CZ292460B6 - Rekombinantní viry MVA, jejich použití, buňky jimi infikované a vakcíny, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Popisuj se rekombinantn viry MVA, kter obsahuj ciz geny inzertovan do m sta p°irozen se vyskytuj c delece v genomu MVA a jsou schopn tyto ciz geny exprimovat. D le se popisuje pou it t chto rekombinantn ch vir MVA pro produkci polypeptid , nap°. antigen nebo terapeutick²ch inidel, a pou it t chto vir pro p° pravu rekombinantn ch vir pro vakc ny nebo virov²ch vektor pro genovou terapii. D le se popisuj bu ky infikovan t mito viry a vakc ny, kter je obsahuj .\

Description

Rekombinantní viry MVA, jejich použití, buňky jimi infikované a vakcíny, které je obsahují

Oblast techniky

Tento vynález se týká rekombinantních virů vakcinie odvozených od modifikovaného viru vakcinie Ankara (MVA) a obsahujících a schopných exprese cizích genů inzertovaných do místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a použití těchto rekombinantních virů MVA pro produkci polypeptidů, jako jsou antigeny nebo terapeutická činidla nebo virové vektory pro genovou terapii a použití těchto rekombinantních virů MVA kódujících antigeny jako vakcíny.

Předmětem vynálezu je rekombinantní virus MVA, který může sloužit jako účinný a obzvláště bezpečný expresní vektor.

Dalším předmětem vynálezu je jednoduchý účinný a bezpečný způsob produkce polypeptidů, např. antigenů nebo terapeutických činidel, rekombinantních virů pro vakcíny a virových vektorů pro genovou terapii.

Dalším předmětem vynálezu je expresní systém založený na rekombinantním viru MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu a dále způsoby produkce polypeptidů, např. antigenů nebo terapeutických činidel nebo tvorby virových vektorů pro genovou terapii nebo vakcín založených na tomto expresním systému.

Dosavadní stav techniky

Virus vakcinie, člen rodu Orthopoxvirus rodiny Poxviridae, byl použit jako živá vakcína pro imunizaci proti lidskému onemocnění neštovicemi. Úspěšná celosvětová vakcinace virem vakcinie měla za důsledek vyhubení viru neštovic, která neštovice způsobuje. (Celosvětové vyhlazení neštovic. Závěrečná zpráva celosvětové komise pro ověření vyhlazení neštovic. Historie veřejného zdraví, č. 4, Ženeva: Světová zdravotnická organizace (dále WHO), 1980). Po zprávě uveřejněné WHO byla vakcinace obecně ukončena s výjimkou osob vystavených vysokému riziku infekce virem neštovic (např. laboratorních pracovníků).

V poslední době jsou vakciniové viry využívány pro úpravu vektorů pro expresi rekombinantních genů a pro potenciální využití jako rekombinantní živé vakcíny (Mackett, M., Smit, G. L. a Moss, B. (1982) P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G. L., Mackett, M. a Moss, B. (1984) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Toto využití zahrnuje sekvence DNA (nebo geny) kódující cizí antigeny, které jsou vpraveny pomocí metod založených na rekombinaci DNA do genomu vakciniových virů. Je-li gen zaintegrován do místa ve virové DNA, které není esenciální pro životní cyklus viru, potom je možné, aby se nově vytvořený rekombinantní vakciniový virus stal infekčním, tedy schopným infikovat cizí buňky s následnou expresí integrované sekvence DNA (EP Patentové aplikace č. 83, 286, a č. 110, 385). Rekombinantní viry vakcinie připravené tímto způsobem mohou být použity jako živé vakcíny pro profylaxi infekčních onemocnění a také mohou být využity pro přípravu heterologních proteinů v eukaryotních buňkách.

Rekombinantní virus vakcinie, ve kterém dochází k expresi genu bakteriofágové T7 RNA polymerázy, umožnil zavedení široce využitelných expresních systémů pro syntézu rekombinantních proteinů v savčích buňkách (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A., a Fuerst T. R. (1990) Nátuře 348, 91 až 92). Ve všech protokolech závisí exprese rekombinantního genu na syntéze T7 RNA polymerázy v cytoplasmě eukaryotních buněk. Nejoblíbenějším se stal protokol pro přechodnou expresi (Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W. a Moss, B. 1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126). Cizí gen se nejprve

-1CZ 292460 B6 inzertuje do plazmidu řízeného promotorem T7 RNA polymerázy. Dále je tento plazmid vpraven do cytoplazmy buněk infikovaných rekombinantním virem vakcinie produkujícím T7 RNA polymerázu za použití standardního postupu pro transfekci.

Transfekční protokol je velmi jednoduchý, neboť není třeba připravovat žádné nové rekombinantní viry a je velmi účinný, neboť k expresi genu dochází u více než u 80 % buněk (Elroy-Stein. O. a Moss, B. (1990) Proč. Acad. Sci. USA 87, 6743 až 6747). Výhodou hybridního systému vakciniový virus/T7 RNA polymeráza oproti jiným přechodným expresním systémům je velmi pravděpodobně jeho nezávislost na transportu plazmidů k buněčnému jádru. V minulosti se tento systém ukázal jako velmi užitečný pro analytické účely ve virologii a v buněčné biologii (Bunocore, L. a Rose, J. K. (1990) Nátuře 345, 625 až 628, Pattnaik, A. K. a Wertz, G. W. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1379 až 1383, Karschin, A., Aiyar,

J., Gouin, A., Davidson, N. a Lester, H. A. (1991) FEBS Lett. 278, 229 až 233, Ho, Β. Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H. A. a Davidson, N. (1992) FEBS Lett. 301, 303 až 306, Bucholz, C. J., Retzler C., Homann, Η. E., a Neubert, W. J. (1994) Virology 204, 770 až 776). Budoucí důležitá využití hybridního systému virus vakcinie/T7 RNA polymeráza, jako je například generace rekombinantních proteinů nebo rekombinantních virových částic pro nové terapeutické nebo profylaktické postupy u lidí však mohou být obtížná vzhledem k produktivní replikaci rekombinantního vektoru vakcinie.

Virus vakcinie je infekční vůči lidem a během potlačování neštovic byly u některých případů pozorovány vážné komplikace. Nejdokonalejší přehled o výskytu těchto komplikací je vypracován na základě průzkumu provedeného v rámci Spojených států, během kterého byla monitorována vakcinace přibližně 12 miliónů lidí vakcinovaných kmenem viru vakcinie dodaným Zdravotnickým výborem města New York City (Lané, J., Ruben, F., Neff, J. a Millar, J. (1969) New Engl. J. Med. 281, 1201 až 1208). Ze studie vyplývá, že nejslibnější možnosti využití viru vakcinie jako vektoru pro vývoj rekombinantních živých vakcín jsou ovlivněny bezpečnostními otázkami a nařízeními. Navíc, většina rekombinantních virů vakcinie popsaných v literatuře je založena na kmeni viru vakcinie Western Reserve. Na druhé straně je však známo, že tento kmen se vyznačuje vysokou virulencí a proto není vhodný pro použití u lidí a zvířat (Morita a kol., Vaccine 5, 65 až 70 (1987)).

Zdravotnické rizika vyplývající z použití vektorů mohou být snížena použitím vysoce zeslabeným kmenem viru vakcinie. Několik takových kmenů viru vakcinie bylo specificky vyvinuto pro účel zabránění nežádoucích vedlejších účinků vakcinace proti neštovicím. Proto býl modifikovaný virus vakcinie Ankara (MVA) vytvořen dlouhodobým sériovým průchodem kmenu viru vakcinie Ankara (CVA) fibroblasty kuřecího embrya (pro přehled, viz. Mayr., Hochstein-Mintzel, V. a Stickl, H. (1975) Infection 3, 6 až 14; Švýcarský patent 568, 392). Virus MVA byl uložen v souladu s požadavky Budapešťské dohody v CNCM (Pastérův institut, Národní sbírka kultur mikroorganismů, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15), dne 15. prosince 1987, pod depozitním číslem 1-721. MVA se vyznačuje svým značným zeslabením, tedy sníženou virulencí nebo infekčností za současného zachování značné imunogenicity. MVA virus byl analyzován za účelem zjištění změn v genomu vzhledem k nativnímu typu kmene CVA. Bylo identifikováno 6 významných delecí genomické DNA (delece I, Π, ΙΠ, IV, V, a VI) o celkovém počtu 31,000 párů bází (Meyer, H., Sutterr, G. A. Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031 až 1038). Výsledný virus MVA získal vysokou specificitu přijetí hostitelskými buňkami omezenou na ptačí buňky. MVA lze navíc charakterizovat jeho extrémním zeslabením. Během testování na různých zvířatech se MVA ukázal jako nevirulentní a to dokonce i u zvířat s potlačenou imunitou. Vynikající vlastnosti kmene MVA byly rovněž demonstrovány během extenzivních klinických zkoušek (Mayr a kol., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375 až 390 (1987), Stickl a kol., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386 až 2392 (1974)). Během těchto studií provedených na více než 120 000 lidech včetně vysoce rizikových pacientů nebyly žádné vedlejší příznaky spojeny s použitím vakcíny MVA.

