PL186857B1 - Modyfikowany wirus MVA, zainfekowana nim komórka eukariotyczna, ich zastosowania oraz zawierające go szczepionki - Google Patents
Modyfikowany wirus MVA, zainfekowana nim komórka eukariotyczna, ich zastosowania oraz zawierające go szczepionkiInfo
- Publication number
- PL186857B1 PL186857B1 PL96324347A PL32434796A PL186857B1 PL 186857 B1 PL186857 B1 PL 186857B1 PL 96324347 A PL96324347 A PL 96324347A PL 32434796 A PL32434796 A PL 32434796A PL 186857 B1 PL186857 B1 PL 186857B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mva
- virus
- heterologous gene
- gene
- antigen
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims abstract description 168
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 76
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 75
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 99
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 71
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 71
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 69
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 50
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 36
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 17
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 16
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 16
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 15
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 15
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 15
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 15
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 14
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 14
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 claims description 14
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 5
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101100004352 Escherichia coli lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000941423 Grom virus Species 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000009589 pathological growth Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
1. Modyfikowany wirus MVA zawierajacy i zdolny do ekspresji genu heterologicznego, znamienny tym, ze gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie wystepujacej delecji w genomie MVA, zwlaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA. 12. Komórka eukariotyczna zainfekowana mody- fikowanym wirusem MVA zawierajacym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterolo- giczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie wyste- pujacej delecji w genomie MVA, zwlaszcza w miejsce dele- cji II w genomie MVA. 24. Zastosowanie komórki eukariotycznej zain- fekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawieraja- cym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie wystepujacej delecji w genomie MVA, zwlaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA... 62. Szczepionka dwuskladnikowa, znamienna tym, ze zawiera jako pierwszy skladnik modyfikowanego wirusa MVA, który zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie wystepu- jacej delecji w genomie MVA, zwlaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, w fizjologicznie dopuszczalnym nosniku, a jako drugi skladnik sekwencje DNA... PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany wirus ospy krowiej, pochodzący od zmodyfikowanego wirusa ospy krowiej Ankara (MVA), zawierający i umożliwiający ekspresję obcych genów, które są wprowadzane w miejsce spontanicznie pojawiającej się delecji w genomie MVA, i zastosowanie takiego zrekombinowanego wirusa MVA do produkcji polipeptydów, np. antygenów lub czynników terapeutycznych, lub wektorów wirusowych do terapii genowej, i zastosowanie takiego zrekombinowanego wirusa MVA, kodującego antygeny, jako szczepionki.
Cel wynalazku.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie zrekombinowanego wirusa MVA, który może służyć jako wydajny i niezwykle bezpieczny wektor ekspresji.
Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie prostego, wydajnego i bezpiecznego sposobu produkcji polipeptydów, np. antygenów lub czynników terapeutycznych, zrekombinowanych wirusów do szczepionek i wektorów wirusowych do terapii genowej.
Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie systemu ekspresji, bazującego na rekombinancie wirusa MVA, kierującego ekspresją polimerazy RNA T7, i sposobów produkcji polipeptydów np. antygenów lub czynników terapeutycznych, lub do wytwarzania wektorów wirusowych do terapii genowej lub szczepionek, bazujących na tym systemie ekspresji.
186 857
Dziedzina wynalazku.
Wirus ospy krowiej, należący do rodzaju Orthopoxvirus w rodzinie Poxviridae, został zastosowany jako żywa szczepionka do uodpornienia przeciw ludzkiej ospie. Udane światowe szczepienia wirusem ospy krowiej przyczyniły się do wytępienia wirusa ospy, czynnika przyczynowego ospy (Światowe wytępienie ospy. Końcowy raport światowej komisji do certyfikacji wytępienia ospy. History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). Od czasu deklaracji WHO, szczepienia zostały przerwane, z wyjątkiem ludzi o wysokim ryzyku zarażenia wirusem ospy (np. pracownicy laboratoriów).
Ostatnio, wirusy ospy krowiej zostały również zastosowane do wytwarzania wektorów wirusowych do ekspresji genów rekombinantów i do potencjalnego zastosowania jako żywe szczepionki rekombinanta (Mackett, M., Smith, G.L. and Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Wiązało się to z tym, że sekwencje DNA (geny), które kodują obce antygeny, zostały z pomocą technik rekombinacji DNA wprowadzone do genomu wirusa ospy krowiej. Jeśli gen zostanie zintegrowany w takim miejscu wirusowego DNA, które nie jest istotne dla cyklu życiowego wirusa, jest możliwe, że nowo produkowane rekombinanty wirusa ospy krowiej będą infekcyjne, tzn. będą mogły infekować obce komórki i tym sposobem powodować ekspresję zintegrowanej sekwencji DNA (zgłoszenie patentowe nr 83, 286 i nr 110, 385). Z drugiej strony, zrekombinowany wirus ospy krowiej wytworzony w ten sposób może być zastosowany do przygotowania heterologicznych białek w komórkach eukariotycznych.
Zrekombinowany wirus ospy krowiej kierujący ekspresją genu polimerazy RNA bakteriofaga T7 pozwolił na utwierdzenie dającego się szeroko zastosować systemu ekspresji do syntezy białek rekombinanta w komórkach ssaków (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., i Fuerst T.R. [1990] Nature 348, 91-92). We wszystkich protokołach, ekspresja genu rekombinanta związana jest z syntezą polimerazy RNA T7 w cytoplaźmie komórek eukariotycznych. Najbardziej popularny stał się protokół przejściowej ekspresji (Fuerst, T.R., Niles, E.G, Studier, F.W. i Moss, B. [1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 i zgłoszenie patentowe USA 7.648.971). Po pierwsze, obcy pożądany gen jest wprowadzany do plazmidu, znajdując się pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7. Następnie, plazmid tej jest wprowadzany, przy zastosowaniu standardowych procedur infekcji, do cytoplazmy komórek zainfekowanych zrekombinowanym wirusem ospy krowiej, produkującym polimerazę RNA T7.
Ten protokół infekcji jest prosty, ponieważ nie ma potrzeby tworzenia nowych zrekombinowanych wirusów i jest bardzo wydajny, gdyż ponad 80% komórek wykazuje ekspresję pożądanych genów (Elroy-Stein, O. I Moss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747). Przewaga hybrydowego systemu wirus ospy krowiej/polimeraza RNA T7 nad systemem przejściowej ekspresji polega na jego niezależności od transportu plazmidu do jądra komórkowego. W przeszłości, system był wyjątkowo użyteczny dla celów analitycznych wirusologii i biologii komórki (Buonocore, L. I Rose, J.K. [1990] nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. iWertz, G.W. [1991] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1379-1383, Karschin, A., Aiyar, J., Gouin, A., Davidson, N. i Lester, H.A. [1991] FEBS Lett. 278, 229-233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H.A. i Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303-306, Buchholz, C.J., Retzler, C., Homann, H.E. i Neubert, W. J. [1994] Virology 204, 770-776). Jakkolwiek, przyszłe, ważne zastosowania systemu hybrydowego wirus ospy krowiej/polimeraza RNA T7, jak np. wytwarzania białek rekombinantów lub cząstek wirusa do nowatorskich zastosowań terapeutycznych lub profilaktycznych, mogą zostać wstrzymane przez produktywną replikację wektora zrekombinowanego wirusa.
Wirus ospy krowiej jest infekcyjny dla ludzi i w czasie szczepień w ramach akcji wytępiania wirusa ospy obserwowano sporadycznie poważne komplikacje. Najlepszy przegląd na temat zakresu komplikacji podany jest przez narodowy przegląd w USA, monitorujący szczepienia około 12 milionów ludzi szczepionką wirusa ospy krowiej, pochodnego szczepowi New York City Board of Health (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. i Millar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201-1208). Tak więc, na najbardziej ekscytującą możliwość zastosowania wirusa ospy krowiej, jako wektora dla żywych szczepionek rekombinanta, wpłynęły problemy i ustalenia bezpieczeństwa. Ponadto, większość wirusów ospy krowiej opisanych w literaturze jest
186 857 jest pochodna szczepowi Western Reserve. Z drugiej strony, znane jest, że szczep ten posiada dużą neurozjadliwość i przez to jest mało odpowiedni dla zastosowania u ludzi i zwierząt (Morita i inni, Vaccine 5, 65-70 [1987]).
Ryzyko zdrowotne dla zastosowań wektora mogłoby być zmniejszone dzięki zastosowaniu silnie osłabionego szczepu wirusa ospy krowiej. Kilkanaście takich szczepów zostało specjalnie wyhodowanych w celu uniknięcia niepożądanych skutków ubocznych szczepień przeciwko ospie. Tak więc, zmodyfikowany wirus ospy krowiej Ankara (MVA) został wytworzony poprzez długotrwałe seryjne pasaże szczepu Ankara wirusa ospy krowiej na kurzych embrionalnych fibroblastach (przegląd Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. I Stickl, H. [1975] Infection 3,
6-14; Patent szwajcarski nr 568, 392). Wirus MVA został zdeponowany w zgodności z wymaganiami Porozumienia Budapeszteńskiego (Budapest Treaty) w CNCM (Institut Pasteur, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) 15tego grudnia 1987 pod numerem depozycyjnym I-721.
MVA wyróżnia się silnym osłabieniem, czyli zmniejszoną zjadliwością lub inaczej zaraźliwością, przy zachowanej dobrej immunogenności. Wirus MVA był analizowany w celu wyznaczenia zmienności genomu w stosunku do typu dzikiego szczepu CVA. Zidentyfikowano sześć dużych delecji w genomowym DNA (delecja I, II, III, IV, V i VI), wynoszące 31,000 par zasad (Meyer, H., Sutter, G i Mayr, A. [1991] J. Gen. Virol. 72,1031-1038). Otrzymany wirus MVAjest mocno ograniczony w stosunku do komórek gospodarza, którymi są komórki ptasie.
Ponadto MVA charakteryzuje się skrajnym osłabieniem. W czasie testowania na różnych modelach zwierzęcych MVA okazał się być niezjadliwym nawet u zwierząt immunosupresorowanych. Co ważniejsze, nadzwyczajne własności szczepu MVA były demonstrowane w rozległych próbach klinicznych (Mayr i inni, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl i inni, Dtsch. med. Wscłir. 99, 2386-2392 [1974]). W czasie tych prób przeprowadzonych u ponad 120,000 ludzi, włączając w to pacjentów wysokiego ryzyka, żadne efekty uboczne nie wiązały się z użyciem szczepionki MVA. Stwierdzono, że replikacja w ludzkich komórkach jest blokowana w czasie infekcji, zapobiegając dojrzewaniu infekcyjnych wirionów. Niemniej, MVA mógł powodować silną ekspresję genów wirusowych i zrekombinowanych nawet w komórkach niepermisywnych, toteż zaproponowano, aby służył on jako wydajny i nadzwyczajnie bezpieczny wektor ekspresji genów (Sutter, G. i Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). Ostatnio, oryginalny system wektora ospy krowiej został opracowany na podstawie MVA, mającego wprowadzone obce sekwencje DNA w miejsce delecji III w genomie MVA lub w genie TK (Sutter, G. i Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195-200 i Patent USA 5.185.146).
W celu dalszego zastosowania MVA poszukiwany jest oryginalny sposób wprowadzania obcych genów przez rekombinację DNA do szczepu MVa wirusa ospy krowiej. Jako, że zamiarem nie było zmienianie genomu wirusa MVA, niezbędne okazało się użycie sposobu, który spełnia to wymaganie. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem sekwencje obcego DNA zostały zrekombinowane z wirusowym DNA precyzyjnie w miejsce spontanicznie pojawiającej się delecji w genomie MVA.
