UA68327C2 - A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals - Google Patents

A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals Download PDF

Info

Publication number
UA68327C2
UA68327C2 UA97126424A UA97126424A UA68327C2 UA 68327 C2 UA68327 C2 UA 68327C2 UA 97126424 A UA97126424 A UA 97126424A UA 97126424 A UA97126424 A UA 97126424A UA 68327 C2 UA68327 C2 UA 68327C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
mma
virus
recombinant
gene
fact
Prior art date
Application number
UA97126424A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Gsf Forschungszentrum Fur Unwe
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8097499&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA68327(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gsf Forschungszentrum Fur Unwe filed Critical Gsf Forschungszentrum Fur Unwe
Publication of UA68327C2 publication Critical patent/UA68327C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Опис винаходу
Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що походить від модифікованого 2 вірусу коров'ячої віспи Анкара (ММА), а також містить та здатний експресувати чужорідні гени, що вбудовані до сайту природної делеції у геномі ММА; до використання таких рекомбінантних вірусів ММА для продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або вірусних векторів для генної терапії; та до використання вказаних рекомбінантних вірусів ММА, що кодують антигени, у якості вакцин.
Метою даного винаходу є отримання рекомбінантного вірусу ММА, який може бути використаний у якості 70 ефективного та абсолютно безпечного експресійного вектору.
Іншою метою даного винаходу є розробка простого, ефективного та безпечного способу продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, а також отримання рекомбінантних вірусів для виготовлення вакцин, та вірусних векторів для використання у генній терапії.
Ще однією метою даного винаходу є отримання експресійної системи на основі рекомбінантного вірусу ММА, 12 що експресує РНК-полімеразу 77; та розробка способів продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або генерування вірусних векторів для використання у генній терапії, або виготовлення вакцин на основі вказаної експресійної системи.
Вірус коров'ячої віспи, що належить до роду Ортопоксвірусів родини Поксвірусів, був використаний у якості живої вакцини для імунізації людини у цілях продукування в нього імунітету проти натуральної віспи. (Те діора! егадісайоп ої втаїйрох. Ріпа! герой ої (Ше діора! соттівзвіоп бог їйе сегійісайоп ої зтаїрох егадісайноп. Нівіогу ої Рибріїс Неакй, Мо4, Сепема: МУУог4 Неайй Огдапігайоп, 1980). З часу підписання декларації ВОЗ (Всесвітня організація охорони здоров'я, М/ІНО) загальна вакцинація була зупинена, за виключенням людей з високим ризиком зараження поксовірусом (наприклад, лаборантів).
Пізніше віруси коров'ячої віспи були також використані для конструювання вірусних векторів, що були с призначені для експресії рекомбінантних генів та для можливого їх застосування в якості живих вакцин Ге) (Маскей, М., тій, О.І, Мозз, В., 1982, Р.М.А.5., ОБА 79, 7415-7419; Зтіфй, О.Ї., Маскеї, М. 5 Мозгв, В., 1984,
ВіоФесппоіїоду 5 Сепеїйїс Епдіпеегіпд Кеміемув, 2, 383-407). Це дає можливість отримати ДНК-послідовності (гени), що кодують чужорідні антигени та вбудовані, за допомогою техніки рекомбінантних ДНК, до геному вірусу коров'ячої віспи. Якщо ген інтегрується в сайт вірусної ДНК, що не має вирішального значення для життєвого в циклу вірусу, тоді знову рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що продукується, може бути інфекційним, тобто с він може інфікувати чужорідні клітини, в результаті чого буде експресуватися інтегрована ДНК-послідовність (Європейські патентні заявки МоМо 83286 та 110385). Отримані таким чином рекомбінантні віруси коров'ячої віспи о можуть бути використані, з однієї сторони, в якості живих вакцин для профілактики інфекційних захворювань, с та, з іншої сторони, в якості матеріалу для продукування гетерологічних білків в еукаріотичних клітинах. 3о Продукування рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що експресує ген РНК-полімерази бактеріофагу 17, ее, дозволяє отримати експресійну систему, яка може широко використовуватися для синтезу рекомбінантних білків у клітинах ссавців (Мов5, В., ЕІгоу-Зіеіп, О., Мігикаті, Т., АІехапдег, МУ.А., ЕРцегві, Т.К., 1990, Маїциге 348, 91-92). Всі методи експресії рекомбінантного гену передбачають синтез РНК-полімерази 77 у цитоплазмі « еукаріотичних клітин. При цьому, найбільш часто використовується схема тимчасової експресії (Ецегві, Т.К., З
Міевз, Е.О., зіцаіег, Е.МУ. 5. Мозв, В., (1986) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА, 83, 8122-8126, та заявка на патент США с Мо7648971). Спочатку потрібний чужорідний ген вбудовують до плазміди під контроль промотору гену
Із» РНК-полімерази 17. Потім, використовуючи стандартну техніку трансфекції, цю плазміду вводять до цитоплазми клітин, інфікованих рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, що продукує РНК-полімеразу 17.
Ця схема трансфекції є досить простою, оскільки вона не потребує створення нових рекомбінантних вірусів, 49 тадотогож є дуже ефективною, оскільки вона дозволяє отримати більше 8095 клітин, що експресують потрібний б ген (ЕІгоу-5Зіеіп, ОО. 55 Мовзв, В. (1990) Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 87, 6743-6747). Перевагу "вірус коров'ячої
Ге | віспи//7-РНК-полімераза" - гібридної системи, у порівнянні з іншими системами з тимчасовою експресією, полягає, вірогідно, в її незалежності від транспорту плазмід до ядра клітини. Раніше цю систему о використовували виключно в аналітичних цілях у вірусології та мікробіології (Виопосоге, Ї. й Козе, У.К. (1990) ка 20 Машге 345, 625-628, Райпаїк, А.К. апа УУегі2, С.МУ. (19911 Ргос. Май. Асад. Зсі. ОА, 88, 1379-1383,
Кагепіп, А., Аїуаг, у., Соціп, А., Юамідзоп, М. апа Іевіег, Н.А. (1991| РЕВ5 Їейф, 278, 229-233, Но, В.У., "м Кагепіп, А., Каутопа, .-., Вгапспек, Т., Іевіег, Н.А. апіа ЮОаміазоп, М. (1992)| РЕВ5 Іейкф., 301, 303-306,
Висппої2, С.)., КеїлЛег С, Нотапп, Н.Е. апа Мецбегі, МУ.). (19941 Мігоіоду, 204, 770-776). Однак у майбутньому можливі важливі зміни гібридної системи "вірус коров'ячої віспи/(РНК-полімераза Т7", наприклад для 29 продукування рекомбінантних білків або рекомбінантних вірусних частинок у цілях розробки нових
ГФ) терапевтичних або профілактичних методів у медицині, можуть зіштовхнутись з певними труднощами, що юю зумовлені продуктивною реплікацією рекомбінантного вектору, отриманого на основі вірусу коров'ячої віспи.
Вірус коров'ячої віспи є інфекційним для людини, та іноді, після вакцинації, що проводилась у якості профілактичної міри по боротьбі з натуральною віспою, у вакцинованих людей спостерігались серйозні 60 ускладнення. Найбільш повний опис випадків ускладнень після вакцинації людей приводиться у Національному звіті США, що висвітлює спостереження за вакцинацією близько 12 мільйонів людей, що була проведена з використанням вакцини, отриманої на основі штаму Нью-Йоркського місцевого департаменту охорони здоров'я (Мем ЖМогкК Сйу Воага ої Неаїййй) вірусу коров'ячої віспи (Гапе, У., Кибреп, ЕР., Мей, 9. апа Мійаг, 9. (1969)
Мем Епаї. У. Мед., 281, 1201-1208). Тому, багатообіцяюча можливість використання вірусу коров'ячої віспи в бо якості вектору для виготовлення живих вакцин зіштовхується з проблемою безпеки та регламентації застосування цього вірусу. Окрім того, більшість рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, що описані у літературі були отримані на основі штаму УУезіегп Кезегме вірусу коров'ячої віспи. З іншої сторони, відомо, що цей штам має високий ступінь нейровірулентності, а тому він є малопридатним для введення людині та
Тваринам (Могіга еї аі!., Массіпе 5, 65-70 (19871).
Ризик для здоров'я людини або тварин, пов'язаний із застосуванням вказаного вірусу в якості вектору, може бути знижений шляхом використання у високому ступені атенуйованого (послабленого) штаму вірусу коров'ячої віспи. Декілька таких штамів вірусу коров'ячої віспи були спеціально розроблені для знищення небажаних побічних ефектів, що з'являлись у результаті вакцинації проти віспи. Так, наприклад, модифікований вірус 7/0 Коров'ячої віспи Анкара (ММА) був отриманий шляхом тривалого серійного пасування штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (СМА) на фібробластах куриних ембріонів (див. огляд Мауг, А., Носпвіеіп-Міпіге!ї, М. апа
ЗІсСКІ, Н. (19751 Іптесіоп З, 6-14; патент Швейцарії Мо568392). Вірус ММА був депонований, у відповідності з вимогами Будапештського договору, в СМСМ (Інститут Пастера, Національна колекція мікроорганізмів, 25 ге ди
Босіецг Коих, 75724 Рагіз Седех 15) 15 грудня 1987р. під номером допуску Мо1-721. Модифікований вірус ММА 7/5 Відрізняється своїм б високим ступенем послабленості, тобто він має знижену вірулентність або інфекційність, зберігаючи при цьому гарну імуногенність. Вірус ММА був проаналізований для того, щоб визначити, які саме зміни є в його геномі у порівнянні з вірусом дикого типу СМА. В результаті цього аналізу були ідентифіковані шість головних делецій у генній ДНК (делеції І, І, ПШ, ІМ, М та МІ), всього 31000 пар основ (Меуег, Н.,
ЗцЧег, б. апа Мауг А. (1991) У. Сеп. Мігоі.,, 72, 1031-1038). У своєму колі хазяїв вірус, що був отриманий, 2о чітко обмежений лише клітинами птахів. Окрім того, ММА відрізняється своєю крайньою послабленістю.
Дослідження на різних тваринах показали, що вірус ММА є авірулентним навіть у тварин з послабленим імунітетом. Та ще важливіше, що штам ММА має чудові властивості, які були продемонстровані у широкомасштабних клінічних іспитах (Мауг еї аІ., 2БІ. Вакї Нуд. Її, АБ Ого. В 167, 375-390 (1987), 5сКІ еї аіІ., Оі8сп. тей. УУзспг., 99, 2386-2392 |19741Ї). Обстеження вище 120000 чоловік, вакцинованих вірусом ММА, сч об показали, що у цих пацієнтів, включаючи пацієнтів з підвищеним ризиком зараження, були відсутні будь-які побічні ефекти. і)
Було винайдено, що реплікація ММА у клітинах людини блокується на пізній стадії інфікування, що сприяє попередженню зборки зрілих інфекційних віріонів. Однак ММА здатний експресувати вірусні та рекомбінантні гени на високому рівні навіть у непермесивних клітинах, в результаті чого було запропоновано, що вірус ММА М зо Може служити в якості ефективного та безпечного вектору експресії генів (ЗуКег, б. апа Мозз, В. (19921 Ргос.
Маї). Асад. Зсі. ОБА, 89, 10847-10851). Нещодавно були розроблені нові системи векторів на основі вірусу ММА, с що має чужорідні ДНК-послідовності, які вбудовані до сайту делеції в геномі ММА або в гені ТК (Зибег, 0. та с
Мозз, В (1995) Оеу. Віої. (апа. Вазеї, Кагодег, 84,195-200 та патент США Мо5185146).
