JP2023510872A - 血液型抗原の修飾 - Google Patents
血液型抗原の修飾 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023510872A JP2023510872A JP2022542899A JP2022542899A JP2023510872A JP 2023510872 A JP2023510872 A JP 2023510872A JP 2022542899 A JP2022542899 A JP 2022542899A JP 2022542899 A JP2022542899 A JP 2022542899A JP 2023510872 A JP2023510872 A JP 2023510872A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- cell
- cells
- guide rna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims description 50
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims description 46
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims description 46
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 240
- 101150099178 abo gene Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 101150048676 FUT1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 884
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 593
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 253
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 220
- 101000802660 Homo sapiens Histo-blood group ABO system transferase Proteins 0.000 claims description 154
- 102100035833 Histo-blood group ABO system transferase Human genes 0.000 claims description 153
- 101150108975 Rhd gene Proteins 0.000 claims description 149
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 claims description 149
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 142
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 100
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 95
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 95
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 76
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 76
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 75
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 claims description 65
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 42
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 33
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 31
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 31
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 claims description 30
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 29
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 28
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims description 27
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 26
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 25
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 23
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 22
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 claims description 21
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 20
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims description 18
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 claims description 10
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 claims description 9
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 claims description 6
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 3
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 claims 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 49
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 47
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 47
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 31
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 30
- 101000580024 Homo sapiens Blood group Rh(D) polypeptide Proteins 0.000 description 316
- 102100027544 Blood group Rh(D) polypeptide Human genes 0.000 description 244
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 154
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 144
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 112
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 112
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 112
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 68
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 62
- 101000885616 Homo sapiens Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 60
- 102100039835 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 49
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 30
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 21
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 21
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 13
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 11
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 11
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 11
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 11
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 11
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 11
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 11
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 11
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 11
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 11
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 11
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 11
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 10
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 9
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 9
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 8
- -1 HLA-DM Proteins 0.000 description 8
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 8
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 101100294239 Homo sapiens NLRC5 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 101150022837 NLRC5 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 6
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 6
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 5
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 5
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 4
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 4
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 4
- 102100021043 Regulatory factor X-associated protein Human genes 0.000 description 4
- 101710189356 Regulatory factor X-associated protein Proteins 0.000 description 4
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 4
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000001624 hip Anatomy 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 4
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 101150106478 GPS1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 3
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 2
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 2
- 102100022718 Atypical chemokine receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150069031 CSN2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000713756 Caprine arthritis encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 102100039104 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit DAD1 Human genes 0.000 description 2
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 102100031546 HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Human genes 0.000 description 2
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000678892 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000884921 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit DAD1 Proteins 0.000 description 2
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000866281 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Proteins 0.000 description 2
- 101000598002 Homo sapiens Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001076422 Homo sapiens Interleukin-1 receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001034314 Homo sapiens Lactadherin Proteins 0.000 description 2
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000979565 Homo sapiens Protein NLRC5 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 101000638161 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100036981 Interferon regulatory factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100026017 Interleukin-1 receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 108010006444 Leucine-Rich Repeat Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102000007524 N-Acetylgalactosaminyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010046220 N-Acetylgalactosaminyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 101100385413 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) csm-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 101150044917 Prl3b1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150113550 Prl3d1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100023432 Protein NLRC5 Human genes 0.000 description 2
- 101100047461 Rattus norvegicus Trpm8 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 2
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000010782 T cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000002534 adenoid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 101150055601 cops2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150037603 cst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000005093 cutaneous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 210000000188 diaphragm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 2
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical group NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 2
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 2
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 2
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 210000004560 pineal gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- BSDCIRGNJKZPFV-GWOFURMSSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(2,5,6-trichlorobenzimidazol-1-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1Cl BSDCIRGNJKZPFV-GWOFURMSSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101710189683 Alkaline protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710154562 Alkaline proteinase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 1
- 101710170876 Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 102100030970 Apolipoprotein C-III Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102100028237 Breast cancer anti-estrogen resistance protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 1
- 102000002164 CARD domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009503 CARD domains Proteins 0.000 description 1
- 108010026988 CCAAT-Binding Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000019063 CCAAT-Binding Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150018129 CSF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100035605 Cas scaffolding protein family member 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 206010010264 Condition aggravated Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101150074775 Csf1 gene Proteins 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 102100024125 Embryonal Fyn-associated substrate Human genes 0.000 description 1
- 102100021579 Enhancer of filamentation 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101900095660 Escherichia coli Cytosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 108700035841 GIY-YIG endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000052907 GIY-YIG endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100040837 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010002459 HIV Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101150118346 HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000578 HLA-B gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035071 HLA-C gene Proteins 0.000 description 1
- 108050008753 HNH endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000000310 HNH endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060003760 HNH nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000029812 HNH nuclease Human genes 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000893570 Hendra henipavirus Species 0.000 description 1
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101000793223 Homo sapiens Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 description 1
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 1
- 101000935644 Homo sapiens Breast cancer anti-estrogen resistance protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000947106 Homo sapiens Cas scaffolding protein family member 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001053896 Homo sapiens Embryonal Fyn-associated substrate Proteins 0.000 description 1
- 101000898310 Homo sapiens Enhancer of filamentation 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000893710 Homo sapiens Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100452383 Homo sapiens IKZF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000852968 Homo sapiens Interleukin-1 receptor-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000763322 Homo sapiens M1-specific T cell receptor beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000884270 Homo sapiens Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000585365 Homo sapiens Sulfotransferase 2A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 1
- 101000763321 Homo sapiens T cell receptor beta chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 1
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 description 1
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026964 M1-specific T cell receptor beta chain Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- 101150073096 NRAS gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000526636 Nipah henipavirus Species 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000849522 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S13 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 102100029867 Sulfotransferase 2A1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100029454 T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Human genes 0.000 description 1
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000003441 Transfusion reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 1
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 1
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 102100037796 Zinc finger protein Helios Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000000803 cardiac myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002514 epidermal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003999 epithelial cell of bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 231100000089 gene mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006450 immune cell response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008088 immune pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011575 immunodeficient mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003816 muromonab-cd3 Drugs 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220036548 rs140382474 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01037—Fucosylgalactoside 3-alpha-galactosyltransferase (2.4.1.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/0104—Glycoprotein-fucosylgalactoside alpha-N-acetylgalactosaminyltransferase (2.4.1.40)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本明細書で提供されるのは、ABO遺伝子、RED遺伝子、及び/またはFUT1遺伝子の遺伝子修飾を有する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、低減されたレベルのMHC I抗原及び/またはMHC II抗原を発現する。いくつかの事例では、細胞はまた、低免疫原性細胞でもある。【選択図】図1
Description
相互参照
本出願は、2020年1月13日に出願された米国仮出願第62/960,607号及び2020年1月13日に出願された米国仮出願第62/960,617号に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年1月13日に出願された米国仮出願第62/960,607号及び2020年1月13日に出願された米国仮出願第62/960,617号に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
血液製剤は、人の体内のすべての赤血球の表面上の抗原の有無に応じて異なる群に分類することができる(ABO血液型)。A、B、AB、及びA1抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群の遺伝子は、抗原タンパク質を作製するための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内の様々な機能を果たす。これらのタンパク質機能には、細胞内外への他のタンパク質及び分子の輸送、細胞構造の維持、他の細胞及び分子への付着、ならびに化学反応への参加が含まれる。
アカゲザル因子(Rh)血液群は、ABO血液群系に次いで第2に重要な血液群系であり、Rh血液群系は、49の定義された血液群抗原からなり、その中でもD、C、c、E、eの5つの抗原が最も重要である。個体のRh(D)状態は、通常、ABO型の後に陽性または陰性の接尾辞で記載される。「Rh因子」、「Rh陽性」、及び「Rh陰性」という用語は、Rh(D)抗原のみを指す。Rh抗原に対する抗体は、溶血輸血反応に関与することができ、Rh(D)及びRh(c)抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクをもたらす。ABO抗体は、すべてのヒトにおいて幼児期に発症する。しかしながら、Rh-ヒトにおけるアカゲザル抗体は、典型的には、その人が感作した場合にのみ発症する。これは、例えば、Rh+乳児を出産することによって、またはRh+輸血を受けることによって生じ得る。
A、B、H、及びRh抗原は、血液、組織、ならびに細胞移植のためのドナーとレシピエントとの間の組織適合性の主要な決定因子である。ABO遺伝子によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ活性は、細胞の表面に表示されるA、B、AB、O組織血液群抗原の産生に関与する。A群の個体は、α(1,3)N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を産生する特異性を有するABO遺伝子産物をコードし、B群の個体は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を産生する特異性を有する。O型個体は、機能的ガラクトシルトランスフェラーゼを全く産生しないため、いずれの修飾も産生しない。AB型の個体は、各々の1つのコピーを保有し、両方のタイプの修飾を産生する。ABO遺伝子の酵素産物は、基質としてH抗原に作用し、したがって、ABO活性を欠くO型個体は、非修飾H抗原を提示し、しばしばO型(H)と呼ばれる。
H抗原自体は、FUT1遺伝子によってコードされるα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素の産物である。非常に稀な個体では、FUT1遺伝子の破壊の結果としてH抗原が完全に失われ、ABOがAまたはB組織血液型を産生するための基質が存在しない。これらの個体はボンベイ組織血液型であると言われている。Rh抗原は、RHD遺伝子によってコードされ、Rh陰性である個体は、RHD遺伝子の欠失または破壊を保有する。
治療用途に好適な細胞株の利用可能性は、厳しく制限されており、多くの場合、利用可能な細胞株は、すべての可能なレシピエントと普遍的に組織適合性ではない。
細胞治療に有用な組織血液型細胞を生成するための新しいアプローチ、組成物、及び方法の必要性が残っている。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくはABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化され、及び/またはRHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、細胞が、組織血液型O細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異(例えば、ヌクレオチド258位でのGのエクソン6における欠失)が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含む相同性指向修復(HDR)鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、細胞が、組織血液型O細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失を含み、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、細胞が、アカゲザル因子(Rh)陰性細胞であるようなホモ接合変異である。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、細胞であって、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、Rh陰性細胞である。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化され、及び/またはRHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に単離されて活性化される。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、細胞が、ボンベイ表現型を有するようなホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つ以上を含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、細胞が、アカゲザル因子(Rh)陰性であるようなホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、細胞が、ボンベイ表現型を有し、かつRh陰性であるようなホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、さらにRh陰性細胞である。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、FUT1遺伝子のエクソン4における欠失を含み、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、細胞が、ユニバーサルボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、O型またはボンベイ表現型を有する。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、細胞が、O型陰性細胞またはボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、ガイドRNA標的配列は、配列番号1または配列番号2を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異は、ホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つ以上を含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、有害な変異が、FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞(RUES2またはH9細胞など)、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、B2M遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、CIITA遺伝子の発現が、部分的にまたは完全に不活性化される。
