KR20170031668A - 면역 조절을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20170031668A
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데이비드 엠. 브리스코
마이클 클락스브룬
사라 브루노
노라 코츄푸라칼
히로나오 나카야마
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본 명세서에 개시되는 방법 및 용도는, 예를 들어, Sema3F 작용제를 투여하여, 동종 이식편 거부 반응 또는 염증을 억제하거나, 또는 Sema3F 억제제를 투여하여 면역 반응을 증가시키는 것으로서, Sema3F 레벨 및/또는 활성의 조절에 의한 면역 시스템의 조절에 관한 것이다.

Description

면역 조절을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNOMODULATION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 6월 2일 출원된 미국 가출원 제 62/006,441호의 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 그의 전문은 본 명세서에서 참조로서 포함된다.
미국 정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 승인 번호 1RO1AI092305에 의해 연방 재정 지원으로 이루어졌다. 미국정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 가지고 있다.
서열 목록
본 출원은, ASCII 포멧으로 전자출원되었으며, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2015년 5월 29일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 701039-080591-PCT_SL.txt로 명명되며, 그 크기는 63,543 바이트이다.
기술 분야
본 명세서에 개시되는 기술은 면역조절에 관한 것이다.
클래스 3 세마포린 패밀리 (Sema3A-G)은 뉴로필린 (neuropilin)과 플렉신 (plexin) 패밀리의 단백질에 결합하여, 세포 이동과 증식을 억제하는 조절 신호를 유도한다. 특히, NRP-1과 SEMA3F 및 NRP-2와 SEMA3A의 결합은 신경 세포 및 혈관 내피 세포에서 억제 신호를 유도한다.
본 명세서에 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은, Sema3F가 면역 조절 특성을 가지며, 부분적으로 이러한 효과가 NRP-2 및 플렉신 A1과의 상호 작용을 통해 매개된다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 명세서에서는, SEMA3F와 그의 수용체의 결합 및 관련 신호 전달의 조작을 기반으로 하는 면역 조절 방법이 제공된다.
비 제한적인 예는 Sema3F 및 NRP-2의 상호 작용을 증가시키거나 강화시킴으로써, 면역계 또는 면역 반응을 억제하는 것, 및/또는 Sema3F 및 NRP-2의 활성 및/또는 상호 작용을 감소시킴으로써, 면역계 또는 면역 반응을 상향조절하는 것을 포함한다.
일 측면에서, 본 명세서에서는, 대상체의 면역계를 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일 측면에서, 본 명세서에서는, 동종 이식편 거부 반응을 억제하는 방법으로서, Sema3F 작용제를 동종 이식편 수용체에 투여하는 단계를 포함하며, 동종 이식편에 대한 면역 거부 반응이 억제되는 방법이 개시된다. 일 측면에서, 본 명세서에서는, 이를 필요로 하는 대상체의 염증성 병증을 치료하는 방법으로서, 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 염증성 병증은 자가면역 질환이다. 일부 실시형태에서, 자가 면역 질환은 제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 염증성 병증은 국소 병증이다. 일부 실시형태에서, 상기 국소 염증성 병증은 발진 및 알레르기 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 Sema3F 폴리펩티드 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이다. 일부 실시형태에서, Sema3F 폴리펩티드는 서열번호 5의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Sema3F 폴리펩티드는 Sema3F 수용체와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 폴리펩티드는 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 푸린-형 억제제 (furin-like inhibitor)이다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 정맥 내로 투여된다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 근육 내, 피하, 또는 피부 내로 투여된다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 염증 부위로 국소 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가의 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 항염증제는 스테로이드; 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신) 또는 그의 유사체; 및 항증식제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 명세서에서는, 이를 필요로 하는 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 대상체에 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 항-Sema3F 항체 시약이다. 일부 실시형태에서, NRP-2 억제제는 항-NRP-2 항체 시약이다. 일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 용해성 NRP-2 수용체이다. 일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 NRP-2 수용체의 용해성 단편이다. 일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이다.
도 1는 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2가 세마포린 결합 도메인 및 VEGF 결합 도메인 둘 모두를 가지는 것에 보여주는 개략도를 도시한다 (문헌 [Bagri et al. 2009]으로부터 변형됨).
도 2는 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. 심장 동종 이식편 (Balb/c)을 완전 MHC 불일치 수용체 (C57BL/6)에 이식하였다. 비조작 수용체는 7-8일 내에 이들 동종 이식편을 거부한다. Sema3F를 인코딩하는 아데노바이러스의 정맥내 주입은 동종 이식편 생존 기간의 연장을 초래하며, 이는 이러한 제제가 면역 반응을 억제하는 강력한 효과를 가진다는 것을 시사한다.
도 3은 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. 심장 동종 이식편 (Balb/c)을 완전 MHC 불일치 수용체 (C57BL/6)에 이식하였다. 비조작 수용체는 7-8일 내에 이들 동종 이식편을 거부한다. Sema3F를 발현하는 세포를 복강내 주입하여, Sema3F의 전신 레벨을 증가시키는 경우, 동종 이식편 생존 기간의 연장이 초래되었고, 이는 이러한 제제가 면역 반응을 억제하는 강력한 효과를 가진다는 것을 시사한다. 항-Sema3F 차단 항체와 조합한 Sema3F-발현 세포를 주입하는 경우, 이식편 생존 기간이 연장되지 않는다.
도 4는 Balb/C 공여체 심장 이식 후, C56BL6 수용체 마우스의 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. Sema3F-발현 세포를 복강내 주입하여, Sema3F의 전신 레벨을 증가시킨 경우, 동종 이식편 생존 기간의 연장이 초래되었다. 0 일째 및 2일째에, 라파마이신 (0.2mg/㎏)을 투여하여, 내성 유발 자극을 개시시켰다. 라파마이신은 Sema3F 발현 세포와 조합된 경우, 생존 기간을 추가로 증가시키지 못했다.
도 5는 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. 심장 동종 이식편 (B6.C-H2bm12 (BM12))을 소수 MHC 불일치 수용체 야생형 (WT C57BL/6), NRP-2+/- (Het/BL6) 또는 NRP-2-/- (녹아웃 마우스/BL6)에 이식하였다. 심장 동종 이식편은 WT 수용체에서 장기간 생존하였으나, KO 마우스는 증가된 거부 반응을 개시시켰다.
도 6은 Sema3F를 인코딩하는 아데노바이러스 또는 대조군 아데노바이러스로 처리 된 마우스에서의 옥사졸론 지연 형 과민 반응을 도시한다. 아데노바이러스 (109 pfu)를 1회 IV 주입한 후 3일째에, 마우스를 프라이밍한 다음, 5일 후 표준 기술을 사용하여 옥사졸론에 의해, 귀에 도전 시험하였다. 상기 그래프는 옥사졸론에 대한 반응으로, 유발된 귀 종창을 보여준다.
도 7은 쥣과 동물 CD4+ T 세포에서, Sema3F 수용체 뉴로필린-2 (mRNA (상부) 및 단백질 (하부)) 발현의 그래프를 도시한다. CD4+ T 세포를 비장으로부터 분리한 후, 6 내지 48시간 동안, 플레이트-결합 항-CD3 (1mcg/㎖)와 함께, 인큐베이션하였다. RNA를 분리한 후, qPCR을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석의 발현은 하부 패널에 제시된다.
도 8은 쥣과 동물 CD4+ T 세포에서, 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2 mRNA 발현의 그래프를 도시한다. 나이브 C57BL6 CD4+ T 세포를 림프절 및 비장으로부터 분리하였다. CD4+ T 세포 하위 세트를 CD25high 및 CD25low 하위 세트로 FACS-선별하였다. CD4+ 하위 세트의 RNA를 분리한 후, qPCR에 의해, 발현 레벨을 측정하였다.
도 9는 CD4+ T 세포, Foxp3pos 및 Foxp3neg 세포 둘 모두의 FACS 분석의 결과를 도시한다. 토끼 항-NRP-2 Ab (Bioss)를 이용하여, NRP-2 발현을 검출하였다.
도 10은 6-48시간째에 미토겐 활성화 후 또는 비활성의 경우, 쥣과 동물 CD4+ T 세포에서의 플렉신 패밀리 분자의 발현 레벨을 도시한다. 야생형 및 NRP-2 이형접합 마우스에서, 발현을 시험하였다.
도 11은 CD4+ 증식의 그래프를 도시한다. 야생형, NRP-2 이형접합, 및 NRP-2 녹아웃 CD4+ 세포를 비장으로부터 분리한 후, 5x104/웰로 플레이팅하고, 0-3 mcg/㎖의 지정 농도에서, 플레이트-결합 항-CD3으로 처리하였다. 그래프는 다양한 마우스 그룹 (n>5 실험 대표)을 이용한 2개의 실험을 도시한다.
도 12는 도 10의 야생형 및 NRP-2 녹아웃 세포에서, 사이토카인 생성의 그래프를 도시한다. CD4+ T 세포를 미토겐 활성화 (3mcg/㎖, 도 10에서 도시된 바와 같음)시킨 후, Luminex 분석법으로 72시간 후에 배양 상청액의 지정 사이토카인의 레벨을 조사하였다.
도 13은 CD4+ CD25neg T 세포의 미토겐 유도 증식 그래프를 도시한다. 비장 CD4+ T 세포를 C57BL/6 백그라운드에서, WT, NRP-2+/- (Hets) 및 NRP-2-/- (KO) 마우스로부터 CD25neg T 효과기 하위 세트로 선별한 후, 플레이트 결합 항-CD3 (0, 0.3, 1, 또는 3 ㎍/mL, 지시된 바와 같음)의 존재하에, 5x104/웰로 플레이팅하였다. 상부 그래프는 항-CD28의 부재하에, 플레이팅된 세포를 보여주며, 하부 그래프는 1 mcg/㎖의 작용성 항-CD28의 존재하에, 플레이팅된 세포를 도시한다.
도 14는 도 12에서 도시된 실험의 NRP-2 녹아웃 CD4+ CD25neg 세포의 사이토카인 생성 그래프를 도시한다. NRP-2 녹아웃 세포를 항-CD3 (3mcg/㎖)에 의해, 미토겐 활성화시킨 후, 배양 상청액의 지정 사이토카인 레벨을 Luminex 분석에 의해, 72시간 후, 조사하였다.
도 15는 ELISPOT 분석에 의해, 측정된 바와 같이, 미토겐 활성 CD25neg CD4+ T 세포의 IFNγ 생성 그래프를 도시한다. 야생형 (WT), NRP-2 HET, 및 NRP-2 KO 세포 (1x105/웰, 1:1 비율로 APC 포함)를 1 mcg/㎖의 작용성 항-CD28의 존재 (하부 그래프) 또는 부재 (상부 그래프)하에, 0, 1, 또는 3 mcg/㎖의 항-CD3에 노출시켰다. 도 16은 ELISPOT 분석에 의해, 측정된 바와 같이, 미토겐 활성 CD25neg CD4+ T 세포의 IL-2 생성 그래프를 도시한다. 야생형 (WT), NRP-2 HET, 및 NRP-2 KO (1x105/웰, 1:1 비율로 APC 포함)를 1 ㎍/mL의 작용성 항-CD28의 존재 (하부 그래프) 또는 부재 (상부 그래프)하에, 0, 1, 또는 3 mcg/㎖의 항-CD3에 노출시켰다.
도 17은 CD4+ CD25+ T 세포의 증식 그래프를 도시한다. 야생형 (WT), NRP-2 HET, 및 NRP-2 KO (5x104/웰)를 1 mcg/㎖의 항-CD28의 존재 (하부 그래프) 또는 부재 (상부 그래프)하에, 0, 0.3, 1, 또는 3 mcg/㎖의 플레이트 결합 항-CD3에 노출시켰다.
도 18은 PI-3K/Akt-mTOR 신호 전달 (상부 블롯) 및 MAPK 신호 전달 (하부 블롯)에 대한 Sema3F의 시간 경과 효과를 도시한다. NRP-2를 발현하는 U87MG를 이 분석에 이용하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, 최장 60분 동안, ~640ng/mL의 Sema3F로 처리된 세포에서, pAkt (mTORC2) 및 pS6K (mTORC1) 및 pERK의 레벨이 감소된 것이 관찰되었다.
도 19는 PI-3K/Akt-mTOR 신호 전달의 Sema3F 억제에 대한 NRP-2 (상부) 및 플렉신A1 (하부) 녹다운의 효과를 도시한다. U87MG 세포를 대조군, NRP-2 또는 플렉신A1 siRNA로 처리하였다. 그 후, 세포를 최장 60분 동안, ~640ng/mL의 Sema3F로 처리하였다. 녹다운 효율을 웨스턴 블롯 분석에 의해, 평가하였다. pAkt (mTORC2), pmTOR 및 pS6K (mTORC1) 발현 레벨을 평가함으로써, PI-3K-Akt 신호 전달 활성을 측정하였다.
도 20은 30분 동안, 증가된 농도의 SEMA3F로 처리된 NRP-2-발현 Jurkat T 세포의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다. pAkt(S473)의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다.
도 21은 다중 세포 유형에서, SEMA3F가 Akt/mTOR 신호 전달을 억제한다는 것을 입증한다. 지정 세포 유형에서, Akt/mTOR 신호 전달에 대한 증가된 농도의 Sema3F의 효과를 입증하는 웨스턴 블롯의 결과가 도시된다.
도 22는 NRP-1 및 NRP-2가 인간 T 세포에 의해 발현된다는 것을 입증한다. CD4+ T 세포를 인간 PBMC로부터 정제한 후, 미토겐-의존적 활성화 (항-CD3/항-CD28) 후, VEGFR1 (Flt-1), NRP-1 및 NRP-2 mRNA의 발현을 평가하였다. Flt-1, NRP-1 및 NRP-2 mRNA 발현 사이의 비교를 보여주는 대표 qPCR 데이터 (다양한 T 세포를 이용한 n=3 실험)가 도시된다. 하단 패널은 내피 세포 (EC)에 대비하여, 비활성 및 활성 인간 CD4+ T 세포에서의 NRP-2 단백질의 발현을 비교하는 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 23은 NRP-2 녹다운 세포가 자극에 대한 반응으로 과활성화되는 것을 보여주는 데이터의 그래프를 도시한다. 좌측 패널은 표준 티미딘 혼입 분석에 의해, 측정된 바와 같이, 미토겐 활성화에 대한 반응에서, CD4+ T 세포 증식을 도시한다. 우측 패널은 APC 및 항-CD3으로의 배양에 대한 반응에서, CD4+ T 세포의 IFNg 레벨을 도시한다.
도 24는 NRP-2 녹아웃 CD4+ CD25neg 세포의 사이토카인 생성 그래프를 도시한다. NRP-2 녹아웃 세포를 항-CD3으로 미토겐 활성화시킨 후, 배양 상청액의 지정 사이토카인 레벨을 Luminex 분석에 의해, 48시간 후, 시험하였다. 이들 연구 결과는 도 12에 나타낸 것과 유사하다.
도 25는 만성 동종 이식편 거부 모델의 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. 심장 동종 이식편 B6.C-Hbm12 (BM12)를 소수 MHC 불일치 수용체, 야생형 C57BL/6(WT), NRP-2 녹아웃 (NRP-2 -/-) 또는 선택 CD4+ T 세포 NRP-2 녹아웃 마우스 (CD4Cre-NRP-2fl/fl)로 이식하였다.
도 26a-26c는 인간 CD4+ T 세포의 NRP-2 발현을 입증하는 데이터를 제시한다. 도 26은 비활성 및 미토겐 (항-CD3/CD28) 활성 인간 CD4+ T 세포에서, qPCR에 의해 평가되는 바와 같이, NPR-2 발현 그래프를 도시한다. 도 26b는 Ficoll에 의해 분리된 인간 모세혈 세포의 CD4+ 하위 세트에서, FACS에 의해 평가되는 NRP-2 발현 그래프를 도시한다. 도 26c는 FACS에 의해 평가되는 바와 같이, 모세혈 세포의 CD4, FoxP3 및 NRP-2 단백질 레벨 그래프를 도시한다. 이 데이터는 도 22에서 나타낸 것과 유사하다.
도 27a-27f는 쥣과 동물 CD4+ T 세포의 NRP-2 발현을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 27A는 쥣과 동물 비장 및 림프절 내의 CD4+ T 세포에서, NRP-2의 FACS 분석을 입증한다. 도 27b는 쥣과 동물 비장으로부터 음성 선택에 의해 분리된 CD4+ T 세포의 그래프를 도시한다. NRP-2 발현을 비활성 및 미토겐 (항-CD3/CD28) 활성 세포에서, qPCR에 의해, 평가하였다. 도 27c는 분리된 CD4+ T 세포의 플렉신 A 패밀리 분자 발현 그래프를 도시한다. 도 27d는 쥣과 동물 비장으로부터 음성 선택에 의해 분리된 CD4+ T 세포의 Foxp3+ 및 Foxp3 음성 하위 세트에서, NRP-2 발현을 도시한다. 도 27e는 미토겐 활성화 (항-CD3-1mcg/㎖)된 분리된 비장 CD4+ T 세포의 NRP-2 발현을 도시한다. 도 27f는 표준 배양 배지 (미토겐+TGFb+항-IL-4+항-IFNg+레티노산)에서, 유도된 Treg 세포로 분화 유도된 CD4+ T 세포의 NRP-1/2 발현을 도시한다. 이들 데이터는 도 7 및 9에 나타낸 것과 유사하다.
도 28a-28d는 SEMA3F가 Akt, mTOR 및 S6K의 인산화를 억제한다는 것을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 28a는 30분 동안, SEMA3F (640 ng/㎖) 처리 후 또는 미처리된 (대조군) U87MG 세포를 도시한다. 포스포단백질 키나아제 항체 어레이에 의해, 세포 용해물을 평가하였다. 각 dot/포스포단백질의 강도를, 표 1에 제시된 바와 같이, Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 도 28b는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가된 어레이의 결과를 도시한다. 도 28c는 시간 경과에 따라, 최장 60분 동안 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리한 후, 웨스턴 블롯에 의해 분석한 U87MG 세포를 도시한다. 도 28b-28c는 3개의 대표 독립 실험이다. 도 28d는 15분 (회색 막대) 또는 30분 (흑색 막대) 동안, SEMA3F (200, 600, 1800 ng/㎖, 좌측으로부터 우측의 막대)로 처리된 U87MG, Jurkat 및 HUVEC 세포를 도시하며; 양성 대조군으로서, HUVEC를 15 및 30분 동안, VEGF-A (25 ng/㎖)로 처리하였다. 또한, HUVEC를 30분 동안, 대조군으로서, PBS 또는 SEMA3F (1800 ng/㎖)로 전처리한 후, VEGF-A (25 ng/㎖)를 15분 및 30분 동안, 배양액에 첨가하였다. PI-3K 활성을 제조사의 지침에 따라, ELISA에 의해, 분석하였다. 데이터는 3개의 실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 29a-29d는 SEMA3F가 mTORC1 및 mTORC2 둘 모두의 복합체 형성을 붕괴한다는 것을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 29a는 30분 동안 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리한 후, 도시된 바와 같이, 항-mTOR, -raptor 및 -rictor에 의해, U87MG 세포에 적용된 면역침전법 및 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 29b는 60분 동안의 SEMA3F (640 ng/㎖) 처리 전에, 30분 동안 라파마이신 (10 nM) 또는 Torin 1 (10 nM)로 처리된 U87MG 세포를 도시하며; 용해물을 웨스턴 블롯에 의해, 분석하였다. 도 29C는 미처리 대조군에 비교된 강도 (평균 ± SD)의 배수 변화를 보여주는 도시된 블롯의 농도계 분석을 나타내는 막대 그래프를 도시한다 (*, p < 0.01; **, p < 0.001, 미처리 대조군 대비). 도 29d는 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 구성적으로 활성인 Akt (2DAkt)로 일시적으로 형질도입된 U87MG 세포를 도시한다. 세포를 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리하고, 용해물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 모든 데이터는 3개의 독립 실험을 나타낸다.
도 30a-30e는 mTORC2가 SEMA3F-유도 RhoA 불활성화 및 스트레스 섬유 손실에 관여한다는 것을 입증하는 데이터를 나타낸다. 도 30a는 30분 동안 SEMA3F (640 ng/㎖), 라파마이신 (10 nM) 또는 Torin 1 (10 nM)로 처리된 U87MG 세포를 도시한다. 그 후, 세포를 Alexa Fluor 488 팔로이딘과 Hoechst 33342로 염색하여, ㄹ-DORXLS 세포 골격 스트레스 섬유 및 세포 핵을 확인하였다. 대표적 세포 염색이 각 패널에 제시되며; 막대 그래프는 3개의 독립 실험의 평균으로서, 섬유/세포의 평균 ± SD 수를 나타낸다. 스캐일 바는 20 μm을 나타낸다. 도 30b는 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 야생형 (WT) mTOR 플라스미드로 일시적으로 형질도입시킨 후, 18시간 후, 30분 동안, SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리된 U87MG 세포를 도시한다. 세포를 도 30a에서 개시된 바와 같이, 염색하였다. 대표적 세포 염색이 제시되며; 막대 그래프는 3개의 독립 실험으로부터의 섬유/세포 (평균 ± SD)의 수를 나타낸다. 도 30c는 대조군 siRNA 또는 raptor- 또는 rictor-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입된 U87MG 세포를 도시한다. 48시간 후, 이것을 30분 동안 SEMA3F로 처리한 후, 상기와 같이, Alexa Fluor 488 팔로이딘 및 Hoechst 33342로 염색하였다. 스트레스 섬유의 수를 3개의 독립 실험에서, 평가하였으며, 평균 ± SD로 제시한다. 도 30d는 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 본 발명자들의 WT mTOR 플라스미드로 일시적으로 형질도입된 U87MG 세포를 도시한다. 18시간 후, 세포를 10분 동안 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리한 후, RhoA 활성을 평가하였다. 도 30E는 대조군 siRNA 또는 raptor- 또는 rictor-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입된 U87MG 세포를 도시하며, 10분 동안 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리한 후, RhoA 활성을 분석하였다. 도 30d-30e에서, 활성 RhoA의 강도를 각각의 총 RhoA로 정규화하였으며; 각각의 겔 레인 밑의 숫자는 대조군에 비교된 강도의 배수 변화를 나타낸다. 도 30d-30e는 3개의 독립 실험을 나타낸다.
도 31a-31d는 SEMA3F가 mTOR-Akt 신호의 억제를 통해, VEGF를 억제한다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 도 31a-31b는 내부 대조군으로서, pGL4.74[hRluc/TK] 및 전장의 인간 VEGF 프로모터 루시퍼라아제로 일시적으로 공동 형질도입된 U87MG 세포를 도시한다. 세포를 저산소증 챔버 (1% O2)에서, 세포 배양액 또는 DFO (250 μM)의 첨가 전에, SEMA3F (640 ng/㎖, 30분 동안)로 처리하였다. 18시간 후, VEGF 프로모터 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 도 31c는 본 발명자들의 VEGF 프로모터 루시퍼라아제 및 pGL4.74[hRluc/TK] 플라스미드 및 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 본 발명의 구성적으로 활성인 Akt (2DAkt)로 일시적으로 공동 형질도입된 U87MG 세포의 그래프를 도시한다. 세포를 DFO의 첨가 전에, 30분 동안, SEMA3F로 처리하였다. 18시간 후, VEGF 프로모터 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 도 31d는 DFO의 첨가 전에, 30분 동안, 지시된 바와 같이, SEMA3F, 라파마이신 (10 nM), Torin 1 (10 nM) 단독으로 또는 조합하여, 처리된 모체 U87MG 세포의 그래프를 도시하며, 배양 상청액을 18시간 후 수집한 후; VEGF 단백질 레벨을 ELISA에 의해, 분석하였다. 각 패널에서, 데이터는 3개의 독립 실험을 나타낸다. 막대 그래프는 삼중 수행된 n=3 실험의 평균 ± SD를 나타낸다 *, p < 0.01, 대조군 대비.
도 32a-32e는 SEMA3F가 생체 내에서 이종 이식편에서 인간 종양의 성장을 억제한다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 도 32a는 누드 마우스에 피하 이식된 모체 U87MG 세포 (Mock) 및 인간 SEMA3F 안정 클론 (S3F)을 도시한다 (1 x 106 세포/주입). 삽도는 각 세포주에서 SEMA3F 발현의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 종양 크기를 지정 시점에 표준 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 괄호 안의 숫자는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다. 도 32b는 24일 후에 수집된 종양의 대표적인 면역조직화학적 항-CD31 염색을 도시한다. 도 32c는 누드 마우스에 피하 투여된 U87MG 세포 (1 x 106 세포/주입)를 도시한다. 2일 후, 대조군 (Ad-Cont) 또는 인간 SEMA3F-His (Ad-3F)-재조합 아데노바이러스 (1 x 109 pfu)를 꼬리 정맥을 통해, 정맥 내 주입하였다. 종양 크기를 지정 시점에 표준 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 괄호 안의 숫자는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다. 마우스를 14일째에 희생시켰다. 삽도는 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의한 간 내의 SEMA3F 발현 (14일째)을 보여준다. 도 32d는 항-CD31을 이용한 종양의 대표적인 면역조직화학 염색을 도시한다. 도 32e는 종양 샘플 내 Akt/mTOR 신호 전달 경로의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 32b, 32d, 및 32e는 3개의 독립 실험의 결과를 나타낸다.
도 33은 SEMA3F-NRP2/플렉신 A1 상호 작용에 의해 매개되는 조절 신호 전달 경로를 보여주는 개략도를 도시한다. SEMA3F는 NRP2-플렉신 A1 복합체와 결합하며, PTEN과 연계하여, PI-3K 및 mTORC2/Akt-의존적 신호 전달을 불활성화시킨다. 수용체 매개 신호는 또한 종양 세포 주에서 PTEN 독립적 기작을 통해 mTORC2/Akt 신호 전달을 불활성화시킬 수 있다. 기능적으로, 이러한 조절/사전 해소 (proresolution) 신호는 세포 증식, 이동, 세포 골격 스트레스 섬유 재배열 및 세포 생존 기간을 억제한다. SEMA3F는 또한 부분적으로 ABL2 키나아제 및 p190RhoGAP6을 통해, RhoA를 불활성화함으로써, 세포 골격 구조를 억제하며; 현재의 연구는 RhoA의 불활성화 및 세포 골격 스트레스 섬유 재배열이 또한 mTORC2의 억제를 통해 매개되는 것을 보여준다.
도 34a-34d는 SEMA3F에 의해 조절되는 세포 내 신호 전달 경로 분석을 도시한다. 도 34a는 SEMA3F 또는 PBS로 60분 동안 처리된 U87MG 세포의 pAkt, pmTOR 및 pS6K의 발현에 대한 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 34b는 웨스턴 블롯을 도시한다. U87MG 세포를 대조군 또는 플렉신 A1-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입시켰다. 48시간 후, 세포를 SEMA3F (640 ng/㎖)로 30 분 및 60분간 처리한 후, 웨스턴 블롯에 의해, 분석하였다. 도 34c는 다중 세포주를 이용한, NRP2 및 플렉신 A1 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 34d는 30분 동안, SEMA3F로 처리된 다중 NRP2-발현 세포주의 웨스턴 블롯을 도시한다. 제공된 모든 데이터는 3개의 독립 실험을 나타낸다.
도 35a-35b는 mTORC2 활성에 대한 SEMA3F의 효과 분석을 도시한다. 도 34a는 웨스턴 블롯을 도시한다. U87MG 세포를 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 구성적으로 활성인 Akt (2DAkt)로 일시적으로 형질도입시켰다. 세포를 SEMA3F (640 ng/㎖)로 처리한 후, 용해물을 웨스턴 블롯에 의해, 분석하였다. 도 35b는 웨스턴 블롯을 도시한다. U87MG 세포를 pcDNA3.1 빈 벡터 또는 2DAkt로 일시적으로 형질도입시켰다. 세포를 SEMA3F (640 ng/㎖)로 30분 동안 처리한 후, 도시된 바와 같이, 항-mTOR, 및 항-rictor를 이용한 면역침전법 및 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다.