-2CZ 292460 B6

Bylo zjištěno, že replikace MVA je blokována během pozdějšího stadia infekce, a tím je zabráněno jeho skladbě do komplexních infekčních virionů. Přesto však byl MVA schopen vysoké úrovně exprese virových i rekombinantních genů dokonce i v nepermisivních buňkách a byl navržen jako účinný a výjimečně bezpečný vektor pro expresi genů (Sutter, G. A. Moss, B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10847 až 10851). V poslední době byly zavedeny nové vektorové vakciniové systémy založené na MVA s cizími sekvencemi DNA inzertovanými v místě delece ΙΠ v genomu MVA nebo uvnitř genu TK (Sutter, G. a Moss, B. (1995) Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195 až 200 a patent US 5 185 146).

Pro další využití MVA je studován nový možný způsob zavedení cizích genů rekombinací DNA do kmene MVA viru vakcinie. Vzhledem k tomu, že účelem nebylo změnit genom viru MVA, bylo nutno použít metodu, která bude vyhovovat tomuto požadavku. Podle tohoto vynálezu je cizí sekvence DNA rekombinována do virové DNA přesně do místa přirozeně vyskytující se delece v genomu MVA.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou, mimo jiné, následující předměty, a to samotné nebo v kombinaci: Rekombinantní virus MVA, který obsahuje alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a je schopen exprese tohoto alespoň jednoho cizího genu; rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, který obsahuje a je schopen exprese alespoň jednoho cizího genu inzertovaného do místa delece Π v genomu MVA;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje markér, terapeutický gen nebo antigenní determinant;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant z patogenního viru, baktérie nebo jiného mikroorganizmu nebo z parazitu nebo z rakovinové buňky;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant z Plasmodium Falciparum, Mycobacteria, Herpes viru, chřipkového viru, hepatitis nebo z virů deficitu lidské imunity;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém antigenní determinant je HTV nef nebo lidská tyrosináza;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, kterým je MVA-LAInef nebo MVA-hTYR; rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu; rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, kterým je MVA-T7 pol;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém je cizí gen pod transkripční regulací raně-pozdního promotoru P7.5 virusu vakcinie;

rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, v podstatě neobsahující viry schopné replikace v lidských buňkách;

použití rekombinantního virusu MVA, jak je uveden výše, pro transkripci sekvencí DNA pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;

eukaryotická buňka infikovaná libovolným z výše uvedených rekombinantních virů MVA;

buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu;

buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu a dále obsahuje jeden nebo více expresních vektorů nesoucích jeden nebo více cizích genů pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;

použití buněk, jak jsou uvedeny výše, pro produkci polypeptidů kódovaných zmíněnými cizími geny, které zahrnuje:

a) kultivací uvedených buněk za vhodných podmínek, a

-3CZ 292460 B6

b) izolaci polypeptidu kódovaných uvedenými geny;

buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu a dále obsahuje expresní vektory nesoucí virové geny, a/nebo virový vektorový konstrukt kódující genom virového vektoru pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;

použití buněk, jak jsou uvedeny výše, pro produkci virových částic, které zahrnuje:

a) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, a

b) izolaci virových částic;

buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu, a dále obsahuje:

a) expresní vektor nesoucí retrovirální vektorový konstrukt schopný infikovat a řídit expresi jednoho nebo více cizích genů nesených uvedeným retrovirálním vektorovým konstruktem, v cílových buňkách, a

b) jeden nebo více expresních vektorů nesoucích geny kódující polypeptidy vyžadované pro sbalení genomu uvedeného retrovirálního vektorového konstruktu pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;

použití buněk, jak jsou uvedeny výše, pro produkci retrovirálních částic, které zahrnuje:

a) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, a

b) izolaci retrovirálních částic;

vakcína obsahující rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant, ve fyziologicky přijatelném nosiči;

použití rekombinantního viru MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant pro přípravu vakcíny;

použití vakcíny, jak je uvedena výše, pro imunizaci živého zvířecího těla, a to včetně lidského; použití vakcíny, jak je uvedena výše, obsahující MVA-LAInef pro prevenci nebo léčbu infekce HIV nebo AIDS;

použití vakcíny, jak je uvedena výše, obsahující MVA-hTYR pro prevenci nebo léčbu melanomů;

vakcína obsahující jako první složku rekombinantní virus MVA, jak je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu ve fyziologicky přijatelném nosiči a jako druhou složku sekvenci DNA nesoucí antigenní determinant pod transkripční regulací promotoru T7RNA polymerázy ve fyziologicky přijatelném nosiči, přičemž tyto dvě složky jsou obsaženy společně nebo jednotlivě;

použití vakcíny, jak je uvedena výše, pro imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského, která zahrnuje inokulaci uvedeného živého zvířecího těla, včetně lidského, první a druhou složkou vakcíny buďto zároveň, nebo s časovou prodlevou za použití stejného inokulačního místa; a

Výraz „gen“ znamená libovolnou sekvenci DNA, která kóduje protein nebo peptid.

Výraz „cizí gen“ znamená gen inzertovaný do sekvence DNA, ve které se přirozeně nevyskytuje.

Cizím genem může být například markerový gen, terapeutický gen, gen kódující antigenní determinant nebo virový gen. Tyto geny jsou v oboru dobře známy.

Modifikovaný virus vakcinie Ankara (MVA), vysoce zeslabený kmen viru vakcinie se specificky vymezenými hostiteli, je neschopný množení v lidských a ve většině jiných testovaných savčích buněčných liniích. Protože však exprese virových genů není omezena v nepermisivních buňkách, mohou být rekombinantní viry MVA podle vynálezu použity jako výjimečně bezpečné a účinné expresní vektory.

Rekombinantní vity MVA kódující antigenní determinant

-4CZ 292460 B6

Podle jednoho provedení se vynález týká rekombinantních virů vakcínie MVA, které obsahují gen kódující cizí antigen, s výhodou patogenního původu a vakcín obsahujících takový virus ve fyziologicky přijatelné formě. Vynález se také týká způsobů přípravy takových rekombinantních virů vakcínie MVA nebo vakcín a použití těchto vakcín pro profylaxi infekcí způsobených takovými patogenními agens.

Podle výhodného provedení vynálezu je cizím genem inzertovaným do virusu MVA gen kódující HIVnef.

Podle vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi genu HTV-1 nef pod regulací raně-pozdním promotorem P7.5 viru vakcínie.

Regulační protein Nef z primárních lentivirů je syntetizován v časné fázi virového replikačního cyklu a ukázal se být esenciálním pro replikaci s vysokým titrem viru a pro indukci onemocnění in vivo. Toto napovídá, že HIV Nef může mít klíčovou úlohu v patogenezi AIDS. Molekulární mechanismy, kteiými Nef přispívá ke zvýšené infektivitě viru a patogenitě HIV, je nutno dále zkoumat. Nef je však imunogenní a specifický antigen pro Nef může být použit jako vakcína proti infekci HIV a AIDS.

V tomto kontextu, rekombinantní virus MVA exprimující gen HIV nef, může být použit pro imunizaci lidí, jednak jako profylaktická vakcína proti lidskému HTV a jednak pro imunoterapii pacientů s AIDS nebo infikovaných HIV.

Navíc, rekombinantní virus MVA exprimující gen HIV nef, může být použit pro produkci rekombinantního proteinu HIV Nef.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je cizím genem inzertovaným do viru MVA gen kódující lidskou tyrosinázu.

Podle vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi genu lidské tyrosinázy pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 viru vakcínie. Lidská tyrosináza byla v poslední době identifikována jako nádorový antigen specifický pro melanomy, který umožňuje vznik protinádorových cytolytických T-lymfocytů (Brichard, V., a kol. (1993) J. Exp. Med. 178, 489 až 495). Vzhledem ktomu, že se zdá že z normálních buněk exprimují gen tyrosinázy pouze melanocyty, je tyrosináza vhodným cílovým antigenem pro imunoterapii melanomů. Rekombinantní virus MVA exprimující gen lidské tyrosinázy, může být proto použit u pacientů s melanomem pro indukci imunitní odezvy, která vyvolává odmítnutí nádoru nebo zabraňuje vzniku metastáz. Rekombinantní virus MVA exprimující gen lidské tyrosinázy může být použit přímo jako vakcína proti melanomů nebo může být použit pro přípravu vakcín proti melanomů. V jednom příkladě může být rekombinantní virus MVA exprimující gen lidské tyrosinázy použit pro produkci rekombinantního proteinu tyrosinázy, který je používán jako antigen pro vakcíny. V jiném příkladě lze za použití rekombinantního viru MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy jako expresního vektoru modifikovat buňky získané od pacienta s nádorem in vitro tak, aby exprimovaly tyrosinázu, a poté je přenést zpět do pacienta pro indukci protinádorové imunitní odpovědi. Vakcína připravená na bázi rekombinantního MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy může být použita buďto parenterálně, nebo lokálně v místě nádoru pro prevenci metastázování nebo fenotypickou změnu nádoru, jako například změnu velikosti, tvaru, celistvosti, vaskularizace nebo jiných znaků. Vakcína připravená na bázi rekombinantního MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy může být použita před, během nebo po chirurgickém odstranění nádoru.