いくつかの実施形態では、細胞は、CD47導入遺伝子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、B2M及びCIITA遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、細胞が、CD47導入遺伝子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、上記のいずれかに従う細胞を含む、薬学的組成物である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療するための方法であって、上記のいずれかに従って細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離細胞を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3からなる群から選択される1つを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかのさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離細胞を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、ならびに配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を細胞に導入することであって、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、導入することと、(c)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成する方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成するための方法であって、(a)単離細胞を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法が、(i)表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3を含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法が、(i)配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を細胞に導入するステップであって、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、導入するステップと、(ii)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離細胞を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むFUT1遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)FUT1遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAが、配列番号13または配列番号14を含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成する方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNA標的配列が、配列番号12を含む。
いくつかの実施形態では、単離細胞は、単離ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、単離細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞(RUES2またはH9細胞など)、複能性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、単離細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M遺伝子を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、上記方法に従って使用される単離細胞は、部分的または完全に不活性化されるCIITA遺伝子をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、CD47導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M及びCIITA遺伝子、ならびにCD47導入遺伝子を含む。
いくつかのさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、上記方法に従って調製された幹細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、分化条件は、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である。
いくつかのさらなる態様では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、上記方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、RUES2細胞株に由来する単離細胞であって、単離細胞が、(a)単離細胞を組織血液型Oにする修飾、及び(b)単離細胞をRh陰性にする修飾のうちの一方または両方を含む、単離細胞である。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞を組織血液型Oにする修飾が、ABO組織血液型B抗原の抗原性を低減または排除する。
いくつかのさらなる実施形態では、修飾が、ABO遺伝子の有害な変異によって、またはABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって、ABO遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子の発現が、ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、ガイドRNA標的配列は、配列番号1または配列番号2を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかのさらなる実施形態では、ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異は、ホモ接合変異である。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞をRh陰性にする修飾が、FUT1遺伝子の有害な変異によるFUT1遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、FUT1遺伝子の発現が、FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかのさらなる実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかのさらなる実施形態では、有害な変異が、FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞をRh陰性にする修飾が、1つ以上のアカゲザル因子抗原の抗原性を低減または排除する。
いくつかのさらなる実施形態では、修飾が、RHD遺伝子の有害な変異によるRHD遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、RHD遺伝子の発現が、RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。
いくつかのさらなる実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される。
いくつかのさらなる実施形態では、有害な変異が、RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの実施形態では、上述の単離細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、上記方法に従って使用される単離細胞は、部分的または完全に不活性化されるCIITA遺伝子をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、CD47導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M及びCIITA遺伝子、ならびにCD47導入遺伝子を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3からなる群から選択される1つを含む。
いくつかのさらなる実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、ならびに配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を細胞に導入することであって、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、導入することと、(c)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかのさらなる実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む。
いくつかのさらなる実施形態では、方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNAが、配列番号12を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、方法は、(i)表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、方法が、(i)配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を細胞に導入するステップであって、各々が、ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、導入するステップと、(ii)ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、PAM配列及び/またはスペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むFUT1遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入することと、(c)FUT1遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号13または配列番号14を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、方法は、(i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を細胞に導入するステップと、(ii)RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNA標的配列が、配列番号12を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M遺伝子を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるCIITA遺伝子を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、CD47導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M及びCIITA遺伝子、ならびにCD47導入遺伝子を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、上述の方法のいずれかに従って調製された操作組織適合性細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、方法である。
いくつかのさらなる実施形態では、分化条件は、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、上述の方法のいずれかに従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。
低免疫原性細胞、その産生方法、及びその使用方法の詳細な説明は、2015年5月9日に出願されたWO2016183041、及び2018年1月14日に出願されたWO2018132783に記載されており、配列表及び図面を含むその開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の他の目的、利点及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
I.緒論
本発明は、部分的に、ユニバーサルな移植に好適な組織血液抗原型を産生するために細胞を遺伝子修飾する方法に基づいている。ユニバーサル組織血液型細胞を産生するためのABO、RHD、及びFUT1遺伝子の遺伝子編集の方法が記載される。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子修飾を保有する細胞はまた、MHC I及び/またはMHC II抗原の発現を調節する遺伝子における遺伝子改変を行う。本明細書に概説される細胞は、患者への細胞療法の実施及び送達を改善ならびに促進することができる。
本発明は、部分的に、ユニバーサルな移植に好適な組織血液抗原型を産生するために細胞を遺伝子修飾する方法に基づいている。ユニバーサル組織血液型細胞を産生するためのABO、RHD、及びFUT1遺伝子の遺伝子編集の方法が記載される。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子修飾を保有する細胞はまた、MHC I及び/またはMHC II抗原の発現を調節する遺伝子における遺伝子改変を行う。本明細書に概説される細胞は、患者への細胞療法の実施及び送達を改善ならびに促進することができる。
II.定義
本明細書で使用される場合、「免疫原性」は、対象(例えば、ヒト対象)に導入されるときに、物質が検出可能な免疫応答(体液性または細胞性)を誘導することを可能にする特性を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫原性」は、対象(例えば、ヒト対象)に導入されるときに、物質が検出可能な免疫応答(体液性または細胞性)を誘導することを可能にする特性を指す。
細胞を特性化するために本明細書で使用される場合、「低免疫原性」という用語は、一般に、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶の傾向が少ないことを意味する。例えば、変更されていないまたは改変されていない野生型細胞と比較して、そのような低免疫原性細胞は、約2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%以下、そのような細胞が移植された対象による免疫拒絶の傾向が少ない。いくつかの態様では、ゲノム編集技術は、MHC I及びMHC II遺伝子の発現を調節するために使用され、したがって、低免疫原性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、MHC不適合の同種レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。場合によっては、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞から産生された分化細胞は、MHC不適合の同種レシピエントに投与される(例えば、移植またはグラフトされる)ときに免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、T細胞媒介性適応免疫拒絶及び/または自然免疫細胞拒絶から保護される。
細胞の低免疫原性は、適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する細胞の能力など、細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。そのような免疫応答は、当業者によって認識されているアッセイを使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答アッセイは、T細胞増殖、T細胞活性化、T細胞死滅、NK細胞増殖、NK細胞活性化、及びマクロファージ活性化に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞及びその誘導体は、対象への投与時に、T細胞及び/またはNK細胞による死滅の減少を受ける。場合によっては、細胞及びその誘導体は、改変されていない細胞または野生型細胞と比較して、マクロファージの貪食が減少していることを示す。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、対応する改変されていない野生型細胞と比較して、レシピエント対象において免疫応答の低下または減少を誘発する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、非免疫原性であるか、またはレシピエント対象において免疫応答を誘発することができない。
「HLA」または「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。HLA複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトには、クラスI及びクラスIIの2つのMHC、「HLA-I」及び「HLA-II」がある。HLA-Iには、HLA-A、HLA-B、HLA-Cの3つのタンパク質が含まれ、細胞内からペプチドを提示し、HLA-I複合体によって提示される抗原は、キラーT細胞(CD8+T細胞または細胞傷害性T細胞としても知られる)を引き付ける。HLA-Iタンパク質は、β-2ミクログロブリン(B2M)と関連している。HLA-IIには、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ及びHLA-DRの5つのタンパク質が含まれており、これらは細胞外からTリンパ球に抗原を提示する。これは、CD4+細胞(Tヘルパー細胞としても知られる)を刺激する。「MHC」または「HLA」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト(HLA)またはマウス(MHC)のどちらに由来するかに依存するので、限定することを意味するものではないことを理解されたい。したがって、これは哺乳動物細胞に関連するので、これらの用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「拒絶を回避する」、「拒絶を逃れる」、「拒絶を防止する」、及び同様の用語は、本発明に従って遺伝子修飾されていない対応する生成物及び細胞と比較した場合、対象に移植されたときに拒絶されにくい、本発明による遺伝子修飾されたまたは他の方法で修飾された膜生成物及び細胞を指すために交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子修飾産物及び細胞は、対象に移植されたときに、対象に不適合ABO血液群またはRh因子である対応する細胞と比較して、拒絶の影響を受けにくい。
本明細書における「同種異系」とは、宿主生物及び免疫細胞応答が生成される細胞移植の遺伝的非類似性を意味する。
「多能性細胞」という用語は、未分化状態を維持しながら自己複製及び増殖することができ、かつ適切な条件下で、特殊な細胞型に分化するように誘導することができる細胞を指す。本明細書で使用される「多能性細胞」という用語は、胚性幹細胞及び胎児、羊膜、または体細胞を含む他の種類の幹細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞株には、H9ヒト胚性幹細胞株、RUES2ヒト胚性幹細胞株などが含まれる。さらなる例示的な幹細胞株には、Health Human Embryonic Stem Cell Registry and the Howard Hughes Medical Institute HUES collection,(Cowan,C.A et.al,New England J.Med.350:13.(2004)に記載されているように)を通じて入手可能になったものが含まれる。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、3つの胚葉:内胚葉(例えば、胃連結、胃腸管、肺など)、中胚葉(例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織)または外胚葉(例えば、表皮組織及び神経系組織)のいずれかに分化する可能性を有する。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語は、非多能性細胞に由来する一種の多能性幹細胞である「人工多能性幹細胞」または「iPSC」も包含する。親細胞の例には、様々な手段によって多能性の未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれる。このような「iPS」または「iPSC」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、または特定のタンパク質の外因性の適用によって作製することができる。iPS細胞を誘導するための方法は当技術分野で知られており、以下でさらに記載されている。(例えば、Zhou et al.,Stem Cells 27(11):2667-74(2009)、Huangfu et al,Nature Biotechnol.26(7):795(2008)、Woltjen et al.,Nature 458(7239):766-770(2009)、及びZhou et al.,Cell Stem Cell 8:381-384(2009)を参照されたく、その各々は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。)人工多能性幹細胞(iPSC)の生成が以下に概説される。本明細書で使用される場合、「hiPSC」は、ヒト人工多能性幹細胞である。
多能性幹細胞のいくつかの特徴は、それらを他の細胞と区別する。例えば、適切な条件下で、3つの胚葉(例えば、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)の全てからの細胞系統に関連する特徴を集合的に示す細胞型への分化を受け得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞の特徴である。分子マーカーの特定の組み合わせの発現または非発現もまた、多能性幹細胞特性である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-カドヘリン、UTF-1、Oct4、Rex1、及びNanogの非限定的なリストからの少なくともいくつか、いくつかの実施形態では、すべてのマーカーを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態はまた、多能性幹細胞の特徴でもある。細胞は、内胚葉前駆細胞及び/または肝細胞に再プログラムされるために、多能性を通過する必要はない。
本明細書で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞を指す。そのような細胞の例には、分化細胞及び前駆細胞が含まれる。分化細胞の例には、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織、及び末梢血から選択される組織からの細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な細胞型には、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、及びT細胞が含まれるが、これらに限定されない。誘導多能性細胞、内胚葉前駆細胞、及び肝細胞を生成するために用いられる出発細胞は、非多能性細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。例えば、誘導多能性細胞は、内胚葉細胞を形成することができる。さらに、多能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などを含むいくつかの種類の血液細胞に分化することができる。
分化細胞には、多能性細胞、寡能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、低潜在的な細胞は、潜在的な細胞に関連して「分化」と見なされる。
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物における臓器、皮膚、血液、骨、及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。本明細書で使用される体細胞には、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、グリア細胞、免疫細胞、間葉細胞、上皮細胞、及び内皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、例えば、本明細書に記載されるように、免疫エフェクター細胞を含む。例示的な免疫エフェクター細胞には、T細胞、例えば、アルファ/ベータT細胞及びガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書における「低免疫原性多能性細胞」、「低免疫多能性細胞」または「HIP細胞」とは、その多能性特性を保持しながら、同種異系宿主に移入されたときに減少した免疫学的拒絶反応をもたらす多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、HIP細胞は、免疫応答を引き起こさない。したがって、「低免疫原性」とは、本明細書に概説されるような免疫工学の前の親(すなわち、「野生型」)細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が大幅に減少または排除されることを指す。多くの場合、HIP細胞は免疫学的にサイレントでありながら、多能性能力を保持している。HIP特性のアッセイが以下に概説される。
細胞の文脈における「野生型」または「wt」とは、天然に見出される細胞を意味する。しかしながら、本明細書で使用される多能性幹細胞の文脈において、これはまた、多能性をもたらすが、低免疫原性を達成するために本発明の遺伝子編集手順を受けなかった核酸変化を含有し得るiPSCを意味する。
単離細胞に適用される「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実行することを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列(例えば、B2M)が本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された細胞または細胞集団を個体に投与することを指す。個体は通常、病気であるかもしくは負傷しているか、または集団の平均的なメンバーと比較して病気になるリスクが高く、そのような注意、配慮、もしくは管理を必要としている。
本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」という用語は、対象が少なくとも1つの症状の軽減、または疾患の改善、例えば、有益なもしくは望ましい臨床結果を有するように、本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された標的ポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益なもしくは望ましい臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、1つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した(すなわち、悪化しない)状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐、病状の改善もしくは緩和、及び寛解(部分的もしくは全体的)が挙げられるが、これらに限定されない。治療することはまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することを含む。したがって、当業者は、治療により疾患状態が改善し得るが、疾患の完全な治癒ではないことがあることを認識している。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は予防を含む。あるいは、病気の進行が低下または停止した場合、治療は「有効」である。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することも意味する。治療が必要なものには、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断されているもの、及び遺伝的感受性または他の要因のためにそのような障害を発症する可能性が高いものが含まれる。
疾患または障害の「治療」または「予防」とは、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防し、進行を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止し、そのような疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を悪化または憎悪させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%軽減される。
本明細書で使用される場合、「投与すること」、「導入すること」及び「移植すること」という用語は、所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば、本発明の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載される細胞を対象に配置する文脈において交換可能に使用される。細胞は、所望の部位に直接移植することができるか、あるいは、移植された細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存し続ける対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、最短で数時間、例えば24時間~数日、最長で数年であり得る。場合によっては、細胞は、移植された細胞を移植位置に維持し、移植された細胞の移動を回避するために、肝臓内または皮下、例えばカプセル内など、所望の部位以外の場所に投与することもできる。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、処置される症状及び/または状態を有意にかつ肯定的に修飾する(例えば、陽性の臨床応答を提供する)のに十分な量の薬学的組成物を意味する。薬学的組成物中で使用するための有効成分の有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、治療期間、併用療法の性質、使用される特定の活性成分、使用される特定の薬学的に許容される賦形剤及び/または担体、ならびに主治医の知識及び専門知識を伴う同様の因子によって変化するであろう。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益/リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した賦形剤、組成物、及び/または投薬形態を指す。
CRISPR-Cas成分に結合し、標的DNA内の特定の位置にそれらを標的化するRNA分子は、本明細書では、「ガイドRNA」、「gRNA」、または「小さなガイドRNA」と称され、本明細書では、「DNA標的化RNA」とも称され得、ガイドRNAは、少なくとも2つのヌクレオチドセグメント:少なくとも1つの「DNA結合セグメント」及び少なくとも1つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」とは、分子の一部、セクション、または領域、例えば、RNA分子のヌクレオチドの連続した区間を意味する。「セグメント」の定義は、特に明記されていない限り、特定の数の総塩基対に限定されない。いくつかの実施形態では、標的化は、gRNAの一部をDNAとハイブリダイズすること(例えば、gRNA標的化ドメインを介して)、及びgRNA分子の一部をRNA誘導ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子と結合すること(例えば、少なくともgRNA tracrを介して)によって達成される。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、本明細書では「単一ガイドRNA」または「sgRNA」などと呼ばれる単一の隣接するポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、gRNA分子は、複数の、通常は2つの、ポリヌクレオチド分子を含み、これらは自体は、通常、ハイブリダイゼーションを通じて会合することができ、本明細書では、「デュアルガイドRNA」または「dgRNA」などと称される。gRNA分子は、以下により詳細に記載され、一般に、標的化ドメイン及びtracrを含む。他の実施形態では、標的化ドメイン及びtracrは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。ガイドRNAは、単離RNA分子として標的細胞に導入されるか、またはガイドRNAをコードするDNAを含む発現ベクターを使用して細胞に導入されることができる。
本明細書で使用される「ガイドRNA標的」という用語は、本明細書に記載されるガイドRNA標的の各々及びいずれかのRNA配列、ならびに遺伝子編集に利用されるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ガイドRNA標的は、ガイドRNAが結合する標的配列を含み、それにより標的配列の遺伝子編集を可能にする。ガイドRNA標的は、標的配列に対応することができ、PAM配列を含まない。
ガイドRNAの「DNA結合セグメント」(または「DNA標的化配列」)は、標的DNA内の特定の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。
ガイドRNAは、1つ以上のポリペプチド結合配列/セグメントを含むことができる。ガイドRNAのポリペプチド結合セグメント(または「タンパク質結合配列」)は、Casタンパク質のRNA結合ドメインと相互作用する。
本明細書で使用される「Cas9分子」という用語は、II型CRISPR-Cas9系に由来するCas9野生型タンパク質、Cas9タンパク質の修飾、Cas9タンパク質のバリアント、Cas9オルソログ、及びそれらの組み合わせを指す。
「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーテンプレート」、及び「ドナーオリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、少なくとも一部が選択された核酸標的部位に組み込まれることが意図される核酸配列を提供するポリヌクレオチドを指す。一般に、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドである。例えば、操作II型CRISPR-Cas9系は、ゲノムDNAにおけるDNA標的配列を修飾するために、ドナーDNA鋳型と組み合わせて使用することができ、ゲノムDNAは、DNA標的配列におけるドナーDNA鋳型の少なくとも一部を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含み、他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「HDR」という用語は、本明細書で使用される場合、相同性指向修復を指し、相同核酸(例えば、内因性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外因性核酸、例えば、鋳型核酸)を使用してDNA損傷を修復するプロセスを指す。HDRは、典型的には、二本鎖切断において有意な切除が行われ、DNAの少なくとも1つの一本鎖部分を形成するときに作用する。正常な細胞において、HDRは、典型的には、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖DNAの安定化、DNAクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、及びライゲーションなどの一連のステップを伴う。いくつかの事例では、HDRは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、ドナー鋳型(例えば、ドナーDNA鋳型)またはドナーオリゴヌクレオチドを使用して、二本鎖切断が生じた配列(例えば、DNA標的配列)を修復する。これにより、例えば、ドナー鋳型DNAからDNA標的配列への遺伝子情報の転写がもたらされる。ドナー鋳型DNA配列またはオリゴヌクレオチド配列がDNA標的配列と異なり、ドナー鋳型DNAポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部または全てがDNA標的配列に組み込まれる場合、HDRはDNA標的配列の改変(例えば、挿入、欠失、変異)をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型DNAポリヌクレオチド全体、ドナー鋳型DNAポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーは、DNA標的配列の部位に組み込まれる。
本明細書で使用される「非相同末端結合」または「NHEJ」という用語は、ライゲーション媒介修復及び/または非鋳型媒介修復を指す。
本発明の方法を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる。本発明は、任意の目的のために細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、変異体細胞を産生するように変更される。本明細書で使用される場合、「変異体細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる結果として生じる遺伝子型を有する細胞を指す。いくつかの事例では、「変異体細胞」は、例えば、本発明のCRISPR/Casシステムを使用して正常に機能する遺伝子が変更された場合に、変異表現型を示す。他の例では、例えば、本発明のCRISPR/Casシステムが変異体遺伝子型を修正するために使用される場合、「変異体細胞」は野生型表現型を示す。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を修正または修復するために(例えば、細胞に正常な表現型を回復するために)変更される。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を誘導するために(例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するために)変更される。