도 36a는 웨스턴 블롯을 도시한다. HUVEC를 SEMA3F (1800 ng/㎖)로 30분간 처리한 후, 도시된 바와 같이, 항-NRP2 및 -PTEN을 이용하여, 면역침전법 및 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 도 36b는 웨스턴 블롯을 도시한다. HUVEC를 SEMA3F 처리 (1800 ng/㎖) 전에, 대조군 또는 플렉신 A1-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입시키고; 용해물을 도시된 바와 같이, 항-NRP2 및 항-PTEN을 이용하여, 면역침전법 및 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 도 36c는 웨스턴 블롯을 도시한다. HUVEC를 SEMA3F 처리 (1800 ng/㎖) 전에, 대조군 또는 PTEN-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입시키고; 용해물을 웨스턴 블롯에 의해, 분석하였다. 도 36d는 웨스턴 블롯을 도시한다. U87MG 세포를 대조군 또는 GIPC1-특이적 siRNA (20 nM)로 형질도입시켰다. 48시간 후, 세포를 30분 동안, SEMA3F (좌측에서 우측으로 200, 600, 1800 ng/㎖)로 처리한 후, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 도 36e는 웨스턴 블롯을 도시한다. 30분 및 60분 동안의 SEMA3F (640 ng/㎖)의 조합 전에, U87MG 세포를 30분 동안, UO126 (10 μM)으로 처리하였다. Akt 및 MAPK 신호 전달을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 제공된 모든 데이터는 3개의 독립 실험을 나타낸다.
도 37은 이식 후, 5일째에, 도 2에서 확인된 마우스로부터 수집된 세포의 표현형을 도시한다. 차이가 없음을 입증하는 FACS 분석 및 그래픽 개요를 이식 후, 초기에, CD3, CD4, CD8 및 Treg 군에서 관찰하였다.
도 38은 세마포린-뉴로필린-2 상호작용의 도식적 모델을 도시한다.
도 39는 NRP-2의 녹다운이 과활성을 초래하는 것으로 밝혀진 도 11-16 및 도 23의 추적 결과이다. 당해 도면에서, T 세포는 배양시, 미토겐 활성화되었으며, 다양한 효과기 표현형으로의 반응이 유도되었다. 당해 그래프에서, NRP-2 녹아웃 CD4+ T 세포에서, CD4+ T 효과기 세포 분화가 향상된다.
도 40은 도 5 및 도 25의 조합 데이터로서, NRP-2 결여가 증가된 심장 동종 이식편 거부 반응을 초래한다는 것을 입증한다. 당해 도면은 소수 MHC 불일치 B6.C-H2bm12 공여체 심장이 C57BL6 (WT) 또는 NRP-2 이형접합, 전체 또는 CD4+ T 세포 KO 수용체로 이식된 후, 생존 기간 그래프를 도시한다.
도 41은 생체 내에서, 아데노바이러스에 의한 NRP-2 리간드 Sema3F의 생성을 입증하는 데이터를 제시한다. 도 2, 6 및 32에서, Sema3F 또는 빈 대조군을 함유하는 아데노바이러스를 마우스에 투여하였다. 이 도면에서, 이러한 접근법이 Sema3F 생성을 초래한다는 것이 입증된다. 우측 부분은, 간의 감염 및 Sema3F 생성을 도시하는 웨스턴 블롯을 제시한다. 좌측 부분은, ELISA에 의해, 투여 후, 14일째에, Sema3F 레벨이 최고인 것이 관찰된 것을 보여준다. 따라서, 도 2, 6 및 32의 경우, 투여 후, 14일에, Sema3F 발현이 최고이고, 23일 후, 그 레벨이 감소된 것일 수 있다.
본 명세서에서는, Sema3F 및 NRP-2의 상호작용이 면역계를 억제한다는 본 발명자들의 연구 결과에 기초한 면역조절 방법이 개시된다. 따라서, 이러한 상호 작용의 증가 또는 강화는 면역 반응을 억제할 수 있으며, 상기 상호 작용의 억제 또는 감소시는 면역 반응을 상향 조절할 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에서는, 대상체의 면역계를 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 면역계의 억제 방법은 염증성 병증을 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역계의 억제 방법은 이식편 거부 반응 (예를 들어, 동종 이식편 거부 반응) 등을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 본 명세서에서는, 세포에서, Akt/mTOR 신호 전달을 억제하는 방법으로서, 세포와 Sema3F 작용제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일 측면에서, 본 명세서에서는, 대상체에서, Akt/mTOR 신호 전달을 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역계의 억제"는 면역계의 다양한 면역 기능의 임의의 파라미터에 의해 측정되는 것으로서, 동물의 면역 기능을 감소 또는 억제하는 것을 지칭한다. 면역 기능의 파라미터의 비 제한적인 예로는 항체 반응, B 세포 반응, T 세포 반응, T 세포 증식, 면역 조절 사이토카인의 생성 및/또는 항원 (예: 동종 또는 이종 세포)에 대한 반응의 크기가 포함될 수 있다. 반대로, "면역계의 자극"은 면역계의 다양한 면역 기능의 임의의 파라미터에 의해 측정 되는 것으로서, 동물의 면역 기능의 증가 또는 활성화를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이식편 거부 반응" 또는 "이식체 거부 반응"은 숙주 이외의 공급원에서 유래한 조직이나 장기에 대한 임의의 면역 매개 초고 급성, 급성 또는 만성 손상을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 세포 및 항체-매개 거부 반응뿐만 아니라 동종 이식편 및 이종 이식편 양자의 거부 반응을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역계의 억제는 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. "이식편-대-숙주 질환 (GVHD)"은 환자 자신의 조직에 대한 기증 조직의 반응이다. GVHD는 골수 이식에 의한 경우, 가장 많이 나타나지만, 다른 조직이나 세포의 이식체에 의해, 유발될 수 있다. GVHD는, 조직 기증자가 환자와 관련이 없거나, 기증자가 환자와 관련이 있지만, 완벽하게 일치하지 않는 경우에 가장 많이 나타난다. GVHD에는 두 가지 형태가 있다: 백혈구가 증가하는 이식 직후 유발되는 급성 GVHD라고 불리는 초기 형태 및 만성 GVHD라고 불리는 후기 형태.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "염증"은 병원균, 손상된 세포 또는 자극물과 같은 유해한 자극에 대한 생물학적 복합 반응을 지칭한다. 염증은 조직에서, 치유 과정을 개시하고, 또한, 유해한 자극을 제거하는 유기체에 의한 방어 시도이다. 따라서, 용어 "염증"은, 염증전 사이토카인, 염증 매개체의 생성 및/또는 이와 같이 생성된 사이토카인의 작용에 기인하는 관련 하류 세포 사건, 예를 들어 발열, 체액 축적, 부종, 농양의 생산 및 세포 사멸을 유도하는 임의의 세포 과정을 포함한다. 염증전 사이토카인 및 염증 매개체에는, 이로 제한되는 것은 아니나, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, TNF-α, 백혈구 억제 인자 (LIF), IFN- γ, 온코스타틴 M (OSM), 섬모 신경 영양 인자 (CNTF), TGF-β, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 염증성 세포를 화학적으로 유발하는 케모카인이 포함된다. 염증에는 급성 반응 (즉, 염증성 과정이 활성화되는 반응)과 만성 반응 (즉, 느린 진행 및 새로운 결합 조직의 형성으로 나타나는 반응) 둘 모두가 포함될 수 있다. 급성 및 만성 염증은 관련된 세포 유형에 의해 구별될 수 있다. 급성 염증은 종종 다핵성 호중구를 수반하며; 만성 염증은 일반적으로 림프조직구증다증 및/또는 육아종성 반응을 특징으로 한다.
염증성 병증은 염증성 조직 (예: 림프구, 호중구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 수지상 세포와 같은 백혈구의 침윤) 또는 질환 상태의 비정상적인 임상 및 조직학적 특징을 유발하거나 그에 기여하는 염증 과정을 특징으로 한다. 염증성 병증에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 피부의 염증성 병증, 폐의 염증성 병증, 관절의 염증성 병증, 장의 염증성 병증, 안구의 염증성 병증, 내분비 계의 염증성 병증, 심혈관계의 염증성 병증, 신장의 염증성 병증, 간의 염증성 병증, 중추 신경계의 염증성 병증, 또는 패혈증 관련 병증이 포함된다. 일부 실시형태에서, 상기 염증성 병증은 상처 치유와 관련된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 방법에 따라 치료되는 염증은 피부 염증; 약물 남용 또는 마약 중독에 의해 야기되는 염증; 감염과 관련된 염증; 각막의 염증; 망막의 염증; 척수의 염증; 기관 재생과 관련된 염증; 및 폐 염증일 수 있다.
일부 실시형태에서, 염증성 병증은 자가 면역 질환일 수 있다. 자가 면역 질환의 비 제한적 예에는 제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염이 포함될 수 있다. 자가 면역 질환은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 ["Automimmue Diseases Research Plan" Autoimmune Disease Coordinating Committee, NIH Publication No. 03-510, December 2002]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 염증, 상처 치유 또는 통증 조절을 위한 치료를 필요로하는 대상체는 턱관절 장애; COPD; 연기 유발 폐 손상; 신장 투석 관련 장애; 척수 손상; 이식편 대 숙주 질환; 골수 이식 또는 그의 합병증; 감염; 외상; 통증; 절개; 외과 절개; 만성 통증 장애; 만성 뼈 장애; 유선염 및 관절 질환을 앓고 있거나 진단받은 대상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 외상에는 격투 관련 손상 또는 수술 과정 동안 유발된 조직 손상이 포함될 수 있다. 연기 유발 폐 손상은 담배 연기, 환경오염 물질 (예를 들어, 스모그 또는 산불) 또는 산업적 노출로부터 초래될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 피부의 염증성 병증, 예를 들어 스위트 증후군, 피하마 괴저증, 각막층하 점막 피부염, 지속융기성홍반, 베체트 병 또는 급성 일반 전신성 잔주름, 수포성 장애, 건선, 병증 유발 농포성 장애, 여드름, 심상성 좌창 (acne vulgaris), 피부염 (예: 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 습진 피부염, 습진 균열 (eczema craquelee), 광 알레르기성 피부염, 광독성 피부염, 식물광 피부염, 방사선 피부염, 정체피부염 또는 알레르기 접촉성 피부염), 습진, 궤양 및 외상, 화상, 피부 또는 점막의 허혈, 여러 형태의 어린 선, 표피 박리, 과형성 흉터, 켈로이드, 노화의 고유 피부 변화, 광피부변화, 피부의 기계적 전단에 의한 마찰성 발포 유발 짓무름, 코르티코스테로이드의 사용의 국소 사용 유발 피부 위축, 및 점막의 염증 (예를 들어, 입술염, 갈라진 입술, 비강 염증, 점막염 및 외음부 질염)일 수 있다.
비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 폐의 염증성 병증, 예를 들어 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 부비동염, 폐기종, 성인 호흡 곤란 증후군, 폐 염증, 폐 섬유증 및 낭성 섬유증 (위장관 또는 다른 조직 (들)이 추가적 또는 대안적으로 포함될 수 있음)일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 관절의 염증성 병증, 예를 들어 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 연소성 류마티스 관절염, 골관절염, 통풍성 관절염, 전염성 관절염, 건선 관절염 및 기타 관절염 병증일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 장 또는 창자의 염증성 병증, 예를 들어 염증 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염 및 원위 직장염일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 안구의 염증성 병증, 예를 들어 건성안 증후군, 포도막염 (홍채염 포함), 결막염, 공막염 및 건성각 결막염일 수 있다. 비 제한적 예로, 염증성 병증은 내분비계의 염증성 병증, 예를 들어 자가 면역 갑상선염 (하시모토 병), 그레이브스 병, I 형 당뇨병, 및 부신 피질의 급성 및 만성 염증일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 심혈관계의 염증성 병증, 예를 들어 관상 동맥 경색 손상, 말초 혈관 질환, 심근염, 혈관염, 협착의 재관류, 동맥경화 및 II 형 당뇨병 관련 혈관 질환일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 신장의 염증성 병증, 예를 들어, 사구체 신염, 간질 신염, 루푸스 신염 및 베게너 병에 이은 신염, 급성 신염에 이은 급성 신부전, 폐쇄 후 증후군 및 관상 허혈일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 간의 염증성 병증, 예를 들어 간염 (바이러스 감염, 자가 면역 반응, 약물 치료, 독소, 환경 제제 (environmental agent)로부터 유발되거나 또는 1차 장애의 2차 결과로서 유발), 담즙 폐쇄증, 원발성 담즙 성 경화증 및 원발성 경화성 담관염일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 중추 신경계의 염증성 병증, 예를 들어, 다발성 경화증 및 신경퇴행성 질환, 예를 들어 알츠하이머 병 또는 HIV 감염과 관련된 치매일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 중추 신경계의 염증성 병증, 예를 들어 MS; 모든 종류의 뇌염 및 수막염; 급성 전염 뇌척수염; 급성 횡단성 척수염; 시신경척수염; 국소 탈수초성 증후군 (예를 들어, 발보의 동심 경화증 (Balo's concentric sclerosis) 및 MS의 Marburg 변이체); 진행성 다병성 백질 뇌증; 아급성 경화성 범 뇌염; 급성 출혈성 루코뇌증 (허스트 병); 인간 T- 림프성 바이러스 1형 관련 척수증/열대성 마비 부전; 데빅병; 인간 면역 결핍 바이러스 뇌증; 인간 면역 결핍 바이러스 수포성 골수 병증; 말초 신경병증; 길랑 발레 증후군 및 기타 면역 매개 신경병; 및 중증 근무력증일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 염증성 병증은 패혈증 관련 병증, 예를 들어, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈성 쇼크 또는 다발성 장기 기능 이상 증후군 (MODS)일 수 있다. 염증성 병증의 추가의 비 제한적인 예로는 내독소 쇼크, 치주 질환, 다발 연골염; 관절 주위 질환; 췌장염; 전신 홍반성 루푸스; 쇼그렌 증후군; 혈관염 유육종증 아밀로이드증; 알레르기; 아나필락시; 전신 비만 세포증; 골반 염증성 질환; 다발성 경화증; 다발성 경화증 (MS); 복강경 경화증, 길랑 발레 증후군, 경화성 담관염, 자가 면역 간염, 레이노 현상, 굿파슈어 증후군, 베게너 육아종증, 류마티스성 다발근통, 측두 동맥염/거세포동맥염, 만성 피로 증후군 CFS),자가 면역성 애디슨 병, 강직성 척추염, 급성 파종성 뇌척수염, 항 인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증 근무력증, 안구간대경련 근간대경련 증후군, 시신경염, 오드 갑상선염, 천포창, 악성 빈혈, 개의 다발성 관절염, 라이타 증후군, 타카야스 동맥염, 온 자가 면역 용혈성 빈혈 (warm autoimmune hemolytic anemia), 섬유 근육통 (fibromyalgia, FM), 자가 염증성 PAPA 증후군, 가족성 중기 열, 류마티스성 다발근통, 결절성 다발 동맥염, 처그 스트라우스 증후군; 섬유성 폐포염, 과민성 폐렴, 알레르기성 아스페르길루스증, 원인불명 폐 호산구 증가증, 폐쇄성 기관지염 폐색성 조직 폐렴; 두드러기; 루푸이드 간염; 가족성 저온 자기 염증성 증후군 (FCAS), 맥클-웰즈 증후군, 신생아 발병 다중 시스템 염증성 질환, 이식편 거부 반응 (동종 이식편 거부 반응 및 이식편-대-숙주 질환 포함), 이염, 만성 폐색성 폐질환, 부비동염, 만성 전립선염, 재관류 손상, 규폐증, 염증성 근 질환, 과민증 및 편두통일 수 있다. 일부 실시형태에서, 염증성 병증은 감염, 예를 들어 바이러스성, 세균성, 곰팡이 성, 기생충 또는 프리온 감염과 관련된다. 일부 실시형태에서, 염증성 병증은 알레르기 반응과 관련된다. 일부 실시형태에서, 염증성 병증은 오염 물질과 관련된다 (예를 들어, 석면폐증, 규폐증 또는 베릴륨증).
일부 실시형태에서, 상기 염증성 병증은 국소 병증, 예를 들어, 발진 또는 알레르기 반응일 수 있다.
일부 실시형태에서, 염증은 상처와 관련된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 기술은 상처 치유를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상처"란 일반적으로 외부의 충격, 기계적 기관 또는 전염병으로 인한 조직 분열 또는 막 (예를 들어, 피부) 파열과 관련된 유기체의 기관 또는 조직의 손상을 광범위하게 의미한다. 상처는 상피 조직, 내피 조직, 결합 조직, 안구 또는, 조직의 강도 및/또는 무결성이 저하된 경우, 예를 들어 외상으로 인해 조직에 손상이 야기된 경우의 기타 임의의 유형의 상처일 수 있다. 용어 "상처"란, 이로 제한되는 것은 아니나, 열상, 찰과상, 궤양, 절개, 화상, 속도 상처 (velocity wound) (예를 들어, 탄환 상처 (gunshot wound)), 관통 상처, 찔린 상처, 타박상, 당뇨병 상처, 혈종, 찢어진 상처, 및/또는 분쇄 손상을 포함한 손상을 포괄한다. 일 측면에서, 용어 "상처"는 다양한 특성을 가진 것으로서, 다양한 방식 중 임의의 하나로 개시된 피부 및 피하 조직에 대한 손상 (예를 들어, 장시간 침대 사용에 의한 욕창, 외상, 절개, 궤양, 화상 등으로 인한 상처)을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상처 치유"는 상처 입은 유기체가 상처 부위 (예를 들어, 피부)에서 조직의 복구를 개시하는 과정을 지칭한다. 상처 치유 과정에는 부분적으로 신생혈관 생성 및 상처 조직의 혈관 재개화가 필요하다. 상처 치유는 당업자에게 알려진 바와 같이, 수축, 상처 면적, 폐쇄 백분율 (percent closure), 폐쇄율 백분율 및/또는 혈관 침윤과 같은 파라미터를 평가함으로써, 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 입자 및 조성물은 상처 치유를 위해, 국소 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 표적, 예를 들어 NRP-2의 레벨 및/또는 활성을 증가시키는 임의의 제제를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는, 표적의 발현 및/또는 활성을 적어도 10% 이상, 예를 들어, 10% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 500% 이상, 또는 1000% 이상 증가시키는 제제를 지칭한다. Sema3F의 작용제의 비 제한적인 예에는 Sema3F 폴리펩티드 또는 그의 작용제 단편 및 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5를 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 2 또는 그의 변이체의 서열을 포함하는 핵산이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Sema3F"는 NRP-1과 비교하여, NRP-2에 우선적으로 결합하는 클래스 III 세마포린의 멤버를 지칭한다. 다수의 종의 Sema3F 폴리펩티드 및 핵산의 서열 예를 들어, 인간 Sema3F (NCBI Gene ID: 6405) 폴리펩티드 (서열번호 1; NCBI Ref Seq: NP_004177) 및 핵산 (서열번호 2; NCBI Ref Seq: NM_004186)은 당업계에 공지되어 있다. Sema3F의 레벨은 혈액, 혈청 및/또는 혈장에서 평가할 수 있으며, Sema3F의 활성은, 예를 들어 Sema3F와 NRP-2의 결합 레벨, 선택 NRP-2 신호 전달 반응, Sema3F 활성의 증가가 감소된 면역 반응 및/또는 동종 면역 반응에 의해 입증되는 경우의 면역 반응성 파라미터 (예를 들어, 사이토카인 반응성, 프라이밍 (priming) 또는 이식 후 세포 이동)의 활성 및/또는 레벨을 측정함으로써, 판단할 수 있다.
일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 Sema3F 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Sema3F 폴리펩티드"에는 인간 폴리펩티드 서열번호 1, NCBI Ref Seq: NP_004177), 성인 폴리펩티드 (서열번호 5); 뿐만 아니라, 이로 제한되는 것은 아니나, 소, 개, 고양이, 닭, 쥐과 동물, 랫트, 돼지, 양, 칠면조, 말, 어류, 개코원숭이 및 다른 영장류를 포함한 다른 종의 상동체가 포함될 수 있다. 또한, 상기 용어는, 예를 들어 적당한 동물 모델에서 측정되는 바와 같이, 서열번호 1 또는 서열번호 5의 전장의 Sema3F의 활성 또는 효과, 예를 들어 동종 이식편 거부 반응의 적어도 50%가 유지되는 Sema3F의 단편 또는 변이체를 지칭한다. 야생형 Sema3F의 활성을 유지하는 보존적 치환 변이체는 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 보존적 치환을 포함 할 것이다. 야생형의 활성의 적어도 50%를 유지하면서 보존적 치환에 내성을 가질 가능성이 가장 높은 아미노산의 확인은, 예를 들어 다른 종의 Sema3F 상동체 또는 파라로그와의 서열 정렬에 의해 유도된다. Sema3F 상동체 간에 동일한 아미노산은 변화를 용인할 가능성이 작으나, 보수적인 차이를 나타내는 것은 인공 변이체와 관련하여 보수적인 변화를 용인할 가능성이 분명하게 훨씬 크다. 유사하게, 비 보존적 차이가 있는 위치는 기능을 수행하는데 중요하지 않으며, 인공 변이체에서 보수적 치환을 용인할 가능성이 더 크다. 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 변이체, 단편 및/또는 융합 단백질은 동종 이식편 거부 반응의 적절한 동물 모델에 상기 변이체를 투여함으로써, 활성 여부를 시험할 수 있다. Sema3F 및 NRP-2의 구조에 대한 추가 논의는, 예를 들어 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 [Klagsbrun M, Eichmann A, Cytokine Growth Factor Rev, 2005]에서, 찾아볼 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, Sema 3F 폴리펩티드는 본 명세서에서 개시되는 서열의 변이체, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 Sema3F 폴리펩티드의 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 변이체는 보존적 치환 변이체이다. 변이체는, 예를 들어 천연 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해, 얻어질 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같이, "변이체"는 천연 또는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이나, 하나 또는 복수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해, 천연 또는 참조 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드-인코딩 DNA 서열은, 천연 또는 참조 DNA 서열과 비교할 때, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 야생형 Sema3F뿐만 아니라, 참조 단백질에 비해 관련 생물학적 활성을 보유하는 것으로서, 예를 들어 동종 이식편 거부 반응을 적어도 50% 억제할 수 있는 변이체 단백질 또는 그의 단편을 인코딩하는 서열을 포괄한다. 아미노산 서열에 관해서, 당업자는, 인코딩된 서열의 아미노산의 낮은 백분율 (즉, 5% 이하, 예를 들어, 4% 이하, 또는 3% 이하, 또는 1% 이하) 또는 단일 아미노산을 변경시키는 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 첨가가, 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 초래하는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인지할 것이다. 일부 변화는, 보존적이든 그렇지 않든 간에, 변이체가 야생형 Sema3F의 활성의 100% 이상, 예를 들어, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 500%, 1000% 이상을 가지도록 관련 활성을 잠재적으로 향상시킬 수 있는 것으로 예상된다.
치환될 수 있는 아미노산 잔기를 확인하는 하나의 방법은, 예를 들어 인간 Sema3F를 하나 이상의 비인간 종의 Sema3F 상동체에 정렬시키는 것이다. 정렬은 기능에 필요할 수 있는 잔기뿐만 아니라, 반대로, 변화를 용인할 수있는 잔기에 관한 지침을 제공 할 수 있다. 예를 들어, 정렬이 상응하는 위치에서 2개의 동일하거나 유사한 아미노산을 나타내는 경우, 그 자리가 기능적으로 중요할 가능성이 더 크다. 반대로, 정렬이 상응하는 위치의 잔기가 크기, 전하, 소수성 등이 현저하게 다른 것을 나타내는 경우, 그 자리가 기능성 폴리펩티드의 변이를 용인할 가능성이 더 크다. 변이체 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 또는 참조 서열, 예를 들어, 서열번호 1 또는 이들 아미노산 서열 중 하나를 인코딩하는 핵산과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 이상 동일할 수 있다. 천연 서열과 돌연변이 서열 사이의 상동성 정도 (동일성 백분율)는, 예를 들어 전세계 웹상에서, 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되는 자유롭게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 서열을 비교함으로써, 측정될 수 있다. 상기 변이체 아미노산 또는 DNA 서열은, 이것이 유도된 서열 (본 명세서에서, "본래의" 서열로 지칭됨)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 이상 유사할 수 있다. 본래의 서열과 변이체 서열 간의 유사성 정도 (유사성 백분율)는, 예를 들어 유사성 행렬 (Similarity matrix)을 사용함으로써, 측정될 수 있다. 유사성 행렬은 당업계에 잘 알려져 있으며, 기본 파라미터 설정 (default parameters set)에 의해, 유사성 행렬을 사용하여 두 개의 서열을 비교하기 위한 다수의 수단이 온라인, 예를 들어, BLASTp (world wide web 주소 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능)에서, 자유롭게 이용 가능하다.
지정 아미노산은 유사한 물리 화학적 특성을 갖는 잔기로 대체될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 지방족 잔기가 다른 지방족 잔기 (예를 들어, Ile, Val, Leu 또는 Ala 서로 간)로 치환되거나, 하나의 극성 잔기가 서로 간에 (예를 들어, Lys과 Arg 사이, Glu와 Asp 사이; 또는 Gln과 Asn 사이) 치환될 수 있다. 기타 이러한 보존적 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특성을 가지는 전체 영역의 치환이 잘 알려져있다. 천연 또는 참조 폴리펩티드의 원하는 활성이 유지된다는 것을 확인하기 위해, 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 본 명세서에 개시되는 하나의 임의의 분석에서 시험할 수 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업계에 잘 알려져 있다. 이렇게 보존적으로 변형된 변이체는, 본 명세서에 일관된 것으로서, 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립 유전자에 첨가되거나 또는 이를 배제하지 않는다. 일반적으로 서로에 대한 보존적 치환에는 하기의 것이 포함된다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린 (S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)]을 참조한다).
