BR112021012231A2 - Modulação do fluxo de carbono através das vias de meg e c3 para a produção melhorada de monoetileno glicol e compostos c3 - Google Patents

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Abstract

mudulação do fluxo de carbono através das vias de meg e c3 para a produção melhorada de monoetileno glicol e compostos c3. a presente invenção refere-se a métodos de modulação do fluxo de carbono através da via de biossíntese de monoetileno glicol (meg) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos c3 expressando enzimas que são essenciais para melhorar os compostos c3 e modulando outros aspectos genéticos de meg e biossíntese de compostos c3. a presente invenção é ainda desenhada para micróbios modificados compreendendo as sequências interrompidas e sequências superex-pressas e composições das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODU-
LAÇÃO DO FLUXO DE CARBONO ATRAVÉS DAS VIAS DE MEG E C3 PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE MONOETILENO GLI- COL E COMPOSTOS C3".
REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório Nor- te-americano No. 62/786.294 depositado em 28 de dezembro de 2018, intitulado "METABOLIC ENGINEERING FOR THE IMPROVED PRO- DUCTION OF MONOETHYLENE GLYCOL AND C3 COMPOUNDS"; Pedido Provisório Norte-americano No. 62/786.298 depositado em 28 de Dezembro de 2018, intitulado "METABOLIC ENGINEERING OF
THE ACETATE PATHWAY FOR THE IMPROVED PRODUCTION OF MONOETHYLENE GLYCOL AND C3 COMPOUNDS"; Pedido Provisório Norte-americano No. 62/786.282 depositado em 28 de dezembro de 2018, intitulado "METABOLIC ENGINEERING OF XYLONATE PATHWAY FOR THE IMPROVED PRODUCTION OF MONOETHYLE- NE GLYCOL AND C3 COMPOUNDS"; Pedido Provisório Norte- americano No. 62/786.283 depositado em 28 de dezembro de 2018, intitulado "MODULATION OF ENZYMES FOR IMPROVED FLUX THROUGH THE C3 PATHWAY FOR THE IMPROVED PRODUCTION OF MONOETHYLENE GLYCOL AND C3 COMPOUNDS"; Pedido Pro- visório Norte-americano No. 62/786.304 depositado em 28 de dezem- bro de 2018, intitulado "MODULATION OF CARBON FLUX THROUGH THE MEG AND C3 PATHWAYS FOR THE IMPROVED PRODUC- TION OF MONOETHYLENE GLYCOL AND C3 COMPOUNDS", cujas descrições são aqui incorporadas por referência.
CAMPO
[0002] A presente descrição se refere a microrganismos recombi- nantes úteis na biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e um ou mais compostos de três carbonos (C3). O pedido refere-se ainda aos méto-
dos de produção de MEG e um ou mais compostos C3 usando os mi- crorganismos recombinantes, bem como composições compreenden- do MEG, um ou mais compostos C3 e/ou os microrganismos recombi- nantes.
DECLARAÇÃO SOBRE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0003] A listagem de sequência associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel e é incorporada por meio deste por referência na especificação. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é BRSK 018 O01WO ST25.txt. O arquivo de texto tem cerca de 232 kilobytes, foi criado em 17 de de- zembro de 2019 e está sendo enviado eletronicamente via EFS-Web.
ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO
[0004] A expressão de enzimas correspondentes às vias comple- tas do monoetileno glicol (MEG) e C3 e seus produtos corresponden- tes não é suficiente para atingir rendimentos e produtividades de com- postos MEG e C3 necessários para um processo industrial vantajoso.
[0005] Existe uma necessidade de vias de biossíntese melhoradas para a produção de MEG e outros compostos químicos úteis em apli- cações industriais e farmacêuticas.
SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO
[0006] O presente pedido geralmente se refere a estratégias de modificação metabólica para melhorar o fluxo de carbono através das vias de MEG e C3, aumentando assim o rendimento, título e/ou produ- tividade (taxa de produção) de MEG, compostos C3 e a coprodução de compostos MEG e C3. O presente pedido se refere a microrganismos recombinantes com uma ou mais vias de biossíntese para a produção de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3 modificados de modo que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 sejam produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado em comparação com um micróbio sem modificação genética (interrupção e/ou superexpressão dos poli- nucleotídeos endógenos ou exógenos).
[0007] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método recombinante de modulação do fluxo de car- bono através da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de composto C3, o método compreenden- do: modificar um micróbio capaz de coprodução de MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio compreende (i) uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintase (mgsA) e/ou (ii) uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintases e/ou glioxilato carbo- ligases.
[0008] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio compreende um ou mais dos seguintes (i) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas codificando uma fosfato acetiltransferase, (ii) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas que codificam uma acetato cinase, (ili) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas que codificam uma piruvato oxidase, (iv) uma interrupção de um ou mais polinucleo- tídeos endógenos sequências que codificam um regulador ArcA, (v) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas que codificam uma lisina acetiltransferase, (vi) uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam um regulador CobB e (vii) uma ou mais sequências poli-
nucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibem um rendimento e/ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a superex- pressão dos polinucleotídeos endógenos ou exógenos de qualquer um ou mais de i-vii.
[0009] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio compreende um ou mais dos seguintes: (i) uma ou mais sequências polinucleotídicas exó- genas que codificam um xilose desidrogenase, (ii) uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonolactonase, (iii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (iv) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que co- dificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, (v) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam uma xilonato desidratase, (vi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas superex- pressas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pen- tanona aldolase, e (vii) uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas superexpressas que codificam para uma glico- aldeído redutase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibem um rendimento ou tí- tulo aumentado; em comparação com um micróbio sem as enzimas introduzidas endógenas ou exógenas e/ou a superexpressão das en- zimas endógenas ou exógenas de qualquer um ou mais de i-vii.
[0010] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio compreende: (i) intro- duzir uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoa- cetil CoA sintase e/ou (ii) introdução de uma ou mais sequências poli- nucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroxi- metilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio que não foi intro- duzido uma acetoacetil CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA sintase e/ou hidroximetilglutaril-CoA liase.
[0011] Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende ainda qualquer uma ou mais modificações aqui descritas.
[0012] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 em que o micróbio compreende um ou mais dos seguintes: (i) uma ou mais sequências de ácido nucleico in- terrompidas que codificam metilglioxal sintase (mgsA), (ii) uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam glicoxilato carboligase (gcl), (iii) uma ou mais sequências polinucleotídicas inter- rompidas que codificam uma fosfato acetiltransferase, (iv) uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma acetato cinase, (v) uma ou mais sequências polinucleotídicas inter- rompidas que codificam uma piruvato oxidase, (vi) uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas interrompidas que codificam um regulador ArcA, (vii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas interrompidas que codificam uma lisina acetiltransferase, (viii) uma ou mais superexpressas de sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas que codificam um regulador CobB, (ix) uma ou mais sequências polinucleotídeas endógenas ou exógenas superex- pressas que codificam uma acetil-CoA sintetase, (x) uma ou mais se- quências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desi-
drogenase, (xi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonolactonase, (xii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas uma xilonato desidratase, (xiii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, (xiv) uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam uma xilonato desidratase, (xv) um ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas superexpressas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, (xvi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam uma glicoaldeído redutase, (xvii) uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam uma glicoaldeído redutase, (xvii) uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacil sintase, e (xvili) uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a modificação.
[0013] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio compreende um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequências de ácido nucleico inter- rompidas que codificam metilglioxal sintase (mgsA), e uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam glioxilato carboligase (gcl) e/ou; uma ou mais sequências polinucleotídicas inter- rompidas que codificam uma fosfato acetiltransferase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma acetato cinase, e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endó-
genas ou exógenas que codificam uma xilolactonase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codifi- cam uma xilonato desidratase e/ou uma ou mais endógenas ou exó- genas uma deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou transferase (AtoDA). Em alguns aspectos, o micróbio compreende uma acetoacetil-CoA transferase funcional (AtoDA).
[0014] Em alguns aspectos, a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que.
[0015] Em alguns aspectos, o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma inter- rupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintases e qualquer uma das modificações acima.
[0016] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, o micróbio compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompi- das que codificam glicoxilato carboligase (gcl); e uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas interrompidas que codificam uma fosfato acetil- transferase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompi- das que codificam uma acetato cinase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilolac- tonase e/ou uma ou mais sequências endógenas ou exógenas se- quências polinucleotídicas ou superexpressando sequências polinu- cleotídeas endógenas que codificam uma xilonato desidratase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas que codi-
ficam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboligase (gcl) e qualquer uma das modificações acima.
[0017] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, o micróbio compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompi- das que codificam uma fosfato acetiltransferase e interrompendo uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas que codificam uma cinase de acetato e/ou introdução de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilolactonase e/ou introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas ou superexpressão de uma sequência polinucleotídi- ca endógena ou desidratase que codifica uma xilolactonase, e/ou in- trodução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hi- droximetilglutaril-CoA liase e/ou; interrupção de uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas endógenas que codificam um regulador ArcA e/ou interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou superexpressar uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma fosfato acetiltransferase e qualquer uma das modi-
ficações acima.
[0018] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3: rompendo uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas endógenas que codificam um acetato cinase e introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilolactonase e/ou uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas ou exógenas ou superexpres- são de uma sequência polinucleotídica endógena que codifica uma xilolactonase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas que codificam um acetoacetil sintase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril- CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a acetato cinase e qualquer uma das modifica- ções acima.
[0019] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, o micróbio compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilolactonase e uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas endógenas ou exógenas ou superexpressão de uma sequência polinucleotídica endógena que codifica uma xilonato desidratase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas que codifi- cam acetoacetil CoA sintase e/ou uma ou mais sequências polinucleo- tídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglu- taril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a xilolactonase exógena introduzida ou superexpressa endógena e qualquer uma das modificações acima.
[0020] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, o micróbio compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequência polinucleotídica endógena ou exógena ou superexpressão de uma sequência endógena sequência polinucleotídica que codifica uma xilonato desidratase e uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroxi- metilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a xilonato desidratase exógena introduzida ou superexpressa endógena, qualquer uma das modificações acima.
[0021] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, o micróbio compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas superexpressas que codificam um acetil-CoA sintetase; e uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codifi- cam a metilglioxal sintase (mgsA), uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam a glioxilato carboligase (gcl) e/ou; uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma cinase de acetato e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilolactonase e/ou uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas ou supe- rexpressando uma sequência polinucleotídica endógena ou exógena que codifica uma xilolactonase uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; uma ou mais sequências polinucleotídi- cas interrompidas que codificam um regulador ArcA e/ou, uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a acetil-CoA sintetase superexpressa endógena e qualquer uma das modificações acima.
[0022] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método de produção de um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por meio de: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais com- postos C3 por: (i) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a metilglioxal sintase (mgsA) e/ou (ii) interrup- ção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a glioxilato carboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem uma inter- rupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintases e/ou glioxilato carboligases.
[0023] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método de produção de um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3: modificação de um micróbio coproduzindo MEG e um ou mais compostos C3 reali- zando um ou mais dos seguintes: (i) interrupção de uma ou mais se- quências polinucleotídicas que codificam uma fosfato acetiltransferase, (ii) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codi-
ficam uma acetato cinase, (ili) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma piruvato oxidase, (iv) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam um regu- lador ArcA, (v) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam uma lisina acetiltransferase, (vi) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um regulador CobB e (vii) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas sequên- cias que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibem um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a superexpressão dos polinucleotí- deos endógenos ou exógenos de qualquer um ou mais de i-vii.
[0024] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método de produção de um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3: modificação de um micróbio coproduzindo MEG e um ou mais compostos C3 reali- zando um ou mais dos seguintes: (i) introdução de uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, (ii) introdução de uma ou mais sequências poli- nucleotídicas exógenas que codificam uma xilolactonase, (iii) introdu- ção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exó- genas que codificam uma xilonato desidratase ou mais sequências po- linucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase e (vii) superexpres- são de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exó- genas que codificam uma glicoaldeído redutase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibem um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem as enzimas exógenas introduzidas e/ou a superex-
pressão das enzimas endógenas ou exógenas de qualquer um ou mais de i-vil.
[0025] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método de produção de um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3: modificação de um micróbio coproduzindo MEG e um ou mais compostos C3: (i) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou (ii) introdução de uma ou mais sequên- cias polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais com- postos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um ren- dimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril-CoA sin- tase ou hidroximetilglutaril-CoA liase.
[0026] Em alguns aspectos, o micróbio compreende qualquer uma ou mais modificações aqui apresentadas.
[0027] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é direcionado a um método de produção de um micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 ao: modificar um micróbio coproduzindo MEG e um ou mais compostos C3 realizan- do um ou mais dos seguintes: (i) interrupção de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintase (mgsA), (ii) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifi- cam glioxilato carboligase (gcl), (ili) interrupção de uma ou mais se- quências polinucleotídicas exógenas que codificam uma fosfato acetil- transferase, (iv) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam um regulador ArcA, (v) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma piruvato oxidase, (vi) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codifi- cam um regulador ArcA, (vii) interrupção de um ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma lisina acetiltransferase, (viii) supe- rexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um CobB regulador, (ix) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase, (x) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, (xi) introdução de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam um xilolactonase, (xii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (xiii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldo- lase, (xiv) superexpressando ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (xv) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, (xvi) superexpressão de uma ou mais se- quências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codifica uma glicoaldeído redutase, (xvii) introdução de um ou mais sequências po- linucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam acetoacetil COA sintase e (xviii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas ou exógenas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título aumentado; em comparação com um micróbio sem a modificação.
[0028] Em alguns aspectos, o micróbio é uma bactéria ou fungo. Em alguns aspectos, a bactéria é uma Escherichia coli. Em alguns as- pectos, o MEG exibe um rendimento ou título aumentado. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[0029] Em alguns aspectos, o um ou mais compostos C3 é aceto- na. Em alguns aspectos, a acetona exibe um rendimento ou título au- mentado. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[0030] Em alguns aspectos, o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3. Em alguns aspectos, os compostos C3 são seleciona- dos a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[0031] Em alguns aspectos da presente descrição, o assunto é desenhado para um método de modulação do fluxo de carbono atra- vés da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3, o método compreendendo: mo- dificar um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: (i) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou (ii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento e/ou título aumentado; em comparação com um micró- bio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril- CoA sintase ou hidroximetilglutaril-CoA liase.
[0032] Em alguns aspectos, o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoace- til-CoA tiolase. Em alguns aspectos, o micróbio carece de uma acetoa- cetil-CoA tiolase funcional. Em alguns aspectos, o micróbio compreen- de uma acetoacetil-CoA tiolase funcional.
[0033] Em alguns aspectos, o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam a acetoa- cetil-CoA transferase (AtoDA). Em alguns aspectos, o micróbio com- preende uma acetoacetil-CoA transferase funcional (AtoDA).
[0034] Em alguns aspectos, a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas.
[0035] Em alguns aspectos, o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento e/ou título aumentado. Em alguns aspectos, o micróbio é uma bactéria ou fungo. Em alguns aspectos, a bactéria é uma Escherichia coli. Em al- guns aspectos, o MEG exibe um rendimento ou título aumentado. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, o rendimento ou título aumen- tado é um aumento de pelo menos 15 %. Em alguns aspectos, o um ou mais compostos C3 é acetona. Em alguns aspectos, a acetona exi- be um rendimento ou título aumentado. Em alguns aspectos, o rendi- mento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %. Em al- guns aspectos, o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[0036] Em alguns aspectos, o um ou mais compostos C3 é aceto- na. Em alguns aspectos, a acetona exibe um rendimento e/ou título aumentado. Em alguns aspectos, o aumento do rendimento e/ou título é um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, o aumento do rendimento e/ou título é um aumento de pelo menos 15 %. Em alguns aspectos, a acetona é produzida em uma taxa mais rápida. Em alguns aspectos, a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %. Em alguns aspectos, (i) o MEG exibe um rendimento e/ou título aumentado de pelo menos 2 % e/ou (ii) o um ou mais compostos C3 exibe um rendimento e/ou título aumentado de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, (i) o MEG exibe um rendimento e/ou título aumenta-
do de pelo menos 15 % e/ou (ii) o um ou mais compostos C3 exibe um rendimento e/ou título aumentado de pelo menos 15 %. Em alguns as- pectos, (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo me- nos 2 % e/ou (ii) a taxa de uma ou mais produção de compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %. Em alguns aspectos, (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 % e/ou (ii) a taxa de uma ou mais produção de compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[0037] Em alguns aspectos, o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3, em que os compostos C3 são selecionados de aceto- na, isopropanol e propeno.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0038] Modalidades ilustrativas da descrição são ilustradas nos desenhos, nos quais:
[0039] A FIG. 1 ilustra a via de coprodução de MEG e isopropanol via da xilulose-1-fosfato.
[0040] A FIG. 2 ilustra a via de coprodução de MEG e isopropanol via de xilonato.
[0041] A FIG. 3 ilustra três possíveis coprodutos de carbono para MEG.
[0042] A FIG. 4 ilustra a produção melhorada de MEG a partir de xilose em E. coli.
[0043] A FIG. 5 ilustra o rendimento geral (g de produtos/g de xilo- se) de etileno glicol, isopropanol e acetona produzido usando uma via da xilulose-1-fosfato.
[0044] A FIG. 6 ilustra a coprodução de MEG, isopropanol e ace- tona usando uma via da xilulose-1-fosfato em E. coli.
[0045] A FIG. 7 ilustra o rendimento geral (g de produtos/g de xilo- se) de etileno glicol, isopropanol e acetona produzido usando uma via da xilulose-1-fosfato.
[0046] A FIG. 8 ilustra a coprodução de MEG, isopropanol e ace- tona usando uma via de xilonato em E. coli.
[0047] A FIG. 9 ilustra o rendimento geral (g de produtos/g de xilo- se) de etileno glicol, isopropanol e acetona produzido usando uma via da xilulose-1-fosfato.
[0048] A FIG. 10 mostra uma SDS-PAGE da fração solúvel dos ensaios (a) a (e), conforme descrito no Exemplo 3. A seta indica a ex- pressão de LinD em (b), (c), (d) e (e).
[0049] A FIG. 11 ilustra que os ensaios (d) e (e) mostraram a pro- dução de propileno e isopropanol em candidatos IPA + LinD. O ensaio (a) mostrou produção de isopropanol de pZs*13 IPA e uma pequena quantidade de propileno. Os ensaios (b) e (c) mostraram a produção de propileno em meio suplementado com 3,0 g/L de isopropanol utili- zando glicerol e glicose como fonte de carbono, respectivamente.
[0050] As FIG. 12A - FIG. 12D ilustram o aumento da produção de MEG na cepa com nphT7 expresso contra a cepa origem (FIG. 12A), com aumento da produção de acetona na cepa (FIG. 12B), com au- mento da produção de ácido acético (FIG. 12C), e com diminuição pico de produção de ácido xilônico em comparação com a origem (FIG. 12D).
[0051] As FIG. 13A - FIG. 13D ilustram o aumento da produção de MEG na cepa com HMG-CoA expresso contra a cepa origem (FIG. 13A), com aumento da produção de acetona na cepa (FIG. 13B), com pouco efeito na produção de ácido acético (FIG. 13C), e com pouco efeito na acumulação de xilulose em comparação com a origem (FIG. 13D).
[0052] As FIG. 14A - FIG. 14B ilustram as quantidades de MEG detectadas para cepa Apta AatoDA atoDA::ERG13,ynG (FIG. 14A) e cepa Apta atoDA::ERG13,ynG AatoDA (FIG. 14B) em relação à cepa
Apto.
[0053] A FIG. 15 ilustra a coprodução de MEG e acetona para a cepa de superexpressão Apta + yagF vs. a cepa Apta.
[0054] As FIG. 16A - FIG. 16 ilustram o aumento da produção de MEG na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 16A), o au- mento da produção de acetona na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 16B), o aumento da produção de ácido acético na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 16C), e o pico de ácido xilô- nico diminuído na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 16D) no que diz respeito ao Exemplo 4 (via do xilonato).
[0055] As FIG. 17A - FIG. 17 ilustram o aumento da produção de MEG na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 17A), o au- mento da produção de acetona na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 17B), a mudança na produção de ácido acético na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 17C), e o acúmulo de xilulo- se na cepa deletada de mgsA vs a cepa origem (FIG. 17D) no que se refere ao Exemplo 5 (via da xilulose).
[0056] As FIGS. 18A - FIG. 18 ilustram o aumento da produção de MEG na cepa deletada de gcl vs a cepa origem (FIG. 18A), o aumento da produção de acetona na cepa deletada de gcl vs a cepa origem (FIG. 18B), o aumento na produção de ácido acético na cepa deletada de gcl vs a cepa origem (FIG. 18C), e o pico de ácido xilônico diminuí- do na cepa deletada de gcl vs a cepa origem (FIG. 18D) no que diz respeito ao Exemplo 6 (via do xilonato).
[0057] As FIG. 19A - FIG. 19B ilustram o aumento da produção de MEG na cepa Apta versus a cepa origem (FIG. 19A) e o aumento da produção de MEG na cepa AackA contra a cepa origem (FIG. 19B).
[0058] As FIG. 20A - FIG. 20B ilustram a maior produtividade de MEG (FIG. 20A) e acetona (FIG. 20B) para AarcA em comparação com a cepa origem.
[0059] As FIG. 21A - FIG. 21B ilustram as maiores quantidades de MEG (FIG. 21A) e acetona (FIG. 21B) para Apta4arcA e AptaApka em comparação com a cepa Apta.
[0060] As FIG. 22A - FIG. 22D ilustram o aumento da produção de MEG nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos vs a cepa origem (FIG. 22A), o aumento da produção de acetona nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos vs a ce- pa origem (FIG. 22B), o aumento da produção de ácido acético nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos versus a cepa origem (FIG. 22C), e a diminuição na produção de pico de ácido xilônico nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmí- deos vs a cepa origem (FIG. 22D).
[0061] As FIG. 23A - FIG. 23 ilustram o aumento da produção de MEG nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos vs a cepa origem (FIG. 23A), o aumento da produção de acetona nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos vs a ce- pa origem (FIG. 23B), o aumento da produção de acético ácido nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmídeos versus a cepa origem (FIG. 23C), e a diminuição na produção de pico de ácido xilônico nas cepas que abrigam xilonolactonase expressa em plasmí- deos vs a cepa origem (FIG. 23D).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO
[0062] As seguintes definições e abreviações devem ser usadas para a interpretação da descrição.
[0063] Quando aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referên- cia a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzimas e a referên- cia ao "microrganismo" inclui a referência a um ou mais microrganis- mos e assim por diante.
[0064] Quando aqui usado, os termos "compreende", "compreen- dendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém", "contendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, destinam-se a abranger uma inclusão exclusiva. Uma composição, mistura, processo, método, arti- go ou aparelho que compreende uma lista de elementos não está ne- cessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal com- posição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressamente declarado o contrário, "ou" refere-se a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo.
[0065] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico" e "“oligonucleotídeo" são usados indistintamente. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotí- deos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleo- tídeos, ou seus análogos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer es- trutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhe- cida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir da análise de liga- ção, exons, íntrons, RNA mensageiro (mMRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossomal (rRNA), RNA de interferência curto (siRNA), RNA em formato de grampo de cabelo curto (ShRNA), micro-RNA (MIRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucle- otídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nu- cleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser modifi- cado posteriormente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
[0066] "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico de formar ligação (ões) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico por Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradici- onais. Uma porcentagem de complementaridade indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar liga- ções de hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson- Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 100 % complementares, respectivamente). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico farão uma ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar", quando aqui usado, refere-se a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes. A identidade de sequência, como para o propósito de avaliar a complementaridade percentual, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento ade- quado, incluindo, mas não se limitando ao algoritmo de Needleman- Wunsch (veja, por exemplo, o alinhador EMBOSS Needle disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/nucleotide.html, opcio- nalmente com configurações padrão), o algoritmo BLAST (veja, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com configurações padrão) ou o algoritmo de Smith-Waterman (veja, por exemplo, o alinhador EMBOSS
Water disponível em www.ebi.ac. uk/Tools/psa/emboss water/ nucleo- tide.html, opcionalmente com configurações padrão). O alinhamento ideal pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padrão.
[0067] Quando aqui usado, "expressão" refere-se ao processo pe- lo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um padrão de DNA (tal como em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pe- lo qual um mRNA transcrito é subsequentemente transladado em pep- tídeos, polipeptídeos ou proteínas. As transcrições e polipeptídeos co- dificados podem ser referidos coletivamente como "produto gênico". Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do MRNA em uma célula eucariótica.
[0068] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usa- dos indistintamente neste documento para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramíificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, como a conjugação com um componente de marcação. Quando aqui usado, o termo "aminoácido" inclui amino- ácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e am- bos os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácidos e pepti- domiméticos.
[0069] Quando aqui usado, o termo "cerca de" é usado como si- nônimo do termo "aproximadamente". Ilustrativamente, o uso do termo "cerca de" em relação a uma quantidade indica que os valores estão ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1 % a 10 %.
[0070] O termo "cultura biologicamente pura" ou "cultura substan-
cialmente pura" refere-se a uma cultura de uma espécie bacteriana aqui descrita não contendo nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.
[0071] Quando aqui usado, uma "cepa origem" ou "cepa base" é a cepa que foi modificada para produzir uma nova cepa resultante. Por exemplo, se Escherichia coli cepa XL1-Blue foi geneticamente modifi- cada para interromper sequências polinucleotídeas genômicos, a cepa de E. coli XL1-Blue é a cepa mãe ou cepa base para a cepa genetica- mente modificada subsequente. Em alguns aspectos, uma cepa ori- gem ou de base pode ocorrer naturalmente. Em outros aspectos, uma cepa origem ou de base pode não ocorrer naturalmente.
[0072] Quando aqui usado, uma "sequência controle" se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.
[0073] Quando aqui usado, "introduzido" refere-se à introdução por meio de biotecnologia moderna, e não a uma introdução de ocorrência natural.
[0074] Quando aqui usado, um "promotor constitutivo" é um pro- motor, que é ativo na maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Existem várias vantagens no uso de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotec- nologia, tais como: alto nível de produção de proteínas utilizadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórter ou marcadores classificáveis, permitindo fácil de- tecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcri- ção que faz parte de um sistema de transcrição regulatório; produção de compostos que requerem atividade onipresente no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os está- gios de desenvolvimento.
[0075] Quando aqui usado, um "promotor não constitutivo" é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durante certos estágios de desenvolvimento. Por exemplo, pro- motores indutíveis e promotores sob controle de desenvolvimento são promotores não constitutivos.
[0076] Quando aqui usado, o promotor "indutível" ou "reprimível" é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbicas, certos produtos químicos, a presença de luz, condições ácidas ou básicas, etc.
[0077] Quando aqui usado, o termo "operacionalmente ligado" re- fere-se à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja regula- da pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expres- são dessa sequência de codificação (isto é, que a sequência de codifi- cação está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas a sequências regu- ladoras em uma orientação de sentido ou anti-sentido. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da descrição podem ser operacionalmente ligadas, direta ou indiretamente, 5' para o mMRNA alvo, ou 3' para o MRNA alvo, ou dentro do mMRNA alvo, ou uma pri- meira região complementar é 5' e seu complemento é de 3' em relação ao mMRNA alvo.
[0078] O termo "sequência de sinal", quando aqui usado, refere-se a uma sequência de aminoácidos que tem como alvo os peptídeos e polipeptídeos para localizações celulares ou para o ambiente extrace- lular. As sequências de sinal estão tipicamente na porção N-terminal de um polipeptídeo e são tipicamente removidas enzimaticamente. Os polipeptídeos que têm suas sequências de sinal são referidos como de tamanho natural e/ou não processados. Os polipeptídeos que tiveram suas sequências de sinal removidas são referidos como maduros e/ou processados.
[0079] O termo "exógeno", quando aqui usado com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzi- mas, etc., refere-se a moléculas que não são normalmente ou natu- ralmente encontradas e/ou produzidas por uma determinada levedura, bactéria, organismo, microrganismo, ou célula na natureza.
[0080] Por outro lado, o termo "endógeno" ou "nativo", quando aqui usado com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucle- otídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., refere-se a moléculas que são normalmente ou naturalmente encontradas em e/ou produzidas por uma dada levedura, bactéria, organismo, microrganismo ou célula na natureza.
[0081] O termo "heterólogo", quando aqui usado no contexto de uma célula hospedeira modificada, refere-se a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: (a) a (s) molécula (s) é/são es- tranhos ("exógenos") à (ou seja, não são encontrados naturalmente) na célula hospedeira; (b) a (s) molécula (s) é/são naturalmente encon- tradas em (por exemplo, é "endógena para") um determinado micror- ganismo hospedeiro ou célula hospedeira, mas é produzida em um local não natural ou em uma quantidade não natural na célula; e/ou (c) a (s) molécula (s) diferem (s) na sequência de nucleotídeos ou amino- ácidos do nucleotídeo endógeno ou sequência (s) de aminoácidos de modo que a molécula difere em nucleotídeo ou sequência de aminoá- cidos do nucleotídeo endógeno ou aminoácido como encontrada en- dogenamente, é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que a encontrada naturalmente) na célula.
[0082] O termo "homólogo", quando aqui usado em relação a uma enzima ou gene original de uma primeira família ou espécie, refere-se a enzimas ou genes distintos de uma segunda família ou espécie que são determinados por análises funcionais, estruturais ou genômicas como sendo uma enzima ou gene da segunda família ou espécie que corresponde à enzima ou gene original da primeira família ou espécie. Os homólogos geralmente apresentam semelhanças funcionais, estru- turais ou genômicas. São conhecidas técnicas pelas quais homólogos de uma enzima ou gene podem ser facilmente clonados usando son- das genéticas e PCR. A identidade de sequências clonadas como ho- mólogas pode ser confirmada usando ensaios funcionais e/ou por ma- peamento genômico dos genes.
[0083] Uma proteína tem "homologia" ou é "homóloga" a uma se- gunda proteína se a sequência de aminoácidos codificada por um ge- ne tem uma sequência de aminoácidos semelhante à do segundo ge- ne. Alternativamente, uma proteína tem homologia com uma segunda proteína se as duas proteínas têm sequências de aminoácidos "seme- lhantes". Assim, o termo "proteínas homólogas" pretende significar que as duas proteínas têm sequências de aminoácidos semelhantes. Em certos casos, a homologia entre duas proteínas é indicativa de sua an- cestralidade compartilhada, relacionada pela evolução. Os termos "se- quências homólogas" ou "homólogos" são considerados, considerados ou conhecidos como estando funcionalmente relacionados. Uma rela- ção funcional pode ser indicada de uma série de maneiras, incluindo, mas não se limitando a: (a) grau de identidade de sequência e/ou (b) a mesma função biológica ou semelhante. De preferência, ambos (a) e (b) são indicados. O grau de identidade de sequência pode variar, mas em uma modalidade, é de pelo menos 50 % (ao usar programas de alinhamento de sequência padrão conhecidos na técnica), pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos 98,5 %, ou pelo menos cerca de 99 %, ou pelo menos 99,5 %, ou pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 %. A homologia pode ser determinada usando programas de software prontamente disponíveis na técnica, tais como aqueles discutidos em Current Pro- tocols in Molecular Biology (F.M.
Ausubel et al., eds., 1987) Suplemen- to 30, seção 7.718, Tabela 7.71. Alguns programas de alinhamento são MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.) e ALIGN Plus (Software Científico e Educacional, Pennsylvania). Outros programas de alinhamento não limitantes incluem Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), AlignX e Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma função biológica semelhante pode incluir, mas não está limitada a: ca- talisar a mesma reação enzimática ou semelhante; tendo a mesma seletividade ou similar para um substrato ou cofator; tendo a mesma estabilidade ou estabilidade semelhante; tendo a mesma ou similar tolerância a várias condições de fermentação (temperatura, pH, etc.); e/ou tendo a mesma ou semelhante tolerância a vários substratos me- tabólicos, produtos, subprodutos, intermediários, etc.
O grau de seme- lhança na função biológica pode variar, mas em uma modalidade, é de pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo me- nos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos 98,5 %, ou pelo menos cerca de 99 % ou pelo menos 99,5 % ou pelo me-
nos 99,8 % ou pelo menos 99,9 %, de acordo com um ou mais ensaios conhecidos por alguém versado na técnica para determinar uma dada função biológica.
[0084] O termo "variante" refere-se a qualquer polipeptídeo ou en- zima aqui descrito. Uma variante também abrange um ou mais com- ponentes de um multímero, multímeros compreendendo um compo- nente individual, multímeros compreendendo múltiplos de um compo- nente individual (por exemplo, multímeros de uma molécula de refe- rência), um produto de decomposição química e um produto de de- composição biológica. Em particular, modalidades não limitativas, uma enzima pode ser uma "variante" em relação a uma enzima de referên- cia em virtude de alteração (ões) em qualquer parte da sequência poli- peptídica que codifica a enzima de referência. Uma variante de uma enzima de referência pode ter atividade enzimática de pelo menos 10 %, pelo menos 30 %, pelo menos 50 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 105 %, pelo menos 110 %, pelo menos 120 %, pelo menos 130 % ou mais em um ensaio padrão usa- do para medir a atividade enzimática de uma preparação da enzima de referência. Em algumas modalidades, uma variante também pode se referir a polipeptídeos com pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo me- nos 99 % de identidade de sequência com as enzimas de tamanho natural ou não processadas da presente descrição. Em algumas mo- dalidades, uma variante também pode se referir a polipeptídeos com pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com as enzimas maduras ou processadas da presente des- crição.
[0085] Quando aqui usado, o termo "de ocorrência não natural", quando usado em referência a um microrganismo, organismo ou ativi- dade enzimática da descrição, pretende significar que o microrganis- mo, organismo ou enzima tem pelo menos uma alteração genética normalmente não encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies referenciadas, incluindo cepas de tipo selvagem das espé- cies referenciadas. As alterações genéticas incluem, por exemplo, mo- dificações que introduzem ácidos nucleicos expressáveis que codifi- cam polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, de- leções de ácido nucleico e/ou outra interrupção funcional do material genético do microrganismo. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões codificantes e fragmentos funcionais das mesmas, para poli- peptídeos heterólogos, homólogos ou heterólogos e homólogos para as espécies referenciadas. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras não codificantes nas quais as modifica- ções alteram a expressão de um gene ou operon. Um microrganismo ou atividade enzimática exemplar que não ocorre naturalmente inclui a atividade de hidroxilação descrita acima.
[0086] Quando aqui usado, os termos "microrganismo" ou "micró- bio" devem ser considerados de forma ampla. Estes termos, usados indistintamente, incluem, mas não estão limitados a, os dois domínios procarióticos, Bacteria e Archaea.
[0087] Quando aqui usado, "isolar", "isolado", "micróbio isolado" e termos semelhantes pretendem significar que um ou mais microrga- nismos foram separados de pelo menos um dos materiais com os quais está associado em um ambiente particular (por exemplo, meio, água, câmara de reação, etc.). Assim, um "micróbio isolado" não existe em seu ambiente natural; em vez disso, é através das várias técnicas aqui descritas que o micróbio foi removido de seu ambiente natural e colocado em um estado de existência não natural. Assim, a cepa iso- lada ou micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação com um carre- ador aceitável, que pode ser um carreador comercial ou industrial acei- tável.
[0088] Em certos aspectos da descrição, os micróbios isolados existem como "culturas isoladas e biologicamente puras". Será apreci- ado por um versado na técnica que uma cultura isolada e biologica- mente pura de um micróbio particular denota que a referida cultura es- tá substancialmente livre de outros organismos vivos e contém apenas o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do referido micróbio. A presente descrição observa que mi- cróbios isolados e biologicamente puros muitas vezes "diferem neces- sariamente de materiais menos puros ou impuros". Veja, por exemplo Ih re Bergstrom, 427 F,2d 1394, (CCPA 1970) (discutindo prostaglan- dinas purificadas), veja também, In re Bergy, 596 F,2d 952 (CCPA 1979) (discutindo micróbios purificados), veja também, Parke-Davis & Co. v. HK Mulford & Co., 189 F. 95 (SDNY 1911) (Learned Hand discu- tindo adrenalina purificada), publicado em parte, revisto em parte, 196 F. 496 (2d Cir. 1912), cada um dos quais são aqui incorporados por referência. Além disso, em alguns aspectos, a descrição fornece cer- tas medidas quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas dentro de uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em cer- tas modalidades, é um atributo adicional que distingue os micróbios presentemente descritos daqueles micróbios existentes em um estado natural. veja, por exemplo, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F,2d 156 (4th Cir. 1958) (discutindo as limitações de pureza para a vitamina B12 produzida por micróbios), aqui incorporado por referência.
[0089] Quando aqui usado, "isolados individuais" devem ser en- tendidos como significando uma composição, ou cultura, compreen- dendo uma predominância de um único gênero, espécie ou cepa de microrganismo, após a separação de um ou mais outros microrganis- mos.
[0090] Os micróbios da presente descrição podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente descrição incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Quando aqui usado, "esporo" ou "esporos" referem- se a estruturas produzidas por bactérias e fungos que são adaptados para sobrevivência e dispersão. Os esporos são geralmente caracteri- zados como estruturas dormentes; no entanto, os esporos são capa- zes de diferenciação através do processo de germinação. A germina- ção é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são ca- pazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germina- ção de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngi- ca ou bacteriana. Os esporos de fungos são unidades de reprodução assexuada e, em alguns casos, são estruturas necessárias nos ciclos de vida dos fungos. Os esporos bacterianos são estruturas para condi- ções de sobrevivência que podem normalmente não ser conducentes à sobrevivência ou ao crescimento das células vegetativas.
[0091] Quando aqui usado, "composição microbiana" se refere a uma composição que compreende um ou mais micróbios da presente descrição.
[0092] Quando aqui usado, "transportador", "transportador aceitá- vel", "transportador comercialmente aceitável" ou "transportador indus- trialmente aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, o que não afeta negativamente o micróbio.
[0093] O termo "potencial de rendimento", quando aqui usado, re- fere-se a um rendimento de um produto de uma via biossintética. Em uma modalidade, o potencial de rendimento pode ser expresso como uma porcentagem em peso do produto final por peso do composto ini- cial.
[0094] O termo "rendimento máximo termodinâmico", quando aqui usado, refere-se ao rendimento máximo de um produto obtido a partir da fermentação de uma determinada matéria-prima, como a glicose, com base no valor energético do produto em comparação com a maté- ria-prima. Em uma fermentação normal, sem o uso de fontes de ener- gia adicionais, como luz, gás hidrogênio ou metano ou eletricidade, por exemplo, o produto não pode conter mais energia do que a matéria- prima. O rendimento máximo termodinâmico significa um rendimento do produto no qual toda a energia e massa da matéria-prima são con- vertidas no produto. Este rendimento pode ser calculado e é indepen- dente de uma via específica. Se uma via específica para um produto tem um rendimento menor do que o rendimento máximo termodinâmi- co, então ele perde massa e pode provavelmente ser melhorado ou substituído por uma via mais eficiente para o produto.
[0095] O termo "redox equilibrado" refere-se a um conjunto de re- ações, que juntas produzem tantos cofatores redox quanto consomem. O projeto de vias metabólicas e a modificação de um organismo de modo que os cofatores redox estejam balanceados ou perto de serem balanceados geralmente resultam em uma produção mais eficiente e com maior rendimento dos compostos desejados. As reações redox sempre ocorrem juntas como duas semirreações ocorrendo simultane- amente, uma sendo uma reação de oxidação e a outra uma reação de redução. Nos processos redox, o redutor transfere elétrons para o oxi- dante. Assim, na reação, o redutor ou agente redutor perde elétrons e é oxidado, e o oxidante ou agente oxidante ganha elétrons e é reduzi- do. Em uma modalidade, as reações redox ocorrem em um sistema biológico. A energia biológica é frequentemente armazenada e libera- da por meio de reações redox. A fotossíntese envolve a redução do dióxido de carbono em açúcares e a oxidação da água em oxigênio molecular. A reação reversa, a respiração, oxida os açúcares para produzir dióxido de carbono e água. Como etapas intermediárias, os compostos de carbono reduzido são usados para reduzir o dinucleotí- deo adenina nicotinamida (NAD”*), que então contribui para a criação de um gradiente de prótons, que impulsiona a síntese de trifosfato de adenosina (ATP) e é mantido pela redução do oxigênio. O termo esta- do redox é frequentemente usado para descrever o equilíbrio de GSH/GSSG, NAD*/NADH e NADP*/NADPH em um sistema biológico, como uma célula ou órgão. O estado redox é refletido no equilíbrio de vários conjuntos de metabólitos (por exemplo, lactato e piruvato, beta- hidroxibutirato e acetoacetato), cuja interconversão é dependente des- sas proporções. Um estado redox anormal pode se desenvolver em uma variedade de situações deletérias, como hipóxia, choque e sepse.
[0096] Quando aqui usado, o termo "produtividade" refere-se à quantidade total de bioproduto produzido por litro por hora.
[0097] Os termos "via C2", "via de ramificação C2", "via bioquímica C2" ou "corrente C2", quando aqui usados, referem-se a uma via bio- química em que o MEG pode ser produzido via glicolaldeído.
[0098] Os termos "via C3", "via de ramificação C3", "via bioquímica C3" ou "corrente C3", quando aqui usados, referem-se a uma via bio- química em que MEG e/ou um ou mais coprodutos, como acetona, isopropanol, propeno, Os compostos da via do isobuteno e/ou serina podem ser produzidos via piruvato, acetil-CoA ou di-hidroxiacetona- fosfato (DHAP).
[0099] As estratégias aqui descritas foram avaliadas quanto ao potencial de melhoria, considerando o fluxo geral de carbono das vias de coprodução do composto MEG + C3. Os métodos descritos neste documento entregam ganhos que não são apenas específicos para uma única via, mas têm um efeito sinérgico sobre os equilíbrios glo- bais de carbono, energia e cofator. Esses resultados sinérgicos ou an- tagônicos só podem ser previstos quando o foco é a complexidade metabólica da via de coprodução MEG + C3.
[00100] A presente descrição combina a produção de monoetileno glicol (MEG) e um ou mais três compostos de carbono em diferentes hospedeiros. Em algumas modalidades, o composto de três carbonos é isopropanol (IPA). A presente descrição evita, assim, alguns dos maiores desafios de modificação de vias para vias de MEG e IPA co- nhecidas demonstradas até agora. Surpreendentemente, a combina- ção de uma via para a produção de MEG e uma via para a produção de um composto de três carbonos se complementa e é altamente si- nérgica, evitando ou superando os maiores desafios e deficiências de cada via sozinha, estabelecendo um bom equilíbrio redox, mas tam- bém entregando o necessário ATP, sem produção de ATP em exces- so.
[00101] Uma produção fermentativa demonstrada de MEG a partir de xilose (WO2013126721A1, que é aqui referenciado em sua totali- dade), via ribulose-1-fosfato, tem um potencial de alto rendimento (79 % em peso = 0,79 g de MEG/g de xilose). O MEG é produzido através de duas vias diferentes que são ativas em paralelo, uma corrente de 2 carbonos (C2) (via glicolaldeído) e uma corrente de 3 carbonos (C3) (via di-hidroxiacetonafosfato (DHAP)). O fluxo C2 é fácil de implemen- tar com alta eficiência, mas o fluxo C3 é muito difícil de implementar com alta eficiência por meio de modificação metabólica. Existem várias opções de vias para DHAP — MEG, todas difíceis de implementar. Além disso, o processo geral é neutro em relação ao ATP. Assim, al-
guma xilose e, portanto, o rendimento serão perdidos a fim de obter algum ATP excedente necessário para o crescimento e manutenção das células.
[00102] Uma produção fermentativa adicional demonstrada de MEG a partir de xilose (Alkim et al., Microb Cell Fact (2015) 14: 127), via da xilulose-1-fosfato, é muito semelhante à via descrita por WO2013 126721A1. Tem o mesmo potencial de alto rendimento (79 % em pe- so), mas o fluxo C3 para produção de MEG via DHAP é difícil de im- plementar e há uma escassez de ATP.
[00103] Uma produção fermentativa adicional de MEG foi demons- trada a partir da glicose (Chen et al., Met. Eng. (2016) 33: 12-18). Ele usa exclusivamente uma via idêntica a uma das soluções de fluxo C3 de WO2013126721A1, passando por DHAP e depois etanolamina pa- ra gliceraldeído para MEG. Somente neste caso, o DHAP é derivado da glicose, não da xilose. Assim, sofre ainda mais com a dificuldade técnica de implementar uma via de alta produtividade e alto rendimen- to de DHAP para MEG. Além disso, tem um potencial de rendimento total reduzido de 69 % em peso versus o rendimento máximo termodi- nâmico para o produto MEG derivado de glicose (82 % em peso). A via é, além disso, neutra em ATP, não gerando nenhum ATP de que as células precisam para seu crescimento e manutenção. Essa via tam- bém não é redox balanceada e tem um alto excesso de 2 mol de NADH por mol de glicose consumida, que precisa ser reoxidada para que a célula seja viável. Em uma fermentação aeróbia, este NADH po- de ser usado para gerar ATP, que no entanto estaria em alto excesso (2 NADH — 6 ATP), levando à formação de biomassa em excesso du- rante a fase de produção e, portanto, redução da formação e do ren- dimento do produto. A única solução descrita para a perda de poten- cial de rendimento para a produção de MEG a partir de glicose é a produção de MEG a partir de xilose com um potencial de alto rendi-
mento. A única solução descrita para o excesso de produção de NADH no MEG a partir do processo de glicose é a produção de MEG a partir de xilose, que pode ser redox neutro.
[00104] Uma produção fermentativa demonstrada de IPA via aceto- acetil-CoA (US 2010/0311135, que é aqui referenciado em sua totali- dade) tem excesso de NADH (2 mol por mol de glicose consumida) e baixo potencial de rendimento (34 % em peso). Essa via tem excesso de ATP (2 mol por mol de glicose consumida), mais do que o necessá- rio para a manutenção da célula durante a fase de produção, favore- cendo a formação de biomassa em relação à produção. Se o NADH não for utilizado por meio de fixação de carbono, ele precisa ser reoxi- dado para que a célula permaneça viável, perdendo ainda mais glicose nesse processo. Alternativamente, o NADH pode ser oxidado através da produção de ATP, o que levaria a um excesso de ATP ainda mais indesejado.
[00105] Outras soluções potenciais existem para reduzir o excesso de NADH e aumentar o potencial de rendimento de IPA (rendimento máximo termodinâmico = 47 % em peso): recapturar o CO2 produzido em excesso durante a fermentação e, ao fazer isso, também reoxidar o excesso de NADH (fixação de CO2). Ou evite o excesso de CO2 e liberação de NADH completamente desviando algum fluxo da glicólise para uma via de fosfocetolase (PK)/fosfotransacetilase (PTA) para ge- rar mais acetil-CoA e menos CO2 e NADH. No entanto, até agora ne- nhuma dessas opções foi tecnicamente demonstrada no contexto da produção de IPA e são geralmente conhecidas por serem muito desa- fiadoras.
[00106] A presente descrição combina um dos três fluxos de C2 de alto rendimento fáceis de implementar para a produção de MEG a par- tir de xilose com um fluxo de produção de IPA fácil de implementar por meio da via DHAP. Surpreendentemente, o problema da via IPA, o ex-
cesso de produção de NADH, complementa o NADH exigindo parte C2 da produção de MEG. A combinação dessas vias leva a um alto po- tencial de rendimento total de 61 % em peso, que está próximo ao rendimento energético máximo de 65 % em peso para a degradação da xilose em MEG e IPA, assumindo que esses produtos sejam produ- zidos em uma proporção de 2: 1. Este potencial de alto rendimento decorre das sinergias de acoplamento da via IPA com o ramo C2 da produção de MEG a partir de xilose.
[00107] A via proposta em sua forma básica não é redox neutra, mas tem um pequeno excesso de 0,5 mol de NADH por mol de xilose consumida. Em uma fermentação aeróbia, a oxidação do NADH pode fornecer ATP suficiente para obter o ATP suficiente, mas não excessi- vo, necessário para o crescimento e manutenção durante a fase de produção, sem ter um impacto significativamente negativo na forma- ção do produto.
[00108] A presente descrição resolve uma série de problemas as- sociados à produção de MEG e/ou IPA. Em uma modalidade, o pro- blema de uma via C3 difícil de implementar na produção de MEG a partir de xilose é resolvido. Em outra modalidade, o problema de falta de ATP na produção de MEG a partir de xilose é resolvido. Em outra modalidade, o problema de perda de potencial de rendimento na pro- dução de MEG a partir de glicose é resolvido. Em outra modalidade, o problema de falta de ATP na produção de MEG a partir de glicose é resolvido. Em outra modalidade, o problema da produção excessiva de NADH na produção de MEG a partir de glicose é resolvido. Em outra modalidade, o problema de perda de potencial de rendimento na pro- dução de IPA a partir de glicose é resolvido. Em outra modalidade, o problema da produção excessiva de NADH na produção de IPA a par- tir de glicose é resolvido.
[00109] Em uma modalidade, a via para a coprodução de MEG +
IPA em E. coli compreende as seguintes enzimas para a produção de IPA: tiolase, acetato: acetoacetil-CoA transferase ou hidrolase, acetoa- cetato descarboxilase e álcool desidrogenase secundário. A via de MEG via ribulose-1-fosfato compreende as seguintes enzimas: D- tagatose 3-epimerase, Dr-ribulocinase, Dr-ribulose-fosfato aldolase e glicolaldeído redutase. A fim de aumentar o fluxo de carbono para a via desejada, três genes específicos que poderiam desviar o fluxo de carbono foram identificados e deletados: o gene xylB que codifica para uma xilulocinase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono para a via da pentose fosfato), o gene aldA que codifica o aldeído desidroge- nase A (pode desviar o fluxo de carbono de glicolaldeído para glicolato em vez de MEG) e o gene IdhA que codifica a lactato desidrogenase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono de piruvato para lactato em vez de acetil-CoA).
[00110] A primeira etapa da via (FIG. 1) é a conversão natural de D- xilose em D-xilulose. A D-xilulose normalmente entra na via da pento- se fosfato para geração de energia e biomassa, que é inibida pela de- leção do gene xylB. Na via de engenharia, todo o carbono será redire- cionado para a D-ribulose pela enzima D-tagatose 3-epimerase. A D- ribulose é convertida em D-Ribulose-1-fosfato pela enzima D- ribulocinase nativa de E. coli. O D-ribulose-1-fosfato é clivado em gli- colaldeído e di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) pela D-ribulose-fosfato aldolase. A degradação adicional de DHAP é denominada ramo C3, levando à produção de IPA. A degradação do glicolaldeído, denomina- do ramo C2, pode levar à formação de etileno glicol ou glicolato. O gli- colato é o subproduto indesejado que pode ser produzido pelo produto do gene aldA. O etileno glicol pode ser produzido a partir do glicolalde- ído usando a enzima glicolaldeído redutase. A conversão de DHAP em acetil-CoA (por meio de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato) faz parte do metabolismo natural da E. coli. Uma molécula de acetil-CoA é conden-
sada em outra molécula de acetil-CoA pela enzima tiolase para produ- zir acetoacetil-CoA. O CoA do acetoacetil-CoA é reciclado em uma molécula de acetato pelo acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hidro- lase, gerando acetil-CoA e acetoacetato. O acetoacetato é descarboxi- lado pela acetoacetato descarboxilase em acetona, que é posterior- mente reduzida a IPA por uma enzima álcool desidrogenase secundá- ria. O IPA pode ainda ser convertido em propeno por uma desidratase.
[00111] Em outra modalidade, a via para a coprodução de MEG + IPA em E. coli compreende as seguintes enzimas para a produção de IPA:tiolase, acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hidrolase, acetoa- cetato descarboxilase e álcool desidrogenase secundário. A via de MEG via D-xilulose-1-fosfato compreende as seguintes enzimas: D- xilulose 1-cinase, D-xilulose-1-fosfato aldolase e glicolaldeído redu- tase. A fim de aumentar o fluxo de carbono para a via desejada, três genes específicos que poderiam desviar o fluxo de carbono foram identificados e deletados: o gene xylB que codifica para uma xiluloci- nase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono para a via da pen- tose fosfato), o gene aldA que codifica o aldeído desidrogenase A (po- de desviar o fluxo de carbono de glicolaldeído para glicolato em vez de MEG) e o gene IdhA que codifica a lactato desidrogenase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono de piruvato para lactato em vez de acetil-CoA).
[00112] A primeira etapa da via (FIG. 2) é a conversão natural de D- xilose em D-xilulose. A D-xilulose normalmente entra na via da pento- se fosfato para geração de energia e biomassa, que é inibida pela de- leção do gene xylB. Na via de engenharia, todo o carbono será redire- cionado para D-xilulose-1-fosfato pela enzima D-xilulose 1-cinase. O D-xilulose-1-fosfato é então clivado em glicoladeído e di hidroxiacetona fosfato (DHAP) pela D-xilulose-1-fosfato aldolase. À produção de MEG a partir de glicolaldeído e um composto de três car-
bonos de DHAP (por exemplo, acetona, IPA e/ou propeno) prossegue conforme descrito para a FIG. 1.
[00113] Em outra modalidade, a via para a coprodução de MEG + IPA em E. coli compreende as seguintes enzimas para a produção de IPA: tiolase, acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hidrolase, acetoa- cetato descarboxilase e álcool desidrogenase secundário. A via de MEG via D-xilonato compreende as seguintes enzimas: xilose desidro- genase, opcionalmente xilonolactonase, xilonato desidratase, 2-ceto-3- desóxi-D-xilonato aldolase e glicolaldeído redutase. A fim de aumentar o fluxo de carbono para a via desejada, três genes específicos que poderiam desviar o fluxo de carbono foram identificados e deletados: gene xylA que codifica para uma D-xilose isomerase (esta enzima po- de desviar o fluxo de carbono de D-xilose para D-xilulose em vez de para D-xilonato ou D-xilonolactona), o gene aldA que codifica para a aldeído desidrogenase A (pode desviar o fluxo de carbono do glicolal- deído para o glicolato em vez de para MEG) e o gene IdhA que codifi- ca para a lactato desidrogenase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono do piruvato para lactato em vez de acetil-CoA).
[00114] A primeira etapa da via (FIG. 3) é a conversão de D-xilose em D-xilonato, seja por um processo de duas etapas usando uma xilo- se desidrogenase para converter D-xilose em D-xilonolactona seguida pela conversão de D-xilonolactona para D-xilonato com uma enzima xilonolactonase, ou por um processo de uma etapa usando uma xilose desidrogenase para converter D-xilose diretamente em D-xilonato. À conversão de D-xilose em D-xilulose é inibida pela deleção do gene xXylA. O D-xilonato é então convertido em 2-ceto-3-desóxi-xilonato por uma xilonato desidratase. O 2-ceto-3-desóxi-xilonato é então clivado em glicolaldeído e piruvato pela 2-ceto-3-desóxi-D-xilonato aldolase. À produção de MEG a partir de glicolaldeído e um composto de três car- bonos a partir de piruvato (por exemplo, acetona, IPA e/ou propeno)
prossegue como descrito para a FIG. 1.
[00115] A via para a coprodução de MEG + IPA em S. cerevisiae (FIG. 5) compreende as seguintes enzimas para a produção de IPA: tiolase, acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hidrolase, acetoacetato descarboxilase e álcool desidrogenase secundário. A via de MEG via D-ribulose-1-fosfato compreende as seguintes enzimas: D-tagatose 3- epimerase, D-ribulocinase, D-ribulose-fosfato aldolase e glicolaldeído redutase. Além das duas vias principais, S. cerevisiae não é capaz de consumir xilose, então duas vias diferentes foram testadas para o con- sumo de xilose. A via 1 compreende 2 genes: Xyl1 converte D-Xilose em xilitol e Xyl2 converte Xilitol em D-xilulose. A via 2 compreende apenas um gene: XylA que converte diretamente D-xilose em D- xilulose. A fim de aumentar o fluxo de carbono para a via desejada, dois genes específicos que poderiam desviar o fluxo de carbono foram identificados e deletados: o gene XKS1 que codifica para uma xiluloci- nase (esta enzima pode desviar o fluxo de carbono para a via da pen- tose fosfato) e o gene PHO13 que codifica para a fosfatase alcalina (pode desviar o carbono da via da pentose fosfato).
[00116] A primeira etapa da via é a conversão de D-xilose em D- xilulose, diretamente ou por meio do xilitol intermediário. A D-xilulose é convertida em D-ribulose pela enzima D-tagatose 3-epimerase. A D- ribulose é então convertida em D-Ribulose-1-fosfato pela D- ribulocinase. O D-ribulose-1-fosfato é clivado em glicolaldeído e DHAP pela D-ribulose-fosfato aldolase. DHAP entra no ramo C3 para a pro- dução de IPA e o glicolaldeído pode ser convertido em etileno glicol usando glicolaldeído redutase. A conversão de DHAP em acetil-CoA (por meio de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato) faz parte do metabo- lismo natural de S. cerevisiae. Uma molécula de acetil-CoA é conden- sada em outra molécula de acetil-CoA pela tiolase, produzindo acetoa- cetil-CoA. A CoA da acetoacetil-CoA é reciclada em uma molécula de acetato pelo acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hidrolase, gerando uma molécula de acetil-CoA e uma de acetoacetato. O acetoacetato é posteriormente descarboxilado pela acetoacetato descarboxilase em acetona, que é posteriormente convertida em IPA por uma enzima ál- cool desidrogenase secundária. O IPA pode ainda ser convertido em propeno por uma desidratase-isomerase.
[00117] —Surpreendentemente, o principal problema da via IPA, o excesso de produção de NADH, é altamente sinérgico com um fluxo C2 para a produção de MEG, complementando o requisito de NADH do ramo C2, deixando apenas NADH suficiente para gerar ATP neces- sário em um processo aeróbio, sem excesso de produção de ATP.
[00118] O processo IPA descrito de US 2010/0311135 e outras aplicações, sem fixação de carbono, pode atingir apenas 34 % em pe- so versus o potencial de rendimento máximo energético de 47 % em peso. Assim, esta via IPA, mesmo que perfeitamente implementada, pode atingir apenas 72 % do rendimento máximo energético. Na pre- sente descrição, a sinergia de acoplar IPA com a produção de MEG é tal que, sem necessidade de fixação de CO?2, o potencial de rendimen- to dos produtos combinados de 61 % em peso é muito próximo (94 %) do energético (= teórico, independente da via) potencial de rendimento máximo de 65 % em peso.
[00119] Em uma outra modalidade, a via de coprodução inventiva de xilose é implementada em um organismo com capacidade natural ou adicionada para fixar CO? usando agentes redutores em excesso, proporcionando assim um potencial de rendimento ainda maior. Várias vias de fixação de CO, são conhecidas e foram implementadas em E. coli ou outros hospedeiros. Acetógenos, como Clostridium ljungdahlii, podem utilizar naturalmente o excesso de NADH gerado na via de fermentação de xilose apresentada, especialmente eficiente para re- capturar o CO» liberado na via de Wood-Ljungdahl para produzir a ace-
til-CoA intermediária, que pode então ser usada para produzir mais acetona ou produtos relacionados. O CO,» é liberado, por exemplo, nas reações de piruvato + CoA + NAD* — acetil-CoA + CO> +2 NADH ou acetoacetona — acetona + CO>. Além disso, a adição de uma segun- da matéria-prima, como gás hidrogênio (H2) ou gás de síntese (uma composição de H2, CO, CO>2) ou metanol, pode fornecer mais agentes redutores e até mesmo permitir que acetogênios ou organismos habili- tados de forma semelhante recapturem todo o CO?» liberado em a via de fermentação da xilose ou CO, presente na segunda matéria-prima. Essa fermentação mixotrófica pode, portanto, aumentar ainda mais o potencial de rendimento. No caso de MEG + acetona da xilose, a fixa- ção de CO, pode levar a um aumento de 25 % da acetona relativa ou 8 % do rendimento total do produto MEG + acetona. Com agentes re- dutores adicionados externamente, calculados para a captura total de todo o carbono xilose, o potencial de rendimento é + 100 % para ace- tona, o que equivale a + 32 % do rendimento total do produto.
[00120] Potenciais de rendimento sem fixação de CO»: 1 xilose — 1 MEG + 1/2 acetona +3/2 CO? +1 NADH 1 xilose — 1 MEG + 1/2IPA +3/2 CO? +1/2 NADH
[00121] Potenciais de rendimento com fixação de CO»: 1 xilose — 1 MEG + 5/8 acetona + 9/8 CO, 1 xilose — 1 MEG + 10/18 IPA + 4/3 CO>
[00122] Potenciais de rendimento com agentes redutores adiciona- dos externamente, calculados para a fixação de CO, equivalente a to- do o CO» liberado durante a fermentação da xilose: 1 xilose — 1 MEG + 1 acetona 1 xilose — 1 MEG + 1 IPA
[00123] Embora esta presente descrição seja teoricamente sólida e sinérgica, surpreendentemente também evita os maiores desafios de modificação metabólica e técnicos de ambos os processos de fermen-
tação MEG e IPA: fermentação MEG de fluxo C3 e fixação de carbono para o processo IPA.
[00124] Em uma modalidade, o MEG é produzido através da con- versão de glicolaldeído em uma via de ramificação C-2 e a acetona é produzida através da conversão de DHAP ou piruvato em uma via de ramificação C-3. Em outra modalidade, o MEG é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via de ramificação C-2 e o IPA é produzido através da conversão de DHAP ou piruvato em uma via de ramificação C-3. Em uma outra modalidade, o MEG é produzido atra- vés da conversão de glicolaldeído em uma via de ramificação C-2 e o propeno é produzido através da conversão de DHAP ou piruvato em uma via de ramificação C-3.
[00125] Em uma modalidade, pelo menos uma porção do excesso de NADH produzido na ramificação C-3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na ramificação C-2. Em outra modalidade, pelo menos uma porção do excesso de NADH produzido na ramifica- ção C-3 é usada para produzir ATP.
[00126] Em uma modalidade, o MEG coproduzido e a acetona compreendem um potencial de rendimento superior a 90 % do poten- cial de rendimento máximo teórico sem fixação de carbono. Em outra modalidade, o MEG e IPA coproduzidos compreendem um potencial de rendimento superior a 90 % do potencial de rendimento máximo teórico sem fixação de carbono. Em uma outra modalidade, o MEG coproduzido e o propeno compreendem um potencial de rendimento superior a 90 % do potencial de rendimento máximo teórico sem fixa- ção de carbono.
[00127] Em uma modalidade, a formação de biomassa em excesso é minimizada e a produção de MEG e acetona é maximizada. Em ou- tra modalidade, a formação de biomassa em excesso é minimizada e a produção de MEG e IPA é maximizada. Em uma outra modalidade, a formação de biomassa em excesso é minimizada e a produção de MEG e propeno é maximizada. Compostos de Produção Monoetileno glicol
[00128] O monoetileno glicol (MEG) é uma importante matéria- prima para aplicações industriais. O uso principal do MEG é na fabri- cação de resinas, filmes e fibras de tereftalato de polietileno (PET). Além disso, o MEG é importante na produção de anticongelantes, re- frigerantes, anticongelantes e descongelantes para aeronaves e sol- ventes. O MEG também é conhecido como etano-1,2-diol ou etileno glicol.
[00129] O etileno glicol também é usado como meio para a transfe- rência de calor por convecção em, por exemplo, automóveis e compu- tadores refrigerados a líquido.
[00130] Por causa de seu alto ponto de ebulição e afinidade pela água, o etileno glicol é um dessecante útil. O etileno glicol é ampla- mente utilizado para inibir a formação de clatratos (hidratos) de gás natural em longos dutos multifásicos que transportam gás natural de campos de gás remotos para uma instalação de processamento de gás. O etileno glicol pode ser recuperado do gás natural e reutilizado como um inibidor após o tratamento de purificação que remove a água e os sais inorgânicos.
[00131] Os usos menores do etileno glicol incluem na fabricação de capacitores, como um intermediário químico na fabricação de 1,4- dioxano e como um aditivo para prevenir a corrosão em sistemas de resfriamento de líquido para computadores pessoais. O etileno glicol também é usado na fabricação de algumas vacinas; como um ingredi- ente secundário em graxa para sapatos, tintas e corantes; como tra- tamento de podridão e fungos para madeira; e como conservante para espécimes biológicos.
Acetona
[00132] A acetona (também conhecida como propanona) é um composto orgânico com a fórmula (CH3)2CO. É um líquido incolor, vo- látil, inflamável e a cetona mais simples.
[00133] A acetona é miscível com água e serve como um solvente importante, normalmente para fins de limpeza em laboratório. Mais de 6,7 milhões de toneladas são produzidas em todo o mundo, principal- mente para uso como solvente e produção de metacrilato de metila e bisfenol A. É um bloco de construção comum em química orgânica. Os usos domésticos familiares da acetona são como ingrediente ativo em removedor de esmalte e como diluente de tinta.
Isopropanol
[00134] O álcool isopropílico (nome IUPAC 2-propanol), também chamado de isopropanol, é um composto com a fórmula química C3H80 ou C3H7O0H ou CH3CHOHCH3. É um composto químico incolor e inflamável com um odor forte. É o exemplo mais simples de um álcool secundário, onde o átomo de carbono do álcool está ligado a dois outros átomos de carbono, às vezes mostrados como (CH3)2CHOH. É um isômero estrutural do propanol. Tem uma grande variedade de utiliza- ções industriais e domésticas.
Propeno
[00135] O propeno, também conhecido como propileno ou metil eti- leno, é um composto orgânico insaturado com a fórmula química C3H6. Ele tem uma ligação dupla e é o segundo membro mais simples da classe alceno dos hidrocarbonetos.
[00136] O propeno é produzido a partir de combustíveis fósseis - petróleo, gás natural e, em uma extensão muito menor, carvão. O pro- peno é um subproduto do refino de petróleo e do processamento de gás natural.
[00137] Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem monoetileno glicol (MEG). Em alguns aspectos, os micró- bios da presente descrição produzem MEG e um ou mais compostos C3. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produ- zem MEG e um ou mais compostos C3. Em alguns aspectos, os mi- cróbios da presente descrição produzem um ou mais dos seguintes compostos C3: acetona, isopropanol e propeno. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem MEG e acetona. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem MEG e isopropanol. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descri- ção produzem MEG e propeno. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem MEG, acetona e isopropanol. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem MEG, aceto- na e propeno. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descri- ção produzem MEG, isopropanol e propeno. Em alguns aspectos, os micróbios da presente descrição produzem MEG, acetona, isopropanol e propeno. Geração de Populações Microbianas Isolamento de Micróbios
[00138] —“Micróbios úteis em métodos e composições aqui descritos podem ser obtidos a partir de depósitos microbianos de micróbios, bactérias e/ou fungos, que produzem ou são capazes de produzir MEG e/ou compostos C3. Um método de obtenção de micróbios pode ser através do isolamento de micróbios de qualquer número de amos- tras ambientais. Micróbios podem ser obtidos em bancos de cepas globais. Modificação genética
[00139] A modificação genética introduzida em um ou mais micró- bios dos métodos aqui descritos pode ser uma mutação nocaute (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de terminação prematuro, deleção de um gene inteiro), ou pode ser eliminação ou abolição da atividade de um domínio de prote- ína (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo, ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou pode alterar ou abolir uma sequência reguladora de um gene alvo. Uma ou mais sequências reguladoras também podem ser inseridas, incluindo sequências reguladoras heterólogas e sequên- cias reguladoras encontradas dentro de um genoma de uma espécie ou gênero microbiano correspondente ao micróbio no qual a variação genética é introduzida. Além disso, as sequências reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura microbiana. A variação genética pode ser uma variação genética predeterminada que é introduzida especificamente em um sítio alvo. A variação genética pode ser uma mutação aleatória no sítio alvo. A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, uma pluralidade de diferentes variações genéticas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) são introdu- zidas em uma ou mais das bactérias isoladas antes de avaliar a me- lhoria da característica. A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer um dos tipos acima, os mesmos ou diferentes tipos e em qualquer combinação. Em alguns casos, uma pluralidade de diferentes variações genéticas é introduzida em série, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma se- gunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento e assim por diante de modo a acumular uma pluralidade de modifica- ções desejadas nos micróbios.
[00140] Em geral, o termo "variação genética" refere-se a qualquer alteração introduzida em uma sequência polinucleotídica em relação a um polinucleotídeo de referência, tal como um genoma de referência ou porção do mesmo, ou gene de referência ou porção do mesmo. Uma variação genética pode ser referida como uma "mutação" e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser referida como uma "variante genética" ou "mutante". As variações genéticas podem ter vários efeitos, como o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular.
As variações genéticas podem ser introduzidas es- pecificamente em um sítio alvo ou introduzidas aleatoriamente.
Uma variedade de ferramentas e métodos moleculares estão disponíveis para a introdução da variação genética.
Por exemplo, a variação gené- tica pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em ca- deia da polimerase, mutagênese direcionada por oligonucleotídeos, mutagênese de saturação, mutagênese por embaralhamento de frag- mentos, recombinação homóloga, recombineering, recombinação me- diada por vermelho lambda, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e suas combinações.
Métodos químicos de introdução de va- riação genética incluem a exposição de DNA a um mutagênico quími- co, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (ENU), N-metil-N-nitro-N'-nitrosogua- nidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofos- famida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostar- da de nitrogênio, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibu- tano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etile- no, dimetilnitrosamina, 7,12, dimetilbenz(a) antraceno, clorambucila, hexametilfosforamida, bissulfano e semelhantes.
Os agentes indutores de mutação de radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação y, raios X e bombardeio rápido de nêutrons.
A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucleico usando, por exemplo, tri- metilpsoraleno com luz ultravioleta.
A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento transponí- vel, é outro método adequado para gerar variação genética.
As varia- ções genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante a amplificação em um sistema in vitro sem células, por exemplo, usan- do uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), como PCR propensa a erros. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de exon, troca de domínio e semelhan- tes). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um áci- do nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de re- paro de DNA em uma célula, por exemplo, a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mu- tante deve gerar uma alta frequência de mutações (ou seja, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, mas não estão limitados a Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e seus homó- logos em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições de exemplo de vários mé- todos para a introdução de variações genéticas são fornecidas em, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5: 1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2 (3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; e Pat. Nos. 6.033.861 e 6.773.900.
[00141] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intra- genéricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, rearranjadas ou SNPs.
[00142] Os sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas cur- tas regularmente espaçadas em cluster)/associados a CRISPR (Cas) podem ser usados para introduzir as mutações desejadas. CRISPR/ Cas9 fornece bactérias e arqueas com imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos usando RNAs CRISPR (crRNAs) para guiar o si- lenciamento de ácidos nucleicos invasores. A proteína Cas9 (ou equi- valente funcional e/ou variante dela, ou seja, proteína semelhante a Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de DNA que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA sin- téticas ou de ocorrência natural chamadas crRNA e tracrRNA (também chamados de RNAs guia). Em alguns casos, as duas moléculas estão covalentemente ligadas para formar uma única molécula (também chamada de um único RNA guia ("sgRNA"). Assim, o Cas9 ou proteína semelhante a Cas9 se associa a um RNA de direcionamento de DNA (cujo termo abrange ambos os configuração de RNA guia de duas mo- léculas e a configuração de RNA guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 e guia a proteína para uma se- quência de ácido nucleico alvo. Se a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 retém sua função enzimática natural, ele clivará o DNA alvo para criar uma quebra de fita dupla, que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição, etc.), alterando assim a expressão do ge- ne. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes são englobadas pelo termo semelhante a Cas9) foram alteradas de modo que tenham uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, eles cli- vam uma única fita em vez de ambas as fitas do DNA alvo, enquanto em outros casos, eles tem severamente reduzida a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Outras descrições exemplares de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontra- das em, por exemplo, US8795965.
[00143] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia da polimerase (PCR) usa iniciadores mutagêni- cos para introduzir as mutações desejadas. A PCR é realizada por ci- clos de desnaturação, anelamento e extensão. Após a amplificação por PCR, a seleção do DNA mutado e a remoção do DNA do plasmí- deo parental podem ser realizadas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante a PCR, seguida por digestão com enzi- mas de restrição para remover apenas o DNA parental não hidroxime-
tilado; 2) mutagênese simultânea de um gene de resistência a antibió- ticos e do gene estudado, alterando o plasmídeo para uma resistência diferente a antibióticos, a nova resistência a antibióticos facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA padrão metilado parental pela enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, pelo qual as cadeias não metiladas mutagenizadas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de liga- ção adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Uma descrição adicional de métodos exemplares pode ser encontrada em, por exemplo, US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, USS354670, US5071743 e US20100267147.
[00144] A mutagênese direcionada por oligonucleotídeo, também chamada de mutagênese direcionada ao sítio, normalmente utiliza um iniciador de DNA sintético. Este iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA padrão em torno do sítio da mu- tação, de modo que pode hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma única mudança de base (uma mutação pon- tual), múltiplas mudanças de base, deleção ou inserção, ou uma com- binação destas. O iniciador de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copia- do contém o sítio mutado e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, os mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de DNA para verificar se eles contêm a mutação desejada.
[00145] Variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR propenso a erros. Nesta técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase em condições que são deficientes na fidelidade de replicação da sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o (s) produto (s) resultante (s) da reação con- têm uma ou mais alterações na sequência quando comparados à mo- lécula padrão, os produtos resultantes são mutagenizados em compa- ração com o padrão. Outro meio de introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutagênico químico, como nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res Junho de 1975; 28 (3): 323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.
[00146] A mutagênese de saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual se tenta gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um local específico, ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese de saturação compreende a mutage- nização de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) na se- quência polinucleotídica definida a ser mutagenizada (em que a se- quência a ser mutagenizada é, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de comprimento). Portanto, um grupo de mutações (por exemplo, varian- do de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutage- nizado. Um agrupamento de mutações a ser introduzido em um casse- te pode ser diferente ou o mesmo de um segundo agrupamento de mutações a ser introduzido em um segundo cassete durante a aplica- ção de uma rodada de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons específicos e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos específicos.
[00147] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, tam- bém chamada de embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar mutações benéficas rapidamente. Num exemplo de um processo de embaralhamento, DNAse é usado para fragmentar um conjunto de ge- nes parentais em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 bp de comprimento. Isto é então seguido por uma reação em cadeia da poli-
merase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com sequência homóloga suficiente sobreposta se anelam entre si e são então esten- didos pela DNA polimerase. Várias rodadas dessa extensão de PCR podem ocorrer, depois que algumas das moléculas de DNA atingirem o tamanho dos genes parentais. Esses genes podem então ser ampli- ficados com outro PCR, desta vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os inici- adores podem ter sequências adicionais adicionadas às suas extremi- dades 5', tais como sequências para sítios de reconhecimento de en- zimas de restrição necessários para ligação a um vector de clonagem. Outros exemplos de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.
[00148] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a re- combinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência poli- nucleotídica alvo. Depois que ocorre uma quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5 'da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão da fita que se segue, uma extremidade 3 'saliente da molécula de DNA quebrada "invade" uma molécula de DNA semelhante ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para deletar um gene, remover exons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagê- nese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicio- nal. Normalmente, um padrão de recombinação também é fornecido. Um padrão de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um padrão de recombinação é projetado para servir como um padrão em recombinação homóloga, como dentro ou perto de uma sequência alvo cortada ou clivada por uma nuclease específica de local. Um polinucleotídeo padrão pode ser de qualquer comprimento adequado, tal como cerca ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 ou mais nu- cleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotí- deo padrão é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência alvo. Quando alinhado de maneira ideal, um polinucleotídeo padrão pode se sobrepor a um ou mais nucleotídeos de sequências alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucle- otídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência padrão e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo estão alinha- dos de forma otimizada, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo padrão está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 ou mais nucleotídeos da sequência alvo. Exemplos não limitantes de nucleases direcionadas ao local úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, nucleases CRISPR, nucleases TALE e meganuclease. Para uma descrição mais detalhada da utilização de tais nucleases, veja, por exemplo, US8795965 e US20140301990.
[00149] A introdução da variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população trata- da de bactérias carregam uma mutação desejada, enquanto outras não. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias portadoras de uma variação genéti- ca desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem- sucedidas envolveu a seleção a favor ou contra alguma funcionalidade conferida ou abolida pela variação genética, como no caso da inserção do gene de resistência a antibióticos ou abolição de uma atividade me- tabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base na própria sequência de polinucleotídeo, de modo que apenas uma varia- ção genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem exigir também um marcador selecionável). Neste caso, a pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas sem a variação genética introduzida em um sítio alvo, de modo que a seleção seja efetivamente direcionada contra a sequência de referência na qual a variação gené- tica é buscada para ser introduzida. Normalmente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do sítio alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio alvo, incluindo clivagem no ou dentro do sítio alvo). A clivagem pode ser direcionada por uma nu- clease específica de sítio selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease CRISPR, uma nuclease TALE (TALEN) ou uma meganuclease. Tal processo é semelhante a processos para intensificar a recombinação homóloga em um sítio al- vo, exceto que nenhum padrão para recombinação homóloga é forne- cido. Como resultado, as bactérias sem a variação genética desejada têm maior probabilidade de sofrer clivagem que, se não for reparada, resulta em morte celular. As bactérias que sobrevivem à seleção po- dem então ser isoladas para avaliar a atribuição de uma característica melhorada.
[00150] Uma nuclease CRISPR pode ser usada como a nuclease específica do local para direcionar a clivagem para um sítio alvo. Uma seleção melhorada de micróbios mutados pode ser obtida usando Cas9 para matar células não mutadas. Os sistemas de nuclease CRISPR empregados para seleção contra não variantes podem em- pregar elementos semelhantes aos descritos acima no que diz respeito à introdução de variação genética, exceto que nenhum padrão para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem direcionada ao sítio alvo aumenta, portanto, a morte das células afetadas.
[00151] Outras opções para induzir especificamente a clivagem em um sítio alvo estão disponíveis, como nucleases de dedo de zinco, sis- temas de nuclease TALE (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. As ZFNs podem ser projetadas para al- vejar as sequências de DNA desejadas e isso permite que as nuclea- ses de dedo de zinco clivem as sequências alvo exclusivas. Quando introduzidos em uma célula, os ZFNs podem ser usados para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo que- bras de fita dupla. As nucleases efetoras de tipo ativador de transcri- ção (TALENs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fu- são de um domínio de ligação de DNA efetor TAL (tipo ativador de transcrição) a um domínio de clivagem de DNA. Os TALENS podem ser rapidamente projetados para se ligar a praticamente qualquer se- quência de DNA desejada e, quando introduzidos em uma célula, os TALENs podem ser usados para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla. Me- ganucleases (endonuclease teleguiada) são endodeoxirribonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconhecimento (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. As meganucleases po- dem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente direcionada. Modificando sua sequência de re- conhecimento por meio da modificação da proteína, a sequência alvo pode ser alterada. Meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam bacterianos, vegetais ou animais e são comumente agrupados em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY-YIG, a família da caixa His-Cyst e a família HNH. Endo- nucleases teleguiadas exemplares incluem I-Scel, |-Ceul, PI-Pspl, Pl- Sce, I|-ScelV, I-Csml, I|-Panl, I-Scell, I-Ppol, I-Scelll, 1- Crel, I-Tevl, 1|- Tevll e I-Tevill.
[00152] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma sequência que compartilha pelo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, T4 %,
75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui descrita.
[00153] Em alguns aspectos, a descrição fornece um micróbio que compreende uma sequência que compartilha pelo menos cerca de 70 Y%, T1 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 Y%, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui descrita.
[00154] Em alguns aspectos, a descrição fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácido nucleico, que compartilha pelo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, T4 %, 75 %, 76 %, 17 %, 78 Y%, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui des- crita.
[00155] Em alguns aspectos, a descrição fornece um micróbio que compreende, ou iniciador que compreende, ou sonda que compreen- de, ou sequência de junção não nativa que compreende uma sequên- cia de ácido nucleico, que compartilha pelo menos cerca de 70 %, 71 Y%, 72 %, 73 Y%, T4 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 Y%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui descrita.
[00156] Em alguns aspectos, a descrição fornece um micróbio que compreende uma sequência de junção não nativa que compartilha pe- lo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 Y%, T4 %, 75 %, 76 %, 17 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %
ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui descrita.
[00157] Em alguns aspectos, a descrição fornece um micróbio que compreende uma sequência de aminoácidos, que compartilha pelo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, T4 %, 75 %, 76 %, 17 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com qualquer sequência aqui des- crita. Métodos de Detecção de Modificação Genética
[00158] A presente descrição ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios aqui ensinados. Em alguns aspectos, a descrição fornece métodos de detecção das cepas paren- tais WT. Em outros aspectos, a descrição fornece métodos de detec- ção de micróbios manipulados ou modificados derivados de cepas pa- rentais ou cepas WT. Em aspectos, a presente descrição fornece mé- todos de identificação de alterações genéticas em um micróbio.
[00159] Em alguns aspectos, os métodos de engenharia genômica da presente descrição levam à criação de sequências de "junção" de nucleotídeos não naturais nos micróbios modificados. Estas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração ge- nética particular em um micróbio aqui ensinado.
[00160] As presentes técnicas são capazes de detectar essas jun- ções de nucleotídeos de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos de PCR quantitativas especializados, incluindo iniciadores e sondas concebidos exclusivamente. Em alguns aspectos, as sondas da descrição ligam-se às sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, o PCR tradicional é utili- zado. Em outros aspectos, a PCR em tempo real é utilizada. Em al-
guns aspectos, é utilizada PCR quantitativa (PCR). Em alguns aspec- tos, os métodos de PCR são usados para identificar sequências hete- rólogas que foram inseridas no DNA genômico ou DNA extragenômico dos micróbios.
[00161] Assim, a descrição pode abranger a utilização de dois mé- todos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qual- quer DNA de fita dupla e (2) sondas de DNA específicas de sequência consistindo de oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas após a hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, ape- nas a junção de nucleotídeos de ocorrência não natural será amplifi- cada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspec- tos, os iniciadores da descrição são escolhidos de modo que os inicia- dores flanqueiam ambos os lados de uma sequência de junção, de modo que se ocorrer uma reação de amplificação, então a referida se- quência de junção está presente.
[00162] Aspectos da descrição envolvem moléculas de sequência de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural per se, juntamen- te com outras moléculas de nucleotídeo que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural em condições de hibridização suaves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a rigorosas são denomi- nadas "sondas de nucleotídeos".
[00163] Em alguns aspectos, o DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da descrição usando qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser ini- ciadores projetados por Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma de tipo selva- gem ou regiões únicas das cepas mutantes não intergenéricas proje- tadas. A reação qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando apenas iniciadores de amplificação direta e reversa; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usa- do com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqgMan contendo um marcador de corante FAM na extremidade 5', um inibidor ZEN in- terno e um aglutinante de sulco menor e inibidor fluorescente a extre- midade 3' (Integrated DNA Technologies).
[00164] A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qQPCR) é um método de quantificar, em tempo real, a amplificação de uma ou mais sequências de ácido nucleico. A quantificação em tempo real do ensaio de PCR permite a determinação da quantidade de ácidos nu- cleicos sendo gerados pelas etapas de amplificação de PCR, compa- rando os ácidos nucleicos de amplificação de interesse e uma sequên- cia de ácido nucleico de controle apropriada, que pode atuar como um padrão de calibração.
[00165] As sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em en- saios qPCR que requerem uma especificidade aumentada para quanti- ficar sequências de ácido nucleico alvo. As sondas TaqMan compre- endem uma sonda de oligonucleotídeo com um fluoróforo ligado à ex- tremidade 5' e um inibidor ligado à extremidade 3' da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem como estão com as extremidades 5' e 3' da sonda em contato próximo uma com a outra, o extintor evita a transmissão do sinal fluorescente do fluoróforo. As sondas TaqMan são projetadas para anelar dentro de uma região de ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a
Tag polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a ativi- dade de exonuclease 5' para 3' da Taq polimerase degrada a sonda que se anelou com o molde. Esta degradação da sonda libera o fluoró- foro, quebrando assim a proximidade do extintor e permitindo a fluo- rescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de pa- drão de DNA presente na reação.
[00166] Os recursos de qPCR permitem que o médico elimine a etapa de pós-amplificação trabalhosa da preparação de eletroforese em gel, que geralmente é necessária para a observação dos produtos amplificados de ensaios de PCR tradicionais. Os benefícios de qPCR sobre PCR convencional são consideráveis e incluem maior velocida- de, facilidade de uso, reprodutibilidade e capacidade quantitativa. Micróbios
[00167] Conforme descrito neste documento, em algumas modali- dades, os microrganismos recombinantes são microrganismos proca- rióticos. Em algumas modalidades, os microrganismos procarióticos são bactérias. "Bactéria" ou "eubactéria", refere-se a um domínio de organismos procarióticos. As bactérias incluem pelo menos onze gru- pos distintos como segue: (1) bactérias Gram-positivas (gram+), das quais existem duas subdivisões principais: (1) grupo G+C alto (Acti- nomicetos, Micobactérias, Micrococos, outros) (2) grupo G+C baixo (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Myco- plasmas); (2) Proteobactérias, por exemplo, bactérias Gram-negativas não fotossintéticas + fotossintéticas roxas (inclui a maioria das bacté- rias Gram-negativas "comuns"); (3) Cianobactérias, por exemplo, foto- tróficos oxigenados; (4) Espiroquetas e espécies relacionadas; (5) Planctomyces; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Clamídia; (8) Bacté- rias verdes de enxofre; (9) Bactérias verdes sem enxofre (também fo- totróficos anaeróbicos); (10) Micrococos radiorresistentes e relativos;
(11) Termófilos Thermotoga e Thermosipho.
[00168] "Bactérias Gram-negativas" incluem cocos, bastonetes não entéricos e bastonetes entéricos. Os gêneros de bactérias Gram- negativas incluem, por exemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Bru- cella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacte- roides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema e Fu- sobacterium.
[00169] "Bactérias Gram-positivas" incluem cocos, bastonetes não esporulados e bastonetes esporulados. Os gêneros de bactérias gram positivas incluem, por exemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacte- rium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus e Strep- tomyces.
[00170] Em alguns aspectos, os microrganismos da presente des- crição são fungos.
[00171] Em alguns aspectos, o microrganismo recombinante é um microrganismo eucariótico. Em algumas modalidades, o microrganis- mo eucariótico é uma levedura. Em modalidades exemplares, a leve- dura é um membro de um gênero selecionado do grupo que consiste em Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyve- romyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizo- saccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotoru- la e Myxozyma.
[00172] Em alguns aspectos, o microrganismo recombinante é um microrganismo procariótico. Em modalidades exemplares, o microrga- nismo procariótico é um membro de um gênero selecionado do grupo que consiste em Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus,
Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium e Brevibacterium.
[00173] Em alguns aspectos, o microrganismo para uso nos méto- dos da presente descrição pode ser selecionado do grupo que consis- te em Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyve- romyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizo- saccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotoru- la, Myxozyma, Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium e Brevibacterium.
[00174] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento pode ser uma espécie selecionada de qualquer um dos seguintes gêneros: Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacte- roides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Fuso- bacterium, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Saccha- romyces, Pichia e Aspergillus.
[00175] Em alguns aspectos, os microrganismos para uso nos mé- todos da presente descrição incluem Clostridiumsp., Clostridium ljung- dahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacte- rium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoace- tica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bac- chii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formi- coaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostri-
dium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovo- rans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoaceto- genium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonuitri- cium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas puti- da, Bacillus sp, Corynebacteriumsp., Yarrowia lipolytica, Scheffer- somyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.
[00176] O termo "microrganismo recombinante" e "célula hospedei- ra recombinante" são usados indistintamente aqui e referem-se a mi- crorganismos que foram geneticamente modificados para expressar ou superexpressar enzimas endógenas, para expressar enzimas heteró- logas, tais como aquelas incluídas em um vetor, em um construto de integração, ou que possuem uma alteração na expressão de um gene endógeno. Por "alteração" entende-se que a expressão do gene, ou nível de uma molécula de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídicas, ou a atividade de um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídi- cas é regulada para cima ou para baixo, de forma que a expressão, nível ou atividade seja maior ou menor do que o observado na ausên- cia da alteração. Por exemplo, o termo "alterar" pode significar "inibir", mas o uso da palavra "alterar" não se limita a esta definição. Entende- se que os termos "microrganismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" se referem não apenas ao microrganismo recombinante particular, mas à progênie ou progênie potencial de tal microrganismo. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes de- vido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo como usado neste documento.
[00177] A cultura dos microrganismos usados nos métodos da des-
crição pode ser conduzida usando qualquer número de processos co- nhecidos na técnica para cultivar e fermentar substratos usando os microrganismos. A título de exemplo, os processos geralmente descri- tos nos seguintes artigos usando substratos gasosos para fermenta- ção podem ser utilizados: (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recy- cling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (ili) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid ou gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fer- mentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermenta- tions. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; todos os quais são incorporados aqui por referência.
[00178] A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator adequado, tal como Biorreator de Tanque Agitado Contínuo, Biorreator de Coluna de Bolhas, Biorreator de Airlift, Biorreator de Leito Fluidiza- do, Biorreator de Leito acondicionado, Foto-Biorreator, Reator de Célu- la Imobilizada, Reator de Leito de Escoamento, Reator de Biofilme de Leito Móvel, Coluna de Bolhas, Fermentador de Elevador a Gás, Rea- tores de Membrana como o Biorreator de Membrana de Fibra Oca. Além disso, em algumas modalidades, o biorreator compreende um primeiro reator de crescimento no qual os microrganismos são cultiva- dos e um segundo reator de fermentação, ao qual o caldo de fermen- tação do reator de crescimento é alimentado e no qual a maior parte do produto de fermentação (por exemplo, MEG, acetona, isopropanol e propeno). Em algumas modalidades, o biorreator realiza simultane- amente a cultura do microrganismo e a produção do produto de fer- mentação (por exemplo, MEG, acetona, isopropanol e propeno) a par- tir de fontes de carbono, tais substratos e/ou matérias-primas forneci- das. Métodos de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbo- nos
[00179] Conforme discutido acima, o presente pedido fornece um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos. Em uma modalidade, o MEG e um ou mais compostos de três carbonos são coproduzidos a partir de xilose. Em outra modalidade, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma de- leção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codi- fica uma D-xilulose-5-cinase e/ou em um gene que codifica uma glico- aldeído desidrogenase. Em algumas modalidades, o gene que codifica a D-xilulose-5-cinase é xyIB. Em algumas modalidades, o gene que codifica a glicoaldeído desidrogenase é aldA.
[00180] Em uma modalidade, o MEG é produzido a partir de xilose via ribulose-1-fosfato. Em outra modalidade, o MEG é produzido a par- tir de xilose via da xilulose-1-fosfato. Em uma outra modalidade, o MEG é produzido a partir de xilose via de xilonato.
[00181] Em uma modalidade, um ou mais compostos de três carbo- nos são produzidos a partir de DHAP ou piruvato. Em uma modalida- de, o um ou mais compostos de três carbonos é acetona. Em outra modalidade, o um ou mais compostos de três carbonos é isopropanol. Em uma outra modalidade, o um ou mais compostos de três carbonos é o propeno.
[00182] Conforme discutido acima, em um aspecto, a presente des- crição fornece um método de produção de um microrganismo recom- binante que produz ou acumula MEG e acetona a partir de D-xilose exógena, compreendendo a introdução no microrganismo recombinan- te e/ou superexpressão de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-tagatose 3-epimerase que catalisa a con- versão de D-xilulose em Dr-ribulose; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-ribulocinase que catalisa a conversão de D-ribulose de (a) em D-ribulose-1-fosfato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-ribulose-1-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribulose-1-fosfato de (b) em glicolaldeído e di- hidroxiacetonafosfato (DHAP); pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma glicolaldeído redutase que catalisa a con- versão de glicolaldeído de (c) em MEG; pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma tiolase que catalisa a conversão de acetil-CoA em aceto- acetil-CoA; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hi- drolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (e) em aceto- acetato; e/ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (f) em acetona; em que o DHAP intermediário produzido é convertido em acetil-CoA através da via de glicólise endógena no microrganismo, e em que MEG e acetona são coproduzidos.
[00183] Em uma modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é codifica- da por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um mi- crorganismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas sSp., Mesorhizobium sp. e Rhodobacter sp. Em algumas modalidades, a D- tagatose 3-epimerase é codificada por uma ou mais moléculas de áci- do nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas cichorii, Pseudomonas sp. ST-24, Mesorhi- zobium loti e Rhodobacter sphaeroides. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são dte e/ou FJ851309,1 ou homólogo destes. Em uma outra modalidade, a D-tagatose 3- epimerase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3 e 5. Em ainda outra modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é codificada por uma sequên- cia de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1,2 e 4.
[00184] Em uma modalidade, a D-ribulocinase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algu- mas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico é fucK ou homólogo deste. Em uma outra modalidade, a D-ribulocinase com- preende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
8. Em ainda uma outra modalidade, a D-ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6 e 7.
[00185] Em uma modalidade, a D-ribulose-1-fosfato aldolase é codi- ficada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico é fucA ou homólogo deste. Em uma outra modalidade, a D-ribulose-1- fosfato aldolase compreende uma sequência de aminoácidos apresen-
tada na SEQ ID NO: 11. Em ainda uma outra modalidade, a D- ribulose-1-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9 e 10.
[00186] Em uma modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona de (g) em isopropanol.
[00187] Em outra modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00188] Em outramodalidade, o método compreende ainda introdu- zir no microrganismo recombinante uma ou mais modificações seleci- onadas do grupo que consiste em: uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilulose-5-cinase que catalisa a conver- são de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e mutação de adeleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase que catalisa a conversão de piruvato em lactato.
[00189] Em uma modalidade, uma D-xilose isomerase endógena catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a xilose isomerase é exógena. Em outra modalidade, a xilose isomerase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de
Pyromyces sp. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase é xylA ou homólogo deste. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95. Em uma outra modali- dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase são codificadas por um sequência de ácido nucleico seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 93 e 94.
[00190] Conforme discutido acima, em outro aspecto, a presente descrição fornece um método de produção de um microrganismo re- combinante que produz ou acumula MEG e acetona a partir de D- xilose exógena, compreendendo a introdução no microrganismo re- combinante e/ou superexpressão de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-xilulose-1-cinase que catalisa a conver- são de D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-xilulose-1-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-xilulose-1-fosfato de (a) para glicolaldeído e di- hidroxiacetonafosfato (DHAP); pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma glicolaldeído redutase que catalisa a con- versão de glicolaldeído de (b) em MEG; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma tiolase que catalisa a conversão de acetil- CoA em acetoacetil-CoA; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hi- drolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (d) em aceto- acetato; e/ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (e) em acetona; em que o DHAP intermediário produzido é convertido em acetil-CoA através da via de glicólise endógena no microrganismo, e em que MEG e acetona são coproduzidos.
[00191] Em uma modalidade, a D-xilulose 1-cinase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas do Homo sapiens. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose 1-cinase é ceto-hexocinase C (Kkhk-C) ou homólogo desta. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose 1-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55. Em uma outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que co- dificam a D-xilulose 1-cinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 53 e 54.
[00192] Em uma modalidade, a D-xilulose-1-fosfato aldolase é codi- ficada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas do Homo sapiens. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldolase é a aldolase B (ALDOB) ou homólogo desta. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldo- lase compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldolase é codifica- da por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56 e 57.
[00193] Em uma modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona de (f) em isopropanol.
[00194] Em outra modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00195] Em outra modalidade, o método compreende ainda introdu- zir no microrganismo recombinante uma ou mais modificações seleci- onadas do grupo que consiste em: uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilulose-5-cinase que catalisa a conver- são de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase que catalisa a con- versão de piruvato em lactato.
[00196] Em uma modalidade, uma D-xilose isomerase endógena catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a xilose isomerase é exógena. Em outra modalidade, a xilose isomerase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pyromyces sp. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase é xylA ou homólogo desta. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95. Em uma outra modali- dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase são codificadas por um sequência de ácido nucleico seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 93 e 94.
[00197] Em algumas modalidades de qualquer aspecto descrito acima, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbo- nos de D-xilose exógena compreende introduzir no microrganismo re- combinante uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilulose-5-cinase para prevenir a conver- são de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato e, em vez disso, desviar a reação em direção à conversão de D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo ge- ne xylB ou homólogo deste.
[00198] Em algumas modalidades de qualquer aspecto descrito acima, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbo- nos de D-xilose exógena compreende introduzir no microrganismo re- combinante uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase para prevenir a produção de ácido glicólico a partir do glicolaldeído e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de glicolaldeído em MEG. Em al- gumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é codifi- cada pelo gene aldA ou homólogo deste.
[00199] Em algumas modalidades de qualquer aspecto descrito acima, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbo- nos de D-xilose exógena compreende introduzir no microrganismo re- combinante uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase para prevenir a pro-
dução de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desviar a reação para a produção de um ou mais compostos de três carbonos. Em al- gumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene IdhA ou homólogo deste.
[00200] Conforme discutido acima, em outro aspecto, a presente descrição fornece um método de produção de um microrganismo re- combinante que produz ou acumula MEG e acetona a partir de D- xilose exógena e glicose, compreendendo a introdução no microrga- nismo recombinante e/ou superexpressão de um ou mais dos seguin- tes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma xilose redutase ou aldose redutase que catalisa a con- versão de D-xilose em xilitol e pelo menos uma molécula de ácido nu- cleico exógena que codifica uma xilitol desidrogenase que catalisa a conversão de xilitol em D-xilulose; pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma D-xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose, e em que o método compreende ainda a introdução no mi- crorganismo recombinante e/ou superexpressão de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-tagatose 3-epimerase que catalisa a con- versão de D-xilulose de (a) ou (b) em D-ribulose; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-ribulocinase que catalisa a conversão de D-ribulose de (c) em D-ribulose-1-fosfato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma D-ribulose-1-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribulose-1-fosfato de (d) em glicolaldeído e di- hidroxiacetonafosfato (DHAP); pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma glicolaldeído redutase ou metilglioxal redu- tase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (e) em MEG; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma tiolase que catalisa a conversão de acetil- CoA em acetoacetil-CoA; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hi- drolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (g) em aceto- acetato; e/ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (h) em acetona; em que o DHAP intermediário produzido é convertido em acetil-CoA através da via de glicólise endógena no microrganismo, e em que MEG e acetona são coproduzidos.
[00201] Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose re- dutase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obti- das a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Hypocrea sp., Scheffersomyces sp., Saccharomyces sp., Pachyso- len sp., Pichia sp., Candida sp., Aspergillus sp., Neurospora sp. e Cryptococcus sp. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou al- dose redutase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Hypocrea jecorina, Scheffersomyces stipitis, Saccha- romyces cerevisiae, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Pichia quercuum, Candida shehatae, Candida tenuis, Candida tropicalis, As- pergillus niger, Neurospora crassa e Cryptococcus lactativorus. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codi- ficam a xilose redutase ou aldose redutase é xyl1 e/ou GRE3 ou ho- mólogo dos mesmos. Em algumas modalidades, uma ou mais molécu- las de ácido nucleico que codificam a xilose redutase ou aldose redu- tase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 84 e 87. Em algumas modali- dades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilo- se redutase ou aldose redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 82, 83, 85 e 86.
[00202] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a xilitol desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Scheffersomyces sp., Trichoderma sp., Pichia Sp., Saccharomyces sp., Gluconobacter sp., Galactocandida sp., Neuros- pora sp. e Serratia sp. Em outra modalidade, a xilitol desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a par- tir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Schef- fersomyces stipitis, Trichoderma reesei, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Gluconobacter oxydans, Galactocandida mastotermitis, Neurospora crassa e Serratia marcescens. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilitol desi- drogenase é xyl2 e/ou xdh1, ou homólogo destas. Em algumas moda- lidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xili- tol desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 90 e 92. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilitol desidrogenase é codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 88, 89 e 91.
[00203] Em uma modalidade, uma D-xilose isomerase endógena catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a xilose isomerase é exógena. Em outra modalidade, a xilose isomerase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pyromyces sp. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase é xylA ou homólogo desta. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95. Em uma outra modali- dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase são codificadas por um sequência de ácido nucleico seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 93 e 94.
[00204] Em uma modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona de (i) em isopropanol.
[00205] Em outra modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00206] Em outramodalidade, o método compreende ainda introdu- zir no microrganismo recombinante uma ou mais modificações seleci- onadas do grupo que consiste em: uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilulose-5-cinase que catalisa a conver- são de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; e uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma fosfatase alcalina que catalisa a conversão de D-xilulose-5-fosfato em D-xilulose.
[00207] Em uma modalidade, a enzima que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato é uma D-xilulose-5-cinase. Em al- gumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é de Saccharomyces cere- visiae. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo gene XKS1 ou homólogo deste. Em algumas modalidades, a D- xilulose-5-cinase é de Piíchia stipitis. Em algumas modalidades, a D- xilulose-5-cinase é codificada pelo gene XYL3 ou homólogo deste.
[00208] Em uma outra modalidade, o microrganismo é um fungo.
[00209] Conforme discutido acima, em outro aspecto, o presente pedido fornece um método de produção de um microrganismo recom- binante que produz ou acumula MEG e acetona a partir de D-xilose exógena, compreendendo a introdução no microrganismo recombinan- te e/ou superexpressão de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma xilose desidrogenase que catalisa a conver- são de D-xilose em D-xilonolactona; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma xilonolactonase que catalisa a conversão de D-xilonolactona de (a) em D-xilonato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma xilonato desidratase que catalisa a conver- são de D-xilonato de (b) em 2-ceto-3-desóxi-xilonato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase que catalisa a conversão de 2-ceto-3-desóxi-xilonato de (c) para glicolalde- ido e piruvato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma glicolaldeído redutase que catalisa a con- versão de glicolaldeído de (d) em MEG;
pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma tiolase que catalisa a conversão de acetil-CoA em aceto- acetil-CoA; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hi- drolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (f) em acetoa- cetato; e/ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (g) em acetona; em que o piruvato intermediário produzido é convertido em acetil-CoA através da via de glicólise endógena no microrganismo, e em que MEG e acetona são coproduzidos.
[00210] Em uma modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado a partir do grupo que consiste em Caulo- bacter sp., Haloarcula sp., Haloferax sp., Halorubrum sp. e Trichoder- ma sp. Em outra modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um mi- crorganismo selecionado a partir do grupo que consiste em Caulobac- ter crescentus, Haloarcula marismortui, Haloferax volcanii, Halorubrum lacusprofundi e Trichoderma reesei. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidro- genase são selecionadas de xylB, xdh1i (HVO B0028) e/ou xyd1, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, uma ou mais mo- léculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase com- preendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 61, 63 e 65. Em ainda outra modali- dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nucleico sele-
cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59, 60, 62 e
64.
[00211] Em uma modalidade, a xilonolactonase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganis- mo selecionado de Caulobacter sp. e Haloferax sp. Em outra modali- dade, a xilonolactonase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter crescentus, Haloferax volcanii e Haloferax gibbonsii. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de áci- do nucleico que codificam a xilonolactonase é xylIC ou homólogo des- ta. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a xilonolactonase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 67. Em ainda outra mo- dalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonolactonase são codificadas por um ácido nucleico sequência apresentada na SEQ ID NO: 66.
[00212] Em uma modalidade, a xilonato desidratase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrga- nismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter sp., Sulfolo- bus sp. e E. coli. Em outra modalidade, a xilonato desidratase é codifi- cada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um mi- crorganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter cres- centus, Sulfolobus solfataricus e E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato de- sidratase são selecionadas de xylD, yjhG e/ou yagF, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase compreendem uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 69, 72 e 75. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 68, 70, 71,73 e 74.
[00213] Em uma modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldo- lase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de Pseudomonas sp. e E. coli. Em outra modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase são selecionadas de yjhH e/ou yagE, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalida- de, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto- 3-desóxi-D-pentonato aldolase compreendem uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 78 e 81. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de áci- do nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 76, 77, 79 e 80.
[00214] Em uma modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona de (h) em isopropanol.
[00215] Em outra modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00216] Em outramodalidade, o método compreende ainda introdu- zir no microrganismo recombinante uma ou mais modificações seleci- onadas do grupo que consiste em:
uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilose isomerase que catalisa a conver- são de D-xilose em D-xilulose; uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase que catalisa a con- versão de piruvato em lactato.
[00217] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D- xilose isomerase para evitar a conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de D-xilose em D- xilulose. Em uma modalidade, a enzima que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose é uma D-xilose isomerase. Em algumas moda- lidades, a D-xilose isomerase é de Escherichia coli. Em algumas mo- dalidades, a D-xilose isomerase é codificada pelo gene xylA ou homó- logo desta.
[00218] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica um glicolal- deído desidrogenase para prevenir a produção de ácido glicólico a par- tir de glicolaldeído e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de glicolaldeído em MEG. Em uma modalidade, a glicolaldeído desi- drogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolal-
deído desidrogenase é codificada pelo gene aldA ou homólogo deste.
[00219] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica um lactato desidrogenase para prevenir a produção de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desviar a reação para a produção de um ou mais compostos de três carbonos. Em uma modalidade, a enzima que cata- lisa a conversão de piruvato em lactato é uma lactato desidrogenase. Em modalidades particulares, a enzima converte piruvato em lactato. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene IdhA ou homólogo deste.
[00220] Conforme discutido acima, em outro aspecto, o presente pedido fornece um método de produção de um microrganismo recom- binante que produz ou acumula MEG e acetona a partir de D-xilose exógena, compreendendo a introdução no microrganismo recombinan- te e/ou superexpressão de um ou mais dos seguintes: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma xilose desidrogenase que catalisa a conver- são de D-xilose em D-xilonato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma xilonato desidratase que catalisa a conver- são de D-xilonato de (a) em 2-ceto-3-desóxi-xilonato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase que catalisa a conversão de 2-ceto-3-desóxi-xilonato de (b) em glicolaldeí- do e piruvato; pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glico- laldeído de (c) em MEG; pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma tiolase que catalisa a conversão de acetil-CoA em aceto- acetil-CoA; pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que codifica uma acetato:acetoacetil-CoA transferase ou hi- drolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (e) em aceto- acetato; e/ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (f) em acetona; em que o piruvato intermediário produzido é convertido em acetil-CoA através da via de glicólise endógena no microrganismo, e em que MEG e acetona são coproduzidos.
[00221] Em uma modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado a partir do grupo que consiste em Caulo- bacter sp., Haloarcula sp., Haloferax sp., Halorubrum sp. e Trichoder- ma sp. Em outra modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um mi- crorganismo selecionado a partir do grupo que consiste em Caulobac- ter crescentus, Haloarcula marismortui, Haloferax volcanii, Halorubrum lacusprofundi e Trichoderma reesei. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidro- genase são selecionadas de xylB, xdh1i (HVO B0028) e/ou xyd1, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, uma ou mais mo- léculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase com- preendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 61, 63 e 65. Em ainda outra modali-
dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nucleico sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59, 60, 62 e
64.
[00222] Em uma modalidade, a xilonato desidratase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrga- nismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter sp., Sulfolo- bus sp. e E. coli. Em outra modalidade, a xilonato desidratase é codifi- cada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um mi- crorganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter cres- centus, Sulfolobus solfataricus e E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato de- sidratase são selecionadas de xylD, yjhG e/ou yagF, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase compreendem uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 69, 72 e 75. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 68, 70, 71,73 e 74.
[00223] Em uma modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldo- lase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de Pseudomonas sp. e E. coli. Em outra modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase são selecionadas de yjhH e/ou yagE, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalida- de, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto- 3-desóxi-D-pentonato aldolase compreendem uma sequência de ami-
noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 78 e 81. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de áci- do nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 76, 77, 79 e 80.
[00224] Em uma modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona de (g) em isopropanol.
[00225] Em outra modalidade, o método compreende ainda a intro- dução no microrganismo recombinante e/ou superexpressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena que co- difica uma desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00226] Em outramodalidade, o método compreende ainda introdu- zir no microrganismo recombinante uma ou mais modificações seleci- onadas do grupo que consiste em: uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D-xilose isomerase que catalisa a conver- são de D-xilose em D-xilulose; uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase que catalisa a con- versão de piruvato em lactato.
[00227] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica uma D- xilose isomerase para evitar a conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de D-xilose em D- xilulose. Em uma modalidade, a enzima que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose é uma D-xilose isomerase. Em algumas moda- lidades, a D-xilose isomerase é de Escherichia coli. Em algumas mo- dalidades, a D-xilose isomerase é codificada pelo gene xylA ou homó- logo desta.
[00228] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica um glicolal- deído desidrogenase para prevenir a produção de ácido glicólico a par- tir de glicolaldeído e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de glicolaldeído em MEG. Em uma modalidade, a glicolaldeído desi- drogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolal- deído desidrogenase é codificada pelo gene aldA ou homólogo deste.
[00229] Em algumas modalidades, um método de produção de um microrganismo recombinante que produz ou acumula MEG e um ou mais compostos de três carbonos de D-xilose exógena compreende a introdução no microrganismo recombinante de uma deleção, inserção ou perda de mutação de função em um gene que codifica um lactato desidrogenase para prevenir a produção de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desviar a reação para a produção de um ou mais compostos de três carbonos. Em uma modalidade, a enzima que cata- lisa a conversão de piruvato em lactato é uma lactato desidrogenase. Em modalidades particulares, a enzima converte piruvato em lactato. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene IdhA ou homólogo deste.
[00230] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a glicolaldeído redutase é codificada por uma ou mais moléculas de áci- do nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de E. colie S. cerevisiae. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico são selecionadas a partir de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafífB (dkgB) e/ou yghE (dkgA) ou homólogo das mesmas. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são yqhD. Em algumas modalidades, o yqhD compreende uma mutação G149E. Em uma outra modalidade, a glicolaldeído redutase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma outra modalidade, a glicolaldeído redutase é codificado por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
[00231] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo sele- cionado do grupo que consiste em Clostridium sp., Bacillus sp., E. coli, Saccharomyces sp. e Marinobacter sp. Em algumas modalidades, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo sele- cionado do grupo que consiste em Clostridium acetobutylicum, Clostri- dium thermosaccharolyticum, Bacillus cereus, E. coli, Saccharomyces cerevisiae e Marinobacter hydrocarbonoclasticus. Em algumas modali- dades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são thlA, atoB e/ou ERG10, ou homólogo destes. Em uma outra modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID
NOs: 35, 37 e 40. Em ainda uma outra modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por um sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 33, 34, 36, 38 e 39.
[00232] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de Clostridium sp. e E. coli. Em outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma ou mais molé- culas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase é atoA e/ou atoD, ou homólogo dos mesmos. Em outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA trans- ferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Clostridium acetobutyli- cum. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é ctfA e/ou ctfB, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, a acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidro- lase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 43, 46, 97, 99, 101 e 103. Ainda uma outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transfe- rase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 41, 42, 44, 45, 96, 98, 100 e 102.
[00233] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado a partir do grupo que consiste em Clostridium sp., Bacillus sp., Chromo-
bacterium sp. e Pseudomonas sp. Em outra modalidade, a acetoaceta- to descarboxilase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa, Chromobacterium viola- ceum e Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a acetoacetato descarboxi- lase é ade ou homólogo deste. Em uma outra modalidade, a acetoace- tato descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 49 e 52. Em ainda outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51.
[00234] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito acima, a enzima que catalisa a conversão de acetona em isopropanol é uma álcool desidrogenase secundária (S-ADH). Em outra modalidade, a enzima é uma álcool desidrogenase secundária que é codificada por uma molécula de ácido nucleico obtida a partir de um microrganismo selecionado a partir de Burkholderia sp, Alcaligenes sp., Clostridium Ssp., Thermoanaerobacter sp., Phytomonas sp., Rhodococcus sp., Me- thanobacterium sp., Methanogenium sp., Entamoeba sp., Trichomonas Sp. e Tritrichomonas sp. Em algumas modalidades, a molécula de áci- do nucleico que codifica a álcool desidrogenase secundária é obtida a partir de um microrganismo selecionado a partir de Burkholderia sp. AIU 652, Alcaligenes eutrophus, Clostridium ragsdalei, Clostridium bei- jerinckii, Clostridium carboxidivorans, Thermoanaerobacter brockii, Thermoanaerobacter ethanolicus (Clostridium thermohydrosulfuricum), Rhodococcus ruber, Methanobacterium palustre, archaea metanogêni- ca Methanogenium liminatans, protista parasita Entamoeba histolytica, protozoário parasita Tritrichomonas fetus e parasita humano Tricho-
monas vaginalis. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a álcool desidrogenase secundária é adh, adhB, ERhAdh1 ou homólogo das mesmas. Em algumas modali- dades, o S-ADH é previsto a partir da homologia e pode ser de Ther- moanaerobacter mathranii, Micrococcus luteus, Nocardiopsis alba, Mycobacterium hassiacum, Helicobacter suis, Candida albicans, Can- dida parapsilosisó, Candida orthopsilosisó, Candida metapsffilosis, Scheigera cesfilosis e Scheigia stiacaviosis. Em uma outra modalida- de, a álcool desidrogenase compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 106 e
108. Em ainda outra modalidade, a álcool desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 104, 105 e 107. Modificação Enzimática
[00235] As enzimas no microrganismo recombinante podem ser projetadas para melhorar um ou mais aspectos do substrato para a conversão do produto. Exemplos não limitantes de enzimas que po- dem ser adicionalmente projetadas para uso em métodos da descrição incluem uma aldolase, uma aldeído redutase, uma acetoacetil coenzi- ma A hidrolase, uma xilose isomerase, uma xilitol desidrogenase e su- as combinações. Estas enzimas podem ser projetadas para melhorar a atividade catalítica, melhorar a seletividade, melhorar a estabilidade, melhorar a tolerância a várias condições de fermentação (temperatura, pH, etc.) ou melhorar a tolerância a vários substratos metabólicos, produtos, subprodutos, intermediários, etc. o termo "atividade catalítica melhorada", quando aqui usado com respeito a uma atividade enzimá- tica particular, refere-se a um nível mais alto de atividade enzimática do que aquele medido em relação a uma enzima não modificada com- parável.
[00236] Por exemplo, métodos de modificação têm sido usados para alterar a estabilidade, especificidade de substrato e estereoespe- cificidade de aldolases para produzir enzimas excelentes para proces- sos biocatalíticos. A termoestabilidade e tolerância ao solvente da fru- tose-1,6-bisfosfato aldolase (FBP-aldolase) foi aumentada usando o embaralhamento do DNA familiar dos genes fda de Escherichia coli e Edwardsiella ictaluri. Uma variante de quarta geração foi identificada que exibiu uma meia-vida média 280 vezes maior a 53 ºC do que qualquer um dos pais. A mesma variante também exibiu atividade re- alçada em vários solventes orgânicos polares e não polares (Hao e Berry 2004 Protein Eng Des Sel 17: 689-697).
[00237] Como outro exemplo, a acetoacetil coenzima A hidrolase pode converter acetoacetil-CoA em acetoacetato. No entanto, a hidro- lase é inespecífica porque também reage com a mesma magnitude de ordem com a acetil-CoA, que é o substrato necessário para a forma- ção de acetoacetil-CoA pela enzima tiolase. Assim, para criar hidrola- ses de acetoacetil-CoA mais eficientes, essas enzimas foram projeta- das para ter pelo menos 10x maior atividade para o substrato de ace- toacetil-CoA do que para o substrato de acetil-CoA, substituindo vários resíduos de ácido glutâmico na subunidade beta da enzima que é im- portante para catálise (WO 2015/042588).
[00238] Como outro exemplo, a enzima E. coli YqhD é um amplo substrato aldeído redutase com atividade redutase dependente de NADPH para mais de 10 substratos de aldeído e é uma enzima útil para produzir combustíveis e produtos químicos biorrenováveis (Jarboe 2010 Applied Microbiology e Biotechnology 89: 249). Embora a ativida- de da enzima YqhD seja benéfica por meio de sua eliminação de aldeí- dos tóxicos, a enzima também é dependente de NADPH e contribui pa- ra a depleção de NADPH e inibição do crescimento de organismos. À PCR propensa a erros de YqhD foi realizada a fim de melhorar a produ- ção de 1,3-propanodiol a partir de 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA).
Esta engenharia direcionada produziu dois mutantes, tos aldeídos, par- ticularmente 3-HPA (Li et al. 2008 Prog. Nat. Sci. 18 (12): 1519-152D99 QN147H e 0202A, com Km diminuído e kcat aumentado para cer4). À atividade catalítica melhorada do mutante D99QN147H é consistente com o que é conhecido sobre a estrutura de YqhD (Sulzenbacher et al. 2004 J. Mol. Biol. 342 (2): 489-502), uma vez que os resíduos Asp99 e Asn147 interagem com NADPH. O uso do mutante DI9QN147H au- mentou a produção de 1,3-propanodiol de 3-HPA 2 vezes. As enzimas YqhD mutantes com eficiência catalítica aumentada (Kcat/Km aumen- tada) para NADPH também foram descritas em WO 2011012697 A2, que é aqui incorporado em sua totalidade.
[00239] Como outro exemplo, a xilose isomerase é uma enzima de- pendente de metal que catalisa a interconversão de açúcares de aldo- se e cetose, principalmente entre xilose em xilulose e glicose em fruto- se. Possui menor afinidade para açúcares de lixose, arabinose e ma- nose. Os grupos hidroxila de açúcares podem definir a preferência de substrato de isomerases de açúcar. O aspartato no resíduo 256 de Thermus thermophilus xilose isomerase foi substituído por arginina (Patel et al. 2012 Protein Engineering, Design & Selection vol. 25 no. 7 pp. 331-336). Esta xilose isomerase mutante exibiu um aumento na especificidade para D-lixose, L-arabinose e D-manose. A eficiência catalítica do mutante D256R xilose isomerase também foi maior para esses 3 substratos em comparação com a enzima do tipo selvagem. Foi hipotetizado que a arginina no resíduo 256 na enzima mutante po- de desempenhar um papel na reação catalítica ou influenciar mudan- ças na orientação do substrato.
[00240] Como outro exemplo, a enzima xilitol desidrogenase de- sempenha um papel na utilização da xilose junto com a xilose redu- tase. A xilose redutase (XR) reduz a xilose a xilitol e então a xilitol de- sidrogenase (XDH) reoxidou o xilitol para formar xilulose. No entanto,
uma vez que XR prefere NADPH como cossubstrato, enquanto XDH usa exclusivamente NAD* como cossubstrato, um problema de reci- clagem de cossubstrato é encontrado.
Uma solução é projetar a XDH de modo que sua especificidade de cossubstrato seja alterada de NAD* para NADP* (Ehrensberger et al. 2006 Structure 14: 567-575). Uma estrutura cristalina da holoenzima Gluconobacter oxydans reve- lou que Asp38 é amplamente responsável pela especificidade NAD* de XDH.
Asp38 interage com os hidroxilas da adenosina ribose, e as pilhas de Met39 sob o anel de purina e também estão localizadas per- to da 2' hidroxila.
Um mutante duplo (D38S/M39R) XDH foi construído, o qual utilizou exclusivamente NADP* sem perda de atividade enzimá- tica.
Tabela 1: Descrição das enzimas Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID sa ana men aan UPS Lona fomato ea e [rowa | D-xilose + NAD(P)H <=> | 1.1.1.3 | xilose redutase xyl1 Scheffersomyces | D-xilose redutase GenelD: 82,83 84 ta fa le o e | | D-xilose + NAD(P)H <=> | 1.1.1.3 | xilose redutase GRE3 Saccharomyces aldose redutase Ge- 85, 86 P38715 87 em amem os Ema es E e e de Xylitol + NAD* <=> D- | 1.1.1.9 | xiltol — desidroge- | xyl2 Scheffersomyces | D-xylulose redutase GenelD: 88,89 P22144 Emo TE == Ee eee o Ee Xiltol + NAD'<=> D-|1.1.1.9 | xilitol desidroge- | xdh1 Trichoderma ree- | Xilitol desidrogenase | ENA Nr.: | 91 92 E E e ee E |) D-xilopiranose <=> D-|5.3.1.5 | xilose isomerase xylA Pyromyces sp. xilose isomerase ENA Nr.: | 93, 94 Q9P8C9 |95 S Eita a a a a CANA, glicolaldeído + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | gldA Escherichia coli glicerol desidroge- | Ge- 12 POA9SS5 13 <=> monoethylene glycol tase nase nelD:1293365 + NAD(P)* 9 glicolaldeíido + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | GRE2 Saccharomyces metilglioxal redutase | Ge- 14 012068 15 <=> monoetileno glicol + tase cerevisiae nelD:854014 NAD(P)* glicolaldeído + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | GRE3 Saccharomyces aldose redutase Ge- 16 P38715 17 <=> monoetileno glicol + tase cerevisiae nelD:856504 NAD(P)*
Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID
— e Ec o rem, PTE Em Tr= TE glicolaldeído + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | yqhD* Escherichia coli Álcool desidrogenase | GenelD: 18,19 Modified | 20
<=> monoetileno glicol + tase 947493 version of
NAD(P)* Q46856;
G149E glicolaldeido + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | yohD Escherichia coli Álcool desidrogenase | GenelD: 21,22 Q46856 23
<=> monoetileno glicol + tase 947493
NAD(P)*
glicolaideído + NAD(P)H | 1.1.1- | glicoladdeído redu- | ydjg Escherichia col — | metiglioxal redutase | Ge- 24 Pr7256 |25
<=> monoetileno glicol + tase nelD:1293014
NAD(P)* 9 glicolaldeído + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | fucO Escherichia coli lactaldeído redutase Ge- 26,27 POA9S1 28 8
NAD(P)* o glicolaideído + NAD(P)H | 1.1.1- | glicoladdeído redu- | yafB (dkgB) | Escherichia coli | metilglioxal redutase | 545778205 | 29 P30863 | 30
<=> monoetileno glicol + tase Imultifuncional]
NAD(P)*
glicolaldeído + NAD(P)H | 1.1.1.- | glicolaldeído redu- | yghE Escherichia coli ácido — 2,5-diceto-D- | GenelD: 31 Q46857 32
<=> monoetileno glicol + tase (dkgA) glicônico redutase À 947495
NAD(P)*
D-xylulose <=> D-ribulose | 5.1.3.- | D-ribulose-3- DTE Pseudomonas D-tagatose 3- | ENA Nr: | 1,2 O50580 3 o Jam o Ja am am
D-xylulose <=> D-ribulose | 5.1.3.- | D-ribulose-3- C1IKKR1 Rhodobacter D-tagatose 3- | ENA Nr: | 4 5
—— — E o EE [EE CET ee
Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID —— EE a rm, CEEE ET TEL D-ribulose +ATP <=> D- | 2.7.1.- | D-ribulose-1-cinase | fucK Escherichia coli L-fuculocinase GenelD: 67 P11553 ribulose-1-phosphate 946022 +ADP D-ribulose-1-fosfato — <=> | 4.1.2.- | D-ribulose-1-fosfato | fucA Escherichia coli L-fuculose fosfato | GenelD: 9,10 POAB87 EK glyceraldeído +di- aldolase aldolase 947282 hidroxiacetonefosfato D-xylulose +ATP <=> D- | 2.7.1.- | D-xilulose 1-cinase | khk-C Homo sapiens ceto-hexocinase C GenBank: 53, 54 P50053 55 ETA Jor ssa [ao pues eme Tem es ess D-xilulose-1-fosfato — <=> | 4.1.2.- | D-xilulose-1-fosfato | aldoB Homo sapiens Frutose-bisfosfato CCDS6756,1 | 56,57 PO5062 58 glyceraldeído +di- aldolase (cDNA) aldolase B 8 hidroxiacetonefosfato NS i D-xilose +NAD*<=> D-|1.1.1.1 | xilose —desidroge- | xylB Caulobacter cres- | D-xilose 1- | GenelD: 59,60 B8H1Z0 |61 xilonolactona +NADH ou |75 nase centus desidrogenase 7329904 D-xilose +NAD*<=> D- xylonate +NADH D-xilose +NADP*<=> D-|1.1.1.1 | xilose — desidroge- | xdh1, Haloferax volcanii | D-xilose 1- | GenelD: 62 D4GP29 |63 xilonolactona +NADPH ou | 79 nase HVO B002 desidrogenase 8919161 D-xilose +NADP*<=> D- 8 xylonate +NADPH
Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID —— Eça a ma, STEEL D-xilose +NADP*<=> D- | 1.1.1.1 | xilose — desidroge- | xyd1 Trichoderma ree- | D-xilose 1- | ENA Nr.: | 64 AOAOZ4S | 65 xilonolactona +NADPH ou | 79 nase sei desidrogenase EF136590,1 MVv2 D-xilose +NADP*<=> D- xylonate +NADPH D-xilonolactona +H20 | 3.1.1.6 | xilonolactonase xylC Caulobacter cres- | Xilonolactonase GenelD: AOAOH3 | 67 EEE roi pes Tio aee Tem e e D-xilonato <=> 2-ceto-3- | 4.2.1.8 | xilonato — desidra- | xyID Caulobacter cres- | xilonato desidratase GenelD: AOAOH3 css ts a a mm D-xilonato <=> 2-ceto-3- | 4.2.1.8 | xilonato — desidra- | yjhG Escherichia coli xilonato desidratase GenelD: 70,71 P39358 72 EEEaço e mar Sa amem E mn D-xilonato <=> 2-ceto-3- | 4.2.1.8 | xilonato — desidra- | yagF Escherichia coli xilonato desidratase GenelD: 73,74 P77596 75 8 Es Ee e e EE mm 2-ceto-3-desóxi-xilonato 4.1.2.- | 2-ceto-3-desóxi-D- | yjhH Escherichia coli Liase não caracteri- | GenelD: 76,77 P39359 78 &S <=> glicolaldeído + pentonato aldolase zada 948825 pyruvate 2-ceto-3-desóxi-xilonato 4.1.2.- | 2-ceto-3-desóxi-D- | yagE Escherichia coli Provável 2-ceto-3- | GenelD: 79,80 P75682 81 <=> glicolaldeído + pentonato aldolase desóxi-galactonato 944925 Ppyruvate aldolase 2 acetyl-Coa -> acetoace- | 2.3.1.9 | acetil coenzima A | thlA Clostridium aceto- | acetil coenzima A | 3309200 33,34 P45359 35 EE e o James [o Je o eee o [e e 2 acetil-Coa -> acetoace- | 2.3.1.9 | acetil coenzima A | atoB Escherichia coli acetil coenzima A | GenelD: 36 P76461 37 Espe pe EE
Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID — EE E rm, PTE ET TEL 2 acetil-Coa -> acetoace- | 2.3.1.9 | acetil coenzima A | ERG10 Saccharomyces acetil coenzima A | 856079 38 P41338 39 Be tim O Jam mm acetoacetil-CoA + acetato | 2,8,3,8 | Subunidade de | atoA Escherichia coli Subunidade de acetil- | 48994873 41,42 P76459 43 -> acetoacetato + acetil- acetil- CoA:acetoacetato- CoA CoA:acetoacetato- CoA transferase CoaA transferase acetoacetil-CoA + acetato | 2,8,3,8 | Subunidade de | atoD Escherichia coli Subunidade de acetil- | 48994873 44,45 P76458 46 -> acetoacetato + acetil- acetil- CoA:acetoacetato- CoA CoA:acetoacetato- CoA transferase CoaA transferase a acetoacetato -> acetone + | 4,1.1.4 | acetoacetato — de- | ado Clostridium aceto- | acetoacetato —decar- | 6466901 47,48 P23670 49 = EEE o mem e acetoacetato -> acetone + | 4,1.1.4 | acetoacetato — de- | ado Clostriddum beije- | acetoacetato —decar- | 149901357 50, 51 AG6MO20 |52 &S EE o [Er En eme fes fee = acetone + NAD(P)H -> 2- [| 1.1.1.2 | álcool — desidroge- | adh Clostriddum beije- | álcool desidrogenase | 60592972 104, P25984 106 meant atncima O a r acetone + NAD(P)H-> 2- | 1.1.1.2 | álcool — desidroge- | adh Clostridium carbo- | álcool desidrogenase | 308066805 107 C6PZV5 | 108 ET [TE Eee eres eres eme 1 eme NADH + NADP*<--> NAD* | 1.6.1.1. | Piridina nucleotídeo | udhA Escherichia coli Piridina — nucleotídeo | GenelD: 109 P27306 110 + NADPH transidrogenase transidrogenase solú- | 948461 solúvel vel
Reação Descrita EC no. | Atividade enzimá- | Gene can- | Organismo Fonte | Função natu- | Identificador | SEQ ID SEQ ID — EEE E rm, CEEE ETA TEL Acetoaceti-CoA + H(2)O | 3.1.21 | acetato:acetoacetil- | ctfA Clostridium aceto- | butirato-acetoacetato | NCBI- P33752 97 <=> CoA + acetoacetato 1 CoA hidrolase butylicum CoA-transferase, GenelD: complexo À 1116168 Acetoaceti-CoA + H(2)O | 3.1.21 | acetato:acetoacetil- | ctfB Clostridium aceto- | butirato-acetoacetato | NCBI- P23673 <=> CoA + acetoacetato 1 CoA hidrolase butylicum CoA-transferase, GenelD: subunidade B 1116169 Acetoaceti-CoA + H(2)O | 3.1.2,1 | acetato:acetoacetil- | atoA Escherichia — coli | Subunidade de acetil- | GenelD: 100 P76459 101 <=> CoA + acetoacetato 1 CoA hidrolase (cepa K12) CoA:acetoacetato- 946719 CoA transferase Acetoaceti-CoA + H(2)O | 3.1.2,1 | acetato:acetoacetil- | atoD Escherichia — coli | Subunidade de acetil- | GenelD: 102 P76458 103 a CoA transferase N Ss
D-tagatose 3-epimerase (EC 5.1.3.31)
[00241] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a epimerização de várias cetoses na posição C-3, interconvertendo D-frutose e D-psicose, D-tagatose e D-sorbose, D-ribulose e D- xilulose, e L-ribulose e L-xilulose. A especificidade depende da espé- cie. As enzimas de Pseudomonas cichorii e Rhodobacter sphaeroides requerem Mn2 +. Em uma modalidade, a enzima é D-tagatose 3- epimerase (dte). Em outra modalidade, a D-tagatose 3-epimerase ca- talisa a conversão de D-xilulose em D-ribulose. o ow o oH á É ou ou no ou D-ribulose = D-xilulose
[00242] Em algumas modalidades, a D-tagatose 3-epimerase é de Pseudomonas spp. Em outra modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é de Pseudomonas cichorii. Em outra modalidade, a D-tagatose 3- epimerase é de Pseudomonas sp. ST-24. Em outra modalidade, a D- tagatose 3-epimerase é de Mesorhizobium loti. Em outra modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é de Rhodobacter sphaeroides (C1KKR1).
[00243] Em uma modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é codifica- da por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas Sp., Mesorhizobium sp. e Rhodobacter sp. Em algumas modalidades, a D-tagatose 3-epimerase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas cichorii, Pseudomonas sp. ST-24, Mesorhi- zobium loti e Rhodobacter sphaeroides. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são dte e/ou FJ851309,1 ou homólogo destas. Em uma outra modalidade, a D-tagatose 3-
epimerase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3 e 5. Em ainda uma outra modalidade, a D-tagatose 3-epimerase é codificada por um ácido nucleico sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1,2 e 4.
[00244] A D-tagatose 3-epimerase também pode ser conhecida como L-ribulose 3-epimerase ou cetose 3-epimerase. D-ribulocinase (EC 2.7.1.16)
[00245] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações: L-fuculose + ATP — L-fuculose 1-fosfato + ADP+ H* D-ribulose + ATP — D-ribulose 1-fosfato + ADP+ H*
[00246] A D-ribulocinase também pode ser conhecida como L- fuculocinase, fuculocinase, ATP: L-fuculose 1-fosfotransferase ou L- fuculose cinase.
[00247] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha papéis na via de degradação da fucose, na supervia da degradação da fucose e ramnose e/ou na via de degrada- ção da D-arabinose |.
[00248] Em algumas modalidades, a enzima pode funcionar como uma L-fucolocinase e uma D-ribulocinase, a segunda enzima das vias de degradação da L-fucose e D-arabinose, respectivamente.
[00249] Em modalidades particulares, a enzima converte D-ribulose em Dr-ribulose-1-fosfato. Em algumas modalidades, a D-ribulocinase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-ribulocinase é codi- ficada pelo gene fucK. Em uma modalidade, a D-ribulocinase é codifi- cada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico é fucK ou homólogo deste. Em uma outra modalidade, a D- ribulocinase compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8. Em ainda uma outra modalidade, a D-ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6 e 7. D-ribulose-1-fosfato aldolase (EC 4.1.2.17)
[00250] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações reversíveis: L-fuculose 1-fosfato 2 (S) -lactaldeído + di-hidroxi acetona fosfato (DHAP) D-ribulose 1-fosfato = glicolaldeído + di-hidroxi acetona fos- fato (DHAP)
[00251] A D-ribulose-1-fosfato aldolase também pode ser conhecida como L-fuculose-fosfato aldolase, L-fuculose-1-fosfato aldolase ou L- fuculose-1-fosfato (S)-lactaldeído-liase.
[00252] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha papéis na via de degradação da fucose, na supervia da degradação da fucose e ramnose e/ou na via de degrada- ção da D-arabinose |. Em uma modalidade, a enzima pode usar Zn?º* como um cofator. Em outra modalidade, um inibidor desta enzima po- de ser fosfoglicolo-hidroxamato.
[00253] Em algumas modalidades, a enzima pode funcionar como uma L-fuculose-fosfato aldolase e uma D-ribulose-fosfato aldolase, a terceira enzima das vias de degradação da L-fucose e D-arabinose, respectivamente.
[00254] A especificidade do substrato da enzima foi testada com uma preparação parcialmente purificada de uma cepa de E. coli.
[00255] As estruturas cristalinas da enzima e vários mutantes pon- tuais foram resolvidos. A combinação dos dados estruturais e da ativi- dade enzimática dos mutantes permitiu a modelagem e o refinamento do mecanismo catalítico da enzima. A seletividade enantiomérica da enzima foi estudada.
[00256] Em modalidades particulares, a enzima converte D- ribulose-1-fosfato em glicolaldeído e DHAP. Em algumas modalidades, a D-ribulose-1-fosfato aldolase é de Escherichia coli. Em algumas mo- dalidades, a D-ribulose-1-fosfato aldolase é codificada pelo gene fucA. Em uma modalidade, a D-ribulose-1-fosfato aldolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algu- mas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico é fucA ou homólogo deste. Em uma outra modalidade, a D-ribulose-1-fosfato aldolase compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em ainda outra modalidade, a D-ribulose-1-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico seleciona- da a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9 e 10. Glicolaldeído redutase (EC 1.1.1.77)
[00257] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações reversíveis: etileno glicol + NAD* 2 glicolaldeído + NADH + H* (S)-propano-1,2-diol + NAD* 2 (S)-lactaldeído + NADH + H*
[00258] A glicolaldeído redutase também pode ser conhecida como lactaldeído redutase, propanodiol oxidorredutase, (R) [ou (S)]-propano- 1,2-diol: NAD* oxidorredutase ou L-1,2-propanodiol oxidorredutase.
[00259] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha papéis na via de degradação do etileno gli- col, na super via do metabolismo e degradação do glicol, na via de de- gradação do L-lactaldeído anaeróbico e/ou na super via da degrada- ção da fucose e ramnose. Em uma modalidade, a enzima pode usar Fe?* como um cofator.
[00260] A L-1,2-propanodiol oxidorredutase é uma desidrogenase do grupo Ill dependente de ferro. Reduz anaerobicamente o L-lactal- deído, um produto das vias catabólicas da L-fucose e da L-ramnose, a L-1,2-propanodiol, que é então excretado da célula.
[00261] As estruturas cristalinas da enzima foram resolvidas, mos- trando um dímero de domínio trocado no qual o metal, o cofator e os sítios de ligação do substrato poderiam ser localizados. Um aspartato e três resíduos de histidina conservados são necessários para a liga- ção de Fe?* e a atividade enzimática.
[00262] n vitro, a enzima pode ser reativada por altas concentra- ções de NAD* e eficientemente inativada por uma mistura de Fe?** e ascorbato ou Fe?* e H2O0>2. Propõe-se que a oxidação catalisada por metal do resíduo His277 conservado seja a causa da inativação.
[00263] A expressão de FucO permite a reversão projetada em uma volta do ciclo de oxidação B. A atividade FucO contribui para a conver- são de isobutiraldeído em isobutanol em uma cepa projetada.
[00264] Em modalidades particulares, a enzima converte glicolalde- ído em MEG. Em algumas modalidades, a glicolaldeído redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído redutase é codificada pelo gene fucO. Em uma modalidade, a glicolaldeído redu- tase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de E. colie S. cerevisiae. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são seleciona- das a partir de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafB (dkgB) e/ou yqhE (dkgA) ou homólogo das mesmas. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são yghD. Em algumas modalida- des, o yghD compreende uma mutação G149E. Em uma outra modali- dade, a glicolaldeído redutase compreende uma sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma outra modalidade, a gli- colaldeído redutase é codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
Aldeído redutases
[00265] Várias redutases de aldeído podem ser usadas para con- verter glicolaldeído em MEG.
[00266] Uma aldeído redutase dependente de NADPH (YqhD) pode catalisar as seguintes reações: acetol + NADP* 2 metilglioxal + NADPH + H* (reversível, EC 1.1.1.-) um álcool + NADP* 2 um aldeído + NADPH + H* (reversibi- lidade não especificada, EC 1.1.1.2) um aldeído + NADP* + H20 — um carboxilato + NADPH + 2H*(EC1.2.14) 1,3-propanodiol + NADP* =2 3-hidroxipropionaldeído + NADPH + H* (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.-) D-3,4-di-hidroxibutanal + NADPH = 1,3,4-butanotriol + NADP"* (reversibilidade não especificada)
[00267] YaqahD é uma aldeído redutase dependente de NADPH que pode estar envolvida na desintoxicação de glioxal e/ou ser parte de uma resposta independente de glutationa à peroxidação lipídica.
[00268] Foi relatado que vários alcoóis, aldeídos, aminoácidos, açúcares e a-hidroxiácidos foram testados como substratos para YqhD. A proteína purificada apresenta apenas atividade álcool desi- drogenase dependente de NADP, com preferência por alcoóis mais longos que C (3), mas com valores de Km na faixa milimolar, sugerin- do que não sejam substratos fisiológicos. Em contraste, YqhD exibe atividade de aldeído redutase de cadeia curta com substratos como propanaldeído, acetaldeído e butanaldeído, bem como acroleína e ma- londialdeído. Em uma cepa modificada metabolicamente, fenilacetal- deído e 4-hidroxifenilacetaldeído são reduzidos a 2-feniletanol e 2-(4- hidroxifenil)etanol pelas aldeído redutases endógenas YqhD, YjgB e YahkK.
[00269] A superexpressão de YqhD aumenta a atividade da 1,3- propanodiol oxidorredutase da célula. E. coli foi projetada para expres- sar YqhD para a produção industrial de 1,3-propanodiol. A atividade YaqhD contribui para a produção de isobutanol, 1,2-propanodiol, 1.2.4- butanotriol e acetol também. A mutação de yqhD permite a produção de butanol por uma reversão projetada de uma volta do ciclo de oxida- ção B.
[00270] YqhD tem atividade furfural redutase, que parece causar inibição do crescimento devido à depleção de NADPH em cepas modi- ficadas metabolicamente que produzem álcool a partir de biomassa lignocelulósica.
[00271] A estrutura cristalina de YghD foi resolvida com resolução de 2 À. YghD é um dímero assimétrico de dímeros, e o sítio ativo con- tém um fon Zn2 +. O cofator NADPH é modificado por grupos hidroxila nas posições 5 e 6 no anel de nicotinamida.
[00272] A superexpressão de yqhD leva ao aumento da resistência a compostos reativos geradores de oxigênio, como peróxido de hidro- gênio, paraquat, cromato e telurito de potássio. Um mutante de dele- ção yghD mostra maior sensibilidade a esses compostos e ao glioxal, e contém níveis aumentados de aldeídos reativos que são gerados durante a peroxidação lipídica. Por outro lado, a deleção de yghD leva ao aumento da tolerância ao furfural.
[00273] Em modalidades particulares, uma aldeído redutase de- pendente de NADPH converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a aldeído redutase dependente de NADPH é de Escheri- Chia coli. Em algumas modalidades, a aldeído redutase dependente de NADPH é codificada pelo gene yqhD.
[00274] Uma metilglioxal redutase multifuncional (DKgA) pode cata- lisar as seguintes reações: acetol + NADP* 2 metilglioxal + NADPH + H* (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-) isobutanol + NADP* 2 isobutanal + NADPH + H* (reversibi- lidade não especificada, EC 1.1.1.-) etil-(2R)-metil-(3S)-hidroxibutanoato + NADP* 2 etil-2- metilacetoacetato + NADPH + H* (reversibilidade não especificada, EC
1.1.1.-) 2-ceto-L-gulonato + NADP* — 2,5-didesidro-D-gliconato + NADPH + H* (a reação é favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.346)
[00275] DKkgA (YqhE) pertence à família da aldo-ceto redutase (AKR) e demonstrou ter atividade da metilglioxal redutase e beta-ceto éster redutase.
[00276] O dkgA codifica uma 2,5-diceto-D-gliconato redutase (25DKGR) A, uma das duas 25DKG redutases em E. coli. A enzima usa o NADPH como o doador de elétrons preferido e acredita-se que esteja envolvida no metabolismo do cetogliconato. A atividade especí- fica da enzima em relação ao 2,5-diceto-D-gliconato é relatada como quase 1000 vezes menor do que sua atividade em relação ao metil- glioxal.
[00277] Devido ao seu baixo Km para NADPH, a redução de fura- nos por DKgA pode esgotar os pools de NADPH e, assim, limitar a bi- ossíntese celular. Uma ampla pesquisa de redutases de aldeído mos- trou que DKgA era uma das várias redutases de aldeído endógenas que contribuem para a degradação dos aldeídos produtos finais dese- jados da modificação metabólica.
[00278] Uma estrutura cristalina de DKgA foi resolvida com resolu- ção de 2,16 À.
[00279] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase multifuncional converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalida- des, a metilglioxal redutase multifuncional é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é codifi-
cada pelo gene dkgA.
[00280] Uma metilglioxal redutase multifuncional (DKgB) pode cata- lisar as seguintes reações: acetol + NADP* 2 metilglioxal + NADPH + H* (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-) álcool 4-nitrobenzílico + NADP* = 4-nitrobenzaldeído + NADPH + H* (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.91) 2-ceto-L-gulonato + NADP* — 2,5-didesidro-D-gliconato + NADPH + H* (a reação é favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.346)
[00281] DkgB (YafB) é um membro da subfamília 3F da aldo-ceto redutase (AKR). DKkgB demonstrou ter atividades de 2,5-diceto-D- gliconato redutase, metilglioxal redutase e 4-nitrobenzaldeído redu- tase.
[00282] O dkgB codifica a redutase de 2,5-diceto-D-gliconato (25DKGR) B, uma das duas redutases de 25DKG em E. coli. A enzima usa o NADPH como o doador de elétrons preferido e acredita-se que esteja envolvida no metabolismo do cetogliconato. No entanto, a ativi- dade específica da enzima em relação ao 2,5-diceto-D-gliconato é re- latada como quase 1000 vezes menor do que sua atividade em rela- ção ao metilglioxal.
[00283] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase multifuncional converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalida- des, a metilglioxal redutase multifuncional é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é codifi- cada pelo gene dkgB.
[00284] Uma metilglioxal redutase (YeaE) pode catalisar a seguinte reação: acetol + NADP* 2 metilglioxal + NADPH + H* (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-)
[00285] O YeaE demonstrou ter atividade da metilglioxal redutase.
[00286] A estrutura da subunidade de YeaE não foi determinada, mas sua similaridade de sequência de aminoácidos com as aldo-ceto redutases DKkgA (YqhE) e DKkgB (YafB) sugere que ela pode ser mo- nomérica.
[00287] Em modalidades particulares, uma redutase de metilglioxal converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metil- glioxal redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase é codificada pelo gene yeaE.
[00288] A L-gliceraldeído 3-fosfato redutase (yghZ) pode catalisar as seguintes reações: L-gliceraldeído 3-fosfato + NADPH + H* — sn-glicerol 3- fosfato + NADP* (EC 1.1.1.-) acetol + NADP* 2 metilglioxal + NADPH + H* (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-)
[00289] Yghz é uma L-gliceraldeído 3-fosfato (L-GAP) redutase. À enzima também é capaz de desintoxicar o metilglioxal em uma taxa baixa. YghZ define a família de proteínas AKR14 (aldo-ceto redutase 14).
[00290] L-GAP não é um metabólito natural e é tóxico para E. coli. L-GAP é um substrato de ambos os sistemas de transporte de glicerol- 3-fosfato e hexose fosfato de E. coli K-12. Postulou-se que o papel fi- siológico do YghZ é a desintoxicação do L-GAP, que pode ser formado por racemização não enzimática do GAP ou por um processo celular desconhecido.
[00291] A estrutura cristalina da enzima E. coli foi determinada e sugere-se que seja um tetrâmero. No entanto, outros descobriram que a proteína forma um octâmero com base em estudos de filtração em gel e microscopia eletrônica.
[00292] Em modalidades particulares, uma L-gliceraldeído 3-fosfato redutase converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a
L-gliceraldeído 3-fosfato redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a L-gliceraldeído 3-fosfato redutase é codificada pelo gene yghz.
[00293] Uma L-1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidroge- nase (GIdA) pode catalisar as seguintes reações: (S)-propano-1,2-diol + NAD* 2 acetol + NADH + H* (reação reversível) aminoacetona + NADH + H* — (R)-1-aminopropan-2-ol + NAD"* (EC 1.1.1.75) glicerol + NAD* 2 di-hidroxiacetona + NADH + H* (reação reversível, EC 1.1.1.6)
[00294] A função fisiológica da enzima GIdA há muito não é clara. À enzima foi isolada independentemente como glicerol desidrogenase e D-1-amino-2-propanol:NAD* oxidorredutase. Naquela época, pensava- se que o D-1-amino-2-propanol era um intermediário para a biossínte- se da vitamina B12 e, embora a E. coli seja incapaz de sintetizar a vi- tamina B12 de novo, procuraram-se enzimas que catalisassem a sín- tese desse composto. Posteriormente, descobriu-se que GIdA era res- ponsável por ambas as atividades.
[00295] O principal papel in vivo do GIdA foi recentemente proposto para ser a remoção da di-hidroxiacetona, convertendo-a em glicerol. No entanto, um papel duplo na fermentação do glicerol também foi re- centemente apresentado. A dissimilação do glicerol em E. coli pode ser realizada por duas vias diferentes. A via de degradação do glicerol e do glicerofosfodiéster requer a presença de um aceptor de elétrons terminal e utiliza uma cinase dependente de ATP do sistema Glp, que fosforila o glicerol em glicerol-3-fosfato. No entanto, após a inativação da cinase e seleção para crescimento em glicerol, verificou-se que uma desidrogenase ligada a NAD*, GIdA, foi capaz de suportar a fer- mentação de glicerol. Recentemente, foi demonstrado que o GIdA es-
tava envolvido na fermentação do glicerol tanto como glicerol desidro- genase, produzindo di-hidroxiacetona, e como 1,2-propanodiol desi- drogenase, regenerando NAD* pela produção de 1,2-propanodiol a partir do acetol.
[00296] A enzima é encontrada em duas formas cataliticamente ati- vas, uma grande forma de oito subunidades e uma pequena forma de duas subunidades. A forma grande parece ser a espécie principal.
[00297] Em modalidades particulares, uma L-1,2-propanodiol desi- drogenase/glicerol desidrogenase converte o glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a L-1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a L- 1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase é codificada pe- lo gene gldA.
[00298] Uma metilglioxal redutase dependente de NADPH (GRE2) de Saccharomyces cerevisiae pode catalisar as seguintes reações: (S)-lactaldeído + NADP* 2 metilglioxal + NADPH 3-metilbutanol + NAD(P)* 2 3-metilbutanal + NAD(P)H
[00299] Gre2 é uma enzima versátil que catalisa a redução estere- osseletiva de uma ampla gama de substratos, incluindo cetonas alifáti- cas e aromáticas, dicetonas, bem como aldeídos, usando NADPH co- mo cofator.
[00300] As estruturas cristalinas de Gre2 de S. cerevisiae em uma forma apo a 2,00À e a forma complexada por NADPH a 2,40À de reso- lução foram resolvidas. Gre2 forma um homodímero, cada subunidade do qual contém um domínio N-terminal de duplicação de Rossmann e um domínio C-terminal variável, que participa do reconhecimento do substrato. O ajuste induzido após a ligação ao cofator NADPH faz com que os dois domínios se desloquem um em direção ao outro, produ- zindo uma fenda interdomínio que se ajusta melhor ao substrato. À simulação computacional combinada com mutagênese direcionada ao sítio e análise de atividade enzimática permitiu a caracterização de um bolso de ligação ao substrato potencial que determina a estereossele- tividade estrita do substrato para catálise.
[00301] Gre2 catalisa a redução irreversível do composto citotóxico metilglioxal (MG) a (S)-lactaldeído como alternativa à desintoxicação de MG pela glioxalase | GLO1. O MG é sintetizado por meio de um desvio da glicólise a partir do fosfato de di-hidroxiacetona e acredita-se que desempenhe um papel na regulação do ciclo celular e na adapta- ção ao estresse. GRE2 também catalisa a redução de isovaleraldeído em álcool isoamílico. A enzima serve para suprimir a filamentação in- duzida pelo álcool isoamílico ao modular os níveis de isovaleraldeído, oO sinal ao qual as células respondem por filamentação. GRE2 também está envolvido no metabolismo do ergosterol.
[00302] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase dependente de NADPH converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase dependente de NADPH é de S. cerevisiae. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase depen- dente de NADPH é codificada pelo gene GRE2. Tiolase/Acetil coenzima A acetiltransferase (EC 2.3.1.9)
[00303] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: 2 acetil-CoA 2 acetoacetil-CoA + coenzima A (reação re- versível) Tiolase/Acetil coenzima A acetiltransferase também pode ser conhecida como acetil-CoA-C-acetiltransferase, acetoacetil-CoA tiolase, acetil-CoA:acetil-CoA C-acetiltransferase ou tiolase |l.
[00304] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha um papel na degradação do acetoacetato (em acetil CoA). Em uma modalidade, um inibidor desta enzima pode ser acetoacetil-CoA.
[00305] Em modalidades particulares, a enzima converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coen- zima A acetiltransferase é de Clostridium spp. Em algumas modalida- des, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é de Clostridium ace- tobutylicum. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é de Clostridium thermosaccharolyticum. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é de Baci- llus cereus. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coenzima A ace- tiltransferase é de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é codificada pelo gene thlA. Em algumas modalidades, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é de Escherichia coli. Em algumas moda- lidades, a tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase é codificada pelo gene atoB.
[00306] Em uma modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetil- transferase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que con- siste em Clostridium sp., Bacillus sp., E. coli, Saccharomyces sp.e Ma- rinobacter sp. Em algumas modalidades, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que con- siste em Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosaccharolyti- cum, Bacillus cereus, E. coli, Saccharomyces cerevisiae e Marinobac- ter hydrocarbonoclasticus. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são thlA, atoB e/ou ERG10, ou homólogo destas. Em uma outra modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A ace- tiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 35, 37 e 40. Em ainda uma outra modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por um sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 33, 34, 36, 38 e 39. Acetato:Acetoacetil-CoA transferase (EC 2.8.3.-)
[00307] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: acetoacetato + acetil-CoA = acetoacetil-CoA + acetato (re- ação reversível, EC 2.8.3.-)
[00308] —Acetato:Acetoacetil-CoA transferase também pode ser co- nhecida como acetoacetil-CoA transferase ou acetil-CoA:acetoacetato- CoA transferase.
[00309] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha um papel na degradação do acetoacetato (em acetil CoA). Em uma modalidade, os inibidores desta enzima po- dem incluir acetil-CoA e coenzima A.
[00310] O crescimento de E. coli em ácidos graxos de cadeia curta (C3-C6) requer a ativação dos ácidos em seus respectivos tioésteres. Esta ativação é catalisada pela acetoacetil-CoA transferase. A reação ocorre em duas semirreações que envolvem uma enzima-CoA cova- lente. A enzima sofre duas mudanças conformacionais detectáveis durante a reação. É provável que a reação ocorra por um mecanismo de pingue-pongue. A enzima pode utilizar uma variedade de substra- tos de ácido carboxílico e acil-CoA de cadeia curta, mas exibe ativida- de máxima com substratos normais e 3-ceto.
[00311] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoace- ti-CoA em acetoacetato. Em algumas modalidades, a aceta- to:acetoacetil-CoA transferase é de Clostridium spp. Em algumas mo- dalidades, a acetato:acetoacetil-CoA transferase é de Clostridium ace- tobutylicum. Em algumas modalidades, a acetato:acetoacetil-CoA transferase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a aceta- to:acetoacetil-CoA transferase é codificado pelos genes atoA e atoD. Em outra modalidade, a composição da subunidade de acetoacetil-
CoA transferase é [(AtoA)2][(AtoD)2], com (AtoA)2 sendo o complexo B e (AtoD): sendo o complexo a. Em uma modalidade, a aceta- to:acetoacetil-CoA transferase é um acetato fundido: acetoacetil-CoA transferase: subunidade a/subunidade B. Em outra modalidade, a ace- tato:acetoacetil-CoA transferase é codificado pelo gene ydiF. Acetato:Acetoacetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.11)
[00312] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: acetoacetil-CoA + H20 2CoA + acetoacetato
[00313] A acetoacetil-CoA hidrolase também pode ser conhecida como acetoacetil coenzima A hidrolase, acetoacetil CoA desacilase ou acetoacetil coenzima A desacilase.
[00314] Esta enzima pertence à família das hidrolases, especifica- mente aquelas que atuam nas ligações tioéster.
[00315] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoace- ti-CoA em acetoacetato. Em algumas modalidades, a aceta- to:acetoacetil-CoA hidrolase é de Clostridium spp. Em algumas moda- lidades, a acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é de Clostridium acetobu- tylicum. Em outra modalidade, a Acetoacetil-CoA hidrolase é codifica- da pelos genes ctfA (subunidade A) e/ou ctfB (subunidade B).
[00316] Em uma outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 43, 46, 97, 99, 101 e 103. Ainda uma outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico seleciona- da a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 41, 42, 44, 45, 96, 98, 100 e 102. Acetoacetato descarboxilase (EC 4.1.1.4)
[00317] A presente descrição descreve enzimas que podem catali-
sar a seguinte reação: acetoacetato + H* — acetona + CO,
[00318] A acetoacetato descarboxilase também pode ser conhecida como ADC, AADC ou acetoacetato carboxiliase.
[00319] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha papéis na biossíntese de isopropanol, fer- mentação de piruvato em acetona, a supervia de fermentação acido- gênica e solvogênica de Clostridium acetobutylicum e/ou a supervia de fermentação solventeogênica de Clostridium acetobutylicum.
[00320] —Acetoacetato descarboxilase (ADC) desempenha um papel fundamental na produção de solventes em Clostridium acetobutylicum. Durante a fase acidogênica de crescimento, os ácidos se acumulam causando uma mudança metabólica para a produção de solventes. Nesta fase, os ácidos são re-assimilados e metabolizados para produ- Zir acetona, butano!l e etanol.
[00321] A purificação e cristalização preliminares da enzima revela- ram que um resíduo de lisina está implicado no sítio ativo. A enzima é um grande complexo composto por 12 cópias de um único tipo de su- bunidade.
[00322] A enzima de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi puri- ficada e o gene adc que a codifica clonado. A enzima também foi puri- ficada a partir da cepa relacionada Clostridium acetobutylicum DSM 792 e o gene clonado e sequenciado. A reação de descarboxilação prossegue pela formação de um intermediário de base de Schiff.
[00323] ADC é uma enzima chave na absorção de ácido, puxando efetivamente a reação da CoA-transferase na direção da formação do acetoacetato.
[00324] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoace- tato em acetona. Em algumas modalidades, a acetoacetato descarbo- xilase é de Clostridium spp. Em algumas modalidades, a acetoacetato descarboxilase é de Clostridium acetobutylicum. Em algumas modali- dades, a acetoacetato descarboxilase é de Clostridium beijerinckii. Em algumas modalidades, a acetoacetato descarboxilase é de Clostridium cellulolyticum. Em algumas modalidades, a acetoacetato descarboxila- se é de Bacillus polymyxa. Em algumas modalidades, a acetoacetato descarboxilase é de Chromobacterium violaceum. Em algumas moda- lidades, a acetoacetato descarboxilase é de Pseudomonas putida. Em outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada pelo ge- ne adc.
[00325] Em uma modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codi- ficada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Clostridium Sp., Bacillus sp., Chromobacterium sp. e Pseudomonas sp. Em outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganis- mo selecionado do grupo que consiste em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa, Chromobacterium violaceum e Pseudomonas putida. Em algumas mo- dalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a acetoacetato descarboxilase é ade ou homólogo desta. Em uma outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 49 e 52. Em ainda outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico se- lecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e
51. Álcool Desidrogenase (EC 1.1.1.-)
[00326] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a oxidação reversível de alcoóis primários ou secundários em alde- ídos ou cetonas, respectivamente. Em uma modalidade, a enzima é uma álcool desidrogenase secundária (S-ADH) e catalisa a redução de cetonas, como acetona, em alcoóis secundários, como 2-propanol (isopropanol).
[00327] Em algumas modalidades, o S-ADH é de Burkholderia sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Burkholderia sp. AIU 652. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Alcaligenes sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Alcaligenes eutrophus. Em algumas mo- dalidades, o S-ADH é de Clostridium sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Clostridium ragsdalei. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Clostridium beijerinckii. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter brockii. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter ethanolicus (Clostridium thermohydrosulfuricum). Em algumas modalidades, o S-ADH é codificado pelo gene adhB. Em algumas modalidades, o S-ADH é do tripanosomatídeo Phytomonas Sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Rhodococcus sp. Em al- gumas modalidades, o S-ADH é de Rhodococcus ruber. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Methanobacterium palustre. Em algumas modalidades, o S-ADH é de arqueia metanogênica Methanogenium liminatans. Em algumas modalidades, o S-ADH é do protista parasita Entamoeba histolytica (EDAdh1). Em algumas modalidades, o S-ADH é do protozoário parasita Tritrichomonas fetus. Em algumas modalida- des, o S-ADH é do parasita humano Trichomonas vaginalis.
[00328] Em algumas modalidades, o S-ADH é previsto a partir da homologia e pode ser de Thermoanaerobacter mathranii, Micrococcus luteus, Nocardiopsis alba, Mycobacterium hassiacum, Helicobacter suis, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, Candida metapsffilosis, Scheigera cesfilosis e Scheigia stiacaviosis.
[00329] Em uma outra modalidade, a álcool desidrogenase com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 106 e 108. Em ainda outra modalidade, a álcool desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 104, 105 e 107. Desidratase (EC 4.2.1.-)
[00330] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações: isopropanol 2 propeno + H20 D-xilulose 1-cinase (EC 2.7.1.-)
[00331] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a conversão de D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato. Em algumas modalidades, a conversão pode ser catalisada por uma ceto- hexocinase C humana (khk-C), também conhecida como frutocinase.
[00332] A ceto-hexocinase, ou frutocinase, fosforila a frutose em frutose-1-fosfato. A enzima está envolvida no metabolismo da frutose, que faz parte do metabolismo dos carboidratos. Pode ser encontrada no fígado, intestino e córtex dos rins.
[00333] No fígado humano, a frutocinase purificada, quando aco- plada à aldolase, contribui para um mecanismo alternativo de produ- ção de oxalato a partir do xilitol. Na sequência acoplada, a frutocinase e a aldolase produzem glicolaldeído, um precursor do oxalato, a partir da D-xilulose via D-xilulose 1-fosfato.
[00334] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato. Em algumas modalidades, a D-xilulose 1- cinase é uma ceto-hexocinase C. Em algumas modalidades, a ceto- hexocinase C é de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a ceto- hexocinase C humana é codificada pelo gene khk-C.
[00335] Em uma modalidade, a D-xilulose 1-cinase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas do Homo sapiens. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose 1-cinase é ceto-hexocinase C (Kkhk-C) ou homólogo desta. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose 1-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55. Em uma outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que co- dificam a D-xilulose 1-cinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 53 e 54. D-xilulose-1-fosfato aldolase (EC 4.1.2.-)
[00336] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a conversão de D-xilulose-1-fosfato em glicolaldeído e DHAP. Em algumas modalidades, a conversão pode ser catalisada por uma aldo- lase B humana, que também é conhecida como frutose-bisfosfato al- dolase B ou aldolase do tipo de fígado.
[00337] A aldolaseB é uma das três isoenzimas (A, B e C) da en- zima frutose 1,6-bifosfato aldolase classe | (EC 4.1.2.13) e desempe- nha um papel chave na glicólise e na gliconeogênese. A enzima fruto- se 1,6-bisfosfato aldolase genérica catalisa a clivagem reversível da frutose 1,6-bifosfato (FBP) em gliceraldeído 3-fosfato e di-hidroxiace- tona fosfato (DHAP), bem como a clivagem reversível de frutose 1- fosfato (F1P) em gliceraldeído e fosfato de di-hidroxiacetona. Em ma- miíferos, a aldolase B é expressa preferencialmente no fígado, enquan- to a aldolase A é expressa no músculo e eritrócitos e a aldolase C é expressa no cérebro. Ligeiras diferenças na estrutura da isozima resul- tam em atividades diferentes para as duas moléculas de substra- to:FBP e frutose 1-fosfato. A aldolase B não exibe preferência e, por- tanto, catalisa ambas as reações, enquanto as aldolases A e C prefe- rem FBP.
[00338] AldolaseB é uma enzima homotetramérica, composta por quatro subunidades. Cada subunidade tem um peso molecular de 36 kDa e contém um cilindro a/B de oito fitas, que envolve a lisina 229 (o aminoácido formador de base de Schiff que é a chave para a catálise).
[00339] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilulose- 1-fosfato em glicolaldeído e DHAP. Em algumas modalidades, a D- xilulose-1-fosfato aldolase é uma aldolase B. Em algumas modalida- des, a aldolase B é de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a aldolase B humana é codificada pelo gene ALDOB:.
[00340] Em uma modalidade, a D-xilulose-1-fosfato aldolase é codi- ficada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas do Homo sapiens. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldolase é a aldolase B (ALDOB) ou homólogo desta. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldo- lase compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a D-xilulose-1-fosfato aldolase é codifica- da por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56 e 57. D-xilose isomerase (EC 5.3.1.5)
[00341] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação reversível: D-xilopiranose 2 D-xilulose
[00342] A D-xilose isomerase também pode ser conhecida como xilose isomerase ou D-xilose cetol-isomerase.
[00343] Assim, em algumas modalidades, a descrição fornece uma enzima que desempenha um papel na degradação da xilose.
[00344] A xiloseisomerase catalisa a primeira reação no catabolis- mo da D-xilose.
[00345] Dois resíduos conservados de histidina, H101 e H271, mos- traram-se essenciais para a atividade catalítica. A fluorescência de dois resíduos de triptofano conservados, W49 e W188, é extinta duran- te a ligação da xilose, e W49 mostrou ser essencial para a atividade catalítica. A presença de Mg?*, Mn?* ou Co?* protege a enzima da des- naturação térmica.
[00346] A composição da subunidade não foi apresentada experi- mentalmente.
[00347] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilose em D-xilulose. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é codificada pelo gene xylA.
[00348] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante que produz MEG e um composto de três carbonos compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma D-xilose isomerase para evitar a conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desviar a reação em direção à conver- são de D-xilose em D-xilonato.
[00349] Em uma modalidade, o microrganismo recombinante com- preende uma xilose isomerase endógena ou exógena que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a xilose isomerase é exógena. Em outra modalidade, a xilose isomerase é co- dificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pyromyces sp. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase é xylA ou homólogo desta. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95. Em uma outra modali- dade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose isomerase são codificadas por um sequência de ácido nucleico seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 93 e 94.
D-xilulose-5-cinase/xilulocinase
[00350] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações: D-xilulose + ATP — D-xilulose 5-fosfato + ADP+ H* (EC
2.7.1.17) ATP + 1-desóxi-D-xilulose — 1-desóxi-D-xilulose 5-fosfato + ADP+ H* (EC 2.7.1.-)
[00351] A D-xilulose-5-cinase também pode ser conhecida como xilulose cinase ou xilulocinase.
[00352] A xilulocinase catalisa a fosforilação da D-xilulose, a se- gunda etapa na via de degradação da xilose, produzindo D-xilulose-5- fosfato, um intermediário da via da pentose fosfato.
[00353] Na ausência de substrato, a xilulocinase tem atividade ATPase fraca. A xilulocinase também pode catalisar a fosforilação de 1-desóxi-D-xilulose. Isso permitiria uma via de resgate potencial para a geração de 5-fosfato de 1-desóxi-D-xilulose para uso na biossíntese de terpenoides, tiamina e piridoxal. A taxa de fosforilação de 1-desóxi- D-xilulose é 32 vezes menor do que a taxa de fosforilação de D- xilulose.
[00354] O mecanismo cinético da enzima bacteriana foi estudado, sugerindo um mecanismo de reação predominantemente ordenado. À enzima sofre mudanças conformacionais significativas após a ligação do substrato e do ATP. Dois resíduos de aspartato conservados, D6 e D233, foram considerados essenciais para a atividade catalítica, e um mecanismo catalítico foi proposto.
[00355] As estruturas de cristal da xilulocinase bacteriana na forma apo e ligada à D-xilulose foram determinadas com resolução de 2,7 e 2,1 À, respectivamente.
[00356] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-
cinase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5- cinase é codificada pelo gene xylB. Em algumas modalidades, a D- xilulose-5-cinase é de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas moda- lidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo gene XKS1. Em algu- mas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é de Pichia stipitis. Em algu- mas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo gene XYL3.
[00357] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante que produz MEG e um composto de três carbonos compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma D-xilulose-5-cinase para evitar a conversão de D-xilulose em D-xilulose -5-fosfato e, em vez disso, desviar a reação em direção à conversão de D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato. Xilose desidrogenase (EC 1.1.1.175 ou EC 1.1.1.179)
[00358] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações: aldeído-D-xilose + NAD* + H20 — D-xilonato + NADH + 2 H* a-D-xilopiranose + NAD* 2 D-xilonolactona + NADH + H* (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.175)
[00359] A xilose desidrogenase também pode ser conhecida como D-xilose desidrogenase, D-xilose 1-desidrogenase, (NAD*)-D-xilose desidrogenase ligada, NAD*-D-xilose desidrogenase, D-xilose: NAD* 1-oxidorredutase
[00360] A D-xilose desidrogenase catalisa a oxidação dependente de NAD* da D-xilose em D-xilonolactona. Esta é a primeira reação na via oxidativa e não fosforilativa para a degradação da D-xilose em Caulobacter crescentus. Essa via é semelhante à via de degradação da L-arabinose em Azospirillum brasilense. A sequência de aminoáci- dos da enzima C. crescentus não está relacionada à da xilose desi- drogenase do archaeon Haloarcula marismortui, ou L-arabinose 1- desidrogenase do Azospirillum brasilense.
[00361] A D-xilose é o substrato preferido para a D-xilose desidro- genase recombinante de Caulobacter crescentus. A enzima pode usar L-arabinose, mas é um substrato mais pobre. O Km para L-arabinose é 166 mM. Outros substratos como D-arabinose, L-xilose, D-ribose, D- galactose, D-glicose e D-glicose-6-fosfato mostraram pouca ou ne- nhuma atividade no ensaio, conforme medido pela produção de NADH. A D-xilose desidrogenase de C. crescentus pode converter a D-xilose em D-xilonato diretamente.
[00362] Parcialmente purificada, a D-xilose desidrogenase nativa de C. crescentus tinha um Km de 70 uM para a D-xilose. Este valor foi inferior ao Km de 760 UM para a enzima marcada com His recombi- nante.
[00363] Em algumas modalidades, a D-Xilose desidrogenase é do archaeon halofílico Haloferax volcanii. A D-Xilose desidrogenase de Haloferax volcanii catalisa a primeira reação na via de degradação oxidativa da xilose do archaeon halofílico Haloferax volcanii. A D- Xilose desidrogenase de H. volcanii mostra 59 % de identidade de se- quência de aminoácidos com uma xilose desidrogenase funcionalmen- te caracterizada de Haloarcula marismortui e 56 % de identidade a um ortólogo em Halorubrum lacusprofundi, mas é apenas 11 % idêntica à bacteriana xilose desidrogenase dependente de NAD+ de Caulobacter crescentus CB15.
[00364] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilose em D-xilonolactona. Em algumas modalidades, a D-Xilose desidroge- nase é de Caulobacter crescentus. Em algumas modalidades, a D- Xilose desidrogenase é codificada por um gene xylB. Em algumas mo- dalidades, a D-Xilose desidrogenase é de Haloferax volcanii. Em al- gumas modalidades, a D-Xilose desidrogenase é de Haloarcula ma- rismortui. Em algumas modalidades, a D-Xilose desidrogenase é de Halorubrum lacusprofundi. Em algumas modalidades, a D-Xilose desi-
drogenase é codificada por um gene xdh.
[00365] Em uma modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrga- nismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter sp., Haloar- cula sp., Haloferax sp., Halorubrum sp. e Trichoderma sp. Em outra modalidade, a xilose desidrogenase é codificada por uma ou mais mo- léculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter crescentus, Haloarcula marismor- tui, Haloferax volcanii, Halorubrum lacusprofundi e Trichoderma reesei. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase são selecionadas de xylB, xdh1 (HVO B0028) e/ou xyd1, ou homólogo dos mesmos. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilose desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 61, 63 e
65. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a xilose desidrogenase é codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59, 60, 62 e 64. Xilonolactonase (3.1.1.68)
[00366] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: D-xilono-1,4-lactona + H2O — D-xilonato
[00367] Esta enzima pertence à família das hidrolases, especifica- mente aquelas que atuam nas ligações de éster carboxílico. Esta en- zima participa das interconversões de pentose e glicuronato.
[00368] A xilonolactonase também pode ser conhecida como D-xi- lonolactonase, xilono-1,4-lactonase, xilono-gama-lactonase ou D-xilo- no-1,4-lactona lactono-hidrolase.
[00369] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilono-
lactona em D-xilonato. Em algumas modalidades, a D-xilonolactonase é de Haloferax sp. Em algumas modalidades, a D-xilonolactonase é de Haloferax volcanii. Em algumas modalidades, a D-xilonolactonase é de Haloferax gibbonsii. Em algumas modalidades, a D-xilonolactonase é de Caulobacter crescentus. Em algumas modalidades, a D-xilonolacto- nase é codificada pelo gene xylC.
[00370] Em uma modalidade, a xilonolactonase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganis- mo selecionado de Caulobacter sp. e Haloferax sp. Em outra modali- dade, a xilonolactonase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter crescentus, Haloferax volcanii e Haloferax gibbonsii. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de áci- do nucleico que codificam a xilonolactonase é xylIC ou homólogo des- te. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que codificam a xilonolactonase compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 67. Em ainda outra mo- dalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonolactonase são codificadas por um ácido nucleico sequência apresentada na SEQ ID NO: 66. Xilonato desidratase (EC 4.2.1.82)
[00371] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: D-xilonato — 2-ceto-3-desóxi-D-xilonato + H2O
[00372] Esta enzima pertence à família das liases, especificamente as hidro-liases, que clivam as ligações carbono-oxigênio. Esta enzima participa das interconversões de pentose e glicuronato.
[00373] A xilonato desidratase também pode ser conhecida como D-xilonato hidro-liase, D-xilo-aldonato desidratase ou D-xilonato desi- dratase.
[00374] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilonato em 2-ceto-3-desóxi-D-xilonato. Em algumas modalidades, a xilonato desidratase é de Caulobacter crescentus. Em algumas modalidades, a xilonato desidratase é codificada pelo gene xyID. Em algumas modali- dades, a xilonato desidratase é de Escherichia coli. Em algumas mo- dalidades, a xilonato desidratase é codificada pelo gene yjhG. Em al- gumas modalidades, a xilonato desidratase é codificada pelo gene yagF. Em algumas modalidades, a xilonato desidratase é de Haloferax volcanii. Em algumas modalidades, a xilonato desidratase é codificada pelo gene xad. Em algumas modalidades, a xilonato desidratase é de Sulfolobus solfataricus.
[00375] Em uma modalidade, a xilonato desidratase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrga- nismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter sp., Sulfolo- bus sp. e E. coli. Em outra modalidade, a xilonato desidratase é codifi- cada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um mi- crorganismo selecionado do grupo que consiste em Caulobacter cres- centus, Sulfolobus solfataricus e E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato de- sidratase são selecionadas de xylD, yjhG e/ou yagF, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase compreendem uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 69, 72 e 75. Em ainda outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilonato desidratase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 68, 70, 71,73 e 74. 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase (4.1.2.28)
[00376] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação:
2-desidro-3-desóxi-D-pentonato = glicolaldeído + piruvato (reversibilidade não especificada)
[00377] Esta enzima pertence à família das liases, especificamente as aldeído-liases, que clivam as ligações carbono-carbono. Esta enzi- ma participa das interconversões de pentose e glicuronato.
[00378] 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase também pode ser co- nhecido como 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato glicolaldeído-liase (for- mador de piruvato), 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato aldolase, ácido 3- desóxi-D-pentulosônico aldolase e 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato gli- colaldeído-liase.
[00379] YjhH parece ser uma 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato aldo- lase. A evidência genética sugere que o YagE também pode funcionar como uma 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato aldolase. yagE é parte do profago CP4-6.
[00380] “Um mutante duplo yjhH yagE não pode usar D-xilonato co- mo única fonte de carbono e os extratos celulares crus não contêm atividade de 2-desidro-3-desóxi-D-pentonato aldolase. Ambos os fenó- tipos são complementados pelo fornecimento de yjhnH em um plasmí- deo.
[00381] —ArcA parece ativar a expressão do gene yjhH sob anaero- biose. Dois supostos sítios de ligação ArcA foram identificados 211 e 597 pb a montante deste gene, mas nenhum promotor a montante de- le foi identificado.
[00382] A estrutura cristalina de YagE sugere que a proteína é um homotetrâmero. Estruturas de cocristal de YagE na presença de pi- ruvato e 2-ceto-3-desoxigalactonato foram resolvidas.
[00383] Em modalidades particulares, a enzima converte 2-ceto-3- desóxi-xilonato em glicolaldeído e piruvato. Em algumas modalidades, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é de Pseudomonas sp. Em algumas modalidades, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é de
Escherichia coli Em algumas modalidades, a 2-ceto-3-desóxi-D- pentonato aldolase é codificada pelo gene yjhH. Em algumas modali- dades, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada pelo gene yagE.
[00384] Em uma modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldo- lase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um microrganismo selecionado de Pseudomonas sp. e E. coli. Em outra modalidade, a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase são selecionadas de yjhH e/ou yagE, ou homólogo das mesmas. Em uma outra modalida- de, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a 2-ceto- 3-desóxi-D-pentonato aldolase compreendem uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 78 e 81. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de áci- do nucleico que codificam a 2-ceto-3-desóxi-D-pentonato aldolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 76, 77, 79 e 80. Glicolaldeído desidrogenase (1.2.1.21)
[00385] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: glicolaldeído + NAD* + H2O —& glicolato + NADH + 2 H*
[00386] Esta enzima pertence à família das oxidorredutases, espe- cificamente aquelas que atuam no grupo aldeído ou oxo do doador com NAD* ou NADP"* como aceptor. Esta enzima participa do metabo- lismo do glioxilato e dicarboxilato.
[00387] A glicolaldeído desidrogenase também pode ser conhecida como glicolaldeído: NAD* oxidorredutase ou glicol aldeído desidroge- nase.
[00388] Em £E.coli,aaldeído desidrogenase A (AIldA) é uma enzima de especificidade de substrato relativamente ampla para pequenos substratos de a-hidroxialdeído. Portanto, é utilizado em várias vias me- tabólicas.
[00389] A L-fucose e a L-ramnose são metabolizadas por vias para- lelas que convergem após suas reações de aldolase correspondentes produzindo os mesmos produtos: fosfato de di-hidroxiacetona e L- lactaldeído. Aerobicamente, a aldeído desidrogenase A oxida L- lactaldeído em L-lactato.
[00390] Em vias paralelas utilizando as mesmas enzimas, a D- arabinose e a L-xilose podem ser metabolizadas em di-hidroxiacetona fosfato e glicolaldeído, que é oxidado em glicolato pela aldeído desi- drogenase A.
[00391] Estruturas cristalinas da enzima sozinhas e em complexos ternários e binários foram resolvidas.
[00392] A aldeído desidrogenase A está presente apenas em con- dições aeróbias e é mais altamente induzida pela presença de fucose, ramnose ou glutamato. A enzima é inibida pelo NADH, que pode atuar como um interruptor para mudar da oxidação do lactaldeído para sua redução pela oxidorredutase de propanodiol. A AIdA é regulada positi- vamente durante a adaptação de curto prazo à limitação da glicose.
[00393] Com base na similaridade de sequência, foi previsto que AIdA fosse uma succinato-semialdeído desidrogenase.
[00394] A regulação da expressão de aldA foi investigada. O gene é regulado pela repressão catabólica, repressão sob condições anaeró- bias via ArcA e indução pela fonte de carbono.
[00395] Em modalidades particulares, a enzima converte glicolalde- ido em glicolato. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidroge- nase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é codificada pelo gene aldA.
[00396] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante que produz MEG e um composto de três carbonos compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma glicolaldeído desidrogenase para prevenir a produção de ácido glicólico a partir de glicolaldeído e, em vez disso, desviar a rea- ção para a conversão de glicolaldeído em MEG. Lactato desidrogenase (1.1.1.28)
[00397] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: (R)-lactato + NAD* — piruvato + NADH + H*
[00398] A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima encontrada em quase todas as células vivas, como em animais, plantas e proca- riotos. A LDH catalisa a conversão de lactato em ácido pirúvico e vice- versa, pois converte NADH em NAD'* e vice-versa. A desidrogenase é uma enzima que transfere um hidreto de uma molécula para outra.
[00399] A LDH existe em quatro classes distintas de enzimas. À mais comum é a L-lactato desidrogenase dependente de NAD(P). Ou- tras LDHs atuam no D-lactato e/ou são dependentes do citocromo c: D-lactato desidrogenase (citocromo) e L-lactato desidrogenase (cito- cromo).
[00400] A LDH tem importância médica porque é amplamente en- contrado nos tecidos do corpo, como células sanguíneas e músculo cardíaco. Por ser liberado durante o dano ao tecido, é um marcador de lesões e doenças comuns, como insuficiência cardíaca.
[00401] A lactato desidrogenase também pode ser conhecida como ácido lático desidrogenase, (R)-lactato:NAD* oxidorredutase ou D- lactato desidrogenase - fermentativa.
[00402] EmE. coli, a lactato desidrogenase (LdhA) é uma lactato desidrogenase (LDH) ligada a NAD solúvel que é específica para a produção de D-lactato. LdhA é um homotetrâmero e mostra cooperati-
vidade homotrópica positiva em condições de pH mais alto.
[00403] E. colicontém duas outras lactato desidrogenases: D- lactato desidrogenase e L-lactato desidrogenase. Ambos são flavopro- teínas associadas à membrana, necessárias para o crescimento aeró- bio com lactato.
[00404] —LdhA está presente em condições aeróbias, mas é induzida quando E. coli é cultivada em uma variedade de açúcares em condi- ções anaeróbicas em pH ácido. Ao contrário da maioria dos genes en- volvidos na respiração anaeróbica, o IdhA não é ativado por Fnr; em vez disso, o sistema ArcAB e vários genes envolvidos no controle do metabolismo de carboidratos (csrAB e mlc) parecem regular a expres- são. A expressão de IdhA é afetada negativamente pelo regulador transcricional ArcA. IdhA pertence ao regulon 032.
[00405] O gene IdhA é um alvo frequente para mutações na modifi- cação metabólica, na maioria das vezes para eliminar a produção de produtos colaterais indesejáveis da fermentação, mas também para produzir especificamente D-lactato.
[00406] Em modalidades particulares, a enzima converte piruvato em lactato. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene IdhA.
[00407] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante que produz MEG e um composto de três carbonos compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma lactato desidrogenase para evitar a produção de lactato a partir de piruvato e, em vez disso, desviar a reação para a produção de um composto de três carbonos. Xilose redutase ou aldose redutase (EC 1.1.1.21)
[00408] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar as seguintes reações:
a-D-xilose + NADPH + H* & xilitol + NADP um alditol + NAD(P)* — NAD(P)H + aldose
[00409] A aldose redutase também pode ser conhecida como aldi- tol: NAD(P)* 1-oxidorredutase, poliol desidrogenase ou aldeído redu- tase.
[00410] —Aldose redutase é uma oxidorredutase citosólica que catali- sa a redução de uma variedade de aldeídos e carbonilas, incluindo monossacarídeos.
[00411] — Aldose redutase pode ser considerada uma enzima prototí- pica da superfamília de enzimas aldo-ceto redutase. A enzima com- preende 315 resíduos de aminoácidos e duplicações em um motivo estrutural do cilindro B/a composto por oito fitas B paralelas. Fios adja- centes são conectados por oito segmentos periféricos em hélice a cor- rendo antiparalelos à folha E. O sítio ativo catalítico está situado no núcleo do cilindro. O cofator NADPH está situado no topo do cilindro B/a, com o anel de nicotinamida projetando-se para baixo no centro do cilindro e o pirofosfato estendendo-se pela borda do cilindro.
[00412] O mecanismo de reação da aldose redutase na direção da redução do aldeído segue uma via sequencial ordenado onde o NADPH se liga, seguido pelo substrato. A ligação de NADPH induz uma mudança conformacional (Enzima-NADPH -> Enzima*-NADPH) que envolve o movimento tipo articulação de um loop de superfície (resíduos 213-217) de modo a cobrir uma porção do NADPH de uma maneira semelhante à de um cinto de segurança. O produto álcool é formado por meio de uma transferência do hidreto pró-R do NADPH para a superfície do carbono carbonílico do substrato. Após a libera- ção do produto álcool, outra alteração conformacional ocorre (E*“NAD(P)* -> E-NAD(P)+) para liberar NADP*. Estudos cinéticos demonstraram que a reorientação desta alça para permitir a liberação de NADP"* parece representar a etapa limitante da taxa na direção da redução do aldeído. Como a taxa de liberação da coenzima limita a taxa catalítica, pode-se veja que a perturbação das interações que es- tabilizam a ligação da coenzima pode ter efeitos dramáticos na veloci- dade máxima (Vmax).
[00413] “Demonstrou-se que Pichia stipitis e Candida shehatae que fermentam D-xilose produzem uma única aldose redutase (ALR) que é ativa tanto com NADPH quanto com NADH. Outras leveduras, como Pachysolen tannophilus e C. tropicalis, sintetizam múltiplas formas de ALR com diferentes especificidades de coenzima. A significativa espe- cificidade de coenzima dupla distingue as enzimas P. stipitis e C. Sshehatae da maioria das outras ALRs até agora isoladas de fontes de mamíferos ou microbianas. A levedura Candida tenuis CBS 4435 pro- duz atividades redutoras de aldeído ligado a NADH e NADPH durante o crescimento em D-xilose.
[00414] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilose em xilitol. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redu- tase é de Hypocrea jecorina. Em algumas modalidades, a xilose redu- tase ou aldose redutase é codificada por um gene xyl1. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Saccha- romyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é codificada por um gene GRE3. Em algumas modali- dades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Pachysolen tan- nophilus. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redu- tase é de Pichia sp. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Pichia stipitis. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Pichia quercuum. Em algumas mo- dalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Candida sp. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Can- dida shehatae. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Candida tenuis. Em algumas modalidades, a xilose re-
dutase ou aldose redutase é de Candida tropicalis. Em algumas moda- lidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Aspergillus niger. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Neurospora crassa. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose redutase é de Cryptococcus lactativorus.
[00415] Em algumas modalidades, a xilose redutase ou aldose re- dutase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obti- das a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Hypocrea sp., Scheffersomyces sp., Saccharomyces sp., Pachyso- len sp., Pichia sp., Candida sp., Aspergillus sp., Neurospora sp. e Cryptococcus sp. Em algumas modalidades, a xilose redutase ou al- dose redutase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Hypocrea jecorina, Scheffersomyces stipitis, Saccha- romyces cerevisiae, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Pichia quercuum, Candida shehatae, Candida tenuis, Candida tropicalis, As- pergillus niger, Neurospora crassa e Cryptococcus lactativorus. Em outra modalidade, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codi- ficam a xilose redutase ou aldose redutase é xyl1 e/ou GRE3 ou ho- mólogo das mesmas. Em algumas modalidades, uma ou mais molécu- las de ácido nucleico que codificam a xilose redutase ou aldose redu- tase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 84 e 87. Em algumas modali- dades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilo- se redutase ou aldose redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 82, 83, 85 e 86. Xilitol desidrogenase (1.1.1.9)
[00416] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação:
xilitol + NAD* — D-xilulose + NADH + H*
[00417] A xilitol desidrogenase também pode ser conhecida como D-xilulose redutase, xilitol desidrogenase dependente de NAD"”, eritritol desidrogenase, 2,3-cis-poliol (DPN) desidrogenase (C3-5), pentitol- DPN desidrogenase, xilitol-2-desidrogenase ou xilitol-2-desidrogenase: NAD* 2-oxidorredutase (formadora de D-xilulose).
[00418] A xilitol desidrogenase (XDH) é uma das várias enzimas responsáveis pela assimilação da xilose no metabolismo eucariótico e é útil para a fermentação da xilose contida nos subprodutos agrícolas para a produção de etanol. Para a utilização eficiente da xilose em al- tas taxas de fluxo, os cossubstratos devem ser reciclados entre a XDH específica de NAD* e a xilose redutase preferencial de NADPH, outra enzima na via.
[00419] Em modalidades particulares, a enzima converte xilitol em D-xilulose. Em algumas modalidades, a xilitol desidrogenase é de le- vedura. Em algumas modalidades, a xilitol desidrogenase é de Pichia Sp., Saccharomyces sp., Gluconobacter sp., Galactocandida sp., Neu- rospora sp. ou Serratia sp. Em algumas modalidades, a xilitol desidro- genase é de Pichia stipitis, S. cerevisiae, Gluconobacter oxydans, Ga- lactocandida mastotermitis, Neurospora crassa ou Serratia marces- cens. Em algumas modalidades, a xilitol desidrogenase é codificada por xyl2 ou xdh1.
[00420] Em uma modalidade, a xilitol desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo selecionado do grupo que consiste em Scheffer- somyces sp., Trichoderma sp., Pichia sp., Saccharomyces sp., Gluco- nobacter sp., Galactocandida sp., Neurospora sp. e Serratia sp. Em outra modalidade, a xilitol desidrogenase é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um microrganismo se- lecionado a partir do grupo que consiste em Scheffersomyces stipitis,
Trichoderma reesei, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Gluco- nobacter oxydans, Galactocandida mastotermitis, Neurospora crassa e Serratia marcescens. Em outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilitol desidrogenase é xyl2 e/ou xdh1, ou homólogo dos mesmos. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilitol desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 90 e 92. Em algumas modalida- des, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a xilitol desidrogenase é codificado por uma sequência de ácido nucleico sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 88, 89 e 91. Fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1)
[00421] A fosfatase alcalina é uma enzima hidrolase responsável pela remoção de grupos fosfato de muitos tipos de moléculas, incluin- do nucleotídeos, proteínas e alcaloides. Como o nome sugere, as fos- fatases alcalinas são mais eficazes em um ambiente alcalino. Às vezes é usado como sinônimo de fosfatase básica.
[00422] A enzima fosfatase alcalina Pho13 de S. cerevisiae é uma proteína monomérica com massa molecular de 60 kDa e hidrolisa p- nitrofenil fosfato com atividade máxima em pH 8,2 com forte depen- dência de íons de Mg?* e Km aparente de 3,6 x 105 M. Nenhum outro os substratos testados, exceto a histona 1I-A fosforilada e a caseína, foram hidrolisados a qualquer taxa significativa. Estes dados sugerem que o papel fisiológico da fosfatase específica de p-nitrofenil fosfato pode envolver a participação na fosforilação reversível de proteínas.
[00423] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilulose- b-fosfato em D-xilulose. Em algumas modalidades, a fosfatase alcalina é de levedura. Em algumas modalidades, a fosfatase alcalina é de Saccharomyces sp. Em algumas modalidades, a fosfatase alcalina é de S. cerevisiae. Em algumas modalidades, a fosfatase alcalina é codi-
ficada pelo gene PHO13.
[00424] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante que produz MEG e um composto de três carbonos compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene que codifica uma fosfatase alcalina para evitar a conversão de D-xilulose- 5-fosfato em D-xilulose. Piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel (EC 1.6.1.1.)
[00425] A presente descrição descreve enzimas que podem catali- sar a seguinte reação: NADH + NADP* = NAD* + NADPH
[00426] A piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel também po- de ser conhecida como NAD(P)* transidrogenase (específico de B), STH, piridina nucleotídeo transidrogenase ou transidrogenase.
[00427] E. colicontém uma piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel e ligada à membrana. A piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel é o produto do gene sthA ou udhA; seu papel fisiológico primá- rio parece ser a reoxidação de NADPH (Canonaco F. et al. (2001) Me- tabolic flux response to phosphoglucose isomerase knock-out in Es- cherichia coli and impact of overexpression of the soluble transhydro- genase UdhA. FEMS Microbiol Lett 204(2): 247-252; Sauer U. et al. (2004). The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Esche- richia coli. J Biol Chem 279(8): 6613-6619). The membrane-bound pro- ton-translocating transhydrogenase is the pntAB gene product; PntAB is a major source of NADPH (Sauer et al. 2004).
[00428] —“UdhA contém FAD não covalentemente ligado e está pre- sente em uma forma que consiste em sete ou oito monômeros (Boons- tra B. et al. (1999) The udhA gene of Escherichia coli encodes a solu- ble pyridine nucleotide transhydrogenase. J Bacteriol 181(3): 1030- 1034).
[00429] A superexpressão moderada de UdhA (SthA) permite um aumento da taxa máxima de crescimento de um mutante de fosfogli- cose isomerase (Canonaco et al. 2001), e um mutante duplo pgi sthA não é viável (Sauer et al. 2004). Esses fenótipos podem ser devidos à capacidade do UdhA de restaurar o equilíbrio redox celular sob condi- ções de formação excessiva de NADPH (Canonaco et al. 2001; Sauer et al. 2004). Mutations in sthA appear during adaptation of a pgi mutant strain to growth on glucose minimal medium (Charusanti P. et al. (2010) Genetic basis of growth adaptation of Escherichia coli after de- letion of pgi, a major metabolic gene." PLoS Genet 6(11): e1001186).
[00430] A transcrição de sthA é sub-regulada pelo crescimento em glicerol (Sauer et al. 2004).
[00431] Em algumas modalidades, a expressão de uma transidro- genase pode aumentar a atividade de uma álcool desidrogenase de- pendente de NADPH, levando a uma conversão melhorada de acetona em 2-propanol. Em uma modalidade, a piridina nucleotídeo transidro- genase solúvel é codificada por uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico obtidas de E. coli. Em outra modalidade, a uma ou mais molécu- las de ácido nucleico que codificam a piridina nucleotídeo transidroge- nase solúvel é udhA ou homólogo deste. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a piridina nu- cleotídeo transidrogenase solúvel compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 110. Em algumas modalida- des, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel são codificadas por uma sequên- cia de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 109. Superexpressão de enzima ou sub-regulação/deleção de enzima para Fluxo de Via Aumentada
[00432] Em várias modalidades aqui descritas, as enzimas exóge- nas e endógenas no microrganismo recombinante que participam das vias de biossíntese aqui descritas podem ser superexpressas.
[00433] Os termos "superexpresso" ou "superexpressão" referem- se a um nível elevado (por exemplo, nível aberrante) de MRNAs que codificam para uma (s) proteína (s) e/ou a níveis elevados de proteína (s) em células em comparação com células semelhantes não modifi- cadas correspondentes expressando níveis basais de MRNAs ou ten- do níveis basais de proteínas. Em modalidades particulares, MRNA (s) ou proteína (s) podem ser superexpressos em pelo menos 2 vezes, 3 Vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes, 12 vezes, 15 ve- zes ou mais em microrganismos modificados para exibir aumento do gene mRNA, proteína e/ou atividade.
[00434] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante da descrição é gerado a partir de um hospedeiro que contém a capa- cidade enzimática de sintetizar substratos, como D-xilulose, D- ribulose, D-ribulose-1-fosfato, D-xilulose-1-fosfato, D-xilonolactona, D- xilonato, 2-ceto-3-desóxi-xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato, ace- toacetil-CoA ou acetoacetato. Em algumas modalidades, pode ser útil aumentar a síntese ou acumulação de, por exemplo, D-xilulose, D- ribulose, D-ribulose-1-fosfato, D-xilulose-1-fosfato, D-xilonolactona, D- xilonato, 2-ceto-3-desóxi-xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato, ace- toacetil-CoA ou acetoacetato, para aumentar a produção de MEG e um ou mais compostos de três carbonos.
[00435] Em algumas modalidades, pode ser útil aumentar a expres- são de enzimas endógenas ou exógenas envolvidas no MEG e nas vias de biossíntese de compostos de três carbonos para aumentar o fluxo de, por exemplo, D-xilulose, D-ribulose, D-ribulose-1-fosfato, D- xilulose-1-fosfato, D-xilonolactona, D-xilonato, 2-ceto-3-desóxi-xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato, acetoacetil-CoA ou acetoacetato, resul- tando assim em aumento da síntese ou acúmulo de MEG e um ou mais compostos de três carbonos.
[00436] Aumento da síntese ou acúmulo pode ser realizado, por exemplo, superexpressão de ácidos nucleicos que codificam um ou mais dos MEG descritos acima e enzimas da via de biossíntese de compostos de três carbonos. A superexpressão de uma enzima ou en- zimas da via de biossíntese de composto de três carbonos e MEG po- de ocorrer, por exemplo, através do aumento da expressão de um ge- ne ou genes endógenos, ou através da expressão, ou aumento da ex- pressão, de um gene ou genes exógenos. Portanto, organismos de ocorrência natural podem ser prontamente modificados para gerar mi- crorganismos produtores de compostos de três carbonos e MEG não naturais por meio da superexpressão de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um MEG e uma enzima da via de bios- síntese de composto de três carbonos. Além disso, um organismo de ocorrência não natural pode ser gerado por mutagênese de um gene endógeno que resulta em um aumento na atividade de uma enzima no MEG e nas vias de biossíntese de compostos de três carbonos.
[00437] “Equipado com a presente descrição, o versado na técnica será capaz de construir prontamente os microrganismos recombinan- tes descritos neste documento, uma vez que os microrganismos re- combinantes da descrição podem ser construídos usando métodos bem conhecidos na técnica como exemplificado acima para expressar exogenamente pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzi- ma da via de biossíntese de composto de três carbonos e MEG em quantidades suficientes para produzir MEG e um ou mais compostos de três carbonos.
[00438] Métodos para construir e testar os níveis de expressão de um MEG de ocorrência não natural e hospedeiro produtor de compos- to de três carbonos podem ser realizados, por exemplo, por métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais méto- dos podem ser encontrados descritos em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubo et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimore, Md. (1999).
[00439] Uma variedade de mecanismos conhecidos na técnica po- dem ser usados para expressar, ou superexpressar, genes exógenos ou endógenos. Por exemplo, um vetor ou vetores de expressão podem ser construídos para abrigar um ou mais MEG e enzimas da via de bi- ossíntese de composto de três carbonos que codificam ácidos nuclei- cos como exemplificado aqui operacionalmente ligado a sequências controle de expressão funcionais no organismo hospedeiro. Os vetores de expressão aplicáveis para uso nos organismos hospedeiros micro- bianos da invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores fági- cos, vetores virais, epissomas e cromossomos artificiais, incluindo ve- tores e sequências de seleção ou marcadores operáveis para integra- ção estável em um cromossomo hospedeiro. Genes marcadores sele- cionáveis também podem ser incluídos que, por exemplo, fornecem resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências auxo- tróficas ou fornecem nutrientes críticos que não estão no meio de cul- tura. As sequências controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e indutíveis, realçadores da transcrição, terminadores da transcrição e semelhantes que são bem conhecidos na técnica. Quan- do dois ou mais ácidos nucleicos de codificação exógena devem ser coexpressos, ambos os ácidos nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um único vetor de expressão ou em vetores de expres- são separados. Para a expressão de vetor único, os ácidos nucleicos de codificação podem ser operacionalmente ligados a uma sequência controle de expressão comum ou ligados a diferentes sequências con- trole de expressão, tais como um promotor induzível e um promotor constitutivo. A transformação de sequências de ácido nucleico exóge- nas envolvidas em uma via metabólica ou sintética pode ser confirma-
da usando métodos bem conhecidos na técnica.
[00440] “Como será entendido pelos versados na técnica, pode ser vantajoso modificar uma sequência de codificação para aumentar sua expressão em um hospedeiro particular. O código genético é redun- dante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos nor- malmente usa um subconjunto desses códons. Os códons que são utilizados com mais frequência em uma espécie são chamados de có- dons ótimos, e aqueles não utilizados com muita frequência são classi- ficados como códons raros ou de baixo uso. Os códons podem ser substituídos para refletir o uso de códons preferencial do hospedeiro, um processo às vezes chamado de "otimização de códons" ou "contro- le de polarização de códons de espécies".
[00441] Sequências de codificação otimizadas contendo códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular (ve- ja também, Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de translação ou para produzir transcritos de RNA recombinante com propriedades de- sejáveis, como uma meia-vida mais longa, em comparação com as transcrições produzidos a partir de uma sequência não otimizada. Os códons de terminação da translação também podem ser modificados para refletir a preferência do hospedeiro. Por exemplo, os códons de terminação típicos para S. cerevisiae e mamíferos são UAA e UGA, respectivamente. O códon de terminação típico para plantas monocoti- ledôneas é UGA, enquanto os insetos e E. coli comumente usam UAA como o códon de terminação (Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
[00442] Os versados na técnica reconhecerão que, devido à natu- reza degenerada do código genético, uma variedade de sequências de ácido nucleico pode ser usada para codificar uma determinada enzima da descrição. As sequências de ácido nucleico que codificam as enzi-
mas biossintéticas são referenciadas aqui meramente para ilustrar uma modalidade da descrição, e a descrição inclui quaisquer sequên- cias de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos e proteínas das enzimas da presente descrição. De maneira semelhante, um polipeptídeo pode tolerar tipicamente uma ou mais substituições, deleções e inserções de aminoácidos em sua se- quência de aminoácidos sem perda ou perda significativa de uma ati- vidade desejada. A descrição inclui tais polipeptídeos com sequências de aminoácidos diferentes das proteínas específicas aqui descritas, desde que os polipeptídeos modificados ou variantes tenham a ativi- dade anabólica ou catabólica enzimática do polipeptídeo de referência. Além disso, as sequências de aminoácidos codificadas pelas sequên- cias de ácido nucleico aqui mostradas apenas ilustram modalidades da descrição.
[00443] As sequências controle de expressão são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, promotores, realçadores, sinais de po- liadenilação, terminadores de transcrição, sítios de entrada de ribos- somo interno (IRES) e semelhantes, que proporcionam a expressão da sequência polinucleotídica em uma célula hospedeira. As sequências controle de expressão interagem especificamente com proteínas celu- lares envolvidas na transcrição (Maniatis et al., Science, 236: 1237- 1245 (1987)). Sequências controle de expressão exemplares são des- critas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Me- thods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
[00444] Em várias modalidades, uma sequência controle de ex- pressão pode ser operacionalmente ligada a uma sequência polinucle- otídica. Por "operacionalmente ligado" entende-se que uma sequência polinucleotídica e uma sequência (s) controle de expressão são conec- tadas de modo a permitir a expressão gênica quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras transcricionais) estão ligadas à sequência (s) controle de expressão) Os promotores opera- cionalmente ligados estão localizados a montante da sequência poli- nucleotídica selecionada em termos da direção da transcrição e trans- lação. Realçadores operacionalmente ligados podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante do polinucleotídeo selecionado.
[00445] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam uma reação em uma via que compete com a via de biossíntese para a produção de MEG e um ou mais compostos de três carbonos.
[00446] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de D- xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato é uma D-xilulose-5-cinase. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5- cinase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5- cinase é codificada pelo gene xylB ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a manipulação evita a conversão de D-xilulose em D- xilulose-5-fosfato e, em vez disso, desvia a reação em direção à con- versão de D-xilulose em D-xilulose-1-fosfato.
[00447] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de glico- laldeído em ácido glicólico. Em algumas dessas modalidades, a enzi- ma que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico é uma glicolaldeído desidrogenase. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a gli- colaldeído desidrogenase é codificada pelo gene aldA ou seus homó-
logos. Em algumas modalidades, a manipulação evita a produção de ácido glicólico a partir de glicolaldeído e, em vez disso, desvia a rea- ção em direção à conversão de glicolaldeído em MEG.
[00448] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, sofrer mutação e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a con- versão de piruvato em lactato. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de piruvato em lactato é uma lactato desidrogenase. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene IdhA ou seus homólogos. Em algumas modali- dades, a manipulação evita a produção de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desvia a reação para a produção de um composto de três carbonos.
[00449] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de D- xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato é uma D-xilulose-5-cinase. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5- cinase é de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo gene XKS1 ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é de Pichia stipitis. Em algumas modalidades, a D-xilulose-5-cinase é codificada pelo ge- ne XYL3 ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a manipula- ção evita a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de D-xilulose em D- xilulose-1-fosfato.
[00450] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de D- xilose em D-xilulose. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose é uma D-xilose isome- rase. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é de E. coli. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é codificada pelo gene XylA ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a manipulação evita a conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de D-xilose em D-xilulose.
[00451] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de D- xilulose-5-fosfato em D-xilulose. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de D-xilulose-5-fosfato em D-xilulose é uma fosfatase alcalina. Em algumas modalidades, a fosfatase alcali- na é de S. cerevisiae. Em algumas modalidades, a fosfatase alcalina é codificada pelo gene PHO13 ou seus homólogos. Em algumas modali- dades, a manipulação evita a conversão de D-xilulose-5-fosfato em D- xilulose.
[00452] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de D- xilose em D-xilulose. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose é uma D-xilose isome- rase. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é de E. coli. Em algumas modalidades, a D-xilose isomerase é codificada pelo gene XylA ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a manipulação evita a conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de D-xilose em D-xilulose. Micróbios Modificados e Suas Composições Composições Microbianas
[00453] Em alguns aspectos, os micróbios da descrição são combi- nados em composições microbianas.
[00454] Em alguns aspectos, as composições microbianas da pre- sente descrição são sólidas. Onde composições sólidas são usadas, pode ser desejado incluir um ou mais materiais transportadores inclu- indo, mas não se limitando a: terras minerais tais como sílicas, talco, caulim, calcário, giz, argila, dolomita, terra diatomácea; sulfato de cál- cio; sulfato de magnésio; óxido de magnésio; zeólitos, carbonato de cálcio; carbonato de magnésio; trealose; quitosana; goma-laca; albu- minas; amido; leite em pó desnatado; Soro de leite doce em pó; malto- dextrina; lactose; inulina; dextrose; e produtos de origem vegetal, co- mo farinhas de cereais, farinhas de casca de árvore, farinhas de ma- deira e farinhas de casca de noz.
[00455] Em alguns aspectos, as composições microbianas da pre- sente descrição são líquidas. Em outras modalidades, o líquido com- preende um solvente que pode incluir água ou um álcool ou uma solu- ção salina ou hidrato de carbono. Em algumas modalidades, as com- posições microbianas da presente descrição incluem ligantes, tais co- mo polímeros, carboximetilcelulose, amido, álcool polivinílico e seme- lhantes.
[00456] Em alguns aspectos, composições microbianas da presente descrição compreendem sacarídeos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos e se- melhantes), sacarídeos poliméricos, lipídeos, lipídeos poliméricos, li- popolissacarídeos, proteínas, proteínas poliméricas, lipoproteínas, áci- dos nucleicos, polímeros de ácido nucleico, sílica, sais inorgânicos e suas combinações. Em uma outra modalidade, as composições micro- bianas compreendem polímeros de ágar, agarose, gelrita, goma gelan e semelhantes. Em alguns aspectos, as composições microbianas compreendem cápsulas plásticas, emulsões (por exemplo, água e óleo), membranas e membranas artificiais. Em algumas modalidades, as emulsões ou soluções de polímero ligadas podem compreender composições microbianas da presente descrição. Veja Harel e Bennett (Patente Norte-americana 8.460.726 B2).
[00457] Em alguns aspectos, as composições microbianas da pre- sente descrição ocorrem em uma forma sólida (por exemplo, esporos liofilizados dispersos) ou uma forma líquida (micróbios intercalados em um meio de armazenamento). Em algumas modalidades, as composi- ções microbianas da presente descrição são adicionadas na forma se- ca a um líquido para formar uma suspensão imediatamente antes do uso.
[00458] Em alguns aspectos, a composição microbiana da presente descrição possui uma atividade de água (aw) inferior a 0,750, 0,700, 0,650, 0,600, 0,550, 0,500, 0,475, 0,450, 0,425, 0,400, 0,375, 0,350, 0,325, 0,300, 0,275, 0,250, 0,225, 0,200, 0,190, 0,180, 0,170, 0,160, 0,150, 0,140, 0,130, 0,120, 0,110, 0,100, 0,095, 0,090, 0,085, 0,080, 0,075, 0,070, 0,065, 0,060, 0,055, 0,050, 0,045, 0,040, 0,035, 0,030, 0,025, 0,020, 0,015, 0,010 ou 0,005.
[00459] Em alguns aspectos, a composição microbiana da presente descrição possui uma atividade de água (aw) inferior a cerca de 0,750, cerca de 0,700, cerca de 0,650, cerca de 0,600, cerca de 0,550, cerca de 0,500, cerca de 0,475, cerca de 0,450, cerca de 0,425, cerca de 0,400, cerca de 0,375, cerca de 0,350, cerca de 0,325, cerca de 0,300, cerca de 0,275, cerca de 0,250, cerca de 0,225, cerca de 0,200, cerca de 0,190, cerca de 0,180, cerca de 0,170, cerca de 0,160, cerca de 0,150, cerca de 0,140, cerca de 0,130, cerca de 0,120, cerca de 0,110, cerca de 0,100, cerca de 0,095, cerca de 0,090, cerca de 0,085, cerca de 0,080, cerca de 0,075, cerca de 0,070, cerca de 0,065, cerca de 0,060, cerca de 0,055, cerca de 0,050, cerca de 0,045, cerca de 0,040, cerca de 0,035, cerca de 0,030, cerca de 0,025, cerca de 0,020, cerca de 0,015, cerca de 0,010 ou cerca de 0,005.
[00460] Os valores de atividade de água são determinados pelo método de Soluções Aquosas Saturadas (Multon, "Techniques d'Ana- lyse E De Controle Dans Les Industries Agroalimentaires" APRIA (1981)) ou por medição direta usando um higrômetro Robotronic BT viável ou outro higrômetro ou higroscópio. Matéria-prima
[00461] Em alguns aspectos, a descrição é direcionada a um méto- do de produção de MEG e/ou um ou mais produtos C3 em um meio de cultura contendo uma matéria-prima que fornece uma fonte de carbo- no de modo que o MEG e/ou um ou mais produtos C3 sejam produzi- dos e recuperados/coletados/isolados. A recuperação/coleta/isolamen- to pode ser por métodos conhecidos na técnica, tais como destilação, separação com base em membrana de separação de gás, extração com solvente e adsorção em leito expandido.
[00462] Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende uma fon- te de carbono. Em alguns aspectos, a fonte de carbono pode ser sele- cionada a partir de açúcares, glicerol, alcoóis, ácidos orgânicos, alca- nos, ácidos graxos, lignocelulose, proteínas, dióxido de carbono e mo- nóxido de carbono. Em um aspecto, a fonte de carbono é um açúcar. Em um aspecto, o açúcar é glicose ou seus oligômeros de glicose. Em um aspecto, os oligômeros de glicose são selecionados de frutose, sacarose, amido, celobiose, maltose, lactose e celulose. Em um as- pecto, o açúcar é um açúcar de cinco carbonos. Em um aspecto, o açúcar é um açúcar de seis carbonos. Em alguns aspectos, a matéria- prima compreende um ou mais cinco açúcares de carbono e/ou um ou mais seis açúcares de carbono. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende um ou mais de xilose, glicose, arabinose, galactose, mal- tose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende um ou mais de xilose e/ou glicose. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende um ou mais dentre arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos.
[00463] Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais cin- co açúcares de carbono (pentoses) e/ou um ou mais seis açúcares de carbono (hexoses). Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais dentre xilose e/ou glicose. Em alguns aspectos, os micróbios uti- lizam um ou mais dentre arabinose, galactose, maltose, frutose, ma- nose, sacarose e/ou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais dentre xilose, glicose, arabinose, ga- lactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos.
[00464] Em alguns aspectos, as hexoses podem ser selecionadas de D-alose, D-altrose, D-glicose, D-manose, D-gulose, D-idose, D- galactose, D-talose, D-tagtose, D-sorbose, D-frutose, D-psicose e ou- tras hexoses conhecidas na técnica. Em alguns aspectos, as pentoses podem ser selecionadas de D-xilose, D-ribose, D-arabinose, D-lixose, D-xilulose, D-ribulose e outras pentoses conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as hexoses e pentoses podem ser seleciona- das a partir do enantiômero levógiro ou dextrógiro de qualquer uma das hexoses e pentoses aqui descritas.
[00465] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados a um biorreator/meio de crescimento durante a fase de crescimento é de pelo menos 5 kg de carboidratos/m3, pelo menos 10 kg de carboidratos/m3, pelo menos 20 kg de carboidra- tos/m3, em pelo menos 30 kg de carboidratos/m3, pelo menos 40 kg de carboidratos/m3, pelo menos 50 kg de carboidratos/m3, pelo menos 60 kg de carboidratos/m3, pelo menos 70 kg de carboidratos/m3, pelo menos 80 kg de carboidratos/m3, pelo menos 90 kg de carboidra- tos/m3, pelo menos 100 kg de carboidratos/m3, pelo menos 150 kg de carboidratos/m3, pelo menos 200 kg de carboidratos/m3, pelo menos 250 kg de carboidratos/m3, pelo menos 300 kg de carboidratos/m3, pelo menos 400 kg de carboidratos/m3 pelo menos 500 kg de carboi- dratos/m3, pelo menos 600 kg de carboidratos/m3, pelo menos 700 kg de carboidratos/m3, até 800 kg de carboidratos/m3. Em algumas mo- dalidades, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de crescimento varia de cerca de 10 kg de carboidrato/m3 a 500 kg de carboidrato/m3.
[00466] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de crescimento varia entre 1 a 200 horas. Em outras modalidades, o tem- po da fase de crescimento é entre 5 a 50 horas. O tempo depende da alimentação e/ou alimentação com carboidratos.
[00467] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção é de pelo menos 50 kg de carboidrato/m3, pelo menos 60 kg de carboidrato/m3, pelo menos 70 kg de carboidrato/m3, pelo me- nos 80 kg de carboidratos/m3, pelo menos 90 kg de carboidratos/m3, pelo menos 100 kg de carboidratos/m3, pelo menos 150 kg de carboi- dratos/m3, pelo menos 200 kg de carboidratos/m3, pelo menos 250 kg de carboidratos/m3, pelo menos 300 kg de carboidratos/m3, pelo me- nos 400 kg de carboidratos/m3, pelo menos 500 kg de carboidra- tos/m3, pelo menos 600 kg de carboidratos/m3, pelo menos 700 kg de carboidratos/m3, pelo menos 800 kg de carboidratos/m3, pelo menos 900 kg carboidrato/m3 até 1000 kg carboidrato/m3. Em algumas mo- dalidades, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de carboidrato/m3 a 800 kg de carboidrato/m3.
[00468] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de produção varia entre 5 a 500 horas. Em outras modalidades, o tempo para a fase de produção varia de 10 a 300 horas para operações em batelada e batelada alimentada. Em outras modalidades, o tempo da fase de produção é de até 300 horas com fermentação contínua.
[00469] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento para o proces- so de uma fase é de pelo menos 50 kg de carboidrato/m3, pelo menos 60 kg de carboidrato/m3, pelo menos 70 kg de carboidrato/m3, pelo menos 80 kg de carboidrato/m3, pelo menos 90 kg de carboidrato/m3, pelo menos 100 kg de carboidrato/m3, pelo menos 150 kg de carboi- drato/m3, pelo menos 200 kg de carboidrato/m3, pelo menos 250 kg de carboidrato/m3, em pelo menos 300 kg de carboidratos/m3, pelo menos 400 kg de carboidratos/m3, pelo menos 500 kg de carboidra- tos/m3, pelo menos 600 kg de carboidratos/m3, pelo menos 700 kg de carboidratos/m3, pelo menos 800 kg de carboidratos/m3, pelo menos 900 kg carboidrato/m3 até 1000 kg carboidrato/m3. Em alguns aspec- tos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de carboidrato/m3 até 800 kg de carboidrato/m3.
[00470] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de produção no processo de uma fase varia entre 5 a 500 horas. Em ou- tros aspectos, o tempo necessário para a fase de produção no proces- so de uma fase varia entre 5 a 300 horas.
[00471] Em alguns aspectos, os processos de produção monofási- cos ou multifásicos levam cerca de 5, cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300 cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 400, cerca de 425, cerca de 450, cerca de 475 ou cerca de 500 horas.
[00472] Em alguns aspectos, os processos de produção monofási- cos ou multifásicos levam 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou 500 horas.
Melhoria de Características
[00473] Os métodos da presente descrição podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de caracte- rísticas desejáveis. Exemplos de características que podem ser intro- duzidas ou melhoradas incluem: aumento da taxa de produção de MEG e/ou um ou mais compostos C3, aumento da taxa de produção de MEG, aumento da taxa de produção de um ou mais compostos C3, aumento da taxa de produção de MEG e um ou mais compostos C3, rendimento aumentado de MEG e/ou um ou mais compostos C3, ren- dimento aumentado de MEG, rendimento aumentado de um ou mais compostos C3, rendimento aumentado de MEG e um ou mais compos- tos C3, e outras características aqui descritas.
[00474] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe uma diferença na característica que é pelo menos cerca de 1 % maior, por exemplo, pelo menos cerca de 1 %, pelo menos cerca de 2 %, pelo menos cerca de 3 %, pelo menos cerca de 4 %, pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 6 %, pelo menos cerca de 7 %, pelo menos cerca de 9 %, pelo menos cerca de 9 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 11 %, pelo menos cerca de 12 %, pelo menos cerca de 13 %, pelo menos cerca de 14 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, em pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos 100 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cer- ca de 400 % ou mais do que uma referência sob condições de contro- le. Em exemplos adicionais, um micróbio resultante dos métodos des- critos neste documento exibe uma diferença na característica que é pelo menos cerca de 5 % maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5
%, pelo menos cerca de 8 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos 100 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cerca de 400 % ou mais do que um micróbio não modificado de referência ou cepa base.
[00475] Em alguns aspectos, o aumento ou diminuição de qualquer um ou mais das características da presente descrição é um aumento de cerca de 0,1 %, cerca de 0,2 %, cerca de 0,3 %, cerca de 0,4 %, cerca de 0,5 %, cerca de 0,6 %, cerca de 0,7 %, cerca de 0,8 %, cerca de 0,9 %, cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 %, cerca de 5 %, cerca de 6 %, cerca de 7 %, cerca de 8 %, cerca de 9 %, cerca de 10 %, cerca de 11 %, cerca de 12 %, cerca de 13 %, cer- ca de 14 %, cerca de 15 %, cerca de 16 %, cerca de 17 %, cerca de 18 %, cerca de 19 %, cerca de 20 %, cerca de 21 %, cerca de 22 %, cerca de 23 %, cerca de 24 %, cerca de 25 %, cerca de 26 %, cerca de 27 %, cerca de 28 %, cerca de 29 %, cerca de 30 %, cerca de 31 %, cerca de 32 %, cerca de 33 %, cerca de 34 %, cerca de 35 %, cer- ca de 36 %, cerca de 37 %, cerca de 38 %, cerca de 39 %, cerca de 40 %, cerca de 41 %, cerca de 42 %, cerca de 43 %, cerca de 44 %, cerca de 45 %, cerca de 46 %, cerca de 47 %, cerca de 48 %, cerca de 49 %, cerca de 50 %, cerca de 51 %, cerca de 52 %, cerca de 53 %, cerca de 54 %, cerca de 55 %, cerca de 56 %, cerca de 57 %, cer- ca de 58 %, cerca de 59 %, cerca de 60 %, cerca de 61 %, cerca de 62 %, cerca de 63 %, cerca de 64 %, cerca de 65 %, cerca de 66 %, cerca de 67 %, cerca de 68 %, cerca de 69 %, cerca de 70 %, cerca de 71 %, cerca de 72 %, cerca de 73 %, cerca de 74 %, cerca de 75 %, cerca de 76 %, cerca de 77 %, cerca de 78 %, cerca de 79 %, cer-
ca de 80 %, cerca de 81 %, cerca de 82 %, cerca de 83 %, cerca de 84 %, cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou cerca de 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa base.
[00476] Em alguns aspectos, o aumento ou diminuição de qualquer um ou mais das características da presente descrição é um aumento de pelo menos 0,1 %, pelo menos 0,2 %, pelo menos 0,3 %, pelo me- nos 0,4 %, pelo menos 0,5 %, pelo menos 0,6 %, pelo menos 0,7 %, pelo menos 0,8 %, pelo menos 0,9 %, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, pelo menos 10 %, pelo menos 11 %, pelo menos 12 %, pelo menos 13 %, pelo menos 14 %, pelo menos 15 %, pelo menos 16 %, pelo menos 17 %, pelo menos 18 %, pelo menos 19 %, pelo menos 20 %, pelo menos 21 %, pelo menos 22 %, pelo menos 23 %, pelo menos 24 %, pelo menos 25 %, pelo menos 26 %, pelo menos 27 %, pelo menos 28 %, pelo menos 29 %, pelo menos 30 %, pelo menos 31 %, pelo menos 32 %, pelo menos 33 %, pelo menos 34 %, pelo menos 35 %, pelo menos 36 %, pelo menos 37 %, pelo menos 38 %, pelo menos 39 %, pelo menos 40 %, pelo menos 41 %, pelo menos 42 %, pelo menos 43 %, pelo menos 44 %, pelo menos 45 %, pelo menos 46 %, pelo menos 47 %, pelo menos 48 %, pelo menos 49 %, pelo menos 50 %, pelo menos 51 %, pelo menos 52 %, pelo menos 53 %, pelo menos 54 %, pelo menos 55 %, pelo menos 56 %, pelo menos 57 %, pelo menos 58 %, pelo menos 59 %, pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos
74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa base.
[00477] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento no rendimento de MEG em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em rela- ção a um micróbio não modificado ou uma cepa base.
[00478] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento no rendimento de um ou mais compostos C3 em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4%, 5%, 6 Y%, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa ba- se.
[00479] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento no rendimento de MEG em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em rela- ção a um micróbio não modificado ou uma cepa base; e um aumento no rendimento de um ou mais compostos C3 em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12%, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não mo- dificado ou uma cepa base.
[00480] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento na taxa de produção de MEG em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa base.
[00481] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento na taxa de produção de um ou mais compostos C3 em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4%, %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12%, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35%, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma ce- pa base.
[00482] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe um aumento na taxa de produção de MEG em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa base; e um au- mento na taxa de produção de um ou mais compostos C3 em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11
%, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 Y%, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado ou uma cepa base.
[00483] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe (1) um aumento na taxa de produção de MEG em pelo menos 2 %, (2) um aumento na taxa de produção de um ou mais compostos C3 em pelo menos 2 %, (3) um aumento no rendimento de MEG em pelo menos 2 % e (4) um aumento no rendi- mento de um ou mais compostos C3 em pelo menos 2 %.
[00484] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe (1) um aumento na taxa de produção de MEG em pelo menos 5 %, 10 % ou 15 %, (2) um aumento na taxa de produção de um ou mais compostos C3 em pelo menos 5 %, 10 % ou 15 %, (3) um aumento no rendimento de MEG em pelo menos 5 %, % ou 15 % e (4) um aumento no rendimento de um ou mais Com- postos C3 em pelo menos 5 %, 10 % ou 15 %.
[00485] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste documento exibe (1) um aumento na taxa de produção de MEG em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 % ou 30 %, (2) um au- mento na taxa de produção de um ou mais compostos C3 em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 % ou 30 %, (3) um aumento no rendi- mento de MEG em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, ou 30 %, e (4) um aumento no rendimento de um ou mais compostos C3 em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 % ou 30 %.
[00486] Em alguns aspectos, o MEG é produzido em pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h.
[00487] Em alguns aspectos, a acetona é produzida pelo menos 0,2 kg/m3 h, 0,5 kg/m3 h, pelo menos 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, em pelo menos 15 kg/m3 h, ou pe- lo menos 20 kg/m3 h.
[00488] Em alguns aspectos, o isopropanol é produzido pelo menos 0,2 kg/m3 h, 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo me- nos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, em pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h.
[00489] Em alguns aspectos, o isopropanol é produzido pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h.
[00490] Em alguns aspectos, o propeno é produzido pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo menos 3 kg/m3 h, pe- lo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h.
[00491] Em alguns aspectos, os produtos combinados dos proces- sos biológicos da presente descrição resultam em uma produção de pelo menos 0,5 kg/m3 h, 1 kg/m3 h, pelo menos 2 kg/m3 h, pelo me- nos 3 kg/m3 h, pelo menos 4 kg/m3 h, pelo menos 5 kg/m3 h, 6 kg/m3 h, pelo menos 7 kg/m3 h, pelo menos 8 kg/m3 h, pelo menos 9 kg/m3 h, pelo menos 10 kg/m3 h, pelo menos 15 kg/m3 h, ou pelo menos 20 kg/m3 h de MEG, acetona, isopropanol, propeno, seus precursores e/ou suas misturas.
Modificação Metabólica para Melhorar o Fluxo através da Via C3
[00492] Os compostos C3 são produzidos a partir de acetil-CoA, que é um metabólito chave nas vias sintéticas e oxidativas. A produ- ção de C3 tem que competir pela Acetil-CoA com as reações naturais da célula. Reações irreversíveis e fortemente impulsionadas para a produção de C3 são essenciais para melhorar o rendimento, título e/ou produtividade dos compostos C3. Acetoacetil CoA sintase e/ou hidro- ximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase são enzimas capazes de puxar o fluxo através da via C3.
[00493] A utilização de ambas as estratégias de expressão dessas enzimas para melhorar o rendimento, título e/ou produtividade da via de MEG é nova. A melhoria do MEG se deve ao maior fluxo de carbo- no pela via, puxado pela maior produção de C3 a partir do ácido acéti- co. Mais ácido acético é produzido para ser convertido em C3, acele- rando o carbono total através da via de MEG e diminuindo os vaza- mentos.
[00494] —Acetoacetil CoA sintase (npht7) - desvio de Malonil-CoA com ou sem deleção de acetoacetil-CoA tiolase (thlA). A acetil-CoA sintase (NphT7 - EC:2.3.1.19) catalisa a condensação de acetil-CoA e malonil-CoA para formar acetoacetil-CoA e CoA. A síntese de acetoa- cetil-CoA em E. coli é uma reação reversível catalisada pela acetoace- til-CoA tiolase (EC 2.3.1.9) a partir de duas moléculas de acetil-CoA. Embora a acetoacetil-CoA tiolase produza acetoacetil-CoA, esta enzi- ma prefere a tiólise de acetoacetil-CoA à síntese de acetoacetil-CoA. À expressão do gene nphT7 pode ser usada para aumentar significati- vamente a concentração de acetoacetil-CoA nas células, uma vez que a reação não é reversível e tem uma forte atração devido ao uso de um ATP. Espera-se que a expressão de nphT7 melhore o rendimento, título e/ou produtividade para as vias C3 devido a uma maior concen- tração de acetoacetil-CoA que é convertida em acetona, isopropanol ou propeno. No entanto, a melhoria do fluxo através da via C3 tem um efeito sinérgico na assimilação da xilose e conversão em MEG, melho- rando o rendimento, título e/ou produtividade na via C2.
[00495] Desvio de HMG-COA - hidroximetilglutaril-CoA sintase (ERG13) e hidroximetilglutaril-CoA liase (YngG) com ou sem deleção de acetoacetil-CoA transferase (AtoDA). O desvio de HMG-CoA é composto por duas etapas: condensação de Acetil-CoA e acetoacetil- CoA para formar (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA e CoA pela Hidroxi- metilglutaril-CoA sintase (ERG13 - EC: 2,3,3,10) e conversão de (S)-3- hidróxi-3-metilglutaril-CoA em acetil-CoA e acetoacetato pela hidroxi- metilglutaril-CoA liase (YngG - EC: 4.1.3.4). O acetoacetato é o pre- cursor direto das vias C3 para acetona, propanol e propeno e pode ser produzido pela Acetato CoA-transferase (AtoDA) nativa de E. coli. À expressão de ERG13 e YngG pode ser utilizada para aumentar signifi- cativamente a concentração de acetoacetato em relação à reação rea- lizada pela Acetato CoA-transferase (AtoDA), uma vez que a transfe- rase é reversível e dependente da concentração de acetato. O desvio de HMG-CoA representa uma alternativa que é essencialmente uma reação com energia favorável e não dependente da concentração e regulação de acetato. Espera-se que a expressão do desvio de HGM- CoA melhore o rendimento, título e/ou produtividade para as vias C3 devido a uma concentração mais elevada de acetoacetato que é con- vertido em produtos C3. No entanto, como já mencionado, a melhoria do fluxo através da via C3 tem um efeito sinérgico na assimilação da xilose e conversão em MEG, melhorando o rendimento, título e/ou produtividade na via C2. Modificação Metabólica da Via do Xilonato
[00496] A otimização da expressão gênica de toda a via do xilonato evitará a perda de carbono para as reações colaterais, evitará o acú- mulo de intermediários e gerará cepas com melhor desempenho quan-
to ao rendimento, título e produtividade tanto para etileno glicol quanto para compostos C3. Em alguns aspectos, as otimizações descritas se concentram na primeira e na última etapa. Em alguns aspectos, dife- rentes fontes de enzima são consideradas para as etapas 1 a 4.
[00497] Em alguns aspectos, a otimização é conduzida não apenas visando a produção de etileno glicol, mas também com atenção aos benefícios/prejuízos na coprodução de C3.
[00498] A produção de etileno glicol pela via do xilonato consiste em 5 etapas enzimáticas. A via otimizado para a coprodução de etile- no glicol e acetona é descrito abaixo:
[00499] A D-xilonolactona é produzida pela oxidação da D-xilose (EC 1.1.1.175 ou 1.1.1.179).
[00500] Fontes: Caulobacter crescentus, Burkholderia xenovorans, Haloferax volcanii, Halomonas elongata, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma reesei, Sus scrofa, Pseudomonas putida, Sphingomonas elodea
[00501] —xilonolactona é hidrolisada para produzir D-xilonato (EC
3.1.1.68)
[00502] Fontes: Caulobacter crescentus, Burkholderia xenovorans, Haloferax volcanii, Halomonas elongata, Sphingomonas elodea
[00503] D-xilonato é desidratado em ácido 2-ceto-3-desoxipenta- noico (EC 4.2.1.82)
[00504] Fontes: Escherichia coli, Caulobacter crescentus, Burkhol- deria xenovorans, Haloferax volcanii, Halomonas elongata, Sphingo- monas elodea, Pseudomonas sp., Achromobacter xylosoxidans, Me- sorhizobium sp., Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirilum seropedicae, Actinoplanes missouriensis, Aspergillus oryzae
[00505] O ácido 2-ceto-3-desóxi-pentanoico é convertido em glico- laldeído e piruvato (EC 4.1.2.20).
[00506] Fontes: Escherichia coli, Sulfolobus sp., Paraburkholderia phytofirmans, Sphingomonas wittichii, Pseudomonas sp., Azotobacter vinelandii, Scheffersomyces stipites, Picrophilus torridus. Trichoderma reesei.
[00507] O glicoaldeído é reduzido a etileno glicol (EC 1.1.1.77)
[00508] Fontes: Escherichia coli
[00509] As variações na via do xilonato, particularmente nas etapas 1-3 que são responsáveis por iniciar o fluxo de xilose através da via, podem ter um grande impacto na produtividade do etileno glicol, embo- ra o rendimento geral possa não ser melhorado. A via C3 também é afetada positivamente, tanto na produção, título e produtividade. Esse aspecto provavelmente está relacionado à diminuição do acúmulo de ácido xilônico que em certos níveis pode ser tóxico para a célula hos- pedeira e diminui o fluxo de carbono para o piruvato, diminuindo o pool de acetil-CoA para a produção de C3.
[00510] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma xilose desidrogenase heteróloga superex- pressa.
[00511] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma xilonolactonase heteróloga superexpres- sada.
[00512] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma xilonato desidratase homóloga superex- pressada ou superexpressão ou expressão de uma xilonato desidra- tase heteróloga.
[00513] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pen- tanona aldolase homóloga superexpressa ou superexpressão ou ex- pressão de um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldo- lase heteróloga.
[00514] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma glicoaldeído redutase homóloga superex- pressada.
[00515] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma glicoaldeído redutase homóloga superex- pressada.
[00516] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende (1) uma xilose desidrogenase heteróloga supe- rexpressa, (2) uma xilonolactonase heteróloga superexpressada, (3) uma xilonato desidratase homóloga superexpressada ou superexpres- são ou expressão de uma xilonato desidratase heteróloga, (4) uma su- perexpressão de glicoaldeído redutase homóloga e/ou (5) superex- pressão de uma glicoaldeído redutase homóloga.
[00517] Em alguns aspectos, as sequências superexpressas ou ex- pressas são tais devido a serem colocadas sob o controle de sequên- cias controle não nativas. Em alguns aspectos, a expressão de xilose desidrogenase heteróloga em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2%, 3%, 4%, ,5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não modificado.
[00518] Em alguns aspectos, a expressão de uma xilonolactonase heteróloga em um micróbio modificado da presente descrição é au- mentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não modificado.
[00519] Em alguns aspectos, a expressão de uma xilonato desidra- tase heteróloga ou homóloga em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2%, 3%, 4%, ,5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não modificado.
[00520] Em alguns aspectos, a expressão de um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase homóloga ou heteróloga em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não mo- dificado.
[00521] Em alguns aspectos, a expressão de uma glicoaldeído re- dutase homóloga em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não modificado. Modificação Metabólica da Via do Acetato
[00522] Em alguns aspectos, a alteração de enzimas chave do me- tabolismo do acetato pode alterar a atividade das vias centrais de E. coli. Deleções dos genes pta, ackA ou poxB, ou superexpressão de acs podem alterar a co-regulação do metabolismo do acetato, shunt de glioxilato e das vias anapleróticas/gliconeogênicas, afetando a assimi- lação eficiente das fontes de carbono. A deleção dos genes pta, ackA, poxB ou a superexpressão da acetil-CoA sintetase melhora a assimila- ção da xilulose e, portanto, aumenta o fluxo por toda a via, resultando em maiores rendimentos e produtividade de etileno glicol e, conse- quentemente, compostos C3. Além disso, uma maior expressão de acetil-CoA sintetase pode aumentar a capacidade das cepas de usar o acetato já presente no substrato como fonte de carbono.
[00523] A viado acetato é composta por quatro enzimas: uma fos- fato acetiltransferase, uma acetato cinase, uma piruvato oxidase e uma acetil-CoA sintetase. A fosfato acetiltransferase é codificada pelo gene pta e catalisa a reação reversível: acetil-CoA + fosfato — acetil fosfato + coenzima A (Número EC: 2.3.1.8). O acetato cinase é codifi- cado pelo gene ackA e catalisa a reação reversível: acetato + ATP & acetil fosfato + ADP (Número EC: 2.7.2.1), estando envolvido na gera- ção da maior parte do ATP formado catabolicamente durante o cres- cimento anaeróbio (reação 22, 23 e 24 Figura 1). A piruvato oxidase é codificada pelo gene poxB e catalisa a reação: piruvato + uma ubiqui- nona [membrana interna] + H2O — CO2 + acetato + um ubiquinol [membrana interna] (Número EC: 1.2.5.1), sendo a principal via de produção de acetato em fase estacionária. A acetil-CoA sintetase é codificada pelo gene acs e catalisa a reação irreversível: acetato + ATP + coenzima A — acetil-CoA + AMP + difosfato (Número EC:
6.2.1.1), tendo um papel principalmente anabólico, eliminando o aceta- to presente no meio extracelular.
[00524] A deleção dos genes pta, ackA ou poxB pode alterar o fluxo de carbono pela via, aumentando não apenas o pool de acetil-CoA disponível para a produção de C3, mas também a captação e assimi- lação da xilose pela via de MEG. A interrupção do ciclo fútil do acetato libera mais acetil-CoA, que é rapidamente convertido em compostos C3 por meio da via sintética do C3. Para evitar a escassez de acetil- CoA, mais piruvato deve ser produzido através da conversão de xilose em MEG e DHAP ou piruvato, aumentando o fluxo de carbono pela via e levando a maiores rendimentos e produtividade.
[00525] O pool de acetil-CoA também pode ser aumentado pela su- perexpressão do gene acs (acetil-CoA sintetase) ou pelo aumento da quantidade de Acs ativos. A enzima Acs é regulada pelo sistema Pat/CobB, onde a proteína lisina acetiltransferase (Pka) inativa Acs por acetilação, enquanto a proteína reguladora dependente de NAD* de- sacetilase CobB libera Acs da repressão por desacetilação. Portanto, a deleção do gene patZ, também conhecido como pka, ou a superex- pressão do gene cobB podem garantir maiores quantidades de Acs ativos. Outra forma de aumentar a quantidade de Acs é pela deleção do gene arcA, um regulador da expressão dos genes do TCA, cuja de- leção leva a maior expressão do gene acs.
[00526] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de fosfato acetiltransferase (pta) interrompida ou deletada.
[00527] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de acetato cinase (ackA) interrompida ou deletada.
[00528] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de piruvato oxidase (poxB) interrompida ou deletada.
[00529] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico do regulador arcA interrompida ou deletada.
[00530] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de lisina ace-
tiltransferase (pka) interrompida ou deletada.
[00531] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de fosfato acetiltransferase (pta) interrompida ou deletada, sequência de ácido nucleico de acetato cinase (ackA), sequência de ácido nucleico de pi- ruvato oxidase (poxB), sequência de ácido nucleico regulador arcA, e/ou sequência de ácido nucleico de lisina acetiltransferase (pka).
[00532] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende um regulador CobB superexpresso.
[00533] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende um acs superexpresso (acetil-CoA sintetase).
[00534] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende um regulador CobB superexpresso e/ou um acs superexpresso (acetil-CoA sintetase).
[00535] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende um regulador CobB superexpresso, acs supe- rexpresso (acetil-CoA sintetase), uma sequência de ácido nucleico de fosfato acetiltransferase (pta) interrompida ou deletada, sequência de ácido nucleico de acetato cinase (ackA), piruvato oxidase (poxB) se- quência de ácido nucleico, sequência de ácido nucleico regulador arcA e/ou sequência de ácido nucleico de lisina acetiltransferase (pka).
[00536] Em alguns aspectos, os acs superexpressos e/ou regulador CobB são superexpressos devido a serem colocados sob o controle de sequências controle não nativas. Em alguns aspectos, a sequência controle é um operador. Em alguns aspectos, a sequência controle é um promotor. Em alguns aspectos, a sequência controle é um promo- tor constitutivo. Em alguns aspectos, as sequências controle nativas são modificadas para causar a superexpressão.
[00537] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma ou mais mutações em uma ou mais se-
quências de ácido nucleico de fosfato acetiltransferase, em uma ou mais sequências de ácido nucleico de acetato cinase, em uma ou mais sequências de ácido nucleico de piruvato oxidase, em uma ou mais sequências de ácido nucleico do regulador arcA, em uma ou mais se- quências de ácido nucleico de lisina acetiltransferase.
[00538] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma fosfato acetiltransferase (pta) em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 Y%, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 Y%, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 Y%, 65 %, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00539] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma acetato cinase (ackA) em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 Y%, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 Y%, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 Y%, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00540] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma piruvato oxidase (poxB) em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 Y%, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 Y%, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 Y%, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00541] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên-
cias de ácido nucleico que codificam um regulador arcA em um micró- bio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12%, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00542] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma lisina acetiltransferase (pka) em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 Y%, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00543] Em alguns aspectos, a expressão do regulador CobB em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, TO %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não mo- dificado.
[00544] Em alguns aspectos, a expressão de acs (acetil-CoA sinte- tase) em um micróbio modificado da presente descrição é aumentada em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % ou 500 % em relação a um micróbio não modificado. Deleção de Vias Concorrentes para Melhorar o Fluxo de Carbono por Meio de Vias MEG e C3
[00545] Em alguns aspectos, a deleção de enzimas chave de vias concorrentes, como metilglioxal sintase e glioxilato carboligase, evitará a perda de carbono para reações colaterais que redirecionam o fluxo de carbono através das vias de MEG e C3.
[00546] Em alguns aspectos, as modificações aqui descritas são realizadas em micróbios que já foram modificados para coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, de modo que o fluxo de carbono seja modulado nas vias de MEG e/ou C3 de modo a permitir mais pro- dução eficiente de compostos MEG e/ou C3.
[00547] A metilglioxal sintase (mgsA - EC: 4.2.3.3) converte DHAP em metilglioxal + Pi em E. Coli. A metilglioxal sintase pode ser posteri- ormente convertida em piruvato por meio de D-lactato. Esta sequência fornece um desvio das reações glicolíticas normais para a conversão de DHAP em piruvato. Embora a metilglioxal sintase esteja presente em E. coli com uma atividade razoável, é possível que as concentra- ções intracelulares normais de Pi e DHAP possam impedir que ela se- ja totalmente ativa. No entanto, qualquer fator que aumente a concen- tração de DHAP ou diminua a concentração de Pi tenderia a desinibir a enzima. DHAP pode se acumular dependendo do fluxo de carbono através da glicólise. A via sintética para a produção de MEG a partir da xilose tem DHAP como intermediário (vias da xilulose e ribulose-1P, para a via do xilonato, o metilglioxal pode ser formado a partir do pi- ruvato) e uma vez que o fluxo para a via da pentose fosfato é bloquea- do, toda a xilose deve passar através da via sintética MEG. Isso pode gerar um transbordamento de carbono pela via sintética, levando ao acúmulo de DHAP, o que não ocorre na captação de xilose pelo WT. O acúmulo de DHAP desinibe o mgsA, que converte o DHPA em me-
tilglioxal. A deleção de mgsA pode forçar o fluxo através das vias de MEG e C3, melhorando a produção de MEG e C3 e diminuindo o acúmulo de intermediários.
[00548] A glioxilato carboligase (gcl - EC: 4.1.1.47) condensa duas moléculas de glioxilato para formar o semialdeído tartronato e o dióxi- do de carbono em E. coli. A glioxilato carboligase pode ser formada a partir de TCA ou glicolato. O glicolato pode ser produzido a partir do glicolaldeído, diminuindo o rendimento de MEG. A deleção de gcl pode melhorar o rendimento geral de MEG e C3, evitando a perda de glico- laldeído (ramificação C2) e glioxilato por meio de reações colaterais. A deleção de gcl também pode manter o carbono dentro do ciclo do TCA ou convertê-lo em piruvato. A conversão de carbono do TCA em pi- ruvato pode aumentar a concentração de acetil-CoA aumentando o rendimento da via C3.
[00549] —Surpreendentemente, a deleção ou interrupção de mgsA e gcl não tem apenas um efeito na produção de MEG, mas também au- menta o rendimento geral e/ou produtividade (taxa de produção) e/ou título de compostos da via C3. Esta melhoria se deve a uma otimiza- ção do fluxo ao longo da via, modificando o perfil de produção de ácido acético e aumentando ou acelerando a produção de acetona.
[00550] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de metil- glioxal sintetase (mgsA) interrompida. Em alguns aspectos, um micró- bio modificado da presente descrição compreende uma sequência de ácido nucleico de glioxilato carboligase (gcl) interrompida. Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende (1) uma sequência de ácido nucleico de metilglioxal sintase (mgsA) interrompida e (2) uma sequência de ácido nucleico de glioxilato car- boligase (gcl) interrompida.
[00551] Em alguns aspectos, um micróbio modificado da presente descrição compreende uma ou mais mutações em uma ou mais se- quências de ácido nucleico de metilglioxal sintase e/ou uma ou mais mutações em uma ou mais sequências de ácido nucleico de glioxilato carboligase.
[00552] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma metilglioxal sintase em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 Y%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % em relação a um micró- bio não modificado.
[00553] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam uma glioxilato carboligase em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 Y%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % em relação a um micró- bio não modificado.
[00554] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam (1) uma glioxilato carboligase e (2) uma metilglioxal sintase em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos cerca de 0,5 %, cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 %, cerca de 5 %, cerca de 6 %, cerca de 7 %, cerca de 8 %, cerca de 9 %, cerca de 10 %, cerca de 11 %, cerca de 12 %, cerca de 13 %, cerca de 14 %, cerca de 15 %, cerca de 16 %, cerca de 17 %, cerca de 18 %, cerca de 19 %, cerca de 20 %, cerca de 21 %, cerca de 22 %, cerca de 23 %, cerca de 24 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, cer-
ca de 45 %, cerca de 50 %, cerca de 55 %, cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, ou cerca de 100 % em relação a um micróbio não modificado.
[00555] Em alguns aspectos, a translação de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico que codificam (1) uma glioxilato carboligase e (2) uma metilglioxal sintase em um micróbio modificado da presente descrição é reduzida em pelo menos 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15%, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % em relação a um micróbio não modificado. Tabela 3: Descrição das sequências SEQ ID NO: 1 Sequência de NT de D-tagatose 3-epimerase DTE de Pseudomonas cicho- ri SEQ ID NO: 2 Sequência de NT otimizada por códon de D-tagatose 3-epimerase DTE de Pseudomonas cichorii SEQ ID NO: 3 Sequência de AA de D-tagatose 3-epimerase DTE de Pseudomonas cicho- ri SEQ ID NO: 4 Sequência de NT de D-tagatose 3-epimerase FJ851309,1 de Rhodobacter sphaeroides SEQ ID NO: 5 Sequência de AA de D-tagatose 3-epimerase FJ851309,1 de Rhodobacter sphaeroides SEQ ID NO: 6 Sequência de NT de L-fuculocinase FucK de Escherichia coli SEQ ID NO: 7 Sequência de NT otimizada por códon de L-fuculocinase FucK de Escheri- chia coli SEQ ID NO: 8 Sequência de AA de L-fuculocinase fucK de Escherichia coli SEQ ID NO: 9 Sequência de NT de L-fuculose fosfato aldolase fucA de Escherichia coli SEQ ID NO: 10 | Sequência de NT otimizada por códon L-fuculose fosfato aldolase fucA de Escherichia coli SEQ ID NO: 11 Sequência de AA de L-fuculose fosfato aldolase fucA de Escherichia coli SEQID NO: 12 | Sequência de NT de glicerol desidrogenase gldA de Escherichia coli SEQIDNO: 13 | Sequência de AA de glicerol desidrogenase gldA de Escherichia coli SEQIDNO: 14 | Sequência de NT de metilglioxal redutase GRE2 de Saccharomyces cere- visiae
SEQIDNO: 15 | Sequência de AA de metilglioxal redutase GRE2 de Saccharomyces cere- a a NC CTOÕ2O SEQID NO: 19. | Sequência de NT otimizada por códon de álcool desidrogenase yqhD* de a Mana ce CASS OSO SEQ ID NO: 22 | Sequência de NT otimizada por códon de álcool desidrogenase yqhD de a Mao ce CS Sm SEQID NO: 27. | Sequência de NT otimizada por códon de lactaldeído redutase fucO de a Mia sea A SO SEQIDNO:29 | Sequência de NT de metilglioxal redutase yafB (dkgB) [multifuncional] de a Mao ess CSS SSSSTO SEQIDNO:30 | Sequência de AA de metilglioxal redutase yafB (dkgB) [multifuncional] de a Mao ese SAS ASS SEQ ID NO: 31 Sequência de NT de ácido 2,5-diceto-D-glicônico redutase A yghE (dkgA) a Mao semen OSSOS SEQID NO: 32 | Sequência de AA de ácido 2,5-diceto-D-glicônico redutase A yqhE (dkgA) a Mao semen SOS SEQIDNO:33 | Sequência de NT de acetil coenzima A acetiltransferase thlA de Clostridium [ii Qa Q Cima SS SS SEQIDNO:34 | Sequência de NT otimizada por códon de acetil coenzima A acetiltransfera- ova SPreomeanates “ “A SEQIDNO:35 | Sequência de AA de acetil coenzima A acetiltransferase thlA de Clostridium a Mia ee SOS SS SO SEQIDNO:36 | Sequência de NT de acetil coenzima A acetiltransferase atoB de Escheri- o E a SEQIDNO:37 | Sequência de AA de acetil coenzima A acetiltransferase atoB de Escheri- Ma SEQIDNO:38 | Sequência de NT de acetil coenzima A acetiltransferase ERG10 de Sac- uia rece “SOS
[O FTSE — SEQIDNO:40 | Sequência de AA de acetil coenzima A acetiltransferase ERG10 de Sac- a Mao res POSSO SEQ ID NO: 41 Sequência de NT de subunidade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transfe- Mia nstaeamea Am SEQID NO: 42 | Sequência de NT otimizada por códon de subunidade de acetil- oii Roo catinmmtdttt SEQIDNO:43 | Sequência de AA de subunidade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transfe- Mia os aeame SOS SEQIDNO:44 | Sequência de NT de subunidade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transfe- oii ancas mA SEQIDNO:45 | Sequência de NT otimizada por códon de subunidade de acetil- oia Ron cotinmmt da antta SEQIDNO:46 | Sequência de AA de subunidade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transfe- aii ancas “ “““SOASES SEQIDNO:47 | Sequência de NT de acetoacetato decarboxilase adc de Clostridium aceto- a Mia seen ACC" ATO SEQIDNO:48 | Sequência de NT otimizada por códon de acetoacetato decarboxilase ade oia Semanas“ “SÓ SEQIDNO:49 | Sequência de AA de acetoacetato decarboxilase adc de Clostridium aceto-
MM SEQIDNO: 50 | Sequência de NT de acetoacetato decarboxilase ade de Clostridium beije- o a ao SEQ ID NO: 51 Sequência de NT otimizada por códon de acetoacetato decarboxilase ade [ai aC LS cemantação "SOS SEQIDNO: 52 | Sequência de AA de acetoacetato decarboxilase ade de Clostridium beije-
MM SEQIDNO: 54 | Sequência de cDNA otimizada por códon de ceto-hexocinase C khk-C de a Mao tese ASAS SS SEQIDNO: 56 | Sequência de cDNA de Frutose-bisfosfato aldolase B aldoB de Homo sapi- a DL SEQIDNO:57 | Sequência de cDNA otimizada por códon de Frutose-bisfosfato aldolase B oia cases “ SSSÓSEO SEQIDNO: 59 | Sequência de NT de D-xilose 1-desidrogenase xylB de Caulobacter cres- o Es A ão
E ERR — SEQ ID NO: 61 Sequência de AA de D-xilose 1-desidrogenase xylB de Caulobacter cres- o ao SEQIDNO:62 | D-xilose 1-desidrogenase xdh1 de Haloferax volcanii, Sequência de NT de a Maçã ese CSSSCSC"S200A SEQIDNO:63 | D-xilose 1-desidrogenase xdh1 de Haloferax volcanii, Sequência de AA de a Mana pose POSSAS" SAO SEQ ID NO: 71 Sequência de NT otimizada por códon de xilonato desidratase yjhnG de MM a SEQIDNO:74 | Sequência de NT otimizada por códon de xilonato desidratase yagF de a Mao eee CS SE SEO SEQIDNO:77 | Sequência de NT otimizada por códon de Liase yjhH Não caracterizada de a Qi eee SACAS OO SEQIDNO:79 | Sequência de NT de Provável 2-ceto-3-desóxi-galactonato aldolase yagE a Mia seres CASS AA SEQIDNO:80 | Sequência de NT otimizada por códon de Provável 2-ceto-3-desóxi- Rs SEQ ID NO: 81 Sequência de AA de Provável 2-ceto-3-desóxi-galactonato aldolase yagE a Cana comeca SS TOO SEQIDNO:83 | Sequência de NT otimizada por códon D-xilose redutase xy!1 de Scheffer- a Mia ia crase SAE E SEO SEQIDNO:86 | Sequência de NT otimizada por códon de aldose redutase GRE3 de Sac- o Javanês TT NO
SEQIDNO:89 | Sequência de NT otimizada por códon de D-xilulose redutase xyl2 de oia rea “TC OS SO OAO SEQIDNO:94 | Sequência de NT otimizada por códon de xilose isomerase xylA de Mi ee CS E OO SEQIDNO: 96 | Butirato-acetoacetato CoA-transferase de Clostridium acetobutylicum, se- oia aa aan "O SEQIDNO:97 | Butirato-acetoacetato CoA-transferase Clostridium acetobutylicum, sequên- A aa SEQIDNO: 98 | Butirato-acetoacetato CoA-transferase de Clostridium acetobutylicum, se- A a SEQIDNO: 99 | Butirato-acetoacetato CoA-transferase de Clostridium acetobutylicum, se- A a SEQ ID NO: 100 | Sequência de NT de Acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase atoA subu- oeaa craarcEemsaçtemeo “SS SEQ ID NO: 101 | Sequência de AA de Acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase subunidade oe semana“ “SS SEQ ID NO: 102 | Sequência de NT de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase subunidade oia 2a semana ão“ “CSS SEQ ID NO: 103 | Sequência de AA de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase subunidade
MMA SEQ ID NO: 104 | Sequência de NT de álcool desidrogenase adh secundária de Clostridium | CQC Caes SE" SAS SEQ ID NO: 105 | Sequência de NT otimizada por códon de álcool desidrogenase adh secun- oia Ses comaneãeãas “ “SS EM SEQ ID NO: 106 | Sequência de AA de álcool desidrogenase adh secundária de Clostridium a Cana as POCCSSAS SS CAS SO SEQ ID NO: 107 | Sequência de NT de álcool desidrogenase adh de Clostridium carboxidivo-
MM SEQ ID NO: 108 | Sequência de AA de álcool desidrogenase adh de Clostridium carboxidivo- e e ii O CZZA222mm SEQ ID NO: 109 | Sequência de NT de piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel de Esche- ON sua Tt
SEQ ID NO: 110 | Sequência de AA de piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel de Esche- richia coli
EXEMPLOS Exemplo 1. Coprodução de etileno glicol (MEG), acetona e isopro- panol (IPA) em E. coli usando a via da xilulose-1-fosfato
[00556] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeiro para a expressão das vias de MEG + IPA. Dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + IPA foram identificados como alvos para deleção: genes aldA e xylB. Uma via de MEG foi in- tegrada no locus xylB, permitindo uma integração estável concomitan- temente com a deleção de xylB. A produção de MEG através da via da xilulose-1-fosfato requer a expressão de três genes: khkC (enzima D- xilulose-1-cinase), aldoB (enzima D-xilulose-1-fosfato aldolase) e fucO (enzima aldeído redutase). Os genes khkC (sequência de aminoácidos KhkC apresentada em SEQ ID NO: 55) e aldoB (sequência de amino- ácidos AldoB apresentada em SEQ ID NO: 58) foram otimizados por códons para E. coli e sintetizados. O gene FucO é nativo de E. coli e foi amplificado por PCR (Iniciador Dianteiro: ATGGCTAACAGAA- TGATTCTG (SEQ ID NO: 117) e Iniciador Reverso: TIACCAGGCGG- TATGGTAAAGCT (SEQ ID NO: 118)).
[00557] Um cassete de integração MEG foi composto por um ope- ron contendo khkC (enzima D-xilulose-1-cinase), aldoB (enzima D- xilulose-1-fosfato aldolase), fucO (enzima aldeído redutase) e termina-
dor rplM sob o controle de proD promotor (promotor constitutivo) flan- queado por regiões homólogas a montante e a jusante do gene xylB. Para cada gene, foi utilizada uma sequência RBS específica. Um mar- cador antibiótico também foi adicionado ao cassete para a seleção de transformantes. O cassete foi construído usando o kit comercial In- fusion, confirmado por sequenciamento e transformado na cepa E. coli K12 MG1655. A integração adequada de uma via de MEG no locus xylB, produzindo uma cepa xylB deletada com uma via de MEG inte- grada, foi confirmada por sequenciamento.
[00558] A cepa que abriga uma via de MEG no locus xylB foi usada como hospedeira para integração de uma via IPA no locus aldA, per- mitindo uma integração estável concomitantemente com a deleção al- dA. A produção de isopropanol requer a expressão de cinco genes: th! (tiolase), atoA/D (acetato:acetoacetil-CoA transferase), adc (acetoace- tato descarboxilase) e adh (álcool desidrogenase secundário). O gene atoA/D é nativo de E. coli e foi amplificado por PCR (Iniciador Diantei- ro: CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 119) e Iniciador Reverso: TATATCTCCTTCTTAAAGTTCA- TAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 119) e Iniciador Reverso: TA- TATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 120). thl (sequência de aminoácidos Thl apresentada em SEQ ID NO: 35), adc (sequência de aminoácidos Adc apresentada em SEQ ID NO: 49) e adh (sequência de aminoácidos Adh apresentada em SEQ ID NO: 106) foram otimizados para códons para E. coli e sintetizado.
[00559] Um cassete de integração IPA foi composto por um operon contendo os genes thl (tiolase), adh (álcool desidrogenase secundá- ria), ade (acetoacetato descarboxilase), atoA/D (acetato:acetoacetil- CoA transferase) e terminador T1 sob o controle de uma força média promotor constitutivo (modificado de RecA) flanqueado por regiões homólogas a montante e a jusante do gene aldA. Para cada gene, foi utilizada uma sequência RBS específica. Un marcador antibiótico foi incluído na cassete para a seleção dos transformantes. O cassete foi construído usando o kit comercial In-fusion, confirmado por sequenci- amento e transformado na cepa E. coli KI2 MG1655. A integração adequada de uma via IPA no locus aldA, produzindo uma cepa aldA deletada com uma via IPA integrada, foi confirmada por sequencia- mento.
[00560] A cepa deletada por xylB aldA com as vias de MEG e IPA integradas no genoma foi inoculada em 3 mL de meio TB para pré- cultivo. Após 16 horas de cultivo, 100 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio TB contendo 15g/L de xilose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,3.
[00561] A xilose foi totalmente consumida após 30 horas de cultivo (FIG. 4). Etileno glicol, acetona e isopropanol alcançaram um título máximo de 3,5 g/L, 70 mg/L e 400 mg/L, respectivamente.
[00562] O rendimento global de coprodução foi calculado conside- rando a quantidade de etileno glicol, isopropanol e acetona produzida por grama de xilose consumida. MEG é o produto com maior rendi- mento, 0,237 g/g, seguido por isopropanol, 0,029 g/ge acetona, 0,006 9/9 (FIG. 7). O melhor rendimento de coprodução, obtido após 48 ho- ras de fermentação, foi de 0,27 g de produtos/g de xilose (44 % do rendimento máximo teórico). Exemplo 2. Coprodução de etileno glicol (MEG), acetona e isopro- panol (IPA) em E. coli usando a via do xilonato
[00563] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi utilizada como hospedei- ro para a expressão das vias de MEG + IPA. Dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + IPA foram identificados como alvos para deleção: os genes aldA e xylA. Uma via de MEG foi integrada no locus xylA, permitindo uma integração estável concomi-
tantemente com a deleção xylA. A produção de MEG através de uma via de xilonato requer a expressão de dois genes: xdh (sequência de aminoácidos Xdh apresentada em SEQ ID NO: 61) de Caulobacter crescentus foi otimizado por códons para E. coli e sintetizado. O gene FucO é nativo de E. coli e foi amplificado por PCR (Iniciador Dianteiro: ATGGCTAACAGAATGATTCTG (SEQ ID NO: 117) e Iniciador Rever- so: TTACCAGGCGGTATGGTAAAGCT (SEQ ID NO: 118)). Duas ou- tras enzimas nativas podem ser superexpressas para melhorar a pro- dução de MEG através de uma via de xilonato:D-xilonato desidratase (yjhG, yagrF ou homólogos dos mesmos) e aldolase (yjhH, yagE ou homólogos dos mesmos).
[00564] Um cassete de integração MEG foi composto por um ope- ron contendo genes xdh (D-xilose desidrogenase), fucO (enzima alde- ído redutase) e terminador rnpB sob o controle do promotor proD (promotor constitutivo) flanqueado por regiões homólogas a montante e a jusante do gene xylA. Para cada gene, foi utilizada uma sequência RBS específica. Un marcador antibiótico também foi adicionado ao cassete para a seleção de transformantes. O cassete foi construído usando o kit comercial In-fusion, confirmado por sequenciamento e transformado na cepa E. coli K12 MG1655. A integração adequada de uma via de MEG no locus xylA, produzindo uma cepa xylA deletada com uma via de MEG integrada, foi confirmada por sequenciamento.
[00565] A cepa que abriga uma via de MEG no locus xylA foi usada como hospedeiro para integração de uma via IPA no locus aldA, per- mitindo uma integração estável concomitantemente com a deleção al- dA. A produção de isopropanol requer a expressão de cinco genes: th! (tiolase), atoA/D (acetato:acetoacetil-CoA transferase), adc (acetoace- tato descarboxilase) e adh (álcool desidrogenase secundário). O gene AtoA/D é nativo de E. coli e foi amplificado por PCR (Iniciador Diantei- ro: CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ
ID NO: 119) e Iniciador Reverso: TATATCTCCTTCTTAAAGTTCA- TAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 119) e Iniciador Reverso: TA- TATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 120). thl (sequência de aminoácidos Thl apresentada em SEQ ID NO: 35), adc (sequência de aminoácidos Adc apresentada em SEQ ID NO: 49) e adh (sequência de aminoácidos Adh apresentada em SEQ ID NO: 106) foram otimizados para códons para E. coli e sintetizado.
[00566] Um cassete de integração IPA foi composto por um operon contendo os genes thl (tiolase), adh (álcool desidrogenase secundá- ria), ade (acetoacetato descarboxilase), atoA/D (acetato:acetoacetil- CoA transferase) e terminador T1 sob o controle de uma força média promotor constitutivo (modificado de RecA) flanqueado por regiões homólogas a montante e a jusante do gene aldA. Para cada gene, foi utilizada uma sequência RBS específica. Un marcador antibiótico foi incluído na cassete para a seleção dos transformantes. O cassete foi construído usando o kit comercial In-fusion, confirmado por sequenci- amento e transformado na cepa E. coli KI2 MG1655. A integração adequada de uma via IPA no locus aldA, produzindo uma cepa aldA deletada com uma via IPA integrada, foi confirmada por sequencia- mento.
[00567] A cepa deletada por xylA aldA com as vias de MEG e IPA integradas no genoma foi inoculada em 3mL de meio de TB para pré- cultivo. Após 16 horas de cultivo, 100 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio TB contendo 15g/L de xilose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,3.
[00568] A xilose foitotalmente consumida antes de 24 horas de cul- tivo (FIG. 8). Etileno glicol, acetona e isopropanol atingiram um título máximo de 5 g/L, 170 mg/L e 420 mg/L, respectivamente.
[00569] O rendimento global de coprodução foi calculado conside-
rando a quantidade de etileno glicol, isopropanol e acetona produzida por grama de xilose consumida. MEG é o produto com maior rendi- mento, 0,339 g/g, seguido por isopropanol, 0,028 g/ge acetona, 0,008 9/g (FIG. 9). O melhor rendimento de coprodução, obtido após 48 ho- ras de fermentação, foi de 0,375 g de produtos/g de xilose (61 % do rendimento máximo teórico). Exemplo 3. Produção direta de propileno a partir de glicose
[00570] Os vetores pZs*13 contendo uma via IPA em um operon sob o promotor plLacO e pET28a contendo o gene LinD foram cotrans- formados em BL21Star (DE3) usando eletroporação. A produção de isopropanol requer a expressão de cinco genes: thl (tiolase), atoA/D (acetato:acetoacetil-CoA transferase), adc (acetoacetato descarboxila- se) e adh (álcool desidrogenase secundário). O gene atoA/D é nativo de E. coli e foi amplificado por PCR (Iniciador Dianteiro: CTGTTGTTA- TATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 119) e Ini- ciador Reverso: TATATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCG- TTGC (SEQ ID NO: 119) e Iniciador Reverso: TATATCTCCTTCOT- TAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 120). thl (sequên- cia de aminoácidos Thl apresentada em SEQ ID NO: 35), adc (se- quência de aminoácidos Adc apresentada em SEQ ID NO: 49) e adh (sequência de aminoácidos Adh apresentada em SEQ ID NO: 106) foram otimizados para códons para E. coli e sintetizado. Um operon contendo genes thl (tiolase), adh (álcool desidrogenase secundário), adc (acetoacetato descarboxilase), atoA/D (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e terminador T1 sob o controle do promotor indutível pLLacoO foi construído em uma cadeia principal pZS*13. A seleção do candidato foi feita usando canamicina e ampicilina em meio LB. A cepa aqui foi referida como IPA + LinD. Esta combinação de plasmídeos fornece uma cepa capaz de produzir isopropanol a partir da glicose e também expressar a enzima linalol isomerase desidratase.
[00571] Uma única colônia de IPA + LinD, pZs*13|PA e pET28a LinD foi inoculada em meio TB contendo 10 g/L de glicerol suplementado com canamicina (50 ug/mL) e ampicilina (100 ug/mL) a 37 ºC, 220 rpm. Após 20 horas, uma nova inoculação foi feita usando densidade óptica de 0,2 em meio TB contendo 1,5g/L de glicerol su- plementado com antibióticos apropriados a 37 ºC, 220 rpm. Após 3 horas, a OD atingiu 1,0 a 600 nm e IPTG foi adicionado a uma concen- tração final de 1 MM. Os frascos foram incubados a 18 ºC, 220 rpm.
[00572] Após 16 horas, a OD foi medida e as culturas foram con- centradas para atingir a OD 20 usando os seguintes meios, conforme descrito para cada ensaio: (a) pzs*13 IPA em TB 20 g/L de glicose (controle para pro- dução de isopropanol), (b) IPA + LinD em TB 10 g/L de glicerol e 3 g/L de isopro- panol (controle para produção de propileno), (c) IPA + LinD em TB 20 g/L de glicose e 3 g/L de isopropa- nol (controle para produção de propileno), (d) IPA + LinD em TB 20 g/L de glicose (candidato 1 para produção de propileno), (e) IPA + LinD em TB 20 g/L de glicose (candidato 2 para produção de propileno)
[00573] Uma alíquota de todas as culturas foi lisada para análise de expressão e as células foram coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 20 min e 4 ºC. O pélete foi mantido em -80 ºC por 1 hora, então foi descongelado em gelo e ressuspenso em 10 % do volume original em Tris-HCI 50 mM pH 7,5. A lise foi feita por sonicação (3-5 ciclos, 10/10 minutos, amplitude de 25 %) em gelo, após isso para separar a fração solúvel, ela foi centrifugada a 5000 rom por 30 min a 4 ºC. As amos- tras foram aquecidas a 95 ºC durante 10 minutos e analisadas em SDS-PAGE (FIG. 10).
[00574] —Alíquotas de 1,0 mL de cada cultura foram colocadas em frascos headspace de 2 mL em triplicata e incubadas a 37 ºC, 225 rpm. No final de 116 horas de incubação, os frascos foram removidos da incubadora com agitação e a concentração de propileno e isopro- panol foi analisada em GC-MS. Foi realizado controle contendo ape- nas meio TB 20 g/L de glicose para verificar contaminação ao final do período de incubação. 1,0 mL da fase headspace foi injetado em cro- matógrafo gasoso (Focus GC - Thermo) equipado com detector de es- pectrômetro de massa por impacto de elétrons (ISQ - Thermo). O hélio foi usado como gás de arraste com uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min, a taxa de divisão usada foi de 10 com um fluxo de divisão de 15 mL/min. Os compostos voláteis foram separados em uma coluna HP-Plot/Q (Agilent) com a temperatura inicial mantida a 90 ºC por 1,0 min segui- da por uma primeira rampa de 13,3 *C/min a 130 ºC e uma segunda a 45 ºC/min a 200 ºC mantida durante 1 min. O tempo de retenção do propileno nestas condições foi de 1,51 min e do isopropanol foi de 4,3 min. A reação do produto foi identificada por comparação com os pa- drões de propileno e isopropanol e por comparação com uma base de dados de fragmentação de massa.
[00575] A produção de isopropanol nos ensaios (a), (d) e (e) foi de 0,5 g/L e em (b) e (c) 3,0 g/L como esperado. A produção de 4 10-5 mM de propileno foi observada no ensaio (b) controle positivo para propileno e uma produção significativa foi observada nos ensaios (d) e (e), candidatos com IPA + LinD cotransformados (FIG. 11). Nenhuma quantidade de propileno foi observada na reação de controle que con- tinha apenas meio TB. Exemplo 4: Expressão de desvio de malonil-CoA na cepa copro- dutora de MEG + acetona - por meio da via de xilonato
[00576] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylA. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00577] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional do gene xdh também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes /o- ci.
[00578] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. O gene nphT7 (acetoacetil CoA sintase) foi expresso sob o controle do promotor GA- PDH em uma cadeia principal do vetor pZS *. O plasmídeo foi constru- ído usando um kit comercial In-fusion e confirmado por sequenciação. O plasmídeo confirmado foi transformado na cepa base. As colônias das transformações foram inoculadas em 5 mL de meio mineral con- tendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o con- sumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consumida após 48 horas de cultivo.
[00579] Após 24 horas de cultivo, aproximadamente 1,3 g/L de MEG podem ser detectados na cepa origem, enquanto 1,7 g/L podem ser detectados ao mesmo tempo na cepa com nphT7 expresso (FIG. 12A). As cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 48h de cultivo enquanto a quantidade total de acetona aumentou 60 % (FIG. 12B), provavelmente relacionado à maior produção de ácido acé- tico (FIG. 12C). O pico de produção de ácido xilônico foi diminuído 2,9 vezes (FIG. 12D). A expressão do gene nhpT7 proporcionou melhora na velocidade de coprodução em relação à cepa origem. Exemplo 5: Expressão de HMG-CoA na cepa coprodutora de MEG + acetona - por meio da via de da xilulose
[00580] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylB. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00581] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene khk-C (ceto-hexocinase), o gene aldoB (frutose-1,6-bisfosfato aldolase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase) foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional dos genes khk-C e aldoB também sob controle do promotor proD foram integrados em diferentes /loci.
[00582] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. O gene ERG13 (hidroximetilglutaril-CoA sintase) e o gene yngG (hidroximetilglutaril- CoA liase) foram expressos no operon e sob o controle do promotor Tac em uma cadeia principal do vetor pZA. O plasmídeo foi construído usando um kit comercial In-fusion e confirmado por sequenciação. O plasmídeo confirmado foi transformado na cepa base. As colônias das transformações foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 ho-
ras de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consumida após 55 horas de cultivo.
[00583] Após 32 horas de cultivo, aproximadamente 1,2 g/L de MEG puderam ser detectados na cepa origem, enquanto 1,9 g/L pude- ram ser detectados ao mesmo tempo na cepa com HMG-CoA expres- so (FIG. 13A). As cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 55h de cultivo, enquanto a quantidade total de acetona aumentou 41 % (FIG. 13B), com pouco efeito na produção de ácido acético (FIG. 13C) e no acúmulo de xilulose (FIG. 13D) . A expressão do desvio de HMG-C0oA garantiu uma melhora na velocidade de coprodução em re- lação à cepa parental. Exemplo 6: Substituição de atoDA exógeno por ERG13 e yngG no operon de acetona e deleção de atoDA endógeno em uma cepa coprodutora de MEG + acetona por meio da via da xilulose com deleção do gene pta
[00584] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylB. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00585] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene khk-C (ceto-hexocinase), o gene aldoB (frutose-1,6-bisfosfato aldolase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase) foi integrado no genoma de E. coli e um outro cópias dos genes khk-C e aldoB também sob o controle do promotor OXB20 foram integradas em um locus diferente.
[00586] A próxima etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o ge- ne adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00587] A próxima etapa foi a deleção do gene pta. Este gene foi deletado com sucesso e a deleção foi confirmada por PCR e sequen- ciamento. A cepa base foi usada como cepa hospedeira para deleção de atoDA exógeno presente no operon acetona com integração dos genes ERG13 e yngG e deleção do atoDA endógeno. Os genes ERG13 e yngG foram integrados com sucesso, o gene atoDA foi ex- cluído com sucesso e ambas as modificações foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00588] “Colônias das cepas modificadas foram inoculadas em 5 mL de meio mineral para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, a pré- cultura foi transferida para 100 ml de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,2.
[00589] “Quantidades maiores de MEG foram detectadas para a ce- pa atoDA::ERG13, yngG AatoDA (FIG. 14B) em relação à cepa paren- tal. Compare com a FIG. 14A. A substituição do gene atoDA exógeno por ERG13 e gene yngG juntamente com a deleção de atoDA endó- geno resultou em uma taxa e quantidade melhorada de produção de MEG em comparação com a cepa parental. Exemplo 7: Expressão de xilonato desidratase yagF e deleção de pta em uma cepa coprodutora de MEG + acetona por meio da via de xilonato
[00590] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylA. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00591] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional do gene xdh também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes /o- ci.
[00592] A próxima etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o ge- ne adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00593] A última etapa foi a deleção do gene pta. Este gene foi ex- cluído com sucesso e a deleção foi confirmada por PCR e sequencia- mento. O plasmídeo contendo a sequência xilonato desidratase yagF foi expresso sob o controle do promotor OXB11 em uma cadeia princi- pal do vetor pZS*. O plasmídeo foi construído usando um Kit comercial In-fusion e confirmado por sequenciação. O plasmídeo confirmado foi transformado na cepa base.
[00594] “Colônias de transformações foram inoculadas em 5 mL de meio mineral para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, a pré-cultura foi transferida para 100 ml de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilo- se e 2,15 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rom até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,2.
[00595] “Quantidades maiores de MEG e acetona foram detectadas para a cepa Apta + yagF (FIG. 15) em relação à cepa Apta. A expres-
são de yagF resultou em uma melhoria na quantidade de MEG e pro- dução de acetona em comparação com a cepa parental. Exemplo 8: Deleção de mgsA em uma cepa coprodutora de MEG + Acetona por meio da via de xilonato
[00596] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via do composto MEG+C3: aldA e xylA. As deleções foram confir- madas por PCR e sequenciamento.
[00597] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foram integrados em diferentes /oci.
[00598] A última etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o con- trole do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tio- lase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento. O gene mgsA foi deletado na cepa base e a deleção foi confirmada por PCR e sequenciamento.
[00599] As colônias foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consumida após 48 horas de cultivo.
[00600] Após 24 horas de cultivo, aproximadamente 1,1 g/L de MEG foi detectado na cepa origem, enquanto 1,7 g/L foi detectado no mesmo ponto de tempo na cepa com mgsA deletado (FIG. 16A). As cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 48h de cultivo enquanto a quantidade total de acetona aumentou 1,7 vezes (FIG. 16B), o que estava relacionado à maior produção de ácido acético (FIG. 16C). O pico de produção de ácido xilônico foi diminuído em 41 % (FIG. 16D). A deleção de mgsA proporcionou uma melhora na velo- cidade de coprodução em relação à cepa parental. Exemplo 9: Deleção de mgsA em uma cepa coprodutora de MEG + Acetona por meio da via da xilulose
[00601] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + IPA: aldA e xylB. Os genes foram excluídos com su- cesso e a deleção confirmada por PCR e sequenciamento.
[00602] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene khk-C (ceto-hexocinase), o gene aldoB (frutose-1,6-bisfosfato aldolase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase) foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional dos genes khk-C e aldoB também sob controle do promotor proD foram integrados em diferentes /loci.
[00603] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. O gene mgsA foi deletado na cepa base e a deleção foi confirmada por PCR e sequen- ciamento.
[00604] As colônias foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consumida após 55 horas de cultivo.
[00605] As cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 55h de cultivo (FIG. 17A) enquanto a quantidade total de acetona au- mentou 31 % (FIG. 17B) com pouco efeito na produção de ácido acéti- co (FIG. 17C) e acúmulo de xilulose (FIG. 17D). A deleção de mgsA proporcionou uma melhora na velocidade de coprodução em relação à cepa parental. Exemplo 10: Deleção de gcl em uma cepa coprodutora de MEG + Acetona - por meio da via de xilonato
[00606] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + IPA: aldA e xylA. Os genes foram deletados com su- cesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00607] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional de xdh O ge- ne também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes loci.
[00608] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. O gene gcl foi deletado na cepa base e a deleção foi confirmada por PCR e sequen-
ciamento.
[00609] As colônias foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consumida após 48 horas de cultivo.
[00610] Após 24 horas de cultivo, aproximadamente 1,7 g/L de MEG podem ser detectados na cepa parental, enquanto 2,1 g/L podem ser detectados no mesmo ponto de tempo na cepa com gcl deletado (FIG. 18A). As cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 48h de cultivo enquanto a quantidade total de acetona foi aumentada em 15 % (FIG. 18B), provavelmente relacionado à maior produção de ácido acético (FIG. 18C). O pico de produção de ácido xilônico foi di- minuído em 15 % (FIG. 18D). A deleção de gcl proporcionou uma me- lhora na velocidade de coprodução em relação à cepa parental. Exemplo 11: Deleção de ackA em uma cepa coprodutora de MEG + acetona por meio da via da xilulose
[00611] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylB. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00612] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene khk-C (ceto-hexocinase), o gene aldoB (frutose-1,6-bisfosfato aldolase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase) foi integrado no genoma de E. coli e um outro cópias dos genes khk-C e aldoB também sob o controle do promotor proD foram integradas em um locus diferente.
[00613] A última etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o con- trole do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tio- lase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento. A cepa base foi usada como cepa hospe- deira para a deleção de dois genes relacionados à via do acetato:pta e ackA. Os genes foram deletados com sucesso e a deleção foi confir- mada por sequenciamento.
[00614] As colônias das cepas deletadas foram inoculadas em 5 mL de meio mineral para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, a pré- cultura foi transferida para 100 ml de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,2.
[00615] “Quantidades maiores de MEG foram detectadas para as cepas Apta (FIG. 19A) e AackA (FIG. 19B) em relação à cepa origem. A deleção de pta ou ackA resultou em uma melhora na velocidade de produção de MEG em relação à cepa parental. Exemplo 12: Deleção de arcA em uma cepa coprodutora de MEG + acetona por meio da via da xilulose
[00616] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylB. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00617] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene khk-C (ceto-hexocinase), o gene aldoB (frutose-1,6-bisfosfato aldolase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase) foi integrado no genoma de E. coli e um outro cópias dos genes khk-C e aldoB também sob o controle do promotor proD foram integradas em um locus diferente.
[00618] A última etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o con- trole do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tio- lase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento. A cepa base foi utilizada como cepa hos- pedeira para a deleção do gene arcA, cuja deleção está relacionada à indução de genes do ciclo do TCA e maior expressão do gene acs quando comparada ao WT. Este gene foi excluído com sucesso e a deleção foi confirmada por PCR e sequenciamento.
[00619] As colônias das cepas deletadas foram inoculadas em 5 mL de meio mineral para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, a pré- cultura foi transferida para 100 ml de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,2.
[00620] “Maior produtividade de MEG (FIG. 20A) e maior produtivi- dade e título de acetona (FIG. 20B) foram detectados para a cepa AarcA em relação à cepa origem. A deleção de arcA resultou em uma melhora na velocidade de produção de MEG e melhora na velocidade e quantidade de produção de acetona em relação à cepa parental. Exemplo 13: Deleção de arcA e pka em uma cepa coprodutora de MEG + acetona por meio da via de xilonato e com deleção de pta
[00621] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylA. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00622] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope-
ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional do gene xdh também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes /o- ci.
[00623] A próxima etapa foi a integração da via da acetona por meio de um operon no genoma de E. coli. Um operon expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o ge- ne adc (acetoacetato descarboxilase) foram integrados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integrações foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00624] A última etapa foi a deleção do gene pta. Este gene foi ex- cluído com sucesso e a deleção foi confirmada por PCR e sequencia- mento. A cepa base foi usada como cepa hospedeira para a deleção de dois genes relacionados à via do acetato:pka e arcA. Os genes fo- ram deletados com sucesso e a deleção foi confirmada por sequenci- amento.
[00625] As colônias das cepas deletadas foram inoculadas em 5 mL de meio mineral para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, a pré- cultura foi transferida para 100 ml de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,2.
[00626] Quantidades maiores de MEG (FIG. 21A) e acetona (FIG. 21B) foram detectadas para as cepas AptaAarcA e Aptaipka em rela- ção à cepa Apta. A deleção de arcA e pka resultou em uma melhora na velocidade e quantidade de MEG e produção de acetona em rela- ção à cepa parental.
Exemplo 14: Expressão de xilolactonase heteróloga na cepa co- produtora de MEG + acetona - por meio da via de xilonato
[00627] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylA. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00628] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional do gene xdh também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes /o- ci.
[00629] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. Plasmídeos con- tendo diferentes sequências que codificam a segunda enzima da via do xilonato (xilolactonase), foram expressos sob o controle do promo- tor OXB11 em uma cadeia principal do vetor pZS*. Os plasmídeos fo- ram construídos usando um kit comercial In-fusion e confirmados por sequenciação. Os plasmídeos confirmados foram transformados na cepa base. As colônias das transformações foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose pa- ra pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transfe- rida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. A OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi totalmente consu-
mida após 48 horas de cultivo.
[00630] Após 24 horas de cultivo, aproximadamente 1,3 g/L de MEG puderam ser detectados na cepa origem, enquanto 2,1 até 2,7 g/L puderam ser detectados ao mesmo tempo em cepas que abrigam xilolactonase expressa em plasmídeos (FIG. 22A). Todas as cepas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 48 h de cultivo en- quanto a quantidade total de acetona foi aumentada de 2,1 a 2,6 vezes (FIG. 22B), provavelmente relacionado à maior produção de ácido acético (FIG. 22C). O pico de produção de ácido xilônico foi diminuído em até 4,7 vezes (FIG. 22D). A expressão da xilolactonase proporcio- nou melhora na velocidade de coprodução em relação à cepa parental. Exemplo 15: Expressão de xilonato desidratase heteróloga na ce- pa coprodutora de MEG + acetona - por meio da via de xilonato
[00631] A cepaMG1655 de E. coli K12 foi usada como hospedeira para a deleção de dois genes que poderiam desviar o fluxo de carbono da via de MEG + Acetona: aldA e xylA. Os genes foram deletados com sucesso e as deleções foram confirmadas por PCR e sequenciamento.
[00632] A próxima etapa foi a integração da via de MEG. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor proD contendo o gene xdh (xilose desidrogenase) e o gene fucO (glicoaldeído redutase), codifi- cando respectivamente a primeira e a última enzima da via do xilonato, foi integrado no genoma de E. coli e uma cópia adicional do gene xdh também sob controle do promotor proD foi integrado em diferentes /o- ci.
[00633] A última etapa foi a integração da via da acetona. Um ope- ron expresso sob o controle do promotor OXB11 contendo o gene thlA (acetoacetil-CoA tiolase); Os genes atoAD (acetato:acetoacetil-CoA transferase) e o gene adc (acetoacetato descarboxilase) foram inte- grados ao genoma de E. coli, gerando a cepa base. Todas as integra- ções foram confirmadas por PCR e sequenciamento. Plasmídeos con-
tendo diferentes sequências que codificam a terceira enzima da via do xilonato (xilonato desidratase), foram expressos sob o controle do promotor OXB11 em uma cadeia principal do vetor pZS*. Os plasmí- deos foram construídos usando um Kkit comercial In-fusion e confirma- dos por sequenciação. Os plasmídeos confirmados foram transforma- dos na cepa base. As colônias das transformações foram inoculadas em 5 mL de meio mineral contendo 12,85 g/L de xilose e 2,15 g/L de glicose para pré-cultivo. Após 16 horas de cultivo, 5 % da pré-cultura foi transferida para 100 mL de meio fresco. Os frascos foram incuba- dos a 37 ºC, 250 rpm até o consumo completo de glicose e xilose. À OD inicial do cultivo foi de 0,1. Para todas as cepas, a xilose foi total- mente consumida após 48 horas de cultivo.
[00634] Após 24 horas de cultivo, aproximadamente 0,8 g/L de MEG puderam ser detectados na cepa origem, enquanto 1,3 até 1,8 g/L puderam ser detectados ao mesmo tempo em cepas contendo xi- lonato desidratase expresso em plasmídeos (FIG. 23A). Todas as ce- pas produziram aproximadamente 4 g/L de MEG em 48 h de cultivo enquanto a quantidade total de acetona foi aumentada 1,5 a 2,2 vezes (FIG. 23B), provavelmente relacionado à maior produção de ácido acético (FIG. 23C). O pico de produção de ácido xilônico diminuiu em até 70 % (FIG. 23D). A expressão da xilonato desidratase proporcio- nou melhora na velocidade de coprodução em relação à cepa parental.
MODALIDADES ENUMERADAS
[00635] “Modalidade 1. Um método para modular o fluxo de carbono através da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3, o método que compreen- de: modificar um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: i. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintase (mgsA), e/ou ii interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida ou exibe um rendimento e/ou título au- mentado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sintases e/ou glioxilato carboligases.
[00636] Modalidade 2.O método da modalidade 1, em que os com- postos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e prope- no.
[00637] “Modalidade 3. O método da modalidade 1, em que a inter- rupção é selecionada a partir de uma deleção, uma mutação pontual, uma substituição, uma inserção ou uma mudança da matriz de leitura.
[00638] “Modalidade 4.O método da modalidade 3, em que a dele- ção compreende a deleção de uma ou mais sequências de ácido nu- cleico.
[00639] “Modalidade 5.O método da modalidade 1, em que a trans- lação de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam pa- ra metilglioxal sintase e/ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam para glioxilato carboligase é reduzida em pelo menos 50 Y%.
[00640] “Modalidade 6. O método da modalidade 1, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápi- da e com um rendimento ou título aumentado.
[00641] “Modalidade 7. O método da modalidade 1, em que uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam para metilglioxal sin- tetase e uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboligase são interrompidas.
[00642] “Modalidade 8. O método da modalidade 1, em que o micró-
bio é uma bactéria ou fungo.
[00643] “Modalidade 9.O método da modalidade 8, em que o micró- bio é seleccionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00644] “Modalidade 10. O método da modalidade 8, em que a bac- téria é uma Escherichia coli.
[00645] “Modalidade 11. O método da modalidade 1, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00646] Modalidade 12. O método da modalidade 11, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00647] “Modalidade 13. O método da modalidade 11, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00648] “Modalidade 14. O método da modalidade 1, em que o MEG é produzido a uma taxa mais rápida.
[00649] “Modalidade 15.O método da modalidade 14, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00650] Modalidade 16. O método da modalidade 14, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00651] Modalidade 17. O método da modalidade 1, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00652] Modalidade 18. O método da modalidade 17, em que a ace- tona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00653] “Modalidade 19. O método da modalidade 18, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00654] “Modalidade 20. O método da modalidade 18, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00655] “Modalidade 21.O método da modalidade 17, em que a ace- tona é produzida a uma taxa mais rápida.
[00656] Modalidade 22.O método da Modalidade 21, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00657] “Modalidade 23.O método da modalidade 21, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00658] “Modalidade 24.O método da Modalidade 1, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00659] Modalidade 25.O método da Modalidade 1, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00660] Modalidade 26.O método da Modalidade 1, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00661] Modalidade 27. O método da Modalidade 1, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00662] Modalidade 28. O método da Modalidade 1, em que o mi- cróbio utiliza xilose, glicose e/ou uma mistura de xilose e glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00663] “Modalidade 29. O método da Modalidade 1, em que o mi- cróbio utiliza arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00664] “Modalidade 30. Um micróbio recombinante capaz de co- produzir MEG e um ou mais compostos C3 por: (i) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam a metilglioxal sintase (mgsA), e/ou (ii) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam glioxilato carboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida ou exibe um rendimento ou título aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sinta- ses e/ou glioxilato carboligases.
[00665] “Modalidade 31. O micróbio recombinante da Modalidade 30, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00666] Modalidade 32. O micróbio recombinante da Modalidade 31, em que a interrupção é selecionada a partir de uma deleção, uma mutação pontual, uma substituição, uma inserção ou uma mudança da matriz de leitura.
[00667] “Modalidade 33. O micróbio recombinante da modalidade 32, em que a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico.
[00668] “Modalidade 34. O micróbio recombinante da Modalidade 30, em que a translação de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a metilglioxal sintase e/ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a glioxilato carboligase é reduzida em pelo menos 50 %.
[00669] “Modalidade 35. O micróbio recombinante da modalidade 30, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e com um rendimento ou título aumentado.
[00670] Modalidade 36. O micróbio recombinante da modalidade
30, em que uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam para metilglioxal sintase e uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica glioxilato carboligase são interrompidas.
[00671] “Modalidade 37. O micróbio recombinante da modalidade 30, em que o micróbio é uma bactéria ou um fungo.
[00672] “Modalidade 38. O micróbio recombinante da Modalidade 37, em que o micróbio é selecionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Baci- Ilus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00673] Modalidade 39. O micróbio recombinante da modalidade 38, em que a bactéria é uma Escherichia coli.
[00674] “Modalidade 40. O micróbio recombinante da modalidade 30, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00675] “Modalidade 41. O micróbio recombinante da modalidade 40, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00676] Modalidade 42. O micróbio recombinante da modalidade 40, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00677] Modalidade 43. O método da modalidade 30, em que o MEG é produzido a uma taxa mais rápida.
[00678] “Modalidade 44.O método da modalidade 43, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00679] “Modalidade 45.O método da modalidade 43, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00680] “Modalidade 46. O micróbio recombinante da modalidade 30, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00681] “Modalidade 47. O micróbio recombinante da modalidade 46, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00682] “Modalidade 48. O micróbio recombinante da modalidade
47, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00683] “Modalidade 49. O micróbio recombinante da modalidade 47, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00684] “Modalidade 50.O método da modalidade 46, em que a ace- tona é produzida a uma taxa mais rápida.
[00685] Modalidade 51. O método da modalidade 50, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00686] Modalidade 52.O método da Modalidade 50, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00687] “Modalidade 53.O método da Modalidade 30, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00688] “Modalidade 54.O método da Modalidade 30, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00689] Modalidade 55.O método da Modalidade 30, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00690] Modalidade 56. O método da Modalidade 30, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00691] “Modalidade 57. O micróbio recombinante da Modalidade 30, em que o micróbio utiliza xilose, glicose e/ou uma mistura de xilose e glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00692] “Modalidade 58. O micróbio recombinante da Modalidade 30, em que o micróbio utiliza arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00693] “Modalidade 59. O método para modular o fluxo de carbono através da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3, o método caracterizado pelo fato de que compreende: modificar um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes: i. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma fosfato acetiltransferase, ii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma cinase de acetato, iii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma piruvato oxidase, iv. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam um regulador ArcA, v. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma lisina acetiltransferase, vi. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam um regulador CobB, e vii. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam uma acetil-CoA sinte- tase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ-
zidos a uma taxa mais rápida ou exibem um rendimento ou título au- mentado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a superexpressão dos polinucleotídeos endógenos ou exógenos de qualquer um ou mais de i-vii.
[00694] “Modalidade 60. O método da Modalidade 59, em que a in- terrupção é selecionada a partir de uma deleção, uma mutação pontu- al, uma substituição, uma inserção ou uma mudança da matriz de lei- tura.
[00695] “Modalidade 61. O método da Modalidade 60, em que a de- leção compreende a deleção de uma ou mais sequências de ácido nu- cleico.
[00696] Modalidade 62. O método da Modalidade 59, em que a translação de um ou mais polipeptídeos em i-v é reduzida em pelo menos 50 %.
[00697] “Modalidade 63. O método da Modalidade 59, em que uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam pelo menos dois dos seguintes polipeptídeos são interrompidas: fosfato acetiltransfera- se, acetato cinase, piruvato oxidase, regulador ArcA e lisina acetil- transferase.
[00698] “Modalidade 64. O método da Modalidade 59, em que a su- perexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 5 % do polipeptídeo codificado por uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas.
[00699] “Modalidade 65. O método da Modalidade 59, em que a su- perexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 30 % do polipeptídeo codificado por uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas.
[00700] “Modalidade 66. O método da Modalidade 59, em que a su-
perexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 70 % do polipeptídeo codificado por uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas.
[00701] “Modalidade 67. O método da Modalidade 59, em que a su- perexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 300 % do poli- peptídeo codificado por uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas.
[00702] “Modalidade 68. O método da Modalidade 59, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00703] “Modalidade 69. O método da Modalidade 59, em que o mi- cróbio é uma bactéria ou fungo.
[00704] “Modalidade 70.O método da modalidade 69, em que o mi- cróbio é seleccionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00705] “Modalidade 71. O método da modalidade 59, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00706] Modalidade 72. O método da modalidade 71, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00707] Modalidade 73. O método da modalidade 71, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00708] Modalidade 74. O método da Modalidade 59, em que o MEG é produzido em uma taxa mais rápida.
[00709] “Modalidade ?75.O método da Modalidade 74, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00710] Modalidade 76. O método da Modalidade 74, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00711] “Modalidade 77. O método da Modalidade 59, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00712] “Modalidade 78. O método da modalidade 77, em que a ace- tona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00713] Modalidade 79. O método da Modalidade 78, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00714] Modalidade 80. O método da modalidade 78, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00715] “Modalidade 81. O método da modalidade 77, em que a ace- tona é produzida a uma taxa mais rápida.
[00716] Modalidade 82.O método da Modalidade 81, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00717] “Modalidade 83.O método da Modalidade 81, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00718] Modalidade 84.O método da Modalidade 59, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00719] “Modalidade 85.O método da Modalidade 59, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00720] “Modalidade 86.O método da Modalidade 59, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00721] “Modalidade 87. O método da Modalidade 59, em que
(i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00722] “Modalidade 88. O método da Modalidade 59, em que o mi- cróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na co- produção do MEG e um ou mais compostos C3.
[00723] Modalidade 89. O método da Modalidade 59, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00724] “Modalidade 90. Micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio coproduz MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes: i. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma fosfato acetiltransferase, ii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma cinase de acetato, iii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma piruvato oxidase, iv. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam um regulador ArcA, v. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam uma lisina acetiltransferase, vi. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam um regulador CobB, e vii. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam uma acetil-CoA sinte- tase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida ou exibem um rendimento ou título au-
mentado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a superexpressão dos polinucleotídeos endógenos ou exógenos de qualquer um ou mais de i-vii.
[00725] “Modalidade 91. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a interrupção é selecionada a partir de uma deleção, uma mutação pontual, uma substituição, uma inserção ou uma mudança da matriz de leitura.
[00726] Modalidade 92. O micróbio recombinante da Modalidade 91, em que a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequên- cias de ácido nucleico.
[00727] Modalidade 93. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a translação de um ou mais polipeptídeos em i-v é reduzi- da em pelo menos 50 %.
[00728] Modalidade 94. O micróbio recombinante da Modalidade 92, em que uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam pelo menos dois dos seguintes polipeptídeos são interrompidas: fosfa- to acetiltransferase, acetato cinase, piruvato oxidase, regulador ArcA e lisina acetiltransferase.
[00729] “Modalidade 95. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 5 % do polipeptídeo codificado por um ou mais polinucleo- tídeos endógenos ou exógenos sequências.
[00730] Modalidade 96. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 30 % do polipeptídeo codificado por um ou mais polinucle- otídeos endógenos ou exógenos sequências.
[00731] “Modalidade 97. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo-
tídicas endógenas ou exógenas em vi e/ou vii produz um aumento de pelo menos 70 % do polipeptídeo codificado por um ou mais polinucle- otídeos endógenos ou exógenos sequências.
[00732] Modalidade 98. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 30 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas.
[00733] Modalidade 99. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 70 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas.
[00734] “Modalidade 100. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 300 % do polipeptídeo codificado por uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas.
[00735] “Modalidade 101. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00736] Modalidade 102. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que o micróbio é uma bactéria ou fungo.
[00737] “Modalidade 103. O micróbio recombinante da Modalidade 102, em que o micróbio é selecionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Baci- Ilus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00738] Modalidade 104. Micróbio recombinante da Modalidade 90, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00739] “Modalidade 105. O micróbio recombinante da Modalidade
104, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00740] “Modalidade 106. O micróbio recombinante da Modalidade 104, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00741] “Modalidade 107. O método da Modalidade 90, em que o MEG é produzido a uma taxa mais rápida.
[00742] “Modalidade 108. O método da Modalidade 107, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00743] “Modalidade 109. O método da Modalidade 107, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00744] “Modalidade 110. O micróbio recombinante da Modalidade 90, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00745] “Modalidade 111. O micróbio recombinante da Modalidade 110, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00746] Modalidade 112. O micróbio recombinante da Modalidade 111, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00747] “Modalidade 113. O micróbio recombinante da Modalidade 111, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00748] “Modalidade 114. O método da Modalidade 110, em que a acetona é produzida em uma taxa mais rápida.
[00749] “Modalidade 115. O método da Modalidade 114, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00750] Modalidade 116. O método da Modalidade 114, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00751] Modalidade 117. O método da Modalidade 90, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %, e
[00752] (i)o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00753] “Modalidade 118. O método da Modalidade 90, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00754] “Modalidade 119. O método da Modalidade 90, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00755] “Modalidade 120.O método da Modalidade 90, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00756] Modalidade 121. O método da Modalidade 90, em que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00757] “Modalidade 122. O método da modalidade 90, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00758] “Modalidade 123. O método para modular o fluxo de carbo- no através da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3, o método caracterizado pelo fato de que compreende: modificar um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes: i. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, ii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonolactonase, iii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, iv. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi- D-glicerol pentanona aldolase, v. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidra- tase, vi. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3- desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, e vii. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas que codificam uma glicoaldeído redu- tase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida ou exibem um rendimento ou título au- mentado; em comparação com um micróbio sem as enzimas introdu- zidas endógenas ou exógenas e/ou a superexpressão das enzimas endógenas ou exógenas de qualquer um ou mais de i-vil.
[00759] “Modalidade 124. O método da Modalidade 123, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas exó- genas que codificam uma xilose desidrogenase.
[00760] “Modalidade 125. O método da Modalidade 123, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam uma xilonolactonase.
[00761] “Modalidade 126. O método da Modalidade 123, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas en-
dógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase.
[00762] “Modalidade 127. O método da Modalidade 123, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase.
[00763] Modalidade 128. O método da Modalidade 123, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase.
[00764] “Modalidade 129. O método da Modalidade 123, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase.
[00765] “Modalidade 130. O método da Modalidade 123, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências polinucleotídicas en- dógenas ou exógenas que codificam uma glicoaldeído redutase.
[00766] Modalidade 131. O método da Modalidade 123, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 5 % da enzi- ma codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endóge- nas ou exógenas.
[00767] “Modalidade 132. O método da Modalidade 123, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 30 % da en- zima codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas.
[00768] “Modalidade 133. O método da Modalidade 123, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 70 % da en- zima codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas.
[00769] “Modalidade 134. O método da Modalidade 123, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas produz um aumento de pelo menos 300 % da en- zima codificada por uma ou mais sequências polinucleotídicas endó- genas ou exógenas.
[00770] Modalidade 135. O método da Modalidade 123, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00771] Modalidade 136. O método da Modalidade 123, em que o micróbio é uma bactéria ou fungo.
[00772] Modalidade 137. O método da Modalidade 136, em que o micróbio é selecionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00773] Modalidade 138. O método da Modalidade 123, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00774] Modalidade 139. O método da Modalidade 138, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00775] “Modalidade 140. O método da Modalidade 138, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00776] Modalidade 141. O método da Modalidade 123, em que o MEG é produzido a uma taxa mais rápida.
[00777] Modalidade 142. O método da Modalidade 138, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00778] Modalidade 143. O método da Modalidade 138, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00779] “Modalidade 144. O método da Modalidade 123, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00780] “Modalidade 145. O método da Modalidade 144, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00781] “Modalidade 146. O método da Modalidade 145, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00782] “Modalidade 147. O método da Modalidade 145, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00783] Modalidade 148. O método da Modalidade 144, em que a acetona é produzida em uma taxa mais rápida.
[00784] “Modalidade 149. O método da Modalidade 148, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00785] “Modalidade 150. O método da Modalidade 148, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00786] Modalidade 151.O método da Modalidade 123, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 % e/ou
[00787] (i)oum ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00788] Modalidade 152.O método da Modalidade 123, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00789] “Modalidade 153. O método da Modalidade 123, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00790] “Modalidade 154. O método da Modalidade 123, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00791] “Modalidade 155. O método da Modalidade 123, em que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00792] “Modalidade 156. O método da Modalidade 123, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00793] Modalidade 157. Micróbio recombinante capaz de coprodu- zir MEG e um ou mais compostos C3, em que o micróbio coproduzin- do MEG e um ou mais compostos C3 compreende um ou mais dos seguintes: i. uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, ii. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonolactonase, iii. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, iv. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, v. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desidratase, vi. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D-glicerol pen- tanona aldolase, e vii. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma glicoaldeído redutase; em que as enzimas de v-vii são superexpressas em compa- ração com sua expressão nativa; e em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida ou exibem um rendimento ou título au-
mentado; em comparação com um micróbio sem as enzimas introdu- zidas endógenas ou exógenas e/ou sem a superexpressão das enzi- mas endógenas ou exógenas de qualquer um ou mais de i-vil.
[00794] “Modalidade 158. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinu- cleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase.
[00795] “Modalidade 159. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonolacto- nase.
[00796] Modalidade 160. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato desi- dratase.
[00797] “Modalidade 161. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio compreende uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase.
[00798] Modalidade 162. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências poli- nucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma xilonato de- sidratase.
[00799] “Modalidade 163. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências poli- nucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase.
[00800] “Modalidade 164. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio superexpressa uma ou mais sequências poli- nucleotídicas endógenas ou exógenas que codificam uma glicaldeído redutase.
[00801] “Modalidade 165. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo me- nos 5 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas ou exógenas.
[00802] “Modalidade 166. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo me- nos 30 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas.
[00803] “Modalidade 167. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo me- nos 70 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas.
[00804] “Modalidade 168. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que a superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas produz um aumento de pelo me- nos 300 % da enzima codificada por uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas ou exógenas.
[00805] “Modalidade 169. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00806] Modalidade 170. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio é uma bactéria ou fungo.
[00807] “Modalidade 171. O micróbio recombinante da Modalidade 170, em que o micróbio é selecionado de um dos seguintes gêneros: Escherichia, Corynebacterium, Saccharomyces, Lactobacillus, Baci- Ilus, Clostridium, Pichia e Aspergillus.
[00808] “Modalidade 172. O micróbio recombinante da modalidade
157, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00809] “Modalidade 173. O micróbio recombinante da Modalidade 172, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00810] Modalidade 174. O micróbio recombinante da Modalidade 172, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00811] “Modalidade 175. O método da Modalidade 157, em que o MEG é produzido a uma taxa mais rápida.
[00812] “Modalidade 176. O método da Modalidade 175, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00813] Modalidade 177. O método da Modalidade 175, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00814] “Modalidade 178. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00815] “Modalidade 179. O micróbio recombinante da Modalidade 178, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00816] Modalidade 180. O micróbio recombinante da Modalidade 179, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 5 %.
[00817] “Modalidade 181. O micróbio recombinante da Modalidade 179, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 30 %.
[00818] Modalidade 182. O método da modalidade 178, em que a acetona é produzida a uma taxa mais rápida.
[00819] “Modalidade 183. O método da Modalidade 182, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 2 %.
[00820] “Modalidade 184. O método da Modalidade 182, em que a taxa mais rápida é um aumento de pelo menos 15 %.
[00821] “Modalidade 185. O método da Modalidade 157, em que
(1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 2 %.
[00822] “Modalidade 186. O método da Modalidade 157, em que (1) o MEG exibe um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %, e (ii) o um ou mais compostos C3 exibem um rendimento ou título aumentado de pelo menos 15 %.
[00823] “Modalidade 187.O método da Modalidade 157, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 2 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 2 %.
[00824] “Modalidade 188. O método da Modalidade 157, em que (i) a taxa de produção de MEG exibe um aumento de pelo menos 15 %, e (ii) a taxa de produção de um ou mais compostos C3 exibe um aumento de pelo menos 15 %.
[00825] “Modalidade 189. Micróbio recombinante da Modalidade 157, em que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00826] Modalidade 190. O micróbio recombinante da Modalidade 157, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00827] “Modalidade 191. O método de modulação do fluxo de car- bono através da via de biossíntese de monoetileno glicol (MEG) e uma ou mais vias de biossíntese de compostos C3, o método caracterizado pelo fato de que compreende: modificar um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: i. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoAsintase e/ou ii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título au- mentado; em comparação com um micróbio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril-CoA sintase e/ou hidroxime- tilglutaril-CoA liase.
[00828] Modalidade 192. O método da Modalidade 191, em que o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais sequências poli- nucleotídicas que codificam acetoacetil-CoA tiolase.
[00829] “Modalidade 193. O método da Modalidade 191, em que o micróbio carece de uma acetoacetil-CoA tiolase funcional.
[00830] “Modalidade 194. O método da Modalidade 191, em que o micróbio compreende uma acetoacetil-CoA tiolase funcional.
[00831] “Modalidade 195. O método da Modalidade 191, em que o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais sequências poli- nucleotídicas que codificam a acetoacetil-CoA transferase (AtoDA).
[00832] “Modalidade 196. O método da Modalidade 191, em que o micróbio compreende uma acetoacetil-CoA transferase funcional (Ato- DA).
[00833] “Modalidade 197. O método da Modalidade 192 ou Modali- dade 195 em que a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas.
[00834] “Modalidade 198. O método da Modalidade 191, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00835] “Modalidade 199. O método da Modalidade 191, em que o micróbio é uma bactéria ou um fungo.
[00836] Modalidade 200. O método da Modalidade 199, em que a bactéria é uma Escherichia coli.
[00837] “Modalidade 201. O método da Modalidade 191, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00838] Modalidade 202. O método da modalidade 201, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00839] Modalidade 203. O método da Modalidade 202, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00840] “Modalidade 204. O método da Modalidade 191, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00841] “Modalidade 205. O método da Modalidade 204, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00842] “Modalidade 206. O método da Modalidade 205, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00843] “Modalidade 207. O método da Modalidade 206, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00844] “Modalidade 208. O método da Modalidade 191, em que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
[00845] “Modalidade 209. O método da Modalidade 191, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00846] Modalidade 210. Micróbio recombinante capaz de coprodu- zir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: i. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoAsintase e/ou ii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos a uma taxa mais rápida e/ou exibe um rendimento ou título au- mentado; em comparação com um micróbio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril-CoA sintase e/ou hidroxime- tilglutaril-CoA liase.
[00847] “Modalidade 211. O micróbio recombinante da Modalidade 210, em que o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais se- quências polinucleotídicas que codificam acetoacetil-CoA tiolase.
[00848] “Modalidade 212. Micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio carece de uma acetoacetil-CoA tiolase funcio- nal.
[00849] “Modalidade 213. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio compreende uma acetoacetil-CoA tiolase fun- cional.
[00850] Modalidade 214. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio compreende uma deleção de uma ou mais se- quências polinucleotídicas que codificam a acetoacetil-CoA transferase (AtoDA).
[00851] Modalidade 215. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio compreende uma acetoacetil-CoA transferase funcional (AtoDA).
[00852] Modalidade 216. O micróbio recombinante da Modalidade 212 ou Modalidade 215, em que a deleção compreende a deleção de uma ou mais sequências polinucleotídicas.
[00853] “Modalidade 217. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que os compostos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
[00854] “Modalidade 218. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos a uma taxa mais rápida e/ou um rendimento ou título aumentado.
[00855] “Modalidade 219. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio é uma bactéria ou um fungo.
[00856] “Modalidade 220. O micróbio recombinante da Modalidade 219, em que a bactéria é uma Escherichia coli.
[00857] “Modalidade 221. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
[00858] “Modalidade 222. O micróbio recombinante da Modalidade 221, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 5 %.
[00859] “Modalidade 223. O micróbio recombinante da Modalidade 221, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 30 %.
[00860] “Modalidade 224. O micróbio recombinante da Modalidade 211, em que um ou mais compostos C3 são acetona.
[00861] Modalidade 225. O micróbio recombinante da Modalidade 224, em que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
[00862] “Modalidade 226. O micróbio recombinante da Modalidade 225, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
[00863] “Modalidade 227. O micróbio recombinante da Modalidade 225, em que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
[00864] “Modalidade 228. Micróbio recombinante da Modalidade 211, em que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00865] “Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publi-
cações de patentes e pedidos de patentes citados neste documento são incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins. No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, pa- tente, publicação de patente e pedido de patente citada neste docu- mento não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que constituem uma técnica anterior válida ou fazem parte do comum conhecimento geral em qualquer país do mundo. Além disso, as seguintes referências são aqui incorporadas por referência.
[00866] As vias modificadas para a coprodução de compostos MEG e C3 em micróbios são apresentadas em WOZ2017015166, US20180023101A1 e US20180179558A1.
[00867] WOZ2014102180A1, WO2014076232A2, US20150329877A1, US20170260551US 8524472 B2, US 20060073577 A1, US 2016 0265005 A1, US 7935511 B2, WO 2005087940 A1, US 20090253164 A1, US 8637286 B2, EP 1546304 B1, US 20070249018 A1, US2016 326553 A1, US 7531337 B2, US 20060073577 A1, KR101351879B1 e WO2013163230A2; e
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Claims (68)

REIVINDICAÇÕES
1. Micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a metilglioxal sintase (mgsA), e/ou (ii) uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilatecarboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sinta- ses e/ou glioxilato carboligases.
2. Micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: (i) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase, (ii) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma acetato cinase, (iii) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma piruvato oxidase, (iv) uma interrupção de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas que codificam um regulador ArcA, (v) uma interrupção de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase, (vi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam um regulador CobB, e (vii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produzidos em um título, taxa mais rápida ou exibem um rendimento aumentado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a superexpres- são dos polinucleotídeos endógenos de qualquer um ou mais de i-vii.
3. Micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: (1) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, (ii) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, (iii) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (iv) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, (v) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma xilonato desidratase, (vi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, e (vii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma glicoaldeído redutase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibem um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem as enzimas exógenas in- troduzidas e/ou a superexpressão das enzimas endógenas de qual- quer um ou mais de i-vil.
4. Micróbio recombinante capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que o micróbio compreende:
(1) uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou (ii) uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril-CoA sintase ou hidroximetilglutaril- CoA liase.
5. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modifi- cações, como definida na reivindicação 2.
6. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modifi- cações, como definida na reivindicação 3.
7. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modifi- cações, como definida na reivindicação 4.
8. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modifi- cações, como definida na reivindicação 3.
9. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modifi- cações, como definida na reivindicação 4.
10. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a modificação, como definida na reivindicação 4.
11. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais mo- dificações, como definida na reivindicação 2 ou 3.
12. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais mo- dificações, como definida em qualquer uma das reivindicações 2 e 4.
13. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais mo- dificações, como definida na reivindicação 3 ou 4.
14. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais mo- dificações, como definida na reivindicação 3 ou 4.
15. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais mo- dificações, como definida em qualquer uma das reivindicações 2, 3 e
4.
16. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: (1) uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam metilglioxal sintase (mgsA), (ii) uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompi- das que codificam glioxilato carboligase (gcl), (iii) uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma fosfato acetiltransferase, (iv) uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompi- das que codificam uma cinase de acetato, (v) uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma piruvato oxidase, (vi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas interrompidas que codificam um regulador ArcA, (vii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas interrompidas que codificam uma lisina acetiltransferase,
(viii) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam um regulador CobB, (ix) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma acetil-CoA sintetase, (x) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, (xi) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, (xii) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (xiii) uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D-glicerol pentanona aldolase, (xiv) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma xilonato desidratase, (xv) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, (xvi) uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas superexpressas que codificam uma glicoaldeído redutase, (xvii) uma ou mais sequências polinucleotídeas que codifi- cam acetoacetil CoA sintase, e (xviii) uma ou mais sequências polinucleotídicas que codifi- cam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a modificação.
17. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes:
i. uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam metilglioxal sintase (mgsA), e li. uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam glioxilato carboligase (gcl) e/ou; iii. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma fosfato acetiltransferase e/ou iv. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma cinase de acetato e/ou v. uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou vi. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou vii. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou viii. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codifi- cam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sinta- ses e qualquer uma das modificações acima.
18. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: i. uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam glioxilato carboligase (gcl); e i. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma fosfato acetiltransferase e/ou li. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma cinase de acetato e/ou iii. uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou iv. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou v. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou vi. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam vidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboli- gase (gcl) e qualquer uma das modificações acima.
19. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: i. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma fosfato acetiltransferaseae ii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídeas endógenos que codificam uma cinase de acetato, e/ou iii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou iv. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou v. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou vi. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase, e/ou; vii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam um regulador ArcA, e/ou, viii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou ix. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma fosfato aceti- Itransferase e qualquer uma das modificações acima.
20. Micróbio recombinante, caracterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: i. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas que codificam um acetato cinasea e ii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou iii. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou iv. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou v. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ-
zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a acetato cinase e qualquer uma das modificações acima.
21. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: i. uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonasea e li. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou iii. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou iv. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a xilonolactonase exóge- na introduzida ou superexpressa endógena e qualquer uma das modi- ficações acima.
22. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: i. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam um xilonato desidratado e ii. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou iii. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a xilonato desidratase exógena introduzida ou superexpressa endógena, qualquer uma das modificações acima.
23. Micróbio recombinante, capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: i. uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas su- perexpressas que codificam uma acetil-CoA sintetase; e li. uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam metilglioxal sintase (mgsA), iii. uma ou mais sequências de ácido nucleico interrompidas que codificam glioxilato carboligase (gcl) e/ou; iv. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma cinase de acetato e/ou v. uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou vi. um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo ou sequências endógenas que codificam uma xilonato desidratase e/ou vii. uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou viii. uma ou mais sequências polinucleotídicas que codifi- cam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; ix. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam um regulador ArcA, e/ou, x. uma ou mais sequências polinucleotídicas interrompidas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a acetil-CoA sintetase superexpressa endógena e qualquer uma das modificações acima.
24. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: (i) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam metilglioxal sintase (mgsA), e/ou (ii) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam glioxilatecarboligase (gcl); em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sinta- ses e/ou glioxilato carboligases.
25. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de ser capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes: (i) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase, (ii) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma acetato cinase, (iii) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma piruvato oxidase,
(iv) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam um regulador ArcA, (v) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase, (vi) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam um regulador CobB, e (vii) superexpressão de uma ou mais sequências polinucle- otídicas endógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibem um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a interrupção e/ou a su- perexpressão dos polinucleotídeos endógenos de qualquer um ou mais de i-vil.
26. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes: (i) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase, (ii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, (iii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonato desidratase, (iv) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, (v) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma xilonato desidratase, (vi) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo-
tídicas endógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, e (vii) superexpressão de uma ou mais sequências polinucle- otídicas endógenas que codificam uma glicoaldeído redutase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibem um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem as enzimas exógenas in- troduzidas e/ou a superexpressão das enzimas endógenas de qual- quer um ou mais de i-vil.
27. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: (i) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou (ii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam para hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilgluta- ril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio que não foi introduzido uma acetoacetil CoA, hidroximetilglutaril-CoA sintase ou hidroximetilglutaril- CoA liase.
28. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 25.
29. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 26.
30. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 27.
31. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 26.
32. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 27.
33. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que compreende a modificação, como definida na rei- vindicação 27.
34. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 25 ou 26.
35. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida em qualquer uma das reivindicações 25 e 27.
36. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 26 ou 27.
37. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida na reivindicação 26 ou 27.
38. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais modificações, como de- finida em qualquer uma das reivindicações 25, 26 e 27.
39. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por:
modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 realizando um ou mais dos seguintes:
(i) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam a metilglioxal sintase (masA),
(ii) interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam glioxilato carboligase (gcl),
(iii) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase,
(iv) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma cinase de acetato,
(v) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma piruvato oxidase,
(vi) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam um regulador ArcA,
(vii) interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase,
(viii) superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas que codificam um regulador CobB,
(ix) superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase,
(x) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilose desidrogenase,
(xi) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam uma xilonolactonase,
(xii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam uma xilonato desidratase,
(xiii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam um ácido de açúcar de 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase,
(xiv) superexpressão de uma ou mais sequências polinu-
cleotídicas endógenas que codificam uma xilonato desidratase, (xv) superexpressão de uma ou mais sequências polinucle- otídicas endógenas que codificam um ácido de açúcar 3-desóxi-D- glicerol pentanona aldolase, (xvi) superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas que codificam uma glicoaldeído redutase, (xvii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam acetoacetil CoA sintase, e (xviii) introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril- CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a modificação.
40. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: ix. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam metilglioxal sintase (mgsA), e x. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam glioxilato carboligase (gcl) e/ou; xi. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase e/ou xii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotí- deas endógenos que codificam uma cinase de acetato, e/ou xiii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou xiv. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou xv. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou xvi. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril- CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam metilglioxal sinta- ses e qualquer uma das modificações acima.
41. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: ii. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam glioxilato carboligase (gcl); e vii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase e/ou viii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotí- deas endógenos que codificam uma cinase de acetato, e/ou ix. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou x. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou xi. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou xii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam glioxilato carboli- gase (gcl) e qualquer uma das modificações acima.
42. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: x. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma fosfato acetiltransferase xi. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídeas endógenas que codificam uma cinase de acetato, e/ou xii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou xiii. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou xiv. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou xv. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase, e/ou; xvi. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam um regulador ArcA, e/ou, xvii. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi-
cas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou xviii. superexpressão de uma ou mais sequências polinu- cleotídicas endógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma fosfato aceti- Itransferase e qualquer uma das modificações acima.
43. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: vi. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídicas endógenas que codificam um acetato cinase e vii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou viii. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou ix. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou x. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem uma interrupção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam a acetato cinase e qualquer uma das modificações acima.
44. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: v. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonasea e vi. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou vii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou viii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril- CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a xilonolactonase exóge- na introduzida ou superexpressa endógena e qualquer uma das modi- ficações acima.
45. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: iv. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e v. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídeas que codificam acetoacetil CoA sintase, e/ou vi. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase; em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a xilonato desidratase exógena introduzida ou superexpressa endógena, qualquer uma das modificações acima.
46. Método de produção de um micróbio recombinante, ca- racterizado pelo fato de que é capaz de coproduzir MEG e um ou mais compostos C3 por: modificação de um micróbio coprodutor de MEG e um ou mais compostos C3 por: xi. superexpressão de uma ou mais sequências polinucleo- tídicas endógenas que codificam uma acetil-CoA sintetase; e xii. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam a metilglioxal sintase (masA), xiii. interrupção de uma ou mais sequências de ácido nu- cleico que codificam glioxilato carboligase (gcl) e/ou; xiv. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotí- deas endógenos que codificam uma cinase de acetato, e/ou xv. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídicas exógenas que codificam uma xilonolactonase, e/ou xvi. introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos ou sequências ou superexpressão de um polinucleotídeo endógeno ou sequências que codificam uma xilonato desidratase e/ou xvii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam acetoacetil CoA sintase e/ou xviii. introdução de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas que codificam hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril- CoA liase; xix. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam um regulador ArcA, e/ou, xx. interrupção de uma ou mais sequências polinucleotídi- cas endógenas que codificam uma lisina acetiltransferase e/ou em que o MEG e/ou um ou mais compostos C3 são produ- zidos em um título, taxa mais rápida ou exibe um rendimento aumen- tado; em comparação com um micróbio sem a acetil-CoA sintetase superexpressa endógena e qualquer uma das modificações acima.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 46, caracterizado pelo fato de que o micróbio é uma bactéria ou um fungo.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a bactéria é uma Escherichia coli.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 46, caracterizado pelo fato de que o MEG exibe um rendi- mento ou título aumentado.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 46, caracterizado pelo fato de que o um ou mais compostos C3 são acetona.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que a acetona exibe um rendimento ou título aumenta-
do.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 2 %.
55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o rendimento ou título aumentado é um aumento de pelo menos 15 %.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 46, caracterizado pelo fato de que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodução do MEG e um ou mais compostos C3.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 46, caracterizado pelo fato de que os compostos C3 são se- lecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
58. Micróbio recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o micróbio é uma bactéria ou um fungo.
59. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma Escherichia coli.
60. Micróbio recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o MEG exibe um rendimento ou título aumentado.
61. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o aumento do rendimento ou título é um aumento de pelo menos 2 %.
62. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o aumento do rendimento ou título é um aumento de pelo menos 15 %.
63. Micróbio recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o um ou mais compostos C3 são acetona.
64. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a acetona exibe um rendimento ou título aumentado.
65. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o aumento do rendimento ou título é um aumento de pelo menos 2 %.
66. Micróbio recombinante, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o aumento do rendimento ou título é um aumento de pelo menos 15 %.
67. Micróbio recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o micróbio utiliza xilose, celobiose, arabinose, manose e/ou glicose na coprodu- ção do MEG e um ou mais compostos C3.
68. Micróbio recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que os compos- tos C3 são selecionados a partir de acetona, isopropanol e propeno.
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