いくつかの実施形態では、変更はインデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせから生じる変異を指す。当業者によって理解されるように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが3の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、変更は点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドのうちの1つを置き換える置換を指す。本発明のCRISPR/Casシステムを使用して、任意の長さのインデルまたは標的ポリヌクレオチド配列における点変異を誘導することができる。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨害する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン(例えば、DNA結合ドメイン)の標的ポリヌクレオチド配列にインデルを誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本発明のCRISPR/Casシステムを使用して、本明細書に記載の詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトする方法を容易に理解するであろう。
「遺伝子ノックアウト」のプロセスは、それが存在する宿主細胞内の特定の遺伝子を不活性化し、目的のタンパク質が産生されないか、または不活性形態のいずれかをもたらし、当業者によって理解され、以下にさらに説明されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去すること、または他の配列との配列を中断すること、リーディングフレームを変更すること、または核酸の調節成分を変更することを含む、いくつかの異なる方法で達成することができる。例えば、目的の遺伝子のコード領域の全てまたは一部を除去するか、または「ナンセンス」配列で置き換えることができ、プロモーターなどの制御性配列の全てまたは一部を除去するか、または置き換えることができ、翻訳開始配列を除去するか、または置き換えることなどができる。
いくつかの実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本発明のCRISPR/Casシステムを使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで実行することができる。エクスビボの目的のために、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を治療または予防するために(例えば、エクスビボで細胞内の変異体対立遺伝子をノックアウトし、ノックアウトされた変異体対立遺伝子を対象に導入することによって)有用であり得る。
本明細書における「ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を付加するプロセスを意味する。これにより、コードされたタンパク質のレベルが上昇する。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子の1つ以上の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、またはタンパク質の発現を増加させる内因性遺伝子の調節成分を改変することを含む、いくつかの方法で達成することができる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」または「複数のベクター」は、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にまたは促進するツールを指す。
本明細書で使用される「パッケージング細胞」という用語は、感染性組換えウイルスまたはウイルスベクターをパッケージングするために必要な要素の一部または全てを含有する細胞を含む。パッケージング細胞は、組換えウイルスベクターを欠いていてもよい。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質を発現することができる1つ以上のベクターが含まれる。エンベロープウイルス粒子の産生に必要な要素の一部のみを含む細胞は、一過性のトランスフェクション、形質導入、または各追加の必要な要素の安定した組み込みの後続のステップを通じて、ウイルス粒子産生細胞株の生成における中間試薬として有用である。これらの中間試薬は、「パッケージング細胞」という用語に包含される。
本明細書で使用される場合、「ウイルス粒子」は、複製能のあるまたは欠陥のあるウイルス、それに由来するウイルスベクターを指し、目的のヌクレオチドを含んでも含んでいなくてもよい。
「エンベロープウイルス」は、ウイルスカプシドを取り囲むタンパク質性ウイルスエンベロープを含有するウイルスを指す。そのようなエンベロープウイルスには、オルトミクソウイルス及びパラミクソウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスが含まれる。エンベロープウイルスによる細胞感染の間、宿主細胞の形質膜は、いくつかのウイルスコードされたタンパク質を含むように改変され、ウイルス核タンパク質コアは、それが組み立てられた宿主細胞を出ると、修飾膜で包まれ、ウイルスエンベロープを形成する。
レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratory Press,758-63に見出すことができる。レンチウイルスは、霊長類群及び非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルスの例には、プロトタイプの「スローウイルス」ビスナ/マエジウイルス(VMV)、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、及び最近報告されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)が含まれる。
レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる(Lewis,P.et al.(1992)EMBO J 11:3053-8;Lewis、P.F.et al.(1994)J.Virol.68:510-6)。対照的に、MLVなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺、及び肝臓組織を構成する細胞などの非分裂細胞またはゆっくりと分裂細胞に感染することができない。
レンチウイルスベクターは、「霊長類」ベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクター(すなわち、霊長類、特にヒトに主に感染しないウイルスに由来する)であり得る。非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に自然に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、シュードタイプレンチウイルスベクターである。シュードタイプレンチウイルスベクターは、他のエンベロープウイルス由来の糖タンパク質を保有するベクター粒子を含む。シュードタイピングは、表現型的に混合された粒子またはシュードタイプの形成を通じてエンベロープウイルスの細胞向性を拡大するためのメカニズムである。いくつかの実施形態において、ベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)の融合性エンベロープG糖タンパク質でシュードタイピングされ得る。シュードタイプタンパク質は、狂犬病ウイルス、MLV、エボラウイルス、バキュロウイルス、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス)、及びフィロウイルスに由来し得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、HIV-1またはHIV-2系ベクターである。HIV-1ベクターは、単純なレトロウイルスにも見られるシス作用要素を含有する。gagオープンリーディングフレーム内に伸長する配列は、HIV-1のパッケージングに重要であることが示されている。したがって、HIV-1ベクターは、翻訳開始コドンが変異しているgagの関連部分を含有することが多い。さらに、大部分のHIV-1ベクターは、RREを含むenv遺伝子の一部も含有する。RevはRREと結合し、核から細胞質への完全長または単一スプライシングされたmRNAの輸送を可能にする。Rev及び/またはRREが存在しない場合、完全長HIV-1 RNAは核内に蓄積する。あるいは、Mason-Pfizerサルウイルスなどの特定の単純なレトロウイルスからの構成輸送要素を使用して、Rev及びRREの要件を緩和することができる。HIV-1 LTRプロモーターからの効率的な転写には、ウイルスタンパク質Tatが必要である。大部分のHIV-2系ベクターは、構造的にHIV-1ベクターに非常に類似している。HIV-I系ベクターと同様に、HIV-2ベクターはまた、完全長または単一スプライシングされたウイルスRNAの効率的な輸送のためにRREを必要とする。本発明で使用するためのHIV由来ベクターは、HIV株に関して限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞/パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターは、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるが、最終標的細胞内で感染性ウイルス粒子を産生するために独立した複製が不可能なウイルス粒子にRNAゲノムをパッケージングすることを可能にするのに十分なレンチウイルス遺伝子情報を有する。好ましい実施形態では、ベクターは、機能的なgag-pol及び/またはenv遺伝子及び/または複製に必須の他の遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、レンチウイルスゲノムと作動可能に連結されて、宿主細胞/パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指示する転写調節制御配列を含む。これらの調節配列は、転写されたウイルス配列(すなわち、5’U3領域)と関連する天然配列であってもよく、または別のウイルスプロモーター(例えば、CMVプロモーター)などの異種プロモーターであってもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、組み込み欠陥である。組み込み欠陥レンチウイルスベクター(IDLV)は、例えば、ベクターを触媒的に不活性なインテグラーゼでパッケージングすることによって(例えば、触媒部位にD64V変異を有するHIVインテグラーゼ;Naldini,L.et al.(1996)Science 272:263-7、Naldini,L.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-8、Leavitt,A.D.et al.(1996)J.Virol.70:721-8)、またはベクターLTRから必須のatt配列を修飾もしくは削除することによって(Nightingale,S.J.et al.(2006)Mol.Ther.13:1121-32)、または上記の組み合わせのいずれかによって産生することができる
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)である。単純ヘルペスウイルス(HSV)は、ニューロンに自然に感染するエンベロープを持った二本鎖DNAウイルスである。HSVは、外来DNAの大きな切片を収容することができ、これにより、ベクターシステムとして魅力的であり、ニューロンへの遺伝子送達のためのベクターとして用いられてきた。治療手順におけるHSVの使用は、溶解サイクルを確立できないように、株を減衰させる必要がある。HSVベクターをヒトの遺伝子治療に使用する場合、目的の遺伝子は、好ましくは、必須遺伝子に挿入される。これは、ベクターウイルスが野生型ウイルスに遭遇した場合、異種遺伝子の野生型ウイルスへの移行が組換えによって生じ得るため、必要である。しかしながら、NOIが必須遺伝子に挿入される限り、組換え移入はまた、レシピエントウイルスにおける必須遺伝子を欠失させ、異種遺伝子の複製能のある野生型ウイルス集団への「エスケープ」を防止する。
他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ワクシニアウイルス由来ベクターである。ワクシニアウイルスは、約190kbの直鎖、二本鎖DNAゲノムを有する大型エンベロープウイルスである。ワクシニアウイルスは、最大約25kbの外来DNAを収容することができ、これはまた大型遺伝子の送達にも有用である。遺伝子治療用途、例えば、MVA及びNYVAC株に好適である、いくつかの減衰ワクシニアウイルス株が当技術分野で即知である。
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合ヌクレオチドを含む高分子化合物を意味する。「核酸」という用語には、ポリリボ核酸(RNA)及びポリデオキシリボ核酸(DNA)が含まれ、両方とも一本鎖または二本鎖であり得る。DNAとしては、相補DNA(cDNA)、ゲノムDNA、プラスミドまたはベクターDNA、及び合成DNAが含まれるが、これらに限定されない。
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを指し、cDNA及びゲノムDNA核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前(5’非コード配列)及び後(3’非コード配列)の制御性配列として作用することができる核酸断片を指す。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
本明細書で使用される「アミノ酸」は、カルボキシル(--COON)及びアミノ(--NH.sub.2)基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然、すなわち、合成アミノ酸の両方を指す。3文字及び1文字の略語を有する天然アミノ酸には、アラニン(Ala;A);アルギニン(Arg、R);アスパラギン(Asn;N);アスパラギン酸(Asp;D);システイン(Cys;C);グルタミン(Gln;Q);グルタミン酸(Glu;E);グリシン(Gly;G);ヒスチジン(His;H);イソロイシン(Ile;I);ロイシン(Leu;L);リジン(Lys;K);メチオニン(Met;M);フェニルアラニン(Phe;F);プロリン(Pro;P);セリン(Ser;S);スレオニン(Thr;T);トリプトファン(Trp;W);チロシン(Tyr;Y);及びバリン(Val;V)が含まれる。
「アミノ酸置換」は、野生型または天然に存在するアミノ酸の、そのアミノ酸残基での野生型または天然に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸による1つ以上の置換を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本発明の置換アミノ酸は、合成または天然に存在するアミノ酸であり得る。ある特定の実施形態では、置換アミノ酸は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、及びVからなる群から選択される天然に存在するアミノ酸である。置換変異体は、短縮された系を使用して記載され得、例えば、第5の(5.sup.th)アミノ酸残基が置換された置換変異体は、「X5Y」と短縮され得、「X」は、置換される野生型または天然に存在するアミノ酸であり、「5」は、タンパク質またはポリペプチド内のアミノ酸残基であり、「Y」は、置換された、または非野生型もしくは非天然に存在するアミノ酸である。
「組換え」という用語は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関連して使用される場合、自然界に存在することが知られていない遺伝物質の新しい組み合わせを意味する。組換え分子は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、遺伝子スプライシング(例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する)、及び核酸分子、ペプチド、またはタンパク質の固体状態合成を含むがこれらに限定されない、組換え技術の分野で利用可能な周知の技術のいずれかによって作製することができる。
「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または核酸は、その天然環境から除去された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または核酸は、希釈剤またはアジュバントなどの賦形剤とともに製剤化され得、依然として単離されたものとみなされ得ることも理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「制御性配列」、「制御性要素」、及び「調節要素」という用語は交換可能であり、発現されるポリヌクレオチド標的の上流(5’非コード配列)、内部、または下流(3’非翻訳配列)であるポリヌクレオチド配列を指す。制御性配列は、例えば、転写のタイミング、転写の量もしくはレベル、RNAプロセシングもしくは安定性、及び/または関連する構造的ヌクレオチド配列の翻訳に影響を与える。制御性配列には、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位などが含まれる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」は、RNAポリメラーゼと結合し、下流コードまたは非コード配列の転写の開始に関与することができるDNA調節領域/配列を指す。いくつかの実施例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流に延びる。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位、及びRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、「TATA」ボックス及び「CAT」ボックスを含有することが多いが、必ずしもそうではない。
「構成的プロモーター」は、典型的には、ほとんどの条件下で活性であり、すなわち、転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、所与の分子因子(例えば、IPTG)の存在下または所与の環境条件(例えば、特定のCO2濃度、栄養素レベル、光、熱)などの特定の条件下でのみ活性である。その状態が存在しない場合、誘導性プロモーターは、典型的には、有意なまたは測定可能なレベルの転写活性を許容しない。例えば、誘導性プロモーターは、温度、pH、ホルモン、代謝産物(例えば、ラクトース、マンニトール、アミノ酸)、光(例えば、波長特異的)、浸透圧電位(例えば、塩誘導性)、重金属、または抗生物質に従って誘導され得る。多数の標準的な誘導性プロモーターが、当業者に知られているであろう。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、互いに機能的関係に配置されたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を制御するか、またはその調節に寄与する場合、コード配列に作用可能に連結される。制御性配列をコードする作用可能に連結されたDNA配列は、典型的には、コード配列と隣接する。しかしながら、エンハンサーは、プロモーターから最大数キロ塩基以上分離された場合に機能することができる。したがって、いくつかのポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結され得るが、隣接しない。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に結合することができる。
「ベクター」及び「プラスミド」という用語は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、遺伝物質を細胞に導入するためのポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクトルは、線形または円形であり得る。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノムに組み込むか、または宿主細胞内で独立して複製することができる。ベクターは、例えば、複製起点、マルチクローニング部位、及び/または選択可能なマーカーを含み得る。発現ベクターは通常、発現カセットを含む。ベクター及びプラスミドには、組み込みベクター、原核生物プラスミド、真核生物プラスミド、植物合成染色体、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。「ベクター」という用語はまた、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで細胞に核酸分子を導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方を含む。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションを含むがこれらに限定されない既知の方法によって、所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む様々な制御性要素を含むことができる。
「発現カセット」という用語は、宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの発現を促進するために、選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御性配列を含む、組換えまたは合成的に生成されたポリヌクレオチド構築物を指す。例えば、制御性配列は、宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写、または宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写及び翻訳を促進することができる。発現カセットは、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または発現ベクターに存在することができる。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、DNA鋳型からのポリヌクレオチドの転写を指し、例えば、mRNAまたは他のRNA転写産物(例えば、構造または足場などの非コードRNA)をもたらす。この用語は、転写されたmRNAがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスをさらに指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。発現は、ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞においてmRNAをスプライシングすることを含み得る。
本明細書で使用される「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性核酸分子を細胞に導入することを意味する。「トランスフェクト」細胞は、細胞内に外因性核酸分子を含み、「形質転換」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムDNAに組み込まれ得る、及び/または細胞によって、一時的にもしくは長期的に染色体外で維持され得る。外因性核酸分子または断片を発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の発現ベクター、例えば、Casタンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、Cas3、Cas9、もしくはCas10タンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
いくつかの実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低下をもたらす。「減少する(decrease)」、「低下した(reduced)」、「低下(reduction)」、及び「減少(decrease)」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少する」、「低下した」、「低下」、及び「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも10%の減少、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、もしくは最大100%を含む減少(すなわち、参照サンプルと比較して非存在のレベル)、あるいは参照レベルと比較して10~100%の間の任意の減少を意味する。
「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、一般に統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも10%、または少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、もしくは最大100%を含む増加、あるいは参照レベルと比較した10~100%の間の任意の増加、あるいは少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、あるいは参照レベルと比較して2倍から10倍以上の間の任意の増加を意味する。
「不活性化する」または「不活性化」という用語は、本明細書では、概して、目的の遺伝子の発現が参照レベルと比較して減少するか、または機能的もしくは活性的なタンパク質形態で発現しないことを意味するために使用され、「部分的に不活性化する」または「部分的に不活性化」という用語は、参照レベルと比較して減少したが除去されない目的の遺伝子の発現、または遺伝子によって発現されるタンパク質の割合が依然としてそれらの活性及び機能を保持することを指す。本明細書で使用される「完全に不活性化する」または「完全に不活性化」という用語は、目的の遺伝子が任意のタンパク質を発現しない、または目的の遺伝子によってコードされる全ての発現タンパク質が不活性であり、非機能的であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照されるポリペプチドが目的の細胞に導入されることを意味することを意図している。ポリペプチドは、例えば、染色体への組み込みなどによる細胞の遺伝物質へのコード化核酸の導入によって、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される用語は、発現可能な形態のコード化核酸の細胞への導入を指す。
「内因性」という用語は、細胞内に存在する参照される分子またはポリペプチドを指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されないコード化核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、修飾分子を親分子から物理的に分化させる改変を指す。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、バリアントポリペプチドの機能を非修飾ポリペプチドから分化させる1つ以上の修飾を含む。例えば、バリアントポリペプチドにおけるアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を与える。他の実施形態では、バリアントポリペプチドは、置換、欠失、もしくは挿入修飾、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、バリアントポリペプチドは、非修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対する親和性を増加させる1つ以上の修飾を含む。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、対応する天然または親配列と比較して、1つ以上の置換、挿入、または欠失を含む。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31~40、41~50、または51、またはそれ以上の修飾を含む。
本明細書で使用される「阻害剤」、「活性化剤」、及び「調節剤」という用語は、生物学的に関連する分子の機能または発現に影響を与える薬剤を指す。「調節物質」という用語は、阻害剤及び活性化剤の両方を含む。これらは、標的分子の発現または活性のためのインビトロ及びインビボアッセイを使用して同定され得る。場合によっては、「阻害剤」は、例えば、発現を阻害するか、または標的分子もしくはタンパク質に結合する薬剤である。これらは、刺激を部分的にまたは完全に遮断するか、またはプロテアーゼ阻害剤活性を有することができる。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作、または下方制御を含む、活性化を低減、減少、防止、または遅延させ得る。調節剤は、標的分子もしくはタンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。いくつかの事例では、「活性化剤」は、例えば、標的分子もしくはタンパク質の機能または発現を誘導あるいは活性化する薬剤である。それらは、標的分子活性に結合する、刺激する、増加する、開く、活性化する、または促進することができる。活性化剤は、標的分子またはタンパク質のアゴニストであり得る。「対象」及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、及び/または本明細書に記載の細胞による予防的治療を含む治療が提供されるヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的なこれらの感染症、状態または病状の治療について、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、哺乳動物、爬虫類、両生類、及び魚を含むが、これらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または飼いならされた哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどの他の哺乳動物、または生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。
用語「相同体」及び「相同配列」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能性、または構造レベルでの参照分子に類似する生物活性分子を指す。相同体は、参照配列と特定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含み得る。したがって、一実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも70パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも80または85パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも90パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも95パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも50、55、60、65、70、75、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を共有する。一実施形態では、相同または誘導体配列は、参照配列と100%配列同一性を共有する。相同または誘導体核酸配列はまた、高ストリンジェンスハイブリダイゼーション条件下で参照核酸配列と結合したままであるそれらの能力によって定義され得る。参照分子と構造的または機能的に類似性を有する相同体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造的及び機能的相同体、ならびに誘導体を検出、生成、及びスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。
本明細書全体を通して与えられるすべての最大数値制限は、そのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に記述されるように、すべてのより低い数値制限を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられるすべての最小数値制限は、そのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に記述されるように、すべてのより高い数値制限を含むであろう。本明細書全体を通して与えられるすべての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記述されるように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべての狭い数値範囲を含むであろう。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「%同一性」という用語は、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの1つ(例えば、BLASTP、及びBLASTN、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム)を使用して、または目視検査によって測定される、最大の対応物と比較され、アラインメントされる場合、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは、比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較では、典型的には、1つの配列が、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによってProc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似の方法を検索することによって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(575 Science Dr.,Madison,Wis.)におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータ化された実装によって、または目視検査によって(一般に、以下のAusubel et al.を参照)によって行われ得る。
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、Altschul et al.,J.Mol.
Biol.215:403-410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公開されている。
Biol.215:403-410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公開されている。
特定の実施形態の実施は、特に反対に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くは、例示の目的で以下に説明されている。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008)、Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II(IRL Press,Oxford,1985)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,Eds.,1984)、Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)、Annual Review of Immunology、ならびにAdvances in Immunologyなどのジャーナルのモノグラフを参照されたい。
請求項はいかなる選択的な要素も除外するように作成することができることに留意されたい。そのため、この記載は、請求項要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などの排他的な用語の使用に対して先の記載として役立つことを意図している。本開示を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書に記載され、例示されている個々の実施形態は、それぞれ、別個の構成要素及び特徴を有しており、この構成要素及び特徴は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、またはそのような特徴と組み合わせてもよい。あらゆる列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、または論理的に可能な他の順序で実行してよい。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法及び材料も本発明の実施または試験に使用してもよいが、代表的な例示的な方法及び材料をここに記載する。
本発明を説明する際には、以下の用語が、使用され、以下に示されるように、定義される。
本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語が特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限値の単位の10分の1までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値と、その指定範囲の任意の他の指定値または介在値とは、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立して、そのより小さい範囲に含まれ得、また、本発明に包含され、指定範囲内の任意の具体的に除外された制限値に従う。表示範囲が1つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に示される。「約」という用語は、その後に続く正確な数字及びその用語の後に続く数字に近いか、またはほぼその数字である数字を文字通り支持するために本明細書で使用される。ある数字が、具体的に引用されている数字に近いか、またはほぼその数字であるかを決定する際に、その近いかまたはほぼ引用されていない数字は、提示されている文脈において、具体的に引用されている数字と実質的に等価を提供する数字であり得る。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。さらに、引用された各刊行物、特許、または特許出願は、刊行物が引用されたものに関連する主題を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利が与えられていないことを認めるものと解釈するべきではない。さらに、提示される公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
III.実施形態の詳細な説明
A.操作組織適合性細胞
理解されるように、本明細書で提供する方法は、任意の型の有核細胞上で実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、非修飾細胞)は、A型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、A型Rh+(例えば、A+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、A型RH-(例えば、A-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型Rh+(例えば、B+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型Rh-(例えば、B-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型Rh+(例えば、AB+)型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型Rh-(例えば、AB-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型Rh+(例えば、O+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、非修飾細胞)は、hh型細胞であり、ボンベイ表現型を有する。