또한, 폴리펩티드의 적절한 입체구조를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 비정상적인 가교 결합을 방지하기 위해, 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 폴리펩티드에 첨가되어 그 안정성을 향상시키거나, 올리고머화를 촉진시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체에 투여되는 폴리펩티드, 예를 들어, Sema 3F 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치환 및/또는 변형은 대상체에서, 단백질 분해를 방지 또는 감소시킬 수 있고/거나, 폴리펩티드의 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 비 제한적 예로, 트랜스페린 (WO06096515A2), 알부민 (Yeh et al., 1992), 성장 호르몬 (US2003104578AA); 셀룰로오스 (Levy and Shoseyov, 2002); 및/또는 Fc 단편 (Ashkenazi and Chamow, 1997) 등의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 접합 또는 융합됨으로써, 변형될 수 있다. 전술한 단락에서의 인용 문헌은 그의 전문이 본 명세서에서 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 폴리펩티드, 예를 들어, Sema3F 폴리펩티드는 적어도 하나의 펩티드 결합 대체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 Sema3F 폴리펩티드는 하나의 유형의 펩티드 결합 대체 또는 여러 가지 유형의 펩티드 결합 대체, 예를 들어 2가지 유형, 3가지 유형, 4가지 유형, 5가지 유형, 또는 그 이상의 유형의 펩티드 결합 대체를 포함할 수 있다. 펩티드 결합 대체의 비 제한적인 예에는 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 술포닐 우레아, 트리플루오로 에틸아민, 오르토-(아미노알킬)-페닐아세트산, 파라-(아미노알킬)- 페닐아세트산, 메타-(아미노알킬)-페닐아세트산, 티오아미드, 테트라졸, 붕소산 에스테르, 올레핀 기 및 그의 유도체가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 폴리펩티드, 예를 들어, Sema 3F 폴리펩티드는 생존 유기체에 의해 생성된 폴리펩티드 및/또는 단백질에서 일반적으로 발견되는 자연 발생 아미노산, 예를 들어, Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R), 및 His (H)을 포함 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 Sema3F 폴리펩티드는 대안적 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적인 아미노산의 비 제한적인 예에는 D-아미노산; β-아미노산; 호모시스테인, 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트; 히푸르산, 옥타하이드로인돌-2-카르복실산, 스타틴, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르 복실산, 페니실아민 (3-메르캅토-D-발린), 오르니틴, 시트룰린, α-메틸-알라닌, 파라-벤조일페닐알라닌, 파라-아미노 페닐알라닌, p-플루오로페닐알라닌, 페닐글리신, 프로파길글리신, 세르코신 및 테트라-부틸글리신), 디아미노부티르산, 7-히드록시-테트라하이드로이소퀴놀린 카르복실산, 나프틸알라닌, 비페닐알라닌, 시클로헥실알라닌, 아미노-이소부티르산, 노르발린, 노르류신, 테트라-류신, 테트라하이드로이소퀴놀린 카르복실산, 피페콜산, 페닐글리신, 호모페닐알라닌, 시클로헥실글리신, 데하이드로류신, 2,2-디에틸글리신, 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산, 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산, 아미노-벤조산, 아미노-나프토산, γ-아미노부티르산, 디플루오로페닐알라닌, 니페코트산, α-아미노 부티르산, 티에닐-알라닌, t-부틸글리신, 트리플루오로발린; 헥사플루오로류신; 플루오르화 유사체; 아지드-변형 아미노산; 알킨-변형 아미노산; 시아노-변형 아미노산; 및 그의 유도체가 포함된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, Sema3F 폴리펩티드는, 예를 들어 함께 상기 펩티드를 포함하는 하나 이상의 아미노산의 모이어티의 첨가에 의해, 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 폴리펩티드는 하나 이상의 모이어티 분자, 예를 들어, 1개 이상의 모이어티 분자/폴리펩티드, 2개 이상의 모이어티 분자/폴리펩티드, 5개 이상의 모이어티 분자/폴리펩티드, 10개 이상의 모이어티 분자/폴리펩티드, 또는 그 이상의 모이어티 분자/폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 폴리펩티드는 한 가지 이상의 유형의 변형 및/또는 모이어티, 예를 들어, 1가지 유형의 변형, 2가지 유형의 변형, 3가지 유형의 변형 또는 그 이상의 유형의 변형을 포함할 수 있다. 변형 및/또는 모이어티의 비 제한적인 예에는 PEG화; 글리코실화; HES화; ELP화; 지질화; 아세틸화; 아미드화; 말단-캡핑 변형; 시아노기; 인산화; 알부민 및 고리화가 포함된다. 일부 실시형태에서, 말단-캡핑 변형은 N-말단의 아세틸화, N-말단 아실화, 및 N-말단 포르밀화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 말단-캡핑 변형은 C-말단의 아미드화, C-말단 알콜, 알데히드, 에스테르 및 티오에스테르 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 반감기는 모이어티, 예를 들어 PEG, 알부민 또는 다른 융합 상대 (예를 들어, 면역글로블린의 Fc 단편)의 첨가에 의해 증가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체에 투여되는 Sema3F 폴리펩티드는 본 명세서에서 개시되는 Sema3F 아미노산 서열 중 하나의 기능성 단편일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "기능성 단편"은 하기에서 개시되는 분석에 따라, 대상체의 면역 반응을 억제할 수 있는 (예를 들어, 동종 이식편 거부 반응을 억제하는) Sema3F 폴리펩티드의 단편 또는 세그먼트이다. 기능성 단편은 본 명세서에서 개시되는 서열의 보존적 치환을 포함할 수 있다.
원래의 아미노산 서열의 변경은 당업자에게 공지된 다수의 기술 중 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어 천연 서열 단편에 결찰을 허용하는 제한 효소 자리에 의해 플랭킹된 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써, 특정 유전자좌에 도입될 수 있다. 결합 후, 생성된 재구성 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 가지는 유사체를 인코딩한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드-지정 자리-특이적 돌연변이 유발 과정을 이용하여, 필요한 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 가지는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공할 수 있다. 이러한 변경의 제조 기술에는, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 ["Artificial DNA: Methods and Applications" CRC Press, 2002; Braman "In Vitro Mutagenesis Protocols" Springer, 2004; and Rapley "The Nucleic acid Protocols Handbook" Springer 2000]에 개시된 기술이 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있으며, 돌연변이는 화학적 합성 과정의 일부로서, 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, Sema3F 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편은, Sema3F 수용체, 예를 들어, NRP-2와 결합할 수 있는 Sema3F 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편은 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있는 Sema3F 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "NRP-2" 또는 "뉴로필린-2"는, 클래스 3 세마포린 및 VEGF를 인식하는 막관통 당단백질 수용체를 지칭한다. NRP는 축삭 성장과 혈관 신생을 조절한다. NRP2는 Sema-3A보다 Sema-3F에 대해 더 높은 친화성을 갖는다는 점에서, NRP2는 NRP1과 구별될 수 있다. NRP-2 유전자, 전사체 및 폴리펩티드의 서열, 예를 들어, 인간 NRP-2 mRNA (예를 들어, 서열번호 3; NCBI Ref Seq: NM_201266) 및 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 4; NCBI Ref Seq: NP_957718) 서열 (NCBI Gene ID: 8828)이 다양한 종에서, 공지되어 있다. NRP-2는 A1 도메인 (예를 들어, 서열번호 4의 28 내지 141 위치에 상응하는 아미노산), A2 도메인 (예를 들어, 서열번호 4의 149 내지 265 위치에 상응하는 아미노산), B1 도메인 (예를 들어, 서열번호 4의 위치 277 내지 427에 상응하는 아미노산) 및 B2 도메인 (예를 들어, 서열번호 4의 433 내지 592 위치에 상응하는 아미노산)을 포함한다. NRP-2 구조에 대한 추가 논의는 당업계에서, 예를 들어, 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Appleton et al. The EMBO Journal 2007 26:4901-4912]에서 찾아 볼 수 있다. 용해성 NRP-2 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 1 내지 862의 적어도 일부를 상응하는 NRP-2 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 용해성 NRP-2 폴리펩티드는 서열번호 4의 적어도 아미노산 1 내지 862를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용해성 NRP-2 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 1 내지 862로부터 선택되는 25개의 인접 아미노산, 예를 들어 서열번호 4의 아미노산 1 내지 862로부터 선택되는 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 또는 적어도 500개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용해성 NRP-2 폴리펩티드는 A1, A2, B1, 및/또는 B2로부터 선택되는 적어도 하나의 NRP-2 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 염증 반응을 조절하는데 사용되는 용해성 NRP-2 폴리펩티드는 Sema3F와 결합할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는, 재조합 방법 및 화학 합성을 포함한 잘 공지된 방법을 이용하여, 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입하여, 폴리펩티드를 생성하는 재조합 방법은, 예를 들어, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Vols 1 to 8, Cold Spring Harbor, NY (1989); M.W. Pennington and B.M. Dunn, Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols, Vol 35, Humana Press, Totawa, NJ (1994)]에 개시된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다. 펩티드는 또한 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여, 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964); Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY (1984); Kimmerlin, T. and Seebach, D. J. Pept. Res. 65:229-260 (2005); Nilsson et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2005) 34:91-118; W.C. Chan and P.D. White (Eds.) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, Cary, NC (2000); N.L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL (2005); J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, 2nd Ed, Oxford University Press, Cary, NC (2002); and P. Lloyd-Williams, F. Albericio, and E. Giralt, Chemical Approaches to the synthesis of peptides and proteins, CRC Press, Boca Raton, FL (1997)]을 참조한다. 펩티드 유도체는 또한 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 제4,612,302호; 제4,853,371호; 및 제4,684,620호, 및 미국 특허 출원 공보 제2009/0263843호에 개시된 바와 같이, 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 기술은 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 폴리펩티드 (예를 들어, Sema3F 폴리펩티드)를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 그의 유사체가 혼입된 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 상기 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성 이중 가닥 DNA의 한 가닥 핵산일 수 있다. 대안으로, 임의의 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않는 단일 가닥 핵산일 수 있다. 일 측면에서, 주형 핵산은 DNA이다. 또 다른 측면에서, 주형은 RNA이다. 적합한 핵산 분자는 게놈 DNA 또는 cDNA를 비롯한 DNA를 포함한다. 다른 적합한 핵산 분자는 mRNA를 비롯한 RNA를 포함한다. 핵산 분자는 게놈 DNA에서와 같이 자연 발생적이거나, 합성적, 즉, 인간의 작업을 기반으로 제조되거나, 두 개의 조합일 수 있다. 핵산 분자는 또한 특정 변형 (들), 예를 들어 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAESE) 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA), 콜레스테롤 첨가 및 미국 특허 출원 제20070213292호에 개시된 바와 같은 포스포로티오에이트 주쇄 (backbone); 및 미국 특허 제6,268,490호에 개시된 바와 같이, 메틸렌 단위를 가지는 것으로서, 2'-산소와 4'-탄소 사이에 연결된 특정 리보뉴클레오시드를 가질 수 있으며, 여기서, 특허 및 특허 출원 둘다 본 명세서에서, 그의 전문이 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 벡터에 포함된다. 본 명세서에서 개시되는 일부 측면에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 벡터와 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 이송을 위해 고안된 핵산 작제물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 바이러스성 또는 비 바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는, 적절한 조절 요소와 결합하는 경우, 복제될 수 있고, 유전자 서열이 세포에 전달될 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 벡터에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포에 이종이 될 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가의 요소를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있어, 2개의 유기체, 예를 들어, 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서, 유지될 수 있다. 용어 "발현"은, 적용 가능한 경우, 이로 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 전사, 전사물 가공, 번역 및 단백질 접힘, 변형 및 가공을 비롯하여, RNA, 단백질의 생성 및 적절한 경우, 단백질의 분비에 관여하는 세포 과정을 지칭한다. "발현 산물"에는 유전자에서 전사된 RNA 및, 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 얻어진 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 경우, 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열 (DNA)을 의미한다. 이 유전자는 코딩 영역 앞과 뒤의 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3'UTR 또는 "트레일러 (trailer)" 서열뿐만 아니라, 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 중간 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스성 벡터"는, 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하며, 바이러스 벡터 입자로 패키징될 수 있는 능력을 가지는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 바이러스 벡터는 비 필수 바이러스 유전자 대신에, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 벡터 및/또는 입자는 시험관 내 또는 생체 내에서 핵산을 세포 내로 이송하기 위해, 이용될 수 있다. 바이러스 벡터의 다양한 형태가 당업계에 공지되어 있다.
"재조합 벡터"는, 생체 내에서 발현될 수 있는 "전이 유전자" 또는 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 벡터가 다른 적절한 조성물 및 치료법과 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 에피솜 유사의 것이다. 적합한 에피솜 유사 벡터의 사용은, 대상체에서, 높은 카피 수의 여분의 염색체 DNA에서, 목적 뉴클레오티드를 유지함으로써, 염색체 통합의 잠재적 효과를 제거하는 수단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 대상체에서, 예를 들어, Sema3F의 레벨은 치료 전의 대상체 (또는, 표적 조직 또는 시스템 내)의 Sema3F의 레벨에 비해, 적어도 20%, 예를 들어, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 또는 350% 이상 증가된다. 일부 실시형태에서, 대상체의 Sema3F의 레벨은 치료전 대상체의 Sema3F의 레벨에 비해, 적어도 100% 증가된다. 일부 실시형태에서, 대상체의 Sema3F의 레벨은 치료전 대상체의 Sema3F의 레벨에 비해, 적어도 200% 증가된다.
일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 정맥 내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 근육내, 피하, 또는 피부내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 작용제는 염증 부위에 국소적으로 투여될 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에서는, 이를 필요로 하는 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 대상체에 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응의 증가가 필요한 대상체는 암, 예를 들어 종양을 가진 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응의 증가가 필요한 대상체는 감염된, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스성 감염된 대상체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "억제제"는, 표적 발현 생성물 (예를 들어, 표적 폴리펩티드 또는 표적을 인코딩하는 mRNA)의 발현 및/또는 활성을, 예를 들어, 적어도 10% 이상, 예를 들어, 10% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 감소시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 예를 들어, Sema3F의 억제제의 효능, 예를 들어 Sema3F의 레벨 및/또는 활성을 감소시키는 능력은, 예를 들어 Sema3F의 발현 생성물의 레벨 및/또는 Sema3F의 활성을 평가함으로써, 측정될 수 있다. 지정된 mRNA 및/또는 폴리펩티드의 레벨의 평가 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, RNA 레벨을 측정하는 경우, RTPCR이 이용될 수 있고, 폴리펩티드 레벨을 측정하는 경우, 항체 (예를 들어, 항-Sema3F 항체, 예를 들어, Cat No. ab39956; Abcam; Cambridge, MA)에 의한 웨스턴 블로팅이 이용될 수 있다. 예를 들어, Sema3F의 활성은 당업계에 공지된 전술된 방법을 이용하여, 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제제는 억제성 핵산; 압타머; 항체 시약; 항체; 또는 소분자일 수 있다.
Sema3F는 푸린-형 효소에 의해 절단될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, Sema3F의 억제제는 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산일 수 있다. 반대로, 일부 실시형태에서, Sema3F의 작용제는 푸린-형 폴리펩티드 억제제, 예를 들어, 억제성 핵산 또는 소분자 억제제일 수 있다. 소분자 푸린-형 폴리펩티드 억제제는 당업계에 공지되어 있으며, 이로 제한되는 것은 아니나, 푸린 억제제 I (예를 들어, Cat No. 344930; EMD Millipore; Billerica MA), 푸린 억제제 II (예를 들어, Cat. No. 344931, EMD Millipore; Billerica MA), 및 프로단백질 전환효소 억제제 (예를 들어, Cat. No. 537076, EMD Millipore; Billerica MA)가 이에 포함될 수 있다. 푸린 억제제에 대한 추가의 논의는, 예를 들어 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Becker et al. J Med Chem 2010 53:1067-1075 and Becker et al. JBC 2012 287:21992-22003]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "푸린-형 폴리펩티드"는, 서브틸리신-관련 촉매 도메인 및 상기 서브틸리신 도메인의 P-도메인 카르복시-말단을 가지는 프로단백질 전환효소 (PCSK)를 지칭한다. PCSK는 프로단백질을 절단하여, 활성 성숙 단백질을 생성한다. 푸린-형 폴리펩티드 및/또는 PCSK는 하나 이상의 PCSK1 (예를 들어, PC1, PC3, PC1/3; NCBI Gene ID: 5122), PCSK2 (예를 들어, PC2; NCBI Gene ID: 5126), PCSK3 (예를 들어, Furin, Pace; NCBI Gene ID: 5045), PCSK4 (예를 들어, PC4; NCBI Gene ID: 54760), PCSK5 (예를 들어, PC5, PC6, PC5/6; NCBI Gene ID: 5125), PCSK6 (예를 들어, PACE4; NCBI Gene ID: 5046), PCSK7 (예를 들어, PC7, PC8; NCBI Gene ID: 9159), PCSK8 (예를 들어, 자리 1 프로테아제, S1P, SK1; NCBI Gene ID: 8720), PCSK9 (예를 들어, NARC-1; NCBI Gene ID: 255738)일 수 있다. 푸린-형 폴리펩티드의 서열 및 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 해당 핵산은 당업계에 공지되어 있으며, 제공된 유전자 명칭에 대한 검색에 의해, 공개 데이타베이스, 예를 들어, NCBI로부터, 다수의 종에 대해, 용이하게 획득할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "플렉신 A1"은 NRP-2와 조합되어, 클래스 III 세마포린, 예를 들어, Sema3F와 결합할 수 있는 막관통 단백질을 지칭한다. 플렉신 A1 폴리펩티드 및 핵산의 서열은 다수의 종, 예를 들어, 인간 플렉신 A1 (NCBI Gene ID: 5361) 폴리펩티드 (서열번호 6; NCBI Ref Seq: NP_115618) 및 핵산 (서열번호 7; NCBI Ref Seq: NM_032242)에서 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 용해성 NRP-2 수용체, 예를 들어, 용해성 NRP-2 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, NRP-2 수용체의 용해성 단편은 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 용해성 NRP-2 수용체 단편은 일반적으로 막관통 도메인이 결여될 것이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 억제제는 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체 시약일 수 있다. 일부 실시형태에서, Sema3F 억제제는 항-Sema3F 항체 시약일 수 있다. 일부 실시형태에서, NRP-2 억제제는 항-NRP-2 항체 시약일 수 있다. 일부 실시형태에서, NRP-2 억제제는 세포 외 NRP-2의 도메인에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"는, 자연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 또는 재조합 DNA 기술로 생성되었는지 여부; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스팩토마, 효모 또는 세균으로부터 분리되었는지 여부에 상관 없이, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자 또는 이들의 항원 특이적 항체 단편 (이로 제한되는 것은 아니나, Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄형 다중 특이적 항체, 디설파이드-연결 scfv, 디아바디)을 지칭한다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같은, "항원"은 항체 제제 상의 결합 자리에 의해 결합되는 분자이다. 전형적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체 내 항체 반응을 유발시킬 수 있다. 항원은 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자 또는 그의 일부일 수 있다. 용어 "항원 결정기"는 항원-결합 분자에 의해, 더욱 구체적으로는 상기 분자의 항원-결합 자리에 의해 인식되는 항원 상의 에피토프를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 시약"은, 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 지정 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 시약은 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 시약은 모노클로날 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 경쇄 (L) 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 약칭 됨)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체 시약"은 완전한 항체뿐만 아니라, 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 사슬 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, CDR, 및 도메인 항체 (dAb) 단편 (예를 들어, 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39] 참조)을 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD 또는 IgM (또한, 아형 및 그의 조합)의 구조적 특징을 가질 수 있다. 항체는 마우스, 토끼, 돼지, 랫트 및 영장류 (인간 및 비인간 영장류) 및 영장류화 항체를 비롯한 임의의 공급원의 것일 수 있다. 항체에는 또한 미디바디, 인간화 항체, 키메라 항체 등이 포함된다.
VH 및 VL 영역은, "프레임워크 영역" ("FR")이라 불리는 더욱 보존적인 영역에 의해 배치되는 것으로서, "상보성 결정 영역"(CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정확하게 정의되어 있다 (본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조). 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은, 제1 엔터티(entity)가 비 표적인 제3 엔터티에 결합하는 것보다 더 큰 특이성 및 친화성으로 제2 표적 엔터티에 결합하는 2개의 분자, 화합물, 세포 및/또는 입자 사이의 화학적 상호 작용을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은, 제3 비표적 엔터티에 대한 친화성보다 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상인 제2 표적 엔터티에 대한 제1 엔터티의 친화성을 지칭할 수 있다.
또한, 및 본 명세서에서 개시되는 바와 같은, 재조합 인간화 항체는 인간의 치료를 위한 기능성 활성을 유지하면서, 잠재적 면역원성을 감소시키도록 더욱 최적화될 수 있다. 이와 관련하여, 기능성 활성은, 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 재조합 항체 또는 그의 항체 시약과 관련된 하나 이상의 공지 기능 활성을 나타내는 능력이 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 기능 활성으로는, 예를 들어 Sema3F에 결합하는 능력이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 방법은 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 제제 (예를 들어, Sema3F 작용제)를 이용한 것으로서, 예를 들어 염증성 병증을 가지거나 또는 가지는 것으로 진단된 대상체의 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 염증성 병증을 가지는 대상체는 현 진단 방법을 사용하여 의사가 확인할 수 있다. 예를 들어, 이러한 병증을 특징짓고, 진단을 보조하는 염증성 병증의 증상 및/또는 합병증은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이로 제한되는 것은 아니나, 면역 반응 마커의 증가된 레벨, 종창 및/또는 열이 포함된다. 염증성 병증에 대한 가족력이 있거나 염증성 병증에 대한 위험 인자에 노출된 경우에는 또한, 대상체가 상기 염증성 병증을 앓을 가능성이 있는지를 결정하거나 또는 특정 염증성 병증의 진단을 내리는데 도움이 될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 조성물 및 방법은, 예를 들어 염증성 병증이 있거나, 그와 같이 진단되거나 또는 면역 억제의 필요가 있는 (예를 들어, 동종 이식편 또는 이식체가 이식된) 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 방법은, 예를 들어, 염증성 병증의 증상을 완화하기 위해, 대상체에, 본 명세서에서 개시되는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "증상의 완화"는 병증 또는 상기 병증과 관련된 증상을 호전시키는 것이다. 균등물 미처리 대조군과 비교할 때, 이러한 감소는 표준 기술로 측정했을 때, 최소 10%이다. 본 명세서에 개시되는 조성물을 대상체에 투여하기 위한 다수의 수단이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 비경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 폐, 피부, 국소 또는 주사 투여가 포함될 수 있다. 투여는 국부 또는 전신으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 완화시키는데 필요한 조성물의 양을 지칭하며, 바람직한 효과를 제공하기 위한 약리학적 조성물의 충분한 양에 관한 것이다. 용어 "치료 유효량"은 따라서, 전형적인 대상체에 투여되는 경우, 특정 효과를 제공하기에 충분한 양을 지칭한다. 다수의 문맥 내의 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 유효량은 질환 증상의 진행을 지연시키거나, 질환 증상의 진행 경로를 변경하거나 (예를 들어, 이로 제한되는 것은 아니나, 질환의 증상 진행을 늦추는 것), 또는 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다. 그러나, 임의의 지정된 경우에, 적당한 "유효량"은 통상적인 실험만을 이용하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유효량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어 LD50 (개체군의 50% 치사량) 및 ED50 (개체군의 50%에서 치료 효과가 있는 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에서, 약제학적 표준 절차에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 투여 비율은 치료 지수로서, LD50/ED50 비율로 표현할 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 또한, 투여는, 세포 배양 또는 적절한 동물 모델에서 측정되는 바와 같이, IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반이 달성되는 조성물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해, 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 혈장 내 레벨은, 예를 들어, 면역 분석법 또는 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 특정 투여량의 효과는 적절한 생물 검정법, 예를 들어, 면역 반응성에 대한 분석 등으로 모니터링할 수 있다. 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요에 따라, 치료의 관찰된 효과에 적합하도록 조정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 기술은 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 약제학적 조성물 및 임의로 약제학적으로 허용 가능한 담체에 관한 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제에는 식염수, 완충 수용액, 용매 및/또는 분산 매질이 포함된다. 폴리펩티드, 예를 들어, Sema3F는 일반적으로 비경구 투여를 위해 제형화되며, 비경구 투여 경로에 적합한 임의의 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로 기능할 수 있는 물질의 일부 비 제한적인 예에는 하기의 것이 포함된다: (1) 당류, 예를 들어, 유당, 포도당 및 자당; (2) 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 그 유도체, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말형 트래거캔트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예를 들어, 스테아린산 마그네슘, 라우릴 황산나트륨 및 활석; (8) 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 면실유, 잇꽃 기름, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 콩기름; (10) 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어, 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 피로겐이 제거된 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; (22) 벌크제, 예를 들어, 폴리펩티드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어, 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예를 들어, 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형물에 사용되는 기타 비 독성 상용 물질. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 방향제, 향료, 방부제 및 항산화제 또한 상기 제형물 내에 존재할 수 있다. 용어, 예를 들어, "부형제", "담체", "약제학적으로 허용 가능한 담체" 등은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 담체는 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 활성제의 분해를 억제한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 약제학적 조성물은 비경구 투여 형태일 수 있다. 비경구 투여 형태의 투여가 전형적으로 오염 물질에 대한 환자의 자연 방어를 우회하기 때문에, 비경구 투여 형태는 바람직하게는 멸균되거나, 또는 환자에게 투여하기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여 형태의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 주사 가능한 용액, 주사 가능한 약제학적으로 허용 가능한 비히클 중에 용해 또는 현탁될 수 있는 건조 제품, 주사 가능한 현탁액 및 유제가 포함된다. 또한, 방출 제어형 비경구 투여 형태는 이로 제한되는 것은 아니나, DUROS® 형 투여 형태 및 과량 투여를 비롯하여, 환자에게 투여하기 위해, 제조될 수 있다.
비경구 투여 형태를 제공하는데 사용될 수 있는 적절한 비히클은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예로는, 제한 없이, 하기의 것이 포함된다: 멸균 수; 주사용수 USP; 식염수; 포도당 용액; 수성 비히클, 예를 들어, 이로 제한되는 것은 아니나, 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로오스 주사, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사, 및 젖산 링거 주사; 수-혼화성 비히클, 예를 들어, 이로 제한되는 것은 아니나, 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 비 수성 비히클, 예를 들어, 이로 제한되는 것은 아니나, 옥수수유, 면실유, 땅콩 기름, 참기름, 올레산 에틸, 미리스틴산 이소프로필, 벤조산 벤질. 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용해도를 변경 또는 변형시키는 화합물이 또한 통상적인 방출 제어형 비경구 투여 형태를 비롯하여, 본 발명의 비경구 투여 형태로 혼입될 수 있다.
통상적인 투여 형태는 일반적으로 제형물로부터 신속하거나 즉각적인 약물 방출을 제공한다. 약물의 약리학 및 약물 동력학에 따라, 통상적인 투여 형태의 사용은 환자의 혈액 및 다른 조직에서의 약물 농도의 광범위한 변동을 야기할 수 있다. 이러한 변동은 다수 파라미터, 예를 들어 투여 빈도, 작용 개시, 효능 기간, 치료 혈액 레벨의 유지, 독성, 부작용 등에 영향을 줄 수 있다. 유리하게는, 제어-방출 제형물을 사용하여, 약물의 작용 개시, 작용 지속 시간, 치료 창 (therapeutic window) 내의 혈장 레벨 및 최고 혈중 농도를 제어할 수 있다. 특히, 제어- 또는 연장-방출 투여 형태 또는 제형물은, 약물의 독성 레벨을 초과하는 경우뿐만 아니라, 약물을 정량 이하 투여하는 경우 (즉, 최소 치료 레벨 이하로 진행되는 경우) 둘 모두로부터 유발될 수 있는 잠재적 부작용 및 안전성 문제를 최소화하면서, 약물의 최대 효과가 달성되도록 하는데, 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 서방출 제형물로 투여될 수 있다.
방출 제어 의약품은 그의 비 방출 제어 비교 대상에 의해 달성되는 것 이상으로 약물 치료를 향상시키고자 하는 공통의 목표를 가진다. 이상적으로, 의료적 치료에서, 최적으로 고안된 방출 제어 제조물의 사용은 최소 시간 내에 병증을 치료하거나 제어하는데 사용되는 최소 약물 물질을 특징으로 한다. 방출 제어 제형물의 장점은 하기와 같다 : 1) 약물의 연장된 활성; 2) 투약 빈도 감소; 3) 증가된 환자 순응도; 4) 총 약물 사용량 감소; 5) 국소 또는 전신 부작용의 감소; 6) 약물 축적의 최소화; 7) 혈액 레벨 변동의 감소; 8) 치료의 효능 향상; 9) 강화 작용 (potentiation) 또는 약물 활성 손실의 감소; 및 10) 질환 또는 병증 제어 속도의 향상. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)).
대부분의 방출 제어 제형물은, 신속하게 원하는 치료 효과를 생성하는 약물 (활성 성분)의 일정량을 초기에 방출하고, 장기간에 걸쳐 이 레벨의 치료 또는 예방 효과를 유지하도록 다른 양의 약물을 점차적이고, 지속적으로 방출하도록 고안된다. 체내에서 이러한 일정한 레벨의 약물을 유지하기 위해서, 대사되고, 체내로부터 배출되는 약물의 양을 대체 할 수 있는 속도로, 약물이 투여 형태로부터 방출되어야 한다. 활성 성분의 방출 제어는, 이로 제한되는 것은 아니나, pH, 이온 강도, 삼투압, 온도, 효소, 물 및 다른 생리적 조건 또는 화합물을 비롯한 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.