Istota wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany wirus MVA zawierający i zdolny do ekspresji genu heterologicznego, charakteryzujący się tym, że gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
Korzystnie, gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną_ determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Korzystniej, gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
186 857
W szczególnie korzystnej realizacji modyfikowanego wirusa według wynalazku determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Korzystnie modyfikowany wirus MVA według wynalazku jest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVa zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
W szczególnie korzystnej realizacji modyfikowanego wirusa według wynalazku gen heterologiczny koduje polimerazę RNAT7.
Korzystnie modyfikowany wirus MVA według wynalazku jest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystniej jest MVA-T7 pol.
W szczególnie korzystnej realizacji modyfikowanego wirusa według wynalazku heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną. wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki. Korzystnie modyfikowany wirus MVA według wynalazku jest w zasadzie pozbawiony wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA zawierającego i zdolnego do ekspresji genu heterologicznego, do transkrypcji sekwencji DNA pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, przy czym gen heterologiczny koduje polimerazę RNa T7 i wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
Korzystnie, stosowany modyfikowany wirus MVAjest wirusem MVA-T7 pol.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka eukariotyczna zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterołogicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
Korzystnie, gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Szczególnie korzystnie, gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
W szczególnie korzystnej realizacji tego aspektu wynalazku determinantą antygenową lub antygenem jest HTV nef lub ludzka tyrozynaza.
Korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
W innej korzystnej realizacji tego aspektu wynalazku gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
Przy czym korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol. Korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkry^i^^i^ią wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki. Równie korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że zainfekowana wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
Równie korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że dodatkowo zawiera jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących jeden lub więcej genów heterologicznych, będących pod kontrola transkrypcyjną promotora polimerazy RNAT7. Równie korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że dodatkowo zawiera wektor ekspresyjny przenoszący gen wirusowy, i/lub konstrukt wektora wirusowego kodujący genom wektora wirusowego, będący pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNa T7.
186 857
Równie korzystnie, komórka eukariotyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że dodatkowo zawiera:
a) wektor ekspresyjny, przenoszący konstrukt wektora retrowirusowego, mający zdolność infekowania i kierowania ekspresją w komórkach docelowych jednego lub więcej genów heterologicznych, przenoszonych przez wspomniany konstrukt wektora retrowirusowego, i
b) jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących geny kodujące polipeptydy niezbędne do pakowania genomu wspomnianego konstruktu wektora retrowirusowego pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji Π w genomie MVA, do produkcji polipeptydu kodowanego przez wspomniany gen heterologiczny obejmującej:
a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie polipeptydu kodowanego przez wspomniany gen heterologiczny. Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Przy czym korzystnie, gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNAT7.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem ΜΥΑ-Τ7 pol.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
Korzystnie, wspomniana komórka eukariotyczna dodatkowo zawiera jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących jeden lub więcej genów heterologicznych, będących pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNAT7.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, przy czym wspomniana komórka dodatkowo zawiera wektor ekspresyjny przenoszący gen wirusowy, i/lub konstrukt wektora wirusowego kodujący genom wektora wirusowego, będący pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNA 17, do produkcji cząsteczek wirusowych obejmującej:
a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie cząsteczek wirusowych.
Korzystne zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową przy czym korzyst186 857 nie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, przy czym wspomniana komórka dodatkowo zawiera:
a) wektor ekspresyjny, przenoszący konstrukt wektora retrowirusowego, mający zdolność infekowania i kierowania ekspresją w komórkach docelowych jednego lub więcej genów heterologicznych, przenoszonych przez wspomniany konstrukt wektora retrowirusowego, i
b) jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących geny kodujące polipeptydy niezbędne do pakowania genomu wspomnianego konstruktu wektora retrowirusowego pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, do produkcji cząsteczek retrowirusowych obejmującej:
a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie cząsteczek retrowirusowych.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
186 857
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca modyfikowanego wirusa i fizjologicznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako modyfikowanego wirusa zawiera modyfikowanego wirusa MVA zawierającego i zdolnego do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA. Korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Równie korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
Równie korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Równie korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że modyfikowany wirus jest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest MVA-L.AInef albo MVA-hTYR.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA do produkowania szczepionki, przy czym modyfikowany wirus MVA zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA. Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że modyfikowany wirus MVA jest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest MVA-LAInef albo MVA- hTYR.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka dwuskładnikowa, charakteryzująca się tym, że zawiera jako pierwszy składnik modyfikowanego wirusa MVA, który zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, a jako drugi składnik sekwencję DNA, przenoszącą determinantę antygenową pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, przy czym obydwa składniki występują razem lub osobno.
186 857
Korzystnie, modyfikowany wirus MVA jest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 poi.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA, który zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, do produkowania szczepionki zawierającej jako pierwszy składnik modyfikowanego wirusa MVA w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, a jako drugi składnik sekwencję DNA, przenoszącą determinantę antygenową pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, przy czym obydwa składniki występują razem lub osobno.
Korzystnie, modyfikowany wirus MVA jest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
Szczegółowy opis wynalazku.
Niniejszy wynalazek, między innymi, zawiera następujące cechy, pojedynczo lub łącznie: zrekombinowany wirus MVA, zawierający i umożliwiający ekspresję przynajmniej jednego obcego genu, wprowadzonego w miejsce spontanicznie pojawiającej się delecji w genomie DNA;
zrekombinowany wirus, jak wyżej, zawierający i umożliwiający ekspresję przynajmniej jednego obcego genu, wprowadzonego w miejsce delecji II w genomie MVA;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodują markery, geny terapeutyczne lub determinanty antygenowe;
zrekombinowany wirus mVa, jak wyżej, w którym obce geny kodują determinanty antygenowe z wirusów chorobotwórczych, bakterii, lub innych mikroorganizmów, lub z pasożytów, lub z komórek nowotworowych;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodują determinanty genowe z Plasmodium Falciparum, Myobacteria, wirusa Herpes, wirusa grypy, zapalenia wątroby, lub wirusa obniżonej odporności u człowieka;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, w którym antygenową determinantą jest nef HIV lub ludzka tyrozynaza;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, którym jest M!VA-I.AInef lub MVA-hTYR; zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, w którym obcy gen koduje polimerraąRNA T7; zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, którym jest MVA-T7 pol;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, w którym obcy gen jest pod transkrypcyjną kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa ospy krowiej;
zrekombinowany wirus MVA, jak wyżej, istotnie pozbawiony wirusów, mogących namnażać się w komórkach ludzkich;
zastosowanie zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, do transkrypcji sekwencji DNA pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7;
komórki eukariotyczne infekowane przez zrekombinowanego wirusa MVA, jak każdego wyżej;
komórka zainfekowana przez zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obcy gen koduje polimerazę RNAT7;
komórka zainfekowana przez zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obcy gen koduje polimerazę RNA T7, dodatkowo zawierając jeden lub więcej wektorów ekspresji, przenoszących jeden lub więcej obcych genów pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7;
zastosowanie komórek, jak wyżej, do produkcji polipeptydów kodowanych przez wymienione obce geny, zawierające:
a) hodowanie wymienionych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie polipeptydów kodowanych przez obce geny komórki zainfekowane przez zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obcy gen koduje polimerazę RNA T7, zawierając dodatkowo wektory ekspresji przenoszące ge14
186 857 ny wirusowe, i/lub konstrukt wektora wirusowego, kodującego genom wektora wirusowego, znajdującego się pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNAT7;
zastosowanie komórek, jak wyżej, w których produkcja cząstek wirusowych obejmuje:
a) hodowanie wymienionych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie cząstek wirusowych komórki zainfekowane przez zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodująpolimerazę RNAT7, zawierając dodatkowo:
a) wektor ekspresji, przenoszący konstrukt wektora retrowirasa, który może zainfekować i kierować ekspresjąjednego lub więcej obcych genów w komórkach docelowych, i
b) jeden lub więcej wektorów ekspresji, przenoszących geny, kodujące polipeptydy, wymagane do pakowania genomu wymienionego konstruktu wektora retrowirusowego, pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7;
zastosowanie komórek, jak powyżej, do produkcji cząstek retrowirasa, obejmujące:
a) hodowanie wymienionych komórek w odpowiednich warunkach, i
b) izolowanie cząstek wirusowych;
szczepionka zawierająca zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodują determinanty antygenowe w fizjologicznie akceptowanym nośniku;
zastosowanie zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodują determinanty antygenowe szczepionki;
zastosowanie szczepionki, jak wyżej, do uodpornienia żyjącego zwierzęcia, w tym również człowieka;
zastosowanie szczepionki, jak wyżej, zawierającej MVA-LAInef do zapobiegania lub leczenia infekcji HIV lub AIDS;
zastosowanie szczepionki, jak wyżej, zawierającej MVA-hTVR do zapobiegania lub leczenia czerniaków;
szczepionka, zawierająca jako pierwszą komponentę zrekombinowanego wirusa MVA, jak wyżej, w którym obce geny kodujące polimerazę RNAT7 są w fizjologicznie akceptowanym nośniku, i jako drugą komponentę sekwencję DNA, kodującą determinanty antygenowe, będącą pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, w fizjologicznie akceptowanym nośniku, gdzie obie komponenty są zawarte razem lub oddzielnie;
zastosowanie szczepionki, jak wyżej, do uodpornienia żyjącego zwierzęcia, w tym również człowieka, obejmujące szczepienie wymienionego żyjącego zwierzęcia, również człowieka, za pomocą pierwszej lub drugiej komponenty szczepionki równocześnie lub z przerwą, w to samo miejsce szczepienia; i termin „gen” oznacza sekwencje DNA, która koduje białka lub peptydy;
termin „obcy gen” oznacza gen wprowadzony do sekwencji DNA, w której normalnie nie występuje.
Obcy gen może być genem markerowym, genem terapeutycznym, genem kodującym determinanty antygenowe, lub geny wirusowe, na przykład. Takie geny są dobrze znane w tej dziedzinie.
Wynalazek.
Zmodyfikowany wirus ospy krowiej Ankara (MVA), o ograniczonym zakresie gospodarzy i jako silnie osłabiony szczep wirusa ospy krowiej, nie ma możliwości namnażania się w testowanych liniach komórek człowieka i większości innych ssaków. Ale, jako że ekspresja genu wirusowego jest nieuszkodzona w niepermisywnych komórkach, to zrekombinowane wirusy MVA, zgodnie z wynalazkiem, mogą być zastosowane jako wyjątkowo bezpieczne i wydajne wektory ekspresji.
Zrekombinowane wirusy MVA kodujące determinanty antygenowe.
W jednym przykładzie wykonania, niniejszy wynalazek odnosi się do zrekombinowanych wirusów ospy krowiej MVA, zawierających gen, który koduje obcy antygen, korzystnie chorobotwórczy czynnik, i do szczepionki, zawierającej takiego wirusa w fizjologicznie akceptowanej formie. Wynalazek odnosi się również do sposobów przygotowania takich zre186 857 kombinowanych wirusów ospy krowiej MVA lub szczepionek, i do zastosowania tychże szczepionek do profilaktyki infekcji, powodowanych przez takie chorobotwórcze czynniki.
W korzystnym przykładzie wykonania, obcym genem wprowadzonym do wirusa MVA jest gen kodujący HIV nef.
