JP2022551753A - レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス - Google Patents

レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス Download PDF

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Abstract

本開示は、ウイルスゲノム中に改変を含み得る改変腫瘍溶解性ウイルスと、タンパク質をコードする外来性核酸を含む組成物を提供する。本明細書で提供される前記ウイルス組成物および方法は、癌の処置のために利用され得る。一実施形態は、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスを提供し、ここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。本発明は例えば、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスであって、前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、ウイルスを提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／９１６，０９５号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に基づく優先権の利益を主張する。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、およびＮＣＢＩアクセッション番号は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、それぞれ具体的および個別に参照により援用されるべきものと示されている場合、およびその全体が記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されている用語と、援用される参考文献で規定されている用語に矛盾がある場合、本開示の定義が優先する。
要旨
一実施形態は、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスを提供し、ここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態において、前記非複製レトロウイルスは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。一実施形態は、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスを提供し、ここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスであり、ここで、前記非複製レトロウイルスは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、またここで、前記非複製レトロウイルスは、腫瘍微小環境において、前記腫瘍溶解性ウイルスが感染した細胞内、および前記腫瘍溶解性ウイルスが感染していない細胞内で、前記非複製レトロウイルスを発現する能力がある。
一実施形態は、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させる腫瘍溶解性ウイルス、ここで、前記非複製レトロウイルスは、非レンチウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、またここで、前記非複製レトロウイルスは、哺乳動物細胞の標的集団における分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染および形質導入する能力がある。一実施形態は、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスを提供し、ここで、前記導入遺伝子は、非複製レトロウイルスのタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む外来性核酸コンストラクトの中にあり、またここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性である。一実施形態は、レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッキングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを含むウイルスを提供し、ここで、前記エンベロープコンストラクト、前記パッケージングコンストラクト、または前記トランスファーコンストラクトの少なくとも１つは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、またここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。
いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクト、前記パッキングコンストラクト、および前記トランスファーコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ウイルスの前記ゲノムの中の異なる位置に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含み、また、前記パッケージングコンストラクトは、レトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子は、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子は、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子は、第１の初期ウイルスプロモーター、第１の初期／後期ウイルスプロモーター、または第１の後期ウイルスプロモーターの制御下にあり；レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子は、第２の初期ウイルスプロモーター、第２の初期／後期ウイルスプロモーター、または第２の後期ウイルスプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、５’末端領域に終止配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、３’末端領域に終止配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、３’末端反復（ＬＴＲ： ３’－ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｇｉｏｎ）領域を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、ハイブリッド５’末端反復（ＬＴＲ： ５’－ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）領域を含む。いくつかの実施形態において、前記ハイブリッド５’末端反復領域は、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記ハイブリッド５’末端反復領域は、ＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域およびウイルスプロモーターを含み、ここで、前記ウイルスプロモーターは、第３の初期ウイルスプロモーター、第３の初期／後期ウイルスプロモーター、または第３の後期ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする前記遺伝子は、前記トランスファーコンストラクトの前記３’末端反復領域の下流に位置する。いくつかの実施形態において、前記自己切断リボザイムは、デルタウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムを含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、５’末端反復領域を含み、ここで、前記第２の初期ウイルスプロモーターは、前記５’末端反復領域に融合されている。
いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、５’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、３’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、３’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記終止配列は、配列番号７に規定されているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルス構造タンパク質は、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質は、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記バクテリオファージは、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、また、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼは、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記バクテリオファージは、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、また、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼは、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される。
一実施形態は、（ｉ）前記ウイルスのゲノム内の第１の位置に挿入されたレトロウイルスエンベロープコンストラクト；および（ｉｉ）前記ウイルスのゲノム内の第２の位置に挿入されたレトロウイルスパッケージングコンストラクトを含むウイルスを提供し、ここで、前記第１の位置と前記第２の位置は、隣接しておらず、ここで、前記エンベロープコンストラクトは、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含み、ここで、前記パッケージングコンストラクトは、レトロウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含み、またここで、前記ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、（ｉｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノム内の第３の位置に挿入されたトランスファーコンストラクトを含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、前記前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムの３’末端の近傍に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子は、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子は、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子は、第１の初期ウイルスプロモーター、第１の初期／後期ウイルスプロモーター、または第１の後期ウイルスプロモーターの制御下にあり；レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子は、第２の初期ウイルスプロモーター、第２の初期／後期ウイルスプロモーター、または第２の後期ウイルスプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、ハイブリッド５’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記ハイブリッド５’末端反復領域は、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記ハイブリッド５’末端反復領域は、ＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域およびウイルスプロモーターを含み、ここで、前記ウイルスプロモーターは、第３の初期ウイルスプロモーター、第３の初期／後期ウイルスプロモーター、または第３の後期ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする前記遺伝子は、前記トランスファーコンストラクトの前記３’末端反復領域の下流に位置する。いくつかの実施形態において、前記自己切断リボザイムは、デルタウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムを含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、５’末端反復領域を含み、ここで、前記第２の初期ウイルスプロモーターは、前記５’末端反復領域に融合されている。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号１に規定されているヌクレオチド配列、または配列番号１として規定されている配列と少なくとも約７０％～少なくとも約９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記核酸は、配列番号２に規定されているヌクレオチド配列、または配列番号２に規定されている配列と少なくとも約７０％～少なくとも約９９％相同なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、３’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、５’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、３’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、３’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記終止配列は、配列番号５に規定されているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の位置と前記第２の位置は、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている。いくつかの実施形態において、前記第１の位置と前記第３の位置は、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている。いくつかの実施形態において、前記第２の位置と前記第３の位置は、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている。いくつかの実施形態において、前記構造タンパク質は、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質は、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む。いくつかの実施形態において、前記エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、複製において、腫瘍選択的である。いくつかの実施形態において、前記非複製レトロウイルスは、腫瘍微小環境の中で選択的に生成される。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、前記第１の初期ウイルスプロモーター、前記第２の初期ウイルスプロモーター、および前記第３の初期ウイルスプロモーター、ここで、前記第１の初期ウイルスプロモーターは、第１のワクシニアウイルス初期プロモーターであり、前記第２の初期ウイルスプロモーターは、第２のワクシニアウイルス初期プロモーターであり、また、前記第３の初期ウイルスプロモーターは、第３のワクシニアウイルス初期プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記第１のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号９に規定されている配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第２のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号１０に規定されている配列を含む。前記第３のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号１１として規定されている配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、ヒトＰＧＫプロモーター（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２および遺伝子ｖａｃｗｒ０３３の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの前記ゲノムは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の欠失を含み、ここで、前記パッケージングコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の位置に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ２０５と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記非レトロウイルスタンパク質は、治療的タンパク質または診断的タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記非レトロウイルスタンパク質は、前記治療的タンパク質を含み、ここで、前記治療的タンパク質は、免疫チェックポイントモジュレーター、抗体またはその部分、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスは、ＨＩＶである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ガンマレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記バクテリオファージは、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、また、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼは、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される。
一実施形態は、癌を処置する方法であって、本開示による腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含み、ここで、前記腫瘍溶解性ウイルスから生成される前記非複製レトロウイルスは、選択的に腫瘍組織を標的にする。いくつかの実施形態において、前記腫瘍組織は、悪性腫瘍組織を含む。一実施形態は、そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させる操作された生産者ウイルスを提供し、ここで、前記操作された生産者ウイルスは、以下の改変、すなわち
ｉ．少なくとも１つのウイルス遺伝子の変異または欠失；
ｉｉ．少なくとも１つの外来性核酸の挿入；
ｉｉｉ．トロピズムの変更；または
ｉｖ．それらの任意の組合せ
の少なくとも１つを含み、
ここで、前記非複製レトロウイルスは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記非複製レンチウイルスは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記生産者ウイルスは、ワクシニアウイルスであり、前記少なくとも１つのウイルス遺伝子は、Ｂ５Ｒ、Ａ５２Ｒ（ＶＡＣＷＲ１７８）、Ｆ１３Ｌ、Ａ３６Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３３Ｒ、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、ＳＰＩ－１、ＳＰＩ－２、Ｂ１５Ｒ、ＶＧＦ、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｃ１２Ｌ、ＴＫ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの外来性核酸は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、代謝調節タンパク質、サイトカイン、上記の任意の組合せを含む融合タンパク質、およびその機能ドメインまたはフラグメントもしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの外来性核酸は、ＰＩＡＳ３をコードする。
