KR19990028617A - 재조합 mva 바이러스 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

MVA게놈내의 자연발생 결실부위에 삽입된 외래유전자를 함유하며 이를 표현할 수 있는 재조합 MVA 바이러스, 및 폴리펩티드, 예를들어 항원 또는 치료제의 제조를 위한 또한 백신용 재조합 바이러스의 제조를 위한 상기 재조합 MVA 바이러스의 용도, 또는 유전자 치료용 바이러스성 벡터.

Description

재조합 MVA 바이러스 및 그의 용도
백시니아 바이러스, 폭스비리다에(Poxviridae)군의 속 오르토폭소비루스의 구성원은 인간 두창질병에 대해 면역화시키기 위한 살아있는 백신으로 사용되었다. 백시니아에 의한 성공적인 광범위한 접종은 두창바이러스의 박멸, 두창의 원인제로 최고에 도달하였다 (두창의 지구상 박멸, 두창 박멸의 증명을 위한 지구상 위원회의 최종보고서, 공중건강의 역사, No.4, 제네바: 세계보건기구, 1980). WHO 선언 이후로 접종은 두창바이러스의 높은 위험에 있는 사람(예, 실험실 작업자)을 제외하고는 보편적으로 중단되었다.
더욱 최근에, 백시니아 바이러스는 또한 재조합 유전자 표현용 및 재조합 라이브 백신으로서 상승용도를 위한 바이러스 벡터를 고안하기 위해 사용되어 왔다 (Mackett, M., Smith, G.L. 및 Moss, B. [1982] P.N.A.S. 미국 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. 및 Moss, B. [1984] 생명공학 및 유전공학 검토 2, 383-4-7). 이것은 DNA 재조합기술의 도움으로 백시니아 바이러스의 게놈내로 도입되는 외래 항원을 암호화하는 DNA서열(유전자)을 포함한다. 유전자가 바이러스의 라이프사이클에 필수적이지 않은 바이러스성 DNA의 부위에 융합하는 경우, 새로 생산된 재조합 백시니아 바이러스가 감염성이 있을 수 있으며, 즉 외래유전자를 감염시켜 융합된 DNA서열을 표현할 수 있다 (유럽특허 출원 제83,286호 및 110,385호). 이러한 방법으로 제조된 재조합 백시니아 바이러스는 한편으로는 감염질병의 예방을 위한 라이브 백시니아로 사용할 수 있고 다른 한편으로는 진핵세포의 이종 단백질의 제조를 위한 라이브 백시니아로 사용할 수 있다.
박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 표현하는 재조합 백시니아 바이러스는 포유류 세포에서 재조합 단백질의 합성을 위한 광범위하게 적용가능한 표현시스템을 구축한다 (Moss, B,, Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., 및 Fuerst T.R. [1990] Nature 348, 91-92). 모든 프로토콜에서 재조합 유전자 표현은 진핵세포의 세포질에서 T7 RNA 폴리머라제의 합성에 좌우한다. 일시적 표현용 프로토콜이 가장 널리 알려져 있다 (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. 및 Moss, B. [1986] Proc, Natl. Acad. Sci. 미국 83, 8122-8126 및 미국특허출원 7,648,971호). 첫째, 흥미있는 외래유전자는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 플라스미드로 삽입된다. 다음에 이 플라스미드는 표준 트랜스팩션 절차를 사용하여 T7 RNA 폴리머라제를 생산하는 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포의 세포질내로 주입하였다.
이 트랜스팩션 프로토콜은 새로운 재조합 바이러스가 만들어질 필요가 없기 때문에 간단하며 또한 흥미있는 유전자를 표현하는 세포의 80% 이상으로 매우 효과적이다 (Elroy-Stein, O. 및 Moss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 87, 6743-6747). 다른 일시적 표현시스템보다 백시니아 바이러스/T7 RNA 폴리머라제 하이브리드 시스템의 이점은 세포핵에 플라스미드의 이송에 매우 독립적일 가능성이 있다. 과거에 이 시스템은 바이러스학 및 세포 생물학에서 분석목적으로 극히 유용하였다 (Buonocore, L. 및 Ross, J.K. [1990] Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. 및 Wertz, G.W. [1991] Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 88, 1379-1383, Karschin, A., Aiyar, J., Gouin, J., Gouin, A., Davidson, N. 및 Lester, H.A. [1991] FEBS Lett. 278, 229-233, Ho. B.Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H.A. 및 Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303-306, Buchholz, C.L., Retzler C., Homann, H.E., 및 Neubert, W.J. [1994] 바이러스학 204, 770-776). 그러나, 예를들어 인간의 새로운 치료 또는 예방 방법에 있어서 재조합 단백질 또는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위하여, 백시니아 바이러스/T7 RNA 폴리머라제 하이브리드 시스템의 중요한 특징 적용은 재조합 백시니아의 생산 복제에 의해 방해받을 수도 있다.
백시니아 바이러스는 인간에 감염성이 있으며 또한 두창 박멸운동 도중 접종시 이따금 심각한 부작용이 관찰되었다. 부작용 빈도에 대한 최선의 관찰은 뉴욕 시티 건강원 백시니아 바이러스 균주를 기본으로 하는 백신으로 약 1200만명의 접종을 검사하는 미국 국내 조사에 의해 제공되었다 (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. 및 Millar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201-1208). 따라서 재조합 라이브 백시니아의 개발을 위한 벡터로서 백시니아 바이러스를 사용하기 위한 가장 흥분되는 가능성은 안전성 문제 및 규제에 의해 영향을 받았다. 더욱이, 상기 문헌에 기술된 재조합 백시니아 바이러스의 대부분은 웨스턴 리저브 백시니아 바이러스 균주를 기초로 한다. 다른 한편, 이 균주는 높은 신경동력을 가지며 또한 인간 및 동물에 사용는데는 적합하지 못하다 (Morita 등, 벡신 5, 65-70 [1987]).
백신 적용에 있어서 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주의 사용에 의해 건강상의 위험성이 감소된다. 백시니아 바이러스의 이러한 여러 가지 균주는 특히 두창 접종의 바람직하지 않은 부작용을 피하기 위해 특별히 개발되었다. 따라서, 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)는 병아리 배자 섬유아세포상에 백시니아 바이러스 (CVA)의 안카라 균주의 장기간 일련의 통과에 의해 생성되었다 (참조: Mayr. A., Hoshstein-Mintzel, V. 및 Stickl, H. [1975] 감염 3, 6-14; 스위스특허 568,392호). MVA바이러스는 1987년 12월 15일 기탁번호 1-721로 CNCM (Institute Pasteur, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에서 부다페스트 조약의 규정요건에 부합되게 기탁되었다. MVA는 큰 약독화, 즉 양호한 면역성을 유지시키면서 감소된 독력 또는 감염성에 의해 구별된다. MVA 바이러스는 와일드 타입 CVA 균주에 대한 게놈의 변화를 측정하기 위해 분석하였다. 총 31,000 염기쌍의 게놈 DNA의 6가지 주요한 절제 (절개Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ및Ⅵ)가 확인되었다 (Meyer, H., Sutter, G. 및 Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). 수득된 MVA 바이러스는 숙주세포를 조류세포로 심하게 한정하였다.
더욱이, MVA는 고도의 약독화를 특징으로 한다. 다양한 동물모델로 시험하였을 경우, MVA는 면역억제 동물에서 조차 무독성인 것으로 입증되었다. 더욱 중요하게, MVA 균주의 우수한 특성은 광범위한 임상시험에서 입증되었다 (Mayer 등, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl 등, Dtsch, med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). 중환자를 포함하여 120,000명 이상의 사람에 대한 이들 조사에서 MVA백신의 사용과 관련된 부작용은 없었다.
