JPH11509091A - 組換えｍｖａウイルスおよびその使用 - Google Patents

組換えｍｖａウイルスおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠損部位に挿入された外来遺伝子を含み、発現することが可能な組換えＭＶＡウイルス、並びにその様な組換えＭＶＡウイルスをポリペプチド（例えば、抗原または治療剤）の製造に使用すること、およびワクチン若しくは遺伝子治療のためのウイルスベクターの製造のために使用すること。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＭＶＡウイルスおよびその使用 本発明は、ワクシニアウイルスアンカラ（Ａnkara）（ＭＶＡ）ゲノム内の天 然に存在する欠失部位に挿入された外来遺伝子を含有し、その発現能を有する、 修飾されたＭＶＡに由来する組換えワクシニアウイルス、およびポリペプチド（ 例えば、抗原若しくは治療剤）または遺伝子治療用ウイルスベクターを製造する ためのそのような組換えＭＶＡウイルスの使用、および抗原をコードするそのよ うな組換えＭＶＡウイルスのワクチンとしての使用に関する。 発明の目的 効率的で非常に安全な発現ベクターとして使用しうる組換えＭＶＡウイルスを 提供することが本発明の目的である。 本発明のもう１つの目的は、ポリペプチド（例えば、抗原または治療剤）、ワ クチン用組換えウイルスおよび遺伝子治療用ウイルスベクターの簡便で効率的で 安全な製造法を提供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え ＭＶＡウイルスに基づく発現系、およびこの発現系に基づくポリペプチド（例え ば、抗原または治療剤）および遺伝子治療用またはワクチン用のウイルスベクタ ーの製造法を提供することである。 発明の背景 ポックスウイルス科オルトポックスウイルス属の一員であるワクシニアウイル スは、ヒト痘瘡疾患に対する免疫化のための生ワクチンとして使用された。ワク シニアウイルスによる予防接種の世界的な成功により、痘瘡の原因因子である痘 瘡ウイルスがついに根絶された（Ｔhe global eradication of smallpox.Ｆinal report of the global commission for the certification of smallpox eradi cation.Ｈistory of Ｐublic Ｈealth，Ｎo.4，Ｇeneva:Ｗorld Ｈealth Ｏrgan ization，1980)。そのＷＨＯの宣言以来、ポックスウイルス感染症に対してハイ リスクの人々（例えば、研究所員）を除き、一般には予防接種は中断されている 。 その後、ワクシニアウイルスは、組換え遺伝子発現用ウイルスベクターの設計 、および組換え生ワクチンとしての潜在的使用に使用されている(Ｍackett，Ｍ. ，Ｓmith，Ｇ.Ｌ.およびＭoss，Ｂ.[1982]Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ.ＵＳＡ 79，7415-7419; Ｓmith，Ｇ.Ｌ.，Ｍackett，Ｍ.およびＭoss，Ｂ.[1984]Ｂiotechnology and Ｇ enetic Ｅngineering Ｒeviews 2，383-407)。これには、ＤＮＡ組換え技術の助 けによりワクシニアウイルスのゲノム中へ導入される外来抗原をコードするＤＮ Ａ配列（遺伝子）が必要となる。ウイルスの生活環に必須でないウイルスＤＮＡ 中の部位にその遺伝子が組込まれた場合、新しく産生された組換えワクシニアウ イルスが感染性となる、すなわち、外来細胞に感染し、そして組込まれたＤＮＡ 配列を発現することが可能である(欧州特許出願第83,286号および第110,385号) 。このようにして製造される組換えワクシニアウイルスは、一方では、感染性疾 患の予防のための生ワクチンとして、他方では、真核細胞における異種タンパク 質の製造のために使用することができる。 バクテリオファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する組換えワクシニ アウイルスにより、哺乳動物細胞中での組換えタンパク質合成に広く適用可能な 発現系を確立させることができた(Ｍoss，Ｂ.，Ｅlroy-Ｓtein，Ｏ.，Ｍizukami ，Ｔ.，Ａlexander，Ｗ.Ａ.およびＦuerst Ｔ.Ｒ.[1990]Ｎature 348，91-92)。 すべてのプロトコールにおいて、組換え遺伝子発現は、真核細胞の細胞質中での Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼの合成に依存する。一過性発現のためのプロトコールが 最も一般的となった(Ｆuerst，Ｔ.Ｒ.，Ｎiles，Ｅ.Ｇ.，Ｓtudier，Ｆ.Ｗ.およ びＭoss，Ｂ.[1986]Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ83,8122-8126および米国特 許出願第7.648.971号)。まず第１に、関心のある外来遺伝子を、Ｔ7 ＲＮＡポリ メラーゼプロモーターの制御下でプラスミド中に挿入する。ついで、このプラス ミドを、標準的なトランスフェクション法を用いて、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを 産生する組換えワクシニアウイルスに感染した細胞の細胞質中に導入する。 このトランスフェクションプロトコールは、新たな組換えウイルスの作製を必 要としないため簡便であり、80％を超す細胞が関心のある遺伝子を発現し、非常 に効率的である(Ｅlroy-Stein，Ｏ.およびＭoss，Ｂ.[1990]Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ87,6743-6747)。他の一過性発現系に対するワクシニアウイルス／Ｔ 7 ＲＮＡ ポリメラーゼハイブリッド系の利点は、おそらく、それが細胞核へのプラスミド の輸送に依存しない点であろう。これまでのところ、この系は、ウイルス学およ び細胞生物学における分析目的に非常に有用となっている(Ｂuonocore，Ｌ.およ びＲose，Ｊ.Ｋ.[1990]Ｎature 345，625-628，Ｐattnaik，Ａ.Ｋ.およびＷertz ，Ｇ.Ｗ.[1991]Ｐroc Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ88，1379-1383，Ｋarschin，Ａ. ，Ａiyar，Ｊ.，Ｇouin，Ａ.，Ｄavidson，Ｎ.およびＬester，Ｈ.Ａ.[1991]Ｆ ＥＢＳ Ｌett.278，229.233，Ｈo，Ｂ.Ｙ.，Ｋarschin，Ａ.，Ｒaymond，Ｊ.， Ｂranchek，Ｔ.，Ｌester，Ｈ.Ａ.およびＤavidson，Ｎ.[1992]ＦＥＢＳ Ｌett. 301，303-306，Ｂuchhoiz，Ｃ.Ｊ.，Ｒetzler Ｃ.，Ｈomann，Ｈ.Ｅ.およびＮeu bert，Ｗ.Ｊ.[1994]Ｖirology 204，770-776)。しかしながら、ワクシニアウイ ルス／Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼハイブリッド系の重要な将来的適用（例えば、ヒ トにおける新規治療または予防的アプローチのための組換えタンパク質または組 換えウイルス粒子の製造）は、組換えワクシニアベクターの生産的複製により妨 げられる可能性がある。 ワクシニアウイルスはヒトに感染性であり、痘瘡根絶運動中の予防接種の際に は、時々、重篤な合併症が認められた。合併症の発生に関する最良の概要説明は 、ニューヨーク市衛生委員会のワクシニアウイルス株（Ｎew York Ｃity Ｂoard of Ｈealth strain of vaccinia virus）に基づくワクチンによる約1200万人の 予防接種を監視した米国における全国調査から得られている(Ｌane，Ｊ.，Ｒube n，Ｆ.，Ｎeff，Ｊ.およびＭillar，Ｊ.[1969]Ｎew Ｅngl.Ｊ.Ｍed.281，1201-1 208)。したがって、組換え生ワクチン開発用のベクターとしてワクシニアウイル スを使用するという最も興味深い可能性は、安全性に対する懸念および規制に影 響されている。さらに、文献に記載されている組換えワクシニアウイルスのほと んどは、ワクシニアウイルスのウエスタン・リザーブ（Ｗestern Ｒeserve）株 に基づく。一方、この株は高い神経毒性を有し、したがって、ヒトおよび動物で の使用にあまり適さないことが知られている(Ｍoritaら，Ｖaccine 5，65-70[19 87])。 ベクターの適用では、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株の使用により 、健康に対する危険性は減少するであろう。特に、痘瘡予防接種の望ましくない 副作用を避けるために、そのようないくつかのワクシニアウイルス株が開発され た。例えば、修飾されたワクシニアウイルスアンカラ（Ａnkara）（ＭＶＡ）は 、ワクシ ニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ株をニワトリ胚繊維芽細胞上で長期にわたり 連続継代することにより作製された（概説としては、Ｍayr，Ａ.，Ｈochstein- Ｍintzel，Ｖ.およびＳtickl，Ｈ.