Pro přípravu vakcín jsou viry vakcínie MVA podle vynálezu převedeny do fyziologicky přijatelné formy. To lze provést na základě zkušenosti z přípravy vakcín MVA použitých při vakcinaci proti neštovicím (jak popsali Stickl, H. a kol. (1974) Dtsch.med.Wschr.99, 2386 až

-5CZ 292460 B6

2392). Typicky, je přibližně ΙΟ⁶—10⁸ částic rekombinantního MVA lyofílizováno ve lOOml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem (PBS) za přítomnosti 2% peptonu a 1% lidského albuminu v ampuli, výhodně ve skleněné. Lyofílyzát může obsahovat plnidla (jako je mannitol, dextran, sacharóza, glycin, laktóza nebo polyvinylpyrrolidon) nebo jiné přídavky (jako jsou antioxidanty, stabilizátory, apod.) vhodné pro parenterální podání. Skleněná ampule je poté utěsněna a lze ji skladovat, s výhodou při teplotách pod -20 °C, po dobu několika měsíců.

Pro vakcinaci nebo terapii, lze lyofílizovat rozpustit v 0,1 až 0,5 ml vodného roztoku, výhodně fyziologického roztoku a může být aplikován buďto parenterálně, například nitrosvalovou inokulací, nebo lokálně, například inokulací do nádoru nebo v místě nádoru. Vakcíny nebo terapeutické prostředky podle vynálezu jsou výhodně vpichovány nitrosvalově (Mayr, A. a kol. (1978) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 167, 375 až 390). Způsob podání, dávku a počet podání může odborník v oboru známým způsobem optimalizovat. Může být vhodné podávat vakcínu několikrát během dlouhého časového období pro dosažení náležité imunitní odezvy proti cizímu antigenu.

Použití rekombinantních virů MVA pro přípravu heterologických polypeptidů

Rekombinantní viry vakcinie MVA podle vynálezu lze rovněž použít pro přípravu heterologických polypeptidů v eukaryotních buňkách. To předpokládá, že se buňky infikují rekombinantní viry vakcinie. V buňkách dochází k expresi genu kódujícího cizí polypeptid a exprimovaný heterologický polypeptid je izolován. Způsoby používané pro produkci takových heterologických polypeptidů jsou odborníkům v oboru obecně známy (EP-A-206 920 a EP-A205 939). Polypeptidy produkované pomocí rekombinantních virů MVA jsou z důvodů specifických vlastností virů MVA vhodnější pro použití jako léčiva pro lidi a zvířata.

Rekombinantní viry MVA kódující T7 RNA polymerázu a jejich použití pro expresi sekvencí DNA pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.

Podle dalšího provedení vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi bakteriofágového genu polymerázy T7 RNA pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 viru vakcinie. Užitečnost rekombinantních virů MVA-T7pol jako expresního systému byla testována pomocí zkoušek přechodné transfekce, během kterých byla indukována exprese rekombinantních genů pod regulací promotoru T7 RNA polymerázy. Za použití genu chloramfenicol acetyltransferázy (CAT) E. colijako reportérového genu bylo zjištěno, že MVAT7pol indukoval expresi genu CAT stejně tak účinně jako vakcínie/T7pol rekombinantní virus odvozený od replikačně kompetentního kmene WR viru vakcinie.

Hybridní systém MVA/T7 polymeráza podle vynálezu tak může být použit jako jednoduchý účinný a bezpečný savčí expresní systém pro produkci polypeptidů bez produktivní replikace viru vakcinie.

Tento expresní systém může být také použit pro generování rekombinantních virových částic pro vakcinaci nebo pro genovou terapii transformací buněčných linií infikovaných rekombinantním MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu, s konstrukty DNA obsahujícími všechny nebo některé z genů a genom nebo rekombinantní genom potřebný pro generování virových částic, například částic MVA nebo retrovirových částic pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.

Retrovirový vektorový systém se skládá ze dvou složek:

1) retrovirový vektor samotný je modifikován retrovirem (vektorovým plazmidem), ve kterém geny kódující virové proteiny byly nahrazeny terapeutickými geny a markerovými geny, které mají být přeneseny do cílových buněk. Protože nahrazení genů kódujících virové proteiny účinně virus inaktivuje, musí být aktivován druhou složkou systému, která modifikovanému retroviru poskytne chybějící virové proteiny.

-6CZ 292460 B6

Druhou složkouje:

2) buněčná linie, která produkuje veliká množství virových proteinů, nedisponuje však schopnosti produkovat replikačně kompetentní virus. Taková buněčná linie je známa jako sbalovací buněčná linie a skládá se z buněčné linie transfektované jedním nebo více plazmidy nesoucími geny (geny kódující polypeptidy gag, pol a env), umožňující sbalení modifikovaného retrovirového vektoru.

Pro účely generování sbaleného vektoru je vektorový plazmid transfektován do sbalovací buněčné linie. Za těchto podmínek je modifikovaný retrovirální genom obsahující inzertované terapeutické a markerové geny transkribován z vektorového plazmidu a sbalován do modifikovaných retrovirových částic (rekombinantních virových částic). Tento rekombinantní virus je poté použit pro infekci cílových buněk, ve kterých je vektorový genom a libovolné nesené markerové nebo terapeutické geny integrován do DNA cílových buněk. Buňky infikované takovou rekombinantní virovou částicí nemohou produkovat nový vektorový virus, neboť v nich nejsou přítomny žádné virové proteiny. DNA vektoru nesoucího terapeutického a markerové geny je však integrována do DNA těchto buněk a v infikovaných buňkách může být exprimována.

Rekombinantní virus MVA exprimující T7 RNA polymerázu podle vynálezu může být použit pro produkci proteinů nutných pro sbalení retrovirových vektorů. Pro tento účel jsou retrovirové geny gag, pol a env (např. virů myší leukémie, Murine Leukemia Virus (MLV)) podřízeny transkripční regulaci promotoru T7 RNA polymerázy v jednom nebo ve více expresních vektorech (např. plazmidech). Expresní vektory jsou poté přeneseny do buněk infikovaných rekombinantním virem MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu spolu s expresním vektorem nesoucím retrovirový vektorový konstrukt, popřípadě pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.

WO 94/29437, WO 89/11539 a WO 96/07748 popisují různé druhy retrovirálních vektorových konstruktů, které mohou být sbaleny za použití výše uvedeného sbalovacího systému.

Další použití rekombinantního viru MVA exprimujícího T7 RNA polymerázu spočívá v generování rekombinantního proteinů, neinfekčních virových částic nebo infekčních mutantních virových částic pro produkci vakcín nebo terapeutických činidel (Buchholz a kol., Virology, 204, 770 až 776 (1994) a EP-B1-356695). Pro tento účel jsou virové geny (např. gagpol a geny env HTV-1) umístěny pod transkripční regulaci promotoru T7 v expresním vektoru (např. plazmidu nebo jiném rekombinantním viru MVA). Tento konstrukt je poté přenesen do buněk infikovaných rekombinantním virem MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu. Rekombinantní virové geny jsou transkribovány s vysokou účinností, rekombinantní proteiny jsou produkovány ve vysokém množství a mohou být purifikovány. Navíc, exprimované rekombinantní virové proteiny (např. HTV-1 env, gag) mohou aglomerovat do virových pseudočástic, které vystupují z buněk a mohou být izolovány z tkáňového kultivačního média. Podle jiného provedení vynálezu mohou virové proteiny (např. z HTV, SIV, spalničkového viru), exprimovaná systémem MVA-T7pol, aktivizovat další introdukovaný mutantní virus (odvozený např. od HIV, STV, spalničkového viru) tím, že pomáhají překonat nedostatky během připojení a infekce, rozbalení, replikace nukleových kyselin, exprese virových genů, aglomerace nebo během jiného kroku virového množení, a tím umožňovat produkci a purifikaci zmíněného mutantního viru.