인간세포에서 MVA복제는 감염 비리온을 숙성시키기 위해 집합을 예방하는 감염에서 뒤늦게 차단되는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, MVA는 비침투성 세포에서 조차 고농도에서 바이러스성 및 재조합성 유전자를 표현할 수 있었으며 또한 유효하고 예외적으로 안전한 유전자 표현벡터로서 작용하는 것으로 제안되었다 (Sutter, G. 및 Moss B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89, 10847-10851). 최근에 새로운 백시니아 벡터 시스템은 MVA 게놈내에서 또는 TK 유전자내에서 결실부Ⅲ에 삽입된 외래 DNA서열을 갖는 MVA에 기초하여 설정되었다 (Sutter, G. 및 Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel. Karger 84, 195-200 및 미국특허 5,185,146호).
MVA의 용도를 더욱 개발하기 위하여 DNA 재조합에 의해 외래유전자를 백시니아 바이러스의 MVA균주내로 도입할 수 있는 새로운 방법이 밝혀졌다. 본 발명은 MVA 바이러스의 게놈을 변화시키는 것이 아니기 때문에 이러한 요건에 부합되는 방법을 사용할 필요가 있었다. 본 발명에 따르면, 외래 DNA서열은 MVA게놈내의 자연 발생 결실 부위에서 정확히 바이러스DNA로 재조합되었다.
본 발명은 MVA게놈내의 자연 발생 결실부위에 삽입된 외래유전자를 함유하며 이를 표현할 수 있고 또한 변형백시니아 바이러스 안카라 (MVA)로부터 유도된 재조합 백시니아 바이러스, 및 폴리펩티드, 예를들어 항원 또는 치료제의 제조를 위한 상기 재조합 MVA 바이러스의 용도 또는 유전자 치료를 위한 바이러스성 벡터의 용도, 및 백신으로서 항원을 엔코딩하는 상기 재조합 MVA 바이러스의 용도에 관한 것이다.
제 1 도 : 동종의 재조합에 의한 외래 DNA의 삽입을 위한 MVA 및 플라스미드의 게놈의 개략적인 지도: MVA의 게놈의 HindIII 억제부위는 상부에 표시되어 있다. MVA 게놈내에서 결실부Ⅱ의 접함을 중복하는 900-bp HindIII-HindIII N 프라그먼트가 도시되어 있다. 결실부Ⅱ에 인접한 MVA DNA 서열(프랭크1 및 프랭크2)은 PCR로 증식되며 또한 삽입 플라스미드 pUC Ⅱ LZ의 제작에 사용된다.
제 2 도 : pUC Ⅱ LZ P7.5: P11-LacZ 표현 카셋트를 함유하는 결실부Ⅱ내로 삽입시키기 위한 MVA 벡터 플라스미드, 및 이 플라스미드의 Smal 부위내로 클론화될 수 있는 유전자를 표현하기 위한 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5.
제 3 도 : pUCⅡ LZdel P7.5: 자기-결실부 P11-LacZ 표현 카셋트를 함유하는 MVA 게놈의 결실부Ⅱ에 외래유전자를 삽입하기 위한 MVA 벡터 플라스미드, 및 이 플라스미드의 Sma1/Not1 클로닝부위내로 클론화될 수 있는 유전자를 표현하기 위한 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5.
제 4 도: 재조합 바이러스 MVA-T7폴의 제작도: MVA게놈의 HindⅢ N 프라그먼트내의 결실부Ⅱ에 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 삽입시키는 벡터 플라스미드 pUC Ⅱ LZ T7폴 및 MVA 게놈 (HindⅢ 억제 엔도뉴클레아제 부위)의 개략적 지도.
제 5 도: MVA-T7폴 바이러스 DNA의 남방향 오염분석도.
제 6 도: [35S]메티오닌을 사용하는 단백질의 대사 라벨. SDS PAGE 분석. 레인 1: MVA T7폴, 레인 2: MVA, 레인 3: CV-1세포.
제 7 도: CAT 평가: T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 CAT 유전자를 함유하는 플라스미드로 트랜스팩트화되고 MVA-T/pol 또는 WR-T7폴로 감염된 CV-1 세포. 용해물은 CAT활성을 시험하였다. C는 클로람페니콜을 의미하며 또한 1-AcC 및 3-AcC는 클로람페니콜의 모노 및 트리 아세틸화된 형태를 의미한다. Cat활성은 60분이내에 형성된 아세틸화 생성물의 백분율로 표현된다.
제 8 도: MVA-LAl네프의 제작: MVA게놈의 HindⅢ N 프라그먼트내의 결실부Ⅱ에 HIV-1 LAI의 네프유전자를 삽입시키는 벡터 플라스미드 pUCⅡ LZ델 P7.5-LAI네프 및 MVA 게놈(HindⅢ 억제 엔도뉴클레아제)부위의 개략적인 지도.
제 9 도: MVA-hTYR의 제작: MVA게놈의 HindⅢ N 프라그먼트내의 결실부Ⅱ에 인간 티로시나제 유전자를 삽입시키는 벡터 플라스미드pUCⅡ LZ델l P7.5-TYR 및 MVA 게놈(HindⅢ 억제 엔도뉴클레아제)의 개략적인 지도.
본 발명의 목적은 효과적이고 또한 예외적으로 안전한 표현벡터로서 작용할 수 있는 재조합 MVA 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리펩티드, 예를들어 항원 또는 치료제, 백신용 재조합 바이러스 및 유전자 치료용 바이러스성 벡터를 제조하기 위한 간단한, 효과적인 및 안전한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 재조합 MVA 바이러스를 기본으로 하는 표현시스템, 및 폴리펩티드, 예를들어 항원 또는 치료제를 제조하는 방법, 또는 이 표현시스템을 기본으로 하는 유전자 치료용 바이러스성 벡터 또는 백신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 특히 다음을 단독으로 또는 결합되게 포함한다.
MVA개놈내의 자연 발생 결실부위에 삽입된 적어도 하나의 외래유전자를 함유하며 또한 이를 표현할 수 있는 재조합 MVA 바이러스;
MVA 게놈내의 결실부Ⅱ에 삽입된 적어도 하나의 외래 유전자를 함유하며 또한 이를 표현할 수 있는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
외래 유전자가 마커(marker), 치료제 또는 항원성 결정인자를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
외래 유전자가 병원성 바이러스, 박테리아 또는 다른 미생물로부터 또는 기생체 또는 종양세포로부터 항원성 결정인자를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
외래 유전자가 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium Falciparum), 미코박테리아(Mycobacteria), 헤퍼스 바이러스(Herpes virus), 인플루엔자 바이러스, 간염 또는 인간 면역결핍 바이러스로부터 항원성 결정인자를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
항원성 결정인자가 HIV 네프 또는 인간 티로시나제인 상술한 재조합 MVA 바이러스;
MVA-LAI네프 또는 MVA-hTYR인 상술한 재조합 MVA 바이러스;
외래 유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
MVA-T7폴인 상술한 재조합 MVA 바이러스;
외래 유전자가 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 전사조절하에 있는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
인간세포로 복제될 수 있는 바이러스가 거의 없는 상술한 재조합 MVA 바이러스;
T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 DNA서열의 전사를 위한 상술한 재조합 MVA 바이러스의 용도;
상술한 재조합 MVA 바이러스에 의해 감염된 진핵세포;
외래 유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 상술한 재조합 MVA바이러스에 의해 감염된 세포;
T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 하나 이상의 외래 유전자를 운반하는 하나 이상의 표현벡터를 추가로 함유하며. 상기 외래 유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 상술한 MVA 바이러스에 의해 감염된 세포;
a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 외래 유전자에 의해 엔코드화된 폴리펩타이드를 분리시킴을 포함하는 상기 외래 유전자에 의해 엔코드화된 폴리펩타이드를 제조하기 위한 상술한 세포의 용도;
바이러스성 유전자를 운반하는 표현벡터, 및/또는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 바이러스성 벡터의 게놈을 엔코딩하는 바이러스성 벡터 구조물을 추가로 함유하며, 외래유전자가 T7 RNA폴리머라제를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스에 의해 감염된 세포;
a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 바이러스성 입자를 분리시킴을 포함하는 바이러스성 입자를 제조하기 위한 상술한 세포의 용도;
a) 레트로바이러스성 벡터 구조물에 의해 운반된 하나 이상의 외래유전자의 표적세포에서의 표현을 지시 감염할 수 있는 레트로바이러스성 벡터구조물을 운반하는 표현벡터, 및 b) T7 RNA 폴리머라제의 전사조절하에 팩키지화될 레트로바이러스성 벡터구조물의 게놈에 요구되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 윤전자를 운반하는 하나 이상의 표현벡터를 추가로 함유하며, 상기 외래 유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스에 의해 감염된 세포;
a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 레트로바이러스성 입자를 분리시킴을 포함하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 상술한 세포의 용도;
상기 외래유전자가 생리학적으로 허용되는 담체중에 항원성 결정인자를 암호화하는 상술한 재조합 MVA 바이러스를 함유하는 백신;
백신을 제조하기 위한, 상기 외래유전자가 항원성 결정인자를 암호하하는 상술한 재조합 MVA 바이러스의 용도;
인간을 포함한 살아있는 동물체의 면역을 위한 상술한 백신의 용도.
