TW575664B - Recombinant MVA virus, and the use thereof - Google Patents

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575664 五、發明說明（1) 本發明係有關重組型牛痘病毒，其係衍生自經修飾的 牛痘病毒安哥拉株（MVA)並包含且能表現被插入在MVA 基因組之一天然發生的刪除位置内的外來基因，以及有關 此類MVA重組型病毒用於生成多肽（例如抗原或治療劑） 或供基因治療用的病毒載體的用途，以及此類編碼抗原的 M VA重組型病毒作為疫苗的用途。 發明之目的 本發明之一目的係提供一 MVA重組型病毒，其可當 作為一有效且異常地安全的表現載體。 本發明之另一目的係提供一簡單、有效及安全之方法 來供製造多肽（例如抗原或治療劑）、疫苗用之重組型病毒 以及基因治療用之病毒載體。 本發明之再一目的係提供一種以一會表現T7 RNA聚 合酶的MVA重組型病毒為主的表現系統，以及根據此表 現系統來製造多胜肷（例如抗原或治療劑）或生產基因治療 或疫苗用的病毒載體之方法。 發明之背景 牛痘病毒（vaccinia virus)[痘病毒科（poxviridae)的正 痘病毒屬之一成員]被使用作為活疫苗以針 對人類天花疾病而行免疫。利用牛痘病毒之成功的全世界 牛痘接種終致達到天花病毒（variola virus)[引起天花的病 :森]的旅除[The global eradication of smallpox· Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication· History of Public Health, Νο·4，Geneva: World 五、發明說明（2) 价β/Μ 7950)。在那份 WHO 聲明之後’除了 處在痘病毒感染之高危險性下的人群（例如實驗室工作者） 之外，牛痘接種已被普遍地休止。 更近期地，牛痘病毒亦被使用來設計病毒載體以供用 於重組基因表現以及供作為重組型活疫苗之可能性使用 (Mackett，M·, Smith, G.L· and Moss，B (1982)，P.N.A.S· USA, 79:7415-7419; Smith, G.L., Mackett, Μ· and Moss, B (1984)， Biotechology and Genetic Engineering Reviews 2:3(53407)。這需要編碼外來基因的DNA序列（基因），在 DNA重組技術的幫助下，被導入致牛痘病毒之基因組中。 若基因被整合至病毒DN A之一個對於病毒的生活史而言 非為必須的位置處，有可能使新生成的重組行牛痘病毒成 為具傳染性的，亦即可感染外來細胞而因此可表現被整合 的DNA序列（EP專利申請案第83,286及110,385號）。以 此方法被製備之重組型牛痘病毒一方面可被使用作為用於 感染疾病的預防之活疫苗，另一方面可被使用於製備真核 細胞之異源性蛋白質。 表現噬菌體T7 RNA聚合酶基因之重組型牛痘病毒容 許建立可廣泛應用的表現系統來供在哺乳動物細胞内合成 重組型蛋白質（Mom, 5·, 广S/e/w, (9·, Γ·, Alexander, W.A.t and Fuerstf T.R. (1990), Nature 348f 9/-92)。在所有操作程序中，重組基因表現仰賴'T7 RNA 聚合酶在真核細胞之細胞質内的合成。最普遍者成為一用 於暫時表現（transient expression)的操作程序（FMersi, Γ.Λ·， 575664 五、發明說明（3) Niles, E.G·，Studier，F.W, and Moss, B· (1986)，Proc. Natl· jcaA &/· 以及美國專利申請案 7.648.971) 0 首先，一感興趣之外來基因被插入至一在T7 RNA聚 合酶啟動子控制下之質體内。接下來，此質體利用一標準 轉染程序被導入至被會生產T7 RNA聚合酶的重組型牛痘 病毒所感染的細胞之細胞質中。 此轉染程序是簡單的，因為沒有新的重組型病毒需要 被製造出，且是非常有效的（有高於80%的細胞會表現該感 興趣的基因）(五卜0少-Adw，（9· Mom, 5. (7990入 Proc. Natl· Acad· Sci· USA, 87:6743-6747、。議年痕病秦 ΙΊΊ RNA 聚合酶雜交物系統相較於其他暫時表現系統之優點極有可 能是在於它不需要將質體轉送到細胞核内。在過去，該系 統對於病毒學與細胞生物學上的分析目的而言是極為有用 的（Bwonocore，L. and Rose，J.K. (1990), Nature, 345: 625-628; Pattnaik，A· K and Wertz，G· W, (1991), Proc· Natl· Acad· Sci· USA, 88:1379-1383; Karschin，A·，Aiyar, J·， Gouin，A·，Davidson, N· and Lester，Η·Α· (1991)，FEBS Lett· 278: 229-233; Ho，Β·Υ.，Karschin，A·，Raymond，J·, Branchek，T·，Lester, Η·Α· and Davidson，N. (1992)，FEBS Lett·, 301:303-306; Buchholz，C.J·，Rekzler，C·，Homann, Η·Ε. andTNeubert，W.J，（1994)，Virology，204:770-776)。但 是，該牛痘病毒/T7 RNA聚合酶雜交物系統之重要的未來 應用，例如像是要生成供人類的治療或預防方法用的重組 6 575664

五、發明說明（4) 型蛋白質或重組型病毒粒子，可能會為該重組型牛痘載體 之生產性複製（Pr〇ductive replicati〇n)所阻礙。 牛痘病毒對於人類而言是具傳染性的，且在天花根除 活動期間的之時觀察到有偶發性嚴重併發症。有關併發症 的發生之最佳回顧係由美國之一國内性觀察所提供，該觀 察監測了接受一以牛痘病毒之紐約健康局株（New York Board of Health strain)為主的疫苗之大約一千兩百萬人的 年痕楱後（Lane, J·，Ruben，F.，Neff，J. and Millar, J· (1969), 五叹/· J. Med·，257:/207-7205)。因此，要使用牛痘病 毒來作為用於發展重組型活疫苗的載體之最令人興奮的可 能性曾受到安全性考量以及法規規定所影響。再者，被描 述於文獻中的大多數重組型牛痘病毒係以牛痘病毒之 Western Reserve株為主。另一方面，已知道此病毒株具有 一高神經毒性而因此很難被適用在人類以及動物身上 [Morita et al·，Vaccine，5:65-70 (1987)] 〇 對於載體應用而言，健康危險性可藉由使用一經高度 減毒的病毒株而被減輕。數種此類的牛痘病毒株被特別地 發展出以避免天花的牛痘接種之非所欲副作用。因此，經 修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)已藉由牛痘病毒之安哥拉 株（CVA)在雞胚纖維母細胞上的長期連續傳代（i〇ng_term serial passages)而被產生（關於回顧，參見Μ叮r, I, Hochstein-Mintzel, V. and Stickl，Η· (1975)，Infection， ϋ以；瑞士專利第568,392號）。MVA病毒有遵照布達佩 斯條約之要求在1987年12月15曰被寄存在CNCM 575664

