CN114980864A - 用于药物递送的离子液体 - Google Patents

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帕维莫·安格桑提克
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Abstract

本文所述的技术涉及离子液体以及药物递送的方法。

Description

用于药物递送的离子液体
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2019年11月22日提交的美国临时申请No.62/939,088的权益，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并通过引用的方式整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年11月19日，名为002806-096230WOPT_SL.txt，大小为25,930字节。
技术领域
本文所述的技术涉及用于稳定和递送活性化合物的离子液体。
背景技术
可通过在溶剂中递送化合物来改善许多活性化合物(例如药学活性化合物)的吸收。然而，此类方法通常不适合体内使用，因为大多数此类溶剂表现出毒副作用和/或充当递送点的刺激物。这些毒性和刺激作用严重到足以减轻活性化合物吸收或性能的任何增加。
发明内容
如本文所证明的，本发明人已经确定了离子液体的特性，这些特性为某些类型的活性化合物提供了令人惊讶的优异活性化合物吸收动力学。因此，本文描述了与这些具有预料不到的高效力的离子液体(IL)相关的组合物和方法。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含：阴离子以及包含季铵的阳离子，所述阴离子为以下中的至少一种：a)非脂肪酸的羧酸；b)包含不超过4个碳的脂肪链的羧酸；c)芳香族阴离子；和/或d)LogP小于1.0的阴离子。
在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：a)非脂肪酸的羧酸；b)包含不超过4个碳的脂肪链的羧酸；或c)芳香族阴离子。在任何方面的一些实施方式中，所述脂肪酸包含不超过3个碳的脂肪链。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子仅包含一个羧酸基团(例如，R-COOH基团)。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸、异戊酸、氢化肉桂酸、4-苯酚磺酸、苯基磷酸、和联苯-3-羧酸。
在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子的摩尔质量等于或大于胆碱。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵具有NR4 +结构，并且至少一个R基团包含羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵具有NR4 +结构，并且只有一个R基包含羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子为C1、C6或C7。
在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体包含约2:1至约1:1的阳离子与阴离子之比。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体包含约2:1的阳离子与阴离子之比。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的阳离子:阴离子比小于1:1。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体具有其中阳离子过量的阳离子:阴离子比。
在任何方面的一些实施方式中，所述组合物进一步包含与至少一种离子液体组合的至少一种活性化合物。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物包括多肽。在任何方面的一些实施方式中，所述多肽为抗体或抗体试剂。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物的分子量大于450。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物的分子量大于500。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：a)非脂肪酸的羧酸；或b)包含不超过4个碳的脂肪链的羧酸。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物包括核酸。在任何方面的一些实施方式中，所述核酸为抑制性核酸。在任何方面的一些实施方式中，所述核酸为siRNA。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：a)非脂肪酸的羧酸；或b)包含不超过4个碳的脂肪链的羧酸；和/或c)芳香族阴离子。
在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的浓度为至少0.1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的浓度为约10％w/v至约70％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约50％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约40％w/v。
在任何方面的一些实施方式中，所述组合物被配制用于经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物被配制用于经皮给予。在任何方面的一些实施方式中，黏膜为鼻黏膜、口腔黏膜或阴道黏膜。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物以1-40mg/kg的剂量提供。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物进一步包含至少一种非离子表面活性剂。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物以可降解胶囊提供。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物为掺合物。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物以一种或多种纳米颗粒提供。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含含有活性化合物的一种或多种纳米颗粒，所述纳米颗粒在包含离子液体的组合物的溶液或悬浮液中。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了给予至少一种活性化合物的方法，所述方法包括给予本文所述的组合物。在任何方面的一些实施方式中，给予所述组合物一次。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物以多剂量给予。
附图说明
图1A-图1D。图1A描绘了胆碱和乙醇酸的化学结构。通过胆碱碳酸氢盐和乙醇酸的盐复分解来制备CGLY变体(胆碱:乙醇酸摩尔比为2:1、1:1和1:2)。图1B证明了从CGLY变体中分离的抗人TNF-α小鼠IgG1抗体(克隆MAb11)在20％v/v-90％v/v的浓度范围内保留的抗原结合能力。图1C描绘了从CGLY变体中分离的抗人TNF-αIgG的圆二色性光谱。将IgG分散在50％v/v CGLY变体中，并在RT(25℃)下储存1h，然后透析48h。暴露于CGLY溶液后，IgG的β-折叠二级构象得以保留。图1D描绘了从CGLY变体中分离的抗人TNF-αIgG的SDS-PAGE。
图2A-图2B描绘了CGLY变体对于Caco-2细胞活力和IgG转运的体外研究。图2A描绘了CGLY变体处理的caco-2细胞活力。数据表示为平均值±S.E.(n＝6)。图2B描绘了在存在30mM CGLY变体时，跨Caco-2单层的FITC-IgG转运增强。数据表示为平均值±S.E.(n＝5)；(*p<0.05，CGLY2:1处理与CGLY1:1和CGLY1:2相比)。(##p<0.01；所有CGLY处理与无CGLY处理相比)。
图3A-图3D描绘了用CGLY2:1跨Caco-2细胞单层的体外分子转运。在不同浓度CGLY2:1存在时，跨Caco-2单层的FITC-IgG(图3A)和Lucifer yellow(图3B)转运增强。数据表示为平均值±S.E.(n＝5)。图3C描绘了在用不同浓度的CGLY处理后对Caco-2细胞紧密连接完整性的影响。数据表示为平均值±S.E.(n＝5)；(*p<0.05；**p<0.001；所有CGLY2:1处理与无CGLY2:1处理相比)。图3D描绘了在24h孵育后，在存在55mM CGLY2:1以及有或没有转胞吞作用抑制剂的情况下，跨Caco-2单层的FITC-IgG转运。数据表示为平均值±S.E.(n＝5)。
图4A在盐水中含有0％、12.5％和25％以及50％v/v的CGLY2:1的情况下，以作为在10-80 1/s之间剪切速率范围的函数描绘了猪小肠粘液的粘度。将CGLY2:1处理添加到粘液中，然后轻轻摇晃，然后允许在测量前平衡30min。数据表示为平均值(n＝3)。黑色圆圈＝0％v/v，深灰色圆圈＝12.5％v/v，浅灰色圆圈为25％v/v，白色圆圈为50％v/v。图4B描绘了在盐水中含有0％、12.5％和25％以及50％v/v的CGLY2:1的情况下，所示出的在49.87 1/s的剪切速率下的猪粘液的平均粘度值。数据表示为平均值±S.E(n＝3)；(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；CGLY2:1处理与无CGLY处理相比)。
图5A-图5C描绘了在空肠内注射具有CGLY2:1的FITC-IgG(图5B)、盐水(图5C)以及不含FITC-IgG的盐水(图5A)之后，肠绒毛的荧光显微图像。荧光显微成像一式三份进行，并示出了代表性图像。比例尺代表200μm。图5A描绘了CGLY2:1的口服剂量毒性测试。提供了口服灌胃CGLY2:1(50％v/v)或盐水15天，剂量为1250mg/kg，n＝2。通过体重监测器、血液化学、GI道和主要器官的H&E染色来评估结果。图5D描绘了来自图5A-图5C的绒毛上每单位面积的FITC-IgG的荧光量化。数据表示为平均值±S.E.(n＝10)。图5E描绘了在空肠内注射处于CGLY2:1或盐水中的IgG后，通过ELISA量化的体内血浆抗人TNF-αIgG浓度。
图6A-图6C描绘了CGLY2:1的体内毒性研究。大鼠每天口服给予一次CGLY2:1或盐水，连续7天。图6A描述了研究期间从第0天到第7天的大鼠体重日志。数据表示为平均值±S.E.(n＝6)。图6B描绘了在第7天处死大鼠并加工GI道切片，用苏木精和伊红(H&E)进行组织学染色的结果。比例尺代表100μm。图6C描绘了大鼠的综合代谢组(n＝6)。第7天进行的血液检查未显示两组之间的显著变化，表明给予CGLY后肝合肾功能正常。所有棒和标记代表平均值±S.E.
图7描绘了药物递送的图表。
图8描绘了在指定的IL中通过ELISA测量的功能抗体稳定性。作为一般趋势，小的阴离子比大的阴离子更能与抗体相容。
图9描绘了在指定的IL中通过尺寸排阻色谱法测量的功能抗体稳定性。使用的抗体为抗人TNFα(小鼠)(克隆MAb11)，透析2天。
图10描绘了在指定的IL中，通过圆二色性测量的功能抗体稳定性。使用的抗体为抗人TNFα(小鼠)(克隆MAb11)，透析2天。
图11描绘了在指定组合物中，空肠内给予后血清中抗体浓度的图表。剂量为200μg/kg，n＝3。
图12描绘了体内mAb局部递送的实验设计。
图13描绘了体内mAb局部递送的结果。
图14描述了CGLY2:1与其它抗体的相容性的测试。
图15和图16描绘了图5A的毒性试验中主要器官(图15)和GI道(图16)的H&E染色。大鼠每天口服给予一次CGLY2:1或盐水，连续7天。在第7天，处死大鼠，对包括心脏、肝、脾、肺和肾在内的主要器官进行加工，用H&E进行组织学染色。未观察到CGLY2:1和盐水对照组之间的差异。比例尺代表100μm。
图17描绘了针对siRNA递送性能测试的IL的结构。
图18描绘了覆盖有一层Caco-2细胞并与分散在各种浓度的CGLY2:1中的FITC-IgG一起孵育5h的transwell膜的代表性共焦显微图像。图像以40×放大倍率拍摄。图像显示了DAPI标记的细胞核、FITC-IgG以及DAPI染色和FITC-IgG的重叠。比例尺代表50μm。
图19A-图19E描述了筛选基于胆碱的生物活性IL-RNA复合体用于增强表皮积聚。(图19A)在与IL(50％v/v)孵育30分钟并透析72小时后，siRNA在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的CD光谱。(图19B)IL孵育后siRNA的代表性天然凝胶图像。bp为碱基对。(图19C)在以1:1的比例混合的IL组合(CAGE+CAPA)存在下并孵育24小时后，在不同皮肤层(a)角质层(SC)、(b)表皮和(c)真皮中siRNA(红色)的代表性共焦图像。从左到右：合并的、Cy5、微分干涉对比(DIC)。比例尺，50μm。(图19D和图19E)在浓度为50％(v/v)的个体IL(图19D)以及50％(v/v)的IL组合存在下，进入不同皮肤层的Cy5标记的siRNA的转运，由胶带剥离法确定(图19E)(n＝3)。对于图19D-图19E，数据为平均值±SEM，并通过正态性检验确定为非参数检验，并通过Kruskal-Wallis检验进行统计。*P<0.05。
图20A-图20F描绘了鉴别IL-siRNA相互作用程度以增强溶剂化和稳定性的MD模拟。(图20A和图20B)在500ns的周期性边界条件下CAGE和siRNA(图20A)以及在
Figure BDA0003759457540000061
的siRNA(图20B)内发现的CAGE组件的模拟晶胞快照。(图20C和图20D)在相似条件下，优化的IL组合(CAGE和CAPA，1:1)和siRNA(图20C)以及
Figure BDA0003759457540000062
siRNA(图20D)内发现的IL种类的模拟晶胞快照。(图20E和图20F)关于CAPA和IL组合(CAGE和CAPA)，与CAGE(对照)对比，在500ns的过程中获得的回转半径(RGYR)(图20E)和均方根偏差(RMSD)(图20F)。
图21A-图21E描绘了建立IL组合的增强的脂质双层相互作用和易位机制的3个MD模拟。(图21A)具有胆碱、香叶酸和苯丙酸的聚集体的脂质双层模拟，用圆圈突出显示。(图21B)从描述离子物质与磷脂头部和尾部的封闭相互作用的圆圈的离子物质的放大视图。该聚集体包含有助于与脂质膜相互作用的所有三种离子物质。(图21C)在脂质双层平面中垂直于膜的代表性快照视图。(图21D和图21E)与CAGE(对照)相比，在CAPA和IL组合(CAGE和CAPA)存在下的模拟过程中脂质膜的平均厚度(图21D)和每个脂质的平均面积(图21E)。对于图21D-图21E，所有数据均为平均值±SEM，通过正态性检验确定为非参数的，并通过Kruskal-Wallis检验进行统计。****P<0.0001。
图22A-图22E证明了IL-siRNA在局部给予后抑制GAPDH表达，而在小鼠中没有毒性。(图22A)局部应用时间表的示意图。(图22B)局部应用IL-siRNA后5天，皮肤组织的代表性组织学(苏木精和伊红(H&E))图像。比例尺，100μm；放大倍数，×10。(图22C)有和无IL时，小鼠皮肤组织中Cy5-siRNA的表皮积累的共焦图像。比例尺，50μm。(图22D)通过qPCR测量GAPDH mRNA表达。β-肌动蛋白mRNA表达用于归一化。数据为平均值±SEM，通过正态性检验确定为非参数的，并通过Kruskal-Wallis检验进行统计。*P<0.05、***P<0.001和****P<0.0001。(图22E)使用GAPDH酶联免疫吸附测定法确定皮肤样品中的GAPDH水平。数据为平均值±SEM，通过单因素ANOVA与Tukey HSD事后检验进行统计。****P<0.0001(对照，n＝5；裸siRNA，n＝5；IL-siCon，n＝4；IL-siRNA，n＝8)。
图23A-图23J证明了局部IL-siRNA对NFKBIZ的局部抑制阻遏了咪喹莫特诱导的银屑病样皮肤炎症以及其它关键银屑病相关基因。(图23A)疾病诱导以及IL-siRNA局部给予的应用时间表的示意图。(图23B)用IL-NFKBIZ siRNA局部处理诱导银屑病的小鼠，并与未处理组和应用IL的组进行比较。(图23C)来自经过和未经处理的小鼠的诱导银屑病的皮肤切片的H&E染色。比例尺，50μm；放大倍数，×10。(图23D)通过IHC分析来自小鼠的皮肤切片的角质形成细胞增殖(增殖标志物，Ki67)。比例尺，100μm。(图23E和图23F)通过每天使用人PASI评分系统以0(无变化)到4(非常明显的变化)的等级进行盲评分而获得的红斑和鳞屑评分。(图23G)与未处理(对照)和IL-siCon处理组相比，用IL-NFKBIZ siRNA处理后各种银屑病相关基因的表达水平的热图。(图23H-图23J)通过qPCR测量mRNA表达水平，β-肌动蛋白mRNA表达分别用于NFKBIZ、TNF-α和IL-17A的归一化。数据为平均值±SEM，通过单因素ANOVA与Tukey HSD事后检验进行统计。*P<0.05、**P<0.01和****P<0.0001(对照，n＝4；IL，n＝4；IL-siCon，n＝4；IL-siRNA，n＝8)。
图24A-图24E描绘了用于改进的生物相容性以及与RNA的相互作用的内部基于胆碱的IL文库的设计和合成。(图24A)基于胆碱的IL文库构成合成的各种阴离子，用CAGE作为参比IL。(图24B)在IL合成中采用的盐复分解的一般合成方案。(图24C)用于递送siRNA的优化IL组合(CAGE+CAPA)的合成方案。(图24D)在RT下保持粘性的合成的IL的1H-NMR光谱，(a)CAGE、(b)CAVA、(c)CAPA和(d)CADA。(图24E)用ImageJ软件测量IL孵育后siRNA条带的相对密度。
图25A-图25D证明了在IL存在下，Cy5标记的siRNA的表皮积累得到改善。(图25A)用于离体猪皮肤渗透研究的Franz扩散池(FDC)装置的示意图。(图25B)对照、裸siRNA以及CAGE存在时的siRNA的代表性共焦图像。(图25C)在新合成的基于胆碱的IL和以1:1的比例的组合存在的情况下，在猪皮肤24h孵育后，Cy5-siRNA的表皮积累。从左到右：合并的、Cy5、微分干涉对比(DIC)。比例尺，50μm。(图25D)Cy5标记的siRNA向不同皮肤层的转运，通过胶带剥离法测定(n＝3)。数据为平均值±SEM，通过正态性检验确定为非参数，并通过Kruskal-Wallis检验进行统计。
图26A-图26B描绘了IL种类迁移率在IL-脂质双层相互作用和渗透中的主要贡献。(图26A)存在IL组合时的脂质双层模拟(以圆圈突出显示)。(图26B)使用python库MDAnalysis进行的IL组合CAGE+CAPA模拟中个体离子种类的轨迹。
图27A-图27D描绘了在局部应用时没有毒性和刺激性的高度生物相容性的IL培养。(图27A)用IL-GAPDH siRNA局部处理健康小鼠的应用部位，并与水和IL-siCon组进行比较。(图27B)来自用IL-siCon连续4天局部处理的健康小鼠的皮肤切片的H&E染色。比例尺，100μm，放大倍数，10×。(图27C)通过用增殖标志物Ki67染色来分析来自健康小鼠的皮肤切片的过度增殖。比例尺，100μm。由于未观察到增殖区域，因此未进行IHC的定量分析。(图27D)通过qPCR测量TNF-αmRNA表达，β-肌动蛋白mRNA表达用于归一化。数据为平均值±SEM，通过单因素ANOVA与Tukey HSD事后检验进行统计。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。(对照，n＝5；裸siRNA，n＝5；IL-siCon，n＝4；IL-siRNA，n＝8)。
图28A-图28D描绘了咪喹莫特诱导的银屑病小鼠中IL-siCon效果的表征。(图28A)用IL-siCon局部处理牛皮癣诱导的小鼠，连续4天。(图28B)来自用IL-siCon局部处理的咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的皮肤切片的H&E染色。比例尺，50μm，放大倍数，10×。(图28C)通过用增殖标志物Ki67染色来分析来自银屑病小鼠的皮肤切片的过度增殖。比例尺，100μm。(图28D)表皮厚度；用ImageJ软件根据10-15个随机部位测量结果计算的表皮厚度平均值。数据为平均值±SEM，通过单因素ANOVA与Tukey HSD事后检验进行统计。*P<0.05，****P<0.0001。
图29A-图29C描绘了IL-NFKBIZ siRNA在在小鼠的咪喹莫特诱导的银屑病样皮肤炎症中的作用。在5天的诱导/应用期间，分析咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的累积评分(图29A)、体重(图29B)和皮肤厚度(图29C)，其通过双皮褶厚度(DSFT)进行监测。数据为平均值±SEM。(对照，n＝4；IL，n＝4；IL-siRNA，n＝8)。
图30A-图30J描绘了沉默NFKBIZ对银屑病相关基因产物的下游影响。通过qPCR测量mRNA表达，并且β-肌动蛋白mRNA表达用于如下的归一化：细胞因子IL-17C、IL-19、IL-22、IL-23A、IL-36A、IL-36G(图30A-图30F)；趋化因子CCL20(图30G)；S100蛋白，S100A9(图30H)；抗微生物蛋白、脂质运载蛋白-2、LCN2和β-防御素-2、DEFB4(图30J)。数据为平均值±SEM，通过单因素ANOVA与Tukey HSD事后检验进行统计。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。(对照，n＝4；IL，n＝4；IL-siCon，n＝4；IL-siRNA，n＝8)。
具体实施方式
本文提供的数据表明，离子液体(IL)的阴离子对特定活性剂是否将被跨生物屏障(例如，上皮层，如真皮)转运发挥主要影响。具有低疏水性和/或芳香族基团的阴离子为抗体和siRNA货物分子提供了相比先前描述的IL(如CAGE(胆碱和香叶酸))中的阴离子而言改善的药物递送特性。在选择与阴离子配对的阳离子时，主要关注的是阳离子不与所述阴离子缔合得过于紧密-紧密缔合导致所述阴离子保留在生物屏障的初始侧。
因此，在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述例子液体包含1)阴离子和2)包含季铵的阳离子，所述阴离子为以下中的至少一种：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不超过4个碳的脂肪链的羧酸；
c)芳香族阴离子；和/或
d)LogP小于1.0的阴离子。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含1)阴离子，所述阴离子为本文所述的羧酸；以及2)包含季铵的阳离子。
如本文所用，术语“离子液体(IL)”是指在室温下呈液态的有机盐或有机盐的混合物。此类溶剂已被证明在各种领域(包括在工业加工、催化、制药和电化学)中有用。所述离子液体含有至少一种阴离子和至少一种阳离子组分。所述离子液体可包含额外的氢键供体(即可提供-OH或-NH基团的任何分子)，实例包括但不限于醇类、脂肪酸类和胺类。至少一种阴离子和至少一种阳离子组分可以任何摩尔比存在。示例性摩尔比(阳离子:阴离子)包括但不限于1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、2:3、3:2，以及这些比例之间的范围。对于离子液体的进一步讨论，参见例如Hough等，“The third evolution of ionic liquids:activepharmaceutical ingredients”，New Journal of Chemistry，31：1429(2007)；以及Xu等，“Ionic Liquids:Ion Mobilities,Glass Temperatures,and Fragilities”，Journal ofPhysical Chemistry B，107(25)：6170-6178(2003)；通过引用的方式将其各自以其整体并入本文。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体或溶剂在低于100℃以液体存在。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体或溶剂在室温以液体存在。
如本文所证明的，具有低疏水性、相对短的碳链和/或芳香族基团的阴离子为大的多肽(例如抗体)或核酸货物分子提供了改善的药物递送特性。在一些实施方式中，改善的药物递送特性包括货物分子的变性或降解减少。在一些实施方式中，改善的药物递送特性包括穿过生物屏障的能力的提高(例如渗透性提高)。在任何方面的一些实施方式中，具有低疏水性和/或相对短的碳链的阴离子为大的多肽(例如抗体)货物分子提供了改善的药物递送特性。在任何方面的一些实施方式中，具有芳香族基团和/或相对短的碳链的阴离子为核酸货物分子提供了改善的药物递送特性。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子为疏水性的。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子包括羧酸。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子包括非脂肪酸的羧酸。
所述羧酸为具有式I结构的化合物，其中，R可为任何基团。
Figure BDA0003759457540000111
通常，所述阴离子为R-X-，其中，X为CO2 -、SO3 -、OSO3 2-或OPO3 2-；R为任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C2-C10烯基或任选取代的C2-C10炔基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在一些实施方式中，R为任选取代的直链或支链C1-C9烷基。例如，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4、5或6个取代基取代的C1-C9烷基：C1-C3烷基、羟基(OH)、卤素、氧代(＝O)、羧基(CO2)、氰基(CN)和芳基。在一些实施方式中，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4或5个取代基取代的C1-C6烷基：C1-C3烷基、羟基、羧基和苯基。优选地，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4或5个取代基取代的C1-C5烷基：甲基、乙基、羟基、羧基和苯基。R的示例性烷基包括但不限于甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧丙基、2,3-二羧甲基-2-羟丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基和壬基。
在一些实施方式中，R为任选取代的直链或支链C2-C8烯基。例如，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4、5或6个取代基取代的C2-C9烯基：C1-C3烷基、羟基、卤素、氧代、羧基、氰基和芳基。在一些实施方式中，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4、或5个取代基取代的C2-C6烯基：C1-C3烷基、羟基、羧基和苯基。优选地，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4或5个取代基取代的C1-C5烯基：甲基、乙基、羟基、羧基和苯基。R的示例性烯基包括但不限于乙烯基、2-羧乙烯基、1-甲基丙烯基和2-甲基丙烯基。
在一些实施方式中，R为任选取代的芳基或杂芳基。例如，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4、5或6个取代基取代的芳基或杂芳基：C1-C3烷基、羟基、卤素、氧代、羧基、氰基和芳基。在一些实施方式中，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2、3、4或5个取代基取代的芳基：C1-C3烷基、羟基、羧基和苯基。优选地，R为任选地被独立地选自于由如下所组成的组中的1、2或3个取代基取代的苯基：甲基、乙基、羟基、羧基和苯基。R的示例性芳基包括但不限于苯基、2-羟苯基、3-羟苯基、4-羟苯基、二羟苯基、三羟苯基、3,4,5-三羟苯基和1,1-联苯-4-基。
在一些实施方式中，X为CO2 -，并且R为甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯基乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧丙基、2,3-二羧甲基-2-羟丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基、壬基、乙烯基、2-羧乙烯基、1-甲基丙烯基、2-甲基丙烯基、3,4,5-三羟苯基或1,1-联苯-4-基。在一些其它实施方式中，X为OSO3 -，并且R为甲基、羧甲基、羟甲基、乙基、1-羟乙基、2-苯基乙基、丙基、丙-2-基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、3-羧丙基、2,3-二羧甲基-2-羟丙基、丁基、戊基、1,2,3,4,5-五羟基戊基、己基、2-乙基己基、壬基、乙烯基、2-羧乙烯基、1-甲基丙烯基、2-甲基丙烯基、3,4,5-三羟苯基、或1,1-联苯-4-基。在又一些其它实施方式中，X为OPO3 2-或SO3 -，并且R为2-羟苯基、3-羟苯基或4-羟苯基。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意指具有指定的碳原子数(即，C1-C10表示1至10个碳)的直的(即未分支)或分支的碳链(或碳)或其组合，其可为完全饱和的、单或多不饱和的，并且可包括单价、二价和多价自由基。烷基为未环化的链。饱和烃基的实例包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体的基团。“烯基”为具有一个或多个双键的不饱和烷基。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、以及高同系物和异构体。
除非另有说明，术语“芳基”意指多不饱和的、芳香族的、烃取代基，可为单环、或稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的多个环(优选1-3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中所述稠环的至少一个是芳环。术语“杂芳基”是指包含至少一个杂原子(例如N、O或S)的芳基基团(或环)，其中，氮和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多个环，其中稠环中的至少一个为杂芳环)。5,6-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为5元，另一个环为6元，并且其中至少一个环为杂芳环。同样地，6,6-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为6元，另一个环为6元，并且其中至少一个环为杂芳环。同时，6,5-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为6元，另一个环为5元，并且其中至少一个环为杂芳环。可通过碳或杂原子将杂芳基基团连接到分子的剩余部分。示例性芳基和杂芳基包括但不限于苯基、4-硝基苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、4-联苯基、吡咯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、吡唑、3-吡唑基、咪唑、咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、苯并咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、噻唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、吡啶、2-吡啶基、萘啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、二苯甲酮吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、吲哚基、5-吲哚基、喹啉、喹啉基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基、呋喃、呋喃基(furyl)或呋喃基(furanyl)、噻吩、噻吩基(thiophenyl)或噻吩基(thienyl)、二苯醚、二苯胺等。
术语“任选取代的”意味着指定的基团或部分未被取代、或被独立地选自于下面的“取代基”定义中所列的取代基的组或其它方式指定的取代基的组中的一个或多个(通常1、2、3、4、5或6个取代基)取代。术语“取代基”是指在被取代基团的任何原子处在被取代基团上进行“取代”的基团。合适的取代基不受限地包括卤素、羟基、羧基(caboxy)、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳基、杂芳基、环基、杂环基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烷基羰基(carbanoyl)、芳基羰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟烷基、烷磺酰基、芳基磺酰基、烷磺酰胺基、芳基磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基或脲基。在一些情况下，两个取代基连同它们所连接的碳可形成环。
如本文所用，“脂肪酸”是指其中R包含饱和或不饱和脂肪链的羧酸，例如，R具有式CnH2n+1。在任何方面的一些实施方式中，所述脂肪酸为一元羧酸。所述脂肪酸可为天然的或合成的。所述脂肪酸的脂肪链可为饱和的、不饱和的、支链的、直链的和/或环状的。在任何方面的一些实施方式中，所述脂肪链不包含芳香族基团。在任何方面的一些实施方式中，所述脂肪链包含烷基链或烯烃链，由烷基链或烯烃链组成或基本上由烷基链或烯烃链组成。
非脂肪酸的示例性羧酸可包括但不限于乳酸、乙醇酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、葡萄糖酸、和己二酸。
Figure BDA0003759457540000141
Figure BDA0003759457540000151
在一些实施方式中，非脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳，无论是直链构型还是支链构型。在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含羟基基团。在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含一种或多种羧酸。
在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳(无论是直链构型还是支链构型)，并且在R基团中包含羟基基团。在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳(无论是直链构型还是支链构型)，并且在R基团中包含羟基基团。
在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含不超过5个碳(无论是直链构型还是支链构型)，并且在R基团中包含一个或多个羧酸基团。在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳(无论是直链构型还是支链构型)，并且在R基团中包含一个或多个羧酸基团。
在一些实施方式中，所述非脂肪酸的羧酸在R基团中包含1-5个碳(无论是直链构型还是支链构型)，并且在R基团中包含一个羧酸基团。
当在本文中提及链中的碳数时，预期提及的是链(包括支链)中的全部碳数。在直链的情况下，这与碳链长度相同。在支链的情况下，“链长度”是指支链中最长的碳链支链。
在一些实施方式中，所述阴离子包含一个羧酸基团。
包含不多于4个碳的脂肪链的示例性羧酸可包括丙酸(脂肪酸)、异丁酸(脂肪酸)、丁酸(脂肪酸)、3,3-二甲基丙烯酸(脂肪酸)、二甲基丙烯酸(脂肪酸)、以及异戊酸(脂肪酸)。
Figure BDA0003759457540000161
Figure BDA0003759457540000171
本文考虑的示例性的替代阴离子包括癸酸和乙基己基硫酸盐。
Figure BDA0003759457540000172
示例性芳香族阴离子包括但不限于没食子酸、氢化肉桂酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、联苯-3-羧酸和苯基磷酸。
Figure BDA0003759457540000173
Figure BDA0003759457540000181
可通过logP的分析来评估疏水性。“LogP”是指P的对数(分配系数)。P为衡量物质在脂质(油)和水之间的分配程度的量度。P本身为一个常数。作为中性分子，其被定义为化合物在水相中的浓度与化合物在不互溶溶剂中的浓度之比。
分配系数，P＝[有机]/[水性]，其中[]＝浓度
Log P＝log10(分区系数)＝log10 P
在实践中，LogP值将根据进行测量的条件和分配溶剂的选择而变化。LogP值为1意味着该化合物在有机相中的浓度是水相中的十倍。logP值增加1表明与水相相比，有机相中的化合物浓度增加了十倍。
在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于1.0的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.80的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.75的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.50的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0.25的LogP。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子具有小于0的LogP。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含1)具有小于1.0的LogP并且为非脂肪酸的羧酸的阴离子，以及2)包含季铵的阳离子。在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含1)具有小于1.0的LogP并且为包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸的阴离子，以及2)包含季铵的阳离子。在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含1)具有小于1.0的LogP并且为芳香族的阴离子，以及2)包含季铵的阳离子。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子具有小于4.0的pKa。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的IL的阴离子具有小于4.0的pKa和小于1.0的LogP。
阴离子的pKa和LogP值为本领域已知的和/或可由本领域技术人员计算。例如，PubChem和SpiderChem提供关于各种阴离子的这些值，化学品制造商通常将它们作为其产品目录列表的一部分提供。示例性阴离子的pKa和LogP值在本文的表1中提供。
示例性的非限制性阴离子在下表1中提供。
表1
LogP pKa
乙醇酸 -1.11 3.8
丙酸 0.33 4.88
异丁酸 0.94 4.84
丁酸 0.79 4.82
没食子酸 0.70 4.40
乳酸 -0.72 3.86
丙二酸 -0.81 2.8
癸酸 4.09 4.9
马来酸 -0.48 1.83
戊二酸 -0.29 4.34
柠檬酸 -1.64 2.79
3,3-二甲基丙烯酸 1.2 5.02
葡萄糖酸 -3.4 3.39
己二酸 0.08 4.4
2-乙基己基硫酸盐 3.10
4-羟基苯磺酸 0.2 9.11
异戊酸 1.16 4.77
氢化肉桂酸 1.84 4.66
苯基磷酸 1.05 9.99
联苯-3-羧酸 3.5 4.14
在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子为烷烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子为烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子包含单个羧基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链包含一个或多个取代基。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团，其中，每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团，其中，所述至少一个取代基基团包含甲基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中，每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中，一个取代基基团包含甲基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含两个取代基基团，其中，每个取代基基团包含甲基基团。
在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子为未取代的烷烃。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子为未取代的烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链骨架包含一个或多个取代基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中，每个取代基基团包含至少一个碳原子。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中，每个取代基基团为烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述羧酸的碳链包含一个或多个取代基基团，其中，每个取代基基团为未取代的烷基、未取代的芳基、未取代的杂烷基、未取代的杂芳基、未取代的烷烃或未取代的烯烃。
如本文所述，在选择与所述阴离子配对的阳离子时，主要关注的是阳离子不与所述阴离子太紧密地缔合-紧密缔合导致所述阴离子保留在生物屏障的初始侧。显示胆碱及其衍生物特别适合作为本文所述阴离子类型的IL阳离子。因此，本文所述的IL的阳离子可为包含季铵的阳离子。季铵是结构为NR4 +的带正电的多原子离子，每个R独立地为烷基基团或芳基基团。
