JP2023510872A - 血液型抗原の修飾 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、ＡＢＯ遺伝子、ＲＥＤ遺伝子、及び／またはＦＵＴ１遺伝子の遺伝子修飾を有する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、低減されたレベルのＭＨＣ Ｉ抗原及び／またはＭＨＣ ＩＩ抗原を発現する。いくつかの事例では、細胞はまた、低免疫原性細胞でもある。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０２０年１月１３日に出願された米国仮出願第６２／９６０，６０７号及び２０２０年１月１３日に出願された米国仮出願第６２／９６０，６１７号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

血液製剤は、人の体内のすべての赤血球の表面上の抗原の有無に応じて異なる群に分類することができる（ＡＢＯ血液型）。Ａ、Ｂ、ＡＢ、及びＡ１抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群の遺伝子は、抗原タンパク質を作製するための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内の様々な機能を果たす。これらのタンパク質機能には、細胞内外への他のタンパク質及び分子の輸送、細胞構造の維持、他の細胞及び分子への付着、ならびに化学反応への参加が含まれる。

アカゲザル因子（Ｒｈ）血液群は、ＡＢＯ血液群系に次いで第２に重要な血液群系であり、Ｒｈ血液群系は、４９の定義された血液群抗原からなり、その中でもＤ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅの５つの抗原が最も重要である。個体のＲｈ（Ｄ）状態は、通常、ＡＢＯ型の後に陽性または陰性の接尾辞で記載される。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈ陽性」、及び「Ｒｈ陰性」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原のみを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血輸血反応に関与することができ、Ｒｈ（Ｄ）及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクをもたらす。ＡＢＯ抗体は、すべてのヒトにおいて幼児期に発症する。しかしながら、Ｒｈ－ヒトにおけるアカゲザル抗体は、典型的には、その人が感作した場合にのみ発症する。これは、例えば、Ｒｈ＋乳児を出産することによって、またはＲｈ＋輸血を受けることによって生じ得る。

Ａ、Ｂ、Ｈ、及びＲｈ抗原は、血液、組織、ならびに細胞移植のためのドナーとレシピエントとの間の組織適合性の主要な決定因子である。ＡＢＯ遺伝子によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ活性は、細胞の表面に表示されるＡ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ組織血液群抗原の産生に関与する。Ａ群の個体は、α（１，３）Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を産生する特異性を有するＡＢＯ遺伝子産物をコードし、Ｂ群の個体は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を産生する特異性を有する。Ｏ型個体は、機能的ガラクトシルトランスフェラーゼを全く産生しないため、いずれの修飾も産生しない。ＡＢ型の個体は、各々の１つのコピーを保有し、両方のタイプの修飾を産生する。ＡＢＯ遺伝子の酵素産物は、基質としてＨ抗原に作用し、したがって、ＡＢＯ活性を欠くＯ型個体は、非修飾Ｈ抗原を提示し、しばしばＯ型（Ｈ）と呼ばれる。

Ｈ抗原自体は、ＦＵＴ１遺伝子によってコードされるα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ酵素の産物である。非常に稀な個体では、ＦＵＴ１遺伝子の破壊の結果としてＨ抗原が完全に失われ、ＡＢＯがＡまたはＢ組織血液型を産生するための基質が存在しない。これらの個体はボンベイ組織血液型であると言われている。Ｒｈ抗原は、ＲＨＤ遺伝子によってコードされ、Ｒｈ陰性である個体は、ＲＨＤ遺伝子の欠失または破壊を保有する。

治療用途に好適な細胞株の利用可能性は、厳しく制限されており、多くの場合、利用可能な細胞株は、すべての可能なレシピエントと普遍的に組織適合性ではない。

細胞治療に有用な組織血液型細胞を生成するための新しいアプローチ、組成物、及び方法の必要性が残っている。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくはＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化され、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、細胞が、組織血液型Ｏ細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異（例えば、ヌクレオチド２５８位でのＧのエクソン６における欠失）が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、細胞が、組織血液型Ｏ細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失を含み、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、細胞が、アカゲザル因子（Ｒｈ）陰性細胞であるようなホモ接合変異である。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｒｈ陰性細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化され、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に単離されて活性化される。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、細胞が、ボンベイ表現型を有するようなホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つ以上を含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、細胞が、アカゲザル因子（Ｒｈ）陰性であるようなホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、細胞が、ボンベイ表現型を有し、かつＲｈ陰性であるようなホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、さらにＲｈ陰性細胞である。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失を含み、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、細胞が、ユニバーサルボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｏ型またはボンベイ表現型を有する。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、細胞が、Ｏ型陰性細胞またはボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号１または配列番号２を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異は、ホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つ以上を含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、単離細胞である。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、有害な変異が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。

いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞（ＲＵＥＳ２またはＨ９細胞など）、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的にまたは完全に不活性化される。

いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、上記のいずれかに従う細胞を含む、薬学的組成物である。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療するための方法であって、上記のいずれかに従って細胞を投与することを含む、方法である。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離細胞を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３からなる群から選択される１つを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかのさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離細胞を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ならびに配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を細胞に導入することであって、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、導入することと、（ｃ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成する方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成するための方法であって、（ａ）単離細胞を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法が、（ｉ）表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３を含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法が、（ｉ）配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を細胞に導入するステップであって、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、導入するステップと、（ｉｉ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離細胞を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むＦＵＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＦＵＴ１遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡが、配列番号１３または配列番号１４を含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞を生成する方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１２を含む。

いくつかの実施形態では、単離細胞は、単離ヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、単離細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞（ＲＵＥＳ２またはＨ９細胞など）、複能性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、単離細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ遺伝子を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、上記方法に従って使用される単離細胞は、部分的または完全に不活性化されるＣＩＩＴＡ遺伝子をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ４７導入遺伝子を含む。

いくつかのさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、上記方法に従って調製された幹細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、分化条件は、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である。

いくつかのさらなる態様では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、上記方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。

いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、ＲＵＥＳ２細胞株に由来する単離細胞であって、単離細胞が、（ａ）単離細胞を組織血液型Ｏにする修飾、及び（ｂ）単離細胞をＲｈ陰性にする修飾のうちの一方または両方を含む、単離細胞である。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞を組織血液型Ｏにする修飾が、ＡＢＯ組織血液型Ｂ抗原の抗原性を低減または排除する。

いくつかのさらなる実施形態では、修飾が、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、またはＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって、ＡＢＯ遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の発現が、ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号１または配列番号２を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、ホモ接合変異である。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかのさらなる実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異は、ホモ接合変異である。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞をＲｈ陰性にする修飾が、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によるＦＵＴ１遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかのさらなる実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかのさらなる実施形態では、有害な変異が、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞をＲｈ陰性にする修飾が、１つ以上のアカゲザル因子抗原の抗原性を低減または排除する。

いくつかのさらなる実施形態では、修飾が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によるＲＨＤ遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される。

いくつかのさらなる実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される。

いくつかのさらなる実施形態では、有害な変異が、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの実施形態では、上述の単離細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、上記方法に従って使用される単離細胞は、部分的または完全に不活性化されるＣＩＩＴＡ遺伝子をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ４７導入遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３からなる群から選択される１つを含む。

いくつかのさらなる実施形態では、操作組織適合性細胞を生成するための方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ならびに配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を細胞に導入することであって、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、導入することと、（ｃ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかのさらなる実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む。

いくつかのさらなる実施形態では、方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、方法は、（ｉ）表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、方法が、（ｉ）配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を細胞に導入するステップであって、各々が、ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、導入するステップと、（ｉｉ）ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、ＰＡＭ配列及び／またはスペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、操作組織適合性細胞を生成する方法であって、（ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むＦＵＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入することと、（ｃ）ＦＵＴ１遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、方法である。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１３または配列番号１４を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、方法は、（ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択するステップと、をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１２を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ遺伝子を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＣＩＩＴＡ遺伝子を含む。

いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子を含む。いくつかのさらなる実施形態では、単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ４７導入遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、上述の方法のいずれかに従って調製された操作組織適合性細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、方法である。

いくつかのさらなる実施形態では、分化条件は、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である。

いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、上述の方法のいずれかに従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、方法である。

低免疫原性細胞、その産生方法、及びその使用方法の詳細な説明は、２０１５年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１、及び２０１８年１月１４日に出願されたＷＯ２０１８１３２７８３に記載されており、配列表及び図面を含むその開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の他の目的、利点及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

ユニバーサルＯ陰性ｉＰＳＣの例示的な実施形態を示す。 ユニバーサルＯ陰性細胞を生成するために使用することができるＡＢＯ遺伝子の例示的なゲノム修飾戦略を示す。 ユニバーサルＯ陰性細胞を生成するために使用することができるＲＨＤ遺伝子の例示的なゲノム修飾戦略を示す。 ｃ．２５８ｄｅｌＧ ＡＢＯ遺伝子型を産生するための３つのＨＤＲ戦略を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 例示的なＡＢＯ標的配列及びＡＢＯ遺伝子のゲノム構造を示す。 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コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 コードエクソンを標的とする例示的なＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｈを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 ＦＵＴ１ ｇＲＮＡ標的配列の表Ｉを示す。 血液型適合サル血清とインキュベートした場合のＲＵＥＳ２－心筋細胞生存、及び不適合血液とインキュベートした場合の拒絶反応を示す。

Ｉ．緒論
本発明は、部分的に、ユニバーサルな移植に好適な組織血液抗原型を産生するために細胞を遺伝子修飾する方法に基づいている。ユニバーサル組織血液型細胞を産生するためのＡＢＯ、ＲＨＤ、及びＦＵＴ１遺伝子の遺伝子編集の方法が記載される。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子修飾を保有する細胞はまた、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩ抗原の発現を調節する遺伝子における遺伝子改変を行う。本明細書に概説される細胞は、患者への細胞療法の実施及び送達を改善ならびに促進することができる。

ＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、「免疫原性」は、対象（例えば、ヒト対象）に導入されるときに、物質が検出可能な免疫応答（体液性または細胞性）を誘導することを可能にする特性を指す。

細胞を特性化するために本明細書で使用される場合、「低免疫原性」という用語は、一般に、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶の傾向が少ないことを意味する。例えば、変更されていないまたは改変されていない野生型細胞と比較して、そのような低免疫原性細胞は、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以下、そのような細胞が移植された対象による免疫拒絶の傾向が少ない。いくつかの態様では、ゲノム編集技術は、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節するために使用され、したがって、低免疫原性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。場合によっては、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞から産生された分化細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントに投与される（例えば、移植またはグラフトされる）ときに免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性適応免疫拒絶及び／または自然免疫細胞拒絶から保護される。

細胞の低免疫原性は、適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する細胞の能力など、細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。そのような免疫応答は、当業者によって認識されているアッセイを使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答アッセイは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞死滅、ＮＫ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、及びマクロファージ活性化に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞及びその誘導体は、対象への投与時に、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞による死滅の減少を受ける。場合によっては、細胞及びその誘導体は、改変されていない細胞または野生型細胞と比較して、マクロファージの貪食が減少していることを示す。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、対応する改変されていない野生型細胞と比較して、レシピエント対象において免疫応答の低下または減少を誘発する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、非免疫原性であるか、またはレシピエント対象において免疫応答を誘発することができない。

「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトには、クラスＩ及びクラスＩＩの２つのＭＨＣ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」がある。ＨＬＡ－Ｉには、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの３つのタンパク質が含まれ、細胞内からペプチドを提示し、ＨＬＡ－Ｉ複合体によって提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引き付ける。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連している。ＨＬＡ－ＩＩには、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲの５つのタンパク質が含まれており、これらは細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。これは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。「ＭＨＣ」または「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）またはマウス（ＭＨＣ）のどちらに由来するかに依存するので、限定することを意味するものではないことを理解されたい。したがって、これは哺乳動物細胞に関連するので、これらの用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「拒絶を回避する」、「拒絶を逃れる」、「拒絶を防止する」、及び同様の用語は、本発明に従って遺伝子修飾されていない対応する生成物及び細胞と比較した場合、対象に移植されたときに拒絶されにくい、本発明による遺伝子修飾されたまたは他の方法で修飾された膜生成物及び細胞を指すために交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子修飾産物及び細胞は、対象に移植されたときに、対象に不適合ＡＢＯ血液群またはＲｈ因子である対応する細胞と比較して、拒絶の影響を受けにくい。

本明細書における「同種異系」とは、宿主生物及び免疫細胞応答が生成される細胞移植の遺伝的非類似性を意味する。

「多能性細胞」という用語は、未分化状態を維持しながら自己複製及び増殖することができ、かつ適切な条件下で、特殊な細胞型に分化するように誘導することができる細胞を指す。本明細書で使用される「多能性細胞」という用語は、胚性幹細胞及び胎児、羊膜、または体細胞を含む他の種類の幹細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞株には、Ｈ９ヒト胚性幹細胞株、ＲＵＥＳ２ヒト胚性幹細胞株などが含まれる。さらなる例示的な幹細胞株には、Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＨＵＥＳ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載されているように）を通じて入手可能になったものが含まれる。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃連結、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織）または外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系組織）のいずれかに分化する可能性を有する。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語は、非多能性細胞に由来する一種の多能性幹細胞である「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」も包含する。親細胞の例には、様々な手段によって多能性の未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれる。このような「ｉＰＳ」または「ｉＰＳＣ」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、または特定のタンパク質の外因性の適用によって作製することができる。ｉＰＳ細胞を誘導するための方法は当技術分野で知られており、以下でさらに記載されている。（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）、Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）、Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）、及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）を参照されたく、その各々は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成が以下に概説される。本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞である。

多能性幹細胞のいくつかの特徴は、それらを他の細胞と区別する。例えば、適切な条件下で、３つの胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の全てからの細胞系統に関連する特徴を集合的に示す細胞型への分化を受け得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞の特徴である。分子マーカーの特定の組み合わせの発現または非発現もまた、多能性幹細胞特性である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、及びＮａｎｏｇの非限定的なリストからの少なくともいくつか、いくつかの実施形態では、すべてのマーカーを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態はまた、多能性幹細胞の特徴でもある。細胞は、内胚葉前駆細胞及び／または肝細胞に再プログラムされるために、多能性を通過する必要はない。

本明細書で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞を指す。そのような細胞の例には、分化細胞及び前駆細胞が含まれる。分化細胞の例には、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織、及び末梢血から選択される組織からの細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な細胞型には、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、及びＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない。誘導多能性細胞、内胚葉前駆細胞、及び肝細胞を生成するために用いられる出発細胞は、非多能性細胞であり得る。

本明細書で使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。例えば、誘導多能性細胞は、内胚葉細胞を形成することができる。さらに、多能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などを含むいくつかの種類の血液細胞に分化することができる。

分化細胞には、多能性細胞、寡能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、低潜在的な細胞は、潜在的な細胞に関連して「分化」と見なされる。

「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物における臓器、皮膚、血液、骨、及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。本明細書で使用される体細胞には、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、グリア細胞、免疫細胞、間葉細胞、上皮細胞、及び内皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、例えば、本明細書に記載されるように、免疫エフェクター細胞を含む。例示的な免疫エフェクター細胞には、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞及びガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。

本明細書における「低免疫原性多能性細胞」、「低免疫多能性細胞」または「ＨＩＰ細胞」とは、その多能性特性を保持しながら、同種異系宿主に移入されたときに減少した免疫学的拒絶反応をもたらす多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩＰ細胞は、免疫応答を引き起こさない。したがって、「低免疫原性」とは、本明細書に概説されるような免疫工学の前の親（すなわち、「野生型」）細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が大幅に減少または排除されることを指す。多くの場合、ＨＩＰ細胞は免疫学的にサイレントでありながら、多能性能力を保持している。ＨＩＰ特性のアッセイが以下に概説される。