Skonstruowaliśmy zrekombinowane wirusy MVA, które umożliwiają ekspresję genu HrV-nef pod kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa ospy krowiej.
Białko regulatorowe Nef lentowirusów naczelnych jest syntetyzowane wcześnie podczas cyklu replikacyjnego wirusa i wykazano, że jest istotne dla wysokiego miana replikacji wirusa i indukcji choroby in vivo. Sugeruje to, że HIV Nef może pełnić kluczową rolę w patogenezie AIDS. Molekularny mechanizm(y), za pomocą którego Nef przyczynia się do zwiększenia zjadliwości wirusa i do chorobotwórczości HIV wymaga wyjaśnienia w przyszłości. Jakkolwiek, Nefjest immunogeniczny i czynniki specyficzne dla Nef mogą być użyte jako szczepionka przeciw infekcji HTV i AIDS.
W tym kontekście, zrekombinowany wirus MVA, kierujący ekspresją genu nef HIV może zostać użyty do uodpornienia ludzi, z jednej strony, jako profilaktyczna szczepionka przeciw ludzkiemu HIV, i z drugiej strony, w immunoterapii pacjentów zainfekowanych HIV lub chorych na AIDS.
Dalej, zrekombinowany wirus MVA, kierujący ekspresją genu nef może być zastosowany do produkcji białka Nef rekombinanta HIV.
W innym korzystnym przykładzie zastosowania wynalazku, obcym genem, wprowadzonym do wirusa MVA jest gen kodujący ludzkątyrozynazę.
Skonstruowaliśmy zrekombinowane wirusy MVA, które umożliwią ekspresję genu ludzkiej tyrozynazy pod kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5. Ostatnio ludzka tyrozynaza została zidentyfikowana jako antygen nowotworowy specyficzny dla czerniaka, który pozwala na wytworzenie antynowotworowych cytolitycznych limfocytów T (Brichard, V i inni [1993] J. Exp.Med. 178, 488-495). Jako, że spośród normalnych komórek tylko melanocyty zdają się wykazywać ekspresję genu tyrozynazy, tyrozynaza jest użytecznym antygenem docelowym dla immunoterapii czerniaków.
Tak więc, zrekombinowany wirus MVA, kierujący ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy, może być użyty u pacjentów z czerniakiem w celu indukcji odpowiedzi odpornościowej, która spowoduje zanik nowotworu lub zapobiegnie metastazie. Zrekombinowany wirus MVA, kierujący ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy może być użyty bezpośrednio, jako szczepionka przeciw czerniakowi, lub wirus może być zastosowany do przygotowania szczepionki przeciw czerniakowi. W jednym przykładzie,, zrekombinowany wirus MVA, kierujący ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy może być zastosowany do produkcji białka tyrozynazy rekombinanta, które może być użyte jako antygen do przygotowania szczepionki. W innym przykładzie, używając zrekombinowanego wirusa MVA, kierującego ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy jako wektora ekspresji, komórki pochodzące z nowotworu pacjenta mogą być zmodyfikowane in vitro, aby wykazywać ekspresję tyrozynazy i następnie zostać przeniesione z powrotem do pacjenta, aby wywołać anty-nowotworową odpowiedź odpornościową. Szczepionka przygotowana w oparciu o zrekombinowanego MVA, kierującego ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy, może być użyta pozajelitowo lub lokalnie w miejscu nowotworu, aby zapobiec metastazie nowotworu lub fenotypowej zmianie nowotworu, np. rozmiaru, kształtu, konsystencji, unaczynienia lub innych własności. Szczepionka przygotowana w oparciu o zrekombinowanego wirusa MVA, kierującego ekspresją genu ludzkiej tyrozynazy może być użyta przed, podczas, lub po operacyjnym wycięciu nowotworu.
W celu przygotowania szczepionki, wirusy ospy krowiej MVA, zgodnie z wynalazkiem, są .przekształcane w formę akceptowaną fizjologicznie. Można to zrobić w oparciu o doświadczenie w przygotowywaniu szczepionek MVA używanych do szczepień przeciwko ospie (jak opisali Stickl, H. i inni [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Typowo, około 106-108 cząstek zrekombinowanego MVAjast suszonych w stanie zamrożenia w 100 ml soli zbuforowanej (PBS) w obecności 2% peptonu i 1% albuminy, w ampułce, korzystnie w szklanej ampułce. Liofilizat może zawierać takie związki jak mannitol, dekstran, cukier, glicyna, laktoza czy poliwinylopiroldyna, i inne substancje pomocnicze (takie jak antyoksydanty, stabilizery,
186 857 itp.), odpowiednie do podawania pozajelitowego. Szklana ampułka jest następnie szczelnie zamykana i może być przechowywana, korzystnie w temperaturach poniżej -20°C, przez kilkanaście miesięcy. Przy szczepieniu czy terapii, liofilizat może być rozpuszczony w 0,1 lub 0,5 ml roztworu wodnego, korzystnie w soli fizjologicznej, i podawany zarówno pozajelitowo, np. przez domięśniowe szczepienie lub miejscowo, np. przez szczepienie do nowotworu lub w miejsce nowotworu. Szczepionki, lub leki, zgodnie z wynalazkiem, są korzystnie podawane domięśniowo (Mayr, A. i inni [1978] Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. B 167, 375-390). Sposób podania, dawka i liczba podań mogą być zoptymalizowane przez osoby doświadczone w tej dziedzinie. Jest korzystnym podawać szczepionkę wiele razy przez dłuższy okres czasu w celu uzyskania odpowiedniej odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko obcemu antygenowi.
Zastosowanie zrekombinowanych wirusów MVA do produkcji heterologicznych peptydów.
Zrekombinowane wirusy MVA, zgodnie z wynalazkiem, mogą być użyte do przygotowania heterologicznych polipeptydów w komórkach eukariotycznych. Odnosi się to do komórek zainfekowanych zrekombinowanym wirusem ospy krowiej. Gen, który koduje obce polipeptydy, ulega ekspresji w tych komórkach i wyprodukowane heterologiczne peptydy są izolowane. Sposoby używane do produkcji takich heterologicznych polipeptydów są generalnie znane osobom doświadczonym w tej dziedzinie (EP-A-206, 920 i EP-205, 939). Polipeptydy produkowane z pomocą zrekombinowanych wirusów MVA są ze względu na specjalne właściwości wirusów MVA są bardziej odpowiednie do zastosowania jako leki u ludzi i zwierząt.
Zrekombinowane wirusy MVA kodujące polimerazę RNA T7 i zastosowanie ich do ekspresji sekwencji DNA pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7.
W następnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku, skonstruowaliśmy zrekombinowane wirusy MVA, które umożliwiają ekspresję genu polimerazy RNA bakteriofaga T7 pod kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa ospy krowiej. Użyteczność zrekombinowanych wirusów MVA-T7 pol, jako systemu ekspresji była testowana w próbie przejściowej transfekcji, w celu indukcji ekspresji zrekombinowanych genów pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7. Stosując gen acetyltransferazy chloramfenikolu (CAT), jako genu reporterowego, stwierdziliśmy, że MVA-T7 pol indukował ekspresję genu CAT tak efektywnie, jak zrekombinowany wirus ospy krowiej/T7 pol, który pochodził z kompetentnego replikacyjnie szczepu WR wirusa ospy krowiej.
System hybrydowy MVA/polimeraza T7, zgodnie z wynalazkiem, może być więc użyty jako prosty, wydajny i bezpieczny system ekspresji w komórkach ssaków, do produkcji polipeptydów, przy braku replikacji produktywnego wirusa ospy krowiej.
Ten system ekspresji może być również zastosowany do wytworzenia zrekombinowanych cząstek wirusów do szczepienia lub terapii genowej, poprzez transformację linii komórek zainfekowanych zrekombinowanym MVA, kierującym ekspresją polimerazy RNA T7, z konstruktem DNA, zawierającym wszystkie lub część genów, i z genomem lub zrekombinowanym genomem, niezbędnym do wytworzenia cząstek wirusów, np. cząstek MVA lub cząstek retrowirusów, pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7.
Systemy wektora retrowirusowego zawierają dwie komponenty:
1) wektor retrowirusowy, który jest zmodyfikowanym retrowirusem (wektor plazmidowy), w którym geny kodujące białka wirusowe zostały zastąpione przez geny terapeutyczne i geny markerowe w celu przeniesienia ich do komórki docelowej. Jako, że zastąpienie genów kodujących białka wirusowe efektywnie uszkadza wirusa, to trzeba użyć drugiej komponenty systemu, która dostarczy zmodyfikowanemu retrowirusowi brakujące białka wirusowe.
Drugą komponentąjest:
2) linia komórek, która produkuje duże ilości białek wirusowych, jakkolwiek brakuje jej zdolności do produkowania wirusa ulegającego replikacji. Taka linia komórek jest znana jako linia komórek pakujących i zawiera linie komórek transfekowanych jednym lub wieloma plazmidami, przenoszącymi geny (geny kodujące polipeptydy gag, pol i env), umożliwiające pakowanie zmodyfikowanych wektorów retrowirusowych.
W celu wytworzenia opakowanych wektorów, wektor plazmidowy jest transfekowany do linii komórek pakujących. W tych warunkach zmodyfikowany genom retrowirusowy, zawierający wprowadzone geny terapeutyczne i markerowe jest transkrybowany z wektora pla186 857 zmidowego i pakowany do zmodyfikowanych cząstek retrowirusa (zrekombinowane cząstki wirusa). Taki zrekombinowany wirus jest następnie używany do infekowania komórek docelowych, w których genom wektora i każdy przenoszony gen markerowy, czy terapeutyczny zostaje zintegrowany z DNA komórek docelowych. Komórka zainfekowana taką zrekombinowaną cząstką nie może produkować nowego wektora wirusowego, jako, że żadne białka wirusowe nie są obecne w takiej komórce. Jakkolwiek, DNA wektora, przenoszącego geny terapeutyczne i markerowe jest zintegrowane z DNA komórkowym i może teraz ulegać ekspresji w zainfekowanych komórkach.
Zrekombinowany wirus MVA, zgodnie z wynalazkiem, kierujący ekspresją polimerazy RNA T7, może zostać użyty do produkcji białek, wymaganych do pakowania wektorów retrowirusowych. W tym celu geny gag, pol i env retrowirusa (np. z Murine Leukemia Virus (MLV) są umieszczane pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7 w jednym lub wielu wektorach ekspresji (np. plazmidach). Wektory ekspresji są następnie wprowadzane do komórek zainfekowanych zrekombinowanym wirusa MVA, kierującym ekspresją polmerazy RNA T7, i wektorem ekspresji, przenoszącym konstrukt wektora retrowirusowego, możliwie pod kontrolą transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNAT7.Geny zrekombinowanych wirusów są transkrybowane z dużą wydajnością, białka rekombinanta są wytwarzane w dużych ilościach i mogą być oczyszczone. Dodatkowo, ulegające ekspresji geny, kodujące białka rekombinanta (np. HIV-1 env, gag) mogą zgromadzić się w pseudo-wirusowe cząstki, które wychodzą z komórek i mogą być izolowane z medium hodowli tkankowej. W innym przykładzie zastosowania, białka wirusowe (np. z HIV, SIV, wirusa odry), ekspresjonowane przez system MVA-T7 mogą odratować dodatkowo wprowadzonego mutanta wirusa (pochodzącego np. z HIV, SIV, wirusa odry) poprzez przezwyciężenie defektu w wiązaniu i infekowaniu, opłaszczaniu, replikacji kwasów nukleinowych, ekspresji genów wirusowych, gromadzeniu, wychodzeniu z komórki lub innym etapie namnażania wirusa, aby umożliwić produkcję i oczyszczanie wymienionego mutanta wirusa.
