BR9609303B1 - Vírus de vaccinia ankara modificado (mva), recombinante, bem como vacina contendo o mesmo. - Google Patents
Vírus de vaccinia ankara modificado (mva), recombinante, bem como vacina contendo o mesmo. Download PDFInfo
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VÍRUS DE
VACCINIA ANKARA MODIFICADO (MVA), RECOMBINANTE, BEM COMO VACINA CONTENDO O MESMO". A presente invenção refere-se aos vírus da varíola bovina recombi- nantes, derivados do vírus da varíola bovina modificado Ankara (MVA), e con- tendo e capazes de expressar genes estranhos que são inseridos no sítio de uma deleção de ocorrência natural no genoma do MVA, e ao uso desses vírus MVA recombinantes para a produção de polipeptídios, por exemplo, antígenos ou agentes terapêuticos, ou vetores virais para terapia genética e ao uso des- ses vírus MVA recombinantes que codificam antígenos como vacinas.
Objetivos da Invenção É um objetivo da presente invenção apresentar um vírus MVA recombinante que possa servir como um vetor de expressão eficiente e ex- cepcionalmente seguro.
Outro objetivo da presente invenção é apresentar um método simples, eficiente e seguro para a produção de polipeptídios, por exemplo, antígenos ou agentes terapêuticos, de vírus recombinantes para vacinas e de vetores virais para terapia genética.
Ainda outro objetivo da presente invenção é apresentar um sis- tema de expressão baseado em um vírus MVA recombiante, que expressa T7 RNA polimerase e métodos para a produção de polipeptídios, por exem- plo, antígenos ou agentes terapêuticos, ou para a geração de vetores virais para terapia genética ou vacinas, baseados nesse sistema de expressão.
Histórico da Invenção O vírus da varíola bovina, um membro do gênero Orthopoxvirus na família Poxviridae. foi usado como vacina viva para imunizar contra a varíola humana. A vacinação mundial bem sucedida com o vírus da varíola bovina culminou na erradicação do vírus da varíola, o agente causador da varíola (The global eradication of smallpox. Final report of the global com- mission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, N° 4, Genebra: Organização Mundial de Saúde, 1980). Desde essa declara- ção da OMS, a vacinação foi universalmente descontinuada, exceto para pessoas com alto risco de infecções por poxvírus (por exemplo, funcionários de laboratórios).
Mais recentemente, os vírus da varíola bovina também foram usados para criar vetores virais para a expressão de genes recombinantes e para o uso potencial como vacinas vivas recombinantes (Mackett. M.. Smith, G.L. e Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79. 7415 - 7419: Smith. G.L., Mackett, M. e Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383 - 401). Isso acarreta a introdução de seqüências de DNA (genes) que codifi- cam antígenos estranhos com o auxílio de técnicas de recombinação de DNA no genoma do vírus da varíola bovina. Se o gene for integrado no sítio do DNA viral que é não-essencial para o ciclo de vida do vírus, é possível que o vírus da varíola bovina recombinante recém produzido seja infeccioso, isto é, capaz de infectar células estranhas e, portanto, expressar a sequên- cia de DNA integrada (Pedidos de Patente EP n° 83.286 e n° 110.385). Os vírus da varíola bovina recombinantes, preparados dessa maneira podem ser usados, por um lado, como vacinas vivas para a profilaxia de doenças infecciosas e, por outro lado, para a preparação de proteínas heterólogas em células eucarióticas. Vírus da varíola bovina recombinantes, que expressam o gene da RNA polimerase do bacteriófago T7, permitiram o estabelecimento de sistemas de expressão, amplamente aplicáveis, para a sítnese de proteínas recombinantes em células de mamíferos (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mi- zukami, T., Alexander, W.A., e Fuerst T.R. [1990] Nature 348, 91 - 92). Em todos os protocoios, a expressão de genes recombinantes se baseia na síntese da T7 RNA polimerase no citoplasma de células eucarióticas. O mais popular é um protocolo para a expressão transitória (Fuerst, T.R., Ni- les, E.G., Studier, F.W. e Moss, B. [1986] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 8122 - 8126 e pedido de patente US 7.648.971). Em primeiro lugar, um gene estranho de interesse é inserido em um plasmídeo sob o controle do promo- tor da T7 RNA polimerase. A seguir, esse plasmídeo é introduzido no cito- plasma de células infectadas com um vírus da varíola bovina recombinante, que produz T7 RNA polimerase, usando procedimentos de transfecção pa- dronizados.
Esse protocolo de transfecção é simples, porque nenhum vírus recombinante novo precisa ser preparado, e muito eficiente, com mais de 80% das células expressando o gene de interesse (Elroy-Stein, O. e Moss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 6743 - 6747). A vantagem do sis- tema híbrido vírus da varíola bovina/T7 RNA polimerase com relação a ou- tros sistemas de expressão transitória é, muito provavelmente, sua indepen- dência do transporte de plasmídeos para o núcleo celular. No passado, o sistema foi extremamente útil para fins analíticos em virologia e biologia ce- lular (Buonocore, L, e Rose, J.K. [1990] Nature 345, 625 - 628, Pattnaik, A.K. eWertz, G.W. [1991] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 1379 - 1383, Kars- chin, A., Aiyar, J. Gouin, A., Davidson, N. e Lester, H.A. [1991] FEBS Lett. 278, 229 - 233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H.A. e Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303 - 306, Buchholz, C.J., Retzler, C„ Homann, H.E. e Neubert, W.J. [1994] Virology 204, 770 - 776).
Entretanto, importantes aplicações futuras do sistema híbrido vírus da varío- la bovina/T7 RNA polimerase, por exemplo, gerar proteínas recombinantes ou partículas virais recombinantes para novas abordagens terapêuticas e profiláticas em seres humanos, poderíam ser prejudicadas pela replicação produtiva do vetor do vírus da varíola recombinante. O vírus da varíola bovina é infeccioso para seres humanos e, durante a campanha de erradicação da varíola, foram observadas complica- ções sérias ocasionais. A melhor revisão acerca da incidência de complica- ções é dada por um levantamento nacional nos Estados Unidos monitori- zando a vacinação de cerca de 12 milhões de pessoas com uma vacina à base da cepa New York City Board of Health do vírus da varíola bovina (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. e Millar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201 - 1208). Conseqüentemente, a possibilidade mais excitante de usar o vírus da varíola bovina como um vetor para o desenvolvimento de vacinas vivas recombinantes foi afetada por preocupações quanto à segurança e regula- mentos. Além disso, a maioria dos vírus da varíola bovina recombinantes, descritos na literatura, se baseiam na cepa Western Reserve do vírus da varíola bovina. Por outro lado, sabe-se que essa cepa tem uma elevada neurovirulência e, portanto, é muito pouco adequada para uso em seres humanos e animais (Morita e outros., Vaccine 5, 65 - 70 [1987]) Para aplicações de vetores, os riscos para a saúde seriam dimi- nuídos com o uso de uma cepa de vírus da varíola bovina altamente atenu- ado. Várias dessas cepas de vírus da varíola bovina foram especialmente desenvolvidas para evitar os efeitos colaterais indesejáveis da vacina contra varíola. Assim, o vírus da varíola bovina modificado Ankara (MVA) foi gerado por passagens seriadas, a longo prazo, da cepa Ankara do vírus da varíola bovina (CVA) em fibroblastos de embriões de galinha (para uma revisão, veja Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. e Sticl, H. [1975] Infection 3,6-14; paten- te suíça n° 568.392). Os vírus MVA foi depositado de acordo com as exi- gências do Tratado de Budapeste na CNCM (Instituto Pasteur, Collection Nationale de Culture de Microorganisms, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15), em 15 de dezembro de 1987, sob o N° de Depósito 1-721. O MVA se distingue por sua grande atenuação, isto é, pela virulência ou in- fecciosidade diminuídas, mantendo, ao mesmo tempo, uma boa imunogeni- cidade. O vírus MVA foi analisado para determinar alterações no genoma com relação à cepa de CVA do tipo selvagem. Seis grandes deleções do DNA gènômico (deleção I, II, III, IV, V e VI), totalizando 31.000 pares de ba- ses, foram identificadas (Meyer, H., Sutter, G. e Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031 - 1038). O vírus MVA resultante se tornou a célula hospedeira se- veramente restrita a células de aves.