HIV 감염 또는 AIDS의 예방 또는 치료를 위한 MVA-LAI네프를 함유하는 상술한 백신의 용도;
멜라노마스(melanomas)의 예방 또는 치료를 위한 MVA-hTYR을 함유하는 상술한 백신의 용도;
제 1 성분으로서 외래유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 재조합 MVA 바이러스를 생리학적으로 허용되는 담체중에 함유하고 또한 제 2 성분으로서 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 항원성 결정인자를 DNA 서열을 생리학적으로 허용되는 담체중에 함유하며, 상기 두성분이 함께 또는 분리되게 함유하는 백신; 및
백신의 상기 제 1 성분 및 제 2 성분을 동시에 또는 일정한 시간 간격으로 동일접종 부위를 사용하여 인간을 포함한 살아있는 동물체를 접종시킴을 포함하며, 인간을 포함한 살아있는 동물체의 면역화를 위한 상술한 백신의 용도.
용어 "유전자"는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.
용어 "외래유전자"는 정상적으로 발견되지 않는 DNA 서열에 삽입된 유전자를 의미한다.
외래유전자는 마커유전자, 치료유전자, 항원성 결정인자를 엔코딩하는 유전자, 또는 바이러스성 유전자일 수 있다. 이러한 유전자는 당업계에 잘 알려져 있다.
변형 백시니아 바이러스 안카라 (MVA), 숙주 억제된 및 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주는 시험되는 인간 및 다른 포유동물 세포라인에서 증식할 수 없다. 그러나 바이러스성 유전자 표현은 비-침투성 세포에 손상되지 않기 때문에 본 발명에 따른 재조합 MVA 바이러스는 예외적으로 안전한 및 유효한 표현벡터로 사용될 수 있다.
항원성 결정인자를 엔코딩하는 재조합 MVA바이러스
한 실시태양에서 본 발명은 바람직하게 병원성 약제의 외래유전자를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 MVA 백시니아 바이러스, 및 이러한 바이러스를 생리학적으로 허용되는 제형중에 함유하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 MVA백시니아 바이러스 또는 백신의 제조방법, 및 이러한 병원성 약제에 의해 원인이 되는 감염의 예방을 위한 이들 백신의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 MVA 바이러스중에 삽입된 외래유전자는 HIV네프를 엔코딩하는 유전자이다.
본 발명자는 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 HIV-1네프 유전자를 표현시키는 재조합 MVA 바이러스를 제작하였다. 주요한 렌티바이러스의 조절 네프 단백질은 초기에는 바이러스성 복제 사이클로 합성하며 또한 높은 적정농도 바이러스 복제 및 생체내 질병 감염에 필수적인 것으로 나타났다. 이것은 HIV네프가 AIDS발병학에 중요한 역할을 할 수 있음을 암시한다. 네프(Nef)가 증가된 바이러스 감염성 및 HIV 병원성에 작용하는 분자메카니즘은 더욱 밝혀질 필요가 있다. 그러나, 네프는 면역성이 있으며 네프-특이적 항원은 HIV 감염 및 AIDS에 대한 백신으로 사용할 수 있다.
본 명세서에서 HIV 네프 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 한편으로는 인간 HIV에 대한 예방백신으로서 인간의 면역화를 위하여 또한 다른 한편으로는 감염된 HIV 또는 AIDS 환자의 면역 치료를 위해 사용할 수 있다. 더욱이 HIV 네프 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 재조합 HIV네프 단백질의 제조를 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서 MVA 바이러스에 삽입된 외래 유전자는 인간 티로시나제를 엔코딩하는 유전자이다.
본 발명자는 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 인간 티로시나제 유전자를 표현시키는 재조합 MVA 바이러스를 제작하였다. 최근에 인간 티로시나제는 항 종양 세포질 T-임파구를 생성시키는 멜라노마-특이성 종양 항원으로 확인되었다 (Brichard, V., 등 [1993] J. Exp. Med. 178, 489-495). 정상세포중에서 멜라노사이트 만이 티로시나제 유전자를 표현하는 것으로 보이기 때문에 티로시나제는 멜라노마스의 면역치료에 유용한 표적 항원이다. 따라서 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 종양 방지를 유발하거나 전이를 예방하는 면역반응을 유발시키기 위해 멜라노마 환자에게 사용될 수 있다. 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 항-멜라노마 백신으로 직접 사용될 수 있거나, 또는 이 바이러스는 항-멜라노마 백신을 제조하기 위해 사용할 수 있다. 한 실시예에서 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 백신 제형에서 항원으로 사용되는 재조합 티로시나제 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서 표현 벡터로서 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA 바이러스를 사용하면, 종양환자로부터 유도된 세포는 티로시나제를 표현하기 위해 시험관내로 변형된 다음 항-종양 면역반응을 유발시키기 위해 환자에게 다시 전이될 수 있다. 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA를 기본으로하여 제조된 백신은 종양의 부위에서 비경구적으로 또는 국소적으로 사용될 수 있다. 이는 종양 전이를 예방하거나 종양, 예를들어 크기, 형태, 연도(consistency), 혈관화 또는 다른 특징을 표현형으로 변화시키기 위해서이다. 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 재조합 MVA를 기초하여 제조된 백신은 종양의 외과적제 전에, 도중에 또는 후에 사용할 수 있다.
백신의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 MVA 백시니아 바이러스는 생리학적으로 허용되는 제형으로 전환된다. 이것은 두창에 대한 접종에 사용되는 MVA 백신의 제조에 있어서 경험을 기초로 행할 수 있다 ( 참고: Stickl, H.등 [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 대표적으로, 재조합 MVA의 약 106-108입자는 앰풀, 바람직하게는 글래스 앰플중에 2%펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재하에 100ml의 포스페이트-완충식염(PBS)으로 동결건조된다. 동결건조물은 비경구 투여에 적합한 증량제 (예를들어 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈) 또는 다른 조제(예를들어 항산화제, 안정화제 등)을 함유할 수 있다. 이어서 글래스 앰풀을 밀봉하고 바람직하게는 -20℃ 이하의 온도에서 여러달 동안 저장할 수 있다.
접종 또는 치료의 경우 동결건조물은 0.1 내지 0.5 ml의 수용액, 바람직하게는 생리적 식염수중에 용해된 다음 비경구적으로, 예를들어 근육내의 접종에 의해 또는 국소적으로, 예를들어 종양의 부위에 또는 종양내로 접종에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 백신 또는 치료제는 근육내로 주사하는 것이 바람직하다 (Mayr, A. 등, [1978] Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B. 167, 375-390). 투여 형태, 용량 및 투여횟수는 당업계의 기술자들에게 통상적인 방법으로 최적화할 수 있다. 필요에 따라 외래유전자에 대한 적절한 면역반응을 얻기 위하여 장기간에 걸쳐 백신을 여러번 투여하는 것이 유리하다.
이형의 폴리펩티드의 제조를 위한 재조합 MVA 바이러스의 용도.