MVA-T7 pol może być także użyty razem z sekwencjami DNA, przenoszącymi geny pożądanych antygenów (np. genu HIV, nef, tat, gag, pol, lub env czy inne) do uodpornienia. Po pierwsze, sekwencje kodujące dany antygen (np. HIV, HCV, HPV, HSV, wirusa odry, wirusa grypy czy inne), które są klonowane, znajdują się pod kontrolą promotora polimarazy RNAT7, korzystnie w wektorze plazmidowym i otrzymany konstrukt DNA jest powielany i oczyszczany przy użyciu standardowych metod laboratoryjnych. Po drugie, wektor DNA jest zaszczepiany równocześnie lub z odpowiednimi przerwami razem z MVA-T7 poi. W miejscu zaszczepienia pożądany gen rekombinanta ulega przejściowej ekspresji w komórkach zawierających zarówno wektor DNA i MVA-T7 pol i odpowiedni antygen jest prezentowany układowi odpornościowemu, stymulując specyficzną antygenowo odpowiedź odpornościową. Ten protokół stosujący nieulegający replikacji wektor ospy krowiej MVA-T7 pol przedstawia obiecujące, nowatorskie podejście do szczepienia kwasami nukleinowymi, umożliwiające efektywną, przejściową ekspresję danego antygenu, unikając jednocześnie potencjalnego ryzyka ekspresji genu konstytutywnego.
Zrekombinowane wirusy ospy krowiej MVA mogą być przygotowane, jak to opisano w dalszej części pracy.
Konstrukt DNA, który zawiera sekwencje DNA, które kodują obce polipeptydy, flankowane przez sekwencje DNA MVA przyległe do spontanicznie pojawiającej się delecji, np. delecji II w genomie MVA, jest wprowadzany do komórek zainfekowanych MVA, w celu homologicznej rekombinacji.
Jako, że konstrukt DNA został wprowadzony do komórki eukariotycznej i obce DNA zostało zrekombinowane z wirusowym DNA, jest możliwe izolowanie pożądanego zrekombinowanego wirusa ospy krowiej w sposób znany, korzystnie z pomocą markera (porównaj Nakano i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593- 1596 [1982], Franke i inni, Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti i inni, Mol. Celi. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi i inni, Virology 97-105 [1986]).
Konstrukt dNa, który ma być wprowadzony, może być liniowy lub kolisty. Koliste DNA jest korzystne, szczególnie plazmidowe. Konstrukt DNA zawiera sekwencje flankujące
186 857 z lewej i z prawej strony spontanicznie pojawiającej się delecji, np. delecji II, w genomie MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. i Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27).
Sekwencja obcego DNA jest wprowadzana między sekwencje flankujące spontanicznie pojawiającej się delecji. Sekwencja obcego DNA może być genem kodującym terapeutyczne peptydy, np. t-PA lub interferon, lub determinantą antygenową z czynnika chorobotwórczego. Czynnikami chorobotwórczymi mogą być wirusy, bakterie i pasożyty, które mogą powodować choroby, jak i komórki nowotworowe, które w organizmie namnazają się w sposób nieograniczony i w ten sposób osiągnąć patologiczny rozrost. Przykłady takich czynników chorobotwórczych są opisane w pracy Davis, B.D. i inni (Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition). Preferowane antygeny czynników chorobotwórczych pochodzą z wirusów ludzkiego obniżenia odporności (np. HIV-1 i HIV-2), z miobakterii powodującej gruźlicę, z pasożyta Plasmodium falciparum, i z komórek czerniaka.
W celu ekspresji sekwencji DNA lub genu, jest niezbędne, aby sekwencje regulatorowe, które są wymagane do transkrypcji genu, były obecne w DNA. Takie sekwencje regulatorowe (zwane promotorami), są znane specjalistom w omawianej dziedzinie, i zawierają na przykład 11 kDa gen wirusa ospy krowiej, jak to opisano w EP-A-198,328, i 7.5 kDa gen (EP-A-110,385).
Konstrukt DNA może być wprowadzany do komórek zainfekowanych MVA poprzez transfekcję, na przykład przy pomocy precypitacji w fosforanie wapniowym (Graham i inni, Virol. 52, 456-467 [1973]; Wigier i inni, Celi 777-785 [1979], za pomocą elektroporacji (Neumann i inni, EMBO J. 1, 841-845 [1982], przez mikroiniekcję (Graessmann i inni, Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), przez liposomy (Straubinger i inni, Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), przez sferoplasty (Schaffner, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 77, 2163-2167 (1980)) lub za pomocą innych sposobów, znanych specjalistom w tej dziedzinie. Transfekcja za pomocą precypitacji w fosforanie wapnia jest korzystna.
Szczegółowe przykłady, które następują poniżej mają na celu lepsze zrozumienie niniejszego wynalazku. Jakkolwiek, nie jest celem stworzenie wrażenia, że wynalazek jest ograniczony do możliwości przedstawionych w przykładach.
Rysunki.
Fig. 1 - Schematyczna mapa genomów MVA i plazmidu służących do wprowadzenia obcego DNA poprzez homologiczną rekombinację: miejsca restrykcyjne HinidW w genomie MVA są wskazane na szczycie. Pokazano 900-bp fragment Hindll -Hindll, który pokrywa połączenie delecji II w genomie MVA. Sekwencje DNA przyległe do delecji II (flanka 1 i flanka 2) zostały zamplifikowane przez PCR i użyte do skonstruowania plazmidu do wprowadzania pUC IILZ.
Fig. 2 - pUC II LZ p.7.5: wektor plazmidowy MVA do wprowadzenia w miejsce delecji II, zawierający kasetę ekspresji P11-LacZ i wczesny/późny promotor P7.5 wirusa ospy krowiej do ekspresji pożądanych genów, które mogą być wklonowane do miejsca Smal w plazmidzie.
Fig. 3 - pUC II LZdel P7.5: wektor plazmidowy MVA do wprowadzenia obcych genów w miejsce delecji II w genomie MVA, zawierający samo-deleeującąkasetę ekspresji PIl-LacZ i wczesny/późny promotor P7.5 wirusa ospy krowiej do ekspresji pożądanych genów, które mogą być wklonowane do miejsca Smal/Notl w plazmidzie.
Fig. 4 - Konstrukcja zrekombinowanego wirusa MVA-T7 pol: schematyczna mapa genomu MVA (miejsca restrykcyjne endonukleazy Hindlll) i wektor plazmidowy pUC II Lz T7, który umożliwia wprowadzenie genu polimerazy RNA T7 w miejsce delecji II we fragmencie HindlU genomu MVA.
Fig. 5 - Analiza Southern blot DNA MVA-T7 pol.
Fig. 6 - Znakowanie metaboliczne białek przy użyciu [35S] metioniny. Analiza SDS PAGE. Kolumna 1: MVZ T7 pol, kolumna 2: MvA, kolumna 3: komórki CV-1.
Fig. 7 - Próba CAT: komórki CV-1 transfekowane plazmidem zawierającym gen CAT, będący pod kontrolą promotora polimerazy RNAT7 i zainfekowane MVA-t/pol lub WR-T7 pol. Lizaty testowano na aktywność CAT. C oznacza chloramfenikol, i 1-AcC i 3-AcC oznaczają monoi trój-acetylowane formy chloramfenikolu. Aktywność CAT jest wyrażana jako procent acetylowanego produktu utworzonego w ciągu 60 min.
186 857
Fig. 8 - Konstrukcja MVA-Lanef: schematyczna mapa genomu MVA (miejsca restrykcyjne endonukleazy HindlUl) i wektor plazmidowy pUC II LZdel P7.5-LAInef, który umożliwia wprowadzenie genu nef zHIV-1 LAI w miejsce delecji II w obrębie fragmentu Hindlll genomu MVA.
Fig. 9 - Konstrukcja MVA-hTYR: schematyczna mapa genomu MVA (miejsca restrykcyjne endonukleazy Hindlll) i wektor plazmidowy pUC II LZdel P7.5-TYR, który umożliwia wprowadzenie genu ludzkiej tyrozynazy w miejsce delecji II w obrębie fragmentu Hindlll genomu MVA.
Przykłady.
1. Rozwój i occyyzccanie wirusów
1.1 Rozwój wirusów MVA
MVA jest silnie osłabionym wirusem ospy krowiej, pochodzącym od szczepu wirusa ospy krowiej Ankara (CVA) poprzez długotrwałe pasażowanie w hodowlach pierwotnych fibroblnztów z kurzych zarodków (CEF). Dla ogólnego przeglądu historii produkcji, właściwości i zastosowań szczepu MVA, polecane jest podsumowanie opublikowane przez Mayr i inni, Infection 3,6-14 [1975]. W związku z osłabieniem w CEF, wirus MVA replikuje się do wysokich mian w tych ptasich komórkach. Natomiast w komórkach ssaków, rozwój MVA jest silnie ograniczony, i typowe płytkowe formacje tworzone przez wirusa są niewykrywalne. Tak więc, wirus rozwijał się w komórkach CEF. W celu przygotowania komórek CEF, H-dniowe embriony były izolowane z inkubowanych kurzych jaj, kończyny usunięto, i embriony były rozdrabniane i rozdzielane w roztworze składającym się z 0,25% trypsyny w 37°C przez 20 min. Otrzymana zawiesina komórek była filtrowana i komórki były osadzane przez wirowanie przy 2000 obr/min w wirówce Sorvall RC-3B w temperaturze pokojowej przez 5 min., ponownie zawieszone w 10-ciokrztnej objętości medium A (MEM Eagle, uzyskane na przykład z Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany) i osadzane ponownie przez wirowanie przy 2000 obr/min w wirówce Sorvall RC-3B w temperaturze pokojowej przez 5 min. Osad komórkowy został umieszczony medium A, zawierającym 10(% surowicę z płodu cielęcego (FCS), penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 mg/ml) i 2 mM glutaminę w celu uzyskania zawiesiny zawierającej 500 000 komórek/ml. Uzyskane tą drogą komórki CEF zostały rozprzestrzenione na płytkach do hodowli tkankowych. Następnie pozwolono im rozwijać się w medium A w inkubatorze CO2 w 37°C przez 1-2 dni, zależnie od pożądanej gęstości komórek, i były używane do infekowania zarówno bezpośrednio lub po 1 dalszym pasażu. Szczegółowy opis przygotowywania hodowli pierwotnych można znaleźć w książce R.I. Freshney, „Culture of animal cell” Alan RUss Verlag, New York [1983], Rozdział 11, strona 99 i następne.
Wirusy MVA zostały użyte do infekcji jak następuje. Komórki CEF były hodowane w 175 cm2 butelkach hodowlanych. Przy 90-100% konferencji, medium zostało usunięte i komórki były inkubowane przez 1 godz. z zawiesiną wirusa MVA (0,01 jednostek infekcyjnych (IU) na komórkę, 0,02 ml/cmi) w medium A. Następnie dodawano więcej medium A (0,2 ml/cm2) i butelki były inkubowane w 37°C przez 2-3 dni (aż około 90% komórek wykazywało cechy cyto-chorobotwórcze). Wstępny preparat wirusa był przygotowywany poprzez zdrapanie monowarstwy komórkowej do medium i osadzanie materiału komórkowego poprzez wirowanie przy 3000 obr/min w wirówce Sorvall w 4°C przez 5 min. Wstępny preparat wirusa był przechowywany w -20°C przed dalszą preparatyką (np. oczyszczaniem wirusa).