Além disso, o MVA se caracteriza por sua extrema atenuação.
Quando testado em vários modelos animais, o MVA se mostrou avirulento, mesmo em animais imunossuprimidos. De maneira mais importante, as ex- celentes propriedades da cepa MVA foram demonstradas foram demonstra- das em amplos ensaios clínicos (Mayre outros., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375 - 390 [1987], Stickl e outros., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386 - 2392 [1974]). Durante esses estudos, em mais de 120.000 seres humanos, incluindo pacientes de alto risco, nenhum efeito colateral foi associado ao uso da vacina MVA.
Descobriu-se que a replicação do MVA em células humanas é bloqueada tardiamente na infecção, impedindo a montagem de virions in- fecciosos maduros. Todavia, o MVA foi capaz de expressar genes virais e recombinantes a altos níveis, mesmo em células não-permissivas e foi pro- posto para servir como um vetor de expressão de genes eficiente e excepci- onalmente seguro (Sutter, G. e Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10847 - 10851). Recentemente, novos sistemas de vetores de varíola bovina foram estabelecidos com base no MVA, com seqüências de DNA estranho inseridas no sítio de deleção III dentro do genoma do MVA ou dentro do gene TK (Sutter, G. e Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195 - 200 e patente US 5.185.146).
Para explorar ainda mais o uso do MVA, buscou-se uma nova possível maneira de introduzir genes por recombínação de DNA na cepa MVA do vírus da varíola bovina. Como a intenção não era alterar o genoma do vírus MVA, foi necessário usar um método que atendesse a essa exi- gência. De acordo com a presente invenção, uma seqüência de DNA estra- nho foi recombinada no DNA viral precisamente no sítio de uma deleção de ocorrência natural no genoma do MVA.
Sumário da Invenção A presente invenção, portanto, entre outras coisas, compreende o seguinte, isoladamente ou em combinação: Um vírus MVA recombinante, contendo e capaz de expressar, pelo menos, um gene estranho inserido no sítio de uma deleção de ocor- rência natural no genoma do MVA; um vírus MVA, como acima, contendo e capaz de expressar, pelo menos, um gene estranho inserido no sítio da deleção II no genoma do MVA; um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene es- tranho codifica um marcador, um gene terapêutico ou um determinante anti- gênico; um virus MVA recombinante, como acima, em qüe o gene es- tranho codifica um determinante antigênico de um virus patogênico, de uma bactéria ou de outro microorganismo, ou de um parasita ou célula tumoral; um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene es- tranho codifica um determinante antigênico do Plasmodium Falciparum, Mycobacteria, vírus da herpes, vírus da gripe, hepatite ou vírus da imunode- ficiência humana; um vírus MVA recombinante, como acima, em que o determi- nante antigênico é HIV nef ou tirosinase humana; um vírus MVA recombinante, como acima, que é MVA-LAInef ou MVA-hTYR; um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene es- tranho codifica T7 RNA polimerase; um vírus MVA recombinante, como acima, que é MVA-T7 pol; um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene es- tranho está sob o controle de transcrição do promotor precoce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina; um vírus MVA recombinante, como acima, essencialmente livre de vírus capazes de replicar em células humanas; uso de um vírus MVA recombinante, como acima, para a trans- crição de seqüências de DNA sob o controle de transcrição de um promotor da T7 RNA polimerase; célula eucariótica infectada por um vírus MVA recombiante, como acima; célula infectada por um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica T7 RNA polimerase; célula infectada por um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica T7 RNA polimerase, contendo, além disso, um ou mais vetores de expressão portadores de um ou mais genes estra- nhos, sob o controle de transcrição de um promotor da T7 RNA polimerase; uso de células, como acima, para a produção dos polipeptídios codificados pelos ditos genes estranhos, compreendendo: a) o cultivo das ditas células sob condições adequadas, e b) o isolamento dos polipeptidios codificados pelos ditos ge- nes estranhos; célula infectada por um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica T7 RNA polimerase. contendo, além disso vetores de expressão portadores de genes virais, e/ou um construto de vetor virai que codifica o genoma de um vetor viral sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA polimerase; uso de células como acima para a produção de partículas virais, compreendendo: a) o cultivo das ditas células sob condições adequadas, e b) o isolamento das partículas virais; célula infectada por um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica T7 RNA polimerase, contendo, além disso: a) um vetor de expressão portador de um construto de vetor retroviral, capaz de infectar e dirigir a expressão em célu- las-alvo de um ou mais genes estranhos portados pelo dito construto de vetor viral, e b) um ou mais vetores de expressão portadores dos genes que codificam os polipeptídios requeridos para que o ge- noma do dito construto de vetor retroviral seja empacotado sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA polimerase; uso de células, como acima, para a produção de partículas re- trovirais, compreendendo: a) o cultivo das ditas células sob condições adequadas, e b) o isolamento das partículas retrovirais; vacina contendo um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica um determinante antigênico em um veículo fisiologicamente aceitável; uso de um vírus MVA recombinante. como acima, em que o ge- ne estranho codifica a preparação de um determinante antigênico de uma vacina; uso de uma vacina, como acima, para a imunização de um or- ganismo animal vivo, incluindo seres humanos; uso de uma vacina, como acima, contendo MVA-LAInef, para a prevenção ou tratamento de infecção por HIV ou AIDS; uso de uma vacina, como acima, contendo MVA-hTYR, para a prevenção ou tratamento de melanomas; vacina compreendendo, como primeiro componente, um vírus MVA recombinante, como acima, em que o gene estranho codifica T7 RNA polimerase em um veículo fisiologicamente aceitável e, como segundo com- ponente, uma seqüência de DNA portadora de um determinante antigênico sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA polimerase, em um veículo fisiologicamente aceitável, os dois componentes estando conti- dos juntos ou separados; uso de uma vacina, como acima, para a imunização de um or- ganismo animal vivo, incluindo seres humanos, compreendendo a inocula- ção do dito organismo animal vivo, incluindo seres humanos, com o primeiro e o segundo componentes da vacina, simultaneamente ou separados no tempo, usando o mesmo sítio de inoculação; e O termo "gene" significa qualquer seqüência de DNA que codifi- que uma proteína ou um peptídio. O termo "gene estranho" significa um gene inserido em uma se- qüência de DNA em que não é normalmente encontrado. O gene estranho pode ser um gene marcador, um gene tera- pêutico, um gene que codifica um determinante antigênico ou um gene viral, por exemplo. Esses genes são bem conhecidos na técnica. A Presente Invenção O vírus da varíola bovina modificado Ankara (MVA), uma cepa de vírus da varíola bovina de gama de hospedeiros restrita e altamente ate- nuado, é incapaz de se multiplicar em um ser humano e na maioria das ou- tras linhagens celulares de mamíferos testadas. Porém, como a expressão do gene viral não é prejudicada em células não-permissivas. os vírus MVA recombinantes, de acordo com a invenção, podem ser usados como vetores de expressão excepcionalmente seguros e eficientes. Vírus MVA recombinantes que codificam um determinante anti- gênico Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a vírus de varíola bovina MVA recombinantes, que contêm um gene que codifica um antígeno estranho, de preferência de um agente patogênico, e a vacinas contendo esse vírus em uma forma fisiologicamente aceitável. A invenção também refere-se a métodos para a preparação desses vírus de varíola bo- vina MVA recombinantes ou vacinas, e ao uso dessas vacinas para a profi- laxia de infecções causadas por esses agentes patogênicos.