Для подальшого більш перспективного використання ММА, були проведені дослідження для розробки нових со
Зб Можливих шляхів введення чужорідних генів до штаму ММА вірусу коров'ячої віспи з використанням техніки «о рекомбінантних ДНК. Оскільки зміна геному вірусу ММА не була метою цих досліджень, то необхідно було використати цей метод, який відповідав би цим цілям. У відповідності з даним винаходом, була здійснена рекомбінація шляхом вбудовування чужорідної ДНК-послідовності до вірусної ДНК точно в сайт натуральної делеції, що є в геномі ММА. «
Даний винахід включає, іпіег аа, до свого об'єму (окремо або в комбінації): в с рекомбінантний вірус ММА, що містить та здатний експресувати принаймні один чужорідний ген, вбудований до сайту природної делеції в геномі ММА; ;» вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, що містить та здатний експресувати принаймні один чужорідний ген, вбудований до сайту делеції ІІ у геномі ММА; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген кодує маркер, терапевтичний агент або б антигенну детермінанту; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту патогенного со вірусу, бактерії або іншого мікроорганізма, паразиту або пухлинної клітини; 2) вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту Ріазтоадійт
Еаїсірагот, мікробактерій, вірусу герпесу, вірусу грипу, вірусу гепатиту, або вірусу імунодефіциту людини; ю вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому антигенною детермінантою є пеї ВІЛ або тирозиназа
І людини; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, яким є ММА-І АІпеї або ММА-НТУК; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген кодує РНК-полімеразу 17; 5Б вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, яким є ММА-ро! 17; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген знаходиться під транскрипційним
Ф) контролем раннього/пізнього промотору р7.5 вірусу коров'ячої віспи; ка вищевказані рекомбінантні віруси ММА, які в основному не здатні реплікуватися у клітинах людини; використання вищевказаного рекомбінантного вірусу ММА для транскрипції ДНК-послідовностей під во транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17; еукаріотична клітина, інфікована будь-яким з вищевказаних рекомбінантних вірусів ММА; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА, в якому чужорідний ген кодує
РНК-полімеразу 17; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА, в якому чужорідний ген кодує 65 РНК-полімеразу Т7, та містить, окрім того, один або декілька експресійних векторів, що несуть один або декілька чужорідних генів під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17;
використання вищевказаних клітин для продукування поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА, в якому чужорідний ген кодує
РНК-полімеразу 177, та, окрім того, містить експресійні вектори, що несуть вірусні гени, та/або вірусну векторну конструкцію, кодуючу геном вірусного вектора під контролем транскрипційного промотору
РНК-полімерази 17; 70 використання вищевказаних клітин для продукування вірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення поліпептидів, що кодуються вказаними чужорідними генами; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА, в якому чужорідний ген кодує
РНК-полімеразу Т7, та, окрім того, містить 10 експресійні вектори, що несуть вірусні гени, та/або вірусну /5 векторну конструкцію, що кодується геном вірусного вектора під контролем транскрипційного промотора
РНК-полімерази 17; використання вищевказаних клітин для продукування вірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та б) виділення вірусних частинок; клітина, інфікована вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА, в якому чужорідний ген кодує
РНК-полімеразу 17, та, окрім того, містить: а) експресійний вектор, що несе ретровірусну конструкцію, що здатна інфікувати клітини-мішені та регулювати в цих клітинах-мішенях експресію одного або декількох чужорідних генів, присутніх у вказаній ретровірусній векторній конструкції; та сч б) один або декілька експресійних векторів, що несуть гени, які кодують поліпептиди, необхідні для геному о вказаної ретровірусної векторної конструкції, що підлягає упаковці під транскрипційний контроль промотору
РНК-полімерази 17; використання вищевказаних клітин для продукування ретровірусних частинок, що передбачає: а) культивування вказаних клітин у відповідних умовах; та М зо б) виділення ретровірусних частинок; вакцина, що містить вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому чужорідний ген кодує антигенну с детермінанту, у фізіологічно придатному носії; с використання вищевказаного рекомбінантного вірусу ММА, в якому чужорідний ген кодує антигенну детермінанту для отримання вакцини; со використання вищевказаної вакцини для імунізації живого організму тварини, включаючи людину; «о використання вищевказаної вакцини, що містить ММА-Г АІпеї, для попередження або лікування ВІЛ-інфекції або СНІДУ; використання вищевказаної вакцини, що містить ММА-ЯТУК, для попередження або лікування меланоми; вакцина, що містить у якості першого компоненту вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому « чужорідний ген кодує РНК-полімеразу 77, у фізіологічно придатному носії; та в якості другого компоненту - з с ДНК-послідовність, що несе антигенну детермінанту під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази
Т7, у фізіологічно придатному носії; при цьому два вказані компоненти присутні разом або окремо; ;» використання вищевказаної вакцини для імунізації живого організму тварини, включаючи людину, що передбачає інокуляцію вказаного живого організму тварини, включаючи людину, першим та другим компонентом вакцини чи одночасно, чи з певним інтервалом часу, з використанням одного й того ж сайту інокуляції; та
Ге» Термін "ген" означає ДНК-послідовність, яка кодує білок або пептид.
Термін "чужорідний ген" означає ген, вбудований до ДНК-послідовності, в якій цей ген звичайно відсутній. со Чужорідним геном може бути, наприклад, маркерний ген; терапевтичний ген; ген, що кодує антигенну 2) детермінанту; або вірусний ген. Ці гени добре відомі спеціалістам.
Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (ММА), що має обмежене коло хазяїв та є у вищому ступені ю атенуйованим штамом вірусу коров'ячої віспи, не здатний розмножуватись у клітинах людини та в досліджених "М клітинних лініях більшості інших ссавців. Однак, оскільки експресія вірусного гену не порушується в непермесивних клітинах, то у відповідності з даним винаходом, рекомбінантні віруси ММА можуть бути використані в якості абсолютно безпечних та ефективних експресійних векторів.
Рекомбінантні віруси ММА, що кодують антигенну детермінанту
В одному з варіантів здійснення даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу ММА коров'ячої віспи, (Ф, що містить ген, який кодує чужорідний антиген, переважно патогенний агент; та до вакцин, що містять вказаний ка вірус у фізіологічно прийнятній формі. Даний винахід також відноситься до способів отримання вказаного рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи ММА або вакцин на основі цього вірусу та до використання цих вакцин бор для профілактики інфекційних захворювань, викликаних вказаними патогенними агентами.
У переважному варіанті даного винаходу, чужорідним геном, що вбудований до вірусу ММА, є ген, що кодує пеї ВІЛ.
Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси ММА, які дозволяють здійснити експресію гену пеї ВІЛ-1 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Регуляторний білок Меї 65 лентивірусів приматів синтезується на ранній стадії реплікативного циклу вірусу; при цьому було показано, що цей білок грає важливу роль в реплікації вірусу з високим титром та індукуванні захворювань іп мімо. Це дозволяє передбачити, що пеї ВІЛ може грати вирішальну роль у патогенезі СНІДу. Молекулярні механізми, завдяки яким пеї сприяє збільшенню інфекційності та патогенності вірусу ВІЛ, потребують додаткового дослідження. Однак очевидно, що пеї є імуногенним, та пеї-специфічний антиген може бути використаний у якості вакцини проти ВІЛ-інфекції та СНІДУ.
У відповідності з цим очевидно, що, з однієї сторони, рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген пеї ВІЛ, може бути використаний у якості профілактичної вакцини проти ВІЛ для імунізації людини, а з іншої сторони, він може бути використаний для імунотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів або хворих на СНІД. Окрім того, рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген пеї ВІЛ, може бути використаний для продукування 7/0 рекомбінантного білка ВІЛ.
В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу чужорідним геном, вбудованим до вірусу ММА, є ген, що кодує тирозиназу людини.
Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси ММА, які дозволяють здійснити експресію гену тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Нещодавно /5 Тирозиназа людини була ідентифікована як меланомо-специфічний пухлинний антиген, який сприяє генеруванню протипухлинних цитолітичних Т-лімфоцитів (Вгіснага, М., еї аї., (1993) У. Ехр. Мед., 178, 489-495). Оскільки серед нормальних клітин, вірогідно, лише меланоцити експресують ген тирозинази, то очевидно, що тирозиназа є цінним антигеном-мішенню для імунотерапії меланоми. Тому рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний для продукування у пацієнтів, що страждають меланомою, імунної
Відповіді, яка стимулює відторгнення пухлини або попереджуючої появи метастазів. Рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний безпосередньо в якості вакцини проти меланоми, чи цей вірус може бути використаний для продукування рекомбінантного білка тирозинази, який може служити в якості антигену у вакцинних препаратах. В іншому прикладі, клітини, що взяті з пухлини пацієнта, можуть бути модифіковані іп мійго з використанням у якості вектору рекомбінантного вірусу ММА, що експресує ген сч г тирозинази людини, а потім модифіковані клітини, що експресують тирозиназу, переносять зворотно в організм пацієнта для індукування у нього протипухлинної імунної відповіді. Вакцина, отримана на основі і) рекомбінантного ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використана або парентерально, або місцево шляхом введення безпосередньо в область пухлини. Для попередження появи метастазів або для фенотипічної зміни пухлини, наприклад зміни її розмірів, форми, консистенції, васкуляризації або інших ознак, М зо вакцина, отримана на основі рекомбінантного вірусу ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути введена до, під час або після хірургічного видалення пухлини. с
Для виготовлення вакцин у відповідності з даним винаходом віруси коров'ячої віспи ММА готують у с відповідній фізіологічно прийнятній формі. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду отримання ММА-вакцин, призначених для противіспяної вакцинації (як описано ЗІсКІ, Н. еї аї., (1974| Сівси. тей. МУвснНг., 99, со 2386-2392). Для цього близько 10 6.108 частинок рекомбінантного ММА ліофілізують у 100мл забуференого Ге) фосфатом фізіологічного розчину (РВ5З) у присутності 295 пептону та 195 альбуміну людини в ампулі, переважно у скляній ампулі. Ліофілізат може містити наповнювачі (такі як маніт, декстран, цукор, гліцин, лактоза або полівінілпіролідон) або інші добавки (такі як антиоксиданти, стабілізатори т. ін.), які підходять для « парентерального введення. Потім скляну ампулу герметично запаюють, та ця ампула може бути залишена на 70 Зберігання протягом декількох місяців при температурі переважно -2076. - с Для вакцинації або терапії ліофілізат може бути розчинений у 0,1-0,5мл водного розчину, переважно ц фізіологічного розчину, та введений або парентерально, наприклад шляхом внутрішньом'язової інокуляції або "» локально, наприклад шляхом інокуляції у саму пухлину або в область локалізації пухлини. Вакцини або терапевтичні засоби даного винаходу переважно вводять шляхом внутрішньом'язової ін'єкції (Мауг, А. еї. аї., 5 ЩМ1978| 2Б5І. Вакб Нуа., І. АБС Огід. В, 167, 375-390). Спосіб, доза та схема введення можуть бути
Ге») оптимізовані власне фахівцем відомими способами. Для того щоб отримати відповідну імунну відповідь проти чужорідного антигену, бажано вводити вакцину декілька разів протягом тривалого періоду часу. со Використання вірусів ММА для продукування гетеро логічних поліпептидів оз У відповідності з даним винаходом рекомбінантні віруси коров'ячої віспи ММА можуть бути також використані для продукування гетерологічних поліпептидів в еукаріотичних клітинах. Для цього клітини інфікують ді рекомбінантними вірусами коров'ячої віспи. В інфікованих клітинах експресуються гени, що кодують чужорідний "І поліпептид, в результаті чого продукується гетерологічний поліпептид, який потім виділяють. Методи, що використовуються для продукування таких гетерологічних поліпептидів, добре відомі фахівцям (ЕР-А-206920 та
ЕР-А-205939). Поліпептиди, продуковані за допомогою рекомбінантних вірусів ММА, більше підходять, виходячи
З конкретних властивостей вірусів ММА, для використання у якості лікарських засобів для введення людині та тваринам.
Ф, Рекомбінантні віруси ММА, що кодують РНкК-полімеразу Т7, їх використання для експресії ко ДНК-послідовностей під контролем промотору РНК-полімерази 77
В іншому варіанті здійснення даного винаходу авторами винаходу були сконструйовані рекомбінантні віруси бо ММА, що дозволяють експресувати ген РНК-полімерази бактеріофага Т7 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Ефективність рекомбінантних вірусів ММА-рої! 17 у якості експресуючих систем оцінювали за допомогою аналізу методом короткочасної трансфекції для індукування експресії рекомбінантних генів під контролем промотору РНК-полімерази 17. Використовуючи в якості гена-репортера ген хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ) Е.соїї, автори винайшли, що ММА-рої! Т7-індукована експресія гену САТ 65 Є такою ж ефективною, як і експресія, індукована вірусом коров'ячої віспи/рої Т7, що походить від компетентного по відношенню до реплікації штаму МУК вірусу коров'ячої віспи.
Таким чином, гібридна система ММА-роЇ! Т7 даного винаходу може бути використана в якості простої, ефективної та безпечної експресійної системи для продукування поліпептидів у клітинах ссавців при відсутності вірусу коров'ячої віспи.