通用术语“季铵”涉及通过使NH4 +离子的所有四个氢原子被有机基团取代而可被视为衍生自氢氧化铵或铵盐的任何化合物。例如，季铵具有NR4 +结构，其中每个R独立地选自羟基、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C2-C10烯基、任选取代的C2-C10炔基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子的摩尔质量等于或大于胆碱，例如摩尔质量等于或大于104.1708g/mol。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子的摩尔质量大于胆碱，例如，摩尔质量大于104.1708g/mol。
在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含烷基、烷烃、烯烃或芳基。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含烷基、烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含烷烃或烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含长度不多于10个碳原子(例如长度不多于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含长度不多于12个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含长度不多于15个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含长度不多于20个碳原子的碳链。
在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于10个碳原子(例如不多于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于12个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于15个碳原子的碳链。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于20个碳原子的碳链。
在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于10个碳原子(例如不多于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个碳原子)的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于12个碳原子的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于15个碳原子的烷基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含不多于20个碳原子的烷基基团。
在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含烷烃、烯烃、芳基、杂芳基、烷基或杂烷基。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含未取代的烷烃、未取代的烯烃、未取代的芳基、未取代的杂芳基、未取代的烷基或未取代的杂烷基。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含未取代的烷烃。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含未取代的烯烃。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的每个R基团独立地包含一个或多个取代基基团。
在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的至少一个R基团包含羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的一个R基团包含羟基基团。在任何方面的一些实施方式中，所述季铵的仅一个R基团包含羟基基团。
示例性的非限制性阳离子可包括胆碱以及由以下结构定义的指定为C1-C7的阳离子中的任一个。
Figure BDA0003759457540000231
所述阳离子的其它非限制性实例包括以下：
1-(羟甲基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓
1-(2-羟乙基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓
1-乙基-1-(3-羟丙基)吡咯烷-1-鎓
1-(3-羟丙基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓
1-(4-羟丁基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓
1-乙基-1-(4-羟丁基)吡咯烷-1-鎓
1-(4-羟丁基)-1-丙基吡咯烷-1-鎓
1-(5-羟戊基)-1-丙基吡咯烷-1-鎓
1-乙基-1-(5-羟戊基)吡咯烷-1-鎓
1-(5-羟戊基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓
1-(羟甲基)-1-甲基哌啶-1-鎓
1-(2-羟乙基)-1-甲基哌啶-1-鎓
1-乙基-1-(2-羟乙基)哌啶-1-鎓
1-乙基-1-(3-羟丙基)哌啶-1-鎓
1-(3-羟丙基)-1-丙基哌啶-1-鎓
1-(3-羟丙基)-1-甲基哌啶-1-鎓
1-(4-羟丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓
1-乙基-1-(4-羟丁基)哌啶-1-鎓
1-(4-羟丁基)-1-丙基哌啶-1-鎓
1-丁基-1-(5-羟戊基)哌啶-1-鎓
1-(5-羟戊基)-1-丙基哌啶-1-鎓
1-乙基-1-(5-羟戊基)哌啶-1-鎓
1-(5-羟戊基)-1-甲基哌啶-1-鎓
3-乙基-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
1-甲基-3-丙基-1H-咪唑-3-鎓
3-丁基-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
1-甲基-3-戊基-1H-咪唑-3-鎓
1,2-二甲基-3-戊基-1H-咪唑-3-鎓
3-丁基-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
1,2-二甲基-3-丙基-1H-咪唑-3-鎓
3-(羟甲基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(2-羟乙基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(3-羟丙基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(4-羟丁基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(5-羟戊基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(5-羟戊基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(4-羟丁基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(3-羟丙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(2-羟乙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(羟甲基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(2-羟乙基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(3-羟丙基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(4-羟丁基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓
3-(5-羟戊基)-1,2,4,5-四甲基-1H-咪唑-3-鎓
1-(5-羟戊基)吡啶-1-鎓
1-(4-羟丁基)吡啶-1-鎓
1-(3-羟丙基)吡啶-1-鎓
1-(2-羟乙基)吡啶-1-鎓
1-(羟甲基)吡啶-1-鎓
1-羟基吡啶-1-鎓
(羟甲基)三甲基鏻
三乙基(羟甲基)鏻
三乙基(2-羟乙基)鏻
(2-羟乙基)三丙基鏻
(3-羟丙基)三丙基鏻
三丁基(3-羟丙基)鏻
(3-羟丙基)三戊基鏻
(4-羟丁基)三戊基鏻
(5-羟戊基)三戊基鏻
在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子为胆碱、C1、C6和/或C7。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子为C1、C6和/或C7。
在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子为胆碱、C1、C6和/或C7，并且所述阴离子为选自表1的阴离子。在任何方面的一些实施方式中，所述阳离子为胆碱，并且所述阴离子为选自表1的阴离子。
阳离子和阴离子的非限制性示例性组合在下表2中提供。
表2
Figure BDA0003759457540000251
Figure BDA0003759457540000261
在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体不为CAGE(胆碱和GErate，CholineAnd GEranate)。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的阳离子不为胆碱。在任何方面的一些实施方式中，所述离子液体的阴离子不为geranate酸或香叶酸。在包含两种或多种离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体不为CAGE(胆碱和GEranate)。在包含两种或多种离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体的阳离子不为胆碱。在包含两种或多种离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体的阴离子不为geranate酸或香叶酸。
在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸，以及联苯-3-羧酸。在任何方面的一些实施方式中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸，以及联苯-3-羧酸。
在任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含第一离子液体和至少第二离子液体。设想了两种、三种、四种、五种或多种本文所述的任何离子液体的组合。作为非限制性实例，下表包含本文所设想的离子液体的示例性成对组合。
Figure BDA0003759457540000271
在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体和第二离子液体具有相同的阳离子，例如胆碱。在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体和第二离子液体具有不同的阴离子。例如，第一离子液体和第二离子液体可各自包含选自以下的不同阴离子：香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸、以及联苯-3-羧酸。在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体具有香叶酸阴离子，第二离子液体具有苯丙酸阴离子。
在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)。在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第二离子液体为胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体和第二离子液体为选自于由如下所组成的组中的不同离子液体：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、以及胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)；并且第二离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和异戊酸(CAVA)、以及胆碱和苯丙酸(CAPA)。在其中所述组合物包含两种以上离子液体的任何方面的一些实施方式中，第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)，第二离子液体为胆碱和苯丙酸(CAPA)。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少0.01％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少0.05％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少0.1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少0.2％w/v、至少0.3％w/v、至少0.4％w/v、至少0.5％w/v、至少1％w/v或更高。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约0.01％w/v至约1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为0.01％w/v至1％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约0.05％w/v至约0.5％w/v。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为0.05％w/v至0.5％w/v。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少25％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在水中的浓度为至少25％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在盐水或生理学上相容缓冲液中的浓度为至少25％w/w。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约5％w/w至约75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为5％w/w至75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在水、盐水或生理上兼容的缓冲液中的浓度为约5％w/w至约75％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在水、盐水或生理上兼容的缓冲液中的浓度为5％w/w至75％w/w。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少约0.1％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少0.1％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约10％w/w至约70％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为10％w/w至70％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约30％w/w至约50％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为30％w/w至40％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约30％w/w至约50％w/w。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为30％w/w至40％w/w。
在任何方面的一些实施方式中，IL的％w/w浓度是在水、盐水或生理上兼容的缓冲液中的％w/w浓度。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL为100％w/w或w/v。
在一些实施方式中，所述IL为无水盐，例如，不稀释或未溶于水的离子液体。在一些实施方式中，所述IL作为水性溶液提供。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少25％w/w，并且具有至少1:3的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在水中的浓度为至少25％w/w，并且具有至少1:3的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少25％w/w，并且具有1:3或1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL在水中的浓度为至少25％w/w，并且具有1:3或1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL为凝胶或剪切稀化牛顿凝胶。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约10:1至约1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有10:1至1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约5:1至约1:5的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有5:1至1:5的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约2:1至约1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有2:1至1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约2:1至约1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约2:1至约1:1的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有2:1至1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有2:1至1:1的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有使得存在更大量的阴离子的阳离子:阴离子比，例如小于1:1的比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有使得存在过量的阴离子的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约1:1至约1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有1:1至1:10的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约1:1至约1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有1:1至1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约1:1至约1:3的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有1:1至1:3的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约1:1至约1:2的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有1:1至1:2的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有约1:1、1:2、1:3或1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有1:1、1:2、1:3或1:4的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有小于约1:1的阳离子:阴离子比。在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有小于1:1的阳离子:阴离子比。不希望受限于理论，相对于阳离子具有更高量的阴离子的组合物显示出更大的疏水性。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL具有阳离子过量的阳离子:阴离子比。
在任何方面的一些实施方式中，例如，当提供一种或多种核酸分子与IL组合时，阳离子:阴离子比大于1:1，例如大于1:2，从约1:2至约1:4，或从1:2至1:4。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少20mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少约20mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少25mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少约25mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少50mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少约50mM。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少100mM、500mM、1M、2M、3M或更高。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为至少约100mM、500mM、1M、2M、3M或更高。
在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约50mM至约4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为50mM至4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约500mM至约4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为500mM至4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约1M至约4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为1M至4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为约2M至约4M。在任何方面的一些实施方式中，所述IL的浓度为2M至4M。
在任何方面的一些实施方式中，所述组合物或制剂中的IL浓度为约0.1mM至20mM。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物或制剂中的IL浓度为约0.5mM至20mM、0.5mM至18mM、0.5mM至16mM、0.5mM至14mM、0.5mM至12mM、0.5mM至10mM、0.5mM至8mM、1mM至20mM、1mM至18mM、1mM至16mM、1mM至14mM、1mM至12mM、1mM至10mM、1mM至8mM、2mM至20mM、2mM至18mM、2mM至16mM、2mM至14mM、2mM至12mM、2mM至10mM、2mM至8mM、4mM至20mM、4mM至18mM、4mM至16mM、4mM至14mM、4mM至12mM、4mM至10mM、4mM至8mM、6mM至20mM、6mM至18mM、6mM至14mM、6mM至12mM、6mM至10mM、6mM至8mM、8mM至20mM、8mM至18mM、8mM至16mM、8mM至14mM、8mM至12mM、8mM至10mM、10mM至20mM、10mM至18mM、10mM至16mM、10mM至14mM、10mM至12mM、12mM至20mM、12mM至18mM、12mM至16mM、12mM至14mM、14mM至20mM、14mM至18mM、14mM至16mM、16mM至20mM、16mM至18mM、或18mM至20mM。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物或制剂中的IL浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。
特别考虑本文所述的组合物或组合可包含本文所述的任何类型的组分中的一种、两种、三种以上。例如，组合物可包含两种以上不同离子液体(例如本文所述的不同离子液体)的混合物、溶液、组合或乳化液；和/或两种以上不同的非离子表面活性剂的混合物、溶液、组合或乳化液；和/或两种以上不同活性化合物的混合物、溶液、组合或乳化液。
在任何方面的一些实施方式中，所述一种或多种IL可与至少一种化合物组合。如本文所用，“与…组合”是指两种以上物质以任何分子或物理排列(例如，在掺合物中、在溶液中、在混合物中、在悬浮液中、在胶体中、在乳化液中)存在于同一制剂中。所述制剂可为均质或异质混合物。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物可被超结构包含，例如纳米颗粒、脂质体、载体、细胞、支架等，所述超结构与所述IL在溶液、混合物、掺合剂、悬浮液等中。
如本文所用，“活性化合物”或“活性剂”是将会对靶细胞或生物体发挥作用的任何试剂。术语“化合物”和“药剂”是指通常不存在或不以给予和/或提供给细胞、组织或受试者的水平存在的任何实体。药剂可选自于由如下所组成的组：化学品；小的有机或无机分子；信号传导分子；核酸序列；核酸类似物；蛋白质；肽；酶；适体；肽模拟物(peptidomimetic)，肽衍生物，肽类似物，抗体；胞内抗体(intrabodies)；生物大分子，由生物材料(如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织)制成的提取物；天然存在的或合成的组合物或其功能片段。在一些实施方式中，所述药剂为任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的非蛋白实体。药剂可已知具有所需的活性和/或性质，或者可选自于多种化合物的库。预期用于本文所述方法的活性化合物的非限制性实例包括小分子、多肽、核酸、化学治疗剂/化疗化合物、抗体、抗体试剂、疫苗、GLP-1多肽或其模拟物/类似物、胰岛素、阿卡波糖、或芦可替尼。
如本文所述，核酸分子可为载体、表达载体、抑制性核酸、适体、模板分子或盒(例如用于基因编辑)、或靶向分子(例如用于CRISPR-Cas技术)、或任何其它希望递送至细胞的核酸分子。所述核酸分子可为RNA、DNA、或其合成或修饰版本。在任何方面的一些实施方式中，所述核酸为抑制性核酸，例如siRNA。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了将核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与与本文描述的一种或多种IL组合的核酸分子接触。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为受试者中的细胞，并且接触步骤包括将与一种或多种IL组合的核酸分子给予所述受试者。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为体外的、体内的或离体的(ex vivo)。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为真核细胞。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为上皮细胞，例如肠上皮细胞。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为表皮细胞。
在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含核酸，所述阴离子具有小于1.0的LogP，并且为a)非脂肪酸的羧酸，b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸，或c)芳香族阴离子。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含核酸，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为芳香族阴离子。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含核酸，所述阴离子为芳香族阴离子。
如本文所用，术语“小分子”是指化学试剂，其可包括但不限于肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10000克每摩尔的有机或无机化合物(即包括杂有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5000克每摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1000克每摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克每摩尔的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物可为治疗性化合物或药物，例如，对治疗受试者中的至少一种病症在治疗上有效的药剂或化合物。在本领域中，已知治疗性化合物用于多种病症，参见例如可在万维网drugs.com上获得的数据库或可在万维网catalog.data.gov/dataset/drugsfda-database上获得的FDA批准的化合物目录；通过引用的方式将其各自以其整体并入本文。
作为非限制性实例，适合用作本文活性化合物/治疗性化合物的示例性抗体和/或抗体试剂包括：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-阿托(adlimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、ado-曲妥珠单抗药物偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿莫罗布单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴西利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝洛妥昔单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、本妥西单抗-维多汀(brentuximabvedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗(capromab)、卡罗单抗五肽(capromab pendetide)、赛妥珠单抗(certolizumab)、赛妥珠单抗聚乙二醇(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、dinutuximab、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、依那西普(etanercept)、依那西普-szzs(etanercept-szzs)、戈利木单抗(golimumab)、ibritumomab、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、idarucizumab、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、易普利姆玛(ipilimumab)、依克珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈西木单抗(necitumumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、obiltoxaximab、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、olaratumab、奥马珠单抗(omalizumab)、palivizumab、panitumumab、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、ramucriumab、雷珠单抗(ranibizumab)、raxibacumab、reslizumab、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(secukinumab)、siltuximab、tocilizumab、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)、vedolizumab、sarilumab、guselkumab、inotuzumab ozogamicin、inotuzumab、阿达木单抗-adbm(adalimumab-adbm)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、贝伐单抗-awwb(bevacizumab-awwb)、benralizumab、emicizumab、emicizumab-kxwh、曲妥珠单抗-dkst(trastuzumab-dkst)、英夫利昔单抗-qbtx(infliximab-qbtx)、ibalizumab、ibalizumab-uiyk、tildrakizumab、tildrakizumab-asmn、burosumab、burosumab-twza、erenumab、erenumab-aooe、tositumomab、mogamulizumab、moxetumomab、moxetumomab pasudotox、cemiplimab、polatuzumab、卡妥索单抗(catumaxomab)、polatuzumab vedotin，及其组合，包括通过组合前述部分制备的双特异性抗体。
作为非限制性实例，适合用作本文的活性化合物/治疗性化合物的示例性抑制性核酸包括：patisiran、及其组合，包括通过组合前述部分制备的双特异性抗体。
如本文所用，术语“化疗剂”是指在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中具有治疗用途的任何化学或生物药剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物和癌症以及以增生性生长为特征的疾病。这些药剂可起到抑制癌细胞持续增殖所依赖的细胞活性的作用。在所有实施方式的一些方面，化疗剂为细胞周期抑制剂或细胞分裂抑制剂。在本发明的方法中有用的化疗剂类别包括烷化剂/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物、以及各种抗肿瘤药物。这些药剂中的大多数对癌细胞具有直接或间接毒性。在一个实施方式中，化疗剂为放射性分子。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物为多肽。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物为抗体或抗体试剂。如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列，并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可包括抗体或包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方式中，抗体试剂可包括单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包含重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段)以及完整的抗体。
在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含多肽(例如抗体或抗体试剂)，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为a)非脂肪酸的羧酸、或b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸、或c)芳香族阴离子。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含多肽(例如抗体或抗体试剂)，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为a)非脂肪酸的羧酸或b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含多肽(例如抗体或抗体试剂)，所述阴离子具有小于1.0的LogP并且为包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含多肽(例如抗体或抗体试剂)，所述阴离子为a)非脂肪酸的羧酸或b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。在任何方面的一些实施方式中，其中，所述活性化合物包含多肽(例如抗体或抗体试剂)，所述阴离子具有小于1.0的LogP。
在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物具有大于约450的分子量。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物具有大于约500的分子量。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物的分子量大于450，例如大于450、大于500、大于550、大于600、大于1000或更高。在任何方面的一些实施方式中，所述活性化合物为极性的。
在其中活性剂为抑制性核酸的任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含两种以上离子液体，并且第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)。在其中活性剂为抑制性核酸的任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含两种以上离子液体，并且第二离子液体为胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
在其中活性剂为抑制性核酸的任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含两种以上离子液体，第一离子液体和第二离子液体为选自于由如下所组成的组中的不同离子液体：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。在其中活性剂为抑制性核酸的任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含两种以上离子液体，第一离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、以及胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)；第二离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和异戊酸(CAVA)、以及胆碱和苯丙酸(CAPA)。在其中活性剂为抑制性核酸的任何方面的一些实施方式中，所述组合物包含两种以上离子液体，第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)，第二离子液体为胆碱和苯丙酸(CAPA)。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物局部给予，或被配制用于局部给予。
在一些实施方式中，所述抑制性核酸为NFKBIZ抑制性核酸，例如，它与NFKBIZmRNA结合并抑制NFKBIZ的表达。如本文所用，“NFKBIZ”或“NFKB抑制剂zeta”是指核因子κB(IκB)蛋白的抑制剂IκBζ，其在调节NF-κB复合体中起关键作用。它是TNF-α、IL-17A以及IL-36诱导型银屑病相关基因产物的直接转录激活剂，这些基因产物参与炎性信号转导、中性粒细胞趋化性和白细胞活化。因此，本文提供了治疗银屑病的方法，例如通过给予本文所述的包含作为NFKBIZ抑制剂(例如NFKBIZ抑制性核酸)的活性剂的组合物。来自许多物种的NFKBIZ序列为本领域已知的，例如，人NFKBIZ序列可在NCBI数据库中Gene ID 64332(例如，mRNAs NM_001005474.3(SEQ ID NO：37)和NM_031419.4(SEQ ID NO：38))下获得。本领域技术人员可例如使用本文上述所述的自动化工具容易地设计NFKBIZ抑制性核酸。NKFBIZ抑制性核酸也可商购，例如，来自Dharmacon(Lafayette，CO)的目录号J-040680-06-0050。
在一些实施方式中，抑制性核酸为TNF-a抑制性核酸，例如，抑制性核酸结合TNF-amRNA，并抑制TNF-a的表达。如本文所用，“肿瘤坏死因子α”或“TNF-α”是指涉及自身免疫性疾病、银屑癣和其它病症的促炎细胞因子。因此，本文提供了治疗炎性病症(例如银屑癣)和/或减少或抑制炎症的方法，例如通过给予本文所述的包含作为TNF-α抑制剂的活性剂(例如TNF-α抑制性核酸)的组合物。来自许多物种的TNF-a序列为本领域已知的，例如，人TNF-a序列可在NCBI数据库中Gene ID7124(例如，mRNA NM_000594.4(SEQ ID NO：39))下获得。本领域技术人员可例如使用本文上述所述的自动化工具容易地设计TNF-α抑制性核酸。TNF-α抑制性核酸也可商购，例如来自Dharmacon(Lafayette，CO)的目录号J-010546-09-0002、J-010546-10-0002、J-010546-11-0002以及J-010546-12-0002。
在一些实施方式中，所述抑制性核酸为IL-17抑制性核酸，例如，所述IL-17抑制性核酸结合IL-17mRNA，并抑制IL-17的表达。如本文所用，“白介素17”或“IL-17”是指通过激活与自身免疫疾病、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和其它病症有关的T细胞产生的促炎细胞因子。因此，本文提供了治疗炎性病症(例如银屑病)和/或减少或抑制炎症的方法，例如通过给予本文所述的包含作为IL-17抑制剂的活性剂(例如IL-17抑制性核酸)的组合物。来自许多物种的IL-17序列为本领域已知的，例如人IL-17序列可在NCBI数据库中Gene ID 3605(例如，mRNA NM_002190.3(SEQ ID NO：40))下获得。本领域技术人员可例如使用本文上述所述的自动化工具容易地设计IL-17抑制性核酸。IL-17抑制性核酸也可商购获得，例如，来自Dharmacon(Lafayette，CO)的目录号J-007937-05-0002、J-007937-06-0002、J-007937-07-0002以及J-007937-08-0002。