A.操作組織適合性細胞
理解されるように、本明細書で提供する方法は、任意の型の有核細胞上で実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、非修飾細胞)は、A型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、A型Rh+(例えば、A+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、A型RH-(例えば、A-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型Rh+(例えば、B+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、B型Rh-(例えば、B-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型Rh+(例えば、AB+)型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、AB型Rh-(例えば、AB-)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、O型Rh+(例えば、O+)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、非修飾細胞)は、hh型細胞であり、ボンベイ表現型を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される操作組織適合性細胞は、遺伝子編集を使用して、A、B、H、及びRh抗原を含む細胞の組織血液抗原のうちの1つ以上を修飾するように産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、例えば、A型細胞をO型細胞に、B型細胞をO型細胞に、AB型細胞をO型細胞に、A+型細胞をO-型細胞に、A-型細胞をO-型細胞に、AB+型細胞をO-型細胞に、AB-型細胞をO-型細胞に、B+型細胞をO-型細胞に、及びB-型細胞をO-型細胞に修飾するための遺伝子編集を使用して生成される。
いくつかの実施形態では、血液型A個体または群A細胞からの細胞は、ABO遺伝子で遺伝子修飾されて、α(1,3)N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有する機能的グリコシルトランスフェラーゼをもはや産生しない。いくつかの実施形態では、血液型B個体または群B細胞からの細胞は、ABO遺伝子で遺伝子修飾されて、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的グリコシルトランスフェラーゼをもはや産生しない。いくつかの実施形態では、血液型A個体、血液型B個体、または血液型AB個体からの細胞は、本明細書に記載の方法に従って操作され、ABO活性を欠く細胞を産生する。いくつかの事例では、ABO活性を有しないそのような細胞は、非修飾H抗原を発現または提示する。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ABO遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ABO遺伝子の1つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ABO遺伝子の2つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ABO遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ABO遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ABO遺伝子のヘテロ接合修飾である。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、FUT1遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、FUT1遺伝子の1つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、FUT1遺伝子の2つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、FUT1遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、FUT1遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、FUT1遺伝子のヘテロ接合修飾である。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、RHD遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、RHD遺伝子の1つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、RHD遺伝子の2つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、RHD遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、RHD遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、RHD遺伝子のヘテロ接合修飾である。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なABO遺伝子産物が細胞によって生成されないように、ABO遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なFUT1遺伝子産物が細胞によって生成されないように、FUT1遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なRHD遺伝子産物が細胞によって生成されないように、RHD遺伝子の遺伝子修飾を含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、組織適合性決定因子をコードする1つ以上の遺伝子における遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ABO遺伝子の遺伝子修飾及びRHD遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの事例では、操作細胞は、O型陰性細胞である。
いくつかの実施形態では、操作細胞は、FUT1遺伝子の遺伝子修飾及びRHD遺伝子の遺伝子修飾を含む。このように、操作細胞は、O型陰性細胞であり得る。
Cas9などであるがこれらに限定されない希少切断エンドヌクレアーゼを使用した遺伝子編集は、ABO遺伝子、FUT1遺伝子、及びRHD遺伝子などであるがこれらに限定されない組織適合性決定基をコードする1つ以上の遺伝子の標的破壊に利用される。
いくつかの事例では、ABO遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか1つを標的とする。他の例では、FUT1遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか1つを標的とする。特定の例では、RHD遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか1つを標的とする。いくつかの実施形態では、遺伝子のコード配列全体またはその大部分は、破壊または切除される。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas9編集による挿入欠失を細胞に導入して、ABO遺伝子、RHD遺伝子、及び/またはFUT1遺伝子を破壊する。
いくつかの実施形態では、RNA誘導DNAヌクレアーゼを使用して、ABO遺伝子のコード配列を標的として、ABO遺伝子の有害な変異を導入し、ABO機能を破壊する。他の実施形態では、ABOの非翻訳領域、イントロン配列、及び/またはエクソン配列が標的とされる。
いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ABO遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。
いくつかの実施形態では、RNA誘導DNAヌクレアーゼを使用して、FUT1遺伝子のコード配列を標的として、FUT1遺伝子の有害な変異を導入し、FUT1機能を破壊する。他の実施形態では、FUT1の非翻訳領域、イントロン配列、及び/またはエクソン配列が標的とされる。
いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。
いくつかの実施形態では、RNA誘導DNAヌクレアーゼを使用して、RHD遺伝子のコード配列を標的として、RHD遺伝子の有害な変異を導入し、RHD機能を破壊する。他の実施形態では、RHDの非翻訳領域、イントロン配列、及び/またはエクソン配列が標的とされる。
いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。
いくつかの実施形態では、細胞の組織適合性は、補体媒介性細胞死滅アッセイを使用して決定される。このようなアッセイの非限定的な例は、XCelligence SPプラットフォーム(ACEA BioSciences)である。
本発明の組織適合性細胞は、培養中の細胞、例えば培養哺乳動物細胞、例えば培養ヒト細胞を含む細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は多能性を保持する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、分化能を保持する。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞または非多能性幹細胞、多能性幹細胞または非多能性幹細胞、前駆細胞または非前駆細胞、分化細胞または非分化細胞などである。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞または細胞株(例えば、ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株)である。
いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞(例えば、RUES2またはH9細胞)、成体幹細胞、及び多能性幹細胞である細胞から産生される。特定の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞(例えば、RUES2またはH9細胞)、成体幹細胞、及び多能性幹細胞に由来するか、またはそれらから生成される分化細胞である。かかる分化細胞は、身体の任意の組織または器官の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞系療法に有用な任意の型である。
いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、上皮、結合、筋肉、もしくは神経組織または細胞、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、身体の任意の臓器または組織から産生される細胞から産生される。いくつかの事例では、細胞は、任意の真核生物(例えば、哺乳動物)器官系、例えば、心血管系(心臓、血管系)から;消化器系(食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、及び肛門)から;内分泌系(視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副甲状腺、副腎)から;排泄系(腎臓、尿管、膀胱)から;リンパ系(リンパ節、リンパ管、扁桃、腺様体、胸腺、脾臓)から;皮膚系(皮膚、髪、爪)から;筋肉系(例えば、骨格筋)から;神経系(脳、脊髄、神経);生殖系(卵巣、子宮、乳腺、精巣、精巣、前立腺)から;呼吸器系(咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜)から;骨格系(骨盤、軟骨)から;及びそれらの組み合わせからである。
いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、高度に有糸分裂する組織(例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩などの高度に有糸分裂する健常な組織)に由来する細胞から産生される。
いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、上皮、結合、筋肉、もしくは神経組織または細胞、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、身体の任意の器官または組織からの幹細胞である成体幹細胞から産生される。いくつかの事例では、本発明の組織適合性細胞は、任意の真核生物(例えば、哺乳動物)器官系、例えば、心血管系(心臓、血管系)から;消化器系(食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、及び肛門)から;内分泌系(視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副甲状腺、副腎)から;排泄系(腎臓、尿管、膀胱)から;リンパ系(リンパ節、リンパ管、扁桃、腺様体、胸腺、脾臓)から;皮膚系(皮膚、髪、爪)から;筋肉系(例えば、骨格筋)から;神経系(脳、脊髄、神経);生殖系(卵巣、子宮、乳腺、精巣、精巣、前立腺)から;呼吸器系(咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜)から;骨格系(骨盤、軟骨)から;及びそれらの組み合わせからの細胞から産生される。多くの実施形態では、多能性幹細胞は、本明細書に記載されるように、身体の特定の器官または組織に存在する2つ以上の特殊化された細胞型に自己再生及び発達(分化)する能力を有する細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、前駆細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成人前駆細胞(MAPC)、内皮前駆細胞(EPC)、芽細胞、脳室下帯に形成される中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚幹細胞(例えば、RUES2またはH9細胞)、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞前駆細胞、及び肝芽細胞である細胞から産生される。
B.組織適合性血液決定基の発現を修飾する方法
本明細書で提供されるのは、遺伝子修飾細胞を生成するために細胞内の核酸配列を修飾する方法である。このような修飾の例示的な技術には、相同組換え、ノックイン技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas9、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技法により、所望の遺伝子座部位での二本鎖DNA切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して、それに結合し、核酸分子の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに焦点を当てている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)のいずれかによって修復される。
本明細書で提供されるのは、遺伝子修飾細胞を生成するために細胞内の核酸配列を修飾する方法である。このような修飾の例示的な技術には、相同組換え、ノックイン技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas9、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技法により、所望の遺伝子座部位での二本鎖DNA切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して、それに結合し、核酸分子の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに焦点を当てている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)のいずれかによって修復される。
一実施形態では、細胞は、当技術分野で知られているように、CRISPR/Cas技術を使用して操作される。CRISPRに基づく技法は多数存在し、例えば、Doudna and Charpentier,Science,doi:10.1126/science.1258096を参照されたい。CRISPR技術及びキットは、市販されている。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)方法論を使用して作製される。TALENは、実質的に任意の所望のDNA配列と結合し、切断するように操作することができる、ヌクレアーゼと組み合わせた制限酵素である。TALENキットは市販されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して操作される。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のDNA配列を標的とするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の固有の配列を標的とすることができる。内因性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して、CRISPR及びTALENと同様に、高等生物のゲノムを正確に改変することができる。
当業者によって理解されるように、いくつかの異なる技術を使用して、細胞を血液組織適合性細胞、及びいくつかの実施形態では、本明細書に概説されるような低免疫原性であるように操作することができる。
1.ABO遺伝子の遺伝子修飾
本明細書では、CRISPR/Cas、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはCRISPR/Cas9遺伝子編集などのRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用して、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型O細胞を産生する方法が提供される。
本明細書では、CRISPR/Cas、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはCRISPR/Cas9遺伝子編集などのRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用して、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型O細胞を産生する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、Cas9編集システムは、ABO遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、表1、A、B、及びCのgRNA標的配列のうちのいずれか1つが使用される。いくつかの事例では、表1、A、B、及びCの2つ以上のgRNA標的配列が、遺伝子編集のために使用される。
いくつかの実施形態では、フレームシフト欠失、例えば、フレームシフト一塩基欠失は、遺伝子を不活性化するためにABO遺伝子に導入される。いくつかの事例では、欠失は、Cas9編集システム及び表1のガイドRNA標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ABO遺伝子のホモ接合性フレームシフト欠失を含む。いくつかの実施形態では、挿入欠失(インデル)は、エクソン1などのコードエクソンに導入される。いくつかの実施形態では、挿入欠失(インデル)は、エクソン2などのコードエクソンに導入される。いくつかの実施形態では、挿入欠失(インデル)は、エクソン8などのコードエクソンに導入される。いくつかの事例では、インデルは、Cas9編集システム及び表1のガイドRNA標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ABO遺伝子のホモ接合性インデルを含む。
いくつかの実施形態では、挿入欠失は、遺伝子編集、例えば、相同性指向性修復(HDR)によってABO遺伝子のエクソン6に258delG変異を導入するために生成される。いくつかの事例では、ABO 258delGバリアントは、ABO遺伝子にノックインされる。いくつかの実施形態では、特定のABO Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)のgRNA標的配列及び258delG変異をコードするHDRドナー鋳型を使用して、操作O型細胞を産生する。いくつかの実施形態では、表2のABOエクソン6-7 gRNA標的配列(ABOエクソン6-7gRNA 1)及びドナー鋳型(ABO 258delGドナー鋳型ガイド1)が使用される。ドナー鋳型は、258delGバリアント、及び逆鎖上のPAM部位を破壊するサイレント変異を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、2つの相同性アームを含み、各々は、約10nt~1Kb(例えば、20nt、30nt、40nt、または50nt~1Kb)の相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、表2のABOエクソン6-7 gRNA標的配列(ABOエクソン6-7gRNA 2)及びドナー鋳型(ABO 258delGドナー鋳型ガイド2)が使用される。ドナー鋳型には、258delGバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにgRNA配列に2つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、2つの相同性を含み、各々は、約10nt~1Kb(例えば、20nt、30nt、40nt、または50nt~1Kb)の相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、表2のABOエクソン6-7 gRNA標的配列(ABOエクソン6-7gRNA 3)及びドナー鋳型(ABO 258delGドナー鋳型ガイド3)が使用される。ドナー鋳型には、258delGバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにgRNA配列に2つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、2つの相同性アームを含み、各々は、約10nt~1Kb(例えば、20nt、30nt、40nt、または50nt~1Kb)の相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、表2のABOエクソン6-7 gRNA標的配列(ABOエクソン6-7gRNA 4)及びドナー鋳型(ABO 258delGドナー鋳型ガイド4)が使用される。ドナー鋳型には、258delGバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにgRNA配列に2つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、2つの相同性アームを含み、各々は、約10nt~1Kb(例えば、20nt、30nt、40nt、または50nt~1Kb)の相同配列を含む。
いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ABO遺伝子のホモ接合258delG変異を含む。
2.RHD遺伝子の遺伝子修飾
本明細書で提供されるのは、CRISPR/Cas、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルスベースの遺伝子編集システム、またはRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してRHD遺伝子を遺伝子編集することによってRh陰性細胞を産生する方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、RHD遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なRHD遺伝子産物を生成しない。RHD遺伝子産物の不在下では、細胞は、Rh血液型抗原を完全に欠く。
本明細書で提供されるのは、CRISPR/Cas、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルスベースの遺伝子編集システム、またはRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してRHD遺伝子を遺伝子編集することによってRh陰性細胞を産生する方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、RHD遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なRHD遺伝子産物を生成しない。RHD遺伝子産物の不在下では、細胞は、Rh血液型抗原を完全に欠く。
いくつかの実施形態では、Cas9編集システムは、RHD遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、表3、D、E、及びFのgRNA標的配列のうちのいずれか1つが使用される。いくつかの事例では、表3、D、E、及びFの2つ以上のgRNA標的配列が、遺伝子編集のために使用される。
いくつかの実施形態では、フレームシフト挿入欠失は、遺伝子の任意のコード配列に導入される。いくつかの実施形態では、遺伝子のUTR、イントロン、またはエクソン内の修飾が、RHD遺伝子の機能を破壊するために追加される。いくつかの実施形態では、表3、D、E、及びFのgRNA標的配列のうちのいずれか1つ以上を含むCRISPR/Cas9編集が利用される。
いくつかの実施形態では、修飾は、遺伝子を不活性化するためにRHD遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のエクソン1またはエクソン2などのコードエクソンが標的とされる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のコードエクソン4が標的とされる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のコードエクソン5が標的とされる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のコードエクソン6が標的とされる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のコードエクソン7が標的とされる。いくつかの実施形態では、RHD遺伝子のコードエクソン8が標的とされる。いくつかの事例では、欠失は、Cas9編集システム、及びRHD遺伝子の5’末端の配列を標的とするガイドRNA標的配列、及びエクソン8などのエクソンに対するガイドRNA標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、1つのgRNA標的配列は、表3のRHD 5’UTRガイド1であり、1つのgRNA標的配列は、表3のRHDエクソン8ガイド1である。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、RHD遺伝子のホモ接合性修飾を含み、それにより遺伝子を不活性化する。
いくつかの実施形態では、gRNA標的配列は、RHD遺伝子のエクソン1またはエクソン2に対するものである。いくつかの実施形態では、gRNA標的配列は、フレームシフト変異を誘導して、エクソン1またはエクソン2を不活性化する表3のgRNAである。
3.FUT1遺伝子の遺伝子修飾
本明細書では、CRISPR/Cas9、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してFUT1遺伝子を編集することによって、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型O細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、FUT1遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なFUT1遺伝子産物を生成しない。FUT1の非存在下では、細胞はH抗原を完全に欠き、ボンベイヒスト血液型(hh)を有する。
本明細書では、CRISPR/Cas9、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはRNA干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してFUT1遺伝子を編集することによって、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型O細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、FUT1遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なFUT1遺伝子産物を生成しない。FUT1の非存在下では、細胞はH抗原を完全に欠き、ボンベイヒスト血液型(hh)を有する。
いくつかの実施形態では、Cas9編集システムは、FUT1遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、表4、G、H、及びIのgRNA標的配列のうちのいずれか1つが使用される。いくつかの事例では、表4、G、H、及びIの2つ以上のgRNA標的配列が、遺伝子編集のために使用される。
いくつかの実施形態では、修飾は、遺伝子を不活性化するためにFUT1遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、FUT1遺伝子のエクソン4などのコードエクソンが標的とされる。いくつかの事例では、欠失は、Cas9編集システム及び表4のガイドRNA標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、FUT1遺伝子のホモ接合性修飾を含み、それにより遺伝子を不活性化する。
いくつかの実施形態では、フレームシフト挿入欠失は、遺伝子の任意のコード配列に導入される。いくつかの実施形態では、遺伝子のUTR、イントロン、またはエクソン内の修飾が、FUT1遺伝子の機能を破壊するために追加される。いくつかの実施形態では、表4、G、H、及びIのgRNA標的配列のうちのいずれか1つ以上を含むCRISPR-Cas9編集が使用される。
いくつかの実施形態では、第1の遺伝子修飾はABO遺伝子の機能を破壊し、第2の遺伝子修飾はRHD遺伝子の機能を破壊する。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子修飾はFUT1遺伝子の機能を破壊し、第2の遺伝子修飾はRHD遺伝子の機能を破壊する。
一般に、これらの方法は、個別に、または組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、B2M遺伝子修飾、CIITA遺伝子修飾、及びCD47導入遺伝子も含む。いくつかの実施形態では、細胞は、B2Mホモ接合ヌル遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、CIITAホモ接合ヌル遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、CD47を過剰発現する。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、B2M-/-、CIITA-/-、CD47 tgを含むがこれらに限定されない遺伝子修飾を保有する。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性幹細胞及び低免疫原性人工多能性幹細胞を含む低免疫原性細胞の生成において、CRISPRは、CD47機能性をノックインするためのウイルス技法(例えば、レンチウイルス)を用いて、操作細胞における活性B2M及び/またはCIITAタンパク質の発現を低減するために使用され得る。また、当業者には理解されるように、B2MをノックアウトするためのCRISPRステップ、続いて、CD47機能をノックインするためのレンチウイルスの最終ステップでCIITAをノックアウトするためのCRISPRステップを順次利用するが、これらの遺伝子は、異なる技術を使用して異なる順序で操作することができる。
C.低免疫原性細胞を生成するための追加の修飾
本明細書では、MHC I及び/またはMHC IIの発現を制御する1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の修飾を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、MHC I及びMHC IIの両方の発現は、本明細書に記載されるものなどの1つ以上の標的化ポリヌクレオチド配列によって制御される。
本明細書では、MHC I及び/またはMHC IIの発現を制御する1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の修飾を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、MHC I及びMHC IIの両方の発現は、本明細書に記載されるものなどの1つ以上の標的化ポリヌクレオチド配列によって制御される。
いくつかの実施形態では、細胞は、MHC Iの発現を制御する1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、MHC IIの発現を制御す1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。いくつかの態様では、遺伝子編集システムを使用して、1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を修飾する。いくつかの実施形態では、標的化ポリヌクレオチド配列は、B2M、CIITA、及びNLRC5からなる群から選択される1つ以上である。ある特定の実施形態では、細胞のゲノムは、HLA発現の重要な構成要素を低下または欠失するように変更されている。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスI分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞)またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は多能性を保持している。いくつかの実施形態では、幹細胞は、分化能を保持する。特定の態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスII分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞)またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、1つ以上の遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスI及びII分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞)またはその集団を提供する。MHC I及び/またはMHC IIタンパク質の発現に対する効率的な干渉は、以下のうちの1つ以上によって達成され得る:(1)多型HLA対立遺伝子(HLA-A、-B、-C)及びMHC-II遺伝子を直接標的とすること、(2)すべてMHC-I分子の表面輸送を防止するB2Mの除去、及び/または(3)HLA発現に重要であるLRC5、RFX-5、RFX関連アンキリン含有タンパク質(RFX-ANK)、RFX関連タンパク質(RFX-AP)、IRF1、NF-Y、及びCIITAなどのMHCエンハノソームの成分の欠失。
ある特定の実施形態では、MHC IまたはMHC IIの発現は、ゲノムDNAの隣接するストレッチを標的化及び欠失し、それにより、B2M、CIITA、及びNLRC5からなる群から選択される標的遺伝子の発現を低下または排除することによって調節される。
いくつかの実施形態では、MHC Iの発現は、ゲノムDNAの隣接するストレッチを標的とし、欠失させることによって低減させ、それによってHLA-A、HLA-B、及びHLA-Cの発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、MHC Iの発現は、B2M遺伝子のゲノム修飾によって低減または排除される。いくつかの事例では、ゲノム修飾は、CRISPR/Casシステムを使用して実施される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、CIITA遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにB2M及びNLRC5などであるがこれらに限定されない1つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、B2M遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにCIITA及びNLRC5などであるがこれらに限定されない1つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、NLRC5遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにB2M及びCIITAなどであるがこれらに限定されない1つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。
いくつかの実施形態では、細胞はまた、HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1阻害剤、及びIL-35からなる群から選択される1つの発現を増加させるための修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、WO2016/183041に記載されているように、HLA発現に重要なRFX-5、RFX関連アンキリン含有タンパク質(RFX-ANK)、RFX関連タンパク質(RFX-AP)、IRF1、NFY-A、NFY-B、NFY-C、及びCIITAなどの1つ以上の遺伝子の発現を調節することによって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。追加の実施形態では、プロデューサー細胞へのさらなる修飾には、WO2016/183041に記載されているように、OX40、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、B7-2、ICOS、CD27、HVEM、SLAM、CD226、PD1、CTLA4、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、CD30、TLT、VISTA、B7-H3、PD-L2、LFA-1、CD2、CD58、ICAM-3、TCRA、TCRB、FOXP3、HELIOS、ST2、PCSK9、CCR5、及び/またはAPOC3などの1つ以上の遺伝子の発現を修飾することが含まれ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、WO2018/227286に記載されているように、PDL-1、HLA-G、CD47、CD200、FASLG、CLC21、MFGE8、及び/もしくはSERPIN B9などの1つ以上の導入遺伝子、またはPDL-1、HLA-G、CD47、CD200、FASLG、CLC21、MFGE8、及び/もしくはSERPIN 9のアゴニストとして作用する生物製剤をコードする遺伝子の導入によって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、PDL-1、HLA-G、及びCD47を含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、PDL-1及びHLA-Gを含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、PDL-1及びCD47を含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、WO2018/227286に記載されているように、TGFβ、CD73、CD39、LAG3、IL1R2、ACKR2、TNFRSF22、TNFRSF23、TNFRS10、DAD1、及び/もしくはIFNγR1 d39などの1つ以上の導入遺伝子、またはTGFβ、CD73、CD39、LAG3、IL1R2、ACKR2、TNFRSF22、TNFRSF23、TNFRS10、DAD1、及び/もしくはIFNγR1 d39のアゴニストとして作用する生物製剤をコードする遺伝子のさらなる導入によって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞の死滅を引き起こすトリガーによって活性化される自殺遺伝子を細胞にさらに導入することによって生成される。一実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)であり、トリガーは、ガンシクロビルである。別の実施形態では、自殺遺伝子は、Escherichia coliシトシンデアミナーゼ遺伝子(EC-CD)であり、トリガーは、5-フルオロシトシン(5-FC)である。さらに別の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質であり、トリガーは、二量体化の特異的化学誘導因子(CID)である。