五、發明說明（5) (Institut Pasteur, Collection Nationale de Cultures Microorganisms, 25，rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)，寄存編號為1-721。MVA以其高減毒性（亦即被 減低的毒性或傳染性而同時維持著良好的免疫原性）而被 分辨。M VA病毒曾被分析以定出在基因組中相對於野生型 CVA株之改變。總共為3 1，000個鹼基對之基因組DNA的 六個主要刪除位置（刪除位置I、II、III、IV、V及VI)已被 鑑定出//·, Swiier, G· 儿J· Gew. Wra/. 72,川所形成的MVA病毒變成宿主細胞 被嚴格地限制為禽類細胞。 再者，MVA之特徵在於其極度的減毒性。當在不同的 動物模型中予以測試時，M VA被證實即令是在免疫受抑制 的動物體内亦是無毒性的。更重要地，M VA株的優良特性 已在大量的臨床試驗中得到證實[Μα少r a/., ΖΜ. Hyg· I，Abt· Org· B 167, 375-390 (1987); Stickl et al·，Dtsch· Med. Wc/m 99, 23如-2392 "974)]。在這些涵蓋超過 120,000個人（包括高危險性病人在内）的研究期間，無一副 作用是與M VA疫苗的使用有關聯。 MVA在人類細胞中之複製被發現於感染後期會被阻 斷而遏止組合成成熟的具感染性病毒粒子。然而，M VA即 使是在非許可的細胞内亦可以高位準來表現病毒基因與重 組基因，並被建議可作為一有效且格外地安全的基因表現 H 後[Sutter G. and Moss, Β. (1992)，Proc· Natl· Acad· Sci. 抑，7-/⑽57]。最近，新牛痘載體系統已根據MVA 8 五、發明說明（6) 而被建立，具有外來DNA序列被插入在MVA病毒基因組 内的刪除位置III處或TK基因内[Sutter，G_ and Moss, B. (1995)，Dev· Biol· Stand· Basel，Karger 84，195-200 以及美 國專利第5，185，146號]。 為了進一步開發MVA之用途，一藉由DNA重組技術 來將外來基因引入至牛痘病毒之M VA株内的新穎可能方 法曾被尋找。由於本發明不是要改變MVA病毒的基因組， 不需要使用一會符合此需求之方法。依據本發明，一外來 基因序列被重組至病毒DNA内準確地位在MVA基因組之 一個天然發生的删除位置處。 發明概要 本發明因此特別地包含下列，單獨地或是組合地： 一 MVA重組型病毒，其包含並可表現至少一個被插 在M VA基因組内之一個天然發生的刪除位置處之外來基 因； 一如上述之MVA重組型病毒，其包含並可表現至少 一個被插入在MVA基因組之刪除位置II處的外來基因； 一如上述之M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼 一標記、一治療基因或一抗原決定位； 一如上述之M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼 一源自下列之抗原決定位：病源性病毒、細菌或其他 微生i，寄生蟲或腫瘤細胞。 一如上述之M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼 一源自下列之抗原決定位：惡性癔原蟲 575664 五、發明說明（7) 、分枝桿菌、范療病毒（Herpes virus)、流感病毒（influenza virus)、肝炎病毒（hepatitis virus) 或人類免疫不全病毒（human immunodeficiency virus); 一如上述之MVA重組型病毒，其中該抗原決定位是 HIV nef或人類酪胺酸酶； 一如上述之MVA重組型病毒，其為MVA-LAlnef或 MVA-hTYR ; 一如上述之MVA重組型病毒，其中該外來基因編碼 T7 RNA聚合酶； 一如上述之MVA重組型病毒，其為MVA-T7 pol ; 一如上述之MVA重組型病毒，其中該外來基因係在 牛痘病毒的早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制下； 如上述之M VA重組型病毒，其基本上不含有可在人 類細胞内複製之病毒； 一如上述之MVA重組型病毒用於在一 Τ7 RNA聚合酶 啟動子Ρ7.5之轉錄控制下來作DNA序列轉錄之用途； 一為上述任一種MVA重組型病毒所感染的真核細胞； 一為一如上述之M VA重組型病毒所感染之細胞，其 中該外來基因編碼Τ < < 7 RN Α聚合酶； 一為一如上述之M VA重組型病毒所感染之細胞，其 中該外來基因編碼Τ7 RNA聚合酶，並額外地包含一或多 個帶有一或多個在一 Τ7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下 之外來基因的表現載體； 如上述之細胞用於生產被該外來基因所編碼之多胜肽 10 五、發明說明（8) 的用途，包含： a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 b) 分離出為該外來基因所編碼之多胜肽。 一為一如上述之M VA重組型病毒所感染之細胞，其 中該外來基因編碼Τ7 RNA聚合酶，並額外地包含帶有病 毒基因的表現載體和/或一編碼一在Τ7 RNA聚合酶啟動子 的轉錄控制下之病毒載體的基因組之病毒建構物； 如上述之細胞用於生產病毒粒子之用途，包含·· a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 b) 分離出病毒粒子； 一為一如上述之MVA重組型病毒所感染之細胞，其 中該外來基因編碼T7RNA聚合酶，並額外地包含： a) —表現載體’其帶有一反轉病毒載體建構物，該反 轉病毒載體建構物可感染並於標的細胞内指引一 或多個為該反轉病毒載體建構物所攜帶的外來基 因之表現，以及 b) —或多個帶有編碼多胜肽之基因的表現載體，該等 多胜狀係為該反轉病毒載體建構物的基因組要在 一 T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下被包裝時 所需要者； 上述細胞用於生產反轉病毒粒子之用途，包含 a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 ， b) 分離反轉病毒粒子； 一種疫苗，其包含一如上述之MVA重組型病毒，其 575664 五 、發明說明（9) 中忒外來基因編碼一位於一生理上可接受的載體内的抗原 決定位； 一如上述之MVA重組型病毒用於製備一疫苗之用 途其中該外來基因編碼一抗原決定位； 一如上述之疫苗用於免疫一活動物體（包括人類）之用 途；

一如上述之包含MVA-LAInef之疫苗用於預防或治療 HIV感染或AIDS的用途； 一如上述之包含MVA-hTYR之疫苗用於預防或治療 黑色瘤的用途；

一種疫苗’其包含有：作為一第一組份之一如上述之 M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼位於一生理上可接 受的載體内的Τ7 RNA聚合酶，以及作為一第二組份之一 DNA序列，該DNA序列攜帶一抗原決定處於一位在一生 理上可接受的載體内的Τ7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制 下，該二組份被包含在一起或是分開的； 一如上述之疫苗用於免疫一活動物體（包括人類）之用 途’包含同時地或有一時間間隔下以該疫苗之第一及第二 組份利用相同的接種位址而接種至該活動物體（包括人 類）；以及 「基因」此詞代表任一種編碼一蛋白質或胜肷之DNA 序列。 「外來基因」此詞代表一被插入在一 DNA序列内之 基因’其中該基因通常是不會於該DN A序列内被發現的。 12 575664 五、發明說明（ίο) 該外來基因，舉例而言，可為一標記基因、一治療基 因或一編碼一抗原決定位之基因，或一病毒基因。此等基 因係為本技藝中所熟知的。 圖式簡單說明 第一圖：M VA的基因組以及用於藉由同源性重組來插 入外來DNA的質體之示意圖：位於MVA的基因組内之 限制位址被標示於上方。與位於MVA基因組内的 刪除位置II之鄰接處相重疊的900-bp Ν片 段被顯示出。與刪除位置II鄰接的MVA DNA序列（側翼1 及側翼2)藉由PCR被擴增並用於構築插入質體pUC II LZ。 第二圖：用於插入至含有Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘 病毒早期/晚期啟動子P7.5之刪除位置II内之pUC II LZ P7.5 : MVA載體質體，俾以表現可被殖入至該質體的Smal 位址内之感興趣的基因。 