在任何实施方式的一个方面，本文提供了在需要其的受试者中治疗炎性病症的方法和/或减少炎症的方法，所述方法包括向所述受试者给予本文所述的组合物，所述组合物包含至少一种IL和至少一种抗炎剂。在任何方面的一些实施方式中，所述抗炎剂为靶向一种或多种促炎基因产物(例如IL-17、TNF-α和/或NFKBIZ)的抑制性核酸。
如本文所用，“炎症”是指对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应。炎症是生物体去除伤害性刺激以及启动组织愈合过程的保护性尝试。因此，术语“炎症”包括导致产生促炎细胞因子、炎症介质和/或由因此产生的细胞因子的作用引起的相关的下游细胞事件(例如发烧、积液、肿胀、脓肿形成以及细胞死亡)的任何细胞过程。炎症可包括急性反应(即炎性过程活跃的反应)和慢性反应(即以缓慢进展和新结缔组织形成为特征的反应)。可通过所涉及的细胞类型来区分急性炎症和慢性炎症。急性炎症通常涉及多形核中性粒细胞；而慢性炎症通常以淋巴组织细胞和/或肉芽肿反应为特征。
炎性病症是以炎性组织(例如，白细胞(例如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和树突状细胞)浸润)或炎性过程为特征的任何疾病状态，所述炎性过程引起或促成疾病状态的异常临床和组织学特征。炎性病症包括但不限于皮肤的炎性病症、肺的炎性病症、关节的炎性病症、肠道的炎性病症、眼的炎性病症、内分泌系统的炎性病症、心血管系统的炎性病症、肾的炎性病症、肝的炎性病症、中枢神经系统的炎性病症或脓毒症相关病症。在一些实施方式中，炎性病症与创伤愈合有关。在一些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的炎症可为皮肤炎症、药物滥用或药物成瘾引起的炎症、与感染相关的炎症、角膜炎症、视网膜炎症、脊髓炎症、与器官再生相关的炎症、以及肺部炎症。
在一些实施方式中，所述炎性病症为皮肤的炎性病症。在该方面的一些实施方式中，所述炎性病症为自身免疫性疾病。
皮肤的炎性病症的非限制性实例可包括银屑病(例如Sweet综合征)，坏疽性脓皮病，角膜下脓疱性皮肤病，持久性隆起红斑，Behcet病或急性泛发性发疹性脓疱病，大疱性疾病，银屑病，导致脓疱病变、痤疮、寻常痤疮、皮炎(例如接触性皮炎、特应性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹性皮炎、eczema craquelee、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物光皮炎、放射性皮炎、淤滞性皮炎或变应性接触性皮炎)的病症，湿疹，由外伤、烧伤、皮肤或黏膜缺血导致的溃疡和糜烂，多种形式的鱼鳞病，大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosae)，增生性瘢痕，瘢痕疙瘩(keloids)，内在老化的皮肤变化，光老化，皮肤机械剪切引起的摩擦起泡，由局部使用皮质类固醇导致的皮肤萎缩以及黏膜炎症(例如唇炎、嘴唇干裂、鼻刺激、黏膜炎和外阴阴道炎)。
在一些实施方式中，所述炎性病症可为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例可包括：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩病、以及自身免疫性甲状腺炎。
作为非限制性实例，炎性病症可为肺的炎性病症，例如哮喘、支气管炎、慢性支气管炎、细支气管炎、肺炎、鼻窦炎、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、肺部炎症、肺纤维化以及囊性纤维化(其可能额外或替代地涉及胃肠道或其它组织)。作为非限制性实例，炎性病症可为关节的炎性病症，例如类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、感染性关节炎、银屑病关节炎和其它关节炎病症。作为非限制性实例，炎性病症可为肠道或肠的炎性病症，例如炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及远端直肠炎。作为非限制性实例，炎性病症可为眼部炎性病症，例如干眼症、葡萄膜炎(包括虹膜炎)、结膜炎、巩膜炎以及干燥性角膜结膜炎。作为非限制性实例，炎性病症可为内分泌系统的炎性病症，例如自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto病)、Graves病、I型糖尿病以及肾上腺皮质的急性和慢性炎症。作为非限制性实例，炎性病症可为心血管系统的炎性病症，例如冠状动脉梗塞损伤、外周血管疾病、心肌炎、血管炎、狭窄再血管化、动脉粥样硬化和与II型糖尿病相关的血管疾病。作为非限制性实例，炎性病症可为肾的炎性病症，例如肾小球肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎和继发于Wegener病的肾炎、继发于急性肾炎的急性肾衰竭、梗阻后综合征以及肾小管缺血。作为非限制性实例，炎性病症可为肝的炎性病症，例如肝炎(由病毒感染、自身免疫反应、药物治疗、毒素、环境因素引起，或作为原发性紊乱的继发性后果)、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化以及原发性硬化性胆管炎。作为非限制性实例，炎性病症可为中枢神经系统的炎性病症，例如多发性硬化症和神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病或与HIV感染相关的痴呆)。作为非限制性实例，炎性病症可为中枢神经系统的炎性病症，例如MS、所有类型的脑炎和脑膜炎、急性播散性脑脊髓炎、急性横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎、局灶性脱髓鞘综合征(例如，Balo的同心圆硬化和MS的马尔堡变体)、进行性多灶性白质脑病、亚急性硬化性全脑炎、急性出血性白质脑炎(赫斯特病)、人T淋巴细胞病毒1型相关脊髓病/热带痉挛性截瘫、德维克病、人免疫缺陷病毒脑病、人免疫缺陷病毒空泡性脊髓病、周围神经病、格林-巴利综合征以及其它免疫介导的神经病，和重症肌无力。作为非限制性实例，炎性病症可为脓毒症相关病症，例如系统性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。炎性病症的其它非限制性实例包括内毒素休克、牙周病、多软骨炎、关节周围紊乱、胰腺炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、血管炎结节病淀粉样变性、过敏、过敏反应、系统性肥大细胞增多症、盆腔炎、多发性硬化症、多发性硬化症(MS)、乳糜泻、格林巴利综合征、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺现象、Goodpasture综合征、韦格纳肉芽肿、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、自身免疫性艾迪生病、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、眼阵挛性肌阵挛综合征、视神经炎、Ord甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、犬多关节炎、Reiter综合征、Takayasu动脉炎、温性自身免疫性溶血性贫血、纤维肌痛(FM)、自身炎症PAPA综合征、家族性地中海热、风湿性多肌痛、结节性多动脉炎、churg strauss综合征、纤维化肺泡炎、过敏性肺炎、过敏性曲霉病、隐源性肺嗜酸性粒细胞增多症、闭塞性细支气管炎机化性肺炎、荨麻疹、狼疮性肝炎、家族性感冒自身炎症综合征、Muckle-Wells综合征、新生儿多系统炎症性疾病、移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)、中耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎、慢性前列腺炎、再灌注损伤、矽肺、炎症肌病、超敏反应以及偏头痛。在一些实施方式中，炎性病症与感染相关，例如病毒、细菌、真菌、寄生虫或朊病毒感染。在一些实施方式中，炎性病症与变态反应相关。在一些实施方式中，炎性病症与污染物(例如，石棉沉着病、矽肺病或铍病)相关。
在一些实施方式中，所述炎性病症可为局部病症，例如皮疹或变态反应。在一些实施方式中，所述炎症与创伤有关。
抗炎剂为本领域已知的，并且作为非限制性实例可包括，非甾体类抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬或萘普生)；皮质类固醇，包括糖皮质激素(例如皮质醇、强的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙(triamcinolone)和倍氯米松)；甲氨蝶呤；柳氮磺胺吡啶；来氟米特；抗TNF药物；环磷酰胺；促消退药物(pro-resolving drugs)；霉酚酸酯(mycophenolate)；或阿片类药物(例如内啡肽、脑啡肽和强啡肽)、类固醇、镇痛剂、巴比妥类药、羟考酮、吗啡、利多卡因、和促炎基因产物的抑制剂(例如，如本文上文所述的抑制性核酸)。促炎基因在本领域中是已知的，并且作为非限制性实例包括NKFBIZ、TNF-α、IL-17、IL-36(IL-37α、IL-36β和IL-36γ)、IL-22、IL-17C、CXCL8、CCL20、IL23A、DEFB4和LCN2。
如本文所用，除非进一步指明，“组合物”是指任何IL、IL的组合或一种或多种IL与一种或多种本文所述的活性剂的组合。
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的包含至少一种IL和任选的活性化合物的组合物或组合可被配制为口服、皮下、经皮、瘤内、静脉内、皮内或肠胃外制剂。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物或组合可被配制用于递送至黏膜，例如递送至鼻、口腔或阴道黏膜。在任何方面的一些实施方式中，口服制剂可为包含含有至少一种IL和任选的活性化合物的组合物的可降解胶囊。
在任何方面的一些实施方式中，本文描述了包含如本文所述的至少一种IL和至少一种活性化合物的组合物。在任何方面的一些实施方式中，本文描述了基本上由如本文所述的至少一种IL和至少一种活性化合物组成的组合物。在任何方面的一些实施方式中，本文描述了由如本文所述的至少一种IL和至少一种活性化合物组成的组合物。在任何方面的一些实施方式中，包含如本文所述的至少一种IL和至少一种活性化合物的组合物作为单一疗法给予，例如，不给予受试者针对所述病症的另一种治疗。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含如本文所述的至少一种活性化合物与至少一种IL的组合的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包含如本文所述的至少一种IL和一种或多种活性化合物。在一些实施方式中，所述药物组合物基本上由如本文所述的至少一种IL和一种或多种活性化合物组成。在一些实施方式中，所述药物组合物由如本文所述的至少一种IL和一种或多种活性化合物组成。在一些实施方式中，所述药物组合物基本上由如本文所述的至少一种IL的水性溶液和一种或多种活性化合物组成。在一些实施方式中，所述药物组合物由如本文所述的至少一种IL的水性溶液和一种或多种活性化合物组成。
本文所述的组合物、制剂和组合可包含如本文所述的至少一种IL，例如，一种IL、两种IL、三种IL或更多种。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物、制剂或组合可包含如本文所述的至少一种IL和CAGE(胆碱和GEranate)。
在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种活性化合物和所述至少一种离子液体进一步与至少一种非离子表面活性剂组合。如本文所用，“非离子表面活性剂”是指缺乏净离子电荷，并且在水性介质中不离解到明显程度的表面活性剂。非离子表面活性剂的性质很大程度上取决于分子中亲水基团和疏水基团的比例。亲水基团包括氧乙烯基(-OCH2CH2-)和羟基基团。通过改变疏水分子(例如脂肪酸)中这些基团的数量，获得范围从强疏水性和水不溶性化合物(例如单硬脂酸甘油酯)到强亲水性和水溶性化合物(例如聚乙二醇)的物质。介于这两个极端之间的类型包括亲水基团和疏水基团的比例更均衡的物质，例如聚乙二醇酯和醚以及脱水山梨糖醇衍生物。合适的非离子表面活性剂可在Martindale，The Extra Pharmacopoeia，第28版，1982，The Pharmaceutical Press，London，GreatBritish，pp.370-379中找到。非离子表面活性剂的非限制性实例包括聚山梨醇酯、TweenTM、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、脂肪酸的乙二醇和甘油酯及其衍生物、脂肪酸的聚氧乙烯酯(聚乙二醇酯)、脂肪酸的聚氧乙烯醚及其衍生物(聚乙二醇醚)、聚乙烯醇、以及脱水山梨糖醇酯、脱水山梨糖醇单酯、由脂肪醇和聚乙二醇形成的醚、聚氧乙烯-聚丙二醇、烷基多糖苷、聚西托醇1000、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺DEA(cocamide DEA)、椰油酰胺MEA、癸基葡糖苷、癸基聚葡萄糖、单硬脂酸甘油酯、IGEPAL CA-630、异鲸蜡醇聚醚-20(isoceteth-20)、月桂基葡糖苷、麦芽糖苷、月桂酸甘油酯(monolaurin)、抗霉枯草菌素、Nonidet P-40、壬苯醇醚-9、壬苯醇醚、NP-40、八乙二醇单十二烷基醚、N-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基葡糖苷、油醇、PEG-10向日葵甘油酯、五甘醇单十二烷基醚、聚多卡醇、泊洛沙姆、泊洛沙姆407、聚乙氧基化牛油胺、聚甘油聚蓖麻油酸酯、脱水山梨糖醇、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、硬脂醇、表面活性素(surfactin)、Triton X-100等。在任何方面的一些实施方式中，至少一种非离子表面活性剂具有中性亲水性头部基团。
如本文所用，“聚山梨醇酯”是指衍生自用脂肪酸酯化的乙氧基化脱水山梨糖醇(山梨糖醇的衍生物)的表面活性剂。聚山梨醇酯的常见品牌名称包括ScatticsTM、AlkestTM、CanarcelTM和TweenTM。示例性的聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)以及聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以约0.1％w/v至约50％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以0.1％w/v至50％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以约1％w/v至约5％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以1％w/v至5％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以约3％w/v至约10％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以3％w/v至10％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以小于约5％w/v的浓度存在。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种非离子表面活性剂(例如，至少一种聚山梨醇酯)以小于5％w/v的浓度存在。
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的至少一种活性化合物和至少一种IL的组合以一种或多种纳米颗粒提供。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的至少一种活性化合物和至少一种IL的组合包含含有活性化合物的纳米颗粒，所述纳米颗粒在包含如本文所述的至少一种IL的组合物的溶液或悬浮液中。
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物(例如包含至少一种IL和活性化合物的组合物)可进一步包含药学上可接受的载体。如本文所用，当其涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时，术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体可互换使用，并表示所述材料能够给予至哺乳动物或给予到哺乳动物上而不产生不期望的生理效应(如恶心、头晕、胃部不适等)。除非有此需要，药学上可接受的载体将不促进针对与其掺合的药剂的免疫应答的提高。包含溶解或分散于其中的活性成分的药理组合物的制备为本领域所熟知，且无需基于剂型进行限制。通常，此类组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可制备适合在使用前在液体中溶解或悬浮的固体形式。所述制剂也可乳化或作为脂质体组合物存在。可以以适合用于本文所述的治疗方法的量，将所述活性成分与药学上可接受且与所述活性成分兼容的赋形剂混合。例如，合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。此外，如果需要，所述组合物可包含增强活性成分的效果的少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本公开的治疗性组合物可包含其组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括例如与诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如醋酸、酒石酸、扁桃酸的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)。与游离羧基基团形成的盐也可例如衍生自诸如钠氢氧化物、钾氢氧化物、铵氢氧化物、钙氢氧化物或铁氢氧化物的无机碱，以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。生理上可耐受的载体在本领域中是众所周知的。示例性的液体载体为除活性成分和水之外不包含物质的无菌水性溶液，或包含缓冲剂(例如处于生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者皆有，如磷酸盐缓冲盐水)的无菌水性溶液。更进一步，水性载体可包含多于一种的缓冲盐，以及盐(例如氯化钠和氯化钾)、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。除了水之外，液体组合物还可包含液相；液相组合物还可包含排除水之外的液相。此类额外的液相的示例为甘油、植物油(如棉籽油)以及水-油乳液。在治疗特定紊乱或病症中将有效的如本文所述方法中使用的活性剂的量将取决于紊乱或病症的性质，并且可通过标准临床技术确定。在本领域的标准参考文本Remington's Pharmaceutical Sciences,A.Osol中描述了合适的药物载体。例如，通过将1.5重量％的活性成分溶解在0.9％氯化钠溶液中来制备适合通过注射给予的肠胃外组合物。
在药物载体的上下文中，术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介。此类药物载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给予时，水为优选的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水性溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释剂型等形式。可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)将所述组合物配制成栓剂。口服剂型可包含标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编著(Mack Publishing Co.，1990年)中描述了合适的药物载体的实例。剂型应适合给予方式。
药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用在本领域中是众所周知的。可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如镁氢氧化物和铝氢氧化物；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，例如乙醇；以及(23)药物剂型中采用的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂也可存在于剂型中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。在一些实施方式中，载体抑制活性化合物的降解。术语“药学上可接受的载体”不包括组织培养基。
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物(例如包含如本文所述的至少一种IL和活性化合物的组合物)可配制成口服、皮下、静脉内、皮内或肠胃外剂型。在任何方面的一些实施方式中，口服剂型可为包含本文所述组合物的可降解胶囊，例如，包含如本文所述的至少一种IL和活性化合物的组合物。
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，活性化合物的生物活性与不存在所述至少一种IL的情况下的活性相比得到改善或稳定。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，与不存在所述至少一种IL的对照相比，IL极大地增强了活性化合物穿过皮肤的渗透。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了使用导管向受试者给予至少一种活性化合物的方法，其中，所述导管涂有如本文所述的至少一种IL。在任何实施方式的一个方面，本文描述了通过将导管放入体内来收集体液的方法，其中，所述导管涂有如本文所述的至少一种IL。
在任何实施方式的一个方面，本文所述的组合物或组合用于给予或递送至少一种活性化合物的方法，例如，用于治疗疾病。在任何实施方式的一个方面，本文描述了给予至少一种活性化合物的方法，所述方法包括与如本文所述的至少一种IL组合给予上述活性化合物。在任何实施方式的一个方面，本文描述了通过给予至少一种活性化合物来治疗疾病的方法，所述方法包括与如本文所述的至少一种IL组合给予所述活性化合物。
例如，通过本文所述的方法治疗的疾病可为癌症(乳腺癌、白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤、癌、尿路上皮癌、肺癌、结肠直肠癌、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞白血病、肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤)、神经母细胞瘤、糖尿病、感染、炎症、炎性疾病(例如，类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病)、自身免疫性疾病、特应性皮炎、胃肠道炎症、炎性肠病(IBD)、胆固醇血症、冠状动脉疾病、哮喘、移植/器官排斥、系统性红斑狼疮、多发性硬化、骨质疏松等。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用本文所述的组合物(例如，包含至少一种IL和活性化合物的组合物)治疗患有或被诊断为患有病症的受试者。患有病症(例如糖尿病)的受试者可由医师使用当前诊断糖尿病的方法来鉴别。表征这些病症并有助于诊断的糖尿病的症状和/或并发症在本领域中是众所周知的，包括但不限于重量减轻、愈合缓慢、多尿、烦渴、多食性头痛、皮肤发痒和疲劳。可能有助于诊断例如糖尿病的测试包括但不限于血液测试(例如空腹血糖水平)。糖尿病家族史或暴露于糖尿病风险因素(例如超重)也有助于确定受试者是否可能患有糖尿病或诊断糖尿病。
可将本文所述的组合物和方法给予患有或被诊断为患有本文所述病症的受试者。在一些实施方式中，本文所述的方法包括给予受试者有效量的本文所述的组合物(例如包含如本文所述的至少一种IL和活性化合物的组合物)，以减轻本文所述的病症的症状。如本文所用，“减轻症状”是改善与病症相关的任何标志物或症状。如通过任何标准技术测量的，与同等的未处理对照相比，此类减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。将本文所述的组合物给予受试者的多种方式是本领域技术人员已知的。此类方法可包括但不限于口服、肠胃外、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、肺部、皮肤、注射或瘤内给予。给予可为局部给予或系统性给予。
在任何方面的一些实施方式中，给予为经皮给予。在任何方面的一些实施方式中，给予为经皮给予、向黏膜(例如鼻、口腔或阴道黏膜)给予、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
口服给予可包括提供片剂(包括但不限于刻痕或包衣片剂)、丸剂、胶囊片(caplets)、胶囊、咀嚼片剂、粉包、扁囊剂、锭剂、囊片(wafers)、气溶胶喷雾剂或液体(例如但不限于，处于水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液中糖浆剂、酏剂、溶液或悬浮液)。口服剂型可包括离散剂型，例如但不限于片剂(包括但不限于刻痕或包衣片剂)、丸剂、胶囊片、胶囊、咀嚼片、粉包、扁囊剂、锭剂、囊片、气溶胶喷雾剂或液体(例如但不限于，处于水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液中的糖浆剂、酏剂、水溶液或悬浮液)。此类组合物含有预定量的CAGE和至少一种活性化合物，并且可通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。一般参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia PA(2005)。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了通过皮下、皮内或静脉内给予递送至少一种活性化合物的方法，所述方法包括将所述活性化合物与本文所述的至少一种IL组合给予。在任何方面的一些实施方式中，皮下、皮内或静脉内给予包括通过注射、导管、通道等给予。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了至少一种活性化合物的肠胃外递送方法，所述方法包括肠胃外给予所述活性化合物与如本文所述的至少一种IL的组合。在一些实施方式中，所述肠胃外给予包括递送至肿瘤，例如癌症肿瘤。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的组合物或组合可为肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的给予通常绕过患者对污染物的天然防御，肠胃外剂型优选为无菌的或能够在给予患者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射媒介中的干燥产品、准备注射的悬浮剂、以及乳剂。此外，可制备用于患者给药的控释肠胃外剂型，包括但不限于
Figure BDA0003759457540000491
型剂型和剂量倾卸。
可用于提供如本文所公开的组合物的肠胃外剂型的合适媒介为本领域技术人员熟知的，所述组合物包含至少一种IL(例如，CAGE)与至少一种活性化合物的组合。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的媒介，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或改进本文所公开的组合物中的成分的溶解度的化合物也可掺入本公开的肠胃外剂型(包括常规和控释肠胃外剂型)。
常规剂型通常提供从剂型中快速或立即的药物释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型会导致患者血液和其他组织中药物浓度的大幅波动。这些波动会影响许多参数，例如给药频率、起效、功效持续时间、治疗性血液水平的维持、毒性、副作用等。尽管如上文所述，包含至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物可排除使用控释剂型的某些原因，但本文预期在一些实施方式中所述方法和组合物可用于控释剂型。例如，控释剂型可用于控制药物的起效、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和峰值血液水平。特别是，控释或缓释剂型或剂型可用于确保实现药物的最大有效性，同时使潜在的不良反应和安全问题最小化，这些问题可能出现在药物剂量不足(即低于最低治疗性水平)以及超过药物的毒性水平时。在一些实施方式中，包含至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的的组合物可以以持续释放进行给予。
控释药物产品具有一个共同目标，即改善药物治疗超过其非控释对应物所达到的目标。理想情况下，在医学治疗中使用优化设计的控释制剂的特征在于在最少量的时间内使用最少的药物物质来治愈或控制病症。控释剂型的优点包括：1)延长药物的活性；2)减少给药频率；3)增加患者依从性；4)总药物用量少；5)减少局部或系统性的副作用；6)药物积累最小化；7)血药水平波动减少；8)治疗效力改善；9)药物活性的增强或丧失减少；以及10)控制疾病或病症的速度提高。Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage Form Design，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.：2000)。
大多数控释剂型被设计成最初释放一定量的药物(活性成分)以迅速产生所期望的治疗效果，并逐渐和持续释放其它量的药物以在延长的时间段内保持这种治疗性或预防性效果水平。为了在体内维持这种恒定的药物水平，药物必须以一定速度从剂型中释放出来，以替代正在代谢并从体内排出的药物量。可通过各种条件刺激活性成分的控释，包括但不限于pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水、以及其它生理条件或化合物。
多种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适用于与本公开的盐和组合物一起使用。实例包括但不限于如下中描述的那些：U.S.Pat.No：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；以及6,365,185B1；以引用的方式将各自并入本文。例如，使用羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统(例如
Figure BDA0003759457540000511
(AlzaCorporation,Mountain View，加利福尼亚州，USA))或它们的组合，这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放，从而提供不同比例的期望释放曲线。
如本文所用，术语“有效量”是指减轻疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的组合物的量，并且涉及足以提供期望效果的药理学组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予典型受试者时足以提供特定效果的组合物的量。如本文所用，在各种背景下，有效量将还包括足以延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)、或逆转疾病症状的量。因此，指定准确的“有效量”通常是不可行的。然而，对于任何给定的情况，合适的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。
可通过例如用于确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定有效量、毒性和治疗效力。剂量可根据采用的剂型和使用的给予途径而变化。毒性和治疗作用之间的剂量比为治疗指数，可表示为LD50/ED50的比。优选表现出大的治疗指数的组合物和方法。最初可通过细胞培养测定来评价治疗有效剂量。同时，可在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，所述浓度范围包括在细胞培养中或在合适的动物模型中测定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的活性化合物的浓度)。例如，可通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。可通过合适的生物测定(例如血糖测定等)来监测任何特定剂量的效果。剂量可由医生确定并根据需要进行调整，以适应观测到的治疗效果。
如本文所用，“糖尿病(diabetes)”是指糖尿病，一种代谢性疾病，其特征在于胰腺分泌胰岛素不足或缺乏。如通篇所用，除非本文另有说明，“糖尿病”包括1型、2型、3型和4型糖尿病。糖尿病的发病通常是由于遗传和环境原因的结合，导致异常高的血糖水平(高血糖)。两种最常见的糖尿病形式是由于胰岛素产生减少(1型糖尿病)，或身体对胰岛素的反应减弱(2型糖尿病和妊娠期糖尿病)。两者都会导致高血糖，这在很大程度上会导致糖尿病的急性症状：尿量过多，导致代偿性口渴和流体摄取增加，视力模糊，无法解释的体重减轻，嗜睡和能量代谢变化。糖尿病会导致许多并发症。如果疾病没有得到充分控制，可能会出现急性并发症(低血糖、酮症酸中毒或非酮症高渗性昏迷)。严重的长期并发症(即慢性副作用)包括心血管疾病(风险加倍)、慢性肾衰竭、视网膜损伤(可能导致失明)、神经损伤(几种)和微脉管损伤(可能导致阳痿和创伤愈合不良)。创伤愈合不良(尤其是足部)会导致坏疽，并可能导致截肢。在一些实施方式中，糖尿病可为2型糖尿病。2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)或成人型糖尿病)是一种主要以胰岛素抵抗(身体对胰岛素的反应减弱)、相对胰岛素缺乏和高血糖为特征的代谢紊乱。在一些实施方式中，受试者可为糖尿病前期，其可表征为例如具有升高的空腹血糖或升高的餐后血糖。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)已知减少人的食物摄取和饥饿感，并且是源自胰高血糖素原基因的转录产物的肠促胰岛素，其有助于葡萄糖稳态。GLP-1模拟物目前用于治疗2型糖尿病。最近的临床试验表明，这些治疗不仅改善葡萄糖稳态，还成功地诱导体重减轻。如本文所用。“GLP-1多肽”是指GLP-1的各种前肽和原肽以及切割产物，例如对于人而言的：GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：2)、GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：3)，以及GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：4)。在一些实施方式中，GLP-1多肽可为GLP-1(7-36)和/或GLP-1(7-37)或来自非人物种的相关多肽。许多物种的GLP-1多肽的序列在本领域中是已知的，例如，人GLP-1(NCBI GeneID：2641)多肽(例如，NCBI Ref Seq：NP_002045.1；SEQ ID NO：1)以及SEQ ID NO：2-SEQ IDNO：4。在一些实施方式中，GLP-1的前肽或原肽可用于本文所述的方法或组合物中，例如胰高血糖素前原蛋白(例如，SEQ ID NO：1)。本文所述的任何多肽的天然存在
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各种GLP-1模拟物是本领域已知的，并且用于糖尿病的治疗。GLP-1模拟物(或类似物)可包括exendin-4(一种与人GLP-1同源的Heloderma蜥蜴多肽)及其衍生物、修饰为DPP-IV抗性的GLP-1类似物、或耦合至各种进一步的试剂(例如以延长半衰期)的人GLP-1多肽。例如，GLP-1模拟物/类似物可包括艾塞那肽、利司那肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、阿必鲁肽、LY2189265、利拉鲁肽以及taspoglutide。此类分子的实例以及对其制造和活性的进一步讨论可在本领域中找到，例如Gupta.Indian J.Endocrinol Metab 17：413-421(2013)；Garber.Diabetes Treatments 41：S279-S284(2018)；美国专利公开US2009/0181912；以及国际专利公开WO2011/080103，通过引用的方式将其各自以其整体并入本文。
在任何方面的一些实施方式中，活性化合物可为化疗剂或对治疗癌症有效的药剂。如本文所用，术语“癌症”通常涉及异常细胞不受控制地分裂，并且可侵入附近组织的一类疾病或病症。癌细胞还可通过血液和淋巴系统扩散到身体的其它部位。有几种主要类型的癌症。癌是在皮肤或者内衬或覆盖内脏器官的组织开始的癌症。肉瘤是始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔或支持组织的癌症。白血病是从造血组织(如骨髓)开始的癌症，导致大量异常血细胞产生，并进入血液。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是在免疫系统细胞中开始的癌症。中枢神经系统癌症是始于脑和脊髓的组织的癌症。
在任何方面的一些实施方式中，所述癌症为原发性癌症。在任何方面的一些实施方式中，所述癌症为恶性癌症。如本文所用，术语“恶性”是指其中一组肿瘤细胞表现出一种或多种不受控制的生长(即超出正常限度的分裂)、侵袭(即侵入和破坏邻近组织)和转移(即通过淋巴或血液扩散到身体的其他位置)。如本文所用，术语“转移”是指癌症从身体的一个部分扩散到另一个部分。由已扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”或“转移瘤”。转移性肿瘤包含与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。如本文所用，术语“良性”或“非恶性”是指可能长得更大，但不会扩散到身体其他部分的肿瘤。良性肿瘤为自限性的，通常不会侵袭或转移。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长的个体细胞或组织。肿瘤通常是指由细胞异常生长形成的肿胀或病变，其可为良性的、恶变前的或恶性的。大多数癌细胞形成肿瘤，但有些癌细胞(例如白血病)不一定形成肿瘤。对于那些形成肿瘤的癌细胞，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。
如本文所用，术语“肿瘤”是指组织的任何新的和异常的生长，例如组织的异常团块，其生长超过正常组织的生长，并且与正常组织的生长不协调。因此，赘生物可为良性赘生物、恶变前赘生物或恶性赘生物。
患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观可测量的癌细胞的受试者。该定义包括恶性的、活跃增殖的癌症，以及潜在的休眠肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并播种其他重要器官的癌症最终会通过受影响器官的功能恶化导致受试者死亡。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑癌和CNS癌、乳腺癌、腹膜的癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部的癌症、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾脏癌或肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃部癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统癌症、外阴癌，以及其它癌症和肉瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级别免疫母细胞NHL、高级别淋巴母细胞NHL、高级别级小非分裂细胞NHL、大块疾病NHL(bulky disease NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤、和华氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病，和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣病(phakomatoses)、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征相关的异常血管增殖。
“癌细胞”是体内、离体或组织培养中的癌变细胞、癌前细胞或转化细胞，其具有不一定涉及新遗传物质摄取的自发或诱导的表型变化。尽管转化可由转化病毒的感染和新基因组核酸的掺入或外源核酸的摄取引起，但其也可自发或在暴露至致癌物后发生，从而使内源基因发生突变。转化/癌症与如下有关：例如形态变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、锚定非依赖性、恶性、丧失接触抑制和生长密度限制、生长因子或血清非依赖性性、肿瘤特异性标志物、侵袭性或转移性、以及在合适的动物宿主(如裸鼠)中生长肿瘤。
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物(例如包含与至少一种活性化合物组合的如本文所述的至少一种IL的组合物)作为单一疗法给予，例如不给予受试者针对该病症的另一治疗。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法可进一步包括给予受试者第二药剂和/或治疗例如作为组合疗法的一部分，所述第二药剂和/或治疗或者在本文所述的组合物(例如，包含与至少一种活性化合物组合的本文所述的至少一种IL的组合物)中，或者作为单独的制剂。例如，用于治疗癌症的第二药剂和/或治疗的非限制性实例可包括放射疗法、手术、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103、烷化剂(例如噻替派和
