KR101351879B1 - 에탄―１，２―디올 생산 미생물 및 이를 이용한 에탄―１，２―디올 생산 방법 - Google Patents

에탄―１，２―디올 생산 미생물 및 이를 이용한 에탄―１，２―디올 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 에탄-1,2-디올의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장균에서 게놈 DNA내 D-자일로스 이소메라아제 유전자 및/또는 알데히드 디히드로게나제 유전자를 녹아웃시키고, D-자일로스 디히드게나제 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시켜 제조된 형질전환 대장균, 및 상기 형질전환 대장균을 이용하여 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

에탄―１，２―디올 생산 미생물 및 이를 이용한 에탄―１，２―디올 생산 방법{ethane―１，２－diol producing microorganism and a method for producinig ethane―１，２－diol using the same}
본 발명은 에탄-1,2-디올의 생합성 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 에탄-1,2-디올의 생산 방법에 관한 것이다.
에탄-1,2-디올(Ethane-1,2-diol; 에틸렌 글리콜; Ethylene glycol; EG)은 중합체 전구체 뿐만 아니라 부동액 및 냉각수로 흔히 사용되는 화합물이다(비특허문헌 1 및 2 참조). 에탄-1,2-디올의 세계적인 수요는 점진적으로 확장되고 있으며, 구체적으로 세계적인 수요가 2010년에 17.8백만 톤에 도달하였으며, 2014년에 약 23.6백만 톤까지 성장할 것으로 기대된다(비특허문헌 3 참조). 현재, 에탄-1,2-디올은 석유화학산업에서 주요한 생산물인 에틸렌(ethylene)으로부터 상업적으로 생산(비특허문헌 4 참조)되기 때문에 생산이 화석 연료에 의존적이고 제한된다. 화석 자원 대신에 재생가능한 바이오매스로부터 화학 약품 및 물질을 생산하는 기술적 발달에 대한 세계적인 요구에 의해, 최근에는 바이오매스로부터 에탄-1,2-디올을 생산하는 녹색 화학 기술들이 보고된바 있다(비특허문헌 5 참조). 이런 기술로는 4.0 MPa의 H2 및 473 K 반응 온도에서 Ru/C 촉매에 의한 자일리톨을 가수소분해하는 기술(비특허문헌 6 참조), 및 리그노셀룰로직 바이오매스(lignocellulosic biomass)를 급속하게 열분해한 다음 수소화 공정과 제올라이트(zeolite) 촉매작용의 조합을 수행하는 기술(비특허문헌 7 참조)을 포함한다. 이런 기술들의 공통적인 특징은 높은 압력 및 온도의 조건, 및 복잡한 다운스트림의 에탄-1,2-디올 분리 공정을 진행하여 다양한 생산물을 형성하는 것이다. 그러나, 지금까지 에탄-1,2-디올에 대한 생합성(biosynthesis)에 관한 기술은 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 에탄-1,2-디올의 생합성 방법을 개발하기 위해 예의노력한 결과, 리그노셀룰로직 공급원료(lignocellulosic feedstock)에서 두 번째로 풍부한 당(sugar)인 D-자일로스(D-xylose)로부터 에탄-1,2-디올을 생산하기 위한 생합성 루트를 설계하였고, 이런 생합성 루트를 대장균(Escherichia coli)에 적용시켜 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 대량 생산할 수 있고 부산물을 현저히 낮게 생산할 수 있는 형질전환 대장균을 제조하였으며, 상기 형질전환 대장균을 이용하여 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 효율적인 생산이 가능함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 리그노셀룰로직 공급원료에서 두 번째로 풍부한 당인 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 효율적으로 생산하기 위한 생합성 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명에 따른 에탄-1,2-디올의 생합성 루트를 수행할 수 있도록 제조되어 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 생산할 수 있는 형질전환 대장균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 대장균을 D-자일로스를 포함한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄-1,2-디올을 생산하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 에탄-1,2-디올의 생합성 루트를 수행할 수 있도록 대장균에 유전자 파괴 및 삽입시키는 단계를 포함하는 형질전환 대장균의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 생산하기 위한 생합성 루트를 설계하고, 이런 생합성 루트를 대장균에 적용시켜 D-자일로스를 기질로 이용하여 에탄-1,2-디올을 높은 농도 및 수율로 생산하면서 부산물은 현저히 낮게 생산할 수 있음을 확인함으로써, 에탄-1,2-디올을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 에탄-1,2-디올의 생합성 기술에 관한 최초의 발명이므로 추후 에탄-1,2-디올의 생물학적 생산 방법의 개발을 위한 지침을 제공한다.
도 1은 에틸렌 글리콜의 화학 합성을 나타내는 그림이다(a반응 조건: 473 K, 4.0 MPa H2, Ru/C).
도 2는 대장균에서 에틸렌 글리콜 생산을 위한 생합성 루트를 나타내는 그림이다a:
a효소: (1) D-자일로스 디히드로게나아제(D-xylose dehydrogenase)(카우로박터 크리센튜스);
(2) D-크실론산 디히드라타아제(D-xylonic acid dehydratase)(대장균);
(3) 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)(대장균);
(4) 디히드로게나아제(대장균);
(b1) D-자일로스 이소메라아제(D-xylose isomerase)(대장균); 및
(b2) 알데히드 디히드로게나아제(대장균).