다양한 공지된 제어방출 또는 연장방출 투여 형태, 제형물 및 장치가 본 발명의 조성물 및 염과 함께 사용되도록 적합화할 수 있다. 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서 그의 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 제 3,845,770호; 제 3,916,899호; 제 3,536,809호; 제 3,598,123호; 제 4,008,719호; 제 5674,533호; 제 5,059,595호; 제 5,591,767호; 제 5,120,548호; 제 5,073,543호; 제 5,639,476호; 제 5,354,556호; 제 5,733,566호; 및 6,365,185 B1호에 개시된 것들이 포함된다. 이러한 투여 형태는, 예를 들어, 비율을 달리하여, 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템 (예를 들어, OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)) 또는 그의 조합을 사용하여 한 가지 이상의 활성 성분의 서방성 또는 제어 방출을 제공하는데, 사용될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 방법은, 예를 들어 조합 요법의 일부로서, 제2 제제 및/또는 치료를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비 제한적인 예로서, 대상체가, 본 명세서에서 개시되는 방법에 따라, 염증 치료되어야 하는 경우, 대상체는 또한, 통증 또는 염증을 앓고 있는 대상체에 유익한 것으로 알려진 제2 약제 및/또는 치료가 투여될 수 있다. 이러한 제제 및/또는 치료의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 비 스테로이드성 항염증제 (NSAID- 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜 또는 나프록센); 글루코코르티코이드를 비롯한 코르티코스테로이드 (예를 들어, 코티솔, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, β메타손, 트리암시놀론 및 베클로메타존); 메토트렉세이트; 설파살라진; 레플루노마이드; 항-TNF 의약품; 시클로포스파미드; 분해 전 약물 (pro-resolving drug); 미코페놀레이트; 또는 아편제 (예를 들어, 엔돌핀, 엔케팔린 및 다이노르핀), 스테로이드, 진통제, 바르비투르산염, 옥시코돈, 모르핀, 리도카인 등이 포함된다. 일부 실시형태에서, 추가의 항염증제는 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드); 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 사이클로스포린, 타크로리무스, 피메크로리무스 또는 FK506); mTOR 억제제 (예를 들어, 에베올리무스, 템시롤리무스, 라파마이신, 데포로리무스, TOP216, OSI-027, TAFA93, nab-라파마이신, 타크롤리무스, 바이올리무스, CI-779, ABT-578, AP-23675, BEZ-235, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라십, AP-23841, AP-23573, KU-0059475, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32 (S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32 (S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 32-데옥소라파마이신; 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디하이드로라파마이신; 소칼레드라팔로그스; AP23464; PI-103, PP242, PP30, Torin1; 및 그의 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 예를 들어, 본 명세서에서 그의 전문이 참조로서 포함되는 미국특허 공보 제2011/0178070호; 제2011/0021515호; 제2007/0112005호; 제2011/0054013호; 국제특허 출원 WO98/02441; WO01/14387; WO99/15530; WO07/135411; WO03/64383; WO96/41807; WO95/16691; WO94/09010; 유럽 특허 제 EP1880723호; 및 미국 특허 제8,163,775호; 제6,329,386호; 제6,200,985호; 제6,117,863호; 제6,015,815호; 제6,015,809호; 제6,004,973호; 제5,985,890호; 제5,955,457호; 제5,922,730호; 제5,912,253호; 제5,780,462호; 제5,665,772호; 제5,637,590호; 제5,567,709호; 제5,563,145호; 제5,559,122호; 제5,559,120호; 제5,559,119호; 제5,559,112호; 제5,550,133호; 제5,541,192호; 제5,541,191호; 제5,532,355호; 제5,530,121호; 제5,530,007호; 제5,525,610호; 제5,521,194호; 제5,519,031호; 제5,516,780호; 제5,508,399호; 제5,508,290호; 제5,508,286호; 제5,508,285호; 제5,504,291호; 제5,504,204호; 제5,491,231호; 제5,489,680호; 제5,489,595호; 제5,488,054호; 제5,486,524호; 제5,486,523호; 제5,486,522호; 제5,484,791호; 제5,484,790호; 제5,480,989호; 제5,480,988호; 제5,463,048호; 제5,446,048호; 제5,434,260호; 제5,411,967호; 제5,391,730호; 제5,389,639호; 제5,385,910호; 제5,385,909호; 제5,385,908호; 제5,378,836호; 제5,378,696호; 제5,373,014호; 제5,362,718호; 제5,358,944호; 제5,346,893호; 제5,344,833호; 제5,302,584호; 제5,262,424호; 제5,262,423호; 제5,260,300호; 제5,260,299호; 제5,233,036호; 제5,221,740호; 제5,221,670호; 제5,202,332호; 제5,194,447호; 제5,177,203호; 제5,169,851호; 제5,164,399호; 제5,162,333호; 제5,151,413호; 제5,138,051호; 제5,130,307호; 제5,120,842호; 제5,120,727호; 제5,120,726호; 제5,120,725호; 제5,118,678호; 제5,118,677호; 제5,100,883호; 제5,023,264호; 제5,023,263호; 및 제5,023,262호에 개시된 화합물; 라파마이신 (시롤리무스) 또는 그의 유사체 (예를 들어, 에버롤리무스, 템시롤리무스, 리다폴로리무스, 데포로리무스); 또는 항증식제 (예를 들어, 미코페놀로에이트 모에피틸, 아자티오프린)일 수 있다. 일부 실시형태에서, mTOR 억제제는 라파마이신 또는 그의 유사체, 예를 들어, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 또는 데포롤리무스일 수 있다. 항증식제에는, 비 제한적 예로서, 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 백금 화합물 및 니트로소우레아스), 항대사성물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토푸린, 플루오로우라실 등) 및 세포독성 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 미트라마이신)이 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 조성물의 유효 투여량이 환자에 1회 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물의 유효 투여량이 환자에 반복 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우, 대상체는 조성물의 치료량, 예를 들어 1 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 초기 치료 섭생 후, 상기 치료는 낮은 빈도를 기반으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 3개월 동안 2주 마다 치료 후, 치료는 6개월 또는 1년 이상 동안, 한 달에 1회 반복될 수 있다. 본 명세서에 개시되는 방법에 따른 치료는 병증의 증상 또는 마커, 예를 들어 면역 반응의 마커의 레벨을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 그 초과 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같은 조성물의 투여량은 의사에 의해, 결정될 수 있으며, 필요에 따라, 관찰된 치료 효과에 적합하도록, 조정될 수 있다. 치료 기간 및 빈도와 관련하여, 숙련된 임상의는 일반적으로, 치료가 치료 효과를 제공하는지 여부를 결정하고, 투여량을 증가 또는 감소시킬 것인지, 투여 빈도를 증가 또는 감소시킬 것인지, 치료를 중단할 것인지, 치료를 재개할 것인지, 또는 치료 섭생에 기타 변경을 가할 것인지를 결정하기 위해, 대상체를 모니터링한다. 투여 일정은 여러 임상 인자, 예를 들어, 활성 성분에 대한 대상체의 민감도에 따라, 일주일에 한 번씩 매일 달라질 수 있다. 바람직한 투여량 또는 활성화 양은 한 번에 투여되거나 하위 투여량, 예컨대 2 내지 4개의 서브 투여량으로 나누어 투여될 수 있고, 예를 들어 적절한 간격으로 하루 또는 다른 적절한 일정을 통해 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 만성적으로서, 예를 들어, 수주 또는 수개월 동안, 매일 1회 이상의 투여 및/또는 치료일 수 있다. 투여 및/또는 치료 일정의 예는 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 이상 동안, 매일, 1일 2회, 1일 3회 또는 1일 4회 이상의 투여이다. 조성물은, 예를 들어 5분, 10분, 15분, 20분 또는 25분에 걸쳐 일정 시간 동안 투여될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 방법에 따른 조성물의 투여를 위한 투여 범위는, 예를 들어, 활성 성분의 형태, 그의 효능, 및 본 명세서에서 개시되는 병증의 증상, 마커 또는 지표를 감소시키고자 하는 정도, 예를 들어, 면역 반응에 대해, 바람직한 감소 백분율 또는 면역 반응을 유도하고자 하는 정도에 의존적이다. 투여는 너무 다량이어서, 부작용을 일으키지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 병증 및 성별에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 합병증이 있는 경우, 각 의사가 조정할 수도 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 개시되는 병증의 치료 또는 본 명세서에서 개시되는 반응의 유도에서의 조성물의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 병증의 하나 이상의 징후 또는 증상이 유리한 방식으로 변경되거나, 임상적으로 인정된 다른 증상이 호전 또는 심지어 개선되거나, 또는 본 명세서에서 개시되는 방법에 따른 치료 후, 바람직한 반응이, 예를 들어, 적어도 10% 유도되는 경우, 치료는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유효한 치료"로 고려된다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시되는 방법에 따라 치료되는 병증의 마커, 지표, 증상 및/또는 발병률 또는 기타 임의의 측정 가능한 적절한 파라미터, 예를 들어, 이식편 거부 반응을 측정함으로써, 효능을 평가할 수 있다. 효능은 또한, 입원이나 의료 개입의 필요성 (즉, 상기 질환의 진행의 중단)에 따라 평가할 때, 개체의 악화 불능에 의해, 평가될 수 있다. 이들 지표의 측정 방법은 당업자에 공지되어 있고/거나, 본 명세서에 개시된다. 치료에는 개체나 동물 (일부 비 제한적인 예로는 인간이나 동물이 포함됨)의 질환의 임의의 치료가 포함되며, 하기의 것이 포함된다: (1) 질병의 억제, 예를 들어, 증상 (예: 통증 또는 염증) 악화의 방지 또는 지연; 또는 (2) 예를 들어, 증상의 퇴행을 일으키는 질환의 중증도의 완화. 질환 치료의 유효량은, 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 때, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 그 질환에 대해 효과적인 치료를 초래하기에 충분한 양을 의미한다. 제제의 효능은 바람직한 반응 또는 병증의 신체 지표를 평가하여 결정할 수 있다. 이러한 파라미터 중 임의의 하나 또는 파라미터들의 임의의 조합을 측정함으로써, 투여 및/또는 치료의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 본 명세서에서 개시되는 병증의 동물 모델에서, 효능, 예를 들어, 마우스에서, 동종 이식편 거부 반응의 치료를 평가할 수 있다. 실험 동물 모델을 사용할 경우, 마커의 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어, 활성화된 T 세포 또는 B 세포의 레벨 및/또는 증식이 관찰되었을 때, 치료 효능이 입증된다.
본 명세서에서 개시되는 조성물, 예를 들어, Sema3F의 작용제의 지정 투여에 대한 평가를 가능하게 하는 시험관 내 및 동물 모델 분석이 본 명세서에서 제공된다. 비 제한적인 예로서, 조성물의 존재 및 부재하에 CD4+ T 세포를 미토겐 (항-CD3)으로 처리하고, 이로 제한되는 것은 아니나, IL-2, IL-4 IFN-γ, IL-17, IL-10, IL-15 및 그 밖의 것들을 비롯하여, 사이토카인의 생성 및/또는 증식을 측정함으로써, 조성물의 효과 및 투여 반응을 평가할 수 있으며, 여기서, 뉴로필린-2 활성은 사이토카인의 프로그램 및/또는 선택의 감소된 생성 및/또는 낮은 레벨의 증식에 의해, 나타난다.
또한, 동물 모델, 예를 들어 동종 이식편 거부 반응, 대장염 또는 피부 염증/지연형 과민성 (DTH)의 마우스 모델에서, 지정된 투여량 조합의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 BALB/c 마우스의 심장 또는 피부 동종 이식편의 수용체일 수 있다. 거부 반응 및/또는 생존은, 예를 들어 적어도 1 내지 3주에 걸쳐 관찰할 수 있다. DTH에서, 피부 종창은 1 내지 7일에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 본 명세서에서 입증되는 바와 같이, 동종 이식편 수용체의 Sema3F로의 치료는 동종 이식편 거부 반응을 억제한다. Sema3F의 치료 후, 염증 반응 및 DTH 반응이 감소한다. 또한, 이식체의 수용체에서, 뉴로필린-2의 녹아웃으로 인해, 거부 반응이 가속화된다.
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 일부 용어 및 구문의 의미가 하기에서 제공된다. 달리 명시되어 있지 않거나, 문맥에 내포되어 있지 않는 한, 하기의 용어 및 문구는 하기에 제공된 의미를 포함한다. 본 발명의 범위는 청구 범위에 의해서만 제한되는 것이므로, 상기 정의는 특정 실시형태에 대한 설명을 돕기 위해 제공되며, 청구된 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 과학적 용어는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 당해 기술 분야의 용어의 사용과 본 명세서에서 제공되는 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 우선한다.
편의상, 본 명세서, 실시형태 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 특정 용어를 여기에 수록한다.
본 명세서에서, 용어 "감소하다", "저하된", "저하" 또는 "억제하다"는 모두 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미한다. 일부 실시형태에서, "저하되다", "저하" 또는 "감소하다" 또는 "억제하다"는 전형적으로 참조 레벨 (예를 들어, 지정 치료의 부재)과 비교하여, 적어도 10 % 감소하는 것을 의미하며, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 초과의 감소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저하" 또는 "억제"는 참조 레벨과 비교하여, 완전한 억제 또는 저하를 포괄하는 것은 아니다. "완전한 억제"는 참조 레벨과 비교하여 100% 억제이다. 감소는 바람직하게는, 지정된 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내로 받아들여지는 레벨으로 하락할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "증가된", "증가하다", "증대되다" 또는 "활성화하다"는 모두 통계적으로 유의한 양의 증가를 의미한다. 일부 실시형태에서, 용어 "증가된", "증가하다", "증대되다" 또는 "활성화하다"는 참조 레벨과 비교하여, 적어도 10 %의 증가, 예를 들어, 참조 레벨과 비교하여, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하의 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가 또는 참조 레벨과 비교하여, 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가 또는 2배 내지 10배 또는 그 이상의 임의의 증가를 의미할 수 있다. 마커 또는 증상의 맥락에서, "증가"는 이러한 레벨의 통계적으로 유의한 증가이다
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로, 상기 동물에는 척추동물, 예를 들어 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물이다. 영장류는 침팬지, 시아노몰거스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 벵골 원숭이 (Rhesus)가 포함된다. 설치류에는 마우스, 랫트, 우드척 (woodchuck), 흰 족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종, 예를 들어, 가축 고양이, 개과 종류, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어가 포함된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다. 본 명세서에서, 용어 "개체", "환자" 및 "대상체"는 상호 교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 상기 포유동물은 인간, 비인간, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나, 이러한 예로 제한되는 것은 아니다. 인간 이외의 포유동물은 유리하게는, 예를 들어, 동종 이식편 거부 반응의 동물 모델을 나타내는 대상체로 사용될 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
대상체는, 치료를 필요로 하는 병증 (예를 들어, 동종 이식이 이루어졌거나 또는 자가 면역 질환을 가지는 대상체) 또는 이러한 병증과 관련된 하나 이상의 합병증을 가지고 있거나, 앓고 있는 것으로 사전에 확인되었거나 또는 그와 같이 진단된 자 또는 임의로, 이전에 상기 병증 또는 상기 병증과 관련된 하나 이상의 합병증의 치료를 받은 적이 있는 자일 수 있다. 대안으로, 대상체는 또한 이전에, 상기 병증 또는 상기 병증과 관련된 하나 이상의 합병증을 가지는 것으로 진단된 적이 없는 자일 수 있다. 예를 들어, 대상체는, 상기 병증 또는 상기 병증과 관련된 하나 이상의 합병증의 하나 이상의 위험 인자를 나타내는 자 또는 위험 인자를 나타내지 않는 자일 수 있다.
특정 병증에 대한 치료를 "필요로 하는 대상체"는 상기 병증을 가지거나, 상기 병증을 가진 것으로 진단되었거나 또는 상기 병증의 발병 위험이 있는 대상체일 수 있다.
용어 "제제"는 일반적으로 세포, 조직 또는 대상체에 투여되는 레벨에서 정상적으로 존재하거나 존재하지 않는 임의의 엔터티를 지칭한다. 제제는, 이로 제한되는 것은 아니나, 폴리뉴클레오티드; 폴리펩티드; 소분자; 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 핵산 유사체를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 폴리펩티드는, 이로 제한되는 것은 아니나, 관심 대상 기능을 보유하는 자연 발생 폴리펩티드, 돌연변이 폴리펩티드 또는 그의 단편일 수 있다. 제제의 추가적 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 핵산 압 타머, 펩티드-핵산 (PNA), 잠금 핵산 (locked nucleic acid) (LNA), 작은 유기 또는 무기 분자; 당류; 올리고당; 다당류; 생물학적 거대 분자, 펩티드 모방체; 핵산 유사체 및 유도체; 생물학적 물질, 예를 들어 박테리아, 식물, 균류 또는 포유동물 세포 또는 조직 및 자연 발생 또는 합성 조성물로부터 제조된 추출물이 포함된다. 제제는 배지에 적용되어, 세포와 접촉되고, 그 효과를 유도할 수 있다. 대안으로, 제제는, 세포 내로의 제제를 인코딩하는 핵산 서열의 도입 및 세포 내에서 핵산 및/또는 단백질 환경 자극물의 생성을 초래하는 그의 전사의 결과로서, 세포 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는, 제한 없이, 합성 및 자연 발생 비-단백질성 엔터티를 비롯한 임의의 화학적, 엔터티 또는 모이어티이다. 특정 실시형태에서, 제제는, 예를 들어 매크로라이드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 비롯하여, 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 방향족 또는 헤테로시클릴 모어어티로부터 선택된 화학적 모이어티를 가지는 소분자이다. 제제는 원하는 활성 및/또는 특성을 가지는 것으로 알려질 수 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소분자"는 "천연 생성물과 같은" 화합물을 지칭할 수 있지만, 용어 "소분자"는 "천연 생성물과 같은" 화합물에 제한되지 않는다. 오히려, 소분자는 전형적으로, 여러 개의 탄소-탄소 결합을 포함하고, 분자량이 약 50 이상이지만, 약 5000 달톤 (5 kD) 미만인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 소분자는 3kD 미만, 더욱 바람직하게는 2kD 미만, 가장 바람직하게는 1kD 미만의 분자량을 가진다. 일부 경우, 소분자는 700 달톤 이하의 분자량을 가지는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 α-아미노 및 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해, 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 나타내는 것으로, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 크기나 기능에 관계없이, 변형된 아미노산 (예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함한 아미노산의 중합체를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 상대적으로 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 반면, 용어 "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되지만, 당업계에서, 이들 용어의 용도는 중첩된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 유전자 생성물 및 그의 단편을 지칭하는 경우, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질에는 유전자 생성물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 다른 균등물, 변이체, 단편 및 전술된 것의 유사체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보 핵산, 데옥시리보핵산 또는 그의 유사체의 단위를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성 이중 가닥 DNA의 하나의 핵산 가닥일 수 있다. 대안으로, 임의의 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않는 단일 가닥 핵산일 수 있다. 일 측면에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 또 다른 측면에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 핵산 분자는 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함한 DNA이다. 다른 적합한 핵산 분자는 mRNA를 포함한 RNA이다.
지정 유전자 발현의 억제제는 억제 핵산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 핵산은 억제 RNA (iRNA)이다. 이중 가닥 RNA 분자 (dsRNA)는 RNA 간섭 (RNAi)으로 알려진 고도로 보존된 조절 기작에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 나타났다. 본 명세서에서 개시되는 억제 핵산은, 길이가 30개의 뉴클레오티드 이하, 즉 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 일반적으로 길이가 19 내지 24개의 뉴클레오티드 인 영역을 가지는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함 할 수 있으며, 이 영역은 실질적으로 표적 mRNA 전사체의 적어도 일부에 상보성이다. 이러한 iRNA를 사용하면, mRNA 전사체의 표적 분해가 가능해져, 표적의 발현 및/또는 활성이 감소한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "iRNA"는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 RNA를 함유하고, RNA 유도성 침묵 복합체 (RISC) 경로를 통해, RNA 전사체의 표적화 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 iRNA는 NRP-2, Sema3F, 및/또는 플렉신A1의 발현 및/또는 활성의 억제를 초래한다. 특정 실시형태에서, 세포가 억제제 (예를 들어, iRNA)와 접촉되면, 세포의 표적 mRNA 레벨이, iRNA가 부재하는 세포에서 발견되는 표적 mRNA 레벨의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 100% 이하로 감소한다.
일부 실시형태에서, iRNA는 dsRNA일 수 있다. dsRNA는, dsRNA가 사용될 조건 하에서 이중 구조를 형성하도록 혼성화 하기에 충분히 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥 (안티센스 가닥)은, 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 표적의 발현 중에 형성된 mRNA의 서열로부터 유도될 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥이 혼성화되고, 적절한 조건하에서 조합될 때, 이중 구조를 형성한다. 일반적으로, 이중 구조는 15 내지 30, 더욱 일반적으로는 18 내지 25, 더욱 일반적으로는 19 내지 24, 가장 일반적으로는 19 내지 21개의 염기쌍 길이를 포함한다. 유사하게는, 표적 서열에 상보적인 영역은 15 내지 30, 더욱 일반적으로는 18 내지 25, 더욱 일반적으로는 19 내지 24, 가장 일반적으로는 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA는 15 내지 20개의 뉴클레오티드 길이를 포함하며, 다른 실시형태에서, dsRNA는 25 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 절단의 표적이 되는 RNA의 표적 영역은 대부분 보통 큰 RNA 분자, 보통 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련 경우, mRNA 표적의 "일부"는, RNAi-절단 (즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다. 9개의 염기쌍 만큼 짧은 이중 가닥을 가지는 dsRNA는 경우에 따라 RNAi- 유도 RNA 절단을 매개할 수 있다. 대부분의 경우, 표적은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이일 것이다.
또 다른 실시형태에서, iRNA의 RNA, 예를 들어, dsRNA는 안정성 또는 기타 유리한 특성을 향상시키기 위해, 화학적으로 변형된다. 본 발명의 특징을 이루는 핵산은 당 업계에 잘 확립된 방법, 예를 들어, 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 ["Current protocols in nucleic acid chemistry,",Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 개시된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 변형에는, 예를 들어 (a) 말단 변형, 예를 들어 5 '말단 변형 (인산화, 접합, 반대 연결 (inverted linkage) 등), 3' 말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 거꾸로 된 연결 등), (b) 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 상대의 연장된 레퍼토리와 염기쌍을 이루는 염기에 의한 대체, 염기 (탈염기 뉴클레오티드 (abasic nucleotide)) 또는 접합된 염기의 제거, (c) 당 변형 (예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치) 또는 당의 대체뿐만 아니라, (d) 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함한 주쇄 변형이 포함된다. 본 명세서에서 개시되는 실시형태에 유용한 RNA 화합물의 특정 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 변형된 주쇄를 포함하거나, 또는 천연 뉴클레오시드 간 연결을 포함하지 않는 RNA가 포함된다. 변형된 주쇄를 가지는 RNA에는, 특히, 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 RNA가 포함된다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 당업계에서 때때로 참고되는 바와 같이, 이들의 뉴클레오시드 간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드로 고려될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 RNA는 그의 뉴클레오시드 간 주쇄에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 주쇄는, 예를 들어 포스포티오에이트, 키랄성 포스포티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함한 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함한 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트 (뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 연결된 것으로서, 반대 극성을 가지는 것 및 이들의 정상적인 3'-5' 연결, 2'-5' 연결 유사체를 가짐)를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 산 무함유 형태가 또한 포함된다. 상기 인-함유 연결의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 각각이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6,239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국특허 RE39464가 포함된다.
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 골격은, 단쇄 (short chain) 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결, 혼합된 헤테로 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로 원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 간 연결에 의해 형성된 골격을 가진다. 이들에는 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분의 일부에 형성됨); 실옥산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 주쇄; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 가지는 기타의 것이 포함된다. 상기 올리고뉴클레오시드의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 각각이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호가 포함된다.
iRNA에서 사용하기에 적합하거나 고려되는 다른 RNA 모방체에서, 뉴클레오티드 단위의 당과 뉴클레오티드 사이의 결합, 즉 골격은 모두 새로운 기에 의해 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 가진 것으로 입증된 하나의 이러한 올리고머 화합물, RNA 모방체는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵 염기는 유지되고, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 각각이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호가 포함된다. PNA 화합물의 추가적 교시는, 예를 들어 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 특징을 이루는 일부 실시형태는 포스포로티오에이트 골격을 가지는 RNA 및 헤테로 원자 골격 및 특히, 상기에서 인용된 미국 특허 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 주쇄로 알려짐], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[천연 포스포디에스테르 골격이 --O--P--O--CH2--로 표시됨] 및 상기에서 인용된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 골격을 가지는 올리고뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 특징을 이루는 RNA는 상기에서 인용된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격구조를 가진다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 이루는 iRNAs, 예를 들어, dsRNA는 2' 위치에서, 하기의 것 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 또는 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 예시적인 적절한 변형에는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 (n 및 m은 1 내지 약 10임)가 포함된다. 다른 실시형태에서, dsRNA는 2' 위치에서, 하기의 것 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아랄킬, O-알크아릴, 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터(intercalator), iRNA의 약동학적 특성을 개선시키는 기 또는 iRNA의 약역학적 특성을 개선시키는 기 및 유사 특성을 갖는 기타 치환기. 일부 실시형태에서, 변형에는 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 알려짐) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) 즉, 알콕시-알콕시 기가 포함된다. 또 다른 예시적 변형은 하기의 실시예에 개시된 바와 같은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기 (또한 2'-DMAOE로 알려짐), 및 또한 하기의 실시예에 개시된 바와 같은 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (또한, 당업계에서, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로 알려짐), 즉, 2'--O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
기타 변형에는 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)가 포함된다. 유사한 변형은 또한 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결된 dsRNA의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에, 당 모방체, 예를 들어 시클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 일부의 경우, 본 출원과 함께 공통으로 보유되며, 각각이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호가 포함된다.
iRNA는 또한 핵염기 (당업계에서 보통 간략하여 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비변형" 또는 "천연" 핵염기에는 퓨린계 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G) 및 피리미딘계 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형 핵 염기에는 기타 합성 및 천연 핵염기, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실 (pseudouracil)), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록시 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가의 핵염기에는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것, 문헌 [Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것; 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, these disclosed by Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것; 문헌 [Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것이 포함된다. 일부 이러한 핵 염기는 본 발명의 특징을 이루는 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 심지어 더욱 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된 경우, 예시적 염기 치환이며, 0.6-1.2℃에 의해, 핵산 이중체의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다 (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
기타 변형 핵 염기뿐만 아니라, 전술된 변형 핵 염기 중 일부의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 각각이 본 명세서에서, 참조로서 포함되는 미국 특허 제3,687,808호뿐만 아니라, 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 제7,495,088호, 및 또한, 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,750,692호가 포함된다.
iRNA의 RNA는 또한, 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA)을 포함하도록, 변형될 수 있다. 잠금 핵산은, 리보오스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 다리를 포함하는 변형된 리보오스 모이어티를 가지는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조 형태의 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 잠금 핵산을 첨가하면, 혈청에서의 siRNA 안정성이 증가하고, 표적 외 효과 (off-target effect)를 감소시키는 것으로 나타났다 (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic acids Research 31(12):3185-3193). 잠금 핵산 뉴클레오티드의 제조에 대해 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 각각이 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 제6,268,490호; 제6,670,461호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,084,125호; 제7,399,845호가 포함된다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같은 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은, iRNA의 활성, 세포 분포, 약동학적 특성 또는 세포 흡수를 향상시키는 RNA 하나 이상의 리간드, 모어어티 또는 접합체와 RNA의 화학적 연결이 포함된다. 이러한 모이어티에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 지질 모이어티 예를 들어, 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산 (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-락-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-락-글리세로-3-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "호전"은, 질환 또는 장애와 관련된 병증의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 지연시키거나 또는 중지시키는 것이 목적인 치효학적 치료를 지칭한다. 용어 "치료하는"에는 병증, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것이 포함된다. 하나 이상의 증상이나 임상 마커가 감소하는 경우, 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 대안으로, 질환의 진행이 감소되거나 중단되는 경우, 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"에는, 치료의 부재시 예상되는 것과 비교하여, 증상이나 마커의 개선뿐만 아니라 증상의 진행이나 악화의 중지 또는 적어도 지연이 포함된다. 유익하거나 바람직한 임상 결과에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 검출 여부와 상관없이, 하나 이상의 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 호전 또는 일시적 완화, 차도 (일부 또는 전체), 및/또는 사망률의 감소가 포함된다. 용어 질환의 "치료"에는 질환의 증상 또는 부작용으로부터 경감의 제공 (일시적 완화 치료 포함)이 포함된다.