Ця експресійна система може бути також використана в цілях генерування рекомбінантних вірусних частинок для вакцинації або генної терапії шляхом трансформації клітинних ліній, які інфіковані рекомбінантним вірусом
ММА, що експресує РНК-полімеразу 17, тобто інфікованих ДНК-конструкцією, що містить усі або деякі гени, та геном або рекомбінантний геном, які необхідні для генерування вірусних частинок, наприклад, ММА-частинок або ретровірусних частинок під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17. 70 Векторні системи на основі ретровірусів складаються з двох компонентів: 1) першим компонентом є власне ретровірусний вектор, що представляє собою модифікований ретровірус (векторну плазміду), в якому гени, що кодують вірусні білки, були замінені терапевтичними генами та маркерними генами, які необхідні для введення у клітину-мішень, оскільки така заміна генів, що кодують вірусні білки, приводить до значного пошкодження вірусу, то цей вірус може бути "врятований" за допомогою 7/5 другого компоненту в системі, який доповнює відсутність вірусних білків у модифікованому ретровірусі; 2) другим компонентом є клітинна лінія, яка продукує великі кількості вірусних білків, але при цьому не має здатності продукувати компетентний по реплікації вірус. Така клітинна лінія відома як лінія клітин з дефектом упаковки та представляє собою клітинну лінію, трансфіковану однією або декількома плазмідами, що несуть гени (гени дад, роЇ та епу, що кодують поліпептиди), які забезпечують упаковку модифікованого 2о ретровірусного вектора.
Для генерування запакованого вектору, векторну плазміду трансфікують у лінію клітин з дефектом упаковки.
В цих умовах модифікований ретровірусний геном, що включає вбудовані терапевтичні та маркерні гени, транскрибується з векторної плазміди та упаковується в модифіковані ретровірусні частинки (рекомбінантні вірусні частинки). Потім цей рекомбінантний вірус використовують для інфікування клітин-мішеней, у ДНК яких сч ов Можуть інтегруватися геном вектора та будь-які присутні в ньому маркерні або терапевтичні гени. Клітина, що інфікована такою рекомбінантною вірусною частинкою, не може продукувати новий векторний вірус, оскільки в і) цих клітинах відсутні вірусні білки. Однак ДНК вектор, що несе терапевтичні та маркерні гени, інтегрується в
ДНК клітини, та може експресуватися в інфікованих клітинах.
У відповідності з даним винаходом, рекомбінантний вірус ММА, що експресує РНК-полімеразу 17, може бути М зо використаний для продукування білків, які необхідні для упаковки ретровірусних векторів. Для цього гени дад, рої, епм ретровірусу (наприклад, вірус лейкоза мишей (МІ М)) вміщують в один або декілька експресійних с векторів (наприклад, плазмід) під транскрипційний контроль промотору РНК-полімерази Т7, разом з с експресійним вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, можливо під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17. со
В'УО 94/29437, МО 89/11539 та УМО 96/07748 описані різні типи ретровірусних векторних конструкцій, які «о можуть бути упаковані з використанням системи для упаковки, яка описана вище.
Окрім того, рекомбінантний вірус ММА, що експресує РНК-полімеразу Т7, може бути використаний для продукування рекомбінантних білків, неінфікованих вірусних частинок, або інфекційних мутантних вірусних частинок у цілях виготовлення вакцин або терапевтичних засобів (Виспої еї аї., Мігоїоду, 204, 770-776 (19941 « та ЕР-В1-356695). Для цього вірусні гени (наприклад, гени дад-рої та епм вірусу ВІЛ-1) вміщували під з с транскрипційний контроль промотору 17 в експресійний вектор (наприклад, у плазміду або інший рекомбінантний . вірус ММА). Потім цю конструкцію вводили до клітин, що інфіковані рекомбінантним вірусом ММА, який експресує и?» РНК-полімеразу Т7. Гени рекомбінантного вірусу транскрибуються з високим ступенем ефективності, в результаті чого можуть бути отримані та очищені білки у великих кількостях. Окрім того, експресовані рекомбінантні вірусні білки (наприклад, епум, дад ВІШІ-1-) можуть збиратися у вірусні псевдочастинки, які
Ге» реплікуються та відділяються від клітини, після чого вони можуть бути виділені з середовища з тканинною культурою. В іншому варіанті здійснення винаходу, вірусні білки (наприклад, вірусів ВІЛ, 5ІМ та вірусу кору), со що експресуються ММА-рої! Т7 системою, можуть спасати додатково введений мутантний вірус (який походить, 2) наприклад від ВІЛ, 5ІМ, вірусу кору) шляхом подолання дефекту інтеграції; а також інфікування, декапсидація, 5р реплікація нуклеїнової кислоти, експресія вірусного гена, збирання, баддінг або інша стадія розмноження о вірусу дозволяють виконувати продукування і очищення вищезгаданого мутантного вірусу. "М Вірус ММА-рої! Т7 може бути також використано разом з ДНК-послідовностями, що несуть ген потрібного антигена (наприклад, ген ВІЛ, пеї, Фаї, рої, дад, епм або інші гени), необхідний для імунізації. Спочатку кодуючу послідовність даного антигена (наприклад ВІЛ, НСМ, НРМ, НОМ, вірусу кору, вірусу грипу або ін.) дв Клонують під контролем промотора РНК-полімерази Т7 переважно в плазмідний вектор, а отриману
ДНК-конструкцію ампліфікують та очищують з використанням стандартних лабораторних процедур. Потім
Ф) векторну ДНК інокулюють одночасно або з деяким інтервалом часу разом з ММА-ро! 77. В місці інокуляції ка потрібний рекомбінантний ген піддається тимчасовій експресії в клітинах, які містять векторну ДНК і ММА-рої
Т7, і відповідний антиген презентується імунній системі хазяїна, стимулюючи антиген-специфічну імунну бо Відповідь. Ця схема, що передбачає використання вектора ММА-рої! 77, що не реплікується, на основі вірусу коров'ячої віспи, є багатообіцяючим новим способом вакцинації нуклеїновою кислотою, що забезпечує ефективну часову експресію даного антигена, але при цьому дозволяє уникнути потенціального ризику конститутивної експресії гена.
Рекомбінантні віруси ММА, що походять від вірусу коров'ячої віспи, можуть бути отримані, як описано нижче. 65 ДНК-конструкцію, яка містить ДНК-послідовність, що кодує чужорідний поліпептид, ірланковану ММА-ДНК послідовностями, суміжними з природною делецією, наприклад делецією ІІ в геномі ММА, вводять в клітини,
інфіковані вірусом ММА, в результаті чого відбувається гомологічна рекомбінація.
Після введення ДНК-конструкції в еукаріотичні клітини і після рекомбінації із заміною вірусної ДНК на чужорідну ДНК, рекомбінантний вірус коров'ячої віспи може бути виділено відомими способами, переважно за
Допомогою маркера (пор. МаКапо еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Зс. ОБА,79,1593-1596 (1982), РгапКе еї аї., Мої.
СНІ. Віої., 1918-1924 (1985), Спакгабагії еї а!., Мої. СТІ. Віо!., 3403-3409 (1985), Рафі еї а/ї., Мігоїоді 95-105 (19961).
ДНК-конструкція, що вводиться, може бути лінійною або кільцевою. Більш бажаною є кільцева ДНК, зокрема - плазміда. ДНК-конструкція містить послідовності що фланкують лівий і правий краї природної делеції, наприклад делеції І в геномі ММА (АМепригдег МУ., Зщіег С.Р., АМепригдег 9. (1989) Агсй. Мігої., 105, 70..7195-27). Чужорідну ДНК-послідовність вбудовують між послідовностями, що фланкують природну делецію. Такою чужорідною ДНК-послідовністю може бути ген, що кодує терапевтичний поліпептид, наприклад, ЕРА або інтерферон, або антигенну детермінанту патогенного агенту. Такими патогенними агентами можуть бути віруси, бактерії і паразити, які можуть викликати захворювання, а також пухлинні клітини, які безконтрольно розмножуються в організмі і можуть приводити до утворення і зростання пухлини. Приклади таких патогенних /5 агентів описані Оамів В.О. еф аї. (Місгоріоюду, Зга ей., Нагрег Іпіегпайопа! Едйоп). Більш бажаними антигенами патогенних агентів є віруси імунодефіциту людини (наприклад, ВІЛ-1 і ВІЛ-2), мікобактерії, що викликають туберкульоз, паразит Ріазтоадаіцт ТаЇІсірагит і клітини меланоми.
Для експресії ДНК-послідовності або гена потрібна присутність регуляторних послідовностей, які необхідні для транскрипції генів, що присутні на ДНК-послідовності. Такі регуляторні послідовності (що називаються 2о промоторами) добре відомі спеціалістам, та прикладом таких послідовностей може служити промотор гену вірусу коров'ячої віспи, що кодує поліпептид 11кДа (описано в ЕР-А-198328), і промотор гена, що кодує 7,5кДа (описано в ЕР-А-110385).
ДНК-конструкцію може бути введено в ММА-інфіковані клітини шляхом трансфекції, наприклад шляхом преципітації фосфатом кальцію (Стапат сеї аї., Мігоі.,, 52, 456-467 (1973); ММУідіег еї аї., СеїЇ, 777-785 сч ов 19791); шляхом електропорації (Меутапп еї аі., ЕМВО У., 1, 841-845, (19821); шляхом мікроін'єкції (сгаевтапп еї аіІ.,, Ме. Епгутоіоду, 101, 482-492 (1983)); шляхом використання ліпосом (Зігацбіпдег еї а!., Меїйодаз іп і)
Епгутоїоду, 101, 512-527 |(1983)); за допомогою сферопластів (Зспапйпег, Ргос. Май. Асай. Зсі. О5А, 77, 2163-2167 (19801), або якимось іншими відомими методами. При цьому більш бажаним методом трансфекції є осаджування фосфатом кальцію. М зо Для кращого розуміння суті цього винаходу нижче наводяться докладні приклади його втілення. Однак ці приклади не повинні розглядатися як деяке обмеження об'єму винаходу. с
Опис креслень с
Фіг1: Схематична карта генома ММА і плазміди для інсерції чужорідної ДНК шляхом гомологічної рекомбінації: НіпаПШ-рестрикційні сайти в геномі ММА вказані зверху. Вказана також НіпапП-Ніпагйії со
М-фрагмент (900 п.о.), який перекриває область делеції ІІ в геномі ММА. ДНК-послідовності ММА, що примикають «о до делеції І (край 1 (Папк 1)) та край 2 (Папк 2)) були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РОК) та використані для конструювання інсерційної плазміди РОС ПІ 7.
Фіг2: рус І 17 Р7.5: плазмідний вектор ММА, що призначений для інсерції в делецію ІІ та містить експресуючий Р111-І ас/-кластер та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, для експресії потрібних « "Тенів, які можуть бути клоновані у Зта!-сайт плазміди. з с Фіг.3: рус І 1 7де! Р7.5: ММА-плазмідний вектор для інсерції чужорідних генів в сайт делеції ІІ у геномі
Й ММА, що містить експресійний Р111-Ї ас7-кластер, що самоделетуючий, та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу и?» коров'ячої віспи для експресії потрібних генів, які можуть бути клоновані в Зта1/Мой1-сайт клонування плазміди.
Фіг.4: Конструювання рекомбінантного вірусу ММА-ро! Т7: схематичні карти геному ММА (рестрикційні
Ніпаїі-сайти ендонуклеази) та векторна плазміда рус ІІ 17 Т7рої, за допомогою якої здійснюють інсерцію ген
Ге» РНК-полімерази 17 в сайт делеції І! в НіпаїП-фрагменті М геному ММА.
Фіг.5: Саузерн-блот-аналіз ДНК вірусу ММА-рої 17. со Фіг.6: Метаболічне мічення білків з використанням | 2551 метіоніну. Аналіз за допомогою електрофорезу в оз ПААГ з ДСН. Шлях 1: ММА-рої Т7; шлях З: клітини СМ-1.
Фіг.7: САТ-аналіз: клітини СМ-1 трансфікували плазмідою, що містить ген САТ під контролем промотору ді РНК-полімерази 776 та інфікували вірусом ММА-Т/рої або МуУкК-ро!/17. Лізати тестували на САТ-активність "С" "І означає хлорамфенікол, та 1-АсС та 3-АсС означають моно- та триацетильовані форми хлорамфеніколу.
САТ-активність виражали як процент ацетильованого продукта, утвореного за 60 хвилин.