본 발명에 따른 재조합 MVA 백시니아 바이러스는 또한 진핵세포중의 이형의 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 이것은 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포를 포함한다. 외래 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 세포로 표현되며 또한 표현된 이형의 폴리펩티드가 분리된다. 이러한 이형의 폴리펩티드의 제조에 사용되는 방법은 일반적으로 당업게의 기술자들에게 알려져 있다 (EP-A-206,920 및 EP-A-205,939). 재조합 MVA 바이러스의 도움으로 생산된 폴리펩티드는 MVA 바이러스의 특성 때문에 인간 및 동물의 약제로서 사용하기에 더욱 적합하다.
T7 RNA 폴리머라제를 엔코딩하는 재조합 MVA 바이러스, 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 DNA 서열의 표현을 위한 그의 용도.
본 발명의 또 다른 실시태양에서 본 발명자들은 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 표현시키는 재조합 MVA 바이러스를 제작하였다. 표현 시스템으로서 MVA-T7폴l 재조합 바이러스의 유용성은 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 재조합 유전자의 표현을 유발시키기 위한 일시적인 트랜스팩션 평가법으로 시험하였다. 리포터 유전자로서 이. 콜라이 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 사용하는 경우, 본 발명자는 MVA-T7폴l이 백시니아 바이러스의 복제-경쟁 WR 균주로부터 유래된 백시니아/T7폴 재조합 바이러스로서 효과적인 CAT 유전자 표현을 유발한다는 것을 밝혀냈다.
본 발명에 따른 MVA/T7 폴리머라제 하이브리드 시스템은 생산 백시니아 바이러스 복제가 없어서 폴리펩티드를 제조하기 위한 간단한, 유효한 및 안전한 포유동물 표현시스템으로서 사용될 수 있다.
본 표현 시스템은 또한 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA-구조물, 또한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사 조절하에 바이러스성 입자, 예를들어 MVA 입자 또는 레트로바이러스성 입자를 생산하는데 필요한 게놈 또는 재조합 게놈과 함께, T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 재조합 MVA로 감염된 세포라인의 변형에 의해 접종 또는 유전자 치료용 재조합 바이러스성 입자를 생산하는데 사용될 수 있다.
레트로바이러스성 벡터시스템은 다음 두가지 성분으로 구성된다.
1) 레트로바이러스성 벡터 자체는 바이러스성 단백질을 엔코딩하는 유전자가 표적세포로 전이될 마커유전자 및 치료유전자로 대체되는 변형 레트로바이러스 (벡터 플라스미드)이다. 바이러스성 단백질을 엔코딩하는 유전자의 대체는 바이러스를 효과적으로 무기력화시키기 때문에 변형 레트로바이러스에 부족한 바이러스성 단백질을 제공하는 시스템에서 제 2 성분으로 회복되어야 한다.
제 2 성분은 다음과 같다:
2) 대량의 바이러스성 단백질을 생산하지만, 복제 경쟁 바이러스를 생산할 능력이 부족한 세포라인. 이 세포라인은 팩키지 세포라인으로 알려져 있으며 또한 변형 레트로바이러스성 벡터를 팩키지화할 수 있는 유전자(gag, pol 및 env 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자)를 운반하는 하나 이상의 플라스미드로 트랜스팩트화된 세포라인으로 구성되어 있다.
팩키지화된 세포를 생산하기 위하여 벡터 플라스미드는 팩키지 세포라인으로 트랜스팩트화된다. 이들 조건하에 삽입된 치료 및 마커 유전자를 포함한 변형 레트로바이러스성 게놈은 벡터 플라스미드로부터 전사되고 변형 레트로바이러스성 입자 (제조합 바이러스성 입자)형태로 팩키지화된다. 이어서 이 재조합 바이러스는 표적세포를 감염시키기 위해 사용되며, 여기서 벡터 게놈 및 특정의 운반 마커 또는 치료유전자는 표적세포의 DNA로 융합된다. 이러한 재조합 바이러스성 입자로 감염된 세포는 바이러스성 단백질이 이들 세포내에 존재하지 않기 때문에 새로운 벡터 바이러스를 생산할 수 없다. 그러나 치료 및 마커 유전자를 운반하는 벡터의 DNA는 세포의 DNA중에 융합되며 감염된 세포중에 표현될 수 있다.
T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 본 발명에 따른 재조합 MVA바이러스는 레트로바이러스성 벡터를 팩키지화하는데 필요한 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 이를 행하기 위해서는 레트로바이러스(예: 뮤린 류케미아 바이러스 (MLV))의 gag, pol 및 env유전자는 하나 이상의 표현벡터 (예: 플라스미드)중 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 놓는다. 이어서 표현벡터는, 가능하면 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에, 레트로바이러스성 벡터구조물을 운반하는 표현벡터와 함께, T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 재조합 MVA 바이러스로 감염된 세포중에 도입된다.
WO 94/29437호, WO 89/11539호 및 WO 96/07748호는 상술한 팩키지 시스템을 사용하여 팩키지화될 수 있는 상이한 유형의 레트로바이러스성 벡터를 기술하고 있다.
T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 재조합 MVA 바이러스의 그밖의 용도는 배신 또는 치료제의 제조를 위한, 재조합 단백질, 비감염성 바이러스 입자, 또는 감염성 변이 바이러스를 생산하는 것이다 (Buchholz 등, 바이러스학, 204, 770-776 (1994) 및 EP-B1-356695호). 이것을 행하기 위해서 바이러스 유전자 (예: HIV-1의 gag-pol 및 env 유전자)는 표현벡터(예: 플라스미드 또는 다른 재조합 MVA 바이러스)중에 T7 프로모터의 전사 조절하에 놓는다. 이어서 이 구조물은 T7 RNA 폴리머라제를 표현하는 재조합 MVA 바이러스로 감염된 세포내로 도입된다. 재조합 바이러스 유전자는 높은 효율로 전사되며, 재조합 단백질은 높은 함량으로 제조되며 또한 정제될 수 있다. 그외에, 표현된 재조합 바이러스 단백질(예: HIV-1env, gag)은 세포로부터 발아되어 조직 배지로부터 분리될 수 있는 바이러스성 유사 입자로 조합할 수 있다. 다른 실시태양에서 MVA-T7폴 시스템으로 표현된 바이러스성 입자 (에: HIV, SIV, Measles 바이러스)는 상술한 변이 바이러스를 생산 및 정제시키기 위해 부착 및 감염, 비코팅, 핵산복제, 바이러스 유전자 표현, 조합, 발아 또는 다른 바이러스 증식 단계에서의 단점을 극복함으로써 (예를들어 HIV, SIV, Measles 바이러스로부터) 추가로 도입된 변이 바이러스를 보호할 수 있다.
MVA-T7폴은 또한 면역화를 위한 흥미있는 항원의 유전자(예, HIV, nef, tat, gag, pol, 또는 env 또는 기타의 유전자)를 운반하는 DNA서열과 함께 사용될 수 있다. 첫째, 소정의 항원 (예: HIV, HCV, HPV, HSV, 미즐즈 바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 기타)의 암호화 서열은 바람직하게는 플라스미드 벡터중에 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 클론화하며 또한 수득된 DNA 구조물은 표준 실험실 절차를 사용하여 증식 및 정제된다. 둘째로, 벡터 DNA는 MVA-T7폴과 함께 동시에 접종하거나 적절한 석회지체와 함께 접종한다. 접종 부위에서 흥미있는 재조합 유전자는 벡터 DNA 및 MVA-T7폴을 함유하는 세포내에 일시적으로 표현되며 또한 상응하는 항원은 항원-특이성 면역반응을 자극하는 숙주 면역시스템으로 나타난다. 비-복제 백시니아 벡터 MVA-T7폴을 사용하는 이 프로토콜은 소정의 항원을 유효한 일시적 표현을 시키지만, 연속적인 유전자 표현의 잠재적 위험성을 피하는 핵산 접종에 유망한 새로운 시도를 나타낸다.