MVA-T7pol může být také použit společně se sekvencemi DNA nesoucími gen antigenu, který je předmětem zájmu (např. gen HIV, nef, tat, gag, pol nebo env nebo jiné), pro imunizaci. Nejprve je sekvence kódující daný antigen (např. HIV, HCV, HPV, HSV, spalničkového viru, chřipkového viru nebo jiných) klonována pod regulaci promotoru T7 RNA-polymerázy výhodně v plazmidovém vektoru a výsledný konstrukt DNA je amplifikován a purifikován za použití standardních laboratorních postupů. Dále, je vektorová DNA inokulována zároveň nebo v příslušném časovém odstupu se systémem MVA-T7pol. V místě inokulace dochází

-7CZ 292460 B6 k přechodné expresi rekombinantního genu v buňkách obsahujících zároveň vektorovou DNA a MVA-T7pol a odpovídající antigen je vystaven hostitelskému imunitnímu systému s výslednou stimulací imunitní odezvy specifické pro tento antigen. Tento postup, využívající nereplikující vektor vakcínie MVA-T7pol, představuje slibnou novou strategii pro vakcinaci nukleových kyselin umožňující účinnou přechodnou expresi daného antigenu, a to za eliminace současného možného rizika konstitutivní exprese genu.

Rekombinantní viry vakcínie MVA mohou být připraveny jak je uvedeno dále.

Konstrukt DNA obsahující sekvenci DNA kódující cizí polypeptid ohraničenou sekvencemi DNA z MVA přilehlými k přirozeně existující deleci, např. deleci Π v genomu MVA, je vnesena do buněk infikovaných MVA pro umožnění homologické rekombinace.

Po vnesení konstruktu DNA do eukaryotní buňky a po rekombinaci cizí DNA s virovou DNA je možno izolovat požadovaný rekombinantní virus vakcínie známým způsobem, výhodně pomocí markéru (srov. Nakano a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 1593 až 1596 (1982), Franke a kol., Mol. Cell. Biol. 1918 až 1924 (1985), Chakrabarti a kol., Mol. Cell. Biol. 3403 až 3409 (1985), Fathi a kol., Virology 97 až 105 (1986)).

Konstrukt DNA pro inzerci může být lineární nebo cirkulámí. Výhodná je cirkulámí DNA, zvláště plazmid. Konstrukt DNA obsahuje sekvence ohraničující na levé i na pravé straně přirozeně se vyskytující deleci, např. deleci Π v genomu MVA (Altenburger, W., Suter, C. P. a Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105,15 až 27).

Cizí sekvence DNA je inzertována mezi sekvence ohraničující přirozeně se vyskytující deleci. Cizí sekvencí DNA může být gen kódující terapeuticky polypeptid, např. t-PA nebo interferon, nebo antigenní determinant z patogenního agens. Patogenními agens mohou být viry, baktérie a paraziti., kteří mohou způsobovat onemocnění, stejně jako i nádorové buňky, které se neomezeně množí v organizmu a mohou tak vést k patologickému růstu. Příklady takových patogenních agens jsou popsány v Davis B. D. a kol., (Microbiology, 3. vyd., Harper Intemational Edition). Výhodnými antigeny patogenních agens jsou antigeny virů deficitu lidské imunity (např. HIV-1 a HIV-2), antigeny mykobakterií způsobujících tuberkulózu, antigeny parazitu Plasmodium falciparum a antigeny buněk melanomu.

Pro účely exprese sekvence DNA nebo genu, je nutné, aby byly v DNA přítomné regulační sekvence, které jsou nutné pro transkripci genu. Takové regulační sekvence (zvané promotoiy) jsou odborníkům v oboru známé a patří mezi ně například tyto sekvence z genu vakcínie o velikosti 11 kDa, jak jsou popsány v EP-A-198 328 a sekvence genu o velikosti 7,5 kDa (EP-A110,385).

Konstrukt DNA může být vnese do buněk infikovaných MVA transfekcí, například metodou srážení fosforečnanem vápenatým (Graham a kol., Viril, 52, 456 až 467 (1973); Wigler a kol., Cell 777 až 785 (1979) elektroporací (Neumann a kol., EMBO J. 1, 841 až 845 (1982)), mikroinjekcí (Graessmann a kol., Meth. Enzymology 101, 482 až 492 (1983)), pomocí lipozómů (Straubinger a kol., Methods in Enzymology 101, 512 až 527 (1983)), pomocí sféroplastů (Schaffher, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 2163 až 2167 (1980)) nebo jinými metodami známými odborníkům v oboru. Výhodná je transfekce metodou srážení fosforečnanem vápenatým.

Následující detailní příklady jsou určeny pro dokonalejší pochopení tohoto vynálezu. Je však třeba mít na zřeteli, že rozsah vynálezu není těmito příklady nijak omezen.

-8CZ 292460 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1:	Schématická mapa genomu MVA a plazmidu pro inzerci cizí DNA homologickou rekombinací: restrikční místa HindUI v genomu MVA jsou uvedena v horní části. Je znázorněn N-fragment HindUI-HindlU o délce 900 párů bází, který překrývá spojení delece Π v genomu MVA. Sekvence DNA MVA sousedící s delecí Π (bokl a bok2) byly amplifikovány pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) a použity pro konstrukci plazmidu pro inzerci pUC Π LZ.
Obrázek 2:	pUC Π LZ P7.5: Vektorový plazmid MVA pro inzerci do delece Π obsahující expresní kazetu Pll-LacZ a raně-pozdní promotor P7.5 viru vaccinie pro expresi požadovaných genů, které mohou být klonovány do místa Smál v plazmidu.
Obrázek 3:	pUCII LZdel P7.5: Vektorový plazmid MVA pro inzerci cizích genů do místa delece Π v genomu MVA, obsahující autodeleční expresní kazetu Pl 1-LacZ a raněpozdní promotor P7.5 viru vakcinie pro expresi požadovaných genů, kteiý může být klonován do klonovaného místa Smál/Not 1 v plazmidu.
Obrázek 4:	Konstrukce rekombinantního viru MVA.T7pol: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindlII) a vektorový plazmid pUC Π LZ T7pol, který umožňuje inzerci genu T7 RNA polymerázy do místa delece Π v N-fragmentu HindUI genomu MVA.
Obrázek 5:	Analýza MVA-T7pol virové DNA Southemovým přenosem
Obrázek 6:	Metabolické znamení proteinů za použití [35S]methioninu, analýzy SDS PAGE. Pruh 1: MVA T7pol, pruh 2: MVA, pruh 3: buňky CV-1.
Obrázek 7:	Test CAT: buňky CV-1 transfektované plazmidem obsahujícím gen CAT pod regulací promotoru T7 RNA-polymerázy a infikované MVA-T/pol nebo WRT7pol. U lyzátů byla testována aktivita CAT. C znamená chloramfenikol a 1-AcC a 3-AcC znamená mono- a triacetylované formy chloramfenikolu. Aktivita Cat je vyjádřena jako procentuální podíl acetylovaného produktu tvořeného za 60 min.
Obrázek 8:	Konstrukce MVA-LAInef: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindUI) a vektorový plazmid pUC Π LZdel P7.5-LAInef, který umožňuje inzerci genu nef HTV-1 LAI do místa delece Π v N-fragmentu Hind ΠΙ genomu MVA.
Obrázek 9:	Konstrukce MVA-TYR: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindUI) a vektorový plazmid pUC Π LZdel P7.5-TYR, který umožňuje inzerci genu lidské tyrosinázy do místa delece Π v N-fragmentu Hind ΠΙ genomu MVA.

Příklady provedení vynálezu

1. Množení a purifíkace virů

1.1 Množení viru MVA

Virus MVA je vakciniový virus o vysokém zeslabení, odvozený z vakciniového virového kmene Ankara (CVA) dlouhodobým průchodem fíbroblastovými kulturami primárního kuřecího embrya (CEF). Obecný přehled o historii jeho přípravy, o vlastnostech a použití kmene MVA je podán

-9CZ 292460 B6 v publikaci Mayr a kol., Infection 3, 6 až 14 (1975). Vzhledem k vysokému stupni zeslabení v CEF je virus MVA replikován s vysokým titrem v těchto ptačích hostitelských buňkách. V samčích buňkách je však množení MVA podstatně omezené a nelze zaznamenat tvorbu plaků typických pro virus. Proto byl virus MVA množen v buňkách CEF. Za účelem přípravy buněk CEF jsou 11 dnů stár embrya izolována zinkubovaných kuřecích vajec, vedlejší složky jsou odstraněny, embrya jsou rozdrcena a disociována v roztoku 0,25% trypsinu při 37 °C po dobu 20 minut. Výsledná buněčná suspenze je filtrována a buňky jsou sedimentovány centrifugací při 2000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při pokojové teplotě po dobu 5 minut, resuspendovány v 10 objemech média A (MEM Eagle, například dostupné z Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany) a znovu sedimentovány centrifugací při 2000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Buněčná peleta je rekonstituována v médiu A obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS), penicilín (100 jednotek/ml), streptomycin (100 mg/ml) a 2 mM glutamin s výsledným vytvořením buněčné suspenze obsahující 500 000 buněk/ml. Buňky CEF získané tímto způsobem byly rozetřeny na kultivačních miskách. Poté byly ponechány v médiu A v inkubátoru s CO₂ při 37 °C po dobu 1 až 2 dnů, podle požadované buněčné hustoty a dále byly použity pro infekci buďto přímo, nebo po následujícím průchodu buňkami. Detailní popis přípravy primárních kultur lze nalézt v knize R. I. Freshneyho, „Kultivace zvířecích buněk“, Alan R. Liss Verlag, New York (1983), kapitola 11, str. 99.