1.2 Oczyszczanie wirusa.
Etapy oczyszczania, przedsięwzięte w celu uzyskania preparatu wirusa, czystego, jak to tylko możliwe i wolnego od komponent specyficznych dla komórek gospodarza, były podobne do opisanych przez Joklik (Virzlzgy 18,9-18 [1962].
Wyjściowy preparat wirusa, który był przechowywany w -20°C, został rozmrożony i zawieszony raz w PBS (w 10-20-krotnej objętości w stosunku do objętości osadu), i zawiesina była wirowana jak wyżej. Nowy osad był zawieszony w 10-cizkrotnej objętości buforu Tris 1 (10 mM Tris-HCl pH 9,0), i zawiesinę poddano krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków (Labsonic L, Braun Biotech International, Melsungen, Germany; 2x10 sekund przy 60 watach i w pokojowej temperatu20
186 857 rze) w celu dalszej dezintegracji pozostałości komórkowych i uwolnienia cząstek wirusa z materiału komórkowego. Jądra komórkowe i większe resztki komórkowe zostały usunięte przez kolejne, krótkie wirowanie zawiesiny (Sorvall GSA rotor uzyskany z DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minuty przy 3000 obr/min i 10°C). Osad był jeszcze raz zawieszany w buforze Tris 1, poddany działaniu ultradźwięków i wirowany, jak opisano wyżej. Zebrane supernatanty, zawierający cząstki wolnego wirusa zostały połączone i rozdzielone w 10 ml 36% cukrozy w 10 mM tris-HCl, pH 9,0, i wirowane w rotorze Beckman SW 27/SW 28 przez 80 min. przy 13,500 obr/min w 4°C. Supernatant został usunięty, i osad zawierający cząstki wirusa został dodany do 1 ml 1 mM Tris-HCl, pH 9,0, homogenizowany przez poddanie krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków (2x10 sekund w temp. pokojowej, aparat jak wyżej), i zastosowano 20-40% gradient cukrozy (cukroza w 1 mM Tris-HCl, pH 9,0) dla dalszego oczyszczenia. Gradient był wirowany w rotorze Beck-mann SW41 przy 13,000 obr/min przez 50 min. w4°C. Po wirowaniu, odrębne pasma, zawierające cząstki wirusa zostały zebrane przez pipetowanie, po odessaniu płynu znad pasm. Otrzymany roztwór cukrozy został rozpuszczony w 3 objętościach PBS i cząstki wirusa zostały osadzone ponownie przez wirowanie (Beckmann SW 27/28,60 min. przy 13,500 obr/min, 4°C). Osad, który teraz zawierał już większość cząstek wirusa, był ponownie zawieszony w pBs i stężenie wirusa zostało wyrównane do średnio 1-5 x 109 IU/ml. Oczyszczony podstawowy roztwór wirusa był przechowywany w -80°C i używany zarówno bezpośrednio lub rozcieńczany PBS w kolejnych eksperymentach.
1.3 Klonowanie wirusai MVA.
W celu przygotowania homogennego roztworu podstawowego wirusa, MVA uzyskany od Prof. Anton Mayr został sklonowany przez ograniczone rozcieńczanie podczas trzech kolejnych pasaży w CEF, hodowanych w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Klon F6 MVA został wyselekcjonowany i namnożony w CEF w celu uzyskania preparatów podstawowych wirusa, które służyłyby jako materiał wyjściowy do wytwarzania zrekombinowanych wirusów MVA, opisanych w tym opisie wynalazku, jak również do wytworzenia zrekombinowanych wirusów MVA opisanych wcześniej (Sutter, G I Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. i Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G, Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G, Montefiori, D., Moss, B. i Lifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741-3752).
2. Κοη5ΗίΑςί3 i charakterystykazrekombinowal^ych wirnsów MVA.
2. 1 Konstrukcja wektorów plazmidowych.
Aby umożliwić wytworzenie zrekombinowanych wirusów MVA, skonstruowano oryginalne wektory plazmidowe. Obce geny zostały precyzyjnie wprowadzone do genomu MVA w miejsce spontanicznie pojawiającej się delecji II w genomie MVA. Sekwencje DNA MVA flankujące miejsce 2500-bp delecji we fragmencie HindIII N genomu MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. i Altenburger, J. [1989], J. Arch. Virol. 105, 15-27) zostały zamplifikowane w reakcji PCR i wklonowane do licznych miejsc plazmidu pUC 18. Primerami dla 600-bp lewej flanki DNA były 5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' i 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (miejsca dla enzymów restrykcyjnych KpnI i Smal są podkreślone). Primerami dla prawej 550-bp flanki DNA były 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' I 5'-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3' (miejsca dla enzymów restrykcyjnych Pstl i Sphl są podkreślone). Między tymi flankani DNA MVA wprowadzonymi do pUC 18, wprowadzony został gen lacZ Escherichia coli, będący pod kontrolą późnego promotora Pil wirusa ospy krowiej (przygotowanego przez cięcia restrykcyjne z pill LZ, Sutter, G. i Moss, B. [1992] PNAs USA 89, 10847-10851) przy użyciu miejsca BamHI w celu utworzenia wektora pUC II LZ do wprowadzenia MVA [Fig. 1], Dalej, 289-bp fragment, zawierający wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa ospy krowiej, razem z miejscem do klonowania Smal (przygotowany przez cięcia restrykcyjne z EcoRI i Xbal z wektora plazmidowego pSC11 [Chakrabarti i inni 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409]) został wprowadzony do miejsca Smal pUC II LZ, aby dostarczyć wektor MVA do pUC II LZ7.5 [Fig. 2], W celu
186 857
W celu skonstruowania wektora plazmidowego, który umożliwi wyizolowanie zrekombinowanych wirusów MVA poprzez przejściową syntezę enzymu reporterowego β-galaktozydazy, 330 bp fragment z końca 3' LacZ E. coli został powielony przez PCR (primerami były 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' i 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3') i sklonowany w miejsca Sali i Pstl plazmidu pUC Π LZ P7.5 w celu uzyskania wektora pUC II LZdel P7.5 dla MVA [Fig. 3]. Przy zastosowaniu miejsce Sma 1, ten wektor plazmidowy może być użyty do wprowadzenia sekwencji DNA, kodujących obcy gen, będący pod transkrypcyjną kontrolą promotora P7.5 wirusa ospy krowiej, do genomu MVA.
Po tym, jak pożądany rekombinant wirusa jest wyizolowany przez selekcje względem ekspresji aktywności β-galaktozydazy, dalsza propagacja zrekombinowanego wirusa prowadzi do samodelecji ponownie utworzonej kasety ekspresji PU-LacZ przez homologiczną rekombinację.
2.2 Konstrukcja i charakterystyka zrekombinowanego wirusa MVAT7 pol.
3.1 kbp i ragmenaDNA, za\Aerającycafygen polimerazy RNA bakteriofaga T7,zost7ł wycięty za pomocą EcoRI z plazmidu pTF7-3 (Fuerst, T.R., Niles, E.G, Studier, F.W. i Moss, B., 1986, PN.A.S. USA 83, 8122-8126), zmodyfikowany przez inkubację z polimerazą DNA Klenow^ w celu wytworzenia tępych końców, i sklonowany do Smal, jedynego miejsca restrykcji pUC II LZ, aby utworzyć plazmidowy wektor transferowy pUC Ii LZ T7 pol [Fig. 4]. Do kantrali ekspresji genu polimerazy RNA T7 wybrano jako regulator transkrypcji wczesny/późny promotor P7.5 wirusa ospy krowiej. W przeciwieństwie do silniejszych pramatarów wirusa ospy krowiej (np. P11), ten system promotora umożliwia ekspresję genów rekombinanta tuż po zainfekowaniu komórek docelowych. Plazmid pUC II LZ T7 pol, który kieruje wprowadzaniem obcych genów do miejsca delecji II w genomie MVA, został użyty do wytworzenia zrekombinowanego wirusa MVA T7 pol.
Komórki CEF zainfekowane MVA o liczebności 0,05 TCID50 na komórkę, były transfekowane DNA plazmidu pUC II LZ T7 pol, jak opisano uprzednio (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. i Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Zrekombinowany wirus MVA kierujący ekspresją polimerazy RNAT7 i β-D-galaktozgdazg (MVAP7.5-T7 poi) został wyselekcjonowany przez pięć kolejnych cykli oczyszczania w komórkach CEF, barwionych 5-bromo-4chloro-3-indolil p-D-galaktozydem (300 pg/ml). Kolejno, zrekombinowane wirusy były namnażane poprzez infekcję monowarstw CEF, i DNA było analizowane poprzez reakcję PCR, w celu porównania genetycznej homogenności preparatu wirusa. Analiza Southern blot DNA MVA-T7 pol wykazała stabilną integrację genów rekombinanta w miejsce delecji II w genomie MVA [Fig. 5], W celu monitorowania ekspresji polimerazy RNA T7 przez zrekombinaąanega MVA T7 pol, analizowano palipeptgdy znakowane [35S] metioniną, pochodzące z hodowli tkankowej zainfekowanej wirusem. Manowarstwg z linii komórkowej CV-1, z nerki małpy, które rozwijały się w 12-to dołkowych płytkach, zostały zainfekowane wirusem, 20 TCID50 na komórkę. 3-5 godzin po infekcji medium było usuwane i hodowle były płukane raz w 1 ml medium bez metioniny. Do każdego dołka zostały dodane 0,2 ml medium bez metioniny, uzupełnione 50 p Ci [35S] metioniny i inkubowane przez 30 min. w 37°C. Ekstrakty cgtaplazmy zainfekowanych komórek były przygotowywane przez inkubowanie każdego dołka w 0,2 ml 0,5% buforu lizującego Nonidet-40 przez 10 min w 37°C i próbki były analizowane przez SDS-PAGE. Metaboliczne wyznakowanie komórek CV-1 przez MVA T7 pol ujawniła synteza dwóch dodatkowych plipeptydów (i) białka o ok. 116,000 Da, reprezentującego P-g^laktozydazę E. Coli, umożliwiającą ujawnienie zrekombinowanego wirusa i (ii) białko o 98,000 Da o spodziewanych rozmiarach βalimerazy RNA bakteriofaga T7 [Fig. 6]. Duża ilość β-galaktazgdazg, wyprodukowanej przez MVA T7 jest znacząca. Rezultaty eksperymentów ze znakowaniem in vivo pokazały bardzo silną ekspresję konstruktu genów Pl 1-LacZ po wprowadzeniu do genomu MVA w miejsce delecji II, co wskazuje, że zrekambinowane geny w wektorze wirusa MVA mogą ulegać ekspresji bardziej wydajnie, gdy są wprowadzane do tego właśnie miejsca w genomie.