"암 세포"는 생체 내, 생체 외 또는 조직 배양에서 암 또는 전암성 (pre-cancerous) 또는 형질전환 세포로서, 새로운 유전 물질의 흡수를 반드시 포함하는 것은 아닌 자발적 또는 유도된 표현형 변화를 가진다. 형질전환 바이러스에 의한 감염과 새로운 게놈 핵산의 도입 또는 외인성 핵산의 흡수로 인해, 형질전환이 일어날 수 있지만, 발암 물질에 노출됨과 동시에 또는 그 이후에, 유발되어, 내인성 유전자를 돌연변이 유발시킬 수 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 적절한 동물 숙주, 예를 들어 누드 마우스에서의 형태 변화, 세포의 불멸화, 비정상적 성장 조절, 병소 형성, 정착 독립, 악성 종양, 접촉 억제 및 성장 밀도 제한의 상실, 성장 인자 또는 혈청 독립성, 종양 특이성 마커, 침입 또는 전이 및 종양 성장과 관련된다. 예를 들어, 문헌 [Freshney, Culture Animal 세포: Manual Basic Tech. (3rd ed., 1994)]을 참조한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 신체 기관 및 시스템의 정상적인 기능을 방해하는 세포의 비제어 성장을 지칭한다. 암 또는 종양이 있는 대상체는 대상체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암세포를 가지는 대상체이다. 이러한 정의에는 양성 및 악성 암뿐만 아니라, 휴면 종양 또는 소전이(micrometastase)가 포함된다. 원래 위치에서 이동하고, 필수 기관에 종양을 옮기는 암은 영향을 받는 기관의 기능 저하를 통해, 결국 대상체의 사망을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 제약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 제약 업계에서 통상적으로 사용되는 담체와 조합된 활성제를 지칭한다. 본 명세서에서 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 문구는, 건전한 의학적 판단 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 의해 조율되는 것으로서, 인류 및 동물의 조직과의 접촉 사용에 적합하며, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제점 또는 합병증이 없는 이러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여"는 원하는 부위에 제제를 부분적으로 전달하게 하는 방법 또는 경로에 의해, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물을 대상체에 배치하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은, 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해, 투여될 수 있다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 나타내며, 일반적으로 2개의 표준 편차(2SD) 이상의 차이를 의미한다.
작용 실시예 이외에 또는 달리 나타내는 경우 외에는, 본 명세서에서 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"으로 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때, 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~를 포함하는"(comprising) 또는 "~를 포함하다"(comprises)라 함은 본 방법 또는 조성물에 필수적인 조성물, 방법 및 그의 각각의 구성요소를 언급하는데 사용되지만, 필수적인지 여부와 상관없이, 지정하고 있지 않은 요소의 포함도 허용된다. .
용어 "~로 이루어진"(consisting of)이라 함은, 실시형태의 설명에 열거되지 않은 임의의 요소를 배제한, 본 명세서에 기술된 조성물, 방법, 및 그의 각각의 구성요소를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "필수적으로 이루어진"(consisting essentially of),이라 함은 소정의 실시형태에 요구되는 요소를 지칭한다. 상기 용어는 그 실시형태의 기본적이고 신규하거나 또는 기능적인 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. 문맥상 명확하게 달리 나타내는 경우 외에는, 단수형의 용어 "하나" (a, an) 및 "상기" (the)에는 복수형의 지시대상을 포함한다. 마찬가지로, 문맥상 명확하게 달리 나타내는 경우 외에는, 단어 "또는"에는 "및"이 포함되는 것을 의도한다. 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 또는 균등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 하기에 개시된다. 약어 "예를 들어"는 라틴어의 exempli gratia에서 유래하고, 본 명세서 중에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"(e.g.)는 용어 "예컨대"(for example)와 동의어이다.
세포 생물학 및 분자 생물학의 통상의 용어에 대한 정의는 문헌 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds]에서 찾아볼 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 발명은, 예를 들어, 본 명세서에서 그 전문이 모두 참조로서 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); or Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)]에 개시된 바와 같이, 표준 절차를 이용하여, 수행되었다.
다른 용어들은 본 발명의 다양한 측면의 설명에서 본 명세서에서 정의된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용되는 문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 계류중인 특허 출원을 포함한 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어, 본 명세서에서 개시되는 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이들 출원에 개시된 방법론을 개시하고 설명하기 위해, 본 명세서에서 참조로서 명시적으로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 선행 발명의 관점이나 또는 기타 임의의 이유로, 이러한 개시내용의 날자를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 이해되어서는 안된다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 본 출원인에게 입수가능한 정보를 기반으로 한 것이며, 이들 문서의 날짜 또는 기재내용의 정확성에 대한 어떠한 인정을 구성하는 것이 아니다.
본 발명의 실시형태에 대한 설명은 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하거나 총망라적인 것으로 이해되어서는 안된다. 본 명세서에서, 본 발명의 특정 실시형태 및 실시예가 설명 목적으로 개시되나, 당업자가 이해하는 바와 같이, 다양한 균등 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 일정한 순서로 표현되나, 대안적 실시형태에서, 다른 순서로 기능이 수행될 수 있거나, 또는 실질적으로 동시에 기능이 수행될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 본 발명에 대한 교시는 적절한 기타 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 다양한 실시형태는 조합되어, 추가의 실시형태가 제공될 수 있다. 본 발명의 측면들은, 필요한 경우, 상기 참조 및 출원의 조성물, 기능 및 개념을 사용하여, 변형되어, 본 발명의 추가의 실시형태가 제공될 수 있다. 또한, 생물학적 기능 균등성 고려 사항으로 인해, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 주지 않으면서 단백질 구조에서 약간의 변화가 있을 수 있다. 본 발명의 상세한 설명에 비추어, 본 발명에 이러한 변화 및 기타 다른 변형이 가해질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 실시형태들 중 임의의 것의 특정 요소들은 다른 실시형태들에서 요소들과 결합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 실시형태와 관련된 장점이 이들 실시형태와 관련하여 기술되었지만, 다른 실시형태가 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 발명의 범위 내에서 반드시 이러한 장점을 나타낼 필요는 없다.
본 명세서에서 개시되는 기술은 다음의 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 어떠한 방식으로도 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 개시되는 기술의 일부 실시형태는 하기의 번호가 매겨진 단락 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다:
1. 동종 이식편 거부 반응을 억제하는 방법으로서, Sema3F 작용제를 동종 이식편 수용자에 투여하는 단계를 포함하며, 동종 이식편에 대한 면역 거부 반응이 억제되는 것인 방법.
2. 대상체의 면역계를 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
3. 이를 필요로 하는 대상체의 염증성 병증을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 염증성 병증이 자가면역 질환인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 자가 면역 질환이 하기의 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법:
제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염.
6. 제3항에 있어서, 상기 염증성 병증이 국소 병증인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 국소 염증성 병증이 발진 및 알레르기 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
8. 치료를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
9. 신생혈관 생성을 감소시키는 방법으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 Sema3F 폴리펩티드 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 Sema3F 수용체와 결합할 수 있는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Sema3F 폴리펩티드가 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있는 것인 방법:
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 푸린-형 억제제 (furin-like inhibitor)인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 정맥 내로 투여되는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 근육 내, 피하, 또는 피부 내로 투여되는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 염증 부위로 국소 투여되는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 추가의 항염증제가 하기의 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법:
스테로이드; 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제 또는 그의 유사체; 및 항증식제.
20. 이를 필요로 하는 대상체에서, 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 대상체에 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 항-Sema3F 항체 시약인 방법.
22. 제20항에 있어서, NRP-2 억제제가 항-NRP-2 항체 시약인 방법.
23. 제20항에 있어서, Sema3F 억제제가 용해성 NRP-2 수용체인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 NRP-2 수용체의 용해성 단편인 방법.
25. 제20항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 방법.
26. 동종 이식편 수용자에서, 동종 이식편 거부 반응을 억제하기 위한 Sema3F 작용제의 용도.
27. 면역계 억제를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 Sema3F 작용제의 용도.
28. 이를 필요로 하는 대상체에서, 염증성 병증의 치료를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
29. 제28항에 있어서, 상기 염증성 병증이 자가면역 질환인 용도.
30. 제29항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
31. 제28항에 있어서, 상기 염증성 병증이 국소 병증인 용도.
32. 제31항에 있어서, 상기 국소 염증성 병증이 발진 및 알레르기 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
33. 암의 치료를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
34. 이를 필요로 하는 대상체에서, 신생혈관 생성의 억제를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 Sema3F 폴리펩티드 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 용도.
36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 용도.
37. 제35항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 Sema3F 수용체와 결합할 수 있는 것인 용도.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있는 것인 용도.
39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 푸린-형 억제제인 용도.
40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 정맥 내로 투여되는 것인 용도.
41. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 근육 내, 피하, 또는 피부 내로 투여되는 것인 용도.
42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 염증 부위로 국소 투여되는 것인 용도.
43. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 용도.
44. 제43항에 있어서, 상기 추가적인 항염증제가 스테로이드; 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제 또는 그의 유사체; 및 항증식제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
45. 이를 필요로 하는 대상체에서, 면역 반응을 촉진하기 위한 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제의 용도.
46. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 항-Sema3F 항체 시약인 용도.
47. 제45항에 있어서, 상기 NRP-2 억제제가 항-NRP-2 항체 시약인 용도.
48. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 용해성 NRP-2 수용체인 용도.
49. 제46항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 NRP-2 수용체의 용해성 단편인 용도.
50. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 용도.
실시예
실시예 1: 동종 이식편 거부 반응에서, 세마포린3f 및 뉴로필린 -2의 신규의 면역조절 기능
클래스 3 세마포린 패밀리 (Sema3A-G)은 플렉신 및 뉴로필린 패밀리 분자와 결합하여, 항-이동 및 항-증식을 초래하는 조절 신호를 유도한다. 본 명세서에서, Sema3F가 뉴로필린-2 (NRP-2)와의 결합을 통해, PI-3K-Akt 및 MAPK 신호 전달을 조절한다는 것이 입증되며, 이는 이러한 리간드-수용체 상호작용이 T 세포 활성 반응을 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 면역계에서의 Sema3F 및 NRP-2의 역할은 아직 개발되어 있지 않은 상태이다.
본 명세서에서는, Sema3F와 완전 불일치 BALB/c 심장 동종 이식편의 C57BL/6 수용체 치료가 개시된다. 본 명세서에서, Sema3F가 거부 반응을 억제할 수 있는 가능성이 있음이 입증된다; 평균 이식편 생존 기간은, 미처리 대조군 (평균 생존 기간 6.5일, n=8, P<0.000)에 대비하여, >22일 (아데노바이러스를 통한 투여시, n=4 마우스,P<0.000) 및 23.4 (i.p. 주입을 통한 투여시, n=16 마우스)이었다. 항-Sema3F 차단 항체에 의해, Sema3F 처리 수용체 (i.p. 주입 모델)를 공동 처리 (0, 2, 4 및 6일)하는 경우, 이식편 생존 기간이 대조군 (평균 생존 7.5일, n=4)으로 감소된다.
qPCR, FACS 및 웨스턴 블롯에 의해, 기준일에, T 세포 하위 세트에서, Sema3F 리간드 NRP-2가 발현되며, 6시간의 미토겐-활성화 (항-CD3) 후, CD4+ 효과기 및 조절 세포에서, 그의 발현이 현저하게 유도된다는 것이 입증되었다. CD4+ T 세포가 플렉신 A1-4 패밀리 분자 (qPCR)를 발현한다는 것이 또한 밝혀졌으며, 이는 Sema3F가 NRP-2 및 플렉신을 통해, 그의 조절 신호 전달을 유도할 수 있다는 것을 추가로 시사한다. 기능을 측정하기 위해, 본 발명자들은 NRP-2+/- (Hets) 및 NRP-2-/- (ko) 마우스를 생성하였고, 시험관 내에서, 이들 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포는 과증식되었으며 (~3배 증가), 미토겐 (항-CD3)에 대한 반응으로서, WT 세포에 대비하여, 증가된 IL-2 및 IFNγ가 생성된다. 과활성화는 CD4+CD25+ 하위 세트에 대비하여, 나이브 NRP-2ko CD4+CD25neg T 세포에서, 가장 현저하였다.
마지막으로, 완전 불일치 BALB/c 및 소수 불일치 B6.C-H-2bm12 공여체 심장 이식체의 수용체로서, NRP-2ko 마우스를 이용하였다. NRP-2ko 마우스는 WT 마우스 (평균 이식편 생존 기간 >54일, n=11, P<0.00)에 대비하여, BM12 심장을 거부하였다 (평균 이식편 생존 기간 32일, n=5). 반대로, NRP-2KO 마우스는 WT 이식편과 동일한 정도로, 완전 불일치 동종 이식편을 거부하였다. 또한, Sema3F는 NRP-2KO 마우스에서 거부 반응을 억제할 수 있으며, 이는, NRP-2와 독립적인 면역 조절 효과를 가질 수 있다는 것을 시사한다. 종합하면, 이들 연구 결과에 의해, Sema3F와 NRP-2가 새로운 면역 조절 단백질로서, 처음으로 밝혀졌다. 이러한 연구 결과는 또한 Sema3F-NRP-2 상호 작용이 동종 이형 반응의 조절에 매우 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 2: 세포 내 PI -3K- Akt 및 MAPK 신호 전달의 조절에 대한 세 마포린3F의 신규의 효과.
클래스 3 세마포린은 뉴로필린 (NRP) 및 플렉신 패밀리 분자와 결합하며, 항-이동 및 세포 골격 붕괴를 초래하는 신호를 유도하는 지도 분자로서 기능한다. 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 세마포린 3F (SEMA3F)는 완전 불일치 심장 동종 이식편 모델에서 동종 이식편 거부 반응을 억제할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는, NRP2 녹아웃 마우스는 과활성 T 세포 및 가속된 거부 반응을 가지며, 이는 Sema3F가 NRP2와의 상호작용을 통해 면역조절을 매개한다는 것을 시사한다는 것이 개시된다. 또한, 본 명세서에서는, NRP2는 효과기 및 조절 CD4+ T 세포 모두에서 발현된다는 것이 입증되며, 이는 T 세포 활성화 반응을 표적으로 하는 신규의 단백질이라는 것을 시사한다. 그러나, SEMA3F-유도 면역 반응 조절의 분자 기작은 알려져 있지 않다.
포스포 키나아제 항체 배열을 이용한 Sema3F 조절 세포 내 신호 전달 경로의 스크리닝을 위해, 높은 레벨의 NRP2를 발현하는 2개의 세포주 (U87MG 및 U343)를 이용하였다. Sema3F (640ng/㎖)의 가장 강력한 효과는 pAkt (T308 및 S473) pmTOR 및 pS6K 및 pERK의 활성을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이를 웨스턴 블롯 분석에 의해 시간 경과에 따라 확인하였다.
SEMA3F는 NRP2와 결합하여, 플렉신 A1과 복합체를 형성한다. siRNA를 사용하여, U87MG 세포에서, NRP2 또는 플렉신 A1의 녹다운은 p-Akt (S473) 및 p-S6K에서, SEMA3F-유도 감소를 억제하였다. 이러한 관찰은 Sema3F의 억제 효과가 세포 표면에서 SEMA3F와 NRP2/플렉신 A1의 결합을 통해, 매개된다는 것을 시사한다.
면역 침전법을 사용하여, SEMA3F가 mTOR과 raptor 및 rictor 둘 모두의 결합을 붕괴시킨다는 것이 또한 관찰되었다. 또한, 30분 동안 mTORC1을 표적으로 하는 라파마이신 (10ng/㎖)으로 세포를 처리하는 경우, Sema3F는 pAkt (S473)/mTORC2를 억제할 수 있다. 또한, 2DAkt로의 형질도입에 의해, mTORC1가 구성적으로 활성화된 후, Sema3F가 pAkt를 억제한다는 것이 다시 밝혀졌으며, 이는 Sema3F-NRP-2 상호 작용의 주요 효과가 mTORC2/Akt-유도 반응을 표적으로 한다는 것을 확인시키는 것이다.
마지막으로, Sema3F-유도 반응을, NRP-2를 발현하는 인간 Jurkat T 세포주에서 평가하였고, 예를 들어, pAKT 활성의 억제를 포함한 현저한 조절 신호 전달 반응을 유도한다는 것이 추가로 확인되었다. Sema3F는 다세포 형태에서 Akt/mTOR 신호 전달을 억제한다 (도 21). 전반적으로, 이러한 연구 결과에 의해, 최초로, SEMA3F가, 세포 내 신호 전달의 조절을 통해, 생리적 염증 해소시, 기능하는 신규의 분비 단백질이라는 것이 확인되었다. 본 명세서에서 개시되는 이러한 연구 결과는, Sema3F가 강력한 항염증 치료제로서, 광범위하게 적용된다는 것을 시사한다.
실시예 3: CD4+ T 세포 하위 세트에서, 뉴로필린 -2, 세마포린 수용체의 발현 및 기능
뉴로필린 NRP-1 및 NRP-2는 각각, 혈관 내피 세포 성장 인자뿐만 아니라, SEMA3A 및 SEMA3F를 포함한 세마포린 클래스 3 패밀리 분자와 결합한다. NRP-1과 SEMA3F의 결합 및 NRP-2와 SEMA3A의 결합은 내피 세포에서 억제 신호를 유도한다. NRP-1이 T 세포에서 발현되며, 이는 CD25+ FoxP3+ T 조절 세포 하위 세트에서 현저하다. 이러한 연구에서, qPCR, 웨스턴 블롯 분석 및 FACS를 이용하여, 비활성화 및 미토겐-활성화 인간 CD4+ T 세포 (항-CD3/항-CD28, 각각 1mg/㎖)에서의 NRP-2의 발현을 평가하였다. 일관되게, NRP-2 발현이 비활성화 세포에서 최소이나, 활성화 후, 현저하게 유도된다 (3 내지 5배, p=0.06, n=3)는 것이 밝혀졌다. 쥣과 동물의 백혈구에서의 NRP-2의 발현 양상을 또한 분석하였으며, 강화된 CD4+ T 세포뿐만 아니라, 비장 세포에서의 발현이 밝혀졌다. NRP-1이 CD25hi Tregs의 주요 수용체이기는 하지만, NRP-2가 CD4+CD25+ T 조절 및 CD4+CD25- T 효과기 하위 세트 둘 모두에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 기능을 정의하기 위해, CD4+ T 세포를 야생형 C57/BL6 마우스로부터 선별하고, 항-CD3 (0,001-1㎎/㎖) 농도를 증가시킨 배양 후, 활성화 반응을 평가 하였다. 종합하여 살펴보면, 이들 연구에 의해, CD4+ T 림프구에서의 NRP-2 발현을 처음으로 밝혀내었으며, 이는, T 세포 활성화 반응에서, SEMA3F-NRP-2 상호 작용이 기능한다는 것을 시사한다. 이러한 연구 결과는 클래스 3 세마포린이 세포-매개 면역 동종 이식편 거부 반응에서, 신규의 조절 사이토카인으로 작용할 수 있는 방법에 대한 새로운 이해를 위한 단계를 설정한다.
미토겐-활성화는 인간 T 세포에서 NRP-1과 NRP-2 둘 모두의 발현을 증가시킨다 (도 7). NRP-1은 CD4+ CD25high T 세포에서 발현되며, NRP-2는 강화된 CD4+ T 세포군에서 일반적으로 발현된다 (도 8).
동종 또는 동계 (syngeneic) 비장 세포에 의한 프라이밍 (priming) 7일 후, 수용체 비장 세포를 CD4 및 NRP-2 (세포 신호전달로부터의 모노클로날 토끼 항-마우스 NRP-2)에 의해 염색한 다음, FITC-접합 당나귀 항-토끼 2차 Ab로 처리하고, FACS에 적용하였다. FACS에 따른 정량화는, 동종 프라이밍 비장 CD4가 동계 프라이밍 또는 미처리 비장 세포와 비교할 때, NRP-2 발현의 증가를 나타내는 것으로 나타났다 (데이타 미제시).
이러한 연구들을 종합하면, CD4+ T 림프구에서의 NRP-2 발현이 확인되고, T 세포 활성화 반응에서, SEMA3F-NRP-2 상호 작용이 시사된다.
참조
Bagri A et al. Clin Cancer Res 2009;15:1860-1864.
실시예 4
본 명세서에서, 뉴로필린-2가 인간 T 세포 및 T 세포주 (Jurkat T 세포)에서 발현되고, Sema3F의 결합이 활성화 반응을 초래한다는 것이 입증된다. 뉴로필린이 쥣과 동물 T 세포에서 발현되는 것으로 추가로 입증된다.
Sema3F 아데노바이러스를 이용한 동종 이식편 수용체 처리는 생존 기간을 연장한다.
세마포린3F를 과발현하는 세포에 심장 이식체의 마우스 수용체로의 i.p. 주입은 동종 이식편 생존 기간의 연장 및 급성 거부 반응의 지연 (미처리 대조군의 거부 반응 6 내지 8일, 형질도입된 세포의 거부 반응 21 내지 28일)과 연관된다. Sema3F를 발현하지 않는 대조군 세포는 동종 이식편 거부 반응을 지연시키지 않는다. 또한, (sema3F의 효과를 차단하기 위해) 항-Sema3F 차단 항체가 제공된 마우스에서, 형질도입된 세포는 생존 기간을 연장시키지 못하며, 거부 반응을 지연시키지 못한다. 예비 연구에서, 형질도입된 세포의 이러한 효과는 NRP-2가 결핍된 마우스에서는 나타나지 않는다.
NRP-2가 결여된 마우스 (이형 접합체 및 NRP-2 KO 마우스)의 세포는 과증식성이며, 미토겐으로 활성화 된 후, 야생형 세포보다 많은 사이토카인을 생성한다. NRP-2가 결여된 마우스 (이형접합 및 NRP-2 KO 마우스)의 경우, 동종 이식편 거부 반응이 증가된다.
본 명세서에서, 하기 사항이 구체적으로 고려된다:
a. 세마포린 3F 또는 관련 분자는 많은 염증성 질환 상태에서, 항-염증 또는 면역 조절제로서, 사용될 수 있다.
b. 세마포린 3F 및 NRP-2 작용제는 동종 이식편 거부 반응의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 상호 작용의 증가는 면역 억제의 역할을 할 수 있다.
c. 면역 반응을 향상시키기 위한 제제로서, 표적 항-세마포린 또는 항-NRP-2 (A 도메인 분자)의 사용.
d. 면역 조절에서, NRP-A 도메인, B 도메인 또는 A+B 도메인 펩티드 용해성 단백질을 이용한 길항 작용의 다른 기작.
실시예 5:
세마포린 3F는 생체 내에서, 급성 동종 이식편 거부 반응에 대한 면역억제제로서 작용한다.
Balb/C 공여체 심장을 C56BL6 마우스로 이식하였다. 대조군 마우스의 경우, 7 내지 8일에 거부 반응이 나타났다. Sema3F를 인코딩하는 아데노바이러스를 심장 이식 후의 마우스에 IV 주입하면, 생존 기간이 최고 40일까지 연장된다 (도 2).
0.2㎎/㎏의 라파마이신을 0 내지 2일에 투여한 후, Sema3F를 투여하였다. 이러한 제한된 모델에서, 가산적 이식편 연장 효과가 관찰되지 않았다 (생존 기간 연장의 징후가 없음) (도 4).
T 세포 하위 세트에서, NRP-2의 발현은 mRNA 레벨 (도 7 및 22), FACS (도 9) 및 웨스턴 블롯 (도 7 및 22)에 의한 단백질 레벨에서 이루어졌다. 도시된 바와 같이, 활성화 CD4+ T 세포, Foxp3pos 및 Foxp3neg 세포 둘 모두에서, NRP-2의 현저한 발현은 관찰되지 않았다.
CD4+ T 세포를 C57BL/6 백그라운드에서, WT, NRP-2+/- (Hets) 및 NRP-2-/- (KO) 마우스의 CD25neg T 효과기 하위 세트로 선별하였다. 미토겐 유도 증식 및 사이토카인 생성 (ELISPOT)을 평가하였다. NRP-2 Hets 및 NRP-2 KO 마우스로부터 유래된 CD25neg 하위 세트뿐만 아니라, 전체 CD4+ T 세포군에서, 현저하게 향상된 활성화 반응이 관찰되었다. 이러한 현저한 과활성화 반응은, NRP-2가 CD4+ T 세포에 신규의 조절 신호를 제공한다는 가설을 확인시킨다. CD4+ CD25neg T 효과기 하위 세트의 선별 군을 또한, 항-CD28의 존재하에, 증가된 농도의 미토겐 (항-CD3)으로 배양하였다. CD4+ T 세포는 보조 자극 신호에 반응하여 최대로 증식하나, NRP-2 KO 세포는 과활성 상태로 유지되며, WT 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포 보다, 현저히 많은 IFNg 및 IL-2가 생성된다. 이러한 관찰 결과는, CD4+ T 세포에서, NRP-2가 기능성이고, 조절 신호를 유도할 수 있다는 것을 추가로 입증한다.
만성 거부 반응
소수 MHC 불일치 B6.C-H2bm12 (BM12) 동종 이식편을 C57BL/6 (야생형/WT), NRP-2+/- (BL6 상 Het) 또는 NRP-2-/- (BL6 상 KO) 마우스에 이식시켰다. 예상된 바와 같이, WT 수용체에서, 동종 이식편은 장기간 생존하나, 이식 후, ~30일 후에, 만선 거부 반응이 발생한다; 질환의 현저한 증거가 45일에 존재한다 (도 5). 이들 모델에서, 장기간 생존 기간이, T 효과기의 확장을 제한하는 것으로서, 이식 후, 21일에, T 조절 세포의 확장과 연계되어 보고되었다(104). NRP-2+/- Het 수용체의 경우, 생존 기간이 감소하고, NRP-2-/- KO 수용체의 경우에는, 생존 기간이 상당히 감소한다 (P<0.05). 이러한 관찰 결과는, CD4+ T 세포에서, NRP-2가 조절 기능을 가진다고 밝혀진 바에 일치한다.
NRP-2는 플렉신 패밀리 분자와 복합체를 형성하고, 조절 신호를 유도할 수 있으며, CD4+ T 세포에서, 플렉신 패밀리 분자가 발현된다 (도 10). 따라서, NRP-2는 플렉신과의 상호 작용을 통해, T 세포에서, 조절 신호를 유도할 수 있다. 다양한 농도에서, 플레이트-결합 항-CD3을 이용하여, 플레이트 상에, 야생형, NRP-2 het, 및 NRP-2 녹아웃 세포를 플레이팅함으로써, CD4+ 세포의 증식에 대한 NRP-2의 효과를 조사하였다. 감소된 레벨의 NRP-2 증식을 가지는 세포에서, 사이토카인 생성 및 증식에 의해 분명해지는 T 세포 활성화가 증가하였다 (도 11). CD4+ CD25- 세포의 증식을 측정하는 유사한 실험을 또한, 항 CD28 (1 ㎍/mL)에 의해 첨가된 공동 자극을 이용하여, 수행하였다 (도 13). NRP-2 녹아웃은 증가한 활성화를 나타내나, aCD28의 존재하에, 대폭 감소한다. 이는, 활성화 반응의 개시에 대비하여, T 세포 활성화 반응의 해소시, NRP-2가 기능할 수 있다는 것을 시사한다.
NRP-2 녹아웃 CD4+ T 세포를 미토겐 활성화에 적용한 후, 배양 상청액에서, 사이토카인 생성을 활성화 후, 72시간에, 조사하였다. NRP-2 녹아웃은 사이토카인의 증가된 생성을 나타내었다 (도 12). 또한, 항-CD3에 의한 미토겐 활성화 후, 48 및 72시간에, NRP2 녹아웃 CD4+ CD25- T 세포에서, 증가된 사이토카인 생성이 관찰되었다 (도 14 및 도 24). 또한, IFNγ 및 IL2의 생성을 ELISPOT 분석에 의해, 조사하였으며 (도 15 및 16), 이는 유사하게, NRP2 녹아웃 세포에서, 증가된 사이토카인의 생성을 입증하였다.
