CN112673094A - 病毒载体产生 - Google Patents

Abstract

包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少细胞表面上CD47的表达。

Description

病毒载体产生

发明领域

本发明涉及显示降低的表面暴露抗原水平的细胞。更具体地，本发明涉及细胞的遗传工程以减少细胞表面上CD47的表达。特别地，本发明涉及此类细胞在包膜病毒颗粒的产生中的用途。

发明背景

基因疗法涉及将遗传物质掺入细胞中以治疗或预防疾病。遗传物质可以给缺陷基因补充那些基因的功能拷贝，使不能正常发挥功能的基因失活或将指导新功能的基因引入细胞。

遗传物质向细胞的递送可以通过使用促进核酸转移的载体来实现。可以对病毒进行工程化改造以将感兴趣的核苷酸(NOI)递送至靶细胞，并通常在基因疗法中用作载体。迄今为止，已用于基因疗法的病毒包括逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和痘苗病毒。

逆转录病毒，例如α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒对于基因疗法特别有用，因为它们允许将校正性遗传物质稳定整合到靶细胞中。在针对腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ADA-SCID；Aiuti,A.et al.(2009)N.Engl.J.Med.360:447-58)，X-连锁严重联合免疫缺陷(SCID-X1；Hacein-Bey-Abina,S.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:355-64)和Wiskott-Aldrich综合征(WAS；Boztug,K.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:1918-27)的基于γ-逆转录病毒衍生的载体的临床试验中已经实现了治疗益处。另外，慢病毒载体已被用作递送载体，用于治疗X连锁的肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)(ALD；Cartier,N.et al.(2009)Science 326:818-23)，以及异染性脑白质营养不良(MLD；Biffi,A.et al.(2013)Science 341:1233158)和WAS(Aiuti,A.et al.(2013)Science 341:1233151)。在临床前研究中，慢病毒载体也已静脉内施用，用于在该疾病的小鼠和犬模型中进行血友病的肝定向基因疗法(Cantore,A.et al.(2012)Blood；Matsui,H.et al.(2011)Mol Ther；Cantore,A.et al.(2015)Science Translational Medicine 7:277ra28)。

已经进行了努力以获得能够逃脱免疫细胞感应的基因疗法载体，以将其用于遗传疾病的稳定的基因替代治疗策略中。然而，基因转移载体的许多应用需要将基因有效传递给先天免疫细胞，例如，将载体用作溶瘤病毒(Lichty,B.D.et al.(2014)Nature RevCancer 14:559-567)以及用于疫苗接种的目的(Rampling et al.(2015)NEJM)。

病毒颗粒包膜通常起源于产生者细胞的膜。因此，在病毒颗粒出芽的细胞膜上表达的膜蛋白可以掺入病毒包膜中。此类表面暴露的蛋白质可能影响病毒颗粒作为基因疗法载体的效用，例如通过改善或防止某些类型的细胞转导，或引起针对病毒颗粒或它们转导的细胞的有害免疫应答。相反，对于某些效用，例如疫苗接种目的，可能希望刺激免疫系统。

因此，在本领域中，对具有改善的细胞转导特性以及刺激或逃避免疫应答的病毒载体颗粒的需求相当大。

发明概述

令人惊讶地，发明人发现，基因对专职的吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)的转移受到LV颗粒上CD47分子的存在的限制。

通过遗传破坏用于产生LV颗粒的细胞中的CD47基因，发明人能够修饰LV包膜的蛋白质组成，并获得在其表面上缺乏人CD47的LV颗粒(无CD47的LV)。令人惊讶地，发明人已经显示，表面暴露的CD47分子的缺乏对细胞无毒，并且不会显著影响这些细胞产生包膜病毒颗粒的能力。

此外，发明人已经证明，无CD47的LV显示出保留的传染性和实质性增加的对吞噬作用的易感性。与携带CD47的LV相比，无CD47的LV更有效地离体和体内转导专职吞噬细胞，并在对小鼠系统性施用后诱导细胞因子应答的实质性更高的升高。与先前可用的LV相比，无CD47的LV提高基因转移至人原代单核细胞中的效率，并且离体通过原代人巨噬细胞和当对小鼠系统性施用时在体内对吞噬作用具备增加的易感性。

在发明者的发现之前，存在有许多参与吞噬作用和病毒载体摄取和进入的途径，不清楚缺乏表面暴露的CD47的LV会显示出增加的基因对APC转移的效率。此外，不清楚病毒颗粒上CD47信号的存在可以负面影响VSV-G与其在靶细胞上的受体之间的相互作用。

工程化CD47阴性细胞可用于产生LV和其他有包膜的病毒载体颗粒，所述颗粒适用于例如基因转移到专职吞噬细胞中，以应用于疫苗接种、免疫调节和癌症免疫疗法。无CD47的LV可用于将基因转移到专职的APC中，从而将LV的应用性扩大到遗传疾病外到诸如癌症靶向免疫疗法策略，传染病的适应症以及疫苗接种目的。实际上，发明人已经显示了，当在体内施用时，无CD47的LV诱导细胞因子和趋化因子的更大释放，这在疗法的目的是诱导免疫反应时是至关重要的。当巨噬细胞参与传染性或免疫介导的疾病，如HIV感染，炎性肠病或其他自身免疫性或自身炎性疾病时，无CD47的LV也可用于靶向巨噬细胞。

在一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒产生者细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少所述细胞表面上CD47的表达。

在一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒包装细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少所述细胞表面上CD47的表达。

在一个实施方案中，细胞包含编码CD47的基因的遗传工程化破坏。细胞可在编码CD47的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。

可以降低细胞表面上CD47的表达，使得细胞基本上缺乏表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，细胞不包含任何表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，细胞经进一步遗传工程化改造以减少细胞表面上MHC-I的表达。在一个实施方案中，细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏。在一个实施方案中，细胞包含一种或多种编码MHC-Iα链的基因的遗传工程化破坏。细胞可在编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。细胞可在编码MHC-Iα链的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。细胞可以包含编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏和编码MHC-Iα链的基因的遗传工程化破坏。

细胞表面上MHC-I的表达可以降低，使得细胞基本上缺乏表面暴露的MHC-I分子。在一个实施方案中，细胞不包含任何表面暴露的MHC-I分子。

术语病毒颗粒“生产者细胞”包括在瞬时转染、稳定转染或载体转导对于产生病毒颗粒必需的所有元件后产生病毒颗粒的细胞，或任何经工程化改造以稳定地包含对于产生病毒颗粒必需的元件的细胞。

术语“包装细胞”包括含有包装传染性重组病毒必需的一些或全部元件的细胞。包装细胞可以缺少重组病毒载体基因组。通常，此类包装细胞包含一种或多种能够表达病毒结构蛋白的载体。通过瞬时转染，转导或稳定整合每个其他需要的元件的随后步骤，仅包含产生包膜病毒颗粒所需的某些元件的细胞可用作生成病毒颗粒产生者细胞系的中间试剂。这些中间试剂被术语“包装细胞”涵盖。本发明还涵盖随后用于产生包膜病毒颗粒产生者或包装细胞系的亲本细胞，其中在细胞表面上CD47的表达已经降低。

本文所指的病毒颗粒涵盖具有复制能力或复制缺陷的病毒，从其衍生的病毒载体，并且可以包含或可以不包含感兴趣的核苷酸。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒产生者或包装细胞是HEK-293细胞或其衍生物。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒产生者或包装细胞是HEK-293T或HEK-293T-REx细胞。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、嗜肝性DNA病毒(hepadnaviral)、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒(bunyaviral)、博尔纳病毒(bornaviral)、弹状病毒(rhabdoviral)或纤丝病毒颗粒、或源自它们的病毒颗粒。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒颗粒，或源自它们的病毒颗粒。

在一个优选的实施方案中，包膜病毒颗粒是慢病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是HIV-1颗粒或源自它们的病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞的群体。

在一个实施方案中，已经根据本发明对群体中的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞进行了遗传工程化改造。

在另一方面，本发明提供了用于产生根据本发明的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞系的亲本细胞，其中所述亲本细胞经遗传工程化改造以减少细胞表面上CD47的表达。

在另一方面，本发明提供前述项中任一项的包膜病毒颗粒产生者细胞用于产生包膜病毒颗粒的用途。

在一个实施方案中，包膜病毒载体颗粒包含在没有基因工程化的情况下(但在其他方面基本相同的情况下)由包膜病毒颗粒产生者细胞产生的颗粒上展示的表面暴露的CD47分子的数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒不包含任何表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒基本上缺乏表面暴露的CD47分子。