Viry MVA byly použity pro infekci podle následujícího. Buňky CEF byly kultivovány v kultivačních nádobách o ploše 175 cm². Při 90 až 100% konfluenci bylo médium odstraněno a buňky byly inkubovány po dobu jedné hodiny se suspenzí viru MVA (0,01 infekčních jednotek (IU) na buňku, 0,02 ml/cm²) v médiu A. Poté bylo přidáno více média A (0,2 ml/cm²) a nádoby byly inkubovány při 37 °C po dobu 2 až 3 dnů (dokud přibližně 90 % buněk nezačalo vykazovat cytopatogenní efekt). Hrubé virové zásobní ekvivalenty byly připraveny setřením vrstev do média a peletizací buněčného materiálu centrifugací při 3000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při 4 °C po dobu 5 minut. Hrubý virový přípravek byl uložen do -20 °C pro další zpracování (např. purifikací viru).

1.2 Purifikace virů

Purifikační postup pro získání virového preparátu o pokud možno nejvyšší čistotě a zbaveného složek specifických pro hostitelskou buňku je podobný postupu popsanému autorem Joklik (Virology 18, 9 až 18 (1962)). Hrubé virové zásobní preparáty, uložené při -20 °C byly rozmraženy a suspendovány jednou v PBS (v deseti až dvaceti násobném objemu) a suspenze byla odstředěna jak je popsáno výše. Nový sediment byl suspendován v 10 objemech v pufru Tris 1 (lOmM Tris-HCl, pH 9,0) a suspenze byla krátce vystavena ultrazvuku (Labsonic L, B. Braun Biotech Intemational, Melsungen Germany; 2 x 10 sekund při 60 wattech a při pokojové teplotě) za účelem další dezintegrace buněčných zbytků a uvolnění virových částic z buněčného materiálu. Buněčná jádra a větší buněčné zbytky byly odstraněny během následné krátké centrifugace suspenze (rotor Sorvall GSA dodaný firmou DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minuty při 300 ot/min při 10 °C). Sediment byl znovu resuspendován v pufru Tris 1, vystaven ultrazvuku a centrifugován jak uvedeno výše. Supematanty obsahující volné virové částice byly spojeny a rozlity na podkladnou vrstvu z 10 ml 36% sacharózy v 10 mM Tris-HCl, pH 9,0 a centrifugovány v rotoru Beckman SW 27/SW 28 po dobu 80 minut, při 13 500 ot/min a při 4°C. Supematant byl odstraněn a sediment obsahující virové částice byl přenesen do 10 ml lmM Tris-HCl, pH 9,0, homogenizován krátkým vystavením ultrazvuku (2x10 sekund při pokojové teplotě, zařízení stejné jako výše uvedené) a přenesen do 20 až 40% gradientu sacharózy (sacharóza v 1 mM Tris-HCl, pH 9,0) pro další purifikaci. Gradient byl centrifugován v rotoru Beckman SW41 při 13 000 ot/min po dobu 50 minut a při 4°C. Po centrifugací byly jednotlivé rozlišené frakce obsahující virové částice shromážděny pipetováním po odsátí objemů nad frakcemi. Získaný roztok sacharózy byl naředěn třemi objemy PBS a virové částice byly znovu sedimentovány centrifugací (Beckman SW 27/28, 60 minut při 13 500 ot/min a 4 °C). Peleta, která v tomto kroku obsahovala většinou čisté virové částice byla resuspendována v PBS a upravena do koncentrace virů odpovídající v průměru 1 až 5x 10^-9

-10CZ 292460 B6

IU/ml. Purifikovaný virový zásobní roztok byl uložen do -80 °C a použit buďto přímo, nebo naředěný roztokem PBS pro další experimenty.

I. 3 Klonování viru MVA

Pro získání homogenních zásobních virových preparátů, virus MVA, získaný od prof. Antona Mayra, byl klonován limitujícím ředěním během třech následných průchodů přes CEF kultivovaných na tkáňových kultivačních miskách o 96 mikromiskách. Klon viru MVA F6 byl vybrán a rozmnožen v CEF za účelem získání pracovních roztoků, které sloužily jako zahajovací materiál pro generování rekombinantních virů MVA popsaných v této patentové publikaci i pro generování rekombinantních virů MVA popsaných dříve (Sutter, G. a Moss, B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10747 až 10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994)) Vaccine 12, 1032 až 1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. a Lifson, J. (1996)

J. Virol. 70, 3741 až 3752).

2. Konstrukce a charakterizace rekombinantních virů MVA

2.1 Konstrukce vektorových plazmidů

Nové vektorové plazmidy byly vytvořeny pro umožnění generování rekombinantních virů MVA. Inzerce cizích genů byla cílena přesně do místa přirozené delece Π v genomu MVA. Sekvence DNA MVA ohraničující místo delece o délce 2500 párů bází N-fragmentu Hindin genomu MVA (Altenburger, W., Suter, C. P. a Altenburger, J. (1989), J. Arch. Virol. 105, 15 až 27) byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány do vícenásobného klonovacího místa plazmidu pUC18. Primery pro levý bok o délce 600 párů bází DNA byly tyto: 5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' a 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (místa restrikčních enzymů KpnI a Smál jsou podtržena). Primery pro pravý bok o délce 550 párů bází DNA byly tyto: 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' a 5'-CAG CAG GCA TGC CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA3' (místa restrikčních enzymů Pst I a Sphl jsou podtržena). Mezi tyto boky DNA MVA, inzertované do pUC18, byl inzertován gen Eschericia coli lacZ pod regulací pozdního promotoru Pil vakciniového viru (připravený restrikčním štěpením ζρΙΠ LZ, Sutter, G. a Moss, B. (1992) PNAS USA 89, 10847 až 10851), s použitím místa BamHI, pro generování vektoru pUCII LZ (Obrázek 1) pro inzerci MVA. Dále, fragment o délce 289 párů bází obsahujících raně-pozdní promotor P7.5 vakciniového viru spolu s místem Smál pro klonování (připravený restrikčním štěpením s EcoRI a Xbal z plazmidového vektoru pSCl 1 (Chakrabati a kol., 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403 až 3409)) byl inzertován do místa Smál v pUCII LZ za vzniku MVA vektoru pUCII LZ P7.5 (Obrázek 2). Pro konstrukci vektorového plazmidu, který umožňuje izolaci rekombinantních virů MVA pomocí přechodné syntézy reportérového enzymu βgalaktosidázy, DNA fragment o 330 párech bází z 3'-terminálu otevřeného čtecího rámce E. coli LacZ byl amplifikován pomocí PCR (primery byly: 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC GCG CTT ACT GCC GCC-3' a 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG3') a klonován do míst Sáli a Pstl v pUC Π LZ P7.5 pro vytvoření MVA vektoru pUC Π LZdel P7.5 (Obrázek 3). S použitím místa Smál může být tento vektorový plazmid použit pro inzerci sekvencí DNA kódující cizí gen regulací promotoru P7.5 vakciniového viru do genomu MVA. Po izolaci požadovaného rekombinantního viru screeningem exprese β-galaktosidázové aktivity, další propagace rekombinantního viru vede k auto-deleci expresní kazety PÍ 1-LacZ.

2.2 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA T7pol

Fragment DNA o 3,1 tisíc párů bází obsahující úplný gen bakteriofágu T7 RNA polymerázy pod regulaci raně-pozdního promotoru P7.5 vaccinia viru byl vyštěpen pomocí EcoRI z plazmidu

-11CZ 292460 B6 pTF7-3 (Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W. a Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 9122 až 8126), modifikován inkubací sKlenow DNA polymerázou s cílem vytvoření tupých konců a klonován do jediného restrikčního místa Smál v pUCII LZ pro vytvoření plazmidového přenosného vektoru pUCII LZ T7pol (Obrázek 4). Jako regulátor transkripce pro expresi genu T7 RNA polymerázy byl vybrán raně-pozdní promotor P7.5 vakciniového viru. Na rozdíl od silnějšího promotoru vakciniového viru (např. PÍ 1), tento promotorový systém umožňuje expresi rekombinantních genů okamžitě po infekci cílových buněk. Plazmid pUCII LZ T7pol, který řídí inzerci cizích genů do místa delece II v genomu MVA, byl použit pro vytvoření rekombinantního viru MVA T7pol.