Sema3F는 PI -3K/ Akt - mTOR 신호 전달을 조절한다.
높은 레벨의 NRP-2를 발현하는 것으로 알려진 U87MG 세포를, 신호 전달 반응을 자극하는 것으로 알려진 레벨 (~640 ng/mL)에서, Sema3F로 처리하였다. pAkt (mTORC2) 및 pS6K (mTORC1) 의존적 활성화의 억제가 관찰되었다 (도 18). SEMA3F의 최고 효과가 ~600ng/㎖에서 관찰되었으며, 이 농도의 SEMA3F를 모든 신호 전달 분석에서 사용하였다. 도 18의 상단 패널에서 도시된 바와 같이, 10분 후, SEMA3F가 pAkt (S473)의 발현을 억제하였고 (농도계 >80%), 30분에, pAkt (S473), pAkt (T308), pmTOR 및 pS6K에서, 가장 현저한 감소가 나타났다. 도 18의 하단 패널에서 도시되는 바와 같이, pERK1/2의 발현은 SEMA3F 처리 후, 세포에서, 현저히 감소하였으며, 30분에, 최고 효과가 나타났다.
그 후, Sema3F로 처리되는 U87MG 세포에서, NRP-2 또는 플렉신A1을 녹다운시키기 위해, siRNA를 사용하였다. 대조군 siRNA 및 표적 siRNA 세포에서, pAkt (mTORC2) 및 pS6K (mTORC1) 의존적 활성화의 억제에 대한 효과의 시간 경과에 따른 관찰 결과는, NRP-2 및 플렉신A1의 녹다운이 Sema3F의 효과를 억제한다는 것을 시사하였다 (도 19). 도 19의 상부 패널에 도시된 바와 같이, SEMA3F는 NRP2 녹다운 후, pAkt 및 pS6K를 억제하지 못했다. 이러한 연구 결과는 SEMA3F가 NRP2를 통해 조절 신호 전달을 유도한다는 것을 확인시킨다.
상기에서 논의한 것처럼, NRP-2는 플렉신 A1과 복합체를 형성하며, 플렉신이 NRP 신호 전달 반응을 유도한다는 것이 보고되어 있다. SEMA3F-NRP-2-유도 반응에서, 이러한 가능성을 시험하기 위해, 플렉신 A1의 녹다운 후, U87MG 세포에서, SEMA3F의 효과를 평가하였다. 도 19의 하부 패널에 도시된 바와 같이, SEMA3F는 대조 siRNA-형질도입 세포에서 pAkt 및 pS6K를 억제하는 효과가 있었지만, 다시, 플렉신 A1 siRNA 형질도입 세포에서 반응을 유도하지는 못했다. 이러한 관찰은 Akt 유도 신호에 대한 SEMA3F의 기능성 효과가 세포 표면에서 NRP-2와 플렉신 A1 사이의 상호 작용을 필요로 한다는 것을 시사한다.
또한, 도 20에 도시된 바와 같이, NRP-2-발현 Jurkat T 세포를 증가된 농도으lSEM A3F로 30분 동안 처리하고, pAkt (S473)의 발현을 웨스턴 블롯에 의해, 평가하였다. 고농도의 SEMA3F (> 600ng/㎖)로 처리 후, 발현이 감소된다.
실시예 6: 인간 CD4+ T 세포에서, 조절 NRP -2 수용체의 발현.
NRP-1 및 NRP-2는 각각 조절 SEMA3A 및 SEMA3F뿐만 아니라, VEGF와 결합한다. CD4+ T 세포를 인간 PBMC로부터 정제한 후, 미토겐-의존적 활성화 (항-CD3/항-CD28) 후, VEGFR1 (Flt-1), NRP-1 및 NRP-2의 발현을 평가하였다. 활성화 후, NRP-2 발현이 현저하게 유도되며, 그 레벨은 기타 임의의 수용체보다 높다 (도 22).
실시예 7
전술된 바와 같이, Sema3F를 인코딩하는 아데노바이러스 또는 대조군 아데노바이러스를 마우스에 주입하였다. 아데노바이러스 주입 후, 3일 및 5일 후, 귀 종창을 유도하는 옥사졸론을 마우스에 추가로 처리하였다. Sema3F 처리된 마우스는 대조군 처리된 마우스에 비해, 종창이 감소되는 것으로 나타났다 (도 6).
실시예 8
CD4+ T 세포를 CD4cre NRP-2fl / fl 마우스로부터 분리한 후, mRNA 및 단백질 레벨에서, NRP-2 발현을 평가하였다. 최소 발현이 주목되었다. 세포를 증가된 농도의 미토겐에 의해, 활성화시키고, 표준 티미딘 혼입 분석법에 의해, 증식을 측정하였다. 또한, CD4+ T 세포를 APC로 배양한 후, 증가된 농도의 항 -CD3 및 IFNg를 ELISPOT 분석으로 평가하였다. NRP-2 T 세포 활성화 반응을 야생형 마우스와 비교하였다. 종합하면, NRP-2 녹다운 세포는 과활성화되었으며, 이는, 이들이 증가된 거부 반응을 개시시킨다는 생체 내 연구 결과와 일치한다 (도 23).
실시예 9
도 25는 만성 동종 이식편 거부 반응 모델의 이식편 생존 기간 곡선을 도시한다. 심장 동종 이식편 B6.C-Hbm12 (BM12)를 소수 MHC 불일치 수용체로서, 야생형 C57BL/6(WT), NRP-2 녹아웃 (NRP-2 -/-) 또는 선택 CD4+ T 세포 NRP-2 녹아웃 마우스 (CD4Cre-NRP-2fl / fl)에 이식하였다. 예상된 바와 같이, 심장 동종 이식편은 WT 마우스에서 장기간 생존한다; 그러나, 녹아웃 마우스는 증가된 거부 반응을 개시시킨다.
실시예 10: 인간 CD4+ T 세포에서, NRP -2의 발현.
인간 CD4+ T 세포를 인간 모세혈로부터 음성적 선택에 의해, 분리하였다. NRP-2의 발현을 비활성화 세포 및 미토겐 (항-CD3/CD28) 활성화 세포에서, qPCR에 의해, 평가하였다 (도 26a). 활성화시, mRNA 발현이 증가하는 것을 주목한다. 또한 인간 Jurkat T 세포주에서, 발현을 평가하였다. FACS에 의해, Jurkats는 높은 레벨의 NRP-2를 발현한다.
인간 말초 혈액 세포를 표준 Ficoll 분리에 의해 분리한 후, 비활성화 또는 미토겐-활성화 후, 사용하였다. NRP-2 발현을 CD4+ 하위 세트에서, FACS에 의해, 평가하였다 (도 26b). 활성화 후, 단백질 발현이 증가한다.
말초 혈액 세포를 항-CD4, 항-FoxP3 및 NRP-2로 염색하였다 (도 26c). FoxP3+ 인간 CD4+ T 조절 세포 및 비-FoxP3/T 효과기 세포 둘 모두가 NRP-2를 발현하는 것을 보여주는 것으로서, FACS에 의해 평가된 바와 같이, 발현을 도시하였다.
실시예 11: 쥣과 동물 CD4+ T 세포에서, NRP -2의 발현.
도 27a는 쥣과 동물 비장 및 림프절 내의 CD4+ T 세포에서, NRP-2의 FACS 분석을 도시한다. CD4+ T 세포의 개별 집단이 NRP-2를 발현하는 것에 주목한다. CD4+ T 세포를 쥣과 동물 비장에서 음성적 선택에 의해 분리하였다. NRP-2의 발현을 비활성화 세포 및 미토겐 (항-CD3/CD28) 활성화 세포에서, qPCR에 의해, 평가하였다 (도 27b). 활성화시, 발현이 증가하는 것에 주목한다. 또한, 플렉신 A 패밀리 분자를 분리된 CD4+ T 세포에서 평가하였다. 이러한 하위 세트에서, 플렉신 A1 및 A4의 발현이 가장 높은 것으로 나타난다 (도 27c). CD4+ T 세포를 쥣과 동물의 비장으로부터 음성적 선택에 의해 분리한 후, NRP-2의 발현을 Foxp3+ 및 Foxp3 음성 하위 세트에서 평가하였다 (도 27d). 비활성 CD4+ 세포의 하위 세트 둘 모두에서, NRP-2가 발현된다. 분리된 비장 CD4+ T 세포를 미토겐 활성화 (항-CD3-1mcg/㎖)시킨 후, NRP-2의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다 (도 27e). 다시, NRP-2는 활성화시에 발현이 증가하는 것으로 밝혀졌다. CD4+ T 세포를 표준 배양 배지 (미토겐+TGFb+항-IL-4+항-IFNg+레티노산)에서, 유도된 Treg 세포로의 분화로 유도한 후, NRP-1/2의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다 (도 27f). 이러한 세포 유형에서, NRP-2는 NRP-1과 공동 발현된다.
실시예 12: 시험관 내 및 생테 내에서, 세마포린 3F 뉴로필린 2 상호작용에 의한 MTOR 신호 전달의 정규화
세마포린 3F (SEMA3F)는 뉴로필린 2 (NRP2)와 플렉신 A 패밀리 분자에 결합하는 능력을 통해, 뉴런 안내 신호를 제공한다. 본 명세서에서는, 포스포키나아제 어레이(phosphokinase array), 면역 침전 및 웨스턴 블롯 분석을 이용한 것으로서, 인간 내피 세포, T 세포 및 종양 세포에서, SEMA3F-NRP2 신호 전달 반응의 분석이 개시된다. 일관되게, SEMA3F는 PI-3K 및 Akt 활성을 억제하며, 반응은 mTOR/rictor 조립체의 붕괴 및 RhoA GTPase의 mTOR 의존적 활성화와 관련된다. 본 명세서에서는, 또한, mTOR-유도성 세포 활성화 반응 및 세포 골격 안정성뿐만 아니라, 혈관 내피 성장 인자의 발현이 시험관 내에서, SEMA3F-NRP2 상호작용에 의해, 억제된다는 것이 개시된다. 생체 내에서, SEMA3F의 국소 및 전신 과다 생성은 NRP2를 발현하는 이종 이식편에서, 종양의 성장을 감소시킨다. 종합하면, SEMA3F는 다양한 인간 세포 유형에서 mTOR 신호 전달을 조절하며, 이는 그의 생명 작용이 만성 질환에 광범위한 영향을 미친다는 것을 시사한다.
도입
신경 회로망은 양성 및 음성 양자의 환경 신호에 대한 축삭 성장 원추의 반응에 의해 조절된다. 예를 들어, 내트린-1에 의해 유도된 신호는 화학유인물질 (chemoattractive)로서 작용하나, 세마포린 3F (SEMA3F)에 의해 지배되는 신호는 화학반발물질 (chemorepulsive)로서 작용한다. 종합적으로 알 수 있는 바와 같이, 이들 과정은, 축삭 유도로서, 중추 신경계의 발생에 중요한 역할을 한다 (1, 2). SEMA3F는 다수의 클래스 3 세마포린 (SEMA3A-G)이며, 그의 수용체는 뉴로필린 1 (NRP1), 뉴로필린 2 (NRP2) 및 플렉신이다 (3, 4). 세마포린은 혈관 및 종양 생명 작용에 관여하며 (5, 6) 및 다량의 데이터는, 이들이 종양 면역과 관련된 면역 반응을 조절한다는 것을 시사한다 (7, 8, 9, 10). 또한, 이들은 시험관 내에서, 내피 세포 (EC) 및 종양 세포의 이동을 억제하고, 생체 내에서, 종양 진행, 전이 및 신생 혈관 생성을 감소시킨다 (5, 6). 그럼에도 불구하고, T 세포, EC, 평활근 세포 및 종양 세포의 SEMA3F에 대한 반응은 잘 알려져 있지 않지만, 기능적 효과는 항원 이동, 세포 골격 붕괴 및 스트레스 섬유의 손실을 포함하는 조절 반응을 특징으로 한다 (5, 6, 11). SEMA3F 신호 전달 기작의 분석은 SEMA3F가 NRP2 및 플렉신 A1과 복합체를 형성한다는 것을 입증하였다. 이러한 복합체는, p190RhoGAP를 활성화하여, RhoA의 불활성화를 초래하는 ABL2 티로신 키나아제, GTP를 GDP로 전환시켜, EC 및 종양 세포의 이동 반응의 감소와 연관된 것으로서, F-액틴의 해중합 (depolymerization) 및 스트레스 섬유의 손실을 초래하는 작은 GTPase를 유인한다 (6).
Gleevec (imatinib), ABL2 티로신 키나아제 억제제는 교아종 세포 및 EC에서 스트레스 섬유 형성 및 운동성의 SEMA3 매개성 손실을 배제한다 (12). SEMA3F로 안정적으로 형질도입된 H157 폐암 세포는 감소된 레벨의 인산화된 Akt (S473), STAT3 및 Erk를 가지며 (13), 감소된 Akt 활성은 혈관 신생 인자, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 낮은 레벨의 발현과 관련된다 (13).
세마포린 및 NRP-유도 반응이 다중 세포 내 신호 전달 경로를 조절할 수 있으며, 공통적인 특징은 Akt 키나아제의 인산화의 억제이다 (2,13). 이러한 효과는, 세마포린-유도 신호 전달의 주요 생물학적 효과가 mTOR 신호 전달의 억제에 관여한다는 것을 고도로 암시한다. 실제로, 최근의 연구는 무척추동물 세마포린-플렉신 상호 작용이 Caenorhabditis elegans (C. elegans)에서, 내피 세포의 형태학적 변화에 필요한 TOR 신호 전달을 조절할 수 있다는 것을 보여 주었다 (14). mTOR은, mTOR, raptor 및 mLST8 (mTORC1) (15, 16), 또는 mTOR, rictor, Sin1, protor 및 mLST8 (mTORC2) (17, 18, 19)로 이루어진 두 개의 별개의 다중 단백질 복합체로 존재하는 세린/트레오닌 키나아제이다. mTORC1은 S6K1 및 4EBP1의 인산화에 의해, 세포 성장을 부분적으로 조절하며, 단백질 번역의 주요 조절자이다 (20, 21). mTORC2는 세포 생존 기간 및 Akt (22) 및 혈청/글루코코르티코이드-조절 키나아제-1 (SGK1) 및 PKC〈 (18, 23)에 의한 활성화를 매개한다. 암 치료 보조제 (27) 및 자가면역 질환, 만성 염증 및 동종 이식편 거부 반응 (24, 25, 26)에 대한 치료제로서, mTOR 신호 전달 경로의 표적화에, 지대한 관심이 존재한다. 그럼에도 불구하고, 인간 면역 세포, 상피 세포 및 종양 세포 (5, 6, 28)에서, NRP2 수용체의 광범위한 발현에도 불구하고, 이러한 신호 전달 경로 또는 이들 질환 과정에 대한 SEMA3F의 영향에 대해서는 거의 보고된 바 없다.
본 명세서에서는, SEMA3F가 NRP2 및 플렉신 A1과 상호작용하여, PI-3K 활성을 감소시키고, mTORC2의 조립을 억제하며, 하류 Akt 신호 전달을 감소시킨다는 것이 개시된다. 또한, SEMA3F가, 종양 형성 및 만성 염증에서 기능을 발휘하도록 잘 확립되어 있는 VEGF의 PI-3K 활성 및 Akt-유도 트랜스활성화를 억제함으로써, 항 종양 효과 및 항 혈관 형성 효과를 유도할 수 있다는 것이 입증되었다. 종합하면, 이러한 연구들에서, SEMA3F는 포유동물 세포에서 신규의 PI-3K/mTORC2 억제제로 정의되며, 이는, SEMA3F가 광범위한 생물학적 임상적 함의를 가지며, 만성 질환의 해소를 개선시키는 치료제라는 것을 시사한다.
결과
SEMA3F는 Akt , mTOR , 및 S6K 인산화를 억제한다. 세포 내 신호 전달 반응에 대한 SEMA3F의 효과를 측정하기 위해, NRP2-발현 인간 교아종 세포주 U87MG에서의 포스포키나아제의 레벨을 프로파일링하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 것으로서 (도28b), SEMA3F가 다수의 키나아제, 특히 Akt (T308 및 S473), Erk (T202/Y204 및 T185/Y187) 및 mTOR (S2448)의 인산화를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (도 28a; 표 1). 시간 경과 분석은, pAkt (T308 및 S473), pmTOR 및 그 하류 신호 전달 (pS6K 및 pS6)이 SEMA3F 처리 후, 10 내지 20분 이내에 억제되고, 이러한 억제 효과가 60분 이상 지속된다는 것을 시사하였다 (도 28c 및 34a). SEMA3F는 NRP2 및 플렉신 A1-siRNA 형질도입 세포 둘 모두에서 pAkt, pS6K 및 pS6을 억제하지 못했으며, 이는, Akt/mTOR 활성에 대한 SEMA3F의 조절 효과가 세포 표면에서 NRP2/플렉신 A1 복합체와의 상호 작용을 필요로 한다는 것을 시사한다 (도 19, 상부 패널 및 34b). SEMA3F는 또한 U251 교아종 세포, 멜라닌 세포주, Jurkat T 림프구 및 내피 세포를 포함한, NRP2를 발현하는 여러 다른 세포주에서 Akt (S473)와 S6K 인산화를 억제하였다 (도 34c-34d). 표준 ELISA 기반 분석법을 사용하여 29, SEMA3F가 각 세포주에서 PI-3K 활성을 시간 의존적 방식으로 억제한다는 것이 밝혀졌다 (도 28d). 또한, SEMA3F로 내피 세포를 30분 동안 전처리하면, 후속 VEGF-유도 PI-3K 활성화가 억제되었다 (도 28d). 이러한 결과는, SEMA3F-NRP2 상호 작용이 PI-3K-Akt/mTOR 신호 전달의 활성을 억제하도록 조절된다는 것을 시사한다.
SEMA3F는 주로 mTORC2의 조립을 억제한다. mTORC1 및 mTORC2 신호 전달은 많은 정상 세포 유형의 분화, 증식 및 생존 기간 (27, 32, 33, 34, 35)뿐만 아니라, 세포 대사 (30, 31)에 중요하다. 면역 침전에 의해, SEMA3F가 mTOR와 raptor 및 rictor 양자 사이의 결합을 억제한다는 것이 밝혀졌으며 (도 29a), 이는 각각 mTORC1 및 mTORC2에 대한 생물학적 효과를 시사한다. 실제로, SEMA3F로 60분 동안 처리된 세포의 경우, pAkt (T308 및 S473) 및 pS6K의 레벨이 감소하였다 (미처리 세포 대비, 도 29b, 레인 1 대 4). 기능의 주요 모드가 mTORC1 대 mTORC2의 억제와 관련이 있는지를 측정하기 위해, 세포를 라파마이신 (mTORC1을 억제하기 위해 30 분 동안 10 nM)으로 전처리한 후, 세포를 SEMA3F 및 라파마이신의 부재 또는 존재하에 추가의 60분 동안 배양하였다. 이전에 보고된 바와 같이 (36, 37, 38), 대조군으로서, 라파마이신 단독에 의한 처리 (90분간)는 pS6K의 현저한 억제를 초래하였으나, pAkt (T308 및 S473) 레벨에서 각각 1.9- (p < 0.001) 및 2.0 배 (p < 0.01)의 유도를 초래하였다 (도 29b, 레인 1 대 2 및 도 29c). 반대로, U87MG 세포를 라파마이신으로 30분간 처리한 후, SEMA3F와 라파마이신으로 추가의 60분간 처리한 결과, pAkt와 pS6K의 레벨이 모두 감소했다 (도 29b, 레인 2 대 5). 주목할 것은, pAkt 발현의 억제에 대한 SEMA3F의 효과는, ATP 경쟁적 mTORC1/C2 억제제 Torin 1로 처리된 세포에서 관찰되는 것과 유사하였다 (도 29b, 레인 2 대 5). SEMA3F는 또한 pSGK1 (S422) 및 pPKC〈 (S657, 도 28b 및 도 35a), mTORC2 활성의 기타 알려진 표적을 억제하였다 (23).
SEMA3F의 주요 생물학적 효과가 mTORC2 복합체 형성에 있는지를 추가로 평가하기 위해, 그 후, U87MG 세포를, T308 및 S473 자리가 키나아제의 구성적 활성 형태를 인코딩하도록 돌연변이된 2ADkt로 형질도입시켰다 (36, 37). EC에서 2DAkt의 과발현은 mTORC1 활성화를 초래하였으며, 라파마이신은 2DAkt-유도 신호 전달 반응을 억제했다 (37). 유사하게, 대조군 형질도입체에 대비하여, 2DAkt의 형질도입은 U87MG 세포에서 pS6K 및 pS6의 발현 유도 레벨과 연관되었으나 (도 29d, 레인 1 대 4), SEMA3F로 형질도입된 세포를 처리한 후에는, 발현에 변화가 없었다. 또한, SEMA3F가 2DAkt 형질도입체에서 pAkt (S473)의 레벨을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (도 35a). 또한, mTORC2 조립체에 대한 주요 효과와 일치하는 것으로서, 면역 침전법에 의해, 2DAkt 형질도입된 세포를 SEMA3F로 처리하면, mTOR/rictor 상호작용이 억제되었다 (도 35b). 종합하면, 이러한 결과는 SEMA3F/NRP2/플렉신 A1 상호 작용이 mTORC2/Akt 활성의 억제에 직접적인 영향을 미친다는 것을 보여준다.
mTORC2는 F- 액틴 세포 골격에 의해, SEMA3F 생명 작용과 연결된다. 다음으로, mTORC2의 억제가 SEMA3F 활성을 세포 골격 붕괴와 연결시키는 중간 반응으로서 작용하는지 여부를 측정하였다. U87MG 세포를 SEMA3F (640 ng/㎖), 라파마이신 (10 nM) 또는 Torin 1 (10 nM)으로 30분간 처리하였으며, 팔로이딘 염색을 사용하여, 액틴 세포 골격을 시각화하였다. SEMA3F는 치료되지 않은 세포에 비해, 스트레스 섬유 형성 및 세포 골격 배열을 현저하게 억제한다 (도 30a, p = 0.002). 또한, mTORC1/C2 억제제 Torin 1 처리 후, 세포에서 유사한 효과가 관찰되었다 (p = 0.01). 반대로, mTORC1 억제제 라파마이신에 의한 처리는 세포 골격의 변화를 유도하지 못했다 (도 30a; 도 35a-35b). 또한, SEMA3F는 pcDNA3.1 대조군 벡터 형질도입 세포에서, 스트레스 섬유 형성을 90% 억제하였으나, mTOR 과발현 작제물로 형질도입된 U87MG 세포에서는 스트레스 섬유 형성에 거의 영향을 미치지 않았다 (도 30b). 이러한 결과는 SEMA3F가 mTORC1에 직접적인 효과가 거의 없다는 것을 시사한다. 이러한 해석에 일관되게, raptor의 녹다운은 또한 스트레스 섬유 형성과 세포 골격 붕괴에 거의 영향을 미치지 않았다 (도 30c). 그러나, SEMA3F는 raptor-siRNA 처리 세포에서, 스트레스 섬유 형성을 감소시켰으며 (도 30c); 특히, rictor의 siRNA 녹다운만으로 붕괴를 유도하는데 충분했다 (p = 0.02). 이러한 데이터는 mTORC2가 SEMA3F-유도성 세포 골격 붕괴를 조절하는 중간 매개체로서 기능한다는 것을 시사한다.
RhoA 활성 (39)을 mTOR 과발현 작제물로 형질도입된 U87MG 세포에서, 로테킨 풀다운 분석 (rhotekin pulldown assay)을 사용하여 측정하였다 (도 30d). RhoA 활성은 대조군 pcDNA3.1-형질도입 세포에서 SEMA3F에 의해 억제되었으나 (88%), mTOR을 과발현하는 세포에서, 활성이 부분적으로 복구되었다 (55%). 또한, siRNA를 사용하면 (상기와 같음), raptor가 아닌 Rictor의 녹다운이 RhoA 활성을 약화시키는 것으로 밝혀졌다 (도 30e). 종합하면, 이러한 관찰 결과는, SEMA3F/NRP2/플렉신 A1 상호 작용에 의한 mTORC2 활성의 억제가, 차례로 세포 골격 붕괴를 유도하는 RhoA를 불활성화시키는 기능이 있다는 것을 보여준다. 따라서, SEMA3F에 의한 mTORC2 활성의 상향 조절은 다수의 생물학적 반응을 표적화할 수 있다.
SEMA3F는 mTOR 경로를 통해, VEGF의 저산소증-유도 생성을 억제한다. VEGF의 국소 발현 및 조절은 많은 생리학적 병리학적 과정의 핵심이다 (40, 41). 이러한 연구 결과는 SEMA3F가 mTOR 키나아제 활성을 표적화할 수 있는 그의 능력을 통해, VEGF의 전사 활성화를 표적화 할 수 있다는 것을 시사한다 (36, 42). VEGF 발현의 조절에 대한 SEMA3F의 효과를 시험하기 위해, U87MG 세포를 전장의 2.6 kb VEGF 프로모터-루시퍼라아제 작제물로 형질도입시킨 후, 저산소증 (1% O2) 또는 저산소증 모방 제제인 디스페리옥사민 (DFO)에 노출시켰다. DFO 처리가 VEGF 프로모터 활성을 유도하였으며 (16배, p < 0.001), 이는 SEMA3F (30분 동안의 전처리, 도 31a)에 의해, 부분적으로 억제되는 것 (43%, p < 0.005)으로 밝혀졌다. VEGF 프로모터 활성은 또한 1 % O2에서 18시간 배양 후, 증가하였으며 (예상된 바와 같음 43); 다시, VEGF 프로모터 활성은 SEMA3F로 처리 한 후에 감소되었으나 (44%, p < 0.05), 기저 레벨은 아니었다. mTORC1/C2에서 SEMA3F의 상대적 효과를 시험하기 위해, U87MG 세포를 2DAkt 작제물 및 전장의 VEGF 프로모터 리포터 작제물로 일시적으로 공동 형질도입시켰으며, 세포를 SEMA3F의 부재 또는 존재하에 배양하였다. DFO 처리 후, SEMA3F가 2DAkt 형질도입 세포에서, VEGF 프로모터 활성을 약화시키지 못하는 것으로 밝혀졌다 (도 31c). 마지막으로, VEGF의 조절 배지로의 분비에 대한 SEMA3F의 효과 (ELISA에 의함)를 DFO의 부재 또는 존재하에 측정하였다. DFO는 VEGF 생성을 현저하게 증가시켰다 (미처리 세포에 비해, 160%, p < 0.001, 데이터 미제시). 또한, DFO-유도 VEGF 단백질 분비는 SEMA3F, mTORC1 억제제 라파마이신 (mTORC1/C2의 표적화를 위해, 18시간 동안) 및 mTORC1/C2 억제제 Torin 1에 의해, 현저하게 감소되었다 (도 31d, p < 0.01). 라파마이신과 SEMA3F로 세포를 병용 처리하면, VEGF 생성이 추가로 억제되지 못했으나, SEMA3F와 Torin1의 조합은 SEMA3F 또는 Torin1 단독의 경우에 비해, VEGF 레벨을 약간 (그러나, 유의하게 p <0.05) 억제하였다 (도 31d). 종합하면, 이러한 연구 결과는 SEMA3F가 mTOR 활성의 조절을 통해, 유도성 VEGF 발현을 부분적으로 억제한다는 것을 시사한다.