いくつかの実施形態において、前記生産者ウイルスは、レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッケージングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを含み、ここで、前記エンベロープコンストラクト、前記パッキングコンストラクト、および前記トランスファーコンストラクトは、前記生産者ウイルスの前記ゲノムの中の異なる位置に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含み、また、前記パッケージングコンストラクトは、レトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子は、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子は、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、５’末端領域に終止配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、３’末端領域に終止配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、ハイブリッド５’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記ハイブリッド５’末端反復領域は、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、５’末端反復領域を含み、ここで、前記第２の初期ウイルスプロモーターは、前記５’末端反復領域に融合されている。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、５’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、３’末端領域に終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、終止配列を含む。いくつかの実施形態において、前記終止配列は、配列番号７に規定されているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルス構造タンパク質は、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質は、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記生産者ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。
いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、第１の初期ワクシニアプロモーターを含み、前記パッケージングコンストラクトは、第２の初期ワクシニアプロモーターを含み、また、前記トランスファーコンストラクトは、第３の初期ワクシニアプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号９に規定されている配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第２のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号１０に規定されている配列を含む。前記第３のワクシニアウイルス初期プロモーターは、配列番号１１として規定されている配列を含む。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、ヒトＰＧＫプロモーター（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態において、前記エンベロープコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２および遺伝子ｖａｃｗｒ０３３の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記パッケージングコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの前記ゲノムは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の欠失を含み、ここで、前記パッケージングコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の位置に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記トランスファーコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ２０５と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６の間に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記非レトロウイルスタンパク質は、治療的タンパク質または診断的タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、前記非レトロウイルスタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含み、ここで、前記非レトロウイルスタンパク質は、前記治療的タンパク質を含み、またここで、前記治療的タンパク質は、免疫チェックポイントモジュレーター、抗体またはその部分、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスは、ＨＩＶである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ガンマレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）である。
一実施形態は、癌を処置する方法を提供し、前記方法は、本開示による操作された生産者ウイルスを対象に投与することを含み、ここで、前記操作された生産者ウイルスから生成される前記非複製レトロウイルスは、選択的に腫瘍組織を標的にする。いくつかの実施形態において、前記腫瘍組織は、悪性腫瘍組織を含む。
一実施形態は、非複製レトロウイルスを生成させる腫瘍溶解性ウイルスを生成させるためのプロセスを提供し、前記プロセスは、哺乳動物細胞内で前記腫瘍溶解性ウイルスの集団を増殖させること、次いで、順次、レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッケージングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを加えること、および選択することを含み、ここで、前記エンベロープコンストラクト、前記パッケージングコンストラクト、または前記トランスファーコンストラクトの少なくとも１つは、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ガンマレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レトロウイルスは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスは、ＨＩＶである。
本開示の新たな特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の原理を利用した例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、同封の図面とを参照することによって、本開示の特徴および利点のより一層の理解が得られるであろう。
図１は、前記ワクシニアウイルスゲノムの中の、各レンチウイルスコンストラクトの挿入または挿入／欠失の位置を示す。
図２は、前記レンチウイルスｅｎｖコンストラクトのマップを示す。
図３は、前記レンチウイルスパッケージングコンストラクトのマップを示す。
図４は、前記レンチウイルストランスファーコンストラクトのマップを示す。
図５は、ウエスタンブロットによる、ＧＡＧ発現の検出を示す。
図６は、ウエスタンブロットによる、ＶＳＶ－Ｇ発現の検出を示す。
図７は、感染性レンチウイルスを生成させるＬｅｎｔｉ－Ｖａｃウイルスを感染させたＨＥＫ２９３細胞の、前記細胞上のＴａｇＲＦＰ－ＴとｓｆＧＦＰ（それぞれ、ワクシニアウイルス感染とレンチウイルス形質導入を示す）の存在によって示した蛍光顕微鏡イメージを示す。
図８は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ配列を含む、例示的なコンストラクトを示す。
詳細な説明
本明細書において、本開示の好ましい実施形態が示され、および記載されているが、そのような実施形態は例示の目的で示されているに過ぎないことが、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および弛緩が、本開示を逸脱することなく、当業者によって直ちに見いだされるであろう。本開示の実施において、本明細書に記載されている本開示の実施形態に対する種々の代替が採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、その特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
ある特定の定義
本明細書で使用されている用語は、特定のケースを説明することを目的としているに過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈に反しない限り、複数形も含み得る。さらに、用語「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される場合、これらの用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様な様式で包含的であることが意図されている。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値について許容できる誤差範囲内であることを意味し得、その値がどのようにして測定または決定されるか（例えば、測定システムの制約）に部分的に依存するであろう。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、与えられた値のプラクティスに従って、１標準偏差の範囲内、または１標準偏差超の範囲内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が説明されている場合、別段の記載がない限り、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、その特定の値について許容される誤差範囲、例えば、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾されている値の±１０％を意味するとみなすべきである。
用語「個体」、「患者」、または「対象」は、互換的に使用され得る。これらの用語は、いずれも、医療従事者（例えば、医師、正看護師、診療看護師、医療補助者、用務員、またはホスピス従業員）の監視（例えば、絶え間ない、または断続的な）によって特徴付けられる状況を必要とせず、またはそのような状況に限定されない。いくつかの実施形態において、患者、対象、または個体は、医療従事者の監視下にあってもよい。
特定のウイルスに関して、用語「異種核酸配列」、もしくは「外来性核酸配列」、または「導入遺伝子」は、本明細書で使用される場合、その特定のウイルスとは異なる起源に由来する核酸配列を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「変異」は、欠失、異種核酸の挿入、逆位、または置換を指し得る（当該技術分野で一般に理解されているオープンリーディングフレームアブレーティング変異が含まれる）。
用語「癌」とその文法的に同等な用語は、本明細書で使用される場合、特有の特性（すなわち、正常な制御の欠如）によって、無制御な増殖、分化の欠如、局所的侵襲、および転移が起こる細胞の過剰増殖を示し得る。本発明の方法に関し、前記癌は、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管、直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、首、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）癌、線維肉腫、胃腸のカルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌、白血病、液状腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、マスト細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網、および腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣の癌、甲状腺癌、尿管癌ならびに／または膀胱癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）の任意のものを含む、任意の癌であり得る。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」は、（例えば、悪性タイプまたは良性タイプの）細胞または組織の異常な増殖を指す。
用語「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、個々のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸のセグメント（「コード配列」または「コード領域」とも呼ばれる）を（必要に応じて、前記コード配列の上流または下流に位置し得る関連する制御領域（例えば、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなど）と合わせて）指し得る。
用語「変異ウイルス」および「改変ウイルス」は、本明細書において互換的に使用される場合、ゲノム中に１つまたはそれを超える変異（それらに限定されないが、欠失、異種核酸の挿入、逆位、置換、またはそれらの組み合わせを含む）を含むウイルスを指し得る。
用語「天然に存在する」は、本明細書においてウイルスに関連して使用される場合、前記ウイルスが天然に見いだすことができること、すなわち、そのウイルスが、天然の供給源から単離することができ、また意図的に改変されていないことを指し得る。
本明細書において言及される用語「阻害」、「低減させる」、もしくは「予防」、またはこれらの用語の任意の変形は、所望の結果を実現するための、任意の測定可能な減少、または完全な阻害を含み得る。
「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、制御配列（転写の開始および速度を制御する核酸配列の領域である）であり得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、調節タンパク質および分子がＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を結合し得る遺伝因子を含み得る。用語「作動可能に配置された」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写調節下」は、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および／または発現を制御するための、正しい機能的位置および／または方向にあることを意味し得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、「エンハンサー」（核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を指す）と共に使用してもよく、「エンハンサー」と共に使用しなくてもよい。
用語「相同性」は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の、最適な比較の目的でその配列をアライン（例えば、第１の配列の配列中にギャップが挿入され得る）することによって決定され得る「相同性」または「パーセント相同性」の計算値であり得る。次いで、その対応する位置のヌクレオチドが比較され得、その２つの配列の間のパーセント同一性は、それらの配列に共通する、一致する位置の数の関数であり得る（すなわち、％相同性＝一致する位置の数／位置の総数×１００）。例えば、第１の配列におけるある位置は、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められていることがあり得、その場合、これらの分子は、その位置において一致している。２つの配列の間のパーセント相同性は、その２つの配列の最適なアラインメントのために挿入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列に共通する一致する位置の数の関数であり得る。いくつかの実施形態において、比較の目的でアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９５％であり得る。ＢＬＡＳＴ（登録商標）サーチによって、２つの配列の間の相同性が決定され得る。相同性は、２つの配列の全長の間、または２つの配列の全長の部分の間であり得る。前記２つの配列は、遺伝子、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、ペプチド配列、アミノ酸配列、またはそれらのフラグメントであり得る。前記２つの配列の実際の比較は、よく知られている方法によって、例えば、数学的アルゴリズムを使用して実現され得る。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０－５８７３－５８７７（１９９３）に記載されているであろう。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれ得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する場合、各プログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の任意の適切なパラメーターが使用され得る。例えば、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してもよく、変更してもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムＣＡＢＩＯＳ（１９８９）、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡがあげられる。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して求めることができる。
用語「対象」は、それらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ｃｏｗ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ｒａｔ、またはマウスを含む、動物を指し得る。用語「対象」および「患者」は、本明細書において、例えば、哺乳動物対象（例えばヒト対象）について、互換的に使用される。
用語「処置する」、「処置する」、および「処置」は、障害、疾患、または症状；または前記障害、疾患、または症状に関連する１つまたはそれを超える徴候を軽減または消失させること；または前記障害、疾患、または症状自体の原因（単数または複数）を軽減または根絶させることを含むことが意図され得る。処置の望ましい効果は、それらに限定されないが、疾患の発症または再発を予防すること、徴候を軽減させること、前記疾患の直接的または間接的な病理学的結果を減少させること、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善を含み得る。
用語「治療有効量」は、投与した場合に、処置中の障害、疾患、または症状の１つまたはそれを超える徴候の発生を予防するために、またはある程度軽減させるために十分であり得る化合物の量を指し得る。用語「治療有効量」は、また、研究者、獣医、医師、または臨床家に求められている、細胞、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出すために十分な化合物の量も指し得る。
用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理学的に許容される担体」、または「生理学的に許容される賦形剤」は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル（例えば、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料など）を指し得る。あるコンポーネントは、医薬製剤の他の成分と適合性であるという点で、「薬学的に許容される」であり得る。また、合理的なベネフィット／リスク比に見合う毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは併発障害を超えることなく、ヒトおよび動物の組織または器官と接触させて使用するのにも好適であり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｒｏｗｅら編、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００５；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；ＡｓｈおよびＡｓｈ編、Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００４）を参照のこと。
用語「医薬組成物」は、本明細書に開示されている化合物と、他の化学成分（例えば希釈剤または担体）との混合物を指し得る。前記医薬組成物は、前記化合物の生物への投与を容易にし得る。化合物を投与する多数の技術（それらに限定されないが、経口、注射、エアロゾル、非経口、および局所投与が含まれる）が、当該技術分野に存在する。医薬組成物は、また、化合物を、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または有機酸と反応させることによって得ることもできる。
