CN1554764A - 重组改良安卡拉痘苗病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

包含并能表达插入改良安卡拉痘苗病毒(MVA)基因组天然缺失位点的外源基因的重组MVA病毒，以及应用这类重组MVA病毒生产多肽，例如抗原或治疗剂，和重组病毒以用作疫苗或产生病毒载体用于基因治疗。

Description

重组改良安卡拉痘苗病毒及其应用
本申请是一个分案申请，其母案是1998年1月4日向中国专利局提交的中国专利申请96195254.7。
技术领域
本发明涉及从改良安卡拉痘苗病毒(MVA)衍生的重组痘苗病毒及其包含且能够表达插入到MVA染色体上天然缺失位点上的外源基因；涉及使用这类重组MVA病毒产生多肽，例如抗原或治疗剂，或产生用于基因治疗的病毒载体，以及使用这类编码抗原的重组MVA病毒作为疫苗。
本发明的目的之一是提供一种重组MVA病毒，它可作为有效且特别安全的表达载体。
本发明的另一种目的是提供一种简单、有效、安全的方法产生多肽，例如抗原或治疗剂，产生重组病毒用作疫苗以及产生病毒载体用于基因治疗。
本发明的再一种目的是提供一种基于表达T7RNA聚合酶的重组MVA病毒的表达系统，以及基于此表达系统产生多肽，例如抗原或治疗药剂，或产生病毒载体用于基因治疗或用作疫苗。
背景技术
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属的一员，曾用作活疫苗免疫人天花病。世界范围用痘苗病毒成功的接种最终导致天花病因-天花病毒的绝迹[天花的全球绝迹。全球天花绝迹鉴定委员会的最后报告。公共卫生历史，第4号(History of Public Health，No.4)，日内瓦：世界卫生组织，1980]。因而世界卫生组织(WHO)宣告，除了有高度危险痘病毒感染的人群(例如实验室人员)外，已全世界性地停止接种。
最近，痘苗病毒也已用于设计病毒载体，以进行重组基因表达和可能用作重组活疫苗[Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.[1982美国国家科学院院报(P.N.A.S.USA)79，7415-7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B.[1984]生物技术和遗传工程评论2(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews2)，383-407]。这必然伴有在DNA重组技术帮助下把编码外源抗原的DNA序列(基因)引入痘苗病毒基因组。如果基因整合到病毒DNA中对病毒生活周期非必需的位点，可能新产生的重组痘苗病毒是感染性的，即能够感染外源细胞并从而表达整合的DNA序列[欧洲专利申请83,286号和110,385号(EP Patent Applications No.83,286 and No.110,385)]。用这种方法制备的重组痘苗病毒一方面可用作活疫苗预防传染性疾病，另一方面可用于在真核细胞中制备异源蛋白质。
表达噬菌体T7 RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒可以建立广泛应用的表达系统以用于在哺乳动物细胞中合成重组蛋白(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，Mizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.[1990]自然(Nature)348，91-92.)。在所有方案中，重组基因表达依赖于真核细胞细胞质中T7 RNA聚合酶的合成。最普遍的一种方案是用于瞬时表达(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F.W.和Moss，B.[1986]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.)Sci.USA 83，8122-8126和美国专利申请(US patent application)7.648.971)。首先，一种感兴趣的外源基因插入质粒并在T7 RNA聚合聚启动子控制之下。随后，质粒引入到细胞的原生质体中，该细胞通过标准转染方法由产生T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒预先感染。
此转染方案非常简单因为不需构建新的重组病毒并且特别有效，有超过80％的细胞表达感兴趣的基因[Elroy-Stein，O.和Moss，B.[1990]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，6743-6747]。痘苗病毒/T7RNA聚合酶杂合系统比其它瞬时表达系统的优势很可能在于它不依赖于质粒到细胞核的转运。在过去，该系统在病毒学和细胞生物学中对检测目的是极其有用的(Bunocore，L.和Rose，J.K.[1990]自然(Nature)345，625-628，Pattnaik，A.K.和Wertz，GW.[1991]美国国家科学院院报(Proc Natl.Acad.Sci.USA)88，1379-1383，Karschin，A.，Aiyar，J.，Gouin，A.，Davidson，N.和Lester，H.A.[1991]欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)278，229-233，Ho，B.Y.，Karschin，A.，Raymond，J.，Branchek，T.，Lester，H.A.和Davidson，N.[1992]欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)301，303-306，Buchholz，C.J.，Retzler C.，Homann，H.E.，和Neubert，W.J.[1994]病毒学(Virology)204，770-776)。然而，痘苗病毒/T7 RNA聚合聚杂合系统的重要前景应用，例如产生重组蛋白或重组病毒颗粒用于人体的新的治疗或预防方法，可能由于重组痘苗载体的大量复制而受到阻碍。
痘苗病毒对人是感染性的并且在根除天花运动中的接种时偶而会观察到严重的并发症。关于并发症发病率的最好综述由一项美国国家调查提供，该调查检测了大约一千二百万接种疫苗的人，接种疫苗基于纽约城市卫生委员会痘苗病毒菌株(Lane，J.，Ruben，F.，Neff，J.和Millar，J.[1969]新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)281，1201-1208)。因而安全性考虑和规范影响了使用痘苗病毒作为载体发展重组活疫苗的最令人鼓舞的可能性。此外，文献中描述的大多数重组痘苗病毒基于西方保藏的痘苗病毒菌株(WesternReserve strain of vaccinia virus)。另一方面，众所周知此菌株有较高的神经毒性因而不适用于人类和动物(Morita等，疫苗(Vaccine)5，65-70[1987])。对于载体应用，通过使用高度减毒的痘苗病毒菌株可以减小健康危险。特别发展了许多这类痘苗病毒以避免天花接种中的不希望的副作用。因而，通过痘苗病毒安卡拉菌株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中长期的连续传代产生了改良安卡拉痘苗病毒(MVA)(综述参看Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H.[1975]感染(Infection)3，6-14；瑞士专利号(Swiss Patent No.)568,392)。MVA病毒按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于1987年11月15日保藏于CNCM(巴斯德研究所，微生物菌种国家收藏馆(Institut Pasteur，CollectionNationale de Cultures de Microorganisms，)25，rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15)，保藏号1-721。MVA的特点是强减毒性，也就是说通过减少的毒性或感染性同时保持良好的免疫原性。检测了MVA病毒以确定它相对于野生型CVA菌株基因组的变化。检测到六个主要的共31,000碱基对的基因组DNA缺失(缺失I，II，III，IV，V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.和Mayr A.[1991]普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)72，1031-1038)。产生的MVA病毒其宿主细胞严格限于禽源细胞。另外，MVA具有高度减毒的特征。在多种动物模型中的检验证明MVA甚至在免疫抑制的动物中都是无毒性的。更重要的是，MVA菌株的优秀特性已在广泛的临床试验中得到证实(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.l，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。在这些超过120,000人的研究中，包括高危病人，没发现有与MVA疫苗相关的副作用。
已发现MVA在人细胞中的复制在感染后期受到阻碍，防止了成熟感染性病毒粒子的组装。尽管如此，MVA甚至在非允许细胞中也能高水平表达病毒的和重组的基因，并建议作为有效的和特别安全的基因表达载体(Sutter，G.和Moss，B.[1992]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851)。最近，在MVA基础上构建了新的痘病毒载体系统，外源DNA序列插入MVA基因组的缺失III或TK基因(Sutter，G.和Moss，B.[1995]发育生物学标准(Dev.Biol.Stand.)Basel，Karger 84，195-200和美国专利(USpatent)5,185,146)。