細胞の文脈における「野生型」または「ｗｔ」とは、天然に見出される細胞を意味する。しかしながら、本明細書で使用される多能性幹細胞の文脈において、これはまた、多能性をもたらすが、低免疫原性を達成するために本発明の遺伝子編集手順を受けなかった核酸変化を含有し得るｉＰＳＣを意味する。

単離細胞に適用される「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実行することを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ）が本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された細胞または細胞集団を個体に投与することを指す。個体は通常、病気であるかもしくは負傷しているか、または集団の平均的なメンバーと比較して病気になるリスクが高く、そのような注意、配慮、もしくは管理を必要としている。

本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」という用語は、対象が少なくとも１つの症状の軽減、または疾患の改善、例えば、有益なもしくは望ましい臨床結果を有するように、本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで変更された標的ポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益なもしくは望ましい臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐、病状の改善もしくは緩和、及び寛解（部分的もしくは全体的）が挙げられるが、これらに限定されない。治療することはまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することを含む。したがって、当業者は、治療により疾患状態が改善し得るが、疾患の完全な治癒ではないことがあることを認識している。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は予防を含む。あるいは、病気の進行が低下または停止した場合、治療は「有効」である。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することも意味する。治療が必要なものには、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断されているもの、及び遺伝的感受性または他の要因のためにそのような障害を発症する可能性が高いものが含まれる。

疾患または障害の「治療」または「予防」とは、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防し、進行を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止し、そのような疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を悪化または憎悪させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。

本明細書で使用される場合、「投与すること」、「導入すること」及び「移植すること」という用語は、所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば、本発明の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載される細胞を対象に配置する文脈において交換可能に使用される。細胞は、所望の部位に直接移植することができるか、あるいは、移植された細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存し続ける対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、最短で数時間、例えば２４時間～数日、最長で数年であり得る。場合によっては、細胞は、移植された細胞を移植位置に維持し、移植された細胞の移動を回避するために、肝臓内または皮下、例えばカプセル内など、所望の部位以外の場所に投与することもできる。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、処置される症状及び／または状態を有意にかつ肯定的に修飾する（例えば、陽性の臨床応答を提供する）のに十分な量の薬学的組成物を意味する。薬学的組成物中で使用するための有効成分の有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、治療期間、併用療法の性質、使用される特定の活性成分、使用される特定の薬学的に許容される賦形剤及び／または担体、ならびに主治医の知識及び専門知識を伴う同様の因子によって変化するであろう。

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した賦形剤、組成物、及び／または投薬形態を指す。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分に結合し、標的ＤＮＡ内の特定の位置にそれらを標的化するＲＮＡ分子は、本明細書では、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、または「小さなガイドＲＮＡ」と称され、本明細書では、「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」とも称され得、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント：少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」とは、分子の一部、セクション、または領域、例えば、ＲＮＡ分子のヌクレオチドの連続した区間を意味する。「セグメント」の定義は、特に明記されていない限り、特定の数の総塩基対に限定されない。いくつかの実施形態では、標的化は、ｇＲＮＡの一部をＤＮＡとハイブリダイズすること（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインを介して）、及びｇＲＮＡ分子の一部をＲＮＡ誘導ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子と結合すること（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）によって達成される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」などと呼ばれる単一の隣接するポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数の、通常は２つの、ポリヌクレオチド分子を含み、これらは自体は、通常、ハイブリダイゼーションを通じて会合することができ、本明細書では、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」などと称される。ｇＲＮＡ分子は、以下により詳細に記載され、一般に、標的化ドメイン及びｔｒａｃｒを含む。他の実施形態では、標的化ドメイン及びｔｒａｃｒは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。ガイドＲＮＡは、単離ＲＮＡ分子として標的細胞に導入されるか、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して細胞に導入されることができる。

本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的」という用語は、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ標的の各々及びいずれかのＲＮＡ配列、ならびに遺伝子編集に利用されるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的は、ガイドＲＮＡが結合する標的配列を含み、それにより標的配列の遺伝子編集を可能にする。ガイドＲＮＡ標的は、標的配列に対応することができ、ＰＡＭ配列を含まない。

ガイドＲＮＡの「ＤＮＡ結合セグメント」（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。

ガイドＲＮＡは、１つ以上のポリペプチド結合配列／セグメントを含むことができる。ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、Ｃａｓタンパク質のＲＮＡ結合ドメインと相互作用する。

本明細書で使用される「Ｃａｓ９分子」という用語は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系に由来するＣａｓ９野生型タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質の修飾、Ｃａｓ９タンパク質のバリアント、Ｃａｓ９オルソログ、及びそれらの組み合わせを指す。

「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーテンプレート」、及び「ドナーオリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、少なくとも一部が選択された核酸標的部位に組み込まれることが意図される核酸配列を提供するポリヌクレオチドを指す。一般に、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドである。例えば、操作ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、ゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ標的配列を修飾するために、ドナーＤＮＡ鋳型と組み合わせて使用することができ、ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ標的配列におけるドナーＤＮＡ鋳型の少なくとも一部を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含み、他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドである。

本明細書で使用される「ＨＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、相同性指向修復を指し、相同核酸（例えば、内因性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外因性核酸、例えば、鋳型核酸）を使用してＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。ＨＤＲは、典型的には、二本鎖切断において有意な切除が行われ、ＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖部分を形成するときに作用する。正常な細胞において、ＨＤＲは、典型的には、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、及びライゲーションなどの一連のステップを伴う。いくつかの事例では、ＨＤＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、ドナー鋳型（例えば、ドナーＤＮＡ鋳型）またはドナーオリゴヌクレオチドを使用して、二本鎖切断が生じた配列（例えば、ＤＮＡ標的配列）を修復する。これにより、例えば、ドナー鋳型ＤＮＡからＤＮＡ標的配列への遺伝子情報の転写がもたらされる。ドナー鋳型ＤＮＡ配列またはオリゴヌクレオチド配列がＤＮＡ標的配列と異なり、ドナー鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部または全てがＤＮＡ標的配列に組み込まれる場合、ＨＤＲはＤＮＡ標的配列の改変（例えば、挿入、欠失、変異）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド全体、ドナー鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーは、ＤＮＡ標的配列の部位に組み込まれる。

本明細書で使用される「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、ライゲーション媒介修復及び／または非鋳型媒介修復を指す。

本発明の方法を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができる。本発明は、任意の目的のために細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することを企図する。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、変異体細胞を産生するように変更される。本明細書で使用される場合、「変異体細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる結果として生じる遺伝子型を有する細胞を指す。いくつかの事例では、「変異体細胞」は、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して正常に機能する遺伝子が変更された場合に、変異表現型を示す。他の例では、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが変異体遺伝子型を修正するために使用される場合、「変異体細胞」は野生型表現型を示す。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を修正または修復するために（例えば、細胞に正常な表現型を回復するために）変更される。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を誘導するために（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するために）変更される。

いくつかの実施形態では、変更はインデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせから生じる変異を指す。当業者によって理解されるように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、変更は点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、任意の長さのインデルまたは標的ポリヌクレオチド配列における点変異を誘導することができる。

本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨害する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）の標的ポリヌクレオチド配列にインデルを誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、本明細書に記載の詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトする方法を容易に理解するであろう。

「遺伝子ノックアウト」のプロセスは、それが存在する宿主細胞内の特定の遺伝子を不活性化し、目的のタンパク質が産生されないか、または不活性形態のいずれかをもたらし、当業者によって理解され、以下にさらに説明されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去すること、または他の配列との配列を中断すること、リーディングフレームを変更すること、または核酸の調節成分を変更することを含む、いくつかの異なる方法で達成することができる。例えば、目的の遺伝子のコード領域の全てまたは一部を除去するか、または「ナンセンス」配列で置き換えることができ、プロモーターなどの制御性配列の全てまたは一部を除去するか、または置き換えることができ、翻訳開始配列を除去するか、または置き換えることなどができる。

いくつかの実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで実行することができる。エクスビボの目的のために、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を治療または予防するために（例えば、エクスビボで細胞内の変異体対立遺伝子をノックアウトし、ノックアウトされた変異体対立遺伝子を対象に導入することによって）有用であり得る。

本明細書における「ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を付加するプロセスを意味する。これにより、コードされたタンパク質のレベルが上昇する。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子の１つ以上の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、またはタンパク質の発現を増加させる内因性遺伝子の調節成分を改変することを含む、いくつかの方法で達成することができる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「複数のベクター」は、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にまたは促進するツールを指す。

本明細書で使用される「パッケージング細胞」という用語は、感染性組換えウイルスまたはウイルスベクターをパッケージングするために必要な要素の一部または全てを含有する細胞を含む。パッケージング細胞は、組換えウイルスベクターを欠いていてもよい。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質を発現することができる１つ以上のベクターが含まれる。エンベロープウイルス粒子の産生に必要な要素の一部のみを含む細胞は、一過性のトランスフェクション、形質導入、または各追加の必要な要素の安定した組み込みの後続のステップを通じて、ウイルス粒子産生細胞株の生成における中間試薬として有用である。これらの中間試薬は、「パッケージング細胞」という用語に包含される。

本明細書で使用される場合、「ウイルス粒子」は、複製能のあるまたは欠陥のあるウイルス、それに由来するウイルスベクターを指し、目的のヌクレオチドを含んでも含んでいなくてもよい。

「エンベロープウイルス」は、ウイルスカプシドを取り囲むタンパク質性ウイルスエンベロープを含有するウイルスを指す。そのようなエンベロープウイルスには、オルトミクソウイルス及びパラミクソウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスが含まれる。エンベロープウイルスによる細胞感染の間、宿主細胞の形質膜は、いくつかのウイルスコードされたタンパク質を含むように改変され、ウイルス核タンパク質コアは、それが組み立てられた宿主細胞を出ると、修飾膜で包まれ、ウイルスエンベロープを形成する。

レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，７５８－６３に見出すことができる。レンチウイルスは、霊長類群及び非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルスの例には、プロトタイプの「スローウイルス」ビスナ／マエジウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及び最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。

レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１：３０５３－８；Ｌｅｗｉｓ、Ｐ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５１０－６）。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺、及び肝臓組織を構成する細胞などの非分裂細胞またはゆっくりと分裂細胞に感染することができない。

レンチウイルスベクターは、「霊長類」ベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクター（すなわち、霊長類、特にヒトに主に感染しないウイルスに由来する）であり得る。非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に自然に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得る。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、シュードタイプレンチウイルスベクターである。シュードタイプレンチウイルスベクターは、他のエンベロープウイルス由来の糖タンパク質を保有するベクター粒子を含む。シュードタイピングは、表現型的に混合された粒子またはシュードタイプの形成を通じてエンベロープウイルスの細胞向性を拡大するためのメカニズムである。いくつかの実施形態において、ベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）の融合性エンベロープＧ糖タンパク質でシュードタイピングされ得る。シュードタイプタンパク質は、狂犬病ウイルス、ＭＬＶ、エボラウイルス、バキュロウイルス、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、及びフィロウイルスに由来し得る。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２系ベクターである。ＨＩＶ－１ベクターは、単純なレトロウイルスにも見られるシス作用要素を含有する。ｇａｇオープンリーディングフレーム内に伸長する配列は、ＨＩＶ－１のパッケージングに重要であることが示されている。したがって、ＨＩＶ－１ベクターは、翻訳開始コドンが変異しているｇａｇの関連部分を含有することが多い。さらに、大部分のＨＩＶ－１ベクターは、ＲＲＥを含むｅｎｖ遺伝子の一部も含有する。ＲｅｖはＲＲＥと結合し、核から細胞質への完全長または単一スプライシングされたｍＲＮＡの輸送を可能にする。Ｒｅｖ及び／またはＲＲＥが存在しない場合、完全長ＨＩＶ－１ ＲＮＡは核内に蓄積する。あるいは、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルスなどの特定の単純なレトロウイルスからの構成輸送要素を使用して、Ｒｅｖ及びＲＲＥの要件を緩和することができる。ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターからの効率的な転写には、ウイルスタンパク質Ｔａｔが必要である。大部分のＨＩＶ－２系ベクターは、構造的にＨＩＶ－１ベクターに非常に類似している。ＨＩＶ－Ｉ系ベクターと同様に、ＨＩＶ－２ベクターはまた、完全長または単一スプライシングされたウイルスＲＮＡの効率的な輸送のためにＲＲＥを必要とする。本発明で使用するためのＨＩＶ由来ベクターは、ＨＩＶ株に関して限定されない。

いくつかの実施形態では、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターは、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるが、最終標的細胞内で感染性ウイルス粒子を産生するために独立した複製が不可能なウイルス粒子にＲＮＡゲノムをパッケージングすることを可能にするのに十分なレンチウイルス遺伝子情報を有する。好ましい実施形態では、ベクターは、機能的なｇａｇ－ｐｏｌ及び／またはｅｎｖ遺伝子及び／または複製に必須の他の遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、レンチウイルスゲノムと作動可能に連結されて、宿主細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指示する転写調節制御配列を含む。これらの調節配列は、転写されたウイルス配列（すなわち、５’Ｕ３領域）と関連する天然配列であってもよく、または別のウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）などの異種プロモーターであってもよい。

いくつかの実施形態では、ベクターは、組み込み欠陥である。組み込み欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は、例えば、ベクターを触媒的に不活性なインテグラーゼでパッケージングすることによって（例えば、触媒部位にＤ６４Ｖ変異を有するＨＩＶインテグラーゼ；Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－７、Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２－８、Ｌｅａｖｉｔｔ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７２１－８）、またはベクターＬＴＲから必須のａｔｔ配列を修飾もしくは削除することによって（Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：１１２１－３２）、または上記の組み合わせのいずれかによって産生することができる

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ニューロンに自然に感染するエンベロープを持った二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＳＶは、外来ＤＮＡの大きな切片を収容することができ、これにより、ベクターシステムとして魅力的であり、ニューロンへの遺伝子送達のためのベクターとして用いられてきた。治療手順におけるＨＳＶの使用は、溶解サイクルを確立できないように、株を減衰させる必要がある。ＨＳＶベクターをヒトの遺伝子治療に使用する場合、目的の遺伝子は、好ましくは、必須遺伝子に挿入される。これは、ベクターウイルスが野生型ウイルスに遭遇した場合、異種遺伝子の野生型ウイルスへの移行が組換えによって生じ得るため、必要である。しかしながら、ＮＯＩが必須遺伝子に挿入される限り、組換え移入はまた、レシピエントウイルスにおける必須遺伝子を欠失させ、異種遺伝子の複製能のある野生型ウイルス集団への「エスケープ」を防止する。

他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ワクシニアウイルス由来ベクターである。ワクシニアウイルスは、約１９０ｋｂの直鎖、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する大型エンベロープウイルスである。ワクシニアウイルスは、最大約２５ｋｂの外来ＤＮＡを収容することができ、これはまた大型遺伝子の送達にも有用である。遺伝子治療用途、例えば、ＭＶＡ及びＮＹＶＡＣ株に好適である、いくつかの減衰ワクシニアウイルス株が当技術分野で即知である。

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合ヌクレオチドを含む高分子化合物を意味する。「核酸」という用語には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、両方とも一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡとしては、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）及び後（３’非コード配列）の制御性配列として作用することができる核酸断片を指す。