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环磷酰胺)、烷基磺酸盐(例如白消安、improsulfan和哌酰硫烷)、氮丙啶类(例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa)、亚乙基亚胺(ethylenimines)和甲基三聚氰胺(methylamelamines)(包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine))、acetogenins(尤其是bulatacin和bulatacinone)、喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)、苔藓抑素、callystatin、CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)、cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)、多拉司他丁(dolastatin)、多卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)、eleutherobin、潘拉司他汀(pancratistatin)、sarcodictyin、海绵抑制素(spongistatin)、氮芥(例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺、美法仑、novembichin、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥)、亚硝基脲类(如卡莫司汀、氯脲菌素、氟莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine)、抗生素(例如烯二炔抗生素(例如，calicheamicin，尤其是calicheamicin gamma1I和calicheamicin omegaI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))、dynemicin(包括dynemicin A)、双膦酸盐(例如氯膦酸盐)、埃斯帕拉霉素、以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、caminomycin、carzinophilin、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、detorubicin、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、匹来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin))、抗代谢物(例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU))、叶酸类似物(例如去甲蝶呤、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙)、嘌呤类似物(例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤)、嘧啶类似物(例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷)、雄激素(例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone))、抗肾上腺素(如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦)、叶酸补充剂(如frolinic acid)、aceglatone、醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比生群、edatraxate、defofamine、地美可辛、diaziquone、elformithine、elliptinium acetate、埃坡霉素、乙环氧定、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、洛尼达宁(lonidainine)、美登木素生物碱(例如美登素和安丝霉素)、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、喷司他丁、phenamet、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、
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多糖复合体(JHS Natural Products，Eugene，Oreg)、雷佐生、根霉素、sizofuran、锗螺胺、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2,2',2”-三氯三乙胺、单端孢菌素(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、verracurin A、roridin A和anguidine)、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、阿糖苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替哌、紫杉烷类(例如
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紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)、
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无氢化蓖麻油白蛋白工程的紫杉醇纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,IL)以及
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多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国))、苯丁酸氮芥、
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吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、铂类似物(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)、长春碱、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、NAVELBINE.RTM、长春瑞滨、novantrone、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、希罗达、伊班膦酸盐、伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、维甲酸类(如维甲酸)、卡培他滨、康普瑞汀、亚叶酸(LV)、奥沙利铂(包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX))、拉帕替尼(Tykerb.RTM.)、减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃罗替尼
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)和VEGF-A抑制剂以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法还可包括使用放射或放射疗法。此外，治疗方法还可包括使用手术治疗。
在某些实施方式中，可一次给予患者有效剂量的如本文所述的组合物(例如包含如本文所述的至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物)。在某些实施方式中，可重复给予患者有效剂量的本文所述的组合物(例如包含如本文所述的至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物)。对于系统性给予，可给予受试者治疗量的本文所述的组合物(例如，包含如本文所述的至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物)，例如，如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种活性化合物以约1.0-40.0mg/kg的剂量存在于组合中。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种活性化合物以1.0-40.0mg/kg的剂量存在于组合中。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种活性化合物以约1.0-20.0mg/kg的剂量存在于组合中。在任何方面的一些实施方式中，所述至少一种活性化合物以1.0-20.0mg/kg的剂量存在于组合中。
在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为约1U/kg至约20U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为1U/kg至20U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可小于20U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为约2U/kg至约10U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为2U/kg至10U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为约2U/kg至约5U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为2U/kg至5U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为约5U/kg至约10U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为5U/kg至10U/kg。在一些实施方式中，所述活性化合物为胰岛素，并且胰岛素的浓度或剂量可为2U/kg、5U/kg或10U/kg。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了治疗有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法通过注射将活性化合物与本文所述的至少一种IL组合给予受试者至受影响的组织中。在一些实施方式中，受影响的组织为包含患病细胞的组织。在一些实施方式中，受影响的组织为表现出疾病症状的组织。合适的受影响组织的非限制性实例包括肿瘤组织、脂肪组织(fat tissue)、脂肪组织(adipose tissue)等。在任何方面的一些实施方式中，合适的受影响组织包括肿瘤组织、脂肪组织(fat tissue)、脂肪组织(adipose tissue)等。在任何方面的一些实施方式中，所述疾病是由组织生长(例如，不希望的、异常的或病理性组织生长)引起的疾病。由组织生长引起的疾病可为由与健康受试者中该组织类型的正常情况不同的组织生长速率、组织生长位置或组织生长模式/结构引起或表征的任何疾病。此类疾病的非限制性实例为肿瘤、癌症、肥胖/肥胖症、和/或增生。在任何方面的一些实施方式中，此类疾病为肿瘤、癌症、肥胖/肥胖症、和/或增生。
在一些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以以较低频率给予治疗。例如，在每两周一次治疗三个月后，可每月重复一次治疗，持续六个月或一年或更长时间。根据本文所述的方法的治疗可将病症的标志物或症状的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
如本文所述的组合物的剂量可由医师确定并在必要时进行调整以适应观测的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少给药频率、停止治疗、恢复治疗、或对治疗方案进行其它更改。给药方案可从每周一次变化至每天一次，这取决于许多临床因素，例如受试者对活性化合物的敏感性。所需的活化剂量或量可一次给予或分成亚剂量(例如2-4个亚剂量)，并在一段时间内给予，例如在一天中以适当的间隔或其它适当的时间表给予。在一些实施方式中，给予可为长期的，例如，在数周或数月的时间内每天一次或多次剂量和/或治疗。给药和/或治疗方案的实例为在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、或6个月或更长的时间内每天1次、每天2次、每天3次或每天4次以上进行给予。可在一段时间内(例如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟期间)给予本文所述的组合物(例如包含至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物)。
根据本文所述的方法，给予本文所述的组合物的剂量范围取决于例如活性化合物的形式，其效能，以及期望降低的如本文所述的病症的症状、标志物或指标的程度(例如症状或标志物期望降低的百分比)。剂量不应太大，以免引起不良副作用。通常，剂量将随着患者的年龄、状况和性别而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，剂量也可以由个体医生调整。
在例如本文所述的病症的治疗中所描述的或诱导本文所述反应的组合物的功效可由熟练的临床医生确定。然而，在根据本文所述的方法治疗后，如果本文描述的病症的一种或多种体征或症状以有益的方式改变，其它临床可接受的症状得到改善或甚至缓解，或诱导期望的反应例如至少10％，则如本文所用的术语，治疗被认为是“有效治疗”。功效可例如通过测量根据本文所述的方法治疗的病症的标志物、指表、症状和/或发生率，或任何其它适当的可测量参数来评估。也可通过个体未恶化(通过住院治疗评估)或对医疗干预的需要(即疾病的进展停止)来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中又是描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如导致症状消退。用于治疗疾病的有效量是指，当给予有需要的受试者时对于该疾病足以导致如本文所定义的术语的有效治疗的量。可通过评估病症的物理指标或所期望反应来确定药剂的功效。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任意组合来监测给药和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。可在本文所述病症的动物模型中评估功效，例如糖尿病或癌症的治疗。当使用实验动物模型时，当观测到标志物的统计学意义变化时，就证明了治疗的功效。
本文提供了体外和动物模型测定，其允许评估本文所述组合物(例如，包含至少一种IL与至少一种活性化合物的组合的组合物)的给定剂量。
在任何方面的一些实施方式中，给予包含如本文所述的至少一种IL(例如与活性化合物组合)的组合物的受试者为患有、诊断为患有或需要治疗肥胖症、超重、或防止体重增加的受试者。在一些实施方式中，受试者为超重。本文所述的方法包括治疗肥胖症、减少体重增加、防止体重增加、促进体重减轻等的方法。例如，此类方法可促进代谢健康，出于美的原因而追求，和/或让患者为手术干预做准备，所述手术干预对于高BMI或体重的患者而言是不利的。在一些实施方式中，例如当受试者超重和/或肥胖时，减轻体重可为医学上必要的和/或医嘱。在一些实施方式中，减轻体重可为出于美容目的，例如当受试者希望减肥时，无论减肥是否在医学上必要和/或医嘱。
术语“肥胖症”是指体内脂肪过多。可通过本领域技术人员接受和使用的任何测量来确定肥胖症。目前，公认的肥胖症测量为体重指数(BMI)，其为体重(以千克计)相对于身高(以米计)的平方的计量。一般来说，对于20岁以上的成年人，BMI介于约18.5和24.9之间被认为是正常的，介于约25.0和29.9之间的BMI被认为是超重，等于或高于约30.0的BMI被认为是肥胖，等于或高于约40的BMI被认为是病态肥胖。(参见例如Gallagher等(2000)Am JClin Nutr 72：694-701。)这些BMI范围基于体重对疾病风险增加的影响。一些与高BMI和肥胖症相关的常见疾病包括心血管疾病、高血压(即血压过高)、骨关节炎、癌症和糖尿病。尽管BMI与体脂相关，但BMI与实际体脂之间的关系因年龄和性别而异。例如，对于相同的BMI，女性比男性更有可能具有更高的体脂百分比。此外，区分正常、超重和肥胖的BMI阈值可因例如年龄、性别、种族、健康状况和体型等因素而有所不同。在一些实施方式中，患有肥胖症的受试者可为在给予如本文所述的治疗之前体重指数为至少约25kg/m2的受试者。在一些实施方式中，患有肥胖症的受试者可为在给予如本文所述的治疗之前体重指数为至少约30kg/m2的受试者。
在任何方面的一些实施方式中，给予包含如本文所述的至少一种IL(例如与至少一种活性化合物组合)的组合物的受试者为患有、诊断为患有或需要治疗代谢紊乱或代谢综合征的受试者。术语“代谢紊乱”是指与葡萄糖调节或血糖控制受损或改变有关或因葡萄糖调节或血糖控制受损或改变而加重的任何紊乱，例如胰岛素抵抗。此类紊乱包括但不限于肥胖症、脂肪组织过多、糖尿病、脂肪肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病、代谢综合征、血脂异常、血压过高、高血糖，以及心血管疾病。“代谢综合征”不同于代谢紊乱，是指当它们一起发生时增加发展出心血管疾病和糖尿病的风险的医学紊乱的组合。例如，美国心脏协会和国际糖尿病基金会已经建立了许多代谢综合征的定义。仅举一个例子，WHO将代谢综合征定义为存在糖尿病、糖耐量受损、空腹血糖受损或胰岛素抵抗中的任何一种，以及以下中的两种：血压等于或大于140/90mmHg、血脂异常、中心性肥胖症和微量白蛋白尿。在一些实施方式中，代谢紊乱可选自于由以下所组成的组：肥胖症、脂肪组织过多、糖尿病、以及心血管疾病。
可通过在溶剂中递送化合物而改善许多活性化合物(例如药学活性化合物)的吸收。然而，此类方法通常不适合体内使用，因为大多数此类溶剂表现出毒副作用和/或充当递送点的刺激物。本文描述了可提供低毒性和改善的递送动力学的方法和组合物。
为方便起见，在下面提供了说明书、实施例以及所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中有所暗示，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，并不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限定。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果本领域术语的使用与本文提供的其定义存在明显矛盾，应以本说明书中提供的定义为准。
为方便起见，将本说明书、实施例以及所附权利要求中的本文使用的某些术语收集在此。
羧酸为具有式RCOOH的带有羰基的官能团，其中R为脂肪族、杂脂肪族、烷基或杂烷基。
在优选的实施方式中，直链或支链烷基在其骨架中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C30，对于支链为C3-C30)，更优选为20个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，更优选地在环结构中具有5、6或7个碳原子。在整个说明书、实施例以及权利要求书中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指具有取代烃骨架的一个或多个碳上的氢的一个或多个取代基的烷基部分。
除非另外指定碳数，否则本文所用的“低级烷基”是指如上定义的烷基基团，但在其骨架结构中具有1-10个碳原子、更优选1-6个碳原子。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长度。在整个申请中，优选的烷基基团为低级烷基。在优选的实施方式中，本文指定为烷基的取代基为低级烷基。
取代的烷基的取代基可包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基(包括膦酸盐和次膦酸盐)、磺酰基(包括硫酸盐、亚磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸盐)和甲硅烷基基团，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸盐和酯)、-CF3、-CN等。
如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链、支链或环状烃基。通常使用Cx烯基和Cx-Cy烯基，其中，X和Y表示链中的碳原子数。例如，C2-C6烯基包括具有1-6个碳的链和至少一个双键的烯基，例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基烯丙基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基等。与另一个自由基一起表示的烯基(例如，如在芳基烯基中)是指具有所示原子数的直链或支链的烯基二价自由基。烯基的骨架可任选地插入有一个或多个杂原子，例如N、O或S。
如本文所用，术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和烃基。通常使用Cx炔基和Cx-Cy炔基，其中X和Y表示链中的碳原子数。例如，C2-C6炔基包括具有1-6个碳的链和至少一个三键的炔基，例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、异戊炔基、1,3-六-二炔-基、正己炔基、3-戊炔基、1-己烯-3-炔基(1-hexen-3-ynyl)等。与另一个自由基一起表示的炔基(例如在芳基炔基中)是指具有所示原子数的直链或支链的炔基二价自由基。炔基的骨架可任选地插入有一个或多个杂原子，例如N、O或S。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。术语“卤素放射性同位素”或“卤代同位素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子的放射性核素。“卤素取代的部分”或“卤素取代的部分”，作为分离的基团或较大基团的一部分，是指如本文所述的被一个或多个“卤素”原子取代的脂肪族、脂环族或芳香族部分，如同此类术语在本申请中被定义一样。例如，卤素取代的烷基包括卤代烷基、二卤代烷基、三卤代烷基、全卤代烷基等(例如卤素取代的(C1-C3)烷基包括氯甲基、二氯甲基、二氟甲基、三氟甲基(-CF3)、2,2,2-三氟乙基、全氟乙基、2,2,2-三氟-1,1-二氯乙基等)。
术语“环基”或“环烷基”是指具有3-12个碳(例如3-8个碳，和例如3-6个碳)的饱和以及部分不饱和环状烃基。通常使用Cx环基和Cx-Cy环基，其中X和Y表示环系统中的碳原子数。环烷基还可任选地被取代，例如被1、2、3或4个取代基取代。环基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、2,5-环己二烯基、环庚基、环辛基、双环[2.2.2]辛基、金刚烷-1-基、十氢萘基、氧代环己基、二氧代环己基、硫代环己基、2-氧代双环[2.2.1]庚-1-基等。
术语“杂环基”是指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，如果是单环具有1-3个杂原子，如果是双环具有1-6个杂原子，或者如果是三环具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个N、O或S中的杂原子)。通常使用Cx杂环基和Cx-Cy杂环基，其中X和Y表示环系统中的碳原子数。在一些实施方式中，每个环的1、2或3个氢原子可被取代基取代。示例性杂环基基团包括但不限于哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、吗啉基、四氢呋喃基、哌啶基、4-吗啉基、4-哌嗪基、吡咯烷基、全氢吡咯基、1,4-二氮杂全氢吡啶基(1,4-diazaperhydroepinyl)、1,3-二噁烷基、1,4-dioxanyland等。
术语“双环”和“三环”是指通过单键多环环组件稠合、桥接或连接。如本文所用，术语“稠环”是指当两个环共有的环原子彼此直接键合时与另一个环键合以形成具有双环结构的化合物的环。常见稠环的非排他性实例包括萘烷、萘、蒽、菲、吲哚、呋喃、苯并呋喃、喹啉等。具有稠环系统的化合物可为饱和的、部分饱和的环基、杂环基、芳香族化合物、杂芳族化合物等。
术语“杂芳基”是指芳香族5-8元单环、8-12元稠合双环或11-14元稠合三环环系统，如果是单环，具有1-3个杂原子，如果是双环，具有1-6个杂原子，如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个N、O或S中的杂原子)。通常使用Cx杂芳基和Cx-Cy杂芳基，其中，X和Y表示环系统中的碳原子数。杂芳基包括但不限于衍生自如下的那些：苯并[b]呋喃、苯并[b]噻吩、苯并咪唑、咪唑并[4,5-c]吡啶、喹唑啉、噻吩并[2,3-c]吡啶、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻吩并[2,3-b]吡啶、中氮茚、咪唑并[l,2a]吡啶、喹啉、异喹啉、酞嗪、喹喔啉、萘啶、喹嗪、吲哚、异吲哚、吲唑、二氢吲哚、苯并噁唑、苯并吡唑、苯并噻唑、咪唑并[l,5-a]吡啶、吡唑并[l,5-a]吡啶、咪唑并[l,2-a]嘧啶、咪唑并[l,2-c]嘧啶、咪唑并[l,5-a]嘧啶、咪唑并[l,5-c]嘧啶、吡咯并[2,3-b]吡啶、吡咯并[2,3]cj吡啶、吡咯并[3,2-c]吡啶、吡咯并[3,2-b]吡啶、吡咯并[2,3-d]嘧啶、吡咯并[3,2-d]嘧啶、吡咯并[2,3-b]吡嗪、吡唑并[1,5-a]吡啶、吡咯并[1,2-b]哒嗪、吡咯并[1,2-c]嘧啶、吡咯并[1,2-a]嘧啶、吡咯并[l,2-a]吡嗪、三唑并[l,5-a]吡啶、蝶啶、嘌呤、咔唑、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、l,2-二氢吡咯并[3,2,l-hi]吲哚、中氮茚、吡啶并[1,2-a]吲哚、2(1H)-吡啶酮、苯并咪唑基、苯并呋喃基、benzothiofuranyl、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、carbolinyl、chromanyl、chromenyl、cinnolinyl、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、furazanyl、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚基、吲哚啉基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、isatinoyl、异苯并呋喃基、异色满烷基(isochromanyl)、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、oxepanyl、oxetanyl、oxindolyl、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、苯氧吩噻基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基(piperidonyl)、4-哌啶酮基、piperonyl、pteridinyl、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-quinolizinyl、喹喔啉基、喹啉基(quinuclidinyl)、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、thianthrenyl、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基以及吨基(xanthenyl)。一些示例性杂芳基包括但不限于吡啶基、呋喃基或呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基或噻吩基、哒嗪基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基、噻唑基、萘啶基、2-氨基-4-氧代-3、4-二氢蝶啶-6-基、四氢异喹啉基等。在一些实施方式中，每个环的1、2、3或4个氢原子可被取代基取代。
如本文所用，术语“取代的”是指用独立地选自但不限于如下的取代基独立替换取代部分上的一个或多个氢原子：烷基、烯基、杂环烷基、烷氧基、芳氧基、羟基、氨基、酰胺基、烷基氨基、芳基氨基、氰基、卤代、巯基、硝基、羰基、酰基、芳基和杂芳基基团。
如本文所用，术语“取代的”是指取代部分上的一个或多个(通常为1、2、3、4或5个)氢原子被独立地选自在下面的“取代基”定义中列出或以其它方式指定的取代基替换。通常，非氢取代基可为可与指定被取代的给定部分的原子结合的任何取代基。取代基的实例包括但不限于酰基、酰氨基、酰氧基、醛、脂环族、脂肪族、烷磺酰氨基、烷磺酰基、烷芳基、烯基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基、烷氨基、烷羰基、亚烷基、次烷基、烷硫基、炔基、酰胺、酰胺基、氨基、氨基、氨基烷基、芳烷基、芳烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、芳基磺酰、芳香族、芳基、芳氨基、芳基甲酰基、芳氧基、叠氮基、氨基甲酰基、羰基、羰基类(包括酮、羧基、羧酸盐/酯、CF3、氰基(CN)、环烷基、亚环烷基、酯、醚、卤代烷基、卤素、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、羟基、羟烷基、亚氨基、亚氨基酮、酮、巯基、硝基、氧杂烷基、氧代、氧代烷基、磷酰基(包括膦酸酯/盐和次膦酸酯/盐)、甲硅烷基团、磺酰胺基、磺酰基(包括硫酸盐、氨磺酰基和磺酸盐/酯)、硫醇和脲基部分，它们中的每一个也可任选地被取代或未被取代。在一些情况下，两个取代基连同它们所连接的碳可形成一个环。
芳基和杂芳基可任选地在一个或多个位置被一个或多个取代基取代，例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰胺基、磷酸盐/酯、膦酸盐/酯、次膦酸盐/酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
如本文所用，术语“烷氧基”或“烷氧基的”是指如上定义的烷基基团具有与其连接的氧自由基。代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两个碳氢化合物。因此，使烷基成为醚的烷基的取代基是或类似于烷氧基，例如可由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一表示。芳氧基(Aroxy)可由-O-芳基或O-杂芳基表示，其中芳基和杂芳基定义如下。烷氧基和芳氧基基团可如上文对烷基所述那样被取代。
如本文所用，术语“芳烷基”是指被芳基基团(例如芳香族或杂芳族基团)取代的烷基。
术语“烷硫基”是指如上定义的烷基具有与其连接的硫自由基。在优选的实施方式中，“烷硫基”部分由-S-烷基、-S-烯基和-S-炔基之一表示。代表性的烷硫基基团包括甲硫基、乙硫基等。术语“烷硫基”还包括环烷基基团、烯烃和环烯烃基团、以及炔基基团。“芳硫基”是指芳基或杂芳基基团。
术语“亚磺酰基”是指-SO-自由基。值得注意的是，亚磺酰基自由基可进一步被多种取代基取代以形成不同的亚磺酰基基团，包括亚磺酸、亚磺酰胺、亚磺酰基酯、亚砜等。
术语“磺酰基”是指-SO2-自由基。值得注意的是，磺酰基自由基可进一步被多种取代基取代以形成不同的磺酰基基团，包括磺酸(-SO3H)、磺酰胺、磺酸酯、砜等。
术语“硫代羰基”是指-C(S)-自由基。值得注意的是，硫代羰基自由基可进一步被多种取代基取代以形成不同的硫代羰基基团，包括硫代酸、硫代酰胺、硫代酯、硫代酮等。
如本文所用，术语“氨基”是指-NH2。术语“烷基氨基”是指具有至少一个与氮相连的直链或支链不饱和脂肪族、环基或杂环基自由基的氮部分。例如，代表性的氨基基团包括-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)2等。术语“烷基氨基”包括“烯基氨基”、“炔基氨基”、“环基氨基”以及“杂环基氨基”。术语“芳基氨基”是指具有至少一个与氮相连的芳基自由基的氮部分。例如-NH芳基和-N(芳基)2。术语“杂芳基氨基”是指具有至少一个与氮连接的杂芳基自由基的氮部分。例如-NH杂芳基和-N(杂芳基)2。任选地，两个取代基与氮一起也可形成环。除非另有说明，本文所述的含有氨基部分的化合物可包括其受保护的衍生物。氨基部分的合适保护基团包括乙酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基等。
术语“氨基烷基”是指如上定义的烷基、烯基和炔基，除了一个或多个取代或未取代的氮原子(-N-)位于所述烷基、烯基或炔基的碳原子之间。例如，(C2-C6)氨基烷基是指包含2-6个碳和一个或多个位于碳原子之间的氮原子的链。
术语“烷氧基烷氧基”是指-O-(烷基)-O-(烷基)，例如-OCH2CH2OCH3等。术语“烷氧基羰基”是指-C(O)O-(烷基)，例如-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3等。术语“烷氧基烷基”是指-(烷基)-O-(烷基)，例如-CH2OCH3、-CH2OCH2CH3等。术语“芳氧基”是指-O-(芳基)，例如-O-苯基、-O-吡啶基等。术语“芳基烷基”是指-(烷基)-(芳基)，例如苄基(即-CH2苯基)、-CH2-吡啶基等。术语“芳基烷氧基”是指-O-(烷基)-(芳基)，例如-O-苄基、-O-CH2-吡啶基等。术语“环烷氧基”是指-O-(环烷基)，例如-O-环己基等。术语“环烷基烷氧基”是指-O-(烷基)-(环烷基)，例如-OCH2环己基等。术语“氨基烷氧基”是指-O-(烷基)-NH2，例如-OCH2NH2、-OCH2CH2NH2等。术语“单或二烷基氨基”分别是指-NH(烷基)或-N(烷基)(烷基)，例如-NHCH3、-N(CH3)2等。术语“单-或二烷基氨基烷氧基”分别是指-O-(烷基)-NH(烷基)或-O-(烷基)-N(烷基)(烷基)，例如-OCH2NHCH3、-OCH2CH2N(CH3)2等。术语“芳基氨基”是指-NH(芳基)，例如-NH-苯基、-NH-吡啶基等。术语“芳基烷基氨基”是指-NH-(烷基)-(芳基)，例如-NH-苄基、-NHCH2-吡啶基等。术语“烷基氨基”是指-NH(烷基)，例如-NHCH3、-NHCH2CH3等。术语“环烷基氨基”是指-NH-(环烷基)，例如-NH-环己基等。术语“环烷基烷基氨基”-NH-(烷基)-(环烷基)，例如-NHCH2-环己基等。
关于本文提供的所有定义，应注意定义应解释为开放式的，意思是可包括超出规定的其它取代基。因此，C1烷基表示有一个碳原子，但不表示碳原子上的取代基是什么。因此，C1烷基包括甲基(即-CH3)以及-CRaRbRc，其中Ra、Rb和Rc可各自独立地为氢或其中碳的α原子为杂原子或氰基的任何其它取代基。因此，CF3、CH2OH和CH2CN都为C1烷基。
除非另有说明，否则本文描述的结构旨在包括仅在一种或多种同位素富集原子的存在下而不同的化合物。例如，除了氢原子被氘或氚替换或碳原子被富集13C或14C的碳替换之外，具有本结构的化合物在本发明的范围内。
如本文所用，术语“异构体”是指具有相同分子式但结构不同的化合物。仅在构型和/或构象上不同的异构体称为“立体异构体”。术语“异构体”也用于指对映异构体。
术语“对映异构体”用于描述彼此的镜像并且不可重叠的一对分子异构体中的一个。用于指定或指代对映异构体的其它术语包括“立体异构体”(因为手性中心周围的排列或立体化学不同，尽管所有对映异构体都是立体异构体，但并非所有立体异构体都是对映异构体)或“旋光异构体”(因为纯对映异构体的光学活性，即不同纯对映异构体在不同方向上旋转平面偏振光的能力)。对映异构体通常具有相同的物理性质，例如熔点和沸点，并且还具有相同的光谱性质。对映异构体在它们与平面偏振光的相互作用和生物活性方面可彼此不同。
术语“外消旋混合物”、“外消旋化合物”或“外消旋体”是指一种化合物的两种对映异构体的混合物。理想的外消旋混合物是其中化合物的两种对映异构体的50:50混合物，使得(+)对映异构体的旋光度抵消(-)对映异构体的旋光度。
当用于提及外消旋混合物时，术语“拆分(resolving/resolution)”是指将外消旋体分离为其两种对映体形式(即(+)和(-)；或(R)和(S)形式)。该术语还可指外消旋体的一种异构体向产物的对映选择性转化。
术语“对映体过量”或“ee”是指其中一种对映异构体的产生多于另一种的反应产物，并且定义为具有以摩尔或重量或体积分数F(+)和F(-)(其中F(+)和F(-)之和＝1)给出的组成的(+)-和(-)-对映异构体的混合物。对映体过量定义为*F(+)-F(-)*，并且对映体过量百分比定义为100x*F(+)-F(-)*。对映异构体的“纯度”由其ee或百分比ee值(％ee)描述。
无论表达为“纯化的对映异构体”或“纯对映异构体”或“拆分的对映异构体”或“对映体过量的化合物”，这些术语均旨在表示一种对映异构体的量超过另一种对映异构体的量。因此，当提及对映异构体制剂时，主要对映异构体的百分比(例如按摩尔或重量或体积)和(或)主要对映异构体的对映体过量百分比两者(或其中之一)可用于确定是否该制剂代表纯化的对映异构体制剂。
术语异构体的“对映体的纯度”或“对映异构体纯度”是指对纯化的对映异构体的定性或定量测量；通常，测量值基于ee或对映体过量来表示。
术语“基本上纯化的对映异构体”、“基本拆分的对映异构体”、“基本上纯化的对映异构体制剂”旨在表示其中一种对映异构体相对于另一种已被富集的制剂(例如衍生自非光学活性起始材料、底物或中间体)，更优选地，其中另一种对映异构体占对映异构体或对映异构体制剂的小于20％、更优选小于10％、更优选小于5％、还更优选小于2％。
术语“纯化的对映异构体”、“拆分的对映异构体”和“纯化的对映异构体制剂”旨在说明其中一种对映异构体(例如R-对映异构体)相对于另一种而言被富集的制剂(例如衍生自非光学活性起始材料、底物或中间体)，并且更优选地，其中另一种对映异构体(例如S-对映异构体)占所述制剂的小于30％、优选小于20％、更优选小于10％(例如在这种特定情况下，R-对映异构体基本上不含有S-对映异构体)、更优选小于5％、更优选小于2％。纯化的对映异构体可在基本上不含其它对映异构体的情况下被合成；或者纯化的对映异构体可在立体优选的程序中合成，然后进行分离步骤；或者纯化的对映异构体可衍生自外消旋混合物。
术语“对映选择性”，也称为对映体比(由符号“E”表示)，是指酶从外消旋底物生成产物外消旋化合物中相对于另一对映异构体的一种对映异构体的选择能力；换句话说，它是酶区分对映异构体能力的量度。非选择性反应的E为1，而E大于20的拆分通常被认为对合成或拆分有用。对映选择性在于所讨论的对映异构体之间的转化率差异。得到对映异构体中的一种被富集的反应产物；相反，剩余的底物在另一种对映异构体方面被富集。出于实践目的，通常希望以大大过量来获得对映异构体中的一种。这是通过在一定程度的转化处终止转化过程来实现的。
CAGE(胆碱和GEranate)是包含阳离子胆碱(参见例如结构I)和阴离子geranate或香叶酸(geranic acid)(参见例如结构II和结构III)的离子液体。例如，CAGE的制备可如国际专利公开WO 2015/066647中所述(通过引用的方式将其整体并入本文)，或如本文实施例中所述。
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在本文中，术语“降低(decrease)”、“减少/减小(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”均用于表示统计学显著量的降低。在一些实施方式中，“减少/减小”、“降低”、或“抑制”通常是指与参比水平(例如不存在给定治疗或药剂)相比，降低至少10％，并且可包括例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“减少/减小”或“抑制”不包括与参比水平相比的完全抑制或减少/减小。“完全抑制”是与参比水平相比100％抑制。降低可优选地下降到没有给定紊乱的个体的正常范围内的可接受的水平。
术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“激活/活化(activate)”在本文中均用于表示统计显著量的增加。在一些实施方式中，术语“增加”、“增强”或“激活/活化”可意指与参比水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％，或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或更多，并且包括与参比水平相比100％增加或10％-100％之间的任何增加，或与参比水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍至10倍之间的任何增加或更多。在标志物或症状的上下文中，“增加”是此类水平的统计学显著增加。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如家猫)、犬科物种(例如狗、狐狸、狼)、鸟类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)以及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者为哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除了人之外的哺乳动物可有利地用作代表本文所述病症的动物模型的受试者。受试者可为雄性或雌性。
受试者可为先前已被诊断具有或鉴定为遭受或患有需要治疗的病症或与此类病症相关的一种或多种并发症的人，并且任选地，已经经历了针对所述病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可为先前未被诊断为患有该病症或与该病症相关的一种或多种并发症的人。例如，受试者可为表现出关于该病症或与该病症相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的人，或者是不表现出风险因素的受试者。
“需要”治疗特定病症的“受试者”可为患有该病症、被诊断为患有该病症或处于发展为该病症的风险中的受试者。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用来表示通过相邻残基的α-氨基和羧基基团之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于指代相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指代小的多肽，但这些术语在本领域中的使用重叠。当涉及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述的其它等同物、变体、片段和类似物。
在本文所述的各种实施方式中，进一步设想包括所述任何特定多肽的变体(天然存在的或以其它方式)、等位基因、同源物、保守修饰变体和/或保守置换变体。关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的改变编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的单独置换、删除或添加为“保守修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被置换为化学上相似的氨基酸，并保留多肽的期望活性。此类保守修饰变体是对多态变体、种间同源物和与本公开一致的等位基因的补充，并且不排除多态变体、种间同源物和与本公开一致的等位基因。
给定的氨基酸可被具有相似物理化学特征的残基替换，例如，用一个脂肪族残基置换另一个(例如Ile、Val、Leu或Ala彼此替代)，或用一个极性残基置换另一个(例如在Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间)。其它此类保守置换(例如具有相似疏水性特征的整个区域的置换)是众所周知的。可以本文所述的任何一种测定来测试包含保守氨基酸置换的多肽，以确认所期望的活性(例如天然或参比多肽的活性和特异性)得以保留。