为了进一步开发MVA的应用，发现了一种通过DNA重组把外源基因引入痘苗病毒MVA菌株的新的可能方法。由于发明不是要改变MVA病毒的基因组，因此必需使用符合此需要的方法。依据本发明，一种外源DNA序列准确地在MVA基因组自然发生发生缺失位点重组到病毒DNA。
发明内容
本发明从而特别地包括单独的下述内容或它们的组合：
一种重组MVA病毒，包含并能够表达至少一种插入MVA基因组天然缺失位点的外源基因；
上述重组MVA病毒，包含并能够表达至少一种插入MVA基因组缺失II位点的外源基因；
上述重组MVA病毒，其中的外源基因编码一种标记，一种治疗基因或一种抗原决定簇；
上述重组MVA病毒，其中的外源基因编码一种来自于病原性病毒、细菌、或其它微生物，或来自于寄生虫，或肿瘤细胞的抗原决定簇；
上述重组MVA病毒，其中的外源基因编码一种来自于恶性疟虫(Plasmodium Falciparum)，分枝杆菌(Mycobacteria)，疱疹病毒，流感病毒(influenza virus)，肝炎或人免疫缺陷病毒的抗原决定簇；
上述重组MVA病毒，其中的抗原决定簇是人免疫缺陷病毒(HIV)的nef或人酪氨酸酶；
上述重组MVA病毒，其为MVA-LAI nef或MVA-hTYR；
上述重组MVA病毒，其中的外源基因编码T7 RNA聚合酶；
上述重组MVA病毒，其为MVA-T7 pol；
上述重组MVA病毒，其中的外源基因处于痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5的转录控制之下；
上述重组MVA病毒，基本上不含能够在人细胞中复制的病毒；
上述重组MVA病毒的应用，用于在T7 RNA聚合酶启动子转录控制之下转录DNA序列；
由上述任一重组MVA病毒感染的真核细胞；
由上述重组MVA病毒感染的细胞，其中的外源基因编码T7 RNA聚合酶；
由上述重组MVA病毒感染的细胞，其中的外源基因编码T7 RNA聚合酶，此外还包含载有一种或几种处于T7 RNA聚合酶启动子转录控制之下的外源基因的一种或几种表达载体；
上述细胞的应用，用于产生由上述外源基因编码的多肽，包括：
a)在适宜条件下培养上述的细胞，以及
b)分离由上述的外源基因编码的多肽。
由上述重组MVA病毒感染的细胞，其中的外源基因编码T7 RNA聚合酶，此外还包含表达载体，该表达载体载有处于T7 RNA聚合酶启动子控制之下的病毒基因和/或编码一病毒载体基因组的一种病毒载体构建体；
上述细胞的应用，用于产生病毒颗粒，包括：
a)在适宜条件下培养上述的细胞，以及
b)分离病毒颗粒；
由上述MVA病毒感染的细胞，其中的外源基因编码T7 RNA聚合酶，此外还含有：
a)载有一种逆转录病毒载体构建体的表达载体，它能够感染和指导由上述逆转录病毒载体构建体携带的一种或几种外源基因在靶细胞中的表达，以及
b)一种或几种表达载体，其载有的基因处于T7 RNA聚合酶启动子转录控制之下并编码上述逆转录病毒载体构建体的基因组包装所必需的多肽；
上述细胞的应用，用于产生逆转录病毒粒子，包括：
a)在适宜条件下培养上述细胞，以及
b)分离逆转录病毒颗粒；
含有上述重组MVA病毒的疫苗，其中的外源基因在生理可接受载体中编码一抗原决定簇；
上述重组MVA病毒的应用，其中的外源基因编码一种疫苗制剂中的抗原决定簇；
上述疫苗的应用，用于免疫活的动物体，包括人；
上述含有MVA-LAInef的疫苗的应用，用于预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染或爱滋病(AIDS)；
上述含有MVA-hTYR的疫苗的应用，用于预防或治疗黑素瘤；
一种疫苗，其第一种组分包括一种上述重组MVA病毒，其中包括的外源基因在生理可接受载体中编码T7 RNA聚合酶；第二种组分包括一种载有在生理可接受载体中处于T7 RNA聚合酶启动子转录控制之下的抗原决定簇的DNA序列，两种组分可同时包含或分别包含；
上述疫苗的应用，用于免疫活的动物体，包括人，包含用疫苗的第一种和第二种组分对上述活的动物体，包括人，进行同时接种或在同一接种部位延时接种；以及
术语“基因”表示编码一种蛋白或肽的任何DNA序列。
术语“外源基因”表示插入一DNA序列的基因，该序列中通常未发现该基因。
外源基因可以是例如标记基因、治疗基因、编码抗原决定簇的基因或病毒基因。这类基因在本技术领域众所周知。
本发明更具体地涉及：
1.重组MVA病毒，它含有并能表达HIVnef抗原或抗原决定簇。
2.项1的重组MVA病毒，其中的HIVnef基因受痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5的控制。
3.项1或2的重组MVA病毒，基本上不含有能在人的细胞中进行复制的病毒。
4.一种真核细胞，被项1-3之一的重组MVA病毒感染。
5.一种疫苗，在生理可接受的载体中含有项1-3之一所述重组MVA病毒。
6.项1-3之一的重组MVA病毒在疫苗制备中的用途。
7.用于免疫活动物体(包括人)的项1-3之一所述重组MVA病毒和/或项5所述疫苗。
8.用于预防或治疗HIV感染或AIDS的项7所述重组MVA病毒和/或疫苗。
9.项1-3之一的重组MVA病毒在制备重组HIVnef蛋白中的用途。
本发明还涉及：
1.重组MVA病毒，含有并能表达人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原决定簇。
2.项1的重组MVA病毒，其中的hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5的控制。
3.项1或2的重组MVA病毒，基本上不含有能在人的细胞中进行复制的病毒。
4.一种真核细胞，被项1-3之一的重组MVA病毒感染。
5.项1-3之一的重组MVA病毒在制备重组hTyr蛋白中的用途。
6.一种疫苗，在生理可接受的载体中含有项1-3之一的重组MVA病毒和/或项5的重组hTyr蛋白。
7.项1-3之一的重组MVA病毒和/或项5的重组hTyr蛋白在疫苗制备中的用途。
8.用于免疫活动物体(包括人)的项1-3之一所述重组MVA病毒和/或项5所述重组hTyr蛋白和/或项6所述疫苗。
9.用于预防或治疗黑色素瘤的项8所述重组MVA病毒，重组hTyr蛋白和/或疫苗。
10.项1-3之一的重组MVA病毒在回体(ex vivo)基因治疗中的用途。
本发明的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)是一种宿主范围局限的和高度减毒的痘苗病毒菌株，它在测试的人和大多数其它哺乳动物细胞系中不能增殖。但由于在非允许细胞中病毒基因表达未受损伤，依据本发明的重组MVA病毒可能用作特别安全和有效的表达载体。
编码抗原决定簇的重组MVA病毒
在一种实施方案中，本发明涉及重组痘苗病毒，其含有编码外源抗原，优选地属于致病病原体的基因，以及以生理可接受形式包含此类病毒的疫苗。本发明也涉及制备此类重组MVA痘苗病毒或疫苗的方法；涉及应用这些疫苗预防那些致病病原体引起的感染。
在本发明的一种优选实施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一种编码HIVnef的基因。
我们已构建了重组MVA病毒，允许HIV-Inef基因在痘苗病毒早/晚期启动子P7.5的控制下进行表达。灵长类慢病毒的调节性Nef蛋白合成于病毒复制周期的早期并已表明对高滴度病毒复制和体内疾病诱导起重要作用。这提示HIVNef可能在爱滋病病理中有关键作用。Nef促进病毒感染性增加和HIV致病性的分子机制需要进一步阐明。但是，Nef是免疫原性的并且Nef特异抗原可用作疫苗防治HIV感染和爱滋病。
在本文中，表达HIVnef基因的重组MVA病毒可用于人体免疫，一方面作为预防疫苗防止人HIV病毒，另一方面用于HIV感染或爱滋病人的免疫治疗。另外，表达HIVnef基因的MVA病毒也可用于重组HIV Nef蛋白的产生。
本发明的另一种优选实施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一编码人酪氨酸酶的基因。
我们已构建了重组MVA病毒，允许人酪氨酸酶基因在痘苗病毒早/晚期启动子P7.5的控制下进行表达。近来。人酪氨酸酶被鉴定为黑素瘤特异性肿瘤抗原，它可造成抗肿瘤的溶细胞T-淋巴细胞的产生(Brichard，V.等[1993]实验医学杂志(J.Exp.Med.)178，489-495)。由于正常细胞中看来只有黑素细胞表达酪氨酸酶基因，因而酪氨酸酶成为黑素瘤免疫治疗的有效目标抗原。所以，表达人酪氨酸酶基因的重组MVA病毒可用于黑素瘤病人以诱导激发肿瘤排斥或防止转移的免疫反应。表达人酪氨酸酶基因的重组MVA病毒可直接用作抗黑素瘤疫苗，或用病毒制备抗黑素瘤疫苗。在一种例子中，表达人酪氨酸酶基因的重组MVA病毒可用于产生重组酪氨酸酶蛋白，它作为抗原用于疫苗制剂。在另一种例子中，用表达人酪氨酸酶基因的重组MVA病毒作为表达载体，来自肿瘤病人的细胞体外修饰以表达酪氨酸酶并继而转移回病人来诱导抗肿瘤免疫反应。基于表达人酪氨酸酶基因的重组MVA病毒的制备疫苗可用于肠胃外或肿瘤部位。可以防止肿瘤转移或肿瘤的诸如大小、形状、稠度、血管形成或其它表型变化。以表达人酪氨酸酶基因的重组MVA为基础制备的疫苗可用于手术切除肿瘤前、期间或切除后。
为了制备疫苗，依据本发明的MVA痘苗病毒要转换成生理可接受形式。这可基于制备MVA疫苗以免疫天花的经验进行(如Stickl，H.等[1974]Dtsch.Med.Wschr.99，2386-2392所述)。典型地，大约106-108重组MVA颗粒在含2％胨和1％人白蛋白的100毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中冻干并置于一种安瓿管中，优选地是一玻璃安瓿管。冻干品可含有补充剂(例如甘露糖醇、葡聚糖、蔗糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它助剂(例如抗氧化剂，稳定剂等，以适用于肠胃外给药。玻璃安瓿管继而密封并可优选地在-20℃以下贮存几个月。
用于接种或治疗的冻干品可溶于0.1到0.5毫升水溶液，优选地是生理盐水中，并经肠胃外给药例如肌肉内接种或局部给药例如接种到肿瘤或在肿瘤部位局部给药。根据本发明的疫苗或治疗优选地采用肌肉内注射(Mayr，A.等[1978]Zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.B 167，375-390)。给药方式，剂量和给药次数可由本领域熟练技术人员对所知方式进行优化。合适的话，在长时间内接种多次以获得对外源抗原合适的免疫反应是适宜的。