재조합 MVA백시니아 바이러스는 후술하는 바와같이 제조할 수 있다.
MVA게놈내에서 자연 발생 결실부, 예를들어 결실부Ⅱ에 인접한 MVA DNA 서열로 프랭킹하는 외래유전자를 암호화하는 DNA-서열을 함유하는 DNA-구조물은 동종의 재조합을 시키기 위해 MVA로 감염된 세포내로 도입된다.
DNA-구조물이 진핵세포내로 도입되고 외래 DNA가 바이러스성 DNA와 재조합되면, 바람직하게는 마커의 도움으로, 원하는 재조합 백시니아 바이러스를 공지된 방법으로 분리시킬 수 있다 (참조: Nakano등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 79, 1593-1596 [1982], Franke등, Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti 등, Mol. Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi 등, 바이러스학 97-105 [1986]).
삽입될 DNA-구조물은 선형 또는 원형일 수 있다. 원형 DNA, 특히 플라스미드가 바람직하다. DNA-구조물은 MVA게놈내의 자연 발생 결실부, 예를들어 결실부Ⅱ의 좌측 및 우측에 프랭킹하는 서열을 포함한다 (Altenburger, W., Suter, C.P. 및 Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27). 외래 DNA 서열은 자연 발생 결실부에 프랭킹하는 서열사이에 삽입된다. 외래 DNA 서열은 치료 폴리펩티드, 예를들어 t-PA 또는 인터페론, 또는 병원성 약제로부터 항원성 결정인자를 암호화하는 유전자일 수 있다. 병원성 약제는 질병의 원인이 될 수 있는 바이러스, 박테리아 및 기생체는 물론, 유기물중에 무제한으로 증식하여 병리학적 성장을 유발시키는 종양세포일 수 있다. 이러한 병원성 약제의 예는 Davis, B.D.등 (Microbiology, 3rd ed. Harper International Edition)에 기술되어 있다. 병원성 약제의 바람직한 항원은 인간 면역결핍 바이러스(예: HIV-1 및 HIV-2, 튜베르큘로시스의 원인이 되는 마이코박테리아, 기생체 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 및 멜라노마 세포의 항원이다.
DNA 서열 또는 유전자의 표현의 경우, 유전자의 전사에 필요한 조절서열이 DNA상에 존재할 필요가 있다. 이러한 조절 서열(소위 프로모터)은 당업계의 기술자에게 알려져 있으며 또한 예를들어 EP-A-198,328호에 기술된 바와같은 백시니아 11kDa 유전자의 서열, 및 7.5 kDa 유전자의 서열(EP-A-110,385)을 포함한다.
DNA-구조물은 예를들면, 칼슘포스페이트 침전에 의해 (Graham등, Virol. 52, 456-467 [1973]; Wigler등, Cell 777-785 [1979]), 일렉트로포레이션에 의해(Neumann 등, EMBO J.1, 841-845 [1982]), 마이크로인젝션에 의해(Graessmann 등, Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), 리포좀에 의해 (Staubinger등, Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), 구형질에 의해(Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 77, 2163-2167 (1980)) 또는 당업계의 기술자에게 알려진 다른 방법에 의해, 트랜스팩션으로 감염된 MVA내로 도입된다. 칼슘포스페이트 침전에 의한 트랜스팩션이 바람직하다.
다음의 상세한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기위한 것이다. 그러나 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 인상을 주어서는 않된다.
1. 바이러스의 성장 및 정제
1.1 MVA바이러스의 성장
MVA 바이러스는 주요한 병아리 배자 섬유아세포(CEF)배양물상에 장기간 연속통과에 의해 백시니아 바이러스 균주 안카라 (CVA)로부터 유도된 고도로 약독화된 백시니아 바이러스이다. 생산과정, 특성 및 MVA균주의 용도에 대한 일반적인 검토를 위해, Mayr 등의 감염 3, 6-14 [1975]에 발표된 요약을 참고할 수 있다. CEF의 약독화로 인하여, MVA 바이러스는 아베인 숙주세포(avain host cell)에서 높은 적정량으로 복제한다. 그러나 포유동물 세포에서 MVA 는 성장이 심하게 억제되며, 바이러스에 의한 대표적인 플라그 형성은 탐지할 수 없다. 따라서 MVA 바이러스는 CEL세포상에서 성장한다. CEF 세포를 제조하기 위해 11-일된 배자를 배양된 계란으로부터 분리하고, 사지를 제거하고, 배자를 0.25% 트립신으로 구성된 용액중에 37℃에서 20분간 잘게 썰어 분리한다. 수득된 세포현탁액을 여과하고 세포를 실온에서 5분간 Sorvall RC-3B 원심분리기로 2000rpm 원심분리에 의해 침전시키고, 10용적의 배지A중에 재현탁시키고(MEM Eagle, 예를들어 독일 라이프 테크로로지스 게엠베하에서 입수가능), 실온에서 5분간 Sorvall RC-3B원심분리기로 2000rpm 원심분리에 의해 다시 침전시키다. 세포펠렛은 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 페니실린(100단위/ml), 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 2mM 글루타민을 함유하는 배지A중에 재구성시켜 500 000 세포/ml을 함유하는 세포현탁액을 얻었다. 이러한 방법으로 수득된 CEF 세포는 세포배양접시에 스프레이하였다. 이들 세포는 원하는 세포밀도에 따라 37℃에서 1-2일간 CO2인큐베이터중의 배지A에서 성장하도록 방치하고 직접적으로 또는 하나의 추가 세포통과후에 감염에 사용되었다. 일차 배양물의 제조를 위한 상세한 설명은 문헌[R.I. Freschney, "동물세포의 배양", Alan R. Liss Verlag, 뉴욕[1983] 제11장, 99페이지]에서 찾을 수 있다.
MVA 바이러스는 다음과 같이 감염에 사용하였다. CEF세포는 175cm2세포배양 병속에 배양하였다. 90-100% 신뢰도에서 배지를 제거하고 세포를 배지A중에 MVA바이러스 현탁액 (0.01 감염단위(IU)/세포, 0.02 ml/cm2)로 1시간 배양하였다. 이어서 배지A를 더 첨가하고(0.2ml/cm2) 병을 37℃에서 2-3일간 (약 90%의 세포가 혈구병원성 효과를 나타낼때까지) 배양하였다. 조 바이러스 주는 베지중에 세포단일층을 문지른 다음 세포물질을 4℃에서 5 분간 Sorvall RC-3B 원심분리기로 300rpm 원심분리에 의해 펠렛화시켜 제조하였다. 조 바이러스 제제는 추가의 가공 (예: 바이러스 정제)전 -20℃에서 저장하였다.