在另一方面，本发明提供了产生包膜病毒颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供根据本发明的包膜病毒颗粒产生者细胞；和

b)在适合于产生包膜病毒颗粒的条件下培养细胞。

在另一方面，本发明提供了可通过本发明的包膜病毒颗粒产生方法获得的包膜病毒颗粒。

在一个实施方案中，包膜病毒载体颗粒包含在没有基因工程化的情况下(但在其他方面基本相同的情况下)由包膜病毒颗粒产生者细胞产生的颗粒上展示的表面暴露的CD47分子的数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒不包含任何表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒基本上缺乏表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、嗜肝性DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、博尔纳病毒、弹状病毒或纤丝病毒颗粒、或源自它们的病毒颗粒。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒颗粒，或源自它们的病毒颗粒。

在一个优选的实施方案中，包膜病毒颗粒是慢病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒是HIV-1颗粒或源自它们的病毒颗粒。

在一个实施方案中，本发明的包膜病毒颗粒用于蛋白质转移(Bobis-Wozowicz,S.et al.(2014)Sci Rep；Voelkel,C.et al.(2010)Proc Natl Acad Sci USA；Maetzig,T.et al.(2012)Curr Gene Ther)。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含感兴趣的核苷酸(NOI)。优选地，包膜病毒颗粒是减毒病毒，例如复制缺陷型病毒。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含编码细胞因子的转基因。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒的群体。

在一个实施方案中，群体中至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的颗粒来源于本发明的包膜病毒颗粒产生者细胞。在一个实施方案中，群体中100％的颗粒来源于本发明的包膜病毒颗粒产生者细胞。在一个实施方案中，群体中的颗粒基本上不包含表面暴露的CD47。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒用于转导巨噬细胞、吞噬细胞、抗原呈递细胞或单核细胞的用途。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒用于转导肝巨噬细胞的用途。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒用于转导巨噬细胞，例如库普弗细胞(Kupffercell)。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒用于转导吞噬细胞。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒用于转导抗原呈递细胞，例如树突细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)或髓样树突细胞(myDC)。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒用于转导单核细胞。

在一个实施方案中，转导是体外、离体或体内转导。在一个实施方案中，转导是体外转导。在一个实施方案中，转导是离体转导。

在一个实施方案中，将包膜病毒颗粒系统性施用于受试者。

在另一方面，本发明提供了由本发明的包膜病毒颗粒转导的细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞或人细胞。

在一个实施方案中，细胞是巨噬细胞(例如库普弗细胞)、吞噬细胞、抗原呈递细胞(例如树突细胞、浆细胞样树突细胞、pDC或髓样树突细胞、myDC)或单核细胞。在一个实施方案中，细胞是肝巨噬细胞。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的包膜病毒颗粒或转导的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一方面，本发明提供了用于疗法的本发明的包膜病毒颗粒。本发明的包膜病毒颗粒可以用于基因疗法。

在另一方面，本发明提供了用于疗法的本发明的转导细胞。本发明的转导细胞可用于基因疗法。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防癌症的本发明的包膜病毒颗粒。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防细菌性或病毒性感染的本发明的包膜病毒颗粒。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的本发明的包膜病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防癌症的本发明的经转导的细胞。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防细菌性或病毒性感染的本发明的经转导的细胞。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的本发明的经转导的细胞。

在另一方面，本发明提供了用于疫苗接种或基因疗法，优选用于治疗或预防癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的本发明的包膜病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供了用于疫苗接种或基因疗法的本发明的经转导的细胞，优选用于治疗或预防癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病。

在另一方面，本发明提供了治疗癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括用本发明的包膜病毒颗粒转导细胞。

在一个实施方案中，转导是体外、离体或体内转导。在一个实施方案中，转导是体外转导。在一个实施方案中，转导是离体转导。

在另一方面，本发明提供了治疗癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的方法，该方法包括将本发明的包膜病毒颗粒或细胞施用于有此需要的受试者。

在一个实施方案中，将包膜病毒颗粒系统性地施用于受试者。

在另一方面，本发明提供了用作疫苗的本发明的包膜病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供了一种疫苗接种方法，该方法包括将本发明的包膜病毒颗粒施用于有此需要的受试者。

附图简述

图1

CD47阴性产生者细胞的生成和表征。(a)在分选后3天对未染色的、未处理的、经CRISPR/Cas9处理的、CD47阴性或CD47阳性分选(如指示)的293T细胞进行流式细胞术分析(具有异常值的轮廓图)。(b)转染后1周在瞬时转染了3种不同sgRNA(A、B或C)与指定量的Cas9和sgRNA表达质粒的293T细胞中CD47阴性细胞(白色条)和带有插入/缺失的等位基因(NHEJ，黑色条)的百分比。(c-e)(c)感染滴度的平均值与SEM(TU/mL)；(d)物理颗粒(ngp24/mL)；和(e)如指示，由CD47阳性(黑色条，n＝3)或CD47阴性(白色条，n＝3)293T产生的LV的比感染性(specific infectivity)(TU/ng p24)。通过Mann-Whitney检验没有显著差异。

图2

无CD47的LV的生成、成像和体外评估。(a-c)LV批次的代表性显微照片(a)和定量分析(c，d)，所述LV批次由对照(LV，黑色圆圈)、CD47过表达(CD47hi LV，黑色方块)或CD47阴性293T细胞(无CD47的LV，白色圆圈)产生，用抗CD47(b)或抗VSV.G(c)抗体免疫染色(如所示)，或作为不含一抗的染色对照(对照，黑色三角形)，并通过电子显微术分析(n＝每个样品41-70个病毒体)。Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较检验。(d)以MOI 10用LV(黑色圆圈)或无CD47的LV(白色圆圈)转导并在转导后3天进行分析(使用5个不同的健康献血者进行的2次独立实验)的293T细胞和原代人巨噬细胞(对于293T为n＝6，对于巨噬细胞为n＝15)中VCN的单一值和平均值与SEM。(e)以MOI 3用LV(黑色圆圈)或无CD47的LV(白色圆圈)转导并且转导后3天进行分析的293T细胞和原代人树突细胞(对于293T为n＝3-4，对于树突细胞为n＝8-11)中GFP阳性细胞百分比的单一值和平均值与SEM。请注意，在从人原代单核细胞开始的分化方案的第2天时转导树突细胞。Mann-Whitney检验。(f)在与LV(黑点)或无CD47的LV(白点)温育后通过ImageStream分析的原代人巨噬细胞的百分比的平均值和SEM与单一值，展示X轴上指示的LV点的数目(用源自11个不同正常供体的巨噬细胞进行的8个独立实验)。Wilcoxon配对检验。VSV.G：水泡性口炎病毒G蛋白。

图3

无CD47的LV的体内评估。(a-c)以1.2-2×10¹⁰TU/kg用LV(a)或无CD47的LV(b)(n＝11-16,对于pDC为n＝4)注射的C57 BL/6血友病B(n＝5-9，黑色星)或NOD(n＝5-11,黑色圆圈)小鼠的FACS分选的肝细胞(Hep)、肝窦状内皮细胞(LSEC)、库普弗细胞(KC)或浆细胞样树突细胞(pDC)和整个脾脏(如指示)中，VCN的单一值和平均值与SEM。LV施用后2个月测量VCN。Mann-Whitney检验。在(c)中，我们报告了(a)(经LV治疗的NOD小鼠)和(b)(无CD47的LV治疗的NOD小鼠)中显示的相同数据集，但此处将它们绘制在一起以在同一小鼠品系(NOD)中直接比较LV和无CD47的LV。

图4

无CD47的LV施用导致更高的促炎细胞因子应答。(a-f)施用LV(黑色圆圈)或无CD47的LV(白色圆圈)后的指定时间(小时)时或者在峰值(g-l，LV施用后的3小时)，NOD小鼠血清中的(a-l)IL-6(a，g)、MCP-1(b，h)、MIP-1α(c，i)、MIP-1β(d，j)、CXCL1(e，k)和G-CSF(f，l)浓度的平均值与SEM。虚线显示未治疗分组的平均浓度。Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较测试。

图5

小鼠中肝库普弗细胞(KC)对LV、CD47hi或无CD47的LV摄取的体内成像。(a)在指示的时间(分钟，在2分钟时开始LV静脉内注射)来自C57BL/6或NOD小鼠肝脏的间隔4μm的8–12个z-堆栈(z-stack)的活体2光子显微镜图像，所述小鼠用GFP标记的LV、CD47hi或无CD47的LV治疗。KC以白色显示。LV阳性KC标有星号。(b)如所示，在用LV、CD47hi或无CD47的LV治疗的C57BL/6或NOD小鼠中，LV阳性KC随时间的百分比。

图6

基于LV的干扰素向肝脏的递送。通过TaqMan进行的基因表达分析，显示了未治疗或使用指定剂量的基于LV的IFNα释放平台治疗的小鼠的总肝脏中一组基因的表达。相对于未处理者的倍数变化。

发明详述

如本文所用，术语“包括”与“包括”或“含有”同义并且是包含性的或开放性的，并且不排除其他未引用的成员、要素或步骤。术语“包含”也包括术语“由……组成”。

在一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少细胞表面上CD47的表达。

细胞表面上CD47的表达减少是指与缺少遗传工程化，但在其他方面基本相同条件下的细胞表面上表达的CD47分子数目相比，经过遗传工程化改造的细胞表面上表达的CD47分子数目减少。