重组MVA病毒用于产生异源多肽的用途
依据本发明的重组MVA痘苗病毒也可用于在真核细胞中制备异源多肽。这导致产生被重组痘苗病毒感染的细胞。编码异源多肽的基因在细胞中表达，并分离所表达的异源多肽。产生此类异源多肽的方法通常为本领域熟练技术人员熟知(EP-A-206和EP-A-205,939)。由于MVA病毒的特殊属性，在重组MVA病毒帮助下产生的多肽非常适于用作人和动物药物。
编码T7 RNA聚合酶的重组MVA病毒及其用于在T7 RNA聚合酶启动 子转录控制下表达DNA序列的用途
在本发明的进一种实施方案中，我们构建了重组MVA病毒，允许在痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5的控制下表达噬菌体T7 RNA聚合酶。MVA-T7pol重组病毒作为表达系统的用途已经过诱导处于T7 RNA聚合酶启动子控制之下的重组基因表达的瞬间转染分析得到证实。使用大肠杆菌(E.coli)氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因作为报告基因，我们发现MVA-T7聚合酶诱导的CAT基因表达就象衍生于痘苗病毒复制型WR菌株的痘苗病毒/T7pol重组体一样有效。
依据本发明的MVA/T7聚合酶杂合系统从而可用作简单、有效和安全的哺乳动物表达系统，以在缺乏大量痘苗病毒复制的情况下产生多肽。
此表达系统也可用于在T7 RNA聚合酶启动子转录控制下产生重组病毒粒子以用于免疫接种或基因治疗，上述病毒粒子通过被表达T7 RNA聚合酶的重组MVA或包含所有或部分基因的DNA构建体以及为产生诸如MVA粒子或逆转录病毒粒子等的病毒粒子所必需的基因组或重组基因组感染的细胞系的转化来产生。
逆转录病毒载体系统由两种组分组成：
1)逆转录病毒载体本身是一种修饰的逆转录病毒(载体质粒)，其中编码病毒蛋白的基因被将要传递给靶细胞的治疗基因和标记基因代替。由于编码病毒蛋白的基因替代损坏了病毒，必须在系统中存在第二种组分提供给修饰逆转录病毒丢失的病毒蛋白以拯救该病毒。
第二种组分是：
2)产生大量病毒蛋白但又缺乏产生可复制型病毒能力的细胞系。此细胞系称为包装细胞系并含有被一种或多个携带能够包装修饰的逆转录病毒载体的基因(编码gag，pol和env多肽的基因)的质粒所转染的一细胞系。
为了产生包装的载体，载体质粒转染入包装细胞系。在这种情况下，含有插入的治疗和标记基因的改良逆转录病毒基因组从载体质粒转录并包装入改良逆转录病毒粒子(重组病毒粒子)。然后用此重组病毒感染靶细胞，其载体基因组和任何携带的标记或治疗基因整合到靶细胞DNA。受此重组病毒粒子感染的细胞不能产生新的载体病毒，因为这些细胞中没有病毒蛋白质。但携带治疗和标记基因的载体DNA整合到了细胞DNA并能在感染细胞中表达。
依据本发明表达T7 RNA聚合酶的重组MVA病毒可用于产生包装逆转录病毒载体所需的蛋白。为此目标，把一种逆转录病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))的gag，pol和env基因置于一种或多个表达载体(例如质粒)中T7RNA聚合酶启动子转录控制之下。表达载体随后引入用重组MVA病毒感染的表达T7 RNA聚合酶的细胞中，同时转入载有逆转录病毒载体构建体的一种表达载体，通常处于T7 RNA聚合酶启动子的转录控制之下。
WO94/29437，WO89/11539和WO96/07748描述了不同类型的逆转录病毒载体构建体，它们可用上述包装系统进行包装。
表达T7 RNA聚合酶的重组MVA病毒的再一种应用是产生重组蛋白，非感染性病毒粒子，或感染性突变病毒粒子，以用于生产疫苗或治疗剂(Buchholz等，病毒学(Virology)，204，770-776(1994)和EP-B1-356695)。为此目的，把病毒基因(例如HIV-1的gag-pol和env基因)置于一种表达载体(例如质粒或其它重组MVA病毒)中T7启动子的转录控制之下。此构建体随后引入用重组MVA病毒感染的表达T7 RNA聚合酶的细胞中。重组病毒基因高效转录，重组蛋白大量制造并可纯化。此外，表达的重组病毒蛋白(例如HIV-1的env，gag)可能组装成假病毒粒子从细胞出芽并可从组织培养物中分离。在另一种实施方案中，由MVA-T7pol系统表达的病毒蛋白(来源于例如人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(Measles virus))通过克服病毒增殖中吸附和感染，脱壳，核酸复制，病毒基因表达，装配，出芽或其它步骤中的缺陷来拯救引入的突变病毒，从而可产生并纯化所述的突变病毒。
MVA-T7pol也可与携带感兴趣抗原基因(例如，HIV的nef，tat，gag，pol或env或其它基因)的DNA序列同时使用进行免疫。首先，给定抗原(例如人免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人乳头瘤病毒(HPV)，单纯疱疹病毒(HSV)，麻疹病毒，流感病毒或其它)的编码序列克隆到处于T7 RNA聚合酶启动子控制之下优选地是质粒的载体中并使用常规实验室方法扩增和纯化产生的DNA构建体。其次，载体DNA同时或在适当时间延迟后与MVA-T7pol一起免疫接种。在接种部位，感兴趣的重组基因在含有载体DNA和MVA-T7pol的细胞中瞬时表达并且相应抗原存在于宿主免疫系统刺激了抗原特异性免疫反应。这种使用非复制痘苗载体MVA-T7pol的方案代表了一种提供给定抗原有效瞬时表达而又避免了组成型基因表达潜在危险的核酸免疫接种的有前途的新方法。
重组MVA痘苗病毒可按下文陈述进行制备。
一种包含侧翼为MVA基因组中邻近自然发生缺失例如缺失II的MVADNA序列的编码一种外源多肽DNA序列的DNA构建体，引入到用MVA感染的细胞中，以发生同源重组。一旦把DNA构建体引入真核细胞并且外源DNA与病毒DNA重组，就可能通过对所需重组痘苗病毒用已知的方式，优选地在标记帮助下，分离到所需重组痘苗病毒(对比Nakano等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79，1593-1596[1982]，Franke等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1918-1924[1985]，Chakrabarti等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3403-3409[1985]，Fathi等，病毒学(Virology)97-105[1986])。要插入的DNA-构建体可以是线状的或环状的。环状DNA是优选的，特别是质粒。DNA-构建体包含位于MVA基因组自然发生缺失例如缺失II左方和右方侧翼的序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger J.(1989)病毒学集刊(Arch.Virol.)105，15-27)。外源DNA序列插入位于自然发生缺失侧翼的序列之间。外源DNA序列可以是编码治疗多肽，例如组织血纤维溶酶原激活剂(t-PA)或干扰素，或来自致病病原体的抗原决定簇的基因。致病病原体可以是导致疾病的病毒、细菌和寄生虫，也可能是在有机体中无限制增殖从而可能导致病理生长的肿瘤细胞。这些致病病原体的例子由Davis，B.D.等做过描述(微生物学(Microbiology)第三版，Harper International Edition)。优选的致病病原体抗原来自人免疫缺陷病毒(例如HIV-1和HIV-2)，导致肺结核的分枝杆菌，寄生虫恶性疟虫，以及黑素瘤细胞。
为了表达一种DNA序列或基因，DNA中必须存在基因转录必需的调节序列。这些调节序列(称为启动子)为本技术领域技术人员所熟知并包含例如EP-A-198,328中所述的痘苗病毒11kDa基因和那些7.5kDa基因(EP-A-110,385)。DNA构建体可通过转染，例如通过磷酸钙沉淀方法(Graham等，病毒学(Virol.)52，456-467[1973]；Wigler等，细胞(Cell)777-785[1978])通过电穿孔方法(Neumann等，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.I，)841-845[1982])，通过微注射方法(Graessmann等，酶学方法(Meth.Enzymology)101，482-492(1983))，通过脂质体方法(Straubinger等，酶学方法(Methods in Enzymology 101，512-527(1983)，通过原生质球方法(Schaffner，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77，2163-2167(1980))或其它本技术领域熟知的方法引入到MVA感染的细胞。通过磷酸钙沉淀进行转染是优选的方法。
下面的详细实施例是为了有助于对本发明的更好理解。但不是说本发明仅局限于实施例内容。
附图说明
图1：图示MVA基因组图谱和用于通过同源重组插入外源DNA的质粒图谱：MVA基因组中的HindIII限制性位点标在上面。显示了重叠MVA基因组中缺失II接界的900bp HindIII-HindIII N片段。邻近缺失II的MVADNA序列通过PCR(聚合酶链式反应)扩增并用于构建插入质粒pUCIILZ。
图2：pUCIILZP7.5：用于插入缺失II的MVA载体质粒，包含P11-Lac Z表达盒和痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5以表达可克隆到质粒SmaI位点的感兴趣基因。
图3：pUCIILZdel P7.5：用于在MVA基因组缺失II位点插入外源基因的MVA载体质粒，含有自缺失P11-Lac Z表达盒和痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5以表达可克隆到质粒SmaI/NotI克隆位点的感兴趣基因。图4：重组病毒MVA-T7pol的构建：图示MVA基因组(HindIII限制性内切核酸酶位点)图谱以及使T7 RNA聚合酶基因插入MVA基因组HingIIIN片段中缺失II位点的载体质粒pUCIILZT7pol的图谱。