Buňky infikované MVA při četnosti 0,05 TCID50 na buňku byly transfektovány DNA plazmidu pUCII LZpol popsaného dříve (Sutter, G., Wyat, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032 až 1040). Rekombinantní virus MVA produkující T7 RNA polymerázu a zároveň β-D-galaktosidázu (MVA P7.5-T7pol) byl vybrán během pěti konsekutivních cyklů plakové purifikace v buňkách CEF obarvených 5-bromo-Á—chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázou (300 μg/ml). Rekombinantní viiy byly následně amplifikovány infekcí vrstvy CEF a DNA byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů. Analýza virové DNA MVA-T7pol pomocí Southemového přenosu prokázala stabilní integraci rekombinantních genů v místě delece Π v genomu MVA (Obrázek 5).

Pro monitorování exprese T7 RNA polymerázy prostřednictvím rekombinantního MVA T7pol byly analyzovány polypeptidy označené (³⁵S)methioninem z kultury infikované virem. Vrstvy tkáňové buněčné linie z opičích ledvin CV-1 kultivované ve 12 mikromiskách byly infikovány virem o četnosti 20 TCID50 na buňku. V čase 3 až 5 hodin po infekci bylo médium odstraněno a kultury byly opláchnuty 1 ml média zbaveného methioninu. Do každé mikromisky bylo přidáno 0,2 ml média zbaveného methioninu a obohaceného 50pCi (³⁵S)methioninu a byla provedena inkubace po dobu 30 min při 37 °C. Cytoplasmatické extrakty infikovaných buněk byly připraveny inkubací každé mikromisky v 0,2 ml 0,5% lyrickém bufru Nonidet P-40 po dobu 10 min při 37 °C a vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE. Metabolické značení buněk CV-1 s použitím MVA T7pol prokázalo syntézu dvou dalších polypeptidů (i) proteinu o velikosti přibližně 116 000 Da představujícího β-galaktosidázu z E.coli produkovanou pro umožnění screeningu rekombinantního viru a (ii) proteinu o velikosti 98 000 Da odpovídající bakteriofágová T7 RNA polymeráze (Obrázek 6). Pozoruhodné je vysoké množství βgalaktosidázy produkované přes MVA T7pol. Výsledky získané z experimentů založených na značení in vivo demonstrují velmi silnou expresi genetické konstrukce Pll-ZacZ při inzerci do MVA genomu v místě delece Π, což indikuje, že exprese rekombinantních genů vektorových virů MVA může být účinnější, jsou-li inzertovány do tohoto místa v genomu MVA.

Užitečnost rekombinantních virů MVA-T7pol jako expresního systému v porovnání sWRT7pol rekombinantním virem vTF7-3 (Fuerst a kol., 1986) byla testována kotransfekcí DNA plazmidového vektoru odvozeného od pTMl (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A., a Fuerst T. R. (1990) Nátuře 348,91 až 92) a obsahujícího (klonovaný do míst Ncol a BamHI násobného klonovacího místa v pIMl) gen E. coli chloramfenikol acetylfosferázy (CAT) pod regulací promotoru T7 RNA polymerázy (PT₇). Transfektované a infikované buňky CV-1 byly suspendované v 0,2 ml 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5). Po třech cyklech zmrazování a roztávání lyzáty byly vyčištěny centrifugací, byl určen proteinový obsah supematantu a vzorky obsahující 0,5, 0,25 a 0,1 celkového proteinu byly testovány pro enzymatickou aktivitu jak je popsáno vMackett, M., Smith, G. L. a Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857 až 864. Po autoradiografii byly označené body kvantifikovány s použitím systému pro imaginativní analýzu Fuji. Výsledky demonstrují, že s použitím vysoce zeslabeného vakciniového vektoru MVA je možné využít systém vakciniový virus-T7 RNA polymerázy stejně tak účinně, jako při použití rekombinantu kompetentního vaccinia viru s plnou replikací (Obrázek 7).

-12CZ 292460 B6

2.3 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA-LAInef

Fragment DNA o 648 párech bází obsahující celý gen nef z HIV-1 LAI byl připraven pomocí PCR zplazmidové DNA (pTG1166 laskavě poskytnuté panem Μ. P. Kieny, Transgene S. A., Strasbourg; PCR primeiy byly tyto: 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' a 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), poté štěpený restrikční endonukleázou BamHI, modifikován inkubací sKlenow DNA polymerázou pro vytvoření rovných konců a klonován do Smál místa v pUC Π LZdel P7.5 pro vytvoření vektoru pUC Π LZdel P7.5-LAInef (Obrázek 8). Tento plazmid lze použít pro modifikování rekombinantního viru MVA, který umožňuje expresi genu nef z HTV-1 LAI pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 vakciniového viru.

Buňky CEF infikované MVA o četnosti 0,05 TCID₅₀ na buňku byly transfektovány DNA plazmidu pUC Π LZdel P7.5.LAInef popsaným dříve (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032 až 1040). Rekombinantní viry MVA obsahující gen nef a přechodně umožňující expresi markerového genu E. coli LacZ byly vybrány konsekutivními cykly plakové purifikace v buňkách CEF, obarvených 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dgalaktosidázou (300 pg/ml). Dále, rekombinantní viry MVA obsahující gen nef a neobsahující markerový gen LacZ (deletovaný) byly vybrány během tří konsekutivních cyklů plakového purifikačního screeningu nebarvících virových foci v buňkách CEF za přítomnosti 5-bromo-4chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázy (300 pg/ml). Dále, rekombinantní viry byly amplifikovány infekcí vrstev CEF a virová DNA MVA-LAInef byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů. Analýza Southemovým přenosem virové DNA potvrdila genetickou stabilitu MVA-LAInef a přesně prokázala integraci genu nef a deleci markerového genu E. coli LacZ v místě delece Π v genomu viru.

Účinná exprese rekombinantního proteinu Nef byla potvrzena analýzou Westernovým přenosem proteinových lyzátů z buněk CEF infikovaných MVA-LAInef s použitím myších monoklonálních protilátek řízených proti HIV-1 Nef (laskavě poskytnutým panem K. Krohnem a použitým jak je popsáno v Ovod, V., Lagestedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G., a Krohn, K. (1992) AIDS 6, 25 až 34).

2.4 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA-hTYR

DNA fragment o délce 1,9 tisíc bází obsahující úplný gen kódující lidskou tyrosinázu (klon tyrosinázy c-DNA 123.B2 izolovaný z buněčné linie melanoma SK29-MEL z pacienta SK29 (AV), GenBank Acc.no.UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wolfel, T., Wolfel, C., De Plaen, E., Léthé, B. Coulie, P. a Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489 až 495) byl připraven z plazmidu pcDNAI/Amp.Tyr (Wolfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Buschenfelde, K. a Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759 až 764) štěpením enzymem EcoRI, modifikován inkubací s Klenow DNA polymerázou pro vytvoření rovných konců a klonován do místa Smál v pUC Π LZdel P7.5 pro vytvoření vektoru pUC Π LZdel P7.5-TYR (Obrázek 9). Tento plazmid lze dále použít pro genetickou modifikaci rekombinantního viru MVA, který umožňuje expresi genu lidské tyrosinázy pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 vaccinia viru.

Buňky CEF infikované s MVA při četnosti 0,05 TCID50 na buňku byly transfektovány s DNA plazmidu pUC Π LZdel P7.5-TYR popsaným dříve (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032 až 1040). Rekombinantní MVA virus umožňující stabilní expresi genu lidské tyrosinázy a přechodnou koexpresi genu E. coli LacZ byl vybrán selekcí během konsekutivních cyklů plakové purifikace v buňkách CEF barvených 5-bromo-4-chloro3-indolyl β-D-galaktosidázou (300 μΐ/ml). Dále, rekombinantní virus MVA umožňující expresi genu lidské tyrosinázy a mající deletovaný markerový gen LacZ byl selektivně izolován během

-13CZ 292460 B6 tří dalších konsekutivních cyklů plakového purifikačního screeningu nezbarvených virových foci v buňkách CEF za přítomnosti 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázy (300 μΐ/ml). Dále, Rekombinantní viry byly amplifikovány infekcí vrstev buněk CEF a virová DNA MVAhTYR byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů. Analýza Southemovým přenosem virové DNA potvrdila genetickou stabilitu MVAhTYR a přesně demonstrovala integraci rekombinantního genu tyrosinázy a delecí markerového genu E. coli LacZ v místě delece Π v genomu viru.

