrição HindIII. As células 293FT foram cotransfectadas com: em primeiro lugar, um plasmídeo contendo um RNA quimérico se dirigindo ao local EMX1 de humano e proteína cas9 de tipo selvagem, e, em segundo lugar, o DNA de oligo como modelo de HR. As amostras são de células 293FT coletadas 96 horas pós-transfecção com Lipofectamine 2000. Todos os produtos foram amplificados com um Iniciador de HR de EMX1, purificados em gel, seguidos por digestão com HindIII para detectar a eficácia de integração do modelo de HR no genoma de humano.
[0462] As Figuras 45 e 46 ilustram uma comparação da eficácia de HR induzida por diferente combinação de proteína Cas9 e modelo de HR. O constructo de Cas9 usado foi ou Cas9 de tipo selvagem ou a versão nickase de Cas3 (Cas9n) . O modelo de HR usado foi: DNA de oligo antissenso (Oligo Antissenso na figura acima), ou DNA de oligo senso (Oligo Senso na figura acima), ou modelo de HR de plasmídeo (modelo de HR na figura acima). A definição senso/antissenso é que a fita ativamente transcrita com sequência correspondendo ao mRNA transcrito é definida como a fita senso do genoma. A Eficácia de HR é mostrada como a percentagem de banda de digestão de HindIII como contra todo o produto genômico amplificado por PCR (números do fundo).
Exemplo 12: Camundongo Autístico
[0463] Iniciativas recentes de sequenciação em larga escala produziram um grande número de genes associados a doença. A descoberta dos genes é somente o início no entendimento do que o gene faz e como leva a um fenótipo de doença. As tecnologias e abordagens correntes para estudar genes candidatos são lentas e laboriosas. Os padrões de ouro, direcionamento de genes e inativações genéticas, requerem um investimento significativo em tempo e recursos, tanto monetários como em termos de pessoal de investigação. Os Requerentes se propuseram a utilizar a nuclease hSpCas9 para se dirigir a muitos genes e fazer tal com eficácia mais elevada e retorno menor em comparação com qualquer outra tecnologia. Devido à elevada eficácia de hSpCas9, os Requerentes conseguem fazer injeção de RNA em zigotos de camundongo e imediatamente obter animais com genoma modificado sem a necessidade de fazer qualquer direcionamento de genes preliminar em mESCs.
[0464] A proteína de ligação ao DNA da helicase do cromodomínio 8 (CHD8) é um gene crítico em envolvido no desenvolvimento e morfogênese precoces de vertebrados. Os camundongos não tendo CHD8 morrem durante o desenvolvimento embriônico. Mutações no gene CHD8 foram associadas a distúrbio do espectro do autismo em humanos. Esta associação foi feita em três diferentes artigos publicados simultaneamente na Nature. Os mesmos três estudos identificaram uma pletora de genes associados a distúrbio do espectro do autismo. O objetivo dos Requerentes foi criar camundongos nocaute para os quatro genes que foram encontrados em todos os artigos, Chd8, Katnal2, Kctd13, e Scn2a. Adicionalmente, os Requerentes escolheram dois outros genes associados ao distúrbio do espectro do autismo, esquizofrenia, e ADHD, GIT1, CACNA1C, e CACNB2. E, finalmente, como um controle positivo, os Requerentes decidiram se dirigir a MeCP2.
[0465] Para cada gene, os Requerentes desenharam três gRNAs que provavelmente inativariam o gene. Uma inativação ocorreria após a nuclease hSpCas9 fazer uma quebra de fita dupla e a via de reparação de DNA propensa a erros, junção de extremidades não homólogas, corrige a quebra, criando uma mutação. O resultado mais provável é uma mutação de troca de grelha que inativaria o gene. A estratégia de direcionamento envolveu procura de protoespaçadores nos éxons do gene que tinham uma sequência PAM, NGG, e era única no genoma. Foi dada preferência a protoespaçadores no primeiro éxon, que seria o mais prejudicial para o gene.
[0466] Cada gRNA foi validado na linha celular de camundongo, Neuro-N2a, por cotransfecção transiente lipossomal com hSpCas9. 72 horas pós-transfecção, o DNA genômico foi purificado usando QuickExtract DNA da Epicentre. Foi realizada PCR para amplificar o local de interesse. Subsequentemente foi seguido o Kit de Detecção de Mutações SURVEYOR da Transgenomics. Os resultados de SURVEYOR para cada gRNA e respectivos controles são mostrados na Figura A1. Um resultado de SURVEYOR positivo é uma larga banda correspondendo ao PCR genômico e duas bandas mais pequenas que são o produto da nuclease de SURVEYOR fazendo uma quebra de fita dupla no local de uma mutação. A eficácia de corte média de cada gRNA foi também determinada para cada gRNA. O gRNA que foi escolhido para injeção foi o gRNA com eficácia mais elevada que era o mais único dentro do genoma.
[0467] RNA (RNA de hSpCas9+gRNA) foi injetado no pró-núcleo de um zigoto e mais tarde transplantado em um mãe de acolhimento. Se permitiu que as mães levassem a termo e os filhotes foram amostrados por corte na cauda 10 dias pós- natal. DNA foi extraído e usado como um modelo para PCR, que foi depois processado por SURVEYOR. Adicionalmente, os produtos de PCR foram enviados para sequenciação. Os animais que foram detectados como sendo positivos ou no ensaio de SURVEYOR ou sequenciação por PCR teriam os seus produtos genômicos de PCR clonados em um vetor pUC19 e sequenciados para determinar mutações putativas de cada alelo.
[0468] Até agora, os filhotes de camundongo da experiência de direcionamento de Chd8 foram completamente processados até ao ponto de sequenciação de alelos. Os resultados de Surveyor para 38 filhotes vivos (linhas 1-38), 1 filhote morto (linha 39) e 1 filhote de tipo selvagem para comparação (linha 40) são mostrados na Figura A2. Os filhotes 1-19 foram injetados com gRNA Chd8.2 e os filhotes 20-38 foram injetados com gRNA Chd8.3. Dos 38 filhotes vivos, 13 foram positivos para uma mutação. O filhote morto teve também uma mutação. Não existiu mutação detectada na amostra de tipo selvagem. A sequência de DNA genômico foi consistente com as descobertas do ensaio de SURVEYOR.
Exemplo 13: Modulação Transcricional Mediada por CRISPR/Cas
[0469] A Figura 67 ilustra um desenho do CRISPR-TF (Fator de Transcrição) com atividade de ativação transcricional. O RNA quimérico é expresso pelo promotor U6, enquanto uma versão de códon otimizado de humano, duplo mutante da proteína Cas9 (hSpCas9m), operacionalmente ligada a NLS triplo e um domínio funcional VP64, é expressa por um promotor EF1a. As mutações duplas, D10A e H840A, tornam a proteína cas9 incapaz de introduzir qualquer clivagem mas mantiveram a sua capacidade de se ligar a DNA alvo quando guiado pelo RNA quimérico.
[0470] A Figura 68 ilustra a ativação transcricional do gene SOX2 de humano com sistema CRISPR-TF (RNA Quimérico e a proteína de fusão Cas9-NLS-VP64). As células 293FT foram transfectadas com plasmídeos transportando dois componentes: (1) RNAs quiméricos diferentes conduzidos por U6 se dirigindo a sequências de 20 pb dentro ou em torno do local genômico SOX2 de humano, e (2) proteína de fusãohSpCas9m (mutante duplo)-NLS-VP64 conduzida por EF1a. 96 horas pós- transfecção, as células 293FT foram coletadas e o nível de ativação é medido pela indução de expressão de mRNA usando um ensaio pRT-PCR. Todos os níveis de expressão são normalizados contra o grupo de controle (barra cinza), o que representa resultados de células transfectadas com o plasmídeo de estrutura principal CRISPR-TF sem RNA quimérico. As sondas de qRT-PCR usadas para detecção do mRNA de SOX2 é Ensaio de Expressão de Genes de Humano Taqman (Life Technologies) . Todas as experiências representam dados de 3 réplicas biológicas, n=3, as barras de erros mostram s.e.m.
Exemplo 14: NLS: NLS de Cas9
[0471] As células 293FT foram transfectadas com plasmídeo contendo dois componentes: (1) Promotor EF1a conduzindo a expressão de Cas9 (SpCas9 de códon otimizado de humano de tipo selvagem) com diferentes desenhos de NLS (2) Promotor U6 conduzindo o mesmo RNA quimérico se dirigindo ao local EMX1 de humano.
[0472] As células foram coletadas ao momento temporal 72 h pós-transfecção, e depois extraídas com 50 μL da solução de extração de DNA genômico QuickExtract seguindo o protocolo do fabricante. O DNA genômico de EMX1 alvo foi amplificado por PCR e depois purificado por Gel com gel de agarose a 1 %. Os produtos genômicos de PCR foram reemparelhados e submetidos ao ensaio de Surveyor seguindo o protocolo do fabricante. As eficácias de clivagem genômica de diferentes constructos foram medidas usando SDS-PAGE em um gel TBE-PAGE a 4-12 % (Life Technologies), analisadas e quantificadas com software ImageLab (Bio-rad), tudo seguindo o protocolo do fabricante.
[0473] A Figura 69 ilustra um desenho de diferentes constructos de NLS de Cas9. Todas as Cas9 foram a versão de códon otimizado de humano da Sp Cas9. As sequências de NLS são ligadas ao gene cas9 no terminal N ou terminal C. Todas as variantes de Cas9 com diferentes desenhos de NLS foram clonadas em um vetor de estrutura principal contendo tal que seja conduzido pelo promotor EF1a. No mesmo vetor existe um local EMX1 de humano de direcionamento de DNA quimérico conduzido pelo promotor U6, formando em conjunto um sistema de dois componentes.
[0474] Tabela M. Resultados do Teste de Desenho de NLS de Cas9. Quantificação de clivagem genômica de diferentes constructos cas9-nls por ensaio de surveyor.
Figure img0075
Figure img0076
[0475] A Figura 70 ilustra a eficácia de clivagem genômica induzida por variantes de Cas9 transportando diferentes desenhos de NLS. A percentagem indica a porção de DNA genômico de EMX1 de humano que foi clivada por cada constructo. Todas as experiências são de 3 réplicas biológicas. n = 3, o erro indica S.E.M.
Exemplo 15: Manipulação de Microalgas usando Cas9
[0476] Métodos de distribuição de Cas9
[0477] Método 1: Os Requerentes distribuem Cas9 e RNA guia usando um vetor que expressa Cas9 sob o controle de um promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2- tubulina.
[0478] Método 2: Os Requerentes distribuem Cas9 e polimerase T7 usando vetores que expressam Cas9 e polimerase T7 sob o controle de um promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2-tubulina. O RNA guia será distribuído usando um vetor contendo o promotor T7 conduzindo o RNA guia.
[0479] Método 3: Os Requerentes distribuem mRNA de Cas9 e RNA guia transcrito in vitro a células de algas. O RNA pode ser transcrito in vitro. O mRNA de Cas9 consistirá na região de codificação para Cas9 bem como 3'UTR de Cop1 para assegurar estabilização do mRNA de Cas9.
[0480] Para Recombinação homóloga, os Requerentes proveem um modelo de reparação dirigida a homologia adicional.
[0481] Sequência de um cassete conduzindo a expressão de Cas9 sob o controle do promotor da beta-2 tubulina, seguido por 3' UTR de COP1.