图5：MVA-T7pol病毒DNA的Sourthern印迹检测
图6：用[35S]甲硫氨酸对蛋白进行代谢标记。SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳检测。泳道1：MVAT7pol，泳道2：MVA，泳道3：CV-1细胞。
图7：氯霉素乙酰基转移酶(CAT)检测：用含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的CAT基因的质粒转染的以及用MVA-T/pol或WR-T7pol感染的CV-1细胞。裂解物用于检测CAT活性。C是指氯霉素，1-AcC和3-AcC是指单和三乙酰化形式的氯霉素。Cat活性用60分钟内形成的乙酰化产物百分数表示。
图8：MVA-LAInef的构建：图示MVA基因组(HindIII限制性内切核酸酶位点)图谱以及使HIV-1LAI的nef基因插入MVA基因组HindIIIN片段中缺失II位点上的载体质粒pUCIILZdel P7.5-LAInef的图谱。图9：MVA-hTYR的构建：图示MVA基因组(HindIII限制性内切核酸酶位点)图谱以及使人酪氨酸酶基因插入MVA基因组HindIIIN片段中缺失II位点上的载体质粒pUCIILZdel P7.5-TYR的图谱。
实施例
1. 病毒的生长和纯化
1.1  MVA病毒的生长
MVA病毒是一种高度减毒的痘苗病毒，它由安卡拉痘苗病毒(CVA)通过在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中长期连续传代衍生而来。关于产物的历史、特性及MVA菌株的应用的概括性综述参考Mayr等在感染(Infection)3，6-14[1975]中发表的总结。由于在CEF中的减毒，MVA病毒在这种禽宿主细胞中复制到很高的滴度。然而在哺乳动物细胞中MVA是严格生长局限的，并且检测不到病毒引起的典型噬斑形成。所以，MVA病毒要生长于CEF细胞。为了制备CEF细胞，从孵化11天的鸡蛋中分离胚，去除末端，并把胚绞碎后在含有0.25％胰蛋白酶的溶液中37℃解离20分钟。过滤产生的细胞悬液并用SorvaURC-3B离心机在室温下2000rpm离心5分钟沉淀细胞，重悬于10体积培养基A(Eagle基础培养基(MEM Eagle)，例如可获取于Life Technologies GmbH，Eggenstein，Germany)，并再用SorvallRC-3B离心机在室温下2000rpm离心5分钟进行沉淀。细胞沉淀重悬于含10％胎牛血清(FCS)，青霉素(100单位/毫升)，链霉素(100毫克/毫升)和2mM谷氨酰氨的培养基A中以获得含500000细胞/毫升的细胞悬液。用这种方法获得的CEF细胞铺于细胞培养皿中。把它们放到培养基A中，按照所需细胞浓度在二氧化碳培养箱中37℃生长1-2天，并直接或再进行一次细胞传代后用于感染。制备原代培养物的详细描述可在R.I.Freshney，“动物细胞培养”(“Culture of animal cell”)，Alan R.Liss Verlag，New York[1983]一书中第11章99页及其下列等等中找到。
MVA病毒按下面方法用于感染。CEF细胞培养在175厘米2细胞培养瓶。在90％-100％铺满时，去除培养基并且细胞在培养基A中与MVA病毒悬液(每个细胞0.01感染单位(IU)，0.02毫升/厘米2)共培养1小时。然后添加更多的培养基A(0.2毫升/厘米2)并且把培养瓶在37℃培养2-3天(直到大约90％的细胞表现细胞病变效应)。通过刮细胞单层到培养基并在Sorvall RC-3B离心机中4℃ 3000rpm离心5分钟沉淀细胞物质制备粗病毒贮存物。粗病毒制剂在进一步处理(例如病毒纯化)前贮存于-20℃。
1.2  病毒的纯化
为获得尽可能纯的并且不含对宿主细胞特异组分的病毒所采用的纯化步骤类似于Joklik所述(病毒学(Virology)18，9-18[1962])。融解贮存于-20℃的粗病毒保存物并在PBS中悬浮一次(10-20倍沉淀体积)，悬浮液如上述方式离心。新沉淀悬浮于10倍体积Tris缓冲液1(10mM Tris-HCl pH9.0)，悬浮液用超声波简短处理(Labsonic L，B.Braun Biotech International，Melsungen Germany；2×10秒，60瓦，室温)以进一步离解细胞碎片并从细胞物质中释放病毒粒子。细胞核和较大细胞碎片继而通过悬浮液的简短离心去除(获取于杜邦公司(Du Pont Co.)的Sorvall GSA转头，D-6353 BadNauheim，FRG；3000rpm 10℃离心3分钟)。沉淀再一次悬浮于Tris缓冲液1，用超声波处理并离心，如上所述。收集的含游离病毒粒子的上清液联合并铺层于10mM Tris-HCl，pH9.0的10毫升36％蔗糖垫层上，在Beckman SW27/SW 28离心机转头中4℃13,500rpm离心80分钟。去掉上清液，含有病毒粒子的沉淀溶解于10毫升pH9.0的1mM Tris-HCl，用超声波简短处理(室温下2×10秒，仪器如上所述)均匀，加样到20％-40％蔗糖梯度(蔗糖溶于1mM Tris-HCl，pH9.0)以进一步纯化。梯度液在Beckmann SW 41离心机转头中4℃13,000rpm离心50分钟。离心后，含有病毒粒子的分离带在抽吸去带上面体积后用移液管收集。获得的蔗糖溶液用三倍体积PBS稀释然后病毒粒子再通过离心沉淀(Beckmann SW 27/28，60分钟，13,500rpm，4℃)。现在，沉淀绝大部分由纯病毒粒子构成，它重悬于PBS并平衡至病毒浓度平均相当于1-5×109IU/ml。纯化的病毒贮存液贮存于-80℃并直接或用PBS稀释后用于随后的实验。
1.3  MVA病毒的克隆
为了产生均匀贮存病毒制剂，获取于Anton Mayr教授的MVA病毒通过在96孔组织培养板上CEF培养物中连续三次传代过程中的有限稀释进行克隆化。筛选到MVA克隆F6并在CEF中扩增以获得病毒的工作贮存物，作为产生本发明申请中描述的重组MVA病毒以及用于产生以前描述的重组MVA病毒的起始材料(Sutter，G.and Moss，B.[1992]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851；Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.[1994]疫苗(Vaccine)12，1032-1040；Hirsch，V.，Fuerst，T.，Sutter，G.，Carroll，M.，Yang，L.，Goldstein，S.，Piatak，M.，Elkins，W.，Alvord，G.，Montefiori，D.，Moss，B.and Lifson，J.[1996]病毒学杂志(J.Virol.)70，3741-3752)。
2. 重组MVA病毒的构建及其特征
2.1. 载体质粒构建
为了实现重组MVA病毒的产生，构建了新的载体质粒。插入到MVA基因组的外源基因准确定位于MVA基因组自然发生缺失II位点。位于MVA基因组HindIIIN片段中2500bp缺失位点侧翼的MVA DNA序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger，J.[1989]，病毒学集刊(J.Arch.Virol.)105，15-27)用PCR法扩增并克隆到质粒pUC18的多克隆位点。用于左方600bp DNA侧翼的引物是5′-CAGCAG GGTACCCTCATCGTACAGGACGTTCTC-3′和5′-CAGCAG CCCGGGTATTCGATGATTATTTTTAACAAAATAACA-3′(限制性酶KpnI和SmaI位点下面划线)。用于右方550bp DNA侧翼的引物是5′-CAGCAG CTGCAGGAATCATCCATTCCACTGAATAGC-3′和5′CAGCAG
GCATGCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGA-3′(限制性酶PstI和SphI位点下面划线)。在插入到pUC18的MVADNA这两段侧翼之间，利用BamHI位点插入处于痘苗病毒晚期启动子P11控制之下的大肠杆菌(Escherichia coli)Lac Z基因(通过pIIILZ限制性消化制备，Sutter，G.和Moss，B.[1992]美国国家科学院院报(PNAS USA)89，10847-10851)，从而产生MVA插入载体pUCIILZ[图1]。接下来一段含有痘苗病毒早期一晚期启动子P7.5以及用于克隆的SmaI位点的289bp片段(通过EcoRI和XbaI限制性消化质粒载体pSCII制备[Chakra barti等，1985，分子和细胞生物学(Molecularand Cellular Biology)5，3403-3409])插入到pUCIILZ的SmaI位点产生了MVA载体pUCIILZ P7.5[图2]。为了构建一种载体质粒以通过报告酶β-半乳糖苷酶的瞬时合成实现重组MVA病毒的分离，一种来自大肠杆菌(E.coli)Lac Z开放阅读框3′末端的330bp DNA片段用PCR扩增(引物是5′-CAGCAGGTCGACCCCGACCGCCTTACTGCCGCC-3′和5′-GGGGGGCTGCAGATGGTAGCGACCGGCGCTCAG-3′)并克隆到pUCIILZP7.5的SalI和PstI位点，获得MVA载体pUCIILZdel P7.5[图3]。利用SmaI位点，此载体质粒可用于把处于痘苗病毒启动子P7.5转录控制之下的编码外源基因的DNA序列插入到MVA染色体。在通过筛选β-半乳糖苷酶活性分离到所需重组病毒后，重组病毒的进一步增殖导致通过同源重组产生再改造P11-LacZ表达盒的自缺失。
2.2. 重组病毒MVA T7pol的构建和特征
一种含有处于痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5控制之下的噬菌体T7RNA聚合酶完整基因的3.1Kbp DNA片段用EcoR1从质粒pTFF3上切下(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F.W.和Moss，B.，1986，美国国家科学院院报(P.N.A.S.USA)83，8122-8126)，与Klenow DNA聚和酶一起温育修饰产生平头末端，并克隆到pUCIILZ的单独SmaI限制性位点。产生质粒转移载体pUCIILZ T7pol[图4]。选择痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5作为T7 RNA聚合酶基因表达的转录调节子。与较强的痘苗病毒晚期启动子(例如P11)相反，此启动子系统使重组基因在靶细胞感染后立即表达。指导外源基因插入MVA基因组缺失II位点的质粒pUCIILZ T7pol用于产生重组病毒MVAT7pol。