いくつかの事例ではCRISPR/Casシステムなどの遺伝子編集システムを使用して、AAVS、HPRT、CCR5、及びROSA26遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への低免疫因子などの低免疫因子の挿入を促進し、積極的に免疫拒絶を阻害する。いくつかの実施形態では、低免疫因子は、細胞の単一のセーフハーバー遺伝子座に挿入される。他の実施形態では、低免疫因子は、1つを超えるセーフハーバー遺伝子座に挿入される。いくつかの事例では、低免疫因子は、発現ベクター、例えば、レンチウイルス発現ベクターを使用してセーフハーバー遺伝子座に挿入される。
細胞の低免疫原性を決定するためのアッセイは、概して、本明細書及び参照により本明細書に組み込まれるWO2018/132783に記載される。例えば、低免疫原性は、いくつかの技術を使用してアッセイされ得る。これらの技術には、同種異系宿主への投与、ならびに宿主動物のT細胞及び/またはB細胞応答のモニタリングが含まれる。T細胞機能は、ELISpot、ELISA、FACS、PCR、またはマスサイトメトリー(CYTOF)によって評価され得る。B細胞応答または抗体応答は、FACSまたはLuminexを使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば、未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、低下したレベルの免疫原性を示す。いくつかの実施形態では、低減されたレベルは、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍低減される。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞と比較して、マクロファージ食作用の低減、例えば、マクロファージ食作用の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の減少を促進し、マクロファージ食作用の低減は、食作用指数をインビトロでアッセイすることによって決定される。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、PBMCによる細胞傷害媒介性細胞溶解の低減、例えば、細胞溶解の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の低減をもたらす。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、NK媒介性細胞溶解の低減、例えば、NK媒介性細胞溶解の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の減少をもたらし、NK媒介性細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによってインビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、CD8+T細胞媒介細胞溶解の低減、例えば、CD8T細胞媒介細胞溶解の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の低減をもたらす。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、CD4+T細胞増殖及び/または活性化の低減、例えば、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の低減を誘導し、CD4T細胞増殖は、インビトロでアッセイされる(例えば、修飾または未修飾哺乳動物源細胞、及びCD4+T細胞とCD3/CD28 Dynabeadsとの共培養アッセイ)。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、T細胞IFN-ガンマ分泌の低減、例えば、T細胞IFN-ガンマ分泌の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の低減を引き起こし、T細胞IFN-ガンマ分泌は、例えば、IFN-ガンマELISPOTによってインビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、免疫原性サイトカインの分泌の低減、免疫原性サイトカインの分泌の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の低減を引き起こし、免疫原性サイトカインの分泌は、ELISAまたはELISpotを使用してインビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、免疫抑制性サイトカインの分泌の増加、例えば、免疫抑制性サイトカインの分泌の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の増加を誘導し、免疫抑制性サイトカインの分泌は、ELISAまたはELISPOTを使用してインビトロでアッセイされる。
本明細書に記載される細胞は、免疫原性について評価することもできる。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、抗IgM抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。他の実施形態では、免疫原性は、PBMC細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)とインキュベートし、次いでPBMCによる細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、ナチュラルキラー(NK)細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、NK細胞とインキュベートし、次いでNK細胞による細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、CD8+T細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、CD8+T細胞とインキュベートし、次いでCD8+T細胞による細胞の溶解について評価される。
1.CIITA
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、クラスIIトランスアクチベータ(CIITA)発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC II遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、CIITAは、LRまたはヌクレオチド結合ドメイン(NBD)ロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーのタンパク質のメンバーであり、MHCエンハンセオソームと結合することによってMHC IIの転写を調節する。
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、クラスIIトランスアクチベータ(CIITA)発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC II遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、CIITAは、LRまたはヌクレオチド結合ドメイン(NBD)ロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーのタンパク質のメンバーであり、MHCエンハンセオソームと結合することによってMHC IIの転写を調節する。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、CIITAのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CIITAの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CIITAのオルソログである。
いくつかの態様では、CIITAの発現の低下または排除は、以下のMHCクラスII:HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、及びHLA-DRのうちの1つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、CIITA遺伝子を標的化する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるCIITA遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びCIITA遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CIITA遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録1(WO2016183041の表12)の配列番号5184~36352からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。
CIITA遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、PCRによるCIITA遺伝子の結果として生じる遺伝子改変及びHLA-II発現の低下は、FACS分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、CIITAタンパク質発現は、CIITAタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
2.B2M
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、アクセサリー鎖B2Mの発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC-I遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、B2Mの発現を調節する(例えば、低下または削除する)ことによって、MHC-I分子の表面輸送が遮断され、細胞が低免疫原性になる。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、アクセサリー鎖B2Mの発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC-I遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、B2Mの発現を調節する(例えば、低下または削除する)ことによって、MHC-I分子の表面輸送が遮断され、細胞が低免疫原性になる。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はB2Mのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、B2Mの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、B2Mのオルソログである。
いくつかの態様では、B2Mの発現の減少または排除は、以下のMHC I分子-HLAーA、HLA-B、及びHLA-Cのうちの1つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、B2M遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるB2M遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びB2M遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、B2M遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録2(WO2016/183041の表15)の配列番号81240~85644からなる群から選択される。
B2M遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、PCRによるB2M遺伝子の結果として生じる遺伝子修飾及びHLA-I発現の低下は、FACS分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、B2Mタンパク質発現は、B2Mタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
3.NLRC5
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、NLRファミリー、CARDドメイ含有5/NOD27/CLR16.1(NLRC5)の発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC-I遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、NLRC5は、MHC-Iを介した免疫応答の重要な調節因子であり、CIITAと同様に、NLRC5はIIFN-γによって高度に誘導され、核に移行することができる。NLRC5は、MHC-I遺伝子のプロモーターを活性化し、MHC-IならびにMHC-I抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、NLRファミリー、CARDドメイ含有5/NOD27/CLR16.1(NLRC5)の発現を標的化及び調節(例えば、低下または排除)することによって、MHC-I遺伝子の発現を調節(例えば、低下または排除)する。いくつかの態様では、調節は、CRISPR/Casシステムを使用して生じ、NLRC5は、MHC-Iを介した免疫応答の重要な調節因子であり、CIITAと同様に、NLRC5はIIFN-γによって高度に誘導され、核に移行することができる。NLRC5は、MHC-I遺伝子のプロモーターを活性化し、MHC-IならびにMHC-I抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はNLRC5のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NLRC5の相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NLRC5のオルソログである。
いくつかの態様では、NLRC5の発現の減少または排除は、以下のMHC I分子-HLAーA、HLA-B、及びHLA-Cのうちの1つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、NLRC5遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるNLRC5遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びNLRC5遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、NLRC5遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも1つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録3(WO2016183041の表14)の配列番号36353~81239からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。
NLRC5遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、PCRによるNLRC5遺伝子の結果として生じる遺伝子改変及びHLA-I発現の低下は、FACS分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、NLRC5タンパク質発現は、NLRC5タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。
4.HLA-A/B/C
いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cのうちの1つ以上を発現しないか、または低減した発現を示さない。いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cを発現しないか、または低減した発現を示さない。
いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cのうちの1つ以上を発現しないか、または低減した発現を示さない。いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cを発現しないか、または低減した発現を示さない。
いくつかの実施形態では、本開示は、HLA-A遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスI分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、低免疫原性幹細胞)またはその集団を提供する。ゲノムDNAの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。
特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的HLA-A配列を改変するための方法であって、HLA-A配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連(Cas)タンパク質及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Casタンパク質を標的HLA-Aポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的HLA-Aポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示は、HLA-B遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスI分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、低免疫原性幹細胞)またはその集団を提供する。ゲノムDNAの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。
特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的HLA-B配列を改変するための方法であって、HLA-B配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連(Cas)タンパク質及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Casタンパク質を標的HLA-Bポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的HLA-Bポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示は、HLA-C遺伝子が編集されてゲノムDNAの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるMHCクラスI分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞(例えば、低免疫原性幹細胞)またはその集団を提供する。ゲノムDNAの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。
特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的HLA-C配列を改変するための方法であって、HLA-C配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連(Cas)タンパク質及び少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Casタンパク質を標的HLA-Cポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的HLA-Cポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。
5.CD47
いくつかの態様では、本明細書に開示される発明は、CD47の発現を調節する(例えば、増加する)。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞ゲノムが修飾されてCD47を発現するゲノムを含む幹細胞(例えば、低免疫原性幹細胞)またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、CD47を発現するように幹細胞ゲノムを改変するための方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのCD47の挿入を容易にすることができる。特定の実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸は、本明細書に提供される付録4(WO2016183041の表29)の配列番号200784~231885からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本明細書に開示される発明は、CD47の発現を調節する(例えば、増加する)。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞ゲノムが修飾されてCD47を発現するゲノムを含む幹細胞(例えば、低免疫原性幹細胞)またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、CD47を発現するように幹細胞ゲノムを改変するための方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのCD47の挿入を容易にすることができる。特定の実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸または少なくとも1対のリボ核酸は、本明細書に提供される付録4(WO2016183041の表29)の配列番号200784~231885からなる群から選択される。
D.遺伝子修飾の方法
本発明は、当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態では、本方法は、本発明のCRISPR/Casシステムを利用することを含む。例えば、無効化されたCas9タンパク質を含むがこれに限定されない塩基編集システムを利用することができる。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列(例えば標的遺伝子)を改変することができる任意のCRISPR/Casシステムを使用することができる。このようなCRISPR/Casシステムは、様々なCasタンパク質を使用することができる(Haft et al.PLoS Comput Biol.2005;1(6)e60)。CRISPR/Casシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できるようにするこのようなCasタンパク質の分子機構としては、RNA結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムの代替物を使用して、部位特異的リコンビナーゼ(SSR)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる)などを含むがこれらに限定されない細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。
本発明は、当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態では、本方法は、本発明のCRISPR/Casシステムを利用することを含む。例えば、無効化されたCas9タンパク質を含むがこれに限定されない塩基編集システムを利用することができる。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列(例えば標的遺伝子)を改変することができる任意のCRISPR/Casシステムを使用することができる。このようなCRISPR/Casシステムは、様々なCasタンパク質を使用することができる(Haft et al.PLoS Comput Biol.2005;1(6)e60)。CRISPR/Casシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できるようにするこのようなCasタンパク質の分子機構としては、RNA結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムの代替物を使用して、部位特異的リコンビナーゼ(SSR)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる)などを含むがこれらに限定されない細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。
CRISPRシステムは、クラス1及びクラス2の2つの主要なクラスに分類することができ、さらに異なるタイプ及びサブタイプに分類される。CRISPRシステムの分類は、特定の核酸を切断することができるエフェクターCasタンパク質に基づいている。クラス1 CRISPRシステムでは、エフェクターモジュールはマルチタンパク質複合体からなるが、クラス2システムでは1つのエフェクタータンパク質のみを使用する。クラス1 CRISPRには、タイプI、III、及びIVが含まれ、クラス2 CRISPRには、タイプII、V、及びVIが含まれる。これらのタイプのCRISPRシステムのいずれも本発明に従って使用することができるが、本発明に従って使用するのに好ましいRNA及びCasタンパク質を組み込む3つのタイプのCRISPR系が存在する:タイプI(Cas3によって例示される)、II(Cas9によって例示される)、及びIII(Cas10によって例示される)。タイプII CRISPRは、最もよく特徴付けされたシステムの1つである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPRタイプIシステムである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPRタイプIIシステムである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPRタイプVシステムである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPRタイプVIシステムである。
本技術のCRISPR/Casシステムを使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞において改変される望ましい標的ポリヌクレオチド配列が、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、さもなければ病原体の細胞への侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に理解するであろう。例えば、細胞内で変化することが望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する一塩基多型を含むゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。そのような例では、本技術のCRISPR/Casシステムを使用して、細胞を野生型対立遺伝子で置き換えることにより、細胞内の疾患に関連するSNPを修正することができる。別の例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、病原体が細胞に侵入し、細胞内で増殖するのを防ぐために標的遺伝子の機能を破壊するための欠失または挿入に適した標的であり得る。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、本発明のCRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに対してハイブリダイズすることができる少なくとも1つ~2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNAまたはガイドRNA標的配列)と、含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基(すなわち、アミノ酸のポリマー)を指すために互換的に使用され、改変アミノ酸(例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化、など)及びアミノ酸類似体が含まれる。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、フラグメント及び他の同等物、バリアント、及び上記の類似体が含まれる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、置換及び/または改変は、タンパク質分解を防止もしくは低下し、かつ/または細胞内のポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、ペプチド結合置換(例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など)を含むことができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、代替アミノ酸(例えば、D-アミノ酸、ベータ-アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど)を含むことができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、部分(例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど)を含むように改変を含むことができる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、コアCasタンパク質を含む。例示的なCasコアタンパク質には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1またはCsx12としても知られている)、Cas10、Cas11、Cas12、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、その相同体、またはその修正版が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、E.coliサブタイプ(CASS2としても知られる)のCasタンパク質を含む。E.Coliサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、及びCas5eが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Ypestサブタイプ(CASS3としても知られる)のCasタンパク質を含む。Ypestサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csy1、Csy2、Csy3、及びCsy4が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Nmeniサブタイプ(CASS4としても知られる)のCasタンパク質を含む。Nmeniサブタイプの例示的なCasタンパク質にはCsn1及びCsn2が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Dvulgサブタイプ(CASS1としても知られる)のCasタンパク質を含む。Dvulgサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csd1、Csd2、及びCas5dが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Tneapサブタイプ(CASS7としても知られる)のCasタンパク質を含む。Tneapサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Cst1、Cst2、Cas5tが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、HmariサブタイプのCasタンパク質を含む。Hmariサブタイプの例示的なCasタンパク質にはCsh1、Csh2、及びCas5hが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Apernサブタイプ(CASS5としても知られる)のCasタンパク質を含む。Apernサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、及びCas5aが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Mtubeサブタイプ(CASS6としても知られる)のCasタンパク質を含む。Mtubeサブタイプの例示的なCasタンパク質には、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、及びCsm5が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、RAMPモジュールCasタンパク質を含む。例示的なRAMPモジュールCasタンパク質には、Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5、及びCmr6が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Klompe et al.,Nature 571,219-225(2019)、Strecker et al.,Science 365,48-53(2019)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、本明細書に記載されるCasタンパク質のいずれか1つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも1つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA(gRNA))と複合体を形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたCas9タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたCas12a(Cpf1としても知られる)タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的ドメインは複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質の機能的部分は、RuvC様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質の機能的部分は、HNHヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質の機能的部分は、RuvC様ドメインの機能的部分を含む。
いくつかの実施形態では、外因性Casタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドに共役または融合させることができる。本明細書において使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」は、細胞中への分子の取り込みを促進するそれぞれポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有することができる。
ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、荷電したタンパク質(例えば、正電荷、負電荷または全体として中性電荷を持つ)に共役または融合させることができる。そのような連結は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、細胞に透過するCasタンパク質の能力を有意に増加させるために正に超荷電した(superpositively charged)GFPに融合させることができる(Cronican et al.ACS Chem Biol.2010;5(8):747-52)。ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、細胞へのその進入を促進するためにタンパク質形質導入ドメイン(PTD)に融合させることができる。例示的なPTDとしては、Tat、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、PTDに融合したCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、tatドメインに融合したCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、正に超荷電したGFPに融合したCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、PTDに融合したCas12aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、tatドメインに融合したCas12aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたCas12aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したCas12aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas12aタンパク質は、正に超荷電したGFPに融合したCas12aポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Casタンパク質をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、mRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたmRNA(例えば、合成の改変されたmRNA)を含む。