1.2 바이러스의 정제
숙주세포에 특이적인 성분들이 없고 또한 가능하면 순수한 바이러스 제제를 얻기 위해 행한 정제단계는 Joklik (바이러스학 18, 9-18 [1962])에 기술된 것과 유사하였다. -20℃에서 저장된 조 바이러스 주는 PBS (침전물 용적의 10-20배)중에 한 번 용해 및 현탁한 다음 현탁액을 상기와 같이 원심분리하였다. 새로운 침전물은 트리스 완충제1 (10mM 트리스-HCl pH 9.0)의 10배 용적으로 현탁한 다음, 세포부스러기를 더욱 분해하고 세포상 물질로부터 바이러스성 입자를 분리하기 위해서 현탁액을 초음파로 간단히 처리하였다(Labsonic L. B. Braun Biotech International, Melsungen 독일; 60와트 및 실온에서 2×10 초). 세포핵 및 더 큰 세포부스러기를 현탁액의 간단한 후속 원심분리로 제거하였다 (듀퐁사로부터 입수가능한 Sorvall GSA 로우터, D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3000rpm 및 10℃에서 3분). 침전물은 트리스 완충제1로 한 번 다시 현탁하고 초음파로 처리한 다음 상술한 바와같이 원심분리하였다. 유리 바이러스입자를 함유하는 수집된 상등액을 혼합하고, 10mM 트리스-HCl, pH 9.0에서 10ml의 36% 수크로스의 쿠션상에 적층하고, 4℃에서 13,500 rpm으로 80분간 벡크만 SW 27/SW 28 로우터로 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 바이러스입자를 함유하는 침전물을 10ml의 1mM 트리스-HCl, pH 9.0으로 수집하고, 초음파의 간단한 처리(실온에서 2×10초간, 상술한 장치)에 의해 균질화하고, 추가 정제를 위해 20-40% 수크로스 구배 (1mM 트리스-HCl중의 수크로스, pH 9.0)로 적용시켰다. 구배를 4℃에서 50분간 13,000 rpm으로 벡크만 SW41 로우터로 원심분리하였다. 원심분리후, 바이러스 입자를 함유하는 분리밴드는 밴드상의 용적을 빨아낸 후 피펫팅에 의해 수집하였다. 수득된 수크로스 용액은 3 용적의 PBS로 희석하고 바이러스 입자를 원심분리에 의해 다시 침전시켰다 (벡크만 SW 27/28, 4℃, 13,500 rpm에서 60분). 주로 순수한 바이러스 입자로 구성된 펠렛은 PBS중에 재현탁하고 평균 1-5×109IU/ml에 해당하는 바이러스 농도로 평행화시켰다. 정제된 바이러스 주 용액은 -80℃에서 저장하고 직접적으로 사용하거나 또는 다음 실험을 위해 PBS로 희석하였다.
1.3 MVA 바이러스의 클로닝
동종의 주 바이러스 제제를 제조하기 위해 Prof. Anton Mayr로부터 수득한 MVA 바이러스는 96-웰 조직 배양 플레이트상에 배양된 CEF중에 3개회의 연속 통과도중에 희석을 제한함으로써 클로닝하였다. MVA 클론 F6을 선택하고 CEF중에 증식하여 본 특허출원에서 기술된 재조합 MVA 바이러스의 생산용 출발물질로서 뿐만 아니라 전술한 재조합 MVA바이러스의 생산용 출발물질로서 작용하는 바이러스의 실시 주를 얻었다 (Sutter, G. 및 Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89, 10847-10851; Sutter, G., Wyatt. L., Foley, P., Bennink, J. 및 Moss, B. [1994] 백신 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. 및 Lifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741-3752).
2. 재조합 MVA바이러스의 제작 및 특성화
2.1 벡터 플라스미드의 제작
재조합 MVA 바이러스를 생산하기 위하여 신규의 벡터 플라스미드를 제작하였다. MVA게놈내에 외래유전자의 삽입은 MVA게놈내의 자연 발생 결실부Ⅱ에 정확하게 표적화하였다. MVA 게놈의 HindⅢ N 프라그먼트에서 2500-bp 결실부위에 프랭킹하는 MVA DNA의 서열(Altenburger, W., Suter, C.P. 및 Altenburger, J. [1989], L. Arch. Virol. 105, 15-27)은 PCR로 증식하고 플라스미드 pUC18의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다. 좌측 600-bp DNA 프랭크에 대한 프라이머는 5'-CAG CAGGGT ACCCTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' 및 5'-CAG CAGCCC GGGTAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3'(억제효소 Kpnl 및 Smal의 부위는 밑줄로 표시함)이었다. 우측 550-bp DNA 프랭크에 대한 프라이머는 5'-CAG CAGCTG CAGGAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' 및 5'-CAG CAGGCA TGCCGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3'(억제효소 Pstl 및 Sphl의 부위는 밑줄로 표시함)이었다. pUC18에 삽입된 MVA DNA의 프랭크들사이에 백시니아 바이러스 말기 프로모터 P11의 조절하에 Escherichia coli lacZ 유전자(pⅢ LZ, Sutter, G. 및 Moss, B. [1992] PNAS 미국 89, 10847-10851로부터 억제분해에 의해 제조함)는 BamHI부위를 사용하여 삽입시켜 MVA 삽입 벡터 pUCⅡLZ를 생산하였다 (제 1 도). 다음에서 클로닝용 Smal 부위와 함께 백시니아 바이러스 초기-말기 프로모터 P7.5를 함유하는 289 bp 프라그먼트(플라스미드 벡터 pSCⅡ로부터 EcoRl 및 Xbal과의 억제분해에 의해 제조함[Chakrabarti 등 1985, 분자 및 세포 생물학 5, 3403-3409])는 pUCⅡ LZ의 Smal부위에 삽입하여 MVA 벡터 pUC Ⅱ LZ P7.5를 얻었다 (제 2 도). 리포터 효소 β-갈락토시다제의 일시적 합성에 의해 재조합 MVA바이러스를 분리시키는 벡터 플라스미드를 제작하기 위해서 이. 콜라이 LacZ 개방 해독 프레임의 3'-말단으로부터 330 bp DNA 프라그먼트는 PCR로 증식하고 (프라이머는 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' 및 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3'이었음), pUC Ⅱ LZ P7.5의 SalⅠ 및 PstⅠ부위로 클로닝하여 MVA 벡터 pUC Ⅱ LZdel P7.5를 얻었다 [제 3 도]. Sma1을 사용하면, 이 벡터 플라스미드는 MVA 게놈내로 백시니아 바이러스 프로모터 P7.5의 전사 조절하에 외래 유전자를 엔코딩하는 DNA 서열을 삽입하기 위해 사용하였다. 원하는 재조합 바이러스가 β-갈락토시다제 활성의 표현을 위해 스크리닝하여 분리한 후, 재조합 바이러스의 추가의 전개는 동종의 재조합에 의한 재고안된 P11-LacZ 표현 카셋트의 자기-결실부를 생기게 한다.
2.2 재조합 바이러스 MVA T7폴의 제작 및 특성화
백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 전체 유전자를 함유하는 3.1 kbp DNA 프라그먼트는 플라스미드 pTF7-3으로부터 EcoRI로 절제하고(Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. 및 Moss, B., 1986, P.N.A.S. 미국 83, 8122-8126), Klenow DNA 폴리머라제로 배양에 의해 변형시켜 무딘 말단부를 만들고, pUCII LZ의 독특한 Smal 억제 부위로 크론닝하여 플라스미드 전이 벡터 pUCII LZ T7폴을 만든다 (제 4 도). T7 RNA 폴리머라제 유전자의 표현을 위한 전사조절제로서 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5를 선택하였다. 더 강력한 백시니아 바이러스 말기 프로모터(예: P11)과 상이하게, 이 프로모터 시스템은 표적세포의 감염 직후에 재조합 유전자를 표현시킨다. MVA 게놈의 결실부Ⅱ내에 외래 유전자의 삽입을 지시하는 플라스미드 pUCⅡ LZ T7폴은 재조합 바이러스 MVA T7폴을 생산하기 위해 사용하였다.
세포당 0.05 TCID50의 다중도에서 MVA로 감염된 CEF세포는 전술한 바와같이 플라스미드 pUCII LZ폴의 DNA로 트랜스팩트화하였다(Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. 및 Moss, B. (1994) 백신 12, 1032-1040). T7 RNA 폴리머라제를 표현하고 β-D-갈락토시다제(MVA P7.5-T7pol)를 함께 표현하는 재조합 MVA바이러스는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 β-D-갈락토시다제 (300 ㎍/㎖)로 오염된 CEF 세포중에 연속 5회의 플라그 정제에 의해 선택하였다. 그후, 재조합 바이러스는 CEF 단일층의 감염에 의해 증식하고, DNA는 바이러스 주의 유전학적 균질성을 확인하기 위해 PCR로 분석하였다. MVA-T7폴 바이러스성 DNA의 남방향 오염 분석은 MVA 게놈내의 결실부위Ⅱ에서 재조합 유전자의 안정한 융합을 입증하였다(제 5 도).