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。

本明細書で使用される「アミノ酸」は、カルボキシル（－－ＣＯＯＮ）及びアミノ（－－ＮＨ．ｓｕｂ．２）基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然、すなわち、合成アミノ酸の両方を指す。３文字及び１文字の略語を有する天然アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が含まれる。

「アミノ酸置換」は、野生型または天然に存在するアミノ酸の、そのアミノ酸残基での野生型または天然に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸による１つ以上の置換を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本発明の置換アミノ酸は、合成または天然に存在するアミノ酸であり得る。ある特定の実施形態では、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される天然に存在するアミノ酸である。置換変異体は、短縮された系を使用して記載され得、例えば、第５の（５．ｓｕｐ．ｔｈ）アミノ酸残基が置換された置換変異体は、「Ｘ５Ｙ」と短縮され得、「Ｘ」は、置換される野生型または天然に存在するアミノ酸であり、「５」は、タンパク質またはポリペプチド内のアミノ酸残基であり、「Ｙ」は、置換された、または非野生型もしくは非天然に存在するアミノ酸である。

「組換え」という用語は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関連して使用される場合、自然界に存在することが知られていない遺伝物質の新しい組み合わせを意味する。組換え分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子スプライシング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する）、及び核酸分子、ペプチド、またはタンパク質の固体状態合成を含むがこれらに限定されない、組換え技術の分野で利用可能な周知の技術のいずれかによって作製することができる。

「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または核酸は、その天然環境から除去された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または核酸は、希釈剤またはアジュバントなどの賦形剤とともに製剤化され得、依然として単離されたものとみなされ得ることも理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「制御性配列」、「制御性要素」、及び「調節要素」という用語は交換可能であり、発現されるポリヌクレオチド標的の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非翻訳配列）であるポリヌクレオチド配列を指す。制御性配列は、例えば、転写のタイミング、転写の量もしくはレベル、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、及び／または関連する構造的ヌクレオチド配列の翻訳に影響を与える。制御性配列には、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流コードまたは非コード配列の転写の開始に関与することができるＤＮＡ調節領域／配列を指す。いくつかの実施例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流に延びる。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多いが、必ずしもそうではない。

「構成的プロモーター」は、典型的には、ほとんどの条件下で活性であり、すなわち、転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、所与の分子因子（例えば、ＩＰＴＧ）の存在下または所与の環境条件（例えば、特定のＣＯ２濃度、栄養素レベル、光、熱）などの特定の条件下でのみ活性である。その状態が存在しない場合、誘導性プロモーターは、典型的には、有意なまたは測定可能なレベルの転写活性を許容しない。例えば、誘導性プロモーターは、温度、ｐＨ、ホルモン、代謝産物（例えば、ラクトース、マンニトール、アミノ酸）、光（例えば、波長特異的）、浸透圧電位（例えば、塩誘導性）、重金属、または抗生物質に従って誘導され得る。多数の標準的な誘導性プロモーターが、当業者に知られているであろう。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、互いに機能的関係に配置されたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を制御するか、またはその調節に寄与する場合、コード配列に作用可能に連結される。制御性配列をコードする作用可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には、コード配列と隣接する。しかしながら、エンハンサーは、プロモーターから最大数キロ塩基以上分離された場合に機能することができる。したがって、いくつかのポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結され得るが、隣接しない。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に結合することができる。

「ベクター」及び「プラスミド」という用語は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、遺伝物質を細胞に導入するためのポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクトルは、線形または円形であり得る。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノムに組み込むか、または宿主細胞内で独立して複製することができる。ベクターは、例えば、複製起点、マルチクローニング部位、及び／または選択可能なマーカーを含み得る。発現ベクターは通常、発現カセットを含む。ベクター及びプラスミドには、組み込みベクター、原核生物プラスミド、真核生物プラスミド、植物合成染色体、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。「ベクター」という用語はまた、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで細胞に核酸分子を導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方を含む。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションを含むがこれらに限定されない既知の方法によって、所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む様々な制御性要素を含むことができる。

「発現カセット」という用語は、宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの発現を促進するために、選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御性配列を含む、組換えまたは合成的に生成されたポリヌクレオチド構築物を指す。例えば、制御性配列は、宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写、または宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写及び翻訳を促進することができる。発現カセットは、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または発現ベクターに存在することができる。

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＤＮＡ鋳型からのポリヌクレオチドの転写を指し、例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写産物（例えば、構造または足場などの非コードＲＮＡ）をもたらす。この用語は、転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスをさらに指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。発現は、ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞においてｍＲＮＡをスプライシングすることを含み得る。

本明細書で使用される「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性核酸分子を細胞に導入することを意味する。「トランスフェクト」細胞は、細胞内に外因性核酸分子を含み、「形質転換」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る、及び／または細胞によって、一時的にもしくは長期的に染色体外で維持され得る。外因性核酸分子または断片を発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の発現ベクター、例えば、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、もしくはＣａｓ１０タンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。

いくつかの実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低下をもたらす。「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少する」、「低下した」、「低下」、及び「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在のレベル）、あるいは参照レベルと比較して１０～１００％の間の任意の減少を意味する。

「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、一般に統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む増加、あるいは参照レベルと比較した１０～１００％の間の任意の増加、あるいは少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の増加、あるいは参照レベルと比較して２倍から１０倍以上の間の任意の増加を意味する。

「不活性化する」または「不活性化」という用語は、本明細書では、概して、目的の遺伝子の発現が参照レベルと比較して減少するか、または機能的もしくは活性的なタンパク質形態で発現しないことを意味するために使用され、「部分的に不活性化する」または「部分的に不活性化」という用語は、参照レベルと比較して減少したが除去されない目的の遺伝子の発現、または遺伝子によって発現されるタンパク質の割合が依然としてそれらの活性及び機能を保持することを指す。本明細書で使用される「完全に不活性化する」または「完全に不活性化」という用語は、目的の遺伝子が任意のタンパク質を発現しない、または目的の遺伝子によってコードされる全ての発現タンパク質が不活性であり、非機能的であることを意味する。

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照されるポリペプチドが目的の細胞に導入されることを意味することを意図している。ポリペプチドは、例えば、染色体への組み込みなどによる細胞の遺伝物質へのコード化核酸の導入によって、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される用語は、発現可能な形態のコード化核酸の細胞への導入を指す。

「内因性」という用語は、細胞内に存在する参照される分子またはポリペプチドを指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されないコード化核酸の発現を指す。

本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、修飾分子を親分子から物理的に分化させる改変を指す。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、バリアントポリペプチドの機能を非修飾ポリペプチドから分化させる１つ以上の修飾を含む。例えば、バリアントポリペプチドにおけるアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を与える。他の実施形態では、バリアントポリペプチドは、置換、欠失、もしくは挿入修飾、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、バリアントポリペプチドは、非修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対する親和性を増加させる１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、対応する天然または親配列と比較して、１つ以上の置換、挿入、または欠失を含む。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１～４０、４１～５０、または５１、またはそれ以上の修飾を含む。

本明細書で使用される「阻害剤」、「活性化剤」、及び「調節剤」という用語は、生物学的に関連する分子の機能または発現に影響を与える薬剤を指す。「調節物質」という用語は、阻害剤及び活性化剤の両方を含む。これらは、標的分子の発現または活性のためのインビトロ及びインビボアッセイを使用して同定され得る。場合によっては、「阻害剤」は、例えば、発現を阻害するか、または標的分子もしくはタンパク質に結合する薬剤である。これらは、刺激を部分的にまたは完全に遮断するか、またはプロテアーゼ阻害剤活性を有することができる。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作、または下方制御を含む、活性化を低減、減少、防止、または遅延させ得る。調節剤は、標的分子もしくはタンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。いくつかの事例では、「活性化剤」は、例えば、標的分子もしくはタンパク質の機能または発現を誘導あるいは活性化する薬剤である。それらは、標的分子活性に結合する、刺激する、増加する、開く、活性化する、または促進することができる。活性化剤は、標的分子またはタンパク質のアゴニストであり得る。「対象」及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、及び／または本明細書に記載の細胞による予防的治療を含む治療が提供されるヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的なこれらの感染症、状態または病状の治療について、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、哺乳動物、爬虫類、両生類、及び魚を含むが、これらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または飼いならされた哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどの他の哺乳動物、または生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。

用語「相同体」及び「相同配列」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能性、または構造レベルでの参照分子に類似する生物活性分子を指す。相同体は、参照配列と特定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含み得る。したがって、一実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも８０または８５パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同または誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を共有する。一実施形態では、相同または誘導体配列は、参照配列と１００％配列同一性を共有する。相同または誘導体核酸配列はまた、高ストリンジェンスハイブリダイゼーション条件下で参照核酸配列と結合したままであるそれらの能力によって定義され得る。参照分子と構造的または機能的に類似性を有する相同体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造的及び機能的相同体、ならびに誘導体を検出、生成、及びスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。

本明細書全体を通して与えられるすべての最大数値制限は、そのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に記述されるように、すべてのより低い数値制限を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられるすべての最小数値制限は、そのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に記述されるように、すべてのより高い数値制限を含むであろう。本明細書全体を通して与えられるすべての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記述されるように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべての狭い数値範囲を含むであろう。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「％同一性」という用語は、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査によって測定される、最大の対応物と比較され、アラインメントされる場合、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較では、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによってＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似の方法を検索することによって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、または目視検査によって（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）によって行われ得る。

配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。

特定の実施形態の実施は、特に反対に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くは、例示の目的で以下に説明されている。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどのジャーナルのモノグラフを参照されたい。

請求項はいかなる選択的な要素も除外するように作成することができることに留意されたい。そのため、この記載は、請求項要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などの排他的な用語の使用に対して先の記載として役立つことを意図している。本開示を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書に記載され、例示されている個々の実施形態は、それぞれ、別個の構成要素及び特徴を有しており、この構成要素及び特徴は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、またはそのような特徴と組み合わせてもよい。あらゆる列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、または論理的に可能な他の順序で実行してよい。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法及び材料も本発明の実施または試験に使用してもよいが、代表的な例示的な方法及び材料をここに記載する。

本発明を説明する際には、以下の用語が、使用され、以下に示されるように、定義される。

本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語が特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値と、その指定範囲の任意の他の指定値または介在値とは、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立して、そのより小さい範囲に含まれ得、また、本発明に包含され、指定範囲内の任意の具体的に除外された制限値に従う。表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に示される。「約」という用語は、その後に続く正確な数字及びその用語の後に続く数字に近いか、またはほぼその数字である数字を文字通り支持するために本明細書で使用される。ある数字が、具体的に引用されている数字に近いか、またはほぼその数字であるかを決定する際に、その近いかまたはほぼ引用されていない数字は、提示されている文脈において、具体的に引用されている数字と実質的に等価を提供する数字であり得る。

本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。さらに、引用された各刊行物、特許、または特許出願は、刊行物が引用されたものに関連する主題を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利が与えられていないことを認めるものと解釈するべきではない。さらに、提示される公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。

ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
Ａ．操作組織適合性細胞
理解されるように、本明細書で提供する方法は、任意の型の有核細胞上で実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、非修飾細胞）は、Ａ型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢ型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｏ型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｏ型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ａ型Ｒｈ＋（例えば、Ａ＋）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ａ型ＲＨ－（例えば、Ａ－）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ型Ｒｈ＋（例えば、Ｂ＋）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ型Ｒｈ－（例えば、Ｂ－）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢ型Ｒｈ＋（例えば、ＡＢ＋）型細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢ型Ｒｈ－（例えば、ＡＢ－）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｏ型Ｒｈ＋（例えば、Ｏ＋）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、非修飾細胞）は、ｈｈ型細胞であり、ボンベイ表現型を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される操作組織適合性細胞は、遺伝子編集を使用して、Ａ、Ｂ、Ｈ、及びＲｈ抗原を含む細胞の組織血液抗原のうちの１つ以上を修飾するように産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、例えば、Ａ型細胞をＯ型細胞に、Ｂ型細胞をＯ型細胞に、ＡＢ型細胞をＯ型細胞に、Ａ＋型細胞をＯ－型細胞に、Ａ－型細胞をＯ－型細胞に、ＡＢ＋型細胞をＯ－型細胞に、ＡＢ－型細胞をＯ－型細胞に、Ｂ＋型細胞をＯ－型細胞に、及びＢ－型細胞をＯ－型細胞に修飾するための遺伝子編集を使用して生成される。

いくつかの実施形態では、血液型Ａ個体または群Ａ細胞からの細胞は、ＡＢＯ遺伝子で遺伝子修飾されて、α（１，３）Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有する機能的グリコシルトランスフェラーゼをもはや産生しない。いくつかの実施形態では、血液型Ｂ個体または群Ｂ細胞からの細胞は、ＡＢＯ遺伝子で遺伝子修飾されて、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的グリコシルトランスフェラーゼをもはや産生しない。いくつかの実施形態では、血液型Ａ個体、血液型Ｂ個体、または血液型ＡＢ個体からの細胞は、本明細書に記載の方法に従って操作され、ＡＢＯ活性を欠く細胞を産生する。いくつかの事例では、ＡＢＯ活性を有しないそのような細胞は、非修飾Ｈ抗原を発現または提示する。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＡＢＯ遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＡＢＯ遺伝子の１つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＡＢＯ遺伝子の２つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＡＢＯ遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＡＢＯ遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＡＢＯ遺伝子のヘテロ接合修飾である。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＦＵＴ１遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＦＵＴ１遺伝子の１つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＦＵＴ１遺伝子の２つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＦＵＴ１遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＦＵＴ１遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＦＵＴ１遺伝子のヘテロ接合修飾である。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＲＨＤ遺伝子内に遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＲＨＤ遺伝子の１つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＲＨＤ遺伝子の２つの対立遺伝子に影響を与える。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＲＨＤ遺伝子の挿入、欠失、または破壊である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＲＨＤ遺伝子のホモ接合修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ＲＨＤ遺伝子のヘテロ接合修飾である。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なＡＢＯ遺伝子産物が細胞によって生成されないように、ＡＢＯ遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なＦＵＴ１遺伝子産物が細胞によって生成されないように、ＦＵＴ１遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、機能的なＲＨＤ遺伝子産物が細胞によって生成されないように、ＲＨＤ遺伝子の遺伝子修飾を含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、組織適合性決定因子をコードする１つ以上の遺伝子における遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢＯ遺伝子の遺伝子修飾及びＲＨＤ遺伝子の遺伝子修飾を含む。いくつかの事例では、操作細胞は、Ｏ型陰性細胞である。

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＦＵＴ１遺伝子の遺伝子修飾及びＲＨＤ遺伝子の遺伝子修飾を含む。このように、操作細胞は、Ｏ型陰性細胞であり得る。

Ｃａｓ９などであるがこれらに限定されない希少切断エンドヌクレアーゼを使用した遺伝子編集は、ＡＢＯ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、及びＲＨＤ遺伝子などであるがこれらに限定されない組織適合性決定基をコードする１つ以上の遺伝子の標的破壊に利用される。

いくつかの事例では、ＡＢＯ遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか１つを標的とする。他の例では、ＦＵＴ１遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか１つを標的とする。特定の例では、ＲＨＤ遺伝子の標的破壊は、そのコードエクソンのいずれか１つを標的とする。いくつかの実施形態では、遺伝子のコード配列全体またはその大部分は、破壊または切除される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集による挿入欠失を細胞に導入して、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、及び／またはＦＵＴ１遺伝子を破壊する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、ＡＢＯ遺伝子のコード配列を標的として、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異を導入し、ＡＢＯ機能を破壊する。他の実施形態では、ＡＢＯの非翻訳領域、イントロン配列、及び／またはエクソン配列が標的とされる。

いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、ＦＵＴ１遺伝子のコード配列を標的として、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異を導入し、ＦＵＴ１機能を破壊する。他の実施形態では、ＦＵＴ１の非翻訳領域、イントロン配列、及び／またはエクソン配列が標的とされる。

いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、ＲＨＤ遺伝子のコード配列を標的として、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異を導入し、ＲＨＤ機能を破壊する。他の実施形態では、ＲＨＤの非翻訳領域、イントロン配列、及び／またはエクソン配列が標的とされる。

いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、インデルを含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、フレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異は、機能喪失変異を含む。

いくつかの実施形態では、細胞の組織適合性は、補体媒介性細胞死滅アッセイを使用して決定される。このようなアッセイの非限定的な例は、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）である。

本発明の組織適合性細胞は、培養中の細胞、例えば培養哺乳動物細胞、例えば培養ヒト細胞を含む細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は多能性を保持する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、分化能を保持する。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞または非多能性幹細胞、多能性幹細胞または非多能性幹細胞、前駆細胞または非前駆細胞、分化細胞または非分化細胞などである。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞または細胞株（例えば、ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株）である。

いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞（例えば、ＲＵＥＳ２またはＨ９細胞）、成体幹細胞、及び多能性幹細胞である細胞から産生される。特定の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞（例えば、ＲＵＥＳ２またはＨ９細胞）、成体幹細胞、及び多能性幹細胞に由来するか、またはそれらから生成される分化細胞である。かかる分化細胞は、身体の任意の組織または器官の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞系療法に有用な任意の型である。

いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、上皮、結合、筋肉、もしくは神経組織または細胞、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、身体の任意の臓器または組織から産生される細胞から産生される。いくつかの事例では、細胞は、任意の真核生物（例えば、哺乳動物）器官系、例えば、心血管系（心臓、血管系）から；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、及び肛門）から；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副甲状腺、副腎）から；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）から；リンパ系（リンパ節、リンパ管、扁桃、腺様体、胸腺、脾臓）から；皮膚系（皮膚、髪、爪）から；筋肉系（例えば、骨格筋）から；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精巣、前立腺）から；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）から；骨格系（骨盤、軟骨）から；及びそれらの組み合わせからである。

いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、高度に有糸分裂する組織（例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩などの高度に有糸分裂する健常な組織）に由来する細胞から産生される。

いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、上皮、結合、筋肉、もしくは神経組織または細胞、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、身体の任意の器官または組織からの幹細胞である成体幹細胞から産生される。いくつかの事例では、本発明の組織適合性細胞は、任意の真核生物（例えば、哺乳動物）器官系、例えば、心血管系（心臓、血管系）から；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、及び肛門）から；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副甲状腺、副腎）から；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）から；リンパ系（リンパ節、リンパ管、扁桃、腺様体、胸腺、脾臓）から；皮膚系（皮膚、髪、爪）から；筋肉系（例えば、骨格筋）から；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精巣、前立腺）から；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）から；骨格系（骨盤、軟骨）から；及びそれらの組み合わせからの細胞から産生される。多くの実施形態では、多能性幹細胞は、本明細書に記載されるように、身体の特定の器官または組織に存在する２つ以上の特殊化された細胞型に自己再生及び発達（分化）する能力を有する細胞である。

いくつかの実施形態では、本発明の組織適合性細胞は、前駆細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成人前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯に形成される中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚幹細胞（例えば、ＲＵＥＳ２またはＨ９細胞）、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞前駆細胞、及び肝芽細胞である細胞から産生される。

Ｂ．組織適合性血液決定基の発現を修飾する方法
本明細書で提供されるのは、遺伝子修飾細胞を生成するために細胞内の核酸配列を修飾する方法である。このような修飾の例示的な技術には、相同組換え、ノックイン技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技法により、所望の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡ切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して、それに結合し、核酸分子の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに焦点を当てている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。

一実施形態では、細胞は、当技術分野で知られているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して操作される。ＣＲＩＳＰＲに基づく技法は多数存在し、例えば、Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは、市販されている。

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法論を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列と結合し、切断するように操作することができる、ヌクレアーゼと組み合わせた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。

いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して操作される。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の固有の配列を標的とすることができる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、高等生物のゲノムを正確に改変することができる。

当業者によって理解されるように、いくつかの異なる技術を使用して、細胞を血液組織適合性細胞、及びいくつかの実施形態では、本明細書に概説されるような低免疫原性であるように操作することができる。

１．ＡＢＯ遺伝子の遺伝子修飾
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集などのＲＮＡ干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用して、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型Ｏ細胞を産生する方法が提供される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９編集システムは、ＡＢＯ遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、表１、Ａ、Ｂ、及びＣのｇＲＮＡ標的配列のうちのいずれか１つが使用される。いくつかの事例では、表１、Ａ、Ｂ、及びＣの２つ以上のｇＲＮＡ標的配列が、遺伝子編集のために使用される。

いくつかの実施形態では、フレームシフト欠失、例えば、フレームシフト一塩基欠失は、遺伝子を不活性化するためにＡＢＯ遺伝子に導入される。いくつかの事例では、欠失は、Ｃａｓ９編集システム及び表１のガイドＲＮＡ標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＡＢＯ遺伝子のホモ接合性フレームシフト欠失を含む。いくつかの実施形態では、挿入欠失（インデル）は、エクソン１などのコードエクソンに導入される。いくつかの実施形態では、挿入欠失（インデル）は、エクソン２などのコードエクソンに導入される。いくつかの実施形態では、挿入欠失（インデル）は、エクソン８などのコードエクソンに導入される。いくつかの事例では、インデルは、Ｃａｓ９編集システム及び表１のガイドＲＮＡ標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＡＢＯ遺伝子のホモ接合性インデルを含む。

いくつかの実施形態では、挿入欠失は、遺伝子編集、例えば、相同性指向性修復（ＨＤＲ）によってＡＢＯ遺伝子のエクソン６に２５８ｄｅｌＧ変異を導入するために生成される。いくつかの事例では、ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧバリアントは、ＡＢＯ遺伝子にノックインされる。いくつかの実施形態では、特定のＡＢＯ Ｃａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のｇＲＮＡ標的配列及び２５８ｄｅｌＧ変異をコードするＨＤＲドナー鋳型を使用して、操作Ｏ型細胞を産生する。いくつかの実施形態では、表２のＡＢＯエクソン６－７ ｇＲＮＡ標的配列（ＡＢＯエクソン６－７ｇＲＮＡ １）及びドナー鋳型（ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧドナー鋳型ガイド１）が使用される。ドナー鋳型は、２５８ｄｅｌＧバリアント、及び逆鎖上のＰＡＭ部位を破壊するサイレント変異を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、２つの相同性アームを含み、各々は、約１０ｎｔ～１Ｋｂ（例えば、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、または５０ｎｔ～１Ｋｂ）の相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、表２のＡＢＯエクソン６－７ ｇＲＮＡ標的配列（ＡＢＯエクソン６－７ｇＲＮＡ ２）及びドナー鋳型（ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧドナー鋳型ガイド２）が使用される。ドナー鋳型には、２５８ｄｅｌＧバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにｇＲＮＡ配列に２つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、２つの相同性を含み、各々は、約１０ｎｔ～１Ｋｂ（例えば、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、または５０ｎｔ～１Ｋｂ）の相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、表２のＡＢＯエクソン６－７ ｇＲＮＡ標的配列（ＡＢＯエクソン６－７ｇＲＮＡ ３）及びドナー鋳型（ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧドナー鋳型ガイド３）が使用される。ドナー鋳型には、２５８ｄｅｌＧバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにｇＲＮＡ配列に２つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、２つの相同性アームを含み、各々は、約１０ｎｔ～１Ｋｂ（例えば、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、または５０ｎｔ～１Ｋｂ）の相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、表２のＡＢＯエクソン６－７ ｇＲＮＡ標的配列（ＡＢＯエクソン６－７ｇＲＮＡ ４）及びドナー鋳型（ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧドナー鋳型ガイド４）が使用される。ドナー鋳型には、２５８ｄｅｌＧバリアント及び修復ゲノム配列の継続的な編集を防ぐためにｇＲＮＡ配列に２つのミスマッチを導入するサイレント変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、２つの相同性アームを含み、各々は、約１０ｎｔ～１Ｋｂ（例えば、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、または５０ｎｔ～１Ｋｂ）の相同配列を含む。

いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＡＢＯ遺伝子のホモ接合２５８ｄｅｌＧ変異を含む。

２．ＲＨＤ遺伝子の遺伝子修飾
本明細書で提供されるのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルスベースの遺伝子編集システム、またはＲＮＡ干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してＲＨＤ遺伝子を遺伝子編集することによってＲｈ陰性細胞を産生する方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ＲＨＤ遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なＲＨＤ遺伝子産物を生成しない。ＲＨＤ遺伝子産物の不在下では、細胞は、Ｒｈ血液型抗原を完全に欠く。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９編集システムは、ＲＨＤ遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、表３、Ｄ、Ｅ、及びＦのｇＲＮＡ標的配列のうちのいずれか１つが使用される。いくつかの事例では、表３、Ｄ、Ｅ、及びＦの２つ以上のｇＲＮＡ標的配列が、遺伝子編集のために使用される。

いくつかの実施形態では、フレームシフト挿入欠失は、遺伝子の任意のコード配列に導入される。いくつかの実施形態では、遺伝子のＵＴＲ、イントロン、またはエクソン内の修飾が、ＲＨＤ遺伝子の機能を破壊するために追加される。いくつかの実施形態では、表３、Ｄ、Ｅ、及びＦのｇＲＮＡ標的配列のうちのいずれか１つ以上を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集が利用される。

いくつかの実施形態では、修飾は、遺伝子を不活性化するためにＲＨＤ遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１またはエクソン２などのコードエクソンが標的とされる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のコードエクソン４が標的とされる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のコードエクソン５が標的とされる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のコードエクソン６が標的とされる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のコードエクソン７が標的とされる。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子のコードエクソン８が標的とされる。いくつかの事例では、欠失は、Ｃａｓ９編集システム、及びＲＨＤ遺伝子の５’末端の配列を標的とするガイドＲＮＡ標的配列、及びエクソン８などのエクソンに対するガイドＲＮＡ標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、１つのｇＲＮＡ標的配列は、表３のＲＨＤ ５’ＵＴＲガイド１であり、１つのｇＲＮＡ標的配列は、表３のＲＨＤエクソン８ガイド１である。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＲＨＤ遺伝子のホモ接合性修飾を含み、それにより遺伝子を不活性化する。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、ＲＨＤ遺伝子のエクソン１またはエクソン２に対するものである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、フレームシフト変異を誘導して、エクソン１またはエクソン２を不活性化する表３のｇＲＮＡである。

３．ＦＵＴ１遺伝子の遺伝子修飾
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、他のウイルス系遺伝子編集システム、またはＲＮＡ干渉などであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを使用してＦＵＴ１遺伝子を編集することによって、任意の他の組織血液型細胞から組織血液型Ｏ細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ＦＵＴ１遺伝子のコード配列を標的とする。いくつかの事例では、細胞は、機能的なＦＵＴ１遺伝子産物を生成しない。ＦＵＴ１の非存在下では、細胞はＨ抗原を完全に欠き、ボンベイヒスト血液型（ｈｈ）を有する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９編集システムは、ＦＵＴ１遺伝子の配列を標的として、遺伝子に挿入または欠失を導入して、その機能を破壊し、場合によっては、それを不活化するために使用される。いくつかの実施形態では、単一のガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、表４、Ｇ、Ｈ、及びＩのｇＲＮＡ標的配列のうちのいずれか１つが使用される。いくつかの事例では、表４、Ｇ、Ｈ、及びＩの２つ以上のｇＲＮＡ標的配列が、遺伝子編集のために使用される。

いくつかの実施形態では、修飾は、遺伝子を不活性化するためにＦＵＴ１遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４などのコードエクソンが標的とされる。いくつかの事例では、欠失は、Ｃａｓ９編集システム及び表４のガイドＲＮＡ標的配列を使用して産生される。いくつかの実施形態では、操作組織適合性細胞は、ＦＵＴ１遺伝子のホモ接合性修飾を含み、それにより遺伝子を不活性化する。

いくつかの実施形態では、フレームシフト挿入欠失は、遺伝子の任意のコード配列に導入される。いくつかの実施形態では、遺伝子のＵＴＲ、イントロン、またはエクソン内の修飾が、ＦＵＴ１遺伝子の機能を破壊するために追加される。いくつかの実施形態では、表４、Ｇ、Ｈ、及びＩのｇＲＮＡ標的配列のうちのいずれか１つ以上を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集が使用される。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子修飾はＡＢＯ遺伝子の機能を破壊し、第２の遺伝子修飾はＲＨＤ遺伝子の機能を破壊する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子修飾はＦＵＴ１遺伝子の機能を破壊し、第２の遺伝子修飾はＲＨＤ遺伝子の機能を破壊する。

一般に、これらの方法は、個別に、または組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子修飾、ＣＩＩＴＡ遺伝子修飾、及びＣＤ４７導入遺伝子も含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍホモ接合ヌル遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡホモ接合ヌル遺伝子型を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４７を過剰発現する。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、Ｂ２Ｍ^-/-、ＣＩＩＴＡ^-/-、ＣＤ４７ ｔｇを含むがこれらに限定されない遺伝子修飾を保有する。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性幹細胞及び低免疫原性人工多能性幹細胞を含む低免疫原性細胞の生成において、ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ４７機能性をノックインするためのウイルス技法（例えば、レンチウイルス）を用いて、操作細胞における活性Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減するために使用され得る。また、当業者には理解されるように、Ｂ２ＭをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲステップ、続いて、ＣＤ４７機能をノックインするためのレンチウイルスの最終ステップでＣＩＩＴＡをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲステップを順次利用するが、これらの遺伝子は、異なる技術を使用して異なる順序で操作することができる。

Ｃ．低免疫原性細胞を生成するための追加の修飾
本明細書では、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を制御する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の修飾を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩの両方の発現は、本明細書に記載されるものなどの１つ以上の標的化ポリヌクレオチド配列によって制御される。

いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣ Ｉの発現を制御する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣ ＩＩの発現を制御す１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。いくつかの態様では、遺伝子編集システムを使用して、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を修飾する。いくつかの実施形態では、標的化ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される１つ以上である。ある特定の実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ発現の重要な構成要素を低下または欠失するように変更されている。

いくつかの態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は多能性を保持している。いくつかの実施形態では、幹細胞は、分化能を保持する。特定の態様では、本開示は、遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、１つ以上の遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞）またはその集団を提供する。ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩタンパク質の発現に対する効率的な干渉は、以下のうちの１つ以上によって達成され得る：（１）多型ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ）及びＭＨＣ－ＩＩ遺伝子を直接標的とすること、（２）すべてＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送を防止するＢ２Ｍの除去、及び／または（３）ＨＬＡ発現に重要であるＬＲＣ５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸ関連アンキリン含有タンパク質（ＲＦＸ－ＡＮＫ）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸ－ＡＰ）、ＩＲＦ１、ＮＦ－Ｙ、及びＣＩＩＴＡなどのＭＨＣエンハノソームの成分の欠失。

ある特定の実施形態では、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩの発現は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを標的化及び欠失し、それにより、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される標的遺伝子の発現を低下または排除することによって調節される。

いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉの発現は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを標的とし、欠失させることによって低減させ、それによってＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉの発現は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノム修飾によって低減または排除される。いくつかの事例では、ゲノム修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して実施される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５などであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５などであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を切断するためにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡなどであるがこれらに限定されない１つ以上の追加の標的ポリヌクレオチド配列を変更するためにそのような細胞のゲノムを編集することを含む。

いくつかの実施形態では、細胞はまた、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、及びＩＬ－３５からなる群から選択される１つの発現を増加させるための修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＷＯ２０１６／１８３０４１に記載されているように、ＨＬＡ発現に重要なＲＦＸ－５、ＲＦＸ関連アンキリン含有タンパク質（ＲＦＸ－ＡＮＫ）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸ－ＡＰ）、ＩＲＦ１、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、及びＣＩＩＴＡなどの１つ以上の遺伝子の発現を調節することによって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。追加の実施形態では、プロデューサー細胞へのさらなる修飾には、ＷＯ２０１６／１８３０４１に記載されているように、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＣＣＲ５、及び／またはＡＰＯＣ３などの１つ以上の遺伝子の発現を修飾することが含まれ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。

いくつかの実施形態では、細胞は、ＷＯ２０１８／２２７２８６に記載されているように、ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、及び／もしくはＳＥＲＰＩＮ Ｂ９などの１つ以上の導入遺伝子、またはＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、及び／もしくはＳＥＲＰＩＮ ９のアゴニストとして作用する生物製剤をコードする遺伝子の導入によって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、及びＣＤ４７を含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＤＬ－１及びＨＬＡ－Ｇを含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＤＬ－１及びＣＤ４７を含む導入遺伝子の導入によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＷＯ２０１８／２２７２８６に記載されているように、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／もしくはＩＦＮγＲ１ ｄ３９などの１つ以上の導入遺伝子、またはＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／もしくはＩＦＮγＲ１ ｄ３９のアゴニストとして作用する生物製剤をコードする遺伝子のさらなる導入によって生成され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、その中で概説された関連技術について組み込まれる。

いくつかの実施形態では、細胞は、細胞の死滅を引き起こすトリガーによって活性化される自殺遺伝子を細胞にさらに導入することによって生成される。一実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、トリガーは、ガンシクロビルである。別の実施形態では、自殺遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である。さらに別の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質であり、トリガーは、二量体化の特異的化学誘導因子（ＣＩＤ）である。

いくつかの事例ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムを使用して、ＡＡＶＳ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への低免疫因子などの低免疫因子の挿入を促進し、積極的に免疫拒絶を阻害する。いくつかの実施形態では、低免疫因子は、細胞の単一のセーフハーバー遺伝子座に挿入される。他の実施形態では、低免疫因子は、１つを超えるセーフハーバー遺伝子座に挿入される。いくつかの事例では、低免疫因子は、発現ベクター、例えば、レンチウイルス発現ベクターを使用してセーフハーバー遺伝子座に挿入される。

細胞の低免疫原性を決定するためのアッセイは、概して、本明細書及び参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１３２７８３に記載される。例えば、低免疫原性は、いくつかの技術を使用してアッセイされ得る。これらの技術には、同種異系宿主への投与、ならびに宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞応答のモニタリングが含まれる。Ｔ細胞機能は、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価され得る。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価され得る。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば、未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、低下したレベルの免疫原性を示す。いくつかの実施形態では、低減されたレベルは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍低減される。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞と比較して、マクロファージ食作用の低減、例えば、マクロファージ食作用の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の減少を促進し、マクロファージ食作用の低減は、食作用指数をインビトロでアッセイすることによって決定される。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、ＰＢＭＣによる細胞傷害媒介性細胞溶解の低減、例えば、細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減をもたらす。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、ＮＫ媒介性細胞溶解の低減、例えば、ＮＫ媒介性細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の減少をもたらし、ＮＫ媒介性細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによってインビトロでアッセイされる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞溶解の低減、例えば、ＣＤ８Ｔ細胞媒介細胞溶解の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減をもたらす。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及び／または活性化の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を誘導し、ＣＤ４Ｔ細胞増殖は、インビトロでアッセイされる（例えば、修飾または未修飾哺乳動物源細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓとの共培養アッセイ）。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の低減、例えば、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を引き起こし、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌は、例えば、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴによってインビトロでアッセイされる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、免疫原性サイトカインの分泌の低減、免疫原性サイトカインの分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を引き起こし、免疫原性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳｐｏｔを使用してインビトロでアッセイされる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、参照細胞、例えば未修飾細胞または免疫原性細胞と比較して、免疫抑制性サイトカインの分泌の増加、例えば、免疫抑制性サイトカインの分泌の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を誘導し、免疫抑制性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してインビトロでアッセイされる。

本明細書に記載される細胞は、免疫原性について評価することもできる。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。他の実施形態では、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とインキュベートし、次いでＰＢＭＣによる細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞とインキュベートし、次いでＮＫ細胞による細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とインキュベートし、次いでＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞の溶解について評価される。

１．ＣＩＩＴＡ
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、クラスＩＩトランスアクチベータ（ＣＩＩＴＡ）発現を標的化及び調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して生じ、ＣＩＩＴＡは、ＬＲまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと結合することによってＭＨＣ ＩＩの転写を調節する。

いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。

いくつかの態様では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録１（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１２）の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。

ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＣＩＩＴＡ遺伝子の結果として生じる遺伝子改変及びＨＬＡ－ＩＩ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。

２．Ｂ２Ｍ
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍの発現を標的化及び調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して生じ、Ｂ２Ｍの発現を調節する（例えば、低下または削除する）ことによって、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送が遮断され、細胞が低免疫原性になる。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。

いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はＢ２Ｍのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。

いくつかの態様では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子－ＨＬＡーＡ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＢ２Ｍ遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録２（ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１５）の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択される。

Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＢ２Ｍ遺伝子の結果として生じる遺伝子修飾及びＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。

３．ＮＬＲＣ５
ある特定の態様では、本明細書に開示される発明は、ＮＬＲファミリー、ＣＡＲＤドメイ含有５／ＮＯＤ２７／ＣＬＲ１６．１（ＮＬＲＣ５）の発現を標的化及び調節（例えば、低下または排除）することによって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して生じ、ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉを介した免疫応答の重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５はＩＩＦＮ－γによって高度に誘導され、核に移行することができる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－ＩならびにＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。

いくつかの実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチド配列はＮＬＲＣ５のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５の相同体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のオルソログである。

いくつかの態様では、ＮＬＲＣ５の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子－ＨＬＡーＡ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低下または排除する。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＮＬＲＣ５遺伝子を標的化する遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的化するための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、本明細書に提供される付録３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１４）の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低下している。

ＮＬＲＣ５遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＰＣＲによるＮＬＲＣ５遺伝子の結果として生じる遺伝子改変及びＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＮＬＲＣ５タンパク質発現は、ＮＬＲＣ５タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化遺伝子改変の存在を確認する。

４．ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ
いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を発現しないか、または低減した発現を示さない。いくつかの実施形態では、本発明の低免疫原性細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃを発現しないか、または低減した発現を示さない。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。

特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的ＨＬＡ－Ａ配列を改変するための方法であって、ＨＬＡ－Ａ配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ＨＬＡ－Ａポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的ＨＬＡ－Ａポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。

特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的ＨＬＡ－Ｂ配列を改変するための方法であって、ＨＬＡ－Ｂ配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ＨＬＡ－Ｂポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的ＨＬＡ－Ｂポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子が編集されてゲノムＤＮＡの連続したストレッチを欠失し、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチは、細胞またはその集団を、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることによって削除することができる。

特定の実施形態では、本開示は、細胞内の標的ＨＬＡ－Ｃ配列を改変するための方法であって、ＨＬＡ－Ｃ配列をクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピー関連（Ｃａｓ）タンパク質及び少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を標的ＨＬＡ－Ｃポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導され、ハイブリダイズされ、標的ＨＬＡ－Ｃポリヌクレオチド配列が、切断され、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸が、切断される、方法が提供される。

５．ＣＤ４７
いくつかの態様では、本明細書に開示される発明は、ＣＤ４７の発現を調節する（例えば、増加する）。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞ゲノムが修飾されてＣＤ４７を発現するゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４７を発現するように幹細胞ゲノムを改変するための方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸を利用して、幹細胞株へのＣＤ４７の挿入を容易にすることができる。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸は、本明細書に提供される付録４（ＷＯ２０１６１８３０４１の表２９）の配列番号２００７８４～２３１８８５からなる群から選択される。

Ｄ．遺伝子修飾の方法
本発明は、当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態では、本方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用することを含む。例えば、無効化されたＣａｓ９タンパク質を含むがこれに限定されない塩基編集システムを利用することができる。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列（例えば標的遺伝子）を改変することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を使用することができる（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できるようにするこのようなＣａｓタンパク質の分子機構としては、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの代替物を使用して、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる）などを含むがこれらに限定されない細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス１及びクラス２の２つの主要なクラスに分類することができ、さらに異なるタイプ及びサブタイプに分類される。ＣＲＩＳＰＲシステムの分類は、特定の核酸を切断することができるエフェクターＣａｓタンパク質に基づいている。クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムでは、エフェクターモジュールはマルチタンパク質複合体からなるが、クラス２システムでは１つのエフェクタータンパク質のみを使用する。クラス１ ＣＲＩＳＰＲには、タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶが含まれ、クラス２ ＣＲＩＳＰＲには、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩが含まれる。これらのタイプのＣＲＩＳＰＲシステムのいずれも本発明に従って使用することができるが、本発明に従って使用するのに好ましいＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込む３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ系が存在する：タイプＩ（Ｃａｓ３によって例示される）、ＩＩ（Ｃａｓ９によって例示される）、及びＩＩＩ（Ｃａｓ１０によって例示される）。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けされたシステムの１つである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＶシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＶＩシステムである。

本技術のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞において改変される望ましい標的ポリヌクレオチド配列が、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、さもなければ病原体の細胞への侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に理解するであろう。例えば、細胞内で変化することが望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する一塩基多型を含むゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。そのような例では、本技術のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞を野生型対立遺伝子で置き換えることにより、細胞内の疾患に関連するＳＮＰを修正することができる。別の例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、病原体が細胞に侵入し、細胞内で増殖するのを防ぐために標的遺伝子の機能を破壊するための欠失または挿入に適した標的であり得る。

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノム配列である。

いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに対してハイブリダイズすることができる少なくとも１つ～２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列）と、含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すために互換的に使用され、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化、など）及びアミノ酸類似体が含まれる。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、フラグメント及び他の同等物、バリアント、及び上記の類似体が含まれる。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、置換及び／または改変は、タンパク質分解を防止もしくは低下し、かつ／または細胞内のポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含むように改変を含むことができる。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、その相同体、またはその修正版が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプ（ＣＡＳＳ２としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、及びＣａｓ５ｅが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（ＣＡＳＳ３としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＣｓｙ４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（ＣＡＳＳ４としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質にはＣｓｎ１及びＣｓｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（ＣＡＳＳ１としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、及びＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（ＣＡＳＳ７としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質にはＣｓｈ１、Ｃｓｈ２、及びＣａｓ５ｈが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（ＣＡＳＳ５としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、及びＣａｓ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（ＣＡＳＳ６としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、及びＣｍｒ６が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７１，２１９－２２５（２０１９）、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５，４８－５３（２０１９）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質のいずれか１つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的ドメインは複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。

いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドに共役または融合させることができる。本明細書において使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」は、細胞中への分子の取り込みを促進するそれぞれポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有することができる。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電したタンパク質（例えば、正電荷、負電荷または全体として中性電荷を持つ）に共役または融合させることができる。そのような連結は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞に透過するＣａｓタンパク質の能力を有意に増加させるために正に超荷電した（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）ＧＦＰに融合させることができる（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞へのその進入を促進するためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させることができる。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたｍＲＮＡ（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）を含む。

Ｃａｓ９は、結合したガイドＲＮＡ内の２０ヌクレオチド配列（例えば、プロトスペーサー）に相補的な部位でのゲノム編集を媒介する。さらに、標的部位は、２０ヌクレオチド標的部位と隣接する３’末端にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでいなければならず、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９については、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を想定する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするセグメントを含む。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするセグメントを含み、本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。ｇＲＮＡ分子は、概して、標的化ドメイン及びｔｒａｃｒを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメイン及びｔｒａｃｒは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」などと呼ばれる単一の隣接するポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数の、通常は２つのポリヌクレオチド分子からなり、これらは自体は、通常、ハイブリダイゼーションを通じて会合することができ、本明細書では、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」、「２部ガイドＲＮＡ」などと称される。

標的部位のＰＡＭ末端（ガイドＲＮＡの３’末端）に隣接する７～１２塩基対において、ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの相補性が必要であり、非ＰＡＭ末端（ガイドＲＮＡの５’末端）においてミスマッチが許容されることが示唆されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントと標的ＤＮＡとの間に少なくとも１つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントと標的ＤＮＡとの間に少なくとも２つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントと標的ＤＮＡとの間に少なくとも３つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントと標的ＤＮＡとの間に少なくとも４つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントと標的ＤＮＡとの間に少なくとも５つのミスマッチがあり、いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つから２つのリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ）と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸配列と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸配列と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）によってコードされる。

本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸配列の使用を想定する。いくつかの実施形態では、単一のガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、デュアルガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のうちの少なくとも１つはｔｒａｃｒＲＮＡを含み、いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のうちの少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸配列は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズさせるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡである。

標的配列（例えば、プロトスペーサー）に特異的なガイドＲＮＡのリボ核酸配列は、ｃｒＲＮＡについてのチミンをウラシルで置き換え、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を追加することによって設計することができる。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の結合シグナルとして機能するＰＡＭ配列を含まない。標的配列から、標的配列に相補的なｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを設計することができる。ガイドＲＮＡ配列もまた、最小限のオフターゲティング結合及び切断で設計される。いくつかの事例では、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１，８２７－８３２に記載のものを含むオフターゲット予測方法及びアルゴリズムを利用して、ガイドＲＮＡ標的配列を評価する。本明細書で提供されるのは、表及び図のいずれかに開示されるｇＲＮＡ標的に対応するＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡである。

本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々は、標的モチーフ間に位置する変異体対立遺伝子に隣接するＣａｓタンパク質によって認識されたデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。

いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的ではなく、かつ／またはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフを相殺するために相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。

いくつかの実施形態では、ゲノム編集のための標的核酸配列は、プロトスペーサー隣接モチーフまたはプロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）と名付けられた特定の配列をその３’末端に有することができる。ＰＡＭは標的化核酸配列内に存在するが、それを標的とするために産生されるｃｒＲＮＡ内には存在しない。いくつかの実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、リーダー遠位端のプロトスペーサーのすぐ近くまたはその付近から始まる２～５ヌクレオチドに対応し得る。ＰＡＭの配列及び位置は、異なるシステム間で異なる。ＰＡＭモチーフの非限定的な例には、ＮＮＡＧＡＡ（配列番号９８）、ＮＡＧ、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ（配列番号９９）、ＡＷＧ、ＣＣ、ＣＣ、ＣＣＮ、ＴＣＮ、及びＴＴＣが含まれる。異なるタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、異なるＰＡＭ要件を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステムはＮＧＧ配列を必要とし、Ｎは任意のヌクレオチドである。いくつかの事例では、Ｃａｓ９タンパク質は、特定のＰＡＭモチーフを認識するように、または非天然のＰＡＭモチーフを認識するように操作することができる。いくつかの事例では、選択標的配列は、アミノ酸の任意の組み合わせとともに、より小さいまたはより大きなＰＡＭモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、選択された標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質またはそのバリアントによって認識される少なくとも３、好ましくは４、より好ましくは５ヌクレオチドを含む、ＰＡＭモチーフを含む。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）によってコードされる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。

本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例示的なｇＲＮＡ配列を表１に提供する。配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６／１８３０４１に見出すことができ、表、付属書、及び配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのさらなる開示は、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８６５，４０６号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，８７１，４４５号、同第８，９０６，６１６号、及び同第８，８９５，３０８号、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６３，８８－９１（２０１９）、Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１９）５１：１３０、ならびにＴａｃｈｉｂａｎａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１９；ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅｓ／２０１９／０９／ｂｅｙｏｎｄ－ｃｒｉｓｐｒ－ｗｈａｔ－ｓ－ｃｕｒｒｅｎｔ－ａｎｄ－ｕｐｃｏｍｉｎｇ－ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ）において提供され、図、図の凡例、及び方法の説明を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例示的なｇＲＮＡ配列を表５に提供する。配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１に見出すことができ、表、付属書、及び配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法論を使用して作製される。

「ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、典型的には転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えばＩ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ及びＦｏｋ－Ｉのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、切断ドメインの二量体化（例えばＦｏｋ－１）を得るために必須のヘテロ二量体形態の下で対によってＤＮＡに結合する必要があるため、特異的な試薬である。左右のヘテロ二量体メンバーはそれぞれ、約１４～２０ｂｐの異なる核酸配列を認識し、全体的な特異性は３０～５０ｂｐの標的配列にまたがる。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対スペーサー領域によって分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームは、ＦｏｋＩモノマーを近接させて二量体化し、標的化された二本鎖切断を生成する。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－Ｏｎｕｌまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、単量体ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載されているＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインと操作されたＴＡＬリピートの融合など、特定の認識及び切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的化配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な１２位及び１３位に２残基（ＲＶＤ）を含む。同様の塩基対塩基特異的核酸結合特性（ｍｏｄｕｌａｒ ｂａｓｅ－ｐｅｒ－ｂａｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（ＭＢＢＢＤ）を備えた結合ドメインは、異なる細菌種で本出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質からも誘導することができる。新しいモジュラータンパク質には、ＴＡＬリピートよりも多くの配列変動性を示すという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ及びＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴ及びＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、重要なアミノ酸１２及び１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対するそれらの特異性を調節するために、特にこの特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に対して変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。

いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的な方法で、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることがよくある。個々のＤＮＡ結合ドメインは、通常「フィンガー」と呼ばれる。ＺＦＰには、少なくとも１つのフィンガー、通常は２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、通常は３～４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。それぞれのフィンガーは通常、およそ３０アミノ酸、亜鉛キレート化、ＤＮＡ結合サブドメインを含む。研究は、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの２つのシステイン残基とともに、亜鉛と配位した２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることを実証した（例えば、Ｂｅｒｇ＆Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照）。

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野において周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼはＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖分解を生成させる。ホーミングエンドヌクレアーゼは非常に特異的であり、長さが１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲で、通常は長さが１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントであり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．及びＢ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは生細胞内の固有の部位を切断することができ、それによって切断部位の近くで遺伝子標的を１０００倍以上増強する（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、低免疫因子などのポリペプチドの発現をノックダウン（例えば、減少、排除、または阻害）するために、ＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法には、合成ＲＮＡｉ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用するもの、及び当技術分野で認められている他の一過性ノックダウン法が挙げられる。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉ用試薬は市販されている。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉ用試薬は市販されている。例えば、ＣＩＩＴＡ ｓｉＲＮＡを導入するか、ＣＩＩＴＡ ｓｈＲＮＡ発現ウイルスを細胞に導入することにより、ＣＩＩＴＡを多能性幹細胞でノックダウンすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＡＢＯ、ＲＨＤ、及びＦＵＴ１からなる群から選択される少なくとも１つの発現を低下または阻害するために使用される。

いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように、改変されたｍＲＮＡ（例えば、合成の改変されたｍＲＮＡ）を含む。

核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、及びＺＦＮシステムなど、本明細書で使用される遺伝子編集システムは、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染を含むがこれらに限定されない任意の好適な技術によって細胞内に送達することができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子編集システムは、エレクトロポレーションによって細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、流動エレクトロポレーションシステムであり、本発明のいくつかの実施形態での使用に適した好適な流動エレクトロポレーションシステムの例は、市販のＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸシステムであり、ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ／Ａｍａｘａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（ＢＩＯＲＡＤ）、ｉＰｏｒａｔｏｒ－９６（Ｐｒｉｍａｘ）、またはｓｉＰＯＲＴｅｒ９６（Ａｍｂｉｏｎ）から入手可能なＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅシステムまたはＥＣＭ８３０などの、本発明での使用に好適であり得る市販の代替的なエレクトロポレーション機器がいくつか存在する。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、細胞のための閉鎖的な無菌システムを形成する。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載されるように、パルス状のエレクトロポレーションシステムであり、細胞のために閉鎖的な無菌システムを形成する。

Ｅ．寛容原性因子の過剰発現
本明細書に記載のすべての技術について、周知の組換え技術を使用して組換え核酸を生成することができる。特定の態様では、寛容原性因子の過剰発現は、発現構築物内の制御性配列を利用して達成される。ある特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療される宿主細胞及びレシピエントに適切である。様々な宿主細胞について、多くの種類の適切な発現ベクター及び好適な制御性配列が当技術分野において知られており、本明細書に開示されている技術と互換性がある。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。当技術分野において既知である構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、または発現構築物は染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための制御性配列としては、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素が含まれる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現されることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び／または抗生物質マーカーなどの、コードされる他のタンパク質の発現の選択のために設計される。

好適な乳動物プロモーターの例には、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター：伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピート領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが含まれる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン、または熱ショックプロモーターである。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞で使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片として便利に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

本明細書に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔法、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。

一旦変更されると、本明細書に記載の分子のいずれかの発現の存在は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイなどの既知の技術を使用してアッセイすることができる。

Ｆ．低免疫原性表現型及び多能性の保持のためのアッセイ
低免疫原性細胞が生成されたら、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているように、それらの低免疫原性及び／または多能性の保持についてアッセイすることができる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示されるようないくつかの技術を使用してアッセイされる。これらの技術には、同種異系宿主への移植及び宿主の免疫系から逃れる低免疫原性の多能性細胞増殖（例えば、奇形腫）のモニタリングが含まれる。場合によっては、低免疫原性の多能性細胞誘導体は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、その後、生物発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、そのような細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞応答を試験して、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。Ｔ細胞機能は、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価される。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。追加的または代替的に、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び図１５に一般的に示されているように、細胞は、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞死滅を回避するそれらの能力についてアッセイされ得る。

いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、当業者に認められているＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＴ細胞死滅アッセイなどのＴ細胞イムノアッセイを使用して評価される。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖アッセイは、細胞をインターフェロン－ガンマで前処理し、細胞を標識Ｔ細胞と共培養し、事前に選択した時間後にＴ細胞集団（または増殖Ｔ細胞集団）の存在をアッセイすることを含む。いくつかの場合には、Ｔ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞を本明細書に概説される細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することを含む。

本明細書に概説される細胞の免疫原性を評価するために、インビボアッセイを実行することができる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生存及び免疫原性は、同種異系のヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。場合によっては、低免疫原性多能性幹細胞を同種異系のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植し、細胞拒絶反応、細胞生存率、及び奇形腫形成についてアッセイされる。場合によっては、移植された低免疫原性多能性幹細胞またはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。

細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、図、図表の凡例、及び方法の説明を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

同様に、多能性の保持はいくつかの方法で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書に一般的に記載され、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２９に示されるような特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加的または代替的に、多能性細胞は、多能性の指標として１つ以上の細胞型に分化する。

当業者によって理解されるように、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の成功した減少は、当技術分野において既知である以下の技術、例えば、ヒト主要組織適合遺伝子ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用する、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用するＦＡＣＳ技術を使用して測定することができる。

さらに、細胞を試験して、ＨＬＡＩ複合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。これは、上記のように、１つ以上のＨＬＡ細胞表面成分に対する抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。

多能性細胞またはその誘導体におけるＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などの当技術分野で知られている技術を使用して測定することができる。

さらに、細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。この場合も、このアッセイは当技術分野で知られているように行われ（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照）、一般に、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づくウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。

ＨＬＡ Ｉ及びＩＩ（またはＭＨＣ Ｉ及びＩＩ）の低下に加えて、本発明の低免疫原性細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞死滅に対する低下した感受性を有する。結果として生じる低免疫原性細胞は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子の発現により、免疫マクロファージ及び自然免疫経路を「回避する」。

Ｇ．低免疫原性多能性幹細胞の維持
低免疫原性多能性幹細胞が生成されると、ｉＰＳＣ細胞の維持で知られているように、それらは未分化状態を維持することができる。例えば、細胞は、分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用して、マトリゲル上で培養することができる。さらに、それらは多能性を維持するための条件下で培地に入れることができる。多能性幹細胞を培養するための方法は当技術分野で認識されており、例えば、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されている。

Ｈ．低免疫原性多能性幹細胞の分化
本発明は、対象へのその後の移植のために異なる細胞型に分化する低免疫原性多能性細胞を提供する。当業者によって理解されるように、既知の方法を使用する分化のための方法は、所望のタイプの細胞に依存する。細胞は懸濁状態で分化し、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン／トロンビン形態などのゲルマトリックス形態になり、細胞の生存を容易にすることができる。いくつかの場合には、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野において既知であるようにアッセイすることができる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、肝臓細胞機能の喪失または肝硬変に対処するために肝臓細胞に分化される。低免疫原性多能性細胞を肝臓細胞に分化させるために使用することができる技法がいくつかある。例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）及びＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）（すべては参照によりそれら全体が、具体的には分化のための方法論及び試薬について本明細書に組み込まれる）を参照されたい。分化は、一般に、アルブミン、アルファフェトプロテイン、及びフィブリノーゲンが挙げられるが、これらに限定されない肝細胞関連及び／または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、アンモニアの代謝、ＬＤＬの貯蔵及び取り込み、ＩＣＧの取り込み及び放出、ならびにグリコーゲンの貯蔵など、機能的に測定することもできる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植のために、ベータ様細胞または膵島オルガノイドに分化される。細胞システムは、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法である。例えば、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、Ｐａｇｌｉｕｃａらは、ヒトｉＰＳＣからのβ細胞の分化の成功について報告している（ｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生のためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｖｅｇａｓらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生、それに続く宿主による免疫拒絶を回避するためのカプセル化を示す（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生するためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）。

分化は、一般に、インスリンが挙げられるが、これに限定されないβ細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化は、グルコース代謝を測定するなど、機能的に測定することもできる。一般に、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２（その全体が、具体的にはそこで概説されているバイオマーカーについて本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、眼の視力を脅かす疾患に対処するために、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化される。ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その全体が、具体的には分化技法及び試薬のためのそこで概説されている方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）で概説されている技法を使用して、ＲＰＥ細胞に分化されている。Ｍａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８（またＲＰＥ細胞のシートの生成及び患者への移植のための技法について、その全体が組み込まれる）も参照されたい。

分化は、一般に、ＲＰＥ細胞関連及び／または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７（その全体が、具体的には結果セクションの最初の段落で概説されているマーカーについて、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、心血管疾患に対処するために心筋細胞に分化される。低免疫原性誘導多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための技法は、当技術分野で知られており、実施例で論じられている。分化は、当技術分野で知られているように、一般に心筋細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによってアッセイすることができる。例えば、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１（その全体が、具体的には心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法について、参照に本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するための新しい血管を形成するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化される。内皮細胞を分化させる技術が知られている。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から内皮細胞を生成するための方法及び試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照されたい。分化は、一般に、内皮細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。

いくつかの実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌することができる、甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞性器官に分化される。甲状腺細胞を分化させる技術は、当技術分野において既知である。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から甲状腺細胞を生成するための方法及び試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ ２０１５．０９．００４を参照されたい。分化は、一般に、甲状腺細胞関連または特定のマーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。

低免疫原性多能性細胞を分化させるための方法の追加の説明は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に見出すことができる。

Ｉ．治療法
当業者によって理解されるように、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞型及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野において既知の技術を使用して移植することができる。一般に、本発明の細胞は、静脈内に、または患者の特定の位置に注射することのいずれかで移植することができる。特定の位置に移植する場合、細胞をゲルマトリックスに懸濁して、細胞が保持されている間の分散を防ぐことができる。

いくつかの実施形態において、細胞またはその薬学的組成物は、対象に全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）または局所的に投与される。いくつかの実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、細胞が肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、対象に投与される。いくつかの実施形態（例えば、対象が自己免疫疾患を有する）では、細胞またはその薬学的組成物は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリン調節剤と共投与される。いくつかの実施形態（例えば、対象ががんまたは感染性疾患を有する）では、細胞またはその薬学的組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。

いくつかの実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、組織または臓器、例えば、ヒトの組織または臓器にエクスビボで送達される。いくつかの実施形態では、組成物は、傷害状態にある（例えば、外傷、疾患、低酸素、虚血または他の損傷からの）エクスビボ組織に送達される。

他の実施形態では、細胞またはその薬学的組成物は、インビボで、すなわちヒトまたは哺乳動物に対して使用される。ヒトに加えて、本明細書に記載される組成物は、農場または作業動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリなど）、及びペットまたは動物園動物（例えば、ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、クマなど）を含むがこれらに限定されない、様々な他の生物の細胞もしくは組織の機能または生理学を同様に調節するためにも使用され得る

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるユニバーサルＯ型陰性細胞は、ＡＢＯ血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ、またはＯであると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルＯ型陰性細胞は、Ｒｈ因子陽性またはＲｈ因子陰性であると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルＯ型陰性細胞は、ＡＢＯ血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ、またはＯであり、かつＲｈ因子陽性であると決定されたレシピエント対象に投与される。特定の実施形態では、ユニバーサルＯ型陰性細胞は、ＡＢＯ血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ、またはＯであり、かつＲｈ因子陰性であると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるボンベイ表現型細胞は、ＡＢＯ血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ、またはＯであると決定されたレシピエント対象に投与される。いくつかの実施形態では、ボンベイ表現型細胞は、ボンベイ表現型を有すると決定されたレシピエント対象に投与される。

いくつかの実施形態では、細胞は、対象の免疫系によって標的とされない。

いくつかの実施形態では、記載される細胞は、単独で投与されるか、または薬学的組成物として製剤化される。薬学的組成物の投与は、経皮または非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、及び皮下を含む）投与によるものであり得る。特定の事例では、投与は、ボーラスまたは連続灌流によるものをさらに含む。

いくつかの実施形態では、細胞またはその組成物は、レシピエント対象に、追加の薬剤、例えば、治療剤と共投与される。いくつかの実施形態では、共投与される治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、またはイムノフィリン調節剤（例えば、シクロスポリンまたはラパマイシン）である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、細胞の免疫媒介性クリアランスを減少させる。いくつかの実施形態では、細胞またはその組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと共投与される。

いくつかの実施形態では、治療有効量の細胞またはその組成物が投与され、疾患を治療する。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、薬学的に許容される担体と投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞に由来する分化細胞を含む、本明細書に記載の細胞のいずれか１つである。