Účinná exprese rekombinantní lidské tyrosinázy byla potvrzena analýzou Westernovým přenosem proteinových lyzátů z buněk CEF infikovaných MVA-hTYR s použitím zaječích polyklonálních protilátek (laskavě poskytnutých V. Hearingem a použitých jak je popsáno v Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. a Hearing, V. (1988) P.N.A.S. USA 85, 3830 až 3834) nebo myších monoklonálních protilátek (laskavě poskytnutých L. Oldem a použitých jak je popsáno vChen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. a Old, L. (1995) P.N.A.S. USA 92, 8125 až 8129) řízených proti tyrosináze.

Příklad 3

Konstrukce inzertního vektoru pro místo delece VI v MVA

3.1. Amplifikace a klonování

Aby se získaly sekvence vhodné krekombinaci do genomu viru neštovic, DNA fragment pocházející z modifikovaného viru vakcinie Ankara (uložený v souladu s Budapešťskou Smlouvou pod přístupovým číslem: V94012707 v Evropské sbírce buněčných kultur, European Collection of Animal Cell Cultures, v Salisbury, UK) byl amplifikován obvyklou metodou PCR s použitím následujících oligonukleotidových primerů:

A24R_1: 5 ’· - CCGAAGCTTAATGAACGCCAGAGG - 3’ (sekvence č. 10)

A27L_lc: 5 ' -AGGCTCGAGTAAGAGCGGCTATGAT- 3' (sekvence č. 11)

Oligonukleotidové primery obsahují blízko u 5' konce, a jsou označené podtržením, rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzymy Hindin (sekvence č. 10) nebo Xhol (sekvence č. 11) pro subklonování výsledného amplifikovaného produktu do klonovacího vektoru. V souladu s tím specificky amplifikovaná sekvence (sekvence č. 9), která má velikost 1,7 kb, byla subklonována pomocí Sall/Hindin do klonovacího plazmidu pUC19 (GenBank přístupové číslo: X02514). Výsledný plazmid byl nazván pSWl (viz obrázek 10).

Subklonovaný inzert byl sekvencován, a tato sekvence byla srovnána s jinými známými sekvencemi viru vakcinie kmenů Copenhagen, WR, a MVA. Bylo zjištěno, že sekvence obsahuje části sekvence MVA-ATI úseku. ΑΊΊ gen většiny virů neštovic tvoří zralé viriony zaplněné denzní cytoplazmatickou hmotou, takzvaná inkluzní tělíska, která mohou být vizualizována vyšetřením infikovaných buněk ve světelném mikroskopu. Navrhovaná funkce ATI je poskytnutí vyšší stability a prodloužené šíření infekčních virových částic do okolního prostředí. Mezi viry neštovic je několik členů, včetně viru ektromelie, viru kravských neštovic a viru neštovic mývalů, které tvoří tento typický inkluzní protein s velikostí 130 až 160 kD. Nicméně další členové rodu viru neštovic, jako např. virus vakcinie Western Reserve (WR), virus vakcinie Copenhagen nebo MVA, netvoří žádná taková inkluzní tělíska. To je výsledek sekvenčních delecí nebo posunových mutací vedoucí ke ztrátě kódující sekvence a mající za následek zkrácený ATI homolog. Například virus vakcinie WR exprimuje ATI homolog o velikosti 94 kD, zatímco MVA a virus vakcinie kmene Copenhagen neexprimuje takový ATI homolog.

-14CZ 292460 B6

Pro další konstrukci inzertních vektorů bylo přirozeně se vyskytující rozpoznávací místo restrikčního enzymu EcoRI použito pro rozštěpení amplifíkované sekvence na dva segmenty. Tyto segmenty slouží jako hraniční/obklopující úseky (flankl, flank2), které zahajují homologní rekombinaci s genomem viru neštovic. Mezi tyto hraniční úseky byly vloženy sekvence virového promotoru vakcinie - např. z promotoru 7.5 a/nebo syntetického promotoru (sP) - stejně jako mnohonásobná klonovací místa pro inzerci operativně heterologních genů. Výsledné plazmidy byly nazvány pSW-7.5-sP, pSW-7.5, pSW-sP.

Dále byla expresní kazeta obsahující gen určující hostitelský rozsah viru vakcinie, KIL, fúzovaný kfuznímu genu EGFP (izolovaný zplazmidu pEGFP, Clonetech, GenBank přístupové č. U76561) a přirozeně se vyskytující promotor KIL, vložena mezi hraniční úseky, jak bylo popsáno výše. Tato expresní kazeta je obzvláště užitečná pro účinnou selekci a izolaci rekombinantních virů. Výsledný plazmid byl nazván pSWklIgfp.

3.2. Produkce rekombinantního viru

Pro produkci rekombinantních virů byly použity 6 jamkové destičky pro tkáňové kultury s monovrstvou buněk konfluentní z přibližně 80 %. Pro vytváření rekombinantních MVA byly použity permisivní buňky, jako jsou například fibroblasty kuřecího embrya. Pro produkci rekombinantních virů vakcinie kmene WR byly používány buňky makaků (Věro).

Nejdříve bylo odstraněno médium z tkáňové kultury a buňky převrstveny médiem bez séra obsahujícím virus neštovic divokého typu s multiplicitou infekce (MOI) 0,01 (např. inokulum 5 χ 10³ IU (infekční jednotky) v 1 ml média na jednu jamku s 5 χ 10⁵ buňkami). Tato směs byla inkubována po dobu 1 hodiny ve 37 °C v 5% atmosféře CO₂. Pak bylo inokulum odstraněno a buňky byly dvakrát promyty 2 ml média OptiMEM na jamku.

Následně byla buněčná monovrstva převrstvena směsí Lipofektin/plazmidová DNA (celkový objem: 1 ml) připraveným dle popisu výrobce (GIBCO BRL) a s použitím 15 pg plazmidové DNA pSWklIgfp. Směs byla inkubována po dobu 5 až 12 hodin ve 37 °C v 5% atmosféře CO₂. Pak byla směs Lipofektin/plazmidová DNA odstraněn a buňky byly převrstveny 1,5 ml čerstvého média doplněného 10% FCS.

hodin po infekci byla buněčná monovrstva oddělena buněčnou škrabkou a buňky s médiem byly přeneseny do mikrozkumavek o objemu 2 ml. Sklizené buňky transfekci byly uloženy v -20 až-80°C.

Po transfekci plazmidu pSWklIgfjp do buněk infikovaných virem neštovic, gen určující rozsah hostitelů KIL fúzovaný ke genu EGFP byl přesně rekombinován do místa genomu viru neštovic, který je homologní s hraničními úseky ve vektorovém plazmidu.

Aby se oddělily rekombinantní MVA viry od nerekombinantních MVA virů, byly vhodné hostitelské buňky, tj. buňky králičí ledviny (RK)13, infikovány virovým materiálem získaným z transfekčního experimentu popsaného výše. Předchozí práce ukázala, že MVA infekce králičích RK13 buněk má za následek časné zablokování virové replikace charakterizované tím, že dojde k narušení syntézy intermediátní virové RNA a pak chybí replikace virové DNA. Nicméně tato neproduktivní MVA infekce RK13 buněk může být překonána koexpresí genu určujícího rozsah hostitelů viru vakcinie KIL (Sutter et al., 1994b). V souladu s tím inokulace virového materiálu získaného z transfekčních experimentů na RK13 kulturách měla za následek vysoce selektivní růst jen rekombinantních virů, které koexprimovaly gen KIL. Po pěti nepřetržitých pasážích (přenosech) na RK13 buňkách pěstovaných na 65 jamkových nebo 96 jamkových destičkách pro tkáňové kultury byl izolován virus MVA-K1LGFP. Nepřítomnost nerekombinantních MVA byla prokázána pomocí PCR.

-15CZ 292460 B6

Navíc exprese fúzovaného genu EGFP umožnila přímé sledování infekce rekombinantním virem prostřednictvím GFP fluorescence. Přímé sledování bylo také použito k identifikaci a pak izolaci rekombínantních virů vakcínie kmene WR, které nejsou senzitivní na KIL selekci.