Em uma modalidade preferida da invenção, o gene estranho inserido no vírus MVA é um gene que codifica HIV nef.
Foram construídos vírus MVA recombinantes que permitem a expressão do gene HIV-1 nef, sob o controle do promotor precoce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. A proteína reguladora Nef de lentivírus de primatas é sintetizada precocemente no ciclo de replicação viral e demons- trou-se que é essencial para a replicação do vírus a alta titulação e para a indução da doença in vivo. Isso sugere que a HIV nef poderia desempenhar um papel crucial na patogênese da AIDS. O(s) mecanismo(s) molecuiar(es) pelo(s) qual(ais) a Nef contribui para a maior infectividade viral e para a pa- togenicidade do HIV precisa(m) ser melhor elucidado(s). Entretanto, a Nef é imunogênica e um antígeno específico para Nef pode ser usado como uma vacina contra a infecção por HIV e AIDS.
Neste contexto, o vírus MVA recombinante que expressa o gene HIV nef pode ser usado para a imunização de seres humanos, por um lado, como vacina profilática contra o HIV humano e, por outro lado, para a imunoterapia de pacientes infectados por HIV ou com AIDS. Além disso, o vírus MVA recombinante que expressão o gene HIV nef pode ser usado para a produção de proteían HIV nef recombinante.
Em outra modalidade preferida da invenção, o gene estranno inserido no vírus MVA é um gene que codifica a tirosinase humana Foram construídos vírus MVA recombinantes que permitem a expressão do gene da tirosinase humana sob o controle do promotor preco- ce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. Recentemente, a tirosinase huma- na foi identificada como um antígeno tumoral específica para melanoma, que permite a geração de linfócitos T citolíticos antiturmorais (Brichard, V., e outros. [1993] J. Exp. Med. 178, 489 - 495). Como entre as células normais apenas os melanócitos parecem expressar o gene da tirosinase, a tirosinase é um antígeno alvo útil para a imunoterapia de melanomas. Consequente- mente, o vírus MVA recombinante que expressa o gene da tirosinase huma- na pode ser usado em pacientes com melanoma, para induzir respostas imunes que provoquem rejeição do tumor ou impessam metástases. O vírus MVA recombinante, que expressa o gene da tirosinase humana, pode ser usado diretamente como uma vacina antimelanoma, ou o vírus pode ser usado para preparar vacinas antimelanoma. Em um exemplo, o vírus MVA recombinante que expressa o gene da tirosinase humana, pode ser usado para a produção de proteína tirosinase recombinante que é usada como an- tígeno em preparações de vacina. Em outro exemplo, usando o vírus MVA recombinante, que expressa o gene da tirosinase humana, como vetor de expressão, células derivadas de um paciente com tumor podem ser modifi- cadas in vitro, para expressar tirosinase e, então, transferidas de volta para o paciente, para induzir respostas imunes antitumorais. Uma vacina prepa- rada com base na expressão por MVA recombinante do gene da tirosinase humana pode ser usada por via parenteral ou local no sítio do tumor, para prevenir metástases tumorais ou para alterar fenotipicamente o tumor, por exemplo, o tamanho, forma, consistência, vascularização ou outras caracte- rísticas. Uma vacina preparada com base no MVA recombinante que ex- pressa o gene da tirosinase humana pode ser usada antes, durante ou de- pois da extirpação cirúrgica do tumor.
Para a preparação de vacinas, os vírus da varíola bovina MVA, de acordo com a invenção, são convertidos em uma forma fisioiogicamente aceitável. Isso pode ser feito com base na experiência com a preparação de vacinas de MVA usadas para a vacinação contra varíola (conforme descrito por Stickl, H. e outros. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386 - 2392). Tipica- mente, cerca de 106 - 10e partículas do MVA recombinante são seca por congelamento em 100 ml de salina tamponada com fosfato (PBS), na pre- sença de peptona a 2% e de albumina humana a 1%. em uma ampola. de preferência uma ampola de vidro. O liofilizado pode conter expansores (como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinilpirroíidona) ou outros auxiliares (como antioxidantes, estabilizadores, e outros), adequados para administração parenteral. A ampola de vidro é, então, vedada e pode ser armazenada, de preferência a temperaturas abaixo de -20°C, durante vários meses.
Para a vacinação ou terapia, o liofilizado pode ser dissolvido em 0. 1 a 0,5 ml de uma solução aquosa, de preferência salina fisiológica, e administrada por via parenteral, por exemplo, por inoculação intramuscular, ou local, por exemplo, por inoculação no tumor ou no sítio de um tumor. Va- cinas ou agentes terapêuticos, de acordo com a invenção são, de preferên- cia, injetados por via intramuscular (Mayr, A. e outros. [1978] Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. B 167, 375 - 390). O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser otimizados por aqueles versados na técnica de maneira conhecida. É conveniente, quando apropriado, administrar a va- cina várias vezes durante um longo período, para obter respostas imunes apropriadas contra o antígeno estranho. O uso de vírus MVA recombinantes para a produção de poli- peptídios heterólogos Os vírus da varíola bovina MVA recombinantes, de acordo com a invenção, também podem ser usados para preparar polipeptídios heteró- logos em células eucarióticas. Isso acarreta a infecção das células com o vírus da varíola bovina recombinante. O gene que codifica o polipeptídio es- tranho é expressado nas células e o polipeptídio heterólogo expressado é isolado. Os métodos a serem usados para a produção desses polipeptídios heterólogos são genericamente conhecidos por aqueles versados na técnica (EP-A-206.920 e ΕΡ-Α-205.939). Os polipeptídios produzidos com o auxílio dos vírus MVA recombinantes são, em razão das propriedades especiais do vírus MVA, mais adequados para uso como medicamentos em seres huma- nos e animais. Vírus MVA recombinantes que codificam T7 RNA polimerase e seu uso para a expressão de seqüências de DNA sob o controle de transcri- ção de um promotor de T7 RNA polimerase Em uma modalidade adicional da presente invenção, foram construídos vírus MVA recombinantes que permitem a expressão do gene da RNA polimerase de bacteriófago T7, sob o controle do promotor preco- ce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. A utilidade dos vírus recombinan- tes MVA-T7pol como sistema de expressão foi testada em ensaios de transfecção transitória, para induzir a expressão de genes recombinantes sob o controle de um promotor da T7 RNA polimerase. Usando o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) de E. coli como gene reportador, des- cobrimos que o MVA-T7pol induzia a expressão do gene CAT tão eficaz- mente quanto um vírus recombinante varíola bovina/T7poi, derivado da cepa WR competente para replicação do vírus da varíola bovina. O sistema híbrido MVA/T7 polimerase de acordo com a inven- ção, pode, portanto, ser usado como um simples, eficiente e seguro sistema de expressão em mamíferos, para a produção de polipeptídios na ausência de replicação produtiva do vírus da varíola bovina.