「抗癌剤」は、本明細書で使用される場合、例えば、癌細胞を死滅させることによって（癌細胞におけるアポトーシスを含む）、癌細胞の増殖速度を低下させることによって、転移の頻度または数を低減させることによって、腫瘍サイズを縮小させることによって、腫瘍増殖を阻害することによって、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させることによって、腫瘍または癌細胞に対する免疫応答を促進することによって、癌の進行を阻止または阻害することによって、または癌を有する対象の寿命を延ばすことによって、対象における癌に対してネガティブな影響を与えることが可能な薬剤または療法を指し得る。抗癌剤の非限定的な例としては、生物学的薬剤（生物学的療法）、化学療法剤、および放射線療法剤があげられ得る。
用語「腫瘍溶解性」は、本明細書で使用される場合、癌または腫瘍細胞を、作用剤（例えば、腫瘍溶解性ポックスウイルスなど、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）によって、例えば、前記細胞の直接的溶解によって、前記細胞に対する免疫応答を刺激すること、アポトーシス、毒性タンパク質の発現、オートファジー、およびタンパク質合成の停止、抗腫瘍免疫の誘導、またはそれらの任意の組合せによって、死滅させることを指し得る。作用剤（例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）を感染させた前記癌または腫瘍細胞の直接的溶解は、前記細胞内において前記ウイルスが複製した結果であり得る。ある特定の例において、用語「腫瘍溶解性」は、癌または腫瘍細胞を、前記細胞を溶解させずに死滅させることを指し得る。
用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞に選択的に感染して死滅させるウイルスを指し得る。ある特定の非限定的な状況下で、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を選択的に死滅させることだけではなく、宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激することにも依存する二重のメカニズムによって、抗腫瘍応答を誘導し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、それらに限定されないが、（ｉ）癌細胞内で選択的に自然に複製し、かつヒトにおいて非病原性であるウイルス（多くの場合、生得的な抗ウイルスシグナリング経路に対する感受性が高いこと、または発癌シグナリング経路に対する依存性による）；および（ｉｉ）使用のために遺伝的に操作されたウイルス、を含み得る。いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、セネカウイルス、レンチウイルス、メンゴウイルス、またはｍｙｘｏｍａｖｉｒであり得る。ある特定の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスであり得る。ある特定の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスであり得る。
用語「改変腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書で使用される場合、その構成要素に改変、例えば、それらに限定されないが、（例えばウイルス遺伝子の変異または欠失、外来性核酸の導入、ウイルス核酸またはウイルスタンパク質の化学修飾、およびウイルスカプシドへの外来性タンパク質または改変ウイルスタンパク質の導入のような）前記ウイルスの天然ゲノム（「バックボーン」）における改変を含む、腫瘍溶解性ウイルスを指し得る。一般に、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に対する治療効果を改善するために、改変され（「操作され」としても知られる）得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、改変ポックスウイルスであり得る。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、改変ポックスウイルスであり得る。
用語「全身送達」と「全身投与」は、本明細書において互換的に使用され、いくつかのケースにおいて、循環系の中への、医療用薬物、腫瘍溶解性ウイルス、または他の物質の投与経路を指し得る。前記全身投与は、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「複製欠陥ウイルス」もしくは「非複製ウイルス」、または「複製能のないウイルス」は、これらの用語の通常の意味（例えば、ゲノム改変の結果として、増殖能力がないウイルスなど）を有する。よって、このような組換えウイルスが細胞に感染した場合、その組換えウイルスは、そのゲノムに含まれる任意のウイルス異種タンパク質を発現することしかできない。特定の実施形態において、本明細書で提供される前記複製欠損ベクターは、非構造タンパク質をコードする遺伝子を含み得、かつ、ＲＮＡ転写および遺伝子発現について自立している。しかしながら、これらのベクターは、構造タンパク質をコードする遺伝子を欠いており、その結果、これらのベクターを感染粒子にパッケージングするためにヘルパーゲノムが必要となる。治療的に安全なベクターを提供することに加えて、前記構造タンパク質が除かれていることによって、これらのベクターの搭載能が向上し、６ｋｂを超える異種配列を組み込むことができる。別の実施形態において、パッケージング細胞株から放出されるウイルス粒子に前記構造タンパク質をパッケージングさせるパッケージングシグナルを除去することによって、間接的に、本発明のアデノウイルスベクターの増殖能力が奪われる。
一態様において、本明細書において、複製欠損ウイルス（例えば、生産者ウイルスとは異なるファミリーの複製欠損ウイルス）を含むカーゴを送達することができる生産者ウイルスが提供される。一態様において、前記生産者ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス、例えば、そのゲノムから非複製ウイルス（例えば、非複製レンチウイルスなど）を生成させるワクシニアウイルスであり得る。いくつかのケースにおいて、カーゴは、少なくとも非複製レンチウイルス（ＬＶ）の部分であり得る。いくつかのケースにおいて、非複製レンチウイルスは、非レンチウイルスタンパク質などの導入遺伝子を含み得る。非レンチウイルスタンパク質は、治療的タンパク質もしくはその機能性フラグメント、および／または診断的タンパク質であり得る。いくつかのケースにおいて、前記非複製レンチウイルスは、感染細胞（例えば、癌細胞など）の溶解をもたらす前記腫瘍溶解性ウイルスが感染した細胞内で前記非レンチウイルスタンパク質を発現する能力がある。いくつかのケースにおいて、前記非複製ウイルスは、ｉｎ ｓｉｔｕで（例えば、腫瘍細胞の中、または腫瘍微小環境内など）前記生産者ウイルスによって生成され得る。例えば、前記非複製ウイルスは、前記腫瘍溶解性生産者ウイルスが感染した腫瘍細胞内で生成され得、また、前記非複製ウイルスは、ｉｎ ｓｉｔｕで治療的または診断的タンパク質を発現し得る。
いくつかの態様において、本明細書において、生産者腫瘍溶解性ウイルスを含むベクターシステムが提供され得る。いくつかの態様において、ベクターシステムは、破壊されたウイルスゲノムを含み得る。いくつかの態様において、単一のベクターは、少なくとも２つのウイルスゲノムを含み得る。いくつかの態様において、単一のベクターは、少なくとも３つのウイルスゲノムを含み得る。一態様において、生産者腫瘍溶解性ワクシニアウイルスゲノムは、外来性ウイルス（例えば、ＨＩＶなど）からの配列を含み得る。いくつかの態様において、本明細書において、３－プラスミドシステムが提供され得、ここで、前記ｅｎｖ機能、パッケージング機能、およびトランスファー機能は、３つの異なるプラスミド上にあり得る。いくつかの態様において、ｅｎｖ、パッケージング、およびトランスファーは、少なくとも１つのウイルスゲノムを含む単一のベクター上にあり得る。
いくつかの例において、生産者ウイルスは、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、ポリドナウイルス、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのファミリー由来であり得る。一態様において、本明細書において提供される生産者腫瘍溶解性ウイルスは、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅウイルス（例えば、ワクシニアウイルスなど）であり得る。一態様において、ワクシニアウイルスは、異なるファミリー由来のウイルスをコードし得る。例えば、ワクシニアウイルスゲノムは、以下のファミリー、すなわち、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、ポリドナウイルス、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅのいずれかのウイルスから選択されるウイルスについての第２のゲノムを含み得る。
いくつかの実施形態において、ｉｎ ｓｉｔｕで生成されたウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、パピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）であり得る。本開示に従って、当該技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が利用され得る。ある特定の実施形態において、本開示の前記生産者ウイルスによって生成されるウイルスは、複製欠損である（すなわち、標的細胞内で自立的に複製できないであろう）。好ましくは、複製欠損ウイルスは、標的細胞の認識および前記ウイルスゲノムのカプシド化に必要なゲノムの配列のみを保持するように、ミニマルウイルスである。複製欠損ウイルスは、細胞に導入した後、感染性でなくてもよい。複製欠損ウイルスベクターを使用することによって、そのベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮することなく、特定の局所的な領域内の細胞に投与することが可能になり得る。よって、特定の組織が（例えば、癌細胞）が特異的に標的となり得る。
一態様において、本明細書で提供される生産者ウイルスから生産されるウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科由来であり得る。一態様において、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）、またはレンチウイルスのいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスのさらなる特定の例は、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３、ＨＴＬＶ－４、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルス、またはそれらの組合せのいずれか１つであり得る。
本明細書で開示されている前記生産者ウイルスによって生成される前記レトロウイルスは、いくつかの実施形態において、分裂細胞ならびに非分裂細胞に感染し得る組込みウイルスである。前記レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、カプシド形成配列、および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を有し得る。複製欠損非感染性レトロウイルスベクターは、前記ウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、前記異種遺伝子および前記パッケージングシグナルを含むように操作された共導入ウイルスをパッケージングするために必要とされる前記構造遺伝子を保持し得るように操作されていてもよい。よって、組換え複製欠損レトロウイルスベクターにおいて、前記ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、一般に、その全部または一部が除去され、興味対象となる異種核酸配列で置換されていてもよい。これらのベクターは、異なる種類のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーベイ肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、およびフレンドウイルスなど）から構築され得る。
本開示の特定の実施形態において、腫瘍溶解性生産者ウイルスから生成される複製欠損レンチウイルスは、いくつかの組織種（脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含む）に導入遺伝子を直接送達し、そこで持続的に発現させるための作用剤として使用され得る。このレトロウイルスベクターのサブタイプは、これらの組織中の分裂細胞および非分裂細胞に効率的に形質導入し、目的の遺伝子の発現を長期間維持することができる（概説として、Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，９：４５７－６３；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２：９８７３－８０を参照のこと）。レンチウイルスパッケージング細胞株は、当該技術分野において利用可能であり、一般に知られている（Ｋａｆｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３：５７６－５８４を参照のこと）。
一態様において、生産者ウイルスまたはｉｎ ｓｉｔｕで産生されたウイルスは、また、アデノウイルスであり得る。アデノウイルスは、本開示の核酸を種々の細胞種に効率的に送達するように改変され得る、真核生物のＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの種々のセロタイプ（例えば、２型または５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）、または動物起源のアデノウイルスなど）が存在する（国際公開番号ＷＯ９４／２６９１４を参照のこと）。動物起源のこれらのアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Ｍａｖ１［Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，７５：８１］）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（ｓｉｍｉａｎ）（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを含み得る。好ましくは、動物起源の前記アデノウイルスは、イヌアデノウイルスであり、より好ましくは、ＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株［ＡＴＣＣアクセッション番号ＶＲ－８００］）である。種々の複製欠損アデノウイルスおよびミニマムアデノウイルスベクターが報告されている（国際公開番号ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本開示による前記複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に知られている任意の技術によって調製され得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１９９１，１０１：１９５；ＥＰ公開第１８５ ５７３号；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８４，３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９７７，３６：５９）。組換えアデノウイルスは、当業者によく知られている標準的な分子生物学的技術を使用して回収および精製される。アデノ随伴ウイルスベースのベクター。前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、そのウイルスが感染した細胞のゲノムの中に（安定かつ部位特異的な様式で）組み込まれ得る、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、細胞の増殖、形態、または分化に対するいかなる影響も引き起こさずに幅広いスペクトルの細胞に感染することができ、また、ヒトの病理に関与しないと思われる。前記ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、シークエンシングされ、および特徴付けされている。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を導入するためのＡＡＶ由来のベクターの使用が報告されている（国際公開番号ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号；ＥＰ公開第４８８ ５２８号を参照のこと）。本開示による前記複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）領域が隣接した目的の前記核酸配列を含むプラスミドと、前記ＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を運搬するプラスミドを、生産者ウイルス（例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）が感染した細胞株にコトランスフェクトすることによって調製され得る。生成された前記ＡＡＶ組換え体は、次いで、標準的な技術によって精製され得る。
腫瘍溶解性ウイルス
本明細書において、腫瘍溶解性生産者ウイルスまたはその部分が提供され得る。腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染し、溶解させ得るウイルスであり得る。一態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌治療における以下の機能、すなわち（１）ウイルス溶解によって腫瘍細胞を直接的に破壊すること、（２）腫瘍部位における異種タンパク質発現のためのベクターとして働くこと、（３）免疫系を刺激／活性化する自己腫瘍抗原の提示、の少なくとも１つを有し得る。癌細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの選択性は、感染の間または複製の間のどちらかに起こり得る。腫瘍選択性ウイルスは、特定の細胞受容体を認識するウイルス表面タンパク質を変化させ、前記ウイルスの癌細胞特異的な侵入を可能にすることによって作製され得る。複製選択性は、効率的な複製のために必要とされるウイルス遺伝子を改変することによって実現され得、その結果、ウイルスは、通常の恒常性経路が破壊されている（例えば、腫瘍抑制因子の欠損または発癌経路の活性化など）細胞においてのみ増殖できる。
一態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、シンビスウイルス（Ｓｉｎｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスのいずれか１つであり得る。いくつかのケースにおいて、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスを含み得る。いくつかのケースにおいて、前記ポックスウイルスは、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、セネカウイルス、レンチウイルス、メンゴウイルス、ｍｙｘｏｍａｖｉｒ、ベータエントモポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、シカポックスウイルス、ガンマエントモポックスウイルス、レポリポックスウイルス、ブタポックスウイルス、モルシポックスウイルス、クロコダイルポックスウイルス、アルファエントモポックスウイルス、カプリポックスウイルス、トリポックスウイルス、またはパラポックスウイルスを含み得る。いくつかのケースにおいて、前記ポックスウイルスは、ワクシニアウイルスを含み得る。
一実施形態において、前記腫瘍溶解性生産者ウイルスは、ワクシニアウイルスであり得る。ワクシニアウイルスは、およそ２５０遺伝子をコードする約１９０キロベースの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する、大型で複雑なエンベロープウイルスであり得る。ワクシニアは、天然痘を根絶させるワクチンとしての役割でよく知られている。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質内でのみ複製するため、ＤＮＡウイルスの中で独特である。したがって、ウイルスＤＮＡ複製のために必要とされる種々の酵素およびタンパク質をコードするために、大きなゲノムが必要とされる。複製の間、ワクシニアは、外膜が異なる種々の感染性形態、すなわち、前記細胞内成熟ウイルス粒子（ＩＭＶ）、前記細胞内エンベロープウイルス粒子（ＩＥＶ）、前記細胞親和性エンベロープウイルス粒子（ＣＥＶ）、および前記細胞外エンベロープウイルス粒子（ＥＥＶ）を生じさせる。ＩＭＶが最も大量に存在する感染性形態であり、宿主間伝播のために重要だと考えられている。ワクシニア中の多くの遺伝子が、腫瘍溶解性ウイルスとしての特性を改善するために改変され得る。
いくつかのケースにおいて、前記腫瘍溶解性生産者ウイルスは、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）であり得、そのゲノム配列を表１に示す。一態様において、ワクシニアウイルスゲノム（例えば、表１に示されている前記ゲノム配列など）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または最大８個の外来性配列（例えば、前記ワクシニアウイルスから生成される複製欠損ウイルスをコードする外来性配列）によって破壊され得る。一態様において、本明細書で提供される生産者腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号１に対して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または最大約１００％のパーセント同一性を有し得る。