第三圖：用於在MVA基因組内的刪除位置II處插入 外來基因的pUC II LZdel P7.5 : MVA載體質體，其含有一 個自我刪除的Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘病毒早期/晚期 啟動子P7.5，俾以表現可被殖入至該質體的殖 入位址内之感興趣的基因。 第四圖：重組型病毒MVA-T7pol之構築：MVA基因 組限制内切酶位址）以及載體質體pUC II LZ T7pol 之示意圖，這容許位在刪除位置II處的Τ7 RNΑ聚合酶基 因插入至MVA基因組之//hi/III N片段内。 第五圖：MVA-T7pol病毒DNA之南方墨點轉印分析。 13 575664 五、發明說明（11) 第六圖：使用[35s]甲硫胺酸的蛋白質之代謝性標示。 SDS PAGE 分析。第 1 行：MVA T7po卜第 2 行：MVA， 第3行：CV-1細胞。 第七圖：CAT分析：被含有在Τ7 RNA聚合酶啟動子 的控制下之CAT基因的質體所穿染以及被MVA-T/pol或 WR-T7pol所感染的CV-1細胞。溶胞產物就CAT活性被 測試。C代表氯黴素，而1-AcC與3-AcC代表單-及三-乙 醯化形式之氣黴素。CAT活性被表示為在60分鐘内被形 成的乙醯化產物之百分比。 第八圖：MVA-LAInef之構築·· MVA基因組（i/kt/III 限制内切酶位址）以及容許HIV-1 LAI之nef基因插入至 MVA基因組之片段内的刪除位置II處的載體質 體 pUC II LZdel P7.5-LAInef 之示意圖。 第九圖：MVA-hTYR之構築：MVA基因組（///wt/III限 制核酸内切酶位址）以及容許人類酪胺酸酶基因插入至 MVA基因組之//Μί/ΙΙΙ N片段内的刪除位置II處的載體質 體 pUC II Lzdel P7.5-TYR 之示意圖。 發明的詳細說明 經修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)，一種宿主範圍受 限制且被高度減毒之牛痘病毒株，無法在被測試的人類以 及大多數其他哺乳動物細胞株中複製。但由於病毒的基因 表現在非許可的細胞内未受損害，依據本發明之MVA重 組型病毒可被用來作為格外安全且有效率之表現載體。 編碼一抗原決定位之MVA重組型病毒 14 575664 五、發明說明（12) 在一具體例中，本發明係有關於含有一編碼一外來抗 原（較佳地是來自一致病原者）之基因的MVA重組型牛痘 病毒，以及包含呈一生理上可接受形式之該一病毒的疫 苗。本發明亦有關用於製備該MVA重組型牛痘病毒或疫 苗之方法，以及有關這些疫苗用於預防由該等致病原所引 起的感染之用途。 在本發明之一較佳具體例中，被插入於MVA病毒内 之外來基因係為一個編碼HIV nef之基因。 吾等已構建MVA重組型病毒，其容許HIV-1 nef基因 在牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之控制下的表現。靈長 類慢病毒（primate lentiviruses)之調控性Nef蛋白質是在病 毒複製週期的早期被合成出，且已被顯示對於活體内的高 效價病毒複製以及疾病誘發而言是為必須的。這暗示HIV nef可能在AIDS發病機理上扮演一重要角色。會使Nef 去助長增高的病毒感染力以及HI V致病性之分子機制需要 被進一步地闡明。然而，Nef係為免疫原性，且Nef-專一 性抗原可被用來作為一對抗HIV感染及AIDS之疫苗。 關於此點，會表現HIV nef基因之MVA重組型病毒可 被使用於人類之免疫，一方面是作為對抗人類HIV之預防 性疫苗，而另一方面是用於被HIV感染的或AIDS病人之 免疫治療。再者，會表現HIV nef基因之MVA重組型病毒 可被應用於重組型HI V nef蛋白質之生產。 在本發明之另一較佳具體例中，被插入至MVA病毒 内之外來基因係為一個編碼人類酪胺酸酶之基因。 15 575664

五、發明說明（13) 吾等已構築MVA重組型病毒，其容許人類酪胺酸酶 基因在牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之控制下的表現。 最近’人類路胺酸酶已被鑑定是為一種容許抗腫瘤溶胞性 τ-淋巴細胞之產生的黑色瘤-專一性腫瘤抗原（Brichard，V. et al· [1993] J. Exp· Med· 178, 489-495)。由於在正常細胞

中’似乎只有黑色素細胞會表現酪胺酸酶基因，酪胺酸酶 係為有關黑色瘤的免疫治療之一有用的標的抗原。因此， 會表現人類酪胺酸酶基因之MVA重組型病毒可被使用於 黑色瘤病人身上以誘發會刺激腫瘤排斥或防止轉移之免疫 反應。會表現人類絡胺酸酶基因之M VA重組型病毒可被 直接地使用作為一抗-黑色瘤疫苗，或該病毒可被使用於製 備抗-黑色瘤疫苗。在一個實例中，會表現人類酪胺酸酶基 因之MVA重組型病毒可被用於重組型酪胺酸酶蛋白質之 生產’該蛋白質被應用作為疫苗製品中之一抗原。在另一 實例中，使用會表現人類酪胺酸酶基因之MVA重組型病 毋來作為表現載體，衍生自一腫瘤病人之細胞可在活體外 被修飾成會表現酪胺酸酶，並接而將該細胞移回至病人體 内以誘發抗-腫瘤免疫反應。一根據會表現人類酪胺酸酶基 因之MVA重組型病毒而被製備之疫苗可被非經腸道地應 用或是在腫瘤之位置處被局部地應用。 為了防止腫瘤轉移或是在表型上改變腫瘤[例如，在大 小、形狀、稠度（consistency)、血管化或其他特徵上]，一 根據會表現人類酿胺酸酶基因之M VA重組型病毒而被製 備之疫苗可在腫瘤的外科手術摘除之前、期間當中或之後 16 575664 五、發明說明（l4) 被使用。 為了疫苗之製備，依據本發明之MVA牛痘病毒被轉 換成一生理上可接受形式。此可根據在製備被使用於對抗 天花的疫苗接種之MVA疫苗上之經驗（如Stickl，H et al. [1974] Dtsch· MecL Wschr· 99, 2386-2392 所述者）來達成。 典型地’大約106-108個MVA重組型粒子在存在有2%蛋 白腺與1%人類白蛋白之100 ml的磷酸鹽緩衝液（PBS)内被 冷凍乾燥於一安瓿（較佳為一玻璃安親）中。冷凍乾燥物可 包含適用於非經腸道的投藥之增充劑[諸如甘露醇、葡聚糖 (dextiran)、糖、甘胺酸、乳醣或聚乙烯咣咯烷酮 (polyvinylpyrolidone)]或其他佐劑（諸如抗氧化劑、安定劑 等）。該安瓶接而被密封並可被儲存（較佳地是在低於_2〇。匚 之溫度下）歷時數個月。 為供疫苗接種或治療，冷凍乾燥物可被溶解於〇1至 0.5 ml之一水性溶液（較佳為生理食鹽水）中，並且予以非 經腸道地投藥（例如，藉由肌肉内接種）或局部地投藥（例 如，接種至一腫瘤内或在腫瘤之位置處）。依據本發明之疫 备或治療劑以肌肉内注射為較佳（Mayr，a. et al. [1978] Zbl. Bakt· Hyg· I· Abt· Odg· B 167,375-390)。投藥之模式、投 藥之劑量及次數可為熟習此項技藝之人士以一已知之方式 而加以最適化。若適合的話，可方便地採行將該疫苗於一 個漫長時段内投藥數次，俾以得到對抗外來抗原之適當<免 疫反應。 MVA重組型病毒用於生產異種多胜肽之用途 17 575664 五、發明說明（15) 依據本發明之MVA重組型牛痘病毒亦可被使用於在 真核細胞中製備異種多胜肽。這需要有被該重組型牛痘病 毒所感染的細胞。編碼外來多胜肽之基因於該等細胞中被 表現，而被表現之異種多胜肽被分離出。要被用於生產該 等異種多胜肽之方法係為熟習此項技藝之人士一般所知曉 的（ΕΡ-Α·206,920 及 EP-A-205,939)〇 藉由該等 MVA 重組型 病毒之助而被產生之多胜肽，由於該等M VA病毒之特殊 性質，是更適合於供使用作為人類及動物之醫藥。 編碼Τ7 RN Α聚合酶之M VA重組型病毒及其用於表現在一 Τ7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下的DNA序列之用途 在本發明之進一步較佳具體例中，吾等已構築出MVA 重組型病毒，其容許噬菌體Τ7 RNA聚合酶基因在牛痘病 毒早期/晚期啟動子Ρ7.5之控制下的表現。MVA-T7pol重 組型病毒作為表現系統之有用性已於暫時轉染分析中被測 試，俾以誘發重組型基因在一 T7 RNA聚合酶啟動子之控 制下的表現。利用大腸桿菌氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)基 因作為一報告基因（reporter gene)，吾等發現MVA-T7pol 會誘發出跟一源自於牛痘病毒之可行複製的WR株之牛痘 /T7pol重組型病毒同樣有效的CAT基因表現。 依據本發明之MVA/T7 RNA聚合酶雜交物系統可因 此被使用作為一用於在沒有生產性牛痘病毒複製下來生產 多胜肽之簡單、有效且安全之哺乳動物表現系統。 此表現系統亦可被使用於產生供用於疫苗接種或基因 治療之重組型病毒粒子，這係藉由以含有全部或某些該等 18 575664