도 3은 대장균을 이용하여 D-자일로스로부터 에틸렌 글리콜을 생산하는 경로를 나타내는 그림이다.
도 4는 pET28a-cxylB 벡터 맵을 나타내는 그림이다.
도 5는 대장균(E. coli)에서 에탄-1,2-글리콜 생합성의 HPLC 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 시료는 E. coli W3110 △ xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB의 48시간 발효로부터 채취하였다.
도 6은 대장균에서 에탄-1,2-글리콜 생합성의 GC 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 시료는 E. coli W3110 △ xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB의 48시간 발효로부터 채취하였다. IS는 내부 표준(internal standard)으로서 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)을 나타낸다.
도 7은 대장균에서 에탄-1,2-글리콜 생합성의 GC-MS 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 시료는 E. coli W3110 △ xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB의 48시간 발효로부터 채취하였다. IS는 내부 표준으로서 1,3-프로판디올을 나타낸다.
도 8은 E. coli W3110 △ xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB에서 에탄-1,2-글리콜의 시간 경로(Time course)를 나타내는 그래프이다.
도 9는 E. coli BW25113 △ aldA △ xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB에서 에탄-1,2-글리콜의 시간 경로를 나타내는 그래프이다.
도 10은 피루브산을 에탄-1,2-글리콜로 전환시키기 위한 2가지 다르게 설계된 생합성 루트를 나타내는 그림이다a:
a효소: (a1) 피루브산 디히드로게나아제(Pyruvate dehydrogenase)(대장균);
(a2) 시트르산 신타아제(Citrate synthase)(대장균);
(a3) 시트르산 히드로리아제(Citrate hydro-lyase)(대장균);
(a4) 이소시트르산 리아제(Isocitrate lyase)(대장균);
(a5) 글리콜산 옥시다아제(Glycolate oxidase)(대장균);
(a6), (a7) 및 (b6) 알데히드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase)(대장균);
(b1) 포스포에놀피루브산 신타아제(Phosphoenolpyruvate synthetase)(대장균);
(b2) 에놀라아제(Enolase)(대장균);
(b3) 2-포스포-글리세르산 포스파타아제(2-phospho-glycerate phosphatase)(베일로넬라 알칼레스켄스((Veillonella alcalescens));
(b4) 히드록시피루브산 리덕타아제(hydroxypyruvate reductase)(대장균); 및
(b5) 광범위하게 유효한 기질 디카르복실라아제(wide-range-substrate decarboxylase)(슈도노마스 푸리타(Pseudomonas putida); 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대장균(Escherichia coli)에서 게놈 DNA내 D-자일로스 이소메라아제(D-xylose isomerase) 유전자 xylA를 녹아웃(knock-out)시키고, 상기 대장균을 D-자일로스 디히드게나제(D-xylose dehydrogenase) 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터로 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는, D-자일로스(D-xylose)로부터 에탄-1,2-디올(ethane-1,2-diol)의 생산능을 가진 형질전환 대장균을 제공한다.
상기 형질전환 대장균은 수탁번호 KCTC 12100BP로 기탁된 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 대장균에서 게놈 DNA내 알데히드 디히드로게나제(aldehyde dehydrogenase) 유전자 aldA 및 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 녹아웃시키고, 상기 대장균을 D-자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터로 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균을 제공한다.
상기 형질전환 대장균은 수탁번호 KCTC 12117BP로 기탁된 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 대장균에 있어서, D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 대장균에 있어서, 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 대장균에 있어서, D-자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB는 카우로박터 크리센튜스(C. crescentus)로부터 유래된 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 대장균에 있어서, 발현벡터는 pET28a 벡터를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 대장균 내에서 삽입한 목적 유전자를 발현할 수 있는 벡터는 모두 사용가능하다.
상기 형질전환 대장균에 있어서, 대장균은 E. coli W3110 또는 E. coli BW25113를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 모든 대장균 종이 사용가능하다.
상기 형질전환 대장균은 하기의 4 단계로 구성된 생합성 루트를 통해 기질인 D-자일로스로부터 에탄-1,2-글리콜을 생산할 수 있다. 구체적으로, 생합성 루트는 단계 1에서 D-자일로스가 D-자일로스 디히드로게나아제의 촉매 작용에 의해 D-크실론산으로 전환되고, 단계 2에서 상기 전환된 D-크실론산이 대장균내 D-크실론산 디히드라타아제의 촉매 작용에 의해 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트로 전환되며, 단계 3에서 상기 전환된 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 대장균내 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제에 의해 글리코알데히드로 전환되고, 단계 4에서 글리코알데히드가 대장균내 알데히드 디히드로게나아제의 촉매 작용에 의해 에틸렌 글리콜로 전환된다(도 2 및 도 3 참조).
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 도 2에 기재된 바와 같이 D-자일로스로부터 에탄-1,2-글리콜 생산을 위한 네 가지 단계로 구성된 생합성 루트를 설계하였다(도 2).
