HU224061B1 - Rekombináns MVA-vírus és alkalmazása - Google Patents
Rekombináns MVA-vírus és alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HU224061B1 HU224061B1 HU9802217A HUP9802217A HU224061B1 HU 224061 B1 HU224061 B1 HU 224061B1 HU 9802217 A HU9802217 A HU 9802217A HU P9802217 A HUP9802217 A HU P9802217A HU 224061 B1 HU224061 B1 HU 224061B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mva
- virus
- recombinant
- gene
- dna
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims abstract description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 37
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 5
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- -1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 2
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 claims description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 2
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 10
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 6
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 claims 6
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 claims 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 claims 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 claims 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims 2
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims 1
- 101100004352 Escherichia coli lacZ gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 claims 1
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 claims 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 claims 1
- 101150043258 gins1 gene Proteins 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 claims 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 claims 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000587120 Vaccinia virus Ankara Species 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000009589 pathological growth Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát olyan rekombináns vaccinia vírusok képezik, melyeka módosított Ankara vaccinia (MVA)-vírusból származnak, az MVA-genomban egy természetes körülmények között előforduló, de a III.deléciós helytől eltérő deléció helyére inszertált idegen génekethordoznak, és azokat expresszálni képesek. A találmány tárgyát képezitovábbá a rekombináns MVA-vírusok alkalmazása polipeptidek – példáulantigének vagy terápiás hatóanyagok – vagy génterápiában alkalmazhatóvíruseredetű vektorok előállítására, valamint az antigéneket kódolórekombináns MVA-vírusok alkalmazása oltóanyagként. A találmányszerinti rekombináns MVA-vírusok hatékony és különlegesen biztonságosexpressziós vektorként alkalmazhatók.
Description
A találmány tárgyát olyan rekombináns vaccinia vírusok képezik, melyek a módosított Ankara vaccinia (MVA)-vírusból származnak, az MVA-genomban egy természetes körülmények között előforduló, de a III. deléciós helytől eltérő deléció helyére inszertált idegen géneket hordoznak, és azokat expresszálni képesek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a rekombináns MVA-vírusok alkalmazása polipeptidek - például antigének vagy terápiás hatóanyagok - vagy génterápiában alkalmazható víruseredetű vektorok előállítására, valamint az antigéneket kódoló rekombináns MVA-vírusok alkalmazása oltóanyagként.
A találmány szerinti rekombináns MVA-vírusok hatékony és különlegesen biztonságos expressziós vektorként alkalmazhatók.
HU 224 061 Β1
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 9 lap ábra)
HU 224 061 Β1
A találmány tárgyát olyan rekombináns vaccinia vírusok képezik, melyek a módosított Ankara vaccinia (MVA)-vírusból származnak, az MVA-genomban egy természetes körülmények között előforduló deléció helyére inszertált idegen géneket hordoznak, és azokat expresszálni képesek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a rekombináns MVA-vírusok alkalmazása polipeptidek - például antigének vagy terápiás hatóanyagok - vagy génterápiában alkalmazható víruseredetű vektorok előállítására, valamint az antigéneket kódoló rekombináns MVA-vírusok alkalmazása oltóanyagként.
A találmány szerinti rekombináns MVA-vírusok hatékony és különlegesen biztonságos expressziós vektorként alkalmazhatók.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy egyszerű, hatékony és biztonságos eljárás polipeptidek, mint például antigének vagy terápiás hatóanyagok, oltóanyagként alkalmazható rekombináns vírusok és génterápiában alkalmazható víruseredetű vektorok előállítására.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy T7 RNSpolimerázt expresszáló rekombináns MVA-víruson alapuló expressziós rendszer is, valamint egy eljárás polipeptidek, például antigének vagy terápiás hatóanyagok előállítására, vagy az ezen az expressziós rendszeren alapuló víruseredetű vektorok előállítása génterápiára vagy oltóanyagként történő alkalmazásra.
Vaccinia vírust, a Poxviridae család Orthopoxvirus nemzetségének egyik tagját, alkalmazták élő oltóanyagként emberi himlő elleni immunizációban. A vaccinia vírussal történő világszerte sikeres immunizálás a variolavírus, a himlő kórokozója kiirtásában tetőzött [The global eradication of smallpox. Final report of the global comission fór the certification of smallpox eradication. History of Public Health, No. 4, Genf: World Health Organization, (1980)]. Az Egészségügyi Világszervezet e kijelentése óta az immunizációt világszerte megszüntették, kivéve a nagy kockázatú himlővírus fertőzésének kitett emberek esetében (mint például laboratóriumi dolgozók).
Újabban vaccinia vírusok is alkalmazásra kerültek rekombináns génexpresszióra szolgáló víruseredetű vektorok kialakításához, és azok potenciális alkalmazására, mint élő rekombináns oltóanyagok [Mackett és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 7415 (1982); Smith és munkatársai: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2 383 (1984)]. Ez együtt jár azzal, hogy idegen antigéneket kódoló DNS-szekvenciákat (géneket) juttatunk be DNS rekombinációs technikák segítségével a vaccinia vírusok genomjába. Abban az esetben, ha a gén olyan helyen integrálódik a víruseredetű DNS-be, amely nem létfontosságú a vírus életciklusához, az újonnan előállított rekombináns vaccinia vírus lehet fertőző, azaz képes idegen sejteket megfertőzni és így az integrált DNS-szekvenciát expresszálni [83,286 és 110,385 számú EP szabadalmi bejelentések]. Az így előállított rekombináns vaccinia vírusok egyrészről alkalmazhatók, mint élő oltóanyagok fertőző betegségek megelőzésére, és másrészről alkalmazhatók heterológ fehérjék előállítására eukarióta sejtekben.
A T7-bakteriofág RNS-polimeráz gént expresszáló rekombináns vaccinia vírus lehetővé tette széles körben alkalmazható expressziós rendszerek létrehozatalát rekombináns fehérjék szintézisére emlőssejtekben [Moss és munkatársai: Natúré 348 91 (1990)]. Minden ilyen eljárásban rekombináns génexpresszió az eukarióta sejtek citoplazmájában történő T7 RNS-polimeráz szintézisére támaszkodik. A legnépszerűbb egy tranziensexpressziós eljárás lett [Fuerst és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 8122 (1986); és a 7.648.971 számú amerikai szabadalmi bejelentés]. Ennek során először a számunkra érdekes idegen gént inszertáljuk egy plazmidba, a T7 RNS-polimeráz promoter szabályozása alatt. A következőkben ezt a plazmidot standard transzfekciós eljárásokat alkalmazva T7 RNS-polimerázt termelő rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtek citoplazmájába juttatjuk be.
Ez a transzfekciós eljárás egyszerű, mert egyetlen új rekombináns vírust sem kell előállítani, és nagyon hatékony, mivel a sejtek több mint nyolcvan százaléka expresszálja a számunkra fontos gént [Elroy-Stein és Moss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 6743 (1990)]. A vaccinia vírus/T7 RNS-polimeráz hibrid rendszer előnyének legvalószínűbb oka más tranziens expressziós rendszerek felett a függetlensége a plazmidok sejtmagba történő transzportjától. Korábbiakban a rendszert nagyon jó eredménnyel alkalmazták analitikai célokra a virológiában és a sejtbiológiában [Buonocore és Rose: Natúré 345 625 (1990); Pattnaik és Wertz: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 881379 (1991); Karschin és munkatársai: FEBS Lett. 278 229 (1991); Ho és munkatársai: FEBS Lett. 307 303 (1992); Buchholz és munkatársai: Virology 204 770 (1994)]. Azonban, a vaccinia virus/T7 RNS-polimeráz hibrid rendszer jövőbeli fontos alkalmazásait, mint például alkalmazását rekombináns gének vagy rekombináns víruseredetű részecskék termelésére emberekben alkalmazható új terápiás és megelőző eljárásokhoz, akadályozhatja a rekombináns vaccinia vektor produktív replikációja.
A vaccinia vírus emberek számára fertőző, és a feketehimlő-kiirtási kampány során alkalmazott oltásokkal kapcsolatban esetenként súlyos szövődményeket figyeltek meg. A szövődmények előfordulásának legjobb összefoglalását adja 12 millió ember a New York City Board of Health vaccinia vírus törzsével történő immunizációjának egyesült államokbeli nemzeti felmérése adja [Lane és munkatársai: New Engl. J. Med. 287 1201 (1969)]. Ennek következtében a vaccinia vírus legfontosabb alkalmazási lehetőségeit vektorként való alkalmazására rekombináns élő oltóanyag kifejlesztésében biztonságát illető aggodalmak és szabályozások befolyásolják. Továbbá a legtöbb irodalomban leírt rekombináns vaccinia vírus a Western Reserve vaccinia vírustörzsön alapul. Másrészről ismert, hogy ennek a törzsnek magas a neurovirulenciája, és ennek következtében csak kismértékben felel meg emberekben és állatokban történő alkalmazásra [Morita és munkatársai: Vaccine 5 65 (1987)].
HU 224 061 Β1
Vektorként történő alkalmazásánál az egészségi kockázatokat csökkenteni lehetne nagymértékben legyengített virulenciájú vaccinia vírustörzs alkalmazásával. Számos ilyen vaccinia vírustörzset kifejezetten a himlővédőoltás során fellépő nem kívánt mellékhatások elkerülésére fejlesztettek ki. így például a módosított Ankara vaccinia vírust (MVA) a vaccinia vírus Ankara törzsének (CVA) csirkeembrió-fibroblaszton történő hosszú távú sorozatos átoltásával állították elő [az összefoglalót lásd: Mayr és munkatársai: Infection 3 6 (1975) és az 568,392 számú svájci szabadalom]. Az MVA-vírus 1987. december 15-én a Budapesti Egyezménynek megfelelően letétbe került az alábbi intézménynél: Institut Pasteur, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) ahol az 1-721 leltári számot kapta. Az MVA-vírusra kiemelkedően jellemző virulenciájának nagymértékű gyengítése, azaz csökkentett virulenciája vagy másképpen fertőzőképessége mellett fönntartott jó immunogenitása. Az MVA-vírust analizáltuk, hogy meghatározzuk a genomjában létrejött változásokat a vad típusú CVA-törzzsel összehasonlítva. A genomi eredetű DNS-ben hat jelentősebb deléciót azonosítottunk, (I., II., III., IV., V. és VI. deléciók), amelyek összesen 31 000 bázispár nagyságot jelentenek [Meyer és munkatársai: J. Gén. Virol. 72 1031 (1991)]. Az ennek eredményeként kapott MVA-vírus gazdasejtjeit tekintve szigorúan madáreredetű sejtekre korlátozódik.
Az MVA-ra továbbá jellemző virulenciájának különlegesen nagy csökkentettsége. Több állatmodellben történő tesztelés során az MVA fertőzésre képtelennek bizonyult, még immunszuppresszált állatokban is. Fontosabb azonban, hogy az MVA-törzs kiváló tulajdonságait széles körű klinikai vizsgálatokban is kimutatták [Mayr és munkatársai: Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167 375 (1987); Stickl és munkatársai: Dtsch. med. Wschr. 99 2386 (1974)]. Az ezen tanulmányok során 120 000 emberben, közöttük még fokozottan veszélyeztetett betegekben is történő vizsgálatokban, egyetlen mellékhatás sem társult az MVA-oltóanyag alkalmazásához.
Megállapították, hogy az MVA replikációja a humán sejtekben a fertőzés során később gátlódik, így megakadályozva a kifejlett fertőző virionok kialakulását. Ennek ellenére, az MVA képes volt víruseredetű és rekombináns géneket magas szinten expresszálni még non-permisszív sejtekben is, és javaslat született az MVA hatékony és különösen biztonságos génexpressziós vektorként való alkalmazására [Sutter és Moss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10847 (1992)]. Újabban az MVA-ra alapozva eredeti vaccinia vektorrendszereket hoztak létre, amelyekben az MVA-genomján belül, vagy a TK-génen belül elhelyezkedő III. deléciós helynél idegen DNS-szekvenciák lettek inszertálva [Sutter és Moss: Dev. Bioi. Stand. Basel, Karger 84 195 (1995) és az 5.185.146 számú US-szabadalomj.
Az MVA alkalmazhatóságának további kihasználására új eljárást kerestek idegen gének DNS-rekombinációval történő bejuttatásának módjára a vaccinia vírus MVA-törzsébe. Mivel nem szándékoztak az MVAvírus genomját megváltoztatni, olyan eljárás alkalmazására volt szükség, amely ezt a feltételt kielégíti. A találmány szerint idegen DNS-szekvenciát rekombináltunk a víruseredetű DNS-be, pontosan az MVA-genomjában egy természetes körülmények között előforduló deléció helyénél.
Tehát a találmány tárgyát képezik többek között, az alábbiak, önmagukban vagy egymással kombinációban:
Rekombináns MVA-vírus, amely legalább egy, az MVA-genomon belül egy természetes körülmények között előforduló deléció helyére inszertált idegen gént tartalmaz és azt expresszálni képes;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amely legalább egy, az MVA-genomon belül a természetes körülmények között előforduló II. deléció helyére inszertált idegen gént tartalmaz és azt expresszálni képes;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az idegen gén egy markért, egy terápiás gént vagy egy antigéndeterminánst kódol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az idegen gén patogén vírusból, baktériumból, vagy más mikroorganizmusból, vagy parazitából, vagy daganatsejtből származó antigéndeterminánst kódol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az idegen gén Plasmodium falciparumból, Mycobacteriumból, Herpes vírusból, influenzavírusból, hepatitisz- vagy humán immundeficienciavírusokból származó antigéndeterminánst kódol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az antigéndetermináns HÍV nef vagy humán tirozináz; a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amely
MVA-LAInef vagy MVA-hTYR;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amely
MVA-T7pol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amelyben az idegen gén a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promoterének transzkripciós szabályozása alatt áll;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírusok, amelyek lényegében nem tartalmaznak humán sejtekben replikálódni képes vírusokat;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus alkalmazása a T7 RNS-polimeráz promoterének transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenciák transzkripciójára;
eukarióta sejt, amely a fentebb felsorolt bármelyik rekombináns MVA-vírussal fertőzött;
sejt, amely a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírussal fertőzött, amelyben az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódol;
sejt, amely a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírussal fertőzött, amelyben az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódol;
és ezenkívül tartalmaz még egy vagy több expressziós vektort, amelyek a T7 RNS-polimeráz promoterének transzkripciós szabályozása alatt álló egy vagy több idegen gént hordoznak;
HU 224 061 Β1 a fentiek szerinti sejtek alkalmazása az idegen gének által kódolt polipeptidek előállítására a következők szerint:
(i) a sejteket megfelelő körülmények között tenyésztjük, és (ii) az idegen gének által kódolt polipeptideket izoláljuk;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírussal fertőzött sejt, amelyben az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódol, ezenkívül tartalmaz még víruseredetű géneket hordozó expressziós vektorokat, és/vagy egy vírusvektor-konstrukciót, amely T7 RNS-polimeráz promoterének transzkripciós szabályozása alatt vírusvektor genomját kódolja;
a fentiek szerinti sejtek alkalmazása víruseredetű részecskék előállítására, a következők szerint:
(i) a sejteket megfelelő körülmények között tenyésztjük, és (ii) a víruseredetű részecskéket izoláljuk;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírussal fertőzött sejt, amelyben az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódol, ezenkívül tartalmaz még:
(a) expressziós vektort, amely retrovírusvektorkonstrukciót hordoz, amely konstrukció képes célsejteket megfertőzni, és képes a retrovírusvektor-konstrukció által hordozott egy vagy több idegen gén expresszióját a célsejtekben irányítani, és (b) egy vagy több expressziós vektort, amely hordozza a retrovírusvektor-konstrukció genom számára szükséges polipeptideket kódoló géneket a T7 RNSpolimeráz promoter transzkripciós szabályozása alatt történő vektorkonstrukció-pakoláshoz;
a fentiek szerinti sejtek alkalmazása retrovírusrészecskék előállítására, a következők szerint:
(i) a sejteket megfelelő körülmények között tenyésztjük, és (ii) a retrovírusrészecskéket izoláljuk; oltóanyag, amely a fentiek szerinti rekombináns
MVA-vírust tartalmazza, amelyben az idegen gén egy fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő antigéndeterminánst kódol;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus alkalmazása, amelyben az idegen gén egy oltóanyag antigéndetermináns-preparátumát kódolja;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása élő állati test immunizálására, beleértve az emberi testet is;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása HlV-fertőzés vagy AIDS megelőzésére vagy kezelésére, amely oltóanyag MVA-LAInef részletet tartalmaz;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása melanómák megelőzésére vagy kezelésére, amely oltóanyag MVA-hTYR részletet tartalmaz;
oltóanyag, amely első komponensként a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírust tartalmaz, amelyben az idegen gén fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő T7 RNS-polimerázt kódol, és második komponensként antigéndeterminánst hordozó DNSszekvenciát tartalmaz, amely fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő DNS-szekvencia a T7 RNS-polimeráz promoter transzkripciós szabályozása alatt áll, és az oltóanyag a két komponenst együtt vagy külön-külön is tartalmazhatja;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása élő állati test, beleértve az emberi test immunizációjára, amely magában foglalja az élő állati test, beleértve az emberi test beoltását az oltóanyag első és második komponensével akár egyidejűleg, akár időben eltolva ugyanazon oltási hely igénybevételével; és a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus alkalmazása találmány szerinti oltóanyagok előállítására.
A „gén” kifejezés alatt bármely olyan DNS-szekvenciát értünk, amely szekvencia fehérjét vagy peptidet kódol.
Az „idegen gén” kifejezés alatt olyan DNS-szekvenciába inszertált gént értünk, amely DNS-szekvenciában a gén természetes körülmények között nem található meg.
Az idegen gén lehet például markergén, terápiás gén, antigéndeterminánst kódoló gén vagy víruseredetű gén. A technika állása szerint az ilyen gének jól ismertek.
A módosított Ankara (MVA) vaccinia virus, amelynek gazdaszervezet-tartománya korlátozott és virulenciája erősen gyengített, nem képes humán és a legtöbb más vizsgált emlőssejtvonalban szaporodni. Azonban mivel a non-permisszív sejtekben a vírusgén-expresszió nincs gátlás alatt, a találmány szerinti rekombináns MVA-vírusok különösen biztonságos és hatékony expressziós vektorként alkalmazhatók.
Antigéndeterminánst kódoló rekombináns MVA-vírusok.
A találmány tárgyát képezik rekombináns MVA vaccinia vírusok, amelyek idegen antigént, előnyösen patogénanyag-eredetű antigént, kódológént tartalmaznak, és a találmány tárgyát képezik ilyen vírust fiziológiailag elfogadható formában tartalmazó oltóanyagok is. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások is ilyen rekombináns MVA vaccinia vírusok, vagy oltóanyagok előállítására, és ezen oltóanyagok alkalmazása a patogén anyagok által okozott fertőzések megelőzésére.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy az MVA-vírusba HÍV nef fehérjét kódoló gént inszertálunk.
Olyan rekombináns MVA-vírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a vaccinia vírus koraí/késői P7.5 promoter szabályozása alatt a HIV-1 nef gén expresszióját. A főemlős-lentivírusok szabályozó Nef fehérjéje a vírusreplikációs ciklus korai szakaszában szintetizálódik, és kimutatták, hogy nélkülözhetetlen a magasabb titerű vírusreplikációhoz és az in vivő betegségindukcióhoz. Ebből arra lehet következtetni, hogy a HÍV Nef feltételezhetően döntő szerepet játszik az AIDS patogenezisében. A molekuláris mechanizmusokat, amelyeken keresztül a HÍV Nef hozzájárul a vírus megnövekedett fertőzőképességéhez és a HÍV patogeneziséhez, célszerű lenne további vizsgálatoknak alávetni. Azonban, a Nef immunogén, és Nef-specifikus antigén alkalmazható oltóanyagként HIV-fertőzés és AIDS ellen.
Ebben az összefüggésben a HÍV nef gént expresszáló rekombináns MVA-vírus alkalmazható embe4
HU 224 061 Β1 rek immunizációjára egyrészről megelőző oltóanyagként emberi HÍV ellen, és másrészről immunterápiára HIV-fertőzött vagy AIDS-es betegek esetében. Továbbá a HÍV nef gént expresszáló rekombináns MVA-vírus alkalmazható rekombináns HÍV Nef fehérje előállítására.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy az MVA-vírusba humán tirozináz fehérjét kódoló idegen gént inszertálunk.
Olyan rekombináns MVA-vírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promoter szabályozása alatt a humán tirozinázgén expresszióját. Újabban a humán tirozinázt melanómaspecifikus tumorantigénként azonosították, amely antigén lehetővé teszi daganatellenes citolitikus T-limfociták termelését [Brichard és munkatársai: J. Exp. Med 178 489 (1993)]. Mivel úgy tűnik, hogy normális sejtekben csak a melanociták expresszálják a tirozinázgént, a tirozináz hasznos célantigén lehet melanómák immunterápiájában. Ennek következtében a rekombináns MVA-vírus, amely expresszálja a humán tirozinázgént, alkalmazható melanómabetegekben olyan immunválaszok kiváltására, amelyek daganatkilökődést hoznak létre, vagy megakadályozzák a metasztázist. Rekombináns MVA-vírusok, amelyek expresszálják a humán tirozinázgént, közvetlenül alkalmazhatók, mint melanómaellenes oltóanyag, vagy a vírus alkalmazható melanómaellenes oltóanyagok előállításában. Egy példa szerint a humán tirozinázgént expresszáló rekombináns MVA-vírus alkalmazható rekombináns tirozináz fehérje előállítására, amely fehérjét antigénként alkalmazhatjuk oltóanyag előállításához. Egy másik példa szerint a humán tirozinázgént expresszáló rekombináns MVA-vírust expressziós vektorként alkalmazva, daganatos betegből származó sejteket in vitro módosíthatjuk úgy, hogy azok expresszálják a tirozinázt, majd ezeket vissza lehet juttatni a betegbe daganatellenes immunreakció kiváltására. A humán tirozinázgént expresszáló rekombináns MVA-vírus alapján előállított oltóanyag alkalmazható parenterálisan vagy lokálisan a daganat helyén a daganatmetasztázis megelőzésére vagy a daganat fenotípusának megváltoztatására, mint például méret, alak, konzisztencia, vaszkularizáció vagy más jellegzetességének megváltoztatására. A humán tirozinázgént expresszáló rekombináns MVA-vírus alapján előállított oltóanyag alkalmazható a daganat műtéti eltávolítását megelőzően, az alatt vagy azt követően.
Oltóanyagok előállításához a találmány szerinti MVA vaccinia vírusokat fiziológiailag elfogadható formába alakítjuk át. Ezt a fekete himlő elleni immunizációra alkalmazott MVA-oltóanyagok előállításában szerzett tapasztalat alapján végezhetjük el [lásd: Stickl és munkatársai: Dtsch. med. Wschr. 99 2386 (1974)]. Általában körülbelül 106-10® rekombináns MVA-részecskét 100 ml foszfátpufferolt fiziológiai sóoldatban (PBS) 2% pepton és 1% humán albumin jelenlétében ampullában, előnyösen üvegampullában, liofilizálunk. A liofilizátum tartalmazhat töltőanyagokat is (mint például mannitolt, dextránt, cukrot, glicint, laktózt vagy poli(vinil-pirrolidon)-t vagy más segédanyagokat (mint például antioxidánsokat, stabilizálókat stb.), amelyek elfogadhatóak a parenterális bejuttatásban. Az üvegampullát ezt követően lezárjuk és több hónapig tárolható, előnyösen - 20 °C alatti hőmérsékleten.
Immunizációhoz vagy terápiához a liofilizátumot 0,1-0,5 ml vizes oldatban, előnyösen fiziológiás sóoldatban, feloldjuk, és vagy parenterálisan, például intramuszkuláris injekcióban vagy lokálisan, például a daganatba vagy a daganat helyénél történő injekcióval beadjuk. A találmány szerinti oltóanyagokat vagy terápiás anyagokat előnyösen intramuszkulárisan injektáljuk [Mayr és munkatársai: Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Őrig. B. 167 375 (1978)]. A beadás módját, a dózist és az oltások számát a szakember az ismert eljárások segítségével optimalizálhatja. Amennyiben lehetséges, elvárható, hogy az oltóanyag-mennyiséget egy hosszabb időtartam során többször adjuk be, hogy a megfelelő immunreakciót váltsuk ki az idegen antigénekkel szemben.
Rekombináns MVA-vírusok alkalmazása heterológ polipeptidek előállítására.
A találmány szerinti rekombináns MVA vaccinia vírusok alkalmazhatók heterológ polipeptidek előállítására is eukarióta sejtekben. Ez magában foglalja a sejtek megfertőzését a rekombináns vaccinia vírusokkal. Az idegen polipeptidet kódoló gén a sejtekben expresszálódik, és az expresszált heterológ polipeptidet izoláljuk. Ilyen heterológ polipeptidek termelésére alkalmazható eljárások a szakember számára általánosságban ismertek [EP-A-206,920 és EP-A-205,939], A rekombináns MVA-vírusok segítségével előállított polipeptidek, az MVA-vírusok különleges tulajdonságai következtében alkalmasabbak gyógyszerként való alkalmazásra állatokban és emberekben.
T7 RNS-polimerázt kódoló rekombináns MVA-vírusok és alkalmazásuk T7 RNS-polimeráz promoter transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenciák expressziójára.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint olyan rekombináns MVA-vírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a T7 bakteriofág RNS-polimeráz-gén expresszióját a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promoterének szabályozása alatt. Az MVA-T7pol rekombináns vírusok expressziós rendszerként történő alkalmazhatóságát megvizsgáltuk tranziens transzfekciós vizsgálati eljárásokban rekombináns gének expressziójának indukálására a T7 RNS-polimeráz promoter szabályozása alatt. Az E. coli klór-amfenikol-acetiltranszferáz (CAT)-gént reportergénként alkalmazva megfigyeltük, hogy az MVA-T7pol ugyanakkora hatékonysággal indukálta a CAT-gén-expressziót, mint egy replikációkompetens WR vaccinia vírustörzsből származó vaccinia/T7pol rekombináns vírus.
A találmány szerinti MVA/T7-polimeráz hibrid rendszer így tehát alkalmazható egyszerű, hatékony és biztonságos emlős-expressziósrendszerként polipeptidek termelésére produktív vaccinia vírusreplikáció nélkül.
Ez az expressziós rendszer úgyszintén alkalmazható rekombináns vírusrészecskék előállítására is immunizáció vagy génterápia céljából, T7 RNS-polimerázt expresszáló rekombináns MVA-vírussal történő fertőzéssel transzformált sejtvonalak útján, olyan DNS5
HU 224 061 Β1 konstrukciók segítségével, amelyek a gének egynéhányat vagy az összest, valamint a vírusrészecskék létrehozásához szükséges genomot, vagy rekombináns genomot tartalmazzák, mint például MVA-részecskék vagy retrovírusrészecskék, és egy T7 RNS-polimeráz promoter transzkripciós szabályozása alatt állnak.
A retrovírusvektor-rendszerek két komponensből tevődnek össze:
1) A retrovlrusvektor önmaga egy módosított retrovírus (vektorplazmid), amelyben a vírusfehérjéket kódoló géneket a célsejtbe transzferálandó terápiás génekre és markergénekre cseréltük ki. Annak következtében, hogy a vírusfehérjéket kódoló gének kicserélése hatékonyan bénítja a vírust, azt a rendszerben található második komponenssel meg kell menteni, amely komponens biztosítja a hiányzó vírusfehérjéket a módosított retrovírus számára.
A második komponens:
2) Egy, a vírusfehérjéket nagy mennyiségben termelő sejtvonal, amelyből azonban hiányzik a képesség replikációkompetens vírusok létrehozására. Ez a sejtvonal a pakolósejtvonalként ismeretes, és egy olyan sejtvonalat képez, amely egy vagy több, a módosított retrovírusvektor pakolását lehetővé tevő gént (a gag, pol és env polipeptideket kódoló gének) hordozó plazmidokkal lett transzfektálva.
A pakolt vektor létrehozásához a vektorplazmidot a pakolósejtvonalba transzfektáljuk. Ilyen körülmények között a módosított retrovírusgenom, amely az inszertált terápiás és markergéneket tartalmazza, transzkripcióra kerül a vektorplazmidból, és a módosított retrovírusrészecskékbe pakolódik (rekombináns vírusrészecskék). Ezt követően ezt a rekombináns vírust alkalmazzuk célsejtek megfertőzésére, amelyekben a vektorgenom és bármely hordozott marker vagy terápiás gén a célsejt DNS-ébe integrálódik. Egy sejt, amelyet ilyen rekombináns vírusrészecskével megfertőztünk, képtelen új vektorvírus létrehozására, hiszen ezekben a sejtekben nincsenek jelen vírusfehérjék. Azonban a terápiás és markergéneket hordozó vektor-DNS integrálódik a sejt DNS-ébe és így expresszálni lehet a fertőzött sejtben.
A találmány szerinti T7 RNS-polimerázt expresszáló rekombináns MVA-vírus alkalmazható a retrovírusvektorok pakolásához szükséges fehérjék előállítására. Ennek érdekében egy retrovírus [például az egéreredetű leukémiavírus (Murine Leukémia Vírus, MLV)] gag, pol és env génjeit a T7 RNS-polimeráz promoter transzkripciós szabályozása alá helyezzük, egy vagy több expressziós vektorban (például plazmidokban). Ezt követően az expressziós vektorokat T7 RNS-polimerázt expresszáló rekombináns MVA-vírussal fertőzött sejtekbe juttatjuk, egy retrovírusvektor-konstrukciót hordozó expressziós vektorral együtt, elképzelhetően egy T7 RNS-polimeráz promoter transzkripciós szabályozása alatt.
A WO 94/29437, a WO 89/11539 és a WO 96/07748 szabadalmi leírások különböző típusú retrovíruskonstrukciókat ismertetnek, amelyek a fent leírt pakolórendszer segítségével pakolhatok.
A T7 RNS-polimerázt expresszáló rekombináns MVA-vírus egy további alkalmazása lehet rekombináns fehérjék, nemfertőző vírusrészecskék, vagy fertőző mutáns vírusrészecskék előállítása oltóanyagok vagy terápiás anyagok termeléséhez [Buchholz és munkatársai: Virology 204 770 (1994) és EP-B1-356695 számú szabadalmi leírás]. Ennek érdekében víruseredetű géneket (mint például a HIV-1 gag, pol és env génjei) helyezünk a T7 promoter transzkripciós szabályozása alá egy expressziós vektorban (mint például plazmid, vagy más rekombináns MVA-vírus). Ezt követően ezt a konstrukciót a T7 RNS-polimerázt expresszáló rekombináns MVA-vírussal fertőzött sejtekbe juttatjuk. A rekombináns víruseredetű gének nagy hatásfokkal átíródnak, nagy mennyiségben termelődnek és rekombináns fehérjék tisztíthatóak. Ezenkívül az expresszált rekombináns vírusfehéijék (mint például HIV-1 env, gag fehérjék) vírus-pszeudorészecskékké rendeződhetnek, amelyek a sejtekből sarjadzás révén kiszabadulhatnak és a szövettenyészet táptalajából izolálhatóak. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, az MVA-T7pol rendszer által expresszált vírusfehérjék (mint például HIV-, SIV- vagy kanyaróvírusból származó fehérjék) segítségével megmenthetünk egy, a fentieken túl bejuttatott mutáns vírust (amely származhat például HIV-ből, SIV-ből vagy kanyaróvírusból) oly módon, hogy a kapcsolódásban és fertőzésben, burokvesztésben, nukleinsavreplikációban, vírusgén-expresszióban, összerendeződésben, sarjadzásban vagy más vírusszaporodási lépésben létrejött hibát ezzel kijavítjuk, és ezzel a mutáns vírustermelését és tisztítását lehetővé tesszük.
Az MVA-T7pol alkalmazható számunkra fontos antigén génjét (például a HÍV, nef, tat, gag, pol vagy env vagy mások génjei) hordozó DNS-szekvenciákkal együtt is immunizációra. Először egy tetszés szerint kiválasztott antigén (mint például HÍV, HCV, HPV, HSV, kanyaróvírus, influenzavírus vagy más vírus) kódoló szekvenciáját egy T7 RNS-polimeráz promoter szabályozása alatt klónozzuk, előnyösen plazmidvektorban, és az eredményként létrehozott DNS-konstrukciót standard laboratóriumi eljárások alkalmazásával amplifikáljuk és tisztítjuk. Ezt követően a vektor-DNS-t MVA-T7pol-lal együtt, egyidőben, vagy megfelelő fáziseltolódással oltással beadjuk. Az oltás helyén a számunkra fontos rekombináns gén átmenetileg expresszálódik az olyan sejtekben, amelyek mind a vektor-DNS-t és az MVA-T7-et tartalmazzák, és a megfelelő antigén kapcsolatba kerül a gazdaszervezet Immunrendszerével, antigénspecifikus immunreakciót kiváltva. Ez az eljárás a nem replikálódó vaccinia MVA-T7pol vektor alkalmazásával egy ígéretes új megközelítést képvisel nukleinsavimmunizációban adott antigén hatékony átmeneti expresszióját lehetővé téve, de kiküszöbölve a konstitutív génexpresszió potenciális kockázatát.
A rekombináns MVA vaccinia vírusokat a következőkben megadott eljárás szerint állíthatjuk elő.
Természetes körülmények között előforduló deléció, például az MVA-genomon belüli II. deléció, mellett elhelyezkedő MVA-DNS-szekvenciák által közrefogott, idegen polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalma6
HU 224 061 Β1 zó DNS-konstrukciót juttattunk be MVA-fertőzött sejtekbe homológ rekombináció létrehozására.
Amint a DNS-konstrukciót bejuttattuk az eukarióta sejtbe, és az idegen DNS rekombinálódott a víruseredetű DNS-sel, izolálni lehet a kívánt rekombináns vaccinia vírust önmagában ismert módon, előnyösen markergén segítségével [vesd össze: Nakano és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 1593 (1982); Franké és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 1918 (1985); Chakrabarti és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3403 (1985); Fathi és munkatársai: Virology 97 (1986)].
Az inszertálásra kerülő DNS-konstrukció lehet lineáris vagy gyűrűbe zárt is. Előnyösen gyűrű alakú DNS-t alkalmazunk, mint például egy plazmidot. A DNS-konstrukció tartalmazhat egy természetes körülmények között előforduló deléciót, például az MVA-genomon belüli II. deléció bal és jobb oldalát közrefogó szekvenciákat [Altenburger és munkatársai: Arch. Virol. 105 15 (1989)]. Az idegen DNS-szekvenciát a természetes körülmények között előforduló deléciót közrefogó szekvenciák közé inszertáljuk. Az idegen DNS-szekvencia lehet egy gén, amely terápiás polipeptidet, mint például t-PA-t vagy interferont kódol, vagy lehet egy patogén ágensből származó antigéndeterminánst kódoló gén. A patogén ágensek lehetnek betegséget okozó vírusok, baktériumok és paraziták, valamint egy élőlényben korlátlanul szaporodó tumorsejtek, amelyek így patológiás növekedésekhez vezethetnek. Ilyen patogén ágensekre szolgáló példákat írt le Davis [Davis és munkatársai: Microbiology, 3. kiadás, Harper International Edition], A patogén ágensek előnyösen alkalmazható antigénjei lehetnek a humán immundeficienciavírusok (például HIV-1 és HÍV—2), a tuberkulózist okozó mikobaktériumok, a Plasmodium falciparum parazita, és a melanomasejtek antigénjei.
DNS-szekvencia vagy gén expressziójához nélkülözhetetlen, hogy a gén transzkripciójához szükséges szabályozószekvenciák a DNS-ben legyenek jelen. Ilyen szabályozószekvenciák (úgynevezett promoterek) a szakember számára ismertek és magukban foglalnak például olyanokat, mint a vaccinia 11 kDa nagyságú gént az EP-A-198,328 szabadalmi leírás szerint, valamint a 7,5 kDa nagyságú gént is [EP-A- 110,385].
A DNS-konstrukció bejuttatható az MVA-fertőzött sejtekbe transzfekcióval, például kalcium-foszfát-precipitáció segítségével [Graham és munkatársai: Virol. 52 456 (1973); Wigler és munkatársai: Cell. 777 (1979)]; elektroporáció segítségével [Neumann és munkatársai: EMBO J. 1 841 (1982)]; mikroinjekció segítségével [Graessmann és munkatársai: Methods in Enzymology 101 482 (1983)]; liposzómák alkalmazásával [Straubinger és munkatársai: Methods in Enzymology 101 512 (1983)]; szferoplasztok segítségével [Schaffner: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 2163 (1980)]; vagy más, a szakember számára ismert eljárásokkal. Előnyösen a transzfekciót kalcium-foszfát-precipitáció segítségével hajtjuk végre.
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az alábbiakban ismertetésre kerülő részletes példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják, és nem korlátozó értelemben kerülnek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékű módosítás, illetve változtatás hajtható végre, és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól, és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körön belülinek
Claims (5)
1. Rekombináns MVA-vírus, amely legalább egy, az MVA-genomon belül egy természetes körülmények 60 között előforduló - de a természetes körülmények között előforduló III. deléciós helytől eltérő - deléciós helyre inszertált idegen gént tartalmaz, expresszióra alkalmas módon.
HU 224 061 Β1
1.3 MVA-vírus klónozása
Homogén vírustörzsállomány-preparátumok előállításához Anton Mayr professzortól kapott MVA-vírust klónoztunk a határhígítás módszerével, 96 lyukas szövettenyésztő lapban tenyésztett CEF-kultúrában, három egymást követő passzálás során. Az F6 MVA-klónt választottuk ki, és CEF-tenyészetben amplifikáltuk, hogy kísérleti vírustörzsállományokat hozzunk létre, amelyek kiinduló anyagként szolgáltak a találmány szerinti rekombináns MVA-vírusok előállítása és a már korábban leírt rekombináns MVA-vírusok előállítása során [Sutter és Moss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10 847 (1992); Sutter és munkatársai: Vaccine 12 1032 (1994); Hirsch és munkatársai: J. Virol. 70 3741 (1996)].
1.2 A vírusok tisztítása
A lehető legtisztább és a gazdasejtre specifikus komponens mentes víruspreparátum előállításához a Joklik által leírtakhoz hasonló tisztítási lépéseket vettünk igénybe [Joklik: Virology 18 9 (1962)]. A-20 °C-on tárolt nyers vírustörzsállományokat felengedtük és felszuszpendáltuk PBS-ben (az üledék térfogatának 10-20-szoros mennyiségében), majd a szuszpenziót a fentiek szerint centrifugáltuk. Az új üledéket 10-szeres mennyiségű 1. számú Trisz-pufferben (10 mM Trisz-HCI pH 9,0) szuszpendáltuk, majd a szuszpenziót rövid ideig ultrahanggal kezeltük (Labsonic L, B. Braun Biotech International, Melsungen, Németország: 2-10 másodperc szobahőmérsékleten 60 watt teljesítmény mellett) annak érdekében, hogy a sejttörmeléket tovább roncsoljuk, és így a sejtes anyagok közül kiszabadítsuk a vírusrészecskéket. A sejtmagokat és a nagyobb méretű sejttörmeléket a szuszpenzió ezt követő rövid centrifugálása során eltávolítottuk (Sorvall GSA rotor, DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, Németország; 3 percig 3000 ford./perc, 10 °C-on). Az üledéket mégegyszer az 1. számú Trisz-pufferben szuszpendáltuk, ultrahanggal kezeltük és centrifugáltuk a fentiek szerint. A szabad vírusrészecskéket tartalmazó összegyűjtött felülúszókat összeöntöttük, és 10 ml, 10 mM Trisz-HCI-ban (pH 9,0) készített, 36% cukrot tartalmazó oldatra rétegeztük, majd Beckman SW 27/SW 28 rotorban centrifugáltuk (80 perc 4 °C-on, 13 500 ford./perc). A felülúszót eldobtuk és a vírusrészecskéket tartalmazó üledéket 10 ml 1 mM Trisz-HCI-ben (pH 9,0) felvettük, rövid idejű ultrahangos kezeléssel homogenizáltuk (a fenti készülékkel, szobahőmérsékleten 2-10 másodperc) és 20-40%-os cukorgradiensre [a cukrot 1 mM Trisz-HCI-ban (pH 9,0) oldottuk fel] rétegeztük további tisztítás céljából. A gradienst Beckmann SW 41 rotorban centrifugáltuk (50 perc, 4 °C-on, 13 500 ford./perc). A centrifugálást követően a vírusrészecskéket tartalmazó elkülönülő sávokat a sáv fölötti térfogat leszívása után pipettázással begyűjtöttük. Az így kapott cukoroldatot háromszoros
HU 224 061 Β1 térfogatú PBS-sel felhígítottuk és a vírusrészecskéket centrifugálással ismét leülepítettük (Beckmann SW 27/28 rotor, 60 perc 4 °C-on, 13 500 ford./perc). Az üledéket, amely ekkor már nagyrészt tiszta vírusrészecskékből állt, újraszuszpendáltuk PBS-ben és ekvilibráltuk, hogy átlagban 1-5-109 lU/ml víruskoncentrációt érjünk el. A tisztított vírustörzsállományt -80 °C-on tároltuk és a további kísérletekhez közvetlenül vagy PBS-sel történő hígítás után alkalmaztuk.
1.1 Az MVA-vírus tenyésztése
Az MVA-vírus egy erősen legyengített vaccinia vírus, amelyet az Ankara vaccinia vírustörzsből (CVA) primer csirkeembrió fibroblaszt (CEF)-tenyészeteken történő hosszú távú sorozatos passzálással hozunk létre. Az előállítás történetének általános áttekintésére, a tulajdonságok és az MVA-törzs alkalmazására, utalni kívánunk az alábbi összefoglaló munkára [Mayr és munkatársai: Infection 3 6 (1975)]. A CEF-tenyészetben történő gyengítésnek köszönhetően, az MVA-vírus magas titerrel replikálódik ebben a madáreredetű gazdasejtben. Emlőssejtekben azonban az MVA növekedése erősen, korlátozott és a vírusnak betudható tipikus tarfoltképződés nem észlelhető. Ezen okból az MVA-vírust CEF-sejteken tenyésztettük. A CEF-sejtek előállításához 11 napos embriókat izoláltunk az inkubált csirketojásokból, a végtagkezdeményeket eltávolítottuk és az embriókat összeaprítottuk, majd 0,25% tripszint tartalmazó oldatban 37 °C-on 20 percig disszociáltuk. A kapott sejtszuszpenziót leszűrtük és a sejteket Sorvall RC-3B centrifugában, szobahőmérsékleten 2000 ford./perc mellett történő 5 perces centrifugálással ülepítettük, ezt követően újraszuszpendáltuk 10-szeres térfogatú ,A” táptalajban (MÉM Eagle, beszerezhető például: Life Technologies GmbH, Eggenstein, Németország), és Sorvall RC-3B centrifugában, szobahőmérsékleten, 2000 ford./perc mellett történő 5 perces centrifugálással újra leülepítettük. A sejtes üledéket 10% fötális borjúsavót (FCS), penicillint (100 egység/ml), streptomicint (100 mg/ml) és 2 mM glutamint tartalmazó „A” táptalajban felvettük úgy, hogy a sejtszuszpenziót 500 000 sejt/ml koncentrációra állítsunk be. Az így kapott CEF-sejteket sejttenyésztő edénybe szélesztettük. A sejteket „A” táptalajban, CO2-inkubátorban 37 °C-on a kívánt sejtkoncentráció eléréséig 1-2 napig tenyésztettük, és ezt követően közvetlenül, vagy egy további sejtpasszálást követően fertőzésre alkalmaztuk. A primer tenyészetek előállításának részletes leírását megtalálhatjuk az alábbi kiadványban: [Freshney: „Culture of Animál Cell.” 11. fejezet, 99. oldal et seq., Alán R. Liss Verlag, New York (1983)].
MVA-vírusokat a következők szerint alkalmaztunk fertőzésre: CEF-sejteket tenyésztettünk 175 cm2 felületű sejtkultúrapalackokban. 90-100%-os összeérésnél a táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket ,A” táptalajban, egy órán keresztül inkubáltuk MVA-vírus-szuszpenzióval (0,01 fertőző egység (IU) sejtenként, 0,02 ml/cm2). Ezután további ,A” táptalajt adtunk hozzá (0,2 ml/cm2) és a palackokat 37 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáltuk (addig, amíg a sejtek körülbelül 90%-a mutat citopatogén hatásokat). Nyers vírustörzsállományokat úgy állítottunk elő, hogy a sejtmonorétegeket a táptalajban lekapartuk és a sejtes anyagot Sorvall RC-3B centrifugában, 3000 ford./perc mellett 5 perces centrifugálással 4 °C-on ülepítettük. A nyers víruspreparátumot további feldolgozásig (mint például vírustisztítás) -20 °C-on tároltuk.
1. példa
Vírusok tenyésztése és tisztítása
1. ábra Az 1. ábra az MVA-genom és a homológ rekombinációval történő idegen DNS inszertálásra szolgáló plazmid sematikus térképe: az MVA-genomon belüli HindW restrikciós helyeket az ábra felső részén tüntettük fel. Bemutatjuk a 900 bázispár nagyságú HindUl-HindM N-fragmenst, amely átfedi az MVA-genomon belül a II. deléció csatlakozási helyét. Az MVADNS-szekvenciákat, amelyek közvetlenül a II. deléció mellett helyezkednek el (flankl és flank2), PCR segítségével amplifikáltuk és a pUCII LZ inszerciós plazmid megszerkesztésében alkalmaztuk.
2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns MVA-vírus, amely a II. deléciós helyre inszertált legalább egy idegen gént tartalmaz expresszióra alkalmas módon.
2.4 Rekombináns MVA-hTYR vírus szerkesztése és jellemzése
Egy 1,9 kilobázispár nagyságú DNS-fragmenst, amely a teljes humán tirozinázt kódoló gént tartalmazza [SK29 azonosítójú beteg (AV) SK29-MEL melanóma-sejtvonalból izolált tirozináz-cDNS 123.B2 klón, GenBank leltári szám: UO1873; Brichard és munkatár10
HU 224 061 Β1 sai: J. Exp. Med. 178 489 (1993)] állítottunk elő a pcDNAI/Amp-Tyr plazmidból [Wölfel és munkatársai:
Eur. J. Immunoi. 24 759 (1994)] EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztve, Klenow-DNS-polimerázzal történő inkubációval módosítva, hogy tompa végeket kap- 5 junk, és a pUCII LZdel P7.5 plazmid Smal hasítási helyébe klónoztuk, hogy létrehozzuk a pUCII LZdel P7.5-TYR vektort (9. ábra). Ezt a plazmidot alkalmazni tudtuk olyan MVA rekombináns vírus megszerkesztésére, amely expresszálja a humán tirozinázgént a vaccinia 10 vírus korai/késői P7.5 promoter szabályozása alatt.
Sejtenként 0,05 TCID50 mennyiségű MVA-val fertőzött CEF-sejteket transzfektáltunk a pUCII LZdel P7.5-TYR plazmidból származó DNS-sel a korábban leírt eljárás szerint [Sutter és munkatársai: Vaccine 12 15 1032 (1994)]. A humán tirozinázgént stabilan expresszáló, és az E. coli LacZ gént átmenetileg együtt expresszáló rekombináns MVA-vírust szelektáltunk plakktisztítás egymást követő fordulóival 5-bróm-4klór-3-indolil β-D-galaktoziddal (300 pg/ml) megfestett 20 CEF-sejtekben. Ezt követően a humán tirozinázt kódoló gént expresszáló rekombináns MVA-vírust - amelyben a LacZ markergén deléciója megtörtént - izoláltunk, három további egymást követő plakktisztítási fordulóval CEF-sejtekből, az 5-bróm-4-klór-3-indolil β-D-galaktozid (300 pg/ml) jelenlétében nemfestődő víruseredetű gócpontokra szkrínelve. Ezt követően a rekombináns vírusokat CEF-monorétegek fertőzésével amplifikáltuk és az MVA-hTYR vírus-DNS-t PCR segítségével analizáltuk a vírustörzsállomány genetikai homogenitásának igazolására. A vírus-DNS Southernblot-analízise igazolta az MVA-hTYR genetikai stabilitását és pontosan megmutatta a rekombináns tirozinázgén beépülését és az E. coli LacZ markergén delécióját a vírusgenomban található II. deléciós helyen.
A rekombináns humán tirozináz hatékony expresszióját az MVA-hTYR vektorral fertőzött CEF-sejtekből kapott fehérjelizátumok Western-blot-analízisével igazoltuk, tirozináz ellen irányított nyúleredetű poliklonális antitesteket alkalmazva [V. Hearing bocsátotta rendelkezésünkre az antitesteket és a Jimenez és munkatársai által leírt módon alkalmaztuk; Jimenez és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3830 (1988)], vagy egéreredetű monoklonális antitesteket alkalmaztunk [L. Old bocsátotta rendelkezésünkre az antitesteket és a Chen és munkatársai által leírt módon alkalmaztuk; Chen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 8125 (1995)].
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGT CTC 33
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 42 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA 42
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC 36
HU 224 061 Β1
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA 36
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC 33
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA; lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 33
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT 39
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNS-primer”
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG 39
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
2.3 Rekombináns MVA-LAInef vírus szerkesztése és jellemzése
Egy 648 bázispár nagyságú DNS-fragmenst állítottunk elő PCR segítségével plazmid DNS-ből [M.-P. Kieny (Transgene S. A., Strasbourg) által rendelkezésünkre bocsátott pTG1166-plazmid; a PCR-primerek a következők voltak: 5’-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3’ és 5-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3’], amely fragmens a HIV-1 LAI teljes nef génjét tartalmazta, ezt megemésztettük BamHl restrikciós endonukleázzal, Klenow-DNS-polimerázzal történő inkubációval módosítottuk, hogy tompa végeket kapjunk, és a pUCII LZdel P7.5 plazmid Smal hasítási helyébe klónoztuk, hogy létrehozzuk a pUCII LZdel P7.5-LAInef vektort (8. ábra). Ezt a plazmidot alkalmazni tudtuk olyan MVA rekombináns vírus megszerkesztésére, amely expresszálja a HIV-1 LAI nef gént a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promoter szabályozása alatt.
Sejtenként 0,05 TCID50 mennyiségű MVA-val fertőzött CEF-sejteket transzfektáltunk a pUCII LZdel P7.5-LAInef plazmidból származó DNS-sel a korábban leírt eljárás szerint [Sutter és munkatársai: Vaccine 12 1032 (1994)]. A nef gént tartalmazó, és az E. coli LacZ markergént átmenetileg együtt expresszáló rekombináns MVA-vírusokat szelektáltunk plakktisztítás egymást követő fordulóival 5-bróm-4-klór-3-indolil β-D-galaktoziddal (300 pg/ml) megfestett CEF-sejtekben. Ezt követően a nef gént tartalmazó rekombináns MVA-vírusokat izoláltunk, amelyekben a LacZ markergén deléciója megtörtént, három további egymást követő plakktisztítási fordulóval CEF-sejtekből, az 5-bróm-4klór-3-indolil β-D-galaktozid (300 pg/ml) jelenlétében nemfestődő víruseredetű gócpontokra szkrínelve. Ezt követően a rekombináns vírusokat CEF-monorétegek fertőzésével amplifikáltuk és az MVA-LAInef vírusDNS-t PCR segítségével analizáltuk a vírustörzsállomány genetikai homogenitásának igazolására. A vírus-DNS Southern-blot-analízise igazolta az MVA-LAInef genetikai stabilitását és pontosan megmutatta a nef gén beépülését és az E. coli LacZ markergén delécióját a vírusgenomban található II. deléciós helyen.
A rekombináns Nef fehérje hatékony expresszióját az MVA-LAInef vektorral fertőzött CEF-sejtekből kapott fehérjelizátumok Western-blot-analízisével igazoltuk, HIV-1 Nef ellen irányított monoklonális egérantitesteket alkalmazva [K. Khron bocsátotta rendelkezésünkre az antitesteket és az Óvod és munkatársai által leírt módon alkalmaztuk; Óvod és munkatársai: AIDS 6 25 (1992)].
2.2 Rekombináns MVA T7pol vírus szerkesztése és jellemzése
Egy 3,1 kilobázispár nagyságú DNS-fragmenst vágtunk ki EcoRI segítségével a pTF7-3 plazmidból [Fuerst és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 8122 (1986)], amely fragmens tartalmazza a teljes T7-bakteriofág RNS-polimeráz-gént a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promoter szabályozása alatt, majd ezt Klenow-DNS-polimerázzal történő inkubációval módosítottuk, hogy tompa végeket állítsunk elő, és a pUCII LZ plazmid egy egyedülálló Smal restrikciós hasítási helyére klónoztuk, hogy ezzel létrehozzuk a pUCII LZ T7pol plazmidtranszfervektort (4. ábra). A T7 RNS-polimeráz-gén expressziójának transzkripciós szabályozására a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promotert választottuk. Az erősebb vaccinia vírus késői promoterekkel szemben (mint például P11), ez a promoterrendszer lehetővé teszi rekombináns gének expresszióját, közvetlenül a célsejtek megfertőzését követően. A pUCII LZ T7pol plazmidot - amely az idegen gének inszercióját irányítja az MVA-genom II. deléciós helyébe - alkalmaztuk a rekombináns MVA T7pol vírus előállítására.
Sejtenként 0,05 TCID50 mennyiségű MVA-val fertőzött CEF-sejteket pUCII LZ T7pol plazmid DNS-sel transzfektáltuk a korábban leírtak szerint [Sutter és munkatársai: Vaccine 12 1032 (1994)]. A T7 RNS-polimerázt, és a β-D-galaktozidázt együttesen expresszáló rekombináns MVA-vírust (MVA P7.5-T7pol) választottunk ki öt egymást követő plakktisztítási fordulóval, 5-bróm-4-klór-3-indolil β-D-galaktoziddal (300 pg/ml) festett CEF-sejtekben. Ezt követően a rekombináns vírusokat CEF-monorétegek fertőzésével amplifikáltuk,
HU 224 061 Β1 és a DNS-t PCR segítségével analizáltuk a vírustörzsállomány genetikai homogenitásának megerősítésére. Az MVA-T7pol víruseredetű DNS Southern-blot-analízise kimutatta a rekombináns gének stabil beépülését az MVA-genomon belül található II. deléciós helynél (5. ábra).
A rekombináns MVA T7pol létrehozta T7 RNS-polimeráz expressziójának folyamatos megfigyeléséhez [35S]metioninnal jelölt polipeptideket analizáltunk a vírussal fertőzött szövettenyészetből. A CV-1 majomvese-sejtvonal monorétegeit 12 lyukas sejttenyésztő lapokon növesztettük, és sejtenként 20 TCID50 vírusmennyiséggel megfertőztük. A fertőzés után 3-5 órával a táptalajt eltávolítottuk, és a tenyészeteket 1 -1 ml metioninmentes táptalajjal egyszer mostuk. Minden lyukba 0,2 ml metioninmentes, 50 μθί [35S]metioninnal kiegészített táptalajt adtunk, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Előállítottuk a fertőzött sejtek citoplazmakivonatait, minden lyukat 0,2 ml 0,5% Nonidet Ρ-40-et tartalmazó lízispufferrel, 37 °C-on, 10 percig inkubálva, majd ezt követően a mintákat SDS-PAGE segítségével analizáltuk. A CV-1 sejtek metabolikus jelölése MVA T7pol-lal két további polipeptid szintézisét fedte fel: (a) egy körülbelül 116 000 Da molekulatömegű fehérje, amely az E. coli β-galaktozidáznak felel meg, amelyet együtt expresszálunk, hogy lehetővé tegyük a rekombináns vírusokra történő szkrínelést; és (b) egy 98 000 Da molekulatömegű fehérje, amely megfelel a T7-bakteriofág RNS-polimeráz várt molekulatömegének (6. ábra). Megjegyzésre érdemes az MVA T7pol által termelt nagy mennyiségű β-galaktozidáz. Az in vivő jelölési kísérletek eredményei a P11-LacZ génkonstrukció nagyon erős expresszióját mutatják, amikor a II. deléció helyén inszertáljuk az MVA-genomba, ezzel jelezve, hogy MVA-vektorvírusokban a rekombináns gének hatékonyabban expresszálhatóak, amennyiben a genomnak erre a helyére inszertáljuk azokat.
Megvizsgáltuk a rekombináns MVA-T7pol vírusok expressziós rendszerként való alkalmazhatóságát a rekombináns WR-T7pol vTF7-3 vírussal szemben [Fuerst és munkatársai: 1986] úgy, hogy pTM 1-ből (Moss és munkatársai: Natúré 348 91 (1990)] származó plazmidvektor-DNS-sel együtt transzfektáltuk, amely vektor T7 RNS-polimeráz promoter (PT7) szabályozása alatt álló E. coli klór-amfenikol-acetil-transzferáz (CAT)-gént tartalmaz (a CAT-gént a pTM1 többszörös klónozóhelyének Ncol és SamHI helyeibe klónozva). A transzfektált és fertőzött CV-1 sejteket 0,2 ml 0,25 M Trisz-HCI-ben (pH 7,5) szuszpendáltuk. Három fagyasztás-felengedés ciklust követően a lizátumokat centrifugálással derítettük, meghatároztuk a felülúszók fehérjetartalmát, és 0,5, 0,25, 0,1 pg összes fehérjét tartalmazó mintákat vizsgáltunk enzimaktivitásra a Mackett és munkatársai által leírt eljárás szerint [Mackett és munkatársai: J. Virol 49 857 (1984)]. Autoradiográfiát követően, a jelölt foltokat mennyiségileg meghatároztuk a Fuji leképezőanallzis-rendszer alkalmazásával. Az eredmények azt mutatják, hogy erősen legyengített MVA vaccinia vektor alkalmazásával ugyanolyan hatékonysággal lehet a vaccinia vírus
T7 RNS-polimeráz rendszert alkalmazni, mint egy teljes mértékben replikációkompetens vaccinia vírus rekombináns esetében (7. ábra).
2.1 Vektorplazmidok szerkesztése
Annak érdekében, hogy rekombináns MVA-vírusok előállítását lehetővé tegyük, új vektorplazmidokat szerkesztettünk. Az idegen gének inszertálását az MVA-genomba pontosan az MVA-genomban természetes körülmények között előforduló II. deléció helyére irányítottuk. Az MVA-genom H/'ndlll N-fragmensében található 2500 bázispár nagyságú deléció helyét közrefogó MVA-DNS-szekvenciákat [Altenburger és munkatársai: J. Arch. Virol. 105 15 (1989)] PCR segítségével amplifikáltuk, és a pUC18 plazmid többszörös klónozási helyére klónoztuk. A bal oldali 600 bázispár nagyságú közrefogó DNS-hez a következő primereket alkalmaztuk: 5’-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3’ és 5’-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3’ (a Kpn\ és Smal restrikciós enzimek hasítási helyeit aláhúzással jelöltük). A jobb oldali 550 bázispár nagyságú közrefogó DNS-hez a következő primereket alkalmaztuk: 5’-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3’ és 5-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3’ (a Psfl és Sphl restrikciós enzimek hasítási helyeit aláhúzással jelöltük). E két pUC18-plazmidba inszertált közrefogó MVA-DNS-darab közé illesztettük be az Escherichia coli lacZ gént a vaccinia vírus késői P11 promoter szabályozása alatt [a promotert plll LZ-plazmidból restrikciós emésztéssel állítottuk elő, Sutter és Moss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10847 (1992)], a BamHI hasítóhely alkalmazásával, hogy előállítsuk a pUCII LZ MVA inszerciós vektort (1. ábra). Ezt követően, egy 289 bázispár nagyságú fragmenst, amely együttesen tartalmazza a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promotert és egy klónozásra alkalmas Smal hasítóhelyet [ezt a pSCjj-plazmidvektorból kiindulva, EcoRI-gyel és Xőal-gyel történő restrikciós emésztéssel állítottuk elő, Chakrabarti és munkatársai: Molecular and Cellular Biology 5 3403 (1985)] inszertáltuk a pUCII LZ Smal hasítóhelyére, hogy megkapjuk az MVA pUCII LZ P7.5-vektort (2. ábra). Olyan vektorplazmid megszerkesztéséhez, amely lehetővé teszi rekombináns MVA-vírusok izolálását a β-galaktozidáz reporterenzim tranziensszintézisének útján, egy, az E. coli LacZ nyílt leolvasási fázis 3’-végéről származó 330 bázispár nagyságú DNS-fragmenst PCR segítségével amplifikáltunk (a primerek a következők voltak: 5’-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3’ és 5-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3'), és a pUCII LZ P7.5 plazmid Sa/I és Pstl hasítási helyeibe klónoztuk, hogy előállítsuk az MVA pUCII LZdel P7.5 vektort (3. ábra). Az Smal hasítási hely segítségével ezt a vektorplazmidot alkalmazhatjuk idegen gént kódoló DNS-szekvenciák beillesztésére az MVA-genomba, a vaccinia vírus P7.5-promoter transzkripciós szabályozása alatt. A kívánt rekombináns vírus izolálását követően, amelyet a β-galaktozidáz-aktivitás expresszálása alapján történő szkríneléssel valósítottunk meg, a rekombináns vírus további tenyésztése az újraszerkesztett P11-LacZ expressziós kazetta homológ rekombinációval történő öndeléciójához vezet.
2. példa
Rekombináns MVA-vírusok szerkesztése és jellemzése
2. ábra pUCII LZ P7.5: A 2. ábra a II. delécióba történő inszertáláshoz alkalmazott MVAvektorplazmidot mutatja be, amely tartalmazza a P11-LacZ expressziós kazettát és a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promotert, hogy a számunkra fontos, a plazmid Smal helyébe klónozható gének expresszióját létrehozzuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns MVA-vírus, amely idegen génként markert, terápiás hatóanyagot, antigént vagy antigéndeterminánst kódoló gént tartalmaz.
3. ábra pUCII LZdel P7.5: A 3. ábra egy MVA-vektorplazmid, amely idegen géneknek az MVA-genomban található II. deléció helyére történő beillesztésére szolgál, amely vektorplazmid tartalmaz egy öndeléciós P11-LacZ expressziós kazettát és a vaccinia vírus korai/késői P7.5 promotert, a számunkra fontos, a plazmid Smal/Noti klónozóhelyébe klónozható gének expressziójának megvalósítására.
4. A 3. igénypont szerinti rekombináns MVA-vírus, amely idegen génként patogén vírusból, baktériumból, más mikroorganizmusból, parazitából vagy tumorsejtből származó antigént vagy antigéndeterminánst kódoló gént tartalmaz.
4. ábra MVA-T7pol rekombináns vírus megszerkesztése: A 4. ábra bemutatja az MVA-genom (HindW restrikciós endonukleáz helyek) és a pUCII LZ T7pol vektorplazmid vázlatos térképét, amely lehetővé teszi a T7 RNS-polimeráz-gén inszertálását az MVA-genom H/ndlll N-fragmensén belüli II. deléció helyére.
5. ábra az MVA-T7pol vírus-DNS Southern-blotanalízisét mutatja be.
6. ábra fehérjék metabolikus jelölését mutatja be [35S]metionin alkalmazásával. SDS-PAGE analízis: 1. sáv: MVA T7pol, 2. sáv: MVA, 3. sáv: CV-1 sejtek.
7. ábra egy CAT vizsgálati eljárást mutat be:
A CV-1 sejteket a T7 RNS-polimeráz promoter szabályozása alatt álló CAT-gént tartalmazó plazmiddal transzfektáltuk és MVA-T7pol-lal vagy WR-T7pol-lal fertőztük. A lizátumokat CAT-aktivitásra vizsgáltuk. A „C” klór-amfenikolt jelöl és az
HU 224 061 Β1 „1-AcC”, illetve a „3-AcC” a klór-amfenikol mono-, illetve triacetilezett változatait jelöli. A CAT-akti vitást a 60 perces időtartam alatt keletkezett acetilezett termék százalékos értékével jellemeztük.
8. ábra az MVA-LAInef megszerkesztését mutatja be: Bemutatjuk az MVA-genom (Hindlll restrikciós endonukleáz hasító helyek) és a pUCII LZdel P7.5-LAInef vektorplazmid vázlatos térképét, amely plazmid lehetővé teszi a HIV-1 LAI nef génjének az MVA-genom Hindin N-fragmensén belüli II. deléciós helyén történő inszertálását.
9. ábra az MVA-hTYR megszerkesztését mutatja be: Bemutatjuk az MVA-genom (Hindlll restrikciós endonukleáz hasító helyek) és a pUCII LZdel P7.5-TYR vektorplazmid vázlatos térképét, amely plazmid lehetővé teszi a humán tirozinázgén az MVA-genom Hindlll N-fragmensén belüli II. deléciós helyén történő inszertálását.
5. A 4. igénypont szerinti rekombináns MVA-vírus, amely idegen génként Plasmodium falciparumbóí, mikobaktériumból, herpeszvírusból, influenzavírusból, hepatitiszvírusból vagy humán immundefficienciavírus-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK78295 | 1995-07-04 | ||
| PCT/EP1996/002926 WO1997002355A1 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant mva virus, and the use thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9802217A2 HUP9802217A2 (hu) | 1999-01-28 |
| HUP9802217A3 HUP9802217A3 (en) | 1999-09-28 |
| HU224061B1 true HU224061B1 (hu) | 2005-05-30 |
Family
ID=8097499
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0402350A HU229261B1 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof |
| HU9802217A HU224061B1 (hu) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Rekombináns MVA-vírus és alkalmazása |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0402350A HU229261B1 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6440422B1 (hu) |
| EP (3) | EP1312679B8 (hu) |
| JP (3) | JP4312260B2 (hu) |
| KR (1) | KR19990028617A (hu) |
| CN (3) | CN1782071A (hu) |
| AT (3) | ATE304058T1 (hu) |
| AU (1) | AU721735B2 (hu) |
| BR (1) | BR9609303B8 (hu) |
| CA (3) | CA2225278C (hu) |
| CZ (1) | CZ292460B6 (hu) |
| DE (3) | DE69635173T2 (hu) |
| DK (3) | DK0836648T3 (hu) |
| EE (3) | EE04753B1 (hu) |
| ES (3) | ES2249647T3 (hu) |
| HK (2) | HK1009830A1 (hu) |
| HU (2) | HU229261B1 (hu) |
| IL (5) | IL122120A (hu) |
| MX (1) | MX9800025A (hu) |
| NO (1) | NO322476B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ313597A (hu) |
| PL (1) | PL186857B1 (hu) |
| PT (1) | PT836648E (hu) |
| RU (1) | RU2198217C2 (hu) |
| SI (3) | SI0836648T1 (hu) |
| TW (2) | TW575664B (hu) |
| UA (3) | UA68327C2 (hu) |
| WO (1) | WO1997002355A1 (hu) |
Families Citing this family (118)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| US7118754B1 (en) * | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
| US6869793B2 (en) * | 1996-09-24 | 2005-03-22 | Bavarian Nordic Research Institute | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| MY119381A (en) * | 1996-12-24 | 2005-05-31 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Recombinant mva virus, and the use thereof |
| US6969609B1 (en) | 1998-12-09 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces | Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| FR2784997A1 (fr) * | 1998-10-22 | 2000-04-28 | Transgene Sa | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| DK1180155T3 (da) * | 1999-05-28 | 2009-02-16 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Vektor til integration af heterologe sekvenser i poxvirale genomer |
| US20150231227A1 (en) * | 2000-03-02 | 2015-08-20 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
| US6682743B2 (en) | 2000-03-14 | 2004-01-27 | Bavarian Nordic A/S | Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (MVA) |
| DE10042598A1 (de) * | 2000-08-30 | 2002-03-28 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS |
| AU2002211654A1 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-22 | Genstar Therapeutics | Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon |
| EE05680B1 (et) | 2000-11-23 | 2013-10-15 | Bavarian Nordic A/S | Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin |
| WO2004022729A1 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| DE10143490C2 (de) * | 2001-09-05 | 2003-12-11 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen |
| DE10144664B4 (de) * | 2001-09-11 | 2005-06-09 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon |
| EP1456230A2 (en) | 2001-12-04 | 2004-09-15 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus ns1 subunit vaccine |
| SI1407006T1 (sl) * | 2001-12-20 | 2006-04-30 | Bavarian Nordic As | Postopek za ponovno pridobivanje in ciscenje poksvirusov iz inficiranih celic |
| AU2003239805B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-09-10 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| BR0310020A (pt) * | 2002-05-16 | 2005-02-15 | Bavarian Nordic As | Expressão de genes no vìrus da vacìnia modificado ancara por uso do promotor de ati de vacìnia |
| JP4895505B2 (ja) | 2002-05-16 | 2012-03-14 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域 |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| DE10249390A1 (de) * | 2002-10-23 | 2004-05-13 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria |
| ES2288634T3 (es) * | 2002-11-25 | 2008-01-16 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas. |
| JP4686443B2 (ja) * | 2003-02-18 | 2011-05-25 | ヘルムホルツ ツェントラム ミュンヘン ドイチェス フォーシュングスツェントラム フュール ゲズントハイト ウント ウンヴェルト ゲーエムベーハー | 組換えｍｖａおよびその生産方法 |
| AU2004291024B2 (en) * | 2003-02-20 | 2009-09-17 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Novel insertion sites in pox vectors |
| ES2319424T3 (es) | 2003-03-27 | 2009-05-07 | Ottawa Health Research Institute | Virus mutantes de la estomatitis vesivular y sus usos. |
| US7731974B2 (en) | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
| US7163685B2 (en) * | 2003-04-16 | 2007-01-16 | City Of Hope | Human cytomegalovirus antigens expressed in MVA and methods of use |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| AU2004263274B2 (en) | 2003-07-21 | 2009-11-05 | Transgene S.A. | Novel multifunctional cytokines |
| WO2005017208A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | George Mason Intellectual Properties, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing hiv infection |
| EP1518932A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-30 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof |
| DE602004009743T2 (de) * | 2003-11-24 | 2008-08-28 | Bavarian Nordic A/S | Promotoren zur Expression in modifiziertem Vaccinia Virus Ankara |
| US7638132B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-12-29 | National University Corporation Hokkaido University | Highly safe smallpox vaccine virus and vaccinia virus vector |
| EP1683870A1 (en) * | 2005-01-24 | 2006-07-26 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vaccines based on the use of MVA |
| WO2006113927A2 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | University Of Washington | Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same |
| US20090060947A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-03-05 | Sanofi Pasteur, Inc. | Immunological compositions |
| RU2551982C2 (ru) * | 2006-06-20 | 2015-06-10 | Трансжене С.А. | Способ получения поксвирусов и композиции поксвирусов |
| WO2008076157A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-06-26 | Duke University | Modified vaccinia ankara virus vaccine |
| CA2663034C (en) * | 2006-09-15 | 2016-05-03 | Ottawa Health Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| AU2007307080B2 (en) | 2006-10-06 | 2014-01-09 | Bavarian Nordic A/S | Methods for treating cancer with MVA |
| US20080241139A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-10-02 | Regents Of The University Of Colorado | Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity |
| AU2008211199A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-08-07 | The Regents Of The University Of Colorado | Methods of modulating immune function |
| WO2008135237A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Medizinische Universität Innsbruck | Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs |
| US8003363B2 (en) * | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| US8003364B2 (en) * | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography |
| WO2008138533A1 (en) * | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| US20100285050A1 (en) * | 2007-10-05 | 2010-11-11 | Isis Innovation Limited | Compositions and Methods |
| BRPI0800485B8 (pt) * | 2008-01-17 | 2021-05-25 | Univ Minas Gerais | vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose |
| KR20100113159A (ko) | 2008-02-12 | 2010-10-20 | 사노피 파스퇴르 리미티드 | 폭스바이러스 정제를 위해 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하는 방법 |
| EP2303322A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-04-06 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| US8691502B2 (en) | 2008-10-31 | 2014-04-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| EP2424999A1 (en) | 2009-04-30 | 2012-03-07 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (CHUV) | Modified immunization vectors |
| SG178254A1 (en) | 2009-08-07 | 2012-03-29 | Transgene Sa | Composition for treating hbv infection |
| US9011874B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-21 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs |
| US9005632B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-14 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains |
| EP3187585A1 (en) | 2010-03-25 | 2017-07-05 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| GB201006405D0 (en) * | 2010-04-16 | 2010-06-02 | Isis Innovation | Poxvirus expression system |
| US20110262965A1 (en) * | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture medium comprising small peptides |
| EP2668201A2 (en) | 2011-01-28 | 2013-12-04 | Sanofi Pasteur SA | Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives |
| WO2012151272A2 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| DK2691530T3 (en) | 2011-06-10 | 2018-05-22 | Univ Oregon Health & Science | CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS |
| PL2739293T3 (pl) * | 2011-08-05 | 2020-11-16 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki |
| EP2568289A3 (en) | 2011-09-12 | 2013-04-03 | International AIDS Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| JP6495653B2 (ja) * | 2011-09-26 | 2019-04-03 | テラベクティ | レンチウイルスパッケージ化のための非サブタイプｂのｇａｇタンパク質の使用 |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| WO2013083254A1 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
| WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
| JP6333814B2 (ja) | 2012-07-10 | 2018-05-30 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニムＴｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓ．Ａ． | マイコバクテリア抗原ワクチン |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| US9657076B2 (en) | 2012-10-23 | 2017-05-23 | Emory University | GM-CSF and IL-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
| US20140286981A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| JP6605480B2 (ja) | 2014-01-09 | 2019-11-13 | トランスジェン・ソシエテ・アノニム | ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原の融合物 |
| GB201412494D0 (en) * | 2014-07-14 | 2014-08-27 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | Vector production |
| PT3197489T (pt) | 2014-09-26 | 2021-04-30 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Métodos e composições para induzir a imunidade protetora contra a infeção pelo vírus da imunodeficiência humana |
| US11701418B2 (en) | 2015-01-12 | 2023-07-18 | Geovax, Inc. | Replication-deficient modified vaccinia Ankara (MVA) expressing Ebola virus glycoprotein (GP) and matrix protein (VP40) |
| WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| CN108368157B (zh) | 2015-12-15 | 2022-04-15 | 扬森疫苗与预防公司 | 人类免疫缺陷病毒抗原、载体、组合物、及其使用方法 |
| AU2017206102C1 (en) | 2016-01-08 | 2022-02-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| WO2017136419A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus |
| CN109152827B (zh) * | 2016-02-25 | 2023-07-21 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | 重组mva或表达人flt3l的mvaδe3l及其作为抗固体肿瘤的免疫治疗剂的用途 |
| US20190134190A1 (en) | 2016-05-04 | 2019-05-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| JP6595132B2 (ja) | 2016-06-16 | 2019-10-23 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｈｉｖワクチン製剤 |
| WO2018045267A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| CA3036959A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Trimer stabilizing hiv envelope protein mutations |
| EP3522920A2 (en) | 2016-10-10 | 2019-08-14 | Transgene SA | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| JP7272965B2 (ja) | 2017-06-15 | 2023-05-12 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｈｉｖ抗原をコードするポックスウイルスベクターおよびその使用方法 |
| CN111065406A (zh) | 2017-06-21 | 2020-04-24 | 特兰斯吉恩股份有限公司 | 个性化疫苗 |
| CN110891601A (zh) | 2017-07-19 | 2020-03-17 | 扬森疫苗与预防公司 | 三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变 |
| US20190022212A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human |
| WO2019055888A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| WO2020051766A1 (zh) | 2018-09-11 | 2020-03-19 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用 |
| WO2020237052A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| JP2022551753A (ja) * | 2019-10-16 | 2022-12-13 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス |
| AU2020384323A1 (en) | 2019-11-14 | 2022-06-02 | Aelix Therapeutics, S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| EP3928789A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| WO2021260065A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| IL308018A (en) | 2021-04-30 | 2023-12-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Oncolytic viruses for different MHC expression |
| EP4108257A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| EP4358999A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| WO2023077147A2 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Pellis Therapeutics, Inc. | T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023220283A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Pellis Therapeutics, Inc. | Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination |
| EP4316514A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-07 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE787901A (fr) | 1971-09-11 | 1972-12-18 | Freistaat Bayern Represente Pa | Vaccin antivariolique |
| JPH0795954B2 (ja) | 1982-11-30 | 1995-10-18 | アメリカ合衆国 | 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法 |
| US5679511A (en) * | 1986-10-06 | 1997-10-21 | Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. | CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway |
| CA1341245C (en) * | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US5221610A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-22 | Institut Pasteur | Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection |
| CN1042564A (zh) * | 1988-11-11 | 1990-05-30 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 乙肝疫苗的制备方法及其制品 |
| JPH03271233A (ja) * | 1990-03-19 | 1991-12-03 | Inst Pasteur | ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発 |
| AU2800392A (en) * | 1991-10-28 | 1993-06-07 | Institut Pasteur | Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides |
| DE69331813T4 (de) * | 1992-12-22 | 2003-07-10 | Ludwig Inst Cancer Res | Verfahren zur Detektion und Behandlung von Individuen mit abnormal hla-a2/tyrosinase-peptidantigenen exprimierenden Zellen |
| US5620886A (en) * | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| CN1055701C (zh) * | 1993-10-19 | 2000-08-23 | 味之素株式会社 | 能诱导对hiv免疫应答的肽及含有该肽的预防、治疗aids的药物 |
| US5676950A (en) * | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
-
1996
- 1996-03-07 UA UA97126424A patent/UA68327C2/uk unknown
- 1996-07-03 SI SI9630623T patent/SI0836648T1/xx unknown
- 1996-07-03 UA UA20031212890A patent/UA75410C2/uk unknown
- 1996-07-03 DE DE69635173T patent/DE69635173T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 KR KR1019970709939A patent/KR19990028617A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-07-03 DE DE69635172T patent/DE69635172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CN CNA2005101248556A patent/CN1782071A/zh active Pending
- 1996-07-03 CZ CZ19974241A patent/CZ292460B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 EP EP03001379A patent/EP1312679B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT03001379T patent/ATE304058T1/de active
- 1996-07-03 BR BRPI9609303-0B8A patent/BR9609303B8/pt active IP Right Grant
- 1996-07-03 EE EEP200300332A patent/EE04753B1/xx unknown
- 1996-07-03 EP EP96925654A patent/EP0836648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 PT PT96925654T patent/PT836648E/pt unknown
- 1996-07-03 CA CA002225278A patent/CA2225278C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EP EP03001378A patent/EP1312678B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT03001378T patent/ATE304057T1/de active
- 1996-07-03 IL IL12212096A patent/IL122120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 JP JP50482497A patent/JP4312260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CA CA2608864A patent/CA2608864C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 ES ES03001378T patent/ES2249647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 MX MX9800025A patent/MX9800025A/es unknown
- 1996-07-03 AT AT96925654T patent/ATE239796T1/de active
- 1996-07-03 ES ES96925654T patent/ES2199294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 NZ NZ313597A patent/NZ313597A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 SI SI9630718T patent/SI1312678T1/sl unknown
- 1996-07-03 DK DK96925654T patent/DK0836648T3/da active
- 1996-07-03 HU HU0402350A patent/HU229261B1/hu unknown
- 1996-07-03 HU HU9802217A patent/HU224061B1/hu active IP Right Grant
- 1996-07-03 CN CNB961952547A patent/CN1154742C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 UA UA20031212892A patent/UA75411C2/uk unknown
- 1996-07-03 ES ES03001379T patent/ES2249648T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AU AU66110/96A patent/AU721735B2/en not_active Expired
- 1996-07-03 EE EE9700344A patent/EE04199B1/xx unknown
- 1996-07-03 EE EEP200300331A patent/EE05138B1/xx unknown
- 1996-07-03 CA CA2596274A patent/CA2596274C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 WO PCT/EP1996/002926 patent/WO1997002355A1/en active Application Filing
- 1996-07-03 DK DK03001378T patent/DK1312678T3/da active
- 1996-07-03 CN CN2004100367144A patent/CN1554764B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630719T patent/SI1312679T1/sl unknown
- 1996-07-03 DK DK03001379T patent/DK1312679T3/da active
- 1996-07-03 DE DE69628011T patent/DE69628011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 RU RU98101904/13A patent/RU2198217C2/ru active
- 1996-07-03 PL PL96324347A patent/PL186857B1/pl unknown
- 1996-12-31 TW TW085116379A patent/TW575664B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 TW TW092116681A patent/TWI245075B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-01-02 US US09/002,443 patent/US6440422B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-02 NO NO19980026A patent/NO322476B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-15 HK HK98110632A patent/HK1009830A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-15 US US10/147,284 patent/US7198934B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-28 IL IL164318A patent/IL164318A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-11 HK HK05100216.3A patent/HK1068015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-19 US US11/523,004 patent/US20070071769A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-19 US US11/522,889 patent/US8153138B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-19 US US11/523,030 patent/US20070071770A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 JP JP2007062631A patent/JP4764367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-12 JP JP2007062630A patent/JP4764366B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-12-01 IL IL202448A patent/IL202448A0/en unknown
-
2010
- 2010-06-14 US US12/814,602 patent/US8197825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-05-17 IL IL212933A patent/IL212933A0/en unknown
-
2012
- 2012-05-02 IL IL219528A patent/IL219528A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7198934B2 (en) | Recombinant MVA virus, and the use thereof | |
| US6869793B2 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines | |
| US20040265324A1 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050329 |