[1975]Ｉnfection 3，6-14;スイス国特許第56 8,392号を参照されたし）。ＭＶＡウイルスは、ブダペスト条約の要求に応じて 、ＣＮＣＭ（Ｉnstitut Ｐasteur，Ｃollection Ｎationale de Ｃultures de Ｍicroorganisms，25，rue du Ｄocteur Ｒoux，75724 Ｐaris Cedex 15）に198 7年12月15日に受託番号Ｉ-721として寄託されている。ＭＶＡは、その高度な弱 毒化、すなわち、優れた免疫原性を維持しつつ、毒性または感染力が減少してい ることにより特徴づけられる。ＭＶＡウイルスは、野生型ＣＶＡ株に対するゲノ ム変化を決定するために分析されており、合計31,000塩基対になるゲノムＤＮＡ の６つの主要な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、ＶおよびVI）が同定されている(Ｍ eyer，Ｈ.，Ｓutter，Ｇ.およびＭayr Ａ.[1991]Ｊ.Ｇen.Ｖirol.72，1031-1038 )。得られたＭＶＡウイルスは、宿主細胞がニワトリ細胞に厳格に限局したもの となった。 さらに、ＭＶＡは、その極端な弱毒化により特徴づけられる。種々の動物モデ ルで試験した場合、ＭＶＡは、免疫抑制されている動物においてさえも無毒であ ることが判明した。さらに重要なことは、ＭＶＡ株の優れた特性が、広範な臨床 試験において証明されていることである(Ｍayrら，Ｚbl.Ｂakt.Hyg.Ｉ，Ａbt.Ｏ rg.Ｂ 167，375-390[1987]，Ｓticklら，Ｄtsch.med.Ｗschr.99，2386-2392[197 4])。ハイリスク患者を含む120,000人を超える人々において行われたこれらの研 究では、ＭＶＡワクチンの使用に伴う副作用はなかった。 ヒト細胞中でのＭＶＡ複製は、感染後期に遮断され、成熟した感染性ビリオン への集合が妨げられることが判明した。それにもかかわらず、ＭＶＡは、非許容 細胞においてさえも、ウイルスおよび組換え遺伝子を高レベルで発現する能力を 有しており、効率的で著しく安全な遺伝子発現ベクターとして使用することが提 案されている(Ｓutter，Ｇ.およびMoss，Ｂ.[1992]Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ ＳＡ 89，10847-10851)。最近、ＴＫ遺伝子内またはＭＶＡゲノム内の欠失III部 位に挿入された外来ＤＮＡ配列を有する新規ワクシニアベクター系が、ＭＶＡに 基づいて確立された(Ｓutter，Ｇ.およびＭoss，Ｂ.[1995]Ｄev.Ｂiol.Ｓtand. Ｂasel，Ｋarger 84，195-200および米国特許第5,185,146号)。 ＭＶＡの使用をさらに開発するために、ワクシニアウイルスのＭＶＡ株中にＤ ＮＡ組換えにより外来遺伝子を導入するための可能な新規方法が探索されている 。その意図はＭＶＡウイルスのゲノムを変化させることではないため、この要求 に応じた方法を用いる必要があった。本発明においては、外来ＤＮＡ配列を、ウ イルスＤＮＡ中の、ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失部位に正確に再結合さ せた。 発明の概要 したがって、本発明は、とりわけ、以下のものを単独でまたは組み合わせて含 んでなる： ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失部位に挿入された少なくとも１つの外来 遺伝子を含有し、その発現能を有する組換えＭＶＡウイルス； ＭＶＡゲノム内の欠失II部位に挿入された少なくとも１つの外来遺伝子を含有 し、その発現能を有する、前記組換えＭＶＡウイルス； 該外来遺伝子が、マーカー、治療剤または抗原決定基をコードする、前記組換 えＭＶＡウイルス； 該外来遺伝子が、病原性ウイルス、細菌または他の微生物からの、または寄生 生物または腫瘍細胞からの抗原決定基をコードする、前記組換えＭＶＡウイルス ； 該外来遺伝子が、熱帯熱マラリア原虫(Ｐlasmodium Ｆalciparum)、マイコバ クテリア、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎またはヒト免疫不 全ウイルスからの抗原決定基をコードする、前記組換えＭＶＡウイルス； 該抗原決定基がＨＩＶ nefまたはヒトチロシナーゼである、前記組換えＭＶＡ ウイルス： ＭＶＡ-ＬＡＩnefまたはＭＶＡ-hＴＹＲである、前記組換えＭＶＡウイルス； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする、前記組換えＭＶＡウイ ルス； ＭＶＡ-Ｔ7 polである、前記組換えＭＶＡウイルス； 該外来遺伝子が、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の転写制 御下にある、前記組換えＭＶＡウイルス； ヒト細胞中で複製可能なウイルスを実質的に含まない、前記組換えＭＶＡウイ ルス； Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でのＤＮＡ配列の転写のための 、前記組換えＭＶＡウイルスの使用； 前記のいずれかの組換えＭＶＡウイルスに感染した真核細胞； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする、前記組換えＭＶＡウイ ルスに感染した細胞； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする前記の組換えＭＶＡウイ ルスに感染した細胞であって、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御 下の１以上の外来遺伝子を保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する細胞 ； 前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドの製造のための、前記細胞の使用 であって、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することを含んでなる 使用； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする前記の組換えＭＶＡウイ ルスに感染した細胞であって、ウイルス遺伝子を保持する発現ベクターおよび／ またはＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御下のウイルスベクターの ゲノムをコードするウイルスベクターコンストラクトをさらに含有する細胞； ウイルス粒子の製造のための、前記細胞の使用であって、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）該ウイルス粒子を単離することを含んでなる使用； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする前記の組換えＭＶＡウイ ルスに感染した細胞であって、 a）標的細胞に感染する能力と、前記レトロウイルスベクターコンストラクト により保持される１以上の外来遺伝子の標的細胞における発現を指令する能力と を有するレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクター、およ び b）前記レトロウイルスベクターコンストラクトのゲノムがパッケージングさ れるのに必要なポリペプチドをコードする遺伝子をＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロ モーターの転写制御下で保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する細胞； レトロウイルス粒子の製造のための、前記細胞の使用であって、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）該レトロウイルス粒子を単離することを含んでなる使用； 生理的に許容される担体中に、該外来遺伝子が抗原決定基をコードする前記組 換えＭＶＡウイルスを含有するワクチン； ワクチンの製造のための、該外来遺伝子が抗原決定基をコードする前記組換え ＭＶＡウイルスの使用； 動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための、前記ワクチンの使用； ＨＩＶ感染若しくはエイズの予防または治療のための、ＭＶＡ-ＬＡＩnefを含 有する前記ワクチンの使用； 黒色腫の予防または治療のための、ＭＶＡ-hＴＹＲを含有する前記ワクチンの 使用； 該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする前記組換えＭＶＡウイル スを生理的に許容される担体中に第１成分として、そしてＴ7 ＲＮＡポリメラー ゼプロモーターの転写制御下で抗原決定基を保持するＤＮＡ配列を生理的に許容 される担体中に第２成分として含んでなり、それらの２成分が一緒にまたは別々 に含有されているワクチン； 動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための前記ワクチンの使用であって、前記 動物（ヒトを含む）生体に、該ワクチンの第１成分および第２成分を同時にまた は一定の時間間隔で同じ接種部位に接種することを含んでなる使用。 