CN106795500A

CN106795500A - 载体生产

Info

Publication number: CN106795500A
Application number: CN201580049356.7A
Authority: CN
Inventors: A.坎托雷; A.L.洛姆巴尔多; L.纳尔迪尼
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Telethon
Current assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Telethon
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: JP6643311B2; US11957747B2; AU2015291213B2; WO2016009326A1; CN116218779A; US20170165348A1; GB201412494D0; AU2021290226B2; US20210346489A1; JP2017525344A; AU2015291213A1; CA2954478C; EP3169788A1; CN106795500B; AU2021290226A1; CA2954478A1; US10912824B2; AU2024203415A1

Abstract

本发明涉及包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞被基因工程改造以减少细胞表面上的MHC‑I的表达。

Description

载体生产

技术领域

本发明涉及显示水平降低的表面暴露抗原的细胞。更具体地，本发明涉及细胞的基因工程改造，以减少细胞表面上主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的表达。特别地，本发明涉及这种细胞在包膜病毒颗粒生产中的用途。

发明背景

基因治疗包括将遗传物质掺入细胞以治疗或预防疾病。遗传物质可以用那些基因的功能性拷贝补充缺损基因，使不适当功能的基因失活或将新的治疗基因引入细胞。

遗传物质向细胞的递送可以通过使用促进核酸转移的载体来实现。病毒可以被工程改造以将目标核苷酸（NOI）递送到靶细胞，并且通常在基因治疗中用作载体。迄今为止用于基因治疗的病毒包括逆转录病毒、腺病毒（AdV）、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）和牛痘病毒。

逆转录病毒，例如α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒，对于基因治疗特别有用，因为它们允许校正遗传物质稳定整合到靶细胞中。在基于用于以下的源自γ-逆转录病毒的载体的临床试验中已经实现了治疗益处：腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷（ADA-SCID; Aiuti，A.等人（2009）N. Engl. J. Med. 360：447- 58）、X-连锁性严重联合免疫缺陷（SCID-X1; Hacein-Bey-Abina，S.等人（2010）N. Engl. J. Med. 363：355-64）和Wiskott-Aldrich综合征（WAS; Boztug，K.等人（2010）N. Engl. J. Med. 363：1918-27）。此外，慢病毒载体已经用作治疗X-连锁性肾上腺脑白质营养不良的递送载体（ALD;Cartier，N.等人（2009）Science 326：818-23），和最近用于异染色性脑白质障碍症（MLD;Biffi，A.等人（2013）Science 341：1233158）和WAS（Aiuti，A.等人（2013）Science 341：1233151）。在临床前研究中，也已经静脉内施用慢病毒载体用于血友病的小鼠和狗模型中的该疾病的肝脏定向基因治疗（Cantore A.等人，Blood 2012; Matsui H.等人，Mol Ther2011; Cantore A.等人，Science Translational Medicine 2015 7：277ra28）。然而，与在基因治疗中使用病毒载体相关的显著问题是它们被靶生物体的免疫系统识别。在包膜病毒载体颗粒（例如逆转录病毒载体颗粒）的情况下，可以识别显示在病毒包膜表面上的膜结合蛋白，并且可以中和病毒颗粒本身。此外，在感染靶细胞时，病毒包膜与细胞膜整合，并因此病毒包膜蛋白可以显示在细胞表面上或保持与细胞表面的紧密结合。因此，免疫系统也可以靶向病毒载体颗粒已经感染的细胞。这两种效应可能导致通过病毒载体的NOI递送的功效的降低。

病毒颗粒包膜通常源于生产细胞的膜。因此，在病毒颗粒从其中芽生的细胞膜上表达的膜蛋白可以掺入病毒包膜中。主要组织相容性复合体I类（MHC-I）是一种这样的细胞膜蛋白，并且因为其在性质上是高度多态性的，此外它是身体免疫应答的主要靶标（McDevitt H.O.（2000）Annu. Rev. Immunol. 18：1-17）。

暴露于产生逆转录病毒载体的细胞的质膜上的MHC-I分子在载体芽殖过程中掺入病毒颗粒包膜中。源自生产细胞并掺入病毒颗粒中的这些MHC-I分子又可以转移到转导细胞的质膜上。或者，由于病毒颗粒吸收并保持结合到靶细胞膜的趋势，MHC-I分子可保持与转导细胞膜紧密结合。

外源MHC-I分子在转导细胞的质膜上存在或与其邻近可以在人和实验动物模型中引发同种异体反应性免疫应答。这可以在离体基因转移随后将转导细胞施用于受试者或者在直接体内施用病毒颗粒时，导致转导细胞的免疫介导的杀伤或吞噬作用。此外，在将带有MHC-I的病毒颗粒体内施用到血流中的情况下，病毒颗粒可在到达其靶细胞之前被预先存在的MHC-I特异性抗体中和。

发明内容

我们已经产生了可以用于生产基本上没有表面暴露的MHC-I分子的包膜病毒颗粒（例如逆转录病毒载体颗粒）的基因工程改造细胞。令人惊讶的是，我们已经显示，表面暴露的MHC-I分子的不存在不显著影响这些细胞产生包膜病毒颗粒的能力。特别地，我们已意料不到地显示，与展示表面暴露的MHC-I的生产细胞相比，包膜病毒颗粒以相当的滴度和产率产生，并且不表现出降低的感染性。用这些细胞产生的包膜病毒颗粒将在基因治疗期间引起较少的不期望的免疫应答，并提供更大的功效和安全性。

一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒生产细胞，其中所述细胞被基因工程改造以减少细胞表面上的MHC-I的表达。

在另一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒包装细胞，其中所述细胞被基因工程改造以减少细胞表面上的MHC-I的表达。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒包装或生产细胞包含编码β2-微球蛋白（β2M）的基因的基因工程改造破坏。在另一个实施方案中，所述细胞包含编码MHC-I α链的一个或多个基因的基因工程改造破坏。所述细胞可以在编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝中包含基因工程改造破坏。所述细胞可以在编码MHC-I α链的基因的所有拷贝中包含基因工程改造破坏。所述细胞可以包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破坏和编码MHC-I α链的基因的基因工程改造破坏两者。

可以减少细胞表面上MHC-I的表达，使得所述细胞基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

术语病毒颗粒“生产细胞”包括在产生病毒颗粒所必需的所有元件的瞬时转染、稳定转染或载体转导后产生病毒颗粒的细胞，或工程改造成稳定包含产生病毒颗粒所必需的元件的任何细胞。

术语“包装细胞”包括含有包装感染性重组病毒所需的一些或所有元件的细胞。包装细胞可以缺少重组病毒载体。通常，这种包装细胞含有能够表达病毒结构蛋白的一种或多种载体。通过随后的每个额外所需元件的瞬时转染、转导或稳定整合的步骤，仅包含用于产生包膜病毒颗粒所需要的一些元件的细胞可用作产生病毒颗粒生产细胞系的中间反应物。这些中间反应物包括在术语“包装细胞”中。随后用于产生包膜病毒颗粒生产者或包装细胞系的亲本细胞也包括在本发明中，其中细胞表面上的MHC-I的表达已经减少。

本文提及的病毒颗粒包括具有复制能力或复制缺陷型病毒，由其获得的病毒载体，并且其可以或可以不包含目标核苷酸。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒生产者或包装细胞源自HEK-293细胞。

在一个实施方案中，包膜病毒载体颗粒源自逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、波纳病毒、弹状病毒或线状病毒。

在一个实施方案中，包膜病毒载体颗粒源自逆转录病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒源自HIV。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞群体。

在一个实施方案中，该群体中至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞已经根据本发明进行基因工程改造。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞用于生产包膜病毒颗粒的用途。优选地，所述包膜病毒颗粒基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

在另一方面，本发明提供了产生包膜病毒颗粒的方法，包括以下步骤：

a）提供根据本发明的包膜病毒颗粒生产细胞；和

b）在适于产生包膜病毒载体颗粒的条件下培养所述细胞。

在另一方面，本发明提供了通过本发明的包膜病毒颗粒生产方法生产的包膜病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供包含数目减少的表面暴露的MHC-I分子的包膜病毒颗粒。表面暴露的MHC-I分子的数目可以减少，使得对MHC-I的免疫应答降低至治疗相关程度。

优选地，包膜病毒载体颗粒基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

本发明的包膜病毒颗粒可以源自逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、波纳病毒、弹状病毒或线状病毒。

所述包膜病毒载体颗粒可以源自逆转录病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒。

所述包膜病毒载体颗粒可以源自HIV。

优选地，本发明的包膜病毒颗粒用于蛋白转移（Bobis-Wozowicz S. 等人，SciRep. 2014; Voelkel C.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2010; Maetzig T. 等人，CurrGene Ther. 2012）。

优选地，所述包膜病毒颗粒包含目标核苷酸（NOI）。优选地，所述包膜病毒颗粒是减毒病毒，例如复制缺陷型病毒。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒群体。

在一个实施方案中，群体中至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的颗粒源自本发明的包膜病毒颗粒生产细胞。在一个实施方案中，群体中100％的颗粒源自本发明的包膜病毒颗粒生产细胞。在一个实施方案中，群体中的颗粒基本上不包含表面暴露的MHC-I。

另一方面，本发明提供了由本发明的包膜病毒颗粒转导的细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞或人细胞。

另一方面，本发明提供了包含本发明的包膜病毒颗粒或本发明的转导细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒用于治疗。本发明的包膜病毒颗粒可用于基因治疗。

在另一方面，本发明提供了本发明的转导细胞用于治疗。本发明的转导细胞可用于基因治疗。

在另一方面，本发明提供了基因治疗的方法，包括用本发明的包膜病毒颗粒转导细胞。

在一个实施方案中，所述转导离体进行。

另一方面，本发明提供了基因治疗的方法，包括将本发明的包膜病毒颗粒或本发明的转导细胞施用于有其需要的受试者。

在另一方面，本发明提供了用作疫苗的本发明的包膜病毒颗粒。

在另一方面，本发明提供了接种疫苗的方法，包括将本发明的包膜病毒颗粒施用于有其需要的受试者。

附图说明

图1

在FACS分选后一个月进行的慢病毒载体（LV）包装细胞系（A-D）或HEK-293T细胞（E-H）流式细胞术分析（具有异常值的轮廓图），未处理的、CRISPR/Cas9-处理的、β2M+或β2M-分选如所示。用PE-缀合的抗人β2M和APC-缀合的全抗人MHC-I对细胞染色。

图2

具有非同源末端连接（NHEJ）的β2M等位基因的百分比，在FACS分选后一个月进行的在慢病毒载体（LV）包装细胞（A）或HEK-293T细胞（B）中通过错配选择性内切核酸酶测定法（Cel1 测定）测定的未处理的（UNT）、CRISPR/Cas9-处理的、β2M+或β2M-分选如所示的。

图3

如所示，通过瞬时转染，在β2M+或β2M-HEK-293T细胞中产生的慢病毒载体（LV）的滴度（A）、颗粒（B）和感染性（C）（n = 3，对于滴度p = 0.1000，对于颗粒p = 0.3758，对于感染性p = 0.1157）。用1μg/ mL多西环素（n = 4，p = 0.1010）诱导3天后，由β2M+或β2M-包装细胞产生的LV的颗粒（D）。

图4

来自由β2M+（+）或β2M-（-）生产细胞产生的数批慢病毒载体（LV）的蛋白提取物的蛋白印迹分析。

图5

基于以每分钟计数（CPM）定量的氚化胸苷掺入的增殖测定（A）。数据是平均值和SEM（n= 3）。作为实验条件（用由β2M+（+）或β2M-（-）细胞产生的慢病毒载体（LV）转导的树突细胞（DC）孵育的CD4⁺ T细胞）与对照条件（用未转导的DC孵育的CD4⁺ T细胞）的CPM之间的比率计算的刺激指数（B）。

发明详述

现在将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方案。

除非另有说明，本发明的实践将采用本领域普通技术人员能力范围内的化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中解释。参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F., 和Maniatis，T.（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. 等人（1995 和定期增刊）Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley＆Sons; Roe，B.，Crabtree，J.，和Kahn，A.（1996）DNA Isolation and Sequencing： Essential Techniques，John Wiley＆Sons; Polak，J.M.，和McGee，J.O’D.（1990）In Situ Hybridization：Principles and Practice，Oxford University Press; Gait，M.J.（1984）Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press; 和Lilley，D.M.和Dahlberg，J.E.（1992）Methods in Enzymology：DNA Structures Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA，Academic Press。这些总体文本中的每一篇通过引用并入本文。

MHC-I在细胞表面上的表达减少是指与缺乏基因工程改造的细胞的表面上表达的MHC-I分子的数目相比，在已被基因工程改造的细胞的表面上表达的MHC-I分子数目减少，但在其它基本上相同的条件下。

可以减少细胞表面上MHC-I的表达，使得表面暴露的MHC-I分子的数目例如少于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的在不存在基因工程改造时显示的表面暴露的MHC-I分子的数目。在一个实施方案中，细胞表面上的MHC-I的表达减少，使得表面暴露的MHC-I分子的数目为在不存在基因工程改造时显示的表面暴露的MHC-I分子的数目的0％。

优选减少细胞表面上MHC-I的表达，使得所述细胞基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

“基本上没有”应理解为与在缺乏基因工程改造的细胞表面上表达的MHC-I分子的数目相比，在已经基因工程改造的细胞的表面上表达的MHC-I分子的数目显著减少，使得对由所述细胞产生的包膜病毒颗粒上的MHC-I的免疫应答降低至治疗有用的程度。

在另一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破坏。

在另一方面，本发明提供了包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞包含编码MHC-I α链的基因的基因工程改造破坏。

在一个方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞的群体。

优选地，群体中的细胞的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100%不包含表面暴露的MHC-I。

用于定量细胞群体中细胞表面暴露的蛋白的蛋白表达的方法是本领域已知的。合适的方法包括流式细胞术、荧光激活细胞分选（FACS）和荧光显微镜。

例如，细胞群体可以与对MHC-I有特异性的抗体接触。所述抗体可以被标记以使其能够检测。所述抗体可以直接缀合至报道部分（例如荧光标记）。或者，可使缀合至报道部分并对第一抗体有特异性的第二抗体与细胞群体接触。合适的报道部分是本领域已知的，并且包括例如基于Alexa Fluor和BODIPY的荧光标记。一旦细胞群体已经与该抗体接触，就可以使用适合于允许定量个体细胞上的蛋白表达的技术（例如流式细胞术）来分析群体。在不裂解细胞的情况下进行分析。

用于定量细胞表面暴露的蛋白的蛋白表达的方法还可以使得能够对细胞群体进行分选以产生富集特定特征的细胞群体（例如产生富集的不包含表面暴露的MHC-I的细胞的细胞群体）。例如，荧光激活细胞分选（FACS）使得能够进行这样的富集。

类似的方法可以应用于定量单个细胞上细胞表面暴露的蛋白的蛋白表达。例如，该方法可以使用微流体方法。

主要组织相容性复合体I类

主要组织相容性复合体I类（MHC-I）是显示在细胞膜的外部小叶上的异二聚体膜蛋白（Penn，D.J.（2002）Major Histocompatibility Complex（MHC）eLS，John Wiley＆Sons，http://www.els.net/[DOI：10.1038/npg.els.0000919]）。MHC-I起到结合和显示蛋白的肽片段至细胞外环境的作用，在此它们可被CD8⁺细胞毒性T细胞识别。由于中枢和外周耐受机制，从正常细胞蛋白产生的肽片段不会激活细胞毒性T细胞。然而，外源肽（例如源自病毒蛋白的那些）将引起免疫应答的激活以破坏细胞。

同种异体MHC-I蛋白本身可以被免疫系统识别。例如，抗体可以直接结合MHC-I表位。结果，包含来源于同种异体源的MHC-I蛋白的细胞和包膜病毒可以被免疫系统靶向和中和。

人MHC-I也被称为人白细胞抗原I类（HLA-I），并且在几乎所有具核细胞上表达。HLA-I由两条多肽链：HLA-I重链（α链）和β2微球蛋白（β2M）组成。HLA-I α链和β2M非共价连接。

HLA-I α链是多态性的。迄今为止已经鉴定出6种HLA-I α链，包括3种经典的高度多态性的α链（HLA-A、HLA-B和HLA-C）和3种非经典的，较少多态性（HLA-E、HLA-F和HLA-G）α链。技术人员将能够容易地确定HLA-I α链的核酸序列。例如，可以使用其在染色体的主要组织相容性复合体区域内的位置在基因组序列中鉴定HLA-I α链（Penn，D.J.（2002）Major Histocompatibility Complex（MHC）eLS，John Wiley＆Sons，http://www.els.net/[DOI：10.1038/npg.els.0000919]）。

编码β2M的核酸序列是本领域已知的。例如，人β2M的核酸序列保藏为GenBank登录号NM_004048。

技术人员将理解，本发明可适用于MHC-I序列的变体，例如这些序列的多态性（例如HLA-I α链序列和β2M序列）。例如，MHC-I序列的变体可以包括单核苷酸多态性（SNP）或多个SNP。

MHC-I的基因工程改造

本发明的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞被基因工程改造以减少细胞表面上的MHC-I的表达。

基因工程改造减少蛋白表达的方法是本领域已知的。例如，这可以通过靶向基因敲除来实现。为了减少蛋白表达，可以敲除编码蛋白本身或其调节序列（例如其启动子）的基因。敲除可以通过缺失编码核酸序列的一部分来实现，其可以删除对于表达或稳定性必需的蛋白的部分，或改变编码序列的阅读框。靶向基因敲除的合适方法包括使用锌指核酸酶（ZFN）、转录激活物样效应物核酸酶（TALEN）和基于CRISPR/Cas的RNA指导的核酸酶（Gaj，T.等人（2013）Trends Biotechnol. 31：397-405）。

例如，如果提供设计用于结合基因组中特定基因座的合适的RNA指导，则CRISPR/Cas9 RNA-指导的核酸酶可以用于催化该基因座处的双链断裂。Cas9和指导RNA可以通过转染编码蛋白和RNA的载体而递送至靶细胞。细胞尝试使用非同源末端连接（NHEJ）途径修复其DNA中的任何双链断裂。这是一种容易出错的机制，其插入随机核苷酸并且通常破坏靶基因的阅读框。

或者，可以使用RNAi技术，或微小RNA或反义RNA以抑制靶基因表达来完成基因工程改造以减少蛋白表达。

一旦进行了靶基因敲除或表达抑制的方法，可以筛选所得的细胞群体，以选择和富集表现出目标表型的那些细胞，例如表面暴露的MHC-I的表达减少。用于筛选和富集的合适技术是本领域已知的，并包括流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）。

在一个实施方案中，包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破坏。β2-微球蛋白稳定MHC-I，因此β2-微球蛋白缺陷的细胞将表现出MHC-I在细胞表面上的表达减少。该细胞可以在编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝中包含基因工程改造破坏。

在另一个实施方案中，所述细胞包含编码MHC-I α链的基因的基因工程改造破坏。该细胞可以在编码MHC-I α链的基因的所有拷贝中包含基因工程改造破坏。

该细胞可以包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破坏和编码MHC-I α链的基因的基因工程改造破坏两者。

载体

载体是允许或促进实体从一个环境到另一个环境的转移的工具。本发明的病毒颗粒可以是载体。

本发明的病毒载体颗粒是包膜病毒颗粒。

包膜病毒颗粒包含外部脂质双层膜。许多包膜病毒是本领域已知的，包括逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、波纳病毒、弹状病毒和线状病毒。

逆转录病毒和慢病毒载体

逆转录病毒载体可以源自任何合适的逆转录病毒或可以从任何合适的逆转录病毒获得。已经鉴定了大量不同的逆转录病毒。实例包括鼠白血病病毒（MLV）、人T细胞白血病病毒（HTLV）、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）、劳斯肉瘤病毒（RSV）、Fujinami肉瘤病毒（FuSV）、莫洛尼鼠白血病病毒（Mo-MLV）、FBR鼠骨肉瘤病毒（FBR MSV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（Mo-MSV）、Abelson鼠白血病病毒（A-MLV）、禽类髓细胞瘤病病毒-29（MC29）和禽类成红细胞白血病病毒（AEV）。逆转录病毒的详细列表可以在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold SpringHarbor Laboratory Press，758-63中找到。

逆转录病毒可以大致分为两类，“简单”和“复杂”。逆转录病毒甚至可以进一步分成七组。这些组中的五个表示具有致癌潜力的逆转录病毒。其余两组是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold Spring HarborLaboratory Press，758-63中呈现。

逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同的特征，例如5’长末端重复（LTR）和3’LTR。以下位于它们之间或之内：能够包装基因组的包装信号、引物结合位点、能够整合入宿主细胞基因组的整合位点，以及编码包装组分的gag、pol和env基因 - 这些是病毒颗粒的装配所需的多肽。慢病毒具有额外的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，其使得能够将整合的原病毒的RNA转录物从细胞核有效输出到感染的靶细胞的细胞质。

在原病毒中，这些基因在两端通过称为LTR的区域侧接。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也用作增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。

LTR本身是相同的序列，其可以被划分为三个元件：U3、R和U5。U3源自RNA的3'末端独特的序列。R来源于在RNA两个末端重复的序列。U5源自RNA的5'末端独特的序列。三种元件的大小可在不同的逆转录病毒之间显著变化。

在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或不起作用。

在典型的逆转录病毒载体中，可以从病毒中去除对于复制必需的一个或多个蛋白编码区的至少一部分。这使得病毒载体成为复制缺陷型。病毒基因组的部分也可以被文库取代，所述文库编码与载体基因组中的调节控制区和报道部分可操作地连接的候选调节部分，以便产生包含能够转导靶宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中的候选调节部分的载体。

慢病毒载体是更大组的逆转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细列表可以在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，758-63中找到。简而言之，慢病毒可以分为灵长类组和非灵长类组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒（HIV），其是人获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体；和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类慢病毒的实例包括原型“慢病毒”脑膜脑炎/呼吸困难病毒（VMV）以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）、马感染性贫血病毒（EIAV）和最近描述的猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。

慢病毒家族与逆转录病毒不同，其在于慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞的能力（Lewis，P等人（1992）EMBO J. 11：3053-8；Lewis，P.F.等人（1994）J. Virol. 68：510-6）。相反，其它逆转录病毒如MLV不能感染非分裂或缓慢分裂的细胞，例如构成例如肌肉、脑、肺和肝组织的那些。

如本文所用的慢病毒载体是包含至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞、表达基因或复制的生物机制。

慢病毒载体可以是“灵长类”载体。慢病毒载体可以是“非灵长类”载体（即源自不主要感染灵长类动物，特别是人的病毒）。非灵长类慢病毒的实例可以是不天然感染灵长类动物的慢病毒科的任何成员。

作为基于慢病毒的载体的实例，下文描述了基于HIV-1和HIV-2的载体。

HIV-1载体含有顺式作用元件，其也存在于简单的逆转录病毒中。已经表明，延伸到gag开放阅读框中的序列对于HIV-1的包装是重要的。因此，HIV-1载体通常含有gag的相关部分，其中翻译起始密码子已突变。此外，大多数HIV-1载体还含有包括RRE的env基因的一部分。Rev结合到RRE，其允许全长或单股剪接（singly spliced）的mRNA从细胞核转运到细胞质。在不存在Rev和/或RRE的情况下，全长HIV-1 RNA在细胞核中积累。或者，来自某些简单逆转录病毒如Mason-Pfizer猴病毒的组成型转运元件可用于减少对Rev和RRE的需要。从HIV-1 LTR启动子的有效转录需要病毒蛋白Tat。

大多数基于HIV-2的载体在结构上与HIV-1载体非常类似。与基于HIV-1的载体相似，HIV-2载体也需要RRE来有效转运全长或单股剪接的病毒RNA。

在一个系统中，所述载体和辅助构建体来自两种不同的病毒，并且降低的核苷酸同源性可以降低重组的概率。除了基于灵长类慢病毒的载体外，基于FIV的载体也已经被开发作为源自病原性HIV-1基因组的载体的替代。这些载体的结构也与基于HIV-1的载体类似。

优选地，用于本发明的病毒载体具有最小的病毒基因组。

“最小病毒基因组”应理解为已经操作病毒载体以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供所需的功能以感染、转导和递送目标核苷酸序列至靶宿主细胞。该策略的进一步细节可以在WO 1998/017815中找到。

优选地，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体将具有足够的慢病毒遗传信息，以允许在包装组分存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中，但不能独立复制以在最终靶细胞内产生感染性病毒颗粒。优选地，载体缺少功能性gag-pol和/或env基因和/或对于复制必需的其它基因。

然而，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包括与慢病毒基因组可操作地连接以引导基因组在宿主细胞/包装细胞中转录的转录调节控制序列。这些调节序列可以是与转录的病毒序列（即5'U3区）相关的天然序列，或者它们可以是异源启动子，例如另一种病毒启动子（例如CMV启动子）。

所述载体可以是其中病毒增强子和启动子序列已被缺失的自我失活（SIN）载体。可以以与野生型载体相似的效力在体内产生SIN载体并转导非分裂细胞。SIN原病毒中长末端重复（LTR）的转录失活应当阻止具有复制能力的病毒的动员。这还应该能够通过消除LTR的任何顺式作用效应来从内部启动子调节基因表达。

所述载体可以是整合缺陷的。整合缺陷型慢病毒载体（IDLV）可以例如通过用催化失活的整合酶包装载体（例如在催化位点具有D64V突变的HIV整合酶; Naldini，L.等人（1996）Science 272：263-7; Naldini，L.等人（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11382-8; Leavitt，A.D.等人（1996）J. Virol. 70：721-8）或通过修饰或缺失来自载体LTR的重要att序列（Nightingale，S.J.等人（2006）Mol. Ther. 13：1121-32），或通过上述的组合来产生。

源自HIV的载体

用于本发明的源自HIV的载体在HIV毒株方面没有特别限制。可以在HIV序列数据库（http://www.hiv.lanl.gov/content/index）中找到HIV毒株序列的许多实例。

源自单纯疱疹病毒（HSV）的载体

单纯疱疹病毒（HSV）是天然感染神经元的包膜双链DNA病毒。HSV可以容纳大部分的外源DNA，这使其作为载体系统是有吸引力的，并且已经用作基因递送到神经元的载体。

在治疗过程中使用HSV需要减弱毒株，使得它们不能建立裂解循环。特别地，如果HSV载体将用于人的基因治疗，则优选将NOI插入必需基因中。这是必要的，因为如果载体病毒遇到野生型病毒，通过重组可发生将异源基因转移到野生型病毒。但是，只要将NOI插入必需基因，重组转移也将删除接受体病毒中的必需基因，并防止异源基因“逃逸”到具有复制能力的野生型病毒群体中。

源自牛痘病毒的载体

牛痘病毒是具有约190kb线性、双链DNA基因组的大包膜病毒。牛痘病毒可容纳高达约25kb的外源DNA，这也使其可用于递送大基因。

本领域已知许多适合于基因治疗应用的减弱的牛痘病毒株，例如MVA和NYVAC毒株。

病毒颗粒生产

在一个方面，本发明提供了本发明的包膜病毒颗粒生产细胞用于生产包膜病毒颗粒的用途。

在一个实施方案中，所述包膜病毒载体颗粒包含小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的在不存在基因工程改造下在由包膜病毒颗粒生产细胞产生的颗粒上显示的表面暴露的MHC-I分子的数目。在另一个实施方案中，所述包膜病毒颗粒基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

包膜病毒颗粒生产细胞可以包含病毒基因组。

病毒基因组是掺入病毒颗粒中的核酸序列。可以将病毒基因组进行工程改造以包含目标核苷酸（NOI）。

因此，为了用于产生病毒颗粒，所述包膜病毒颗粒生产细胞可以包含病毒基因组，并随后在适合于产生包膜病毒颗粒的条件下培养。

“包膜病毒颗粒包装细胞”可以例如包含编码病毒颗粒装配所需的一些或全部结构蛋白的核酸序列。

仅包含用于产生包膜病毒颗粒所需要的一些元件的细胞可用作产生病毒颗粒生产细胞系的中间反应物，通过随后的每个额外所需元件的瞬时转染、转导或稳定整合的步骤。这些中间反应物包括在本发明的包装细胞系中。随后用于产生包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞系的亲本细胞代表本发明的另一个实施方案，其中所述亲本细胞的细胞表面上的MHC-I的表达已经减少。

编码感染性包膜病毒颗粒生产所需组分的核酸序列可以瞬时转染或转导入或稳定保持（例如稳定整合入细胞基因组或游离保持）在包装细胞或生产细胞内。或者，可以使用瞬时转染或转导和稳定保持的组合将核酸序列引入细胞中。

因此，本发明的细胞可以被转染或转导或经工程改造以通过靶向整合来稳定整合包含病毒基因组的核酸，以能够生产包含病毒基因组的包膜病毒颗粒。

编码感染性包膜病毒颗粒生产所需的单独组分的核酸序列可以作为单独的表达盒提供给细胞。

在一个实施方案中，本发明的包装细胞包含编码Gag、Gag/Pol和/或Env蛋白或其功能性替代物的核酸序列。所述细胞可任选地包含编码可能是逆转录病毒载体颗粒装配所需的其它蛋白例如Rev蛋白的核酸序列。

包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞可以是能够生产或包装包膜病毒颗粒的任何合适的细胞类型。所述细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。例如，所述包膜病毒颗粒生产细胞可以源自亲本HEK-293细胞。

目标核苷酸

本发明的载体例如病毒颗粒可以包含目标核苷酸（NOI）。

优选地，目标核苷酸产生治疗效果。

合适的NOI包括但不限于编码如下的序列：酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、微小RNA、shRNA、siRNA、核酶、miRNA靶序列、靶蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、转录因子、膜蛋白、表面受体、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如具有相关报道基团的衍生物）。NOI还可以编码前药激活酶。

NOI的实例是凝血因子VIII或因子IX或其工程改造的衍生物，其可用于血友病的基因治疗，或β-珠蛋白链，其可用于地中海贫血/镰状细胞病的基因治疗。

可以通过病毒载体蛋白转移而转移的合适的蛋白包括但不限于核酸酶、整合酶、转座酶、酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、转录因子、膜蛋白、表面受体、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如具有相关报道基团的衍生物）。

药物组合物

本发明的包膜病毒颗粒或转导细胞可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制用于向受试者施用。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并且可能含有人血清白蛋白。

细胞治疗产品的处理优选根据用于细胞治疗的FACT-JACIE国际标准进行。

基因治疗

一方面，本发明提供包膜病毒颗粒和转导细胞用于治疗，例如用于基因治疗。包膜病毒颗粒可以称为包膜病毒载体颗粒。

“转导细胞”或已经“被包膜病毒载体颗粒转导”的细胞，应当理解为由包膜病毒载体颗粒携带的核酸（例如包含NOI）已经转移到所述细胞。待转导的细胞优选是靶细胞。

本发明的包膜病毒载体颗粒可以直接施用于受试者。可以工程改造所述病毒载体颗粒以将感染靶向受试者中的特定细胞。所述病毒载体颗粒也可以被工程改造以将NOI的表达靶向受试者中的特定细胞。这可以使用促进抑制特定细胞中NOI表达的组织特异性启动子或核酸序列来实现。

包膜病毒载体颗粒还可以用于转导已经从受试者体内除去的细胞，作为离体基因治疗方法的一部分。

转导的细胞可作为自体细胞移植方法的一部分或作为同种异体细胞移植方法的一部分施用。

“自体细胞移植方法”应当理解为，细胞的起始群体（其然后用本发明的包膜病毒载体颗粒转导）得自与施用转导细胞群体相同的受试者。自体移植方法是有利的，因为它们避免与免疫不相容性相关的问题并且对于受试者可利用，而不管基因匹配供体的可获得性。

“同种异体细胞移植方法”应当理解的是，细胞的起始群体（其然后用本发明的包膜病毒载体颗粒转导）从与施用转导细胞群体的受试者不同的受试者获得。优选地，供体将与施用细胞的受试者基因匹配，以使免疫不相容性的风险最小化。

包膜病毒载体颗粒或转导细胞的合适剂量是使得治疗和/或预后有效的。待施用的剂量可取决于待治疗的受试者和病症，并且可由技术人员容易地确定。

例如，所述用途可以作为造血干细胞和/或祖细胞移植方法的一部分。

造血干细胞移植（HSCT）是来源于骨髓（在这种情况下称为骨髓移植）或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域中的医学方法，最常用于患有血液或骨髓疾病或某些类型的癌症的人。

HSCT的许多接受者是多发性骨髓瘤或白血病患者，其不会受益于用化疗的长期治疗或已经对化疗有抗性。HSCT的候选人包括儿科病例，其中患者具有先天缺陷，例如具有缺陷性干细胞的严重联合免疫缺陷或先天性中性白细胞减少，以及在出生后已经失去干细胞的具有再生障碍性贫血的儿童或成人。用干细胞移植物治疗的其它病症包括镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤因氏肉瘤、结节性小圆细胞瘤和霍奇金病。最近，已开发非清髓性或所谓的“微型移植”方法，其需要较小剂量的制备化学疗法和放射。这已允许HSCT在被认为太弱而不能承受常规治疗方案的老年人和其他患者中进行。

本发明的包膜病毒载体颗粒或转导细胞可用于治疗遗传性疾病，例如血浆蛋白缺乏、代谢性疾病、溶酶体贮积病、粘多糖病、免疫缺陷、血液病，包括但不限于血友病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷、Wiskott-Aldrich综合征、异染性脑白质营养不良、球样性脑白质营养不良，β-地中海贫血、慢性肉芽肿病。

本发明的包膜病毒载体颗粒或转导细胞可用于治疗WO1998/005635中所列的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病、发烧、心血管效应、出血、凝血和急性期反应、恶病质、厌食、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵袭和扩散、血管生成、转移、恶性、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风、血管炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎；牙周炎、牙龈炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解症；角膜溃疡，视网膜病变和手术伤口愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位、动脉粥样硬化或内部硬化(endosclerosis)。

此外或可选地，本发明的包膜病毒载体颗粒或转导细胞可用于治疗WO 1998/007859中所列的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制剂或免疫刺激剂活性（例如用于治疗免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒的感染；淋巴细胞生长的调节；治疗癌症和许多自身免疫疾病，以及预防移植排斥或诱导肿瘤免疫）；调节造血，例如治疗骨髓或淋巴疾病；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如用于治疗伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周病和神经变性；抑制或激活卵泡刺激激素（调节生育力）；趋化/化学激活活性（例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位）；止血和血栓溶解活性（例如用于治疗血友病和中风）；抗炎活性（用于治疗例如败血症性休克或克罗恩病）；作为抗菌剂；例如代谢或行为的调节剂；作为止痛剂；治疗特定缺陷障碍；在治疗例如银屑病中，在人或兽医学中。

此外，或可选地，本发明的包膜病毒载体颗粒或转导细胞可用于治疗WO 1998/009985中所列的疾病。为了便于参考，现在提供部分列表：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性，和因此，抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应答的抑制作用，包括与炎症无关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞粘附于细胞外基质组分和纤连蛋白以及T细胞中上调的fas受体表达的能力；抑制非期望的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎，与超敏反应相关的炎症，过敏反应，哮喘，系统性红斑狼疮，胶原病和其它自身免疫疾病，与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎症性疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病，与消化性溃疡相关的炎症，溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病，肝纤维化，肝硬化或其它肝脏疾病，甲状腺炎或其它腺体疾病，肾小球肾炎或其它肾脏和泌尿系统疾病，耳炎或其它耳鼻喉科疾病，皮炎或其它皮肤疾病，牙周病或其它牙科疾病，睾丸炎或附睾-睾丸炎，不孕，睾丸创伤或其它免疫相关性睾丸疾病，胎盘功能障碍，胎盘功能不全，习惯性流产，子痫，先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关的妇科疾病，后葡萄膜炎，中间葡萄膜炎，前葡萄膜炎，结膜炎，脉络膜视网膜炎，眼色素层炎，视神经炎，眼内炎症例如视网膜炎或囊样黄斑水肿，交感性眼炎，巩膜炎，色素性视网膜炎，退行性软骨病的免疫和炎性成分，眼创伤的炎性成分，由感染引起的眼部炎症，增生性玻璃体视网膜病变，急性缺血性视神经病变，过度瘢痕形成，例如在青光眼过滤操作之后，针对眼植入物的免疫和/或炎症反应和其它免疫和炎症相关的眼科疾病，与自身免疫性疾病或病症或障碍相关的炎症，其中在中枢神经系统（CNS）或任何其它器官，免疫和/或炎症抑制将是有益的，帕金森病，来自帕金森病治疗的并发症和/或副作用，AIDS相关性痴呆综合征，HIV相关性脑病，德维克病，西德纳姆舞蹈病，阿尔茨海默氏病和其它变性疾病，CNS的病症或疾病，斯托克斯的炎性成分，脊髓灰质炎后综合征，精神疾病的免疫和炎性成分，脊髓炎，脑炎，亚急性硬化性全脑炎，脑脊髓炎，急性神经病，亚急性神经病，慢性神经病，吉-巴综合征，西德纳姆舞蹈病，重症肌无力，假性肿瘤脑，唐氏综合征，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化，CNS压迫或CNS创伤的炎性成分或CNS感染，肌萎缩和营养不良的炎性成分，以及免疫和炎症相关的疾病，中枢和周围神经系统的病症或疾病，创伤后炎症，脓毒性休克，感染性疾病，手术的炎症并发症或副作用，骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用，基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用，例如由于感染病毒载体或与AIDS相关的炎症，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，以治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病，例如白血病，通过减少单核细胞或淋巴细胞的量，用于在移植天然或人工细胞、组织和器官例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的情况下预防和/或治疗移植物排斥。

治疗方法

应当理解，本文中对治疗的所有提及包括治愈性、姑息性和预防性治疗，尽管在本发明的上下文中，提及预防更通常与预防性治疗相关。优选对哺乳动物，特别是人的治疗。人和家畜治疗都在本发明的范围内。

疫苗

一方面，本发明提供了用作疫苗的本发明的包膜病毒颗粒。优选地，所述包膜病毒颗粒不具有感染性，例如不能感染细胞。

减弱的病毒在本领域中通常用作疫苗，以提供针对病毒的天然、毒性形式的感染的免疫。

用作疫苗的减弱的病毒可以使用如上所述的本发明的生产细胞生产，优选地，其中可以去除NOI。本发明的生产细胞能够生产展示出数目减少的表面暴露的MHC-I分子的用作疫苗的包膜病毒颗粒。用作疫苗的包膜病毒载体颗粒可以基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

表面暴露的MHC-I分子的数目减少或缺乏在用作疫苗的病毒中是有利的，因为该病毒将不太可能被与MHC-I结合的抗体中和。

另外，免疫应答可以对同种异体MHC-I而不是针对病毒抗原反应，因此通过更有效地诱导保护性免疫，基本上没有同种异体MHC-I分子的病毒颗粒可以是更有效的疫苗。

用作疫苗的病毒可进一步经工程改造以在其表面或感染细胞内表达其它蛋白。这样的蛋白可以作为用于产生抗体或细胞免疫的抗原，其可以进一步增加机体的免疫防御。

实施例

实施例1

材料和方法

β2M基因破坏

为了产生编码Cas9的真核表达质粒，使用XbaI和PmeI从hCas9质粒（Addgene，质粒第41815号）切除人密码子优化形式的化脓性链球菌（streptococcus pyogenes）Cas9序列。然后将该片段克隆到先前用XbaI和EcoRV消化的pcDNA3.1质粒（Invitrogen）中。

为了产生编码β2M RNA指导的质粒，使用DNA合成来产生含有人U6启动子序列，随后是反式激活RNA序列（GeneWix）的质粒。然后用BsaI消化该质粒，以便产生对应于识别β2M的外显子1的CRISPR RNA（crRNA）的以下退火的寡核苷酸的相容的DNA末端：5'-ACCGAGTAGCGCGAGCACAGCTA-3'; 5 -AAACTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3'。

通过磷酸钙DNA转染将质粒递送入细胞（250ng Cas9表达质粒加上50或100ng指导RNA表达质粒）。

流式细胞术

将所有细胞悬浮液用FcR封闭试剂（Miltenyi）和在磷酸盐缓冲盐水、0.5%牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸（2mM）中的PE-缀合的抗人β2M（BioLegend，克隆2M2）和APC-缀合的全抗人MHC-I（Santa Cruz Biotechnology）（染色溶液）在4℃孵育20分钟。抗体染色后，洗涤细胞，再悬浮于染色溶液中，并通过流式细胞术（FACSCanto，BD Biosciences）分析。

错配选择性内切核酸酶测定

使用错配选择性内切核酸酶测定来测量在Cas9靶位点处的非同源末端连接（NHEJ）导致的突变的程度。简言之，使用在β2M基因中侧接crRNA位点的引物（Fw：5'-TACAGACAGCAAACTCACCCAGTC-3'; Rv：5-AGAACTTGGAGAAGGGAAGTCACG-3'）进行PCR。使PCR产物变性，使其重新退火并用Surveyor核酸酶测定（Transgenomic）消化。因为该酶在双链体扭曲位点切割DNA，所以野生型和突变等位基因（携带核酸酶活性导致的突变或缺失）之间的再退火产物被特异性消化。将反应产物在Spreadex EL1200 Wide Mini凝胶（ElchromScientific）上分离，用溴化乙锭染色，并且通过ImageQuant TL软件对条带的强度进行定量。使用公式(1-(亲本片段)^1/2)×100计算未切割的亲本片段与两个较低迁移切割产物的比率（Lombardo，A. 等人，（2011）Nat. Methods 8：861-9。

慢病毒载体（LV）生产

通过用pCCLsin.cPPT.PGK.GFP.pre转移载体，包装质粒pMDLg/p.RRE、pCMV.REV，VSV-G包膜质粒pMD2.G的磷酸钙瞬时转染293T细胞产生第三代慢病毒载体（LV），如先前所述（Follenzi，A. 等人（2002）Methods Mol. Med. 69：259-74）。在转染前24小时将293T细胞接种在15cm培养皿中。转染前2小时，用新鲜培养基替换培养基。对于每个培养皿，分别使用35μg、12.5μg、6.25μg和9μg质粒DNA制备含有LV基因组质粒、包装质粒pMDLg/pRRE和pCMV.REV和pMD2.G的混合物的溶液。向DNA混合物中添加0.1×TE溶液（10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0，在dH₂O中）和水（1:2）至1250μL的最终体积。将溶液留在旋转轮上20-30分钟，然后加入125μL的2.5M CaCl₂。就在转染之前，通过添加1250μL的2×HBS（281mM NaCl，100mM HEPES，1.5mM Na₂HPO₄，pH 7.12）形成沉淀，同时将溶液在涡旋上保持搅拌。立即将沉淀物加入培养基中并留在细胞上14-16小时，并随后更换培养基。在培养基更换后30小时收集上清液，并使上清液通过0.22μm过滤器（Millipore）。

包装细胞先前由稳定表达四环素调节的转录阻遏物的293-T-REx（Invitrogen）开始产生，在与CMV启动子连接的Tet操纵子的控制下，用表达HIV-1 Rev、Gag/Pol和VSV-G的质粒稳定转染。通过向培养基中加入多西环素（1μg/mL）诱导LV颗粒的产生，和72小时后收集上清液，并使上清液通过0.22μm过滤器（Millipore）。

LV滴定

在聚凝胺（8μg/mL）的存在下，用系列载体稀释物转导十万个293T细胞。GFP阳性（GFP+）细胞的百分比在转导后7天通过流式细胞术测量。滴度表示为转导单位_293T（TU）/mL，并使用下式计算：

TU/mL = [（％GFP +细胞/ 100）×10⁵×1/稀释因子]

根据制造商的方案（NEN Life Science Products）通过HIV-1 Gag p24抗原免疫捕获测量载体颗粒。载体感染性计算为滴度和颗粒之间的比率（TU/ng p24）。

统计学分析

使用Mann-Whitney检验在p <0.05显著性水平下进行统计学分析。

结果

为了产生没有表面暴露的MHC-I分子的细胞系用于生产缺乏表面暴露的MHC-I分子的慢病毒载体（LV），我们开始永久破坏编码β-2-微球蛋白的基因（β2M）。因为β2M是MHC-I的通用组分，为MHC-I在细胞膜上表达所需，通过基因失活β2M基因，我们旨在损害所有高度多态MHC-I分子的表面表达，而不需要单独地破坏构建MHC-I的各基因（Shiina，T. 等人（2009）J. Hum. Genet. 54：15-39；Adams，E.J. 等人（2013）Annu. Rev. Immunol. 31：529-6）。为此，我们使用CRISPR/Cas9系统（Hsu，P.D.（2014）Cell 157：1262-78）。Cas9是RNA-指导的核酸酶，如果提供设计用于结合所需基因座的适当的RNA指导，其能够在基因组中的预定基因座处进行DNA双链断裂（DSB）。因此，其中发生DSB的细胞通过非同源末端连接（NHEJ）途径修复DNA，所述非同源末端连接（NHEJ）途径为插入随机核苷酸并常常破坏靶基因的阅读框架的易错机制（Lombardo，A. 等人（2011）Nat. Methods 8：861-9）。我们递送两种质粒，一种编码Cas9核酸酶，和另一种表达指导RNA，其设计为通过瞬时转染到基于HEK-293的诱导型细胞系（之前经工程改造以产生LV颗粒）和HEK-293T细胞（其常规地用于通过利用LV包装和基因组构建体的瞬时转染产生LV）两者，与β2M基因的第一外显子中的序列进行碱基配对。我们通过流式细胞术分析显示，虽然未处理的细胞对于β2M和MHC-I是100％阳性的（图1A和1E），高达44％的用Cas9处理的细胞和适当的指导RNA松散β2M，并因此MHC-I在其膜上表达（图1B和1F）。然后我们通过荧光激活细胞分选（FACS）富集β2M阴性（β2M-）细胞至几乎完全纯度（95％）。我们已经显示这些细胞在培养中是稳定的，并且对β2M和MHC-I两者保持阴性（图1D和1H）。尽管在HEK-293T细胞中β2M破坏的效率最初较低（6％，图1F），但是我们能够通过FACS分选容易地富集β2M-HEK-293T细胞（图1G和1H）。

为了在基因水平上证实这些结果，我们通过错配选择性内切核酸酶测定法（Cel1测定; Lombardo，A. 等人（2011）Nat. Methods 8：861-9）分析了β2M基因处NHEJ的事件。我们已经显示，在CRISPR/Cas9处理的细胞中高达35％的β2M等位基因被破坏，其在293T细胞和LV包装细胞系中在β2M-分选的细胞中增加（图2）。

然后我们评价β2M-细胞是否保持其产生LV的能力。为此目的，我们比较了在标准瞬时转染方法中在β2M阳性（β2M+）和β2M-293T细胞中产生的LV的感染滴度、颗粒输出和感染性。我们的数据显示，在β2M-293T细胞中产生的LV与在β2M+ 293T细胞中产生的那些没有显著不同（图3A、3B和3C）。我们还诱导β2M+和β2M-包装细胞中LV的产生，并且在从2个包装细胞系收集的LV中显示类似的颗粒输出（图3D）。

总体而言，这些结果显示了用CRISPR/Cas9处理的细胞中的β2M等位基因的有效破坏以及MHC-I分子从β2M-细胞的质膜几乎完全消失。此外，我们已经显示，源自这些β2M-细胞的LV在其感染性方面没有损伤。

实施例2

材料和方法

根据当地伦理委员会批准（Protocol TIGET03）和赫尔辛基宣言，在知情同意的情况下从健康供体获得人外周血。通过Lymphoprep（Fresenius Kabi）的密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC）。

T细胞纯化和树突细胞（DC）分化

使用Pan T细胞分离试剂盒II（Miltenyi Biotech）根据制造商的说明通过阴性选择从PBMC纯化CD3⁺ T细胞，并冷冻。通过使用CD14 MicroBeads（Miltenyi Biotech）根据制造商的说明进行阳性选择，从相同供体的PBMC中分离CD14⁺单核细胞。将细胞在37℃下在补充有10％胎牛血清（FBS）（Euroclone）、100U/mL青霉素/链霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza）的RPMI 1640（Corning）中在10ng/mL rhIL-4（R＆D Systems）和100ng/mL rhGM-CSF（Genzyme）的存在下培养7天以分化DC。细胞在第2天用1μg p24/mL由β2M+或β2M-细胞产生的慢病毒载体（LV）转导。细胞在第6天用1μg/mL的LPS（Sigma）成熟额外1天，以产生成熟DC。在第7天，收集DC并用于刺激T细胞。

T细胞的增殖

将CD3⁺ T细胞解冻并在补充有10％FBS（Euroclone）、100U/mL青霉素/链霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza）和20U/mL rhIL-2（Chiron）的RPMI 1640（Corning）中过夜培养。然后在最终体积为200μL的IMDM（Sigma）中用未转导的DC或用由β2M+或β2M-细胞产生的LV转导的DC（10:1和5:1 T细胞:DC比）刺激T细胞3天，该IMDM补充有10％FBS（Euroclone）、100U/mL青霉素/链霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza），然后用1μCi/孔3H-胸苷脉冲处理16小时。

蛋白印迹

用补充有PIC（蛋白酶抑制剂混合物；Roche）的膜蛋白裂解缓冲液（150mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM EDTA，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，1％Triton-X100）提取各批LV中的总蛋白。将样品再悬浮于裂解溶液中并在4℃下孵育10分钟。使用Bradford测定（BioRad）测定裂解物的蛋白浓度。在还原条件下通过SDS-PAGE分析20μg蛋白。对于免疫印迹，使用iBIotGel Transfer stack（Novex）将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用特异性抗体孵育，然后用过氧化物酶缀合的二抗（ECL小鼠或兔IgG; GE Healthcare）孵育，并使用化学发光试剂（ECL; GE Healthcare）检测并在放射自显影胶片上曝光。使用以下抗体：兔单克隆抗人MHC-I（OriGene Technologies，在TBS，Tween-20 0.1％，脱脂奶粉5％中以1:1000加入）、小鼠单克隆抗Gag p24（NIH AIDS试剂程序＃3537，在TBS，Tween-20 0.1％，脱脂奶粉5％中以1:1000加入）。

结果

为了检测MHC-I在来自LV-生产细胞的质膜的慢病毒载体（LV）颗粒中的掺入，我们对蛋白进行蛋白印迹分析，所述蛋白从通过超速离心从β2M+或β2M-生产细胞的条件培养基收集的LV中提取。

我们在由β2M+细胞产生的LV中检测到对应于MHC-I的分子量的清晰条带，但在由β2M-细胞产生的LV中没有检测到。如预期的，两个样品对于衣壳Gag p24蛋白类似地是阳性的（图4）。

然后我们开始测量免疫细胞响应暴露于由β2M+或β2M-细胞产生的LV颗粒的自体树突细胞的激活。

我们从健康供体的外周血单核细胞中纯化CD3⁺ T淋巴细胞和CD14⁺单核细胞，并随后将CD14⁺细胞暴露于由β2M+或β2M-细胞产生的相同量的LV颗粒。然后我们在树突细胞（DC）中分化转导的单核细胞，并与来自相同供体的CD3⁺淋巴细胞共培养它们。我们通过氚化胸苷掺入测量T淋巴细胞增殖，并观察到与响应暴露于由β2M+细胞产生的LV的DC相比，响应暴露于由β2M-产生的LV的DC的T淋巴细胞增殖显著更少（图5）。

总的来说，这些数据证实了MHC-I在由亲本β2M+细胞产生的LV颗粒中的存在和由β2M-细胞有效产生无MHC的LV。此外，这些数据表明无MHC的LV颗粒和转导细胞不太可能诱导并且被同种异体特异性免疫应答靶向。

在上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述细胞、病毒载体颗粒、用途和方法的各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 圣拉法埃莱医院有限公司

泰莱托恩基金会

<120> 载体生产

<130> P105283PCT

<150> GB1412494.5

<151> 2014-07-14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于识别beta2M的外显子1的CRISPR RNA (crRNA)的寡核苷酸

<400> 1

accgagtagc gcgagcacag cta 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于识别beta2M的外显子1的CRISPR RNA (crRNA)的寡核苷酸

<400> 2

aaactagctg tgctcgcgct act 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 在beta2M基因中侧接crRNA位点的引物

<400> 3

tacagacagc aaactcaccc agtc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 在beta2M基因中侧接crRNA位点的引物

<400> 4

agaacttgga gaagggaagt cacg 24

Claims

1.包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞被基因工程改造以减少细胞表面上的MHC-I的表达。

2.权利要求1的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破坏。

3.权利要求1或2的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞包含编码MHC-Iα链的一个或多个基因的基因工程改造破坏。

4.权利要求1-3中任一项的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞是HEK-293细胞或其衍生物。

5.权利要求4的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述细胞是HEK-293T或HEK-293T-REx细胞。

6.权利要求1-5中任一项的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述包膜病毒颗粒是逆转录病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黄病毒、沙粒病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、波纳病毒、弹状病毒、线状病毒或由其获得。

7.权利要求1-6中任一项的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述包膜病毒颗粒源自逆转录病毒或单纯疱疹病毒或牛痘病毒。

8.权利要求1-6中任一项的包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞，其中所述包膜病毒载体源自慢病毒。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于产生包膜病毒颗粒生产细胞或包装细胞系的亲本细胞，其中所述亲本细胞被基因工程改造以减少所述细胞表面上的MHC-I的表达。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的包膜病毒颗粒生产细胞用于生产包膜病毒颗粒的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述包膜病毒颗粒基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

12.一种产生包膜病毒颗粒的方法，包括以下步骤：

a）提供根据权利要求1-8中任一项所述的包膜病毒颗粒生产细胞；和

b）在适于产生包膜病毒颗粒的条件下培养细胞。

13.由权利要求12的方法产生的包膜病毒颗粒。

14.包膜病毒颗粒，其中所述颗粒基本上没有表面暴露的MHC-I分子。

15.权利要求13或14的包膜病毒颗粒，其中所述包膜颗粒源自逆转录病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒。

16.由权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒转导的细胞。

17.一种药物组合物，其包含权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒或权利要求15的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

18.权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒，其用于治疗。

19.权利要求18的包膜病毒颗粒，其用于疫苗接种或基因治疗。

20.权利要求16的细胞，其用于治疗。

21.一种基因治疗的方法，包括用权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒转导细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述转导离体进行。

23.一种基因治疗的方法，包括向有其需要的受试者施用权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒或权利要求16的细胞。

24.权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒，其用作疫苗。

25.一种疫苗接种的方法，包括向有其需要的受试者施用权利要求13-15中任一项的包膜病毒颗粒。