Użyteczność zrekambinawanych wirusów MVA-T7 pol, jako systemu ekspresji, w porównaniu z rekombinantem WR-T7 pol wirusa vTF7-3 (Fuerst i inni, 1986), była testowana
186 857 przez ko-transfekcję DNA wektora plazmidowego, pochodzącego z pTMl (Moss, B., ElroyStein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A. i Fuerst, T.R. (1990) Nature 348, 91-92) i zawierającego (klonowany do miejsc Ncol i Bo/wHI pTMl) gen acetyltransferazy chloramfenikolu (CAT) E. Coli, będący pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 (PT7). Transfekowane i zainfekowane komórki CV-1 były zawieszone w 0,2 ml 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5). Po trzech cyklach mrożenia-rozmrażania, lizaty były klarowane przez wirowanie, określano skład białek w supematantach, i próbki zawierające 0,5, 0,25, 0,1 pg wszystkich białek były analizowane na aktywność enzymu, jak opisali to Mackett, M., Smith, G.L. i Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864. Po autoradiografii, wyznakowane prążki analizowano ilościowo przy użyciu systemu analizy obrazu Fuji. Wyniki wykazały, że dzięki zastosowaniu silnie osłabionego wektora MVA możliwe jest wykorzystanie systemu polimerazy RNA T7, tak wydajnego, jak dzięki użyciu w pełni kompetentnego replikacyjnie zrekombinowanego wirusa ospy krowiej [Fig. 7].
2.3 Konstrukcja i charakterystyka zrekombinowanego wirusa MVA-LAInef.
Fragment DNA o 648 bp, zawierający cały gen nef HIV-1 LAI został przygotowany w PCR z DNA plazmidu (pTG1166 dostarczony dzięki uprzejmości M.P. Kieny, Transgene S.A., Strasbourg; otrzymanymi w PCR primerami były 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' i 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), cięty endonukleazami restrykcyjnymi BamłAl, modyfikowany przez inkubację z polimerazą DNA Klenow'a w celu wytworzenia tępych końców, i sklonowany do miejsca Smal pUC LZdel P7.5 w celu utworzenia wektora pUC Π LZdel P7.5-LAInef [Fig. 8]. Plazmid ten mógłby być użyty do stworzenia zrekombinowanego wirusa MVA, który wywołuje ekspresje genu ne/HTV-l LAI pod kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa ospy krowiej.
Komórki zainfekowane MVA, 0.05 TCID50 na komórkę, były transfekowane DNA plazmidu pUC II LZdel P7.5-LAInef, jak opisano wcześniej ((Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. i Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Zrekombinowane wirusy MVA, zawierające gen nef i przejściowo powodujące koekspresję genu markerowego LacZ E. Coli, były wyselekcjonowane poprzez kolejne cykle oczyszczania płytek w komórkach CEF barwionych
5-bromo-4-chloro-3-indolil β-D-galaktozydem (300 pg/ml). Następnie, zrekombinowane wirusy, zawierające gen nef i mające usunięty gen markerowy LacZ były izolowane w trzech kolejnych cyklach oczyszczania, analizowane na obecność nie barwiących się miejsc wirusowych w komórkach CEF w obecności 5-bromo-4-chloro-3-indolil β-D-galaktozydem (300 pg/ml). Dalej, zrekombinowane wirusy były namnażane poprzez infekcję mono warstw CEF, i DNA MVA-LAInef było analizowane poprzez reakcję PCR, w celu porównania genetycznej homogenności preparatu wirusa. Analiza Southern biot wirusowego DNA potwierdziła genetyczną stabilność MVA-Lalnef i precyzyjnie wykazała stabilną integrację genu nef i delecję genu markerowego LacZ E. coli w miejsce delecji II w genomie wirusa.
Wydajna ekspresja białek nef rekombinanta została potwierdzona przez analizę Western błot lizatów białkowych z komórek z komórek CEF zaifekowanych MVA-Lamef, przy zastosowaniu mysich monoklonalnych przeciwciał, kserowanych przeciwko HIV-1 Nef (dostarczonych dzięki uprzejmości K. Krohn i użytych jak opisali to Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G. I Krohn, K. [1992] AIDS 6, 25-34).
2.4 Konstrukcja i charakterystyka zrekombinowanego wirusa MVA-hTYR
Fragment DNA o 1.9 kb, zawirający cały gen kodujący ludzką tyrozynazę [klon 123.B2 c-DNA tyrozynazy, wyizolowany z linii komórek czerniaka SK29-MEL pacjenta SK29 (AV), GenBank Acc. No. UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wólfel, T„ Wolfel, C., De Plaen, E„ Lethe, B., Coulie, P. i Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489-495] był wypreparowany z plazmidu pcDNAI/Amp-Tyr [Wolfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Buschenfelde, K. i Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 759-764] przez cięcie EcoRI, modyfikowany przez inkubację z polimerazą DNA Klenow'a w celu wytworzenia tępych końców, i sklonowany w miejsce Smal pUC II LZdel P7.5, aby otrzymać wektor pUC II LZdel P7.5-TYR [Fig. 9]. Plazmid ten mógłby być użyty do stworzenia zrekombinowanego
186 857 wirusa MVA, który wywołuje ekspresję genu ludzkiej tyrozynazy pod kontrolą wczesnego/późnego promotora P7.5.
Komórki zainfekowane MVA, 0.05 TCID50 na komórkę, były transferowane DNA plazmidu pUC II LZdel P7.5-TYR, jak opisano wcześniej (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. i Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Zrekombinowane wirusy MVA, stabilnie wywołujące ekspresję genu ludzkiej tyrozynazy i przejściowo powodujące ko-ekspresję genu LacZ E. coli, były wyselekcjonowane poprzez kolejne cykle oczyszczania płytek w komórkach CEF barwionych 5-bromo-4-chloro-3-indolil β-D-galaktozydem (300 pg/ml). Następnie, zrekombinowane wirusy MVA, powodujące ekspresję genu ludzkiej tyrozynazy i mające usunięty gen markerowy LacZ były izolowane w trzech kolejnych cyklach oczyszczania, analizowane na obecność nie barwiących się miejsc wirusowych w komórkach CEF w obecności
5-bromo-4-chloro-3-indolil β-D-gaJaktozydu (300 g/^ml). l5ldej, zrekombinowane wamsy b\4y namnażane poprzez infekcję moaowarstw cEf, i DNA MVA-hTYR było analizowane poprzez reakcję PCR, w celu porównania genetycznej homogenności preparatu wirusa. Analiza Southern blot wirusowego DNA potwierdziła genetyczną stabilność MVA-hTYR i precyzyjnie wykazała stabilną integrację genu tszooynkwego i delej genu markerowego LacZ E. coli w miejsce drlrcji II w genomie wirusa.
Wydajna ekspresja ludzkiej tyrooyagoy przez rekombin5ata została potwierdzona przez analizę Western blot lizatów białkowych z komórek CEF zainfekowanych MVA-hTYR, przy zastosowaniu króliczych, polialoa5lnych przeciwciał (dostarczonych dzięki uprzejmości V. H^ng i użytych, jak to opisał Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. I Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830-3834) lub mysich, monokaongaaych przeciwciał (dostarczonych dzięki uprzejmości L. Old i użytych, jak opisali to Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. i Old, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125-8129), skierowanych przeciwko tyrkzsnaoie.
Lista sekwencji (1) Informacca ogólna (1) Zgłaszający:
(A) Nazwa: GSF-Forschuagszentrum fuer Umwelt und Gesundheit GmbH (B) Ulica: Ingolstaedter Landstn. 1, Nruhrrberg (C) Miasto: Obrzschleissheim (D) Kraj: Niemcy (E) Kod pocztowy (ZIP): 85764 (ii) Tytuł wynalazku: Zreaombiaowgay wirus MVA, i jego zastosowanie (iii) Liczba sekwencji: 8 (iv) Forma komputerowa:
(A) Środek: dyskietka (b) Komputer: kompatybilny IBM PC (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patent^ Release #1.0, wersja #1.30 (EPO) (vi) Dane poprzedniego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: DK 0782/95 (B) Data zgłoszenia: 4 lipca 1995 z.
(2) Informacja dla SEQ ID NO: 1 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis;: /op= „DNA-primer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:
CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC (2) Informacja dla SEQ ID NO:2
186 857 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: /op= „DNA-primer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:
CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA (2) Informacja dla SEQ ID NO:3 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: /op=„DNA-prinee”” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC (2) Informacja dla SEQ ID NO:4 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36 par zasad (b) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: fop^ „DNA-pi-meer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA (2) Informacja dla SEQ ID NO: 5 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: „DNA-primer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:
CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC (2) Informacja dla SEQ ID NO: 6 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: /op= „DNA-primer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG (2) Informacja dla SEQ ID NO:7 (i) Chajekteeestyya sekwencji (A) Długość: 39 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza
186 857 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: /op= „DNA-primer” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:
CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT (2) Informacja dla SEQ ID NO:8 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 39 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molekularny: inne kwasy nukleinowe (A) Opis: Λ)ρ= „DNA-primrr” (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:
CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG
186 857
KLON #9
186 857
ο ο
LŁI
C
α.
FIG. 3
186 857
MVA /7/ndlll
FIG .
186 857
GEN
T7pol
Hindlll N χ}'
FIG. 5
186 857
| kDa 220 | 1 2 | 3 |
| a | ||
| 97 | ||
| 66 | —> — | aft |
| ws? | ąłłWF | |
| 46 | 1 | |
| * ' |
FIG.6
186 857
FIG. 7
186 857
IIIPU/W νΛΙΛΙ
FIG .
186 857
MVA H/ndlll
pUC II LZdel P7.5-TYR
186 857
IWA Hindlll
O
M
LU
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (65)
- Zastrzeżenia patentowe1. Modyfikowany wirus MVA zawierający i zdolny do ekspresji genu heterologicznego, znamienny tym, że gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
- 2. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 1, znamienny tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 3. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 4. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 2, znamienny tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 5. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 4, znamienny tym, że jest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest MVA-LALnef albo MVA-hTYR.
- 6. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 1, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
- 7. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 6, znamienny tym, że jest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie jest MVA-T7pol.
- 8. Modyfikowany wirus MVA według zastrz. 1, znamienny tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki.
- 9. Modyfikowany wirus mVa według zastrz. 1-8, znamienny tym, że jest w zasadzie pozbawiony wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
- 10. Zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA zawierającego i zdolnego do ekspresji genu heterołogicznego, do transkrypcji sekwencji DNA pod transkrypcyjną. kontrolą promotora polimerazy RNA T7, przy czym gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7 i wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
- 11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że modyfikowany wirus MVAjest wirusem MVA-T7 poi.
- 12. Komórka eukariotyczna zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterołogicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji Ii w genomie MVA.
- 13. Komórka eukariotyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 14. Komórka eukariotyczna według zastrz. 12 albo 13, znamienna tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 15. Komórka eukariotyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HlV nef lub ludzka tyrozynaza.186 857
- 16. Komórka eukariotyczna według zastrz. 15, znamienna tym, że jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTVR.
- 17. Komórka eukariotyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNAT7.
- 18. Komórka eukariotyczna według zastrz. 17, znamienna tym, że jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA baktenofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
- 19. Komórka eukariotyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa kro wianki.
- 20. Komórka eukariotyczna według jednego z zastrz. od 12 do 19, znamienna tym, że zainfekowana wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
- 21. Komórka eukariotyczna według zastrz. 17 albo 18, znamienna tym, że dodatkowo zawiera jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących jeden lub więcej genów heterologicznych, będących pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNAT7.
- 22. Komórka eukariotyczna według jednego z zastrz, od 12 do 21, znamienna tym, że dodatkowo zawiera wektor ekspresyjny przenoszący gen wirusowy, i/lub konstrukt wektora wirusowego kodujący genom wektora wirusowego, będący pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNA T7.
- 23. Komórka eukariotyczna według jednego z zastrz, od 14 do 21, znamienna tym, że dodatkowo zawiera:a) wektor ekspresyjny, przenoszący konstrukt wektora retrowirusowego, mający zdolność infekowania i kierowania ekspresją w komórkach docelowych jednego lub więcej genów heterologicznych, przenoszonych przez wspomniany konstrukt wektora retrowirusowego, ib) jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących geny kodujące polipeptydy niezbędne do pakowania genomu wspomnianego konstruktu wektora retrowirusowego pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7.