「遺伝子」なる語は、タンパク質またはペプチドをコードする如何なるＤＮＡ 配列をも意味する。 「外来遺伝子」なる語は、ＤＮＡ配列中に挿入されている、通常は該配列中に 存在しない遺伝子を意味する。 外来遺伝子は、例えば、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗原決定基をコード する遺伝子、またはウイルス遺伝子であってもよい。そのような遺伝子は、当該 分野でよく知られている。 本発明 宿主範囲が限定されている高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である修 飾されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ヒトおよび試験された他の ほとんどの哺乳動物細胞系において増殖能を有さない。しかし、ウイルス遺伝子 発現は、非許容細胞においては損なわれていないため、本発明の組換えＭＶＡウ イルスは、非常に安全で効率的な発現ベクターとして使用することができる。 抗原決定基をコードする組換えＭＶＡウイルス １つの実施態様では、本発明は、外来抗原（好ましくは、病原体のもの）をコ ードする遺伝子を含有する組換えＭＶＡワクシニアウイルス、および生理的に許 容される形態中にそのようなウイルスを含有するワクチンに関する。本発明はま た、そのような組換えＭＶＡワクシニアウイルスまたはワクチンの製造法、およ びそのような病原体が引き起こす感染症の予防のためのこれらのワクチンの使用 に関する。 本発明の好ましい実施態様においては、ＭＶＡウイルスに挿入される外来遺伝 子は、ＨＩＶ nefをコードする遺伝子である。 本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の制御下で ＨＩＶ-1 nef遺伝子の発現を可能とする組換えＭＶＡウイルスを構築した。 霊長類レンチウイルスの調節性Ｎefタンパク質は、ウイルス複製サイクルの初 期に合成され、高力価のウイルスの複製およびインビボでの疾患誘導に必須であ ることが示されている。これは、ＨＩＶ Ｎefが、エイズ病原において非常に重 要な役割を果たしているかもしれないことを示唆している。Ｎefがウイルス感染 力の増大およびＨＩＶの病原性に寄与する分子メカニズムについては、さらに解 明されねばならない。しかしながら、Ｎefは免疫原性であり、Ｎef特異的抗原は 、ＨＩＶ感染およびエイズに対するワクチンとして使用することができる。 このような状況において、ＨＩＶ nef遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルス は、一方では、ヒトＨＩＶに対する予防ワクチンとしてヒトの免疫化に、他方で は、ＨＩＶ感染者またはエイズ患者の免疫療法に使用することができる。さらに 、ＨＩＶ nef遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスは、組換えＨＩＶ Ｎefタ ンパク質の製造に使用することができる。 本発明のもう１つの好ましい実施態様では、ＭＶＡウイルス中に挿入される外 来遺伝子は、ヒトチロシナーゼをコードする遺伝子である。 本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の制御下で ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現を可能とする組換えＭＶＡウイルスを構築した。 最近、ヒトチロシナーゼは、抗腫瘍細胞溶解性Ｔリンパ球を産生する黒色腫特異 的腫瘍抗原として同定された(Brichard，Ｖ.ら[1993]J.Exp.Med.178，489-495) 。正常細胞のうち、メラノサイトのみがチロシナーゼ遺伝子を発現すると考えら れるため、チロシナーゼは、黒色腫の免疫療法のための有用な標的抗原である。 したがって、ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスを黒色腫 の患者で使用して、腫瘍拒絶を惹起するか又は転移を防ぐ免疫応答を誘導するこ とができる。ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスは、抗黒 色腫ワクチンとして直接使用することができるし、あるいは、該ウイルスは、抗 黒色腫ワクチンの製造にも使用することができる。１つの具体例では、ヒトチロ シナーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスは、ワクチン調製物中の抗原と して使用される組換えチロシナーゼタンパク質の製造に使用することができる。 もう１つの具体例では、ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイル スを発現ベクターとして使用することにより、腫瘍患者由来の細胞を、チロシナ ーゼを発現するようインビトロで修飾し、患者に再導入して、抗腫瘍免疫応答を 誘導することができる。ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡに基づ いて調製されたワクチンは、非経口的にまたは局所的に腫瘍部位で使用して、腫 瘍の転移を防ぐため、または腫瘍の表現型（例えば、サイズ、形状、堅さ、血管 新生または他の特徴）を変化させるために使用することができる。ヒトチロシナ ーゼ遺伝子を発現する組換えＭＶＡに基づいて調製されたワクチンは、腫瘍の外 科的切除の前、手術中またはその後に使用することができる。 ワクチンの製造では、本発明のＭＶＡワクシニアウイルスを、生理的に許容さ れる形態に変換する。これは、痘瘡に対する予防接種に使用されるＭＶＡワクチ ンの製造における経験に基づいて行なうことができる(Stickl，Ｈ.ら，[1974]Ｄ tsch.med.Ｗschr.99，2386-2392に記載されているとおりである)。典型的には、 約106〜108個の組換えＭＶＡ粒子を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）100ml中２％ ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下、アンプル、好ましくはガラスアン プル中で凍結乾燥する。該凍結乾燥物は、非経口投与に適した増量剤（例えば、 マ ンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリ ドン）または他の補助物質（例えば、抗酸化剤、安定化剤など）を含有していて もよい。ついで、そのガラスアンプルを封管する。それは、好ましくは−20℃未 満の温度で数ヶ月保存することができる。 予防接種または治療には、該凍結乾燥物を、0.1〜0.5mlの水溶液、好ましくは 生理食塩水に溶解し、例えば筋肉内接種により非経口的に、あるいは例えば腫瘍 中または腫瘍部位への接種により局所的に投与することができる。本発明のワク チンまたは治療剤は、好ましくは筋肉内に注射する(Ｍayr，Ａ.ら，[1978]Ｚbl. Ｂakt.Ｈyg.，Ｉ.Ａbt.Ｏrig.Ｂ 167，375-390)。当業者であれば、投与方法、 投与の用量および回数を公知方法で最適化することができる。場合によっては、 外来抗原に対する適当な免疫応答を得るために、非常に長期にわたりワクチンを 数回投与するのが好都合である。 異種ポリペプチドの製造のための組換えＭＶＡウイルスの使用 本発明の組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、真核細胞における異種ポリペプ チドの製造にも使用することができる。これには、該組換えワクシニアウイルス に感染する細胞が必要となる。外来ポリペプチドをコードする遺伝子を該細胞中 で発現させ、発現された異種ポリペプチドを単離する。そのような異種ポリペプ チドの製造に使用する方法は、当業者に一般に公知である（ＥＰ-Ａ-206,920お よびＥＰ-Ａ-205,939)。組換えＭＶＡウイルスの助けにより製造されるポリペプ チドは、ＭＶＡウイルスの特別な特性のため、ヒトおよび動物で薬物として使用 するのに一層適したものである。 Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えＭＶＡウイルス、およびＴ7 ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーターの転写制御下でのＤＮＡ配列の発現のためのその使用 本発明のさらに別の実施態様では、本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／ 後期プロモーターＰ7.5の制御下でバクテリオファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ 遺伝子の発現を可能とする組換えＭＶＡウイルスを構築した。発現系としてのＭ ＶＡ-Ｔ7pol組換えウイルスの有用性は、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター の制御下で組換え遺伝子の発現を誘導する一過性トランスフェクションアッセイ において既に試験されている。大腸菌（Ｅ.coli）クロラムフェニコールアセチ ルトラ ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をレポーター遺伝子として使用して、本発明者 らは、ＭＶＡ-Ｔ7polが、複製可能なワクシニアウイルスＷＲ株に由来するワク シニア／Ｔ7pol組換えウイルスと同等に有効にＣＡＴ遺伝子発現を誘導すること を見出した。 したがって、本発明のＭＶＡ／Ｔ7ポリメラーゼハイブリッド系は、生産的ワ クシニアウイルス複製の不存在下でポリペプチドを製造するための簡便で効率的 で安全な哺乳動物発現系として使用することができる。 また、この発現系は、ウイルス粒子（例えば、ＭＶＡ粒子またはレトロウイル ス粒子）の産生に必要な遺伝子、ゲノムまたは組換えゲノムのすべてまたはいく つかをＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御下で含有するＤＮＡコン ストラクトにより、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えＭＶＡに感染した 細胞系を形質転換することにより、予防接種または遺伝子治療用の組換えウイル ス粒子を産生させるために使用することができる。 レトロウイルスベクター系は、以下の２つの成分よりなる。 １）該レトロウイルスベクター自体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝 子が標的細胞に導入すべき治療用遺伝子およびマーカー遺伝子で置換されている 修飾されたレトロウイルス（ベクタープラスミド）である。ウイルスタンパク質 をコードする遺伝子の置換は、該ウイルスを有効に欠損させるため、それは、該 修飾レトロウイルスに該欠損ウイルスタンパク質を付与する該系の第２成分によ りレスキューされる必要がある。 第２成分は、 ２）大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製可能なウイルスを産生する 能力を欠く細胞系である。この細胞系は、パッケージング細胞系として公知であ り、該修飾レトロウイルスベクターのパッケージングを可能にする遺伝子（gag 、polおよびenvポリペプチドをコードする遺伝子）を保持する１以上のプラスミ ドでトランスフェクションされた細胞系よりなる。 このパッケージングされたレトロウイルスベクターを得るために、該ベクター プラスミドをパッケージング細胞系にトランスフェクションする。これらの条件 下で、挿入された治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を含む修飾されたレトロウ イルスゲノムが該ベクタープラスミドから転写され、該修飾レトロウイルス粒子 （組換えウイルス粒子）中にパッケージングされる。ついで、この組換えウイル スを使用して標的細胞に感染させると、ベクターゲノムおよび保持されている任 意のマーカーまたは治療用遺伝子が標的細胞のＤＮＡ中に組込まれるようになる 。そのようなウイルス粒子が感染した細胞中にはウイルスタンパク質が存在しな いため、該細胞は新たなベクターウイルス粒子を産生できない。しかしながら、 該治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を保持するベクターのＤＮＡは、該細胞の ＤＮＡ中に組込まれ、該感染細胞中で発現されうる。 Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する本発明の組換えＭＶＡウイルスを使用して 、レトロウイルスベクターのパッケージングに必要なタンパク質を製造すること ができる。これを行なうためには、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイ ルス(ＭＬＶ)）のgag、polおよびenv遺伝子を、１以上の発現ベクター（例えば 、プラスミド）においてＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御下に置 く。ついで、この発現ベクターを、おそらくＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモータ ーの転写制御下でレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクタ ーと共に、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えＭＶＡウイルスが感染した 細胞中に導入する。 ＷＯ94/29437、ＷＯ89/11539およびＷＯ96/07748は、前記のパッケージング系 を用いてパッケージングされうる種々の型のレトロウイルスベクターコンストラ クトを記載している。 Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えＭＶＡウイルスのさらなる使用は、 ワクチンまたは治療剤の製造のための組換えタンパク質、非感染性ウイルス粒子 または感染性突然変異ウイルス粒子の製造である（Ｂuchholzら，Ｖirology，20 4，770-776(1994)およびＥＰ-Ｂl-356695)。これを行なうためには、ウイルス遺 伝子（例えば、ＨＩＶ-1のgag-polおよびenv遺伝子）を、発現ベクター（例えば 、プラスミドまたは別の組換えＭＶＡウイルス）中のＴ7プロモーターの転写制 御下に置く。ついでこのコンストラクトを、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する 組換えＭＶＡウイルスに感染した細胞中に導入する。この組換えウイルス遺伝子 は、高い効率で転写され、大量の組換えタンパク質が得られ、それを精製するこ とができ る。さらに、発現された組換えウイルスタンパク質(例えば、ＨＩＶ-1 env，gag )が集合して、該細胞から出芽するウイルス偽粒子になることがあり、組織培養 液からそれを単離することができる。もう１つの実施態様では、ＭＶＡ-Ｔ7pol 系により発現されるウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、麻疹ウイル スからのもの）が、付着および感染、アンコーティング、核酸の複製、ウイルス 遺伝子発現、集合、出芽またはウイルス増殖の他の過程の欠損を克服することに より、追加的に導入された突然変異ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、麻疹ウ イルスからのもの）をレスキューして、前記突然変異ウイルスの産生および精製 を可能とするかもしれない。 ＭＶＡ-Ｔ7polは、免疫化のため関心のある抗原（例えば、ＨＩＶの遺伝子、n ef、tat、gag、polまたはenvまたはその他）の遺伝子を保持するＤＮＡ配列と共 に使用することができる。まず第１に、標準的な実験プロトコールを用いて、与 えられた抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、麻疹ウイルス、イン フルエンザウイルスまたはその他）のコード配列を、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターの制御下、好ましくはプラスミドベクター中にクローニングし、得ら れたＤＮＡコンストラクトを増幅し精製する。第２に、ベクターＤＮＡを、ＭＶ Ａ-Ｔ7polと共に、同時にあるいは適当な時間間隔をあけて接種する。関心のあ る組換え遺伝子を、接種部位で、ベクターＤＮＡおよびＭＶＡ-Ｔ7polを共に含 有する細胞中で一過性発現させ、対応する抗原を宿主免疫系に提示させ、抗原特 異的免疫応答を刺激する。非複製性ワクシニアウイルスＭＶＡ-Ｔ7polを使用す るこのプロトコールは、与えられた抗原を一過性発現させるが構造的遺伝子発現 の潜在的危険性を回避する核酸予防接種の有望な新規アプローチを代表するもの である。 組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、以下のとおり製造することができる。 ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失（例えば、欠失II）の隣のＭＶＡ ＤＮ Ａ配列に隣接した外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコ ンストラクトを、ＭＶＡに感染した細胞中に導入して、相同的組換えさせる。 該ＤＮＡコンストラクトを真核細胞中に導入し、外来ＤＮＡをウイルスＤＮＡ と再結合させたら、自体公知の方法で、好ましくはマーカーの助けにより、所望 の組換えワクシニアウイルスを単離することが可能である(Ｎakanoら，Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 79，1593-1596[1982]，Ｆrankeら，Ｍol.Ｃell.Ｂiol .1918-1924[1985]，Ｃhakrabartiら，Ｍol.Ｃell.Ｂiol.3403-3409[1985]，Ｆat hiら，Ｖirology 97-105[1986]と比較されたし)。 挿入すべきＤＮＡコンストラクトは、線状であっても環状であってもよい。環 状ＤＮＡ、特にプラスミドが好ましい。該ＤＮＡコンストラクトは、ＭＶＡゲノ ム内の天然に存在する欠失（欠失II）の左右に隣接した配列(フランク)を含有す る(Ａltenburger，Ｗ.，Ｓuter，Ｃ.Ｐ.およびＡltenburger，Ｊ.(1989)Ａrch. Ｖirol.105，15-27)。