表１：ワクシニアウイルスＷＲの全ゲノム
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いくつかの実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルス（例えば、本明細書に記載されている生産者ウイルス、操作された生産者ウイルス）は、種々の外来性核酸を、単独で、またはウイルス遺伝子改変（例えば、ウイルス遺伝子の変異または欠失（完全な、または部分的な欠失）など）と組み合わせて含み得る。ウイルス遺伝子の非限定的な例としては、Ｂ５Ｒ、Ａ５２Ｒ（ＶＡＣＷＲ１７８）、Ｆ１３Ｌ、Ａ３６Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３３Ｒ、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、ＳＰＩ－１、ＳＰＩ－２、Ｂ１５Ｒ、ＶＧＦ、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｃ１２Ｌ、ＴＫ、およびそれらの任意の組合せがあげられ得る。外来性核酸の非限定的な例としては、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、代謝調節タンパク質、サイトカイン、上記の任意の組合せを含む融合タンパク質、およびその機能ドメインまたはフラグメントもしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸配列があげられ得る。
ヒアルロナン（ＨＡ）は、ＥＣＭの重要な構造要素であり、また、反復する二糖単位からなる高分子量の直鎖グリコサミノグリカンである。ヒアルロナン（ＨＡ）は、結合組織、上皮組織、および神経組織にわたって幅広く分布し得、その発現レベルは、多くの種類の腫瘍において著しく上昇し得る。ヒアルロニダーゼは、ＨＡの分解を触媒する酵素のファミリーである。これまでにヒトにおいて同定されている機能性のヒアルロニダーゼは、少なくとも５つ存在し（すなわち、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４、およびＨＹＡＬ５（ＰＨ－２０またはＳＰＡＭ１としても知られる））、これらのうち、比較的中性のｐＨで機能することがこれまでに知られているものは、ＰＨ－２０ただ１つである。本開示のいくつかの実施形態において、ヒアルロニダーゼを他の腫瘍標的化治療剤（例えば、導入遺伝子（本明細書において、外来性核酸ともいう））と組み合わせることによって、少なくとも前記ＥＣＭを減少させ、かつ前記腫瘍内および前記腫瘍間の前記治療剤の移送を促進することによって、本明細書に記載されている生産者ウイルスとして使用され得る前記改変腫瘍溶解性ウイルスの前記治療効果が促進され得る。
本明細書のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されている生産者ウイルスとして使用することができ、ヒアルロナンを分解する能力がある膜結合タンパク質（例えば、ヒアルロニダーゼなど）をコードする外来性核酸を含み得る、改変腫瘍溶解性ウイルスを開示する。用語「ヒアルロニダーゼ」は、本明細書で使用される場合、腫瘍中のＨＡの分解を触媒する任意の酵素またはそのフラグメント（それらに限定されないが、ＰＨ－２０および他の種由来のホモログ、ならびに類似の酵素機能を有する他の操作された／設計のタンパク質を含む）を指し得ることに留意すべきである。本明細書で使用される場合、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素のクラスを指し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている生産者ウイルスとして使用され得る前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、キメラタンパク質であるケモカイン受容体をコードし得る外来性核酸を含み得る。その細胞外ドメインの少なくとも一部は、前記ウイルスの前記腫瘍標的化送達を促進するケモカイン受容体由来であってもよく、また、その細胞内ドメインの少なくとも一部は、前記腫瘍特異的複製を促進、免疫抑制活性を阻害、またはいくつかの他の有益な効果を伝達するケモカイン受容体由来であってもよく、または、この逆であってもよい。例えば、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＣＲ５の細胞内ＧＴＰアーゼドメイン、およびＣＸＣＲ４またはＣＣＲ２の細胞外ケモカイン結合ドメインを有するタンパク質をコードする核酸を含み得る。あるケースにおいて、異なる機能性を有するドメインを組み合わせることによって、前記改変腫瘍溶解性ウイルスの治療能力のさらなる改善が実現され得る。本開示の一実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのケモカイン受容体をコードし得る外来性核酸を含み得る。いくつかのケースにおいて、２つまたはそれを超える異なるケモカイン受容体（これらは、前記ウイルスによって同時に発現され得る）をコードし得る外来性核酸を含み得る。本明細書に記載されている改変腫瘍溶解性ウイルスから同時に発現され得る例示的なケモカイン受容体としては、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２があげられ得る。１つを超えるケモカイン受容体を発現する改変腫瘍溶解性ウイルスにおいて、前記腫瘍溶解性ウイルスの臨床適用に関して、腫瘍細胞に対する組み合わせ効果または相乗的効果が実現され得る。
ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、外来性ＣＸＣＲ４発現核酸を含む。ある特定の実施形態において、前記改変腫瘍溶解性ウイルスは、外来性ＣＣＲ２発現核酸を含む。ある特定の実施形態は、ＣＸＣＲ４とＣＣＲ２の両方を含む改変腫瘍溶解性ウイルスを開示し、両ケモカインは、同じウイルスから発現される。ある特定の状況において、典型的には前記腫瘍微小環境中で発現されるＣＸＣＬ１２および／またはＣＣＬ２は、前記ＣＸＣＲ４および／またはＣＣＲ２を発現しているリンパ球または前記改変腫瘍溶解性ウイルスが感染した他の遊走性細胞を誘引し、それによって前記改変腫瘍溶解性ウイルスの前記腫瘍標的化送達を増大させ得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている生産者ウイルスは、１またはそれを超える外来性核酸配列（あるいは、導入遺伝子と呼ばれる）を含み得、前記外来性核酸配列は、ＳＴＡＴ３の活性を調節し得る作用剤をコードするｍＲＮＡを生成させることができ、またその結果、ＳＴＡＴ３によって制御される遺伝子の活性化も調節し得る。よって、本明細書で提供されるある特定の例は、ＳＴＡＴ－３媒介性遺伝子活性化を調節し得る作用剤をコードし得る外来性核酸配列を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。語句「ＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を調節する」は、本明細書で使用される場合、ＳＴＡＴ３活性が調節され、またその結果、ＳＴＡＴ３によって制御される１つまたはそれを超える遺伝子の活性化もまた調節されるプロセスを指し得る。
ある特定の実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を調節し得る前記作用剤は、タンパク質またはそのフラグメントであり得る。ある特定の実施形態において、前記タンパク質または前記そのフラグメントは、ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、または最小化し得る。ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、および／または最小化するタンパク質またはそのフラグメントは、例えば、ＳＴＡＴ３応答遺伝子のプロモーター領域内のＤＮＡ結合配列に対するＳＴＡＴ３の結合をブロックし得る。追加の例において、ＳＴＡＴ３活性およびＳＴＡＴ３媒介性遺伝子活性化を阻害、低減、または最小化する前記タンパク質またはそのフラグメントは、前記ＳＴＡＴ３タンパク質を、例えばＳＨ２ドメインで、直接結合し得る。ある特定の実施形態において、ＳＴＡＴ３活性を阻害、低減、および／または最小化するタンパク質は、ＳＴＡＴ３のリン酸化をブロック、阻害、低減、および／もしくは最小化し、ならびに／またはＳＴＡＴ３を脱リン酸化する。ある特定の非限定的な実施形態において、ＳＴＡＴ３活性を調節する前記タンパク質は、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、活性化ＳＴＡＴのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳ、例えば、ＰＩＡＳ３）、およびサイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）タンパク質（例えば、ＳＯＣ３）を含み得る。
例えば、いくつかの態様において、ワクシニアウイルスゲノムは、レンチウイルスの外来性ｅｎｖ、パッケージングコンストラクト、およびトランスファーコンストラクトを含み得る。外来性配列は、ワクシニアウイルスゲノムの任意の位置に挿入され得る。一態様において、外来性配列は、５’または３’末端の近傍に挿入され得る。一態様において、外来性配列は、別の外来性配列に隣接して挿入される。一態様において、外来性配列は、最も近い次の外来性配列から約０．５ｋｂ～約１０００ｋｂ離れて挿入される。いくつかの例において、前記レンチウイルスタンパク質をコードする前記外来性配列は、初期ワクシニアウイルスプロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態において、前記生産者ウイルスは、バクテリオファージ制御配列（例えば、バクテリオファージプロモーター、バクテリオファージ終止配列、またはそれらの組合せなど）を発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり得る。
バクテリオファージプロモーターまたは終止配列は、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージ由来であり得る。前記バクテリオファージ制御配列は、クローニングおよび操作のための標準的な方法を使用してクローニングされ得る。いくつかの実施形態において、前記生産者ウイルスは、バクテリオファージポリメラーゼを発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり得る。用語「バクテリオファージポリメラーゼ」は、任意のバクテリオファージポリメラーゼ（Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージプロモーターと適合性であるものを含む）を指し得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージポリメラーゼを発現する前記生産者ウイルス、および前記バクテリオファージポリメラーゼは、クローニングおよび操作のための標準的な方法を使用してクローニングされ得る。
Ｅｎｖエレメント
いくつかの態様において、外来性配列は、ｅｎｖエレメントであり得る。いくつかの態様において、ｅｎｖエレメントは、ｖｓｖｇ含有ｅｎｖコンストラクト由来であり得る。いくつかの態様において、ｖｓｖｇ含有ｅｎｖコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０３２（ｋ１ｌ）遺伝子と前記ｖａｃｗｒ０３３（ｋ２ｌ）遺伝子の間のポイントで前記ワクシニアウイルスゲノムを組み換え得る。一態様において、ｖｓｖｇ含有ｅｎｖコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０３２（ｋ１ｌ）遺伝子と前記ｖａｃｗｒ０３３（ｋ２ｌ）遺伝子の間のポイントでワクシニアウイルスゲノムを組み換えるように設計され得る。このゲノムにおける位置によって、いくつかの利点、すなわち、（１）遺伝子間に適切なスペースをもたらす、（２）ｖａｃｗｒ０３２のための同定可能なプロモーターが見いだされ得る、および（３）内在性ワクシニアウイルスゲノムを破壊し得る任意の他の外来性配列から最も離れた前記ゲノムの５’末端に前記コンストラクトが配置される、という利点がもたらされ得る。一態様において、前記ｖｓｖｇ遺伝子とそのプロモーターは、隣接するＶＶ遺伝子の向きと整合するように、３’から５’に配置され得る。いくつかのケースにおいて、ｅｎｖは、ワクシニアゲノムの塩基対２６０４１の位置に挿入される。一態様において、エンベロープコンストラクトは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２と遺伝子ｖａｃｗｒ０３３の間に挿入され得る。一態様において、エンベロープコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２またはその部分と遺伝子ｖａｃｗｒ０３３またはその部分の間に挿入され得る。
一態様において、ｅｎｖエレメントは、配列番号２に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一態様において、ｅｎｖエレメントは、配列番号３に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するｖｓｖｇ配列を含む。
パッケージングコンストラクト
一態様において、外来性配列は、パッケージングコンストラクト配列であり得る。一態様において、パッケージングコンストラクトは、ワクシニアウイルスゲノムを組換え、遺伝子のコード配列（例えば、ｖａｃｗｒ０９３（Ｊ１ｒ）遺伝子とｖａｃｗｒ０３３（Ｊ３ｒ）遺伝子の間のｖａｃｗｒ０９４（Ｊ２ｒ）遺伝子）を置換するように設計され得る。一態様において、外来性配列の挿入によるゲノムの破壊が行われ得る。一態様において、ゲノムの破壊は、ウイルスの機能を減弱させ得る。例えば、破壊（例えば、ｊ２ｒ－欠失）は、腫瘍細胞に優先的に感染する弱毒変異ウイルスを生じさせるので、パッケージングコンストラクトは、ワクシニアウイルスゲノムを組換え、遺伝子のコード配列を置換または破壊するように設計され得る。また、この破壊／挿入によって、前記ワクシニアウイルスゲノムの中央近傍（ここは、他の外来性配列（例えば、ｅｎｖなど）から比較的離れている）に、前記外来性パッケージングコンストラクトが配置される。いくつかのケースにおいて、パッケージングコンストラクトは、ワクシニアウイルスゲノムの塩基対８０７２４－８１２５７の位置において挿入または欠失される。一態様において、パッケージングコンストラクトは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５の間に挿入され得る。一態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子またはその部分の欠失を含む。一態様において、パッケージングコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子またはその部分の位置に挿入され得る。一態様において、パッケージングコンストラクトは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３またはその部分と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５またはその部分の間に挿入され得る。一態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは、ｖａｃｗｒ０９４遺伝子またはその部分の欠失を含む。一態様において、パッケージングコンストラクトは、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子またはその部分の位置に挿入され得る。
一態様において、パッケージングエレメントは、配列番号４に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一態様において、パッケージングエレメントは、配列番号５に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するｇａｇ／ｐｏｌ配列を含む。一態様において、前記レンチウイルスの構造タンパク質をコードする前記核酸は、配列番号４に規定されているヌクレオチド配列、または配列番号５として規定されている配列と少なくとも約７０％～少なくとも約９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
トランスファーコンストラクト
一態様において、外来性配列は、トランスファーコンストラクト配列であり得る。一態様において、ワクシニアウイルス後期遺伝子は、単一遺伝子を含有するｍＲＮＡではなく、その代わりに、終止前の数遺伝子離れたプロモーターを使用して開始され得る大きな１０～２０ｋｂのｍＲＮＡに転写され得る。一態様において、破壊されたワクシニアウイルスゲノムは、ｖａｃｗｒ２０５とｖａｃｗｒ２０６の間（前期ＶＶゲノムの遠い３’末端の近傍の、後期遺伝子転写物を含まない領域）にトランスファーコンストラクトを含み得る。いくつかのケースにおいて、トランスファーコンストラクトは、ワクシニアウイルスゲノムの塩基対１８３６４５の位置に挿入される。一態様において、トランスファーコンストラクトは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ２０５またはその部分と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６またはその部分の間に挿入され得る。
一態様において、本明細書で提供されるワクシニアウイルスは、少なくとも１つのプロモーターを含み得る。一態様において、本明細書で提供されるワクシニアウイルスは、約１個のプロモーター～約３個のプロモーターを含み得る。一態様において、本明細書で提供されるワクシニアウイルスは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大約１０個のプロモーターを含み得る。一態様において、プロモーターは、初期プロモーターであり得る。一態様において、プロモーターは、初期／後期プロモーターまたは後期プロモーター（ｌａｔｅｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）であり得る。いくつかのケースにおいて、前記トランスファーコンストラクトは、自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする遺伝子（例えば、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムなど）をさらに含み得る。いかなる特定の理論にも拘束されないが、自己切断ＲＮＡ配列が転写される場合、速やかに、および転写中に、それ自身を切断し得ることが企図される。よって、自己切断ＲＮＡ配列は、正しい地点でそれ自身を速やかに切断するであろうことから、このシステムは、ＲＮＡを終止させるために、早期発現に頼る必要はないであろう。そうであるから、後期プロモーター（例えば、ワクシニアウイルス後期プロモーター）を使用することは、有利であり得る。なぜならば、前記レトロウイルスの（例えば、レンチウイルスの）コンポーネントの全てが、大幅に高い発現量を有し、かつ著しく多くのレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を生成させ得る前記後期プロモーター（例えば、ＶＶ後期プロモーターなど）によって直ちに発現され得るからである。前記自己切断リボザイムをコードする前記遺伝子は、いくつかの例において、前記トランスファーコンストラクトの前記終止配列（例えば、図４のＵ５ＮＵ）の３’に位置し得る。
一態様において、トランスファーコンストラクトは、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルス遺伝子ｖａｃｗｒ２０５またはその部分と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６またはその部分の間に挿入され得る。一態様において、トランスファーエレメントは、配列番号６に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
レンチウイルス
一態様において、本明細書において、そのゲノムから非複製レンチウイルスまたはその部分を生成させる腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスなど）が提供され得る。いくつかの実施形態において、非複製レンチウイルスは、非レンチウイルスタンパク質またはその機能性フラグメントをコードする導入遺伝子を含む。一態様において、非複製レンチウイルスは、哺乳動物細胞の標的集団における分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染および形質導入する能力がある。一態様において、哺乳動物細胞は、ヒトであり得る。
一態様において、本明細書において、第二世代レンチウイルスが提供され得る。第二世代レンチウイルスは、パッケージングのためにｔａｔエレメントを利用し得るトランスファープラスミドを含み得る。一態様において、第二世代レンチウイルスは、単一のプラスミド中にパッケージングエレメント、例えば、Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、およびｔａｔを含み得る。一態様において、第二世代レンチウイルスは、ＶＳＶ－Ｇをコードし得るｅｎｖエレメントを含み得る。第二世代レンチウイルスは、３－プラスミドシステムであり得る。一態様において、第二世代レンチウイルスは、野生型ＬＴＲを利用し得る。第二世代レンチウイルスは、複製欠陥であり得、また、種々のＨＩＶ遺伝子をコードするために３個のプラスミドを利用し得る。