五、發明說明（16) 基因之DNA-建建物來轉形被感染以會表現T7 RNA聚合 酶之MVA重組型病毒的細胞株，而為要產生病毒粒子（例 如MVA粒子或反轉病毒粒子）所需之基因組或重組型基因 組係在一 T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下。 反轉病毒載體系統係由二個組份所組成： 1)反轉病毒載體本身係為一經修飾之反轉病毒（載體 質體）’其中編碼病毒蛋白質之基因已為要被轉移至標的細 胞内之冶療基因及標幟基因所取代。由於編碼病毒蛋白質 的基因之取代會有效地損害到病毒，該病毒必須藉由該系 統中能提供所遺失的蛋白質給經修飾之病毒之第二組份來 予以拯救。 第二組份為： 2)—細胞株，其會產生大量的病毒蛋白質但缺乏能產生可 行複製的病毒之能力。此細胞株被知之為包裝細胞株且 係由一被一或多個帶有能使該經修飾之反轉病毒載體被 包裝之基因（編碼gag、p〇l及env多胜肷之基因）的質體 所穿染之細胞株所構成。 為了產生經包裝之載體，載體質體被穿染至包裝細胞 株内。在這些情況下，含有被插入之治療基因及標記基因 之經修飾的反轉病毒基因組從該載體質體被轉錄出並被包 裝入經修飾之反轉病毒粒子（重組型病毒粒子）中。此重組 型病毒接而被用來感染標的細胞，其中該載體基因組及任 何被攜帶之標記或治療基因變成被整合入標的細胞之 DNA中。一被該一重組型病毒粒子所感染之細胞無法製造 19 575664 五、發明說明（17) 新載體病毒，因為無病毒蛋白質存在於此等細胞中。然而， 帶有治療基因或標記基因的載體之DNA被整合至細胞之 DNA中，而接著可在被感染之細胞中被表現。 依據本發明之可表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型病 毒可被用來生產在包裝反轉病毒載體上所需要之蛋白質。 為了做到此點，一反轉病毒[例如鼠科動物白血病毒（MLV)] 之gag、pol及env基因被置於一位在一或多個表現載體（例 如質體）内之T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下。 該等表現載體接而連同一帶有一反轉病毒載體建構物 (可能係在一 T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下）之表現 載體被導入至被感染以會表現T7 RNA聚合酶的MVA重組 型病毒之細胞内。 WO 94/29437、W0 89/11539 及 W0 96/07748 描述了 不同型式之反轉病毒載體建構物，其等可使用上述之包裝 系統而加以包裝。 會表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型病毒之一進一步 用途係為產生用於疫苗或治療劑之生產的重組型蛋白質、 非感染性病毒粒子或感染性突變病毒粒子（Buchholz et al.， Virology, 204，770-776 (1994)以及 EP-B1-356695)。為了 做到此點，病毒基因（例如HIV-1之gag-pol及env基因） 被置於位在一表現載體（例如質體或另一個MVA重組型病 毒）内之T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下。此建構物接 而被導入至被感染以會表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型 病毒的細胞内。該等重組型病毒基因以高效率被轉錄，重 20 575664 五、發明說明（18) 組型蛋白質以高量被生成且可被純化出。另外，被表現之 重組型病毒蛋白質（例如HIV-1 env、gag)可組合成病毒偽 粒子，該等病毒偽粒子自細胞出芽並可自組織培養基中被 分離出。在另一具體例中，由MVA-T7 pol系統所表現出 之病毒蛋白質（源自於例如HIV、SIV、痲疹病毒）可拯救一 被額外地導入之突變病毒（源自於例如HIV、SIV、痲疹病 毒），這係藉由克服一在附著與感染、去外套、核酸複製、 病毒基因表現、組裝、出芽或在病毒複製中之另一個步驟 上之缺陷，俾以容許所提及之突變病毒之生產與純化。 MVA-T7 pol亦可連同帶有一感興趣之抗原的基因（例 如HIV之基因，nef、tat、gag、pol或env或其他）之DNA 序列被使用於免疫。首先，一選定抗原（例如HIV、HCV、 HP V、HSV、痲療病毒、流感病毒或其他）之一編碼序列較 佳地在一 T7 RNA聚合酶啟動子之控制下被選殖至一質體 載體中，而所形成之DNA建構物利用標準實驗室方法被 擴增與純化。其次，載體DNA連同MVA-T7pol同時地或 是在合適之時間差下被接種。 於接種之位置處，感興趣之重組型基因於含有該載體 DNA以及MVA-T7 pol兩者之細胞中被暫時性地表現，而 對應之抗原被呈現給宿主免疫系統來刺激一抗原-專一性 免疫反應。對於容許一給定的抗原之有效暫時性表現但避 免構成性基因表現之潛在風險的核酸疫苗接種而言，此利 用非複製牛痘載體MVA-T7pol之操作方法代表一有希望 的新方法。 21 575664 五、發明說明（19) M VA重組型牛痘病毒可如下面所述來製備： 一個包含有一編碼一外來多胜版且有鄰接一位在 MVA基因組内之天然發生的删除位置（例如删除位置π)之 MVA DNΑ序列夾於兩側之DNA序列的DNA建構物被導 入至被M VA感染之細胞内，俾以容許同源性重組。 一旦該DNA建構物已被導入至真核細胞内，且該外 來DNA已與病毒DNA重組，有可能以一本身為已知的方 法來分離所欲的重組型牛痘病毒，較佳地是在一標記之輔 助下（比較 Nakano et al·，Proc· Natl· Acad. Sci. USA 79 1593-1596 [982]; Franke et al·，Mol. Cell. Bi〇i.，1918-1924 [1985]; Chakrabarfi et al·，Mol· Cell. Bi〇l·，34〇3 34〇9 [1985]; Fathi et al·，Virology 97-105 [1986])· 要被插入的.DNA建構物可以是線形或圓形。一圓形 DNA是較佳的，特別是一質體。DNA建構物包含有位在 MVA基因組内之一個天然發生的刪除位置（例如删除位置 II)之左側與右側的側翼序列（Altenburger，W·，Suter，C.P. and Altenburger J· (1989) Arch. Virol· 105，15-27)。該外來 DNA序列被插入在位於該天然發生的刪除位置之側翼的 序列之間。該外來DNA序列可為一編碼一治療性多胜肽 (例如t-PA或干擾素）或一源自於致病原之抗原決定位之基 因。該致病原可為能引起一疾病之病毒、細菌及寄生蟲， 以及會在一生物體内無限制地複製而因此可導致病理生長 之腫瘤細胞。此類致病原之實例為Davis，B.D.等人所描述 (Microbiology，3rd，Harper International Edition)。較佳之 22 575664

五、發明說明（2〇) 致病原抗原係為那些為人類免疫不全病毒（例如HIV-1及 HIV-2)、造成結核病之分枝桿菌（MycMac/er⑷、寄生森惡 性瘧原蟲（朽以/ddparwm)以及黑色瘤細胞所具之 抗原。