Фіг.8: Конструювання ММА-Г АІпеї: схематичні карти геному ММА (рестрикційні НіпаїІІ-сайти ендонуклеази) та векторної плазміди рос ІІ І 7аеї р7.5-ІГ АІпеї, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену пеї ВІЛ-1 ГАЇ в сайт делеції ІІ в Ніпап-фрагмент М геному ММА.
Ф, Фіг.9: Конструювання ММА-пТУК: схематичні карти геному ММА (рестрикційні НіпаїїІ-сайти ендонуклеази) та ко векторної плазміди рос ІІ І 7ае! Р7.5-ТУК, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену тирозинкінази в сайт делеції ІІ в Ніпап-фрагмеші М геному ММА. во Приклади 1. Культивування та очистка вірусів 1.1. Культивування вірусу ММА
Вірус ММА є у високому ступені ослабленим вірусом коров'ячої віспи, отриманим від штаму вірусу коров'ячої віспи Анкара (СМА) в результаті довготривалого серійного пасування на культурі первинних фібробластів 65 курячого ембріону (СЕР). Із загальним оглядом історії продукування, властивостей та використання штаму ММА можна ознайомитись у коротких публікаціях Мауг еї аї., іп Іптесіоп, 3, 6-14 (1975). Завдяки атенуації в СЕБЕ,
в цій пташиній клітині-хазяїні вірус ММА реплікується з високим титром. Однак у клітинах ссавця ріст ММА сильно обмежений, та звичайне утворення бляшек під дією вірусу не виявляється. Тому вірус ММА був культивований на клітинах СЕР. У цілях отримання клітин СЕРЕ 11-денні ембріони виділяли з інкубованих курячих
ЯЄЦЬ, кінцівки видаляли, та ембріони подрібнювали та дисоціювали в розчині, що містить 0,2595 трипсину, за температури 37"С протягом 20 хвилин.
Отриману клітинну суспензію фільтрували та клітини осаджували шляхом центрифугування при 200О0об/хв. у центрифузі Зогмаі! КС-3ЗВ за кімнатної температури протягом 5 хвилин, а потім ресуспендували в 10 об'ємах середовища А (середовище Ігла (ОМЕМ), що отримується, наприклад, від І Ше Тесппоіодіез стрН, Еддепвіевїп, 7/0 Зегтапу), після чого знову осаджували шляхом центрифугування при 2000об/хв. у центрифузі Зогмаї! КС-3В за кімнатної температури протягом 5 хвилин. Після центрифугування клітинний осад переносили в середовище А, що містить 1095 фетальну сироватку теляти (ЕС5), пеніцилін (100 одиниць/мл), стрептоміцин (10Омг/мл) та 2и0М глутамін, у результаті чого отримували клітинну суспензію, що містить 500000 клітин/мл. Клітини СЕК, отримані у такий самий спосіб, наносили шляхом розпилення на чашки для культивування клітин. Ці клітини культивували /5 В середовищі А в інкубаторі з СО» за 37"С протягом 1-2 днів залежно від потрібної щільності клітин та використовували для інфікування або відразу, або після одного клітинного пересіву. Детальний опис отримання первинних культур може бути знайдено в роботі К.І. Егезппеу, "СиМиге ої апіта! сеї", АіІап К. г ізз Мепад
Мем Хогк 1983. Спаріег ІІ, стор. 99.
Віруси ММА інфікували наступним чином. Клітини СЕЕ культивували в 175см2 флаконах для культивування Кклітин. При 90-10095 суцільності середовище видаляли, та клітини інкубували протягом однієї години з суспензією вірусу ММА (0,01 одиниць інфекції (МЕ) на клітину, О0,02мл/см?) в середовищі А. Потім додавали додатково кількість середовища А (0,2мл/см?) та флакони інкубували за температури 377С протягом 2-3 днів (доки 90905 клітин не починали проявляти цитопатогенний ефект). Неочищений вірусний вихідний матеріал був отриманий шляхом зскрібання клітинних моношарів у середовищі та осадження клітинного матеріалу шляхом с центрифугування при ЗО000об/хв. у центрифузі Зогма! КСОС-3ЗВ за температури 47"С протягом п'яти хвилин. о
Неочищений вірусний препарат зберігали за температури -20"С перед подальшою обробкою (наприклад, очисткою вірусу). 1.2. Очистка вірусів
Для того щоб отримати по можливості чистий вірусний препарат, який не містить компонентів, специфічних в. для цієї хазяйської клітини, проводили стадії очистки способом, аналогічним описаному оКіїкК (Мігоіоду, 18, сч 9-18 (19621). Неочищений вірусний вихідний матеріал витримували за температури -20"С, а потім відтаювали та один раз суспендували в РВ5 (10-20-кратний об'єм осаду), після чого суспензію центрифугували, як описано со вище. Щойно отриманий осад суспендували в десяти об'ємах буферу Трис 1 (10мМ Трис-НСІ, рН-9,0), та со суспензію швидко обробляли ультразвуком (Іарзвопіс Ї., В. Вгашп Віоїесп Іпіегпайопа!, Меїзипдеп, Сегтапу; 2х10 секунд при бОВат та при кімнатній температурі) в цілях подальшого дезінтегрування клітинного дебрису та (Се) вивільнення вірусних часток з клітинного матеріалу. Ядра клітин та більшу частину клітинного дебрісу видаляли шляхом швидкого центрифугування суспензії (роторна центрифуга Зогмаї! С5А від ЮиРопі Со., ЮО-6353 Вай
Машпеїт, ЕКО; З хвилини при З0О0Ооб/хв. та температурі 10"С). Осад знову один раз суспендували в буфері Трис « 1, обробляли ультразвуком та центрифугували, як описано вище. Зібрані супернатанти, що містять вільні вірусні частки, об'єднували та покривали градієнтом ТОмл 3095 сахарози в 1О0мМ Трис-НСІ з рН-9,0, а потім ші с центрифугували в центрифузі Весктап ЗМУ 27/5МУ 28 при 13500об/хв. протягом 80 хвилин за температури 47С. ч Потім супернатант відкидали, а осад, що містить вірусні частки, розчиняли в ТОмл їмММ Трис-НСІ з рН-9,0, » гомогенізували шляхом швидкої обробки ультразвуком (2х10 секунд за кімнатної температури з використанням пристрою, описаного вище) та наносили на градієнт 20-4095 сахарози (сахароза в їмл Трис-НСІ, рН-9,0) для подальшої очистки. Градієнт центрифугували в роторній центрифузі Весктапп ЗМУ41 при 13000об/хв. протягом (2) 50 хвилин за температури 4"С. Після центрифугування дискретні смуги, що містять вірусні частки, збирали о шляхом піпетування після зменшення об'єму вищевказаної смуги. Отриманий розчин сахарози розводили трьома об'ємами РВ5 та вірусні частки знову осаджували шляхом центрифугування (Весктапп ЗМУ27/28, 60 о хвилин при 13500об/хв., температура 4"С). Осад, який складався головним чином з чистих вірусних часток, ко 20 ресуспендували в РВ5 та врівноважували до середніх концентрацій вірусу, що складає в середньому 1-Бх109МЕ/мл. Розчин очищеного вірусного вихідного матеріалу зберігали при -807С та використовували або "М відразу, або розводили фосфатно-буферним фізіологічним розчином для проведення подальших експериментів. 1.3 Клонування вірусу ММА
Для генерування гомогенних вихідних вірусних препаратів вірус ММА, отриманий від Ргої. Апіоп Мауг, 259 клонували шляхом лімітуючого розведення протягом трьох подальших пересівів у клітини СЕРЕ, культивовані на
ГФ) 9б-лункових планшетах для культивування тканини. Клон б ММА відбирали та ампліфікували в СЕЕ з отриманням маточних розчинів вірусу, які служать у якості вихідного матеріалу для генерування рекомбінантних де вірусів ММА, описаних у даній патентній заявці, а також для генерування рекомбінантних вірусів ММА, описаних раніше (З!цШег, б. та Мозе, В., (1992) Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 89, 10847-10851; БицЧег, с., УУуай, Г., 60 ЕоІеу, Р., ВеппіпК, У. та Мовзв, В., (1994), Массіпе 12, 1032-1040; Нігесп, М., ЕРицегві, Т., ЗМУНег, 0.,
Сатоїї, М. Мапа, Ї., Соідвієїп, З., Ріайак, М., ЕїКіпв, МУ., АїЇмога, с., Мопіейогі, О., Мозвв5, В. апа
І ївоп, 9., (1986) 9. Мігої., 70 3741-3752). 2. Конструювання та характеризація рекомбінантних вірусів ММА 2.1. Конструювання векторних плазмід бо У цілях генерування рекомбінантих вірусів ММА були сконструйовані нові векторні плазміди. Вбудовування чужорідних генів у геном ММА здійснювали точно в сайт природної делеції І в геномі ММА. Послідовності
ММА-ДНК, фланкуючи сайт 2500 п.о.-делеції у НіпаПй-фрагменті М геномі ММА (АМКепригдег, МУ. Зцщіег, С.Р. та
АКМепригдег, у. (19891, У. Агсй. МігоІ., 105, 15-27), були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та клоновані в сайт множинного клонування плазміди рИиС18. Праймерами для лівого 600 п.о.-ДНК-краю є: 5-САС САС ОСТ АСС СТО АТО СТА САС САС СТТ СТО-3 та 5-САС САС ССС обо ТАТ ТСО АТО АТТ АТТ
ТТТ ААС ААА АТА АСА-3' (сайти для рестриктуючих ферментів Крп! та Зтаї! підкреслені). Праймерами для правого 550 п.о.--ДНК-краю є: 5-САС САС СТО САС САА ТСА ТСС АТТ ССА СТО ААТ АОС-3 та 5-САС
САС ОСА ТОС СОА СОА АСА ДОС ААС ТОТ АОС АСА-3 (сайти для рестриктуючих ферментів Рай! та Зрп! /о підкреслені). Між цими краями ММА ДНК, вставленій в руС18, вбудовували ген Іас/ ЕзспНегіснпіа соїї під контролем пізнього промотору Р11 вірусу коров'ячої віспи (отриманого шляхом гідролізу ферментом рії! 17,
ЗІЩег, С. апа Мозз, В. (1992| РМАБЗ ОЗА 89, 10847-10851) з використанням ВатнНі-сайта, в результаті чого отримували інсерційний ММА-вектор рисі 17 (Фіг.1). Після цього 289 п.о.-фрагмент, що містить ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи разом з ЗтаІ-сайтом для клонування (отриманим шляхом рестрикції 7/5 ферментами Есокі та Хбваї з плазмідного вектору реС11 |Снакгабагі! та ін., 1985, Моіесціаг та СеїІміаг Віоіоду 5, 3403-3409), вставляли Зтаї!-сайт рисі! з отриманням ММА-вектора рисі! І 7 Р 7.5 (Фіг.2). Для конструювання векторної плазміди, яка дозволяє виділяти рекомбінантні віруси ММА шляхом часового синтезу репортерного ферменту-р-галактозидази, 330 п.о.-ДНК-фрагмент від З-кінця відкритої рамки зчитування Іасл. Е. сої ампліфікували за допомогою РСК (праймери 5-САсС САС СТО БАС ССС ЗАС СОС СТІ АСТ ОСС ОСо-3 та го 5-068055 50505 СТО САС АТО ТА Со АСС ОС ОСТ САС-3)) та клонували в заї! та Реві-сайти рСО 112 Р7.5 з отриманням ММА-вектору рис І! І 7аеї Р7.5 (Фіг.3). З використанням Зтаї!-сайту, ця векторна плазміда може бути використана для вставки ДНК-послідовностей, кодуючих чужорідний ген під транскрипційним контролем промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, в геном ММА. Після цього потрібний рекомбінантний вірус виділяли шляхом скринінгу на експресію р-галактозидазної активності та подальше його культивування призводило до с самоделеції знову сконструйованого Р11-| ас7-експресуючого кластера в результаті гомологічної рекомбінації. 2.2. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу ММА-рої!Т7 і) 3,1 Кер-ДНК-фрагмент, що містить повний ген РНК-полімерази бактеріофагу Т7 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, вирізали ферментом Есокі з плазміди рТЕ7-3 (Егиеві,
Т.Р., Міпез, Е.б., Біцаїег, Б.МУ. апа Мозв, В., (1986), Р»М»А»5» ШБА, 83, 8122-8126), модифікували шляхом ч- інкубування ДНК-полімерази фрагментом Кленова для продукування тупих кінців та клонували в унікальний
Зтаї!-сайт рестрикції /7 рисі з утворенням плазмідного вектору переносу рисІІ-І 7-ро! Т7 (Фіг.4). В якості с транскрипційного регулятору для експресії гену РНК-полімерази 77 був вибраний ранній/пізній промотор Р7.5 со вірусу коров'ячої віспи (наприклад, Р11) ця промоторна система дозволяє експресувати рекомбінантні гени безпосередньо після інфікування клітин-мішеней. І 2-ро! Т7-плазміда рисі, яка забезпечує введення чужорідних со
Зз5 генів у сайт делеції ІІ геному ММА, була використана для генерування вірусу ММА-рої! 17. Ге)
Клітини СЕРЕ інфікували вірусом ММА при множинності інфекції ТСІО50-0,05 на клітину та трансфікували ДНК плаз-І 2-рої Т/-плазміди риОСІІ, як описано раніше (ЗиЧег, с., ММуацй, Ї., ЕРоіІеу, Р., ВеппіпК, У. та Мозв, В., (19941), Массіпе 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус ММА, експресуючий РНК-полімеразу Т7 та сумісно « експресуючий р-галактозидазу (Р7.5-ро! Т7 ММА), відбирали в результаті проведення п'яти послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах СЕРЕ, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл- рД-Ю-галактозидом (З0Омкг/мл). - с Рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів СЕРЕ, та ДНК аналізували за допомогою РОК и для підтвердження генетичної однорідності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК ММА-рої! Т7 є» продемонстрував стабільну інтеграцію рекомбінантних генів у сайт делеції І в геномі ММА (Фіг.5). Для спостереження за експресією РНК-полімерази Т7 шляхом рекомбінантного ММА-роЇ! Т7 були проаналізовані мічені (3581 метіоніном поліпептиди від вірус-інфікованої культури тканини. Моношари клітинної лінії нирок
Ме, мавпи СМ-1, культивовані в 12-лункових планшетах, інфікували вірусом при множинності інфекції ТСІОво-20 на со клітину. Через 3-5 годин після інфікування середовище видаляли, та культури один раз промивали 1мл середовища, що не містить метіоніну. В кожну лунку додавали 0,2мл середовища, що не містить метіоніну, разом о з БомкКи (228) метіоніном та середовище інкубували протягом 30 хвилин за 377С. Цитоплазматичні екстракти ко 20 інфікованих клітин отримували шляхом інкубування кожної лунки в 0,2мл 0,595 буферу для лізису Мопідеї Р-40 протягом 10 хвилин при 37"С, та зразки аналізували шляхом електрофорезу в ПААГ з ДСН. Метаболічне
Що. мічення клітин СМ-1 вірусом ММА-рої 77 виявило синтез двох додаткових поліпептидів (ї) білку розміром біля 116000Да, що представляє собою сумісно експресовану р-галактозидазу Е. соїї, яка дозволяє проводити скринінг на рекомбінантний вірус; та (ії) білка з очікуваним розміром 98000Да, що відповідає РНК-полімеразі бактеріофагу 77 (Фіг.6). При цьому було відмічено, що ММА-Т7ро! продукує велику кількість р-галактозидази.