SEMA3F는 생체 내에서, U87MG 종양 성장 및 신생 혈관 생성을 억제한다. 본 발명자들의 신호 전달 연구의 생체 내 관련성을 측정하기 위해, SEMA3F의 종양 성장에 대한 효과를 잘 수립된 이종 이식편 모델에서, 평가하였다 (5, 44, 45). 한가지 접근법에서, SEMA3F를 구성적으로 과다 발현하도록 조작된 모체 U87MG 세포 또는 U87MG 세포에 누드 마우스 (1 × 106/마우스)를 피하 이식하고; 종양 크기 (㎣)를 3주 동안, 지정된 시점에 측정하였다. SEMA3F 생성 세포가 이식된 경우, 모체 세포에 대비하여, 종양 성장이 본질적으로 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다 (p < 0.0005, 도 32a). 또한, CD31 발현 EC의 면역 조직 화학적 분석은 모체 U87MG 종양에서 다수의 혈관을 나타내었으며 (도 32b); 반대로, U87MG/SEMA3F-유도 종양 내의 모세 혈관은 수축되었으며, 내강 (lumen)이 식별되지 않았다 (도 32b). 두 번째 접근법은 1 x 106 U87MG 세포를 누드 마우스의 피부에 주입하는 것이었으며, 2일 후, 마우스에, 대조군 아데노 바이러스 (Ad-Cont) 또는 His (Ad-3F)로 태깅 (tagging)된 인간 SEMA3F를 인코딩하는 아데노 바이러스의 단일 정맥 내 주입을 제공하였다. Ad-3F (1 x 109 pfu)를 마우스에 주입해도 30일 동안 독성이 나타나지 않았으며; 마우스의 몸무게가 늘고, 일반적인 거동은 정상이었다. 웨스턴 블롯 분석은 Ad-3F의 투여가 간에서, 높은 레벨의 SEMA3F 생성을 야기했으며 (도 32c), ELISA에 의해, SEMA3F 레벨이 혈청에서 측정 가능한 것으로 나타났다. SEMA3F 단백질의 순환 혈청 레벨은 아데노바이러스 투여 후 8일째에 최고를 이루고 (종양 세포 주입 후 10일째), 14일째 실험이 끝날 때까지 지속되었다 (26 ng/㎖의 평균, n=4). 따라서, 이 접근법은, 마우스에서 종양 성장이 확립된 후에, 순환 SEMA3F 생성이 개시되도록 할 수 있다. 종양 용적은 Ad-Cont 처리 마우스에서, 14일째까지 400㎣에 도달하였으나, Ad-3F를 주입한 마우스에서는 14일간 종양 성장이 거의 나타나지 않았다 (p < 0.0001, 도 32c). 면역 염색에 의해, Ad-3F 처리 마우스에서 채취한 종양 내에, CD31 발현 모세 혈관의 표현형의 현저한 붕괴가 있었으며, 대부분의 혈관 내강이 뚜렷하게 나타나지 않았다 (도 32d). 또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해, Ad-Cont 처리 마우스와 비교하여, Ad-3F 처리 후, 종양에서 pAkt, pmTOR 및 pS6K 레벨이 억제된 것으로 밝혀졌다 (도 32e). 따라서, 두 가지 매우 다른 접근법에서, SEMA3F 투여 (국소 및/또는 전신)는 유사한 항 종양 효과를 가진다. 종합하면,이러한 결과는, SEMA3F가, Akt/mTOR 신호 전달 경로의 억제에 의해, 종양 성장 및 신생 혈관 생성을 억제한다는 것을 입증한다.
논의
세마포린은 축삭 유도와 선도 (pathfinding)의 매개체로 처음 밝혀졌으며, 혈관 항상성과 종양 발생을 조절하는 것으로 밝혀졌다 (1, 2). 이러한 연구에서, SEMA3F는 강력한 mTOR 억제제로 정의되며, 그 효과는 PI-3K 활성의 억제와 mTOR/rictor 및 mTOR/raptor 복합체의 조립을 통해, 매개된다. 또한, 그 기능성 효과가 NRP2-플렉신 A1 수용체와의 상호 작용을 통해, 매개되는 것으로 밝혀졌다. SEMA3F에 의한 mTOR의 조절은 T 세포, 내피 세포 및 종양 세포 주를 포함한 여러 세포 유형에서 밝혀졌으며, 이들 모두는 세포 활성화, 분화 및 증식을 위해, 이러한 신호 전달 경로를 이용할 수 있도록 잘 확립되어 있다. 이러한 연구 결과는 SEMA3F 생명 작용이 만성 염증과 관련된 암 및 질환, 예를 들어, 동종 이식편 거부 반응을 포함하여, 많은 생리적 병리학적 병증에 광범위하게 관련되어 있다는 것을 시사한다.
mTORC1의 세포 내 조절에 대해 많은 부분이 알려져 있지만, mTORC2 활성의 상향 조절에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 있지 않다. C. elegans에서, 무척추동물 세마포린-플렉신 상호 작용이 TOR과 rictor의 결합을 감소시키나, TOR/raptor 결합을 촉진하여, 4EBP-eIF4F 경로 14를 통한 mRNA 번역을 야기하는 것으로 나타났다. 반대로, 포유동물 세포에서, 현재 제시된 연구는, SEMA3F가 mTORC2 활성을 선택적으로 표적화하며, 따라서, 세포 활성화 후, 사전 해소 (pro-resolution)를 위한 고유의 용해성 리간드로서 기능할 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, mTORC1을 활성화시키는 2DAkt로의 NRP2-발현 세포주의 형질도입은, SEMA3F가 mTOR과 raptor 사이의 결합 (데이터 미제시) 또는 S6K 및 S6의 인산화/활성화에 대해, 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다. 또한, SEMA3F 반응은, 주로 mTORC1을 표적화하는 것으로 알려진 라파마이신으로의 단기간 경과 처리 후에 관찰된 것과 현저하게 다르다. 반대로, 다수 분석에서, 세포 활성화 및 세포 골격 붕괴에 대한 SEMA3F의 억제 효과가 주로 mTORC2에 대한 효과를 통해 매개되었으며, Torin1 (mTORC1/C2의 약리학적 억제제)로 처리한 후 관찰된 것과 유사하다는 것이 밝혀졌다.
중요하게도, SEMA3F가 mTORC246, 47의 활성화시, 기능성으로 보고된 PI-3K 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, SEMA3F가 PI-3K의 상향 억제를 통해 mTORC2를 불활성화시킬 가능성이 있다. 또 다른 관련 패밀리 멤버 NRP1은 PI-3K의 음성 조절자인 염색체 ten (PTEN) (7)에서 결실된 tensin 상동체 및 포스파타아제를 결합 및 활성화시킨다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 따라서, SEMA3F에 의한 NRP2의 연결이 PI-3K 활성을 조절하는 중간 매개체 기능하는 PTEN의 집결을 초래할 수 있다고 가정했다. 이러한 가능성에 일치하는 것으로서, PTEN이 인간 제대 정맥 EC (HUVEC, 도 36a)에서, NRP2와 동시 면역침전된 것으로 밝혀졌다. 또한, siRNA 형질도입 및 플렉신 A1의 녹다운 후, 면역 침전에 의해, PTEN이 NRP2와의 결합을 유지시키며 (도 36b), 이는, HUVEC에서, PTEN과 NRP2 (플렉신 A1이 아님) 사이의 직접적 상호 작용을 시사한다. 또한, SEMA3F는 HUVEC에서 PTEN의 siRNA 녹다운 후, pAkt 발현을 억제하지 못했다 (도 36c). 이러한 결과는 대부분, NRP2에 대한 PTEN의 결집이 PI-3K/Akt/mTOR 신호 전달에 대한 조절 효과에 대해 역학적이라는 것을 암시한다.
그러나, U87MG, U251 및 Jurkat 세포는 상대적으로 PTEN이 결여된 것으로 보고되었으며 (48, 49, 50) (도 34c 참조), 이는 SEMA3F가 또한 PTEN-독립적 기작을 통해, 조절 반응 (들)을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, 예상된 바와 같이, PTEN은 U87MG 세포에서 NRP2와 공동-면역 침전되지 않았다 (데이터 미제시). 이를 위해, NRP2 신호를 PI-3K 활성과 역학적으로 연결시킬 수 있는 다른 어댑터를 스크리닝하였다. 여기에는 GIPC1 (GAIP/RGS19 상호 작용 단백질, 또한, 뉴로필린 상호 작용 단백질 또는 synectin으로 알려짐, 도 36d) (51,52,53), 다른 GIPC 패밀리 멤버 (52) 및 mTOR 상호 작용 단백질을 포함하는 DEP 도메인 (DEPTOR) (32, 54)이 포함된다. 그러나, 이들 어댑터의 siRNA 녹다운은 pAkt 발현에 대한 SEMA3F의 조절 효과를 변화시키지 않았다 (데이터 미제시). SEMA3F가 mTOR/Akt 및 MAPK 신호 전달에 미치는 영향 사이의 혼선을 평가하였다. 약리학적 MEK 억제제 U0126은 pAkt 레벨에 대한 SEMA3F의 조절 효과를 조절하지 않았으며, 이는 Akt-mTOR 신호 전달에 대한 SEMA3F의 억제 효과가 MAPK 독립적이라는 것을 시사한다 (도 36e). 따라서, SEMA3F-NRP2 상호 작용은 정상 세포의 일차 배양에서 PI-3K 및 mTORC2를 조절하기 위해, PTEN을 결집시킬 수 있으나, 추가적인 어댑터/키나아제가 또한 이러한 반응에서 기능할 수 있다.
SEMA3F를 포함한 축삭 유도 분자의 세마포린 패밀리은, 액틴 세포 골격 스트레스 섬유의 부수적 재배열로부터 야기되는 신경 성장 원뿔 붕괴를 촉진하는 것으로, 잘 알려져 있다. SEMA3F는 시험관 내 및 생체 내에서, 종양 세포 및 EC 부착, 확산 및 운동성의 강력한 억제제이다 (5, 6). 또한, SEMA3F는 24시간 이내에 U87MG 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않는다 6. 종양 및 혈관 내피 세포에서, SEMA3F는 RhoA를 불활성화시켜, 세포 골격 스트레스 섬유 형성을 억제한다 6, 12. 본 명세서에서, mTORC2가 이러한 반응에서 중간 매개체이며, RhoA 불활성화에 필수적이라는 것이 입증된다. 예를 들어, SEMA3F 처리로 인해, mTOR로의 세포 형질도입 (mTORC1 유도를 위해) 후, 세포 붕괴가 초래되며, 이는, 이러한 효과가 mTOR-독립적이고/거나, mTORC2의 표적화와 관련된다는 것을 시사한다. mTORC2에 대한 효과와 일치하는 것으로서, rictor의 siRNA 녹다운 및 mTORC2 억제제 Torin 1으로의 U87MG 세포의 처리는, SEMA3F로 처리한 후 관찰되는 바와 같이, 스트레스 섬유의 수를 일관되게 감소시켰다. 또한, raptor siRNA (mTORC1) 녹다운 세포에서 스트레스 섬유의 수를 감소시켰다. 중요하게는, SEMA3F는 rictor siRNA 처리 세포에서, 스트레스 섬유를 추가로 감소시키며, 이는, SEMA3F가 부분적으로 mTORC2 및 부분적으로 ABL2/p190RhoGAP 경로 (도 33)를 통해, RhoA를 불활성화시킬 가능성이 있다는 것을 시사한다. mTORC2가 Rho GTPase 패밀리과 상호 작용하고 F-액틴 세포 골격의 재구성을 매개하는 것으로 보고되었지만 (18, 55), 본 명세서에서, 이러한 효과가 NRP2 유도 신호의 자극을 통해, 표적화될 수 있다는 것이 입증된다.
Akt의 mTORC2-의존적 활성화는 내피 세포에서, VEGF의 전사 활성화에서, 기능한다 (36). VEGF는 종양 성장을 증대시키는 신생혈관 생성 촉진 인자 (proangiogenesis factor)로서, 만성 염증과 관련된 백혈구 화학유인물질로서 기능한다 (43). SEMA3F가 mTORC2 활성을 표적화하므로, VEGF의 유도성 발현에 생물학적 영향이 있는지를 또한 평가했다. SEMA3F가 mTORC2 및 mTORC1 둘 모두의 억제를 통해, 유도성 VEGF 발현을 현저하게 억제한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, SEMA3F는, mTORC1 활성화를 유도하는 2DAkt 작제물로의 세포의 형질도입 후, VEGF의 트랜스활성화를 억제하지 못한다. 또한, SEMA3F 또는 라파마이신 (mTORC1/C2 둘 모두를 억제하는 장기간 치료) 또는 mTORC1/C2 억제제 Torin 1로 처리하면, U87MG 세포에서 VEGF 발현의 억제 레벨이 유사하다는 것이 밝혀졌다. SEMA3F와 라파마이신을 조합한 결과, 추가적인 억제 효과는 없었으며, 이는 SEMA3F와 라파마이신이 동일한 신호 전달 경로를 표적으로 한다는 것을 시사한다. 그러나, 놀랍게도 SEMA3F는 Torin 1의 VEGF 발현에 대한 억제 효과를 부분적으로 증대시켰다. 이는, 이러한 연구에 사용된 Torin 1 투여량이 mTORC2를 완전히 억제하기에 충분하지 않거나, 대안으로, Torin 1이 추가로 SEMA3F-유도 조절 기작 (들)을 밝혀낼 가능성이 있다는 것을 암시할 수 있다. 주목할만한 것으로서, SEMA3F만으로는 VEGF 발현을 기저 레벨까지 억제하지 못하지만, EC의 VEGF 유도 증식을 억제하는 것으로 이전에 보고된 바 있다 (56). 그럼에도 불구하고, 이러한 새로운 연구 결과는, SEMA3F의 항-VEGF 효과가 생체 내 생물학적 효과, 예를 들어 종양 성장 억제 잠재력에 대한 본 발명자들의 과거 (5, 6) 및 현재의 관찰 결과에 비추어, 가장 현저할 수 있다는 것을 시사한다.
폐, 뇌 및 유방암 세포와 같은 종양 세포에서의 SEMA3F의 과발현은 이종 이식편 마우스 모델에서 종양 발달 및 신생 혈관 생성을 현저하게 억제한다 (5, 13, 44, 45, 57). 이들 연구에서, 대조군이나 SEMA3F 생성 U87MG 세포는 누드 마우스에 피하 이식되었으며, SEMA3F의 발현이 종양 성장 및 신생 혈관 생성을 강력하게 억제한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 아데노바이러스를 사용하여, 종양 발생 후, 종양 성장 및 신생 혈관 생성에 대한 높은 레벨의 순환 SEMA3F 단백질의 영향을 평가하였다. 특히, 순환 SEMA3F는 종양 성장을 현저하게 억제했다. 그러나, 성장하는 종양 내에 새로 생성된 모든 혈관은 극적으로 붕괴된 표현형을 가지며, 이는 세포 골격에 대한 공지된 SEMA3F 효과와 일치한다 (6). 또한, SEMA3F-처리 마우스의 종양 용해물은 pAkt, pmTOR 및 pS6K의 감소된 레벨을 나타내었으며, 이는 시험 관내에서의 효과와 일치한다. 따라서, 생체 내 모델에서, SEMA3F는 신생혈관 생성을 억제하는 내피 세포에 대한 효과뿐만 아니라, VEGF 분비의 억제 및 Akt-mTOR 신호 전달의 직접 억제 둘 모두를 통해, 종양 성장에 큰 영향을 미칠 수 있다. 또한, 두 가지 다른 접근법 (종양에 의한 국소 과발현 및 전신 투여)에 의해 얻어진 종양 성장의 현저한 억제는, SEMA3F가 생체 내에서 강력한 mTOR 억제제라는 것을 확인시킨다.
이러한 연구 결과는, SEMA3F-NRP2 상호 작용이 세포 내 PI-3K 활성, mTORC2-의존적 신호 전달, RhoA 활성 및 세포 골격 스트레스 섬유 형성을 억제한다는 것을 입증한다. SEMA3F는 또한 시험관 내에서 전사 및 단백질 레벨 둘 모두에서 VEGF의 유도성 발현을 억제하며, 생체 내에서 강력한 항종양 효과를 가진다. SEMA3F는 세포 활성화 후 해소를 촉진시키는 기능을 하는 분비된 생리적 mTOR 억제제이다. 이러한 연구 결과는, SEMA3F를 치료 목적으로 사용하는 것, 예를 들어 만성 면역 매개 질환, 동종 이식편 거부 반응 또는 신생혈관 생성 관련 병리, 예를 들어, 종양 성장 및 진행을 표적으로하는 것을 포함하여 광범위한 임상적 함의를 가진다.
방법
항체 및 시약: 항체, 토끼 모노클로날 항-포스포-Akt (Thr308) 항체 (#2965); 마우스 모노클로날 항-포스포-Akt (Ser473) 항체 (#4051); 토끼 폴리클로날 항-Akt 항체 (#9272); 토끼 폴리클로날 항-포스포-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) 항체 (#9101); 마우스 모노클로날 항-Erk1/2 항체 (#4696); 토끼 모노클로날 항-포스포-S6K (Thr389) 항체 (#9234); 토끼 모노클로날 항-S6K 항체 (#2708); 토끼 모노클로날 항-포스포-S6 (Ser235/236) 항체 (#4856); 마우스 모노클로날 항-S6 항체 (#2317); 토끼 모노클로날 항-포스포mTOR (Ser2448) 항체 (#5536); 토끼 폴리클로날 항-mTOR 항체 (#2972); 토끼 폴리클로날 항-플렉신 A1 항체 (#3813); 토끼 모노클로날 항-raptor 항체 (#2280); 토끼 모노클로날 항-RhoA 항체 (#2117); 토끼 모노클로날 항-PTEN 항체 (#9188)는 모두 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구입하였다. 염소 폴리클로날 항-포스포-SGK (S422, sc-16745); 마우스 모노클로날 항-NRP2 항체 (C-9, sc-13117); 염소 폴리클로날 항-GIPC 항체 (N-19, sc-9648)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc (Dallas, TX)로부터 구입하였다. 토끼 폴리클로날 항-rictor 항체 (A300-458A)는 Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, TX)에서 구입하였으며, 마우스 모노클로날 항-β-액틴 항체 (AC-15)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
VEGF-A (DVE00) ELISA 키트는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. PI3-키나아제 활성 ELISA (K-1000s)는 Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT)로부터 구입하였다. mTOR 억제제, 라파마이신 및 Torin 1은 각각 Lc Laboratories (Woburn, MA) 및 R&D Systems에서 구입하였다. 데스페리옥사민 (DFO)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, MEK 억제제 (U0126)는 EMD-Millipore (Billerica, MA)에서 구입하였다. pGL4.74[hRluc/TK] 벡터 (Promega Madison, WI)를 루시퍼라아제 분석의 내부 대조군으로서, 사용하였다.
세포 배양: U87MG 및 U251 인간 교아종 세포, 신장 293 세포 및 293T 세포, 및 Jurkat T 림프구는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였으며, 추천된 바와 같이, 10% FBS (Denville Scientific, Inc., South Plainfield, NJ) 및 1% L-글루타민/페니실린 G/스트렙토마이신 설페이트 (1% GPS, Life Technologies)를 포함하는 배지에서 배양하였다. HUVEC는 Lonza (Walkersville, MD)에서 구입하였으며, EGM2 SingleQuot가 보충된 EBM2 배지에서 배양하였다. 인간 멜라닌 세포 (HEMn-LP, Life Technologies)는 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서, Human Melanocyte Growth Supplement (Life Technologies)가 보충된 Medium 254를 이용하여, 유지시켰다. 모든 저산소증 실험에서, 세포를 37℃, 1% O2의 저산소 챔버 (Heracell, Thermo Scientific, Hudson, NH)에서 배양하였다.
인간 재조합 SEMA3F: FuGENE HD Transfection Reagent (Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여, 전장의, His-Myc-태깅 인간 SEMA3F 작제물을 293T 세포로 형질도입시켰다. 배양 배지로 분비된 SEMA3F를 HiTrap™ HP Chelating 칼럼 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Pittsburgh, PA)에서 정제하였다 (60).
포스포 -키나아제 어레이: 인간 포스포-키나아제 어레이 키트 (ARY003)는 R&D Systems에서 얻었다. U87MG 세포를, 이전에, 세포 골격 붕괴를 유도하고, RhoA 활성을 억제하는 것으로 밝혀진 SEMA3F로 처리하였다 (6). U87MG 세포를, U87MG 세포 및 HUVEC에서, 형태 변화를 유도하고, 세포 이동을 억제하는 것으로 밝혀진 320 ng/㎖의 SEMA3F로 전처리하였다. 이들 결과에 일치하는 것으로서, 본 발명자들은 SEMA3F (최저 농도 200 ng/㎖에서도)가 pAkt 및 pS6K 신호 전달을 억제한다는 것을 밝혀내었다 (도 34d). 그러나, 다른 세포 유형에서, 이 농도는 이러한 신호를 억제하기에 차선적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 640 ng/㎖에서의 농도를 SEMA3F 신호 전달 경로를 분석하기 위해, 최적화하였다. 세포 용해물을 SEMA3F 처리 후 30분에 수집하고, 포스포단백질의 레벨을 제조사의 지침에 따라, 이들 어레이로 분석하였다.
웨스턴 블로팅: 각 샘플 내의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 상기 막을 30분 동안, TBS-T (0.1% Tween 20/트리스-완충 식염수 [TBS]) 중의 4% 무 지방 우유로 차단한 후, 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. TBS-T로 세척한 후, 막을 적당한 양 고추냉이 퍼옥시다아제-접합 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, ECL 검출 시약을 이용하여, 면역 활성을 검출하였다.
면역침전법: 세포 용해물을 적절한 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 면역침전시켰다. 단백질 G-세파로오스 4 패스트 플로우 비드 (GE Healthcare)를 각각의 샘플에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 샘플을 SDS 샘플 완충액에 용해시키고, 5분간 끓였다.
F- 액틴 염색: 세포를 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정한 후, PBS 중의 0.2% Triton X-100으로 투과시켰다. F-액틴 및 핵을 Alexa Fluor 488 팔로이딘 및 Hoechst 33342로 각각 염색하였다. 각 배양의 3-5 영역에서 공초점 이미지를 검토하고, 스트레스 섬유를, 개시된 바와 같은 표준 방법론을 사용하여, 대표적인 개별 세포 (~5/실험)에서 계수하였다 6.
RhoA 활성: RhoA 활성 분석을, 제조사 지침 (Cytoskeleton, Denver, CO)에 따라, 로테킨 풀다운에 기초한 RhoA 활성화 분석 키트를 사용하여, 측정하였다.
RNA 간섭: 제조사 프로토콜에 따라, siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여, siRNA (20 nM)의 형질도입을 수행하였다. 대조군 siRNA (Silencer Negative Control #2 siRNA)는 Life Technologies에서 구입하였다. ON-TARGETplus™ Human NRP2 siRNA는 Thermo Scientific (Hudson, NH)에서 구입하였으며, 플렉신 A1 (Hs_PLXNA1_3), rictor (Hs_RICTOR_5), PTEN (Hs_PTEN_6) 및 GIPC1 (Hs_RGS19IP1_1) siRNA는 Qiagen (Valencia, CA)에서, Raptor siRNA (sc-44069)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX)에서 구입하였다. 일반적으로, siRNA 형질도입은 분석 전에 48시간 동안 수행되었다.
형질도입 및 루시퍼라아제 분석: Lipofectamine 2000 시약 (Life Technologies)을 이용하여, 제조사의 지침에 따라, 지시된 바와 같이, U87MG 세포를 플라스미드 작제물 (pcDNA3.1, WT mTOR, 2DAkt, VEGF 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 또는 pGL4.74[hRluc/TK])로 일시적으로 형질도입시켰다. 18시간 후, 각 실험 설계에서, 설명된 바와 같이, 세포를 처리하였다. VEGF 프로모터 활성을 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)을 사용하여 분석하고, 루시퍼 라아제 활성을 내부 대조군으로서 Renilla 루시퍼라제에 의해, 정규화시켰다.
아데노바이러스: 재조합 대조군 (# 000047A) 및 인간 SEMA3F-His (# 129755A) 아데노바이러스는 Applied Biological Materials, Inc (Richmond, Canada)에서 구입하였다. 각 아데노바이러스를 293 세포로 증폭시키고, Fast Trap Adenovirus Purification and Concentration Kit (EMD-Millipore)를 이용하여, 정제하였다. Adeno-X™ Rapid Titer Kit (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)에 의해, 아데노바이러스 역가를 측정하였다. 아데노바이러스는 1 x 1010 pfu/㎖ 이상의 역가로 얻어졌다.
종양 이종 이식편 모델: 모체 U87MG 세포 또는 인간 SEMA3F 안정 U87MG 클론 (1 x 106/주입)을 누드 마우스 (수컷, 8-10주령)에 피하 투여하였다. 하나의 모델에서, 종양 크기는 표준 캘리퍼스를 사용하여 3-4 일마다 측정되었다. 24일째에 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하였다. 두 번째 모델에서, 모체 U87MG 세포를 누드 마우스에 피하 투여하였다. 시험 연구에서, 종양 세포 주사 (1 × 106 U87MG 세포/주입) 전에, SEMA3F (Ad-3F)를 인코딩하는 아데노바이러스 또는 대조군 아데노바이러스 (Ad-Cont)를 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주입하였으며; 본 발명자들은 Ad-3F 그룹의 모든 종양이 성장하지 못했다는 것을 관찰했다 (데이터 미제시). 따라서, 본 발명자들은 우리의 접근법을 수정하였고, Ad-3F의 투여를 종양 주입 후 2일까지 연기시켜, 종양 성장이 순환계 내에서 SEMA3F 최고 생성 전에 개시되도록 하였다 (투여 후 ~8-10주, 데이터 미제시). 종양 크기를 표준 캘리퍼스를 사용하여 매일 측정하고, 혈청 샘플을 5일 및 8일째에 꼬리 정맥으로부터 채취한 후, 종양, 간 및 혈청 샘플을 채취한 14일째에 마우스를 희생시켰다. SEMA3F의 생성을 항-His/항-Sema3F로 간을 웨스턴 블롯 분석하고, MyBioSource (San Diego, CA)의 인간 SEMA3F ELISA 키트 (MBS454602)를 사용하여 SEMA3F의 혈청 레벨을 분석하여 확인하였다.
면역조직화학: 파라핀-포매 절편을 탈파라핀화한 후, 37℃에서, 30분 동안, 0.2M Tris 완충액 (pH7.2) 중의 프로테이나아제 K (36 ㎍/㎖)로 활성화시킨 다음, 면역조직화학 염색을 위해, 처리하였다. 면역조직화학을 항-마우스 CD31 항체 (BD Biosciences, San Jose, CA), VectaStain Kit (Vector, Burlingame, CA) 및 Tyramide Signal Amplification (TSA) Biotin 시스템 (NEN Life Science Products, Boston, MA)에 의해, 제조사의 지침에 따라, 수행하였다.
통계 분석: 모든 분석은 적어도 3회 독립적으로 수행되었다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 제시된다. 스튜던트 t 검정을 사용하여, 그룹들을 비교하였고, p 값 < 0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
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실시예 13
도 2에 제시된 바와 같이, 5일째에, 이식 후, 초기에, Treg 표현형을 시험함으로써, Sema3F의 면역 조절 기능을 평가하였다. FACS 및 요약 (도 37)의 하단 패널에서 제시된 바와 같이, CD3, CD4, CD8 및 Treg에서, 차이가 관찰되지 않는다.
실시예 14
CD4+ T 효과기 세포 분화를 NRP-2 녹아웃 및 제어 녹아웃에서 시험하였다. NRP-2 녹아웃 CD4+ T 세포에서 분화가 향상된다 (도 39). 데이터는 NRP-2가 효과기 T 세포 확장을 억제한다는 것을 시사한다.
실시예 15
소수 MHC 불일치 B6.C-H2bm12 공여체 심장을 C57BL6 (WT) 또는 NRP-2 KO 수용체에 이식한 후, 생존 기간을 측정하였다. NRP-2 결여는 심장 동종 이식편 거부 반응의 증가를 초래한다 (도 40).
실시예 16
생체 내에서, NRP-2 리간드 Sema3F의 효과를 연구하기 위해, 심장 이식 모델에서, 부재 대조군 또는 Sema3F를 포함하는 아데노바이러스를 마우스에 투여하였다. Sema3F 벡터는 간에서, Sema3F의 생성을 증가시켰다. Sema3F 레벨은 투여 후, 14일째에 최고였다 (도 41).