[0482] TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCT GCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTC CTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCA GGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGAT CACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCC TCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTA CGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCC TGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCC AGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGAT CGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCG C CAGAAGAAGATACAC CAGAC G GAAGAAC C G GAT CTGCTATCTG CAAGAGAT CTT CAGC AACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGT GGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGG CCTAC CAC GAGAAGTAC C C CAC CATCTAC CAC C T GAGAAAGAAAC TGGTG GACAG CAC C GACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGG CCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCA TCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGC GTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCT GATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGA GCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTG CAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGA CCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCG ACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAG AGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCT GCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACA TTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAG ATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCA GCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCA TTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAG AAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAG ATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAG TGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAG AACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGT GTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCC TGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTG ACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGA AATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGA AAAT TATCAAGGACAAGGAC T T CCTGGACAAT GAGGAAAACGAGGACAT T CTGGAAGAT ATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAAC CTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCG GCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAG ACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGAT CCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGG GCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGC ATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCC C GAGAACAT CGTGATC GAAAT GGCCAGAGAGAAC CAGAC CAC C CAGAAG G GACAGAAGA ACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATC C T GAAAGAACAC CCCGTG GAAAACAC C CAG C T GCAGAAC GAGAAG CTGTACCTGTACTA CCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCG AC TAC GAT GTG GAC CATATCGTGCCT CAGAG CTTTCT GAAG GAC GAC TCCATC GACAAC AAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGA GGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCC AGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAG GCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACA GATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAG TGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTT TACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGT CGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCG ACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAG GCTAC CGCCAAG TACTTCTTC TACAG CAACAT CAT GAAC TTTTT CAAGACCGAGAT TAC CCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGG AGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCC CAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTAT CCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGA AGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTG GAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAG TGTGAAAGAGCTGCTGGGGAT CACCAT CAT GGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAG AAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAAC GGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCT GCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCT CCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGAC GAGAT CAT C GAGCAGAT CAG C GAG TTCTC CAAGAGAG TGATCCTGGCC GACGC TAATCT GGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCG AGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTAC TTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCAC CCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGG GAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAAGGATCCGGCAAGACT GGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTAT GTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTC CTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT
[0483] Sequência de um cassete conduzindo a expressão de polimerase T7 sob o controle do promotor da beta-2 tubulina, seguido por 3' UTR de Cop1.
[0484] TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCT GCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTC CTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCA GGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGAT CACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCC TCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACatgcctaagaagaagaggaaggttaa cacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttca acactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcat gagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagc tggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaaga tgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccg acagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaa gaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcg caatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagct aagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaa gaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcg aggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgag atgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtagg tcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtg caggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccg tggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggt gcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgt acaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattga gcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccg cgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgt atcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctg gttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaag gaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgacaaggttcc gttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgcta agtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcg ttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttcc gctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatg aggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacggg attgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataa cgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgg gcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaag cgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgct ggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccga atcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggta gctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggt caaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactc ctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctg atgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagat tgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggta gccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgca ctgattcacgactccttcggtacgattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagt gcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgacc agttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaa ggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaGGATCCGG CAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATG TGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTG GCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT
[0485] Sequência de RNA guia conduzido pelo promotor T7 (promotor T7, Ns representam a sequência de direcionamento):
[0486] gaaat TAATACGACTCAC TATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgt tttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg gcaccgagtcggtgcttttttt
[0487] Distribuição de genes:
[0488] As estirpes de Chlamydomonas reinhardtii CC 124 e CC-125 do Chlamydomonas Resource Center serão usadas para eletroporação. O protocolo de eletroporação segue o protocolo recomendado padrão do kit GeneArt Chlamydomonas Engineering.
[0489] Igualmente, os Requerentes geram uma linha de Chlamydomonas reinhardtii que expressa Cas9 constitutivamente. Isto pode ser feito por uso de pChlamy1 (linearizado usando Pvul) e seleção quanto a colônias resistentes à higromicina. A sequência para pChlamy1 contendo Cas9 está em baixo. Em este modo de se alcançar inativação de genes é simplesmente necessário distribuir o RNA ao RNA guia. Por recombinação homóloga, os Requerentes distribuem RNA guia bem como um modelo de recombinação homóloga linearizado.
[0490] pChlamy1-Cas9:
[0491] TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG TGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGAT TAT CAAAAAG GATCTTCACC TAGAT CCTTT TAAAT TAAAAAT GAAG TTT TAAAT C AATC TAAAG TATATAT GAG TAAAC TTGGTCT GACAG TTACCAATGCTTAAT CAG T GAG G CACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTG TAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCG AGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCG AGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGG GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTAC AGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAAC GATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGC ACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGT ACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCG TCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAA ACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGT AACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGG TGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATG TTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTC TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAA AAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTT TTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAG CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCT AATCCTGTTACCAGTGGCTGTTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACT CAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACA CAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGG TCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGT CCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGG GCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCT GGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTC AGTGAGCGAGGAAGCGGTCGCTGAGGCTTGACATGATTGGTGCGTATGTTTGTATGAAG CTACAGGACTGATTTGGCGGGCTATGAGGGCGGGGGAAGCTCTGGAAGGGCCGCGATGG GGCGCGCGGCGTCCAGAAGGCGCCATACGGCCCGCTGGCGGCACCCATCCGGTATAAAA GCCCGCGACCCCGAACGGTGACCTCCACTTTCAGCGACAAACGAGCACTTATACATACG CGACTATTCTGCCGCTATACATAACCACTCAGCTAGCTTAAGATCCCATCAAGCTTGCA TGCCGGGCGCGCCAGAAGGAGCGCAGCCAAACCAGGATGATGTTTGATGGGGTATTTGA GCACTTGCAACCCTTATCCGGAAGCCCCCTGGCCCACAAAGGCTAGGCGCCAATGCAAG CAGTTCGCATGCAGCCCCTGGAGCGGTGCCCTCCTGATAAACCGGCCAGGGGGCCTATG TTCTTTACTTTTTTACAAGAGAAGTCACTCAACATCTTAAAATGGCCAGGTGAGTCGAC GAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTG TGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTC GCCGTTTCCATTTG CAGGAGAT T C GAG GTAC CAT GTACCCATACGATGTTC CAGAT TAC GCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCT GGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCA GCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATC GGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGC CAGAAGAAGATACAC CAGACGGAAGAACCGGATCTGCTAT C TGCAAGAGATCTT CAGCA ACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTG GAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGC CTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCG ACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGC CACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCAT CCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCG TGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTG ATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAG CCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGC AGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGAC CAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGA CATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGA GATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTG CCT GAGAAG TACAAAGAGAT TTTCTTCGAC CAGAG CAAGAAC GGCTACGCCGGC TACAT TGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGA TGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAG CGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCAT TCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGA AGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGA TTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGT GGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGA ACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTG TATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCT GAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGA CCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAA ATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAA AAT TAT CAAGGACAAGGAC T T CCTGGACAAT GAGGAAAACGAGGACAT TCT GGAAGATA TCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACC TATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGG CTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGA CAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATC CACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGG CGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCA TCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCC GAGAACAT CGTGATC GAAAT GGC CAGAGAGAAC CAGAC CAC C CAGAAG G GACAGAAGAA CAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCC T GAAAGAACAC CCCGT GGAAAACAC C CAG CTG CAGAAC GAGAAG CTGTACCTGTACTAC CTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGA CTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACA AGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAG GTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCA GAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGG CCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAG ATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGT GAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTT ACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTC GTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGA CTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGG CTACCGC CAAG TAC TTCTTC TACAG CAACAT CAT GAAC TTTTT CAAGACCGAGAT TACC CTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGA GATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCC AAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATC CTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAA GTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGG AAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATG GAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGA AGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACG GCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTG CCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTC CCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACG AGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTG GACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGA GAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACT TTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACC CTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGG AGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAACATATGATTCGAATGT CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCG GCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGG GCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAA GACATTATAGC GAG CTAC CAAAGCCATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC TTC TACA CAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTC AGTCACAACCCGCAAACATGACACAAGAATCCCTGTTACTTCTCGACCGTATTGATTCG GATGATTCCTACGCGAGCCTGCGGAACGACCAGGAATTCTGGGAGGTGAGTCGACGAGC AAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTC GACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCG TTTCCATTTGCAGCCGCTGGCCCGCCGAGCCCTGGAGGAGCTCGGGCTGCCGGTGCCGC CGGTGCTGCGGGTGCCCGGCGAGAGCACCAACCCCGTACTGGTCGGCGAGCCCGGCCCG GTGATCAAGCTGTTCGGCGAGCACTGGTGCGGTCCGGAGAGCCTCGCGTCGGAGTCGGA GGCGTACGCGGTCCTGGCGGACGCCCCGGTGCCGGTGCCCCGCCTCCTCGGCCGCGGCG AGCTGCGGCCCGGCACCGGAGCCTGGCCGTGGCCCTACCTGGTGATGAGCCGGATGACC GGCACCACCTGGCGGTCCGCGATGGACGGCACGACCGACCGGAACGCGCTGCTCGCCCT GGCCCGCGAACTCGGCCGGGTGCTCGGCCGGCTGCACAGGGTGCCGCTGACCGGGAACA CCGTGCTCACCCCCCATTCCGAGGTCTTCCCGGAACTGCTGCGGGAACGCCGCGCGGCG ACCGTCGAGGACCACCGCGGGTGGGGCTACCTCTCGCCCCGGCTGCTGGACCGCCTGGA GGACTGGCTGCCGGACGTGGACACGCTGCTGGCCGGCCGCGAACCCCGGTTCGTCCACG GCGACCTGCACGGGACCAACATCTTCGTGGACCTGGCCGCGACCGAGGTCACCGGGATC GTCGACTTCACCGACGTCTATGCGGGAGACTCCCGCTACAGCCTGGTGCAACTGCATCT CAACGCCTTCCGGGGCGACCGCGAGATCCTGGCCGCGCTGCTCGACGGGGCGCAGTGGA AGCGGACCGAGGACTTCGCCCGCGAACTGCTCGCCTTCACCTTCCTGCACGACTTCGAG GTGTTCGAGGAGACCCCGCTGGATCTCTCCGGCTTCACCGATCCGGAGGAACTGGCGCA GTTCCTCTGGGGGCCGCCGGACACCGCCCCCGGCGCCTGATAAGGATCCGGCAAGACTG GCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATG TATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCC TGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT
[0492] Para todas as células de Chlamydomonas reinhardtii modificadas, os Requerentes usaram PCR, ensaio de nuclease de SURVEYOR, e sequenciação de DNA para verificar modificação bem-sucedida.
Exemplo 16: Uso de Cas9 como um repressor transcricional em bactérias
[0493] A capacidade de controlar artificialmente a transcrição é essencial tanto no estudo da função de genes como na construção de redes de genes sintéticos com propriedades desejadas. Os Requerentes descrevem aqui o uso da proteína Cas9 guiada por RNA como um repressor transcricional programável.
[0494] Os Requerentes demonstraram previamente como a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes SF370 pode ser usada para dirigir a edição do genoma em Streptococcus pneumoniae. Em este estudo, os Requerentes manipularam a estirpe crR6Rk contendo um sistema CRISPR mínimo, consistindo em cas9, o tracrRNA e uma repetição. As mutações D10A-H840 foram introduzidas em cas9 em esta estirpe, dando a estirpe crR6Rk**. Quatro espaçadores se dirigindo a diferentes posições do gene promotor da β-galactosidase bgaA foram clonados na matriz de CRISPR transportada pelo plasmídeo pDB98 previamente descrito. Os Requerentes observaram uma redução de X a Y vezes na atividade de β - galactosidase dependendo da posição dirigida, demonstrando o potencial de Cas9 como um repressor programável (Figura 73).
[0495] Para alcançar repressão de Cas9** em Escherichia coli, um plasmídeo repórter (pDB127) com proteína fluorescente verde (GFP) foi construído para expressar o gene gfpmut2 a partir de um promotor constitutivo. O promotor foi desenhado para transportar vários PAMs NPP em ambas as fitas, para medir o efeito da ligação de Cas9** em várias posições. Os Requerentes introduziram as mutações D10A-H840 em pCas9, um plasmídeo descrito transportando o tracrRNA, cas9 e uma matriz de CRISPR mínima desenhado para a clonagem fácil de novos espaçadores. Foram desenhados vinte e dois espaçadores diferentes para se dirigirem a diferentes regiões do promotor e grelha de leitura aberta de gfpmut2. Uma redução de aproximadamente 20 vezes da fluorescência de foi observada após direcionamento de regiões se sobrepondo ou adjacentes aos elementos promotores -35 e -10 e à sequência de Shine- Dalgarno. Os alvos em ambas as fitas mostraram níveis de repressão similares. Estes resultados sugerem que a ligação de Cas9** a qualquer posição da região promotora previne o início da transcrição, presumivelmente através da inibição estérica da ligação de RNAP.