用MVA在每细胞感染复数为0.05 TCID50情况下感染的CEF细胞，按照前面所述使用质粒pUCIILZ T7pol DNA进行转染(Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。表达T7RNA聚合酶并共表达β-D-半乳糖苷酶的重组MVA病毒(MVA P7.5-T7pol)通过在CEF细胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)进行连续五轮噬斑纯化选择出来。随后，通过感染CEF单层扩增重组病毒，并用PCR检测DNA以证实病毒贮存物的遗传均一性。MVA-T7pol病毒DNA的Southern印迹检测证明了重组基因在MVA基因组中缺失II位点的稳定整合[图5]。
为检测重组MVA T7pol的T7 RNA聚合酶表达，测定了来自病毒感染的组织培养物中的[35S]甲硫氨酸标记多肽。生长于12孔板上的单层猴肾细胞系CV-1用病毒以每细胞感染复数20TCID50进行感染。感染3到5小时后，去除培养基，并用1毫升无甲硫氨酸培养基冲洗培养物一次。每孔加入补充有50微居里(μCi)[35S]甲硫氨酸的0.2毫升无甲硫氨酸培养基并在37℃温育30分钟。感染细胞的胞质抽提物通过每孔在0.2毫升0.5％Nonidet P-40裂解缓冲液中37℃温育10分钟制备，样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。CV-1细胞与MVA T7pol的代谢标记显示了两种额外多肽的合成(i)一种大约116,000道尔顿的蛋白代表共表达的大肠杆菌β-半乳糖苷酶以筛选重组病毒以及(ii)一种98,000道尔顿的蛋白，同噬菌体T7 RNA聚合酶预期大小一致[图6]。由MVAT7pol产生的大量β-半乳糖苷酶是令人注目的。体内实验的结果表明，当插入到MVA基因组缺失II位点时有P11-Lac Z基因构建体的强表达，揭示MVA载体病毒中的重组基因当插入到MVA基因组的该位置时可能会更有效地表达。
MVA-T7pol重组病毒作为表达系统的用途与WR-T7pol重组病毒vTF 7-3(Fuerst等1986)的比较通过一种质粒载体DNA的共转染进行了测定，该质粒载体衍生于pTM1(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，Mizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.(1990)自然(Nature)348，91-92)并含有(克隆到pTM1多克隆位点的NcoI和BamHI位点)处于T7 RNA聚合酶启动子(PT7)控制之下的大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。转染和感染的CV-1细胞悬浮于0.2毫升0.25M Tris-HCl(pH7.5)。三轮冻融循环后，通过离心澄清裂解液，测定了上清液中蛋白含量，并且含0.5，0.25，0.1微克总蛋白的样品按Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.(1984)病毒学杂志(J.Virol.)49，857-864所述检测了酶活性。放射自显影后，用Fuji成像检测系统定量标记斑点。结果表明通过使用高减毒痘苗载体MVA，可能利用痘苗病毒-T7RNA聚合酶系统时就象使用完全的可复制型痘苗病毒重组体一样有效[图7]。
2.3. 重组病毒MVA-LAInef的构建及鉴定
一种含有HIV-1 LAI完整nef基因的648bp DNA片段通过PCR从质粒DNA制备(pTG 1166由M.-P.Kieny，Transgene S.A.，Strasbourg惠赠；PCR引物为5′-CAGCAGGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGT-3′和5′-CAGCAGGGATCCATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG-3′)，用限制性内切核酸酶BamHI消化，与Klenow DNA聚合酶一起温育修饰以产生平头末端，并克隆到pUCIIL Zdel P7.5的SmaI位点以产生载体pUCIILZdel P7.5-LAInef[图8]。此质粒可用于改造MVA重组病毒以在痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5控制下表达HIV-1 LAI的nef基因。
用MVA在每细胞感染复数0.05 TCID50感染的CEF细胞再按前述方法用质粒pUCIIL Zdel P7.5-LAInef的DNA进行转染(Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.[1994]疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。含有nef基因和瞬时共表达大肠杆菌Lac Z标记基因的重组MVA通过在CEF细胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D半乳糖苷(300μg/ml)染色的连续几轮噬斑纯化选择出来。此后含有nef基因和缺失Lac Z标记基因的重组MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通过三轮附加的连续噬斑纯化筛选以寻找CEF细胞中的非染色病毒病灶而得以分离。随后，重组病毒感染CEF单层进行扩增，并且用PCR检测MVA-LAInef病毒DNA以证实病毒贮存物的遗传均一性。病毒DNA的Southern印迹检测证实了MVA-LAInef的遗传稳定性并精确表明nef基因和大肠杆菌Lac Z标记基因缺失整合到了病毒基因组缺失II位点。
重组Nef蛋白的有效表达通过对来自MVA-LAInef感染的CEF细胞的蛋白裂解液使用引导抗HIV-1 Nef的鼠单克隆抗体(由K.Krohn惠赠并按照Ovod，V.，Lagerstedt，A.，Ranki，A.，Gombert，F.，Spohn，R.，Tahtinen，M.，Jung，G.，和Krohn，K.[1992]爱滋病(AIDS)6，25-34所述使用)进行Western印迹检测得以证实。
2.4. 重组病毒MVA-hTYR的构建及鉴定
一种含有编码人酪氨酸酶完整基因的1.9kb DNA片段[酪氨酸酶C-DNA克隆123，B2分离自病人SK 29(AV)的黑素细胞系SK 29-MEL，GenBank Acc.no.UO 1873；Brichard，V.，Van Pel，A.，Wolfel，T.，Wolfel，C.，DePlaen，E.，Lethe，B.，Coulie，P.和Boon，B.(1993)实验医学杂志(J.Exp.Med.)178，489-495]通过EcoR1消化从质粒pc DNAI/Amp-Tyr[Wolfel，T.，Van Pel，A.，Brichard，V.，Schneider，J.，Seliger，B.，Meyer zum Buschenfelde，K.和Boon，T.(1994)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)24，759-764]制备，与Klenow DNA聚合酶一起温育修饰产生平头末端，并克隆到pUCIIL ZdelP7.5的SmaI位点以产生载体pUCIIL Zdel P7.5-TYR[图9]。此质粒可用于改造MVA重组病毒以在痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5控制下表达人酪氨酸酶基因。
MVA以每细胞感染复数0.05 TCI D50感染的CEF细胞用前述的质粒pUCIIL Zdel P7.5-TYR的DNR转染(Sutter，G，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。稳定表达人酪氨酸酶基因并瞬时共表达大肠杆菌Lac Z基因的重组MVA病毒通过在CEF细胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)染色的连续几轮噬斑纯化选择出来。此后，表达编码人酪氨酸酶基因并有缺失的Lac Z标记基因的重组MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通过三轮附加的连续噬斑纯化以筛选CEF细胞中的非染色病毒病灶而得以分离。随后，重组病毒感染CEF单层进行扩增，并且用PCR检测MVA-hTYR病毒DNA以证实病毒贮存物的遗传均一性。病毒DNA的Southern印迹检测证实了MVA-hTYR的遗传稳定性并精确表明重组酪氨酸酶基因和大肠杆菌Lac Z标记基因缺失整合到了病毒基因组中缺失II位点重组人酪氨酸酶的有效表达通过对来自MVA-hTYR感染的CEF细胞的蛋白裂解液使用兔多克隆抗体(由V.Hearing惠赠并按照Jimenez，M.，Kameyama，K.，Maloy，L.，Tomita，Y.和Hearing，V.[1988]美国国家科学院院报(P.N.A.S.USA)85，3830-3834所述使用)或引导抗酪氨酸酶的鼠单克隆抗体(由L.Old惠赠并按照Chen，Y.，Stockert，E.，Tsang，S.，Coplan，K.和Old，L.[1995]美国国家科学院院报(P.N.A.S.USA)92，8125-8129所述使用)进行Western印迹检测得以证实。
                              序列表
(1)一般资料
    (i)申请人
      (A)名称：GSF-Forschungszentrumfuer Umwelt und Gesundheit