Esse sistema de expressão também pode ser usado para a ge- ração de partículas virais recombinantes, para vacinação ou terapia genéti- ca, por transformação de linhagens celulares infectadas com o MVA que expressa a T7 RNA polimerase, com construtos de DNA contendo todos ou alguns dos genes, e o genoma ou genoma recombinante necessário para gerar partículas virais, por exemplo, partículas de MVA ou partículas retrovi- rais, sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA polimerase.
Sistemas de vetor retrovira! consistem em dois componentes: 1) o próprio vetor retroviral é um retrovírus modificado (vetor plasmídico), em que os genes que codificam as proteínas virais foram substituídos por genes terapêuticos e genes marcadores para serem trans- feridos à célula-aivo. Como a substituição dos genes que codificam as pro- teínas virais mutila eficazmente o vírus, ele tem de ser resgatado pelo se- gundo componente no sistema que fornece as proteínas virais faltantes ao retrovírus modificado. O segundo componente é: 2) uma linhagem celular que produz grandes quantidades de proteínas virais, mas que não possui a capacidade de produzir vírus compe- tentes para a repiicação. Essa linhagem celular é conhecida como a linha- gem celular de pacote e consiste em uma linhagem celular transfectada com um ou mais plasmídeos portadores dos genes (genes que codificam os poli- peptídios gag, pol e env) que permitem que o vetor retroviral modificado seja empacotado.
Para gerar o vetor empacotado, o vetor plasmídico é transfecta- do para a linhagem celular de pacote. Sob essas condições, o genoma re- troviral modificado, incluindo os genes terapêuticos e marcadores inseridos, é transcrito a partir do vetor plasmídico e empacotado nas partículas retrovi- rais modificadas (partículas virais recombinantes), Esse vírus recombinante é, então, usado para infectar células-alvo nas quais o genoma do vetor e qualquer gene marcador ou terapêutico portado tornam-se integrados no DNA da célula alvo. Uma célula infectada com essa partícula viral recombi- nante não pode produzir novos vírus vetores, pois nenhuma proteína viral está presente nessas células. Entretanto, o DNA do vetor portador dos ge- nes terapêuticos e marcadores está integrado no DNA da célula e pode ser agora expressado na célula infectada. O vírus MVA recombinante, de acordo com a invenção, que ex- pressa 11 RNA polimerase, pode ser usado para produzir as proteínas re- queridas para empacotar vetores retrovirais. Para isso, os genes gag, pol e env de um retrovírus (por exemplo, o Vírus da Leucemia Murina (MLV)) são colocados sob o controle de transcrição de um promotor 11 RNA polimerase em um ou mais vetores de expressão (por exemplo, plasmídeos). Os veto- res de expressão são, então, introduzidos em células infectadas com o vírus MVA recombinante que expressa a T7 RNA poíimerase, juntamente com um vetor de expressão portador de um construto de vetor retroviral, possivel- mente sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA poíimerase.
As WO 94/29437, WO 89/11539 e WO 96/07748 descrevem diferentes tipos de construtos de vetores retrovirais que podem ser empaco- tados usando o sistema de pacote acima descrito.
Um uso adicional para o vírus MVA recombinante que expressa T7 RNA poíimerase é a geração de proteínas recombinantes, partículas ví- rais não infecciosas ou partículas virais mutantes infecciosas, para a produ- ção de vacinas ou agentes terapêuticos (Buchholz e outros., Virology, 204, 770 - 776 (1994) e EP-B1-356695). Para isso, genes virais (por exemplo, os genes gag-pol e env de HIV-1) são colocados sob o controle de transcrição do promotor T7 em um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo ou ou- tro vírus MVA recombinante). Esse construto é, então, introduzido em célu- las infectadas com o vírus MVA recombinante que expressa T7 RNA polime- rase. Os genes virais recombinantes são transcritos com alta eficiência, proteínas recombinantes são preparadas em grandes quantidades e podem ser purificadas. Além disso, proteínas virais recombinantes expressadas (por exemplo, env, gag de HÍV-1) podem montar pseudopartículas virais que brotam das células e podem ser isoladas do meio de cultura de tecido. Em outra modalidade, proteínas virais (por exemplo, de vírus HIV, SIV, saram- po) expressadas pelo sistema MVA-T7 pol podem resgatar um vírus mutante adicionalmente introduzido (derivado, por exemplo, do vírus HIV, SIB, sa- rampo), superando um defeito na fixação e infecção, remoção da capa, re- plicação do ácido nucléico, expressão do gene viral, montagem, eclosão ou outra etapa na multiplicação viral, para permitir a produção e purificação dos vírus mutante mencionado. O MVA-T7pol também pode ser usado juntamente com se- qüências de DNA portadoras do gene de um antígeno de interesse (por exemplo, o gene de HIV, nef, tat, gag, pol ou env, ou outros) para imuniza- ção. Em primeiro lugar, uma seqüência codificadora de um dado antígeno (por exemplo, HIV, HCV, HPV, HSV, vírus do sarampo, vírus da gripe, ou outros) é clonada sob o controle de um promotor da T7 RNA polimerase, de preferência em um vetor plasmídico, e o construto de DNA resultante é amplificado e purificado usando-se procedimentos laboratoriais padroniza- dos. Em segundo lugar, o DNA do vetor é inoculado simultaneamente, ou com um intervalo de tempo apropriado, juntamente com MVA-T7 pol. No sítio da inoculação, o gene recombinante de interesse é expressado transi- toriamente em células contendo tanto o DNA do vetor, quanto o MVA-T7 pol e o antígeno correspondente é apresentado ao sistema imune do hospedei- ro, estimulando uma resposta imune específica para o antígeno. Esse proto- colo, que usa o vetor de varíola bovina não-repíicante MVA-T7 pol, represen- ta uma nova abordagem promissora à vacinação com ácidos nucléicos, permitindo uma expressão transitória eficiente de um dado antígeno, mas evitando o risco potencial de expressão do gene constitutivo.
Os vírus de varíola bovina MVA recombinantes podem ser pre- parados conforme apresentado a seguir.
Um construto de DNA que contém uma sequência de DNA que codifica um polipeptídio estranho flanqueado por seqüências de DNA de MVA adjacentes a uma deleção de ocorrência natural, por exemplo, a dele- ção II, dentro do genoma do MVA, é introduzido em células infectadas com MVA, para permitir a recombinação homóloga.