Cas9は、結合したガイドRNA内の20ヌクレオチド配列(例えば、プロトスペーサー)に相補的な部位でのゲノム編集を媒介する。さらに、標的部位は、20ヌクレオチド標的部位と隣接する3’末端にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含んでいなければならず、Streptococcus pyogenes Cas9については、PAM配列はNGGである。本発明の方法は、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を想定する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つはtracrRNAを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つはCRISPR RNA(crRNA)を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Casタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドRNAを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、Casタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするセグメントを含む。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸の両方は、Casタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするセグメントを含み、本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のCRISPR/Casシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。1~2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも2つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。gRNA分子は、概して、標的化ドメイン及びtracrを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメイン及びtracrは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、本明細書では「単一ガイドRNA」または「sgRNA」などと呼ばれる単一の隣接するポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、gRNA分子は、複数の、通常は2つのポリヌクレオチド分子からなり、これらは自体は、通常、ハイブリダイゼーションを通じて会合することができ、本明細書では、「デュアルガイドRNA」または「dgRNA」、「2部ガイドRNA」などと称される。
標的部位のPAM末端(ガイドRNAの3’末端)に隣接する7~12塩基対において、ガイドRNAと標的DNAとの相補性が必要であり、非PAM末端(ガイドRNAの5’末端)においてミスマッチが許容されることが示唆されている。いくつかの実施形態では、ガイドRNAのDNA結合セグメントと標的DNAとの間に少なくとも1つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドRNAのDNA結合セグメントと標的DNAとの間に少なくとも2つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドRNAのDNA結合セグメントと標的DNAとの間に少なくとも3つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドRNAのDNA結合セグメントと標的DNAとの間に少なくとも4つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドRNAのDNA結合セグメントと標的DNAとの間に少なくとも5つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つから2つのリボ核酸配列(例えば、gRNA)と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、2つのリボ核酸配列と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つのリボ核酸配列と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸(例えば、合成の修飾されたmRNA)によってコードされる。
本発明の方法は、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸配列の使用を想定する。いくつかの実施形態では、単一のガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドRNAが使用される。いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のうちの少なくとも1つはtracrRNAを含み、いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のうちの少なくとも1つはCRISPR RNA(crRNA)を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Casタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドRNAを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸配列は、Casタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズさせるcrRNA及びtracrRNAを含むガイドRNAである。
標的配列(例えば、プロトスペーサー)に特異的なガイドRNAのリボ核酸配列は、crRNAについてのチミンをウラシルで置き換え、tracrRNA配列を追加することによって設計することができる。ガイドRNAは、Casタンパク質の結合シグナルとして機能するPAM配列を含まない。標的配列から、標的配列に相補的なcrRNAを含むガイドRNAを設計することができる。ガイドRNA配列もまた、最小限のオフターゲティング結合及び切断で設計される。いくつかの事例では、Hsu et al.,Nature Biotechnology,2013,31,827-832に記載のものを含むオフターゲット予測方法及びアルゴリズムを利用して、ガイドRNA標的配列を評価する。本明細書で提供されるのは、表及び図のいずれかに開示されるgRNA標的に対応するRNA配列を含むガイドRNAである。
本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のCRISPR/Casシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。1~2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも2つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも1つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸の各々は、標的モチーフ間に位置する変異体対立遺伝子に隣接するCasタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。
いくつかの実施形態では、1~2つのリボ核酸の各々は、Casタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドRNAを含む。
いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、かつ/またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、かつ/またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的ではなく、かつ/またはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、かつ/またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフを相殺するために相補的であり、かつ/またはハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集のための標的核酸配列は、プロトスペーサー隣接モチーフまたはプロトスペーサー関連モチーフ(PAM)と名付けられた特定の配列をその3’末端に有することができる。PAMは標的化核酸配列内に存在するが、それを標的とするために産生されるcrRNA内には存在しない。いくつかの実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)は、リーダー遠位端のプロトスペーサーのすぐ近くまたはその付近から始まる2~5ヌクレオチドに対応し得る。PAMの配列及び位置は、異なるシステム間で異なる。PAMモチーフの非限定的な例には、NNAGAA(配列番号98)、NAG、NGG、NGGNG(配列番号99)、AWG、CC、CC、CCN、TCN、及びTTCが含まれる。異なるタイプII CRISPRシステムは、異なるPAM要件を有する。例えば、S.pyogenesシステムはNGG配列を必要とし、Nは任意のヌクレオチドである。いくつかの事例では、Cas9タンパク質は、特定のPAMモチーフを認識するように、または非天然のPAMモチーフを認識するように操作することができる。いくつかの事例では、選択標的配列は、アミノ酸の任意の組み合わせとともに、より小さいまたはより大きなPAMモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、選択された標的配列は、Cas9タンパク質またはそのバリアントによって認識される少なくとも3、好ましくは4、より好ましくは5ヌクレオチドを含む、PAMモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸及び少なくとも1~2つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入(例えば、レンチウイルス形質導入)を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1~2つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、2つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸(例えば、合成の修飾されたmRNA)によってコードされる。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、ペプチド核酸(PNA)またはロックド核酸(LNA)を含む。
本明細書に記載の遺伝子のCRISPR/Casベースの標的化に有用な例示的なgRNA配列を表1に提供する。配列は、2016年5月9日に出願されたWO2016/183041に見出すことができ、表、付属書、及び配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
CRISPR/Casシステムのさらなる開示は、米国特許第8,697,359号、同第8,993,233号、同第8,795,965号、同第8,771,945号、同第8,889,356号、同第8,865,406号、同第8,999,641号、同第8,945,839号、同第8,932,814号、同第8,871,445号、同第8,906,616号、及び同第8,895,308号、Yan et al.,Science 363,88-91(2019)、Moon et al.Experimental & Molecular Medicine(2019)51:130、ならびにTachibana,Science(2019;www.sciencemag.org/features/2019/09/beyond-crispr-what-s-current-and-upcoming-genome-editing)において提供され、図、図の凡例、及び方法の説明を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の遺伝子のCRISPR/Casベースの標的化に有用な例示的なgRNA配列を表5に提供する。配列は、2016年5月9日に出願されたWO2016183041に見出すことができ、表、付属書、及び配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)方法論を使用して作製される。
「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)とは、典型的には転写活性化因子様エフェクター(TALE)に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えばI-TevI、ColE7、NucA及びFok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。TALE-ヌクレアーゼは、切断ドメインの二量体化(例えばFok-1)を得るために必須のヘテロ二量体形態の下で対によってDNAに結合する必要があるため、特異的な試薬である。左右のヘテロ二量体メンバーはそれぞれ、約14~20bpの異なる核酸配列を認識し、全体的な特異性は30~50bpの標的配列にまたがる。部位特異的変異を誘導するために、14~20塩基対スペーサー領域によって分離された2つの個々のTALENアームは、FokIモノマーを近接させて二量体化し、標的化された二本鎖切断を生成する。特定の実施形態では、TALEドメインは、例えば、I-CreI及びI-Onulまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合させることができる。いくつかの実施形態では、TALE-ヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、TALE-ヌクレアーゼは、単量体TALE-ヌクレアーゼである。単量体TALE-ヌクレアーゼは、WO2012138927に記載されているI-TevIの触媒ドメインと操作されたTALリピートの融合など、特定の認識及び切断のために二量体化を必要としないTALE-ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、細菌種Xanthomonas由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的化配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な12位及び13位に2残基(RVD)を含む。同様の塩基対塩基特異的核酸結合特性(modular base-per-base nucleic acid binding properties)(MBBBD)を備えた結合ドメインは、異なる細菌種で本出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質からも誘導することができる。新しいモジュラータンパク質には、TALリピートよりも多くの配列変動性を示すという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、GまたはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN及びTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT及びAを認識するためのSWである。別の実施形態では、重要なアミノ酸12及び13は、ヌクレオチドA、T、C及びGに対するそれらの特異性を調節するために、特にこの特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に対して変異させることができる。TALENキットは市販されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的な方法で、DNA、RNA及び/またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略されることがよくある。個々のDNA結合ドメインは、通常「フィンガー」と呼ばれる。ZFPには、少なくとも1つのフィンガー、通常は2つのフィンガー、3つのフィンガー、または6つのフィンガーを有する。各フィンガーは、2~4塩基対のDNA、通常は3~4塩基対のDNAに結合する。ZFPは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。それぞれのフィンガーは通常、およそ30アミノ酸、亜鉛キレート化、DNA結合サブドメインを含む。研究は、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基とともに、亜鉛と配位した2つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることを実証した(例えば、Berg&Shi,Science 271:1081-1085(1996)を参照)。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野において周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖分解を生成させる。ホーミングエンドヌクレアーゼは非常に特異的であり、長さが12~45塩基対(bp)の範囲で、通常は長さが14~40bpの範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIバリアントであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Chevalier,B.S.及びB.L.Stoddard,Nucleic Acids Res.,2001,29,3757-3774)。それらは生細胞内の固有の部位を切断することができ、それによって切断部位の近くで遺伝子標的を1000倍以上増強する(Puchta et al.,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040、Rouet et al.,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106、Choulika et al.,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973、Puchta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060、Sargent et al.,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77、Donoho et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,4070-4078、Elliott et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101、Cohen-Tannoudji et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、低免疫因子などのポリペプチドの発現をノックダウン(例えば、減少、排除、または阻害)するために、RNAサイレンシングまたはRNA干渉(RNAi)を使用して作製される。有用なRNAi法には、合成RNAi分子、短鎖干渉RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)を利用するもの、及び当技術分野で認められている他の一過性ノックダウン法が挙げられる。配列特異的shRNA、siRNA、miRNAなどを含むRNAi用試薬は市販されている。配列特異的shRNA、siRNA、miRNAなどを含むRNAi用試薬は市販されている。例えば、CIITA siRNAを導入するか、CIITA shRNA発現ウイルスを細胞に導入することにより、CIITAを多能性幹細胞でノックダウンすることができる。いくつかの実施形態では、RNA干渉は、CIITA、B2M、ABO、RHD、及びFUT1からなる群から選択される少なくとも1つの発現を低下または阻害するために使用される。
いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、mRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたmRNA(例えば、合成の改変されたmRNA)を含む。
核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。CRISPR、TALEN、及びZFNシステムなど、本明細書で使用される遺伝子編集システムは、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染を含むがこれらに限定されない任意の好適な技術によって細胞内に送達することができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子編集システムは、エレクトロポレーションによって細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、流動エレクトロポレーションシステムであり、本発明のいくつかの実施形態での使用に適した好適な流動エレクトロポレーションシステムの例は、市販のMaxCyte STXシステムであり、BTX-Harvard Apparatus、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)、またはsiPORTer96(Ambion)から入手可能なAgilePulseシステムまたはECM830などの、本発明での使用に好適であり得る市販の代替的なエレクトロポレーション機器がいくつか存在する。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、細胞のための閉鎖的な無菌システムを形成する。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載されるように、パルス状のエレクトロポレーションシステムであり、細胞のために閉鎖的な無菌システムを形成する。
E.寛容原性因子の過剰発現
本明細書に記載のすべての技術について、周知の組換え技術を使用して組換え核酸を生成することができる。特定の態様では、寛容原性因子の過剰発現は、発現構築物内の制御性配列を利用して達成される。ある特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする組換え核酸は、発現構築物中の1つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療される宿主細胞及びレシピエントに適切である。様々な宿主細胞について、多くの種類の適切な発現ベクター及び好適な制御性配列が当技術分野において知られており、本明細書に開示されている技術と互換性がある。典型的には、1つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。当技術分野において既知である構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または2つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、または発現構築物は染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも1つの調節配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための制御性配列としては、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素が含まれる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現されることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び/または抗生物質マーカーなどの、コードされる他のタンパク質の発現の選択のために設計される。
本明細書に記載のすべての技術について、周知の組換え技術を使用して組換え核酸を生成することができる。特定の態様では、寛容原性因子の過剰発現は、発現構築物内の制御性配列を利用して達成される。ある特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする組換え核酸は、発現構築物中の1つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療される宿主細胞及びレシピエントに適切である。様々な宿主細胞について、多くの種類の適切な発現ベクター及び好適な制御性配列が当技術分野において知られており、本明細書に開示されている技術と互換性がある。典型的には、1つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。当技術分野において既知である構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または2つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、または発現構築物は染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも1つの調節配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための制御性配列としては、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素が含まれる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現されることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び/または抗生物質マーカーなどの、コードされる他のタンパク質の発現の選択のために設計される。
好適な乳動物プロモーターの例には、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター:伸長因子1アルファ(EF1α)プロモーター、ハムスターのユビキチン/S27aプロモーター(WO97/15664)、サル空胞ウイルス40(SV40)初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のロングターミナルリピート領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター(MMTV)、モロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート領域、及びヒトサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターが含まれる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン、または熱ショックプロモーターである。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞で使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが挙げられる。SV40の初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点も含有するSV40制限フラグメントとして便利に得られる(Fiers et al,Nature 273:113-120(1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII制限酵素断片として便利に得られる(Greenaway et al,Gene 18:355-360(1982))。前述の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入(例えば、レンチウイルス形質導入)を介して細胞に導入される。
一旦変更されると、本明細書に記載の分子のいずれかの発現の存在は、ウエスタンブロット、ELISAアッセイ、FACSアッセイなどの既知の技術を使用してアッセイすることができる。
F.低免疫原性表現型及び多能性の保持のためのアッセイ
低免疫原性細胞が生成されたら、WO2016183041及びWO2018132783に記載されているように、それらの低免疫原性及び/または多能性の保持についてアッセイすることができる。
低免疫原性細胞が生成されたら、WO2016183041及びWO2018132783に記載されているように、それらの低免疫原性及び/または多能性の保持についてアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性は、WO2018132783の図13及び図15に例示されるようないくつかの技術を使用してアッセイされる。これらの技術には、同種異系宿主への移植及び宿主の免疫系から逃れる低免疫原性の多能性細胞増殖(例えば、奇形腫)のモニタリングが含まれる。場合によっては、低免疫原性の多能性細胞誘導体は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、その後、生物発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、そのような細胞に対する宿主動物のT細胞及び/またはB細胞応答を試験して、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。T細胞機能は、ELISpot、ELISA、FACS、PCR、またはマスサイトメトリー(CYTOF)によって評価される。B細胞応答または抗体応答は、FACSまたはLuminexを使用して評価される。追加的または代替的に、WO2018132783の図14及び図15に一般的に示されているように、細胞は、自然免疫応答、例えば、NK細胞死滅を回避するそれらの能力についてアッセイされ得る。
いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、当業者に認められているT細胞増殖アッセイ、T細胞活性化アッセイ、及びT細胞死滅アッセイなどのT細胞イムノアッセイを使用して評価される。いくつかの場合には、T細胞増殖アッセイは、細胞をインターフェロン-ガンマで前処理し、細胞を標識T細胞と共培養し、事前に選択した時間後にT細胞集団(または増殖T細胞集団)の存在をアッセイすることを含む。いくつかの場合には、T細胞活性化アッセイは、T細胞を本明細書に概説される細胞と共培養し、T細胞におけるT細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することを含む。
本明細書に概説される細胞の免疫原性を評価するために、インビボアッセイを実行することができる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生存及び免疫原性は、同種異系のヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。場合によっては、低免疫原性多能性幹細胞を同種異系のヒト化NSG-SGM3マウスに移植し、細胞拒絶反応、細胞生存率、及び奇形腫形成についてアッセイされる。場合によっては、移植された低免疫原性多能性幹細胞またはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。
細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Deuse et al.,Nature Biotechnology,2019,37,252-258及びHan et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446に記載されており、図、図表の凡例、及び方法の説明を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
同様に、多能性の保持はいくつかの方法で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書に一般的に記載され、WO2018132783の図29に示されるような特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加的または代替的に、多能性細胞は、多能性の指標として1つ以上の細胞型に分化する。
当業者によって理解されるように、多能性細胞におけるMHCI機能(細胞がヒト細胞に由来する場合はHLA I)の成功した減少は、当技術分野において既知である以下の技術、例えば、ヒト主要組織適合遺伝子HLAクラスI抗原のアルファ鎖に結合する市販のHLA-A、B、C抗体を使用する、例えば、HLA複合体に結合する標識抗体を使用するFACS技術を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、HLAI複合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。これは、上記のように、1つ以上のHLA細胞表面成分に対する抗体を使用するFACS分析によってアッセイすることができる。
多能性細胞またはその誘導体におけるMHC II機能(細胞がヒト細胞に由来する場合はHLA II)の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、FACS技術、RT-PCR技術などの当技術分野で知られている技術を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、HLA II合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。この場合も、このアッセイは当技術分野で知られているように行われ(例えば、WO2018132783の図21を参照)、一般に、ヒトHLAクラスII HLA-DR、DP、及びほとんどのDQ抗原に結合する市販の抗体に基づくウエスタンブロットまたはFACS分析のいずれかを使用して行われる。
HLA I及びII(またはMHC I及びII)の低下に加えて、本発明の低免疫原性細胞は、マクロファージ食作用及びNK細胞死滅に対する低下した感受性を有する。結果として生じる低免疫原性細胞は、1つ以上のCD47導入遺伝子の発現により、免疫マクロファージ及び自然免疫経路を「回避する」。
G.低免疫原性多能性幹細胞の維持
低免疫原性多能性幹細胞が生成されると、iPSC細胞の維持で知られているように、それらは未分化状態を維持することができる。例えば、細胞は、分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用して、マトリゲル上で培養することができる。さらに、それらは多能性を維持するための条件下で培地に入れることができる。多能性幹細胞を培養するための方法は当技術分野で認識されており、例えば、WO2016183041及びWO2018132783に記載されている。
低免疫原性多能性幹細胞が生成されると、iPSC細胞の維持で知られているように、それらは未分化状態を維持することができる。例えば、細胞は、分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用して、マトリゲル上で培養することができる。さらに、それらは多能性を維持するための条件下で培地に入れることができる。多能性幹細胞を培養するための方法は当技術分野で認識されており、例えば、WO2016183041及びWO2018132783に記載されている。
H.低免疫原性多能性幹細胞の分化
本発明は、対象へのその後の移植のために異なる細胞型に分化する低免疫原性多能性細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。細胞は懸濁状態で分化し、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン/トロンビン形態などのゲルマトリックス形態になり、細胞の生存を容易にすることができる。いくつかの場合には、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。
本発明は、対象へのその後の移植のために異なる細胞型に分化する低免疫原性多能性細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。細胞は懸濁状態で分化し、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン/トロンビン形態などのゲルマトリックス形態になり、細胞の生存を容易にすることができる。いくつかの場合には、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、肝臓細胞機能の喪失または肝硬変に対処するために肝臓細胞に分化される。低免疫原性多能性細胞を肝臓細胞に分化させるために使用することができる技法がいくつかある。例えば、Pettinato et al.,doi:10.1038/spre32888、Snykers et al.,Methods Mol Biol 698:305-314(2011)、Si-Tayeb et al,Hepatology 51:297-305(2010)及びAsgari et al.,Stem Cell Rev(:493-504(2013)(すべては参照によりそれら全体が、具体的には分化のための方法論及び試薬について本明細書に組み込まれる)を参照されたい。分化は、一般に、アルブミン、アルファフェトプロテイン、及びフィブリノーゲンが挙げられるが、これらに限定されない肝細胞関連及び/または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、アンモニアの代謝、LDLの貯蔵及び取り込み、ICGの取り込み及び放出、ならびにグリコーゲンの貯蔵など、機能的に測定することもできる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、I型糖尿病(T1DM)に対処するための移植のために、ベータ様細胞または膵島オルガノイドに分化される。細胞システムは、T1DMに対処するための有望な方法である。例えば、Ellis et al.,doi/10.1038/nrgastro.2017.93(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。さらに、Pagliucaらは、ヒトiPSCからのβ細胞の分化の成功について報告している(doi/10.106/j.cell.2014.09.040を参照、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生のためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる)。さらに、Vegasらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生、それに続く宿主による免疫拒絶を回避するためのカプセル化を示す(doi:10.1038/nm.4030、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生するためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる)。
分化は、一般に、インスリンが挙げられるが、これに限定されないβ細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、グルコース代謝を測定するなど、機能的に測定することもできる。一般に、Muraro et al,doi:10.1016/j.cels.2016.09.002(その全体が、具体的にはそこで概説されているバイオマーカーについて本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、眼の視力を脅かす疾患に対処するために、網膜色素上皮(RPE)に分化される。ヒト多能性幹細胞は、Kamao et al.,Stem Cell Reports 2014:2:205-18(その全体が、具体的には分化技法及び試薬のためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる)で概説されている技法を使用して、RPE細胞に分化されている。Mandai et al.,doi:10.1056/NEJMoa1608368(またRPE細胞のシートの生成及び患者への移植のための技法について、その全体が組み込まれる)も参照されたい。