為了表現一 DNA序列或基因，在DNA上必須要存在 有為該基因之轉錄所需的調節序列。該等調節序列（被稱^ 啟動子）係為熟習此項技藝者所知的，並且包含，例如’ > EP-A-198,328中所述的那些為牛痘11 kDa基因所具者’以 及那些為7.5 kDa基因所具者（EP-A-110,385)。 DNA建構物可藉由穿染而被導入至經MVA感染之細 胞内，例如藉由攝酸#5沈澱法（Graham et al.，Virol· 52’ 456-467 [1973]; Wigler et al·，Cell 777-785 [1979])、藉由電 穿孔法（Neumann et al·，EMBO J· 1，841-845 [1982])、藉由 微注射法[Graessmann et al·， Meth. Enzymology 101，482-492 (1982)]、藉由微脂粒法[Straubinger et al.，Pr〇c

Natl. Acad· Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)]或藉由熟習此 項技藝者所知之其他方法。藉由磷酸鈣沈澱法之穿染是為 較佳的。 以下之洋細貫施例係意欲幫助對本發明有一更佳瞭 解。但是，並無意圖給予「本發明被限定於該等實施例中 的標的」之印象。 實施例 ” 1 ·病毒之生長及純化 1 · 1 M VA病毒之生長 23 575664 五、發明說明（21) M VA病毒是一經高度減毒之牛痘病毒，其係源自於牛 痘病毒安哥拉株（CVA)並藉由在原始雞胚纖維母細胞（CEF) 培養物上作長期連續繼代而得。有關MVA株之生產、性 質及用途之歷史的整體性回顧，可參見Mayer等人在 Infection 3,6-14 [1975]中所發表之總結報告。由於在CEF 内之減毒，M VA病毒在此禽類宿主細胞中複製至高效價。 然而，在哺乳類細胞中，M VA生長受到嚴重限制，且由該 病毒所形成之典型菌斑是偵測不到的。因此，MVA病毒是 於CEF細胞上生長。為了製備CEF細胞，自被孵化之雞 蛋中分離出11天大之胚胎，除去端點（extremities)，而胚 胎被剁碎並在37°C於一 0.25%胰蛋白酶溶液中予以解離歷 時20分鐘。將所形成之細胞懸浮液過濾，而細胞藉由於室 溫下在一 Sorvall RC-3B離心機内以2000 rpm予以離心歷 時5分鐘而被沉降，將之再懸浮於10倍體積之培養基A (MEM Eagle，例如可得自於 Life Technologies GmbH， Eggenstein，德國）中，再次藉由於室溫下在一 Sorvall RC-3B 離心機内以2000 rpm予以離心歷時5分鐘而將細胞沉降。 細胞沉塊被再重建於含有10%胎牛血清（FCS)、盤尼西林 (100單位/毫升）、鏈黴素（100單位/毫升）以及2 mM麩胺酸 之培養基A中而得到一含有500000個細胞/毫升之細胞懸 浮液。以此方法所得之CEF細胞被塗佈於細胞培養皿上。 視所需的細胞密度而定，它們被留在培養基A中，並在37 °C下於一 C02培養箱中生長歷時1-2天，並被直接地或是 於再一次的細胞繼代後被用於感染。原始培養物的製備之 24 575664 五、發明說明（22) 一詳細描述可見於R.I. Freshney所著之教科書“Culture of animal cell”，Alan R· Liss Verlag，New York [1983] Chapter 11，page 11 et seq· 〇 MVA病毒係如下述而被用於感染。CEF細胞被培養在 175 cm2之細胞培養舰中。在90-100%群集（confluence)下， 培養基被移除，而細胞以一配於培養基A中之M VA病毒 懸浮液（〇·〇1感染單位（IU)/細胞，〇·〇2 ml/cm2)予以培育歷 時1小時。然後加入更多的培養基A (0.2 ml/cm2)，而培養 瓶在37°C下被培育歷時2-3天[直到大約90%之細胞顯示出 細胞病變效應]。藉由將細胞單層刮入培養基内並藉由在4 °C下於一 Sorvall RC-3B離心機内以3000 rpm予以離心歷 時5分鐘來沉澱細胞物質而得到粗病毒貯液。粗病毒製品 在作進一步處理（例如病毒純化）之前被儲藏於-20°C下。 1.2病毒之純化 為得到一越純越好且不含對宿主細胞具專一性的成份 之病毒製品而被採用之純化步驟係類似於那些為Jokik所 述者（Virology 18, 9-18 [1962])。已被儲藏於-20°C下之粗病 毒製品被解凍並予以懸浮於PBS (10-20倍之沈澱體積）内 一次，且懸浮液依據上述予以離心。新沈澱物被懸浮於10 倍體積之Tris緩衝溶液1 (10 mM Tris-HCl ρΗ9·0)中，且懸 浮液以超音波（Labsonic L，Β· Braun Biotech International， Melsungen，德國；在60瓦特及室溫下，2x 10秒）予以短 暫處理，俾以進一步分解細胞碎片並自細胞物質中釋出病 毒粒子。細胞核及較大細胞碎片在隨後的懸浮液之短暫離 25 575664 五、發明說明（23) 心（可得自於 DuPont Co·，D-6353 Bad Nauheim，FRG 之 Sorvall GSA離心轉子；在300 rpm及10°C下歷時3分鐘） 中被去除。沈澱物如上所述被再次地懸浮於Tris緩衝溶液 1中、以超音波予以處理並予以離心。所收集的包含自由 病毒粒子之上清液被合併並層放於一由10 ml之配於1〇 mM Tris-HCl，pH 9.0中之36%蔗糖所構成之緩衝物上，並 在4°C下於一 Beckman SW 27/SW 28離心轉子内以i3,500 rpm予以離心歷時80分鐘。丟棄上清液，而包含病毒粒子 之沈澱物被帶到10 ml之1 mM Tris-HCl，ρΗ9·0中，藉由 使用超音波（在室溫下2χ 10秒，儀器如上所述）之短暫處 理予以均質化，並將之施用至一個20-40%蔗糖梯度（配於i mM Tris-HCl，pH 9.0内的蔗糖）中以達進一步之純化。該梯 度在4°C下於Backmann SW41離心轉子内以13,000 rpm予 以離心歷時50分鐘。離心後，包含病毒粒子之區帶（discrete bands)係藉由抽除掉位在該區帶上方之容積後再作吸取而 被收集。所得之蔗糖溶液以3倍容積之PBS加以稀釋，而 病毒粒子再次地藉由離心（Beckmann SW 27/28，在13,500 rpm與4°C下歷時60分鐘）而被沈澱。 將現在大部分係由純病毒粒子所組成之沈澱丸再懸浮 於PBS中’並予以調整至相當於平均i-5xl〇9 IU/nU之病 毒濃度。經純化之病毒貯液被儲存於_80°C下，並直接地或 是以PBS稀釋而被應用於隨後的實驗。 1.3 MVA病毒之選殖 為了產生均勻之病毒貯液製備物，得自於Anton Mayr 26 575664 五、發明說明（24) 教授之MVA病毒，藉由在被培養在96井組織培養盤上之 CEF的三次連續繼代期間當中進行限制稀釋處理而被選殖 出。MVA純株F6被選出並於CEF内被擴增以得到病毒之 工作聍液，其可當作起始材料來供生成於本案中所描述之 M VA重組型病毒以及供用於生成先前所描述之M VA重組 型病毒（Sutter，G. and Moss，Β· [1992] Proc. Natl· Acad. Sci. USA 89，10847-10851; Sutter，G. Wyatt，L·，Foley，P·， Bennink，J. and Moss，B. [1994] Vaccine 12，1032-1040; Hirsch，V·，Fuerst，T·，Sutter，G.，Carroll，M·，Yang，L·， Goldstein，S·，Piatak，M·，Elkins，W·，Alvord，G·，Montefiori， D·，Moss，B. and Lifson，J· [1996] J. Virol. 70，3741-3752) o 2. MVA重組型病毒之構築及特性判定 2.1載體質體之構築 為了容許MVA重組型病毒之產生，新質體載體被建 構。外來基因至M VA基因組内之插入被精確地對準至位 在MVA基因組内之天然發生的刪除位置II之位址。位在 MVA基因組之Hindlll N片段中之一個2500 bp删除位置 的側翼之 MVA DNA 序列（Altenburger，W·，Sutter，C.P· and Altenburger，J· [1989]，J. Arch. Virol. 105, 15-27)以 PCR 予 以擴增並被選殖至質體pUC18之多重選殖位址内。有關左 端600 bp DNA側翼之引子係為5’-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3’及 5，-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3’（有關於限制酶尤及Smal之位址被劃底線表 27 575664 五、發明說明（25) 示）。有關右端550 bp DNA側翼之引子係為5’-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3’及 5，-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3 ’（有關於限制酶PWI及办ΛΙ之位址被劃底線表 示）。在被插入至pUC 18内之此等側翼MVA DNA之間， 處在牛痘病毒晚期啟動子P11之控制下之大腸桿菌McZ基 因（藉由限制消化而從pill LZ被製得，Sutter，G. and Moss， Β· [1992] PNAS USA 89, 10847-10851)，使用 BamHI 位址， 而被插入以產生MVA插入載體pUCII LZ (第一圖）。接下 來，一個包含牛痘病毒早期-晚期啟動子P7.5之289 bp片 段連同一用於選殖之Smal位址（藉由使用五及 之限制消化而從質體載體pSCll 被製得[Chakrabartietal· 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409])被插入 至pUC II LZ之Smal位址内以生成MVA載體pUC II LZ P7.5 (第二圖）。為了構築一容許經由報告酵素/3-半乳糖苷 酶之暫時合成來作MVA重組型病毒之分離的載體質體， 一源自於大腸桿菌ΖμΖ開放解讀框架（open reading frame) 之3’端之330 bp DNA片段以PCR予以擴增（引子為 5，-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3,及 5，-GGG GGG CTG CAG AATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3’），並將之選殖入 pUC II LZ P7.5 之心/1 及PWI位址内而得到MVA載體pUC II Lzdel Ρ7·5 (第三 圖）。利用Smal位址，此載體質體可被用於將編碼一處在 牛痘病毒啟動子P7.5之轉錄控制下的外來基因之DNA序 28 575664 五、發明說明（26) 列插入至M VA基因組中。 在所欲之重組型病毒已藉由篩選Θ -半乳糖苷酶活性 之表現而被分離出後，該重組型病毒之進一步繁殖導致被 再處理之Pll-LacZ表現卡匣藉由同源性重組的自我刪除。 2.2重組型病毒MVA T7pol之構築及特性判定 一個包含處在牛痘病毒早期/晚期啟動子Ρ7.5之控制 下的噬菌體Τ7 RNA聚合酶之全部基因的3.1 kbp DNA片 段藉由EcoRI而自質體pTF7-3被切出（Furest，T.R·，Niles， E.G., Studier, F.W. and Moss, B.? 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122-8126)，藉由使用Klenow DNA聚合酶之培育來予以 修飾以生成鈍端，並將之選殖入pUCII LZ之一個獨特的 限制位址内，以形成質體轉移載體pUCII LZ T7pol (第四圖）。作為有關於Τ7 RNA聚合酶基因的表現之轉錄 控制子，牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5被選用。相對於 較強之牛痘病毒晚期啟動子（例如P11)，此啟動子系統如容 許重組型基因緊接在目標細胞的感染後之表現。 會引導外來基因插入至MVA基因組之刪除位置II之 位址處的質體pUCII LZ T7pol被用於產生重組型病毒 MVA T7pol。被MVA以每個細胞為0.05 TCID5G之增殖率 (multiplicity)所感染的CEF細胞被穿染以如前所述之質體 pUCII LZ T7pol 之 DNA (Sutter，G，Wyatt，L·，Foley，P.， Bennink，J. and Moss，Β·(1994) Vaccine 12，1032-1040) 〇 會表現T7 RNA聚合酶並且共同表現/3-D-半乳糖苷 酶之MVA重組型病毒（MVA Ρ7·5-Τ7ρο1)藉由為5-溴-4-氯 29 575664 五、發明說明（27) -3-吲哚基冷-D-半乳糖苷（300 pg/ml)所染色之CEF細胞的 5次連續的菌斑純化處理而被選出。接著，重組型病毒藉 由感染CEF單層而被擴增，且DNA藉由PCR予以分析以 確認病毒貯液之基因均一性。MVA-T7pol病毒DNA之南 方墨點轉印分析證實重組型基因在M VA基因組内的刪除 位置II之位址處的安定整合（第五圖）。為了監測由重組型 MVA-T7pol之Τ7 RNA聚合酶表現，得自於被病毒感染之 組織培養物的[35S]甲硫胺酸-標記的多胜肽被分析。被養在 12井培養盤内之猴腎細胞株CV-1之單層被病毒以每個細 胞20 TCID5〇之增殖率所感染。在感染3至5小時後，將 培養基移除並以1 ml不含曱硫胺酸之培養基來清洗培養 物一次。對每一個井，予以加入0.2 ml之補充有50 gCi 的[35S]曱硫胺酸之不含曱硫胺酸之培養基，並將之培育於 37°C下歷時30分鐘。被感染的細胞之細胞質萃取物係藉由 在37°C下將每個井培育在0.2 ml之0.5% Nonidet P-40溶 胞緩衝液中歷時10分鐘而被製得，並以SDS-PAGE來分 析樣品。帶有MVA T7pol的CV-1細胞之代謝物標示顯示 出兩個額外之多胜肽的合成：⑴一為大約116,000 Da之蛋 白質，其代表被共同表現以容許重組型病毒之篩選的大腸 桿菌/3-半乳糖苷酶，以及（ii) 一為98,000 Da之蛋白質，其 帶有所預期之噬+菌體T7 RNA聚合酶的大小（第六圖）。由 MVA T7pol所製出之大量冷-半乳糖苷酶相當可觀。源自於 活體内標示試驗之結果證實：Pll-ZwZ基因建構物體當被 插入至MVA基因組内位在刪除位置II之位址處時有一非 30 575664 五、發明說明（28) 常強之表現，這出示位在MVA載體病毒内之重組型基因， 當被插入至MVA基因組之此個位置内時，可被更有效地 表現。 MVA-T7pol重組型病毒相較於WR-T7pol重組型病毒 vTF7-3 (Fuerst等人，1986)在作為表現系統上之有用性， 係藉由與一質體載體之DNA的共穿染來測試，該質體載 體係衍生自 pTMl (Moss，B·，Elroy-Stein，01，Mizukami，T·， Alexander, W.A. and Fuerst T.R.(1990) Nature 348, 91-92) 且包含處在一 T7 RNA聚合酶啟動子（PT7)的控制下之大腸 桿菌氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)基因（被選殖入pTMl多選 殖位址之及位址内）。被穿染與感染之CV-1 細胞被懸浮於0.2 ml之0·25 M THs-HCl (ρΗ7·5)中。在三 次冷凍-解凍循環後，溶胞液以離心加以澄清，上清液之蛋 白質含量被測定，而含有0.5、0.25、0.1 pg總蛋白質之樣 品係如 Macket，M·，Smith，G.L. and Moss，B. (1984) J· Virol. 49, 857-864所述來就酵素活性作分析。 在自動放射顯相後，被標示之點利用富士影像分析系 統加以定量。結果證實：藉由使用經高度減毒之牛痘載體 MVA，有可能開發出跟使用一完全可複製之牛痘病毒重組 體同樣有效率之牛痘病毒-T7 RNA聚合酶系統（第七圖）。 2.3重組病毒MVA-LAInef之構築及特性判定 一個包含HIV-1 LAI之整個we/基因之648 bp DNA片 段係藉由PCR而從質體DNA (pTG1166係由M.-P. Kieny， Transgene S.A·，Strasbourg 慷慨提供；PCR 引子係為 31 575664 五、發明說明（29) 5，-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3,及 5，-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3’）而被製備，以限制 内切酶予以消化，利用Klenow DNA聚合酶培育予 以修飾而生成鈍端，並將之選殖入pUC II LZdel P7.5之 Smal位址内，以製造出載體pUCIILZdelP7.5-LAInef (第 八圖）。