Uma vez que o construto de DNA tenha sido introduzido na célu- la eucariótica e o DNA estranho tenha recombinado com o DNA viral, é possível isolar o vírus da varíola bovina recombinante desejado, de maneira já conhecida, de preferência com o auxílio de um marcador (comparar com Nakano e outros,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1593-1596 [1982], Franke e outros., Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti e outros., Mol. Cell.
Biol. 3403-3409 [1985], Fathi e outros., Virology 97-105 [1986]). O construto de DNA a ser inserido pode ser linear ou circular.
Prefere-se DNA circular, particularmente um plasmídeo. O construto de DNA contém seqüências flanqueando os lados esquerdo e direito de uma deleção de ocorrência natural, por exemplo, a deleção II, dentro do genoma do MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. e Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15 - 27). A seqüência de DNA estranho é inserida entre as sequências que flan- queiam a deteção de ocorrência natural. A seqüência de DNA estranho pode ser um gene que codifica um polipeptídio terapêutico, por exemplo. t-PA ou interferon, ou um determinante antigênico de um agente patogênico. Agen- tes patogênicos podem ser vírus, bactérias e parasitas que podem causar doenças, assim como células tumorais que se multiplicam sem restrições em um organismo e, portanto, podem levar a crescimentos patológicos.
Exemplos desses agentes patogênicos são descritos em Davis, B.D. e ou- tros. (Microbiology, 3a Ed., Harper International Edition). Antígenos preferi- dos de agentes patogênicos são aqueles dos vírus da imunodeficiência hu- mana (por exemplo, HIV-1 e HIV-2), de micobactérias causadoras de tuber- culose, do parasita Plasmodium falciparum e de células de melanoma.
Para a expressão de uma seqüência de DNA ou gene, é neces- sário que seqüências reguladoras, que são requeridas para a transcrição do gene, estejam presentes no DNA. Essas seqüências reguladoras (chamadas de promotores) são conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, as do gene de 11 kDa da varíola bovina, conforme descrito na EP-A-198.328, e aquelas do gene de 7,5 kDa (EP-A-110.385). O construto de DNA pode ser introduzido em células infectadas com MVA por transfecção, por exemplo, por meio de precipitação com fosfa- to de cálcio (Graham e outros., Virol. 52, 456 - 467 [1973]; Wigler e outros., Cell 777 - 785 [1979]), por meio de eletroporação (Neumann e outros., EM- BO J. 1, 841 - 845 [1982]), por microinjeção (Graessmann e outros., Meth.
Enzymology 101,482 - 492 (1983)), por meio de lipossomos (Straubinger e outros., Methods in Enzymology 101, 512 - 527 (1983)), por meio de esfe- roplastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 2163 - 2167 (1980)), ou por outros métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Prefere-se a transfecção por meio da precipitação com fosfato de cálcio.
Os exemplos detalhados que seguem destinam-se a contribuir para um melhor entendimento da presente invenção. Entretanto, não se pretende que dêem a impressão que a invenção se limita ao assunto dos exemplos.
Desenhos Figura 1: mapa esquemático do genoma de MVA e plasmídeo para inserção de DNA estranho por recombinação homóloga, sítios de res- trição Hindlll dentro do genoma do MVA são indicados em cima. O fragmen- to Hindlll-Hindlll N de 900 pb que cobre a junção da deleção II dentro do genoma do MVA é mostrado. As seqüêndas de DNA do MVA adjacentes à deleção II (flanco 1 e flanco 2) foram amplificadas por PCR e usadas para a construção do plasmídeo de inserção pUC II LZ.
Figura 2: pUCII LZ P7.5: vetor plasmídico de MVA para inserção na deleção II, contendo o cassete de expressão P11-LacZ e o promotor pre- coce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina, para expressar genes de inte- resse que podem ser clonados no sítio Smal do plasmídeo.
Figura 3: pUCII LZdel P7.5: vetor plasmídico de MVA para inser- ção de genes estranhos no sítio de deleção II no genoma do MVA, contendo um cassete de expressão P11-LacZ auto-removível e o promotor preco- ce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina, para expressar genes de interesse que podem ser clonados no sítio de clonagem Sma1/Not1 do plasmídeo.
Figura 4: Construção do vírus recombinante MVA-T7pol: mapas esquemáticos do genoma do MVA (sítios de endonuclease de restrição Hindlll) e do vetor plasmídico pUC II LZ T7pol, que permite a inserção do gene da T7 RNA polimerase no sítio da deleção II dentro do fragmento Hindlll N do genoma do MVA.
Figura 5: Análise Southern blot do DNA viral de MVA-T7poi.
Figura 6: Marcação metabólica de proteínas com [35S]metionina.
Análise SDS PAGE. Pista 1: MVA T7pol, Pista 2: MVA, Pista 3: células CV-1.
Figura 7: Ensaio CAT: células CV-1 transfectadas com o plas- mídeo contendo o gene CAT sob o controle do promotor da T7 RNA polime- rase e infectadas com MVA-T/pol ou WR-T7pol. Os lisados foram testados quanto à atividade da CAT. C significa cloranfenicol, e 1-AcC e 3-AcC signi- ficam formas mono- e triacetiladas de cloranfenicol. A atividade da Cat é expressada como porcentagem de produto acetilado formado em 60 min.
Figura 8: Construção de MVA-LAInef: mapas esquemáticos do genoma de MVA (sítios de endonuclease de restrição Hindllt) e do vetor plasmídico pUC II LZdel P7.5-LAInef, que permite a inserção do gene nef de HIV-1 LAI no sitio da deleção li dentro do fragmento Hindlli N do genoma do MVA.
Figura 9: Construção de MVA-hTYR: mapas esquemáticos do genoma de MVA (sítios de endonuclease de restrição Hindlli) e do vetor plasmídico pUC II LZdel P7.5-TYR, que permite a inserção do gene da tiro- sinase humana no sítio de deleção II dentro do fragmento Hindlli N do ge- noma de MVA.
Exemplos 1. Crescimento e purificação dos vírus 1.1 Crescimento do vírus MVA O vírus MVA é um vírus da varíola bovina altamente atenuado, derivado da cepa Ankara do vírus da varíola bovina (CVA) por passagens seriadas a longo prazo em culturas de fibroblastos de embriões de galinha primários (CEF). Para uma revisão genérica da história da produção, pro- priedades e uso da cepa MVA, pode-se fazer referência ao resumo publica- do por Mayr e outros., in Infection 3, 6 - 14 [1975], Devido à atenuação em CEF, o vírus MVA se replica em altos títulos nessa célula hospedeira de ave. Em células de mamíferos, entretanto, o MVA tem seu crescimento se- veramente restrito e a formação de placas típicas pelo vírus não é detectá- vel. Conseqüentemente, o vírus MA foi cultivado em células CEF. Para pre- parar células CEF, embriões de 11 dias de idade foram isolados de ovos de galinha incubados, as extremidades foram removidas e os embriões foram picados e dissociados em uma solução composta por tripsina a 0,25% a 37°C durante 20 minutos, A suspensão de células resultante foi filtrada e as células foram sedimentadas por centrifugação a 2.000 rpm em uma centrí- fuga Sorvall RC-3B, à temperatura ambiente e durante 5 minutos, novamen- te postos em suspensão em 10 volumes de meio A (MEM Eagle, por exem- plo, obtido na Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemanha), e novamen- te sedimentados por centrifugação a 2.000 rpm em uma centrífuga Sorvall RC-3B, à temperatura ambiente e durante 5 minutos. A pellet de células foi reconstituída em meio A contendo soro de novilho fetal a 10% (FCS), penici- lina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) e glutamina a 2 mM, para se obter uma suspensão de células contendo 500.000 células/ml. Célu- las CEF obtidas dessa maneira foram espalhadas sobre placas de cultura de células. Foram deixadas crescer em meio A, em um incubador de C02 a 37°C, durante 1 - 2 dias, dependendo da densidade celular desejada, e fo- ram usadas para infecção diretamente ou após uma passagem de células adicional. Uma descrição detalhada da preparação de culturas primárias pode ser encontrada no livre de R.l. Freshney, "Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983], capítulo 11, página 99 e seg. Vírus MVA foram usados para infecção da seguinte maneira. As células CEF foram cultivadas em garrafas de cultura celular de 175 cm2. A uma confluência de 90 - 100%, o meio foi removido e as células foram incu- badas durante uma hora com uma suspensão de vírus MVA (0,01 unidades infecciosas (IU) por célula, 0,02 ml/cm2) em meio A. Então, adicionou-se mais meio A (0,2 ml/cm2) e as garrafas foram incubadas a 37°C durante 2 - 3 dias (até que cerca de 90% das células mostrassem efeito citopatogênico).