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SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNOMODULATION <130> 701039-080591-PCT <140> <141> <150> 62/006,441 <151> 2014-06-02 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 785 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Trp Ala Ser Leu Leu Thr Gly Ala 1 5 10 15 Trp Pro Ser Phe Pro Thr Gln Asp His Leu Pro Ala Thr Pro Arg Val 20 25 30 Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys Ala Thr Gly Thr Ala His Phe Phe 35 40 45 Asn Phe Leu Leu Asn Thr Thr Asp Tyr Arg Ile Leu Leu Lys Asp Glu 50 55 60 Asp His Asp Arg Met Tyr Val Gly Ser Lys Asp Tyr Val Leu Ser Leu 65 70 75 80 Asp Leu His Asp Ile Asn Arg Glu Pro Leu Ile Ile His Trp Ala Ala 85 90 95 Ser Pro Gln Arg Ile Glu Glu Cys Val Leu Ser Gly Lys Asp Val Asn 100 105 110 Gly Glu Cys Gly Asn Phe Val Arg Leu Ile Gln Pro Trp Asn Arg Thr 115 120 125 His Leu Tyr Val Cys Gly Thr Gly Ala Tyr Asn Pro Met Cys Thr Tyr 130 135 140 Val Asn Arg Gly Arg Arg Ala Gln Ala Thr Pro Trp Thr Gln 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Val Cys Val Arg Asp Cys 930 935 940 Ser Pro His Tyr Arg Ala Leu Ser Pro Lys Arg Phe Thr Phe Val Thr 945 950 955 960 Pro Thr Phe Tyr Arg Val Ser Pro Ser Arg Gly Pro Leu Ser Gly Gly 965 970 975 Thr Trp Ile Gly Ile Glu Gly Ser His Leu Asn Ala Gly Ser Asp Val 980 985 990 Ala Val Ser Val Gly Gly Arg Pro Cys Ser Phe Ser Trp Arg Asn Ser 995 1000 1005 Arg Glu Ile Arg Cys Leu Thr Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Ser 1010 1015 1020 Ala Pro Ile Ile Ile Asn Ile Asn Arg Ala Gln Leu Thr Asn Pro 1025 1030 1035 Glu Val Lys Tyr Asn Tyr Thr Glu Asp Pro Thr Ile Leu Arg Ile 1040 1045 1050 Asp Pro Glu Trp Ser Ile Asn Ser Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val 1055 1060 1065 Thr Gly Thr Asn Leu Ala Thr Val Arg Glu Pro Arg Ile Arg Ala 1070 1075 1080 Lys Tyr Gly Gly Ile Glu Arg Glu Asn Gly Cys Leu Val Tyr Asn 1085 1090 1095 Asp Thr Thr Met Val Cys Arg Ala Pro Ser Val Ala Asn Pro Val 1100 1105 1110 Arg Ser Pro Pro Glu Leu Gly Glu Arg Pro Asp Glu Leu Gly Phe 1115 1120 1125 Val Met Asp Asn Val Arg Ser Leu Leu Val Leu Asn Ser Thr Ser 1130 1135 1140 Phe Leu Tyr Tyr Pro Asp Pro Val Leu Glu Pro Leu Ser Pro Thr 1145 1150 1155 Gly Leu Leu Glu Leu Lys Pro Ser Ser Pro Leu Ile Leu Lys Gly 1160 1165 1170 Arg Asn Leu Leu Pro Pro Ala Pro Gly Asn Ser Arg Leu Asn Tyr 1175 1180 1185 Thr Val Leu Ile Gly Ser Thr Pro Cys Thr Leu Thr Val Ser Glu 1190 1195 1200 Thr Gln Leu Leu Cys Glu Ala Pro Asn Leu Thr Gly Gln His Lys 1205 1210 1215 Val Thr Val Arg Ala Gly Gly Phe Glu Phe Ser Pro Gly Thr Leu 1220 1225 1230 Gln Val Tyr Ser Asp Ser Leu Leu Thr Leu Pro Ala Ile Val Gly 1235 1240 1245 Ile Gly Gly Gly Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Ala Val 1250 1255 1260 Leu Ile Ala Tyr Lys Arg Lys Ser Arg Asp Ala Asp Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Lys Arg Leu Gln Leu Gln Met Asp Asn Leu Glu Ser Arg Val Ala 1280 1285 1290 Leu Glu Cys Lys Glu Ala Phe Ala Glu Leu Gln Thr Asp Ile His 1295 1300 1305 Glu Leu Thr Asn Asp Leu Asp Gly Ala Gly Ile Pro Phe Leu Asp 1310 1315 1320 Tyr Arg Thr Tyr Ala Met Arg Val Leu Phe Pro Gly Ile Glu Asp 1325 1330 1335 His Pro Val Leu Lys Glu Met Glu Val Gln Ala Asn Val Glu Lys 1340 1345 1350 Ser Leu Thr Leu Phe Gly Gln Leu Leu Thr Lys Lys His Phe Leu 1355 1360 1365 Leu Thr Phe Ile Arg Thr Leu Glu Ala Gln Arg Ser Phe Ser Met 1370 1375 1380 Arg Asp Arg Gly Asn Val Ala Ser Leu Ile Met Thr Ala Leu Gln 1385 1390 1395 Gly Glu Met Glu Tyr Ala Thr Gly Val Leu Lys Gln Leu Leu Ser 1400 1405 1410 Asp Leu Ile Glu Lys Asn Leu Glu Ser Lys Asn His Pro Lys Leu 1415 1420 1425 Leu Leu Arg Arg Thr Glu Ser Val Ala Glu Lys Met Leu Thr Asn 1430 1435 1440 Trp Phe Thr Phe Leu Leu Tyr Lys Phe Leu Lys Glu Cys Ala Gly 1445 1450 1455 Glu Pro Leu Phe Met Leu Tyr Cys Ala Ile Lys Gln Gln Met Glu 1460 1465 1470 Lys Gly Pro Ile Asp Ala Ile Thr Gly Glu Ala Arg Tyr Ser Leu 1475 1480 1485 Ser Glu Asp Lys Leu Ile Arg Gln Gln Ile Asp Tyr Lys Thr Leu 1490 1495 1500 Thr Leu Asn Cys Val Asn Pro Glu Asn Glu Asn Ala Pro Glu Val 1505 1510 1515 Pro Val Lys Gly Leu Asp Cys Asp Thr Val Thr Gln Ala Lys Glu 1520 1525 1530 Lys Leu Leu Asp Ala Ala Tyr Lys Gly Val Pro Tyr Ser Gln Arg 1535 1540 1545 Pro Lys Ala Ala Asp Met Asp Leu Glu Trp Arg Gln Gly Arg Met 1550 1555 1560 Ala Arg Ile Ile Leu Gln Asp Glu Asp Val Thr Thr Lys Ile Asp 1565 1570 1575 Asn Asp Trp Lys Arg Leu Asn Thr Leu Ala His Tyr Gln Val Thr 1580 1585 1590 Asp Gly Ser Ser Val Ala Leu Val Pro Lys Gln Thr Ser Ala Tyr 1595 1600 1605 Asn Ile Ser Asn Ser Ser Thr Phe Thr Lys Ser Leu Ser Arg Tyr 1610 1615 1620 Glu Ser Met Leu Arg Thr Ala Ser Ser Pro Asp Ser Leu Arg Ser 1625 1630 1635 Arg Thr Pro Met Ile Thr Pro Asp Leu Glu Ser Gly Thr Lys Leu 1640 1645 1650 Trp His Leu Val Lys Asn His Asp His Leu Asp Gln Arg Glu Gly 1655 1660 1665 Asp Arg Gly Ser Lys Met Val Ser Glu Ile Tyr Leu Thr Arg Leu 1670 1675 1680 Leu Ala Thr Lys Gly Thr Leu Gln Lys Phe Val Asp Asp Leu Phe 1685 1690 1695 Glu Thr Ile Phe Ser Thr Ala His Arg Gly Ser Ala Leu Pro Leu 1700 1705 1710 Ala Ile Lys Tyr Met Phe Asp Phe Leu Asp Glu Gln Ala Asp Lys 1715 1720 1725 His Gln Ile His Asp Ala Asp Val Arg His Thr Trp Lys Ser Asn 1730 1735 1740 Cys Leu Pro Leu Arg Phe Trp Val Asn Val Ile Lys Asn Pro Gln 1745 1750 1755 Phe Val Phe Asp Ile His Lys Asn Ser Ile Thr Asp Ala Cys Leu 1760 1765 1770 Ser Val Val Ala Gln Thr Phe Met Asp Ser Cys Ser Thr Ser Glu 1775 1780 1785 His Lys Leu Gly Lys Asp Ser Pro Ser Asn Lys Leu Leu Tyr Ala 1790 1795 1800 Lys Asp Ile Pro Asn Tyr Lys Ser Trp Val Glu Arg Tyr Tyr Ala 1805 1810 1815 Asp Ile Ala Lys Met Pro Ala Ile Ser Asp Gln Asp Met Ser Ala 1820 1825 1830 Tyr Leu Ala Glu Gln Ser Arg Leu His Leu Ser Gln Phe Asn Ser 1835 1840 1845 Met Ser Ala Leu His Glu Ile Tyr Ser Tyr Ile Thr Lys Tyr Lys 1850 1855 1860 Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu Lys Asp Glu Gln Ala Arg Arg 1865 1870 1875 Gln Arg Leu Arg Ser Lys Leu Glu Gln Val Val Asp Thr Met Ala 1880 1885 1890 Leu Ser Ser 1895 <210> 7 <211> 9071 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgccgctgc caccgcggag cctgcaggtg ctcctgctgc tgctgctgtt gctgctgctg 60 ctgccgggca tgtgggctga ggcaggcttg cccagggcag gcgggggttc acagcccccc 120 ttccgcacct tctcggccag cgactggggc ctcacccacc tagtggtgca tgagcagaca 180 ggcgaggtgt atgtgggcgc agtgaaccgc atctataagc tgtcggggaa cctgacactg 240 ctgcgggccc acgtcacggg ccctgtggag gacaacgaga agtgctaccc gccgcccagc 300 gtgcagtcct gcccccacgg cctgggcagt actgacaacg tcaacaagct gctgctgctg 360 gactatgccg ctaaccgcct gctggcctgt ggcagcgcct cccagggcat ctgccagttc 420 ctgcgtctgg acgatctctt caaactgggt gagccacacc accgtaagga gcactacctg 480 tccagcgtgc aggaggcagg cagcatggcg ggcgtgctca ttgccgggcc accgggccag 540 ggccaggcca agctcttcgt gggcacaccc atcgatggca agtccgagta cttccccaca 600 ctgtccagcc gtcggctcat ggccaacgag gaggatgccg acatgttcgg cttcgtgtac 660 caggatgagt ttgtgtcatc acagctcaag atcccttcgg acacgctgtc caagttcccg 720 gcctttgaca tctactatgt gtacagcttc cgcagcgagc agtttgtcta ctacctcacg 780 ctgcagctag acacacagct gacctcgcct gatgccgccg gcgagcactt cttcacgtcc 840 aagatcgtgc ggctctgtgt ggacgacccc aaattctact cgtacgttga gttccccatt 900 ggctgcgagc aggcgggtgt ggagtaccgc ctggtgcagg atgcctacct gagccggccc 960 ggccgtgccc tggcccacca gctgggcctg gctgaggacg aggacgtgct gttcactgtg 1020 ttcgcccagg gccagaagaa ccgcgtgaag ccaccaaagg agtcagcact gtgcctgttc 1080 acgctcaggg ccatcaagga gaagattaag gagcgcatcc agtcctgcta ccgtggtgag 1140 ggcaagctct ccctgccgtg gctgctcaac aaggagctgg gctgcatcaa ctcgcccctg 1200 cagatcgatg acgacttctg cgggcaggac ttcaaccagc ccctgggggg cacagtcacc 1260 attgagggga cgcccctgtt cgtggacaag gatgatggcc tgaccgccgt ggctgcctat 1320 gactatcggg gccgcactgt ggtattcgcc ggcacgcgaa gtggccgcat ccgcaagatc 1380 ctggtggacc tctcaaaccc cggtggccgg cctgccctgg cctacgagag cgtcgtggcc 1440 caggagggca gccccatcct gcgagacctc gtcctcagcc ccaaccacca gtacctctac 1500 gccatgaccg agaagcaggt gacgcgggtg cctgtggaga gctgtgtgca gtacacgtcc 1560 tgtgagctgt gtctggggtc acgggacccc cactgtggct ggtgtgtcct gcacagcatc 1620 tgctcgcggc gggacgcctg tgagcgagca gacgagcccc agcgctttgc tgcggacctg 1680 ctgcagtgtg tgcagctgac tgtgcagccc cgcaatgtgt ctgtcaccat gtcccaggtc 1740 ccacttgtgc tgcaggcctg gaacgtgcct gacctctcag ctggcgtcaa ctgctccttc 1800 gaggacttca cggaatctga gagcgtcctg gaggatggcc ggatccactg ccgctcaccc 1860 tccgcccggg aggtggcgcc catcacgcgg ggccagggag accagcgggt ggtgaaactc 1920 tacctaaagt ccaaggagac agggaagaag tttgcgtctg tggacttcgt cttctacaac 1980 tgcagcgtcc accagtcctg cctgtcctgt gtcaacggct cctttccctg ccactggtgc 2040 aaataccgcc acgtgtgcac acacaacgtg gctgactgcg ccttcctgga gggccgtgtc 2100 aacgtgtctg aggactgccc acagatcctg ccctccacgc agatctacgt gccagtggga 2160 gtggtaaaac ccatcaccct ggccgcacgg aacctgccac agccacagtc aggccagcgt 2220 ggatatgagt gcctcttcca catcccgggc agcccggccc gtgtcaccgc cctgcgcttc 2280 aacagctcca gcctgcagtg ccagaattcc tcgtactcct acgaggggaa cgatgtcagc 2340 gacctgccag tgaacctgtc agtcgtgtgg aacggcaact ttgtcattga caacccacag 2400 aacatccagg cgcacctcta caagtgcccg gccctgcgcg agagctgcgg cctctgcctc 2460 aaggccgacc cgcgcttcga gtgcggatgg tgcgtggccg agcgccgctg ctccctgcga 2520 caccactgcg ctgccgacac acctgcatcg tggatgcacg cgcgtcacgg cagcagtcgc 2580 tgcaccgacc ccaagatcct caagctgtcc cccgagacgg gcccgaggca gggcggcacg 2640 cggctcacta tcacaggcga gaacctgggc ctgcgattcg aagacgtgcg tctgggcgtg 2700 cgcgtgggca aggtgctgtg cagccctgtg gagagcgagt acatcagtgc ggagcagatc 2760 gtctgtgaga tcggggacgc cagctccgtg cgtgcccatg acgccctggt ggaggtgtgt 2820 gtgcgggact gctcaccaca ctaccgcgcc ctgtcaccca agcgcttcac cttcgtgaca 2880 ccaaccttct accgtgtgag cccctcccgt gggcctctgt cagggggcac ctggattggc 2940 atcgagggaa gccacctgaa cgcaggcagt gatgtggctg tgtcggtcgg tggccggccc 3000 tgctccttct cctggaggaa ctcccgtgag atccggtgcc tgacaccccc cgggcagagc 3060 cctggcagcg ctcccatcat catcaacatc aaccgcgccc agctcaccaa ccctgaggtg 3120 aagtacaact acaccgagga ccccaccatc ctgaggatcg accccgagtg gagcatcaac 3180 agcggtggga ccctcctgac ggtcacaggc accaacctgg ccactgtccg tgaaccccga 3240 atccgggcca agtatggagg cattgagagg gagaacggct gcctggtgta caatgacacc 3300 accatggtat gccgcgcccc gtctgtggcc aaccctgtgc gcagcccacc agagctgggg 3360 gagcggccgg atgagctggg cttcgtcatg gacaacgtgc gctccctgct tgtgctcaac 3420 tccacctcct tcctctacta ccctgacccc gtactggagc cactcagccc cactggcctg 3480 ctggagctga agcccagctc cccactcatc ctcaagggcc ggaacctctt gccacctgca 3540 cccggcaact cccgactcaa ctacacggtg ctcatcggct ccacaccctg taccctcacc 3600 gtgtcggaga cgcaactgct gtgcgaggcg cccaacctca ctgggcagca caaggtcacg 3660 gtgcgggcag gtggcttcga gttctcgcca gggacactgc aggtgtactc ggacagcctg 3720 ctgacgctgc ctgccattgt gggcattggc ggaggcgggg gtctcctgct gctggtcatc 3780 gtggctgtgc tcatcgccta caagcgcaag tcacgagatg ctgaccgcac actcaagcgg 3840 ctgcagctcc agatggacaa cctggagtcc cgcgtggccc tcgaatgcaa ggaagccttt 3900 gcagagctgc agacagacat ccacgagctg accaatgacc tggacggtgc cggcatcccc 3960 ttccttgact accggacata tgccatgcgg gtgctctttc ctgggatcga ggaccaccct 4020 gtgctcaagg agatggaggt gcaggccaat gtggagaagt cgctgacact gttcgggcag 4080 ctgctgacca agaagcactt cctgctgacc ttcatccgca cgctggaggc acagcgcagc 4140 ttctccatgc gcgaccgcgg gaatgtggcc tcgctcatca tgacggccct gcagggcgag 4200 atggaatacg ccacaggcgt gctcaagcag ctgctttccg acctcatcga gaagaacctg 4260 gagagcaaga accaccccaa gctgctactg cgccggactg agtcggtggc agagaagatg 4320 ctaactaact ggttcacctt cctcttgtat aagttcctca aggagtgcgc tggggagccg 4380 ctgttcatgc tgtactgcgc catcaagcag cagatggaga agggccccat tgacgccatc 4440 acgggtgagg cacgctactc cctgagtgag gacaagctca tccggcagca gattgactac 4500 aagacactga ccctgaactg tgtgaaccct gagaatgaga atgcacctga ggtgccggtg 4560 aaggggctgg actgtgacac ggtcacccag gccaaggaga agctgctgga cgctgcctac 4620 aagggcgtgc cctactccca gcggcccaag gccgcggaca tggacctgga gtggcgccag 4680 ggccgcatgg cgcgcatcat cctgcaggac gaggacgtca ccaccaagat tgacaacgat 4740 tggaagaggc tgaacacact ggctcactac caggtgacag acgggtcctc ggtggcactg 4800 gtgcccaagc agacgtccgc ctacaacatc tccaactcct ccaccttcac caagtccctc 4860 agcagatacg agagcatgct gcgcacggcc agcagccccg acagcctgcg ctcgcgcacg 4920 cccatgatca cgcccgacct ggagagcggc accaagctgt ggcacctggt gaagaaccac 4980 gaccacctgg accagcgtga gggtgaccgc ggcagcaaga tggtctcgga gatctacttg 5040 acacggctac tggccaccaa gggcacactg cagaagtttg tggacgacct gtttgagacc 5100 atcttcagca cggcacaccg gggctcagcc ctgccgctgg ccatcaagta catgttcgac 5160 ttcctggatg agcaggccga 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gaggggtgag gccagggccc tccaggggga ggggtagcca 6060 gcttgggctg tccccttgag accaggacaa gaggctgggg gtgtcagcat tcccagcttt 6120 ccaagctgcc cccaggcggc agagtctgag ggtcccgggg cccggttggc agctggagaa 6180 agaggcaaaa agcccgtagc cgggcaagag gagctcaagt cggtctgggc ccgttgccac 6240 cgactcccac ctccagcacc catgcccgct gcaccgctgc catcctcaga ttcaccgcgt 6300 gctctgcgcg gccgaggccg gagcaccaca tccacctcgc cccagagagg ctctgctccc 6360 tcctatggag gggctgtggg ccaggctgct cagactcctg ggtggcttcc agacggaccg 6420 ggcagcccct ctccgtcctc agggctgtgc ctctgggagc cactgggcca ggggccccgg 6480 gtcgcagaga gcacgttccc gttatttatt cccctccgcg tcctacacag gctgccctgg 6540 cagctgtctt caagggtagg ctgagctccc caccctggag cccctgaggg cggcccctga 6600 gcactcctct ctctccactc tctctgtccc tgccccagcg gcttccagtg tggcatctca 6660 gcagtgtcct ggcccctcca gagcagtggg acatctgggg actgtttttg tgtttagggg 6720 aaaaaattct gctgcactct gcttgggcct tgaggtctgt ggcagggctc ctctggcccg 6780 cagtggcctg gatctatctg ggccatgagt gacgggcagt gaccagaggg actggaggcc 6840 agcggtgtcc acccttgccc tcagcaagag agaatgcatt cttaaaagaa agctgtacat 6900 gtatatatat gcatatatat atatgtggct ctagcctcag gctccagccc cagtggggta 6960 ctgtacagtt aactgaagaa gaattttaaa gacgatttga acaagaaaat gaaggcagtg 7020 ggaaagcaat gccaaatggt tgtggagaaa gtggccggag cctccctgga gtggagcagc 7080 cctgaagcct gtgccccccg acctgcgggc cgctgttttg gtttgacatg acaaggaaag 7140 gacttcctgc tgaccctgag agcctctggg gtgccgcggc accacggggc atgcatgatt 7200 gtgctagcgt ttagtctgag ttgatctttt taaaactgca agtgttgaat actagaggtt 7260 gttagaccct tttttatgtt ttttaattaa tcagtcactt gtaaaagcaa acaagcggtc 7320 catccccttt tcaaggtcac ttttttgatg gtaccgaaga tcccatggac attaagggac 7380 agctaactgt ggccagactc agccccatgt ccttggccag gcccaaggag aggactcggc 7440 cccatggggt gtgccagtct tgcagtccgc cccagctgag tagcgtgagc cagatgacgc 7500 cacagagacc cgcctcttcc ctgaacgcgg gtcggtgtgg agtcagtgac tgctgactca 7560 gggagctcct tggccccgtg ggcactgtgc cagggctggg gccttctgct gctgccacac 7620 ccagctcagg cctgggccag cccctgcccc cagcccactg agggggtggg cttactccct 7680 gggcagtctt gggggccaga gctgaggcca gtccatatta cagtggctgg gctgtttttt 7740 tcagtagccc ctagcattgg ctgggattcc tgttcctggg tgcgcctcca cctcccttct 7800 gatgtttcct ggctatggtg gggtgggaac ctcagtttcc cccaaagtct tccctggatg 7860 ctggcttcag gttgaagtcc ctggttcttc cagttcctca cgggttaggt aggggctcct 7920 gcatcacctt cagaatccag ttccaacccc cactctcctt aggccttgtg ctctgctctg 7980 ccctgccagg ctgcccttgt ccatgtgagt agcatgggcg ggtggtgggg acggcagtgg 8040 tgatgaaggg ggtgcaccac aggcctcatg aagcagttcc cacatgggcg tgtggctggg 8100 gcgtggccac cacagagcac atggctgtgt ctaggcgcaa gcactttagc agtatctgtt 8160 tacatgcgca aggatcaagc cgactacctg tgctgtctac tgggacagca gtctccgagc 8220 tactccgtac ctccctctgc caggtcgtgg agttaggccc cagtccctac ttgtcactgg 8280 ttcccactgt gctcctaact gtgcagcacc tgggagctct ggcctggggc tggaggccct 8340 ggtaggagct gcagttggag gccgttctgt gcccagcagc ggtgagcggc tcccatgggc 8400 cctgtgtctg cagggagcca gggctgcggc acatgtgctg tgaaactggc acccacctgg 8460 cgtgctgctg ccgccacttg cttcctgcag cacctcctac cctgctccgt gtcctccctc 8520 tccccgcgcc tggctcagga gtgctggaaa agctcacgcc tcggcctggg agcctggcct 8580 cttgatatac ctcgagcttc ccctgtgctc cccagcccca ggaccactgg ccccttggcc 8640 tgaggggctg ggggccccac gacctgcagc gtcgagtccg ggagagagcc cggagcggcg 8700 tgccatctcg gctcggcctt gctgagagcc tccgccctgg ctttctccct gtctggattc 8760 agtggctcac gttggtgcta cacagctaga atagatatat ttagagagag agatattttt 8820 aagacaaagc ccacaattag ctgtccttta acaccgcaga accccctccc agaagaagag 8880 cgatccctcg gacggtccgg gcgggcaccc tcagccgggc tctttgcaga agcagcaccg 8940 ctgactgtgg gcccggccct cagatgtgta catatacggc tatttcctat tttactgttc 9000 ttcagattta gtacttgtaa ataaacacac acattaagga gagattaaac atttttgcta 9060 aaagctaaaa a 9071

Claims (50)

  1. 동종 이식편 거부 반응을 억제하는 방법으로서, Sema3F 작용제를 동종 이식편 수용자에 투여하는 단계를 포함하며, 동종 이식편에 대한 면역 거부 반응이 억제되는 것인 방법.
  2. 대상체의 면역계를 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 이를 필요로 하는 대상체의 염증성 병증을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염증성 병증이 자가면역 질환인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자가 면역 질환이 제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법:
  6. 제3항에 있어서, 상기 염증성 병증이 국소 병증인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 국소 염증성 병증이 발진 및 알레르기 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 치료를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  9. 치료를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 신생혈관 생성을 감소시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 Sema3F 폴리펩티드 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Sema3F 폴리펩티드가 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, Sema3F 폴리펩티드가 Sema3F 수용체와 결합할 수 있는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Sema3F 폴리펩티드가 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 푸린-형 억제제 (furin-like inhibitor)인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 정맥 내로 투여되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 근육내, 피하, 또는 피부내로 투여되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 염증 부위로 국소 투여되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 추가적인 항염증제가 스테로이드; 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제 또는 그의 유사체; 및 항증식제. 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 대상체에 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 항-Sema3F 항체 시약인 방법.
  22. 제20항에 있어서, NRP-2 억제제가 항-NRP-2 항체 시약인 방법.
  23. 제20항에 있어서, Sema3F 억제제가 용해성 NRP-2 수용체인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 NRP-2 수용체의 용해성 단편인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 방법.
  26. 동종 이식편 수용자에서, 동종 이식편 거부 반응을 억제하기 위한 Sema3F 작용제의 용도.
  27. 면역계 억제를 필요로 하는 대상체에 Sema3F 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 Sema3F 작용제의 용도.
  28. 이를 필요로 하는 대상체에서, 염증성 병증의 치료를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
  29. 제28항에 있어서, 상기 염증성 병증이 자가면역 질환인 용도.
  30. 제29항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병; 전신성 홍반성 루푸스; 류마티스 관절염; 건선; 염증성 장 질환; 크론병; 및 자가 면역 갑상선염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도:
  31. 제28항에 있어서, 상기 염증성 병증이 국소 병증인 용도.
  32. 제31항에 있어서, 상기 국소 염증성 병증이 발진 및 알레르기 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
  33. 암의 치료를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
  34. 이를 필요로 하는 대상체에서 신생혈관 생성의 억제를 위한 Sema3F 작용제의 용도.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 Sema3F 폴리펩티드 또는 Sema3F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 용도.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 용도.
  37. 제35항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 Sema3F 수용체와 결합할 수 있는 것인 용도.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 폴리펩티드가 A1; A2; B1; 및 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NRP-2의 도메인과 결합할 수 있는 것인 용도.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 푸린-형 억제제인 용도.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 정맥 내로 투여되는 것인 용도.
  41. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 근육 내, 피하, 또는 피부 내로 투여되는 것인 용도.
  42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sema3F 작용제가 염증 부위로 국소 투여되는 것인 용도.
  43. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 용도.
  44. 제43항에 있어서, 추가의 항염증제가 스테로이드; 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제 또는 그의 유사체; 및 항증식제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
  45. 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 촉진하기 위한 하나 이상의 Sema3F 억제제 또는 NRP-2 억제제 또는 플렉신 A1 억제제의 용도.
  46. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 항-Sema3F 항체 시약인 용도.
  47. 제45항에 있어서, 상기 NRP-2 억제제가 항-NRP-2 항체 시약인 용도.
  48. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 용해성 NRP-2 수용체인 용도.
  49. 제46항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 A1, A2, B1 또는 B2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 NRP-2 수용체의 용해성 단편인 용도.
  50. 제45항에 있어서, 상기 Sema3F 억제제가 푸린-형 폴리펩티드 또는 푸린-형 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 용도.
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