               GmbH
      (B)街道：Ingolstaedter Landstr.1，Neuherberg
      (C)城市：Oberschleissheim
      (E)国家：德国
      (F)邮编(ZIP)：85764
    (ii)发明名称：重组MVA病毒及其应用
    (iii)系列数目：8
    (iv)计算机可读形式：
      (A)媒介类型：软盘
      (B)计算机：IBM兼容PC
      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
      (D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.30版本(EPO)
    (vi)在先申请资料：
      (A)申请号：DK 0782/95
      (B)申请日：1995，7，4
(2)序列资料1：
    (i)序列特征：
      (A)长度：33碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：其它核酸
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(2)序列资料2：
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      (A)长度：42碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：其它核酸
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(2)序列资料3：
    (i)序列特征：
      (A)长度：36碱基对
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    (ii)分子类型：其它核酸
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    (xi)序列描述：序列3：
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(2)序列资料4：
    (i)序列特征：
      (A)长度：36碱基对
      (B)类型：核酸
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    (ii)分子类型：其它核酸
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(2)序列资料5：
    (i)序列特征：
      (A)长度：33碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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  (ii)分子类型：其它核酸
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(2)序列资料6：
    (i)序列特征：
      (A)长度：33碱基对
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(2)序列资料7：
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CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG    39

Claims (10)

1.重组MVA病毒，它含有并能表达HIV nef抗原或抗原决定簇，或者它含有并能表达人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原决定簇。
2.权利要求1的重组MVA病毒，其中的HIV nef基因或hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5的控制。
3.权利要求1或2的重组MVA病毒，基本上不含有能在人的细胞中进行复制的病毒。
4.一种真核细胞，被权利要求1-3之一的重组MVA病毒感染。
5.一种疫苗，在生理可接受的载体中含有权利要求1-3之一的重组MVA病毒。
6.权利要求1-3之一的重组MVA病毒在疫苗制备中的用途。
7.用于免疫活动物体，包括人，的权利要求1-3之一的重组MVA病毒和/或权利要求5的疫苗。
8.用于预防或治疗HIV感染或AIDS，或者用于预防或治疗黑色素瘤的权利要求5所述重组MVA病毒和/或疫苗。
9.权利要求1-3之一的重组MVA病毒在制备重组HIV nef蛋白或重组hTyr蛋白中的用途。
10.权利要求1-3之一的重组MVA病毒在回体(ex vivo)基因治疗中的用途。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101142319B (zh) * 2005-01-24 2012-05-23 盖斯福研究中心健康和环境有限公司 基于使用修饰安卡拉痘苗病毒的疫苗
CN101460627B (zh) * 2006-06-20 2012-09-05 特朗斯吉有限公司 制备痘病毒的方法以及痘病毒组合物
CN106795500A (zh) * 2014-07-14 2017-05-31 圣拉法埃莱医院有限公司 载体生产
CN109071592A (zh) * 2016-01-08 2018-12-21 吉奥瓦科斯公司 用于产生对肿瘤相关抗原的免疫应答的组合物和方法

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
US7118754B1 (en) * 1996-07-30 2006-10-10 Transgene S.A. Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection
AU4556597A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
MY119381A (en) * 1996-12-24 2005-05-31 Gsf Forschungszentrum Umwelt Recombinant mva virus, and the use thereof
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
FR2784997A1 (fr) * 1998-10-22 2000-04-28 Transgene Sa Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6682742B1 (en) 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
US20150231227A1 (en) * 2000-03-02 2015-08-20 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
WO2001068820A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Anton Mayr Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)
DE10042598A1 (de) * 2000-08-30 2002-03-28 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS
WO2002031168A2 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 Genstar Therapeutics Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7740863B2 (en) 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
DE10143490C2 (de) * 2001-09-05 2003-12-11 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen
DE10144664B4 (de) * 2001-09-11 2005-06-09 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon
CA2466413C (en) 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
NZ533586A (en) * 2001-12-20 2005-02-25 Bavarian Nordic As Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells using high pressure homogenisation
EP1839672A3 (en) * 2002-04-19 2007-11-21 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus Ankara for the vaccination of neonates
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA009525B1 (ru) * 2002-05-16 2008-02-28 Бавариан Нордик А/С Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора
KR101044538B1 (ko) 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
DE10249390A1 (de) * 2002-10-23 2004-05-13 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria
PT1567653E (pt) 2002-11-25 2007-10-01 Bavarian Nordic As Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati
ATE403005T1 (de) * 2003-02-18 2008-08-15 Helmholtz Zentrum Muenchen Rekombinantes mva und verfahren zur erzeugung davon
JP5052893B2 (ja) 2003-02-20 2012-10-17 アメリカ合衆国 ポックスベクターにおける新規の挿入部位
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
MXPA05010260A (es) 2003-03-27 2006-03-17 Ottawa Health Research Inst Virus de estomatitis vesicular mutantes y usos de los mismos.
WO2004093905A1 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 City Of Hope Human cytomegalovirus antigens expressed in mva and methods of use
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
ES2359473T3 (es) 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
WO2005017208A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-24 George Mason Intellectual Properties, Inc. Compositions and methods for treating or preventing hiv infection
EP1518932A1 (en) 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
DK1536015T3 (da) * 2003-11-24 2008-02-18 Bavarian Nordic As Promotorer til ekspression i modificeret vacciniavirus Ankara
JP4719855B2 (ja) 2003-12-05 2011-07-06 国立大学法人北海道大学 高度安全性痘瘡ワクチンウイルスおよびワクシニアウイルスベクター
WO2006113927A2 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
US20090060947A1 (en) * 2006-05-19 2009-03-05 Sanofi Pasteur, Inc. Immunological compositions
WO2008076157A2 (en) * 2006-09-08 2008-06-26 Duke University Modified vaccinia ankara virus vaccine
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
CA2665068C (en) 2006-10-06 2016-01-05 Bn Immunotherapeutics Inc. Methods for treating cancer with mva
US20080241139A1 (en) * 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
CA2676129A1 (en) * 2007-01-26 2008-08-07 The Regents Of The University Of Colorado Methods of modulating immune function
EP2152736B1 (en) 2007-05-03 2017-07-05 Lysomab GmbH Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs
US8003364B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography
JP2010526546A (ja) * 2007-05-14 2010-08-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
US8003363B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
US20100285050A1 (en) * 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
BRPI0800485B8 (pt) * 2008-01-17 2021-05-25 Univ Minas Gerais vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose
CN102257134B (zh) 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
US20110052627A1 (en) * 2008-06-20 2011-03-03 Paul Chaplin Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
EP2424999A1 (en) 2009-04-30 2012-03-07 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (CHUV) Modified immunization vectors
KR20120052352A (ko) * 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물
EP2501405A4 (en) * 2009-11-20 2013-12-04 Inviragen Inc COMPOSITION, METHOD, AND USES OF POX VIRUS ELEMENTS IN VACCINATE CONSTRUCTS
US9005632B2 (en) 2009-11-20 2015-04-14 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
GB201006405D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
US20110262965A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
EP2668201A2 (en) 2011-01-28 2013-12-04 Sanofi Pasteur SA Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
PL2739293T3 (pl) * 2011-08-05 2020-11-16 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2761011B1 (en) * 2011-09-26 2018-05-23 Theravectys Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
KR20150058152A (ko) 2012-07-10 2015-05-28 트랜스진 에스아이 마이코박테리아 항원 백신
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
EP2912069B1 (en) 2012-10-23 2019-07-31 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
US20140286981A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3092000A1 (en) 2014-01-09 2016-11-16 Transgene SA Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
RS61902B1 (sr) 2014-09-26 2021-06-30 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Metodi i kompozicije za indukovanje zaštitnog imuniteta protiv infekcije virusom humane imunodeficijencije
WO2016115116A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
AU2016369326B2 (en) 2015-12-15 2019-02-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
BR112018015696A2 (pt) 2016-02-03 2018-12-26 Geovax Inc composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus
MX2018010231A (es) * 2016-02-25 2019-06-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Mva recombinante o mvadele3l que expresa el flt3l humano y uso de los mismos como agentes inmunoterapéuticos contra tumores sólidos.