Estoques de vírus bruto foram preparados raspando-se monocamadas de células no meio e formando-se pellets do material celular por centrifugação a 3.000 rpm, em uma centrífuga Sorvall RC-3B, a 4°C e durante 5 minutos. A preparação de vírus bruto foi armazenada a -20 °C antes de processa- mento adicional (por exemplo, purificação do vírus). 1.2 Purificação dos vírus A etapas de purificação efetuadas para se obter uma prepara- ção de vírus que fosse tão pura quanto possível e livre de componentes es- pecíficos da célula hospedeira foram similares às descritas por Joklik (Virology 18, 9 - 18 [1962]). Estoques de vírus bruto que haviam sido arma- zenados a -20 °C foram descongelados e postos em suspensão uma vez em PBS (10-20 vezes o volume do sedimento) e a suspensão foi centrifugada como acima. O novo sedimento foi posto em suspensão em 10 vezes o vo- lume do tampão Tris 1 (Tris-HCI a 10 mM, pH 9,0), e a suspensão foi bre- vemente tratada com ultra-som (Labsonic L, B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemanha; 2x10 segundos a 60 watts e temperatura ambien- te), para desintegrar ainda mais os detritos celulares e para liberar as partí- culas de vírus do material celular. Os núcleos das células e os detritos celu- lares maiores foram removidos na breve centrifugação subsequente da sus- pensão (rotor Sorvall GSA, obtido na DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minutos a 3.000 rpm e 10°C). O sedimento foi novamente posto em suspensão em tampão Tris 1, tratado com ultra-som e centrifugado, confor- me acima descrito. Os sobrenadantes coletados contendo as partículas de vírus livre foram combinados e aplicados sobre um coxim de 10 ml de saca- rose a 36% em Tris-HCI a 10 mM, pH 9,0, e centrifugados em um rotor Be- ckman SW 27/SW 28 durante 80 minutos, com 13.500 rpm a 4°C. O sobre- nadante foi descartado e o sedimento contendo as partículas de vírus foi recolhido em 10 ml de Tris-HCI a 1 mM, pH 9,0, homogeneizado por um breve tratamento com ultra-som (2x10 segundos à temperatura ambiente, aparelho conforme acima descrito), e aplicado a um gradiente de sacarose de 20 - 40% (sacarose em Tris-HCI a 1 mM, pH 9,0), para purificação adi- cional. O gradiente foi centrifugado em um rotor Beckmann SW41 a 13.000 rpm durante 50 minutos a 4°C. Após a centrifugação, bandas distintas con- tendo partículas de vírus foram colhidas por pipetagem, depois de aspirar o volume acima da banda. A solução em sacarose obtida foi diluída com três volumes de PBS e as partículas de vírus foram novamente sedimentadas por centrifugação (Beckmann SW 27/28, 60 minutos a 13.500 rpm, 4°C). A pellet, que agora consistia principalmente em partículas de vírus puro, foi posta em suspensão em PBS e equilibrada a concentrações de vírus cor- respondentes, em média, a 1 - 5 x 109 iü/ml. A solução de estoque de vírus purificado foi armazenada a -80°C e usada diretamente ou diluída com PBS para experimentos subseqüentes.
1.3 Clonagem do vírus MVA
Para gerar preparações de vírus de estoque homogêneas, vírus MVA obtido com o Prof. Anton Mayr foi clonado por limitação da diluição durante três passagens consecutivas em CEF cultivadas em placas de cultu- ra de tecidos de 96 poços. O clone F6 do MVA foi selecionado e amplificado em CEF para obter estoques de trabalho do vírus, que servissem como material de partida para a geração dos vírus MVA recombinantes descritos neste pedido de patente, assim como para a geração dos vírus MVA re- combinantes previamente descritos (Sutter, G. e Moss, B. [1992] Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 89, 10847 - 10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink. J. e Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032 - 1040; Hirsch, V., Fuerst, T, Sutter, G., Carroll, M.t Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. e Lifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741 - 3752). 2. Construção e caracterização de vírus MVA recombinantes 2.1 Construção de vetores plasmídicos Para permitir a geração de vírus MVA recombinantes, novos vetores plasmídicos foram construídos. A inserção de genes estranhos do genoma do MVA foi orientada precisamente para o sítio da deleção II de ocorrência natural no genoma do MVA. As seqüências de DNA do MVA que flanqueiam o sítio de uma deleção de 2.500 pb no fragmento Hindlll N do genoma do MVA (Aitenburger, W., Suter, C.P. e Altenburger, J. [1989], J.