その天然に存在する欠失に隣接した配列の間に、外来ＤＮ Ａ配列を挿入する。外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチド（例えば、t-ＰＡま たはインターフェロン）または病原体からの抗原決定基をコードする遺伝子であ ってもよい。病原体は、疾患を引き起こしうるウイルス、細菌、寄生生物、およ び器官中で無制限に増殖し病理的増殖につながりうる腫瘍細胞であってもよい。 そのような病原体の具体例は、Ｄavis，Ｂ.Ｄ.ら(Ｍicrobiology，第３版，Ｈar per Ｉnternational Ｅdition)に記載されている。病原体の好ましい抗原は、ヒ ト免疫不全ウイルス(例えば、ＨＩＶ-1およびＨＩＶ-2)、結核を引き起こすマイ コバクテリア、寄生生物である熱帯熱マラリア原虫(Ｐlasmodium falciparum)、 および黒色腫のものである。 ＤＮＡ配列または遺伝子の発現のためには、該遺伝子の転写に必要な調節配列 が該ＤＮＡ上に存在することが必要である。そのような調節配列（プロモーター と称される）は当業者に公知であり、それには、例えば、ＥＰ-Ａ-198,328に記 載されているワクシニア１１kＤa遺伝子、7.5kＤa遺伝子（ＥＰ-Ａ-110,385）の ものが含まれる。 該ＤＮＡコンストラクトは、例えば、リン酸カルシウム沈殿法（Ｇrahamら， Ｖirol.52，456-467[1973];Ｗiglerら，Ｃell 777-785[1979])、エレクトロポレ ーション（Ｎeumannら，ＥＭＢＯ Ｊ.1，841-845[1982])、マイクロインジェク ション(Ｇraessmannら，Ｍeth.Ｅnzymology 101，482-492(1983))、リポソーム( Ｓtraubingerら，Ｍethods in Ｅnzymology 101，512-527(1983))、スフェロプ ラスト（Ｓchaffner，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 77，2163-2167(1980)） または当業者に公知の他の方法によりトランスフェクションすることにより、Ｍ ＶＡ感染細胞中に導入することができる。リン酸カルシウム沈殿法によるトラン スフェクショ ンが好ましい。 以下の詳細な実施例は、本発明のよりよい理解に寄与するものであるが、本発 明が実施例の内容に限定されるとの印象を与えるものではない。 図面 図１：ＭＶＡのゲノム、および相同的組換えによる外来ＤＮＡの挿入のための プラスミドの地図を示す。ＭＶＡのゲノム内のＨindIII制限部位を上部に示す。 ＭＶＡゲノム内の欠失IIの結合と重複する900bpのＨindIII-ＨindIIIのＮ末端を 示す。欠失IIに隣接するＭＶＡ ＤＮＡ配列（フランク１およびフランク２）を 、ＰＣＲにより増幅し、挿入プラスミドpＵＣIIＬＺの構築に使用した。 図２：pＵＣIIＬＺ Ｐ7.5：欠失II中へ挿入するためＭＶＡベクタープラスミ ドであり、これは、Ｐ11-ＬacＺ発現カセットと、該プラスミドのＳmaＩ部位中 へクローニングすることができる関心のある遺伝子を発現させるためのワクシニ アウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5とを含有する。 図３：pＵＣII ＬＺdel Ｐ.7.5：ＭＶＡゲノム内の欠失II部位に外来遺伝子を 挿入するためのＭＶＡベクタープラスミドであり、これは、自己欠失性Ｐ11-Ｌa cＺ発現カセットと、該プラスミドのＳma1/Ｎot1クローニング部位中にクローニ ングすることができる関心のある遺伝子を発現させるためのワクシニアウイルス 初期／後期プロモーターＰ7.5とを含有する。 図４：組換えウイルスＭＶＡ-Ｔ7polの構造：ＭＶＡゲノム(ＨindIII制限エン ドヌクレアーゼ部位)、およびＭＶＡゲノムのＨindIII Ｎ断片内の欠失II部位へ のＴ7 ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpＵＣ II ＬＺＴ7polの地図を示す。 図５：ＭＶＡ-Ｔ7polウイルスＤＮＡのサザンブロット分析。 図６：［35Ｓ］メチオニンを用いるタンパク質の代謝標識。ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析。レーン１：ＭＶＡ-Ｔ7pol、レーン２：ＭＶＡ、レーン３：ＣＶ-1細胞。 図７：ＣＡＴアッセイ：Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でＣＡ Ｔ遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクションされ、ＭＶＡ-Ｔ/polま たはＷＲ-Ｔ7polに感染したＣＶ-1細胞。ライゼートをＣＡＴ活性に関して試験 した。Ｃはクロラムフェニコールを意味し、1-ＡcＣおよび3-ＡcＣはクロラムフ ェニコール のモノおよびトリアセチル化体を意味する。Ｃat活性は、60分で生じたアセチル 化産物の割合（％）として表されている。 図８：ＭＶＡ-ＬＡＩnefの構造：ＭＶＡゲノム(ＨindIII制限エンドヌクレア ーゼ部位)、およびＭＶＡゲノムのＨindIII Ｎ断片内の欠失II部位でのＨＩＶ-1 ＬＡＩのnef遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpＵＣ II ＬＺdel Ｐ7.5-ＬＡＩnefの地図を示す。 図９：ＭＶＡ-hＴＹＲの構造：ＭＶＡゲノム(ＨindIII制限エンドヌクレアー ゼ部位)、およびＭＶＡゲノムのＨindIII Ｎ断片内の欠失II部位でのヒトチロシ ナーゼ遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpＵＣ II ＬＺdel Ｐ7.5- ＴＹＲの地図を示す。 実施例 １．ウイルスの増殖および精製 1.1 ＭＶＡウイルスの増殖 ＭＶＡウイルスは、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）培養上で長期にわた り連続継代することにより高度に弱毒化された、ワクシニアウイルス株アンカラ （ＣＶＡ）由来のワクシニウイルスである。ＭＶＡ株の産生の歴史、特性および 使用の一般的な概説は、ＭayrらによりＩnfection 3，6-14[1975]において公開 されている抄録を参照することができる。ＣＥＦ中での弱毒化により、ＭＶＡウ イルスは、このニワトリ宿主細胞中では高力価になるまで増殖する。しかしなが ら、哺乳動物細胞では、ＭＶＡは厳しく増殖が制限され、該ウイルスによる典型 的なプラーク形成は検出不可能である。したがって、ＣＥＦ細胞上でＭＶＡウイ ルスを増殖させた。ＣＥＦ細胞を調製するために、インキュベートされた鶏卵か ら11日齢の胚を単離し、肢を取り、胚を細かく刻み、0.25％トリプシンよりなる 溶液中に37℃で20分間解離させた。得られた細胞懸濁液を濾過し、Ｓorvall Ｒ Ｃ-3Ｂ遠心機中2000rpm、室温で５分間遠心することにより細胞を沈降させ、10 容量の培地Ａ（ＭＥＭ Ｅagle、例えば、Ｌife Ｔechnologies ＧmbＨ，Ｅggens tein，Ｇermanyから入手可能なもの）に再懸濁し、Ｓorvall ＲＣ-3Ｂ遠心機中2 000rpm、室温で５分間遠心することにより再沈降させた。10％ウシ胎児血清(Ｆ ＣＳ)、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)および２mＭグ ルタミンを含有す る培地Ａ中で該細胞ペレットを再構成して、500000細胞/mlを含有する細胞懸濁 液を得た。このようにして得たＣＥＦ細胞を細胞培養皿上に広げた。それを、37 ℃のＣＯ2インキュベーター中の培地Ａ中で、所望の細胞密度に応じて１〜２日 間成長させ、それを直接またはさらに１細胞継代した後、感染に使用した。初代 培養の調製の詳細な説明は、Ｒ.Ｉ.Ｆreshneyの著書（"Ｃulture of animal cel l"，Ａlan Ｒ.Ｌiss Ｖerlag，Ｎew Ｙork［1983］第11章，99頁以下参照）に記 載されている。 以下のとおり、ＭＶＡウイルスを感染に使用した。ＣＥＦ細胞を175cm2細胞培 養ボトル中で培養した。密集度90〜100％で、該培地を除去し、培地Ａ中、ＭＶ Ａウイルス懸濁液（0.01感染単位(ＩＵ)/細胞、0.02ml/cm2）と共に該細胞を１ 時間インキュベートした。ついで、さらに培地Ａを加え(0.2ml/cm2)、該ボトル を37℃で２〜３日間インキュベートした(約90％の細胞が細胞変性効果を示すま で)。細胞単層を該培地中にかき取り、Ｓorvall ＲＣ-3Ｂ遠心機中3000rpm、４ ℃で５分間遠心して該細胞物質をペレット化することにより、粗製ウイルススト ックを調製した。該粗製ウイルス調製物を、さらに加工（例えば、ウイルスの精 製）するまで−20℃で保存した。 1.2 ウイルスの精製 宿主細胞特異的成分を含まない可能な限り純粋なウイルス調製物を得るために 行なった精製工程は、Ｊoklik(Ｖirology 18，9.18[1962])により記載されてい るものと同様であった。−20℃で保存されている粗製ウイルスストックを融解し 、ＰＢＳ（該沈降物の容量の10〜20倍）に１回懸濁し、該懸濁液を前記のとおり 遠心した。新たな沈降物を10倍容量のトリス緩衝液１(10mＭトリス−ＨＣl、pＨ 9.0)に懸濁し、該懸濁液を超音波（Ｌabsonic Ｌ，Ｂ.