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 상기 설계된 생합성 루트의 열역학적 실현가능성을 확인하기 위해 열역학적 분석을 수행하였다. 그 결과, 생합성 루트의 네 가지 단계 중에서 세 번째 단계의 알돌 분해 반응이 낮은 양성의 표준 깁스 자유 에너지를 나타내었으나, 나머지 세 가지 단계는 음성의 표준 깁스 자유 에너지를 나타내었으며, 전체 생합성 루트의 표준 깁스 자유 에너지가 음성으로 나타내었다. 따라서, 본 발명의 생합성 루트는 열역학적으로 실현가능성이 있음을 확인하였다.
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 상기 설계된 생합성 루트의 중간체가 다른 부산물로 전환할 수 있는 잠재적인 반응을 예측하기 위해, 데이타베이스를 이용하여 경로 예측 시스템을 분석하였다. 그 결과, 도 2의 네 가지 단계 과정에서 D-자일로스를 D-크실룰로오스로의 전환하거나(도 2의 b1) 글리코알데히드를 글리코산으로 전환하는(도 2의 b2) 반응이 각각 유발될 수 있음을 확인하였다
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 대장균에서 상기 설계된 생합성 루트를 실행하기 위해, E. coli W3110의 게놈 DNA에서 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 유전자 파괴시킨 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)를 숙주로서 제조한 후, 카우로박터 크리센튜스(C. crescentus) 유래 자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB를 pET28a 벡터 내로 연결시켜 T7 프로모터의 조절 하에 발현할 수 있게 제조한 다음, 상기 재조합 플라스미드 pET28a-cxylB를 상기 숙주 내로 형질전환시켜 형질전환체 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB를 제조하였다.
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 대장균에서 상기 설계된 생합성 루트를 실행하기 위해, E. coli BW25113의 게놈 DNA에서 xylA 뿐만 아니라 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA를 유전자 파괴시킨 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r (DE3)를 숙주로서 제조한 후, 카우로박터 크리센튜스 유래 자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB를 pET28a 벡터 내로 연결시켜 T7 프로모터의 조절 하에 발현할 수 있게 제조한 다음, 상기 재조합 플라스미드 pET28a-cxylB를 상기 숙주 내로 형질전환시켜 형질전환체 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB를 제조하였다.
본 발명의 한가지 실시양태에서는, E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB 및 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB의 에탄-1,2-디올 생산능을 확인하기 위해, 기질로서 D-자일로스를 포함하는 배지에서 배양한 후, 배양물 내에 대사 산물을 분석하였다. 그 결과, E. coli W3110△xylA::Cm r (DE3)/pET28a-cxylB는 높은 농도 및 수율로 에탄-1,2-디올을 생산하였고, 그 외 부산물을 현저히 낮은 농도로 생산하였다. E. coli BW25113△aldA△xylA::Cm r (DE3)/pET28a-cxylB는 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB에 비해거는 낮지만 높은 농도 및 수율로 에탄-1,2-디올을 생산하였다(도 5 내지 9 참조).
본 발명의 한가지 실시양태에서는, 상기 설계된 생합성 루트를 최적화하기 위해, 생산물 수율 및 농도를 증가시키는 대사공학을 추가적으로 적용시킨 루트를 도 10에 기재된 바와 같이 설계하였다(도 10 참조). 구체적으로, 에탄-1,2-디올의 생합성 루트에서 세 번째 단계의 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 대장균내 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제의 촉매 작용에 의해 글리코알데히드로 전환되는 과정에서 피루브산이 생산되는데(도 2 참조), 이때 추가로 설계된 루트들은 생산된 피루브산을 에탄-1,2-디올로 전환시킴으로써(도 10 참조), 에탄-1,2-디올의 생산 농도 및 수율를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 상기 두 종의 형질전환 대장균을 D-자일로스를 포함하는 배지에 배양시켜 에탄-1,2-디올을 생합성하는 단계; 및
2) 배양 후 얻은 배양물로부터 에탄-1,2-디올을 수득하는 단계를 포함하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 생산 방법에 있어서, 단계 1)의 형질전환 대장균은 상술한 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB 또는 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 생산 방법에 있어서, 단계 1)의 배양은 발효기에서 비연속 발효(batch fermentation) 방법으로 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 생산 방법에 있어서, 단계 1)의 에탄-1,2-디올의 생합성은 하기의 a) 내지 d) 단계로 구성된 경로에 의해 일어날 수 있다:
a) D-자일로스가 D-자일로스 디히드로게나아제에 의해 D-크실론산(D-xylonic acid)으로 전환되는 단계;
b) D-크실론산이 D-크실론산 디히드라타아제(D-xylonic acid dehydratase)에 의해 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate)로 전환되는 단계;
c) 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde)로 전환되는 단계; 및
d) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
이때, 상기 에탄-1,2-디올의 생합성 경로에 있어서,
단계 c)의 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 글리코알데히드로 전환되는 과정에서 발생되는 부산물인 피루브산(Pyruvate)을 에탄-1,2-디올로 전환시키기 위해, 추가적으로 상기 형질전환 대장균에서 하기의 e) 내지 k) 단계로 구성된 경로를 수행할 수 있도록 설계할 수 있다:
e) 피루브산이 피루브산 디히드로게나아제(Pyruvate dehydrogenase)에 의해 아세틸-코에이(Acetyl-CoA)로 전환되는 단계;
f) 아세틸-코에이가 시트르산 신타아제(Citrate synthase)에 의해 시트르산(Citrate)으로 전환되는 단계;