- 24. Zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, do produkcji polipeptydu kodowanego przez wspomniany gen heterologiczny obejmującej:a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, ib) izolowanie polipeptydu kodowanego przez wspomniany gen heterologiczny.
- 25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 26. Zastosowanie według zastrz. 24 albo 25, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
- 29. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
- 30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.186 857
- 31. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki.
- 32. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 24 do 31, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
- 33. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna dodatkowo zawiera jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących jeden lub więcej genów heterologicznych, będących pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNA T7.
- 34. Zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, przy czym wspomniana komórka dodatkowo zawiera wektor ekspresyjny przenoszący gen wirusowy, i/lub konstrukt wektora wirusowego kodujący genom wektora wirusowego, będący pod kontrolą transkrypcyjną promotora polimerazy RNAT7, do produkcji cząsteczek wirusowych obejmującej:a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, ib) izolowanie cząsteczek wirusowych.
- 35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 36. Zastosowanie według zastrz. 34 albo 35, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 37. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
- 39. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
- 40. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem ΜΥΑ-Τ7 poi.
- 41. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora P7.5 wirusa krowianki.
- 42. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 34 do 41, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
- 43. Zastosowanie komórki eukariotycznej zainfekowanej modyfikowanym wirusem MVA zawierającym i zdolnym do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, przy czym wspomniana komórka dodatkowo zawiera:a) wektor ekspresyjny, przenoszący konstrukt wektora retrowirusowego, mający zdolność infekowania i kierowania ekspresją w komórkach docelowych jednego lub więcej genów heterologicznych, przenoszonych przez wspomniany konstrukt wektora retrowirusowego, ib) jeden lub więcej wektorów ekspresyjnych, przenoszących geny kodujące polipeptydy niezbędne do pakowania genomu wspomnianego konstruktu wektora retrowirusowego pod186 857 transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, do produkcji cząsteczek retrowirusowych obejmującej:a) hodowanie wspomnianych komórek w odpowiednich warunkach, ib) izolowanie cząsteczek retrowirusowych.
- 44. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że komórka eukariotyczna jest zainfekowana modyfikowanym wirusem MVA, w którym gen heterologiczny koduje znany marker, czynnik terapeutyczny, antygen lub determinantę antygenową, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 45. Zastosowanie według zastrz. 43 albo 44, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 46. Zastosowanie według zastrz. 44, znamienne tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest zainfekowana wirusem MVA-LAlnef albo MVA-hTYR.
- 48. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje polimerazę RNA T7.
- 49. Zastosowanie według zastrz. 48, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna jest zainfekowana wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
- 50. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że gen heterologiczny jest pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora p7.5 wirusa krowianki.
- 51. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 43 do 50, znamienne tym, że wspomniana komórka eukariotyczna zainfekowana jest wirusem MVA w zasadzie pozbawionym wirusów zdolnych do replikacji w komórkach ludzkich.
- 52. Szczepionka zawierająca modyfikowanego wirusa i fizjologicznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako modyfikowanego wirusa zawiera modyfikowanego wirusa MVA zawierającego i zdolnego do ekspresji genu heterologicznego, przy czym gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
- 53. Szczepionka według zastrz. 52, znamienna tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.
- 54. Szczepionka według zastrz. 52 albo 53, znamienna tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 55. Szczepionka według zastrz. 52, znamienna tym, że determinantą antygenową łub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 56. Szczepionka według zastrz. 55, znamienna tym, że modyfikowany wirus jest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest MVA-LAInef albo MVA-hTYR.
- 57. Zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA do produkowania szczepionki, przy czym modyfikowany wirus MVA zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA.
- 58. Zastosowanie według zastrz. 57, znamienne tym, że gen heterologiczny jest genem znanego markera, czynnika terapeutycznego, antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym korzystnie gen heterologiczny koduje znaną determinantę antygenową lub antygen z wirusa chorobotwórczego, mikroorganizmu, zwłaszcza bakterii, lub z pasożyta, albo z komórki nowotworowej.186 857
- 59. Zastosowanie według zastrz. 57 albo 58, znamienne tym, że gen heterologiczny koduje determinantę antygenową lub antygen z Plasmodium, Falciparum, Mycobacterium, wirusa Herpes, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby, lub wirusów niedoboru odporności u człowieka.
- 60. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że determinantą antygenową lub antygenem jest HIV nef lub ludzka tyrozynaza.
- 61. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, że modyfikowany wirus MVAjest wirusem MVA zawierającym gen HIV nef albo wirusem MVA zawierającym gen ludzkiej tyrozynazy, korzystnie jest iMVA-LAInef albo MVA-hTVR.
- 62. Szczepionka dwuskładnikowa, znamienna tym, że zawiera jako pierwszy składnik modyfikowanego wirusa MVA, który zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, a jako drugi składnik sekwencję DNA, przenoszącą determinantę antygenową pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, przy czym obydwa składniki występują razem lub osobno.
- 63. Szczepionka według zastrz. 62, znamienna tym, że modyfikowany wirus MVAjest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 poi.
- 64. Zastosowanie modyfikowanego wirusa MVA, który zawiera gen heterologiczny i jest zdolny do jego ekspresji, natomiast gen heterologiczny wprowadzony jest w miejsce znanej naturalnie występującej delecji w genomie MVA, zwłaszcza w miejsce delecji II w genomie MVA, do produkowania szczepionki zawierającej jako pierwszy składnik modyfikowanego wirusa MVA w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, a jako drugi składnik sekwencję DNA, przenoszącą determinantę antygenową, pod transkrypcyjną kontrolą promotora polimerazy RNA T7, w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, przy czym obydwa składniki występują razem lub osobno.
- 65. Zastosowanie według zastrz. 64, znamienne tym, że modyfikowany wirus MVAjest wirusem MVA zawierającym gen polimerazy RNA bakteriofaga T7, korzystnie wirusem MVA-T7 pol.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK78295 | 1995-07-04 | ||
| PCT/EP1996/002926 WO1997002355A1 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant mva virus, and the use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL324347A1 PL324347A1 (en) | 1998-05-25 |
| PL186857B1 true PL186857B1 (pl) | 2004-03-31 |
Family
ID=8097499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96324347A PL186857B1 (pl) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Modyfikowany wirus MVA, zainfekowana nim komórka eukariotyczna, ich zastosowania oraz zawierające go szczepionki |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6440422B1 (pl) |
| EP (3) | EP1312678B1 (pl) |
| JP (3) | JP4312260B2 (pl) |
| KR (1) | KR19990028617A (pl) |
| CN (3) | CN1554764B (pl) |
| AT (3) | ATE304057T1 (pl) |
| AU (1) | AU721735B2 (pl) |
| BR (1) | BR9609303B8 (pl) |
| CA (3) | CA2225278C (pl) |
| CZ (1) | CZ292460B6 (pl) |
| DE (3) | DE69635173T2 (pl) |
| DK (3) | DK1312679T3 (pl) |
| EE (3) | EE04199B1 (pl) |
| ES (3) | ES2249647T3 (pl) |
| HK (2) | HK1009830A1 (pl) |
| HU (2) | HU229261B1 (pl) |
| IL (5) | IL122120A (pl) |
| MX (1) | MX9800025A (pl) |
| NO (1) | NO322476B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ313597A (pl) |
| PL (1) | PL186857B1 (pl) |
| PT (1) | PT836648E (pl) |
| RU (1) | RU2198217C2 (pl) |
| SI (3) | SI1312678T1 (pl) |
| TW (2) | TW575664B (pl) |
| UA (3) | UA68327C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997002355A1 (pl) |
Families Citing this family (120)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| US7118754B1 (en) * | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
| EP0951555A2 (en) * | 1996-09-24 | 1999-10-27 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| MY119381A (en) * | 1996-12-24 | 2005-05-31 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Recombinant mva virus, and the use thereof |
| US6969609B1 (en) * | 1998-12-09 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces | Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| FR2784997A1 (fr) * | 1998-10-22 | 2000-04-28 | Transgene Sa | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| US6682742B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-01-27 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh | Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes |
| US20150231227A1 (en) * | 2000-03-02 | 2015-08-20 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
| SI1263936T1 (sl) | 2000-03-14 | 2006-06-30 | Bavarian Nordic As | Spremenjen sev modificiranega virusa vakcinacije Ankara (MVA) |
| DE10042598A1 (de) * | 2000-08-30 | 2002-03-28 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS |
| WO2002031168A2 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-18 | Genstar Therapeutics | Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| CN101676389A (zh) | 2000-11-23 | 2010-03-24 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改良安卡拉痘苗病毒变体 |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| DE10143490C2 (de) * | 2001-09-05 | 2003-12-11 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen |
| DE10144664B4 (de) * | 2001-09-11 | 2005-06-09 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon |
| EP2345665A3 (en) | 2001-12-04 | 2012-02-15 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus NS1 subunit vaccine |
| CN1289663C (zh) * | 2001-12-20 | 2006-12-13 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 从感染细胞中回收和纯化痘病毒的方法 |
| DE60314823T3 (de) | 2002-04-19 | 2017-11-16 | Bavarian Nordic A/S | Modifizierte variante des vaccinia ankara virus als impfstoff für neugeborene |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| AU2003236646B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-01-15 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome |
| PL372091A1 (pl) * | 2002-05-16 | 2005-07-11 | Bavarian Nordic A/S | Ekspresja genów w zmodyfikowanym wirusie krowianki Ankara uzyskana w wyniku zastosowania promotora ATI wirusa ospy krów |
| DK1434858T4 (en) | 2002-09-05 | 2019-04-01 | Bavarian Nordic As | PROCEDURE FOR AMPLIFICATION OF A POXVIRUS UNDER SERUM-FREE CONDITIONS |
| DE10249390A1 (de) * | 2002-10-23 | 2004-05-13 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria |
| CN1717488A (zh) | 2002-11-25 | 2006-01-04 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 包含至少两个牛痘ati启动子的重组痘病毒 |
| DK1594970T3 (da) * | 2003-02-18 | 2008-11-17 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Fremgangsmåde til generering af rekombinant MVA |
| US7638134B2 (en) * | 2003-02-20 | 2009-12-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Insertion sites in fowlpox vectors |
| ES2319424T3 (es) | 2003-03-27 | 2009-05-07 | Ottawa Health Research Institute | Virus mutantes de la estomatitis vesivular y sus usos. |
| US7731974B2 (en) * | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
| WO2004093905A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | City Of Hope | Human cytomegalovirus antigens expressed in mva and methods of use |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| AU2004263274B2 (en) | 2003-07-21 | 2009-11-05 | Transgene S.A. | Novel multifunctional cytokines |
| US20100189747A1 (en) * | 2003-07-31 | 2010-07-29 | Raymond Weinstein | Compositions and methods for treating or preventing hiv infection |
| EP1518932A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-30 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof |
| DE602004027767D1 (de) | 2003-11-24 | 2010-07-29 | Bavarian Nordic As | Promotoren zur Expression in modifiziertem Vaccinia Virus Ankara |
| US7638132B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-12-29 | National University Corporation Hokkaido University | Highly safe smallpox vaccine virus and vaccinia virus vector |
| EP1683870A1 (en) * | 2005-01-24 | 2006-07-26 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vaccines based on the use of MVA |
| US20090269365A1 (en) * | 2005-04-20 | 2009-10-29 | University Of Washington | Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same |
| US20090060947A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-03-05 | Sanofi Pasteur, Inc. | Immunological compositions |
| RU2489486C2 (ru) * | 2006-06-20 | 2013-08-10 | Трансжене С.А. | Процесс получения поксвирусов и композиции поксвирусов |
| US7972605B2 (en) * | 2006-09-08 | 2011-07-05 | Duke University | Modified vaccinia ankara virus vaccine |