바이러스로부터 재조합 MVA T7폴 [35S]메티오닌-라벨된 폴리펩티드에 의해 T7 RNA 폴리머라제의 표현을 조사하기 위해, 감염된 조직 배양물을 분석하였다. 12-웰 플레이트내에서 성장한 원숭이 신장 세포라인 CV-1의 단일층은 세포당 20 TCID50의 다중도에서 바이러스로 감염시켰다. 감염후 3 내지 5시간에서 배지를 제거하고, 배양물을 1ml의 메티오닌 유리배지로 한 번 세척하였다. 각웰에 50 μCi의 [35S]메티오닌으로 보충된 0.2 ml의 메티오닌 유리배지를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양시켰다. 감염된 세포의 세포질 추출물은 37℃에서 10분간 0.2ml의 0.5%Nonidet P-40 용해 완층제중에 각웰을 배양시켜 제조하고, 샘플은 SDS-PAGE로 분석하였다. MVA T7폴로 CV-1 세포의 대사라벨화는 두 개의 추가 폴리펩티드의 합성을 나타낸다: (i) 재조합 바이러스를 스크리닝하기 위해 함께 표현된 이. 콜라이 β-갈락토시다제를 표시하는 약 116,000 Da의 단백질 및 (ii) 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 예상된 크기를 갖는 98,000 Da 단백질 (제 6 도). MVA T7폴로 만든 대량의 β-갈락토시다제는 현저하다. 생체내 라벨화 실험으로부터의 결과는 MVA 게놈의 이 부위에 삽입되었을 때 MVA 벡터 바이러스중의 재조합 유전자가 더 효율적으로 표현될 수 있음을 나타내는 결실부 Ⅱ에서 MVA 게놈내로 삽입되었을 때 P11-LacZ 유전자 구조물의 매우 강한 표현을 입증한다.
WR-T7폴l 재조합 바이러스 vTF7-3(Fuerst등, 1986)에 비하여 표현시스템으로서 MVA-T7폴 재조합 바이러스의 유용성은 pTM1 (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., 및 Fuerst T.R. (1990) Nature 348, 91-92)으로부터 유도되며 또한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 (PT7)의 조절하에 이. 콜라이 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 (CAT) 유전자를 포함하는 (pTM1 다중 클로닝 부위의 Ncol 및 BamH1부위에 클로닝된) 플라스미드 벡터의 DNA의 코-트랜스팩션에 의해 시험하였다. 트랜스팩트화 및 감염된 CV-1세포는 0.2ml의 0.25M 트리스-HCl (pH 7.5)중에 현탁하였다. 3회 냉동-용해 사이클후, 용해물은 원심분리에 의해 세척하고, 상등액의 단백질 함량을 측정하고, 0.5, 0.25, 0.1㎍ 총 단백질을 함유하는 샘플은 Mackett, M., Smith, G.L. 및 Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864에 기술된 바와같이 효소활성을 평가하였다. 오토라디오그라피 후, 라벨화된 스폿은 Fuji 영상 분석 시스템을 사용하여 정량하였다. 그 결과는 고도로 약독화된 백시니아 벡터 MVA를 사용함으로써 완전 복제-경쟁 백시니아 바이러스 재조합을 사용함에 의해 효율적으로 백시니아 바이러스-T7 RNA 폴리머라제 시스템을 이용할 수 있다 (제 7 도).
2.3 재조합 바이러스 MVA-LAI네프의 제작 및 특성화
HIV-1 LA1의 전체 네프 유전자를 함유하는 648bp DNA 프라그먼트는 플라스미드 DNA로부터 PCR에 의해 제조하며 (M.-P. Kieny, Transgene S. A., Strasbourg에 의해 친절하게 제공된 pTG1166; PCR 프라이머는 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' 및 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'이었다), 억제 엔도뉴클레아제 BamH1으로 분해하고, Knenow DNA 폴리머라제로 배양시켜 변형하여 무딘 말단부를 생성시키고, pUCⅡ LZdel P7.5-LAInef의 Smal 부위에 크로닝하여 pUCⅡ LZdel P7.5-LAInef의 벡터를 만든다 [제 8 도]. 이 플라스미드는 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 HIV-1 LAI의 네프 유전자를 표현하는 MVA재조합 바이러스를 고안하는데 사용하였다.
세포당 0.05 TCID50의 다중도에서 MVA로 감염된 CEF 세포는 전술한 바와같이 플라스미드 pUC Ⅱ LZdel P7.5-LAInef의 DNA로 트랜스팩트화된다 (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. 및 Moss, B. [1994] 백신 12, 1032-1040). 네프 유전자를 함유하며 이. 콜라이 LacZ 마커 유전자를 일시적으로 함께 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토사이드(300㎍/㎖)로 오염된 CEF세포의 연속회의 플라그 정제에 의해 선택하였다. 다음에서 네프 유전자를 함유하며 LacZ 마커 유전자를 삭제한 재조합 MVA 바이러스는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토사이드(300㎍/㎖)의 존재하에 CEF 세포의 비-오염 바이러스성 환부를 스크린하는 3회 연속적인 추가 프라그 정제에 의해 분리하였다. 그후, 재조합 바이러스는 CEF단일층의 감염에 의해 증식하고 MVA-LAI네프 바이러스성 DNA는 PCR로 분석하여 바이러스 주의 유전학적 균질성을 화인하였다. 바이러스성 DNA의 남방향의 무딘 분석은 MVA-LAI네프의 유전학적 안정성을 확인하였으며 또한 바이러스성 게놈내에서 결실부Ⅱ에서 이. 콜라이 LacZ 마커유전자의 결실 및 네프 유전자의 융합을 정밀하게 입증하였다.
재조합 네프 단백질의 효과적인 표현은 HIV-1네프에 대한 마우스 모노크로날 항체를 사용하여 MVA-NAI네프로 감염된 CEF세포로부터 단백질 용해물의 서방향 오염분석에 의해 확인하였다 (K. Krohn에 의해 친절하게 제공되고 또한 Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G., 및 Krohn, K. [1992] AIDS 6, 25-34에 기술된 바와같이 사용함).
2.4 재조합 바이러스 MVA-hTYR의 제작 및 특성화
인간 티로시나제를 엔코딩하는 전체유전자를 함유하는 1.9 kb DNA 프라그먼트 (환자 SK29 (AV), GenBank Acc. no. UO1873의 멜라노메 세포 라인 SK29-MEL로부터 분리된 티로시나제 c-DNA 클론 123.B2; Brichard, V., Van Pel, A., Wolfel, T., Wolfel, C., De Plaen, E., Lethe, B., Coulie, P., 및 Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489-495]는 EcoRI 분해에 의해 플라스미드 pcDNA/Amp-Tyr(Wolfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Buschenfelde, K. 및 Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759-764]로부터 제조하며, Klenow DNA 폴리머라제로 배양시켜 변형하여 무딘 말단부를 생성시키고, pUCⅡ LZdel P7.5의 Smal 부위에 크로닝하여 벡터 pUCⅡ LZdel P7.5-TYR을 만든다 [제 9 도]. 이 플라스미드는 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 조절하에 인간 티로시나제 유전자를 표현하는 MVA재조합 바이러스를 고안하는데 사용하였다.
세포당 0.05 TCID50의 다중도에서 MVA로 감염된 CEF 세포는 전술한 바와같이 플라스미드 pUC Ⅱ LZdel P7.5-TYR의 DNA로 트랜스팩트화된다 (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. 및 Moss, B. [1994] 백신 12, 1032-1040). 인간 티로시나제용 유전자를 안정되게 표현하며 이. 콜라이 LacZ 유전자를 일시적으로 함께 표현하는 재조합 MVA 바이러스는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토사이드(300㎍/㎖)로 오염된 CEF세포의 연속회의 플라그 정제에 의해 선택하였다. 다음에서 인간 티로시나제를 엔코딩하는 유전자를 표현하며 LacZ 마커 유전자를 결실하는 재조합 MVA 바이러스는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토사이드(300㎍/㎖)의 존재하에 CEF 세포의 비-오염 바이러스성 환부를 스크린하는 3회의 연속적인 추가 프라그 정제에 의해 분리하였다. 그후, 재조합 바이러스는 CEF단일층의 감염에 의해 증식하고 MVA-hTYR 바이러스성 DNA는 PCR로 분석하여 바이러스 주의 유전학적 균질성을 확인하였다. 바이러스성 DNA의 남방향의 무딘 분석은 MVA-hTYR의 유전학적 안정성을 확인하였으며 또한 바이러스성 게놈내의 결실부Ⅱ에서 이. 콜라이 LacZ 마커유전자의 절제 및 재조합 티로시나제 유전자의 융합을 정밀하게 입증하였다.