Ｂraun Ｂiotech Ｉntern ational，Ｍelsungen Ｇermany；60ワットおよび室温で2×10秒）で短時間処理 して、さらに細胞デブリスを分解し、該細胞物質からウイルス粒子を放出させた 。該細胞核およびより大きな細胞デブリスを、後続の該懸濁液の短時間遠心分離 （ＤuＰont Ｃo.から入手可能なＳorvall ＧＳＡローターＤ-6353 Ｂad Ｎauhei m，ＦＲＧ;3000rpmおよび10℃で３分）で除去した。前記のとおり、該沈降物を トリス緩衝液１に再懸濁し、超音波処理し、遠心した。遊離ウイルス粒子を含有 する集めた上清を合わせ、10mＭトリス−ＨＣl（pＨ9.0）中の36％ショ糖10mlの クッション上に重 層し、Ｂeckman ＳＷ27/ＳＷ28ローター中、13,500rpm、４℃で80分間遠心した 。該上清を捨て、ウイルス粒子を含有する沈降物を１mＭ トリス−ＨＣl(pＨ9.0 )10ml中に取り、短時間の超音波処理（室温で２×10秒、装置は前記のとおり） によりホモジナイズし、さらに精製するために20〜40％ショ糖勾配（１mＭトリ ス−ＨＣl(pＨ9.0)中のショ糖）に適用した。該勾配をＢeckman ＳＷ41 ロータ ー中、13,000rpm、４℃で50分間遠心した。遠心後、ウイルス粒子を含有する分 離したバンドの収穫を、バンドを超える容量を吸引した後にピペッティングする ことにより行なった。得られたショ糖溶液を３容量のＰＢＳで希釈し、遠心（Ｂ eckman ＳＷ27/28、13,500rpm、４℃で60分）により該ウイルス粒子を再沈降さ せた。該ペレットは、この段階で大部分が純粋なウイルス粒子からなり、それを ＰＢＳに再懸濁し、平均１〜５×109ＩＵ/mlに対応するウイルス濃度にまで平衡 化させた。精製されたウイルスストック溶液を−80℃で保存し、直接使用するか 、あるいは後続の実験のためにＰＢＳで希釈した。 1.3 ＭＶＡウイルスのクローニング 均一なストックウイルス調製物を得るために、Ａnton Ｍayr博士から得たＭＶ Ａウイルスを、96ウェル組織培養プレート上で培養されたＣＥＦ中で３連続継代 する間に限界希釈によりクローニングした。ＭＶＡクローンＦ6を選択し、ＣＥ Ｆ中で増幅して、本特許出願に記載されている組換えＭＶＡウイルスを得るため 、および既に記載されている（Ｓutter，Ｇ.およびＭoss，Ｂ.[1992]Ｐroc.Ｎat l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 89，10847-10851;Ｓutter，Ｇ.，Ｗyatt，Ｌ，.Ｆoley， Ｐ.，Ｂennink，Ｊ.およびＭoss，Ｂ.[1994]Ｖaccine 12，1032-1040;Ｈirsch， Ｖ.，Ｆuerst，Ｔ.，Ｓutter，Ｇ.，Ｃarroll，Ｍ.，Ｙang，Ｌ.，Ｇoldstein， Ｓ.，Ｐiatak，Ｍ.，Ｅlkins，Ｗ.，Ａlvord，Ｇ.，Ｍontefiori，Ｄ.，Ｍoss， Ｂ.およびＬifson，Ｊ.[1996]Ｊ.Ｖirol.70，3741.3752）組換えＭＶＡウイルス を得るための出発物質として使用するウイルスの実施ストックを得た。 ２．組換えＭＶＡウイルスの構築および特徴づけ 2.1 ベクタープラスミドの構築 組換えＭＶＡウイルスを産生させるために、新規ベクタープラスミドを構築し た。ＭＶＡゲノム中への外来遺伝子の挿入は、ＭＶＡゲノム内の天然に存在する 欠失II部位へ正確に標的化した。ＭＶＡゲノムのＨindIII Ｎ断片中の2500bpの 欠 失部位に隣接するＭＶＡ ＤＮＡの配列（Ａltenbuger，Ｗ.，Ｓuter，Ｃ.Ｐ.お よびＡltenburger，Ｊ.[1989]，Ｊ.Ａrch.Ｖirol.105，15-27）をＰＣＲにより 増幅し、プラスミドpＵＣ18のマルチプルクローニング部位中にクローニングし た。左側の600bpのＤＮＡフランクのプライマーは、5'-CAG CAG GGT ACC CTC AT C GTA CAG GAC GTT CTC-3'および5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3'（制限酵素ＫpnＩおよびＳmaＩの部位に下線を付している ）であった。右側の550bpのＤＮＡフランクのプライマーは、5'-CAG CAG CTG CA G GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3'および5'-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3'（制限酵素ＰstＩおよびＳphＩの部位に下線を付して いる）であった。pＵＣ18中に挿入されたＭＶＡ ＤＮＡのこれらのフランクの間 に、ワクシニアウイルス後期プロモーターＰ11の制御下の大腸菌(Ｅcherichia c oli)lacＺ遺伝子(pIII ＬＺから制限消化により調製された(Ｓutter，Ｇ.および Ｍoss，Ｂ.[1992]ＰＮＡＳ ＵＳＡ 89，10847-10851))を、ＢamＨＩ部位を使用 することにより挿入して、ＭＶＡ挿入ベクターpＵＣII ＬＺ（図１）を得た。つ いで、クローニング用のＳmaＩ部位と共にワクシニアウイルス初期−後期プロモ ーターＰ7.5を含有する289bp断片（プラスミドベクターpＳＣ11[Ｃhakrabartiら ，1985，Ｍolecular and Ｃellular Biology 5，3403-3409]からＥcoＲＩおよび ＸbaＩで制限消化することにより調製した）を、pＵＣII ＬＺのＳmaＩ部位中に 挿入して、ＭＶＡベクターpＵＣII LZ Ｐ7.5を得た（図２）。レポーター酵素β −ガラクトシダーゼの一過性合成を介して組換えＭＶＡウイルスの単離を可能と するベクタープラスミドを構築するために、大腸菌（Ｅ.coli）ＬacＺオープン リーディングフレームの3'末端からの330bpのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ（プライマ ーは5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3'および5'-GGG GGG CT G CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3'であった）により増幅し、pＵＣII ＬＺ Ｐ7.5のＳalＩおよびＰstＩ部位中にクローニングして、ＭＶＡベクターpＵＣI I ＬＺdelＰ7.5を得た(図３)。ＳmaＩ部位を用いて、このベクタープラスミドを 使用して、ワクシニアウイルスプロモーターＰ7.5の転写制御下で外来遺伝子を コードするＤＮＡ配列をＭＶＡゲノム中に挿入することができる。β−ガラクト シダーゼ活性の発現に関してスクリーニングすることにより所望の組換えウイル スを単離し た後、該組換えウイルスをさらに増殖させて、相同的組換えにより、再操作され たＰ11-ＬacＺ発現カセットの自己欠失が得られる。 2.2 組換えウイルスＭＶＡ Ｔ7polの構築および特徴づけ ワクシニアウイルス前期／後期プロモーターＰ7.5の制御下でバクテリオファ ージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼの完全な遺伝子を含有する3.1kbpのＤＮＡ断片を、 プラスミドpＴＦ7-3（Fuerst，Ｔ.Ｒ.，Ｎiles，Ｅ.Ｇ.，Ｓtudier，Ｆ.Ｗ.およ びＭoss，Ｂ.，1986，Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ ＵＳＡ83，8122-8126）からＥcoＲＩで切り 出し、クレノウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修飾し て平滑末端を作り、pＵＣII ＬＺの唯一のＳmaＩ制限部位中にクローニングして 、プラスミド導入ベクターpＵＣII ＬＺ Ｔ7polを作製した(図４)。Ｔ7 ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子の発現用の転写調節体として、ワクシニアウイルス初期／後 期プロモーターＰ7.5を選択した。より強力なワクシニアウイルス後期プロモー ター（例えば、Ｐ11）と異なり、このプロモーター系は、標的細胞に感染した直 後に組換え遺伝子を発現させる。ＭＶＡゲノムの欠失II部位中への外来遺伝子の 挿入を指令するプラスミドpＵＣII ＬＺ Ｔ7polを使用して、組換えウイルスＭ ＶＡＴ7polを得た。 0.05ＴＣＩＤ50/細胞の多重度でＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞を、既に記載さ れているとおりに(Ｓutter，Ｇ.，Ｗyatt，Ｌ.，Ｆoley，Ｐ.，Ｂennink，Ｊ.お よびＭoss，Ｂ.(1994)Ｖaccine 12，1032-1040)、プラスミドpＵＣII ＬＺ Ｔ7p olのＤＮＡでトランスフェクションした。Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを発現し、β −Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＭＶＡ Ｐ7.5.Ｔ7pol）と共に共発現する組換えＭＶ Ａウイルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド（3 00μg/ml）で染色されたＣＥＦ細胞における５回の連続したプラーク精製により 選択した。