一態様において、本明細書において、第三世代レンチウイルスが提供され得る。第三世代レンチウイルスは、トランスファーエレメントをパッケージングするために、第二世代または第三世代パッケージングシステムを利用し得る。一態様において、第三世代レンチウイルスは、パッケージングするために、最大で２個のプラスミド、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌをコードする１個のプラスミドおよびｒｅｖをコードする第２のプラスミドを利用する。一態様において、第三世代レンチウイルスは、ＶＳＶ－Ｇをコードし得るｅｎｖエレメントを含み得る。一態様において、第三世代レンチウイルスは、最大で４個のプラスミドを使用し、また、ｔａｔエレメントの使用を排除し得る。一態様において、第三世代レンチウイルスは、第二世代レンチウイルスよりも安全であり得る。第三世代レンチウイルスは、ハイブリッドＬＴＲウイルスプロモーターを含み得、例えば、５’ＬＴＲは、除去または部分的に除去されていてもよく、また、外来性プロモーター（例えば、ワクシニアウイルスＣＭＶまたはＲＳＶプロモーター）に融合されていてもよい。
いくつかのケースにおいて、本明細書において、レンチウイルスまたはその部分が提供され得る。いくつかのケースにおいて、レンチウイルスは、ＨＩＶ－１ウイルス由来であり得る。いくつかの態様において、レンチウイルスは、非ＨＩＶ－１ウイルス、例えば、ＨＩＶ－２，サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびそれらの任意の組合せ由来であり得る。
いくつかのケースにおいて、本明細書において、ＨＩＶ－１ウイルス由来のレンチウイルスが提供され得る。いくつかの態様において、ＨＩＶ－１ウイルスの異なるコンポーネントをコードする多数のプラスミドが、多数のプラスミドに送達され得る。レンチウイルスベクターシステムは、前記レンチウイルスの部分を含む少なくとも２つのプラスミドを含み得る。いくつかの態様において、少なくとも２、３、４、５、６、７、または最大約８個のプラスミドは、前記レンチウイルスの部分を含み得る。いくつかの態様において、ＬＶベクターは、３－プラスミドシステムであり得る。いくつかのケースにおいて、３－プラスミドシステムは、Ｇａｇ－Ｐｏｌおよび前記ｅｎｖ機能をコードする２個のヘルパープラスミド、ならびに前記ＴＶプラスミドを含む。いくつかの態様において、ＬＶベクターは、４－プラスミドシステムであり得る。４プラスミドＬＶシステムは、ＨＩＶ－１のアクセサリー遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆ）を含み得、ＬＶの第一世代にのみ存在し得る。いくつかの態様において、これらは必要ではないため、除去されている。同様に、制御性ｔａｔ遺伝子（第二世代ＬＶに存在する）は、ＴＶにおける前記５’末端反復（ＬＴＲ）の前記Ｕ３プロモーターが構成的に活性なプロモーター配列によって置換されていることから、そのトランス作用性機能は不要であるため、いくつかのケースにおいて、除去されている。いくつかの態様において、ワクシニアウイルスは、外来性ウイルス（例えば、ＨＩＶ－１ ｒｅｖ遺伝子など）由来の遺伝子を欠いていてもよい。いくつかの態様において、本明細書で提供されるベクターは、ハイブリッド５’ＬＴＲ領域を含み得る。ハイブリッド５’ＬＴＲ領域は、ワクシニアウイルス由来の少なくとも１つのコンポーネント、およびＨＩＶ－１由来の少なくとも１つのコンポーネントを含み得る。いくつかの態様において、ＨＩＶ－１由来のコンポーネントは、５’ＬＴＲである。いくつかの態様において、ＨＩＶ－１由来のコンポーネントは、３’ＬＴＲである。ハイブリッドコンストラクトは、ｔａｔを欠いていてもよい。いくつかの態様において、ハイブリッドコンストラクトは、ｔａｔの代わりにワクシニアウイルス転写因子を利用し得る。
いくつかの実施形態において、構成的に活性なプロモーター配列は、サイトメガロウイルス（プロモーター）またはラウス肉腫ウイルス（プロモーター）のいずれか１つであり得る。いくつかのケースにおいて、オプションのエンハンサーまたは誘導性／抑制性プロモーター配列（例えば、７ｔｅｔＯなど）が含められ得る（ｐＲＲＬ（キメララウス肉腫ウイルスレンチウイルスデザインを含むトランスファーベクターコンストラクト（ＲＳＶ）－ＨＩＶ ５’ＬＴＲ）またはｐＣＣＬデザインを含むトランスファーベクターコンストラクト（（ＣＭＶ）－ＨＩＶ ５’ＬＴＲ）。これらの改変によって、ＨＩＶ－１およびｅｎｖに由来するｇａｇ－ｐｏｌ（前記構造タンパク質およびウイルス酵素をコードする）およびｒｅｖ（転写後調節因子をコードする）の使用に基づき、ヘルパー機能を有するＬＶベクターシステムがもたらされ得る。いくつかの態様において、本明細書において提供されるベクターは、ｒｅｖを欠く。いくつかの態様において、ＬＶベクターは、異なる異種エンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化され得る。いくつかの態様において、前記水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープの糖タンパク質は、下流のプロセッシングの間の改善された安定性、ならびにその幅広い形質導入スペクトルのために利用され得る。いくつかの態様において、ＴＶプラスミドは、前記標的細胞に導入される遺伝子材料であり、かつ、カプシド形成、逆転写、および組み込みに必要とされるシス作用性エレメントと隣接する前記導入遺伝子発現カセットを含むＬＶバックボーンを含み得る。いくつかの態様において、トランスフェクトされた細胞は、感染後、少なくともＴＶプラスミドの部分を含む。いくつかの態様において、本明細書において、自己不活性化（ＳＩＮ）－ＬＶベクターが提供され得る。ＳＩＮ－ＬＶベクターは、２’ＬＴＲのＵ３エレメントに欠失を含む。いくつかの態様において、ＳＩＮ－ＬＶベクターは、標的細胞にトランスフェクトされると、前記ウイルスＬＴＲの転写能力を失う。これによって、複製可能な組換え体が出現するリスクを最小化することができ、プロモーター干渉に関連する問題が回避される。いくつかの態様において、本明細書において、第三世代プラスミドシステム（このシステムからはｔａｔが除去されている）が提供され得る。いくつかの態様において、第三世代ベクターは、異種プロモーターに融合されたキメラ５’ＬＴＲを使用することによって、前記ＨＩＶ－１タンパク質ＴＡＴの活性を置き換え得る。
いくつかのケースにおいて、ワクシニアウイルス初期遺伝子転写の終止は、ワクシニアウイルス特異的因子を誘引して転写を停止させるために、かつ、ポリＡテールを生成させてウイルスｍＲＮＡを保護するために、前記終止配列ＵＵＵＵＵＮＵ（Ｕ５ＮＵ）（配列番号７）を利用し得る。一態様において、本明細書で提供されるベクターは、コンストラクトの所望の末端領域に隣接して、ＡＴＴＴＴＴＡＴ（配列番号８）配列を含み得る。いくつかの実施形態において、前記終止配列は、配列番号７に規定されている配列に対して約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大約１００％のパーセント同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される前記レトロウイルスベクターは、複製欠損（すなわち、標的細胞内で自立的に複製できない）であり得る。いくつかの態様において、複製欠損ウイルスは、標的細胞の認識および前記ウイルスのカプシド化に必要なゲノムの配列のみを保持するように、ミニマルウイルスである。
いくつかのケースにおいて、複製欠損ウイルスは、細胞に導入した後、感染性ではない。複製欠損ウイルスベクターを使用することによって、そのベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮することなく、特定の局所的な領域内の細胞に投与することが可能になる。よって、特定の組織が特異的に標的となり得る。
一態様において、本明細書で提供されるレンチウイルスコンストラクトは、生産者腫瘍溶解性ウイルスからの発現のために、プロモーターを含み得る。一態様において、レンチウイルスエレメントの発現は、初期発現であり得る。一態様において、レンチウイルスエレメントの発現は、ロバストであり得る。例えば、ワクシニアウイルスは、感染初期の間に（例えば、感染後２時間以内に）ポリＡテールを有する、短い単一の遺伝子ｍＲＮＡを生成させ得る。この期間の後、感染の中期および後期のウイルスｍＲＮＡは、特異的に終止されなくてもよい、またはポリアデニル化されなくてもよい。機能的なレンチウイルストランスファーＲＮＡを形成するために、レンチウイルス末端反復（ＬＴＲ）に隣接する特定の部位で転写が開始および終止され得、したがって、レンチウイルスエレメントは、ワクシニアウイルス感染後の最初の２時間においてロバストに発現され得る。したがって、いくつかのケースにおいて、本明細書で提供されるベクターは、各エレメントについて強い初期プロモーターを有し得、また、強い初期プロモーターを前記トランスファーコンストラクトの５’ＬＴＲに融合させ得る。一態様において、先行する強い初期プロモーターと共に、約１～１０ウイルスエレメントが存在する。一態様において、先行する強い初期プロモーターと共に、約１～５ウイルスエレメントが存在する。先行する強い初期プロモーターと共に、約１～３ウイルスエレメントが存在する。いくつかの例において、前記レンチウイルスコンストラクトのコンポーネントは、初期／後期、または後期ウイルスプロモーターの制御下にあり得る。例えば、前記パッケージングコンストラクト、前記トランスファーコンストラクト、および前記エンベロープコンストラクトは、それぞれ独立して、初期／後期ウイルスプロモーターまたは後期ウイルスプロモーターを含む。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の結合を制御する核酸の配列であり、遺伝子転写効率に対して主要な効果を及ぼし得、ここで、遺伝子は、前記細胞内、および／またはその中で遺伝子が発現され得る細胞種の中で発現され得る。プロモーターの非限定的な例としては、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦｌα）プロモーター、シミアン空胞形成ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリヒドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒドグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｇｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、またはそれらの組合せがあげられる。
いくつかの実施形態において、本開示は、癌が現出している、または癌を発症するリスクがある対象における抗腫瘍免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの態様において、癌は、転移性であり得る。一態様において、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＨＳＶ、ワクシニアウイルス、またはアデノウイルス）、前記腫瘍溶解性ウイルスから生成されるレトロウイルス、またはその両方は、治療的タンパク質または診断的タンパク質を発現し得る。一態様において、治療的タンパク質は、ＰＤ－１の活性をアンタゴナイズするＰＤ－１結合作用剤（例えば、単鎖抗ＰＤ－１抗体など）であり得る。他の実施形態において、前記治療的タンパク質、前記ＰＤ－１リガンドの受容体への結合をアンタゴナイズする作用剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＰＤ－Ｌ２抗体、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２デコイ、または可溶性ＰＤ－１受容体）。一態様において、ＰＤ－１遮断は、また、Ｔ細胞（ＣＴＬおよびヘルパー）およびＢ細胞の不活性化をブロックすることによって抗腫瘍免疫応答も刺激し、それによってより多くの癌を死滅させる。
パッケージング細胞株
一態様において、本明細書において、パッケージング細胞株が提供され得る。複製欠損ウイルスの生成は、トランス相補性によって実現され得、ここで、パッケージング細胞は、感染粒子を生成させるために必要な前記ウイルスタンパク質の全て、ならびに送達のためにその中にパッケージングされるであろう目的の前記核酸配列（例えば、ウイルス配列）を、一緒になって発現する多数のプラスミド（例えば、約２、３、４、５、またはそれを超えるプラスミド）と共にコトランスフェクトされ得る。多くのレンチウイルスベクターシステムは、前記トランスファープラスミドと共に２つのヘルパープラスミド（第二世代）を形質導入することに基づいているが、いくつかのより新しいシステム（第三世代）は、トランスファープラスミドと組み合わされ、かつパッケージング細胞株をトランスフェクトするために利用される３個のプラスミド上に、前記パッケージングコンストラクトおよびエンベロープコンストラクトを有する。一態様において、本明細書において、レトロウイルスと共に使用するためのパッケージング細胞株が提供され得る。一態様において、第一世代レトロウイルスパッケージング細胞株が利用され得る。第一世代レトロウイルスパッケージング細胞株は、マウス３Ｔ３細胞由来であり得る。一態様において、第二世代レトロウイルスベクターパッケージング細胞株が利用され得る。第二世代レトロウイルスベクターパッケージング細胞株の非限定的な例としては、ＨＥＫ２９３（胚性腎）、ＴＥ６７１（横紋筋肉腫）、およびＨＴ１０８０（線維肉腫）のようなヒト細胞があげられる。第三世代パッケージング細胞株は、第二世代パッケージングプラスミド中、ならびにトランスファーベクター中に存在する不必要なウイルス配列を欠いていてもよく、安全性を改善するために除去されている。
非レンチウイルスタンパク質
治療的タンパク質またはその部分
いくつかの実施形態において、非レンチウイルスタンパク質は、治療的タンパク質またはその部分であり得る。一態様において、治療的タンパク質またはその部分は、免疫チェックポイントモジュレーター、抗体またはその部分、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびそれらの任意の組合せのいずれか１つであり得る。
一態様において、治療的タンパク質またはその部分は、免疫チェックポイントモジュレーターであり得る。一態様において、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイントを阻害し得る。一態様において、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイントを活性化し得る。免疫チェックポイント阻害剤は、いくつかの種類の免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞など）、およびいくつかの癌細胞によって作られるタンパク質をブロックする薬物であり得る。これらの免疫チェックポイントタンパク質は、チェックにおいて免疫応答の維持を助け、Ｔ細胞が癌細胞を殺すことを妨げ得る。これらのタンパク質が阻害された場合、前記免疫系における「ブレーキ」は解除され、Ｔ細胞は癌細胞を殺すことができる。Ｔ細胞または癌細胞上に見られるチェックポイントタンパク質の例としては、それらに限定されないが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１／Ｂ７－２があげられる。一態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書で提供されるウイルスによって送達され得る。
免疫チェックポイントモジュレーターおよび／または任意の治療的タンパク質によって標的化され得る種々の免疫チェックポイントが存在する（表２）。
表２：免疫チェックポイントモジュレーターによって標的化される免疫チェックポイントをコードする遺伝子
Figure 2022551753000048
Figure 2022551753000049
Figure 2022551753000050
Figure 2022551753000051
前記治療的タンパク質は、いくつかのケースにおいて、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（例えば、Ｇａｚｙｖａ）、ＶＥＧＦＲ Ｆｃ融合物（例えば、アイリーア）、ＣＴＬＡ－４ Ｆｃ融合物（例えば、Ｎｕｌｏｊｉｘ）、グルカゴン様ペプチド－１受容体アゴニストＦｃ融合物（例えば、トルリシティ）、ＶＥＧＦＲ Ｆｃ融合物（例えば、ザルトラップ）、組換え第ＩＸ因子Ｆｃ融合物（例えば、オルプロリクス）、組換え第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合物（例えば、イロクテイト）、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト－アルブミン融合物（例えば、Ｔａｎｚｅｕｍ）、組換え第ＩＸ因子アルブミン融合物（例えば、イデルビオン）、ペグ化ＩＦＮβ－１ａ（例えば、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ）、ペグ化組換え第ＶＩＩＩ因子（例えば、アディノベイト）、エムタンシン結合ヒト化抗ＨＥＲ２・ｎｅｕ（例えば、カドサイラ）、マウス／ヒトキメラ抗ＣＤ３０（例えば、アドセトリス）、抗ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）（例えば、パージェタ）、抗ＩＬ－６受容体（アクテムラ）、抗ＣＤ２０（例えば、オビヌツズマブ；Ｇａｚｙｖａ）、抗インテグリンα４β７（ＬＰＡＭ－１）（例えば、エンティビオ）、抗ＰＤ－１（例えば、キイトルーダ）、抗ダビガトラン（例えば、Ｐｒａｘｂｉｎｄ）、抗ＩＬ－５（例えば、ヌーカラ）、抗ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）（例えば、エムプリシティ）、抗ＩＬ－１７ａ（例えば、トルツ）、抗ＩＬ－５（例えば、Ｃｉｎｑａｉｒ）、抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、テセントリク）、抗ＣＤ２５（例えば、Ｚｉｎｂｒｙｔａ）、抗ＣＤ３０（例えば、アドセトリス）、抗ＩＬ－６（例えば、Ｓｙｌｖａｎｔ）、抗ＧＤ２（例えば、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）、抗Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えば、Ａｎｔｈｉｍ）、抗ＴＮＦα（例えば、Ｉｎｆｌｅｃｔｒａ）、ヒト抗Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（例えば、ベリムマブ）、ヒト抗ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ）、ＣＴＬＡ－４ Ｆｃ融合物（例えば、ベラタセプト）、ヒト化抗ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）（例えば、ペルツズマブ）、ＶＥＧＦＲ Ｆｃ融合物（例えば、ｚｉｖ－アフィルベルセプト（ｚｉｖ－ａｆｉｌｂｅｒｃｅｐｔ））、Ｇ－ＣＳＦ（例えば、ｔｂｏ－フィルグラスチム）、ヒト抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）（例えば、ラムシルマブ）、マウス／ヒトキメラ抗ＩＬ－６（例えば、シルツキシマブ）、ペンブロリズマブ、マウス二重特異性抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３（例えば、ブリンツモマブ（ｂｌｉｎｔｕｍｏｍａｂ））、ニボルマブ、副甲状腺ホルモン、マウス／ヒトキメラ抗ＧＤ２（例えば、ジヌツキシマブ）、ヒト抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ）、ヒト抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ネシツムマブ）、ヒト化抗ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）（例えば、エロツズマブ）、アテゾリズマブであり得る。
一態様において、治療的タンパク質は、サイトカインであり得る。サイトカインは、炎症性サイトカインであり得る。一態様において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびそれらの組合せであり得る。さらに、炎症性サイトカインは、また、本明細書で提供されるウイルスと共に導入されてもよい。炎症性サイトカインの非限定的な例としては、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、Ｃ－Ｃモチーフリガンド４（ＣＣＬ４）、Ｃ－Ｃモチーフリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－１８、およびＩＬ－３３があげられる。
一態様において、治療的タンパク質は、増殖因子であり得る。いくつかの態様において、増殖因子は、インターロイキンであり得る。インターロイキンの非限定的な例としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦα、または細胞（例えば、免疫細胞など）の増殖のための、任意の他の付加的な作用剤があげられる。
一態様において、治療的タンパク質は、化学療法剤であり得る。化学療法用薬剤または化合物は、癌の処置に有用な化学物質であり得る。本開示のウイルスと組み合わせて使用され得る前記化学療法癌用薬剤としては、それらに限定されないが、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）があげられる。これには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびナベルビン（商標）（ビノレルビン、５’－ノルアンヒドロブラスチン（ｎｏｒａｎｈｙｄｒｏｂｌａｓｔｉｎｅ））が含まれる。さらに他のケースにおいて、化学療法癌用薬剤としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン化合物など）があげられる。本明細書で使用される場合、「カンプトテシン化合物」は、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（ＨＣＬイリノテカン）、ハイカムチン（商標）（塩酸トポテカン）、ならびにカンプトテシンおよびそのアナログ由来の他の化合物を含む。本明細書に開示されている方法および組成物において使用され得る化学療法癌用薬剤の別のカテゴリーは、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシド、テニポシド、およびミトポドジドなど）である。本開示は、アルキル化剤（これは、腫瘍細胞内の遺伝物質をアルキル化する）として知られている他の化学療法癌用薬剤をさらに包含する。これには、限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ｂｅｌｕｓｔｉｎｅ、ウラシルマスタード、クロマファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎ）、およびダカルバジンが含まれる。本開示は、化学療法剤として代謝拮抗薬を包含する。この種の薬剤の例としては、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリム（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｍｅ）、およびプロカルバジンがあげられる。
一態様において、治療剤は、抗生剤であり得る。いくつかのケースにおいて、抗生剤は、細胞壁標的薬剤、細胞膜標的薬剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成阻害剤、または静菌剤であり得る。細胞壁標的薬剤は、ペニシリン誘導体（ペナム）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタム、およびカルバペネムであり得る。βラクタム系抗生物質は、殺菌性または静菌性であり、また、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することによって機能する。いくつかのケースにおいて、抗生剤は、タンパク質合成阻害剤であり得る。タンパク質合成阻害剤は、酵素トランスペプチダーゼ（これは、細菌によって細胞壁を作るために必要である）の不可逆的阻害剤として働くアンピシリンであり得る。これは、二分裂における細菌細胞壁合成の第３および最終ステージを阻害し、それが、最終的に細胞溶解を引き起こす。したがって、アンピシリンは、通常、溶菌性である。いくつかのケースにおいて、殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。他のケースにおいて、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、またはペンタミジンである。抗生物質の追加の例としては、限定されないが、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、およびダウノマイシンがあげられる。
一態様において、治療剤は、また、抗体またはその部分であり得る。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。投与され得るポリクローナル抗体は、抗リンパ球または抗胸腺細胞抗原であり得る。モノクローナル抗体は、抗ＩＬ－２受容体抗体、抗ＣＤ２５抗体、または抗ＣＤ３抗体であり得る。抗ＣＤ２０抗体もまた使用され得る。ＣＤ２０と反応する薬剤（例えば、リツキサン）などのＢ細胞アブレーション療法もまた、免疫抑制剤として使用され得る。例示的な抗癌抗体としては、それらに限定されないが、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミド、およびミトキサントロンがあげられる。
一態様において、治療剤は、また、抗真菌剤であり得る。いくつかのケースにおいて、抗真菌剤は、ポリエン、アゾール、アリルアミン、またはエキノキャンディンのクラスのものであり得る。いくつかの実施形態において、ポリエン抗真菌剤はアムホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハミシン（ｈａｍｙｃｉｎ）、ナタマイシン、ナイスタチン、またはリモシジンである。いくつかのケースにおいて、抗真菌剤は、アゾールファミリーのものであり得る。アゾール系抗真菌剤は、ラノステロール－１４α－デメチラーゼを阻害し得る。アゾール系抗真菌剤は、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコアゾール（ｓｕｌｃｏａｚｏｌｅ）、またはチオコナゾールなどのイミダゾールであり得る。アゾール系抗真菌剤は、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブボナゾール（ｉｓａｖｕｖｏｎａｚｏｌｅ）、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、またはボリコナゾールなどのトリアゾールであり得る。いくつかのケースにおいて、アゾールは、アバファンギンなどのチアゾールであり得る。抗真菌剤は、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、またはテルビナフィンなどのアリルアミンであり得る。抗真菌剤は、また、アニデュラファンギン、カスポファンギン、またはミカファンギンなどのエキノキャンディンであり得る。抗真菌剤であり得る追加の薬剤は、オーロン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸、クリスタルバイオレット、またはペルーバルサムであり得る。
医薬組成物
本明細書において、医薬として許容され得るウイルス治療剤が提供される。一態様において、本明細書において、また、腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬として許容され得るウイルス治療剤を実現する方法も提供される。本明細書で提供される組成物および方法は、疾患（例えば、癌など）の処置のために使用され得る。
癌は、それらに限定されないが、黒色腫、肝細胞癌、乳癌、肺癌、腹膜癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、白血病、リンパ腫、腎癌、膵臓癌、上皮癌、胃癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、十二指腸癌、膵臓腺癌、中皮腫、多形神経膠芽腫、星細胞腫、多発性骨髄腫、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、胆管肉腫、膵臓腺癌、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、腸管型胃腺癌、頸部扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄増殖性新生物、および肉腫を含み得る。
一態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌の中の治療剤選択性を向上させ得る。一態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、また、治療的タンパク質または診断的タンパク質を運搬し、癌の近傍で、前記タンパク質またはその機能性フラグメントを発現し得る。一態様において、治療的タンパク質または診断的タンパク質は、内在性免疫応答を増強し得る。一態様において、本明細書で提供される治療的タンパク質と結合した本明細書で提供される腫瘍溶解性ウイルスおよび／またはレトロウイルスは、前記治療剤と結合していない同種のウイルスと比較して、より強い抗癌効果を有し得る。一態様において、本明細書で提供される治療的タンパク質と結合した本明細書で提供される前記腫瘍溶解性ウイルスおよび／またはレトロウイルスは、前記治療剤と結合していない同種のウイルスと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または最大約１０倍大きな抗癌効果を有し得る。一態様において、本明細書で提供される治療的タンパク質と結合した本明細書で提供される前記腫瘍溶解性ウイルスおよび／またはレトロウイルスは、前記治療剤と結合していない同種のウイルスと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または最大１００％多く癌を縮小させ得る。
一態様において、本明細書において、また、本明細書で提供される核酸、ポリペプチド、ベクター、およびプラスミドと接触させた細胞の毒性を低減させる方法も提供され得る。例えば、本明細書で提供されるウイルスをコードするベクターは、ポリシストロニックであり得、それによって多数のエレメント（例えば、ウイルスなど）を単一のベクターコンストラクトに導入し、ベクターに関連する毒性を低減させ得る。一態様において、本明細書で提供される腫瘍溶解性ウイルスと本明細書で提供される治療的タンパク質をコードするバイシストロニックベクターは、１つ目が本明細書で提供される前記腫瘍溶解性ウイルスをコードし、２つ目が前記前記治療剤をコードする、２つのモノシストロニックベクターを導入する場合と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または最大約１０倍毒性が低い。いくつかのケースにおいて、少なくとも本明細書で開示されるバイシストロニックベクターが使用される場合、各エレメントを単独でデュアルベクターシステムに導入する場合と比較して、細胞毒性は、約、少なくとも約、または最大約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％低減される。
本明細書に記載されているように、本明細書で開示されるウイルス粒子は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、少なくとも複製欠損ウイルスの部分を含む導入遺伝子を含むウイルスベクターを細胞に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるウイルスは、ＰＦＵ（プラーク形成単位）として測定され得る。いくつかのケースにおいて、本開示の組成物および方法のウイルス投与量のＰＦＵは、約１０８～約５×１０１０ＰＦＵであり得る。いくつかのケースにおいて、本明細書で提供されるウイルスの投与量は、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ＰＦＵである。いくつかのケースにおいて、本開示のウイルス投与量（ｖｉｒａｌ）は、最大約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、９×１０１５ＰＦＵである。いくつかの態様において、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定され得る。いくつかのケースにおいて、本開示のウイルスは、１×１０１０～３×１０１２ベクターゲノム、または１×１０９～３×１０１３ベクターゲノム、または１×１０８～３×１０１４ベクターゲノム、または少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ベクターゲノムであり、または１×１０８～３×１０１４ベクターゲノムであり、または最大約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ベクターゲノムである。
いくつかのケースにおいて、本開示のウイルスまたはウイルスベクターの投与量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定され得る。いくつかのケースにおいて、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの、その核酸が送達され得る細胞に対する比、または多重度を指し得る。いくつかのケースにおいて、ＭＯＩは、１×１０６ＧＣ／ｍＬ（ゲノムコピー／ｍＬ）であり得る。いくつかのケースにおいて、ＭＯＩは、１×１０５ＧＣ／ｍＬ～１×１０７ＧＣ／ｍＬであり得る。いくつかのケースにおいて、ＭＯＩは、１×１０４ＧＣ／ｍＬ～１×１０８ＧＣ／ｍＬであり得る。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１ＧＣ／ｍＬ、１×１０２ＧＣ／ｍＬ、１×１０３ＧＣ／ｍＬ、１×１０４ＧＣ／ｍＬ、１×１０５ＧＣ／ｍＬ、１×１０６ＧＣ／ｍＬ、１×１０７ＧＣ／ｍＬ、１×１０８ＧＣ／ｍＬ、１×１０９ＧＣ／ｍＬ、１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、１×１０１５ＧＣ／ｍＬ、１×１０１６ＧＣ／ｍＬ、１×１０１７ＧＣ／ｍＬ、および１×１０１８ＧＣ／ｍＬ ＭＯＩであり得る。いくつかのケースにおいて、本開示のウイルスは、約１×１０８ＧＣ／ｍＬ～約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ ＭＯＩであり、または最大約１×１０１ＧＣ／ｍＬ、１×１０２ＧＣ／ｍＬ、１×１０３ＧＣ／ｍＬ、１×１０４ＧＣ／ｍＬ、１×１０５ＧＣ／ｍＬ、１×１０６ＧＣ／ｍＬ、１×１０７ＧＣ／ｍＬ、１×１０８ＧＣ／ｍＬ、１×１０９ＧＣ／ｍＬ、１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、１×１０１５ＧＣ／ｍＬ、１×１０１６ＧＣ／ｍＬ、１×１０１７ＧＣ／ｍＬ、および１×１０１８ＧＣ／ｍＬ ＭＯＩである。
本明細書に記載されているベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合物を含む、任意の適切な方法によって送達され得る。例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクショシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するエレクトロポレーションもまた、細胞内への核酸の送達のために使用され得る。
本明細書で提供されるベクターおよびプラスミドによる細胞（例えば、生産者細胞など）のトランスフェクション効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超であり得る。いくつかの実施形態において、トランスフェクション効率は、対照の送達プラットフォーム（例えば、本明細書で提供される方法を用いずに操作されたウイルス）を使用した同種の細胞のトランスフェクション効率と比較して、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超であり得る。いくつかのケースにおいて、トランスフェクションまたは形質導入効率は、細胞の選択、選別などを用いずに定量され得る。
一態様において、本明細書で提供されるベクターは、個々の対象に対して、投与によって、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内インフュージョン）によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達され得る。
キット
本明細書において、ウイルス組成物を含むキットが開示され得る。本明細書において、癌、病原体感染、および／または免疫不全の処置または予防のためのキットが開示され得る。一実施形態において、キットは、有効量のウイルス組成物を含む、単位投与剤形の治療用または予防用組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、ウイルスの治療用組成物を含み得る滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、または当該技術分野で知られている他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔、または医薬の保持に適した他の材料で作られていてもよい。いくつかのケースにおいて、本明細書で提供されるウイルスは、前記ウイルスを、癌、病原体感染、免疫不全を有するか、発症するリスクがある対象、または移植を受けるであろう対象に対して投与するための指示と一緒に提供され得る。指示は、一般に、癌、病原体感染、免疫不全、の処置もしくは予防、または移植のための前記組成物の使用についての情報を含み得る。
以下の実施例は記載されている実施形態をさらに例証するが、本開示の範囲を限定するものではない。
実施例１：非複製レンチウイルスを含むウイルスコンストラクトのベクター設計および配列
非複製レンチウイルスを含むウイルスベクターを、以下のようにして作製した。ｅｎｖ、パッケージング、およびトランスファーエレメントを、野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２４３３１２．１のワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株（表１および配列番号１）に、図１に示すように、全て数万塩基離して組み込んだ。前記ウイルスベクターは、ワクシニアウイルスプロモーターと、ワクシニアウイルス転写因子を利用することによってＴＡＴなしで転写のために機能するＨＩＶ－１ ５’ＬＴＲとの融合物である、ハイブリッド５’ＬＴＲ領域を含む。ワクシニアウイルスの強い初期プロモーターを各コンポーネントに加え、強い初期プロモーターを前記トランスファーコンストラクトの５’ＬＴＲに融合させた。ワクシニアウイルス初期遺伝子転写の終止には、転写を停止させ、かつウイルスｍＲＮＡを保護するためのポリＡテールを生成させるワクシニアウイルス特異的因子を誘引するために、前記終止配列ＵＵＵＵＵＮＵ（Ｕ５ＮＵ）（配列番号７）を利用する。配列ＡＴＴＴＴＴＡＴ（配列番号８）を、各コンストラクトの所望の末端領域に付加した。
ｅｎｖコンストラクト
ｖｓｖｇ含有ｅｎｖコンストラクトを、ｖａｃｗｒ０３２（ｋ１ｌ）遺伝子とｖａｃｗｒ０３３（ｋ２ｌ）遺伝子の間のポイントで、前記ワクシニアウイルスゲノムを組み換えるために設計した。強いワクシニアウイルス初期プロモーター
ＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴ（配列番号９）
を使用した。
マップ、およびエレメントがそのマップと類似の色でマークされている配列を、以下に、図２および表２に示す。
表２：レンチウイルスｅｎｖコンストラクトのマップ：Ｖａｃｗｒ０３２（１－７９０）；Ｕ５ＮＵ（９０６－９１４および９１７－９２５）；ＶＳＶＧ（９２６－２４６１）；ワクシニアウイルスプロモーター（２４７０－２５０９）；ｌｏｘＰ（２５２９－２５６２および３３４３－３３７６）；ＧＦＰ（２６０６－３３２２）；Ｖａｃｗｒ０３３（３５０３－４４１６）
Figure 2022551753000052
Figure 2022551753000053
Figure 2022551753000054
 パッケージングコンストラクト
パッケージングコンストラクトを、前記ワクシニアウイルスゲノムを組み換えて、ｖａｃｗｒ０９３（Ｊ１ｒ）遺伝子とｖａｃｗｒ０３３（Ｊ３ｒ）遺伝子の間のｖａｃｗｒ０９４（Ｊ２ｒ）遺伝子のコード配列を置換するために設計した。この欠失は、ｊ２ｒ－欠失が、腫瘍細胞に優先的に感染する弱毒変異ウイルスを生成させるという理由で選択した。また、この挿入によって、前記ワクシニアウイルスゲノムの中央近傍（ここは、他のコンストラクトから比較的離れている）に、前記コンストラクトが配置される。アノテーション付きマップ、およびエレメントがそのマップと類似の色でマークされている配列を図３および表３に示す。前記パッケージングコンストラクトは、強いワクシニアウイルス初期プロモーター：
ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号１０）
を利用する。
表３：前記レンチウイルスパッケージングコンストラクトのマップ：ｖａｃｗｒ０９３（５２４－９８５）；ワクシニアウイルスプロモーター（１０００－１０３９）；ｇａｇｐｏｌ（１０４０－５３４６）；Ｕ５ＮＵ（５７５０－５７５７および５７７３－５７８０）；ｌｏｘＰ（５８６９－５９０２および６６９９－６７３２）；ＧＦＰ（５９７９－６６９８）；ｖａｃｗｒ０９５（６７９８－７７２９）
Figure 2022551753000055
Figure 2022551753000056
Figure 2022551753000057
Figure 2022551753000058
 トランスファーコンストラクト
前記トランスファーエレメントを、ｖａｃｗｒ２０５とｖａｃｗｒ２０６の間（前記ワクシニアウイルスゲノム（表１）の遠い３’末端近傍の、後期遺伝子転写物を含まない領域）に挿入した。マップ、およびエレメントがそのマップと類似の色でマークされている配列を図４および表４に示す。前記トランスファーコンストラクトは、強いワクシニアウイルス初期プロモーター：
Figure 2022551753000059
 およびヒトＰＧＫプロモーター：
Figure 2022551753000060
 を利用する。
表４：前記レンチウイルストランスファーコンストラクトのマップ：ｖａｃｗｒ２０５（１－９０５）；５’ＬＴＲ（１０１２－１１９２）；ψ（１２３９－１３６４）；ＲＲＥ（１８５７－２０９０）；ＣＭＶプロモーター（２９２６－３１２９）；ＧＦＰ（３１７４－３８９０）；ｃＰＰＴ／ＣＴＳ（４５８４－４７０１）；ｈＰＧＫプロモーター（４７５０－５２６０）；ＰＡＣ（５２８２－５８８１）；３’ＬＴＲ（６００９－６２４２）；Ｕ５ＮＵ（６２４３－６２５１）；ＳＶ４０ポリＡ（６３２３－６３３１）；ｌｏｘＰ（６４６９－６５０２および７３３２－７３６９）；ｒｆｐ（６５７９－７３１３）；ｖａｃｗｒ２０６（７４５５－８１５８）
Figure 2022551753000061
Figure 2022551753000062
Figure 2022551753000063
Figure 2022551753000064
 実施例２：非複製レンチウイルスを含むウイルスコンストラクトの作製
ウイルスコンストラクトは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された短いＤＮＡフラグメント「ｇＢｌｏｃｋｓ」、プライマーエクステンション、および／または全プラスミド合成生成物を組み合わせることによって作製した。ＢＳ－Ｃ－１細胞を、完成したプラスミドでトランスフェクトし、次いで、ＡＴＣＣから入手したＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株の野生型ワクシニアウイルスを感染させた。ｅｎｖコンストラクトで始まり、パッケージングコンストラクトが続き、そして最後が前記トランスファーコンストラクトであるという順序になるように、コンストラクトを加え、および選択した。各添加の中間で、Ｃｒｅ＋細胞で増殖させてｓｆＧＦＰまたはＴａｇＲＦＰ－Ｔを除去することによって前記ワクシニアウイルスレポーターを除去し、次いで、レポーター陰性ウイルスプラークを選択した。
Ｇａｇ／Ｐｏｌの発現
ＧＡＧ発現の検出を、ウエスタンブロットによって行った。ＢＳ－Ｃ－１細胞に、前述のウイルスを５感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。２４時間後、細胞をウエスタンブロットのために処理し、ＶｉｒｏＬａｂｓから入手したＨＲＰ標識抗ＨＩＶ－１ Ｇａｇ抗体（カタログ番号ＨＩＶＧＡＧ－ＨＲＰ、ロット番号０５１６Ｐ４）を使用してＧａｇを可視化した。Ｒｅｔｒｏ－Ｖａｃからのｇａｇｐｏｌの発現によって、完全に成熟し、プロセシングされたＧａｇタンパク質（図５に示すように、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む）が生じた。これによって、ｐｏｌ配列の開始点近傍のＨＩＶ－１リボソームフレームシフトシグナルによって誘発された－１のフレームシフトが成功しているために、ＨＩＶプロテアーゼ（ｐｏｌのＮ末端）が発現し、かつ活性であることが示された。このフレームシフトを助ける、真核生物終結因子１（ｅＲＦ１）などの宿主因子が、細胞質およびワクシニアウイルスファクトリー中に存在し得る可能性がある。このフレームシフトは、ＨＩＶ－１において、全転写イベントの５％で起こると考えられており、この割合が５％付近にとどまることが、能力のあるウイルスを生成させるために重要である。
ＶＳＶ－Ｇの発現
Ｒｅｔｒｏ－ＶａｃからのＶＳＶ－Ｇの発現が成功していることが、ウエスタンブロットによって検出された。ＢＳ－Ｃ－１細胞に、前述のウイルスを５ＭＯＩで感染させた。２４時間後、細胞をウエスタンブロットのために処理し、図６に示すように、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄからの抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（クローン ｐｏｌｙ２９０３９）（カタログ番号９０３９０１、ロット番号Ｂ２３２５４８）を使用してＶＳＶ－Ｇを可視化した。ＶＳＶ－Ｇは、５７．４ｋＤａであると予想された。
レポーター遺伝子は、レトロウイルス生成が成功したことを示す
全てのレンチウイルスコンストラクトを同じワクシニアウイルス系統に導入したら、次いで、共通のレンチウイルス増殖細胞株ＨＥＫ２９３で最終産物を増殖させた。感染の２４時間後、図７に示すように、ウイルスプラーク内で、前記ワクシニアウイルスからのＴａｇＲＦＰ－Ｔレポーターを、蛍光顕微鏡法を用いて可視化した。さらに、ウイルスプラーク内に散在する細胞について、前記レトロウイルストランスファーコンストラクト内のｓｆＧＦＰレポーターを検出した。これによって、レトロウイルスが、ワクシニアウイルス感染細胞から生成されており、また、隣接する細胞を形質転換していることが示された。
実施例３：ウイルス粒子の回収
ウイルス粒子を単離するために、トランスフェクションの２４時間前に、約１２×１０６個の２９３Ｔ細胞（２０ｍｌ）を、１５ｃｍ２プレート上に蒔く。一般に、２枚の１５ｃｍプレートを使用する。細胞は、適切に維持し、比較的少ない継代数にすべきである。以下のステップは、一度に１プレートずつ行う。２ｍｌの２×ＨＢＳを、バブリングしながら、パスツールピペットで、前記ＤＮＡ混合物に滴下で添加した。完了した後、混合物を１２～１５秒間バブリングした。２９３Ｔのプレートをインキュベーターから取り出し（プレートは、できる限り長くインキュベーター内に入れておく）、プレート全体にわたってトランスフェクション混合物を滴下で加える。プレートを、前後に穏やかに回旋させ、速やかにインキュベーターに戻す。３．５～４時間後、培地を除去し、１０ｍｌの温ＰＢＳで２回洗浄し、プレート上に２０ｍｌの温Ｄ１０を加え、インキュベーター内に置く。トランスフェクションの３６～４８時間後、ウイルス上清を採取し、５０ｍｌ管で、２０００ｒｐｍ、４℃で、７分間遠心する。
ウイルスＳＮを、４５μｍフィルターで濾過する。３５ｍｌの濾過した上清を、超遠心管に入れる。追加の培地で管のバランスを取る。パラフィルムの小片を管にかぶせる。（残りの上清の一部の力価を求めることは、濃縮中にウイルスのロスがあるか否かを判定するために有用である。）管を、ＳＷ－２８ローターを使用して、２５，０００ｒｐｍ、４℃で、９０分間遠心する。液体をデカントし、管をキムワイプ上に１０分間伏せておく。管の底に付かないように注意しながら、残った培地を吸引する。１５μｌの冷ＰＢＳ（胚感染について、または所望の任意の量）を加え、管を、振盪せずに、４℃で終夜放置する。再懸濁のために、管を傾けて保持し、先端がペレットに付かないように注意しながら、ペレット上の液体を２０回ピペッティングする。この操作後、再懸濁されていないペレットが完全になくなることが求められる。このペレットはウイルスを含まず、廃棄してもよい。ウイルスをアリコートするか、または使用する。ウイルスは、アリコートし、液体窒素で急速冷凍し、－８０で保存すべきである。濃縮されたウイルスを凍結することによって、力価に変化がないべきである。複数回の凍結融解は避ける。
別の実験において、本明細書に記載されているベクターから生成されたウイルスを細胞に感染させる。産生が増強されたミュータントを優先的に選択するために、前記ウイルスプールを感染させたフラスコからの培地を、非感染フラスコに加える。連続的な感染を数回繰り返した後、クローン性プラークを単離する。
実施例４：細胞生存率アッセイ
１つの実験において、ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートでコンフルエントになるまで増殖させ、１ＭＯＩのＲｅｔｒｏ－Ｖａｃで感染させる。２４時間後、１ｍｌの上清を抜き取り、８００ｇで遠心し、次いで、５００μｌの上清を抜き取り、ウイルスプラークアッセイに使用する。段階希釈の間、サンプルを抗Ｌ１ ＮＲ－４５１１４抗体または抗ＶＩＧ抗体で処理し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、希釈物を、プラークアッセイのために、コンフルエントなＢＳ－Ｃ－４０細胞の６ウェルプレートに加える。
１．５時間後、培地を、３％ＣＭＣのＣＭ１０で交換した。４８時間後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、ウイルスプラークをカウントして、前記ＨｅＬａ細胞上清中のウイルスの力価および中和抗体のブロッキング能力を決定する。
別の実験において、９６ウェルプレートにおいて、ＨＣＴ１１６またはＭＣ３８細胞株を播種し、９０％コンフルエントになるまで増殖させる。次いで、細胞に、本明細書で提供されるウイルスベクター（例えば、本明細書で提供される配列を含む）から生成された１ＭＯＩのウイルスを感染させる。毎日、２４時間ごとに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞生存率を調べる。全てのウェルからブランク値の平均を差し引き、未感染対照群の平均値を算出し、次いで各感染ウェルの相対値を（Ａ４９０／未感染細胞の平均）として算出することによって、相対的生存率を算出する。
実施例５：マウスにおけるウイルスベクターの腫瘍溶解能の試験
この研究の目的は、マウスの癌マウスモデルにおいて、提供されたウイルスベクターの効果を、他のベクター（例えば、対照ベクター）と比較して探索することである。
１つの実験において、非複製レンチウイルスを生成させるウイルスベクターを、ビヒクル（緩衝生理食塩水）対照、およびレンチウイルスベクターを生成させない別の改変ワクシニアウイルスと比較する。前記２種のウイルス（１×１０７ＰＦＵ）のいずれか１つ、または前記生理食塩水の一用量を投与して、未確立のＲＥＮＣＡ腫瘍を皮下移植したＢＡＬＢ／ｃマウスを処置する。腫瘍体積を、ノギス測定によってモニターする。
別の実験において、異なるマウス腫瘍モデルである、皮下にＢ１６腫瘍を担持するＣ５７／ＢＬ６マウスを、Ｒｅｔｒｏ－Ｖａｃウイルスの効果を試験するために使用する。前記腫瘍移植の９６時間後に、マウスに対して、どちらかのウイルスの単回静脈内注射を行い（１×１０８ＰＦＵ／マウス、１時点につき、１群あたりｎ＝５）、次いで、前記マウスを、前記注射後１日または２日後に屠殺する。腫瘍１グラムあたりのウイルスゲノム数をｑＰＣＲで定量するために、腫瘍を採取する。
１つの実験において、同所性（乳房脂肪パッド）４Ｔ１腫瘍を皮下に担持するマウスにおいて、Ｒｅｔｒｏ－Ｖａｃベクターを試験する。各マウスを、１×１０８ＰＦＵの用量で、Ｒｅｔｒｏ－Ｖａｃベクターの単回注射で処置する。腫瘍中のウイルス数を、注射後毎日３日間、ｉｎ ｖｉｖｏで、生物発光イメージングおよびルシフェラーゼ活性の測定によって定量する。前記ウイルスの治療効果も調べる。腫瘍体積を、マウスの生存率（％）と共にモニターする。
別の実験において、同じウイルスを、異なる腫瘍モデルである、皮下にＢ１６腫瘍を担持するＣ５７／ＢＬ６マウスで試験する。
別の実験において、異なる癌細胞株における非複製レンチウイルスを含むウイルスについてのウイルス複製能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、プラークアッセイによって調べる。前記細胞株に前記ウイルスを加えた後、２４時間ごとに、プラーク形成を定量する。結果をモニターすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増幅された効果を検出できるか否かが決定されるであろう。
ＣＸＣＲ４発現によって与えられる増強された治療効果の根底にあるメカニズムの理解を開始する試みにおいて、Ｂ細胞が枯渇したトランスジェニックマウス（本明細書においてＪＨと呼ぶ）を使用して実験を行う。上記のウイルスを、Ｂ細胞を有するＢＡＬＢ／ｃマウス、およびＢ細胞を欠くＪＨマウス（これらは、両方とも、未確立の４Ｔ１腫瘍が皮下に移植されている）に投与する。腫瘍におけるＲｅｔｒｏ－Ｖａｃウイルスの蓄積が増加を示すか否かを決定するために、生物発光イメージング放射が用いられる。４Ｔ１腫瘍を皮下に担持するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｂ細胞の腫瘍内への侵入があるが、例えば脾臓またはリンパ節（ＬＮ）のような他の器官への侵入はないか否かを決定するために、フローサイトメトリー実験も行われる。
別の実験において、４Ｔ１腫瘍が皮下に移植され、次いで上記のように処理されたマウスからＴ細胞を回収し、その免疫活性を、異なる免疫源に応答したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の放出を試験するエリスポットアッセイによって調べる。試験されたＴ細胞は、前記ウイルス注射の１４日後に脾臓から回収される。
１つの実験において、皮下にＲＥＮＣＡ腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｒｅｔｒｏ－Ｖａｃの単回静脈内注射（１×１０７ＰＦＵ）によって処理する。２４時間後に腫瘍を採取し、組織１ミリグラムあたりのウイルスゲノム数をｑＰＣＲによって定量する。
別の実験において、皮下にＲＥＮＣＡ腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、第１日および４日に、同じ４種の改変ウイルスの１つの静脈内注射（１×１０７ＰＦＵ）によって処理し、腫瘍体積を上記のようにモニターする。
別の実験において、上記の前記ウイルス注射後の１４日間、腫瘍サンプル中のレンチウイルス発現をアッセイする。このシステムを使用することによって、前記ＰＤ１チェックポイント阻害剤の長期的な発現が調節されることが期待される。
実施例６：ガンマレトロウイルスコンポーネントを有するＲＥＴＲＯ－ＶＡＣ
本開示の例示的なＲｅｔｒｏ－Ｖａｃが設計され、ここで、前記パッケージングおよびトランスファーコンストラクトの前記レンチウイルスコンポーネントは、ガンマレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ））のものと置き換えられる。レンチウイルスのシステムと比較して、ＭＭＬＶのようなガンマレトロウイルスは、活発に分裂している細胞によってのみ、選択的な感染および組み込みを示す。よって、このアプローチは、活発に分裂している新生物細胞に感染を限定することによって、安全性プロファイルおよびレトロウイルス標的化の特異性を向上させることが期待され得る。
実施例７：Ｔ７ポリメラーゼ発現システムを有するＲＥＴＲＯ－ＶＡＣ
ポックスウイルスシステムにおいて、初期遺伝子転写は、コピー数が少なく、寿命が短く、かつ安定性が低いウイルスｍＲＮＡを生じさせ得るが、中期および後期遺伝子転写は、最も豊富で、コピー数が多く、かつ安定なウイルスｍＲＮＡを生じさせ得る。初期遺伝子由来のｍＲＮＡは、クリーンな転写開始点（ＴＳＳ）を有し、特異的なウイルス終止部位で終わる。しかしながら、中期および後期遺伝子は、５’ポリＡキャップを含むように改変されており、また、終止は、未制御かつ高可変性であり得る。よって、レンチウイルストランスファーコンストラクト由来のレトロウイルスｇＲＮＡとして適切なＲＮＡを作製するためには、正確なＴＳＳおよび終止がレトロウイルスＲＮＡパッケージングに必須であることを考慮すると、信頼することができるのは、通常、初期遺伝子転写だけである。これによって、前記トランスファーコンストラクトの転写が、コピー数が少なく、安定性が低いシステムに制限される。この制限を回避するために、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに基づく発現システムを有するワクシニアウイルスが作製される。このバージョンのＲｅｔｒｏ－Ｖａｃシステムは、また、前記レンチウイルストランスファーコンストラクトの上流の１８ｂｐプロモーターに対して高い特異性で結合する、Ｔ７ポリメラーゼ（配列番号８は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列を提供する）も発現することができる。転写は、高効率な終止部位で停止するまで継続し得る。このシステムは、初期のみのＶＶ転写と比較して、はるかに多くのＲＮＡコピーを生成し、また、ＲＮＡ末端のより高度な制御も可能にし得る。前記トランスファーコンストラクトの転写は、レンチウイルス生成における律速段階であり得るため、Ｒｅｔｒｏ－ＶａｃにこのＴ７ポリメラーゼシステムを加えることによって、レンチウイルス力価が著しく向上することが予想される。このようなコンストラクトの例を図８に示す。コンストラクトを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの例示的な配列は、配列番号７として提供されている。
Figure 2022551753000065
Figure 2022551753000066
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Claims (135)

  1. そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスであって、前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、ウイルス。
  2. 前記非複製レトロウイルスが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項１のウイルス。
  3. そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させるウイルスであって、前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスであり、前記非複製レトロウイルスが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記非複製レトロウイルスが、腫瘍微小環境において、前記腫瘍溶解性ウイルスが感染した細胞内、および前記腫瘍溶解性ウイルスが感染していない細胞内で、前記非レトロウイルスタンパク質を発現する能力がある、ウイルス。
  4. そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させる腫瘍溶解性ウイルスであって、前記非複製レトロウイルスが、非レンチウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記非複製レトロウイルスが、哺乳動物細胞の標的集団における分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染および形質導入する能力がある、腫瘍溶解性ウイルス。
  5. 非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスであって、前記導入遺伝子が、非複製レトロウイルスのタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む外来性核酸コンストラクトの中にあり、前記ウイルスが、腫瘍溶解性である、ウイルス。
  6. レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッキングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを含むウイルスであって、前記エンベロープコンストラクト、前記パッケージングコンストラクト、または前記トランスファーコンストラクトの少なくとも１つが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、ウイルス。
  7. 前記エンベロープコンストラクト、前記パッキングコンストラクト、および前記トランスファーコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ウイルスの前記ゲノムの中の異なる位置に挿入されている、請求項６のウイルス。
  8. 前記エンベロープコンストラクトが、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記パッケージングコンストラクトが、レトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項６または７のウイルス。
  9. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子が、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子が、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある、請求項８のウイルス。
  10. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子が、第１の初期ウイルスプロモーター、第１の初期／後期ウイルスプロモーター、または第１の後期ウイルスプロモーターの制御下にあり；レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子が、第２の初期ウイルスプロモーター、第２の初期／後期ウイルスプロモーター、または第２の後期ウイルスプロモーターの制御下にある、請求項８のウイルス。
  11. 前記エンベロープコンストラクトが、５’末端領域に終止配列をさらに含む、請求項６～１０のいずれか一項のウイルス。
  12. 前記パッケージングコンストラクトが、３’末端領域に終止配列をさらに含む、請求項６～１１のいずれか一項のウイルス。
  13. 前記トランスファーコンストラクトが、３’末端反復領域を含む、請求項６～１２のいずれか一項のウイルス。
  14. 前記トランスファーコンストラクトが、ハイブリッド５’末端反復領域を含む、請求項６～１３のいずれか一項のウイルス。
  15. 前記ハイブリッド５’末端反復領域が、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む、請求項１４のウイルス。
  16. 前記ハイブリッド５’末端反復領域が、ＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域およびウイルスプロモーターを含み、前記ウイルスプロモーターが、第３の初期ウイルスプロモーター、第３の初期／後期ウイルスプロモーター、または第３の後期ウイルスプロモーターである、請求項１４のウイルス。
  17. 前記トランスファーコンストラクトが、自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする遺伝子をさらに含む、請求項６～１６のいずれか一項のウイルス。
  18. 前記自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする前記遺伝子が、前記トランスファーコンストラクトの前記３’末端反復領域の下流に位置する、請求項１７のウイルス。
  19. 前記自己切断リボザイムが、デルタウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムを含む、請求項１８のウイルス。
  20. 前記パッケージングコンストラクトが、５’末端反復領域を含み、前記第２の初期ウイルスプロモーターが、前記５’末端反復領域に融合されている、請求項９～１９のいずれか一項のウイルス。
  21. 前記エンベロープコンストラクトが、５’末端領域に終止配列を含む、請求項６～２０のいずれか一項のウイルス。
  22. 前記パッケージングコンストラクトが、３’末端領域に終止配列を含む、請求項６～２１のいずれか一項のウイルス。
  23. 前記トランスファーコンストラクトが、３’末端領域に終止配列を含む、請求項６～２２のいずれか一項のウイルス。
  24. 前記終止配列が、配列番号７に規定されているヌクレオチド配列を含む、請求項１１～２３のいずれか一項のウイルス。