可以降低细胞表面上CD47的表达，使得例如表面暴露的CD47分子的数目是在没有遗传工程的情况下展示的表面暴露的CD47分子数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，降低细胞表面上的CD47的表达，使得表面暴露的CD47分子的数目是在没有基因工程的情况下展示的表面暴露的CD47分子的数目的0％。

优选降低细胞表面上CD47的表达，使得细胞基本上缺乏表面暴露的CD47分子。

如本文所用，术语“基本上缺乏”是指与缺少遗传工程化(但在其他方面基本相同的条件下)的细胞表面上表达的CD47分子的数目相比，已经被遗传工程化改造的细胞表面上表达的CD47分子的数目大大减少，使得该细胞产生的包膜病毒颗粒在转导巨噬细胞、吞噬细胞、抗原呈递细胞和/或单核细胞的能力上表现出治疗上有用的增加和/或在系统性施用后诱导细胞因子应答。

在另一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中细胞包括编码CD47的基因的遗传工程化破坏。

在一个实施方案中，细胞经进一步遗传工程化改造以减少细胞表面上MHC-I的表达。

在一个实施方案中，细胞还包含编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏。

在一个实施方案中，细胞还包括一种或多种编码MHC-Iα链的基因的遗传工程化破坏。

在一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞的群体。

优选地，群体中至少约50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的细胞不包含表面暴露的CD47。

优选地，群体中至少约50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的细胞不包含表面暴露的MHC-I。

量化细胞群体中细胞表面暴露的蛋白质的蛋白质表达的方法是本领域已知的。合适的方法包括流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)和荧光显微术。

例如，细胞群体可以与对CD47或MHC-I具有特异性的抗体接触。抗体可以被标记以使其能够被检测。抗体可以直接与报道分子部分(例如荧光标记物)缀合。或者，可以使与报道分子部分缀合并且对一抗具有特异性的二抗与细胞群体接触。合适的报道分子部分是本领域已知的，并且包括例如Alexa Fluor和基于BODIPY的荧光标记物。一旦细胞群体已经与抗体接触，可以使用适合于量化个别细胞上蛋白质表达的技术，例如流式细胞术来分析群体。在不裂解细胞的情况下进行分析。

用于量化细胞表面暴露的蛋白质的蛋白质表达的方法还可以实现细胞群体的分选以产生富集特定特征的细胞群体(例如，产生不包含表面暴露的CD47的细胞中富集的细胞群体)。例如，荧光激活细胞分选(FACS)使得能够进行此类富集。

相似的方法可以应用于量化单细胞上细胞表面暴露的蛋白质的蛋白质表达。例如，方法可以采用微流体方法。

分化簇47(CD47)

分化簇47(CD47；也称为整联蛋白相关蛋白，IAP)是属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白。CD47结合血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)和信号调节蛋白alpha(SIRPα)，并发挥巨噬细胞的信号的功能。

人CD47的氨基酸序列实例是：

人CD47的氨基酸的另外的实例是：

人CD47的氨基酸的另外的实例是：

人CD47的氨基酸的另外的实例是：

人CD47的氨基酸的另外的实例是：

CD47的基因工程化

对本发明的包膜病毒颗粒生产者或包装细胞进行了遗传工程化改造，以减少细胞表面上CD47的表达。

遗传工程化以减少蛋白质表达的方法是本领域已知的。例如，这可以通过靶向基因敲除来实现。为了降低蛋白质表达，可以敲除编码蛋白质本身或其调控序列(例如其启动子)的基因。敲除可以通过缺失编码核酸序列的一部分来实现，其可以缺失表达或稳定性所必需的蛋白质的一部分，或改变编码序列的阅读框。用于靶向基因敲除的合适方法包括使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和基于CRISPR/Cas的RNA引导的核酸酶(Gaj,T.et al.(2013)Trends Biotechnol.31:397–405)。

例如，如果给CRISPR/Cas9 RNA引导的核酸酶提供了设计用于结合特定基因座的适当RNA引导物，则它可用于催化基因组中该特定基因座处的双链断裂。可通过转染编码蛋白质和RNA的载体将Cas9和引导RNA递送至靶细胞。细胞尝试使用非同源末端连接(NHEJ)途径修复其DNA中的任何双链断裂。这是一个易错的机制，其插入随机核苷酸并经常破坏靶定基因的阅读框。

或者，可以使用RNAi技术或微小RNA或反义RNA来抑制靶基因的表达来完成降低蛋白质表达的遗传工程化。

一旦进行了靶向基因敲除或表达抑制的方法，就可以筛选所得的细胞群体以选择并富集那些表现出感兴趣表型，例如表面暴露的CD47表达降低的细胞。用于筛选和富集的合适技术是本领域已知的，并且包括流式细胞术和荧光激活细胞分选(FACS)。

细胞可在编码CD47的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。

主要组织相容性复合物I类

主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是一种在细胞膜的外部小叶上展示的异二聚体膜蛋白(Penn,D.J.(2002)Major Histocompatibility Complex(MHC)eLS,John Wiley&Sons,http://www.els.net/[DOI:10.1038/npg.els.0000919])。MHC-I的功能是将蛋白质的肽片段结合并展示到细胞外环境中，在那里它们可以被CD8⁺细胞毒性T细胞识别。由于中枢和外周耐受机制，从正常细胞蛋白产生的肽片段不会激活细胞毒性T细胞。然而，外来肽(例如源自病毒蛋白的那些肽)将引起免疫应答的活化以破坏细胞。

免疫系统可以识别同种异体MHC-I蛋白自身。例如，抗体可以直接结合MHC-I表位。因此，包含来源于同种异体来源的MHC-I蛋白的细胞和有包膜的病毒可被免疫系统靶向并中和。

人MHC-I也称为人白细胞抗原I类(HLA-I)，并在几乎所有有核细胞上表达。HLA-I由两条多肽链组成，HLA-I重链(α链)和β2微球蛋白(β2M)。HLA-Iα链和β2M非共价连接。

HLA-Iα链是多态的。迄今为止，已鉴定出6条HLA-Iα链，包括3条经典的高度多态性α链(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和3条非经典的较少多态性(HLA-E、HLA-F和HLA-G)α链。技术人员将能够容易地确定HLA-Iα链的核酸序列。例如，HLA-Iα链可以使用它们在染色体的主要组织相容性复合物区域内的位置在基因组序列中进行鉴定(Penn,D.J.(2002)MajorHistocompatibility Complex(MHC)eLS,John Wiley&Sons,http://www.els.net/[DOI:10.1038/npg.els.0000919])。

编码β2M的核酸序列是本领域已知的。例如，人β2M的核酸序列以GenBank登录号NM_004048保存。

技术人员将理解，本发明适用于MHC-I序列的变体，例如这些序列的多态性(例如，HLA-Iα链序列和β2M序列)。例如，MHC-I序列的变体可以包括单核苷酸多态性(SNP)或多个SNP。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒产生者或包装细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏。β2-微球蛋白稳定MHC-I，因此缺乏β2-微球蛋白的细胞在细胞表面上表现出降低的MHC-I表达。细胞可在编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。

在另一个实施方案中，细胞包含编码MHC-Iα链的基因的遗传工程化破坏。细胞可在编码MHC-Iα链的基因的所有拷贝中包含遗传工程化破坏。

细胞可以包括编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏和编码MHC-Iα链的基因的遗传工程化破坏。

载体

载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。本发明的病毒颗粒可以是载体。

本发明的病毒载体颗粒是包膜病毒颗粒。

包膜病毒颗粒包含外脂质双层膜。许多有包膜的病毒在本领域中是已知的，包括逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、嗜肝性DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、博尔纳病毒、弹状病毒和纤丝病毒。

本发明的包膜病毒颗粒可以是例如逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、嗜肝性DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、博尔纳病毒、弹状病毒或纤丝病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒。如本文所用，术语“源自”可以指例如掺入至少一种可源自某种类型病毒的组分。

逆转录病毒和慢病毒载体

逆转录病毒载体可以源自或可源自任何合适的逆转录病毒。已经鉴定出许多不同的逆转录病毒。例子包括鼠白血病病毒(MLV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤浪(Fujinami)肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病(myelocytomatosis)病毒29(MC29)和禽成红细胞增多病病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,ColdSpring Harbour Laboratory Press,758-63。

逆转录病毒可以大致分为两类，“简单”和“复杂”。逆转录病毒甚至可以进一步分为七组。这些组中的五个代表具有致癌潜力的逆转录病毒。其余两组是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述在Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold Spring HarbourLaboratory Press,758-63中呈现。

逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，例如5'长末端重复(LTR)和3'LTR。在它们之间或之内的是使基因组得到包装的包装信号、引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点、以及编码包装成分的gag、pol和env基因–这些是病毒颗粒的组装需要的多肽。慢病毒具有其他功能，例如HIV中的rev和RRE序列，它们使得将整合的原病毒的RNA转录物有效从细胞核输出到被感染靶细胞的细胞质。