ГФ) Експерименти з іп мімо-міченням продемонстрували дуже високий рівень експресії Р111-І ас7-ген-вмісній т конструкції, введеній у геном ММА в сайт делеції 11, що свідчить про те, що рекомбінантні гени у векторному вірусі ММА можуть бути експресовані з великою ефективністю в тому випадку, якщо вони вбудовані саме в цій локус геному ММА. 60 Ефективність рекомбінантних вірусів ММА-рої 77 як експресуючих систем у порівнянні з рекомбінантним
МУК-Т7рої вірусом мТЕ7-3 (Ешегві та ін., 1986) оцінювали шляхом ко-трасфекції ДНК плазмідного вектору, що походить від РТМІ (Мозв, В., ЕІгоу-З(еіп, О., Мігикаті, Т., АІехападег, МУ.А., б Ецегвї Т.М. (1990) Майшге, 348, 91-92), та містить ген (клонований у МсоІ- та ВатНі-сайти множинного клонування ртМ1) хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ) Є. сої під контролем промотору РНК-полімерази Т7 (РІ7). бо Трансфіковані та інфіковані клітини СМ-1 суспендували в 0,2мл 0,25М Трис-НСІ (рН-7,5). Після трьох циклів заморожування-відтаювання лізати освітлювали шляхом центрифугування, а потім визначали вміст білка в супернатантах, та зразки, що містять 0,5; 0,25; 0,1мкг повного білку, аналізували на ферментну активність методом, описаним Маскей, М., Зтій, .Ї. 5 Мозгвз, В., (19841, 9. МігоіІ., 49, 857-864. Після авторадіографії кількість мічених плям оцінювали з використанням візуалізуючої аналітичної системи Еціі. Отримані результати проілюстрували, що шляхом використання у високому ступені атенуйованого вектору ММА на основі вірусу коров'ячої віспи може бути отримана система "вірус коров'ячої віспи-РНК-полімераза 17", яка являється такою ж ефективною, як і при використанні досить компетентного по реплікації рекомбінанта на основі вірусу коров'ячої віспи (Фіг.7). 70 2.3. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу ММА-І АІпеї 648 п.о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген пеї ГАЇ ВІЛ-1, отримували за допомогою РСК з плазмідною
ДНК (рто1166, люб'язно наданою М.-Р. Кіепу, Ттапздепе 5.А., Зігазроиго; для РОК використовували наступні праймери: 5-САС САС ОА ТСС АТО ОСТ ОС АдОо ТО ТСА АДАА АСТ АСТ-3 та 5-САО САС ОбБА ТСС АТО
ТСА ОСА ТТ СТ БАА ОТА СТО СОоб-3)), гідролізували рестриктуючою ендонуклеазою Ватні, модифікували /5 Шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затупіння кінців", та клонували в ЗтаІ-сжт рос ІІ І 27-деї
Р7.5, в результаті чого отримували вектор рис ІІ І 7ае! Р7.5-І АІпеї (Фіг.8). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу ММА, який експресує ген пеї ВІЛ-1-ЇАЇ під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи.
Клітини СЕРЕ, інфіковані вірусом ММА при множинності зараження ТСІОв5о-0,05 (ТСІЮ - середня цитопатогенна доза) на клітину, трансфікували ДНК плазміди рос 1 І 7аеІ-Р7.5-І.АІпеї, як описано раніше (З,иКег, 5., УУуай,
Г., Єоїеу, Р., ВеппіпкК, 9., 5 Мозз, В. (1994) Массіпе, 12, 1032-1040). Рекомбінантні віруси ММА, що містять ген пеї та сумісно маркерний ген І ас7 Е. соїї, що сумісно експресується з часовою регуляцією, відбирали шляхом проведення послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах СЕРЕ, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл- Д-ЮО-галактозидом (З0Омкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, що містять ген пеї сч та мають делетований маркерний ген Гас7, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу у клітинах СЕК у о присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-;-О-галактозида (З0Омкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів, та ММА-І АІпеї-вірусну ДНК аналізували за допомогою РСК для того, щоб упевнитись у генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну /-|ч« стабільність ММА-І АІпеї та явно продемонстрував інтеграцію гену пеї та делецію маркерного гену І ас Е. сої в сайті делеції 11 у вірусному геномі. с
Ефективна експресія рекомбінантного білку Меї була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу со білок-продукуючих лізатів клітин СЕРЕ, інфікованих вірусом ММА-Г АІпеї з використанням мишачих тАВ проти Меї
ВІЛ-1 (люб'язно наданих К. Кгтопп та використаних як описано Омод, У., І адегвіеді, А., Капкі, А., Сотрегі, Е., со
Зропп, К., Танііпеп, М., Уипо, О., 5 Ктопп, К. (19921 АІОБ, 6, 25-34. Ге) 2.4. Конструювання та характеризація рекомбінантного вірусу ММА-пПТУК 1,9 п.о.--ДНК-фрагмент, що містить повний ген, кодуючий тирозиназу людини І(кДНК-клон тирозинази 123.82 виділяли з клітинної лінії меланоми 5К29-МЕГ. пацієнта 5К29 (АМ), СепВапк Мо допуску ОО1873; Вгіснага, М., Мап «
Реї, А., МуУбІеї, Т., МУбІеї, С, Ое Ріаеп, Е., Іе(йе, В., Соціієе, Р. та Вооп, В. (1993), У. Ехр. Мед., 178, 470 489-495) отримували з плазміди рсОМАїАтр-Туг (МУбМеІ, Т., Мап Реї, А., Вгіснага, М., Зсппеїідег, 5., - с Зеїїдег, В., Меуег 20ит ВизвспепіеІде, К., та Вооп, Т. (1994) Еиг. 9). Іттипої, 24, 759-764) шляхом гідролізу ц ферментом ЕсокіІІ, а потім модифікували шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затуплення "» кінців" та клонували у ЗтаїІ-сайт рос І І 7де! Р7.5, в результаті чого отримували вектор рис ІІ І 7ає!ї Р7.5-ТУК (Фіг.9). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу ММА, який експресує ген тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи.
Ге) Клітини СЕР, інфіковані вірусом ММА при множинності зараження ТСІЮО5о-О,5 на клітину, трансфікували ДНК плазміди рос ІІ І 2де! Р7.5-ТУК, як описано в літературі (З,уЧег, б., УУуай, Г., Роіеу, Р., ВеппіпК, 9У., 5 Моз, В.,
Ме (19941 Массіпе 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус ММА, стабільно експресуючий ген тирозинази людини та о сумісно експресуючий, з часовою регулюцією, ген І ас7 Е соїї, відбирали шляхом проведення послідовних циклів юю 50 методом бляшек у клітинах СЕРЕ, пофарбованих 5-бром-4-хлор-З-індоліл- Д-Ю-галактозидом (З0Омкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, які експресують ген, що кодує тирозиназу людини та має делетований маркерний ген що Гас/, виділлли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу в клітинах СЕБЕ у присутності 5-бром-4-хлор-З-індоліл- Д-О-галактозида (З0Омкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів СЕРЕ, та ММА-пТУК-вірусну ДНК аналізували за допомогою РСК для того, щоб
Ге! упевнитися в генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність ММА-НЙТУК та явно продемонстрував інтеграцію рекомбінантного гену тирозинази та делецію де маркерного гену І ас Е сої в сайт делеції ІІ у вірусному геномі.
Ефективна експресія рекомбінантної тирозинази людини була підтверджена за допомогою 60 Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин СЕРЕ, інфікованих вірусом ММА-пТУК з використанням кролячих поліклональних антитіл (люб'язно наданих М. Неагіпуо, та використаних, як описано, дітепе?., М.,
Катеуата, К., Масу, Ї., Тотіа, М., 5 Неагіпо, М. (1988| Р.М.А.5. ОБА 85, 3830-3834) або мишачих моноклональних антитіл (люб'язно представлених І. Ой та використаних, як описано, Спеп, У., ЗіосКегі, Е.,
Твапа, 5., Соріап, К. 5 Ода, І. (1995) Р.М.А.5. ОБА 92, 8125-8129), направлених проти тирозинази. 65 3.0 Конструювання вектору інсерції для делеції сайту МІ ММА
Для отримання послідовностей, придатних для рекомбінації у геномі поксвірусу, фрагмент ДНК, отриманий від модифікованого вірусу коров'ячої віспи Анкара (СМА) (депонованого згідно з Будапештським Договором під номером допуску М94012707 в Європейській колекції культур клітин тваринного походження, Великобританія), було ампліфіковано відповідною полімеразною ланцюговою реакцією (РСК) за використання наступних олігонуклеотидних праймерів:
Ага 1;5 - СССААДОСТТ ДААТОДАСОССАСАСО - 3'ЗедіЮ Мо10
А271 1с55 - АВОСТОСОАСТААСАОСООСТАТОАТ - 3'Зедію Мо11
Олігонуклеотидні праймери включають, ближче до 5' кінця й підкреслені, послідовність розпізнавання для рестрикційних ензимів Ніпаш (Зедій Мо10) або Хпо! (ЗедіЮ Мо11) для субклонування отриманого продукту /о ампліфікації в клонуючий вектор. Відповідно окремо ампліфікована послідовність (Зедію Ме9) із молекулярною вагою 1,7 п.о. була субклонована заїїНіпашШ у клонуючу плазміду рОС19 (СесВапк Ассезвіоп МоХО2514).
Отримана плазміда була позначена рзумі (Фіг.10).