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
US10273268B2 (en) 2016-06-16 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine formulation
AU2017318689A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
HUE052008T2 (hu) 2016-09-15 2021-04-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Trimert stabilizáló HIV-burokfehérje-mutációk
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
MA49397A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Bavarian Nordic As Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation
EP3641803A2 (en) 2017-06-21 2020-04-29 Transgene Personalized vaccine
BR112020000867A2 (pt) 2017-07-19 2020-07-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero
US20190022212A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human
WO2019055888A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
JP7320601B2 (ja) 2018-09-11 2023-08-03 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用
TW202110476A (zh) 2019-05-22 2021-03-16 荷蘭商傑森疫苗防護公司 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法
KR20220082033A (ko) * 2019-10-16 2022-06-16 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. 레트로바이러스의 계내 생성을 위한 생산자 바이러스
CA3161633A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
EP3842065A1 (en) 2019-12-23 2021-06-30 Transgene Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine
WO2021260065A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
EP3928789A1 (en) 2020-06-24 2021-12-29 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
IL308018A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for different MHC expression
WO2022269003A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN
EP4108257A1 (en) 2021-06-23 2022-12-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
WO2023220283A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Pellis Therapeutics, Inc. Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination
EP4316514A1 (en) 2022-08-03 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE787901A (fr) 1971-09-11 1972-12-18 Freistaat Bayern Represente Pa Vaccin antivariolique
AU570940B2 (en) 1982-11-30 1988-03-31 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Process for producing poxvirus recombinants for expression offoreign genes
US5679511A (en) * 1986-10-06 1997-10-21 Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US5221610A (en) * 1988-05-26 1993-06-22 Institut Pasteur Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection
CN1042564A (zh) * 1988-11-11 1990-05-30 中国科学院上海生物化学研究所 乙肝疫苗的制备方法及其制品
JPH03271233A (ja) * 1990-03-19 1991-12-03 Inst Pasteur ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発
EP0613378A1 (en) * 1991-10-28 1994-09-07 Institut Pasteur Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides
ES2172287T4 (es) * 1992-12-22 2003-04-16 Ludwig Inst Cancer Res Metodos de deteccion y tratamiento de individuos con celulas anormales que expresan los antigenos peptidicos hla-a2/tirosinasa.
US5620886A (en) * 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
CA2173138A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-27 Masafumi Takiguchi Peptide capable of inducing immune response against hiv and aids preventive or remedy containing the peptide
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101142319B (zh) * 2005-01-24 2012-05-23 盖斯福研究中心健康和环境有限公司 基于使用修饰安卡拉痘苗病毒的疫苗
CN101460627B (zh) * 2006-06-20 2012-09-05 特朗斯吉有限公司 制备痘病毒的方法以及痘病毒组合物
CN106795500A (zh) * 2014-07-14 2017-05-31 圣拉法埃莱医院有限公司 载体生产
US10912824B2 (en) 2014-07-14 2021-02-09 Ospedale San Raffaele S.R.L. Vector production
CN106795500B (zh) * 2014-07-14 2022-12-13 圣拉法埃莱医院有限公司 载体生产
US11957747B2 (en) 2014-07-14 2024-04-16 Ospedale San Raffaele S.R.L. Vector production
CN109071592A (zh) * 2016-01-08 2018-12-21 吉奥瓦科斯公司 用于产生对肿瘤相关抗原的免疫应答的组合物和方法
CN109071592B (zh) * 2016-01-08 2022-07-19 吉奥瓦科斯公司 用于产生对肿瘤相关抗原的免疫应答的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20100291139A1 (en) 2010-11-18
PL186857B1 (pl) 2004-03-31
EP1312678A1 (en) 2003-05-21
CA2225278A1 (en) 1997-01-23
JP4312260B2 (ja) 2009-08-12
SI0836648T1 (en) 2003-12-31
CZ292460B6 (cs) 2003-09-17
PT836648E (pt) 2003-09-30
TW200305646A (en) 2003-11-01
JP2007244382A (ja) 2007-09-27
US6440422B1 (en) 2002-08-27
SI1312678T1 (sl) 2006-02-28
DK1312678T3 (da) 2005-12-19
ES2249648T3 (es) 2006-04-01
BR9609303A (pt) 1999-05-25
MX9800025A (es) 1998-03-31
RU2198217C2 (ru) 2003-02-10
PL324347A1 (en) 1998-05-25
EP1312678B1 (en) 2005-09-07
BR9609303B1 (pt) 2014-04-08
HUP9802217A2 (hu) 1999-01-28
DK0836648T3 (da) 2003-08-25
WO1997002355A1 (en) 1997-01-23
KR19990028617A (ko) 1999-04-15
AU721735B2 (en) 2000-07-13
US8153138B2 (en) 2012-04-10
IL202448A0 (en) 2011-07-31
EP1312679B8 (en) 2005-11-23
DE69635172T2 (de) 2006-06-22
BR9609303B8 (pt) 2014-05-06
DE69635173D1 (de) 2005-10-13
IL122120A0 (en) 1998-04-05
HUP9802217A3 (en) 1999-09-28
EP0836648B1 (en) 2003-05-07
EE200300332A (et) 2003-10-15
US20070071770A1 (en) 2007-03-29
NO980026L (no) 1998-01-02
JP4764366B2 (ja) 2011-08-31
EE04199B1 (et) 2003-12-15
US7198934B2 (en) 2007-04-03
HU0402350D0 (en) 2005-01-28
NO322476B1 (no) 2006-10-09
IL122120A (en) 2005-07-25
ATE239796T1 (de) 2003-05-15
CA2596274A1 (en) 1997-01-23
TW575664B (en) 2004-02-11
AU6611096A (en) 1997-02-05
JPH11509091A (ja) 1999-08-17
ATE304057T1 (de) 2005-09-15
DE69628011D1 (de) 2003-06-12
EP0836648A1 (en) 1998-04-22
EP1312679A1 (en) 2003-05-21
CA2608864A1 (en) 1997-01-23
CA2608864C (en) 2010-09-07
DE69635173T2 (de) 2006-07-13
HK1009830A1 (en) 1999-06-11
UA68327C2 (en) 2004-08-16
UA75410C2 (en) 2006-04-17
EE9700344A (et) 1998-06-15
CA2596274C (en) 2010-09-07
SI1312679T1 (sl) 2006-02-28
DE69628011T2 (de) 2004-03-18
DK1312679T3 (da) 2006-01-09
US20100266630A1 (en) 2010-10-21
JP2007252374A (ja) 2007-10-04
ES2199294T3 (es) 2004-02-16
ES2249647T3 (es) 2006-04-01
JP4764367B2 (ja) 2011-08-31
TWI245075B (en) 2005-12-11
US8197825B2 (en) 2012-06-12
US20070071769A1 (en) 2007-03-29
CN1189857A (zh) 1998-08-05
CN1782071A (zh) 2006-06-07
CA2225278C (en) 2009-01-27
EE04753B1 (et) 2006-12-15
DE69635172D1 (de) 2005-10-13
CZ424197A3 (cs) 1998-03-18
EE200300331A (et) 2003-10-15
IL212933A0 (en) 2011-07-31
HU229261B1 (en) 2013-10-28
EE05138B1 (et) 2009-02-16
HU224061B1 (hu) 2005-05-30
CN1154742C (zh) 2004-06-23
ATE304058T1 (de) 2005-09-15
NZ313597A (en) 1999-01-28
EP1312679B1 (en) 2005-09-07
HK1068015A1 (en) 2005-04-22
NO980026D0 (no) 1998-01-02
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