可根据其侧链性质的相似性对氨基酸进行分组(A.L.Lehninger,inBiochemistry，第二版，pp.73-75，Worth Publishers，纽约(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，可根据共同的侧链特性将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守置换将需要将这些类别中的一个成员替换为另一个类别。具体的保守置换包括，例如，Ala置换为Gly或Ser；Arg置换为Lys；Asn置换为Gln或His；Asp置换为Glu；Cys置换为Ser；Gln置换为Asn；Glu置换为Asp；Gly置换为Ala或Pro；His置换为Asn或Gln；Ile置换为Leu或Val；Leu置换为Ile或Val；Lys置换为Arg、Gln或Glu；Met置换为Leu、Tyr或Ile；Phe置换为Met、Leu或Tyr；Ser置换为Thr；Thr置换为Ser；Trp置换为Tyr；Try置换为Trp；和/或Phe置换为Val、Ile或Leu。
在一些实施方式中，本文所述的多肽(或编码此类多肽的核酸)可为本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本文下文描述的测定保留至少50％的野生型参比多肽活性的肽片段或区段。功能片段可包含本文公开的序列的保守置换。
在一些实施方式中，本文所述的多肽可为本文所述序列的变体。在一些实施方式中，变体为保守修饰的变体。例如，可通过天然核苷酸序列的突变获得保守置换变体。如本文所指的“变体”是与天然或参比多肽基本上同源的多肽，但由于一个或多个删除、插入或置换而具有与所述天然或参比多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。当与天然或参比DNA序列相比时，编码变体多肽的DNA序列包括含有一个或多个核苷酸的添加、删除或置换但编码保留活性的变体蛋白或其片段的序列。广泛的基于PCR的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可由普通技术人员应用。
变体氨基酸或DNA序列可与天然或参比序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性。例如，通过使用在万维网上普遍用于此目的的免费可用的计算机程序(例如具有默认设置的BLASTp或BLASTn)比较两个序列，可确定天然序列和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)。
在任何方面的一些实施方式中，变体可为与本文提供的参比序列之一具有至少90％、至少95％、至少98％或更高序列同源性，并保留该参比序列的野生型活性(例如肠促胰岛素活性)的多肽。在任何方面的一些实施方式中，变体可为与本文提供的天然存在的参比序列之一具有至少90％、至少95％、至少98％或更高序列同源性，并保留该参比序列的野生型活性(例如肠促胰岛素活性)的多肽。在任何方面的一些实施方式中，变体可为与本文提供的参比序列之一具有至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同源性，并保留该参比序列的野生型活性(例如肠促胰岛素活性)的天然存在的多肽。
可通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来完成天然氨基酸序列的改变。例如，可通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定基因座引入突变，该突变序列两侧是限制性位点，能够连接到天然序列的片段。连接后，所得重建序列编码具有所需氨基酸插入、置换或删除的类似物。或者，可使用寡核苷酸定向的位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，所述改变的核苷酸序列具有根据所需的置换、删除或插入而改变的特定密码子。进行此类改变的技术非常成熟，包括例如由Walder等(Gene，42：133，1986)；Bauer等(Gene，37:73，1985)；Craik(BioTechniques，1985年1月，12-19)；Smith等(GeneticEngineering:Principles and Methods，Plenum Press，1981)；以及U.S.Pat.No：4,518,584和4,737,462公开的技术，通过引用的方式将其整体并入本文。也可将不参与维持多肽正确构象的任何半胱氨酸残基置换掉(通常置换为丝氨酸)，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至多肽，以改善其稳定性或促进寡聚化。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成的抗体以及多种形式，包括全长抗体及其抗原结合部分；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双抗体(diabody)、多特异性抗体、双重特异性抗体(dual specific antibody)、抗独特型抗体、双特异性抗体(bispecificantibody)、其功能活性表位结合部分、和/或双功能杂合抗体。每条重链由所述重链的可变区(本文缩写为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻链的可变区(本文缩写为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL结构域组成。VH和VL区可进一步分为称为互补决定区(CDR)的高变区，并散布有称为框架区(FR)的保守区。因此，每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们从N末端到C末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这种结构对于本领域技术人员来说是众所周知的。
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列，并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可包括抗体或包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方式中，抗体试剂可包括单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包含重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)。在另一实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和域抗体(dAb)片段)，以及完整的抗体。
抗体和/或抗体试剂可包括免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、完整的人抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、及其功能活性表位结合部分。
如本文所用，术语“纳米抗体”或单域抗体(sdAb)是指包含从骆驼科动物和单峰骆驼获得的抗体的小单可变域(VHH)的抗体。从骆驼和单峰骆驼(Camelus baclrianus和Calelus dromaderius)家族成员(包括世界新成员，例如美洲驼物种(Lama paccos、Lamaglama和Lama vicugna))获得的抗体蛋白已在大小、结构复杂性以及关于人受试者的抗原性方面进行了表征。在自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺乏轻链，因此在结构上与来自其它动物的抗体的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构不同。参见PCT/EP93/02214(WO94/04678，1994年3月3日公开；通过引用将其整体并入本文)。
可通过基因工程获得骆驼抗体的一个区域(即被认为是VHH的小的单个可变结构域)，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，从而产生一种低分子量的抗体衍生蛋白，称为“骆驼纳米抗体”。参见U.S.Pat.No.5,759,808，1998年6月2日公布；另见Stijlemans,B.等，2004J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等，2003Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等，2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等，2002Int J Cancer 89：456-62；以及Lauwereys,M.等，1998EMBO J.17：3512-3520；通过引用的方式将各自以其整体并入本文。可从例如来自Ablynx(Ghent,Belgium)商购骆驼抗体和抗体片段的工程化文库。与其它非人来源的抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，以获得更接近人序列的序列，即可使纳米抗体“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
骆驼纳米抗体的分子量约为人IgG分子的十分之一，并且该蛋白的物理直径仅为几纳米。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体能够与对于较大的抗体蛋白在功能上不可见的抗原位点结合，即骆驼纳米抗体可用作试剂检测使用经典免疫学技术难测的抗原，也可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是，骆驼纳米抗体可以通过与靶标蛋白凹槽或狭窄裂缝中的特定位点结合来进行抑制，因此其可以发挥更接近于经典的低分子量药物功能而不是经典的抗体的能力。低分子量和紧凑的尺寸进一步使得骆驼纳米抗体极度热稳定，对极端pH值和蛋白水解消化稳定，并且抗原性差。参见美国专利申请20040161738，2004年8月19日公布；以引用方式将其整体并入本文。这些特征结合对人的低抗原性显示出巨大的治疗潜力。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指纳入了核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条核酸链。或者，其可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。一方面，核酸可为DNA。在另一方面，核酸可为RNA。例如，合适的DNA可包括cDNA。例如，合适的RNA可包括mRNA。
如本文所用，“抑制性核酸”是指可抑制靶标表达的核酸分子，例如双链RNA(dsRNA)、抑制性RNA(iRNA)等。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸可为沉默RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。抑制性核酸还可包括引导序列分子(例如，引导RNA)，其例如与酶组合以诱导靶标的插入、删除、插入缺失和/或突变，从而抑制靶标的表达。
已证明双链RNA分子(dsRNA)在称为RNA干扰(RNAi)的高度保守调节机制中阻断基因表达。本文所述的抑制性核酸可包括RNA链(反义链)，所述RNA链具有长度为30个核苷酸以下(即长度为15-30个核苷酸，通常长度为19-24个核苷酸)的区域，所述区域基本上与所靶向的mRNA转录物的至少部分互补。使用这些iRNA可实现mRNA转录物的靶向降解，从而降低靶标的表达和/或活性。
如本文所用，术语“iRNA”是指包含RNA(或如下文所述的修饰核酸)并通过RNA诱导的沉默复合体(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割的药剂。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的iRNA引起对靶标的表达和/或活性的抑制。在任何方面的一些实施方式中，使细胞与抑制剂(例如iRNA)接触引起细胞中靶标mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，直至并包括在不存在iRNA的细胞中发现的靶标mRNA水平的100％。在任何方面的一些实施方式中，给予受试者抑制剂(例如iRNA)引起受试者中靶标mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，直至并包括在不存在iRNA的受试者中发现的靶标mRNA水平的100％。
在任何方面的一些实施方式中，iRNA可为dsRNA。dsRNA包括足够互补以在将使用该dsRNA的条件下杂交形成双链体结构的两条RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶标序列具有互补性(基本上互补并且通常完全互补)的区域。所述靶标序列可衍生自在靶标表达期间形成的mRNA序列，例如，它可跨越一个或多个内含子边界。另一条链(有义链)包括与反义链具有互补性的区域，使得两条链在合适条件下结合时杂交并形成双链体结构。通常，所述双链体结构的长度在15(含)和30(含)个碱基对之间、更通常长度在18(含)和25(含)个碱基对之间、更通常长度在19(含)和24(含)个碱基对之间、最通常长度在19(含)和21(含)个碱基对之间。类似地，与靶标序列具有互补性的区域的长度在15(含)和30(含)个碱基对之间、更通常长度在18(含)和25(含)个碱基对之间、更通常长度在19(含)和24(含)个碱基对之间、最通常长度在19(含)和21(含)个碱基对之间。在任何方面的一些实施方式中，所述dsRNA的长度在15(含)和20(含)个核苷酸之间，并且在其它实施方式中，所述dsRNA的长度在25(含)和30(含)个核苷酸之间。正如普通技术人员将认识到的，靶向切割的RNA的靶向区域最经常是较大RNA分子(通常为mRNA分子)的一部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度足以成为RNAi定向切割(即通过RISC途径的切割)的底物。具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA在某些情况下可介导RNAi定向的RNA切割。大多数情况下，靶标的长度为至少15个核苷酸，优选长度为15-30个核苷酸。
抑制性核酸类型的示例性实施方式可包括例如siRNA、shRNA、miRNA和/或amiRNA，其均为本领域公知的。本领域技术人员将能够例如使用可公开获得的设计工具，设计进一步的siRNA、shRNA或miRNA以靶向靶标基因或基因产物(例如mRNA)的核酸序列。siRNA、shRNA或miRNA通常使用公司(如Dharmacon(Layfayette，CO)或Sigma Aldrich(St.Louis，MO))来制造。
在任何方面的一些实施方式中，iRNA的RNA(例如dsRNA)被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。可通过本领域中良好建立的方法合成和/或修饰本文所述的核酸，例如在“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage,S.L.等(编著)，JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA(通过引用的方式将其并入本文)中描述的那些方法。修饰包括例如，(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如替换为稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伴侣库进行碱基配对的碱基，碱基移除(无碱基核苷酸)，或缀合的碱基；(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖的替换；以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本文所述实施方式的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰的骨架或不含天然核苷间键的RNA。具有修饰骨架的RNA尤其包括在骨架中没有磷原子的RNA。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提到的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA也可被认为是寡核苷。在任何方面的一些实施方式中，修饰的RNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
例如，修饰的RNA骨架可包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、具有正常3'-5'连结键的硼磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、和硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)，它们的2'-5'连接类似物，以及具有相反极性者的那些物质，其中，相邻的核苷单元对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。其中不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间连结键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连结键、或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间连结键形成的骨架。这些骨架包括具有如下的骨架：吗啉代连结键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它骨架，以及具有杂原子骨架的寡核苷，特别是--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]，--CH2--O--N(CH3)--CH2--，--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]。
在适合或考虑用于iRNA的其它RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连结键(即骨架)都被新基团替换。保持碱基单元用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)，已被证明具有优异杂交特性的RNA模拟物。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被替换为含有酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架。核碱基被保留并直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。
iRNA的RNA也可被修饰以包含一种或多种锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含连接2'和4'碳的额外桥接。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。已证实向siRNA添加锁核酸是血清中siRNA的稳定性增加，并减少脱靶效应(Elmen,J.等,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等，(2003)Nucleic Acids Research31(12)：3185-3193)。
修饰的RNA也可包含一个或多个取代的糖部分。本文所述的iRNA(例如dsRNA)可在2'位置包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中，所述烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在任何方面的一些实施方式中，dsRNA在2'位置包含以下之一：C1至C10低级烷基，取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基，SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、改善iRNA药代动力学性质的基团、或改善iRNA药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。在任何方面的一些实施方式中，修饰包括2'甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰为2'-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如下文实施例中所述；以及2'-二甲氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2，也在下文的实施例中有描述。
其它修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。也可在iRNA的RNA上的其它位置、特别是3'末端核苷酸或2'-5'连接的dsRNA上糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置进行类似的修饰。iRNA也可具有糖模拟物，例如环丁基部分来代替呋喃戊糖。
抑制性核酸还可包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所用，“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶(2-thiothymine)和2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫脲嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤(7-daazaadenine)，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。这些核碱基中的某些特别可用于增加本发明特征的抑制性核酸的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。已证实5-甲基胞嘧啶置换可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，并且是示例性碱基置换，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时甚至更特别。
上述所述的修饰的核酸、骨架和核碱基的制备在本领域中是众所周知的。
在本发明中特征的抑制性核酸的另一修饰涉及将抑制性核酸与一个或多个配体、部分或缀合物化学连接，所述配体、部分或缀合物增强iRNA的活性、细胞分布、药代动力学性质或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553-6556)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4：1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20：533-538)；脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259：327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75：49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸酯/盐(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654；Shea等，Nucl.AcidsRes.，1990，18：3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654)；棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229-237)；或十八烷基胺或己氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923-937)。
在本文所述的各个方面的一些实施方式中，抑制性核酸为引导核酸(gNA)。如本文所用，术语“引导核酸”、“引导序列”、“crRNA”、“引导RNA”、“单引导RNA”、“gRNA”或“CRISPR引导序列”是指包含确定酶(例如CRISPR/Cas系统的Cas DNA结合蛋白)对多核苷酸靶标的特异性的序列的核酸。gNA可包含与靶标核酸序列至少部分互补的多核苷酸序列，其足以与靶标核酸序列杂交，并指导酶(例如核酸酶)与靶标核酸序列的序列特异性结合。
在一些实施方式中，由gNA指导的酶为基因编辑蛋白，例如在所期望的识别位点中诱导缺口或双链断裂的任何核酸酶。此类酶可为天然的或工程化的。然后这些断裂可由细胞通过以下两种方式之一修复：非同源末端连接和同源定向修复(同源重组)。在非同源末端连接(NHEJ)中，双链断裂通过将断裂末端彼此直接连接来修复。因此，尽管一些核酸材料可能丢失，导致缺失，但没有新的核酸材料插入该位点。在同源定向修复中，与切割的靶标DNA序列具有同源性的供体多核苷酸可用作修复切割的靶标DNA序列的模板，从而导致遗传信息从供体多核苷酸转移到靶标DNA。因此，可将新的核酸材料插入/复制到该位点。归因于NHEJ和/或同源定向修复的对靶标DNA的修饰可用于基因校正、基因替换、基因标记、转基因插入、核苷酸删除、基因破坏、基因突变等。
在一个实施方式中，基因编辑蛋白为CRISPR相关核酸酶。天然原核CRISPR相关核酸酶系统包含一系列具有恒定长度的插入可变序列的短重复(即成簇的规律间隔的短回文重复)，和CRISPR相关(“Cas”)核酸酶蛋白。转录的CRISPR阵列的RNA被Cas蛋白的子集加工成小引导RNA，其通常具有如下所述的两个组分。至少有三种不同的系统：I型、II型和III型。在这3个系统中，参与将RNA加工为成熟crRNA的酶是不同的。在天然原核系统中，引导RNA(“gRNA”)包含两种短的非编码RNA种类，称为CRISPR RNA(“crRNA”)和反式作用RNA(“tracrRNA”)。在示例性系统中，gRNA与核酸酶(例如Cas核酸酶)形成复合体。gRNA：核酸酶复合体结合具有前间隔序列邻近基序(“PAM”)和前间隔区的靶多核苷酸序列，所述前间隔区为与gRNA的一部分互补的序列。gRNA：核酸酶复合体对靶多核苷酸的识别和结合诱导靶标的切割。
任何CRISPR相关核酸酶均可用于本发明的系统和方法中。CRISPR核酸酶系统是本领域技术人员已知的，例如Cas9、Cas12、Cas12a等，参见专利/申请8,993,233；US 2015/0291965；US 2016/0175462；US 2015/0020223；US 2014/0179770、8,697,359、8,771,945、8,795,965；WO 2015/191693；US 8,889,418；WO 2015/089351；WO 2015/089486；WO 2016/028682；WO 2016/049258；WO 2016/094867；WO 2016/094872；WO 2016/094874；WO 2016/112242；US 2016/0153004；US 2015/0056705；US 2016/0090607；US 2016/0029604、8,865,406、8,871,445；通过引用的方式将其各自以其整体并入。核酸酶还可为噬菌体Cas核酸酶，例如CasΦ(例如，Pausch等，Science 369：333-7(2020)；通过引用的方式将其整体并入本文)。
全长引导核酸链可为任何长度。例如，引导核酸链的长度可为约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多个核苷酸。在本文所述的各个方面的一些实施方式中，核酸链的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸。例如，引导核酸序列长为10-30个核苷酸。
除了与靶标核酸互补的序列之外，在一些实施方式中，gNA还包含支架序列。编码与靶标核酸互补的序列和支架序列的gNA的表达具有与靶标核酸结合(杂交)以及将核酸内切酶募集到靶标核酸的双重功能，这可能引起位点特异性CRISPR活性。在一些实施方式中，此类的嵌合gNA可被称为单引导RNA(sgRNA)。
在本文所述的各个方面的一些实施方式中，使用引导设计工具(例如，BenchlingTM、Broad Institute GPPTM、CasOFFinderTM、CHOPCHOPTM、CRISPORTM、DeskgenTM、E-CRISPTM、GeneiousTM、GenHubTM、GUIDESTM(例如用于文库设计)、Horizon DiscoveryTM、IDTTM、Off-SpotterTM，以及SynthegoTM；其可在万维网上获得)来设计引导核酸。
如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可为病毒载体或非病毒载体。术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、重组载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导从与载体上的转录调控序列连接的序列表达RNA或多肽的载体。表达的序列将通常(但不一定)对细胞而言是异源的。表达载体可包含额外的元件，例如，表达载体可具有两个复制系统，因此允许其在两种生物体中维持，例如在人细胞中用于表达和在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及视情况为分泌蛋白质的细胞过程，在适用的情况下，包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以及通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接到适当的调控序列时，在体外或体内转录(DNA)为RNA的核酸序列。基因可包含也可不包含编码区之前和之后的区域(例如5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列)，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文所用，术语“病毒载体”是指包含病毒来源的至少一个元件并且具有被包装到病毒载体颗粒中的能力的核酸载体构建体。病毒载体可含有编码如本文所述的多肽的核酸来代替非必需的病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体在本领域是已知的。
“重组载体”是指包含异源核酸序列或能够在体内表达的“转基因”的载体。应当理解，在一些实施方式中，本文所述的载体可与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方式中，所述载体为游离的。使用合适的游离型载体提供了在受试者中将感兴趣的核苷酸维持在高拷贝数染色体外DNA中的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗性治疗，其目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如本文所述的病症或疾病)相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或紊乱的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，与没有治疗时的预期情况相比，“治疗”不仅包括改善症状或标志物，还包括停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、疾病程度缩减、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、缓解(无论是部分还是全部)和/或降低死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。
如本文所用，术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如医药工业中常用的载体)组合的活性剂。本文使用了短语“药学上可接受的”来指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触，而不产生过量毒性、刺激、变态反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，与合理的收益/风险比相称。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可为水以外的载体。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可为乳膏、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可为人工的或工程化的载体，例如，在自然界中不会发现活性成分存在的载体。
如本文所用，术语“给予/给药”是指通过引起在所需部位至少部分递送药剂的方法或途径将本文公开的化合物置于受试者内。可通过引起受试者中的有效治疗的任何合适的途径给予包含本文公开的化合物的药物组合物。
如本文所用，“接触”是指用于将药剂递送或暴露于至少一个细胞的任何合适的方式。示例性递送方法包括但不限于直接递送至细胞培养基、灌注、注射或本领域技术人员熟知的其它递送方法。在一些实施方式中，接触包括人体活动，例如注射；分配、混合和/或倾析的动作；和/或递送装置或机器的操作。
术语“有效量”是指足以提供与病症相关的症状的至少一些改善的组合物的量。在一个实施方式中，“有效量”是指将减少患有病症的受试者的所述病症的标志物或症状的组合物的量。
术语“统计学显著”或“显著”是指统计学显著性，并且通常是指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实施例中或另有说明的情况下，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可表示±1％。
如本文所用，术语“包括/包含/含有”用于指方法和组合物，以及其各自的组分对本发明是必要的，但可包括未指定的元件(无论必要与否)。如本文所用，术语“包括/包含/含有”是指除了呈现的定义的元件之外还可存在其他元件。使用“包括/包含/含有”表示包括而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分不包括在实施方式的描述中未列举的任何元件。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些元件。该术语允许存在不实质影响本发明的实施方式的基本和新颖或功能特征的额外元件。
如本文所用，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中，第一实体与第二靶实体结合的特异性和亲和力大于其与非靶标的第三实体的结合。在一些实施方式中，特异性结合可指第一实体与第二靶实体的亲和力为与所述第三非靶实体的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更大。对给定靶标特异的试剂是在所使用的测定条件下表现出对该靶标的特异性结合的试剂。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但合适的方法和材料在下文中予以描述。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语exempli gratia，在本文用于表示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
本文公开的本发明的替代元件或实施方式的分组不应被解释为限制。每个组成员可单独或与该组的其它成员或本文中发现的其它元件以任何组合的方式被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可将组的一个或多个成员包含在组中或从组中删除。当任何这样的包含或删除发生时，本说明书在此被认为包含修改的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非本文另有定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可见于：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，由Merck Sharp&DohmeCorp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等(编著)，TheEncyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine，由BlackwellScience Ltd.出版，1999-2012(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编著)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版，2006；Janeway's Immunobiology，Kenneth Murphy，Allan Mowat，CaseyWeaver(编著)，Taylor&Francis Limited，2014(ISBN0815345305，9780815345305)；Lewin's Genes XI，由Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；MichaelRichard Green和Joseph Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)(ISBN1936113414)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier SciencePublishing，Inc.，New York，USA(2012)(ISBN044460149X)；Laboratory Methods inEnzymology:DNA，Jon Lorsch(编著)，Elsevier，2013(ISBN 0124199542)；CurrentProtocols in Molecular Biology(CPMB)，Frederick M.Ausubel(编著)，John Wiley andSons，2014(ISBN 047150338X,9780471503385)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(编著)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及CurrentProtocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan，ADA MKruisbeek，David H Margulies，Ethan M Shevach，Warren Strobe(编著)John Wiley and Sons,Inc.，2003(ISBN0471142735，9780471142737)，通过引用的方式将其内容全部并入本文。
本领域技术人员可容易地识别使用的化疗剂(例如，参见Physicians'CancerChemotherapy Drug Manual 2014，Edward Chu，Vincent T.DeVita Jr.，Jones&BartlettLearning；Principles of Cancer Therapy，Harrison'sPrinciples of InternalMedicine，第18版，第85章，；Therapeutic Targeting of Cancers Cells:Era ofMolecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology，Chs.28-29in Abeloff'sClinical Oncology，2013Elsevier；以及Fischer D S(编著)，The Cancer ChemotherapyHandbook，第4版，St.Louis,Mosby-Year Book，2003)。
其它术语在本发明的各个方面的描述中定义。
出于描述和公开的目的，在本申请全文中引用的包括参考文献、已授权专利、已公开专利申请和共同未决专利申请在内的所有专利和其它出版物均通过引用明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的方法学可与本文描述的技术结合使用。这些出版物仅因为其公开早于本申请提交日而提供。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人没有权利借助于在前的发明或任何其它原因而将该公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述都是基于申请人可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。
本公开的实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方式和实例，但是相关领域的技术人员将认识到，在本公开的范围内可进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定顺序呈现，但替代实施方式可以以不同顺序执行功能，或者所述功能可基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可适当地应用于其它程序或方法。可组合本文描述的各种实施方式以提供进一步的实施方式。如有必要，可修改本公开的各方面，以采用上述参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开的更进一步的实施方式。此外，由于生物功能等效性的考虑，可在不影响生物或化学作用(在种类或量方面)的情况下对蛋白结构进行一些改变。可根据详细描述对本公开进行这些和其它改变。所有此类修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。
任何前述实施方式的特定元件可组合或替代其它实施方式中的元件。此外，虽然已经在这些实施方式的上下文中描述了与本公开的某些实施方式相关联的优点，但其它实施方式也可表现出这样的优点，并且并非所有实施方式都必须表现出此类优点以落入本公开的范围内。
通过以下实施例进一步说明本文描述的技术，这些实施例决不应被解释为进一步限制。
可根据以下编号的段落中的任何一个来定义本文描述的技术的一些实施方式：
1.一种包含至少一种离子液体的组合物，所述离子液体包含：
阴离子和包含季铵的阳离子，
所述阴离子为如下中的至少一种：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；
c)芳香族阴离子；和/或
d)LogP小于1.0的阴离子。
2.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；或
c)芳香族阴离子。
3.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述脂肪酸包含不多于3个碳的脂肪链。
4.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子仅包含一个羧酸基团(例如，R-COOH基团)。
5.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：
乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸、异戊酸、氢化肉桂酸、4-苯酚磺酸、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
6.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子的摩尔质量等于或大于胆碱。
7.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且至少一个R基团包含羟基基团。
8.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且只有一个R基包含羟基基团。
9.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为C1、C6或C7。
10.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1至约1:1的阳离子与阴离子的比。
11.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1的阳离子与阴离子的比。
12.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的阳离子:阴离子比小于1:1。
13.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体具有阳离子过量的阳离子:阴离子比。
14.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含与所述至少一种离子液体组合的至少一种活性化合物。
15.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括多肽。
16.如段落15所述的组合物，其中，所述多肽为抗体或抗体试剂。
17.如段落15-16中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于450。
18.如段落15-16中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于500。
19.如段落15-18中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。20.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括核酸。
21.如段落20所述的组合物，其中，所述核酸为抑制性核酸。
22.如段落21所述的组合物，其中，所述核酸为siRNA。
23.如段落20-22中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；和/或
c.芳香族阴离子。
24.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为至少0.1％w/v。
25.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约10％w/v至约70％w/v。
26.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约50％w/v。
27.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约40％w/v。
28.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
29.如段落28所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予。
30.如段落28所述的组合物，其中，所述黏膜为鼻黏膜、口腔黏膜或阴道黏膜。
31.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物以1-40mg/kg的剂量提供。
32.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种非离子表面活性剂。
33.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
34.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以可降解胶囊提供。
35.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为掺合物。
36.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以一种或多种纳米颗粒提供。
37.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物包含含有所述活性化合物的一种或多种纳米颗粒，所述纳米颗粒在包含所述离子液体的组合物的溶液或悬浮液中。
38.一种给予至少一种活性化合物的方法，所述方法包括给予段落14-37中任一项所述的组合物。
39.如段落38所述的方法，其中，将所述组合物给予一次。
40.如段落38-39中任一项所述的方法，其中，所述组合物以多剂量给予。
可根据以下编号的段落中的任一项来定义本文所述的技术的一些实施方式：
1.一种包含至少一种离子液体的组合物，所述至少一种离子液体包含：阴离子和包含季铵的阳离子，
所述阴离子为如下中的至少一种：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；
c)芳香族阴离子；和/或
d)LogP小于1.0的阴离子。
2.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；或
c)芳香族阴离子。
3.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述脂肪酸包含不多于3个碳的脂肪链。
4.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子仅包含一个羧酸基团(例如，R-COOH基团)。
5.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：
香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
6.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：
乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
7.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子的摩尔质量等于或大于胆碱。
8.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且至少一个R基团包含羟基基团。
9.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且只有一个R基团包含羟基基团。
10.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为胆碱、C1、C6或C7。
11.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为胆碱。
12.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为C1、C6或C7。
13.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1至约1:1的阳离子与阴离子的比。
14.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1的阳离子与阴离子的比。
15.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的阳离子:阴离子比小于1:1。
16.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体具有阳离子过量的阳离子:阴离子比。
17.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物包含第一离子液体和至少第二离子液体。
18.如段落17所述的组合物，其中，每种离子液体具有胆碱阳离子。
19.如段落17-18中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体和所述第二离子液体各自包含不同的阴离子。
20.如段落19所述的组合物，其中，所述第一离子液体和所述第二离子液体各自包含选自于以下的不同阴离子：
香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
21.如段落17-20中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体具有香叶酸阴离子，所述第二离子液体具有苯丙酸阴离子。
22.如段落17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)。
23.如段落17-22中任一项所述的组合物，其中，所述第二离子液体为胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
24.如段落17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体和第二离子液体为选自于由如下所组成的组中的不同离子液体：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
25.如段落17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、以及胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)；以及
第二离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和异戊酸(CAVA)、以及胆碱和苯丙酸(CAPA)。
26.如段落17-22中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)，所述第二离子液体为胆碱和苯丙酸(CAPA)。
27.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含与所述至少一种离子液体组合的至少一种活性化合物。
28.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括多肽。
29.如段落28所述的组合物，其中，所述多肽为抗体或抗体试剂。
30.如段落28-29中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于450。
31.如段落28-30中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于500。
32.如段落28-31中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。
33.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括核酸。
34.如段落33所述的组合物，其中，所述核酸为抑制性核酸。
35.如段落34所述的组合物，其中，所述核酸为siRNA。
36.如段落34-35中任一项所述的组合物，其中，所述抑制性核酸为NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸。
37.如段落33-36中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；和/或
c.芳香族阴离子。
38.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为至少0.1％w/v。
39.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约10％w/v至约70％w/v。
40.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约50％w/v。
41.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约40％w/v。
42.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
43.如段落42所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予。
44.如段落42所述的组合物，其中，所述黏膜为鼻黏膜、口腔黏膜或阴道黏膜。
45.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物以1-40mg/kg的剂量提供。
46.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种非离子表面活性剂。
47.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
48.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以可降解胶囊提供。
49.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为掺合物。
50.如前述段落中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以一种或多种纳米颗粒提供。
51.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物包含含有所述活性化合物的一种或多种纳米颗粒，所述纳米颗粒在包含所述离子液体的组合物的溶液或悬浮液中。
52.一种给予受试者至少一种活性化合物的方法，所述方法包括给予段落27-51中任一项所述的组合物。
53.如段落52所述的方法，其中，将所述组合物给予一次。
54.如段落52-53中任一项所述的方法，其中，所述组合物以多剂量给予。
55.如段落52-54中任一项所述的方法，其中，所述给予为经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
56.如段落52-55中任一项所述的方法，其中，所述组合物包含NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸，并且所述受试者需要治疗炎性病症。
57.一种在有需要的受试者中治疗炎性病症的方法，所述方法包括给予所述受试者如段落36-51中任一项所述的组合物。
58.如段落56-57中任一项所述的方法，其中，所述给予为局部给予。
59.如段落56-58中任一项所述的方法，其中，所述炎性病症为银屑病。
60.一种如段落27-51中任一项所述的组合物，所述组合物用于将至少一种活性化合物给予受试者的方法中。
61.如段落60所述的组合物，其中，将所述组合物给予一次。
62.如段落60所述的组合物，其中，所述组合物以多剂量给予。
63.如段落60-62中任一项所述的组合物，其中，所述给予为经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
64.如段落60-63中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸，并且所述受试者需要治疗炎性病症。
65.一种如段落36-51中任一项所述的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗炎性病症的方法中。
66.如段落64-65中任一项所述的组合物，其中，所述给予为局部给予。
67.如段落64-66中任一项所述的组合物，其中，所述炎性病症为银屑病。
实施例
实施例1：用于口服单克隆抗体递送的离子液体
单克隆抗体(mAb)目前用于治疗多种病症，包括癌症、银屑病、关节炎和特应性皮炎等。目前，所有mAb均通过静脉内或皮下注射给药。本文描述了使用新型离子液体胆碱和乙醇酸盐(乙醇酸)(CGLY)作为治疗性抗体的口服给药平台。CGLY保持了TNFα抗体的稳定性和结构。CGLY在体外显著增强TNFα抗体的细胞旁转运。CGLY还降低了肠粘液的粘度，这是抗体转运的另一个关键障碍。大鼠体内结果表明，CGLY有效地将TNFα抗体递送到肠黏膜和系统性循环中。一周重复剂量研究以及然后的组织学和血清生化分析表明，大鼠对CGLY具有良好的耐受。总体而言，这项工作说明了使用基于胆碱的离子液体作为口服递送平台用于局部和系统性递送治疗性抗体的好处。
治疗性单克隆抗体(mAb)是迄今为止最大的一类基于蛋白的治疗剂[1,2]。超过50种基于mAb的产品已被批准为产品，超过500种基于mAb的疗法在临床开发中[3]。抗体用于治疗多种疾病，包括癌症、感染、炎症和自身免疫性疾病[1,4]。然而，mAb以静脉输注或皮下注射剂型的形式递送，这与诸如系统性炎性反应、输注反应以及由于疼痛和针头恐惧症导致的低耐心依从性等不良反应有关[5-7]。由于其给药简单、患者可接受性高以及制造成本低，mAb口服给药相比于注射提供了潜在优势。除了提供潜在的非侵入性系统性给药方式外，口服给药还提供了一种将抗体局部递送到胃肠道的方式，用于治疗局部疾病，例如炎性肠病[8-10]。尽管如此，与所有蛋白的口服给药一样，许多胃肠障碍共同限制了蛋白药物的吸收[11,12]。这促使努力开发能够以更有效的方式实现治疗效果的口服抗体制剂。例如，正在开发针对肿瘤坏死因子(TNF)的重组抗体，用于治疗胃肠感染和炎性肠病[13-15]。使用重组部分，抗体显示出对肠蛋白酶的耐受性和抗降解的改善。此外，一种工程化的抗TNF抗体片段也表现出渗透进GI道内患病组织的改善[14]。
本文描述了研究基于胆碱的IL用于口服IgG递送的潜力。为此，制备了胆碱-乙醇酸盐(CGLY)离子液体，并就抗体稳定性、体外转运和体内摄取进行了评估。
结果
IgG-CGLY变体制剂的物理化学表征
进行初步研究以评估CGLY中的离子化学计量对与IgG抗体相容的作用。用胆碱:乙醇酸摩尔比为2:1、1:1和1:2合成了CGLY的三种变体(图1A)。以0.1mg mL-1的浓度将模型IgG抗体抗人TNF-α小鼠IgG1(克隆MAb11)溶解在稀释在盐水中的20-90％v/v的范围内的CGLY变体中。IgG抗体完全溶解在所有CGLY变体和浓度中，没有观察到沉淀。在室温下孵育1h并透析48h后，使用ELISA根据其抗原结合能力来对抗体样品进行评价(图1B)。具有CGLY2:1和CGLY1:1的IgG-CGLY制剂表明在CGLY浓度分别高达60％v/v和70％v/v时对TNF-αIgG1的固有结合能力的影响忽略不计。另一方面，从CGLY1:2分离的IgG抗体样品在20-90％v/v的浓度范围内诱导结合效率降低。
为了进一步阐明CGLY对IgG抗体的影响，进行了圆二色性(CD)和SDS-PAGE分析。由于CGLY的存在产生显著的背景CD噪声，因此在CD测量之前，将IgG-CGLY样品在室温下透析48h。与原始状态IgG相比，抗人TNF-αIgG的远UV波长光谱显示椭圆度的形状或程度没有差异(图1C)。所有CD光谱在218nm处显示最小值，这是β-折叠的典型表现，是IgG的主要二级结构[30,31]。结果表明，在暴露于CGLY变体后，IgG的结构构象得以保留。同时，SDS-PAGE还用于评估CGLY对抗人TNF-αIgG的影响，特别关注潜在的IgG聚集[32]。在不存在CGLY的情况下，模型IgG显示为单条带，分子量～150kDa(图1D)。来自所有CGLY变体组的IgG也在同一条带位置鉴定。在150kDa条带之下或之上没有出现其它条带，这表明来自具有CGLY的制剂的抗体没有可检测到的片段化或聚集[32,33]。总之，来自ELISA、CD光谱和SDS PAGE的抗体表征结果表明，CGLY2:1和CGLY1:1对构象或抗体聚集的影响最小。
CGLY对Caco-2细胞活力和IgG转运的影响
Caco-2细胞对CGLY2:1和CGLY1:1具有高度耐受性，未观察到对细胞增殖的不利影响，直到高浓度>100mM；而CGLY1:2在相当低的浓度下减弱了细胞活力(图2A)。CGLY2:1、CGLY1:1和CGLY1:2的IC50分别接近140.4mM、223.3mM和40.78mM。
使用异硫氰酸荧光素标记的(FITC)-IgG跨Caco-2单层研究CGLY增强跨上皮转运的能力。这些研究是使用30mM CGLY进行的，其远低于所有CGLY变体的IC50。在整个5h长的研究中，在所有CGLY组中，FITC-IgG转运随着时间逐渐增加，而在无CGLY对照的transwell中没有可检测的FITC-IgG转运(图2B)。具体而言，在CGLY变体中CGLY2:1在所有时间点显示出显著最高的IgG转运。在研究结束时，用CGLY2:1处理的单层中的平均IgG转运为1.70μg cm-2，比CGLY1:1(0.83μg cm-2)高2倍以上，比CGLY1:2处理的细胞(1.06μg cm-2)高1.6倍。
通过考虑来自IgG抗体-CGLY表征的结果和Caco-2细胞对CGLY的反应，CGLY2:1在所研究的CGLY变体中作为用于IgG抗体递送的最佳离子液体脱颖而出。因此，选择CGLY2:1用于以后进一步的体外和体内研究。
CGLY2:1介导的抗体跨Caco-2肠细胞转运的详细分析
CGLY2:1以浓度依赖性方式增强FITC-IgG跨Caco-2单层的跨上皮转运(图3A)。随着CGLY2:1浓度从30mM增加到80mM，转运量从1.70μgcm-2增加到9.32μg cm-2。同时，值得注意的是，在没有CGLY2:1的情况下，无法可检测的FITC-IgG的转运。这些结果与从Caco-2细胞的共聚焦图像评估的转运一致(图20)。在5h研究结束时，细胞的荧光图像清楚地表明，与对照孔相比，随着CGLY2:1浓度的增加，Caco-2细胞对FITC-IgG的摄取更高。
细胞旁和跨细胞是参与跨肠上皮转运肽和蛋白的主要途径。为了研究CGLY2:1介导的IgG跨Caco-2单层转运的机制，研究了细胞旁转运和跨细胞转运二者的作用。首先，通过细胞旁转运标志物Lucifer Yellow的转运评估细胞旁途径[34]。在用30-80mM CGLY2:1处理的细胞的所有时间点上，转运的Lucifer Yellow的量显著改善(图3B)。在30mM CGLY2:1的最低范围下，Lucifer Yellow转运增强了～2倍。在80mM CGLY2:1浓度下，Lucifer Yellow的转运在不同时间点增强了4-6倍。在平行实验中，对具有不同浓度CGLY2:1的Caco-2transwell进行跨上皮电阻(TEER)测量，以评估Caco-2单层的紧密连接完整性，并进一步验证CGLY2:1-辅助转运中的细胞旁参与情况。对于未处理的Transwell，直到24h时研究结束，TEER测量显示在15％范围内略有增加，这与先前的文献一致[23,35]。添加有30mM CGLY2:1，TEER值在1h内降低11％，在前5h保持在11％-16％减少。然而，通过CGLY2:1的TEER下降明显是短暂的，细胞在24h内恢复了96％的紧密连接完整性。通过增加CGLY2:1浓度，TEER减少的程度进一步增加。在研究的1-5h，观察到对于55mM CGLY2:1是大约34％的TEER下降，对于80mM CGLY2:1是45％下降，表明紧密连接的打开。尽管如此，CGLY2:1诱导的TEER减小仍然表现出短暂的行为，并且在24h内，对于55mM和80mM CGLY2:1，细胞分别恢复了94％和82％的初始TEER值。当细胞被30-80mM CGLY2:1处理时，TEER测量结果的下降和恢复表明，CGLY2:1可暂时打开肠紧密连接并促进IgG转运穿过肠上皮屏障。总之，随着增加的CGLY2:1的存在，Lucifer yellow转运的增加和TEER值的减小证实了CGLY2:1的细胞旁转运特征。
通过评估转胞吞作用抑制剂的影响来研究跨细胞途径对IgG转运的贡献，包括单丹磺酰戊二胺(MDC；网格蛋白介导的内吞作用的抑制剂)、菲律宾菌素(小窝(caveolar)介导的内吞作用的抑制剂)和渥曼青霉素(磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，参与微胞饮作用)[36]。与无抑制剂对照相比，24h孵育后FITC-IgG的累积转运在任何抑制剂处理的细胞之间没有显示出显著差异(图3D)。研究结果表明，由CGLY2:1引起的FITC-IgG通过Caco2 transwell的递送改善主要不是通过跨细胞转运辅助的。
CGLY2:1对粘液粘度的影响
肠粘液是肠道屏障的关键组分[12]。为了研究CGLY2:1对猪小肠粘液(PIM)的影响，评估了用CGLY2:1处理的PIM的流变学。图4A说明了PIM样品在与0-50％v/v的CGLY2:1孵育后的剪切稀化谱。与未处理的PIM相比，用CGLY2:1处理的粘液的粘度在整个测量的剪切范围内都显示出显著下降。例如，在49.87 1/s的剪切速率下，未处理的PIM的平均粘度测量为576.8cP，该值与先前报道的文献[37,38]相当(图4B)。添加12.5、25和50％v/v的CGLY2:1将粘液粘度分别显著降低至317.9cP、398.0cP和429.6cP。CGLY2:1降低粘液粘度的能力可以有助于抗体递送至肠上皮。
通过CGLY2:1的IgG的体内局部和系统性抗体递送
将配制在CGLY2:1中的FITC-IgG空肠内注射到Wistar大鼠中(1mg mL-1的FITC-IgG，处于50％v/v CGLY2:1中)。对照大鼠接受具有或不具有FITC-IgG的等量盐水注射。2h后，收获空肠组织并制备冷冻切片用于成像(图5A-图5C)，并对肠绒毛上每单位面积的FITC-IgG的荧光信号进行量化(图5D)。处理组之间肠黏膜中FITC-IgG信号存在显著差异。CGLY2:1处理组的空肠组织在肠绒毛中显示出显著的FITC-IgG信号(图5B)，与无CGLY2:1对照相比，计数的荧光信号超过4.5倍(图5D)。另一方面，对于具有处于盐水中的FITC-IgG的对照组，与阴性对照相比，绒毛上的FITC信号不显著。来自FITC-IgG的信号相当严格地位于绒毛的外部，即粘液层(图5C)，这表明单独的IgG的转运大大地受到粘液屏障影响。研究结果表明，CGLY2:1有效地增强了IgG通过肠粘液和上皮层的渗透。
在平行研究中，通过测量血浆IgG水平来确定使用CGLY2:1增强IgG吸收的优势(图5E)。在该研究中，抗人TNF-αIgG单克隆抗体用作模型抗体，并通过空肠内注射以200μg kg-1(具有或不具有CGLY2:1)给药。注射后最初2h IgG浓度逐渐升高。在研究的3-5h，从CGLY2:1处理组观察到IgG浓度显著增强。具体而言，在研究结束时，CGLY2:1处理组的IgG浓度比对照高5倍。总之，优异的局部FITC-IgG和血浆IgG浓度结果表明CGLY2:1能够使IgG通过绒毛渗透和转移到血流中。更重要的是，由于血浆中的IgG浓度通过ELISA检测，因此转运的IgG在功能上得以保留。鉴于抗体的长循环半衰期，预计重复口服给药IgG可持续增加血液浓度并达到更高的浓度。
CGLY2:1的体内毒性评价
用成年雄性Wistar大鼠评估CGLY2:1的毒性。每天口服给予CGLY2:1一次，连续7天，剂量为625mg/kg。给予盐水的大鼠用作阴性对照组。在研究期间，给予CGLY2:1的大鼠与给予盐水的大鼠相比保持相似的体重，并且所有大鼠的体重均显示出稳定增加(图6A)。两组均未观察到例如嗜睡、腹泻、驼背姿势、皮毛蓬乱的生理症状。第7天，处死大鼠，收集血液样品用于代谢组分析，从大鼠取下主要器官和胃肠(GI)组织，并用苏木精和伊红(H&E)染色。与盐水对照组相比，CGLY2:1处理组的胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)和结肠的组织切片显示出未改变的胃和肠黏膜上皮结构，包括隐窝和绒毛的大小和数量，以及黏膜厚度(图6B)。免疫细胞(例如中性粒细胞、淋巴细胞或巨噬细胞)没有浸润到黏膜中，表明没有组织炎症的迹象。主要器官H&E染色未见出血，CGLY2:1处理组与盐水对照组无差异(图21)。综合血液化学组分析显示两组之间没有显著差异(图6C)，表明CGLY2:1对大鼠的肝肾功能没有明显的不良影响。CGLY2:1的体内毒性研究显示，对大鼠体重、血液代谢组或组织病理学变化没有影响，表明CGLY2:1在大鼠模型中口服给药是安全的。
结论
合成了具有不同离子化学计量的乙醇酸胆碱IL。在CGLY变体中，胆碱与乙醇酸摩尔比为2:1的CGLY2:1表现出优异的细胞相容性、IgG完整性保护以及体外转运IgG抗体的最佳性能。对CGLY2:1的进一步研究揭示，CGLY2:1可暂时扰乱肠的紧密连接完整性，并且CGLY2:1增强的IgG跨Caco-2细胞的转运是通过细胞旁途径。CGLY2:1还能够降低粘液粘度。与阴性对照相比，CGLY2:1中的IgG的空肠内给药显著改善了大鼠肠绒毛对抗体的吸收，并使模型单克隆抗体的血浆浓度提高了5倍。此外，CGLY2:1处理对大鼠体重、GI道组织学改变或血液综合代谢组没有不良影响。总体而言，本报告证明了CGLY2:1的前景和优势，其是一种口服递送媒介，可有效提高IgG抗体的局部和系统性生物利用度，并具有出色的生物相容性。
实验部分
材料：乙醇酸、胆碱碳酸氢盐、二甲亚砜(DMSO)、来自人血清的FITC标记的免疫球蛋白G(FITC-IgG，20mg mL-1)、苏木精和伊红溶液购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。LEAFTM纯化的抗人TNF-α小鼠IgG1(克隆Mab11)、重组人TNF-α、ELISA包被缓冲液、HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(克隆poly4053)和TMB底物购自Biolegend(San Diego，CA，USA)。10mM磷酸钠缓冲液，pH＝7.4购自Boston BioProducts(Ashland，MA，USA)，0.9％无菌盐水溶液购自Teknova(Hollister，CA，USA)。Laemmli蛋白样品缓冲液、4-15％12孔预制聚丙烯酰胺凝胶、Tris/甘氨酸/SDS允许缓冲液、Mini-PROTEANTMTetra Cell电泳系统和Bio-SafeTMCoomassie染色剂购自BioRad Laboratories(Hercules，CA，USA)。Caco-2人结肠直肠腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)，而Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)含或不含酚红、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)溶液、Hank平衡盐溶液(HBSS)、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)和0.25％胰蛋白酶溶液购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)。包括基础接种培养基(BSM)、肠上皮细胞分化培养基(EDM)和MITO+血清补充剂的肠上皮生长培养基购自Corning(Corning，NY，USA)。
Figure BDA0003759457540001061
细胞培养插入物(孔径3.0μm，直径12mm)和TEER测量装置
Figure BDA0003759457540001062
获得自Millipore Sigma(Burlington，MA，USA)，而TEER测量电极获得自World Precision Instruments，Inc(Sarasota,FL,USA)。多聚甲醛(16％w/v)购自Alfa Aesar(Ward Hill，MA，USA)。具有4',6-二脒基-2-苯吲哚,二盐酸盐(DAPI)的Vectashield HardsetTM获得自Vector LaboratoryInc.(Burlingame，CA，USA)。猪小肠获得自CBSET Inc.(Lexington，MA，USA)。体重在275-300g之间的雄性Wistar大鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA，USA)。BD肝素锂涂层管购自Becton，Dickinson and Company(Franklin Lanes，NJ，USA)，Luciferyellow购自VWR(Radnor，PA，USA)。使用的所有其它试剂均为分析级。
CGLY变体的制备和抗体-CGLY的制备：CGLY变体如先前报道的那样合成[27]。简而言之，溶解在溶解所需的最少量超纯水中的乙醇酸与胆碱碳酸氢盐(80wt％溶液)以2:1、1:2和1:2的摩尔比(胆碱：乙醇酸)在40℃恒定搅拌下反应12h，直至CO2释放停止。通过在20mbar、60℃下旋转蒸发2h去除残留的水，然后在真空烘箱中在60℃下干燥48h。每种CGLY制剂通过核磁共振(NMR)光谱进行表征。
CGLY2：1-1H NMR(600MHz，D2O)3.10(s，18H，NCH3 )：3.39(m，4H，NCH2 CH2OH)；3.66(d，2H，HOCH2 OO)；3.82(m，4H，NCH2CH2 OH)
CGLY1：1-1H NMR(600MHz，DMSO)3.10(s，9H，NCH3 )；3.39(m，2H，NCH2 CH2OH)；3.66(d，2H，HOCH2OO)；3.82(m，2H，NCH2CH2 OH)
CGLY1：1-1H NMR(600MHz，DMSO)3.10(s，9H，NCH3 )；3.39(m，2H，NCH2 CH2OH)；3.66(d4H，HOCH 2OO)；3.82(m，2H，NCH2CH2 OH)
通过将预定量的抗体添加到特定体积的CGLY中，然后轻轻混合1min来制备IgG-CGLY制剂。
通过ELISA、圆二色性和SDS PAGE对CGLY变体中的抗体进行物理化学评价：为了评价CGLY变体中的抗体稳定性，将具有0.1mg mL-1抗人TNF-αIgG抗体浓度、具有或不具有CGLY2：1、CGLY1：1和CGLY1：2(20-90％v/v)的抗体-CGLY样品在室温(25℃)下孵育1小时，然后在10mM pH 7.4磷酸钠缓冲液(Boston BioProducts)中透析。48小时后，收集抗体样品，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行评估。通过ELISA测定透析的抗人TNF-αIgG抗体-CGLY样品的TNFα特异性结合能力。首先使用ELISA包被缓冲液(Polysciences，Inc.)用2μg mL-1人TNFα包被96孔ELISA板过夜。然后将孔用SuperblockTM封闭缓冲液(ThermoFisherScientific)封闭30分钟，然后添加连续稀释的透析抗人TNF-αIgG抗体样品作为一抗。孵育2小时后，将孔用含有0.05％Tween20(PBST)的PBS洗涤三次。然后将HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Biolegend)用作二抗。将板孵育1小时，然后用PBST洗涤5次。ELISA板用TMB底物(Biolegend)显色，并用Spectramax i3TM读板器在450nm处测量吸光度。
为了使用圆二色性(CD)和SDS-PAGE分析抗体稳定性，具有0.5mg mL-1抗人TNF-αIgG抗体浓度，有或没有50％v/v的CGLY2：1、CGLY1：1和CGLY1：2的抗体-CGLY样品在室温(25℃)下孵育1小时，然后在10mM pH7.4磷酸钠缓冲液(Boston BioProducts)中透析48小时。在CD测量之前，将抗体浓度调整为0.2mg mL-1。将400μL抗体样品加载到矩形石英杯(1mm路径长度，Starna Cells，1-Q-1)，用CD分光光度法(Jasco J-1500)采集远UV区(190-250nm)的CD光谱，表明蛋白二级结构。进行SDS-PAGE测定以评估抗体-CGLY样品的抗体聚集。具体而言，将所有样品调整为在Laemmli蛋白样品缓冲液中的等效抗体浓度。然后使用Mini-PROTEANTMTetra Cell电泳系统(BioRad)在Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液中的4-15％12孔预制聚丙烯酰胺凝胶上分离样品。根据制造商的方案，用Bio-SafeTMCoomassie染料(BioRad)对蛋白条带进行染色以用于观察。
Caco-2细胞培养：Caco-2细胞系(人结肠直肠腺癌，ATCC HTB-37)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在37℃、含5％CO2的潮湿环境下，维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(100UmL-1青霉和100μg mL-1链霉素)的Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)中。
CGLY的Caco-2细胞活力评价：以150,000个细胞mL-1的密度将悬浮在补充的DMEM中的Caco-2细胞接种并分配(每孔100μL)到96孔板中。每个CGLY变体(CGLY2:1、CGLY1:1和CGLY1:2)都用补充的DMEM稀释至浓度范围为1.875-480mM。从每个孔中吸出培养基，并将每种稀释液(每孔100μL)分配到6个孔中(6个细胞重复)。对照孔仅填充培养基。将细胞与不同浓度的CGLY变体在37℃、5％CO2下孵育5小时，然后用新鲜DMEM(每孔100μL)更换培养基。让细胞再生长19小时(总共24小时)。基于MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)化合物，使用Cell Titer 96AQueousTMOne Solution细胞增殖试验(Promega Corporation)评估细胞活力。简而言之，每孔加入20μL MTS试剂，轻轻混匀，37℃孵育4h。随后使用Spectramax i3读板器在490nm处读取96孔板的吸光度。通过490nm处的吸光度测量，MTS四唑向甲臜产物的转化与活细胞数量成正比。如制造商的方案中所建议，通过从所有其它实验孔中减去无细胞对照孔的平均吸光度，并假设含有未处理细胞的孔的平均吸光度代表100％，计算细胞活力的百分比。
Caco-2单层培养transwell：对于transwell中的转运实验，使用3天快速Caco-2生长系统。将细胞置于补充有MITO血清+补充剂的
Figure BDA0003759457540001081
基础接种培养基(BSM)中，并以400,000个细胞mL-1的密度接种在置于24孔板内的
Figure BDA0003759457540001091
PCF插入物上。根据制造商的建议，将500μL含有培养基的细胞置于顶端侧，而将1000μL无细胞BSM置于基底侧。在37℃、5％CO2下孵育24小时后，将培养基更换为相同体积的补充有MITO血清+补充剂的肠上皮细胞分化培养基，再孵育2-4天。定期测量TEER，当它达到200ohms.cm2以上，表明细胞之间有足够的紧密连接完整性，进行转运研究。
FITC-IgG和lucifer yellow通过Caco-2单层transwell转运：在实验之前，用HBSS洗涤Caco-2transwell两次，然后将顶端侧(400μL)和基底侧(600μL)与不含酚红、FBS和P/S的DMEM一起孵育30分钟。此后，用400μL的500μg mL-1FITC-IgG或Lucifer yellow替换顶端侧的培养基，用0、30、55或80mM CGLY制备所述FITC-IgG或Lucifer yellow，并溶解在不含酚红、FBS和P/S的DMEM中。在顶端侧加入FITC-IgG后，立即从基底侧取出150μL等分试样，并更换为等体积的新鲜DMEM。这在1、2、3、4和5小时重复。在研究过程中，将transwell板置于在以100rpm转速旋转的振荡器上的37℃、5％CO2的培养箱中，仅在上述时间段取出并移除等分试样。在5小时研究结束后，使用BioTek、Synergy Neo2TM读板器(Vermont，USA)分别在485/520nm和485/530nm激发/发射波长下测量等分试样中的FITC-IgG和Lucifer yellow浓度。从每个荧光分子的校准溶液计算每个时间点的FITC-IgG和Lucifer yellow浓度，然后将其绘制为基底室浓度与时间的关系。
对于Caco-2细胞摄取FITC-IgG的定性分析，在研究结束时，用HBSS洗涤来自FITC-IgG转运研究的transwell两次，然后加入500μL的4％多聚甲醛，并保持在4℃过夜。第二天，从孔中吸出多聚甲醛，用PBS洗涤膜两次，切下transwell膜并轻轻放置在载玻片上。将含有DAPI的封固介质添加至膜，并用盖玻片覆盖。膜的共聚焦成像(ZEISS,激光扫描共聚焦显微镜LSM 700)在40×放大倍率下拍摄。
CGLY2:1处理的Caco-2单层transwell的TEER测量：Caco-2transwell被洗涤一次，并与不含酚红、FBS和P/S的DMEM一起孵育30分钟。记录每个插入物的TEER值。此后，用400μL的0、30、55或80mM CGLY2:1替换顶端侧的培养基。在研究期间，将transwell板置于在以100rpm旋转的振荡器上的37℃、5％CO2的培养箱内，仅在1、2、3、4、5和24小时取出进行额外的TEER测量，以确定TEER恢复和紧密连接的可逆性。将TEER绘制为初始值的百分比变化与时间的关系。
与转胞吞作用抑制剂一起的FITC-IgG转运：在实验之前，用HBSS洗涤Caco-2transwell两次，然后与顶端侧(400μL)和基底侧(600μL)中不含酚红、FBS和P/S的DMEM一起孵育30分钟。此后，用400μL不含酚红、FBS和P/S的DMEM替换顶端侧中的培养基，所述DMEM中含有500μg mL-1FITC-IgG、55mM CGLY2:1，含或不含转胞吞作用抑制剂(包括50μM单丹磺酰戊二胺(MDC)、1μg mL-1菲律宾菌素和0.5μM渥曼青霉素)[36]。孵育24小时后，从基底侧取出150μL等分试样，并使用BioTek、Synergy Neo2TM读板器(Vermont,USA)在485/520nm激发/发射波长下测量等分试样中的FITC-IgG浓度，并与没有任何转胞吞作用抑制剂的对照孔相比，绘制FITC-IgG转运百分比。
粘液流变学研究：通过用小实验室刮刀轻轻刮擦洗过的黏膜表面，从猪肠中提取猪小肠粘液，尽可能避免去除上皮细胞[39]。收集猪粘液并立即进行研究。将10uL的处于0.9％盐水中的0、12.5、25和50％v/v CGLY添加到200uL猪粘液等分试样中，并使用具有40mm直径钢平行板几何结构的AR-G2流变仪(TA Instruments，New Castle，DE，USA)，在25℃下在1-100 1/s的剪切速率范围内测量粘度。
通过空肠内给药在体内局部递送抗体-CGLY：与使用动物有关的所有实验均根据哈佛大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。在研究之前，将275-300g成年雄性Wistar大鼠禁食过夜，但自由饮水。实验当天，将大鼠麻醉并注射200μL的1mg mL-1FITC标记的IgG抗体(FITC-IgG)(n＝3)，所述IgG抗体处于盐水中的50％v/v CGLY2:1中或处于盐水中。以接受不含FITC-IgG的等量盐水注射的大鼠用作阴性对照组。2小时后，处死大鼠，并使用瑞士滚动技术收集和保存空肠组织[40]。然后将卷起的组织在4℃下在4％多聚甲醛中固定12小时，转移到4℃的4.5％蔗糖中4小时，最后转移到4℃的20％蔗糖中12小时[41]。然后将组织在存在最佳切割温度(OCT)化合物的情况下在-80℃下冷冻，并将组织切片切成25μm厚。使用载玻片扫描显微镜(ZEISS Axio Scan.Z1)进行可视化，并使用ZenTM(Blueedition)软件处理图像。