Субклонована вставка була потім вбудована в послідовність, і ця послідовність була порівняна з іншими відомими послідовностями з вірусних штамів коров'ячої віспи Копенгагена, М/К і ММА. Було виявлено, що /5 Вказана послідовність містить частини послідовності області ММА-АТІ. Ген АТІ більшості ортопоксвірусів формує щільну цитоплазматичну матрицю, що вбудовує розвинуті віріони, так звані тільця включень, які можуть бути виявлені шляхом розгляду інфікованих клітин за допомогою оптичного мікроскопу. Запропонована функція АТІ полягає в забезпеченні більшої стабільності й подовженого розповсюдження інфекційних вірусних частинок у загальному середовищі. Серед ортопоксвірусів є декілька представників, включаючи вірус ектромелії, поксвірус
Корови, і поксвірус єнота, які виробляють цей типовий білок вбудовування з розміром від 130 до 16бОкДа. Втім інші представники роду ортопоксвірусу, як-от: вірус коров'ячої віспи МУевіегп Кезегме (МУК), вірус коров'ячої віспи Копенгагена або ММА, не створюють таких тілець включень. Це є результатом делецій послідовності або мутацій із зсувом рамок, що призводять до втрати кодуючої послідовності й мають наслідком усічений
АТІ-гомологічний орган. Наприклад вірус коров'ячої віспи МУК експресує 94кДа АТІ-гомологічний орган, тоді як сч
ММА ї штам вірусу коров'ячої віспи Копенгагена не експресує подібний АТІ-гомологічний орган.
З метою подальшого конструювання векторів вбудовування використовували сайт розпізнавання і) рестрикційного ензиму ЕсокіІ для розділення ампліфікованої послідовності на два сегменти. Ці сегменти служать як фланкуючі області (фланк 1, фланк 2), що вони ініціюють гомологічну рекомбінацію з поксвірусним геномом.
Між цими фланкуючими областями були вбудовані послідовності промотору вірусу коров'ячої віспи - наприклад, М зо промотор 7,5 (7,5) та/ або синтетичний промотор (5Р), - а також багаточисельні клонуючі сайти для вбудовування діючих гетерологічних генів. Отримані плазміди позначають рему-7 5-8Р, реаму-7,5, раеМму-в8Р. с
Додатково між фланкуючими областями, як згадано вище, вбудовували експресуючий кластер, що містить со ген кола хазяїв вірусу коров'ячої віспи, К1Ї, об'єднаний із геном злиття ЕСЕР (виділеним з плазміди рРЕСЕР,
СіІопеФесі, СепВапк, номер допуску Мо)76561) і природним промотором Кт. Цей експресійний кластер со особливо корисний для ефективного відбору та виділення рекомбінантних вірусів. Отримана плазміда «о позначається ремуУкідтр.
Генерування рекомбінантного вірусу
Для генерування рекомбінантних вірусів використовують б-лункові планшети для культивування тканини з клітинними моношарами, що мають близько 8095 злиття. Для відтворення рекомбінантного ММА використовують « пермесивні клітини, як-от: фібробласти курячого ембріону. Для відтворення рекомбінантних вірусів коров'ячої з с віспи штаму МУК використовують клітини африканської зеленої мавпи (Мего). . По-перше, середовище клітинної культури відкидають і клітини вкривають вільним від сироватки "» середовищем, яке містить поксвірус дикого типу за кратності інфекції (МОЇ) 0,01 (наприклад, інокулят 5Х10 З |Ш (інфекційних одиниць) в їмл середовища для однієї лунки з 5х10? клітинами). Цю суміш інкубують протягом 1 години за 37"С в 5965 СО2-атмосфері. Потім інокулят видаляють і клітини двічі промивають за допомогою 2мл (о) ОрІМЕМ на кожну лунку. бо Пізніше моношар клітини вкривають Ліпофектіном/плазмідою ДНК-мікс (в цілому об'єм: мл), виготовлений згідно із вказівкою виробника (СІВСО ВЕ) за використання 1549 плазміди ДНК рЗМУУКІ1тТоїр. Суміш інкубували (65) протягом 5-12 годин за 37"С у 5956 СО».-атмосфері. По тому Ліпофектин/плазміду ДНК-мікс видаляють, а також 7 50 клітини вкривають 1,5мл свіжого середовища із доданими 1095 ЕС5.
Після 48 годин після інфекції моношар клітини від'єднується клітинним соскаблювачем і клітини, й "м середовище переносять у 2мл-мікроцентрифуговані трубки. Продукти трансфекції зберігаються за температури від -207С до -8070.
Після трансфекції плазміди реМУК1Тдгїр у поксвірусні інфекційні клітини ген Кт. кола хазяїв, злитий з геном
ЕСЕР, були точно рекомбіновані в сайт поксвірусного геному, гомологічного до фланкуючих областей у о векторній плазміді.
Для виділення рекомбінантних вірусів ММА з не-рекомбінатних вірусів ММА, клітину кола хазяїв, а саме ко кролячої нирки (КК)13, інфікували вірусним матеріалом, отриманим з трансфекційного експерименту, як було вказано вище. Попередня робота показала, що ММА інфікування клітин кроля КК13 призводить до раннього 60 блокування вірусної реплікації, що відрізняється послабленим синтезом проміжної вірусної РНК та вірусною РНК з недостатньою реплікацією. Втім це непродуктивне інфікування ММА клітин КК1З3 могло компенсуватися сумісною експресією гену КТ кола хазяїв вірусу коров'ячої віспи (З!цЩег еї аїЇ., 19945). Відповідно інокуляція вірусного матеріалу, отриманого після вказаних експериментів трансфекції, в культури КК1З призвела до високого вибіркового вирощування тільки рекомбінантних вірусів, які сумісно експресують ген Кт. Після 65 п'яти послідовних пасажів вирощування клітин ККІ1З на б5-лункових або 9б-лункових планшетах для культивування тканини вірус ММА-КТІ!СЕР був виділений. Відсутність не-рекомбінантного ММА була продемонстрована за допомогою РСК. Додатково експресія злитого гена ЕСЕР уможливила пряме спостереження за інфікуванням рекомбінантним вірусом за допомогою флюоресценсії СЕР. Пряме спостереження також використовують для ідентифікації й пізнішого виділення рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи штаму МУК, які не є чуттєвими стосовно селекції К1Ї.
Перелік послідовностей (1) Загальна інформація: (І) Заявник: (А) Назва: О5Е-Рогеспипдзгепігит їшег Ютуей ипа Севипаепівї СтрНн 70 (В) Вулиця: Іпдоівіаедег І апавіг. 1, Меипегрега (С) Місто: Орегзспіеіззпеїт (Е) Країна: Німеччина (Р) Поштовий індекс: 85764 (ї) Назва винаходу: Рекомбінантний вірус ММА та його використання (ії) Кількість послідовностей: 8 (м) Тип комп'ютерного зчитування: (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: РС сумісний з ІВМ (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: РаїепіІп Кеїеазе я 1,0 Мегзіоп 2 1,30 (ЕРО) (мі) Данні попередньої заявки: (А) Номер заявки: ОК 0782/95 (В) Дата подання: 04 липня 1995р. (2) Данні послідовності БЕО ІЮ Мо1: с (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ і) (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна ї- зо (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.-"ДНК-праймер" с (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо1: с
САССАСОСТА СССТСАТСОТ АСАССАСОТТ СТО
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Мо2: со (Ї) Характеристика послідовності: «о (А) Довжина: 42 пари основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна « (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота з с (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" . (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо2: и? САССАССССО ОСТАТТСОАТ САТТАТТТТТ ААСААДААТАА СА (2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Моз: (Ї) Характеристика послідовності:
Ге» (А) Довжина: 36 пар основ (В) Тип: нуклеіновокислотна со (С) Ланцюговість: одноланцюгова оо (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота ю (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" "М (хі) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Мо3:
САССАОСТОС АССААТСАТС САТТССАСТО ААТАОС
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Мод: (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 36 пар основ
Ф) (В) Тип: нуклеіновокислотна ка (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна во (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо4;:
САССАСОСАТ ОССОАСОААС АДАССААСТОТ АССАСА
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Моб: 65 (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ
(В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.-"ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Моб:
САССАОСТСО АССССОАССО ССТТАСТОСС СС
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Моб: 70 (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Моб: вОООООСсТОС АСАТОСТАОС САССООСОСТ СА (2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Мо7: (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 39 пар основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна с (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" і) (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо7:
САССАСОСАТ ССАТОСОТОО СААСТОСТСА ААААСТАСТ
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Мов: ч- зо (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 39 пар основ с (В) Тип: нуклеіновокислотна с (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна со (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота «о (А) Опис/опис.-"ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо8:
САССАСОСАТ ССАТОТСАСС АСТТСТТОАА СТАСТОоСОоО «210» Послідовність БЕО ІЮ Мо9 « «211» 1736 в с «212»ДНК . «213» Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара ит «220» «400» 9 ссвравіаає арсвостасе аба(сісіве сбааазараї (са(оцса» ас(ввсасеос 6о0
Ф віссатагра ріааснаас їстена апааааріа тайсааааа аграрна 120 (ее) с їаазівесва асацаєааа Шаїсодас фоаацетас сзасеенса арагнааі 180 мо Енесрарса Масгосеії Таваїсіай? аагаєава сагеерава аазааістза 240 «М всаазаіасає рсаїсаріяао аазасаєара засацанцс асрааоцаї (арерасці 300
Ф) іме) 60 б5 аграадосаї аїссізазаї гоасрасааї аразааісіс сацареарс їссайесаа 360 (сесіаасас ааїацатає (Цааарааї раааісаєа арассаєрсі арсетаєаї 420 загерагсаї (ваабасаза ашазаасо Назасаці абаїсацас (аасоцесі 480 саасаєсаєт абагаєсаої ашір(ава айсірога арайсасеа (ропасіссі 540 їагасатасе айсбірарає аасоарсааї раїаавайіс Цацайіра всяасаае 6 їаєесаєта арсаааай асасерісаа цаасійар сісісараа! (агазаєааа 660 псагса (ареаєасс саїмаща їеешщаасо (азасераїс асареагає 120 сасрасаєва! агоа(сеіїаа (оссеріц сааядіазар араготаєр асіасіасас 780 всашаюті асіаєстаєс абсіагаар (роїасаці Порааїрацй (сесастай 840 аааршщасе ташароар ааіссірсас ашарнія аріскссів аагагасай 900 уй агагроша врагацсіо шписрагас їапйраааза Щарсааєє ассіагасі 960 сещшаси агразсаазса агаразаєро з(а(рацас веЦрасщшща агазавадев 1020 аайосіаар рірасараао ссіааассст абаасеаїгаа ясеазнсаї рс(агаарас 1080 с всагсаарос (раасрісаа агсесісота аааасірсор аррідасссатесраастію 1140 о аайраааєс (раасятарі аасоісаара ройПераата ксаасіара! рсірарааає 1200 заазаденаа еНстасаза арараасіар засеіваїят віаїсшсі амарааес 1260 їч- зо Чассісцс йсараїсса сабрасааас сацассаза Набасаці ссісосана 1320 сч аааагртаїс іїссойраса асіраросіа сареНсірі араамарса ссіссаєсса 13850 с садасенНас сезассоай аріраїсіра сассаїстої врабтісваа ссараасаєє 1440 с сесссарсці сісааіаїса расцсарія їсссаартар сарнасассіссассаааа 1500 ісе) ссірааасіс сасавації сеааіаєсав асріссрац сійбарцаа сааіссасяс 1560 ссацйаєв айсрраєії свааціраї раїайсраєа ріаїстасі ассавасіар 1620 « аванасас сарааварас сеспрараї саасіає (аагосіа (аааасеаас 1680 8 с з» варессися Цсрааає( зашірасі цасессістї десрисац аарсії 1736 п «210» Послідовність ЗЕО ІЮ Мо10 «911» 24 б «212» ДНК
Го! «213» Штучна послідовність «220» о «223» Опис штучної послідовності: олігонуклеотидний праймер ма 70 «400» 10 ссдаадсна аїддаасдсса дада "м «210» Послідовність ЗЕО ІЮ Мо11 «2112 25 «212» ДНК 99 «213» Штучна послідовність
ГФ) «220» «223» Опис штучної послідовності: олігонуклеотидний праймер о «400» 11 аддсісдаді аададсодсі аюдаї бо 65
МУА Ніпацш
С МКЕ ЕОМІвІУН О А в плн 10 Кб й . Ши Не іл девлешии (25009) 0 йлані он. з ЕСОНІ
Й край: фара 0 РМ ква»
Шопен
Чннки Бе ші из чу с см з кет ВТВ ВИН сен 0; ї- жлон Ме сч
ММА крані ММ БУ Б совійсх МРІЇ ММА крій о вобфсвові -. Втаі Бсові вв Есовіваї барі Ре
ЩЕ В о 4: 2: ВИ вові «
Краї о -о с
І» клон-ЛІ4 й шиті во вико ьа шт (22) ММА жвай 1 МИР ЕЕ сопіаси чер 0 МУджран 5 що рисі в
ГФ) т . ко 60 65
"З Муд окр: МИР 00 Жофіют 0 УУРМ ЗД МУ край? кот рис піл Р7.5 Мой ти
Й сп ти ап І І . с
ММА Ніпо І | | о сомке вомівнив, й г. лм ччиТичччВьчьниши в / т-щи щ / пн | со щі У нНіпаші - денеобя 1) (2500 Бо) й наши ви (Се) шт шк ' -о с . Й :» ав Твої рРІБ ас РИ край?