ＩＶ．実施例
実施例１：ユニバーサル組織血液型細胞工学
Ａ．細胞培養
Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１８９５）を得て、ＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３３４９４０１）で培養し、０．５μｇ／ｃｍ²のＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３１８０４））コーティングプレートまたはフラスコで増殖させた。細胞を約９０～９５％ コンフルエントに達したときに継代した。継代のために、細胞を最初にＤＰＢＳ－／－（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１４１９０２５０）で２回洗浄する。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１１０５０１）を添加し、細胞を３７℃で５分間、またはプレートもしくはフラスコをゆっくりと揺動させることによって細胞が脱離するまでインキュベートした。単一細胞懸濁を容易にするために細胞を厳密に再懸濁し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１３３００５７）で洗浄した後、２５０ｇで３分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットをＳｔｅｍＦｌｅｘ培地＋１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－５４５－０）中に再懸濁した。次いで、細胞をカウントし、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地＋１０ｕＭ Ｙ－２７６３２中の新しいＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコーティングプレートまたはフラスコに適切な密度で播種した。翌日、培地をＳｔｅｍＦｌｅｘ培地からＹ－２７６３２を除いたものに交換し、細胞が９０～９５％コンフルエントに達するまで２日ごとに交換した。

Ｂ．ガイドＲＮＡ及びＨＤＲ鋳型設計
ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１についての合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＥＮＳＥＭＢＬ：ＡＢＯ（ＥＮＳＧ０００００１７５１６４）、ＲＨＤ（ＥＮＳＧ０００００１８７０１０）、及びＦＵＴ１（ＥＮＳＧ０００００１７４９５１）からのゲノム配列を用いたＢｅｎｃｈｌｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎツールを使用して設計した。ＡＢＯでは、エクソン６／７を標的とする３つのｇＲＮＡ配列を、ｃ．２５８ｄｅｌＧをコードする相同性修復（ＨＤＲ）鋳型ならびに上流及び下流の相同配列の１００塩基と組み合わせて使用した。エクソン６－７ ｇＲＮＡ１標的（５’－ＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧ－３’；配列番号２４）に向けられたガイドＲＮＡは、一本鎖修復鋳型１（５’－ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＴＧ－３’；配列番号２５）と対となる。エクソン６－７ ｇＲＮＡ２標的（５’－ＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴ－３’；配列番号２６）に向けられたガイドＲＮＡは、一本鎖修復鋳型２（５’－ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＡＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＴＧ－３’；配列番号２７）と対となる。エクソン６－７ ｇＲＮＡ３標的（５’－ＡＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＡＴ－３’；配列番号２８）に向けられたガイドＲＮＡは、一本鎖修復鋳型３（５’－ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＴＧ－３’；配列番号２９）と対となる。あるいは、エクソン１ ｇＲＮＡ標的（５’－ＧＧＣＣＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴ－３’；配列番号３０）に向けられたガイドＲＮＡ、またはエクソン２ ｇＲＮＡ標的（５’－ＧＧＡＴＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧ－３’；配列番号３１）に向けられたガイドＲＮＡを使用して、初期コドンのエクソン１及び２に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。ＲＨＤでは、エクソン２標的配列（５’－ＣＡＣＣＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＧ－３’；配列番号３２）及びエクソン３標的配列（５’－ＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡ－３’；配列番号３３）を標的とする２つのｇＲＮＡ配列を使用して、初期コドンエキソン１及び２にＤＳＢを導入する。あるいは、５’ＵＴＲ標的配列（５’－ＴＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＡ－３’；配列番号３４）を標的とするｇＲＮＡを、エクソン８（５’－ＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＡＣ－３’；配列番号３５）を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて使用して、遺伝子のコード配列全体をゲノムから削除する。ＦＵＴ１では、エクソン４（唯一のコードエクソン）を標的とする２つのｇＲＮＡ配列には、エクソン４ ｇＲＮＡ１標的（５’ＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＧＡＣ－３’；配列番号３６）に向けられたガイドＲＮＡ、及びエクソン４ ｇＲＮＡ２標的（５’－ＧＡＴＴＡＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＴＴＧ－３’；配列番号３７）に向けられたガイドＲＮＡが含まれ、使用され、ＤＳＢを遺伝子のコード配列に誘導する。

Ｃ．細胞工学
ＡＢＯまたはＦＵＴ１のいずれかを標的とするｇＲＮＡを、ヌクレアーゼ非含有水中で室温で１５分間、Ａｌｄｅｖｒｏｎから入手した組換えＳｐｙＦｉ Ｃａｓ９タンパク質と複合体化した。細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ細胞脱離溶液を使用してＳＴＥＭＦＬＥＸ及びビトロネクチンで採取し、Ｌｏｎｚａ ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ緩衝液Ｐ３＋ＲＮＰ複合体中でペレット化して再懸濁し、Ｌｏｎｚａ ＮＵＣＬＥＯＣＵＶＥＴＴＥ容器に移した。細胞を、ＣＡ－１３７プログラムを使用してＬｏｎｚａ ４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲコアユニットでエレクトロポレーションし、ＣＬＯＮＥＲ補充剤を含むＳＴＥＭＦＬＥＸ培地で補充した。細胞を、ＣＬＯＮＥＲ補充剤を伴うＳＴＥＭＦＬＥＸ培地を含む２４ウェルプレートの２つのビトロネクチンコーティングウェルに移した。細胞を増殖させ、次いで、ＲＨＤ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体で再びエレクトロポレーションした。細胞をＡ抗原及びＲｈ抗原に対する抗体で染色し、陰性細胞集団をＦＡＣＳによって９６ウェルプレートの単一ウェルに選別した。次いで、個々のクローンを再度染色して、細胞がＯ型Ｒｈ陰性またはボンベイ型Ｒｈ陰性であることを確認し、これはゲノム解析によって確認した。

Ｄ．ＡＢＯ、ＲＨＤ、及びＦＵＴ１遺伝子編集を特徴付けるためのゲノミクスアッセイ
これらの部位に特異的なプライマーを使用して、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１の標的領域を含むアンプリコンを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ配列決定プラットフォームを使用して配列を配列決定した。結果をヒトゲノムに整列させ、挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）について分析した。

Ｅ．ＡＢＯ、ＲＨＤ、及びＦＵＴ１遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を特徴付けるための表現型アッセイ
遺伝子編集細胞の単一細胞クローニングは、Ｈａｎａ単一細胞ディスペンサー（Ｎａｍｏｃｅｌｌ）を使用して９６ウェルプレートで実施した。ＣＥＬＩＧＯイメージングサイオメータ（Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用して、単一細胞の沈着確認及びクローン細胞の増殖をモニタリングした。単一細胞クローンを継代し、以下の３つのコホートに拡大した：１．細胞維持及び細胞バンキング；２．次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によるゲノム特性評価；及び３．表現型の特徴付け。

Ｆ．免疫蛍光による表現型の特徴付け

細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。次いで細胞を洗浄し、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ－２０中の５％ロバ血清中で、室温で１５分間遮断した。一次抗体を適用する前に、細胞をＰＢＳ中で３回濯いだ。抗体を、上記表６の指定された希釈に従って、遮断緩衝液（５％ロバ血清／ＰＢＳ）中で４℃で一晩希釈した。次いで、細胞をＰＢＳで３回濯ぎ、Ａｌｅｘａ－４８８及びＡｌｅｘａ－６４７複合抗体をＰＢＳで１：５００に希釈し、室温で３０分間細胞に添加した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８と複合した抗体を一晩インキュベートし、二次抗体を必要としない。細胞を３回洗浄し、ＨｏｅｃｈｓｔをＰＢＳ中で希釈し、細胞に添加した。細胞は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５細胞イメージングリーダーでイメージングするために調整した。野生型（ＷＴ）細胞は、ワークフローを通して維持し、遺伝子ＫＯは、ＷＴ細胞発現レベルに対して確認した。

Ｇ．ＡＢＯ、ＲＨＤ、及びＦＵＴ１のノックアウトを検証するための機能アッセイ
Ｏ陰性個体からのヒト血清を、ベンダーから入手した。補体媒介細胞殺傷アッセイを、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＳＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。９６ウェルＥプレート（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）をコラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングし、ユニバーサルＯ型Ｒｈ陰性またはボンベイ型Ｒｈ陰性ｉＰＳＣを、１００μｌの細胞特異的培地にプレーティングした。細胞指数値が０．７に達した後、ヒトＯ陰性血清を添加した。陰性対照として、加熱不活化血清を使用した。データを標準化し、ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ）で分析する。

実施例２：Ｂ陽性細胞であるＲＵＥＳ２胚性幹細胞の分化
ヒトＲＵＥＳ２胚性幹細胞（Ｌａｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５（３）：３３２－３４２（２００９）；ｈＰＳＣＲｅｇ ＩＤ：ＲＵＥＳｅ００２－Ａ）を心筋細胞様細胞に分化させた。得られたＲＵＥＳ２由来細胞は、リアルタイム細胞分析アッセイ（ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（登録商標）；図１８）で測定した際に、血液型Ｂマカク血清とインキュベートした場合は生存したが、ヒト血液型Ｏ血清またはブタ血液型Ａ血清とインキュベートした場合は細胞が死滅した。この結果は、ＲＵＥＳ２及びそれに由来する分化心筋細胞がＢ型血液型であることを示す。

さらに、未分化ＲＵＥＳ２細胞を、血液型（例えば、Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓ．１５（４）：２７４－２７８（２００１６）を参照されたい）及びＲｈ状態についてのＰＣＲアッセイによって特徴付けした。具体的には、Ｒｈ Ｄ及びＲｈ ＣｃＥｅのエクソン４及びエクソン５の配列をそれぞれ認識する対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、Ｒｈ Ｄ表現型細胞のゲノムＤＮＡに対して使用した。９９℃で５分間の変性の最初のサイクルの後、９５℃で１分間の変性、５５℃で１．５分間のプライマーアニーリング、及び７２℃で２．５分の伸長からなる３５サイクルを実施し、７２℃で９分間の最終サイクルが続いた。Ｒｈ ＣｃＥｅ遺伝子は、Ｒｈ Ｄ遺伝子ではエクソン４と５との間のイントロン４に欠失があり、ＣｃＥｅ遺伝子から得られるＤＮＡ断片よりも６００ｂｐ小さいＤＮＡ断片が生じるため、ＲｈＤ遺伝子と区別される。プライマーＡ９及びＡ６では、約１２００ｂｐのＰＣＲ産物はＣｃＥｅ遺伝子に由来したが、ＲｈＤ遺伝子に由来する約６００ｂｐのより小さいＰＣＲ産物は、ドナーがＤ陰性であった場合に欠損していた。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上でサイズ分離し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射により可視化した。その結果、ＲＵＥＳ２細胞はＢ型であり、かつＲｈ陽性であることを確認した。

例示的なオリゴヌクレオチドプライマー配列：
Ａ６．５’ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴ ３’（アンチセンス）（配列番号２１）
Ａ９．５’ＡＣＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴ ３’（センス）（配列番号２２）

ＰＣＲアッセイを使用して細胞のＲｈ状態を決定するためのさらなる技術は、例えば、Ｓｉｍｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９５，８５（１０），２９７５－２９８０、及びＡｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９３，８２（６５１）に記載されており、図、図の凡例、及び方法の説明を含む開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例３：ヒトＡＢＯ遺伝子のゲノム
ヒトエピソームｉＰＳＣ（Ｇｉｂｃｏ）は、血液型Ａ陽性である。細胞を、ＡＢＯ遺伝子内でインデルを作製することによってＯ陽性に編集した。ガイドＲＮＡ ＵＣＵＣＵＣＣＡＵＧＵＧＣＡＧＵＡＧＧＡ（配列番号１７）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｓｐ）ａｓ９と複合体化し、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次いで、ＲＮＰをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に２日間回収した。ＡＢＯ遺伝子の編集は、編集部位のＰＣＲ増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。

編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、２つのホモ接合性ＡＢＯ ＫＯクローンを選択した。選択した２つのクローンは、＋１インデル及び＋２インデルであった。得られた細胞は、血液型Ｏ陽性であると機能的にアッセイされた。

実施例４：Ａ＋からＯ＋へのヒトｉＰＳＣのゲノム修飾
ヒトエピソームｉＰＳＣ（Ｇｉｂｃｏ）を、相同性指向修復（ＨＤＲ）によるエクソン６のＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧ変異の導入によって、Ａ陽性（Ａ＋）からＯ陽性（Ｏ＋）に編集した。ガイドＲＮＡ ＣＡＧＵＡＧＧＡＡＧＧＡＵＧＵＣＣＵＣＧ（配列番号１８）を、ｓｐ Ｃａｓ９と複合体化し、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次いで、ＲＮＰ及びドナー鋳型（以下）をエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に２日間回収した。ＡＢＯ遺伝子の編集は、編集部位のＰＣＲ増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。

ドナー鋳型：ＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号１９）。

編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、２つのホモ接合性ＡＢＯ ２５８ｄｅｌＧ変異クローンを選択した。得られた細胞は、血液型Ｏ陽性であると機能的にアッセイされた。

実施例５：ヒトＦＵＴ１遺伝子のゲノム
ヒトエピソームｉＰＳＣ（Ｇｉｂｃｏ）を、ＦＵＴ１遺伝子におけるインデルの作製によって、Ａ陽性からボンベイ表現型、Ｒｈ陽性に編集した。ガイドＲＮＡ ＣＵＧＧＡＵＧＵＣＧＧＡＧＧＡＧＵＡＣＧ（配列番号２３）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｓｐ）Ｃａｓ９と複合体化し、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次いで、ＲＮＰをエレクトロポレーションを介して細胞に送達した。次いで、細胞を、編集の評価の前に２日間回収した。ＦＵＴ１遺伝子の編集は、編集部位のＰＣＲ増幅及びアンプリコンのサンガー配列決定によって評価した。

編集したプールを使用して、単一細胞希釈によるクローン性増殖のために単一細胞を播種した。得られたクローンを、サンガー配列決定を使用して検証し、２つのホモ接合性ＦＵＴ１ ＫＯクローンを選択した。得られた細胞は、ボンベイ表現型、Ｒｈ陽性であると機能的にアッセイされた。

すべての見出し及び節の表記は、明確さ及び参照目的のために使用されているにすぎず、決して限定するものとみなされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って、必要に応じて異なる見出し及び節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。

本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれているかのように具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。

当業者に明らかであるように、本出願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正及び変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (174)