SEZNAM SEKVENCÍ

Informace k sekvenci č. 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 1:

CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC

Informace k sekvenci č. 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 2:

CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAATAA CA

Informace k sekvenci č. 3:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 3:

CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC

-16CZ 292460 B6

Informace k sekvenci č. 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 4:

CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA

Informace k sekvenci č. 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc =,,DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 5:

CAGCAGGTCG ACCCGACCG CCTTACTGCC GCC

Informace k sekvenci č. 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 6:

GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG

Informace k sekvenci č. 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární

-17CZ 292460 B6 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 7:

CAGCACCCAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT

Informace k sekvenci č. 8:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer“ (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 8:

CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTCTTGAA GTACTCCGG <210> Sekvence č. 9 <211> 1736 <212>DNA <213> Modifikovaný virus vakcínie Ankara <220>

-18CZ 292460 B6 <400>9 ctcgagtaag agcggctatg atatctctgg ctaaaaagat tgatgttcag actggacggc 60 gtccatatga gtaacttaac tcttttgtta attaaaagta tattcaaaaa atgagttata 120 taaatggcga acattataaa tttatggaac gttgcgagca ttactgcgtt taaatctatg gcaaatacat atgaaagcat tggctaacac aatggatcat caatataťtt tatatatacg tatgcatgta ttcatgttta cacgacatat gcatttatgt aaagtttacg atatggttta cgtttatgtt aattgctaag gcatgaaggc aattgaaatc aaaaagttaa ttacctcttc aaaatgtatc cagacgttac cgaaccgatt ccccagcttt ctgaatatca cacagatttt cgaatatcag attcggatct cgaatttgat cagaaaagac ggcttgagat ttcgaaatct aatttgactt gcatcagtag aaaacataga atcctaaaat aatattatat tgaatacaaa tatatatagt attctgágat agcaaatatt taggatcacc atgatcgtaa tgccggtttt actatctatc tatttaggag ggatattctg agaacaaaca gtgacagaag tgaacgtgaa atcgctcgta tgaacgtagt aacgtgaaga gttctacaaa ttcagatcca tccgttgaca ggacgagaat •tttaaagaat atttaaaacg attttgtata aacgagcaat acacggtcaa catgtattta tatctataag aatcctggac ttttcgatac atagaaatgg cctaaacccg agagaactag catgagaaac actgaggcta agtgatgtga gacttcagta ggaattgtac caacggttca agatgttaat atagatgaaa catgggataa aaaaatcgaa aacattattc acgaagťtat tagggacttt agaaaatctc cattaggagc tccaatgcaa gaatatcata agaccatgct agcgtatgat ttaaacattt atatgattao taacgttggt atatctggta agaatcacga tggtactcct gataaaaatc tťa-ttaatga gcgtatcaag ttaactatag c-tctgagaat tagaaataaa tggtťtaacg taaacggatc acaggtatat cataataaag agataggtag actactatac tggtagattt ttgaatgatt tcgcactatt atttagtttg agtgt-tcctg tattgaaaaa tttagcaatg atatgattat ataacgataa aaaactgcgg ggttggaata aácgtgatcg cattaccaaa caggtťctgt caccatcggt tcccaagtag acgtccgatt ctatagttaa caatccacgc gatattgata tgtatctact accaaactag caactttatc taatggttta taaaacgaag ttacgcctct ggcgttcatt aagctt aatatatatt atgctatact ataaaaaagg gctataagac

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080 gttgagttta gcgaattcat aggtaaccca tgcgaacgtg 1140 tcaactagat gtatctttct ttatacattt agaagtagca ggatgtcgaa ccagaacatc cagttacacc tccaccaaaa gctgagaaag agtagatatc cctcgcatta cctccatcca cctgaaactc ccattttata aatattacaa gaggccttcg <210> Sekvence č. 10 <211> 24 <212> DNA <213< Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Oligonukleotidový primer <400>10 ccgaagctta atgaacgcca gagg <210> Sekvence č. 11 <211> 25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Oligonukleotidový primer

1200

1260 1320 1380

1440

1500

1560

1620 1680 1736

-19CZ 292460 B6 <400>ll aggctcgagt aagagcggct atgat

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní modifikovaný virus vakcinie Ankara, MVA, který obsahuje a je schopen exprimovat alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa přirozeně se vyskytující delece, avšak kromě přirozeně se vyskytujícího místa delece ΙΠ, v genomu MVA.
2. 2. Rekombinantní virus MVA podle nároku 1, který obsahuje a je schopen exprimovat alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa delece II v genomu MVA.
3. 3. Rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 2, kde cizí gen kóduje markér, terapeutické činidlo, antigen nebo antigenní determinantu.
4. 4. Rekombinantní virus MVA podle nároku 3, kde cizí gen kóduje antigen nebo antigenní determinantu z patogenního viru, bakterie nebo z jiného mikroorganismu nebo z parazita nebo z nádorové buňky.
5. 5. Rekombinantní virus MVA podle nároku 4, kde cizí gen kóduje antigen nebo antigenní determinantu zPlasmodium Falciparum, Mykobaktéria, viru Herpes, chřipkového viru, viru hepatitidy nebo z virů deficitu lidské imunity.
6. 6. Rekombinantní virus MVA podle nároků 3 a 5, kde antigenem nebo antigenní determinantou je HIV nef nebo lidská tyrosináza.
7. 7. Rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 2, kde cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu.
8. 8. Rekombinantní virus MVA, který obsahuje a je schopen exprimovat gen kódující antigen nebo antigenní determinantu lidské tyrosinázy, přičemž tento gen je inzertovaný do genomu MVA.
9. 9. Rekombinantní virus MVA, který obsahuje a je schopen exprimovat gen kódující antigen nebo antigenní determinantu HIV nef, přičemž tento gen je inzertovaný do genomu MVA.
10. 10. Rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 9, kde cizí gen je pod transkripční regulací raně-pozdního promotoru P7.5 viru vakcinie.
11. 11. Rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 10, který není schopen replikace v lidských buňkách.
12. 12. Rekombinantní virus MVA podle nároku 7 pro použití k transkripci sekvencí DNA pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
13. 13. Eukaryotní buňka infikovaná rekombinantním virem MVA podle libovolného z nároků 1 až 12.
14. 14. Buňka podle nároku 13, která dále obsahuje jeden nebo více expresních vektorů nesoucích jeden nebo více cizích genů pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.

    -20CZ 292460 B6
15. 15. Použití buněk podle nároku 13 nebo 14 pro in vitro produkci polypeptidů kódovaných cizími geny, kdy se

    a) buňky kultivují za vhodných podmínek, a

    b) izolují polypeptidy kódované cizími geny.
16. 16. Buňka podle nároku 13 nebo 14, která dále obsahuje expresní vektor nesoucí virové geny nebo/a virový vektorový konstrukt kódující genom virového vektoru pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
17. 17. Použití buněk podle nároku 16 pro in vitro produkci virových částic, kdy se

    a) buňky kultivují za vhodných podmínek, a

    b) izolují virové částice.
18. 18. Buňka podle nároku 13 nebo 14, která dále obsahuje

    a) expresní vektor nesoucí retrovirový vektorový konstrukt schopný infikovat a řídit expresi jednoho nebo více cizích genů nesených retrovirovým vektorovým konstruktem v cílových buňkách, a

    b) jeden nebo více expresních vektorů nesoucích geny kódující polypeptidy nutné pro sbalení genomu retrovirového vektorového konstruktu pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
19. 19. Použití buněk podle nároku 18 pro in vitro produkci retrovirových částic, kdy se

    a) buňky kultivují za vhodných podmínek, a

    b) izolují retrovirové částice.
20. 20. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 12 ve fyziologicky přijatelném nosiči.
21. 21. Použití rekombinantního viru MVA podle nároků 1 až 12 pro výrobu vakcíny.
22. 22. Rekombinantní virus MVA podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12 pro použití při imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského těla, inokulací viru MVA do živého zvířecího těla, včetně lidského těla.
23. 23. Vakcína podle nároku 20 pro použití při imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského těla, inokulací vakcíny do živého zvířecího těla, včetně lidského těla.
24. 24. Vakcína podle nároku 20 nebo 23, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje rekombinantní MVA včetně genu kódujícího antigen nebo antigenní determinantu HTV nef, a je určena pro použití při prevenci nebo léčbě infekce HTV nebo AIDS.
25. 25. Vakcína podle nároku 20 nebo 23, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje rekombinantní MVA včetně genu kódujícího antigen nebo antigenní determinantu lidské tyrosinázy, a je určena pro použití při prevenci nebo léčbě melanomů.
26. 26. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje jako první složku rekombinantní virus MVA podle nároku 7 ve fyziologicky přijatelném nosiči, a jako druhou složku obsahuje sekvenci DNA nesoucí antigen nebo antigenní determinantu pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy ve fyziologicky přijatelném nosiči, přičemž tyto dvě složky jsou přítomny buďto společně, nebo odděleně zvlášť.

    -21CZ 292460 B6
27. 27. Vakcína podle nároku 26 pro použití při imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského, inokulací do živého zvířecího těla, včetně lidského, první a druhé složky vakcíny buďto zároveň, nebo s časovou prodlevou, avšak s využitím stejného inokulačního místa.
28. 28. Použití rekombinantního viru MVA podle nároku 7 pro výrobu vakcíny podle nároku 26 nebo 27.