Га «ріг: я. г) 50 і (Ф) ко бо б5 з В її ва впала не я а 36 о. Ка 70 Ттрої гек в-й 56 "ще Баш з с й шк ще нан - ВШ 000 ЖЕ "ЛЯ о. сч о. ше о
Фіг; 5 те сч
І питан со тю то | « ї й т З с нм :» Ї ж чо. й 451 97 я К.І 1
Ф Ше ма 70 : ой ь : ш-оо у. о "в о о 6о о б5
Фіс. 6.
КУ бідок |в оз вин І І повна. 05 дов о|| ов о
КеЕ НН ЕН але. ех Пет ве А віх Мч тя та о о Но НН НН АН то «ЗШ не ю и н Нм е "7"Аес: «В не НН не А кА оо нн в тс з и шо ее Ав: НН ха ШИН НН о а зр а ек нн НН я» то з ще ше в НН кеш нн НН йо З. оси ДВ и ДО
ПМК око НН еи пон з УК 7 5» ММА Ніпаш сч (8) с КЕ ЕОМ ОВО о А В ; ця ри ! " й й НИ
Її Шия --оо 10 КЬ с
Й Шья / ше со /Ніжій делеши її М (2500 бо) 0 лані - -- асо т - АМИ мя юь. тин п іль у, ФЮ « пиши ! шви знанні НИ т с край і край 7 ;з» крані РУ БАїйеї с РИ лаві кран.
Ф с | сей па А М ТК Ж у ЗИ Я ИН Но: нн со РОСТІ гав Р7.Б5-Ї Діпеї (65) мо "Фів. 8 "і
Ф) ко во 65
ММА /Ніпапй
С МКЕ ЕООМІЯВІ ЯН ВО. А в 70 / она щ. І / -вщ 5 Шо -22- - М ма Кк -
Ка | Ще см
Ша і и ни у р тру пхявню ння 2 рус 7аві Р7.Б-ТУА 5) «фігу ї- «оз, сч й й 4 Й | о КУ і "й х ; (Се) ій -к Ок ! виш ' | « ї Ме ' ВЖІ ект ш- їх М - с 79 : ЖВкок оби юя шо; її в б ьре ДЕ ц ! х Ок «» і Я ж , / Ж
Б я Й МІ мо Шо, Шона що
Фіг. 10
Ф)

Claims (24)

Формула винаходу іме)
1. Рекомбінантний вірус ММА, що містить та здатний експресувати принаймні один сторонній ген, вбудований 60 у сайт природної делеції в геномі ММА, за виключенням сайта ІІІ природної делеції.
2. Рекомбінантний вірус ММА за п. 1, який відрізняється тим, що містить та здатний експресувати принаймні один сторонній ген, вбудований у сайт делеції ІІ в геномі ММА.
З. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-2, який відрізняється тим, що сторонній ген кодує маркер, терапевтичний агент, антиген або антигенну детермінанту. бо
4. Рекомбінантний вірус ММА за п. 3, який відрізняється тим, що сторонній ген кодує антиген або антигенну детермінанту патогенного вірусу, бактерії або іншого мікроорганізму, паразита або пухлинної клітини.
5. Рекомбінантний вірус ММА за п. 4, який відрізняється тим, що сторонній ген кодує антиген або антигенну детермінанту з Ріазтодіцт Раїсірагит, мікобактерії, вірусу герпесу, вірусу грипу, вірусу гепатиту або вірусу імунодефіциту.
б. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 3-5, який відрізняється тим, що антигеном або антигенною детермінантою є пеї ВІШІ або тирозиназа людини.
7. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-2, який відрізняється тим, що сторонній ген кодує РНК-полімеразу 17.
8. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-7, який відрізняється тим, що сторонній ген знаходиться під 70 транскрипційним контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи.
9. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-8, який відрізняється тим, що, по суті, не включає віруси, здатні реплікуватися в клітинах людини.
10. Рекомбінантний вірус ММА за п. 7, який відрізняється тим, що його використовують для іп Уйго транскрипції ДНК-послідовностей під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17.
11. Ізольована еукаріотична клітина, яка відрізняється тим, що інфікована рекомбінантним вірусом ММА за будь-яким з пп. 1-9.
12. Еукаріотична клітина за п. 11, яка відрізняється тим, що додатково містить один або декілька експресійних векторів, що несуть один або декілька сторонніх генів під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17.
13. Спосіб продукування іп мйго поліпептидів з використанням еукаріотичної клітини за пп. 11-12, відповідно до якого поліпептиди кодуються вказаними сторонніми генами і який передбачає: а) культивування вказаних клітин у прийнятних умовах; та б) виділення поліпептидів, які кодуються вказаними сторонніми генами.
14. Еукаріотична клітина за пп. 11-12, яка відрізняється тим, що додатково містить експресуючий вектор, що сч ов несе вірусні гени та/(або вірусну векторну конструкцію, що кодує геном вірусного вектора під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17. і)
15. Спосіб продукування іп міїго вірусних часток, який відрізняється тим, що передбачає: а) культивування еукаріотичної клітини за пп. 11-12 в придатних умовах; та б) виділення вірусних часток. М зо
16. Еукаріотична клітина за пп. 11-12, 14, яка відрізняється тим, що додатково містить: а) експресійний вектор, що несе ретровірусну векторну конструкцію, здатну інфікувати клітини-мішені та с регулювати в цих клітинах-мішенях експресію одного або декількох сторонніх генів, присутніх у зазначеній с ретровірусній векторній конструкції; та б) один або декілька експресійних векторів, які несуть гени, що кодують поліпептиди і необхідні для со зв Теному вказаної ретровірусної векторної конструкції, упакованої під транскрипційним контролем промотору «о РНК-полімерази 17.
17. Спосіб для продукування вірусних часток, який відрізняється тим, що передбачає: а) культивування еукаріотичної клітини за п. 16 у придатних умовах; та б) виділення вірусних часток. «
18. Вакцина, що містить рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-9, яка використовується з фізіологічно з с прийнятним носієм. .
19. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1-9, який відрізняється тим, що використовується для одержання и?» вакцини.
20. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що застосовується для імунізації тварини, включаючи людину, що передбачає інокуляцію зазначеної тварини, включаючи людину, Ге» вакциною та/або рекомбінантним вірусом ММА.
21. Вакцина за п. 18, яка відрізняється тим, що застосовується для імунізації тварини, включаючи людину, що со передбачає інокуляцію зазначеної тварини, включаючи людину, зазначеною вакциною. 2)
22. Вакцина за п. 18, яка відрізняється тим, що містить рекомбінантний вірус ММА, включаючи ген, який кодує бр антиген або антигенну детермінанту пеї ВІ, для попередження або лікування ВІЛ-інфекції або СНІДУ. ю
23. Вакцина за п. 18, яка відрізняється тим, що містить рекомбінантний вірус ММА, включаючи ген, який кодує І антиген або антигенну детермінанту тирозинази людини, для попередження або лікування меланоми.
24. Вакцина, що містить як перший компонент рекомбінантний вірус ММА за п. 7 у фізіологічно прийнятному носії та як другий компонент - ДНК-послідовність, що несе антиген або антигенну детермінанту, під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 77 у фізіологічно прийнятному носії; при цьому два вказаних компоненти присутні разом або окремо. Ф) 25. Вакцина за п. 24, яка відрізняється тим, що використовується для імунізації тварини, включаючи людину, ка що передбачає інокуляцію вказаної тварини, включаючи людину, першим та другим компонентом вакцини або одночасно, або з певним інтервалом часу, з використанням одного і того ж сайта інокуляції. во 26. Спосіб імунізації тварини, який відрізняється тим, що передбачає інокуляцію вказаної тварини вакциною за пп. 18, 21-25, у якому компоненти вакцини за пп. 24-25 подаються одночасно або з певним інтервалом часу, але з використанням одного й того ж сайта інокуляції. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних 65 мікросхем", 2004, М 8, 15.08.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України.