ついで、組換えウイルスをＣＥＦ単層への感染により増幅し、該ＤＮ ＡをＰＣＲにより分析して、該ウイルスストックの遺伝的等質性を確認した。Ｍ ＶＡ-Ｔ7polウイルスＤＮＡのサザンブロット分折は、ＭＶＡゲノム内の欠失II 部位での該組換え遺伝子の安定な組込みを示した(図５)。 組換えＭＶＡ Ｔ7polによるＴ7 ＲＮＡポリメラーゼの発現をモニターするた めに、ウイルスに感染した組織培養からの[35Ｓ]メチオニン標識ポリペプチドを 分析した。12ウェルプレート中で成長させたサル腎細胞系ＣＶ-1の単層に、20Ｔ ＣＩＤ50/細胞 の多重度でウイルスを感染させた。感染の３〜５時間後、該培地を除去し、メチ オニンを含まない培地（無メチオニン培地）１mlで培養液を１回洗浄した。各ウ ェルへ、[35Ｓ]メチオニンの50μＣiで補足された無メチオニン培地0.2mlを加え 、37℃で30分間インキュベートした。各ウェルを0.5％Ｎonidet Ｐ-40溶解緩衝 液0.2ml中37℃で10分間インキュベートすることにより、感染細胞の細胞質抽出 物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりサンプルを分析した。ＭＶＡ Ｔ7polによる ＣＶ-1細胞の代謝標識から、以下の２つの追加的ポリペプチドの合成が示された ：（i）組換えウイルスのスクリーニングを可能とする共発現された大腸菌（Ｅ. coli）β−ガラクトシダーゼを表す約116,000Ｄaの一部、および（ii）バクテリ オファージＴ7 ＲＮＡポリメラーゼの予想サイズを有する98,000Ｄaのタンパク 質(図６)。ＭＶＡ Ｔ7polにより産生された大量のβ−ガラクトシダーゼは、注 目に値する。インビボ標識実験の結果、ＭＶＡゲノム中の欠失II部位に挿入され た場合に、Ｐ11-ＬacＺ遺伝子コンストラクトの非常に強力な発現が示されたが 、このことは、ＭＶＡベクターウイルス中の組換え遺伝子が、ＭＶＡゲノムのこ の遺伝子座内に挿入された場合に、より効率的に発現されうることを示すもので ある。 ＷＲ-Ｔ7pol組換えウイルスvＴＦ7-3（Ｆuerstら，1986）と比べたＭＶＡ-Ｔ7 pol組換えウイルスの発現系としての有用性は、pＴＭ1（Ｍoss，Ｂ.，Ｅlroy-Ｓ tein，Ｏ.，Ｍizumami，Ｔ.，Ａlexander，Ｗ.Ａ.およびＦuerst Ｔ.Ｒ.(1990) Ｎature 348，91-92）に由来しＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＰＴ7） の制御下で大腸菌(Ｅ.coli)クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ （ＣＡＴ）遺伝子を含有する（pＴＭ1マルチプルクローニング部位のＮcoＩおよ びＢamＨＩ部位中にクローニングされた）プラスミドベクターのＤＮＡのコトラ ンスフェクションにより試験した。トランスフェクションされ感染したＣＶ-1細 胞を、0.25mlの0.25Ｍトリス−ＨＣl（pＨ7.5）に懸濁した。３サイクルの凍結 −融解の後、該ライゼートを遠心分離により清澄化し、該上清のタンパク質含量 を測定し、0.5、0.25、0.1μｇの合計タンパク質を含有するサンプルを、Ｍacke tt，Ｍ.，Ｓmith，Ｇ.Ｌ.およびＭoss，Ｂ.(1984)Ｊ.Ｖirol.49，857-864に記載 されているとおりに、酵素活性に関してアッセイした。オートラジオグラフィー の後、標識されたスポットをフジイメージング分析系を用いて定量した。 その結果から、高度に弱毒化されたワクシニアベクターＭＶＡを使用すること により、完全に複製可能なワクシニアウイルス組換え体を使用した場合と同程度 に効率的なワクシニアウイルス−Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼ系の開発が可能である ことが示される(図７)。 2.3 組換えウイルスＭＶＡ-ＬＡＩnefの構築および特徴づけ ＨＩＶ-1 ＬＡＩの完全なnef遺伝子を含有する648bpのＤＮＡ断片を、プラス ミド プライマーは、5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' および5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'であった ）からＰＣＲにより調製し、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩで消化し、クレノ ウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修飾して平滑末端を 作り、pＵＣII ＬＺdel Ｐ7.5のＳmaＩ部位中にクローニングして、ベクターpＵ ＣII ＬＺdel Ｐ7.5-ＬＡＩnefを作製した(図８)。このプラスミドを使用して、 ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の制御下でＨＩＶ-1 ＬＡＩの nef遺伝子を発現するＭＶＡ組換えウイルスを操作することができた。 0.05ＴＣＩＤ50/細胞の多重度でＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞を、既に記載さ れているとおりに(Ｓutter，Ｇ.，Ｗyatt，Ｌ.，Ｆoley，Ｐ.，Ｂennink，Ｊ.お よびＭoss，Ｂ.[1994]Ｖaccine 12，1032-1040)、プラスミドpＵＣII ＬＺdel Ｐ7.5-ＬＡＩnefのＤＮＡでトランスフェクションした。nef遺伝子を含有し、大 腸菌（Ｅ.coli）ＬacＺマーカー遺伝子を一過性に共発現する組換えＭＶＡウイ ルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド（300μg/ ml）で染色されたＣＥＦ細胞における連続したプラーク精製により選択した。つ いで、nef遺伝子を含有しＬacＺマーカー遺伝子が欠失している組換えＭＶＡウ イルスを、ＣＥＦ細胞において5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Ｄ− ガラクトシド（300μg/ml）の存在下で未染色なウイルスフォーカスに関してさ らに３回の連続したプラーク精製スクリーニングを行なうことにより単離した。 ついで、組換えウイルスをＣＥＦ単層への感染により増幅し、該ＭＶＡ-ＬＡＩn efウイルスＤＮＡをＰＣＲにより分析しで、該ウイルスストックの遺伝的等質性 を確認した。ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析から、ＭＶＡ-ＬＡＩnefの遺 伝的安定性が確認され、該ウイルスゲノム内 の欠失II部泣でのnef遺伝子の組込みおよび大腸菌（Ｅ.coli）ＬacＺマーカー遺 伝子の欠失が明確に示された。 組換えＮefタンパク質の効率的発現が、ＨＩＶ-1 Ｎefに対するマウスモノク ローナル抗体(Ｋ.Ｋrohnから贈呈され、Ｏvod，Ｖ.，Ｌagerstedt，Ａ.，Ｒanki ，Ａ.，Ｇombert， 記載されているとおりに使用された）を用いて、ＭＶＡ-ＬＡＩnefに感染したＣ ＥＦ細胞からのタンパク質ライゼートのウエスタンプロット分析により確認され た。 2.4 組換えウイルスＭＶＡ-hＴＹＲの構築および特徴づけ ヒトチロシナーゼをコードする完全な遺伝子を含有する1.9kbのＤＮＡ断片［ 患者ＳＫ29(ＡＶ)の黒色腫細胞系ＳＫ29-ＭＥＬから単離されたチロシナーゼc- ＤＮＡクローン123.Ｂ2，ＧenＢank Ａcc.no.ＵＯ1873; Brichard，Ｖ.，Ｖan Ｐel，Ａ.， よびＢoon，Ｔ.(1994)Ｅur.，Ｊ.Ｉmmunol 24，759-764］からＥcoＲＩ消化によ り調製し、クレノウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修 飾して平滑末端を作り、pＵＣII ＬＺdel Ｐ7.5のＳmaＩ部位中にクローニング して、ベクターpＵＣII ＬＺdel Ｐ7.5-ＴＹＲを作製した(図９)。このプラスミ ドを使用して、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の制御下でヒ トチロシナーゼ遺伝子を発現するＭＶＡ組換えウイルスを操作することができた 。 0.05 ＴＣＩＤ50/細胞の多重度でＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞を、既に記載さ れているとおりに(Ｓutter，Ｇ.，Ｗyatt，Ｌ.，Ｆoley，Ｐ.，Ｂennink，Ｊ.お よびＭoss，Ｂ.(1994)Ｖaccine 12，1032-1040)、プラスミドpＵＣII ＬＺdel Ｐ7.5-ＴＹＲのＤＮＡでトランスフェクションした。ヒトチロシナーゼの遺伝子 を安定に発現し大腸菌(Ｅ.coli)ＬacＺマーカー遺伝子を一過性に共発現する組 換えＭＶＡウイルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Ｄ−ガラク トシド（300μg/ml）で染色されたＣＥＦ細胞における連続したプラーク精製に より選択した。