在原病毒中，这些基因在两端侧翼都有称为LTR的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。LTR也可以充当增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。

LTR本身是相同的序列，它们可以分为三个元件：U3、R和U5。U3源自RNA 3'末端独特的序列。R源自在RNA的两端重复的序列。U5源自RNA 5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间，三个元件的大小可以相当大地变化。

在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以是不存在或非功能性的。

在典型的逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去复制必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分。这使得病毒载体变为复制缺陷。病毒基因组的部分也可以用可操作连接到载体基因组中的调节控制区和报告部分的编码候选调节部分的文库替换，以产生包含候选调节部分的载体，该载体能够转导靶宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

慢病毒载体是大量逆转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold Spring Harbour Laboratory Press,758-63。简而言之，慢病毒可以分为灵长类和非灵长类组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病原；和猿免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒的例子包括原型“慢病毒”visna/maedi病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。

慢病毒家族与逆转录病毒家族的不同之处在于慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞两者的能力(Lewis,P et al.(1992)EMBO J.11:3053-8；Lewis,P.F.et al.(1994)J.Virol.68:510-6)。相反，其他逆转录病毒(例如MLV)不能感染非分裂或缓慢分裂的细胞，例如组成肌肉、脑、肺和肝组织的细胞。

如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞，表达基因或被复制的生物学机制。

慢病毒载体可以是“灵长类”载体。慢病毒载体可以是“非灵长类”载体(即源自主要不感染灵长类，特别是人的病毒)。非灵长类慢病毒的实例可以是慢病毒科的任何不天然感染灵长类的成员。

作为基于慢病毒的载体的实例，下面描述基于HIV-1和HIV-2的载体。

HIV-1载体含有在简单逆转录病毒中也发现的顺式作用元件。已经显示了延伸到gag可读框中的序列对于包装HIV-1是重要的。因此，HIV-1载体通常包含gag的相关部分，在该部分中翻译起始密码子已发生突变。此外，大多数HIV-1载体还含有env基因的一部分，其包括RRE。Rev结合RRE，所述RRE允许全长或单剪接的mRNA从细胞核转运至细胞质。在没有Rev和/或RRE的情况下，全长HIV-1RNA积累在细胞核中。或者，可以使用来自某些简单的逆转录病毒(例如Mason-Pfizer猴病毒)的组成性转运元件来缓解对Rev和RRE的需求。从HIV-1LTR启动子进行有效转录需要病毒蛋白Tat。

大多数基于HIV-2的载体在结构上与HIV-1载体非常相似。与基于HIV-1的载体相似，HIV-2载体也需要RRE以有效转运全长或单剪接的病毒RNA。

在一个系统中，载体和辅助构建体来自两种不同的病毒，并且降低的核苷酸同源性可以降低重组的可能性。除了基于灵长类慢病毒的载体外，还开发了基于FIV的载体作为源自病原性HIV-1基因组的载体的备选。这些载体的结构也类似于基于HIV-1的载体。

优选地，用于本发明的病毒载体具有最小的病毒基因组。

通过“最小病毒基因组”，应当理解，病毒载体已被操纵以便除去非必需元件并保留必要元件，以提供对靶宿主细胞进行感染、转导和递送感兴趣的核苷酸序列所需要的功能性。此策略的更多详情可以参见WO 1998/017815。

优选地，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体会具有足够的慢病毒遗传信息以允许将RNA基因组在存在包装组分的情况下包装成病毒颗粒，所述病毒颗粒能够感染靶细胞但不能独立复制以在最终的靶细胞内产生感染性病毒颗粒。优选地，载体缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或复制必需的其它基因。

然而，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包括与慢病毒基因组可操作连接以指导宿主细胞/包装细胞中基因组转录的转录调节序列。这些调节序列可以是与转录的病毒序列相关的天然序列(即5'U3区)，或者它们可以是异源启动子，例如另一种病毒启动子(例如CMV启动子)。

载体可以是自灭活(SIN)载体，其中病毒增强子和启动子序列已被删除。可以产生SIN载体，并且在体内以野生型载体的功效相似的功效转导非分裂细胞。SIN原病毒中的长末端重复序列(LTR)的转录失活应当阻止具有复制能力的病毒的动员。这还应当通过消除LTR的任何顺式作用来实现来自内部启动子调节的基因表达。

载体可能是整合缺陷的。整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)可以通过如下产生：例如，通过将载体与无催化活性的整合酶包装在一起(例如在催化位点中带有D64V突变的HIV整合酶；Naldini,L.et al.(1996)Science 272:263-7；Naldini,L.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-8；Leavitt,A.D.et al.(1996)J.Virol.70:721-8)或通过修饰或缺失载体来自LTR的必需att序列(Nightingale,S.J.et al.(2006)Mol.Ther.13:1121-32)，或通过上述项的组合。

HIV衍生载体

就HIV毒株而言，用于本发明的HIV衍生载体没有特别限制。可以在HIV序列数据库(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)上找到许多HIV毒株序列的例子。

单纯疱疹病毒(HSV)衍生载体

单纯疱疹病毒(HSV)是一种自然感染神经元的有包膜的双链DNA病毒。HSV可以容纳大部分外来DNA，使其成为载体系统具有吸引力，并且已被用作将基因传递给神经元的载体。

在治疗程序中使用HSV需要将菌株进行减毒，使得它们不能建立裂解周期。特别地，如果将HSV载体用于人类的基因疗法，则优选将NOI插入必需基因中。这是必需的，因为如果载体病毒遇到野生型病毒，则可以通过重组发生异源基因向野生型病毒的转移。然而，只要将NOI插入必需基因中，重组转移也将删除受体病毒中的必需基因，并防止异源基因“逃逸”到具有复制能力的野生型病毒群体中。

痘苗病毒衍生的载体

痘苗病毒是一种具有约190kb的线性双链DNA基因组的大的有包膜的病毒。痘苗病毒可容纳多达约25kb的外来DNA，这也使其可用于递送大的基因。

本领域已知许多适合基因疗法应用的减毒痘苗病毒株，例如MVA和NYVAC株。

病毒颗粒产生

在一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒产生者细胞用于产生包膜病毒颗粒的用途。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒各自包含少于10、5、4、3、2或1个表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒各自包含少于10个表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒各自包含少于5个表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒各自包含少于2个表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒不包含任何表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含在没有基因工程化的情况下(但在其他方面基本相同的情况下)由包膜病毒颗粒产生者细胞产生的颗粒上展示的表面暴露的CD47分子的数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在另一个实施方案中，包膜病毒颗粒基本上缺乏表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含在没有基因工程化的情况下(但在其他方面基本相同的情况下)由包膜病毒颗粒产生者细胞产生的颗粒上展示的表面暴露的MHC-I分子的数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在另一个实施方案中，包膜病毒颗粒基本上缺乏表面暴露的MHC-I分子。

量化病毒颗粒上表面暴露的蛋白质数目的方法是本领域已知的。合适的方法包括电子显微术。

例如，可以将病毒颗粒样品吸附到电子显微术格栅上(例如，如实施例中所公开)，并使用多聚甲醛固定在其上。然后可以先将样品与对感兴趣的蛋白质(例如CD47)具有特异性的一抗一起温育，然后与对一抗具有特异性的金颗粒缀合的二抗一起温育，然后使用多聚甲醛再进行固定步骤。然后可以使用电子显微镜对样品进行可视化，并对金颗粒进行计数，以量化感兴趣的表面暴露的蛋白质的数目。

包膜病毒颗粒产生者细胞可以包含病毒基因组。

病毒基因组是掺入病毒颗粒中的核酸序列。病毒基因组可以被工程化改造以包含感兴趣的核苷酸(NOI)。

因此，为了用于产生病毒颗粒，包膜病毒颗粒产生者细胞可以包含病毒基因组，并且随后在适合于产生包膜病毒颗粒的条件下培养。

“包膜病毒颗粒包装细胞”可以例如包含编码病毒颗粒组装所需要的一些或全部结构蛋白的核酸序列。

通过瞬时转染，转导或稳定整合每个其他需要的元件的随后步骤，仅包含产生包膜病毒颗粒所需的某些元件的细胞可用作生成病毒颗粒产生者细胞系的中间试剂。这些中间试剂被本发明的包装细胞涵盖。随后要用于产生包膜病毒颗粒产生者或包装细胞系的亲本细胞(其中细胞表面上CD47的表达已降低)代表了本发明的另一个实施方案。

可以将编码产生感染性的包膜病毒颗粒所需要的组分的核酸序列瞬时转染或转导至包装或产生者细胞中或稳定地维持于包装或产生者细胞内(例如稳定地整合入细胞基因组或以附加体形式维持)。或者，可以使用瞬时转染或转导以及稳定维持的组合将核酸序列引入细胞。