| JP5606067B2 (ja) | 2006-09-15 | 2014-10-15 | オタワ ホスピタル リサーチ インスティテュート | 腫瘍崩壊性ラブドウイルス |
| EP2073837B1 (en) | 2006-10-06 | 2014-06-25 | Bavarian Nordic Inc. | Recombinant modified vaccinia ankara virus encoding a her-2 antigen in combination with a taxane for use in treating cancer |
| US20080241139A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-10-02 | Regents Of The University Of Colorado | Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity |
| JP2010516772A (ja) * | 2007-01-26 | 2010-05-20 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド | 免疫機能を調節する方法 |
| EP2152736B1 (en) | 2007-05-03 | 2017-07-05 | Lysomab GmbH | Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs |
| JP2010526546A (ja) * | 2007-05-14 | 2010-08-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製 |
| US8003363B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| US8003364B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography |
| US20100285050A1 (en) * | 2007-10-05 | 2010-11-11 | Isis Innovation Limited | Compositions and Methods |
| BRPI0800485B8 (pt) * | 2008-01-17 | 2021-05-25 | Univ Minas Gerais | vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose |
| EP2240573A4 (en) | 2008-02-12 | 2011-08-31 | Sanofi Pasteur Ltd | METHOD USING ION EXCHANGE AND GELFILTRATION CHROMATOGRAPHY FOR POXVIRUS CLEANING |
| EP2303322A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-04-06 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| US8691502B2 (en) | 2008-10-31 | 2014-04-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| WO2010127115A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) | Modified immunization vectors |
| NZ598000A (en) | 2009-08-07 | 2013-10-25 | Transgene Sa | Composition for treating hbv infection |
| WO2011063359A1 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Inviragen, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs |
| US9005632B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-14 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains |
| WO2011119920A2 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| GB201006405D0 (en) * | 2010-04-16 | 2010-06-02 | Isis Innovation | Poxvirus expression system |
| US20110262965A1 (en) * | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture medium comprising small peptides |
| EP2668201A2 (en) | 2011-01-28 | 2013-12-04 | Sanofi Pasteur SA | Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives |
| WO2012151272A2 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| HUE037408T2 (hu) | 2011-06-10 | 2018-08-28 | Univ Oregon Health & Science | CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok |
| DK2739293T3 (da) * | 2011-08-05 | 2020-08-24 | Sillajen Biotherapeutics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til frembringelse af vaccinavirus |
| US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2761011B1 (en) * | 2011-09-26 | 2018-05-23 | Theravectys | Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| DK2788021T3 (en) | 2011-12-09 | 2017-04-10 | Bavarian Nordic As | POXVIRUS VECTOR FOR EXPRESSION OF BACTERIAL ANTIGENES CONNECTED TO TETANANOX INFRAGMENT C |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| SG11201500171YA (en) | 2012-07-10 | 2015-02-27 | Transgene Sa | Mycobacterial antigen vaccine |
| WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| WO2014066443A1 (en) | 2012-10-23 | 2014-05-01 | Emory University | Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
| US20140286981A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| CA2936131A1 (en) | 2014-01-09 | 2015-07-16 | Transgene Sa | Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens |
| GB201412494D0 (en) | 2014-07-14 | 2014-08-27 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | Vector production |
| KR102159626B1 (ko) | 2014-09-26 | 2020-09-25 | 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 | 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물 |
| WO2016115116A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus |
| WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| DK3390430T3 (da) | 2015-12-15 | 2019-11-18 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Human immundefektvirus-antigener, vektorer, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US11278607B2 (en) | 2016-01-08 | 2022-03-22 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| WO2017136419A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus |
| JP7034080B2 (ja) * | 2016-02-25 | 2022-03-11 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | ヒトｆｌｔ３ｌを発現する組換えｍｖａまたはｍｖａδｅ３ｌおよび固形腫瘍に対する免疫療法薬としてのそれらの使用 |
| CA3023022A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| AU2017286375B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine formulation |
| AU2017318689A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-04-11 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| IL265186B (en) | 2016-09-15 | 2022-09-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | HIV envelope proteins with trimer-stabilizing mutations |
| WO2018069316A2 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| CN110958887B (zh) | 2017-06-15 | 2023-10-31 | 扬森疫苗与预防公司 | 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法 |
| SG11201912429RA (en) | 2017-06-21 | 2020-01-30 | Transgene Sa | Personalized vaccine |
| CN110891601A (zh) | 2017-07-19 | 2020-03-17 | 扬森疫苗与预防公司 | 三聚体稳定性hiv包膜蛋白突变 |
| US20190022212A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human |
| US20190083620A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| CA3081436A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Western Oncolytics Ltd. | Platform oncolytic vector for systemic delivery |
| JP7320601B2 (ja) | 2018-09-11 | 2023-08-03 | 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 | 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用 |
| WO2020237052A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| AU2020366460A1 (en) * | 2019-10-16 | 2022-03-24 | Kalivir Immunotherapeutics, Inc. | Producer viruses for generation of retroviruses in SITU |
| EP4058058A1 (en) | 2019-11-14 | 2022-09-21 | Aelix Therapeutics S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| EP3928789A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| WO2021260065A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| JP2024516400A (ja) | 2021-04-30 | 2024-04-15 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | 修飾されたｍｈｃ発現のための腫瘍溶解性ウイルス |
| WO2022269003A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN |
| EP4108257A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| WO2023077147A2 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Pellis Therapeutics, Inc. | T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| US20230364227A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Pellis Therapeutics, Inc. | Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination |
| EP4316514A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-07 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2 |
| WO2024193905A1 (en) | 2023-03-17 | 2024-09-26 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Hbv antigen formulation for treating hepatitis b |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE787901A (fr) | 1971-09-11 | 1972-12-18 | Freistaat Bayern Represente Pa | Vaccin antivariolique |
| AU570940B2 (en) | 1982-11-30 | 1988-03-31 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Process for producing poxvirus recombinants for expression offoreign genes |
| US5679511A (en) * | 1986-10-06 | 1997-10-21 | Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. | CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway |
| CA1341245C (en) | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US5221610A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-22 | Institut Pasteur | Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection |
| CN1042564A (zh) * | 1988-11-11 | 1990-05-30 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 乙肝疫苗的制备方法及其制品 |
| JPH03271233A (ja) * | 1990-03-19 | 1991-12-03 | Inst Pasteur | ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発 |
| AU2800392A (en) * | 1991-10-28 | 1993-06-07 | Institut Pasteur | Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides |
| PT1025849E (pt) * | 1992-12-22 | 2002-09-30 | Ludwig Inst Cancer Res | Metodos para deteccao e tratamento de individuos tendo celulas anormais que expressam antigenios do peptideo hla-a2/tirosinase |
| US5620886A (en) * | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| WO1995011255A1 (fr) * | 1993-10-19 | 1995-04-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide pouvant induire une reponse immune contre vih et agent contenant ce peptide pour la prevention ou le traitement du sida |
| US5676950A (en) * | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
-
1996
- 1996-03-07 UA UA97126424A patent/UA68327C2/uk unknown
- 1996-07-03 IL IL12212096A patent/IL122120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 DK DK03001379T patent/DK1312679T3/da active
- 1996-07-03 EE EE9700344A patent/EE04199B1/xx unknown
- 1996-07-03 MX MX9800025A patent/MX9800025A/es unknown
- 1996-07-03 DE DE69635173T patent/DE69635173T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 RU RU98101904/13A patent/RU2198217C2/ru active
- 1996-07-03 PL PL96324347A patent/PL186857B1/pl unknown
- 1996-07-03 NZ NZ313597A patent/NZ313597A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 EP EP03001378A patent/EP1312678B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AU AU66110/96A patent/AU721735B2/en not_active Expired
- 1996-07-03 JP JP50482497A patent/JP4312260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 WO PCT/EP1996/002926 patent/WO1997002355A1/en active Application Filing
- 1996-07-03 ES ES03001378T patent/ES2249647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EE EEP200300331A patent/EE05138B1/xx unknown
- 1996-07-03 AT AT03001378T patent/ATE304057T1/de active
- 1996-07-03 CA CA002225278A patent/CA2225278C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT03001379T patent/ATE304058T1/de active
- 1996-07-03 DE DE69628011T patent/DE69628011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630718T patent/SI1312678T1/sl unknown
- 1996-07-03 EP EP03001379A patent/EP1312679B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT96925654T patent/ATE239796T1/de active
- 1996-07-03 CN CN2004100367144A patent/CN1554764B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630719T patent/SI1312679T1/sl unknown
- 1996-07-03 HU HU0402350A patent/HU229261B1/hu unknown
- 1996-07-03 ES ES03001379T patent/ES2249648T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630623T patent/SI0836648T1/xx unknown
- 1996-07-03 ES ES96925654T patent/ES2199294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EP EP96925654A patent/EP0836648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CA CA2608864A patent/CA2608864C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 BR BRPI9609303-0B8A patent/BR9609303B8/pt active IP Right Grant
- 1996-07-03 HU HU9802217A patent/HU224061B1/hu active IP Right Grant
- 1996-07-03 EE EEP200300332A patent/EE04753B1/xx unknown
- 1996-07-03 KR KR1019970709939A patent/KR19990028617A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-07-03 DE DE69635172T patent/DE69635172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CZ CZ19974241A patent/CZ292460B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 CA CA2596274A patent/CA2596274C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CN CNA2005101248556A patent/CN1782071A/zh active Pending
- 1996-07-03 UA UA20031212890A patent/UA75410C2/uk unknown
- 1996-07-03 PT PT96925654T patent/PT836648E/pt unknown
- 1996-07-03 DK DK96925654T patent/DK0836648T3/da active
- 1996-07-03 CN CNB961952547A patent/CN1154742C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 UA UA20031212892A patent/UA75411C2/uk unknown
- 1996-07-03 DK DK03001378T patent/DK1312678T3/da active
- 1996-12-31 TW TW085116379A patent/TW575664B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 TW TW092116681A patent/TWI245075B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980026A patent/NO322476B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-02 US US09/002,443 patent/US6440422B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-15 HK HK98110632A patent/HK1009830A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-15 US US10/147,284 patent/US7198934B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-28 IL IL164318A patent/IL164318A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-11 HK HK05100216.3A patent/HK1068015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-19 US US11/522,889 patent/US8153138B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-19 US US11/523,004 patent/US20070071769A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-19 US US11/523,030 patent/US20070071770A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 JP JP2007062630A patent/JP4764366B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-12 JP JP2007062631A patent/JP4764367B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-12-01 IL IL202448A patent/IL202448A0/en unknown
-
2010
- 2010-06-14 US US12/814,602 patent/US8197825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-05-17 IL IL212933A patent/IL212933A0/en unknown
-
2012
- 2012-05-02 IL IL219528A patent/IL219528A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL186857B1 (pl) | Modyfikowany wirus MVA, zainfekowana nim komórka eukariotyczna, ich zastosowania oraz zawierające go szczepionki | |
| US6869793B2 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines | |
| US20060002896A1 (en) | Method of generating recombinant MVA | |
| US20040265324A1 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |