CZ424197A3 - Rekombinantní viry MVA, jejich použití, buňky jimi infikované a vakcíny, které je obsahují - Google Patents
Rekombinantní viry MVA, jejich použití, buňky jimi infikované a vakcíny, které je obsahují Download PDFInfo
- Publication number
- CZ424197A3 CZ424197A3 CZ974241A CZ424197A CZ424197A3 CZ 424197 A3 CZ424197 A3 CZ 424197A3 CZ 974241 A CZ974241 A CZ 974241A CZ 424197 A CZ424197 A CZ 424197A CZ 424197 A3 CZ424197 A3 CZ 424197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mva
- virus
- recombinant
- recombinant mva
- vaccine
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims description 171
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 101
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 40
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 38
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 18
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 10
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 6
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 10
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 5
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 3
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 2
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BZCOASIWPFVBQZ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1-(4-pyrrolidin-1-ylbut-2-ynyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound CC1CCC(=O)N1CC#CCN1CCCC1 BZCOASIWPFVBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000009589 pathological growth Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
(57) Anotace:
Rekombinantní viry MVA, které obsahují cizí geny inzertované clo místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a jsou schopné tyto cizí geny exprimovat. Dále se popisuje použití těchto rekombinantních virů MVA pro produkci polypeptidů, např. antigenů nebo terapeutických činidel, a použití těchto virů pro přípravu rekombinantních virů pro vakcíny nebo virových vektorů pro genovou terapii. Dále se popisují buňky infikované těmito viry a vakcíny, které je obsahují.
?</ ΪΜ-ΊΊ• · · ·
jejich použití, buňky jimi infikované a
175 531/HK
vakcíny které je obsahují
Oblast techniky
Tento vynález se týká rekombinantních virusů vakcinie odvozených od modifikovaného virusu vakcinie Ankara (MVA) a obsahujících a schopných exprese cizích genů inzertovaných do místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a použití w těchto rekombinantních virů MVA pro produkci polypeptidů, jako jsou antigeny nebo terapeutická činidla nebo virové vektory pro '* genovou terapii a použití těchto rekombinantních virusů MVA kódujících antigeny jako vakcíny.
Předmětem vynálezu je rekombinantní virus MVA, který může sloužit jako účinný a obzvláště bezpečný expresní vektor.
Dalším předmětem vynálezu je jednoduchý, účinný a bezpečný způsob produkce polypeptidů, např. antigenů nebo terapeutických činidel, rekombinantních virů pro vakcíny a virových vektorů pro genovou terapii.
Dalším předmětem vynálezu je expresní systém založený na rekombinantním viru MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu a dále způsoby produkce polypeptidů, např. antigenů nebo terapeutických činidel nebo tvorby virových vektorů pro genovou terapii nebo vakcín založených na tomto expresním systému.
** Dosavadní stav techniky * Virus vakcinie, člen rodu Orthopoxvirus rodiny Poxviridae, byl použit jako živá vakcína pro imunizaci proti lidskému onemocnění neštovicemi. Úspěšná celosvětová vakcinace virusem vakcinie měla za důsledek vyhubeni viru neštovic, který neštovice způsobuje. (Celosvětové vyhlazení neštovic. Závěrečná zpráva celosvětové komise pro ověření vyhlazení neštovic. Historie
-2veřejného zdraví, č. 4, Ženeva: Světová zdravotnická organizace (dále WHO), 1980). Po zprávě uveřejněné WHO byla vakcinace obecně ukončena s výjimkou osob vystavených vysokému riziku infekce virem neštovic (např. laboratorních pracovníků).
V poslední době jsou vakciniové viry využívány pro úpravu vektorů pro expresi rekombinantních genů a pro potenciální využití jako rekombinantní živé vakcíny (Mackett, M., Smít, G.L. a Moss,
B. (1982) P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. a Moss, B. (1984) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Toto využití zahrnuje sekvence DNA (nebo geny) kódující cizí antigeny, které jsou vpraveny pomocí metod založených na rekombinaci DNA do genomu vakciniových virů. Je-li gen zaintegrován do místa ve virové DNA, které není esenciální pro životni cyklus viru, potom je možné, aby se nove vytvořený rekombinantní vakciniový virus stal infekčním, tedy schopným infikovat cizí buňky s následnou expresí integrované sekvence DNA (EP Patentové aplikace č. 83, 286, a č. 110, 385). Rekombinantní virusy vakcinie připravené tímto způsobem mohou být použity jako živé vakcíny pro profylaxi infekčních onemocnění a také mohou být využity pro přípravu heterologních proteinů v eukaryotních buňkách.
Rekombinantní virus vakcinie, ve kterém dochází k expresi genu bakteriofágové T7 RNA polymerázy, umožnil zavedení široce využitelných expresních systémů pro syntézu rekombinantních proteinů v savčích buňkách (Moss, B., Elroy-Stein, 0., Mizukami, T., Alexander, W.A., a Fuerst T.R. (1990) Nátuře 348, 91-92). Ve všech protokolech závisí exprese rekombinantního genu na syntéze T7 RNA polymerázy v cytoplasmě eukaryotních buněk. Nejoblíbenějším se stal protokol pro přechodnou expresi (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. a Moss, B. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 a patentová přihláška US 7.648.971). Cizí gen se nejprve inzertuje do plasmidu řízeného promotorem T7 RNA polymerázy. Dále je tento plasmid vpraven do cytoplasmy buněk infikovaných rekombinantním virem vakcinie produkujícím T7 RNA polymerázu za použití standardního postupu pro transfekci.
-3····
Transfekční protokol je velmi jednoduchý, neboť není třeba připravovat žádné nové rekombinantní viry a je velmi účinný, neboť k expresi genu dochází u více než u 80% buněk (Elroy-Stein. O. a Moss, B. (1990) Proč. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747). Výhodou hybridního systému vakciniový vírus/T7 RNA polymeráza oproti jiným přechodným expresním systémům je velmi pravděpodobně jeho nezávislost na transportu plasmidů k buněčnému jádru. V minulosti se tento systém ukázal jako velmi užitečný pro analytické účely ve virologii a v buněčné biologii (Buonocore, L.a Rose, J.K. (1990) Nátuře 345, 625-628, Pattnaik, A.K. a Wertz, G.W. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1379-1383, Karschin, A., Aiyar, J.,
Gouin, A.,
Davidson,
N. a Lester,
H.A. (1991) FEBS Lett. 278, 229233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J.,
Branchek, T., Lester,
303-306, Buchholz, C.J.,
Retzler C., Homann, H.E., a Neubert, W.J.
(1994) Virology 204,
770-776). Budoucí důležitá využití hybridního systému virus vakcinie/T7 RNA polymeráza, jako je například generace rekombinantních proteinů nebo rekombinantních virových částic pro nové terapeutické nebo profylaktické postupy u lidí však mohou být obtížná vzhledem k produktivní replikaci rekombinantního vektoru vakcinie.
Virus vakcinie je infekční vůči lidem a během potlačování neštovic byly u některých případů pozorovány vážné komplikace. Nejdokonalejší přehled o výskytu těchto komplikací je vypracován na základě průzkumu provedeného v rámci Spojených států, během kterého byla monitorována vakcinace přibližně 12 miliónů lidi vakcinovaných kmenem viru vakcinie dodaným Zdravotnickým výborem města New York City (Lané, J., Ruben, F., Neff, J. a Millar, J. (1969) New Engl. J. Med. 281, 1201-1208). Ze studie vyplývá, že nejslibnější možnosti využití viru vakcinie jako vektoru pro vývoj rekombinantních živých vakcin jsou ovlivněny bezpečnostními otázkami a nařízeními. Navíc, většina rekombinantních virů vakcinie popsaných v literatuře je založena na kmeni viru vakcinie Western Reserve. Na druhé straně je však známo, že tento kmen se vyznačuje vysokou virulencí a proto není vhodný pro použití u lidí a zvířat (Morita a kol., Vaccine 5, 65-70(1987)).
*
-4e···
Zdravotnická rizika vyplývající z použiti vektorů mohou být snížena použitím vysoce zeslabeným kmenem viru vakcinie. Několik takových kmenů viru vakcinie bylo specificky vyvinuto pro účel zabránění nežádoucích vedlejších účinků vakcinace proti neštovicím. Proto byl modifikovaný virus vakcinie Ankara (MVA) vytvořen dlouhodobým sériovým průchodem kmenu viru vakcinie Ankara (CVA) fibroblasty kuřecího embrya (pro přehled, viz. Mayr., Hochstein-Mintzel, V. a Stickl, H. (1975) Infection 3, 6—14; Švýcarský patent č. 568, 392). Virus MVA byl uložen v souladu s požadavky Budapešťské dohody v CNCM (Pastérův institut, Národní sbírka kultur mikroorganismů, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15), dne 15. prosince 1987, pod depozitárním číslem 1-721. MVA se vyznačuje svým značným zeslabením, tedy sníženou virulencí nebo infekčností za současného zachování značné imunogenicity. MVA virus byl analyzován za účelem zjištění změn v genomu vzhledem k nativnímu typu kmene CVA. Bylo identifikováno 6 významných delecí genomické DNA (delece I, II, III, IV, V, a VI) o celkovém počtu 31,000 párů baží (Meyer, H., Sutter, G. A Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Výsledný virus MVA získal vysokou specificitu přijetí hostitelskými buňkami omezenou na ptačí buňky. MVA lze navíc charakterizovat jeho extrémním zeslabením. Během testování na různých zvířatech se MVA ukázal jako nevirulentní a to dokonce i u zvířat s potlačenou imunitou. Vynikající vlastnosti kmene MVA byly rovněž demonstrovány během extenzívních klinických zkoušek (Mayr a kol·., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987), Stickl a kol., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)). Během těchto studií provedených na více než 120 000 lidech včetně vysoce rizikových pacientů nebyly žádné vedlejší příznaky spojeny s použitím vakcíny MVA.
Bylo zjištěno, že replikace MVA je blokována během pozdějšího stadia infekce, a tím je zabráněno jeho skladbě do komplexních infekčních virionů. Přesto však byl MVA schopen vysoké úrovně exprese virových i rekombinantních genů dokonce i v nepermisivních buňkách a byl navržen jako účinný a výjimečně bezpečný vektor pro expresi genů (Sutter, G. A Moss, B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851) . V poslední době byly zavedeny nové vektorové
-5vakciniové systémy založené na MVA s cizími sekvencemi DNA inzertovanými v místě delece III v genomu MVA nebo uvnitř genu TK (Sutter, G. a Moss, B. (1995) Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195-200 a patent US 5.185.146).
Pro další využití MVA je studován nový možný způsob zavedení cizích genů rekombinací DNA do kmene MVA viru vakcinie. Vzhledem k tomu, že účelem nebylo změnit genom viru MVA, bylo nutno použít metodu, která bude vyhovovat tomuto požadavku. Podle tohoto vynálezu je cizí sekvence DNA rekombinována do virové DNA přesně do místa přirozeně vyskytující se delece v genomu MVA.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou, mimo jiné, následující předměty, a to samotné nebo v kombinaci:
Rekombinantní virus MVA, který obsahuje alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a je schopen exprese tohoto alespoň jednoho cizího genu;
rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, který obsahuje a je schopen exprese alespoň jednoho cizího genu inzertovaného do místa delece II v genomu MVA;
rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje markér, terapeutický gen nebo antigenní determinant;
rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant z patogenního viru, baktérie nebo jiného mikroorganismu nebo z parazitu nebo z rakovinové buňky;
rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant z Plasmodium Falciparum, Mycobacteria, Herpes viru, chřipkového viru, hepatitis nebo z virů deficitu lidské imunity;
-6rekombinantni virus
MVA, j ako j e uveden antigenní determinant je
HIV nef nebo lidská výše, ve kterém tyrosináza;
rekombinantni virus
MVA, j ako je uveden výše, kterým je
MVA-LAInef nebo MVA-hTYR;
rekombinantni virus MVA, j ako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu;
rekombinantni virus MVA, j ako je uveden výše, kterým je
MVA-T7 pol;
j ako cizí gen pod transkripční regulací virusu vakcinie;
rekombinantni virus MVA, uveden výše, ve kterém je je raně-pozdního promotoru P7.5 rekombinantni viry, jako jsou uvedeny výše, v podstatě neobsahující viry schopné replikace v lidských buňkách;
použiti rekombinantního virusu MVA, jako je uveden výše, pro transkripci sekvencí DNA pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;
eukaryotícká buňka infikovaná libovolným z výše uvedených rekombinantních virů MVA;
buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu;
buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu a dále obsahuje jeden nebo více expresních vektorů nesoucích jeden nebo více cizích genů pod transkripční regulaci promotoru T7 RNA polymerázy;
použití buněk, jako jsou uvedeny výše, pro produkci polypeptidů kódovaných zmíněnými cizími geny, které zahrnuje:
• 9 • ·
-Ί-
a) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, a
b) izolaci polypeptidů kódovaných uvedenými geny;
buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu a dále obsahuje expresní vektory nesoucí virové geny, a/nebo virový vektorový konstrukt kódující genom virového vektoru pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;
použití buněk, jako jsou uvedeny výše, pro produkci virových částic, které zahrnuje:
a) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, a
b) izolaci virových částic;
buňka infikovaná rekombinantním virem MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu, a dále obsahuje:
a) expresní vektor nesoucí retrovirální vektorový konstrukt schopný infikovat a řídit expresi jednoho nebo více cizích genů nesených uvedeným retrovirálním vektorovým konstruktem, v cílových buňkách, a
b) jeden nebo více expresních vektorů nesoucích geny kódující polypeptidy vyžadované pro sbalení genomu uvedeného retrovirálního vektorového konstruktu pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy;
použití buněk, jak jsou uvedeny výše, pro produkci retrovirálních částic, které zahrnuje:
a) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, a
b) izolaci retrovirálních částic;
-8vakcina obsahující rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenní determinant, ve fyziologicky přijatelném nosiči;
použiti rekombinantního viru MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje antigenni determinant pro přípravu vakcíny;
*··· použití vakcíny, jako je uvedena výše, pro imunizaci živého zvířecího těla, a to včetně lidského;
použití vakcíny, jako je uvedena výše, obsahující MVA-LAInef pro prevenci nebo léčbu infekce HIV nebo AIDS;
použití vakcíny, jako je uvedena výše, obsahující MVA-hTYR pro prevenci nebo léčbu melanomů;
vakcina obsahující jako první složku rekombinantní virus MVA, jako je uveden výše, ve kterém cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu ve fyziologicky přijatelném nosiči a jako druhou složku sekvenci DNA nesoucí antigenní determinant pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy ve fyziologicky přijatelném nosiči, přičemž tyto dvě složky jsou obsaženy společně nebo jednotlivě;
použití vakcíny, jako je uvedena výše, pro imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského, která zahrnuje inokulaci uvedeného živého zvířecího těla, včetně lidského, první a druhou složkou vakcíny buďto zároveň nebo s časovou prodlevou za použití stejného inokulačního místa; a
Výraz „gen” znamená libovolnou sekvenci DNA, která kóduje protein nebo peptid.
Výraz „cizí gen znamená gen inzertovaný do sekvence DNA, ve které se přirozeně nevyskytuje.
-9• · · ♦
·· ··♦·
Cizím genem může být například markerový gen, terapeutický gen, gen kódující antigenní determinant nebo virový gen. Tyto geny jsou v oboru dobře známy.
Modifikovaný virus vakcinie Ankara (MVA) , vysoce zeslabený kmen viru vakcinie se specificky vymezenými hostiteli, je neschopný množení v lidských a ve většině jiných testovaných savčích buněčných liniích. Protože vsak exprese virových genů není omezena v nepermisivních buňkách, mohou být rekombinantní viry MVA podle vynálezu použity jako výjimečně bezpečné a účinné expresní vektory.
Rekombinantní viry MVA kódující antigenní determinant
Podle jednoho provedení se vynález týká rekombinantních virusů vakcinie MVA, které obsahují gen kódující cizí antigen, s výhodou patogenního původu a vakcín obsahujících takový virus ve fyziologicky přijatelné formě. Vynález se také týká způsobů přípravy takových rekombinantních virů vakcinie MVA nebo vakcín a použití těchto vakcín pro profylaxi infekcí způsobených takovými patogenními agens.
Podle výhodného provedení vynálezu je cizím genem inzertovaným do virusu MVA gen kódující HIV nef.
Podle vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi genu HIV-1 nef pod regulací raně-pozdním promotorem P7.5 viru vakcinie.
Regulační protein Nef z primátních lentivirů je syntetizován v časné fázi virového replikačního cyklu a ukázal se být esenciálním pro replikaci s vysokým titrem viru a pro indukci onemocnění in vivo. Toto napovídá, že HIV Nef může mít klíčovou úlohu v patogenezi AIDS. Molekulární mechanismy, kterými Nef přispívá ke zvýšené infektivitě viru a patogenitě HIV, je nutno dále zkoumat. Nef je však imunogenní a specifický antigen pro Nef může být použit jako vakcína proti infekci HIV a AIDS.
-ιόν tomto kontextu, rekombinantní virus MVA exprimující gen HIV nef, může být použit pro imunizaci lidí, jednak jako profylaktická vakcína proti lidskému HIV a jednak pro imunoterapii pacientů s AIDS nebo infikovaných HIV.
Navíc, rekombinantní virus MVA exprimující gen HIV nef, může být použit pro produkci rekombinantního proteinu HIV Nef.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je cizím genem inzertovaným do viru MVA gen kódující lidskou tyrosinázu.
Podle vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi genu lidské tyrosinázy pod regulací raněpozdního promotoru P7.5 viru vakcínie. Lidská tyrosináza byla v poslední době identifikována jako nádorový antigen specifický pro melanomy, který umožňuje vznik protinádorových cytolytických T-lymfocytů (Brichard, V., a kol. (1993) J. Exp. Med. 178, 489495). Vzhledem k tomu, že se zdá že z normálních buněk exprimují gen tyrosinázy pouze melanocyty, je tyrosináza vhodným cílovým antigenem pro imunoterapii melanomů. Rekombinantní virus MVA exprimující gen lidské tyrosinázy, může být proto použit u pacientů s melanomem pro indukci imunitní odezvy, která vyvolává odmítnutí nádoru nebo zabraňuje vzniku metastáz. Rekombinantní virus MVA.exprimující gen lidské tyrosinázy může být použit přímo jako vakcína proti melanomů nebo může být použit pro přípravu vakcín proti melanomů. V jednom příkladě může být rekombinantní virus MVA exprimující gen lidské tyrosinázy použit pro produkci rekombinantního proteinu tyrosinázy, který je používán jako antigen pro vakcíny. V jiném příkladě lze za použití rekombinantního viru MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy jako expresního vektoru modifikovat buňky získané od pacienta s nádorem in vitro tak, aby exprimovaly tyrosinázu, a poté je přenést zpět do pacienta pro indukci protinádorové imunitní odpovědi. Vakcína připravená na bázi rekombinantního MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy může být použita buďto parenterálně nebo lokálně v místě nádoru pro prevenci metastázování nebo fenotypickou změnu
-11nádoru, jako například změnu velikosti, tvaru, celistvosti, vaskularizace nebo jiných znaků. Vakcína připravená na bázi rekombinantního MVA exprimujícího gen lidské tyrosinázy může být použita před, během nebo po chirurgickém odstranění nádoru.
Pro přípravu vakcín jsou viry vakcinie MVA podle vynálezu převedeny do fyziologicky přijatelné formy. To lze provést na základě zkušenosti z přípravy vakcín MVA použitých při vakcinaci proti nešťovicím (jak popsali Stickl, H. a kol. (1974) Dtsch.med.Wschr.99, 2386-2392). Typicky, je přibližně 1O6-1O8 částic rekombinantního MVA lyofilyzováno ve 100 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem (PBS) za přítomnosti 2% peptonu a 1% lidského albuminu v ampuli, výhodně ve skleněné. Lyofilyzát může obsahovat plnidla (jako je manitol, dextran, sacharóza, glycin, laktóza nebo polyvinylpyrolidon) nebo jiné přídavky (jako jsou antioxidanty, stabilizátory, apod.) vhodné pro parenterální podání. Skleněná ampule je poté utěsněna a lze ji skladovat, s výhodou při teplotách pod -20°C, po dobu několika měsíců.
Pro vakcinaci nebo terapii, lze lyofilyzát rozpustit v 0.1 až 0.5 ml vodného roztoku, výhodně fyziologického roztoku a může být aplikován bud*to parenterálně, například nitrosvalovou inokulací nebo lokálně, například inokulací do nádoru nebo v místě nádoru. Vakcíny nebo terapeutické prostředky podle vynálezu jsou výhodně vpichovány nitrosvalově (Mayr, A. a kol. (1978) Zbl. Bakt. Hyg.,
I. Abt. Orig. B 167, 375-390). Způsob podání, dávku a počet podání může odborník v oboru známým způsobem optimalizovat. Může být vhodné podávat vakcínu několikrát během dlouhého časového období pro dosažení náležité imunitní odezvy proti cizímu antigenu.
Použití rekombinantních virů MVA pro přípravu heterologických polypeptidů
Rekombinantní viry vakcinie MVA podle vynálezu lze rovněž použít pro přípravu heterologických polypeptidů v eukaryotních buňkách. To předpokládá, že se buňky infikují rekombinantními viry vakcinie. V buňkách dochází k expresi genu kódujícího cizí polypeptid a exprimovaný heterologický polypeptid je izolován.
-12Způsoby používané pro produkci takových heterologických polypeptidů jsou odborníkům, v oboru obecně známy (EP-A-206, 920 a EP-A-205, 939). Polypeptidy produkované pomoci rekombinantních virů MVA jsou z důvodů specifických vlastností virů MVA vhodnější pro použití jako léčiva pro lidi a zvířata.
Rekombinantní viry MVA kódující T7 RNA polymerázu a jejich použití pro expresi sekvenci DNA pod transkripčni regulaci promotoru T7 RNA polymerázy
Podle dalšího provedení vynálezu byly zkonstruovány rekombinantní viry MVA, které umožňují expresi bakteriofágového genu polymerázy T7 RNA pod regulací raně-pozdniho promotoru P7.5 viru vakcinie. Užitečnost rekombinantních virů MVA-T7pol jako expresního systému byla testována pomocí zkoušek přechodné transfekce, během kterých byla indukována exprese rekombinantních genů pod regulaci promotoru T7 RNA polymerázy. Za použití genu chloramfenicol acetyltransferázy (CAT) E. coli jako reportérového genu bylo zjištěno, že MVA-T7pol indukoval expresi genu CAT stejně tak účinně jako vakcínie/T7pol rekombinantní virus odvozený od replikačně kompetentního kmene WR viru vakcinie.
Hybridní systém MVA/T7 polymeráza podle vynálezu tak může být použit jako jednoduchý účinný a bezpečný savčí expresní systém pro produkci polypeptidů bez produktivní replikace viru vakcinie.
Tento expresní systém může být také použit pro generování rekombinantních virových částic pro vakcinaci nebo pro genovou terapii transformací buněčných linií infikovaných rekombinantním MVA exprimujícím T7 RNA polymerázu, s konstrukty DNA obsahujícími všechny nebo některé z genů a genom nebo rekombinantní genom potřebný pro generování virových částic, například částic MVA nebo retrovirových částic pod transkripčni regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
Retrovirový vektorový systém se skládá ze dvou složek:
-13·· ····
1) retrovirový vektor samotný je modifikovaným retrovirem (vektorovým plasmidem), ve kterém geny kódující virové proteiny byly nahrazeny terapeutickým geny a markerovými geny, které mají být přeneseny do cílových buněk. Protože nahrazení genů kódujících virové proteiny účinně virus inaktivuje, musí být aktivován druhou složkou systému, která modifikovanému retroviru poskytne chybějící virové proteiny.
Druhou složkou je:
2) buněčná linie, která produkuje veliká množství virových proteinů, nedisponuje však schopností produktovat replikačně kompetentní virus. Taková buněčná linie je známa jako sbalovací buněčná linie a skládá se z buněčné linie transfektované jedním nebo více plasmidy nesoucími geny (geny kódující polypeptidy gag, pol a env), umožňující sbalení modifikovaného retrovirového vektoru.
Pro účely generování sbaleného vektoru je vektorový plasmid transfektován do sbalovači buněční linie. Za těchto podmínek je modifikovaný retrovirální genom obsahující inzertované terapeutické a markerové geny transkribován z vektorového plasmidu a sbalován do modifikovaných retrovirových částic (rekombinantních virových částic). Tento rekombinantní virus je poté použit pro infekci cílových buněk, ve kterých je vektorový genom a libovolné nesené markerové nebo terapeutické geny integrován do DNA cílových buněk. Buňky infikované takovou rekombinantní virovou částicí nemohou produkovat nový vektorový virus, neboť v nich nejsou přítomny žádné virové proteiny. DNA vektoru nesoucího terapeutické a markerové geny je však integrována do DNA těchto buněk a v infikovaných buňkách může být exprimována.
Rekombinantní virus MVA exprimující T7 RNA polymerázu podle vynálezu může být použit pro produkci proteinů nutných pro sbalení retrovirových vektorů. Pro tento účel jsou retrovirové geny gag, pol a env (např. virů myší leukémie, Murine Leukemia Virus (MLV)) « ♦· ····
-14podřízeny transkripčni regulaci promotoru T7 RNA polymerázy v jednom nebo ve více expresních vektorech (např. plasmidech). Expresní vektory jsou poté přeneseny do buněk infikovaných rekombinantnim virem MVA exprimujicim T7 RNA polymerázu spolu s expresním vektorem nesoucím retrovirový vektorový konstrukt, popřípadě pod transkripčni regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
WO 94/29437, WO 89/11539 a WO 96/07748 popisuji různé druhy retrovirálnich vektorových konstruktů, které mohou být sbaleny za použiti výše uvedeného sbalovaciho systému.
Další použiti rekombinantniho viru MVA exprimujiciho T7 RNA polymerázu spočívá v generování rekombinantních proteinů, neinfekčních virových částic nebo infekčních mutantních virových částic pro produkci vakcín nebo terapeutických činidel (Buchholz a kol., Virology, 204, 770-776(1994) a EP-B1-356695). Pro tento účel jsou virové geny (např. gag-pol a geny env HIV-1) umístěny pod transkripčni regulaci promotoru T7 v expresním vektoru (např. plasmidu nebo jiném rekombinantnim viru MVA). Tento konstrukt je poté přenesen do buněk infikovaných rekombinantnim virem MVA exprimujicim T7 RNA polymerázu. Rekombinantní virové geny jsou transkribovány s vysokou účinností, rekombinantní proteiny jsou produkovány ve vysokém množství a mohou být purifikovány. Navíc, exprimované rekombinantní virové proteiny (např. HIV-1 env, gag) mohou aglomerovat do virových pseudočástic, které vystupuji z buněk a mohou být izolovány z tkáňového kultivačního média. Podle jiného provedení vynálezu mohou virové proteiny (např. z HIV, SIV, spalničkového viru), exprimovaná systémem MVA-T7pol, aktivizovat další introdukovaný mutantní virus (odvozený např. od HIV, SIV, spalničkového viru) tím, že pomáhají překonat nedostatky během připojení a infekce, rozbalení, replikace nukleových kyselin, exprese virových genů, aglomerace nebo během jiného kroku virového množení, a tím umžňovat produkci a purifikaci zmíněného mutantního viru.
-15MVA-T7pol může být také použit společně se sekvencemi DNA nesoucími gen antigenů, který je předmětem zájmu (např. gen HIV, nef, tat, gag, pol nebo env nebo jiné), pro imunizaci. Nejprve je sekvence kódující daný antigen (např. HIV, HCV, HPV, HSV, spalničkového viru, chřipkového viru nebo jiných) klonována pod regulaci promotoru T7 RNA-polymerázy výhodně v plasmidovém vektoru a výsledný konstrukt DNA je amplifikován a purifikován za použití standartních laboratorních postupů. Dále, je vektorová DNA inokulována zároveň nebo v příslušném časovém odstupu se systémem MVA-T7pol. V místě inokulace dochází k přechodné expresi rekombinantního genu v buňkách obsahujících zároveň vektorovou DNA a MVA-T7pol a odpovídající antigen je vystaven hostitelskému imunitnímu systému s výslednou stimulací imunitní odezvy specifické pro tento antigen. Tento postup, využívající nereplikující vektor vakcinie MVA-T7pol, představuje slibnou novou strategii pro vakcinaci nukleových kyselin umožňující účinnou přechodnou expresi daného antigenů, a to za eliminace současného možného rizika konstitutivní exprese genu.
Rekombinantní viry vakcinie MVA mohou být připraveny jak je uvedeno dále.
Konstrukt DNA obsahující sekvenci DNA kódující cizí polypeptid ohraničenou sekvencemi DNA z MVA přilehlými k přirozeně existující deleci, např. deleci II v genomu MVA, je vnesena do buněk infikovaných MVA pro umožnění homologické rekombinace.
Po vnesení konstruktu DNA do eukaryotní buňky a po rekombinaci cizí DNA s virovou DNA je možno izolovat požadovaný rekombinantní virus vakcinie známým způsobem, výhodně pomocí markéru (srov. Nakano a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 15931596 (1982), Franke a kol., Mol. Cell. Biol. 1918-1924 (1985), Chakrabarti a kol., Mol. Cell. Biol. 3403-3409 (1985), Fathi a kol., Virology 97-105 (1986)).
-16·· ····
Konstrukt DNA pro inzerci může být lineární nebo cirkulární. Výhodná je cirkulární DNA, zvláště plasmid. Konstrukt DNA obsahuje sekvence ohraničující na levé i na pravé straně přirozeně se vyskytující delecí, např, delecí II v genomu MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. a Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27).
Cizí sekvence DNA je inzertována mezi sekvence ohraničující přirozeně se vyskytující deleci. Cizí sekvencí DNA může být gen kódující terapeutický polypeptid, např. t-PA nebo interferon, nebo antigenní determinant z patogenního agens. Patogenními agens mohou být viry, baktérie a paraziti, kteří mohou způsobovat onemocnění, stejně jako i nádorové buňky, které se neomezeně množí v organismu a mohou tak vést k patologickému růstu. Příklady takových patogenních agens jsou popsány v Davis B.D. a kol., (Microbiology,
3. vyd., Harper International Edition). Výhodnými antigeny patogenních agens jsou antigeny virů deficitu lidské imunity (např. HIV-1 a HIV-2), antigeny mykobakterií způsobujících tuberkulózu, antigeny parasitu Plasmodium falciparum a antigeny buněk melanomu.
Pro účely exprese sekvence DNA nebo genu, je nutné, aby byly v DNA přítomné regulační sekvence, které jsou nutné pro transkripci genu. Takové regulační sekvence (zvané promotory) jsou odborníkům v oboru známé a patří mezi ně například tyto sekvence z genu vakcinie o velikosti llkDa, jak jsou popsány v EP-A-198, 328 a sekvence genu o velikosti 7.5 kDa (EP-A-110,385).
Konstrukt DNA může být vnesen do buněk infikovaných MVA transfekcí, například metodou srážení fosforečnanem vápenatým (Graham a kol., Vířil, 52, 456-467 (1973); Wigler a kol., Cell 777-785 (1979) elektroporací (Neumann a kol., EMBO J. 1, 841-845 (1982)), mikroinjekcí (Graessmann a kol., Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), pomocí lipozómů (Straubinger a kol., Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), pomocí sféroplastů (Schaffner, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) nebo jinými metodami známými odborníkům v oboru. Výhodná je transfekce metodou srážení fosforečnanem vápenatým.
-17Následujici detailní příklady jsou určeny pro dokonalejší pochopení tohoto vynálezu. Je však třeba mít na zřeteli, že rozsah vynálezu není těmito příklady nijak omezen.
Popis obrázků
| Obrázek 1: | Schématická mapa genomu MVA a plasmidu pro inzerci cizí DNA homologickou rekombinací: restrikční místa HindlII v genomu MVA jsou uvedena v horní části. Je znázorněn N-fragment HindlII-HindlII o délce 900 párů baží, který překrývá spojení delece II v genomu MVA. Sekvence DNA MVA sousedící s delecí II (bokl a bok2) byly amplifikovány pomocí PCR (polymerasové řetězové reakce) a použity pro konstrukci plasmidu pro inzerci pUC II LZ. |
| Obrázek 2: | pUC II LZ P7.5: Vektorový plasmid MVA pro inzerci do delece II obsahující expresní kazetu Pll-LacZ a raně-pozdní promotor P7.5 viru vaccinie pro expresi požadovaných genů, které mohou být klonovány do místa Smál v plasmidu. |
| Obrázek 3: | pUCII LZdel P7.5: Vektorový plasmid MVA pro inzerci cizích genů do místa delece II v genomu MVA, obsahující autodeleční expresní kazetu PllLacZ a raně-pozdní promotor P7.5 viru vakcinie pro expresi požadovaných genů, který může být klonován do klonovacího místa Smál/Not1 v plasmidu. |
| Obrázek 4: | Konstrukce rekombinantního viru MVA.T7pol: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindlII) a vektorový plasmid pUC II LZ T7pol, který umožňuje inzerci genu T7 RNA polymerázy do místa delece II v N-fragmentu HindlII genomu MVA. |
| Obrázek 5: | Analýza MVA-T7pol virové DNA Southernovým přenosem |
····
-19Obrázek 6:
Obrázek 7:
Obrázek 8:
Obrázek 9:
Metabolické značeni proteinů za použití [35S]methioninu, analýzy SDS PAGE. Pruh 1: MVA T7pol, pruh 2: MVA, pruh 3: buňky CV-1.
Test CAT: buňky CV-1 transfektované plasmidem obsahujícím gen CAT pod regulací promotoru T7 RNApolymerázy a infikované MVA-T/pol nebo WR-T7pol. U lyzátů byla testována aktivita CAT. C znamená chloramfenikol a 1-AcC a 3-AcC znamená mono- a triacetylované formy chloramfenikolu. Aktivita Cat je vyjádřena jako procentuální podíl acetylovaného produktu tvořeného za 60 min.
Konstrukce MVA-LAInef: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindlII) a vektorový plasmid pUC II LZdel P7.5-LAInef, který umožňuje inzerci genu nef HIV-1 LAI do místa delece II v N-fragmentu Hind III genomu MVA.
Konstrukce MVA-TYR: schématické mapy genomu MVA (místa restrikční endonukleázy HindlII) a vektorový plasmid pUC II LZdel P7.5-TYR, který umožňuje inzerci genu lidské tyrosinázy do místa delece II v N-fragmentu Hind III genomu MVA.
»···
Příklady provedeni vynálezu
1. Množeni a purifikace virů
1.1 Množení viru MVA
Virus MVA je vakciniový virus o vysokém zeslabení, odvozený z vakciniového virového kmene Ankara (CVA) dlouhodobým průchodem fibroblastovými kulturami primárního kuřecího embrya (CEF). Obecný přehled o historii jeho přípravy, o vlastnostech a použití kmene MVA je podán v publikaci Mayr a kol., Infection 3, 6-14 (1975). Vzhledem k vysokému stupni zeslabení v CEF je virus MVA replikován s vysokým titrem v těchto ptačích hostitelských buňkách. V samčích buňkách je však množení MVA podstatně omezené a nelze zaznamenat tvorbu plaků typických pro virus. Proto byl virus MVA množen v buňkách CEF. Za účelem přípravy buněk CEF jsou 11 dnů stará embrya izolována z inkubovaných kuřecích vajec, vedlejší složky jsou odstraněny, embrya jsou rozdrcena a disociována v roztoku 0.25%ního trypsinu při 37°C po dobu 20 minut. Výsledná buněčná suspenze je filtrována a buňky jsou sedimentovány centrifugací při 2000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při pokojové teplotě po dobu 5 minut, resuspendovány v 10 objemech média A (MEM Eagle, například dostupné z Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany) a znovu sedimentovány centrifugací při 2000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Buněčná peleta je rekonstituována v médiu A obsahujícím 10%ní fetální telecí sérum (FCS), penicilín (100 jednotek/ml), streptomycin (100 mg/ml) a 2 mM glutamin s výsledným vytvořením buněčné suspenze obsahující 500 000 buněk/ml. Buňky CEF získané tímto způsobem byly rozetřeny na kultivačních miskách. Poté byly ponechány v médiu A v inkubátoru s CO2 při 37°C po dobu 1-2 dnů, podle požadované buněčné hustoty a dále byly použity pro infekci buďto přímo nebo po následujícím průchodu buňkami. Detailní popis přípravy primárních kultur lze nalézt v knize R.I. Freshneyho, „Kultivace
| • 4·· | • | • *4 ·· · 4 | ||
| 4 4 | • 9 4 | 44 • 4 | 4*4* 4 | |
| 4 | • · | * 4 | 4 | |
| » · | * | • · · | Η» | • |
| • 4 | *44 | 4 | 4 | |
| • 4 | 4 |
zvířecích buněk, Alan R. Liss Verlag, New York (1983), kapitola 11, str. 99.
Viry MVA byly použity pro infekci podle následujícího. Buňky CEF byly kultivovány v kultivačních nádobách o ploše 175 cm2. Při 90 až 100%ní konfluenci bylo médium odstraněno a buňky byly inkubovány po dobu jedné hodiny se suspenzí viru MVA (0.01 infekčních jednotek (IU) na buňku, 0.02 ml/cm2) v médiu A. Poté bylo přidáno více média A (0.2 ml/cm2) a nádoby byly inkubovány při 37°C po dobu 2 až 3 dnů (dokud přibližně 90% buněk nezačalo vykazovat cytopatogenní efekt). Hrubé virové zásobní ekvivalenty byly připraveny setřením vrstev do média a peletizací buněčného materiálu centrifugací při 3000 ot/min v centrifuze Sorvall RC-3B při 4°C po dobu 5 minut. Hrubý virový přípravek byl uložen do -20°C pro další zpracování (např. purifikaci viru).
1.2 Purifikace virů
Purifikační postup pro získání virového preparátu o pokud možno nejvyšší čistotě a zbaveného složek specifických pro hostitelskou buňku je podobný postupu popsanému autorem Joklik (Virology 18, 9-18(1962)). Hrubé virové zásobní preparáty, uložené při -20°C byly rozmraženy a suspendovány jednou v PBS (v deseti až dvaceti násobném objemu) a suspenze byla odstředěna jak je popsáno výše. Nový sediment byl suspendován v 10 objemech v pufru Tris 1 (lOmM Tris-HCl, pH 9.0) a suspenze byla krátce vystavena ultrazvuku (Labsonic L, B.Braun Biotech International, Melsungen Germany; 2' x 10 sekund při 60 wattech a při pokojové teplotě) za účelem další dezintegrace buněčných zbytků a uvolnění virových částic z buněčného materiálu. Buněčná jádra a větší buněčné zbytky byly odstraněny během následné krátké centrifugace suspenze (rotor Sorvall GSA dodaný firmou DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minuty při 3000 ot/min při 10°C) . Sediment byl znovu resuspendován v bufru Tris 1, vystaven ultrazvuku a centrifugován jak uvedeno výše. Supernatanty obsahující volné virové částice byly spojeny a rozlity na podkladnou vrstvu z 10 ml 36%ní sacharózy v 10 mM Tris-22···· • 4 • · • · • 4 • · ··· 4«·φ • · ··· ····
HC1, pH 9.0 a centrifugovány v rotoru Beckman SW 27/SW 28 po dobu 80 minut, při 13 500 ot/min a při 4°C. Supernatant byl odstraněn a sediment obsahující virové částice byl přenesen do 10 ml lmM TrisHC1, pH 9.0, homogenizován krátkým vystavením ultrazvuku (2 x 10 sekund při pokojové teplotě, zařízení stejné jako výše uvedené) a přenesen do 20 až 40%ního gradientu sacharózy (sacharóza v 1 mM Tris-HCl, pH 9.0) pro další purifikaci. Gradient byl centrifugován v rotoru Beckman SW41 při 13000 ot/min po dobu 50 minut a při 4°C. Po centrifugaci byly jednotlivé rozlišené frakce obsahující virové částice shromážděny pipetovánim po odsátí objemů nad frakcemi. Získaný roztok sacharózy byl naředěn třemi objemy PBS a virové částice byly znovu sedimentovány centrifugaci (Beckmann SW 27/28, 60 minut při 13 500 ot/min a 4°C) . Peleta, která v tomto kroku obsahovala většinou čisté vírové částice byla resuspendována v PBS a upravena do koncentrace virů odpovídající v průměru 1 až 5 x 109 IU/ml. Purifikovaný virový zásobní roztok byl uložen do -80°C a použit buďto přímo nebo naředěný roztokem PBS pro další experimenty.
1.3 Klonování viru MVA
Pro získání homogenních zásobních virových preparátů, virus MVA, získaný od prof. Antona Mayra, byl klonován limitujícím ředěním během třech následných průchodů přes CEF kultivovaných na tkáňových kultivačních miskách o 96 mikromiskách. Klon viru MVA F6 byl vybrán a rozmnožen v CEF za účelem získání pracovních roztoků, které sloužily jako zahajovací materiál pro generování rekombinantních virů MVA popsaných v této patentové publikaci i pro generování rekombinantních virů MVA popsaných dříve (Sutter,
G. a Moss, B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10847 - 10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994)) Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. a Lifson, J. (1996) J. Virol. 70, 3741-3752).
-232. Konstrukce a charakterizace rekombinantnich virů MVA
2.1 Konstrukce vektorových plasmidů
Nové vektorové plasmidy byly vytvořeny pro umožnění generování rekombinantnich virů MVA. Inzerce cizích genů byla cílena přesně do místa přirozené delece II v genomu MVA. Sekvence DNA MVA ohraničující místo delece o délce 2500 párů bází Nfragmentu HindlII genomu MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. a Aletnburger, J. (1989), J. Arch. Virol. 105, 15-27) byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány do vícenásobného klonovacího místa plasmidů pUC18. Primery pro levý bok o délce 600 párů bázi DNA byly tyto: 5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' a 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (místa restrikčních enzymů KpnI a Smál jsou podtržena). Primery pro pravý bok o délce 550 párů bází DNA byly tyto: 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' A 5'-CAG CAG GCA TGC CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3' (místa restrikčních enzymů Pst I a Sphl jsou podtržena). Mezi tyto boky DNA MVA, inzertované do pUC18, byl inzertován gen Eschericia coli lacZ pod regulací pozdního promotoru Pil vakciniového viru (připravený restrikčním štěpením z plil LZ, Sutter, G. a Moss, B. (1992) PNAS USA 89, 10847-10851), s použitím místa BamHI, pro generování vektoru pUCII LZ (Obrázek 1) pro inzerci MVA. Dále, fragment o délce 289 párů bází obsahující raně-pozdní promotor P7.5 vakciniového viru spolu s místem Smál pro klonování (připravený restrikčním štěpením s EcoRI a Xbal z plasmidového vektoru pSCll (Chakrabati a kol·., 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409)) byl inzertován do místa Smál v pUCII LZ za vzniku MVA vektoru pUCII LZ P7,5 (Obrázek 2). Pro konstrukci vektorového plasmidů, který umožňuje izolaci rekombinantnich virů MVA pomocí přechodné syntézy reportérového enzymu β-galaktosidázy, DNA fragment o 330 párech bází z 3'-terminálu otevřeného čtecího rámce E.coli LacZ byl amplifikován pomocí PCR (primery byly: 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' a 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC
-24·♦· ·
• ·· ·
GCT CAG-3') a klonován do míst Sáli a Pstl v pUC II LZ P7.5 pro vytvoření MVA vektoru pUC II LZdel P7.5 (Obrázek 3). S použitím místa Smál může být tento vektorový plasmid použit pro inzerci sekvencí DNA kódující cizí gen regulací promotoru P7.5 vakciniového viru do genomu MVA. Po izolaci požadovaného rekombinantního viru screeningem exprese β-galaktosidázové aktivity, další propagace rekombinantního viru vede k auto-deleci expresní kazety Pll-iacJ.
2.2 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA T7pol
Fragment DNA o 3.1 tisíc párů bází obsahující úplný gen bakteriofágu T7 RNA polymerázy pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 vaccinia viru byl vyštěpen pomocí EcoRI z plasmidu pTF7-3 (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. a Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122-8126), modifikován inkubací s Klenow DNA polymerázou s cílem vytvoření tupých konců a klonován do jediného restrikčního místa Smál v pUCII LZ pro vytvoření plasmidového přenosného vektoru pUCII LZ T7pol (Obrázek 4). Jako regulátor transkripce pro expresi genu T7 RNA polymerázy byl vybrán raněpozdní promotor P7.5 vakciniového viru. Na rozdíl od silnějšího promotoru vakciniového viru (např. Pil), tento promotorový systém umožňuje expresi rekombinantních genů okamžitě po infekci cílových buněk. Plasmid pUCII LZ T7pol, který řídí inzerci cizích genů do místa delece II v genomu MVA, byl použit pro vytvoření rekombinantního viru MVA T7pol.
Buňky infikované MVA při četnosti 0.05 TCID50 na buňku byly transfektovány DNA plasmidu pUCII LZpol popsaného dříve (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Rekombinantní virus MVA produkující T7 RNA polymerázu a zároveň β-D-galaktosidázu (MVA P7.5-T7pol) byl vybrán během pěti konsekutivních cyklů plakové purifikace v buňkách CEF obarvených
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázou (300 gg/ml). Rekombinantní viry byly následně amplifikovány infekcí vrstvy CEF a DNA byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů. Analýza virové DNA MVA-25- • · · · · ·· ··· ·······
T7pol pomocí Southernového přenosu prokázala stabilní integraci rekombinantních genů v místě delece II v genomu MVA (Obrázek 5).
Pro monitorování exprese T7 RNA polymerázy prostřednictvím rekombinantního MVA T7pol byly analyzovány polypeptidy označené (35S) methioninem z kultury infikované virem. Vrstvy tkáňové buněčné linie z opičích ledvin CV-1 kultivované ve 12 mikromiskách byly infikovány virem o četnosti 20 TCID5o na buňku. V čase 3 až 5 hodin po infekci bylo médium odstraněno a kultury byly opláchnuty 1 ml média zbaveného methioninu. Do každé mikromisky bylo přidáno 0.2 ml média zbaveného methioninu a obohaceného 50pCi (35S) methioninu a byla provedena inkubace po dobu 30 min při 37°C. Cytoplasmatické extrakty infikovaných buněk byly připraveny inkubací každé mikromisky v o.2 ml 0.5%ním lytickém bufru Nonidet P-40 po dobu 10 min při 37°C a vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE. Metabolické značení buněk CV-1 s použitím MVA T7pol prokázalo syntézu dvou dalších polypeptidů (i) proteinu o velikosti přibližně 116 000 Da představujícího β-galaktosidázu z E.coli produkovanou pro umožnění screeníngu rekombinantního viru a (ii) proteinu o velikosti 98 000 Da odpovídající bakteriofágové T7 RNA polymeráze (Obrázek 6). Pozoruhodné je vysoké množství βgalaktosidázy produkované přes MVA T7pol. Výsledky získané z experimentů založených na značení in vivo demonstrují velmi silnou expresi genetické konstrukce Pll-LacZ při inzerci do MVA genomu v místě delece II, což indikuje, že exprese rekombinantních genů vektorových virů MVA může být účinnější, jsou-li inzertovány do tohoto místa v genomu MVA.
Užitečnost rekombinantních virů MVA-T7pol jako expresního systému v porovnání s WR-T7pol rekombinantním virem vTF7-3 (Fuerst a kol., 1986) byla testována kotransfekcí DNA plasmidového vektoru odvozeného od pTMl (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., a Fuerst T.R. (1990) Nátuře 348, 91-92) a obsahujícího (klonovaný do míst Ncol a BamHI násobného klonovacího místa v pTMl) gen E. coli chloramfenikol acetyltransferázy (CAT) pod regulací promotoru T7 RNA polymerázy (PT7) . Transfektované a infikované buňky CV-1 byly suspendované v 0.2 ml 0.25 M Tris-HCl (pH 7.5). Po třech cyklech zmrazování a roztávání lyzáty byly
-26vyčištěny centrifugací, byl určen proteinový obsah supernatantu a vzorky obsahující 0.5, 0.25 a 0.1 celkového proteinu byly testovány pro enzymatickou aktivitu jak je popsáno v Mackett, M., Smith, G.L. a Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864. Po autoradiografii byly označené body kvantifikovány s použitím systému pro imaginativní analýzu Fu j i. Výsledky demonstrují, že s použitím vysoce zeslabeného vakciniového vektoru MVA je možné využít systém vakciniový virus-T7 RNA polymerázy stejně tak účinně, jako při použití rekombinantu kompetentního vaccinia viru s plnou replikací (Obrázek 7).
2.3 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA-LAInef
Fragment DNA o 648 párech bází obsahující celý gen nef z HIV1 LAI byl připraven pomocí PCR z plasmidové DNA (pTG1166 laskavě poskytnuté panem M.P. Kieny, Transgene S.A., Strasbourg; PCR primery byly tyto: 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' a 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), poté štěpený restrikční endonukleázou BamHI, modifikován inkubací s Klenow DNA polymerázou pro vytvoření rovných konců a klonován do Smál místa v pUC II LZdel P7.5 pro vytvoření vektoru pUC II LZdel P7.5-LAInef (Obrázek 8). Tento plasmid lze použít pro modifikování rekombinantního viru MVA, který umožňuje expresi genu nef z HIV-1 LAI pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 vakciniového viru.
Buňky CEF infikované MVA o četnosti 0.05 TCID50 na buňku byly transfektovány DNA plasmidu pUC II LZdel P7.5.LAInef popsaným dříve (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Rekombinantní viry MVA obsahující gen nef a přechodně umožňující expresi markerového genu E. coli LacZ byly vybrány konsekutivními cykly plakové purifikace v buňkách CEF, obarvených 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dgalaktosidázou (300 gg/ml). Dále, rekombinantní viry MVA obsahující gen nef a neobsahující markerový gen LacZ (deletovaný) byly vybrány během tří konsekutivních cyklů plakového purifikačního screeningu nebarvících virových foci v buňkách CEF
-27• · • · · « • · · · · (300 za přítomnosti 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázy gg/ml). Dále, rekombinantní viry byly amplifikovány infekcí CEF a virová DNA MVA-LAInef byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů Analýza Southernovým přenosem virové DNA potvrdila genetickou stabilitu MVA-LAInef a přesně prokázala integraci genu nef a deleci markerového genu E.coli LacZ v místě delece II v genomu viru.
Účinná exprese rekombinantního proteinu Nef byla potvrzena analýzou Westernovým přenosem proteinových lyzátů z buněk CEF infikovaných MVA-LAInef s použitím myších monoklonálních protilátek řízených proti HIV-1 Nef (laskavě poskytnutým panem K. Krohnem a použitým jak je popsáno v Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Táhtinen, M., Jung, G., a Krohn, K. (1992) AIDS 6, 25-34).
2.4 Konstrukce a charakterizace rekombinantního viru MVA-hTYR
DNA fragment o délce 1.9 tisíc bází obsahující úplný gen kódující lidskou tyrosinázu (klon tyrosinázy c-DNA 123.B2 izolovaný z buněčné linie melanoma SK2 9-MEL z pacienta SK29 (AV) , GenBank Acc.no.U01873; Brichard, V., Van Pel, A., Wólfel, T., Wólfel, C., De Plaen, E., Léthé, B., Coulie, P. a Boon, B. (1993), J. Exp. Med.178, 489-495) byl připraven z plasmidu pcDNAI/Amp.Tyr (Wólfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Bůschenfelde, K. a Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759-764) štěpením enzymem EcoRI, modifikován inkubaci s Klenow DNA polymerázou pro vytvoření rovných konců a klonován do místa Smál v pUC II LZdel P7.5 pro vytvoření vektoru pUC II LZdel P7.5TYR (Obrázek 9) . Tento plasmid lze dále použít pro genetickou modifikaci rekombinantního viru MVA, který umožňuje expresi genu lidské tyrosinázy pod regulací raně-pozdního promotoru P7.5 vaccinia viru.
Buňky CEF infikované s MVA při četnosti 0.05 TCID50 na buňku byly transfektovány s DNA plasmidu pUC II LZdel P7.5-TYR popsaným dříve (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. a Moss, B.
vrstev
• · · ♦ · • ♦ · · · · · • · · · ······· ·· · (1994) Vaccine 12, 1032-1040). Rekombinantní MVA virus umožňující stabilní expresi genu lidské tyrosinázy a přechodnou koexpresi genu E.coli LacZ byl vybrán selekcí během konsekutivních cyklů plakové purifikace v buňkách CEF barvených 5-bromo-4-chloro-3indolyl β-D-galaktosidázou (300 μΐ/ml). Dále, rekombinantní virus MVA umožňující expresi genu lidské tyrosinázy a mající deletovaný markerový gen LacZ byl selektivně izolován během tří dalších konsekutivních cyklů plakového purifikačního screeningu nezbarvených vírových foci v buňkách CEF za přítomnosti 5-bromo-4chloro-3-indolyl β-D-galaktosidázy (300 μΐ/ml). Dále, rekombinantní víry byly amplifikovány infekcí vrstev buněk CEF a virová DNA MVA-hTYR byla analyzována pomocí PCR pro potvrzení genetické homogenity uložených virových preparátů. Analýza Southernovým přenosem virové DNA potvrdila genetickou stabilitu MVA-hTYR a přesně demonstrovala integraci rekombinantního genu tyrosinázy a deleci markerového genu E.coli LacZ v místě delece II v genomu viru.
Účinná exprese rekombinantní lidské tyrosinázy byla potvrzena analýzou Westernovým přenosem proteinových lyzátů z buněk CEF infikovaných MVA-hTYR s použitím zaječích polyklonálních protilátek (laskavě poskytnutých V. Hearingem a použitých jak je popsáno v Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. a Hearing, V. (1988) P.N.A.S. USA 85, 3830-3834) nebo myších monoklonálních protilátek (laskavě poskytnutých L. Oldem a použitých jak je popsáno v Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. a Old, L. (1995) P.N.A.S. USA 92, 8125-8129) řízených proti tyrosináze.
-29• · · · • · · ·
SEZNAM SEKVENCÍ
Informace k sekvenci č. 1:
(i) Charakteristika sekvence:
| (A) | délka: 33 párů bázi | ||
| (B) | typ: nukleová kyselina | ||
| (C) | řetězec: | jednořetězcová | |
| (0) | topologie: | : lineární | |
| ) Typ molekuly: | : jiná nukleová | kyselina | |
| (A) | popis: | /desc = „DNA-primer |
(xi) Popis sekvence: Sek. č.: 1:
CAGCAGGGTA CCCTCATCGT AGAGGACGTT CTC
Informace k sekvenci č. 2:
(i) Charakteristika sekvence:
| (A) | délka: 42 | párů bázi |
| (B) | typ: nukleová kyselina | |
| (C) | řetězec: | jednořetězcová |
| (D) | topologie: | lineární |
(ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 2:
-30CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAATAA CA
Informace k sekvenci č. : 3:
(i) Charakteristika sekvence:
| (A) | délka: 36 párů bází | |
| (B) | typ: nukleová kyselina | |
| (C) | řetězec: | jednořetězcová |
| (D) | topologie: | lineární |
| ) Typ | i molekuly: | jiná nukleová kyselina |
| (A) | popis: | /desc = „DNA-primer |
(xi) Popis sekvence: Sek. č.: 3:
CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC
Informace k sekvenci č. : 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 36 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer *··· • ·· · (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 4:
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA
Informace k sekvenci č. : 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc = „DNA-primer (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 5:
CAGCAGGTCG ACCCGACCG CCTTACTGCC GCC
Informace k sekvenci č. : 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: /desc=DNA-primer (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 6:
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG
Informace k sekvenci č. : 7:
(i) Charakteristika sekvence:
| (A) | délka: 39 | párů bází |
| (B) | typ: nukl | eová kyselina |
| (C) | řetězec: | jednořetězcová |
| (D) | topologie: | lineární |
(ii) Typ molekuly:
jiná nukleová kyselina (A) popis:
/desc=DNA-primer (xi) Popis sekvence: Sek. č.: 7:
CAGCACCCAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT
Informace k sekvenci č. : 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: desc = „DNA-primer
Claims (28)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Rekombinantní virus MVA, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa přirozeně se vyskytující delece v genomu MVA a je schopen exprese tohoto alespoň jednoho cizího genu.
- 2. Rekombinantní virus MVA podle nároku 1, vyznačující se t i m, že obsahuje alespoň jeden cizí gen inzertovaný do místa delece II v genomu MVA a je schopen exprese tohoto alespoň jednoho cizího genu.
- 3. Rekombinantní virus MVA podle nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že cizí gen kóduje markér, terapeutické činidlo nebo antigenní determinant.
- 4. Rekombinantní virus MVA podle nároku 3, vyznačuj i ci se tím, že cizí gen kóduje antigenní determinant z patogenního viru, baktérie nebo z jiného mikroorganismu nebo z parazita nebo z nádorové buňky.
- 5. Rekombinantní virus MVA podle nároku 4, vyznačuj i ci se tím, že cizí gen kóduje antigenní determinant z Plasmodium Falciparum, Mykobaktérie, virusu Herpes, chřipkového virusu, hepatitis nebo z virusů deficitu lidské imunity.
- 6. Rekombinantní virus MVA podle nároků 4a5, vyznačující se tím, že antigenním determinantem je HIV nef nebo liská tyrosináza.
- 7. Rekombinantní virus MVA podle nároku 6, vyznačuj Ιοί se t i m , že jím je MVA-LAInef nebo MVA-hTYR.
- 8. Rekombinantní virus MVA podle nároků laž2, vyznačující se tím, že cizí gen kóduje T7 RNA polymerázu.
- 9. Rekombinantni virus MVA podle nároku 8, vyznačuj Ιοί se tím, že jím. je MVA-T7pol.
- 10. Rekombinantni virus MVA podle nároků laž 9, vyznačující se tím, že cizí gen je pod transkripční regulací raně-pozdního promotoru P7.5 viru vakcinie.
- 11. Rekombinantni viry MVA podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že v podstatě neobsahují viry schopné replikace v lidských buňkách.
- 12. Použití rekombinantního viru MVA podle nároků 8 až 9 pro transkripci sekvencí DNA pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
- 13. Eukaryotní buňka, vyznačující se tím, že je infikovaná rekombinantním virem MVA podle libovolného z nároků 1 až 11.
- 14. Buňka podle nároku 13, vyznačující se tím, že je infikovaná rekombinantním virem MVA podle nároků 8 až 9.
- 15. Buňka podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje jeden nebo více expresních vektorů nesoucích jeden nebo více cizích genů pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
- 16. Použití buněk podle nároku 15 pro produkci polypeptidů kódovaných uvedenými cizími geny, které zahrnujea) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, ab) izolaci polypeptidů kódovaných uvedenými cizími geny.
- 17. Buňka podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje expresní vektory nesoucí virové geny nebo/a virový vektorový konstrukt kódující genom virového vektoru pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.-36• · · ·
- 18. Použiti buněk podle nároku 17 pro produkci virových částic, které zahrnujea) kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, ab) izolaci virových částic.
- 19. Buňka podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahujea) expresní vektor nesoucí retrovirový vektorový konstrukt schopný infikovat a řídit expresi jednoho nebo více cizích genů nesených uvedeným retrovirovým vektorovým konstruktem v cílových buňkách, ab) jeden nebo více expresních vektorů nesoucích geny kódující polypeptidy nutné pro sbalení genomu uvedeného retrovirového vektorového konstruktu pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy.
- 20. Použití buněk podle nároku 19 pro produkci retrovirových částic, které zahrnujea) . kultivaci uvedených buněk za vhodných podmínek, ab) izolaci retrovirových částic.
- 21. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní virus MVA podle nároků 3 až 7 ve fyziologicky přijatelném nosiči.
- 22. Použití rekombinantního viru MVA podle nároků 3 až 7 pro přípravu vakcíny.
- 23. Použití vakcíny podle nároku 21 pro imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského těla, které zahrnuje inokulací uvedeného živého zvířecího těla, včetně lidského, vakcínou.
- 24. Použití vakcíny podle nároku 21 obsahující MVA-LAInef pro prevenci nebo léčbu infekce HIV nebo AIDS.
- 25. Použiti vakcíny podle nároku 21 obsahující MVA-hTYR pro prevenci nebo léčbu melanomů.
- 26. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje jako první složku rekombinantní virus MVA podle nároků 8 až 9 ve fyziologicky přijatelném nosiči a jako druhou složku sekvenci DNA nesoucí antigenní determinant pod transkripční regulací promotoru T7 RNA polymerázy ve fyziologicky přijatelném nosiči, přičemž tyto dvě složky jsou přítomny buďto zároveň nebo každá zvlášť.
- 27. Použití vakcíny podle nároku 26 pro imunizaci živého zvířecího těla, včetně lidského, které zahrnuje inokulaci uvedeného živého zvířecího těla, včetně lidského, první a druhou složkou vakcíny buďto zároveň nebo s časovou prodlevou, ale s použitím stejného inokulačního místa.
- 28. Použití rekombinantního virusu MVA podle nároků 8 až 9 pro přípravu vakcíny podle nároku 26.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK78295 | 1995-07-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ424197A3 true CZ424197A3 (cs) | 1998-03-18 |
| CZ292460B6 CZ292460B6 (cs) | 2003-09-17 |
Family
ID=8097499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19974241A CZ292460B6 (cs) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Rekombinantní viry MVA, jejich použití, buňky jimi infikované a vakcíny, které je obsahují |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6440422B1 (cs) |
| EP (3) | EP1312679B8 (cs) |
| JP (3) | JP4312260B2 (cs) |
| KR (1) | KR19990028617A (cs) |
| CN (3) | CN1782071A (cs) |
| AT (3) | ATE239796T1 (cs) |
| AU (1) | AU721735B2 (cs) |
| BR (1) | BR9609303B8 (cs) |
| CA (3) | CA2596274C (cs) |
| CZ (1) | CZ292460B6 (cs) |
| DE (3) | DE69635172T2 (cs) |
| DK (3) | DK1312679T3 (cs) |
| EE (3) | EE04199B1 (cs) |
| ES (3) | ES2199294T3 (cs) |
| HK (2) | HK1009830A1 (cs) |
| HU (2) | HU224061B1 (cs) |
| IL (5) | IL122120A (cs) |
| MX (1) | MX9800025A (cs) |
| NO (1) | NO322476B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ313597A (cs) |
| PL (1) | PL186857B1 (cs) |
| PT (1) | PT836648E (cs) |
| RU (1) | RU2198217C2 (cs) |
| SI (3) | SI0836648T1 (cs) |
| TW (2) | TW575664B (cs) |
| UA (3) | UA68327C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997002355A1 (cs) |
Families Citing this family (119)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| US7118754B1 (en) * | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
| EP0951555A2 (en) * | 1996-09-24 | 1999-10-27 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| MY119381A (en) * | 1996-12-24 | 2005-05-31 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Recombinant mva virus, and the use thereof |
| US6969609B1 (en) | 1998-12-09 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces | Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| FR2784997A1 (fr) * | 1998-10-22 | 2000-04-28 | Transgene Sa | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| ATE412762T1 (de) | 1999-05-28 | 2008-11-15 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Vektor zur integration von heterologen sequenzen in poxvirusgenomen |
| US20150231227A1 (en) * | 2000-03-02 | 2015-08-20 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
| EE05633B1 (et) | 2000-03-14 | 2013-02-15 | Mayr Anton | Muundatud vaktsiiniaviirus Ankara (MVA), sellega nakatatud peremeesrakk ning seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon, MVA valmistamine ja raviotstarbeline kasutamine |
| DE10042598A1 (de) * | 2000-08-30 | 2002-03-28 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS |
| AU2002211654A1 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-22 | Genstar Therapeutics | Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| AU2002231639B2 (en) | 2000-11-23 | 2007-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant |
| US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| DE10143490C2 (de) * | 2001-09-05 | 2003-12-11 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen |
| DE10144664B4 (de) * | 2001-09-11 | 2005-06-09 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon |
| CA2466413C (en) | 2001-12-04 | 2014-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus ns1 subunit vaccine |
| EA006485B1 (ru) * | 2001-12-20 | 2005-12-29 | Бавариан Нордик А/С | Способ выделения и очистки поксвирусов из инфицированных клеток |
| EA011233B1 (ru) * | 2002-04-19 | 2009-02-27 | Бавариан Нордик А/С | Применение модифицированного вируса осповакцины анкара для вакцинации новорожденных |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| SI1407033T1 (sl) | 2002-05-16 | 2006-06-30 | Bavarian Nordic As | Intergenske regije kot insercijska mesta v genomumodificiranega virusavakcinije Ankara (MVA) |
| ES2256747T3 (es) * | 2002-05-16 | 2006-07-16 | Bavarian Nordic A/S | Expresion de genes en el virus de la vacuna modificado, usando el promotor ati de la viruela de la vaca. |
| NZ538575A (en) | 2002-09-05 | 2007-03-30 | Bavarian Nordic As | Method for the amplification of a virus wherein primary avian cells are cultivated in a serum-free medium comprising growth factors and attachment factors |
| DE10249390A1 (de) * | 2002-10-23 | 2004-05-13 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria |
| AU2003293675B2 (en) | 2002-11-25 | 2009-04-23 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant poxvirus comprising at least two cowpox ATI promoters |
| DE602004015418D1 (de) * | 2003-02-18 | 2008-09-11 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Rekombinantes mva und verfahren zur erzeugung davon |
| EP1601333B1 (en) * | 2003-02-20 | 2013-01-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Novel insertion sites in pox vectors |
| US7731974B2 (en) | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
| NZ542902A (en) | 2003-03-27 | 2007-06-29 | Ottawa Health Research Inst | Mutant vesicular stomatitis viruses and use thereof |
| US7163685B2 (en) * | 2003-04-16 | 2007-01-16 | City Of Hope | Human cytomegalovirus antigens expressed in MVA and methods of use |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| ES2359473T3 (es) | 2003-07-21 | 2011-05-23 | Transgene S.A. | Citoquinas multifuncionales. |
| WO2005017208A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | George Mason Intellectual Properties, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing hiv infection |
| EP1518932A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-30 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof |
| DK1845164T3 (da) | 2003-11-24 | 2010-09-20 | Bavarian Nordic As | Promoterer til ekspression i modificeret vacciniavirus ankara |
| US7638132B2 (en) | 2003-12-05 | 2009-12-29 | National University Corporation Hokkaido University | Highly safe smallpox vaccine virus and vaccinia virus vector |
| EP1683870A1 (en) * | 2005-01-24 | 2006-07-26 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vaccines based on the use of MVA |
| WO2006113927A2 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | University Of Washington | Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same |
| US20090060947A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-03-05 | Sanofi Pasteur, Inc. | Immunological compositions |
| NZ573437A (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-24 | Transgene Sa | Process for producing poxviruses and poxvirus compositions |
| US7972605B2 (en) * | 2006-09-08 | 2011-07-05 | Duke University | Modified vaccinia ankara virus vaccine |
| EP2839837B1 (en) * | 2006-09-15 | 2019-05-08 | Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Oncolytic farmington rhabdovirus |
| EP2596801B1 (en) | 2006-10-06 | 2018-05-02 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia ankara virus encoding a her-2 antigen for use in treating cancer |
| US20080241139A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-10-02 | Regents Of The University Of Colorado | Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity |
| US8557764B2 (en) * | 2007-01-26 | 2013-10-15 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods of modulating immune function |
| DK2152736T3 (en) | 2007-05-03 | 2017-09-18 | Lysomab Gmbh | Complement factor H-derived short-consensus repeat (SCR) antibody constructs |
| US8003363B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| WO2008138533A1 (en) * | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| US8003364B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography |
| US20100285050A1 (en) * | 2007-10-05 | 2010-11-11 | Isis Innovation Limited | Compositions and Methods |
| BRPI0800485B8 (pt) * | 2008-01-17 | 2021-05-25 | Univ Minas Gerais | vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose |
| BRPI0908474A2 (pt) | 2008-02-12 | 2016-07-26 | Sanofi Pasteur Ltd | métodos de uso de cromatografia de troca de íon e de filtração de gel para purificação de vírus causador da catapora |
| EP2303322A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-04-06 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| US8691502B2 (en) | 2008-10-31 | 2014-04-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| WO2010127115A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) | Modified immunization vectors |
| KR20120052352A (ko) | 2009-08-07 | 2012-05-23 | 트랜스진 에스.에이. | Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물 |
| JP5798124B2 (ja) * | 2009-11-20 | 2015-10-21 | タケダ ワクチン, インコーポレイテッドTakeda Vaccines, Inc. | ワクチン構築物におけるポックスウイルスエレメントに関する免疫原性組成物 |
| US9005632B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-14 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains |
| ES2625406T3 (es) | 2010-03-25 | 2017-07-19 | Oregon Health & Science University | Glicoproteínas de CMV y vectores recombinantes |
| GB201006405D0 (en) * | 2010-04-16 | 2010-06-02 | Isis Innovation | Poxvirus expression system |
| US20110262965A1 (en) * | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture medium comprising small peptides |
| WO2012101509A2 (en) | 2011-01-28 | 2012-08-02 | Sanofi Pasteur Sa | Immunological compositions against hiv |
| WO2012151272A2 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| SI2691530T1 (en) | 2011-06-10 | 2018-08-31 | Oregon Health & Science University | CMV glycoproteins and recombinant vectors |
| CA2841831C (en) * | 2011-08-05 | 2019-12-31 | John Bell | Methods and compositions for production of vaccinia virus |
| US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| JP6495653B2 (ja) * | 2011-09-26 | 2019-04-03 | テラベクティ | レンチウイルスパッケージ化のための非サブタイプｂのｇａｇタンパク質の使用 |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| WO2013083254A1 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
| WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
| TWI638829B (zh) | 2012-07-10 | 2018-10-21 | 法商傳斯堅公司 | 分枝桿菌抗原疫苗 |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| CN109134640A (zh) | 2012-10-23 | 2019-01-04 | 爱默蕾大学 | Gm-csf和il-4轭合物、组合物以及与其相关的方法 |
| US20140286981A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US10765731B2 (en) | 2014-01-09 | 2020-09-08 | Transgene Sa | Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens |
| GB201412494D0 (en) * | 2014-07-14 | 2014-08-27 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | Vector production |
| EA037583B1 (ru) | 2014-09-26 | 2021-04-16 | Бет Изрейэл Диконисс Медикал Сентер, Инк. | Способы и композиции для индукции защитного иммунитета против инфекции вирусом иммунодефицита человека |
| EP3244919A4 (en) | 2015-01-12 | 2018-06-27 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus |
| WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| PT3390430T (pt) | 2015-12-15 | 2019-11-20 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antígenos, vetores, composições para o vírus da imunodeficiência humana e métodos da sua utilização |
| AU2017206102C1 (en) * | 2016-01-08 | 2022-02-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| WO2017136419A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus |
| JP7034080B2 (ja) * | 2016-02-25 | 2022-03-11 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | ヒトｆｌｔ３ｌを発現する組換えｍｖａまたはｍｖａδｅ３ｌおよび固形腫瘍に対する免疫療法薬としてのそれらの使用 |
| CA3023022A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| KR102389489B1 (ko) | 2016-06-16 | 2022-04-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Hiv 백신 제형 |
| US10307477B2 (en) | 2016-09-02 | 2019-06-04 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| BR112019004593A2 (pt) | 2016-09-15 | 2019-07-02 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero |
| WO2018069316A2 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| EP3638302B1 (en) | 2017-06-15 | 2024-03-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Poxvirus vectors encoding hiv antigens, and methods of use thereof |
| KR20240113607A (ko) | 2017-06-21 | 2024-07-22 | 트랜스진 | 개인 맞춤형 백신 |
| WO2019016062A1 (en) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV ENVELOPE PROTEIN MUTATIONS STABILIZING TRIMERIC FORM |
| US20190022212A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human |
| US20190083620A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| EP3973973A1 (en) | 2017-10-31 | 2022-03-30 | KaliVir Immunotherapeutics, Inc. | Platform oncolytic vector for systemic delivery |
| JP7320601B2 (ja) | 2018-09-11 | 2023-08-03 | 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 | 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用 |
| TW202110476A (zh) | 2019-05-22 | 2021-03-16 | 荷蘭商傑森疫苗防護公司 | 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法 |
| JP2022551753A (ja) * | 2019-10-16 | 2022-12-13 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス |
| CA3161633A1 (en) | 2019-11-14 | 2021-05-20 | Aelix Therapeutics, S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| EP3928789A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| WO2021260065A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| BR112023022681A2 (pt) | 2021-04-30 | 2024-01-23 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Vírus oncolíticos para expressão modificada de mhc |
| EP4108257A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| EP4358999A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| WO2023077147A2 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Pellis Therapeutics, Inc. | T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| US20230364227A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Pellis Therapeutics, Inc. | Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination |
| EP4316514A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-07 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE787901A (fr) | 1971-09-11 | 1972-12-18 | Freistaat Bayern Represente Pa | Vaccin antivariolique |
| WO1984002077A1 (en) | 1982-11-30 | 1984-06-07 | Us Health | Process for producing poxvirus recombinants for expression of foreign genes |
| US5679511A (en) * | 1986-10-06 | 1997-10-21 | Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. | CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway |
| CA1341245C (en) * | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US5221610A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-22 | Institut Pasteur | Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection |
| CN1042564A (zh) * | 1988-11-11 | 1990-05-30 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 乙肝疫苗的制备方法及其制品 |
| JPH03271233A (ja) * | 1990-03-19 | 1991-12-03 | Inst Pasteur | ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発 |
| AU2800392A (en) * | 1991-10-28 | 1993-06-07 | Institut Pasteur | Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides |
| ES2151544T3 (es) * | 1992-12-22 | 2001-01-01 | Ludwig Inst Cancer Res | Metodos para la deteccion y el tratamiento de individuos con celulas anormales que expresan antigenos peptidos hla-a2/tirosinasa. |
| US5620886A (en) * | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| CN1055701C (zh) * | 1993-10-19 | 2000-08-23 | 味之素株式会社 | 能诱导对hiv免疫应答的肽及含有该肽的预防、治疗aids的药物 |
| US5676950A (en) * | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
-
1996
- 1996-03-07 UA UA97126424A patent/UA68327C2/uk unknown
- 1996-07-03 SI SI9630623T patent/SI0836648T1/xx unknown
- 1996-07-03 KR KR1019970709939A patent/KR19990028617A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-07-03 EP EP03001379A patent/EP1312679B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630718T patent/SI1312678T1/sl unknown
- 1996-07-03 HU HU9802217A patent/HU224061B1/hu active IP Right Grant
- 1996-07-03 CA CA2596274A patent/CA2596274C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EE EE9700344A patent/EE04199B1/xx unknown
- 1996-07-03 DK DK03001379T patent/DK1312679T3/da active
- 1996-07-03 EP EP96925654A patent/EP0836648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 DK DK03001378T patent/DK1312678T3/da active
- 1996-07-03 CN CNA2005101248556A patent/CN1782071A/zh active Pending
- 1996-07-03 AT AT96925654T patent/ATE239796T1/de active
- 1996-07-03 ES ES96925654T patent/ES2199294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 BR BRPI9609303-0B8A patent/BR9609303B8/pt active IP Right Grant
- 1996-07-03 CA CA2608864A patent/CA2608864C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 RU RU98101904/13A patent/RU2198217C2/ru active
- 1996-07-03 PL PL96324347A patent/PL186857B1/pl unknown
- 1996-07-03 UA UA20031212890A patent/UA75410C2/uk unknown
- 1996-07-03 CA CA002225278A patent/CA2225278C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 HU HU0402350A patent/HU229261B1/hu unknown
- 1996-07-03 EE EEP200300332A patent/EE04753B1/xx unknown
- 1996-07-03 AU AU66110/96A patent/AU721735B2/en not_active Expired
- 1996-07-03 ES ES03001379T patent/ES2249648T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EP EP03001378A patent/EP1312678B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CN CNB961952547A patent/CN1154742C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 WO PCT/EP1996/002926 patent/WO1997002355A1/en active Application Filing
- 1996-07-03 AT AT03001379T patent/ATE304058T1/de active
- 1996-07-03 IL IL12212096A patent/IL122120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 SI SI9630719T patent/SI1312679T1/sl unknown
- 1996-07-03 NZ NZ313597A patent/NZ313597A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 CN CN2004100367144A patent/CN1554764B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 PT PT96925654T patent/PT836648E/pt unknown
- 1996-07-03 CZ CZ19974241A patent/CZ292460B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 DE DE69635172T patent/DE69635172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 DK DK96925654T patent/DK0836648T3/da active
- 1996-07-03 ES ES03001378T patent/ES2249647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 MX MX9800025A patent/MX9800025A/es unknown
- 1996-07-03 EE EEP200300331A patent/EE05138B1/xx unknown
- 1996-07-03 DE DE69628011T patent/DE69628011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 UA UA20031212892A patent/UA75411C2/uk unknown
- 1996-07-03 JP JP50482497A patent/JP4312260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT03001378T patent/ATE304057T1/de active
- 1996-07-03 DE DE69635173T patent/DE69635173T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-31 TW TW085116379A patent/TW575664B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 TW TW092116681A patent/TWI245075B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980026A patent/NO322476B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-02 US US09/002,443 patent/US6440422B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-15 HK HK98110632A patent/HK1009830A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-15 US US10/147,284 patent/US7198934B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-28 IL IL164318A patent/IL164318A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-11 HK HK05100216.3A patent/HK1068015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-19 US US11/523,030 patent/US20070071770A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-19 US US11/522,889 patent/US8153138B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-19 US US11/523,004 patent/US20070071769A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-12 JP JP2007062631A patent/JP4764367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-12 JP JP2007062630A patent/JP4764366B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-12-01 IL IL202448A patent/IL202448A0/en unknown
-
2010
- 2010-06-14 US US12/814,602 patent/US8197825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-05-17 IL IL212933A patent/IL212933A0/en unknown
-
2012
- 2012-05-02 IL IL219528A patent/IL219528A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1312679B1 (en) | Recombinant MVA virus, and the use thereof | |
| US6869793B2 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines | |
| US20040265324A1 (en) | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160703 |