因此，本发明的细胞可以用包含病毒基因组的核酸转染或转导或者工程化改造为通过靶向整合稳定整合包含病毒基因组的核酸，以实现包含病毒基因组的包膜病毒颗粒的产生。

可以将编码产生感染性的包膜病毒颗粒所需要的不同组分的核酸序列作为不同的表达盒提供给细胞。

在一个实施方案中，本发明的包装细胞包含编码Gag、Gag/Pol和/或Env蛋白或其功能替代物的核酸序列。细胞可以任选地包含编码逆转录病毒载体颗粒装配可能需要的其他蛋白质，例如Rev蛋白质的核酸序列。

包膜病毒颗粒产生者或包装细胞可以是能够产生或包装包膜病毒颗粒的任何合适的细胞类型。细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。例如，包膜病毒颗粒产生者细胞可以源自亲本HEK-293细胞。

感兴趣的核苷酸

本发明的病毒颗粒可以包含感兴趣的核苷酸(NOI)。

优选地，感兴趣的核苷酸产生治疗作用。

合适的NOI包括但不限于编码酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、微小RNA、shRNA、siRNA、核酶、miRNA靶序列、靶蛋白的跨域(transdomain)负突变体、毒素、条件毒素、抗原、病毒蛋白、细菌蛋白、肿瘤抑制因子蛋白、生长因子、转录因子、膜蛋白、表面受体、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如具有相关报告基团的衍生物)。NOI也可以编码前药活化酶。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含编码细胞因子的转基因。在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包含编码干扰素，优选干扰素-α的转基因。本发明可以实现一种或多种细胞因子递送至肝巨噬细胞以治疗或预防癌症，例如转移。本发明可以实现干扰素(例如，干扰素-α)递送至肝，例如肝巨噬细胞。

NOI的另一个实例是可用于血友病的基因疗法的凝固因子VIII或凝固因子IX或其工程化衍生物，或可用于地中海贫血/镰状细胞病的基因疗法的β-珠蛋白链。

可以通过病毒载体蛋白质转移转移的合适蛋白质包括但不限于核酸酶、整合酶、转座酶、酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的跨域负突变、毒素、条件毒素、抗原、病毒蛋白、细菌蛋白、肿瘤阻抑物蛋白、生长因子、转录因子、膜蛋白、表面受体、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如具有相关报道基团的衍生物)。

药物组合物

可以配制本发明的包膜病毒颗粒或经转导的细胞以与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用于受试者。合适的载体和稀释剂包括等张盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并潜在含有人血清白蛋白。

优选地，细胞疗法产品的处理按照FACT-JACIE国际细胞疗法标准进行。

基因疗法

在一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒和经转导的细胞，用于疗法，例如用于基因疗法。包膜病毒颗粒可以称为有包膜的病毒载体颗粒。

“经转导的细胞”或已经“由有包膜的病毒载体颗粒转导的”细胞应当理解为由有包膜的病毒载体颗粒所携带的核酸(例如包含NOI)已经转移至细胞。被转导的细胞优选是靶细胞。

可将本发明的有包膜的病毒载体颗粒直接(例如系统性)施用于受试者。可以将病毒载体颗粒工程化改造以将感染靶向到受试者中的特定细胞。病毒载体颗粒也可以被工程化改造以将NOI的表达靶向到受试者中的特定细胞。这可以使用组织特异性启动子或有助于抑制特定细胞中NOI表达的核酸序列来实现。

有包膜的病毒载体颗粒还可以用于转导已经从受试者身体取出的细胞，作为离体基因疗法方法的一部分。

经转导的细胞可以作为自体细胞移植程序的一部分或作为同种异体细胞移植程序的一部分进行施用。

“自体干细胞移植物程序”应当理解为起始细胞群体(它们然后用本发明的有包膜的病毒载体颗粒转导)是从与接受经转导的细胞群体施用的受试者相同的受试者获得的。自体移植物程序是有利的，因为它们避免了与免疫学不相容性相关的问题，并且无论遗传匹配供体的可用性如何，可用于受试者。

“同种异体细胞移植物程序”应当理解为起始细胞群体(它们然后用本发明的有包膜的病毒载体颗粒转导)是从与接受经转导的细胞群体施用的受试者不同的受试者获得的。优选地，将供体与接受细胞施用的受试者遗传匹配，以使免疫学不相容的风险最小化。

例如，有包膜的病毒载体颗粒或经转导的细胞的合适剂量应当在治疗和/或预防上是有效的。待施用的剂量可以取决于受试者和待治疗的病况，并且可以由技术人员容易地确定。

本发明的病毒载体颗粒能够比未表现出表面暴露的CD47水平降低的病毒颗粒以更高的效率转导专职吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)。

本发明的病毒载体颗粒可用于将转基因转移到细胞如吞噬细胞和APC中。病毒载体颗粒可以用于癌症的治疗，例如通过癌症免疫疗法或通过直接的抗肿瘤作用。另外，病毒载体颗粒可用于治疗感染、免疫介导的疾病或自身免疫性疾病。这些效果可以通过将转基因转移到APC中来实现。

本发明的病毒载体颗粒可用于将抗原转移到APC中以用于免疫(疫苗接种)或免疫调节目的。

本发明的病毒载体颗粒也可以用于靶向巨噬细胞。在一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒用于转导肝巨噬细胞的用途。优选地，包膜病毒颗粒包含编码细胞因子的转基因。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒或经转导的细胞，用于治疗或预防癌症，优选肝癌(例如肝转移)。优选地，包膜病毒颗粒包含编码细胞因子的转基因。

本发明的有包膜的病毒载体颗粒或经转导的细胞可用于治疗遗传疾病，例如血浆蛋白缺乏、代谢病症、溶酶体贮积症、粘多糖贮积症、免疫缺陷、血液病症，包括但不限于血友病、腺苷脱氨酶严重合并免疫缺陷、Wiskott-Aldrich综合征、异染性脑白质营养不良、球状细胞性脑白质营养不良(globoid leukodystrophy)、β-地中海贫血和慢性肉芽肿病。

本发明的有包膜的病毒载体颗粒或经转导的细胞可用于治疗WO 1998/005635中列出的病症。为了便于参考，现在提供了所述列表的一部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病症、发热、心血管效应、出血、凝血和急性期反应、恶病质、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫性疾病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移、恶性、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默(Alzheimer)氏病、动脉粥样硬化、中风、血管炎、克罗恩(Crohn)氏病和溃疡性结肠炎；牙周炎，牙龈炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡，大疱性表皮松解症；角膜溃疡，视网膜病变和手术伤口愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化或内硬化(endosclerosis)。

另外/或者，本发明的有包膜的病毒载体颗粒或经转导的细胞可用于治疗WO1998/007859中列出的病症。为了便于参考，现在提供了该列表的一部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫性疾病，以及预防移植排斥或诱导肿瘤免疫)；调节血液生成，例如治疗髓样或淋巴样疾病；促进骨、软骨、肌腱、韧带和神经组织的生长，例如用于治疗伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周病以及神经变性；抑制或激活促卵泡激素(调节生育力)；趋化性/趋化因子活性(例如用于将特定细胞类型动员到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如败血性休克或克罗恩氏病)；作为抗微生物剂；例如新陈代谢或行为的调节剂；作为止痛药；治疗特定的缺陷性病症；在治疗例如银屑病中，在人或兽药物中。

另外/或者，本发明的产品、人工转录阻抑物(ATR)、多核苷酸和细胞可用于治疗WO1998/009985中列出的病症。为了便于参考，现在提供了该列表的一部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性和因此抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应答的抑制效应，包括与炎症无关的反应；抑制巨噬细胞和T细胞粘附于细胞外基质成分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中上调的fas受体表达；抑制不想要的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、与超敏反应相关的炎症、过敏反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫性疾病、与动脉粥样硬化有关的炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗死、血管炎症性疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病、与消化性溃疡相关的炎症、溃疡性结肠炎等胃肠道疾病、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺体疾病、肾小球肾炎或其它肾脏和泌尿疾病、耳炎或其它耳鼻喉科疾病、皮炎或其它皮肤疾病、牙周病或其它牙科疾病、睾丸炎或附睾炎(epididimo-orchitis)、不育、睾丸外伤(orchidal trauma)或其它免疫相关睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎性相关的妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、视神经炎、眼内炎症，例如视网膜炎或囊样斑点水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、变性性眼底病(degenerative fondus disease)的免疫和炎性成分、眼外伤的炎性成分、感染引起的眼部炎症、增殖性玻璃体视网膜病变、急性缺血性视神经病变、过度瘢痕形成，例如在青光眼过滤手术之后，针对眼部植入物的免疫和/或炎症反应和其它免疫和炎性相关眼科疾病、与自身免疫性疾病或状况或病症有关的验证(其中都在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎症抑制将是有益的)、帕金森氏病、来自治疗帕金森病的顺从性和/或副作用、AIDS相关性痴呆复合物HIV相关性脑病、德维克病(Devic’s disease)、西德纳姆舞蹈病(Sydenhamchorea)、阿尔茨海默氏病和CNS的其它变性性疾病、状况或病症、中风的炎性成分、脊髓灰质炎后综合征、精神障碍的免疫和炎性成分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴二氏综合征(Guillaim-Barresyndrome)，西德纳姆舞蹈病(Sydenhamchora)、重症肌无力、假性脑瘤(pseudo-tumourcerebri)、唐氏综合征(Down's Syndrome)、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性成分，肌肉萎缩和营养不良的炎性成分，以及中枢和周围神经系统的免疫和炎症相关疾病、状况或病症、创伤后炎症、感染性休克、感染性疾病、炎症并发症或手术的副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、基因疗法的炎症和/或免疫并发症和副作用，例如由于感染病毒载体，或与AIDS相关的炎症，以足以或抑制体液和/或细胞免疫应答，以治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病，例如，白血病(通过减少单核细胞或淋巴细胞的量进行)，以在移植天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、镜片、起搏器、天然或人工的皮肤组织的情况下预防和/或治疗的移植物排斥。