Arch. Virol. 105, 15 - 27) foram amplificadas por PCR e clonadas no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pUC18. Os iniciadores para o flanco de DNA esquerdo de 600 pb foram 5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA
CAG GAC GTT CTC-3' e 5-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3’ (os sítios para as enzimas de restrição Kpnl e Smal estão sublinhados). Os iniciadores para o flanco de DNA direito de 550 pb foram 5’-CAG CAG CTG CAG GAA TC A TCC ATT CCA CTG AAT AGC- 3' e 5’-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3' (os sítios para as enzimas de restrição Pstl e Sphl estão sublinhados). Entre esses flancos de DNA de MVA inseridos no pUC18, o gene lacZ de Escheri- chia coli, sob o controle do promotor tardio P11 do vírus da varíola bovina (preparado por digestão de restrição de plll LZ, Sutter, G. e Moss, B. [1992] PNAS USA 89, 10847 - 10851), foi inserido usando-se o sítio BamHI, para gerar o vetor de inserção de MVA pUCII LZ (Figura 1). A seguir, um frag- mento de 289 pb contendo o promotor precoce-tardio P7.5 do vírus da vario- Ia bovina, juntamente com um sítio Smal para clonagem (preparado por di- gestão de restrição com EcoRl e Xbal do vetor piasmídico pSC11 [Chak- rabarti e outros., 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403 - 3409]). foi inserido no sítio Smal do pUCII LZ, para fornecer o vetor de MVA pUC II LZ P7.5 (Figura 2). Para construir um vetor piasmídico que permitisse o isola- mento de vírus MVA recombinantes, mediante síntese transitória da enzima reportadora β-galactosidase, um fragmento de DNA de 300 pb da extremi- dade 3’ do quadro de leitura aberto LacZ de E. coli foi amplificado por PCR
(os iniciadores foram 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAG CGC CTT ACT
GCC GCC-3' e 5-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3'), e clonado nos sítios Sall e Pstl de pUC II LZ P7.5, para se obter o vetor de MVA pUC II LZdel P7.5 (Figura 3). Usando o sítio Smal, esse vetor piasmídico pode ser usado para inserir seqüências de DNA que codificam um gene estranho, sob o controle de transcrição do promotor P7.5 do vírus da varíola bovina no genoma do MVA. Após o vírus recombinante desejado ter sido isolado por triagem da expressão da atividade de β-galactosidase, a propagação adicional do vírus recombinante levou à autodeleção do cassete de expressão P11-LacZ remanipulado por recombinação homóloga. 2.2 Construção e caracterização do vírus recombinante MVA T7pol Um fragmento de DNA de 3,1 kpb, contendo o gene inteiro da RNA polimerase de bacteriófago T7 sob o controle do promotor preco- ce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina, foi excisado com EcoRl do plas- mídeo pTF7-3 (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. e Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122 - 8126), modificado por incubação com DNA polime- rase Klenow, para gerar extremidades niveladas, e clonado em um sitio de restrição Smal único de pUCII LZ, para preparar o vetor de transferência de plasmídeo pUCII LZ T7pol (Figura 4). Como regulador de transcrição para a expressão do gene da T7 RNA polimerase, escolheu-se o promotor preco- ce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. Contrariamente aos promotores tardios mais fortes do vírus da varíola (por exemplo, P11), esse sistema promotor permite a expressão de genes recombinantes imediatamente após a infecção das células alvo. O plasmídeo pUCII LZ T7pol, que dirige a inser- ção dos genes estranhos no sítio de deleção II do genoma de MVA, foi usa- do para gerar o vírus recombinante MVA T7pol. Células CEF infectadas com MVA a uma multiplicidade de 0,05 TCID50 por célula foram transfectadas com DNA do plasmídeo pUCII LZ T7pol, conforme previamente descrito (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Ben- nink, J. e Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032 - 1040). O vírus MVA recombi- nante, que expressa a T7 RNA polimerase e coexpressa β-D-galactosidase (MVA P7.5-T7pol), foi selecionado por cinco rodadas consecutivas de purifi- cação em placa de células CEF coradas com 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D- galactosidase (300 μ9/ιτιΙ). Subseqüentemente, os vírus recombinantes fo- ram amplificados por infecção de monocamadas de CEF e 0 DNA foi anali- sado por PCR, para confirmar a homogeneidade genética do estoque de vírus. A análise Southern blot do DNA viral de MVA-T7pol demonstrou uma integração estável dos genes recombinantes no sítio da deleção II com 0 genoma do MVA (Figura 5).
Para monitorizar a expressão de T7 RNA polimerase pelo MVA T7pol recombinante, poiipeptídios marcados com [35S]metionina da cultura de tecido infectada com vírus foram analisados. Monocamadas da linhagem celular de rim de macaco CV-1, cultivadas em placas de 12 poços, foram infectadas com 0 vírus a uma multiplicidade de 20 TCID50 por célula. De 3 a 5 horas após a infecção, 0 meio foi removido e as culturas foram lavadas uma vez com 1 ml de meio livre de metionina. A cada poço, 0,2 ml de meio livre de metionina, suplementado com 50 pCi de [35S]metionina, foram adici- onados e incubados durante 30 min a 37°C. Extratos citoplásmicos de célu- las infectadas foram preparados por incubação de cada poço em 0,2 ml de tampão de lise Nonidet P-40 a 0,5% durante 10 min, a 37°C, e as amostras foram analisadas por SDS-PAGE. A marcação metabólica das células CV-1 com MVA T7 pol revelou a síntese de dois poiipeptídios adicionais: (i) uma proteína de cerca de 116.000 Da, representando a β-galactosidase de E. coli coexpressada, para permitir a triagem de vírus recombinantes; e (ii) uma proteína de 98.000 Da, com 0 tamanho esperado da RNA polimerase de bacteriófago T7 (Figura 6). A grande quantidade de β-galactosidase pro- duzida pelo MVA T7po! é notável. Os resultados dos experimentos de mar- cação in vivo demonstram uma expressão muito forte do construto de gene P11-LacZ, quando inserido no genoma de MVA no sítio da deleção II, indi- cando que genes recombinantes nos vírus vetores MVA poderíam ser ex- pressados mais eficientemente quando insertidos nesse locus do genoma do MVA. A utilidade dos vírus recombinantes MVA-T7pol como sistema de expressão, em comparação com o vírus WR-T7pol recombinante vTF7-3 (Fuerst e outros., 1986), foi testada peta co-transfecção de DNA de um vetor plasmídico derivado de pTM1 (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Ale- xander, W.A., e Fuerst T.R. [1990] Nature 348, 91 - 92) e contém (ctonado nos sítios Ncol e BamHI do sítio de clonagem múltipla pTM1) o gene da clo- ranfenicol acetiltransferase (CAT) de E. coli, sob o controle de um promotor de T7 RNA polimerase (PT7). Células CV-1 transfectadas e infectadas foram postas em suspensão em 0,2 ml de Tris-HCI a 0,25 M (pH 7,5). Após três ciclos de congelamento-descongelamento, os lisados foram clareados por centrifugação, o teor de proteína dos sobrenadantes foi determinado e as amostras contendo 0,5, 0,25, 0,1 pg de proteína total foram ensaiadas quanto à atividade enzimática, conforme descrito por Mackett, M., Smith, G.L. e Moss, B. (1984), J. Virol. 49, 857 - 864. Após a auto-radiografia, os pontos marcados foram quantificados usando-se 0 sistema de análise de imagem Fuji.