分化は、一般に、RPE細胞関連及び/または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。例えば、Kamao et al.,doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007(その全体が、具体的には結果セクションの最初の段落で概説されているマーカーについて、本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、心血管疾患に対処するために心筋細胞に分化される。低免疫原性誘導多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための技法は、当技術分野で知られており、実施例で論じられている。分化は、当技術分野で知られているように、一般に心筋細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによってアッセイすることができる。例えば、Loh et al.,doi:10.1016/j.cell.2016.06.001(その全体が、具体的には心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法について、参照に本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するための新しい血管を形成するために、内皮コロニー形成細胞(ECFC)に分化される。内皮細胞を分化させる技術が知られている。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から内皮細胞を生成するための方法及び試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に組み込まれる、Prasain et al.,doi:10.1038/nbt.3048を参照されたい。分化は、一般に、内皮細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌することができる、甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞性器官に分化される。甲状腺細胞を分化させる技術は、当技術分野において既知である。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から甲状腺細胞を生成するための方法及び試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kurmann et al.,doi:10.106/j.stem 2015.09.004を参照されたい。分化は、一般に、甲状腺細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
低免疫原性多能性細胞を分化させるための方法の追加の説明は、例えば、Deuse et al.,Nature Biotechnology,2019,37,252-258及びHan et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446に見出すことができる。
I.治療法
当業者によって理解されるように、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞型及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野において既知の技術を使用して移植することができる。一般に、本発明の細胞は、静脈内に、または患者の特定の位置に注射することのいずれかで移植することができる。特定の位置に移植する場合、細胞をゲルマトリックスに懸濁して、細胞が保持されている間の分散を防ぐことができる。
当業者によって理解されるように、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞型及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野において既知の技術を使用して移植することができる。一般に、本発明の細胞は、静脈内に、または患者の特定の位置に注射することのいずれかで移植することができる。特定の位置に移植する場合、細胞をゲルマトリックスに懸濁して、細胞が保持されている間の分散を防ぐことができる。
いくつかの実施形態において、細胞またはその薬学的組成物は、対象に全身的に(例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内)または局所的に投与される。いくつかの実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、細胞が肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、対象に投与される。いくつかの実施形態(例えば、対象が自己免疫疾患を有する)では、細胞またはその薬学的組成物は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリン調節剤と共投与される。いくつかの実施形態(例えば、対象ががんまたは感染性疾患を有する)では、細胞またはその薬学的組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。
いくつかの実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、組織または臓器、例えば、ヒトの組織または臓器にエクスビボで送達される。いくつかの実施形態では、組成物は、傷害状態にある(例えば、外傷、疾患、低酸素、虚血または他の損傷からの)エクスビボ組織に送達される。
他の実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、インビボで、すなわちヒトまたは哺乳動物に対して使用される。ヒトに加えて、本明細書に記載される組成物は、農場または作業動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリなど)、及びペットまたは動物園動物(例えば、ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、クマなど)を含むがこれらに限定されない、様々な他の生物の細胞もしくは組織の機能または生理学を同様に調節するためにも使用され得る
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるユニバーサルO型陰性細胞は、ABO血液型A、B、AB、またはOであると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルO型陰性細胞は、Rh因子陽性またはRh因子陰性であると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルO型陰性細胞は、ABO血液型A、B、AB、またはOであり、かつRh因子陽性であると決定されたレシピエント対象に投与される。特定の実施形態では、ユニバーサルO型陰性細胞は、ABO血液型A、B、AB、またはOであり、かつRh因子陰性であると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるボンベイ表現型細胞は、ABO血液型A、B、AB、またはOであると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ボンベイ表現型細胞は、ボンベイ表現型を有すると決定されたレシピエント対象に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞は、対象の免疫系によって標的とされない。
いくつかの実施形態では、記載される細胞は、単独で投与されるか、または薬学的組成物として製剤化される。薬学的組成物の投与は、経皮または非経口(静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、及び皮下を含む)投与によるものであり得る。特定の事例では、投与は、ボーラスまたは連続灌流によるものをさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞またはその組成物は、レシピエント対象に、追加の薬剤、例えば、治療剤と共投与される。いくつかの実施形態では、共投与される治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド(例えば、デキサメタゾン)、細胞増殖抑制剤(例えば、メトトレキサート)、抗体(例えば、ムロモナブ-CD3)、またはイムノフィリン調節剤(例えば、シクロスポリンまたはラパマイシン)である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、細胞の免疫媒介性クリアランスを減少させる。いくつかの実施形態では、細胞またはその組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。
いくつかの実施形態では、治療有効量の細胞またはその組成物が投与され、疾患を治療する。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、薬学的に許容される担体と投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞に由来する分化細胞を含む、本明細書に記載の細胞のいずれか1つである。
IV.実施例
実施例1:ユニバーサル組織血液型細胞工学
A.細胞培養
Gibco Human Episomal iPSC株(ThermoFisher Scientific,A1895)を得て、StemFlex Medium(ThermoFisher Scientific,A3349401)で培養し、0.5μg/cm2のVitronectin Recombinant Human Protein(ThermoFisher Scientific,A31804))コーティングプレートまたはフラスコで増殖させた。細胞を約90~95% コンフルエントに達したときに継代した。継代のために、細胞を最初にDPBS-/-(Life Technologies,14190250)で2回洗浄する。Accutase(ThermoFisher Scientific A1110501)を添加し、細胞を37℃で5分間、またはプレートもしくはフラスコをゆっくりと揺動させることによって細胞が脱離するまでインキュベートした。単一細胞懸濁を容易にするために細胞を厳密に再懸濁し、次いでDMEM/F12(ThermoFisher Scientific,11330057)で洗浄した後、250gで3分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットをStemFlex培地+10μM Y-27632(Fisher Scientific,12-545-0)中に再懸濁した。次いで、細胞をカウントし、StemFlex培地+10uM Y-27632中の新しいVitronectinコーティングプレートまたはフラスコに適切な密度で播種した。翌日、培地をStemFlex培地からY-27632を除いたものに交換し、細胞が90~95%コンフルエントに達するまで2日ごとに交換した。
実施例1:ユニバーサル組織血液型細胞工学
A.細胞培養
Gibco Human Episomal iPSC株(ThermoFisher Scientific,A1895)を得て、StemFlex Medium(ThermoFisher Scientific,A3349401)で培養し、0.5μg/cm2のVitronectin Recombinant Human Protein(ThermoFisher Scientific,A31804))コーティングプレートまたはフラスコで増殖させた。細胞を約90~95% コンフルエントに達したときに継代した。継代のために、細胞を最初にDPBS-/-(Life Technologies,14190250)で2回洗浄する。Accutase(ThermoFisher Scientific A1110501)を添加し、細胞を37℃で5分間、またはプレートもしくはフラスコをゆっくりと揺動させることによって細胞が脱離するまでインキュベートした。単一細胞懸濁を容易にするために細胞を厳密に再懸濁し、次いでDMEM/F12(ThermoFisher Scientific,11330057)で洗浄した後、250gで3分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットをStemFlex培地+10μM Y-27632(Fisher Scientific,12-545-0)中に再懸濁した。次いで、細胞をカウントし、StemFlex培地+10uM Y-27632中の新しいVitronectinコーティングプレートまたはフラスコに適切な密度で播種した。翌日、培地をStemFlex培地からY-27632を除いたものに交換し、細胞が90~95%コンフルエントに達するまで2日ごとに交換した。
B.ガイドRNA及びHDR鋳型設計
ABO、RHD、FUT1についての合成ガイドRNA(sgRNA)は、ENSEMBL:ABO(ENSG00000175164)、RHD(ENSG00000187010)、及びFUT1(ENSG00000174951)からのゲノム配列を用いたBenchling CRISPR Guide RNA Designツールを使用して設計した。ABOでは、エクソン6/7を標的とする3つのgRNA配列を、c.258delGをコードする相同性修復(HDR)鋳型ならびに上流及び下流の相同配列の100塩基と組み合わせて使用した。エクソン6-7 gRNA1標的(5’-GCCAGCCAAGGGGTACCACG-3’;配列番号24)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型1(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTTCTCGTGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号25)と対となる。エクソン6-7 gRNA2標的(5’-GATGTCCTCGTGGTACCCCT-3’;配列番号26)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型2(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTAAACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号27)と対となる。エクソン6-7 gRNA3標的(5’-AATGTGCCCTCCCAGACAAT-3’;配列番号28)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型3(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTTTGGGAGGGCACTTTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号29)と対となる。あるいは、エクソン1 gRNA標的(5’-GGCCAGCGTCCGCAACACCT-3’;配列番号30)に向けられたガイドRNA、またはエクソン2 gRNA標的(5’-GGATCATAGGTCGAAGTGCG-3’;配列番号31)に向けられたガイドRNAを使用して、初期コドンのエクソン1及び2に二本鎖切断(DSB)を導入する。RHDでは、エクソン2標的配列(5’-CACCGACAAAGCACTCATGG-3’;配列番号32)及びエクソン3標的配列(5’-TGGCCAAGATCTGACCGTGA-3’;配列番号33)を標的とする2つのgRNA配列を使用して、初期コドンエキソン1及び2にDSBを導入する。あるいは、5’UTR標的配列(5’-TGGTTGTGCTGGCCTCTCTA-3’;配列番号34)を標的とするgRNAを、エクソン8(5’-GGAGGCGCTGCGGTTCCTAC-3’;配列番号35)を標的とするgRNAと組み合わせて使用して、遺伝子のコード配列全体をゲノムから削除する。FUT1では、エクソン4(唯一のコードエクソン)を標的とする2つのgRNA配列には、エクソン4 gRNA1標的(5’GGTCTGGACACAGGATCGAC-3’;配列番号36)に向けられたガイドRNA、及びエクソン4 gRNA2標的(5’-GATTACCAAACCGGCCATTG-3’;配列番号37)に向けられたガイドRNAが含まれ、使用され、DSBを遺伝子のコード配列に誘導する。
ABO、RHD、FUT1についての合成ガイドRNA(sgRNA)は、ENSEMBL:ABO(ENSG00000175164)、RHD(ENSG00000187010)、及びFUT1(ENSG00000174951)からのゲノム配列を用いたBenchling CRISPR Guide RNA Designツールを使用して設計した。ABOでは、エクソン6/7を標的とする3つのgRNA配列を、c.258delGをコードする相同性修復(HDR)鋳型ならびに上流及び下流の相同配列の100塩基と組み合わせて使用した。エクソン6-7 gRNA1標的(5’-GCCAGCCAAGGGGTACCACG-3’;配列番号24)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型1(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTTCTCGTGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号25)と対となる。エクソン6-7 gRNA2標的(5’-GATGTCCTCGTGGTACCCCT-3’;配列番号26)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型2(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTAAACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号27)と対となる。エクソン6-7 gRNA3標的(5’-AATGTGCCCTCCCAGACAAT-3’;配列番号28)に向けられたガイドRNAは、一本鎖修復鋳型3(5’-TGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTTTGGGAGGGCACTTTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTG-3’;配列番号29)と対となる。あるいは、エクソン1 gRNA標的(5’-GGCCAGCGTCCGCAACACCT-3’;配列番号30)に向けられたガイドRNA、またはエクソン2 gRNA標的(5’-GGATCATAGGTCGAAGTGCG-3’;配列番号31)に向けられたガイドRNAを使用して、初期コドンのエクソン1及び2に二本鎖切断(DSB)を導入する。RHDでは、エクソン2標的配列(5’-CACCGACAAAGCACTCATGG-3’;配列番号32)及びエクソン3標的配列(5’-TGGCCAAGATCTGACCGTGA-3’;配列番号33)を標的とする2つのgRNA配列を使用して、初期コドンエキソン1及び2にDSBを導入する。あるいは、5’UTR標的配列(5’-TGGTTGTGCTGGCCTCTCTA-3’;配列番号34)を標的とするgRNAを、エクソン8(5’-GGAGGCGCTGCGGTTCCTAC-3’;配列番号35)を標的とするgRNAと組み合わせて使用して、遺伝子のコード配列全体をゲノムから削除する。FUT1では、エクソン4(唯一のコードエクソン)を標的とする2つのgRNA配列には、エクソン4 gRNA1標的(5’GGTCTGGACACAGGATCGAC-3’;配列番号36)に向けられたガイドRNA、及びエクソン4 gRNA2標的(5’-GATTACCAAACCGGCCATTG-3’;配列番号37)に向けられたガイドRNAが含まれ、使用され、DSBを遺伝子のコード配列に誘導する。
C.細胞工学
ABOまたはFUT1のいずれかを標的とするgRNAを、ヌクレアーゼ非含有水中で室温で15分間、Aldevronから入手した組換えSpyFi Cas9タンパク質と複合体化した。細胞を、ACCUTASE細胞脱離溶液を使用してSTEMFLEX及びビトロネクチンで採取し、Lonza NUCLEOFECTOR緩衝液P3+RNP複合体中でペレット化して再懸濁し、Lonza NUCLEOCUVETTE容器に移した。細胞を、CA-137プログラムを使用してLonza 4D-NUCLEOFECTORコアユニットでエレクトロポレーションし、CLONER補充剤を含むSTEMFLEX培地で補充した。細胞を、CLONER補充剤を伴うSTEMFLEX培地を含む24ウェルプレートの2つのビトロネクチンコーティングウェルに移した。細胞を増殖させ、次いで、RHD遺伝子を標的とするgRNAを含有するRNP複合体で再びエレクトロポレーションした。細胞をA抗原及びRh抗原に対する抗体で染色し、陰性細胞集団をFACSによって96ウェルプレートの単一ウェルに選別した。次いで、個々のクローンを再度染色して、細胞がO型Rh陰性またはボンベイ型Rh陰性であることを確認し、これはゲノム解析によって確認した。
ABOまたはFUT1のいずれかを標的とするgRNAを、ヌクレアーゼ非含有水中で室温で15分間、Aldevronから入手した組換えSpyFi Cas9タンパク質と複合体化した。細胞を、ACCUTASE細胞脱離溶液を使用してSTEMFLEX及びビトロネクチンで採取し、Lonza NUCLEOFECTOR緩衝液P3+RNP複合体中でペレット化して再懸濁し、Lonza NUCLEOCUVETTE容器に移した。細胞を、CA-137プログラムを使用してLonza 4D-NUCLEOFECTORコアユニットでエレクトロポレーションし、CLONER補充剤を含むSTEMFLEX培地で補充した。細胞を、CLONER補充剤を伴うSTEMFLEX培地を含む24ウェルプレートの2つのビトロネクチンコーティングウェルに移した。細胞を増殖させ、次いで、RHD遺伝子を標的とするgRNAを含有するRNP複合体で再びエレクトロポレーションした。細胞をA抗原及びRh抗原に対する抗体で染色し、陰性細胞集団をFACSによって96ウェルプレートの単一ウェルに選別した。次いで、個々のクローンを再度染色して、細胞がO型Rh陰性またはボンベイ型Rh陰性であることを確認し、これはゲノム解析によって確認した。
D.ABO、RHD、及びFUT1遺伝子編集を特徴付けるためのゲノミクスアッセイ
これらの部位に特異的なプライマーを使用して、ABO、RHD、FUT1の標的領域を含むアンプリコンを作製し、Illumina NextSeq配列決定プラットフォームを使用して配列を配列決定した。結果をヒトゲノムに整列させ、挿入及び欠失(indel)について分析した。
これらの部位に特異的なプライマーを使用して、ABO、RHD、FUT1の標的領域を含むアンプリコンを作製し、Illumina NextSeq配列決定プラットフォームを使用して配列を配列決定した。結果をヒトゲノムに整列させ、挿入及び欠失(indel)について分析した。
E.ABO、RHD、及びFUT1遺伝子のノックアウト(KO)を特徴付けるための表現型アッセイ
遺伝子編集細胞の単一細胞クローニングは、Hana単一細胞ディスペンサー(Namocell)を使用して96ウェルプレートで実施した。CELIGOイメージングサイオメータ(Nexcelcom)を使用して、単一細胞の沈着確認及びクローン細胞の増殖をモニタリングした。単一細胞クローンを継代し、以下の3つのコホートに拡大した:1.細胞維持及び細胞バンキング;2.次世代シーケンシング(NGS)によるゲノム特性評価;及び3.表現型の特徴付け。
遺伝子編集細胞の単一細胞クローニングは、Hana単一細胞ディスペンサー(Namocell)を使用して96ウェルプレートで実施した。CELIGOイメージングサイオメータ(Nexcelcom)を使用して、単一細胞の沈着確認及びクローン細胞の増殖をモニタリングした。単一細胞クローンを継代し、以下の3つのコホートに拡大した:1.細胞維持及び細胞バンキング;2.次世代シーケンシング(NGS)によるゲノム特性評価;及び3.表現型の特徴付け。
F.免疫蛍光による表現型の特徴付け
細胞をPBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。次いで細胞を洗浄し、PBS/TWEEN-20中の5%ロバ血清中で、室温で15分間遮断した。一次抗体を適用する前に、細胞をPBS中で3回濯いだ。抗体を、上記表6の指定された希釈に従って、遮断緩衝液(5%ロバ血清/PBS)中で4℃で一晩希釈した。次いで、細胞をPBSで3回濯ぎ、Alexa-488及びAlexa-647複合抗体をPBSで1:500に希釈し、室温で30分間細胞に添加した。Alexa Fluor 488と複合した抗体を一晩インキュベートし、二次抗体を必要としない。細胞を3回洗浄し、HoechstをPBS中で希釈し、細胞に添加した。細胞は、Cytation5細胞イメージングリーダーでイメージングするために調整した。野生型(WT)細胞は、ワークフローを通して維持し、遺伝子KOは、WT細胞発現レベルに対して確認した。
G.ABO、RHD、及びFUT1のノックアウトを検証するための機能アッセイ
O陰性個体からのヒト血清を、ベンダーから入手した。補体媒介細胞殺傷アッセイを、XCelligence(登録商標)SPプラットフォーム(ACEA BioSciences)で実施した。96ウェルEプレート(ACEA BioSciences)をコラーゲン(Sigma-Aldrich)でコーティングし、ユニバーサルO型Rh陰性またはボンベイ型Rh陰性iPSCを、100μlの細胞特異的培地にプレーティングした。細胞指数値が0.7に達した後、ヒトO陰性血清を添加した。陰性対照として、加熱不活化血清を使用した。データを標準化し、RTCAソフトウェア(ACEA)で分析する。
O陰性個体からのヒト血清を、ベンダーから入手した。補体媒介細胞殺傷アッセイを、XCelligence(登録商標)SPプラットフォーム(ACEA BioSciences)で実施した。96ウェルEプレート(ACEA BioSciences)をコラーゲン(Sigma-Aldrich)でコーティングし、ユニバーサルO型Rh陰性またはボンベイ型Rh陰性iPSCを、100μlの細胞特異的培地にプレーティングした。細胞指数値が0.7に達した後、ヒトO陰性血清を添加した。陰性対照として、加熱不活化血清を使用した。データを標準化し、RTCAソフトウェア(ACEA)で分析する。
実施例2:B陽性細胞であるRUES2胚性幹細胞の分化
ヒトRUES2胚性幹細胞(Lacoste et al.,Cell Stem Cell 5(3):332-342(2009);hPSCReg ID:RUESe002-A)を心筋細胞様細胞に分化させた。得られたRUES2由来細胞は、リアルタイム細胞分析アッセイ(XCelligence(登録商標);図18)で測定した際に、血液型Bマカク血清とインキュベートした場合は生存したが、ヒト血液型O血清またはブタ血液型A血清とインキュベートした場合は細胞が死滅した。この結果は、RUES2及びそれに由来する分化心筋細胞がB型血液型であることを示す。
ヒトRUES2胚性幹細胞(Lacoste et al.,Cell Stem Cell 5(3):332-342(2009);hPSCReg ID:RUESe002-A)を心筋細胞様細胞に分化させた。得られたRUES2由来細胞は、リアルタイム細胞分析アッセイ(XCelligence(登録商標);図18)で測定した際に、血液型Bマカク血清とインキュベートした場合は生存したが、ヒト血液型O血清またはブタ血液型A血清とインキュベートした場合は細胞が死滅した。この結果は、RUES2及びそれに由来する分化心筋細胞がB型血液型であることを示す。
さらに、未分化RUES2細胞を、血液型(例えば、Mohamed et al.,Blood Res.15(4):274-278(20016)を参照されたい)及びRh状態についてのPCRアッセイによって特徴付けした。具体的には、Rh D及びRh CcEeのエクソン4及びエクソン5の配列をそれぞれ認識する対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、Rh D表現型細胞のゲノムDNAに対して使用した。99℃で5分間の変性の最初のサイクルの後、95℃で1分間の変性、55℃で1.5分間のプライマーアニーリング、及び72℃で2.5分の伸長からなる35サイクルを実施し、72℃で9分間の最終サイクルが続いた。Rh CcEe遺伝子は、Rh D遺伝子ではエクソン4と5との間のイントロン4に欠失があり、CcEe遺伝子から得られるDNA断片よりも600bp小さいDNA断片が生じるため、RhD遺伝子と区別される。プライマーA9及びA6では、約1200bpのPCR産物はCcEe遺伝子に由来したが、RhD遺伝子に由来する約600bpのより小さいPCR産物は、ドナーがD陰性であった場合に欠損していた。PCR生成物を2%アガロースゲル上でサイズ分離し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射により可視化した。その結果、RUES2細胞はB型であり、かつRh陽性であることを確認した。
例示的なオリゴヌクレオチドプライマー配列:
A6.5’TGACCCTGAGATGGCTGT 3’(アンチセンス)(配列番号21)
A9.5’ACGATACCCAGTTTGTCT 3’(センス)(配列番号22)
A6.5’TGACCCTGAGATGGCTGT 3’(アンチセンス)(配列番号21)
A9.5’ACGATACCCAGTTTGTCT 3’(センス)(配列番号22)
PCRアッセイを使用して細胞のRh状態を決定するためのさらなる技術は、例えば、Simsek et al.,Blood,1995,85(10),2975-2980、及びArce et al.,Blood,1993,82(651)に記載されており、図、図の凡例、及び方法の説明を含む開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例3:ヒトABO遺伝子のゲノム
ヒトエピソームiPSC(Gibco)は、血液型A陽性である。細胞を、ABO遺伝子内でインデルを作製することによってO陽性に編集した。ガイドRNA UCUCUCCAUGUGCAGUAGGA(配列番号17)は、S.pyogenes(sp)as9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNPをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。ABO遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
ヒトエピソームiPSC(Gibco)は、血液型A陽性である。細胞を、ABO遺伝子内でインデルを作製することによってO陽性に編集した。ガイドRNA UCUCUCCAUGUGCAGUAGGA(配列番号17)は、S.pyogenes(sp)as9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNPをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。ABO遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、2つのホモ接合性ABO KOクローンを選択した。選択した2つのクローンは、+1インデル及び+2インデルであった。得られた細胞は、血液型O陽性であると機能的にアッセイされた。
実施例4:A+からO+へのヒトiPSCのゲノム修飾
ヒトエピソームiPSC(Gibco)を、相同性指向修復(HDR)によるエクソン6のABO 258delG変異の導入によって、A陽性(A+)からO陽性(O+)に編集した。ガイドRNA CAGUAGGAAGGAUGUCCUCG(配列番号18)を、sp Cas9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNP及びドナー鋳型(以下)をエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。ABO遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
ヒトエピソームiPSC(Gibco)を、相同性指向修復(HDR)によるエクソン6のABO 258delG変異の導入によって、A陽性(A+)からO陽性(O+)に編集した。ガイドRNA CAGUAGGAAGGAUGUCCUCG(配列番号18)を、sp Cas9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNP及びドナー鋳型(以下)をエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。ABO遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
ドナー鋳型:CTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGAC(配列番号19)。
編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、2つのホモ接合性ABO 258delG変異クローンを選択した。得られた細胞は、血液型O陽性であると機能的にアッセイされた。
実施例5:ヒトFUT1遺伝子のゲノム
ヒトエピソームiPSC(Gibco)を、FUT1遺伝子におけるインデルの作製によって、A陽性からボンベイ表現型、Rh陽性に編集した。ガイドRNA CUGGAUGUCGGAGGAGUACG(配列番号23)は、S.pyogenes(sp)Cas9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNPをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。FUT1遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
ヒトエピソームiPSC(Gibco)を、FUT1遺伝子におけるインデルの作製によって、A陽性からボンベイ表現型、Rh陽性に編集した。ガイドRNA CUGGAUGUCGGAGGAGUACG(配列番号23)は、S.pyogenes(sp)Cas9と複合体化し、リボ核タンパク質(RNP)を形成した。次いで、RNPをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に2日間回収した。FUT1遺伝子の編集は、編集部位のPCR増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。
編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、2つのホモ接合性FUT1 KOクローンを選択した。得られた細胞は、ボンベイ表現型、Rh陽性であると機能的にアッセイされた。
すべての見出し及び節の表記は、明確さ及び参照目的のために使用されているにすぎず、決して限定するものとみなされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って、必要に応じて異なる見出し及び節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれているかのように具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
当業者に明らかであるように、本出願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正及び変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
Claims (174)
- 単離細胞であって、ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化され、RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項1に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項1または2に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む、請求項3に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、組織血液型O細胞であるようなホモ接合変異である、請求項1または2に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含む相同性指向修復(HDR)鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、請求項1に記載の細胞。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項7に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む前記HDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項1及び7~8のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、前記細胞が、組織血液型O細胞であるようなホモ接合変異である、請求項1及び7~9のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項1~10のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失を含み、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項11に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項11に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項1~13のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、アカゲザル因子(Rh)陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項1~14のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項1~15のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記細胞が、Rh陰性細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項17または18に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む、請求項17~19のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む、請求項17~19のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項17~21のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項17~22のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、請求項17に記載の細胞。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項24に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む前記HDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項17及び24~25のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、前記細胞が、O型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項17及び24~26のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化され、RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項28に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項28または29に記載の細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項28~30のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む、請求項28~31のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ボンベイ表現型を有するようなホモ接合変異である、請求項28~32のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つ以上を含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項28~33のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、請求項28または34に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項28または34に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、アカゲザル因子(Rh)陰性であるようなホモ接合変異である、請求項28~36のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ボンベイ表現型を有し、かつRh陰性であるようなホモ接合変異である、請求項28~37のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記細胞が、Rh陰性細胞である、請求項39に記載の細胞。
- 前記FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項39または40に記載の細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項39~41のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記FUT1遺伝子のエクソン4における欠失を含み、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項39~42のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ユニバーサルボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項39~43のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記細胞が、O型またはボンベイ表現型を有する、請求項45に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項45または46に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項45に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、請求項45~48のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項45~49のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、O型陰性細胞またはボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項45~50のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項52に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項52または53に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む、請求項52~54のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む、請求項52~54のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項52~55のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、請求項52または53に記載の細胞。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項58に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む前記HDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項52~53及び58~59のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、ホモ接合変異である、請求項52~53及び58~60のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項62に記載の単離細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つ以上を含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項62または63に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、請求項62~64のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項62~65のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項62~66のいずれか1項に記載の細胞。
- 単離細胞であって、FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
- 前記FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項68に記載の単離細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項68または69に記載の細胞。
- 前記有害な変異が、前記FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む、請求項68~70のいずれか1項に記載の細胞。
- RHD遺伝子の有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項68~71のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項1~72のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される、請求項1~51のいずれか1項に記載の細胞。
- MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項1~74のいずれか1項に記載の細胞。
- B2M遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項74または75に記載の細胞。
- CIITA遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項74~76のいずれか1項に記載の細胞。
- CD47導入遺伝子をさらに含む、請求項74~77のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記B2M及び前記CIITA遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、CD47導入遺伝子をさらに含む、請求項74~78のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項1~74のいずれか1項に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
- 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項1~74のいずれか1項に記載の細胞を前記患者に投与することを含む、前記方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離細胞を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3からなる群から選択される1つを含む、請求項82に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項82または83に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項84に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離細胞を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、ならびに配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、前記導入することと、
(c)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項87に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、前記HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む、請求項87または88に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項87~89のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項90に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項90に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離細胞を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項93に記載の方法。
- (i)表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項93~95のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3を含む、請求項96に記載の方法。
- (i)配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、前記導入することと、(ii)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項93~97のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項98に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、前記HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む、請求項98または99に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離細胞を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むFUT1遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記FUT1遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号13または配列番号14を含む、請求項101に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項101または102に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項103に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNA標的配列が、配列番号12を含む、請求項103に記載の方法。
- 前記単離細胞が、単離ヒト細胞である、請求項82~105のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される、請求項82~106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む、請求項82~107のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M遺伝子を含む、請求項82~108のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるCIITA遺伝子を含む、請求項82~109のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、CD47導入遺伝子を含む、請求項82~110のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M及びCIITA遺伝子、ならびにCD47導入遺伝子を含む、請求項82~111のいずれか1項に記載の方法。
- 分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項107~112のいずれか1項に記載の方法に従って調製された幹細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、前記方法。
- 前記分化条件が、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である、請求項113に記載の方法。
- 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項113または114に記載の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、前記方法。
- RUES2細胞株に由来する単離細胞であって、前記単離細胞が、
(a)前記単離細胞を組織血液型Oにする修飾、及び
(b)前記単離細胞をRh陰性にする修飾のうちの一方または両方を含む、前記単離細胞。 - 前記単離細胞を組織血液型Oにする前記修飾が、ABO組織血液型B抗原の抗原性を低減または排除する、請求項116に記載の単離細胞。
- 前記修飾が、ABO遺伝子の有害な変異によって、または前記ABO遺伝子のエクソン6 258delG変異の挿入によって、前記ABO遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項116または117に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の発現が、前記ABO遺伝子のエクソン1のACACCT;エクソン2のAGTGCG;またはエクソン8のCAAGCGC、GGCGCA、TGGGCG、ACCACG、GCCGCA、CCACGT、TGCCGT、TACTCG、ACTCGG、GAGCGC、GCCTGG、GTCCTT、TCACGC、TGGACG、TGGTCG、GCTGGC、CACGCG、AGGTGA、もしくはGCATCG内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項118に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項118または119に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1または配列番号2を含む、請求項118~120のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3を含む、請求項118~121のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項118~122のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、請求項118に記載の単離細胞。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項124に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列と、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む前記HDR鋳型と、を含む、CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項118、124、及び125のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記ABO遺伝子の前記エクソン6 258delG変異が、ホモ接合変異である、請求項118及び124~126のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記修飾が、FUT1遺伝子の有害な変異による前記FUT1遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項116に記載の単離細胞。
- 前記FUT1遺伝子の発現が、前記FUT1遺伝子のエクソン4のATCGAC、AGTACG、CGCCCT、GTTTGC、CGACAA、GGTGCG、CGCCGT、ACGCCG、CCGGTT、CGCGGG、TTTTCG、ATACCG、GTGCGC、CCATTG、TGTCGG、ATCTGC、CTTTGT、GGGGCC、GGCCAT、TGCGAT、CGTGCA、もしくはATGGAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項128に記載の単離細胞。
- 前記FUT1遺伝子の前記有害な変異が、表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して生成される、請求項128または129に記載の単離細胞。
- 前記有害な変異が、前記FUT1遺伝子のエクソン4における欠失と、配列番号13または配列番号14を含むガイドRNA標的配列と、を含む、請求項128~130のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記単離細胞をRh陰性にする前記修飾が、1つ以上のアカゲザル因子抗原の抗原性を低減または排除する、請求項116~131のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記単離細胞をRh陰性にする前記修飾が、RHD遺伝子の有害な変異による前記RHD遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項118~132のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記RHD遺伝子の発現が、前記RHD遺伝子のエクソン2のTCATGG、GAGGTG、AACTCG、AGTTTC、TTGGCT、もしくはCACAGC;エクソン3のCCGTGA;エクソン4のGGGTAGもしくはAGGGAA;エクソン5のTTCGAT、TCAGCG、CATAGT、もしくはATCGAA;エクソン6のCGTCGGもしくはTCCGTC;エクソン7のCGGCAA、CGGAGC、TACCGT、GCTTGC、もしくはCTTGCT;またはエクソン8のGGTTCTもしくはTCCTAC内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項133に記載の単離細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、表D~F中のものからなる群から選択される1つを含む1つ以上のガイドRNA標的配列を含むCRISPR-Cas9遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項133または134に記載の単離細胞。
- 前記有害な変異が、前記RHD遺伝子のエクソン1~8を含むゲノム領域の欠失と、配列番号11を含むガイドRNA標的配列と、配列番号12を含む別のガイドRNAと、を含む、請求項133~135のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記RHD遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入/欠失を含み、前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項133~136のいずれか1項に記載の単離細胞。
- MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項116~137のいずれか1項に記載の単離細胞。
- B2M遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項116~138のいずれか1項に記載の単離細胞。
- CIITA遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項116~139のいずれか1項に記載の単離細胞。
- CD47導入遺伝子をさらに含む、請求項116~140のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 前記B2M及び前記CIITA遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、CD47導入遺伝子をさらに含む、請求項116~141のいずれか1項に記載の単離細胞。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3からなる群から選択される1つを含む、請求項143に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項143または144に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項145に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項145に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、ならびに配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、前記導入することと、
(c)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項148に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、前記HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む、請求項148または149に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項148~150のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項151に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項151に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、前記別のガイドRNAが、配列番号12を含む、請求項154に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項154に記載の方法。
- (i)表A~C中のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項154~156のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号1~3を含む、請求項157に記載の方法。
- (i)配列番号3~5のものからなる群から選択される1つを含むABO遺伝子のエクソン6 258delG変異を産生するためのガイドRNA標的配列、ならびに前記258delG変異をコードする配列、PAM配列、スペーサー領域、及び2つの相同性アームを含むHDR鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ABO遺伝子と約10ヌクレオチド~約1Kbの相同配列を含む、前記導入することと、(ii)前記ABO遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項154~156のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HDR鋳型が、前記HDR鋳型がCas9によって切断されないことを確実にするために、前記PAM配列及び/または前記スペーサー領域における1つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項159に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号3~5からなる群から選択される1つを含み、前記HDR鋳型が、配列番号6~8からなる群から選択される1つを含む、請求項159または160に記載の方法。
- 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
(a)単離RUES2細胞またはその誘導体を取得することと、
(b)Cas9ヌクレアーゼ、及び表G~I中のものからなる群から選択される1つを含むFUT1遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、
(c)前記FUT1遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。 - 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号13または配列番号14を含む、請求項162に記載の方法。
- (i)表D~F中のものからなる群から選択される1つを含むRHD遺伝子のガイドRNA標的配列を前記細胞に導入することと、(ii)前記RHD遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項159または163に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号9または配列番号10を含む、請求項164に記載の方法。
- 前記ガイドRNA標的配列が、配列番号11を含み、別のガイドRNA標的配列が、配列番号12を含む、請求項164に記載の方法。
- 前記単離細胞が、MHC-Iの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び/またはMHC-IIの1つ以上の転写制御因子をコードする1つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項143~166のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M遺伝子を含む、請求項143~167のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるCIITA遺伝子を含む、請求項143~168のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、CD47導入遺伝子を含む、請求項143~169のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるB2M及びCIITA遺伝子、ならびにCD47導入遺伝子を含む、請求項143~170のいずれか1項に記載の方法。
- 分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項143~171のいずれか1項に記載の方法に従って調製された操作組織適合性細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、前記方法。
- 前記分化条件が、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である、請求項172に記載の方法。
- 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項172または173に記載の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202062960617P | 2020-01-13 | 2020-01-13 | |
US202062960607P | 2020-01-13 | 2020-01-13 | |
US62/960,607 | 2020-01-13 | ||
US62/960,617 | 2020-01-13 | ||
PCT/US2021/013140 WO2021146222A1 (en) | 2020-01-13 | 2021-01-12 | Modification of blood type antigens |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023510872A true JP2023510872A (ja) | 2023-03-15 |
JPWO2021146222A5 JPWO2021146222A5 (ja) | 2024-01-22 |
Family
ID=74562041
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022542899A Pending JP2023510872A (ja) | 2020-01-13 | 2021-01-12 | 血液型抗原の修飾 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230272429A1 (ja) |
EP (1) | EP4090743A1 (ja) |
JP (1) | JP2023510872A (ja) |
CN (1) | CN116234906A (ja) |
AU (1) | AU2021207810A1 (ja) |
CA (1) | CA3164591A1 (ja) |
WO (1) | WO2021146222A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220007093A (ko) * | 2019-05-10 | 2022-01-18 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 변형된 만능 세포 |
US20240252642A1 (en) * | 2021-05-19 | 2024-08-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Hypoimmunogenic rhd negative primary t cells |
AU2022325231A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions |
WO2023019208A2 (en) * | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Engineering cells for cell-based therapies, and associated compositions and methods |
EP4384544A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-06-19 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy |
IL310691A (en) | 2021-08-11 | 2024-04-01 | Sana Biotechnology Inc | Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy |
WO2023019225A2 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8724885D0 (en) | 1987-10-23 | 1987-11-25 | Binns M M | Fowlpox virus promotors |
DE19539493A1 (de) | 1995-10-24 | 1997-04-30 | Thomae Gmbh Dr K | Starker homologer Promotor aus Hamster |
SG10201602651YA (en) | 2011-04-05 | 2016-05-30 | Cellectis | Method for the generation of compact tale-nucleases and uses thereof |
ES2536353T3 (es) | 2012-12-12 | 2015-05-22 | The Broad Institute, Inc. | Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
EP4234696A3 (en) | 2012-12-12 | 2023-09-06 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
ES2576126T3 (es) | 2012-12-12 | 2016-07-05 | The Broad Institute, Inc. | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias |
WO2014093655A2 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains |
JP2018515139A (ja) | 2015-05-08 | 2018-06-14 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 万能ドナー幹細胞および関連する方法 |
US20190330601A1 (en) * | 2016-05-13 | 2019-10-31 | University Of Copenhagen | A cell-based array platform |
US20190376045A1 (en) | 2017-01-13 | 2019-12-12 | The Regents Of The University Of California | Immunoengineered pluripotent cells |
US20210161971A1 (en) | 2017-06-12 | 2021-06-03 | Sinai Health System | Allograft tolerance without the need for systemic immune suppression |
WO2019084531A1 (en) * | 2017-10-27 | 2019-05-02 | The Children's Hospital Of Philadelphia | MODIFIED RED GLOBES HAVING PHENOTYPES OF RARE ANTIGENS |
KR20220007093A (ko) * | 2019-05-10 | 2022-01-18 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 변형된 만능 세포 |
-
2021
- 2021-01-12 EP EP21704098.9A patent/EP4090743A1/en active Pending
- 2021-01-12 JP JP2022542899A patent/JP2023510872A/ja active Pending
- 2021-01-12 AU AU2021207810A patent/AU2021207810A1/en active Pending
- 2021-01-12 US US17/792,121 patent/US20230272429A1/en active Pending
- 2021-01-12 CN CN202180022172.7A patent/CN116234906A/zh active Pending
- 2021-01-12 CA CA3164591A patent/CA3164591A1/en active Pending
- 2021-01-12 WO PCT/US2021/013140 patent/WO2021146222A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2021207810A1 (en) | 2022-08-04 |
EP4090743A1 (en) | 2022-11-23 |
CN116234906A (zh) | 2023-06-06 |
CA3164591A1 (en) | 2021-07-22 |
WO2021146222A1 (en) | 2021-07-22 |
US20230272429A1 (en) | 2023-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2023510872A (ja) | 血液型抗原の修飾 | |
US11977073B2 (en) | HLA G-modified cells and methods | |
Wiley et al. | Patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) for the study and treatment of retinal degenerative diseases | |
JP6968416B2 (ja) | Rna誘導性の、hiv感染の処置のための、方法および組成物 | |
WO2016014837A1 (en) | Gene editing for hiv gene therapy | |
JP2019517281A (ja) | 神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 | |
KR20230029659A (ko) | 저면역원성 세포 | |
JP2021515576A (ja) | フォリスタチンを分泌するように遺伝子操作されたb細胞ならびにフォリスタチン関連疾患、状態、障害を処置するために、ならびに筋肉の成長および強度を増強するためにこれを使用する方法 | |
CN112673094A (zh) | 病毒载体产生 | |
KR101252065B1 (ko) | 유전자 치료를 위한 벡터 | |
US20140065110A1 (en) | Genetically modified msc and therapeutic methods | |
JP2016528900A (ja) | 宿主細胞へのレトロウイルスの導入の効率の増強 | |
TW202002999A (zh) | 臍帶羊膜的基本上純的間質幹細胞群用於產生攜帶轉殖基因的哺乳動物幹細胞的用途 | |
US20240228961A9 (en) | Genetically modified genes and cells, and methods of using same for silencing virus gene expression | |
Huelsmann et al. | A suicide gene approach using the human pro-apoptotic protein tBid inhibits HIV-1 replication | |
JP2022528722A (ja) | 改善された遺伝子編集のための組成物及び方法 | |
CN113316637A (zh) | 依靠人工反式激活物的选择 | |
Craig-Müller | Modeling MyD88 deficiency | |
WO2024120427A1 (zh) | 一种表达gsn的通用型细胞及其制备方法 | |
US20240093242A1 (en) | Gene correction for scid-x1 in long-term hematopoietic stem cells | |
WO2024120429A1 (zh) | 一种表达stc1的通用型细胞及其制备方法 | |
Bauer et al. | Gene Therapy for HIV: From Inception to a Possible Cure | |
WO2023173123A1 (en) | Genetically modified cells and compositions and uses thereof | |
JP2023548118A (ja) | 治療剤のin vivo送達のために、遺伝子改変B細胞を投与する方法 | |
CN118076362A (zh) | 用于改变低免疫原性细胞中的基因表达的诱导型系统 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240112 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240112 |