通过空肠内给药体内系统性递送抗体-CGLY：该研究是对禁食过夜但自由饮水的成年雄性Wistar大鼠进行的。在研究开始前，对大鼠进行麻醉，剪下腹部毛发，并使用必妥碘和70％乙醇准备手术区域。在腹部做切口以暴露肠，并且将测试制剂注射到空肠中。在肠暴露后即在注射前即刻取零时间点的血液。每组6只大鼠注射200μg kg-1的0.3mg mL-1抗人TNF-αIgG抗体，所述抗人TNF-αIgG抗体处于盐水中的50％v/vCGLY2:1中或处于单独的盐水中。此后，将肠切片放回腹部并缝合肌肉和皮肤。通过在手术前将动物放在温度受控的加热垫上，然后在手术后额外盖上毛巾，可防止麻醉期间动物体温下降。动物在整个研究过程中保持麻醉，5小时后实施安乐死。通过在0、0.5、1、1.5、2、3和5小时从处理过的大鼠收集约250μL血液在肝素涂层管中来评价血浆中的抗人TNF-αIgG浓度。遵循标准方案从全血中分离血浆。将血液样品以2,000×g离心15分钟。血浆上清液立即转移到干净的试管中，在操作过程中储存在冰中，随后在-20℃下储存，直到进一步分析IgG含量。如前所述通过ELISA进行每个时间点血浆样品中抗人TNF-αIgG浓度的评价，并由抗人TNF-αIgG的校准溶液进行计算。
体内毒性研究：为了评价CGLY2:1在体内的急性毒性，使用上述程序，以625mg/kg的剂量每天一次口服给予成年雄性Wistar大鼠(n＝6，每只275-300g)处于盐水中的50％v/vCGLY2:1，连续7天。对照大鼠给予等量的盐水剂量。在实验期间，每天监测大鼠体重。第7天处死大鼠，采集血样进行综合代谢组分析，处理主要器官和胃肠组织进行组织学检查。将心脏、肝、脾、肺、肾和胃肠(胃、小肠和结肠)组织在中性缓冲的10％v/v福尔马林中固定18小时，在70％乙醇中脱水，然后包埋在石蜡中。将组织切片切成5μm厚，脱蜡、再水化，并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用明场载玻片扫描显微镜(ZEISS Axio Scan.Z1TM)对组织形态进行可视化，并使用ZenTM(Blue edition)软件处理图像。
统计分析：所有数据均表示为平均值±标准差。对于SDS PAGE研究，实验一式三份进行，并示出了代表性图像。在荧光和明场成像中，实验一式三份进行，并示出了代表性图像。所有其它实验至少一式三份进行。为了检查统计学显著性，在GraphPad Prism 8TM中进行了非配对双尾t检验，置信水平P＝0.05被认为是显著的。
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实施例2
测试多种IL以确定它们促进功能性抗体稳定性的程度(图8-图10)。作为一般趋势，小的阴离子比较大的阴离子更能与抗体相容。用不同的个体抗体保持性能(图14)。
还测试了口服或通过空肠内给药的抗体递送(图11-图13)。经证实，当口服给药时，IL没有毒性(图15-图16)。
还考虑了用于siRNA递送的IL，并测试了siRNA的透皮(图17-图18)。
实施例3
靶向肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-17A(IL-17A)的系统性抗体对斑块型银屑病有效。尽管它们很受欢迎，但安全问题对系统性生物制剂构成了挑战。虽然抗TNF-α和抗IL-17A抗体有效抑制各自的蛋白，但发明人假设基于上游靶标(如NFKBIZ)的局部沉默的方法将有利于治疗银屑病。然而，由于皮肤的屏障功能和siRNA的稳定性差，将小干扰RNA(siRNA)有效递送到皮肤中是一个重大障碍。使用离子液体作为使能技术，本文描述了将NFKBIZ siRNA有效递送到皮肤中及其在银屑病模型中的治疗功效。用IL-siRNA治疗可抑制异常基因表达，并导致包括TNF-α和IL-17A在内的银屑病相关信号下调。这些结果为siRNA的局部递送平台提供了框架。
引言
银屑病是影响全世界超过1.25亿人的最严重的慢性皮肤病之一，在美国估计经济负担为1350亿美元/年(1)。其发病机制和潜在机制仍不完全清楚。核因子κB(NF-κB)是一种普遍表达的转录因子，被认为是免疫反应的主要调节因子，并与包括银屑病在内的多种自身免疫性炎性疾病有关(2)。临床上有几种针对NF-κB信号传导通路的治疗方法；然而，对缺乏特异性和副作用的担忧构成了挑战(3)。这尤其具有挑战性，因为对NF-κB等多效性蛋白的系统性抑制可能会导致严重的副作用，因为它们提供了作为生存因子的基本基础活性。涉及通路特异性抑制剂的以网络为中心的方法已获得相当大的治疗兴趣(4)。在这方面，英夫利昔单抗和阿达木单抗[均为抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体]以及苏金单抗[一种抗白介素-17A(IL-17A)抗体]已获得美国食品和药物管理局的批准，并声称通过调节NF-κB活性来介导其治疗效果(5)。
NFKBIZ是一种编码核因子κB(IκB)蛋白的非典型抑制剂IκBζ的基因，由于其在调节NF-κB复合体中的关键作用而引起了治疗干预的兴趣(6，7)。据报道，它是TNF-α、IL-17A和IL-36诱导型银屑病相关基因产物的直接转录激活剂，这些基因产物参与炎性信号传导、中性粒细胞趋化性和白细胞活化(8-11)。此外，银屑病患者中NFKBIZ的强表达可能与升高的IL-36和IL-17A型反应相关(12)。NFKBIZ的局部沉默可能是有利的，因为与单一抗体相比，它可潜在地扩大可从治疗中受益的患者群体。
通过局部应用小干扰RNA(siRNA)使NFKBIZ沉默提供了一种具有最小副作用的非侵入性和自我给药的治疗选择(13)。然而，该途径的最大挑战是只有有限数量的低分子量(多至几百道尔顿)和高辛醇-水分配系数的药物可用于成功的局部给药(14)。由于其高分子量，亲水分子(尤其是抗体和核酸等大分子)的透皮和局部递送仍然具有挑战性(15)。一些报告展示了使用球形核酸(16)和自组装框架核酸(17)等技术进行局部siRNA递送。微针也已被探索用于siRNA的局部递送(18)。还探索了诸如电穿孔(19)和肽载体等方法(20-22)。还开发了策略来传递siRNA以治疗皮肤创伤(23，24)。
本文描述了一种模块化的基于IL的siRNA递送方法，用于沉默各种感兴趣的基因。具体而言，本文描述了在局部给药后同时稳定siRNA并增强siRNA渗透到皮肤中的IL组合。在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中证明了该制剂在体内沉默NFKBIZ方面的功效。
结果
IL筛选。设计和合成了IL文库以评估siRNA向皮肤中的传递。由于其生物相容性，胆碱在所有IL中用作阳离子。几种不同的阴离子用于合成IL(图24A-图24E)。香叶酸用作IL文库中的参比阴离子[即胆碱和香叶酸(CAGE)作为参比IL]。选择其它阴离子有几个原因。首先，与香叶酸相比，选择含有较短线性碳链的阴离子来评估链长对siRNA稳定性和递送的影响。选择具有芳香族基团的阴离子，因为它们可能通过静电、疏水和极性相互作用与堆叠的RNA碱基对相互作用。所有IL均以1:2(阳离子:阴离子)的化学计量比制备，并评估了稳定性和siRNA递送。在合成的IL中，CAGE、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、以及胆碱和苯丙酸(CAPA)在室温(RT)下仍为粘性液体，而胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)以及胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)固化或形成凝胶(图24A-图24E)。可在图24A-图24E中找到代表性的1H核磁共振(NMR)光谱，证实了IL的成功合成和纯度。此外，由于白介素和IL都被表示为“IL”，为了清楚起见，所有白介素在整个手稿中都以数值表示。
IL对siRNA稳定性的影响。评估了IL对siRNA稳定性的影响。用50％(v/v)浓度的个体IL水性溶液孵育siRNA的圆二色性(CD)显示，在存在CAGE、CADA和CABA的情况下，α螺旋骨架有显著变化(由210nm处的负带予以证实)。另一方面，CAVA和CAPA保留了siRNA的二级结构(图19A)。从天然凝胶电泳获得的条带与CD结果相辅相成(图19B)。在CAPA存在下siRNA的稳定性提高表明，由两种结构不同的阴离子制备的IL之间可能存在协同效应。因此，评估了IL混合物对siRNA稳定性的影响，以确定CAPA与siRNA的相容性是否可提供额外的保护，防止CAGE和CABA对siRNA结构的不利影响。CAGE(25％v/v)和CAPA(25％v/v)的组合导致显著条带，表明siRNA结构的保留(图24A-图24E)。
筛选用于siRNA递送的最佳IL组合。然后在franz扩散池(FDC)中关于Cy5标记的siRNA表皮渗透到猪皮肤，对个体IL和它们的组合进行评估(图19C)。在对照中观察到裸siRNA的一些表皮摄取。CAGE在所有测试的IL中表现出最高的递送(图19D)。在存在CAGE(50％v/v)的情况下，约0.20nmol/cm2的siRNA被递送到表皮，相比而言在裸siRNA的情况下为0.07nmol/cm2。由于50％CAGE对siRNA结构具有潜在影响，因此还测量了IL组合将siRNA递送到皮肤中的能力。CAPA和CAGE(各25％v/v)的组合导致～0.4nmol/cm2 siRNA递送进入皮肤(图19E)。因为CAGE+CAPA组合产生最高的表皮递送以及高稳定性，所以选择它作为进一步研究的主要配方(图25A-图25D)。
IL-诱导的对RNA的嵌入和溶剂化作用。进行分子动力学(MD)模拟以探索IL组合(CAGE+CAPA)稳定RNA的机制。从
Figure BDA0003759457540001171
RNA内的单胞的快照可明显看出，CAGE中的香叶酸负责形成聚集的团块，导致香叶酸与胆碱、水和RNA分子分离(图20A-图20B)。向CAGE添加苯丙酸导致IL溶液中三种分子种类/离子的分布更加一致(图20C-图20D)。此外，苯丙酸分子与RNA分子接近，可能是由于存在疏水性芳香环，不像其脂肪族对应物(香叶酸)，证实了它在插入堆叠的RNA碱基对之间的关键作用，有助于RNA溶剂化和稳定性。
通过在500ns的过程中进行模拟并测量均方根偏差(RMSD)和回转半径(RGYR)来评估RNA的结构特性。CAGE组获得的RGYR在150ns前保持一致，并在靠近模拟结束时开始下降，表明系统的紧密性不一致(图20E)。相比之下，当IL组合(CAGE+CAPA)超过500ns时，获得的RGYR增加且一致，这与改善的IL-RNA相互作用结果相吻合。优化的IL系统与RNA的这种改进的相互作用和紧密性也可归因于向CAGE添加苯丙酸后相对分子迁移率的增加或局部粘度的降低。此外，IL系统的较低粘度可能会削弱IL对RNA施加的分子内应变，这是在CAGE+CAPA的情况下观察到的RMSD降低的可能解释(图20F)。
IL介导的脂质膜动力学调节。为了评估IL在脂质双层中的插入和易位，在IL存在下进行脂质双层的模拟(图21A-图21C)。除了提高RNA的稳定性和溶剂化外，导致聚集体形成的离子物质的紧密堆积似乎增强了IL-脂质膜的相互作用。由个体离子部分形成的聚集体似乎使IL系统和分子之间的连续性成为可能，从而构成脂质双层。除了IL之外，离子聚集体的集体质量可能在促进膜渗透方面发挥关键作用，特别是如先前报道的，香叶酸提取或流化脂质的能力(26)。
通过在350ns的模拟时间内测量存在IL时脂质双层的平均厚度来评估包括CAGE、CAPA和CAGE+CAPA在内的IL对膜动力学的相对影响。在存在CAGE(50％v/v)的情况下观察到最高厚度，表明脂质双层内有更大的IL嵌入。注意到水和CAPA(50％v/v)组的类似厚度，而具有CAPA(25％v/v)的CAGE(25％v/v)导致更高的厚度(图21D)。MD模拟快照突出了IL中个体离子物质与磷脂膜相互作用的动力学。检测到IL结合的离子物质与双层的最终嵌入(图21B)。此外，在CAGE+CAPA模拟中可视化个体离子物质的轨迹后，观察到香叶酸相对于苯丙酸的迁移率降低(图26A-图26B)。当关注由所有三种IL物质(胆碱、香叶酸和苯丙酸)组成的IL聚集体时，观察到每个香叶酸分子在模拟过程中倾向于保持与聚集体接触，而胆碱和苯丙酸能够在非均相物质的聚集体和构成系统其余部分的主体溶剂之间移动。这种流动性的增加可能导致整个系统的局部粘度分布的变化。当可视化与聚集体接触的脂质头部基团时，观察到头部基团占据每个脂质的较大面积。这可通过IL聚集体区域内个体分子轨迹的更“分散”分布来证明。脂质之间空间的这种扩张是由IL与膜的嵌入以及随后脂质种类的位移引起的。由于聚集导致IL对双层膜的影响局部化，因此与主体溶剂的成分周转率低的聚集可能会导致不均匀的膜破坏以及局部粘度的差异。当与其它IL系统相比时，这种膜破坏的不均匀分布可能解释了在CAGE模拟过程中看到的每个脂质值的面积分布广泛(图21E)。总体而言，这些结果表明IL的总周转在跨脂质双层转运RNA中的贡献。
IL在小鼠中的生物相容性。评价了优化的CAGE+CAPA IL配方在小鼠体内的毒性。将IL-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA制剂(25μl)连续四天局部应用于SKH-1elite(SKH-1E)无毛小鼠的背部皮肤(图22A)。对于IL处理的动物，没有观察到炎症、发红和/或刺激的迹象(图27A-图27D)。进一步收获皮肤组织，切片并染色组织病理学和毒理学标志物。用IL制剂处理的组没有表现出表皮增厚和角质形成细胞过度增殖的迹象，并且与未处理和/或裸siRNA处理的动物相当(图22B和图27A-图27D)。还在健康小鼠中测试了TNF-α基因表达水平。用裸siRNA处理的动物在统计学上等同于未处理的动物。与未处理组相比，用IL-GAPDH siRNA和IL-siCon(用于后续实验的对照siRNA)处理的小鼠表现出稍低的TNF-αmRNA转录物(图27A-图27D)。
在健康小鼠中的IL-siRNA渗透和GAPDH沉默。在连续四天透皮应用后，在健康小鼠中测量表皮内的Cy5荧光。共聚焦图像显示，与小鼠中的裸siRNA相比，IL处理组的表皮中Cy5荧光显著增加(图22C)。在使用定量聚合酶链式反应(qPCR)确定GAPDH基因沉默效率后，发现与裸siRNA和未处理的小鼠相比，IL-siRNA处理组的GAPDH表达水平分别降低了4.5倍和8.6倍(图22D)。也观察到裸siRNA处理组的GAPDH mRNA表达略有下降。相继地，有必要确定GAPDH mRNA表达的变化是否转化为蛋白减少。与基因敲低结果一致，与所有其它处理组相比，IL-siRNA处理组的GAPDH蛋白表达显示出统计学上显著的衰减(～2倍)(图22E)。裸siRNA处理组的GAPDH mRNA表达降低并没有下调GAPDH蛋白表达。
皮肤中的局部NFKBIZ沉默抑制咪喹莫特诱导的银屑病。使用CAGE+CAPA作为局部制剂测试了NFKBIZ siRNA治疗银屑病的能力。在诱导银屑病和局部应用IL-NFKBIZ siRNA制剂(图23A)之后，收获皮肤组织并分析。宏观上，与未处理、IL处理和IL-siCon处理组相比，背部皮肤中NFKBIZ的局部敲低显著减少了咪喹莫特诱导的炎症，显示应用IL-NFKBIZsiRNA区域的红斑和鳞屑减少(图23B和图28A-图28D)。来自小鼠的皮肤切片的苏木精和伊红(H&E)染色显示通过IL-siRNA敲低NFKBIZ减少了表皮增厚、棘层肥厚、角化过度和棒状网脊(图23C和图28A-图28D)。同样，免疫组织化学(IHC)分析显示未处理、IL处理和IL-siCon处理组中角质形成细胞过度增殖，而用IL-NFKBIZ siRNA处理的组表现出缺乏角质形成细胞增殖(Ki67染色)(图23D和图28A-图28D)。在整个诱导/应用期间每天对咪喹莫特诱导的皮肤炎症(红斑和鳞屑)的共同特征进行评分。从第3天开始，通过局部IL-siRNA应用，红斑和鳞屑的个体评分显示合理降低(图23E-图23F)。未处理组和IL处理组获得了最大累积分数，并且在IL-siRNA处理组中显著下跌(图29A-图29C)。用于测量皮肤厚度的双皮褶厚度(DSFT)在组之间没有产生重大差异(图29A-图29C)。此外，热图和mRNA分析表明，与未处理组和IL-siCon处理组相比，NFKBIZ和其它银屑病相关基因产物的表达显著降低(图23G-图23J和图30A-图30J)。在IL-siCon处理后，大多数基因上调，包括NFKBIZ、TNF-α、细胞因子(IL-17C、IL-19、IL-22、IL-36A和IL-36G)、趋化因子(CCL20)和抗菌蛋白(LCN2和DEFB4)(图23G)。在仅用IL处理后，在健康小鼠中观察到TNF-α和IL-17A mRNA表达的一些下调(图23I-图23J)。
讨论
对关键炎症信号通路调节剂和潜在机制的时间顺序的有限理解在银屑病的治疗中提出了挑战。最近发现包括NF-κB、Janus激酶(JAK)/信号传导和转录激活因子(STAT)和p38丝裂原活化蛋白激酶在内的信号传导通路在这种复杂疾病的发病机制中起主要作用(31)。NFKBIZ是一种编码IκBζ的基因，是一种重要的转录共激活因子，可介导一系列特定炎性细胞因子的下游效应，鉴于Johansen等(6)和Müller等的最新发现，这一点尤为重要，这表明IκBζ是IL-17A、IL-23和IL-36的关键调节剂(32)。因此，靶向NFKBIZ/IκBζ抑制促炎信号传导通路和银屑病相关基因产物的产生是银屑病治疗的可行策略。临床上，靶向TNF-α和IL-17A的抗体已显示出有望满足主要终点和改善疾病状况(33)。然而，作为生物制剂，这些抗体具有潜在的系统性毒性、产生抗抗体和高成本的挑战。
本文描述了能够改善表皮积累和通过皮肤递送RNA的IL组合。发明人假设IL的组合将稳定siRNA，同时提高其渗透性。这一假设在类似于人类斑块型银屑病的咪喹莫特诱导的银屑病样皮肤炎症模型中得到验证。连续四天局部应用IL-siRNA产生炎性细胞因子和一系列银屑病相关基因产物的水平的显著降低。
CAGE+CAPA IL制剂提供了优于其它透皮药物递送系统的几个优点。IL制剂的组分、胆碱碳酸氢盐、香叶酸和苯丙酸已被证明是安全的或GRAS(通常被认为是安全的)化学品，并为IL的安全性提供了坚实的基础。此外，与其它挥发性有机溶剂相比，简单的合成和放大工艺、高溶剂化能力和可调节性提供了额外的优势。由于其在堆叠的RNA碱基对和IL的芳香环之间的复杂嵌入，以及与脂质双层的增强相互作用，该系统特别适用于核酸的透皮递送。
这些结果表明IL可与核酸复合而不损害生物活性，因此使它们成为透皮药物递送的理想选择。用于IL合成的盐复分解或阴离子交换反应特别有利，因为它不需要整合苛刻的有机溶剂来用于siRNA递送。基于相互作用的分子机制和结合特性，可调节个体IL组分以与几乎任何核酸相互作用。
可调离子化学计量和物理化学性质是基于IL的系统的其它关键特征。先前的工作已经表明了离子间相互作用在活性成分溶解和分配到皮肤中的作用(34)。此外，Chandran等(35)已经证明了静电相互作用和IL的凹槽结合关联在DNA稳定性中的重要性。迄今为止，IL在提高siRNA稳定性和溶剂化方面的作用尚未得到全面探索。本文介绍的工作系统地改变了IL的阴离子组分，其结构与香叶酸相似和/或含有化学计量比为1:2的芳环，并开发了基于胆碱的IL库。据观察，除苯丙酸外，含有芳环的IL的阴离子通常在RT下固化或形成凝胶。与其它IL和组合相比，在CAVA、CAPA和CAGE+CAPA存在下观察到了出色的siRNA稳定性，这可能是由于与siRNA的出色相互作用。IL组合CAGE+CAPA产生最高的siRNA表皮积累，明显高于任何个体IL和/或组合。
本研究中确定的最佳执行IL组合CAGE+CAPA通过MD模拟证明了三种离子物质的一致分布，表明改进的分子迁移率和较低的粘度有助于溶剂化效果增强。此外，MD模拟快照显示苯丙酸与RNA分子密切相关，这可能归因于疏水和极性相互作用、π-π堆积和/或堆积的RNA碱基对之间的插入的组合，从而增强了RNA稳定性。从500ns过程的模拟中获得的RGYR和RMSD测量结果进一步证实了IL-RNA相互作用的改善。
了解IL介导的脂质双层调节的幅度也很重要。MD模拟揭示了离子物质聚集在提高膜渗透性方面的关键作用，CAGE(50％v/v)获得的双层厚度最高，其次是CAGE+CAPA。来自模拟的这些观察结果进一步确立了香叶酸作为IL组合通过脂质双层易位的主要驱动力，这与实验结果一致。虽然苯丙酸似乎通过降低整个IL系统的局部粘度而在改善双层渗透方面的作用很小，但这些结果也表明它还负责使膜流化并形成动态孔。早先有报道称，去质子化的芳香族羧酸(如苯丙酸)渗透双层比pH分配假设所预期的快几个数量级，并且它们的渗透完全由生理pH下的阴离子控制(36)。预期这些IL有助于跨越细胞屏障以将siRNA递送到细胞溶质区室中。
为了评估CAGE+CAPA的生物相容性，在第五天进行皮肤的组织学评估，这与局部应用的总持续时间一致。在IL处理组中未观察到皮肤结构、表皮增厚和角质形成细胞增殖的宏观变化。与未处理组相比，对炎性细胞因子水平的进一步研究未发现TNF-αmRNA有任何统计学上显著的增加。一些IL处理组表现出TNF-αmRNA水平的降低，这可能是由于IL的存在。在IL-GAPDH siRNA处理组中观察到GAPDH mRNA和蛋白表达的显著抑制。
NFKBIZ先前已被证明在负责银屑病发病机制的几种促炎细胞因子和抗微生物肽的基因转录中起关键作用(6,12)。使用咪喹莫特诱导的银屑病模型，证明了局部应用IL-NFKBIZ siRNA制剂后NFKBIZ的局部沉默损害了体内条件下银屑病相关基因产物的表达。IL-siRNA处理的小鼠表现出显著减少的皮肤病理学，包括减少的红斑和鳞屑、较少的表皮增厚和角质形成细胞增殖。与未处理组相比，IL-siCon和IL处理组的一些炎性细胞因子和相关基因产物的mRNA水平局部增加可归因于咪喹莫特。NFKBIZ的局部沉默导致对关键促炎细胞因子(包括IL-17A、IL-23和IL-36)mRNA水平的强烈抑制。局部NFKBIZ沉默的下游效应也得到了验证，并且与先前报道的皮内注射IκBζsiRNA的效应一致(6)。由于小鼠皮肤的渗透性通常比人类皮肤高得多，因此未在体内进行皮肤渗透定量的详细研究。
总之，本文提供了能够将RNA递送至表皮的透皮IL平台。该平台与一系列基因筛选相结合，以支持NFKBIZ作为银屑病治疗中的关键信号传导靶基因。IL制剂保留了siRNA的生物活性，并在咪喹莫特诱导的银屑病样皮肤炎症模型中局部应用后产生显著的靶基因消除。优化后的IL配方没有表现出毒性，重复应用是可接受的。该平台适用于核酸的广泛应用，并且可轻松制造和扩大规模。该平台可增强经皮药物递送以用于治疗皮肤病学病症的能力，并通过靶向此类常见介质来帮助提高长期治疗效果。
材料和方法
皮肤穿透性IL-RNA复合体。如前所述合成基于胆碱的IL文库(26)。简而言之，将阳离子、胆碱碳酸氢盐和各种阴离子以1:2的比例混合，在盐复分解反应后制备IL。根据溶解度，将阴离子溶解在最小体积的超纯水或乙醇/甲醇中，并在40℃下与胆碱碳酸氢盐反应24小时。使用旋转蒸发器在20mbar和60℃下将所得的IL溶液干燥2小时。在真空烘箱中在60℃下去除残留的水48小时。在安捷伦DD2600-MHz光谱仪(补充材料和方法)上，用二甲基亚砜(DMSO)-d6通过NMR对RT下为粘性的IL进行表征。将IL与RNA(100μM)以1:1的体积比混合，并在RT下孵育30分钟。使用透析盒(10,000截留分子量，Invitrogen)将RNA-IL溶液(1ml)针对10mM磷酸钠缓冲液透析72小时。使用NanoDrop仪器(Thermo Fisher Scientific)确认和标准化RNA的浓度。使用CD和凝胶电泳确定IL溶液中RNA的稳定性。
MD模拟研究。使用OpenMM MD包和AMBER力场ff14SB和GAFF进行MD模拟。从PubChem下载每个IL种类的三维SD文件，并在使用LEaP准备模拟输入拓扑之前使用Antechamber进行参数化。为了生成脂质膜模拟的起始坐标，PACKMOL用于为每个小叶构建一个由100个磷脂酰胆碱(POPC)分子组成的双层。
Figure BDA0003759457540001241
立方体的剩余内容物由～1:1的水(TIP3P)和IL组成，与Na+和Cl-电荷平衡。在周期性边界条件下对每个系统进行了500ns的模拟。对于siRNA的模拟，用Avogadro(37)生成核酸的螺旋起始结构，然后将其放入由～1:1水和IL组成的模拟盒中，在周期性边界条件下模拟350ns。MD轨迹的分析使用Python库MD Analysis关于siRNA的RMSD和RGYR来进行。视觉分子动力学(38)插件MEMBPLUGIN(39)用于执行膜轨迹分析。
皮肤渗透研究。如前所述，使用FDC中的猪皮肤进行皮肤渗透研究(40)。将总体积为20μl处于IL溶液中的Cy5标记的RNA(50μM)施加到猪皮肤表面，并在中等搅拌的封闭条件下在40℃下孵育24小时。分别使用共聚焦显微镜和胶带剥离技术对RNA的皮肤渗透性进行可视化和量化。
动物研究。所有动物研究均在Harvard John A.Paulson School of Engineeringand Applied Sciences,Harvard University进行。进行的程序和研究得到InstitutionalAnimal Care and Use Committee of the Faculty of Arts and Sciences,HarvardUniversity的批准，并符合所有适用法规。携带GAPDH(定制siRNA，有义seq：5'-GUGUGAACCACGAGAAAUAUU-3'(SEQ ID NO：5)，反义seq：5'-AAUAUUUCUCGUGGUUCACAC-3'(SEQID NO：6)；Dharmacon)、siCon(目录号D-001810-02-50；Dharmacon)和NFKBIZ siRNA(目录号J-040680-06-0050；Dharmacon)的IL分别局部应用于健康和咪喹莫特处理的SKH-1E无毛小鼠(Charles River)。使用类似于人银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分的盲评分系统来测量小鼠背部的严重程度、红斑和鳞屑。此外，在整个疾病诱导和处理期间，通过卡尺测量小鼠背部皮肤的DSFT来监测皮肤厚度。
mRNA转录物的定量。将快速冷冻的皮肤组织粉碎形成粉末并在QIAzol LysisReagent中均质化以制备用于qPCR的组织裂解物。按照制造商的方案对mRNA水平进行量化和归一化。将处理组中mRNA转录物的相对丰度以及沉默归一化至管家基因(β-肌动蛋白)。然后用它们的SEM绘制平均归一化siRNA处理值。
统计分析。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.)进行单因素方差分析(ANOVA)和统计分析。结果被描述为平均值±SEM。双尾学生t检验用于两组之间的比较。通过单因素ANOVA来分析参数数据，然后用Tukey诚实显著性差异(HSD)事后检验。对非参数数据进行了Kruskal-Wallis检验。统计检验显示在图中。P<0.05被认为具有统计学显著性。
圆二色性。在哈佛医学院大分子相互作用中心(CMI)，在配备有PFD-425S热控制器单元的Jasco J-815分光偏振计中，使用1cm路径石英杯(Hellma 100-10-40，样式100-QS)在15℃下记录透析RNA样品的圆二色性测量结果。对在10mM磷酸钠缓冲液中的RNA浓度进行归一化，并在RT下孵育30分钟以确保还原和平衡，然后装入石英比色皿。通过对每个样品以0.1nm间隔平均进行5次扫描，在20℃下记录200nm至310nm的近UV光谱。Spectrum Manager2用于减去基线，并将光谱绘制为摩尔椭圆度，[θ](deg·cm2·dmol-1)。
核磁共振。在Harvard CCB Laukien-Purcell Instrumentation Center,Magnetic Resonance Laboratory中，所有NMR实验均在0-50℃下在配备有5mm反三共振纳米探针的Agilent DD2-600NMR上进行，该探针具有1200(H)、100(C)、2000(H)灵敏度。通过将干燥的IL放入包含填充有DMSO-d6的同轴插入物的NMR管中，通过1H NMR表征每种IL制剂。使用Mnova qNMR v1.0处理和分析NMR数据。
凝胶电泳。为了确定RNA在IL溶液中的稳定性，在1％琼脂糖凝胶(含有0.01％v/v10,000×GelRed Nucleic Acid Stain，在1×TBE中)中分离透析的RNA样品。通过溶解在1×TBE中制备琼脂糖溶液，并在微波中在60℃加热10分钟直至完全溶解。将琼脂糖溶液倒入浇铸台中，放置10孔梳子以产生1.5毫米深的孔。使熔化的琼脂糖在RT下冷却30分钟以进行聚合。用1×TBE缓冲溶液将腔室填充到凝胶表面上方1.5cm的高度。将RNA样品与琼脂糖凝胶上样染料(6×)预混合，然后将2μL样品从左到右装入孔中。一旦所有孔被填满，电源就被激活，以避免染料最初扩散到凝胶中。样品在100V下运行40分钟，并在哈佛大学Bauer CoreFacility使用带有cSeries Capture软件的Azure c300(Azure Biosystems)进行成像。
离体猪皮肤渗透研究。猪皮肤研究在渗透面积为1.77cm2的Franz扩散池(FDC)中进行。猪皮购自Lampire Biological Laboratories,Pipersville,PA,USA。简要地解冻皮肤，修剪毛发，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)洗涤。使用36mm的冲头切出一个皮肤圆盘，并使用手术刀去除结缔组织和皮下脂肪层。将皮肤(大约0.5毫米厚)放置在扩散池上，角质层(SC)朝上。池的接收组件充满PBS(～12mL)，并配备磁力搅拌棒。将1mL PBS添加到供体室中，并使用波形发生器(Agilent 33120)和电压表(Fluke 87True RMS Multimeter)在100Hz的频率和100mV的振幅下测量电导率。仅使用测得的经表皮电导率小于10μA的皮肤样本进行进一步研究。将池置于37℃的烘箱中进行温热。在将20μL Cy5标记的siRNA-IL(siRNA50μM)溶液涂在皮肤上以确保完全覆盖之前，将供体区室放置5分钟。池的供体室和侧臂分别用封口膜/箔和eppendorf密封以减少蒸发，并在搅拌板上于37℃孵育24小时。孵育后，将皮肤从池中取出，用PBS轻轻洗涤，并使用胶带剥离和共聚焦显微镜进行进一步分析。
冷冻切片。在从池中取出皮肤并在PBS中洗涤后，使用合适的组织模具在OCT(Sakura Finetek，USA)中将皮肤组织快速冷冻(直径达2.0cm)。使用Leica CryostatCM1850(Leica，Buffalo Grove，IL)在-20℃下切割对应于应用区域的皮肤薄切片(15-20μm)。通过将载玻片与切片接触，将切下的切片立即转移到玻璃载玻片上(保持在RT)并进一步分析。
共焦显微术。在低温恒温器中切片后，用盖玻片覆盖皮肤切片。显微术在配备有Zeiss Axio Imager Z2显微镜和Colibri FL照明以及CoolSnapnHQ2相机的Zeiss 710共聚焦系统上进行。切片用40×空气1.2数值孔径物镜和633nm的Ar激光对红色荧光Cy5进行成像。使用基于java的图像处理程序ImageJ/FIJI处理图像。关于对照和测试样品，所有图像采集和处理均在相同条件下进行。
胶带剥离。从池中去除皮肤，并在PBS中洗涤后，使用粘合胶带从表皮剥离SC至多十层(SC1、SC2-5、SC6-10)。在SC去除后，使用外科无菌手术刀将表皮与真皮分离，并通过用4mm冲压三次来去除三分之一的真皮(按面积)。将每一层分别收集在含有1mL PBS/甲醇(1:1)混合物的玻璃小瓶中，并放置摇晃过夜以从皮肤层中提取Cy5-siRNA，使用读板器(TecanSafire，AG，瑞士)在96孔板上进行进一步分析，激发波长为633nm，发射波长为665nm。
小鼠和处理。雌性SKH-1E无毛小鼠(6-8周龄)购自Charles River Laboratories(MA，USA)。将动物保持在受控温度(24-26℃)、每天12:12小时的光照/黑暗循环以及自由进食和饮水。实验根据Institutional Animal Care and Use Committee of the Facultyof Arts and Sciences,Harvard University进行。连续四天每天用25μL的GAPDH siRNA(50μM)-IL制剂处理健康小鼠。
对于银屑病模型，早上用每日剂量新鲜制备的25μL的50μM NFKBIZ siRNA-IL制剂处理小鼠背部皮肤并风干。6小时后，将获得自Patterson Veterinary,CO,USA的62.5mg5％咪喹莫特乳膏(Aldara；PerrigoCo.)施用于同一区域。IL-siRNA和咪喹莫特处理均持续4天。每天使用电子数字游标卡尺通过双皮褶厚度(DSFT)评估背侧皮肤的皮肤厚度。如前所述，每天使用人银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分系统对红斑和鳞屑进行盲评分，评分范围从0(无变化)到4(非常明显的变化)。综合单个分数，得出理论上的最大累积分数为8。在第5天，动物在CO2室中被安乐死，收获并收集处理过的背部皮肤(皮肤面积4cm2)用于组织学和qPCR。
ELISA。对于GAPDH siRNA处理后小鼠细胞中GAPDH蛋白的半定量测量，使用GAPDHSimpleStep ELISA试剂盒(ab176642，Abcam)。简而言之，使用研钵和研杵将200mg收获的冷冻皮肤粉碎成粉末并在冷的0.5mL 1×细胞提取缓冲液中均质化。将裂解物在冰上孵育20分钟，并在4℃下以18000×g离心20分钟。将上清液收集在干净的试管中，并立即使用Nanodrop对每个样品中的蛋白质浓度进行定量。使用1×细胞提取缓冲液将样品稀释至20mg/mL蛋白浓度。按照制造商的方案制备板条，并使用酶标仪(Biotec Synergy 2，USA)在450nm处测量蛋白水平。
qPCR。在将冷冻组织粉碎形成粉末后，将组织裂解物在700μLQIAzol LysisReagent中均质化，并根据制造商的方案使用Qiagen miRNeasy Mini Kit(217004)提取总RNA。对mRNA水平进行归一化，并使用Biorad iScriptTMReverse Transcription Supermix(1708841)进行逆转录以产生cDNA。使用SsoFast EvaGreen Supermix(172-5211)对获得的cDNA进行实时逆转录PCR。在Biorad CFX 96仪器上对相同的cDNA样品分别进行感兴趣基因和内源性对照(β-肌动蛋白)的三次反应。使用了小鼠NFKBIZ、TNF-α、IL-17A、IL-17C、IL-19、IL-22、IL-23A、IL-36A、IL-36G、CCL20、S100A9、LCN2和DEFB4基因的以下引物序列：GAPDH(正向：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(SEQ ID NO：7)；反向：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SEQ ID NO：8))、NFKBIZ(正向：5'-TATCGGGTGACACAGTTGGA-3'(SEQ ID NO：9)；反向：5'-TGAATGGACTTCCCCTTCAG-3'(SEQ ID NO：10))，TNF-α(正向：5'-GGCAGGTTCTGTCCCTTTCAC-3'(SEQ ID NO：11)；反向：5'-TTCTGTGCTCATGGTGTCTTTTCT-3'(SEQ ID NO：12))、IL-17A(正向：5'-ATGAGTGCCGACAAACAACG-3'(SEQ ID NO：13)；反向：5'-GTGACGTGGAACGGTTGAGG-3'(SEQ ID NO：14))、IL-17C(正向：5'-CTGGAAGCTGACACTCACGA-3'(SEQ ID NO：15)；反向：5'-GGTAGCGGTTCTCATCTGTG-3'(SEQ ID NO：16))、IL-19(正向：5'-TTCCACGAGATCAAGAGAGC-3'(SEQ ID NO：17)；反向：5'-TCTACACCTGTTCCGCTGAG-3'(SEQ IDNO：18))，IL-22(正向：5'-TTGAGGTGTCCAACTTCCAGCA-3'(SEQ ID NO：19)；反向：5'-GCATAGGTAGCCAGAGCCAG-3'(SEQ ID NO：20))，IL-23A(正向：5'-TGGCATCGAGAAACTGTGAGA-3'(SEQ ID NO：21)；反向：5'-TCAGTTCGTATTGGTAGTCCTGTTA-3'(SEQ ID NO：22))、IL-36A(正向：5'-AGTGGGTGTAGTTCTGTAGTGTGC-3'(SEQ ID NO：23)；反向：5'-GTTCGTCTCAAGAGTGTCCAGATAT-3'(SEQ ID NO：24))、IL-36G(正向：5'-CACAGATGAGAACCGCTACCC-3'(SEQ ID NO：25)；反向：5'-GCGGATGAACTCGGTGTGGAA-3'(SEQID NO：26))、CCL20(正向：5'-GTGGGTTTCACAAGACAGATG-3'(SEQ ID NO：27)；反向：5'-TTTTCACCCAGTTCTGCTTTG-3'(SEQ ID NO：28))、S100A9(正向：5'-CCTTCTCAGATGGAGCGCAG-3'(SEQ ID NO：29)；反向：5'-TGTCCAGGTCCTCCATGATG-3'(SEQ ID NO：30))、LCN2(正向：5'-GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3'(SEQ ID NO：31)；反向：5'-GGATCCCGATGGCTAGAGCA-3'(SEQ IDNO：32))、和DEFB4/mBD4(正向：5'-AGGGAAGGATGAGATTAAGACTGG-3'(SEQ ID NO：33)；反向：5'-CTTGCTGGTTCTTCGTCTTTT-3'(SEQ ID NO：34)。管家基因的引物，β-肌动蛋白(正向：5'-CGGTTCCGATGCCCTGAGGCTCTT-3'(SEQ ID NO：35)；反向：5'-CGTCACACTTCATGATGGAATTGA-3'(SEQ ID NO：36))。验证了引物的特异性，通过熔融曲线分析监测扩增子特异性。对于评价的每个基因组序列，通过从未处理/对照组获得的Ct值中减去处理样品的Ct值来计算每个样品的ΔCt值。计算2^ΔΔCt得出PCR产物的相对量(相对富集)。
组织病理学和免疫组织化学。用苏木精和伊红对来自OCT包埋组织的切片(15-20μm)进行染色，并通过光学显微镜进行评价。对于Ki67免疫组织化学，切片在柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中以100加热30分钟以进行抗原修复。将切片与抗ki67一抗(兔抗小鼠单克隆抗体；1:1000稀释度；ab16667，Abcam，Cambridge，UK)在4℃下孵育过夜，然后与过氧化物酶耦合的抗兔IgG二抗孵育30分钟。切片用DAB染色，用苏木精复染，并使用光学显微镜(带有Olympus相机的Olympus BX53显微镜)进行评估。使用ImageJ/FIJI软件测量对照和测试样品的表皮厚度。
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序列表
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<130> 002806-096230WOPT
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<151> 2019-11-22
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Lys Ser Ile Tyr Phe Val Ala Gly Leu Phe Val Met Leu Val Gln
1 5 10 15
Gly Ser Trp Gln Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser
20 25 30
Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn
35 40 45
Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys
50 55 60
Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn
65 70 75 80
Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu
85 90 95
Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
100 105 110
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
115 120 125
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg
130 135 140
Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp
145 150 155 160
Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile
165 170 175
Thr Asp Arg Lys
180
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Gly
35
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
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gugugaacca cgagaaauau u 21
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<212> RNA
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tccaccaccc tgttgctgta 20
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tgaatggact tccccttcag 20
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ggcaggttct gtccctttca c 21
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ttctgtgctc atggtgtctt ttct 24
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atgagtgccg acaaacaacg 20
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ctggaagctg acactcacga 20
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ggtagcggtt ctcatctgtg 20
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ttccacgaga tcaagagagc 20
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tctacacctg ttccgctgag 20
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ttgaggtgtc caacttccag ca 22
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gcataggtag ccagagccag 20
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tggcatcgag aaactgtgag a 21
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tcagttcgta ttggtagtcc tgtta 25
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agtgggtgta gttctgtagt gtgc 24
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gttcgtctca agagtgtcca gatat 25