此質體可被用於構築會在牛痘病毒早期/晚期啟動 子P7.5之控制下來表現nef基因之MVA重組型病毒。被 MVA以每個細胞0.05 TCID5〇之增殖率所感染之CEF細胞 被穿染以如前所述之質體pUCII LZdel P7.5-LAInef之 DNA (Sutter, G，Wyatt，L.，Foley，P·，Bennink，J· and Moss， B.(1994) Vaccine 12，1032-1040)。包含 nef 基因且會暫時 共同表現大腸桿菌LacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由 為5-溴-4-氣·3·吲哚基/3-D-半乳糖苷（300 gg/ml)所染色之 CEF細胞的連續的菌斑純化處理而被選出。接著，包含nef 基因且已刪除掉ZacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由在 5-溴-4-氯-34丨哚基冷-半乳糖苷（300 pg/ml)之存在下，就 CEF細胞中未染色之病毒點作三次額外之連續的菌斑純化 處理而被分離出。接著，重組型病毒藉由CEF單層的感染 而被擴增，而MVA-LAInef病毒DNA藉由PCR被分析以 確認病毒貯液之基因均一性。病毒DN A之南方墨點轉印 分析確認了 MVA-LAInef之基因安定性並準確地證實在病 毒基因組内的刪除位置II之位址處有nef基因之併入以及 大腸桿菌ΙπΖ標記基因之删除。 32 575664 五、發明說明（30) 重組型Nef蛋白質之有效表現係藉由得自於被 MVA-LAInef所感染之CEF細胞的蛋白質溶胞液，利用針 對HIV-1 Nef之小白鼠單株抗體（腎由K· Krohn慷慨提供， 且如 Ovod，V·，Lagerstedt，A” Ranki，A·，Gombert，F·， Spohn，R·，Tahtinen，Μ· Jung，G·，and Krohn，D· [1992] AIDS 6, 25-34所述被使用）的西方墨點轉印分析而被確認。 2.4重組型病毒MVA-hTYR之構築及特性判定 一個包含編碼人類酪胺酸酶的整個基因之1.9 kb DNA 片段（分離自病人SK29 (AV)之黑色瘤細胞株SK29-MEL的 赂胺酸酶 c-DNA 純株 123.B2，GenBankAcc.No· U01873 ； Brichard, V.? Van Pel, A., Wolfel, T., Wolfel, C., De Plaen, E., Lethe, B., Coulie, P. and Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178，489-495)係從質體 pcDNAI/Amp-Tyr (W6lfel，T·，Van Pel，A·，Brichard，V·，Schneider，J·，Seliger， B.? Meyer zum Buschenfelde, K. nad Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759-764)被製備出，以五予以消化，利用 Klenow DNA聚合酶培育予以修飾而生成鈍端，並將之選 殖入pUC II LZdel P7.5之Smal位址内，以製造出載體pUC II LZdel P7.5-TYR (第九圖）。此質體可被用於構築能在牛 痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之控制下來表現人類酪胺酸 酶基因之MyA重組型病毒。 被MVA以每個細胞為0.05 TCID5G之增殖率 (multiplicity)所感染的CEF細胞被穿染以如前所述之質體 pUCII LZdel P7.5-TYR 之 DNA (Sutter，G，Wyatt，L.，Foley， 33 575664 五、發明說明（31) P·， Bennink， J. and Moss， Β·(1994) Vaccine 12， 1032-1040)。安定地表現人類酪胺酸酶基因且暫時地共同 表現大腸桿菌ZacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由為5-溴-4-氣-3-吲哚基冷-D-半乳糖苷（300 gg/ml)所染色之CEF 細胞的連續的菌斑純化處理而被選出。接著，會表現編碼 人類酪胺酸酶之基因且已刪除掉ΙμΖ標記基因之M VA重 組型病毒藉由在5-溴-4-氯-3-吲哚基冷-半乳糖苷（300 pg/ml)之存在下，就CEF細胞中未染色之病毒點作三次額 外之連續的菌斑純化處理而被分離出。接著，重組型病毒 藉由CEF單層的感染而被擴增，而MVA-hTYR病毒DNA 藉由PCR被分析以確認病毒貯液之基因均一性。病毒DNA 之南方墨點轉印分析確認了 MVA-hTYR之基因安定性並 準確地證實在病毒基因組内的刪除位置II之位址處有重組 型酪胺酸酶基因之併入以及大腸桿菌ZacZ標記基因之刪 除。 重組型人類酪胺酸酶之有效表現係藉由得自於被 MVA-hTYR所感染之CEF細胞的蛋白質溶胞液，利用針對 路胺酸酶之兔多株抗體（腎由V. Hearing慷慨提供，且如 Jimenez，M·，Kameyama，Κ·, Maloy，L·，Tomita，Y. and Hearing，V· [1988] P.N.A.S· USA 85, 3 830-3 834 所述被使用） 或小白鼠單株抗體（腎由L· Old慷慨提供，且如Chen，Y.， Stockert，E·，Tsang，S·，Coplan，K and Old，L. [1995] P.N.A.S. USA 92，8125-8129所述被使用）的西方墨點轉印 分析而被確認。 34

Claims (1)

1. 575664

   公告本 申請專利範圍 第085 116379號專利再審杳宏由▲主斤 蚕_累申％專利範圍修正本 修正日期：92年12月 1 ·種用以生成~ DNA建構物的方法，該DNA建構物可 用於生成經修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)重組型 病毋，祕VA重組型病毒包含並可表現被插入於 的基因組内的一個天然發生的刪除位置π處之一或一 種以上的外來基因，該方法包含的步驟為：將一個含 有一或一種以上的外來基因的DNA序列插入至位在 M VA基因組内的_個天然發生的刪除位置π之側翼的 序列之間。 2·如申請專利範圍第巧之方法，其中被包含於該dna序 歹J中的”亥外來基因編碼一標記、一治療劑、一抗原或 一抗原決定位。 3·如申請專利範圍第2項之方法，其中被包含於該]3>1八序 列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定 位·病源性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲 或腫瘤細胞。 4.如申請專利範圍第3項之方法，其中被包含於該DNA序 列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定 位·惡性癔原蟲（Ρ/α㈣y^/c/p0rwm)、分枝桿菌 (卿⑶όα)、危療病毒（Herpes virus)、流感病毒 (influenza virus)、肝炎病毒（hepatitis virus)或人類免疫 不全病毒（human immunodeficiency virus)。 5_如申請專利範圍第3項之方法，其中該抗原或抗原決定 575664 六、申請專利範圍 位是HIV nef或人類酪胺酸酶。 6·如申請專利範圍第丨項之方法，其中被包含於該1)^^八序 列中的該外來基因係處在牛痘病毒的早期/晚期啟動子 P7.5的轉錄控制下。 7·如申請專利範圍第丨項之方法，其中被包含於該dna序 列中的該外來基因編碼T7 RNA聚合酶。 