[0496] Para determinar se Cas9** poderia prevenir o alongamento da transcrição, os Requerentes dirigiram-na à grelha de leitura de gpfmut2. Foi observada uma redução na fluorescência quando as fitas codificantes e não codificantes foram dirigidas, sugerindo que a ligação de Cas9 é de fato forte o suficiente para representar um obstáculo à RNAP em operação. No entanto, enquanto foi observada uma redução de 40 % na expressão quando a fita codificante foi o alvo, foi observada uma redução de 20 % para a fita não codificante (Fig 21b, comparar T9, T10 e T11 com B9, B10 e B11). Para determinar diretamente os efeitos da ligação de Cas9** na transcrição, os Requerentes extraíram RNA de estirpes transportando o constructo T5, T10, B10 ou de controle que não se dirige a pDB127 e o sujeitaram a análise por transferência de Northern usando uma ligação de sonda antes dos (B477) ou após os (B510) locais alvo B10 e T10. Consistente com os métodos de fluorescência dos Requerentes, não foi detectada transcrição de gfpmut2 quando Cas9** foi dirigida à região promotora (alvo T5) e foi observada uma transcrição após o direcionamento da região T10. Interessantemente foi observado um transcrito mais pequeno com a sonda B477. Esta banda corresponde ao tamanho esperado de um transcrito que seria interrompido por Cas9**, e é uma indicação direta de uma terminação transcricional causada por ligação de dgRNA::Cas9** à fita codificante. Surpreendentemente, os Requerentes não detectaram transcrição quando a fita não codificante foi dirigida (B10). Uma vez que é improvável que a ligação de Cas9** à região B10 interfira com o início da transcrição, este resultado sugere que o mRNA foi degradado. Se mostrou que DgRNA::Cas9 se liga a ssRNA in vitro. Os Requerentes especulam que a ligação pode desencadear degradação do mRNA por nucleases do hospedeiro. De fato, o bloqueio dos ribossomos pode induzir clivagem no mRNA transcrito em E. coli.
[0497] Algumas aplicações requerem um ajuste preciso expressão de genes ao invés da sua repressão completa. Os Requerentes almejaram alcançar níveis de repressão imediata através da introdução de não correspondências que enfraquecerão as interações crRNA/alvo. Os Requerentes criaram uma série de espaçadores baseados nos constructos B1, T5 e B10 com números crescentes de mutações na extremidade 5’ do crRNA. Até 8 mutações em B1 e T5 não afetaram o nível de repressão, e um aumento progressivo na fluorescência foi observado para mutações adicionais.
[0498] A repressão observada com somente uma correspondência de 8 nt entre o crRNA e seu alvo levanta a questão de efeitos fora do direcionamento do uso de Cas9** como um regulador transcricional. Uma vez que um bom PAM (NGG) é também requerido para ligação de Cas9, o número de nucleotídeos para corresponder para se obter algum nível de respiração é 10. Uma correspondência de 10 nt ocorre aleatoriamente uma vez a cada ~1 Mbp, e assim é mais provável que tais locais sejam encontrados em genomas bacterianos pequenos. No entanto, para reprimir eficazmente a transcrição, tal local necessita de estar na região promotora do gene, o que torna o não direcionamento muito menos provável. Os Requerentes mostraram também que a expressão de genes pode ser afetada se a fita não codificante de um gene foi dirigida. Para que isto aconteça, um alvo aleatório teria de estar na orientação certa, mas relativamente mais provável que tais eventos aconteçam. De fato, durante o decurso deste estudo, os Requerentes foram incapazes de construir um dos espaçadores desenhados em pCas9**. Os Requerentes descobriram mais tarde que este espaçador mostrava uma correspondência de 12 pb próximo de um bom PAM no gene murC essencial. Um tal não direcionamento poderia ser facilmente evitado por uma explosão sistemática dos espaçadores desenhados.
[0499] aspectos da invenção são adicionalmente descritos nos seguintes parágrafos numerados: 1. Um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores, em que o sistema compreende a. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tract mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma sequência guia a montante da sequência tract mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência alvo que é hibridizada com a sequência traer, e (2) a sequência tract mate que é hibridizada com a sequência traer; e b. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear; em que os componentes (a) e (b) estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema. 2. O sistema vetor do parágrafo 1, em que o componente (a) compreende adicionalmente a sequência traer a jusante da sequência tract mate sob o controle do primeiro elemento regulador. 3. O sistema vetor do parágrafo 1, em que o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. 4. O sistema vetor do parágrafo 1, em que o sistema compreende a sequência traer sob o controle de um terceiro elemento regulador. 5. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a sequência traer exibe pelo menos 50 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tract mate quando alinhada otimamente. 6. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. 7. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. 8. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. 9. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. 10. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. 11. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. 12. O sistema vetor do parágrafo 1, em que o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 13. O sistema vetor do parágrafo 1, em que o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. 14. O sistema vetor do parágrafo 4, em que o terceiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 15. O sistema vetor do parágrafo 1, em que a sequência guia tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. 16. O sistema vetor do parágrafo 1, em que menos do que 50 % dos nucleotídeos da sequência guia participam no emparelhamento de bases autocomplementar quando dobrada otimamente. 17. Um vetor compreendendo um elemento regular operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear, em que o referido elemento regulador conduz a transcrição da enzima CRISPR em uma célula eucariótica tal que a referida enzima CRISPR se acumule em uma quantidade detectável no núcleo da célula eucariótica. 18. O vetor do parágrafo 17, em que o referido elemento regulador é um promotor de polimerase II. 19. O vetor do parágrafo 17, em que a referida enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. 20. O vetor do parágrafo 17, em que a referida enzima CRISPR é uma enzima Cas9. 21. O vetor do parágrafo 17, em que a referida enzima CRISPR não tem a capacidade de clivar uma ou mais fitas de uma sequência alvo à qual se liga. 22. Uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. 23. A enzima CRISPR do parágrafo 22, em que a referida enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. 24. A enzima CRISPR do parágrafo 22, em que a referida enzima CRISPR é uma enzima Cas9. 25. A enzima CRISPR do parágrafo 22, em que a referida enzima CRISPR não tem a capacidade de clivar uma ou mais fitas de uma sequência alvo à qual se liga. 26. Uma célula hospedeira eucariótica compreendendo: a. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tract mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma sequência guia a montante da sequência tract mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência alvo que é hibridizada com a sequência traer, e (2) a sequência tract mate que é hibridizada com a sequência traer; e/ou b. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear. 27. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a referida célula hospedeira compreende os componentes (a) e (b) . 28. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que o componente (a), o componente (b), ou os componentes (a) e (b) são estavelmente integrados em um genoma da célula eucariótica hospedeira. 29. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que o componente (a) compreende adicionalmente a sequência traer a jusante da sequência tract mate sob o controle do primeiro elemento regulador. 30. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. 31. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, compreendendo adicionalmente um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado à referida sequência traer. 32. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a sequência traer exibe pelo menos 50 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tract mate quando alinhada otimamente. 33. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. 34. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. 35. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. 36. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. 37. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. 38. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. 39. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 40. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. 41. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 31, em que o terceiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 42. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que a sequência guia tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. 43. A célula hospedeira eucariótica do parágrafo 26, em que menos do que 50 % dos nucleotídeos da sequência guia participam no emparelhamento de bases autocomplementar quando dobrada otimamente. 44. Um animal não humano compreendendo uma célula hospedeira eucariótica de qualquer um dos parágrafos 26-43. 45. Um kit compreendendo um sistema vetor e instruções para se utilizar o referido kit, compreendendo o sistema vetor: a. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tract mate e um ou mais locais de inserção para inserção de uma sequência guia a montante da sequência tract mate, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula eucariótica, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo, e (2) a sequência tract mate que é hibridizada com a sequência traer; e/ou b. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear. 46. O kit do parágrafo 45, em que o referido kit compreende os componentes (a) e (b) localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema. 47. O kit do parágrafo 45, em que o componente (a) compreende adicionalmente a sequência traer a jusante da sequência tract mate sob o controle do primeiro elemento regulador. 48. O kit do parágrafo 45, em que o componente (a) compreende adicionalmente duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressas, cada uma das duas ou mais sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente em uma célula eucariótica. 49. O kit do parágrafo 45, em que o sistema compreende a sequência traer sob o controle de um terceiro elemento regulador. 50. O kit do parágrafo 45, em que a sequência traer exibe pelo menos 50 % de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tract mate quando alinhada otimamente. 51. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR compreende uma ou mais sequências de localização nuclear de resistência suficiente para conduzir a acumulação da referida enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. 52. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR tipo II. 53. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. 54. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR é de códon otimizado para expressão em uma célula eucariótica. 55. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou mais fitas na localização da sequência alvo. 56. O kit do parágrafo 45, em que a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de fita de DNA. 57. O kit do parágrafo 45, em que o primeiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 58. O kit do parágrafo 45, em que o segundo elemento regulador é um promotor de polimerase II. 59. O kit do parágrafo 49, em que o terceiro elemento regulador é um promotor de polimerase III. 60. O kit do parágrafo 45, em que a sequência guia tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. 61. O kit do parágrafo 45, em que menos do que 50 % dos nucleotídeos da sequência guia participam no emparelhamento de bases autocomplementar quando dobrada otimamente. 62. Um sistema de computador para selecionar uma sequência alvo candidata dentro de uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica para direcionamento por um complexo CRISPR, compreendendo o sistema: a. uma unidade de memória configurada para receber e/ou armazenar a referida sequência de ácidos nucleicos; e b. um ou mais processadores sozinhos ou em combinação programados para (i) localizar uma sequência motivo CRISPR dentro da referida sequência de ácidos nucleicos, e (ii) selecionar uma sequência adjacente à referida sequência motivo CRISPR localizada como a sequência alvo candidata à qual o complexo CRISPR se liga. 63. O sistema de computador do parágrafo 62, em que o referido passo de localização compreende identificar uma sequência motivo CRISPR localizada menos do que cerca de 500 nucleotídeos a partir da referida sequência alvo. 64. O sistema de computador do parágrafo 62, em que a referida sequência alvo candidata tem pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. 65. O sistema de computador do parágrafo 62, em que o nucleotídeo na extremidade 3' da sequência alvo candidata está localizado não mais do que cerca de 10 nucleotídeos a montante da sequência motivo CRISPR. 66. O sistema de computador do parágrafo 62, em que a sequência de ácidos nucleicos na célula eucariótica é endógena do genoma eucariótico. 67. O sistema de computador da reivindicação 62, em que a sequência de ácidos nucleicos na célula eucariótica é exógena ao genoma eucariótico. 68. Um meio legível por computador compreendendo códigos que, após execução por um ou mais processadores, implementam um método de selecionar uma sequência alvo candidata dentro de uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica para direcionamento por um complexo CRISPR, compreendendo o referido método: (a) localizar uma sequência motivo CRISPR dentro da referida sequência de ácidos nucleicos, e (b) selecionar uma sequência adjacente à referida sequência motivo CRISPR localizada como a sequência alvo candidata à qual o complexo CRISPR se liga. 69. O meio legível por computador do parágrafo 68, em que a referida localização compreende localizar uma sequência motivo CRISPR que está menos do que cerca de 500 nucleotídeos a partir da referida sequência alvo. 70. O legível por computador do parágrafo 68, em que a referida sequência alvo candidata tem pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. 71. O legível por computador do parágrafo 68, em que o nucleotídeo na extremidade 3' da sequência alvo candidata está localizado não mais do que cerca de 10 nucleotídeos a montante da sequência motivo CRISPR. 72. O legível por computador do parágrafo 68, em que a sequência de ácidos nucleicos na célula eucariótica é endógena o genoma eucariótico. 73. O legível por computador do parágrafo 68, em que a sequência de ácidos nucleicos na célula eucariótica é exógena ao genoma eucariótico. 74. Um método de modificar um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica, compreendendo o método permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando deste modo o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tract mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência traer. 75. O método do parágrafo 74, em que a referida clivagem compreende clivagem de uma ou duas fitas na localização da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. 76. O método do parágrafo 74, em que a referida clivagem resulta em transcrição diminuída de um gene alvo. 77. O método do parágrafo 74, compreendendo adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção, ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. 78. O método do parágrafo 77, em que a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma proteína expressa a partir de um gene compreendendo a sequência alvo. 79. O método do parágrafo 74, compreendendo adicionalmente distribuir um ou mais vetores à referida célula eucariótica, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada à sequência tract mate, e a sequência traer. 80. O método do parágrafo 79, em que os referidos vetores são distribuídos à célula eucariótica em um indivíduo. 81. O método do parágrafo 74, em que a referida modificação tem lugar na referida célula eucariótica em uma cultura de células. 82. O método do parágrafo 74, compreendendo adicionalmente isolar a referida célula eucariótica de um indivíduo antes da referida modificação. 83. O método do parágrafo 82, compreendendo adicionalmente retornar a referida célula eucariótica e/ou as células daí derivadas ao referido indivíduo. 84. Um método de modificar a expressão de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica, compreendendo o método: permitir que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleotídeo tal que a referida ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do referido polinucleotídeo; em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridizada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tract mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência traer. 85. O método do parágrafo 74, compreendendo adicionalmente distribuir um ou mais vetores às referidas células eucarióticas, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada à sequência tract mate, e a sequência traer. 86. Um método de gerar uma célula eucariótica modelo compreendendo um gene de doença mutado, compreendendo o método: a. introduzir um ou mais vetores em uma célula eucariótica, em que o um ou mais vetores conduzem a expressão de uma ou mais de: uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tract mate, e uma sequência traer; e b. permitindo que um complexo CRISPR se ligue a um polinucleotídeo alvo para efetuar clivagem do polinucleotídeo alvo dentro do referido gene de doença, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridizada com a sequência alvo dentro do polinucleotídeo alvo, e (2) a sequência tract mate que é hibridizada com a sequência traer, gerando deste modo uma célula eucariótica modelo compreendendo um gene de doença mutado. 87. O método do parágrafo 86, em que a referida clivagem compreende clivagem de uma ou duas fitas na localização da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. 88. O método do parágrafo 86, em que a referida clivagem resulta em transcrição diminuída de um gene alvo. 89. O método do parágrafo 86, compreendendo adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção, ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. 90. O método do parágrafo 89, em que a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma proteína expressa a partir de um gene compreendendo a sequência alvo. 91. Um método de desenvolver um agente biologicamente ativo que modula um evento de sinalização celular associado a um gene de doença, compreendendo: a. contatar um composto de teste com uma célula modelo de qualquer um dos parágrafos 86-90; e b. detectar uma mudança em uma leitura que é indicativa de uma redução ou um aumento de um evento de sinalização celular associado à referida mutação no referido gene de doença, se desenvolvendo deste modo o referido agente biologicamente ativo que modula o referido evento de sinalização celular associado ao referido gene de doença. 92. Um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma sequência guia a montante de uma sequência tract mate, em que a sequência guia, quando expressa, dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo correspondente presente em uma célula eucariótica. 93. O polinucleotídeo recombinante do parágrafo 89, em que a sequência alvo é uma sequência viral presente em uma célula eucariótica. 94. O polinucleotídeo recombinante do parágrafo 89, em que a sequência alvo é um proto-oncogene ou um oncogene.
[0500] Embora formas de realização preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui será óbvio àqueles peritos na técnica que tais formas de realização são providas somente a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças, e substituições irão agora ocorrer àqueles peritos na técnica sem se afastarem da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às formas de realização da invenção descritas aqui podem ser empregues na prática da invenção. Se pretende que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes estejam abrangidos por elas.
[0501] Referências: 1. Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, M.C., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010) . 2. Bogdanove, A.J. & Voytas, D.F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333, 1843- 1846 (2011). 3. Stoddard, B.L. Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys. 38, 49-95 (2005). 4. Bae, T. & Schneewind, O. Allelic replacement in Staphylococcus aureus with inducible counter-selection. Plasmid 55, 58-63 (2006) . 5. Sung, C.K., Li, H., Claverys, J.P. & Morrison, D.A. An rpsL cassette, janus, for gene replacement through negative selection in Strepcoccus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5190-5196 (2001). 6. Sharan, S.K., Thomason, L.C., Kuznetsov, S.G. & Court, D.L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4, 206-223 (2009). 7. Jinek, M. et al. 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Claims (48)

1. Sistema CRISPR-Cas manipulado para modificar uma célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma proteína Cas9 ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam a proteína Cas9, e (b) um RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o RNA quimérico, em que o RNA quimérico compreende uma sequência guia capaz de hibridizar com uma sequência alvo adjacente a um Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM) no núcleo da célula eucariótica, uma sequência tracr mate capaz de hibridizar com uma sequência tracr, e uma sequência tracr compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento, em que a proteína Cas9 é fundida a pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS), em que o RNA quimérico é capaz de formar um complexo CRISPR com a proteína Cas9 e direcionar a proteína Cas9 para a sequência alvo na célula eucariótica, em que a célula eucariótica é uma célula humana.
2. Sistema CRISPR-Cas manipulado para modificar uma célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma proteína Cas9 ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam a proteína Cas9, e (b) um RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o RNA quimérico, em que o RNA quimérico compreende uma sequência guia capaz de hibridizar com uma sequência alvo adjacente a um Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM) no núcleo da célula eucariótica, uma sequência tracr mate capaz de hibridizar com uma sequência tracr, e uma sequência tracr compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento, em que a proteína Cas9 é fundida a dois ou mais sinais de localização nuclear (NLSs), em que o RNA quimérico é capaz de formar um complexo CRISPR com a proteína Cas9 e direcionar a proteína Cas9 para a sequência alvo na célula eucariótica, em que a célula eucariótica é uma célula humana.
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é fundida a um primeiro NLS no ou próximo ao C-terminal da Cas9 e um segundo NLS no ou próximo ao N-terminal da Cas9.
4. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o NLS é independentemente selecionado do grupo que consiste em PKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, PAAKRVKLD, RQRRNELKRSP, NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV, VSRKRPRP, PPKKARED, POPKKKPL, SALIKKKKKMAP, DRLRR, PKQKKRK, RKLKKKIKKL, REKKKFLKRR, KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK, e RKCLQAGMNLEARKTKK.
5. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência tracr compreende pelo menos 40 nucleotídeos em comprimento.
6. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência tracr compreende pelo menos 50 nucleotídeos em comprimento.
7. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é Cas9 de S. pyogenes, e o PAM compreende NGG; ou em que a Cas9 é Cas9 de S. thermophilus e o PAM compreende NNAGAAW.
8. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação em um domínio catalítico e é uma nickase incapaz de clivar uma fita de DNA.
9. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação correspondente a D10A, H840A, N854A ou N863A de Cas9 de S. pyogenes.
10. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação em dois ou mais domínios catalíticos e substancialmente carece de toda a atividade de clivagem de DNA.
11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende uma mutação correspondente a D10A de Cas9 de S. pyogenes e compreende ainda pelo menos uma mutação correspondente a H840A, N854A ou N863A de Cas9 de S. pyogenes.
12. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é fundida a pelo menos um domínio de proteína heteróloga.
13. Sistema, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o domínio de proteína heteróloga compreende um marcador de epítopo, um domínio repórter ou um domínio de proteína com uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição , atividade do fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histonas, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação de ácido nucleico.
14. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende um ou mais vetores que codificam ou compreendem a proteína Cas9 e o RNA quimérico.
15. Sistema, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 e o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas são codificados ou compreendidos no mesmo vetor.
16. Sistema, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que os vetores são vetores virais.
17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os vetores virais são vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados ou vetores do vírus herpes simplex.
18. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas e a proteína Cas9.
19. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é complexada com o RNA quimérico.
20. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas e um mRNA que codifica a Cas9 que é otimizado por códon para expressão na célula eucariótica.
21. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que (a) e (b) estão compreendidos em um lipossoma, um virossomo, um imunolipossoma, um vírion artificial, um vetor viral ou uma partícula viral para distribuição à célula eucariótica.
22. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma pluralidade de sequências guia visando uma pluralidade de diferentes sequências alvo.
23. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende um polinucleotídeo molde que se sobrepõe a pelo menos 5 nucleotídeos da sequência alvo.
24. Uso do sistema conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio genético em um indivíduo.
25. Sistema CRISPR-Cas manipulado para modificar uma célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma proteína Cas9 ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam a proteína Cas9, e (b) um RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o RNA quimérico, em que o RNA quimérico compreende uma sequência guia capaz de hibridizar com uma sequência alvo adjacente a um Motivo Adjacente do Protoespaçador (PAM) no núcleo da célula eucariótica, uma sequência tracr mate capaz de hibridizar com uma sequência tracr, e uma sequência tracr compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento, em que a proteína Cas9 é fundida a pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS) e pelo menos um domínio de proteína heteróloga, em que o RNA quimérico é capaz de formar um complexo CRISPR com a proteína Cas9 e direcionar a proteína Cas9 para a sequência alvo na célula eucariótica.
26. Sistema CRISPR-Cas manipulado para modificar uma célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma proteína Cas9 ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam a proteína Cas9, e (b) um RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o RNA quimérico, em que o RNA quimérico compreende uma sequência guia capaz de hibridizar com uma sequência alvo adjacente a um Motivo Adjacente do Protoespaçador (PAM) no núcleo da célula eucariótica, uma sequência tracr mate capaz de hibridizar com uma sequência tracr, e uma sequência tracr compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos de comprimento, em que a proteína Cas9 é fundida a dois ou mais sinais de localização nuclear (NLSs) e pelo menos um domínio de proteína heteróloga, em que o RNA quimérico é capaz de formar um complexo CRISPR com a proteína Cas9 e direcionar a proteína Cas9 para a sequência alvo na célula eucariótica.
27. Sistema, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é fundida a um primeiro NLS no ou próximo ao C-terminal da Cas9 e um segundo NLS no ou próximo ao N-terminal da Cas9.
28. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o NLS é independentemente selecionado do grupo que consiste em PKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, PAAKRVKLD, RQRRNELKRSP, NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV, VSRKRPRP, PPKKARED, POPKKKPL, SALIKKKKKMAP, DRLRR, PKQKKRK, RKLKKKIKKL, REKKKFLKRR, KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK, e RKCLQAGMNLEARKTKK.
29. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que a sequência tracr compreende pelo menos 40 nucleotídeos em comprimento.
30. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que a sequência tracr compreende pelo menos 50 nucleotídeos em comprimento.
31. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é Cas9 de S. pyogenes e o PAM compreende NGG; ou em que a Cas9 é Cas9 de S. thermophilus e o PAM compreende NNAGAAW.
32. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação em um domínio catalítico e é uma nickase incapaz de clivar uma fita de DNA.
33. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação correspondente a D10A, H840A, N854A ou N863A de Cas9 de S. pyogenes.
34. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende pelo menos uma mutação em dois ou mais domínios catalíticos e substancialmente carece de toda a atividade de clivagem de DNA.
35. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende uma mutação correspondente a D10A de Cas9 de S. pyogenes e compreende ainda pelo menos uma mutação correspondente a H840A, N854A ou N863A de Cas9 de S. pyogenes.
36. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 35, caracterizado pelo fato de que o domínio de proteína heteróloga compreende um marcador de epítopo, um domínio repórter ou um domínio de proteína com uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de transcrição de repressão, atividade do fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histonas, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação de ácido nucleico.
37. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 36, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende um ou mais vetores que codificam ou compreendem a proteína Cas9 e o RNA quimérico.
38. Sistema, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 e o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas são codificados ou compreendidos no mesmo vetor.
39. Sistema, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que os vetores são vetores virais.
40. Sistema, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que os vetores virais são vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados ou vetores do vírus herpes simplex.
41. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 36, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas e a proteína Cas9.
42. Sistema, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é complexada com o RNA quimérico.
43. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 36, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende o RNA quimérico do sistema CRISPR-Cas e um mRNA codificando a Cas9 que é otimizado por códon para expressão em uma célula eucariótica.
44. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 43, caracterizado pelo fato de que (a) e (b) estão compreendidos em um lipossoma, um virossomo, um imunolipossoma, um vírion artificial, um vetor viral ou uma partícula viral para distribuição à célula eucariótica.
45. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 44, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma pluralidade de sequências guia visando uma pluralidade de diferentes sequências alvo.
46. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 45, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende um polinucleotídeo molde que se sobrepõe a pelo menos 5 nucleotídeos da sequência alvo.
47. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 46, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica é uma célula de mamífero ou uma célula humana.
48. Uso do sistema conforme definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 47 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio genético em um indivíduo.
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