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cacagatgag aaccgctacc c 21
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gcggatgaac tcggtgtgga a 21
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gtgggtttca caagacagat g 21
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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ttttcaccca gttctgcttt g 21
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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ccttctcaga tggagcgcag 20
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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tgtccaggtc ctccatgatg 20
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ggaccagggc tgtcgctact 20
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ggatcccgat ggctagagca 20
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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agggaaggat gagattaaga ctgg 24
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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cttgctggtt cttcgtcttt t 21
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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cggttccgat gccctgaggc tctt 24
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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cgtcacactt catgatggaa ttga 24
<210> 37
<211> 3790
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
ctcctcttgc cacgaggtca gacggcgagt tcttagagaa aaaggctgct tagctgctgc 60
ttatcatgta acctcaaaag gaaactgatc gtctttctca tgctgtcacg tacttgggtt 120
attatcgctg attacagctg gaaacaattg atttgctctt acgtatttgt gtgacttgac 180
tcttcaaaca caaaggttaa caggaagatc tcgagggccc tggctgaact tcaccttttg 240
gctttcttgg cctgatgctg aactctcgag gttgagcccc atatgggggt tggcaggcag 300
cagagaggcc cctttcaagg tgttcgggta aagaactcag tgaaggaact cctgttgcac 360
atccgaagtc ataaacagaa ggcttctggc caagctgtgg atgattttaa gacacaaggt 420
gtgaacatag aacagttcag agaattgaag aacacagtat catacagtgg gaaaaggaaa 480
gggcccgatt cgttgtctga tggacctgct tgcaaaaggc cagctctgtt gcattcccaa 540
tttttgacac cacctcaaac accaacgccc ggggagagca tggaagatgt tcatctcaat 600
gaacccaaac aggagagcag tgctgatctg cttcagaaca ttatcaacat taagaatgaa 660
tgcagccccg tttccctgaa cacagttcaa gttagctggc tgaaccccgt ggtggtccct 720
cagagctccc ccgcagagca gtgtcaggac ttccatggag ggcaggtctt ttctccacct 780
cagaaatgcc aaccattcca agtcaggggc tcccaacaaa tgatagacca ggcttccctg 840
taccagtatt ctccacagaa ccagcatgta gagcagcagc cacactacac ccacaaacca 900
actctggaat acagtccttt tcccatacct ccccagtccc ccgcttatga accaaacctc 960
tttgatggtc cagaatcaca gttttgccca aaccaaagct tagtttccct tcttggtgat 1020
caaagggaat ctgagaatat tgctaatccc atgcagactt cctccagtgt tcagcagcaa 1080
aatgatgctc acttgcacag cttcagcatg atgcccagca gcgcctgtga ggccatggtg 1140
gggcacgaga tggcctctga ctcttcaaac acttcactgc cattctcaaa catgggaaat 1200
ccaatgaaca ccacacagtt agggaaatca ctttttcagt ggcaggtgga gcaggaagaa 1260
agcaaattgg caaatatttc ccaagaccag tttctttcaa aggatgcaga tggtgacacg 1320
ttccttcata ttgctgttgc ccaagggaga agggcacttt cctatgttct tgcaagaaag 1380
atgaatgcac ttcacatgct ggatattaaa gagcacaatg gacagagtgc ctttcaggtg 1440
gcagtggctg ccaatcagca tctcattgtg caggatctgg tgaacatcgg ggcacaggtg 1500
aacaccacag actgctgggg aagaacacct ctgcatgtgt gtgctgagaa gggccactcc 1560
caggtgcttc aggcgattca gaagggagca gtgggaagta atcagtttgt ggatcttgag 1620
gcaactaact atgatggcct gactcccctt cactgtgcag tcatagccca caatgctgtg 1680
gtccatgaac tccagagaaa tcaacagcct cattcacctg aagttcagga gcttttactg 1740
aagaataaga gtctggttga taccattaag tgcctaattc aaatgggagc agcggtggaa 1800
gcgaaggatc gcaaaagtgg ccgcacagcc ctgcatttgg cagctgaaga agcaaatctg 1860
gaactcattc gcctcttttt ggagctgccc agttgcctgt cttttgtgaa tgcaaaggct 1920
tacaatggca acactgccct ccatgttgct gccagcttgc agtatcggtt gacacaatta 1980
gatgctgtcc gcctgttgat gaggaaggga gcagacccaa gtactcggaa cttggagaac 2040
gaacagccag tgcatttggt tcccgatggc cctgtgggag aacagatccg acgtatcctg 2100
aagggaaagt ccattcagca gagagctcca ccgtattagc tccattagct tggagcctgg 2160
ctagcaacac tcactgtcag ttaggcagtc ctgatgtatc tgtacataga ccatttgcct 2220
tatattggca aatgtaagtt gtttctatga aacaaacata tttagttcac tattatatag 2280
tgggttatat taaaagaaaa gaagaaaaat atctaatttc tcttggcaga tttgcatatt 2340
tcatacccag gtatctggga tctagacatc tgaatttgat ctcaatggta acattgcctt 2400
caattaacag tagcttttga gtaggaaagg actttgattt gtggcacaaa acattattaa 2460
tatagctatt gacagtttca aagcaggtaa attgtaaatg tttctttaag aaaaagcatg 2520
tgaaaggaaa aaggtaaata cagcattgag gcttcatttg gccttagtcc ctgggagtta 2580
ctggcgttgg acaggcttca gtcattggac tagatgaaag gtgtccatgg ttagaatttg 2640
atctttgcaa actgtatata attgttattt ttgtccttaa aaatattgta catacttggt 2700
tgttaacatg gtcatatttg aaatgtataa gtccataaaa tagaaaagaa caagtgaatt 2760
gttgctattt aaaaaaattt tacaattctt actaaggagt ttttattgtg taatcactaa 2820
gtctttgtag ataaagcaga tggggagtta cggagttgtt cctttactgg ctgaaagata 2880
tattcgaatt gtaaagatgc tttttctcat gcattgaaat tatacattat ttgtagggaa 2940
ttgcatgctt tttttttttt ttctcccgag acagggtctt gctctggcgc ccaggctgga 3000
gtacagtggc atgatcttgg ctcacttcag ccttgacttg ggctcaagtg atcctcctac 3060
ctgagccttc tgagtaactg gaactacagg tgtgcactcc tcgcctggct aattttttat 3120
tttttgtaca ggcaggatct tgccaccttg cccaggctgg tcttgaactc ctgagctcat 3180
gccatctgcc tgccttagtc tcccaaaatg ctgggattac aggagtgagc caccatgccc 3240
ggctggcagt tgcatggaag agaacacctc tttatggctt accctctaga atttctaatt 3300
tatgtgttct gttgaaattt ttgttttttt acctttattg aaacaacaaa aagtcagtat 3360
tgaaacatat cttcctgttt tctgttgtca aatgatgata atgtgccatg atgttttata 3420
tatatcattc agaaaaagtt ttatttttta ataacattct attaacatta ttttgcttgc 3480
cgctggcatg cctgaggaat gtatttggct ttgattacac actaagtttt tgtaataaat 3540
ttgactcatt aaaaaccttt tttttttaaa aaaaaaaaaa aagaaaatct cattagtgaa 3600
cttatctttg cagctgagta cttaaattct ttttaaaaag ataccctttg gattgatcac 3660
attgtttgac ccagtatgtc ttgtagacac gttagttata atcaccttgt atctctaaat 3720
atggtgtgat atgaaccagt ccattcacat tggaaaaact gatggtttta aataaactaa 3780
ttcactaata 3790
<210> 38
<211> 3923
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
gtactggccc gcgccgtccg cccgccgaca gctccctgag ccagcccggg aggcagccgc 60
gcgcagcgag ccggtggcgc aggtgtcggg gtcctcgagc gcccagcctg ggagcatgat 120
tgtggacaag ctgctggacg acagccgcgg cggagagggg ctgcgggacg cggcgggcgg 180
ctgcggcctc atgaccagcc cgctcaacct gagctacttc tacggcgcgt cgccgcccgc 240
cgccgccccg ggcgcctgcg acgccagctg ctcggtcttg ggcccctcgg cgcccggctc 300
gcccggctcc gactcctccg acttctcctc tgcctcgtcg gtgtcctcct gcggcgccgt 360
ggagtcccgg tcgagaggcg gcgcccgcgc cgagcgccag ccagttgagc cccatatggg 420
ggttggcagg cagcagagag gcccctttca aggtgttcgg gtaaagaact cagtgaagga 480
actcctgttg cacatccgaa gtcataaaca gaaggcttct ggccaagctg tggatgattt 540
taagacacaa ggtgtgaaca tagaacagtt cagagaattg aagaacacag tatcatacag 600
tgggaaaagg aaagggcccg attcgttgtc tgatggacct gcttgcaaaa ggccagctct 660
gttgcattcc caatttttga caccacctca aacaccaacg cccggggaga gcatggaaga 720
tgttcatctc aatgaaccca aacaggagag cagtgctgat ctgcttcaga acattatcaa 780
cattaagaat gaatgcagcc ccgtttccct gaacacagtt caagttagct ggctgaaccc 840
cgtggtggtc cctcagagct cccccgcaga gcagtgtcag gacttccatg gagggcaggt 900
cttttctcca cctcagaaat gccaaccatt ccaagtcagg ggctcccaac aaatgataga 960
ccaggcttcc ctgtaccagt attctccaca gaaccagcat gtagagcagc agccacacta 1020
cacccacaaa ccaactctgg aatacagtcc ttttcccata cctccccagt cccccgctta 1080
tgaaccaaac ctctttgatg gtccagaatc acagttttgc ccaaaccaaa gcttagtttc 1140
ccttcttggt gatcaaaggg aatctgagaa tattgctaat cccatgcaga cttcctccag 1200
tgttcagcag caaaatgatg ctcacttgca cagcttcagc atgatgccca gcagcgcctg 1260
tgaggccatg gtggggcacg agatggcctc tgactcttca aacacttcac tgccattctc 1320
aaacatggga aatccaatga acaccacaca gttagggaaa tcactttttc agtggcaggt 1380
ggagcaggaa gaaagcaaat tggcaaatat ttcccaagac cagtttcttt caaaggatgc 1440
agatggtgac acgttccttc atattgctgt tgcccaaggg agaagggcac tttcctatgt 1500
tcttgcaaga aagatgaatg cacttcacat gctggatatt aaagagcaca atggacagag 1560
tgcctttcag gtggcagtgg ctgccaatca gcatctcatt gtgcaggatc tggtgaacat 1620
cggggcacag gtgaacacca cagactgctg gggaagaaca cctctgcatg tgtgtgctga 1680
gaagggccac tcccaggtgc ttcaggcgat tcagaaggga gcagtgggaa gtaatcagtt 1740
tgtggatctt gaggcaacta actatgatgg cctgactccc cttcactgtg cagtcatagc 1800
ccacaatgct gtggtccatg aactccagag aaatcaacag cctcattcac ctgaagttca 1860
ggagctttta ctgaagaata agagtctggt tgataccatt aagtgcctaa ttcaaatggg 1920
agcagcggtg gaagcgaagg atcgcaaaag tggccgcaca gccctgcatt tggcagctga 1980
agaagcaaat ctggaactca ttcgcctctt tttggagctg cccagttgcc tgtcttttgt 2040
gaatgcaaag gcttacaatg gcaacactgc cctccatgtt gctgccagct tgcagtatcg 2100
gttgacacaa ttagatgctg tccgcctgtt gatgaggaag ggagcagacc caagtactcg 2160
gaacttggag aacgaacagc cagtgcattt ggttcccgat ggccctgtgg gagaacagat 2220
ccgacgtatc ctgaagggaa agtccattca gcagagagct ccaccgtatt agctccatta 2280
gcttggagcc tggctagcaa cactcactgt cagttaggca gtcctgatgt atctgtacat 2340
agaccatttg ccttatattg gcaaatgtaa gttgtttcta tgaaacaaac atatttagtt 2400
cactattata tagtgggtta tattaaaaga aaagaagaaa aatatctaat ttctcttggc 2460
agatttgcat atttcatacc caggtatctg ggatctagac atctgaattt gatctcaatg 2520
gtaacattgc cttcaattaa cagtagcttt tgagtaggaa aggactttga tttgtggcac 2580
aaaacattat taatatagct attgacagtt tcaaagcagg taaattgtaa atgtttcttt 2640
aagaaaaagc atgtgaaagg aaaaaggtaa atacagcatt gaggcttcat ttggccttag 2700
tccctgggag ttactggcgt tggacaggct tcagtcattg gactagatga aaggtgtcca 2760
tggttagaat ttgatctttg caaactgtat ataattgtta tttttgtcct taaaaatatt 2820
gtacatactt ggttgttaac atggtcatat ttgaaatgta taagtccata aaatagaaaa 2880
gaacaagtga attgttgcta tttaaaaaaa ttttacaatt cttactaagg agtttttatt 2940
gtgtaatcac taagtctttg tagataaagc agatggggag ttacggagtt gttcctttac 3000
tggctgaaag atatattcga attgtaaaga tgctttttct catgcattga aattatacat 3060
tatttgtagg gaattgcatg cttttttttt tttttctccc gagacagggt cttgctctgg 3120
cgcccaggct ggagtacagt ggcatgatct tggctcactt cagccttgac ttgggctcaa 3180
gtgatcctcc tacctgagcc ttctgagtaa ctggaactac aggtgtgcac tcctcgcctg 3240
gctaattttt tattttttgt acaggcagga tcttgccacc ttgcccaggc tggtcttgaa 3300
ctcctgagct catgccatct gcctgcctta gtctcccaaa atgctgggat tacaggagtg 3360
agccaccatg cccggctggc agttgcatgg aagagaacac ctctttatgg cttaccctct 3420
agaatttcta atttatgtgt tctgttgaaa tttttgtttt tttaccttta ttgaaacaac 3480
aaaaagtcag tattgaaaca tatcttcctg ttttctgttg tcaaatgatg ataatgtgcc 3540
atgatgtttt atatatatca ttcagaaaaa gttttatttt ttaataacat tctattaaca 3600
ttattttgct tgccgctggc atgcctgagg aatgtatttg gctttgatta cacactaagt 3660
ttttgtaata aatttgactc attaaaaacc tttttttttt aaaaaaaaaa aaaaagaaaa 3720
tctcattagt gaacttatct ttgcagctga gtacttaaat tctttttaaa aagataccct 3780
ttggattgat cacattgttt gacccagtat gtcttgtaga cacgttagtt ataatcacct 3840
tgtatctcta aatatggtgt gatatgaacc agtccattca cattggaaaa actgatggtt 3900
ttaaataaac taattcacta ata 3923
<210> 39
<211> 1678
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
agcagacgct ccctcagcaa ggacagcaga ggaccagcta agagggagag aagcaactac 60
agaccccccc tgaaaacaac cctcagacgc cacatcccct gacaagctgc caggcaggtt 120
ctcttcctct cacatactga cccacggctc caccctctct cccctggaaa ggacaccatg 180
agcactgaaa gcatgatccg ggacgtggag ctggccgagg aggcgctccc caagaagaca 240
ggggggcccc agggctccag gcggtgcttg ttcctcagcc tcttctcctt cctgatcgtg 300
gcaggcgcca ccacgctctt ctgcctgctg cactttggag tgatcggccc ccagagggaa 360
gagttcccca gggacctctc tctaatcagc cctctggccc aggcagtcag atcatcttct 420
cgaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag 480
ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat 540
aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag 600
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc 660
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 720
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag 780
ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc 840
gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt gccctgtgag gaggacgaac atccaacctt 900
cccaaacgcc tcccctgccc caatcccttt attaccccct ccttcagaca ccctcaacct 960
cttctggctc aaaaagagaa ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta gaactttaag 1020
caacaagacc accacttcga aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca cagtgaagtg 1080
ctggcaacca ctaagaattc aaactggggc ctccagaact cactggggcc tacagctttg 1140
atccctgaca tctggaatct ggagaccagg gagcctttgg ttctggccag aatgctgcag 1200
gacttgagaa gacctcacct agaaattgac acaagtggac cttaggcctt cctctctcca 1260
gatgtttcca gacttccttg agacacggag cccagccctc cccatggagc cagctccctc 1320
tatttatgtt tgcacttgtg attatttatt atttatttat tatttattta tttacagatg 1380
aatgtattta tttgggagac cggggtatcc tgggggaccc aatgtaggag ctgccttggc 1440
tcagacatgt tttccgtgaa aacggagctg aacaataggc tgttcccatg tagccccctg 1500
gcctctgtgc cttcttttga ttatgttttt taaaatattt atctgattaa gttgtctaaa 1560
caatgctgat ttggtgacca actgtcactc attgctgagc ctctgctccc caggggagtt 1620
gtgtctgtaa tcgccctact attcagtggc gagaaataaa gtttgcttag aaaagaaa 1678
<210> 40
<211> 1871
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
gtccatctca tagcaggcac aaactcatcc atccccagtt gattggaaga aacaacgatg 60
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aaggcaggaa tcacaatccc acgaaatcca ggatgcccaa attctgagga caagaacttc 180
ccccggactg tgatggtcaa cctgaacatc cataaccgga ataccaatac caatcccaaa 240
aggtcctcag attactacaa ccgatccacc tcaccttgga atctccaccg caatgaggac 300
cctgagagat atccctctgt gatctgggag gcaaagtgcc gccacttggg ctgcatcaac 360
gctgatggga acgtggacta ccacatgaac tctgtcccca tccagcaaga gatcctggtc 420
ctgcgcaggg agcctccaca ctgccccaac tccttccggc tggagaagat actggtgtcc 480
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ttaaagcttc agaggtaaca cttggccaag atatgagatc tgaattacct ttccctcttt 720
ccaagaagga aggtttgact gagtaccaat ttgcttcttg tttacttttt taagggcttt 780
aagttattta tgtatttaat atgccctgag ataactttgg ggtataagat tccattttaa 840
tgaattacct actttatttt gtttgtcttt ttaaagaaga taagattctg ggcttgggaa 900
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tctctgttcc attaaaccct tataataaaa tccttctgta ataataaagt ttcaaaagaa 1260
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agttatgcaa attctcctat aagcaaaaca aagcatgtct ttgagtaaca atgacctgga 1380
aatacccaaa attccaagtt ctcgatttca catgccttca agactgaaca ccgactaagg 1440
ttttcatact attagccaat gctgtagaca gaagcatttt gataggaata gagcaaataa 1500
gataatggcc ctgaggaatg gcatgtcatt attaaagatc atatggggaa aatgaaaccc 1560
tccccaaaat acaagaagtt ctgggaggag acattgtctt cagactacaa tgtccagttt 1620
ctcccctaga ctcaggcttc ctttggagat taaggcccct cagagatcaa cagaccaaca 1680
tttttctctt cctcaagcaa cactcctagg gcctggcttc tgtctgatca aggcaccaca 1740
caacccagaa aggagctgat ggggcagaac gaactttaag tatgagaaaa gttcagccca 1800
agtaaaataa aaactcaatc acattcaatt ccagagtagt ttcaagtttc acatcgtaac 1860
cattttcgcc c 1871

Claims (67)

1.一种包含至少一种离子液体的组合物，所述至少一种离子液体包含：阴离子和包含季铵的阳离子，
所述阴离子为如下中的至少一种：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；
c)芳香族阴离子；和/或
d)LogP小于1.0的阴离子。
2.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a)非脂肪酸的羧酸；
b)包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；或
c)芳香族阴离子。
3.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述脂肪酸包含不多于3个碳的脂肪链。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子仅包含一个羧酸基团(例如，R-COOH基团)。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：
香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子选自于由如下所组成的组：
乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子的摩尔质量等于或大于胆碱。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且至少一个R基团包含羟基基团。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述季铵具有NR4 +的结构，并且只有一个R基团包含羟基基团。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为胆碱、C1、C6或C7。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为胆碱。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子为C1、C6或C7。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1至约1:1的阳离子与阴离子的比。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体包含约2:1的阳离子与阴离子的比。
15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的阳离子:阴离子比小于1:1。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体具有阳离子过量的阳离子:阴离子比。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含第一离子液体和至少第二离子液体。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，每种离子液体具有胆碱阳离子。
19.如权利要求17-18中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体和所述第二离子液体各自包含不同的阴离子。
20.如权利要求19所述的组合物，其中，所述第一离子液体和所述第二离子液体各自包含选自于以下的不同阴离子：
香叶酸、乙醇酸、丙酸、异丁酸、丁酸、没食子酸、乳酸、丙二酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、3,3-二甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、葡萄糖酸、己二酸、乙基己基硫酸钠、癸酸、羟基苯磺酸、4-羟基苯磺酸(4-苯酚磺酸)、异戊酸、氢化肉桂酸(苯丙酸)、苯基磷酸和联苯-3-羧酸。
21.如权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体具有香叶酸阴离子，所述第二离子液体具有苯丙酸阴离子。
22.如权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)。
23.如权利要求17-22中任一项所述的组合物，其中，所述第二离子液体为胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
24.如权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体和第二离子液体为选自于由如下所组成的组中的不同离子液体：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、胆碱和异戊酸(CAVA)、胆碱和苯基磷酸(CAPP)、胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)、胆碱和4-苯酚磺酸(CASA)、或胆碱和苯丙酸(CAPA)。
25.如权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和香叶酸(CAGE)、胆碱和二甲基丙烯酸(CADA)、以及胆碱和联苯-3-羧酸(CABA)；以及
所述第二离子液体选自于由如下所组成的组：胆碱和异戊酸(CAVA)、以及胆碱和苯丙酸(CAPA)。
26.如权利要求17-22中任一项所述的组合物，其中，所述第一离子液体为胆碱和香叶酸(CAGE)，所述第二离子液体为胆碱和苯丙酸(CAPA)。
27.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含与所述至少一种离子液体组合的至少一种活性化合物。
28.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括多肽。
29.如权利要求28所述的组合物，其中，所述多肽为抗体或抗体试剂。
30.如权利要求28-29中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于450。
31.如权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物的分子量大于500。
32.如权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸。
33.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物包括核酸。
34.如权利要求33所述的组合物，其中，所述核酸为抑制性核酸。
35.如权利要求34所述的组合物，其中，所述核酸为siRNA。
36.如权利要求34-35中任一项所述的组合物，其中，所述抑制性核酸为NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸。
37.如权利要求33-36中任一项所述的组合物，其中，所述阴离子的LogP小于1.0，并且为：
a.非脂肪酸的羧酸；或
b.包含不多于4个碳的脂肪链的羧酸；和/或
c.芳香族阴离子。
38.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为至少0.1％w/v。
39.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约10％w/v至约70％w/v。
40.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约50％w/v。
41.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述离子液体的浓度为约30％w/v至约40％w/v。
42.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
43.如权利要求42所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于经皮给予。
44.如权利要求42所述的组合物，其中，所述黏膜为鼻黏膜、口腔黏膜或阴道黏膜。
45.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述活性化合物以1-40mg/kg的剂量提供。
46.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种非离子表面活性剂。
47.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
48.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以可降解胶囊提供。
49.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为掺合物。
50.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以一种或多种纳米颗粒提供。
51.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含含有所述活性化合物的一种或多种纳米颗粒，所述纳米颗粒在包含所述离子液体的组合物的溶液或悬浮液中。
52.一种给予受试者至少一种活性化合物的方法，所述方法包括给予权利要求27-51中任一项所述的组合物。
53.如权利要求52所述的方法，其中，将所述组合物给予一次。
54.如权利要求52-53中任一项所述的方法，其中，所述组合物以多剂量给予。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中，所述给予为经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
56.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中，所述组合物包含NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸，并且所述受试者需要治疗炎性病症。
57.一种在有需要的受试者中治疗炎性病症的方法，所述方法包括给予所述受试者如权利要求36-51中任一项所述的组合物。
58.如权利要求56-57中任一项所述的方法，其中，所述给予为局部给予。
59.如权利要求56-58中任一项所述的方法，其中，所述炎性病症为银屑病。
60.一种如权利要求27-51中任一项所述的组合物，所述组合物用于将至少一种活性化合物给予受试者的方法中。
61.如权利要求60所述的组合物，其中，将所述组合物给予一次。
62.如权利要求60所述的组合物，其中，所述组合物以多剂量给予。
63.如权利要求60-62中任一项所述的组合物，其中，所述给予为经皮给予、给予至黏膜、口服给予、皮下给予、皮内给予、肠胃外给予、瘤内给予或静脉内给予。
64.如权利要求60-63中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含NFKBIZ、TNFα和/或IL-17抑制性核酸，并且所述受试者需要治疗炎性病症。
65.一种如权利要求36-51中任一项所述的组合物，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗炎性病症的方法中。
66.如权利要求64-65中任一项所述的组合物，其中，所述给予为局部给予。
67.如权利要求64-66中任一项所述的组合物，其中，所述炎性病症为银屑病。
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