Os resultados demonstram que, com o uso do vetor MVA de varíola bovina altamente atenuado, é possível exlorar o sistema vírus da va- ríola bovina-T7 RNA polimerase tão eficientemente quanto o uso de um ví- rus de varíola bovina recombinante competente para a replicação (Figura 7). 2.3 Construção e caracterização do vírus recombinante MVA-LAInef Um fragmento de DNA de 648 pb, contendo o gene nef inteiro de HIV-1 LAI, foi preparado por PCR a partir de DNA plasmídico (pTG1166 gentilmente fornecido por M.P. Kieny, Transgène S.A., Estrasburgo; os inici- adores da PCR foram 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG
TCA AAA AGT AGT-3' e 5’-CAG CAG GGA TCC ATG TC A GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), digerido com a endonuclease de restrição BamHl. modificado por incubação com DNA polimerase Klenow, para gerar extremi- dades niveladas, e clonado no sítio Smal de pÜC II LZdel P7.5, para prepa- rar o vetor pUC II LZdel P7.5-LAInef (Figura 8). Esse plasmídeo podia ser usado para produzir vírus MVA recombinantes que expressassem o gene nef de HIV-1 LAI sob o controle do promotor precoce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. Células CEF infectadas com MVA a uma multiplicidade de 0,05 TCID50 por célula foram transfectadas com DNA do plasmídeo pUC II LZdel P7.5-LAInef, conforme previamente descrito (Sutter, G., Wyatt. L., Foley, P., Bennink, J. e Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032 - 1040). Vírus MVA recom- binantes contendo o gene nef e coexpressando transitoriamente o gene marcador LacZ de E. coli foram selecionados por rodadas consecutivas de purificação em placa em células CEF, coradas com 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactosidase (300 pg/ml). A seguir, vírus MVA recombinantes contendo o gene nef e com a deleção do gene marcador LacZ foram isolados por três rodadas consecutivas adicionais de purificação em placa, com triagem dos focos virais não-corados em células CEF, na presença de 5-bromo-4-cloro- 3-indolil β-D-galactosidase (300 pg/ml). Subsequentemente, vírus recombi- nantes foram amplificados por infecção de monocamadas de CEF e 0 DNA viral de MVA-LAInef foi analisado por PCR, para confirmar a homogeneida- de genética do estoque de vírus. A análise Southern blot do DNA viral con- firmou a estabilidade genética do MVA-LAInef e demonstrou precisamente a integração do gene nef e a deleção do gene marcador LacZ de E. coli no sítio de deleção II dentro do genoma viral. A expressão eficiente da proteína Nef recombinante foi confir- mada por análise Western blot de lisados de proteína de células CEF infec- tadas com MVA-LAInef, usando anticorpos monoclonais de camundongo dirigidos contra Nef de HIV-1 (gentilmente fornecidos por K. Krohn e usados conforme descrito por Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tãhtinen, M., Jung, G. e Krohn, K. [1992] AIDS 6, 25 - 34).
2.4 Construção e caracterização do vírus recombinante MVA-hTYR
Um fragmento de DNA de 1.9 kb, contendo o gene inteiro que codifica a tirosinase humana [clone c-DNA de tirosinase 123.B2, isolado da linhagem celular de melanoma SK29-MEL do paciente SK29 (AV), GenBank Acc. no. U01873; Brichard, V. Van Pel, A., Wõlfel, T., Wõlfe!, C.. De Plaen. E., Lethé, B., Coulie, P. e Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489 - 495], foi preparado a partir do plasmídeo pcDNAI/Amp-Tyr [Wõlfel, T, Van Pel, A.
Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Büschenfelde, K. e Boon. T. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 759 - 764], por digestão com EcoRI, modifi- cado por incubação com DNA polimerase Klenow, para gerar extremidades niveladas, e clonado no sítio Smal de pUC II LZdel P7.5, para preparar o vetor pUC II LZdel P7.5-TYR (Figura 9). Esse plasmídeo podia ser usado para produzir vírus MVA recombinantes que expressassem o gene da tirosi- nase humana sob o controle do promotor precoce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina. Células CEF infectadas com MVA a uma multiplicidade de 0,05 TCID50 por célula foram transfectadas com DNA do plasmídeo pUC II LZdel P7.5-TYR, conforme previamente descrito (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. e Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032 - 1040). Vírus MVA recom- binantes expressando de maneira estável o gene da tirosinase humana e coexpressando transitoriamente 0 gene marcador LacZ de E. coli foram se- lecionados por rodadas consecutivas de purificação em placa em células CEF, coradas com 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactosidase (300 pg/ml). A seguir, vírus MVA recombinantes expressando o gene da tirosinase hu- mana e com a deleção do gene marcador LacZ foram isolados por três ro- dadas consecutivas adicionais de purificação em placa, com triagem dos focos virais não-corados em células CEF, na presença de 5-bromo-4-cloro- 3-indolil β-D-galactosidase (300 pg/ml). Subsequentemente, vírus recombi- nantes foram amplificados por infecção de monocamadas de CEF e o DNA viral de MVA-hTYR foi analisado por PCR, para confirmar a homogeneidade genética do estoque de vírus. A análise Southern blot do DNA viral confir- mou a estabilidade genética do MVA-hTYR e demonstrou precisamente a integração do gene da tirosinase humana e a deleção do gene marcador LacZ de E. coli no sítio de deleção II dentro do genoma viral. A expressão eficiente da tirosinase humana foi confirmada por análise Western blot de lisados de proteína de células CEF infectadas com MVA-hTYR, usando anticorpos policlonais de coelho (gentilmente fornecidos por V. Hearing e usados conforme descrito por Jimenez, M., Kameyama, K
Maloy, L., Tomita, Y. e Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830 - 3834) ou anticorpos monoclonais de camundongo (gentilmente fornecidos por L. Old e usados conforme descrito por Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan. K. e Old, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125 - 8129) dirigidos contra tirosinase.
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Ge- sundheit GmbH (B) RUA: Ingolstaedter Landstr. 1, Neuherberg (C) CIDADE: Oberschleissheim (E) PAÍS; Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 85764 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vírus MVA recombinante e seu uso (iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 8 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível (B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC
(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO REQUERENTE: DK 0782/95 (B) DATA DE DEPÓSITO: 04-JUL-1995 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°:2: CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA; única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO.Vdesc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2: CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA; única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA; outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRlÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4: CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nuciéico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5: CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nuciéico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nuciéico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6 GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases {B) TIPO: ácido nuciéico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nuciéico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7 CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nuciéico (C) CONFORMAÇÃO DA FITA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "DNA Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8: CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG
Claims (12)
1. Vírus de Vaccinid Ankara modificado (MVA) recombinante caracterizado pelo fato de conter e de ser capar de expressar pelo menos um: gene exógeno inserido em um sírio de uma del.eção de ocorrência natural no genoma do KVA selecionado a partir dos sítios I, II, IV, V ou VI.
2. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de conter e ser capaz de expressar pelo menos um gene exógeno inserido no sítio de deleção II dentro do genoma do MVA.
3. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o gene exógeno codificar um marcador, um agente terapêutico, ou um determinante antigênico.
4. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o gene exógeno codificar um determinante antigênico de um vírus patogênico, de uma bactéria ou de outro microorganismo, ou de um parasita ou célula tumoral.
5. Vírus MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o gene exógeno codificar um determinante antigênico do Plasmodium Falsiparum, Mycobacteria, Herpes vírus, vírus da gripe, hepatite ou vírus da imunodeficiência humana.
6. V: rus MVA recombinante, de acordo cora qua iquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo tato de o determinante antigênico ser HIV nef ou tirosinase humana.
7. Vírus MVA recombmante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de c gene exóger.c codificar Ti RMA polimerase.
8. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de o gene exógeno estar sob o controle de transcrição do promotor precoce/tardio P7.5 do vírus da varíola bovina.
9. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser essencialmente livre de vírus capazes de replicar em células humanas.
10. Vírus MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser utilizável na imunização de um organismo animal vivo, incluindo um humano.
11. Vacina caracterizada pelo fato de conter um vírus MVA recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em um veiculo físiologicamente aceitável.
12. Vacina caracterizada pelo fato de compreender, como primeiro componente, um vírus MVA recombinante, como definido na reivindicação 7, em um veiculo fisiologicamente aceitável e, como segundo componente, uma sequência de DNA portadora de um determinante antigênico sob o controle de transcrição de um promotor de T7 RNA polimerase, em veiculo fisiologicamente aceitável, os dois componentes estando contidos juntos ou separadamente.
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