g) 시트르산이 시트르산 히드로리아제(Citrate hydro-lyase)에 의해 이소시트르산(Isocitrate)으로 전환되는 단계;
h) 이소시트르산이 이소시트르산 리아제(Isocitrate lyase)에 의해 글리옥살산(Glyoxalate) 및 숙신산(succinate)으로 전환되는 단계;
i) 글리옥살산이 글리콜산 옥시다아제(Glycolate oxidase)에 의해 글리콜산(Glycolate)으로 전환되는 단계;
j) 글리콜산이 알데히드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde)로 전환되는 단계; 및
k) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
또한, 상기 에탄-1,2-디올의 생합성 경로에 있어서,
단계 c)의 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 글리코알데히드로 전환되는 과정에서 발생되는 부산물인 피루브산(Pyruvate)을 에탄-1,2-디올로 전환시키기 위해, 추가적으로 상기 형질전환 대장균에서 하기의 l) 내지 q) 단계로 구성된 경로를 수행할 수 있도록 설계할 수 있다:
l) 피루브산이 포스포에놀피루브산 신타아제(Phosphoenolpyruvate synthetase)에 의해 포스포에놀피루브산(Phosphoenolpyruvate)로 전환되는 단계;
m) 포스포에놀피루브산이 에놀라아제(Enolase)에 의해 2-포스포-D-글리세른산(2-Phosp-D-glycerate)으로 전환되는 단계;
n) 2-포스포-D-글리세른산이 2-포스포-글리세르산 포스파타아제(2-phospho-glycerate phosphatase)에 의해 글리세른산(glycerate)으로 전환되는 단계;
o) 글리세른산이 히드록시피루브산 리덕타아제(hydroxypyruvate reductase)에 의해 히드록시피루브산(Hydroxypyruvate)으로 전환되는 단계;
p) 히드록시피루브산이 디카르복실라아제(decarboxylase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde) 및 CO2로 전환되는 단계; 및
q) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
또한, 본 발명은
1) 대장균에서 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 녹아웃시키는 단계; 및
2) 자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
3) 단계 1)의 대장균을 단계 2)의 발현벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 대장균에서 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA를 녹아웃시키는 단계;
2) 단계 1)의 대장균에서 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 녹아웃시키는 단계;
3) 자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
3) 단계 2)의 대장균을 단계 3)의 발현벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에 있어서, D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, D-자일로스 디히드게나제 유전자 cxylB는 카우로박터 크리센튜스(C. crescentus)로부터 유래된 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 발현벡터는 pET28a 벡터를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 대장균 내에서 삽입한 목적 유전자를 발현할 수 있는 벡터는 모두 사용가능하다.
상기 제조 방법에 있어서, 대장균은 E. coli W3110 또는 E. coli BW25113를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 모든 대장균 종이 사용가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 당업자에게 명백한 사실이다. 따라서, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
< 실시예 1> 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트 설계
본 발명자들은 대장균에서 D-자일로스로부터 에탄-1,2-글리콜 생산을 위한 생합성 루트를 설계하였다(도 2 참조). 본 발명의 생합성 루트의 첫 번째 단계는 D-자일로스가 D-자일로스 디히드로게나아제의 촉매 작용에 의해 D-크실론산으로 전환하는 단계이다. 또한, 두 번째 단계는 D-크실론산이 대장균내 D-크실론산 디히드라타아제(D-xylonic acid dehydratase)의 촉매 작용에 의해 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트로 전환하는 단계이다. 또한, 세 번째 단계는 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 대장균내 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)에 의해 글리코알데히드로 전환하는 단계이다. 마지막으로, 네 번째 단계로는 글리코알데히드가 대장균내 알데히드 디히드로게나아제의 촉매 작용에 의해 에틸렌 글리콜로 전환하는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 생합성 루트의 첫 번째 단계로서, D-자일로스 디히드로게나아제가 D-자일로스를 D-크실론산으로 전환을 촉진시키는데 적용하였다. 각각의 D-자일로스 디히드로게나아제는 특성이 있기 때문에 상기 반응을 위해 D-자일로스 디히드로게나아제를 선별하였으며, 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)로부터 유래된 D-자일로스 디히드로게나아제를 선별하였다. 상기 D-자일로스 디히드로게나아제는 NADP+ 대신에 조효소인 NAD+를 선호한다(비특허문헌 10 참조). 상기 NAD+는 세포의 대사 네트워크에서 많은 반응에 의해 재생될 수 있기 때문에 상기 첫 번째 단계에서 조효소 소모를 피할 수 있다. 대장균은 두 번째 단계의 반응을 촉진시킬 수 있는 D-크실론산 디히드라타아제(YjhG 및 YagF)를 암호화하고, 세 번째 단계의 반응을 촉진시킬 수 있는 두 개의 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)(YjhH 및 YagE)를 암호화한다(비특허문헌 10 및 11 참조). 이런 효소 프로파일 때문에 숙주로서 대장균을 선택하였다. 게다가, 대장균의 광범위한 기질 범위의 알데히드 디히드로게나아제(broad-substrate-range aldehyde dehydrogenase) YqhD는 본 발명의 생합성 루트의 마지막 단계를 촉진시킬 수 있다(비특허문헌 12 참조). 대장균에서 다른 알데히드 디히드로게나아제의 다용성 및 다양성을 고려해 볼 때, 고유의 디히드로게나아제의 활성은 대장균에서 네 번째 단계를 위해 적절하다.
< 실시예 2> 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트의 열역학적 분석
본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트(도 2 참조)의 열역학적 실현가능성에 대해 이론적인 평가를 하기 위해 열역학적 분석을 수행하였다. 각 반응을 위한 표준 깁스 자유 에너지(standard Gibbs free energy change; △rG'o)를 계산하기 위해 그룹 기여 방법(Group contribution method)을 적용하였다(비특허문헌 13 참조). 모든 반응식과 관련된 △rG'o는 하기 표 1에 나타내었다.
에탄-1,2-디올 생합성 루트에서 반응의 △rG'o 값
단계 반응 효소 △rG'o
(kcal/mol)
1 D-자일로스 + NAD+ + H2O → D-자일로네이트 + NADH + 2H+ D-자일로스 디히드로게나아제 -14.1
2 D-자일로네이트 → 2-케토-3-디옥시-D-자일로네이트 + H2O D-자일로네이트 디히드라타아제 -8.6
3 2-케토-3-디옥시-D-자일로네이트 → 글리코알데히드 + 피루브산 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제 4.3
4 글리코알데히드 + NAD(P)H+ H+ → 에탄-1,2-글리콜 + NAD(P)+ 글리코알데히드
디히드로게나자		 -7.1
그 결과, 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트(도 2 참조)에서 총 네 가지의 반응 중에서, 단지 단계 3의 알돌(aldol) 분해 반응이 작은 양성의 △rG'o 값을 가지는 것으로 나타났으며, 이는 독립적인 반응으로서 열역학적으로 선호되지 않는 것을 나타낸 것을 알 수 있다. 그러나, 나머지 세 가지 반응은 음성의 △rG'o 값을 가지는 것으로 나타났으며, 전체 생합성 루트의 총 표준 깁스 자유 에너지가 음성으로 나타났다. 따라서, 이론적으로 본 발명의 생합성 루트(도 2 참조)는 열역학적으로 실현가능성이 있다.
< 실시예 3> 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트에서 다른 부산물의 생산 가능성 확인
본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트(도 2 참조)의 중간체가 다른 부산물로 전환할 수 있는 잠재적인 반응을 예측하기 위해, 미네소타 대학 생촉매 및 생분해 데이타베이스(University of Minnesota Biocatalysis and Biodegradation Database; UM-BBD)의 경로 예측 시스템을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트의 단계 b1 및 단계 b2의 두 반응이 대장균에서 발생할 수 있음을 확인하였다(도 2 참조). 자일로스 이소메라아제 XI 및 알데히드 디히드로게나아제 AldA는 각각 상기 두 가지 반응의 촉매작용을 하는 것을 알 수 있었다(EcoCYC).
< 실시예 4> 대장균에서 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 루트의 실행
<4-1> 균주의 준비
E. coli W3110를 ATCC(ATCC No. 27325)로부터 구입하였고, E. coli BW25113△a l dA:: Kan r 를 국가생명자원사업(National BioResource Project; NBRP)의 게이오 콜렉션(Keio collection)으로부터 구입하였다(비특허문헌 14 참조).
Datsenko 및 Wanner의 이전 보고서로부터 유래된 원-스텝(one-step) 유전자 비활성 전략을 E. coli 게놈 DNA에서 유전자 파괴 및 내성 유전자 제거를 위해 적용하였다(비특허문헌 15 참조). 모든 유전자 파괴 프라이머 및 검증 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열(5'-3') 기능
XylK-F TCGTGAAGGTTACGAAACGCTGTTAAATACCGACTTGCGTCATATGAATATCCTCCTTAGT (서열번호: 4) xylA 유전자 파괴 단편의 증폭
XylK-R CGGCTCATGCCGCTGAACCCATAGCAATTTAGGCGCAGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (서열번호: 5)
XylA-F CGGCAACGCAAGTTGTTAC (서열번호: 6) xylA 유전자 파괴 검증
XylA-R CGTCAGACATATCGCTGGC (서열번호: 7)
<4-2> 플라스미드의 제조
플라스미드 pET28a-cxylB를 사전에 제조하였다(도 4 참조)(비특허문헌 16 참조). 플라스미드 pKD46를 레드(Red) 재조합효소 발현벡터로 사용하였고, pKD3를 파괴 카세트의 PCR 증폭을 위한 주형 플라스미드로 사용하였으며, pCP20를 내성 유전자 제거 플라스미드로 사용하였다. 유전자 파괴 및 제거를 위해 사용되는 프로토콜은 OPENWETWARE(Http://openwetware.org)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
<4-3> E. coli W3110 △ xylA :: Cm r ( DE3 )/ pET28a - cxylB 의 제조
xylA 파괴 카세트를 pKD3를 주형으로 이용하여 한 쌍의 파괴 프라이머로 증폭시켰다. 상기 증폭된 파괴 카세트를 E. coli W3110에 적용시켜 E. coli W3110△xylA::Cm r 를 제조하였다. E. coli W3110△xylA :: Cm r 는 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 유전자 파괴시킴으로써, D-자일로스가 D-크실룰로오스로의 전환을 방해한 것이다. 유전자 파괴의 유전자형 및 표현형을 검증한 다음, λDE3 용원화(Lysogenization) 키트(Novagen, USA)를 이용하여 λDE3 프로파지를 E. coli W3110 △xylA :: Cm r 내로 삽입시킴으로써 최종적으로 컨스트럭트 E. coli W3110△xylA::Cm r (DE3)를 수득하였다. 상기 최종 컨스트럭트를 pET28a-cxylB로 전기충격 형질전환시켜 형질전환체 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB를 제조하였다. 본 발명자들은 제조된 형질전환 대장균을 2011년 12월 12일에 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(KCTC 12100BP).
<4-4> E. coli BW25113 △ aldA △ xylA :: Cm r ( DE3 )/ pET28a - cxylB 의 제조
PCP20 플라스미드를 E. coli BW25113△aldA :: Kan r 에 적용시켜 카나마이신 내성 유전자를 제거하였다. 그런 다음, xylA의 파괴 카세트를 E. coli BW25113△aldA에 적용시켜 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r 를 제조하였다. E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r 는 xylA뿐만 아니라 aldA를 유전자 파괴시킴으로써 본 발명의 생합성 루트에서 단계 b1 및 단계 b2 반응(도 2 참조) 모두를 방해한 것이다. 유전자 파괴의 유전자형 및 표현형 검증을 모두 수행하였다. 그런 다음, λDE3 용원화 키트(Novagen, USA)를 이용하여 λDE3 프로파지를 E. coli BW25113△aldA :: Cm r 내로 삽입시킴으로써 최종적으로 컨스트럭트 E. coli BW25113△aldA :: Cm r (DE3)를 수득하였다. 상기 최종 컨스트럭트를 pET28a-cxylB로 전기충격 형질전환시켜 형질전환체 E. coli BW25113△aldA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB를 제조하였다. 본 발명자들은 제조된 형질전환 대장균을 2012년 1월 19일에 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(KCTC 12117BP).
<4-5> 에탄-1,2- 디올(에틸렌 글리콜)의 생합성
본 발명의 생합성 루트를 대장균에서 실행하기 위해, 상기 실시예 <4-3> 및 <4-4>에서 제조된 대장균에서 에탄-1,2-디올을 생합성하였다.
우선, 박토-트립톤(Bacto-tryptone)(20 g), 박토 효모 추출물(Bacto yeast extract)(10 g), Na2HPO4(12 g), KH2PO4(6 g), NH4Cl(2 g) 및 NaCl(1 g)를 포함하는 발효 배지(2 L)를 준비하였다. 자일로스 용액(80 g) 및 MgSO4(0.48g)을 각각 고압멸균시킨 후 상기 발효 배지에 첨가하였다. 이와 동시에 카나마이신(80 umol)을 상기 발효 배지에 첨가하였다. 아가 플레이트로부터 선별된 단일 콜로니를 클로람페니콜 및 카나마이신을 포함하는 5 mL의 LB 배지 내로 도입함으로써 접종물을 제조하였다. 그런 다음 37℃에서 150 rpm으로 교반하면서 배양시켰다. 배양 12시간 후, 배양물을 클로람페니콜 및 카나마이신을 포함하는 100 mL 프레시 LB 배지에 옮긴 다음, 추가로 12시간 동안 배양시켰다. 그런 다음, 배양물을 발효 용기로 옮긴 후 배치 발효를 개시하였다(t=0h). 발효 조절 세팅은 37℃, pH 7.0, 350 rpm의 속도로 교반, 및 0.5 vvm의 기류로 설정하였다. 농축된 NH4OH 및 3 N H2SO4를 첨가하여 pH를 유지시켰고, 발효 초기와 매 12시간 마다 0.2 ml의 IPTG(이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드) 저장액(1 M)을 첨가하였다. 그런 다음, GC 및 HPLC 분석을 통해 에탄-1,2-글리콜의 농도를 측정하였다.
<4-6> 에탄-1,2- 디올(에틸렌 글리콜)의 농도 측정
자일로스, 크실론산 및 에탄-1,2-디올과 같은 세포외 대사산물을 정량하기 위해, 고성능 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC) 분석을 수행하였다. 구체적으로, Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼(300×7.8 mm)에서 용리액으로 0.5 mM H2SO4를 0.4 ml/min의 유속으로 HPLC를 수행하였다. 상기 컬럼은 55℃로 유지하였고, Waters 2414 굴절률 검출기(refractive index detector)를 이용하여 피크를 검출하였다(도 5 참조).
또한, 에탄-1,2-디올 생산을 정량하기 위해, 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography; GC) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector, FID) 및 HP-1 컬럼(25 m X 0.32 mm x 0.17 um)가 갖춰진 GC(Agilent 6890N)를 사용하였다. 운반 가스는 200℃의 입구 온도 및 14.10 mL/min의 비분할 유속을 갖는 질소를 사용하였다. 오븐 프로그램은 0.5분 동안 80℃로 세팅하고, 30℃/min의 비율로 200℃까지 향하게 하고, 1분 동안 유지시킨 후, 최종적으로 235℃까지(10℃/min) 향하게 한 다음, 동일한 최종 온도로 1분 동안 유지시켰다. FID 온도는 260℃로 세팅하였다. 1,3-프로판디올을 내부 표준으로 사용하였다(도 6 참조).
또한, 발효 시료를 분석하기 위해, 가스 크로마토그래피-질량분석(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)을 수행하였다. 구체적으로, HP-5MS 모세관 컬럼(60 m X 0.25 mm X 0.25 um)이 갖춰진 가스 GC-MS(Agilent 6890, 5973MSD)를 수행하였다. 운송 가스로 헬륨을 사용하였다. 오븐 프로그램 및 입구 온도는 GC 분석과 동일하게 수행하였다. 1,3-프로판디올을 내부 표준으로 사용하였다(도 7 참조).
그 결과, 상기 실시예 <4-3>의 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB은 에탄-1,2-디올을 성공적으로 생산하였다. 구체적으로, 48시간에 10.3 g/L의 높은 농도로 에탄-1,2-디올을 생산하였으며, 이는 25.8% 수율을 나타내는 것이다(도 8 참조). 또한, 아세트산(0.5 g/L), 포르름산(1.2 g/L) 및 에탄올(0.5 g/L)은 발효 48시간 후에 낮은 농도로 생산되었다(표 3 참조).
한편, 상기 실시예 <4-4>의 E. coli BW25113△aldA△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB은 상기 E. coli W3110△xylA :: Cm r (DE3)/pET28a-cxylB에 비해 에탄-1,2-디올을 더 낮은 수준으로 생산하였다. 구체적으로, 발효 48시간 후, 에탄-1,2-디올의 농도는 단지 2.5 g/L로서 6.3% 수율을 나타내었다(도 9 참조). 이는 aldA 방해가 배양물에서 많은 D-크실론산 축적을 야기하는 것을 대사물질 분석을 통해 입증한 것이다. 발효 시간을 연장한 만큼, D-크실론산 축적 및 에탄-1,2-디올 축적이 모두 증가하였다. 그러나, 연장된 발효 시간(144시간)에서 조차, 배양물에서 잔여 D-크실론산은 여전히 높았으며(16 g/L), 에탄-1,2-디올의 농도는 단지 5.3 g/L에 도달하여 13.2% 수율을 나타내었다(표 3 참조).
대장균에 의한 D-자일로스로부터 생산된 에틸렌 글리콜의 농도 및 수율
진입 종 에틸렌 글리콜a
농도 (g/L) 수율 (%)
1 E. coli W3110 (DE3), pET28a n.d. n.d.
2 E. coli W3110 △xylA::Cmr (DE3), pET28a-cxylB 10.3 25.8
3 E. coli BW25113 △aldA △xylA::Cmr (DE3), pET28a-cxylB 2.5 6.3
a 발효 48시간 후 농도를 나타내었다; D-자일로스(40 g/L)는 모든 종에서 48시간에 고갈되었으며, 따라서 수율은 40 g/L의 기질을 기초로 하여 산출되었다; n.d.는 검출되지 않았음을 나타내었다.
< 실시예 5> 본 발명의 생합성 루트의 최적화를 위한 추가적인 루트 설계
본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 경로를 최적화하기 위해, 생산물 수율 및 농도를 증가시키는 방법을 개발하였다. 구체적으로, 피루브산 형성에 의한 탄소 손실(도 2의 단계 3 참조)을 줄이기 위해, 두 가지 컴퓨터 툴, PathComp(http://www.genome.jp) 및 ReBiT(Retro-Biosynthesis Tool, http://www.retro-biosynthesis.com)를 이용하여 피루브산을 에탄-1,2-디올로 전환하는 두 가지 루트를 설계하였다(도 10). 따라서, 본 발명의 에탄-1,2-글리콜의 생합성 경로에 상기 피루브산으로부터 에탄-1,2-디올로의 전환 기술을 동반하면 에탄-1,2-글리콜에 대한 생산 효율성을 증가할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 재생가능한 바이오매스로부터 에탄-1,2-디올의 생합성 방법은 환경에 대한 증가하는 걱정과 불안한 화석 에너지 비용뿐만 아니라, 지속적으로 확장되는 에탄-1,2-디올의 수요를 고려하여, 화석을 기반으로 전환하는 기존의 방법에 대한 유망한 대안을 제공한다. 또한, 본 발명의 미생물을 이용한 생합성 방법은 자일리톨의 가수소 분해를 위해 요구되는 높은 H2 압력과 증가된 온도를 피할 수 있으므로 효율적인 에탄-1,2-디올의 생산을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 생합성 방법이 식물 공급원료 전처리 기술과 동반되는 경우, 매우 경제적으로 에탄-1,2-디올의 생산을 가능하게 할 것이다. 아울러, 본 발명의 생합성 방법의 최적화를 위해 발효 및 대사 공학을 접목시킴으로써 에탄-1,2-디올의 대량 생산을 가능하게 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12100BP 20111212 한국생명공학연구원 KCTC12117BP 20120119
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  3. 대장균에서 게놈 DNA내 알데히드 디히드로게나제(aldehyde dehydrogenase) 유전자 aldA 및 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 녹아웃시키고, 상기 대장균을 D-자일로스 디히드로게나제 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터로 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  4. 제 3항에 있어서, 수탁번호 KCTC 12117BP로 기탁된 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  5. 제 3항에 있어서, D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  6. 제 3항에 있어서, 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  7. 제 3항에 있어서, D-자일로스 디히드로게나제 유전자 cxylB는 카우로박터 크리센튜스(C. crescentus)로부터 유래된 것으로서 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  8. 제 3항에 있어서, 발현벡터는 pET28a 벡터인 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  9. 제 3항에 있어서, 대장균은 E. coli W3110 또는 E. coli BW25113인 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균.