治疗方法

应当理解的是，本文中对治疗的所有提及均包括治愈、姑息和预防性治疗；尽管在本发明的上下文中提及预防与预防性治疗更相关。优选治疗哺乳动物，特别是人。人和兽医治疗两者均在本发明的范围内。

疫苗

在一方面，本发明提供了用作疫苗的本发明的包膜病毒颗粒。优选地，包膜病毒颗粒不是感染性的，例如不能感染细胞。优选地，包膜病毒颗粒不能复制。

减毒病毒在本领域中通常用作疫苗，以提供抵抗天然、有毒形式的病毒感染的免疫力。

可以使用如上所述的本发明的产生者细胞来产生用作疫苗的减毒病毒，其中优选地可以省略NOI。本发明的产生者细胞实现包膜病毒颗粒的产生，所述包膜病毒颗粒表现出减少数目的表面暴露的CD47分子，以用作疫苗。用作疫苗的有包膜的病毒载体颗粒可以基本上缺乏表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒各自包含少于10、5、4、3、2或1个表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒各自包含少于10个表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒各自包含少于5个表面暴露的CD47分子。在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒各自包含少于2个表面暴露的CD47分子。

在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒各自包含在没有基因工程化的情况下(但在其他方面基本相同的情况下)由包膜病毒颗粒产生者细胞产生的颗粒上展示的表面暴露的CD47分子的数目的小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

在一个实施方案中，用作疫苗的包膜病毒颗粒不包含任何表面暴露的CD47分子。

本发明的产生者细胞还可以实现包膜病毒颗粒的产生，所述包膜病毒颗粒表现出减少数目的表面暴露的MHC-I分子，以用作疫苗。用作疫苗的有包膜的病毒载体颗粒可以基本上缺乏表面暴露的MHC-I分子。

表面暴露的MHC-I分子的数目减少或缺乏在用作疫苗的病毒中是有利的，因为病毒不太可能会被与MHC-I结合的抗体所中和。

另外，免疫应答可以针对同种异体MHC-I而不是针对病毒抗原起反应，因此基本上缺乏同种异体MHC-I分子的病毒颗粒通过更有效地诱导保护性免疫而可以是更有效的疫苗。

用作疫苗的病毒可以进一步工程化改造，以在其表面上或感染细胞内表达其他蛋白质。这类蛋白质可以充当抗原，以产生抗体或细胞免疫，其可以进一步增加身体的免疫防御。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒进一步包含一种或多种抗原。一种或多种抗原可以源自例如病毒、细菌、真菌、原生动物和/或寄生物。

在一个实施方案中，抗原源自选自下组的病毒：埃博拉病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒、巨细胞病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、delta肝炎病毒、戊肝病毒、庚肝DNA病毒、细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒)、嵌杯病毒科、披膜病毒科(例如风疹病毒和登革热病毒)、黄病毒科、冠状病毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科(Birnaviridae)、Rhododoviridae(例如狂犬病毒)、纤丝病毒科、副粘病毒科(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒)、正粘病毒科(例如甲流、乙流和丙流病毒)、布尼亚病毒科、沙粒病毒科和逆转录病毒科(例如HIV-1、HIV-2和SIV)。

在一个实施方案中，抗原源自引起白喉、破伤风、百日咳或脑膜炎的细菌。

在一个实施方案中，抗原源自选自下组的细菌：白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertusis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，包括血清型脑膜炎球菌A、B、C、Y和WI35(MenA、B、C、Y和WI35)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza type B，Hib)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。

在一个实施方案中，抗原源自引起疟疾或莱姆病的寄生物。

熟练技术人员将理解，他们可以结合本文中公开的本发明的所有特征而不背离所公开的本发明的范围。

现在将通过非限制性实施例描述本发明的优选特征和实施方案。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中解释。参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.etal.(1995及定期增补)Current Protocols in Molecular Biology,第9、13和16章,JohnWiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.and McGee,J.O’D.(1990)In SituHybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；和Lilley,D.M.andDahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA,Academic Press。这些通用教科书中的每个均通过引用并入本文。

实施例

实施例1

结果

产生者细胞中的CD47破坏不影响慢病毒(LV)的产生

CD47是一种通过与其受体SIRPα受体的物种特异性相互作用的已知吞噬作用抑制剂。为了获得在表面上缺乏CD47分子的慢病毒(LV)(无CD47的LV)，我们通过瞬时转染表达Cas9的质粒以及三种不同的gRNA将产生者细胞中的CD47基因进行遗传失活，并且进行FACS分选至纯度CD47-阴性产生者细胞(图1a-b)。CD47阴性细胞产生的LV具有与其CD47阳性对应物等同的感染力(图1c)。

无CD47的LV显示增强的原代人类吞噬细胞转导

CD47分子以与产生者细胞膜上CD47表达成正比的水平掺入LV颗粒上，如通过用抗CD47抗体免疫染色的LV颗粒的电子显微术所示(图2a，b)。因此，由CD47阴性细胞产生的LV是无CD47的LV。重要的是，LV颗粒上的CD47含量不影响包膜VSV.G蛋白的掺入(图2c)。当无CD47的LV和对照LV的匹配输入暴露于原代人巨噬细胞时，我们发现前者比后者对人巨噬细胞的显著更高的转导，而参考293T细胞的转导保持不变(图2d)。这些数据指示，调节LV颗粒上CD47的水平影响其被人类巨噬细胞摄取。我们在树突细胞分化方案的第2天用LV-GFP转导人类原代单核细胞，在分化结束时测量GFP表达，并且发现与对照LV相比，无CD47的LV的更高的基因转移效率(图2e)。此外，我们生成了带有绿色荧光蛋白(GFP)的荧光LV，该绿色荧光蛋白与pp60Src的膜靶向域融合，先前显示有效地掺入出芽的HIV包膜中的嵌合蛋白。可以使用ImageStream将这些荧光LV颗粒在进入原代人类巨噬细胞中后进行可视化，所述ImageStream是一种组合的流式细胞术和成像系统，其允许LV进入的高通量量化。使用此种方法，我们证实了与对照LV相比，无CD47的LV的吞噬作用增加(图2f)。

无CD47的LV在体内施用时显示肝和脾专职吞噬细胞的摄取增加

已经显示非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的SIRPα对人CD47具有高亲和力。因此，我们比较了将LV施用于NOD和C57BL/6血友病B小鼠的结果。我们发现，在NOD相对于C57BL/6小鼠中分选的肝细胞中每个细胞的LV拷贝(载体拷贝数，VCN)高4倍和肝巨噬细胞和脾脏中的VCN分别低30倍和5倍(图3a)。令人感兴趣的是，NOD浆细胞样树突细胞(pDC)中的LV拷贝也低于>10倍，所述NOD浆细胞样树突细胞是已知的病毒核酸传感器，并且报道在暴露于LV颗粒后释放I型干扰素(IFN)。肝细胞类型之间生物分布的这些毒株间差异主要取决于NOD SIRP-α和LV颗粒上人CD47分子之间的相互作用，因为当我们以相同剂量施用无CD47的LV时，它们几乎被完全消除(图3b)。无CD47的LV在NOD小鼠中以比其携带CD47的对应物高的效率转导肝巨噬细胞、肝pDC和脾(图3c)。

无CD47的LV施用导致吞噬细胞相关的促炎细胞因子增加

在静脉内LV施用后，CD47的表面展示也影响急性细胞因子和趋化因子的释放。具体而言，白细胞介素6(IL6)、单核细胞化学引诱物蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1α)、MIP-1β、趋化因子(CXC基序)配体1(CXCL1)和粒细胞集落刺激因子在LV施用后3小时在LV处理的小鼠中与未处理的NOD小鼠相比显著增加。令人感兴趣的是，向NOD小鼠施用无CD47的LV触发这些巨噬细胞相关的细胞因子和促炎性细胞因子的最强增加(图4a-1)。这些数据与所观察到的由LV颗粒的CD47内容物对专职吞噬细胞摄取的调节一致。