재조합 인간 티로시나제의 효과적인 표현은 티로시나제에 대하여 (V. Hearing에 의해 친절하게 제공되고 또한 Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. 및 Hearing V. [1988] P.N.A.S. 미국 85, 3830-3834) AIDS 6, 25-34에 기술된 바와같이 사용함) 또는 마우스 모노크로날 항체(L. Old에 의해 친절하게 제공되고 또한 Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. 및 Old, L. [1995] P.N.A.S. 미국 92, 8125-8129에 기술된 바와같이 사용함)를 사용하여 MVA-hTYR로 감염된 CEF세포로부터 단백질 용해물의 서방향 오염분석에 의해 확인하였다.
서열리스트
(1) 일반정보
(i) 출원인
(A) 성명 : GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundheit
GmbH
(B) 스트리트: 인골스태드터 랜드스트리트 1, 뉴헤르베르그
(C) 시티 : 오버쉬라이쉬하임
(E) 국가 : 독일
(F) 우편번호(ZIP): 85764
(ii) 발명의 명칭 : 재조합 MVA 바이러스, 및 그의 용도
(iii) 서열 번호 : 8
(iv) 컴퓨터 해독형태:
(A) 배지유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 컴패터블
(C) 조작시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 파턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(vi) 선출원데이타
(A) 출원번호 : DK 0782/95
(B) 출원일자 : 1995년 7월 4일
(2) SEQ. ID NO: 1에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 1
CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC
(2) SEQ. ID NO: 2에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 42 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 2
CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA
(2) SEQ. ID NO: 3에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 36 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 3
CAGCAGCTGC' AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC
(2) SEQ. ID NO: 4에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 36 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 4
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA
(2) SEQ. ID NO: 5에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 5
CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GTC
(2) SEQ. ID NO: 6에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 6
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG
(2) SEQ. ID NO: 7에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 7
CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT
(2) SEQ. ID NO: 8에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 사슬의 수 : 단일
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 기타 핵산
(A) 기술형 : /데스크 = "DNA-프라이머"
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 8
CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG

Claims (28)

  1. MVA개놈내의 자연 발생 결실부위에 삽입된 적어도 하나의 외래유전자를 함유하며 또한 이를 표현할 수 있는 재조합 MVA 바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, MVA 게놈내의 결실부Ⅱ에 삽입된 적어도 하나의 외래 유전자를 함유하며 또한 이를 표현할 수 있는 재조합 MVA 바이러스.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 외래 유전자가 마커, 치료제 또는 항원성 결정인자를 암호화하는 재조합 MVA 바이러스.
  4. 제 3 항에 있어서, 외래 유전자가 병원성 바이러스, 박테리아 또는 다른 미생물로부터 또는 기생체 또는 종양세포로부터 항원성 결정인자를 암호화하는 재조합 MVA 바이러스.
  5. 제 4 항에 있어서, 외래 유전자가 플라스모듐 팔시파룸, 미코박테리아, 헤퍼스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 간염 또는 인간 면역결핍 바이러스로부터 항원성 결정인자를 암호화하는 재조합 MVA 바이러스.
  6. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, 항원성 결정인자가 HIV 네프 또는 인간 티로시나제인 재조합 MVA 바이러스.
  7. 제 6 항에 있어서, MVA-LAI네프 또는 MVA-hTYR인 재조합 MVA 바이러스.
  8. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 외래 유전자가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 재조합 MVA 바이러스.
  9. 제 8 항에 있어서, MVA-T7폴인 재조합 MVA 바이러스.
  10. 제 1 항 내지 9 항중 어느 하나에 있어서, 외래 유전자가 백시니아 바이러스 초기/말기 프로모터 P7.5의 전사조절하에 있는 재조합 MVA 바이러스.
  11. 제 1 항 내지 10 항중 어느 하나에 있어서, 인간세포중에 복제될 수 있는 바이러스가 거의 없는 재조합 MVA 바이러스.
  12. T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 DNA서열의 전사를 위한 제 8 항 또는 9 항에 따른 재조합 MVA 바이러스의 용도.
  13. 제 1 항 내지 11 항중 어느 하나에 따른 재조합 MVA 바이러스에 의해 감염된 진핵세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 제 8 항 또는 9 항에 따른 재조합 MVA 바이러스에 의해 감염된 세포.
  15. 제 14 항에 있어서, T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 하나 이상의 외래 유전자를 운반하는 하나 이상의 표현벡터를 추가로 함유하는 세포.
  16. a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 외래 유전자에 의해 엔코드화된 폴리펩타이드를 분리시킴을 포함하는 상기 외래 유전자에 의해 엔코드화된 폴리펩타이드를 제조하기 위한 제 15 항에 따른 세포의 용도.
  17. 제 14 항에 있어서, 바이러스성 유전자를 운반하는 표현벡터, 및/또는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 바이러스성 벡터의 게놈을 엔코딩하는 바이러스성 벡터 구조물을 추가로 함유하는 세포
  18. a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 바이러스성 입자를 분리시킴을 포함하는 바이러스성 입자를 제조하기 위한 제 17 항에 따른 세포의 용도.
  19. 제 14 항에 있어서, a) 레트로바이러스성 벡터 구조물에 의해 운반된 하나 이상의 외래유전자의 표적세포에서의 표현을 지시 감염할 수 있는 레트로바이러스성 벡터구조물을 운반하는 표현벡터, 및 b) T7 RNA 폴리머라제의 전사조절하에 팩키지화될 레트로바이러스성 벡터구조물의 게놈에 요구되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 운반하는 하나 이상의 표현벡터를 추가로 함유하는 세포.
  20. a) 세포를 적절한 조건하에 배양시키고, b) 레트로바이러스성 입자를 분리시킴을 포함하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 제 19 항에 따른 세포의 용도.
  21. 생리학적으로 허용되는 담체중에 제 3 항 내지 7 항중 어느 하나에 따른 재조합 MVA 바이러스를 함유하는 백신.
  22. 백신의 제조를 위한 제 3 항 내지 7 항중 어느 하나에 따른 재조합 MVA 바이러스의 용도.
  23. 백신을 가진 인간을 포함한 살아있는 동물체의 접종을 포함하는, 인간을 포함한 살아있는 동물체의 면역을 위한 제 21 항에 따른 백신의 용도.
  24. HIV 감염 또는 AIDS의 예방 또는 치료를 위한 MVA-LAI네프를 함유하는 제 21 항에 따른 백신의 용도,
  25. 멜라노마스(흑색종)의 예방 또는 치료를 위한 MVA-hTYR을 함유하는 제 21 항에 따른 백신의 용도.
  26. 제 1 성분으로서 제 8 항 또는 9 항에 따른 재조합 MVA 바이러스를 생리학적으로 허용되는 담체중에 함유하고 또한 제 2 성분으로서 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 전사조절하에 항원성 결정인자를 DNA 서열을 생리학적으로 허용되는 담체중에 함유하며, 상기 두성분이 함께 또는 분리되게 함유하는 백신.
  27. 백신의 상기 제 1 성분 및 제 2 성분을 동시에 또는 일정한 시간 간격으로 동일접종 부위를 사용하여 인간을 포함한 살아있는 동물체의 접종을 포함하는, 인간을 포함한 살아있는 동물체의 면역화를 위한 제 26 항에 따른 백신의 용도.
  28. 제 26 항에 따른 백신의 제조를 위한 제 8 항 또는 9 항에 따른 재조합 MVA 바이러스의 용도.
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