ついで、ヒトチロシナーゼをコードする遺伝子を発現しＬacＺマ ーカー遺伝子が欠失している組換えＭＶＡウイルスを、ＣＥＦ細胞において5− ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−Ｄ−ガラクトシド（300μg/ml）の存在下で未染色なウイルスフォーカスに 関してさらに３回の連続したプラーク精製スクリーニングを行なうことにより単 離した、ついで、組換えウイルスをＣＥＦ単層への感染により増幅し、該ＭＶＡ -hＴＹＲウイルスＤＮＡをＰＣＲにより分析して、該ウイルスストックの遺伝的 等質性を確認した。ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析から、ＭＶＡ-hＴＹＲ の遺伝的安定性が確認され、該ウイルスゲノム内の欠失II部位での組換えチロシ ナーゼ遺伝子の組込みおよび大腸菌（Ｅ.coli）ＬacＺマーカー遺伝子の欠失が 明確に示された。 組換えヒトチロシナーゼの効率的な発現が、チロシナーゼに対するウサギポリ クローナル抗体（Ｖ.Ｈearingにより贈呈され、Ｊimenez，Ｍ.，Ｋameyama，Ｋ. ，Ｍaloy，Ｌ.，Ｔomita，Ｙ.およびＨearing，Ｖ.[1988]Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ.ＵＳＡ85 ，3830-3834に記載のとおりに使用された）またはマウスモノクローナル抗体（ Ｌ.Ｏldにより贈呈され、Ｃhen，Ｙ.，Ｓtockert，Ｅ.，Ｔsang，Ｓ.，Ｃoplan ，Ｋ.およびＯld，Ｌ.[1995]Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ.ＵＳＡ92，8125-8129に記載されてい るとおりに使用された）を用いて、ＭＶＡ-hＴＹＲに感染したＣＥＦ細胞からの タンパク質ライゼートのウエスタンブロット分析により確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 39/00 39/00 Ｈ 39/015 39/015 39/04 39/04 39/145 39/145 39/21 39/21 39/245 39/245 39/29 39/29 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 7/00 7/00 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オールマン、マリオン ドイツ連邦共和国、デー−81927 ミュン ヘン、コズィマシュトラーセ 220 (72)発明者 エルフレ、フォルカー ドイツ連邦共和国、デー−81679 ミュン ヘン、コルベルガーシュトラーセ ７

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失部位に挿入された少なくとも１つの 外来遺伝子を含有し、その発現能を有する組換えＭＶＡウイルス。 ２．ＭＶＡゲノム内の欠失II部位に挿入された少なくとも１つの外来遺伝子を 含有し、その発現能を有する、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。 ３．該外来遺伝子が、マーカー、治療剤または抗原決定基をコードする、請求 項１または２に記載の組換えＭＶＡウイルス。 ４．該外来遺伝子が、病原性ウイルス、細菌または他の微生物からの、または 寄生生物または腫瘍細胞からの抗原決定基をコードする、請求項３に記載の組換 えＭＶＡウイルス。 ５．該外来遺伝子が、熱帯熱マラリア原虫(Ｐlasmodium Ｆalciparum)、マイ コバクテリア、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎またはヒト免 疫不全ウイルスからの抗原決定基をコードする、請求項４に記載の組換えＭＶＡ ウイルス。 ６．該抗原決定基がＨＩＶ nefまたはヒトチロシナーゼである、請求項４また は５に記載の組換えＭＶＡウイルス。 ７．ＭＶＡ-ＬＡＩnefまたはＭＶＡ-hＴＹＲである、請求項６に記載の組換え ＭＶＡウイルス。 ８．該外来遺伝子がＴ7 ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項１または２ に記載の組換えＭＶＡウイルス。 ９．ＭＶＡ-Ｔ7 polである、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。 10．該外来遺伝子が、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ7.5の転 写制御下にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡウイルス。 11．ヒト細胞中で複製可能なウイルスを実質的に含まない、請求項１〜10のい ずれか１項に記載の組換えＭＶＡウイルス。 12．Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御下でのＤＮＡ配列の転写 のための、請求項８または９に記載の組換えＭＶＡウイルスの使用。 13．請求項１〜11のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡウイルスに感染した真 核細胞。 14．請求項８または９に記載の組換えＭＶＡウイルスに感染した、請求項13に 記載の細胞。 15．Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御下の１以上の外来遺伝子 を保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する、請求項14に記載の細胞。 16．前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドの製造のための、請求項15に 記載の細胞の使用であって、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することを含んでなる 使用。 17．ウイルス遺伝子を保持する発現ベクターおよび／またはＴ7 ＲＮＡポリメ ラーゼプロモーターの転写制御下のウイルスベクターのゲノムをコードするウイ ルスベクターコンストラクトをさらに含有する、請求項14に記載の細胞。 18．ウイルス粒子の製造のための、請求項17に記載の細胞の使用であって、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）該ウイルス粒子を単離することを含んでなる使用。 19．a）標的細胞に感染する能力と、前記レトロウイルスベクターコンストラ クトにより保持される１以上の外来遺伝子の標的細胞における発現を指令する能 力とを有するレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクター、 および b）前記レトロウイルスベクターコンストラクトのゲノムがパッケージングさ れるのに必要なポリペブチドをコードする遺伝子をＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロ モーターの転写制御下で保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する、請求 項14に記載の細胞。 20．レトロウイルス粒子の製造のための、請求項19に記載の細胞の使用であっ て、 a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして b）該レトロウイルス粒子を単離することを含んでなる使用。 21．生理的に許容される担体中に請求項３〜７のいずれか１項に記載の組換え ＭＶＡウイルスを含有するワクチン。 22．ワクチンの製造のための、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組換えＭ ＶＡウイルスの使用。 23．動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための、請求項21に記載のワクチンの 使用であって、前記動物（ヒトを含む）生体に該ワクチンを接種することを含ん でなる使用。 24．ＨＩＶ感染またはエイズの予防または治療のための、ＭＶＡ-ＬＡＩnefを 含有する請求項21に記載のワクチンの使用。 25．黒色腫の予防または治療のための、ＭＶＡ-hＴＹＲを含有する請求項21に 記載のワクチンの使用。 26．請求項８または９に記載の組換えＭＶＡウイルスを生理的に許容される担 体中に第１成分として、そしてＴ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転写制御 下で抗原決定基を保持するＤＮＡ配列を生理的に許容される担体中に第２成分と して含んでなり、それらの２成分が一緒にまたは別々に含有されているワクチン 。 27．動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための請求項26に記載のワクチンの使 用であって、前記動物（ヒトを含む）生体に、該ワクチンの第１成分および第２ 成分を同時にまたは一定の時間間隔で同じ接種部位に接種することを含んでなる 使用。 28．請求項26に記載のワクチンの製造のための、請求項８または９に記載の組 換えＭＶＡウイルスの使用。
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