1. 単離細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化され、ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
2. 前記ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１に記載の細胞。
3. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１または２に記載の細胞。
4. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞。
5. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む、請求項３に記載の細胞。
6. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、組織血液型Ｏ細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１または２に記載の細胞。
7. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、請求項１に記載の細胞。
8. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項７に記載の細胞。
9. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む前記ＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１及び７～８のいずれか１項に記載の細胞。
10. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、前記細胞が、組織血液型Ｏ細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１及び７～９のいずれか１項に記載の細胞。
11. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞。
12. 前記有害な変異が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失を含み、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項１１に記載の細胞。
13. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１１に記載の細胞。
14. 前記ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞。
15. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、アカゲザル因子（Ｒｈ）陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞。
16. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の細胞。
17. 単離細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
18. 前記細胞が、Ｒｈ陰性細胞である、請求項１７に記載の細胞。
19. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１７または１８に記載の細胞。
20. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞。
21. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞。
22. 前記ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の細胞。
23. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の細胞。
24. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、請求項１７に記載の細胞。
25. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項２４に記載の細胞。
26. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む前記ＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１７及び２４～２５のいずれか１項に記載の細胞。
27. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、前記細胞が、Ｏ型陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項１７及び２４～２６のいずれか１項に記載の細胞。
28. 単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化され、ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
29. 前記ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項２８に記載の細胞。
30. 前記ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項２８または２９に記載の細胞。
31. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の細胞。
32. 前記有害な変異が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の細胞。
33. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ボンベイ表現型を有するようなホモ接合変異である、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の細胞。
34. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つ以上を含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の細胞。
35. 前記有害な変異が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、請求項２８または３４に記載の細胞。
36. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項２８または３４に記載の細胞。
37. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、アカゲザル因子（Ｒｈ）陰性であるようなホモ接合変異である、請求項２８～３６のいずれか１項に記載の細胞。
38. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ボンベイ表現型を有し、かつＲｈ陰性であるようなホモ接合変異である、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の細胞。
39. 単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
40. 前記細胞が、Ｒｈ陰性細胞である、請求項３９に記載の細胞。
41. 前記ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項３９または４０に記載の細胞。
42. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の細胞。
43. 前記有害な変異が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失を含み、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の細胞。
44. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、ユニバーサルボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の細胞。
45. 単離細胞であって、ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
46. 前記細胞が、Ｏ型またはボンベイ表現型を有する、請求項４５に記載の細胞。
47. 前記ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項４５または４６に記載の細胞。
48. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項４５に記載の細胞。
49. 前記有害な変異が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の細胞。
50. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の細胞。
51. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、前記細胞が、Ｏ型陰性細胞またはボンベイ陰性細胞であるようなホモ接合変異である、請求項４５～５０のいずれか１項に記載の細胞。
52. 単離細胞であって、ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくは前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
53. 前記ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項５２に記載の単離細胞。
54. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項５２または５３に記載の細胞。
55. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の細胞。
56. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の細胞。
57. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の細胞。
58. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、請求項５２または５３に記載の細胞。
59. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項５８に記載の細胞。
60. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む前記ＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項５２～５３及び５８～５９のいずれか１項に記載の細胞。
61. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、ホモ接合変異である、請求項５２～５３及び５８～６０のいずれか１項に記載の細胞。
62. 単離細胞であって、ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
63. 前記ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項６２に記載の単離細胞。
64. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つ以上を含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項６２または６３に記載の細胞。
65. 前記有害な変異が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の細胞。
66. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の細胞。
67. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項６２～６６のいずれか１項に記載の細胞。
68. 単離細胞であって、ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される、前記単離細胞。
69. 前記ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項６８に記載の単離細胞。
70. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項６８または６９に記載の細胞。
71. 前記有害な変異が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の細胞。
72. ＲＨＤ遺伝子の有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項６８～７１のいずれか１項に記載の細胞。
73. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１～７２のいずれか１項に記載の細胞。
74. 前記細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の細胞。
75. ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の細胞。
76. Ｂ２Ｍ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項７４または７５に記載の細胞。
77. ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の細胞。
78. ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の細胞。
79. 前記Ｂ２Ｍ及び前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む、請求項７４～７８のいずれか１項に記載の細胞。
80. 請求項１～７４のいずれか１項に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
81. 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１～７４のいずれか１項に記載の細胞を前記患者に投与することを含む、前記方法。
82. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
    （ａ）単離細胞を取得することと、
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
    （ｃ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
83. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３からなる群から選択される１つを含む、請求項８２に記載の方法。
84. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項８２または８３に記載の方法。
85. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項８４に記載の方法。
86. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項８４に記載の方法。
87. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
    （ａ）単離細胞を取得することと、
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ならびに配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、前記導入することと、
    （ｃ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
88. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
89. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、前記ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む、請求項８７または８８に記載の方法。
90. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
91. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項９０に記載の方法。
92. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項９０に記載の方法。
93. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
    （ａ）単離細胞を取得することと、
    （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
    （ｃ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
94. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項９３に記載の方法。
95. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項９３に記載の方法。
96. （ｉ）表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項９３～９５のいずれか１項に記載の方法。
97. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３を含む、請求項９６に記載の方法。
98. （ｉ）配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、前記導入することと、（ｉｉ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項９３～９７のいずれか１項に記載の方法。
99. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項９８に記載の方法。
100. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、前記ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む、請求項９８または９９に記載の方法。
101. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
     （ａ）単離細胞を取得することと、
     （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むＦＵＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
     （ｃ）前記ＦＵＴ１遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
102. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１３または配列番号１４を含む、請求項１０１に記載の方法。
103. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
104. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１０３に記載の方法。
105. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１２を含む、請求項１０３に記載の方法。
106. 前記単離細胞が、単離ヒト細胞である、請求項８２～１０５のいずれか１項に記載の方法。
107. 前記単離細胞が、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される、請求項８２～１０６のいずれか１項に記載の方法。
108. 前記単離細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子を含む、請求項８２～１０７のいずれか１項に記載の方法。
109. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ遺伝子を含む、請求項８２～１０８のいずれか１項に記載の方法。
110. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＣＩＩＴＡ遺伝子を含む、請求項８２～１０９のいずれか１項に記載の方法。
111. 前記単離細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項８２～１１０のいずれか１項に記載の方法。
112. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項８２～１１１のいずれか１項に記載の方法。
113. 分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項１０７～１１２のいずれか１項に記載の方法に従って調製された幹細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、前記方法。
114. 前記分化条件が、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である、請求項１１３に記載の方法。
115. 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１１３または１１４に記載の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、前記方法。
116. ＲＵＥＳ２細胞株に由来する単離細胞であって、前記単離細胞が、
     （ａ）前記単離細胞を組織血液型Ｏにする修飾、及び
     （ｂ）前記単離細胞をＲｈ陰性にする修飾のうちの一方または両方を含む、前記単離細胞。
117. 前記単離細胞を組織血液型Ｏにする前記修飾が、ＡＢＯ組織血液型Ｂ抗原の抗原性を低減または排除する、請求項１１６に記載の単離細胞。
118. 前記修飾が、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、または前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって、前記ＡＢＯ遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項１１６または１１７に記載の単離細胞。
119. 前記ＡＢＯ遺伝子の発現が、前記ＡＢＯ遺伝子のエクソン１のＡＣＡＣＣＴ；エクソン２のＡＧＴＧＣＧ；またはエクソン８のＣＡＡＧＣＧＣ、ＧＧＣＧＣＡ、ＴＧＧＧＣＧ、ＡＣＣＡＣＧ、ＧＣＣＧＣＡ、ＣＣＡＣＧＴ、ＴＧＣＣＧＴ、ＴＡＣＴＣＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＧＡＧＣＧＣ、ＧＣＣＴＧＧ、ＧＴＣＣＴＴ、ＴＣＡＣＧＣ、ＴＧＧＡＣＧ、ＴＧＧＴＣＧ、ＧＣＴＧＧＣ、ＣＡＣＧＣＧ、ＡＧＧＴＧＡ、もしくはＧＣＡＴＣＧ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１１８に記載の単離細胞。
120. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１１８または１１９に記載の単離細胞。
121. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、コードエクソン内への挿入または欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１または配列番号２を含む、請求項１１８～１２０のいずれか１項に記載の単離細胞。
122. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３を含む、請求項１１８～１２１のいずれか１項に記載の単離細胞。
123. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記有害な変異が、ホモ接合変異である、請求項１１８～１２２のいずれか１項に記載の単離細胞。
124. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成され、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、請求項１１８に記載の単離細胞。
125. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項１２４に記載の単離細胞。
126. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む前記ＨＤＲ鋳型と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１１８、１２４、及び１２５のいずれか１項に記載の単離細胞。
127. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記エクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異が、ホモ接合変異である、請求項１１８及び１２４～１２６のいずれか１項に記載の単離細胞。
128. 前記修飾が、ＦＵＴ１遺伝子の有害な変異による前記ＦＵＴ１遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項１１６に記載の単離細胞。
129. 前記ＦＵＴ１遺伝子の発現が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４のＡＴＣＧＡＣ、ＡＧＴＡＣＧ、ＣＧＣＣＣＴ、ＧＴＴＴＧＣ、ＣＧＡＣＡＡ、ＧＧＴＧＣＧ、ＣＧＣＣＧＴ、ＡＣＧＣＣＧ、ＣＣＧＧＴＴ、ＣＧＣＧＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＡＴＡＣＣＧ、ＧＴＧＣＧＣ、ＣＣＡＴＴＧ、ＴＧＴＣＧＧ、ＡＴＣＴＧＣ、ＣＴＴＴＧＴ、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＣＣＡＴ、ＴＧＣＧＡＴ、ＣＧＴＧＣＡ、もしくはＡＴＧＧＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１２８に記載の単離細胞。
130. 前記ＦＵＴ１遺伝子の前記有害な変異が、表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して生成される、請求項１２８または１２９に記載の単離細胞。
131. 前記有害な変異が、前記ＦＵＴ１遺伝子のエクソン４における欠失と、配列番号１３または配列番号１４を含むガイドＲＮＡ標的配列と、を含む、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の単離細胞。
132. 前記単離細胞をＲｈ陰性にする前記修飾が、１つ以上のアカゲザル因子抗原の抗原性を低減または排除する、請求項１１６～１３１のいずれか１項に記載の単離細胞。
133. 前記単離細胞をＲｈ陰性にする前記修飾が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異による前記ＲＨＤ遺伝子の部分的または完全に不活性化される発現を含む、請求項１１８～１３２のいずれか１項に記載の単離細胞。
134. 前記ＲＨＤ遺伝子の発現が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン２のＴＣＡＴＧＧ、ＧＡＧＧＴＧ、ＡＡＣＴＣＧ、ＡＧＴＴＴＣ、ＴＴＧＧＣＴ、もしくはＣＡＣＡＧＣ；エクソン３のＣＣＧＴＧＡ；エクソン４のＧＧＧＴＡＧもしくはＡＧＧＧＡＡ；エクソン５のＴＴＣＧＡＴ、ＴＣＡＧＣＧ、ＣＡＴＡＧＴ、もしくはＡＴＣＧＡＡ；エクソン６のＣＧＴＣＧＧもしくはＴＣＣＧＴＣ；エクソン７のＣＧＧＣＡＡ、ＣＧＧＡＧＣ、ＴＡＣＣＧＴ、ＧＣＴＴＧＣ、もしくはＣＴＴＧＣＴ；またはエクソン８のＧＧＴＴＣＴもしくはＴＣＣＴＡＣ内での挿入または欠失によって部分的あるいは完全に不活性化される、請求項１３３に記載の単離細胞。
135. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含む１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって生成される、請求項１３３または１３４に記載の単離細胞。
136. 前記有害な変異が、前記ＲＨＤ遺伝子のエクソン１～８を含むゲノム領域の欠失と、配列番号１１を含むガイドＲＮＡ標的配列と、配列番号１２を含む別のガイドＲＮＡと、を含む、請求項１３３～１３５のいずれか１項に記載の単離細胞。
137. 前記ＲＨＤ遺伝子の前記有害な変異が、フレームシフト挿入／欠失を含み、前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１３３～１３６のいずれか１項に記載の単離細胞。
138. ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項１１６～１３７のいずれか１項に記載の単離細胞。
139. Ｂ２Ｍ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項１１６～１３８のいずれか１項に記載の単離細胞。
140. ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化される、請求項１１６～１３９のいずれか１項に記載の単離細胞。
141. ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む、請求項１１６～１４０のいずれか１項に記載の単離細胞。
142. 前記Ｂ２Ｍ及び前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現が、部分的または完全に不活性化され、ＣＤ４７導入遺伝子をさらに含む、請求項１１６～１４１のいずれか１項に記載の単離細胞。
143. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
     （ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、
     （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
     （ｃ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
144. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３からなる群から選択される１つを含む、請求項１４３に記載の方法。
145. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１４３または１４４に記載の方法。
146. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項１４５に記載の方法。
147. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１４５に記載の方法。
148. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
     （ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、
     （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ならびに配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、前記導入することと、
     （ｃ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
149. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項１４８に記載の方法。
150. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、前記ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む、請求項１４８または１４９に記載の方法。
151. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１４８～１５０のいずれか１項に記載の方法。
152. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項１５１に記載の方法。
153. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１５１に記載の方法。
154. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
     （ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、
     （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
     （ｃ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
155. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、前記別のガイドＲＮＡが、配列番号１２を含む、請求項１５４に記載の方法。
156. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１５４に記載の方法。
157. （ｉ）表Ａ～Ｃ中のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
158. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１～３を含む、請求項１５７に記載の方法。
159. （ｉ）配列番号３～５のものからなる群から選択される１つを含むＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異を産生するためのガイドＲＮＡ標的配列、ならびに前記２５８ｄｅｌＧ変異をコードする配列、ＰＡＭ配列、スペーサー領域、及び２つの相同性アームを含むＨＤＲ鋳型を前記細胞に導入することであって、各々が、前記ＡＢＯ遺伝子と約１０ヌクレオチド～約１Ｋｂの相同配列を含む、前記導入することと、（ｉｉ）前記ＡＢＯ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
160. 前記ＨＤＲ鋳型が、前記ＨＤＲ鋳型がＣａｓ９によって切断されないことを確実にするために、前記ＰＡＭ配列及び／または前記スペーサー領域における１つ以上のサイレント変異をさらに含む、請求項１５９に記載の方法。
161. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号３～５からなる群から選択される１つを含み、前記ＨＤＲ鋳型が、配列番号６～８からなる群から選択される１つを含む、請求項１５９または１６０に記載の方法。
162. 操作組織適合性細胞を生成する方法であって、
     （ａ）単離ＲＵＥＳ２細胞またはその誘導体を取得することと、
     （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び表Ｇ～Ｉ中のものからなる群から選択される１つを含むＦＵＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、
     （ｃ）前記ＦＵＴ１遺伝子が、部分的または完全に不活化される、操作細胞を選択することと、を含む、前記方法。
163. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１３または配列番号１４を含む、請求項１６２に記載の方法。
164. （ｉ）表Ｄ～Ｆ中のものからなる群から選択される１つを含むＲＨＤ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を前記細胞に導入することと、（ｉｉ）前記ＲＨＤ遺伝子が、部分的または完全に不活性化される、操作細胞を選択することと、をさらに含む、請求項１５９または１６３に記載の方法。
165. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号９または配列番号１０を含む、請求項１６４に記載の方法。
166. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１１を含み、別のガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号１２を含む、請求項１６４に記載の方法。
167. 前記単離細胞が、ＭＨＣ－Ｉの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子、及び／またはＭＨＣ－ＩＩの１つ以上の転写制御因子をコードする１つ以上の部分的もしくは完全に不活性化される遺伝子をさらに含む、請求項１４３～１６６のいずれか１項に記載の方法。
168. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ遺伝子を含む、請求項１４３～１６７のいずれか１項に記載の方法。
169. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＣＩＩＴＡ遺伝子を含む、請求項１４３～１６８のいずれか１項に記載の方法。
170. 前記単離細胞が、ＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項１４３～１６９のいずれか１項に記載の方法。
171. 前記単離細胞が、部分的または完全に不活性化されるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項１４３～１７０のいずれか１項に記載の方法。
172. 分化細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項１４３～１７１のいずれか１項に記載の方法に従って調製された操作組織適合性細胞を培養し、それにより分化細胞を調製することを含む、前記方法。
173. 前記分化条件が、幹細胞を、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞型に分化させるのに適切である、請求項１７２に記載の方法。
174. 細胞補充療法を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１７２または１７３に記載の方法に従って調製された分化細胞の集団を投与することを含む、前記方法。

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