活体内成像显示CD47调节库普弗细胞(KC)的LV吞噬作用的速率和程度

为了实时研究静脉内施用后肝脏中LV吞噬作用的动力学，我们进行了活体内2光子显微术(IV2PM)。为了使LV可视化，我们使用了在对照293T、CD47hi 293T或CD47阴性293T细胞中产生的荧光LV，如本文所述。在麻醉小鼠的手术暴露肝脏中实时记录LV摄取。在C57BL/6小鼠中施用GFP标记的LV导致库普弗细胞(KC)的快速且广泛的摄取(通过在施用LV之前输注抗F4/80抗体可视化)，其在施用后的5-10分钟内的检查的场中都变为LV阳性(图5)。相比之下，对NOD小鼠施用相同的LV显示KC摄取的延迟和总体下降；当施用CD47hi LV时，这甚至进一步降低，与对照LV相比，对于CD47hi在记录结束时(LV后40分钟)仅LV阳性KC的分数的一半。重要的是，在NOD小鼠中KC对无CD47的LV摄取的动力学和量反而非常快，并且与C57BL/6小鼠中注射的对照LV的那些重叠。根据LV表面上CD47的识别和含量，KC摄取LV的明显不同时机和程度提供了该分子在体内保护LV免受吞噬作用的主要作用的直接证据。

基于LV的干扰素向肝脏的递送

我们的结果指示，基于LV的干扰素alpha(IFNα)递送可在治疗小鼠的肝脏中诱导IFN标签的激活(图6)。值得注意的是，利用上述体内基因疗法而不是依靠外源细胞因子施用的基本原理是基于放过脱靶组织并以近生理水平达到局部、稳定和连续的细胞因子表达的机会，因此限制以下的风险：(i)不良事件；(ii)脱靶效应；和(iii)来自暴露于过多细胞因子给药的脱敏。我们在非人类灵长类(NHP)中进行的放大研究指示，在没有任何明显的急性毒性的情况下，并且在从肝脏和脾脏中恢复几乎所有整合的LV的情况下，可实现稳定、稳健的且肝LV驱动的转基因表达。(Milaniet al.(2019)SciTransl Med)。

材料和方法

质粒构建

先前描述了表达Cas9和sgRNA的质粒(Amabile,A.et al.(2016)Cell 167:219-232 e214)。用于产生sgRNA的CRISPR的序列是：CD47 A(CTACTGAAGTATACGTAAAGTGG)；B(CTTGTTTAGAGCTCCATCAAAGG)；和C(ATCGAGCTAAAATATCGTGTTGG)。

载体产生

实验室级VSV.G假型化第三代自失活(SIN)LV是通过磷酸钙瞬时转染到293T细胞中或通过LV稳定的产生者细胞系产生的(Milani et al.,EMBO Mol Med 9(11):1558-1573)。用含有所选LV基因组转移质粒，包装质粒pMDLg/pRRE和pCMV.REV、pMD2.G和pAdvantage混合物的溶液转染293T细胞，如先前所述(Milani et al.,EMBO Mol Med 9(11):1558-1573)。转染后14-16小时更换培养基，并且更换培养基后30小时收集上清液。或者，当LV产生者细胞处于亚汇合状态时，通过用含有1μg/mL的多西环素(Sigma)的培养基更换培养基来诱导LV产生，并在诱导后3天收集上清液。将含LV的上清液通过0.22μm过滤器(Millipore)进行灭菌，并在需要时转移到无菌的poliallomer试管(Beckman)中，并于20℃以20,000g离心120分钟(Beckman Optima XL-100K Ultracentrifuge)。将LV沉淀物溶解在适当体积的PBS中以允许500-1000x浓度。

LV滴定

对于LV滴定，在聚凝胺(8μg/mL)存在下，用连续LV稀释液转导1×10⁵个293T细胞。对于LV-GFP，在转导后3-7天通过流式细胞术分析细胞，并用公式TU/mL＝((％GFP+细胞/100)×100,000×(1/稀释因子))计算感染滴度，表示为转导单位293T(TU)/mL。对于所有其他LV，转导后14天，使用Maxwell 16细胞DNA纯化试剂盒(Promega)，按照制造商的说明提取基因组DNA(gDNA)。使用引物(HIV fw:5’-T ACTGACGCTCTCGCACC-3’；HIV rv:5’-TCTCGACGCAGGACTCG-3’)和探针(FAM 5’-ATCTCTCTCCTTCTAGCCTC-3’)从100ng模板gDNA开始通过定量PCR(qPCR)确定VCN，所述引物在LV的引物结合位点区域上设计。通过在人类端粒酶基因上设计的引物/探针组(Telofw:5’-GGCACACGTGGCTTTTCG-3’；Telorv:5’-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3’；Telo探针:VIC 5’-TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG-3’TAMRA)或人类GAPDH基因(Applied Biosystems HS00483111_cm)量化内源DNA的量。通过公式＝(ng LV/ng内源DNA)x用作标准曲线的样品的VCN来计算VCN。通过使用稳定携带1个载体整合子的CEM细胞系生成标准曲线，该细胞系先前通过Southern印迹和荧光原位杂交(FISH)确定。所有反应在Viia7实时PCR热循环仪(Applied Biosystems)中一式两份或一式三份进行。每个qPCR运行带有内部对照，该内部对照是通过使用稳定携带4个载体整合子的CEM细胞系生成的，所述细胞系先前通过Southern印迹和FISH分析确定。使用公式TU/mL＝(VCN×100,000×(1/稀释因子)计算感染滴度，表示为TU/mL。通过HIV-1Gag p24抗原免疫捕获测定法(Perkin Elmer)根据制造商的说明测量LV物理颗粒。根据感染滴度和物理颗粒之间的比率计算LV比感染性。

小鼠实验

NOD和野生型C57BL/6小鼠购自Charles River。将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下。通过尾静脉注射在成年(7-10周龄)小鼠中进行载体施用。使用毛细管将小鼠从眶后丛取血，并将血液收集到0.38％柠檬酸钠缓冲液pH 7.4中。将小鼠用三溴乙醇(Avertin)深度麻醉，并在安排的时间通过吸入CO₀实施安乐死。所有动物程序均根据机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

肝细胞亚群的分级和分选

在随后的步骤中，经由下腔静脉向肝脏灌注(2.5mL/min)12.5mL的以下溶液：1)PBS EDTA(0.5mM)，2)HBSS(汉克氏平衡盐溶液，Gibco)和HEPES(10mM)，3)HBSS-HEPES0.03％胶原酶IV(Sigma)。收获消化的肝组织，使其通过70μm细胞过滤器(BDBiosciences)，并处理成单细胞悬浮液。随后将该悬浮液离心3次(在室温下30、25和20g，3分钟)以获得含PC的沉淀物。将含有nPC的上清液离心(650g，在室温下7分钟)，并将回收的细胞上样到30/60％Percoll(Sigma)梯度上(1800g，在室温下20分钟)。收集nPC界面并洗涤两次。随后将nPC与以下单克隆抗体一起温育：e-fluor 450缀合的抗CD45(30-F11，e-Bioscience)、别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD31(MEC13.3，BD Biosciences)、藻红蛋白(PE)缀合的F4/80(CI:A3-1，Biorad)、PE-Cy5缀合的抗CD45R/B220(来自BD Biosciences)、PE-Cy7缀合的抗CD11c(N418，e-Bioscience)、纯化的抗CD16/32(2.4G2，BD Biosciences)。通过FACS，MOFLO-DAKO-Beckman-Coulter分选nPC亚群(LSEC，KC，pDC)；通过FACS除去污染PC悬浮液的nPC，排除用APC缀合的抗CD31/抗CD45混合物标记的细胞，从而获得分选的肝细胞(Hep)。

细胞培养和体外实验

在补充有10％胎牛血清(FBS，Euroclone)、4mM谷氨酰胺(Lonza)、青霉素和链霉素100IU/mL(Lonza)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma)中维持293T和LV产生者细胞系。原代人类巨噬细胞得自通过阴性选择(泛单核细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)分离的CD14阳性细胞，得自健康供体的血沉棕黄层(根据S.R.S.I.伦理委员会批准的方案获得)，并在补充有5％人血清、4mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素100IU/mL的IMDM中分化7天。通过流式细胞术确定CD14阳性细胞的纯度，并且是>90％。在hGM-CFS 100ng/mL和hIL4 10ng/mL的存在下，通过7天的培养，在树突细胞中分化CD14阳性单核细胞。将所有细胞在37℃在5％CO₂湿润气氛中维持。常规测试所有细胞系的支原体污染。通过旋转接种(1,100g，在37℃)转导人原代巨噬细胞和293T达1小时，然后用PBS洗涤并培养3天。

基因破坏和错配选择性内切核酸酶测定法

通过指示量的期望sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒的磷酸钙介导的瞬时转染来进行基因破坏。使用错配选择性内切核酸酶测定法来测量由于Cas9靶位点处的非同源末端连接(NHEJ)所致的突变程度(Lombardo,A.et al.(2011)Nat Methods 8:861-869)。使用CD47基因中sgRNA结合位点侧翼的引物(fw:5’-TTCCTTTCCAGGATCAGCTCAGC-3’；rv:5’-TTGATTCAAAGGAGTACCTATCCC-3’)进行PCR。使PCR产物变性，允许再退火并用Surveyor核酸酶测定法(Transgenomic)消化。因为该酶在双链体畸变的位点处切割DNA，所以野生型和突变型等位基因(由于核酸酶活性而携带的突变或缺失)之间的再退火产物被特异性消化。将反应产物在Spreadex EL1200 Wide Mini凝胶(Elchrom Scientific)上分离，用溴化乙啶或GelRed(Biotium)染色，并通过ImageQuant TL 5软件对条带的强度进行定量。使用公式(1-(亲本分数)1/2)x100计算未切割的亲本片段与两个较低迁移的切割产物的比率。

流式细胞术

使用配备有DIVA软件的FACSCanto分析仪(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。收获100,000-500,000个细胞，用PBS或MACS缓冲液(PBS pH 7.20.5％BSA，2mM EDTA)洗涤，当抗体染色时用Fc Receptor-Block(Miltenyi Biotec)处理，然后重悬于洗涤用缓冲液。在MACS缓冲液中进行染色，在黑暗中于4℃将细胞与抗体(下表中所示的比例)温育20分钟。抗鼠IgG珠用于单一染色对照(BD Biosciences)。抗CD47 Pacific Blue(BDBiosciences，B6H12，1:20)。

电子显微术

将几微升浓缩的LV批次吸附在辉光放电碳涂层的Formvar铜网格上，并用PBS中的8％多聚甲醛固定20分钟。在PBS中的50mM甘氨酸中洗涤几次后，将网格在PBS中的1％BSA中封闭，并与在封闭缓冲液中稀释的一抗温育30-90分钟(抗VSV.G,KeraFAST,1:50,Anti-CD47,BD Biosciences,1:10)。用PBS中的0.1％BSA洗涤几次后，将样品与蛋白A-金(10nm)温育30分钟，用1％戊二醛固定，用2％乙酸铀酰染色并风干。用Zeiss LEO 512透射电子显微镜观察网格。EsivisionPro 3.2软件控制的2k x 2k底部安装的底部缓慢扫描Proscan相机采集图像。为了量化标记密度，以名义放大率16k拍摄病毒颗粒的随机图像，并使用ImageJ手动计算与病毒体相关的金颗粒。基于预期的大小(约120nm)和电子致密核限定病毒体。

细胞因子ELISA

通过基于磁性的多重ELISA 23分析物(Bio-Plex 23-Plex，I组，Biorad)，按照制造商的说明测定小鼠血清中细胞因子和趋化因子的浓度。

VCN确定

对于人类巨噬细胞实验，使用QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen)按照制造商的说明提取DNA。对于小鼠实验，使用Maxwell 16组织DNA纯化试剂盒(Promega)从全肝或整个脾脏样品中提取DNA，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)或QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen)根据细胞数目从分级/分选的肝细胞中提取DNA。如上所述(参见“LV滴定”)，在人巨噬细胞中测定VCN。用稳定的LV产生者细胞系产生的LV转导人原代巨噬细胞，因此缺乏质粒污染。使用LV的引物结合位点区上设计的引物/探针组(参见上文的“LV滴定”)，从5-20ng模板gDNA开始，通过ddPCR测定鼠DNA中的VCN。通过在鼠sema3a基因上设计的引物/探针组(Sema3A fw:5’-ACCGATTCCAGATGATTGGC-3’；Sema3A rv:5’-TCCATATTAATGCAGTGCTTGC-3’；Sema3A探针:HEX 5’-AGAGGCCTGTCCTGCAGCTCATGG-3’BHQ1)量化内源鼠DNA的量。按照制造商的说明(Biorad)用每种引物(900nM)和探针(250nM)进行PCR反应，用QX200阅读器阅读，并用QuantaSoft软件(Biorad)分析。

ImageStream

使用ImagestreamX MarkII系统(Amnis，Merck)，通过成像流式细胞术分析原代人巨噬细胞和293T细胞中的LV进入。仪器配备有3种激光(405nm，488nm和642nm)、6通道CCD摄像机、Multimag选项，但没有扩展的场深度选项。激发激光设置如下：405nm(10mW)，488nm(200mW)。以60X_0.9NA的低速物镜为每个样品收集至少5000个事件，并使用IDEAS 6.2软件分析图像。在样品的相同激光设置但没有明场照明和侧散射照明的情况下采集单染色样品，并用于补偿。

活体成像

如所述(Benechet,A.P.et al.(2017)Methods Mol Biol 1514:49-61)手术准备C57BL/6或NOD小鼠以进行肝IV2PM。成像前20分钟，给小鼠静脉内注射PE缀合的抗F4/80抗体(克隆BM8，Biolegend)。开始录制视频后2分钟，静脉内注射GFP标记的LV、CD47hi或无CD47的LV。用Nikon Ti-U荧光倒置显微镜和25倍物镜(NA 0.95)获得图像(TriMScope II)。对于四维分析，每20秒获取300-至400-μm2 xy-切片的8至12个z堆栈(间距4μm)。通过在成像前立即静脉内注射非靶向性量子点(Quantum Dot)655(Invitrogen)来可视化肝窦。使用Imaris软件(Bitplane)将图像堆栈顺序转换为体积渲染的三维视频。

统计分析

在与圣拉斐尔大学生物医学统计中心(CUSSB)的专职统计学家进行咨询后，进行了统计分析。当不满足正态性假设时，进行非参数统计检验。当比较2个或更多个实验组时分别进行Mann-Whitney或Kruskall-Wallis测试。对于随时间的重复测量，进行双向ANOVA。对于配对观察，进行Wilcoxon匹配对检验。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明公开的病毒颗粒、细胞、组合物、用途和方法的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案公开了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应过度限制于此类特定实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，所公开的用于实施本发明的方式的各种修改都在所附权利要求书的范围之内。

Claims (21)

1.包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少所述细胞表面上CD47的表达。

2.权利要求1的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞包含编码CD47的基因的遗传工程化破坏。

3.权利要求1或2的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞经进一步遗传工程化改造以降低所述细胞表面上MHC-I的表达。

4.前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的遗传工程化破坏和/或编码MHC-Iα链的一个或多个基因的遗传工程化破坏。

5.前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞是HEK-293细胞或其衍生物，优选其中所述细胞是HEK-293T或HEK-293T-REx细胞。

6.前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、嗜肝性DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、博尔纳病毒、弹状病毒或纤丝病毒颗粒、或源自它们的病毒颗粒。

7.前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒，优选地其中所述包膜病毒颗粒是慢病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒。

8.用于产生根据前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者或包装细胞系的亲本细胞，其中所述亲本细胞经遗传工程化改造以降低所述细胞表面上CD47的表达。

9.前述权利要求中任一项的包膜病毒颗粒产生者细胞在产生包膜病毒颗粒中的用途。

10.产生包膜病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)提供根据权利要求1-7中任一项的包膜病毒颗粒产生者细胞；和

b)在适合于产生所述包膜病毒颗粒的条件下培养所述细胞。

11.可通过权利要求10的方法获得的包膜病毒颗粒。

12.权利要求11的包膜病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒颗粒，或源自它们的病毒颗粒，优选地其中所述包膜病毒颗粒是慢病毒颗粒或源自它们的病毒颗粒。

13.权利要求11或12的包膜病毒颗粒在转导巨噬细胞、吞噬细胞、抗原呈递细胞或单核细胞中的用途。

14.由权利要求11或12的包膜病毒颗粒转导的细胞。

15.药物组合物，其包含权利要求11或12的包膜病毒颗粒或权利要求14的细胞，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

16.权利要求11或12的包膜病毒颗粒或权利要求14的细胞，用于疗法，优选地用于治疗或预防癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病。

17.权利要求11或12的包膜病毒颗粒或权利要求14的细胞，用于疫苗接种或基因疗法，优选地用于治疗或预防癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病。

18.治疗癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的方法，其包括用权利要求11或12的包膜病毒颗粒转导细胞，优选地其中所述转导在离体或体外进行。

19.治疗癌症、细菌性或病毒性感染、免疫介导性疾病或自身免疫性疾病的方法，其包括将权利要求11或12的包膜病毒颗粒或权利要求14的细胞施用于有此需要的受试者。

20.权利要求11或12的包膜病毒颗粒，其用作疫苗。

21.疫苗接种方法，其包括将权利要求11或12的包膜病毒颗粒施用于有此需要的受试者。

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