8· —種用以生成一載體質體的方法，該載體質體可用於 生成一 M VA重組型病毒，該μ VA重組型病毒包含並可 表現被插入於M VA的基因組内的天然發生的刪除位置 Π處之一或一種以上的外來基因，該方法包含的步驟 為·將位在MVA基因組内之一個天然發生的删除位置η 的左側與右側的MVADNA側翼序列選殖至一質體中， 以及將一含有一或一種以上的外來基因的DNA序列插 入至該質體内居於該左側及該右側MVA DNA側翼序列 之間。 如申明專利範圍第8項之方法，其中被包含於該DNA序 歹J中的ό亥外來基因編碼一標記、一治療劑、一抗原或 抗原決定位。 10·如申請專利範圍第9項之方法，其中被包含於該DNA序 列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定 位病源性病毋、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤 細胞。 U·如申請專利範圍第K)項之方法，其中被包含於該dna 序列中的该外來基因編碼—源自下列之抗原或抗原決 575664 六、申請專利範圍 定位··惡性癔原蟲分枝桿菌 (Mycc^acier/a)、痕療病毒（Herpes virus)、流感病毒 (influenza virus)、肝炎病毒（hepatitis virus)或人類免疫 不全病毒（human immunodeficiency virus) 〇 12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該抗原或抗原決 定位是HIV nef基因或人類酪胺酸酶。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中由此所生成的載 體質體導致MVA-LAInef或MVA-hTYR的生成。 14. 如申請專利範圍第8項之方法，其中被包含於該DNA序 列中的該外來基因係處在牛痘病毒的早期/晚期啟動子 P7.5的轉錄控制下。 15·如申請專利範圍第8項之方法，其中被包含於該DNA序 列中的該外來基因編碼T7 RNA聚合酶。 16·如申請專利範圍第15項之方法，其中由此所生成的載 體質體導致MVA-T7 pol的生成。 17. —種用以生成一 MVA重組型基因組/病毒的方法，該 MVA重組型基因組/病毒包含並可表現被插入於MVA 的基因組内的一個天然發生的刪除位置Π處之一或一 種以上的外來基因，該方法包括下列步驟： (a) 以一 MVA來感染一禽類宿主細胞； (b) 以一藉由申請專利範圍第8項的方法所製備的載 體質體來穿染該被感染的禽類宿主細胞； (c) 進行該載體質體與該MVA的DNA基因組之間的同 源性重組；以及 、申清專利範圍 ⑷刀、離所形成的MVA重組型基因組/病毒； 其中感染步驟⑷與穿染步驟(b)被同時地或是在有一合 適之時間差下被進行。 18·7申請專利範圍第17項之方法，其中所形成的MVA重 、、 土口、、且 / 病毋是 MVA-LAInef、MVA-hTYR 或 MVA-T7p〇l 〇 申明專利範圍第17項之方法，其中位於所形成的 MVA重組型基因組/病毒中之該外來基因是在牛癌病毒 的早J /晚期啟動子ρ7·5的轉錄控制下。 2〇·如申請專利範圍第17項之方法，Λ中所形成的MVA重 、且3L基因組/病毒不含有於人類細胞内可複製的病毒。 21·種用以製備一疫苗的方法，其包括將依據申請專利 範圍第17項之方法所製備的MVA重組型基因組八病毒與 藥學上可接受的載劑相混合。 22. 一種用以製備一疫苗的方法，其包括將依據申請專利 靶圍第18項之方法所製備的MVA重組型基因組/病毒與 一藥學上可接受的載劑相混合。 23. -種用以製備—疫苗的方法，其包括將依據中請專利 範圍第19項之方法所製備的MVA重組型基因組八病毒與 一藥學上可接受的載劑相混合。 24·種用以在活體外於一細胞培養物中表現一外來基因 的方法’其包括下列步驟： (i)以一藉由申請專利範圍第17項之方法所生成的 MVA重組型基因組/病毒來感染禽類宿主細胞；及 '申請專利範圍 (ι〇培養被感染的禽_主細胞，藉此，該外來基因於 該被感染的禽類宿主細胞内被表現。 25.如申請專利範圍第24項之方法，其中於步驟⑴中所用 的MVA重組型基因組/病毒是mva -LAInef、MVA-hTYR 或 MVA-T7p〇l。 26· =申請專利範圍第24項之方法，其中該等細胞額外地 s有或多個表現載體攜帶有處於T7 RNA聚合酶啟動 子之轉錄控制下的一或一種以上的外來基因。 27·如申請專利範圍第26項之方法，#中該等細胞被進一 v坨養，藉此，該一或一種以上的外來基因被表現而 容許分離出由該（等）夕卜來基所編碼之多肽。 28·如申請專利範圍第24項之方法，#中該等細胞額外地 含有： )表現載體，其帶有一反轉病毒載體建構物，該反 轉病t載體建構物可感染並於標的細胞内指引一 或夕個為該反轉病毒载體建構物所攜帶的外來基 因之表現，以及 b)或多個帶有編碼多胜肽之基因的表現載體，該等 夕胜肽係為该反轉病毒載體建構物的基因組要在 T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下被包裝時 所需要者。 29.2請專職圍第28項之方法，其中該等細胞被進一 八養’精此’病毒粒子被生成並從該細胞培養物被 分離出。 575664 六、申請專利範圍 30. —種用以生產一MVA重組型病毒之方法，該MVA重組 型病毒包含並可表現被插入於MVA的基因組内的一個 天然發生的刪除位置Π處之一或一種以上的外來基 因，該方法包含的步驟為：令一 MVA病毒與一質體進 行重組，於該質體内有一含有一或一種以上的外來基 因的DNA序列被側接以MVA-DNA序歹ij ，該等 MVA-DNA序列鄰接於MVA基因組内之一個天然發生 的刪除位置Π。 3 1 ·如申請專利範圍第30項之方法，其中該重組係藉由以 該質體來穿染禽類細胞並以MVA病毒來感染該等細胞 而被進行，其中穿染及感染係同時地或在有一合適之 時間差下被進行。 32·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中該禽類細胞為雞 胚纖維母細胞（CEF)。 33. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該外來基因編碼 一標記、一治療劑、一抗原或一抗原決定位。 34. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該外來基因編碼 一源自下列之抗原或抗原決定位：病源性病毒、細 菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。 35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該外來基因編碼 一源自下列之抗原或抗原決定位：惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)、分故辑議（Mycobacteria)、龟 療病毒（Herpes virus)、流感病毒（influenza virus)、肝炎 病毒（hepatitis virus)或人類免疫不全病毒（human 6 575664 、申請專利範圍 immunodeficiency virus) 〇 36. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該抗原或抗原決 定位是HIV nef或人類酷胺酸酶。 37. 如申請專利範圍第30項之方法，其中所形成的MVA重 組型病毒是 MVA-LAInef或 MVA-hTYR或 MVA-T7 pol。 3 8.如申請專利範圍第30項之方法，其中該外來基因編碼 T7 RNA聚合酶。 39. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該外來基因係處 在牛痘病毒的早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制下。 40. 如申請專利範圍第30項之方法，其中所形成的MVA病 重組型毒不含有於人類細胞内可複製的病毒。 41. 一種用以製備一疫苗的方法，其包括將藉由申請專利 範圍第30至40項中任一項之方法來製備而形成的MVA 重組型病毒與一藥學上可接受的載劑相混合。