  10. 1) 제 3항의 형질전환 대장균을 D-자일로스를 포함하는 배지에 배양시켜 에탄-1,2-디올을 생합성하는 단계; 및
    2) 배양 후 얻은 배양물로부터 에탄-1,2-디올을 수득하는 단계를 포함하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 배양은 발효기에서 비연속 발효(batch fermentation) 방법으로 배양하는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 에탄-1,2-디올은 대장균에서 하기의 단계로 생합성되는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산 방법:
    a) D-자일로스가 D-자일로스 디히드로게나아제에 의해 D-크실론산(D-xylonic acid)으로 전환되는 단계;
    b) D-크실론산이 D-크실론산 디히드라타아제(D-xylonic acid dehydratase)에 의해 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate)로 전환되는 단계;
    c) 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde)로 전환되는 단계; 및
    d) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
  13. 제 12항에 있어서, 단계 c)에서 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 글리코알데히드로 전환되는 과정에서 발생되는 부산물인 피루브산(Pyruvate)을 에탄-1,2-디올로 전환시키기 위해, 하기의 단계를 포함하는 방법을 추가로 적용시키는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산 방법:
    e) 피루브산이 피루브산 디히드로게나아제(Pyruvate dehydrogenase)에 의해 아세틸-코에이(Acetyl-CoA)로 전환되는 단계;
    f) 아세틸-코에이가 시트르산 신타아제(Citrate synthase)에 의해 시트르산(Citrate)으로 전환되는 단계;
    g) 시트르산이 시트르산 히드로리아제(Citrate hydro-lyase)에 의해 이소시트르산(Isocitrate)으로 전환되는 단계;
    h) 이소시트르산이 이소시트르산 리아제(Isocitrate lyase)에 의해 글리옥살산(Glyoxalate) 및 숙신산(succinate)으로 전환되는 단계;
    i) 글리옥살산이 글리콜산 옥시다아제(Glycolate oxidase)에 의해 글리콜산(Glycolate)으로 전환되는 단계;
    j) 글리콜산이 알데히드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde)로 전환되는 단계; 및
    k) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
  14. 제 12항에 있어서, 단계 c)에서 2-디히드로-3-디옥시-D-펜토네이트가 글리코알데히드로 전환되는 과정에서 발생되는 부산물인 피루브산(Pyruvate)을 에탄-1,2-디올로 전환시키기 위해, 하기의 단계를 포함하는 방법을 추가로 적용시키는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산 방법:
    l) 피루브산이 포스포에놀피루브산 신타아제(Phosphoenolpyruvate synthetase)에 의해 포스포에놀피루브산(Phosphoenolpyruvate)로 전환되는 단계;
    m) 포스포에놀피루브산이 에놀라아제(Enolase)에 의해 2-포스포-D-글리세른산(2-Phosp-D-glycerate)으로 전환되는 단계;
    n) 2-포스포-D-글리세른산이 2-포스포-글리세르산 포스파타아제(2-phospho-glycerate phosphatase)에 의해 글리세른산(glycerate)으로 전환되는 단계;
    o) 글리세른산이 히드록시피루브산 리덕타아제(hydroxypyruvate reductase)에 의해 히드록시피루브산(Hydroxypyruvate)으로 전환되는 단계;
    p) 히드록시피루브산이 디카르복실라아제(decarboxylase)에 의해 글리코알데히드(Glycoaldehyde) 및 CO2로 전환되는 단계; 및
    q) 글리코알데히드가 알데히드 디히드로게나아제에 의해 에탄-1,2-디올로 전환되는 단계.
  15. 삭제
  16. 1) 대장균에서 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA를 녹아웃시키는 단계;
    2) 단계 1)의 대장균에서 D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA를 녹아웃시키는 단계;
    3) 자일로스 디히드로게나제 유전자 cxylB를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 대장균을 단계 3)의 발현벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균의 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서, D-자일로스 이소메라아제 유전자 xylA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균의 제조 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균의 제조 방법.
  19. 제 16항에 있어서, D-자일로스 디히드로게나제 유전자 cxylB는 카우로박터 크리센튜스(C. crescentus)로부터 유래된 것으로서 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, D-자일로스로부터 에탄-1,2-디올의 생산능을 가진 형질전환 대장균의 제조 방법.
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