UA97126424A 1995-07-04 1996-03-07 A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals UA68327C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK78295 1995-07-04
PCT/EP1996/002926 WO1997002355A1 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant mva virus, and the use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA68327C2 true UA68327C2 (en) 2004-08-16

Family

ID=8097499

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA97126424A UA68327C2 (en) 1995-07-04 1996-03-07 A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
UA20031212890A UA75410C2 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant virus mva and use thereof
UA20031212892A UA75411C2 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant virus of mva

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA20031212890A UA75410C2 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant virus mva and use thereof
UA20031212892A UA75411C2 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant virus of mva

Country Status (27)

Country Link
US (6) US6440422B1 (uk)
EP (3) EP1312678B1 (uk)
JP (3) JP4312260B2 (uk)
KR (1) KR19990028617A (uk)
CN (3) CN1782071A (uk)
AT (3) ATE239796T1 (uk)
AU (1) AU721735B2 (uk)
BR (1) BR9609303B8 (uk)
CA (3) CA2608864C (uk)
CZ (1) CZ292460B6 (uk)
DE (3) DE69628011T2 (uk)
DK (3) DK0836648T3 (uk)
EE (3) EE05138B1 (uk)
ES (3) ES2249647T3 (uk)
HK (2) HK1009830A1 (uk)
HU (2) HU229261B1 (uk)
IL (5) IL122120A (uk)
MX (1) MX9800025A (uk)
NO (1) NO322476B1 (uk)
NZ (1) NZ313597A (uk)
PL (1) PL186857B1 (uk)
PT (1) PT836648E (uk)
RU (1) RU2198217C2 (uk)
SI (3) SI0836648T1 (uk)
TW (2) TWI245075B (uk)
UA (3) UA68327C2 (uk)
WO (1) WO1997002355A1 (uk)

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
US7118754B1 (en) * 1996-07-30 2006-10-10 Transgene S.A. Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection
US6869793B2 (en) * 1996-09-24 2005-03-22 Bavarian Nordic Research Institute Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
MY119381A (en) * 1996-12-24 2005-05-31 Gsf Forschungszentrum Umwelt Recombinant mva virus, and the use thereof
US6969609B1 (en) * 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
FR2784997A1 (fr) * 1998-10-22 2000-04-28 Transgene Sa Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6682742B1 (en) 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
US20150231227A1 (en) * 2000-03-02 2015-08-20 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
PL205922B1 (pl) 2000-03-14 2010-06-30 Bavarian Nordic As Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu
DE10042598A1 (de) * 2000-08-30 2002-03-28 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS
WO2002031168A2 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 Genstar Therapeutics Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
IL154712A0 (en) 2000-11-23 2003-10-31 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US7740863B2 (en) 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
DE10143490C2 (de) * 2001-09-05 2003-12-11 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen
DE10144664B4 (de) * 2001-09-11 2005-06-09 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon
EP2345665A3 (en) 2001-12-04 2012-02-15 Bavarian Nordic A/S Flavivirus NS1 subunit vaccine
HU227507B1 (hu) * 2001-12-20 2011-07-28 Bavarian Nordic As Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl
EP1420822B2 (en) * 2002-04-19 2017-07-05 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
NZ536502A (en) 2002-05-16 2005-10-28 Bavarian Nordic As Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome for inducing an immune response in a mammal
PL372091A1 (en) * 2002-05-16 2005-07-11 Bavarian Nordic A/S Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter
PL215169B1 (pl) * 2002-09-05 2013-10-31 Bavarian Nordic As Sposób amplifikacji wirusów, kompozycja zawierajaca pokswirusa uzyskanego tym sposobem oraz jego zastosowanie do otrzymywania szczepionki
DE10249390A1 (de) * 2002-10-23 2004-05-13 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria
ATE365220T1 (de) * 2002-11-25 2007-07-15 Bavarian Nordic As Mindestens zwei ati promotoren enthaltendes rekombinantes pockenvirus
CN1723285B (zh) * 2003-02-18 2013-01-02 德国慕尼黑亥姆霍兹研究中心健康和环境有限公司 重组的mva及其产生方法
CA2515890C (en) * 2003-02-20 2013-09-17 Therion Biologics Corporation Novel insertion sites in pox vectors
US7731974B2 (en) * 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
JP2007524363A (ja) 2003-03-27 2007-08-30 オタワ ヘルス リサーチ インスティチュート 変異体水疱性口内炎ウイルスおよびそれらの使用
WO2004093905A1 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 City Of Hope Human cytomegalovirus antigens expressed in mva and methods of use
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
EP1648931B1 (en) 2003-07-21 2011-02-09 Transgene S.A. Multifunctional cytokines
US20100189747A1 (en) * 2003-07-31 2010-07-29 Raymond Weinstein Compositions and methods for treating or preventing hiv infection
EP1518932A1 (en) * 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
ATE471383T1 (de) * 2003-11-24 2010-07-15 Bavarian Nordic As Promotoren zur expression in modifiziertem vaccinia virus ankara
US7638132B2 (en) 2003-12-05 2009-12-29 National University Corporation Hokkaido University Highly safe smallpox vaccine virus and vaccinia virus vector
EP1683870A1 (en) * 2005-01-24 2006-07-26 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vaccines based on the use of MVA
US20090269365A1 (en) * 2005-04-20 2009-10-29 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
CA2670804A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Sanofi Pasteur Inc. Immunological composition
DK2530161T3 (en) * 2006-06-20 2018-06-06 Transgene Sa Process for the preparation of poxviruses and poxvirus compositions
US7972605B2 (en) * 2006-09-08 2011-07-05 Duke University Modified vaccinia ankara virus vaccine
US8481023B2 (en) * 2006-09-15 2013-07-09 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
ES2500465T3 (es) 2006-10-06 2014-09-30 Bavarian Nordic Inc. Virus vaccinia Ankara modificado recombinante que codifica antígeno HER-2 en combinación con un taxano para uso en el tratamiento del cáncer
US20080241139A1 (en) * 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
US20090175838A1 (en) * 2007-01-26 2009-07-09 Newell Rogers M Karen Methods of modulating immune function
US20110159018A1 (en) 2007-05-03 2011-06-30 Medizinische Universitat Innsbruck Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs
US8003363B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
US8012738B2 (en) * 2007-05-14 2011-09-06 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
US8003364B2 (en) * 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography
US20100285050A1 (en) * 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
BRPI0800485B8 (pt) * 2008-01-17 2021-05-25 Univ Minas Gerais vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose
AU2009214768B2 (en) 2008-02-12 2015-01-22 Sanofi Pasteur Limited Methods using ion exchange and gel filtration chromatography for poxvirus purification
WO2009152969A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
CA2760315C (en) 2009-04-30 2019-05-28 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) Modified immunization vectors
EP2461826A2 (en) 2009-08-07 2012-06-13 Transgene SA Composition for treating hbv infection
US9011874B2 (en) 2009-11-20 2015-04-21 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs
US9005632B2 (en) 2009-11-20 2015-04-14 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
GB201006405D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
EP2668201A2 (en) 2011-01-28 2013-12-04 Sanofi Pasteur SA Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
SI2691530T1 (en) 2011-06-10 2018-08-31 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
ES2813413T3 (es) 2011-08-05 2021-03-23 Sillajen Biotherapeutics Inc Métodos y composiciones para la producción de virus vaccina
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
DK2761011T3 (en) * 2011-09-26 2018-08-27 Theravectys USING GAG PROTEINS NON-SUBType B GAG FOR LENTIVIRAL PACKAGING
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
WO2013083254A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
US10357555B2 (en) 2012-07-10 2019-07-23 Transgene Sa Mycobacterial antigen vaccine
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
US9657076B2 (en) 2012-10-23 2017-05-23 Emory University GM-CSF and IL-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
US20140286981A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
SG11201605595YA (en) 2014-01-09 2016-08-30 Transgene Sa Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
GB201412494D0 (en) 2014-07-14 2014-08-27 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon Vector production
CN112121160A (zh) 2014-09-26 2020-12-25 贝斯以色列护理医疗中心有限公司 诱导针对人免疫缺陷病毒感染的保护性免疫性的方法和组合物
EP3244919A4 (en) 2015-01-12 2018-06-27 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3390430B1 (en) 2015-12-15 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
ES2944314T3 (es) 2016-01-08 2023-06-20 Geovax Inc Composiciones y procedimientos para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor
BR112018015696A2 (pt) 2016-02-03 2018-12-26 Geovax Inc composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus
AU2017222687B2 (en) * 2016-02-25 2022-02-24 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant MVA or MVADELE3L expressing human Flt3L and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
CN109219448B (zh) 2016-06-16 2022-09-20 扬森疫苗与预防公司 Hiv疫苗配制品
US10307477B2 (en) 2016-09-02 2019-06-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
US10793607B2 (en) 2016-09-15 2020-10-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Trimer stabilizing HIV envelope protein mutations
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
KR20200015759A (ko) 2017-06-15 2020-02-12 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Hiv 항원을 인코딩하는 폭스바이러스 벡터, 및 그 사용 방법
AU2018287159A1 (en) 2017-06-21 2020-01-16 Transgene Personalized vaccine
AU2018304502B2 (en) 2017-07-19 2022-03-31 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Trimer stabilizing HIV envelope protein mutations
WO2019018724A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS FOR SAFE INDUCTION OF MULTICLADED CROSS-IMMUNITY AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN HUMAN BEINGS
WO2019055888A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
CN111315407B (zh) 2018-09-11 2023-05-02 上海市公共卫生临床中心 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
WO2020237052A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
EP4051302A4 (en) * 2019-10-16 2024-03-13 Kalivir Immunotherapeutics Inc MANUFACTURER VIRUSES TO GENERATE RETROVIRUSES IN SITU
WO2021094984A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
EP3842065A1 (en) 2019-12-23 2021-06-30 Transgene Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine
WO2021260065A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
EP3928789A1 (en) 2020-06-24 2021-12-29 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
KR20240004764A (ko) 2021-04-30 2024-01-11 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. 변형된 mhc 발현을 위한 종양용해성 바이러스
EP4358999A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
EP4108257A1 (en) 2021-06-23 2022-12-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
WO2023220283A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Pellis Therapeutics, Inc. Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination
EP4316514A1 (en) 2022-08-03 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE787901A (fr) 1971-09-11 1972-12-18 Freistaat Bayern Represente Pa Vaccin antivariolique
JPH0795954B2 (ja) 1982-11-30 1995-10-18 アメリカ合衆国 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法
US5679511A (en) * 1986-10-06 1997-10-21 Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US5221610A (en) * 1988-05-26 1993-06-22 Institut Pasteur Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection
CN1042564A (zh) * 1988-11-11 1990-05-30 中国科学院上海生物化学研究所 乙肝疫苗的制备方法及其制品
JPH03271233A (ja) * 1990-03-19 1991-12-03 Inst Pasteur ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発
EP0613378A1 (en) 1991-10-28 1994-09-07 Institut Pasteur Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides
ATE215830T1 (de) * 1992-12-22 2002-04-15 Ludwig Inst Cancer Res Verfahren zur detektion und behandlung von individuen mit abnormal hla-a2/tyrosinase- peptidantigenen exprimierenden zellen
US5620886A (en) * 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
WO1995011255A1 (fr) * 1993-10-19 1995-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Peptide pouvant induire une reponse immune contre vih et agent contenant ce peptide pour la prevention ou le traitement du sida
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals

Also Published As

Publication number Publication date
AU721735B2 (en) 2000-07-13
US20070071769A1 (en) 2007-03-29
HUP9802217A2 (hu) 1999-01-28
PT836648E (pt) 2003-09-30
ATE239796T1 (de) 2003-05-15
ATE304057T1 (de) 2005-09-15
CA2225278C (en) 2009-01-27
EE04753B1 (et) 2006-12-15
KR19990028617A (ko) 1999-04-15
CA2608864C (en) 2010-09-07
HUP9802217A3 (en) 1999-09-28
DE69628011T2 (de) 2004-03-18
ES2249648T3 (es) 2006-04-01
DE69628011D1 (de) 2003-06-12
CA2608864A1 (en) 1997-01-23
DE69635172D1 (de) 2005-10-13
HK1009830A1 (en) 1999-06-11
DE69635173D1 (de) 2005-10-13
CN1189857A (zh) 1998-08-05
CN1782071A (zh) 2006-06-07
UA75411C2 (en) 2006-04-17
US8153138B2 (en) 2012-04-10
HU229261B1 (en) 2013-10-28
NZ313597A (en) 1999-01-28
UA75410C2 (en) 2006-04-17
NO980026D0 (no) 1998-01-02
IL122120A0 (en) 1998-04-05
HK1068015A1 (en) 2005-04-22
EE05138B1 (et) 2009-02-16
SI1312679T1 (sl) 2006-02-28
CN1554764B (zh) 2012-03-21
EP0836648A1 (en) 1998-04-22
EE200300332A (et) 2003-10-15
EP1312679A1 (en) 2003-05-21
CZ424197A3 (cs) 1998-03-18
SI0836648T1 (en) 2003-12-31
US6440422B1 (en) 2002-08-27
TWI245075B (en) 2005-12-11
PL324347A1 (en) 1998-05-25
US8197825B2 (en) 2012-06-12
WO1997002355A1 (en) 1997-01-23
JP4312260B2 (ja) 2009-08-12
EP1312678B1 (en) 2005-09-07
US20100266630A1 (en) 2010-10-21
SI1312678T1 (sl) 2006-02-28
BR9609303B1 (pt) 2014-04-08
BR9609303A (pt) 1999-05-25
ATE304058T1 (de) 2005-09-15
TW575664B (en) 2004-02-11
US20030035792A1 (en) 2003-02-20
DK1312678T3 (da) 2005-12-19
RU2198217C2 (ru) 2003-02-10
IL219528A0 (en) 2012-06-28
HU224061B1 (hu) 2005-05-30
CA2225278A1 (en) 1997-01-23
IL164318A0 (en) 2005-12-18
AU6611096A (en) 1997-02-05
JP4764366B2 (ja) 2011-08-31
JP4764367B2 (ja) 2011-08-31
DE69635172T2 (de) 2006-06-22
EP1312678A1 (en) 2003-05-21
CA2596274A1 (en) 1997-01-23
BR9609303B8 (pt) 2014-05-06
EE200300331A (et) 2003-10-15
EP1312679B8 (en) 2005-11-23
JPH11509091A (ja) 1999-08-17
CN1154742C (zh) 2004-06-23
CZ292460B6 (cs) 2003-09-17
IL122120A (en) 2005-07-25
EE9700344A (et) 1998-06-15
JP2007244382A (ja) 2007-09-27
DE69635173T2 (de) 2006-07-13
EP0836648B1 (en) 2003-05-07
EP1312679B1 (en) 2005-09-07
ES2249647T3 (es) 2006-04-01
ES2199294T3 (es) 2004-02-16
MX9800025A (es) 1998-03-31
NO980026L (no) 1998-01-02
JP2007252374A (ja) 2007-10-04
IL164318A (en) 2013-08-29
DK0836648T3 (da) 2003-08-25
IL202448A0 (en) 2011-07-31
TW200305646A (en) 2003-11-01
CN1554764A (zh) 2004-12-15
DK1312679T3 (da) 2006-01-09
NO322476B1 (no) 2006-10-09
US20100291139A1 (en) 2010-11-18
HU0402350D0 (en) 2005-01-28
EE04199B1 (et) 2003-12-15
US7198934B2 (en) 2007-04-03
IL212933A0 (en) 2011-07-31
US20070071770A1 (en) 2007-03-29
CA2596274C (en) 2010-09-07
PL186857B1 (pl) 2004-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA68327C2 (en) A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
NZ227562A (en) Recombinant vaccinia virus (mva) containing a dna insert coding for a foreign antigen
US20060002896A1 (en) Method of generating recombinant MVA
ES2380731T3 (es) Vacunas basadas en el uso de VMA