  25. 前記レトロウイルス構造タンパク質が、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む、請求項８～２４のいずれか一項のウイルス。
  26. 前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質が、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む、請求項２５のウイルス。
  27. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質が、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む、請求項８～２６のいずれか一項のウイルス。
  28. 核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項１～３および５～２７のいずれか一項のウイルス。
  29. 前記核酸ポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される、請求項２８のウイルス。
  30. バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項１～３および５～２７のいずれか一項のウイルス。
  31. 前記バクテリオファージが、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される、請求項３０のウイルス。
  32. Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼが、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される、請求項３１のウイルス。
  33. 核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項４の腫瘍溶解性ウイルス。
  34. 前記核酸ポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される、請求項３３の腫瘍溶解性ウイルス。
  35. バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項４の腫瘍溶解性ウイルス。
  36. 前記バクテリオファージが、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される、請求項３５の腫瘍溶解性ウイルス。
  37. Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼが、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される、請求項３６の腫瘍溶解性ウイルス。
  38. （ｉ）ウイルスのゲノム内の第１の位置に挿入されたレトロウイルスエンベロープコンストラクト；および（ｉｉ）前記ウイルスのゲノム内の第２の位置に挿入されたレトロウイルスパッケージングコンストラクト、を含むウイルスであって、前記第１の位置と前記第２の位置が、隣接しておらず、前記エンベロープコンストラクトが、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含み、前記パッケージングコンストラクトが、レトロウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含み、前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、ウイルス。
  39. （ｉｉｉ）前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノム内の第３の位置に挿入されたトランスファーコンストラクトをさらに含む、請求項３８のウイルス。
  40. 前記トランスファーコンストラクトが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項３９のウイルス。
  41. 前記トランスファーコンストラクトが、前記前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムの３’末端の近傍に挿入されている、請求項３９または４０のウイルス。
  42. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子が、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子が、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある、請求項３８～４１のいずれか一項のウイルス。
  43. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子が、第１の初期ウイルスプロモーター、第１の初期／後期ウイルスプロモーター、または第１の後期ウイルスプロモーターの制御下にあり；レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子が、第２の初期ウイルスプロモーター、第２の初期／後期ウイルスプロモーター、または第２の後期ウイルスプロモーターの制御下にある、請求項３８～４１のいずれか一項のウイルス。
  44. 前記トランスファーコンストラクトが、ハイブリッド５’末端反復領域を含む、請求項３８～４２のいずれか一項のウイルス。
  45. 前記ハイブリッド５’末端反復領域が、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む、請求項４４のウイルス。
  46. 前記ハイブリッド５’末端反復領域が、ＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域およびウイルスプロモーターを含み、前記ウイルスプロモーターが、第３の初期ウイルスプロモーター、第３の初期／後期ウイルスプロモーター、または第３の後期ウイルスプロモーターである、請求項４４のウイルス。
  47. 前記トランスファーコンストラクトが、自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする遺伝子をさらに含む、請求項３９～４６のいずれか一項のウイルス。
  48. 前記自己切断ＲＮＡリボザイムをコードする前記遺伝子が、前記トランスファーコンストラクトの前記３’末端反復領域の下流に位置する、請求項４７のウイルス。
  49. 前記自己切断リボザイムが、デルタウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムを含む、請求項４８のウイルス。
  50. 前記パッケージングコンストラクトが、５’末端反復領域を含み、前記第２の初期ウイルスプロモーターが、前記５’末端反復領域に融合されている、請求項４２～４９のいずれか一項のウイルス。
  51. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記核酸が、配列番号１に規定されているヌクレオチド配列、または配列番号１として規定されている配列と少なくとも約７０％～少なくとも約９９％相同なヌクレオチド配列を含む、請求項３８～５０のいずれか一項のウイルス。
  52. 前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記核酸が、配列番号２に規定されているヌクレオチド配列、または配列番号２として規定されている配列と少なくとも約７０％～少なくとも約９９％相同なヌクレオチド配列を含む、請求項３８～５１のいずれか一項のウイルス。
  53. 前記トランスファーコンストラクトが、３’末端反復領域を含む、請求項３８～５２のいずれか一項のウイルス。
  54. 前記エンベロープコンストラクトが、５’末端領域に終止配列を含む、請求項３８～５３のいずれか一項のウイルス。
  55. 前記パッケージングコンストラクトが、３’末端領域に終止配列を含む、請求項３８～５４のいずれか一項のウイルス。
  56. 前記トランスファーコンストラクトが、３’末端領域に終止配列を含む、請求項３９～５５のいずれか一項のウイルス。
  57. 前記終止配列が、配列番号５に規定されているヌクレオチド配列を含む、請求項５３～５６のいずれか一項のウイルス。
  58. 前記第１の位置と前記第２の位置が、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている、請求項３８～５７のいずれか一項のウイルス。
  59. 前記第１の位置と前記第３の位置が、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている、請求項３９～５８のいずれか一項のウイルス。
  60. 前記第２の位置と前記第３の位置が、少なくとも約１０，０００塩基隔てられている、請求項３９～５９のいずれか一項のウイルス。
  61. 前記構造タンパク質が、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む、請求項３８～６０のいずれか一項のウイルス。
  62. 前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質が、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む、請求項６１のウイルス。
  63. 前記エンベロープタンパク質が、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む、請求項３８～６２のいずれか一項のウイルス。
  64. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、複製において、腫瘍選択的である、請求項１～６３のいずれか一項のウイルス。
  65. 前記非複製レトロウイルスが、腫瘍微小環境の中で選択的に生成される、請求項６４のウイルス。
  66. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項１～６５のいずれか一項のウイルス。
  67. 前記第１の初期ウイルスプロモーター、前記第２の初期ウイルスプロモーター、および前記第３の初期ウイルスプロモーターを含み、前記第１の初期ウイルスプロモーターが、第１のワクシニアウイルス初期プロモーターであり、前記第２の初期ウイルスプロモーターが、第２のワクシニアウイルス初期プロモーターであり、前記第３の初期ウイルスプロモーターが、第３のワクシニアウイルス初期プロモーターである、請求項６６のウイルス。
  68. 前記第１のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号９に規定されている配列を含む、請求項６７のウイルス。
  69. 前記第２のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号１０に規定されている配列を含む、請求項６７または６８のウイルス。
  70. 前記第３のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号１１として規定されている配列を含む、請求項６７～６９のいずれか一項のウイルス。
  71. 前記トランスファーコンストラクトが、ヒトＰＧＫプロモーター（配列番号１２）を含む、請求項６～３７および３９～７０のいずれか一項のウイルス。
  72. 前記エンベロープコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２と遺伝子ｖａｃｗｒ０３３の間に挿入されている、請求項６６～７１のいずれか一項のウイルス。
  73. 前記パッケージングコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５の間に挿入されている、請求項６６～７２のいずれか一項のウイルス。
  74. 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの前記ゲノムが、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の欠失を含み、前記パッケージングコンストラクトが、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の位置に挿入されている、請求項６～７３のいずれか一項のウイルス。
  75. 前記トランスファーコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ２０５と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６の間に挿入されている、請求項６６～７４のいずれか一項のウイルス。
  76. 前記非レトロウイルスタンパク質が、治療的タンパク質または診断的タンパク質を含む、請求項１～７５のいずれか一項のウイルス。
  77. 前記非レトロウイルスタンパク質が、前記治療的タンパク質を含み、前記治療的タンパク質が、免疫チェックポイントモジュレーター、抗体またはその部分、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびそれらの任意の組合せを含む、請求項７６のウイルス。
  78. 前記レトロウイルスが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである、請求項１～７７のいずれか一項のウイルス。
  79. 前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項７８のウイルス。
  80. 前記レンチウイルスが、ＨＩＶである、請求項７９のウイルス。
  81. 前記レトロウイルスが、ガンマレトロウイルスである、請求項７８のウイルス。
  82. 前記ガンマレトロウイルスが、モロニーマウス白血病ウイルスである、請求項８１のウイルス。
  83. 核酸ポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項７８～８０のいずれか一項のウイルス。
  84. 前記核酸ポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにＤＮＡポリメラーゼミュータントからなる群から選択される、請求項８３のウイルス。
  85. バクテリオファージポリメラーゼをコードする外来性核酸配列を含む、請求項７８～８０のいずれか一項のウイルス。
  86. 前記バクテリオファージが、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、およびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択される、請求項８５のウイルス。
  87. Ｔ３バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ３バクテリオファージプロモーターによって発現され、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼが、Ｔ７バクテリオファージプロモーターによって発現され、ＳＰ６バクテリオファージポリメラーゼが、ＳＰ６バクテリオファージプロモーターによって発現される、請求項８６のウイルス。
  88. 癌を処置する方法であって、請求項１～８７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含み、前記腫瘍溶解性ウイルスから生成される前記非複製レトロウイルスが、選択的に腫瘍組織を標的にする、方法。
  89. 前記腫瘍組織が、悪性新生物組織を含む、請求項８８の方法。
  90. そのゲノムから非複製レトロウイルスを生成させる操作された生産者ウイルスであって、前記操作された生産者ウイルスが、以下の改変：
    ｉ．少なくとも１つのウイルス遺伝子の変異または欠失：
    ｉｉ．少なくとも１つの外来性核酸の挿入；
    ｉｉｉ．トロピズムの変更；または
    ｉｖ．それらの任意の組合せ
    の少なくとも１つを含む、操作された生産者ウイルス。
  91. 前記非複製レトロウイルスが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項９０の操作された生産者ウイルス。
  92. 生産者ウイルスが、ワクシニアウイルスであり、前記少なくとも１つのウイルス遺伝子が、Ｂ５Ｒ、Ａ５２Ｒ（ＶＡＣＷＲ１７８）、Ｆ１３Ｌ、Ａ３６Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３３Ｒ、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、ＳＰＩ－１、ＳＰＩ－２、Ｂ１５Ｒ、ＶＧＦ、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｃ１２Ｌ、ＴＫ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９０または９１の操作された生産者ウイルス。
  93. 前記少なくとも１つの外来性核酸が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＰＨ－２０、ＨＭＧＢ１、ＰＩＡＳ３、ＩＬ１５、ＩＬ１５－Ｒα、ＬＩＧＨＴ、ＩＴＡＣ、フラクタルカイン、ＣＣＬ５、代謝調節タンパク質、サイトカイン、上記の任意の組合せを含む融合タンパク質、およびその機能ドメインまたはフラグメントもしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項９０～９２いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  94. 前記少なくとも１つの外来性核酸が、ＰＩＡＳ３をコードする、請求項９３の操作された生産者ウイルス。
  95. 前記生産者ウイルスが、レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッケージングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを含み、前記エンベロープコンストラクト、前記パッキングコンストラクト、および前記トランスファーコンストラクトが、前記生産者ウイルスの前記ゲノムの中の異なる位置に挿入されている、請求項９０～９４いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  96. 前記エンベロープコンストラクトが、レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記パッケージングコンストラクトが、レトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項９５の操作された生産者ウイルス。
  97. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする前記遺伝子が、第１の初期ウイルスプロモーターの制御下にあり、前記レトロウイルス構造タンパク質をコードする前記遺伝子が、第２の初期ウイルスプロモーターの制御下にある、請求項９６の操作された生産者ウイルス。
  98. 前記エンベロープコンストラクトが、５’末端領域に終止配列をさらに含む、請求項９５～９７いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  99. 前記パッケージングコンストラクトが、その３’末端領域に終止配列をさらに含む、請求項９５～９８いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  100. 前記トランスファーコンストラクトが、終止配列を含む、請求項９５～９９いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  101. 前記トランスファーコンストラクトが、ハイブリッド５’末端反復領域を含む、請求項９５～１００いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  102. 前記ハイブリッド５’末端反復領域が、第３の初期ウイルスプロモーターおよびＨＩＶ－１タンパク質５’末端反復領域を含む、請求項１０１の操作された生産者ウイルス。
  103. 前記パッケージングコンストラクトが、５’末端反復領域を含み、前記第２の初期ウイルスプロモーターが、前記５’末端反復領域に融合されている、請求項９５～１０２いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  104. 前記エンベロープコンストラクトが、５’末端領域に終止配列を含む、請求項９５～１０３いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  105. 前記パッケージングコンストラクトが、３’末端領域に終止配列を含む、請求項９５～１０４いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  106. 前記トランスファーコンストラクトが、終止配列を含む、請求項９５～１０５いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  107. 前記終止配列が、配列番号７に規定されているヌクレオチド配列を含む、請求項１０４～１０６いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  108. 前記レトロウイルス構造タンパク質が、成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質を含む、請求項９６～１０７いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  109. 前記成熟Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質が、ｐ５５、ｐ４１、およびｐ２４を含む、請求項１０８の操作された生産者ウイルス。
  110. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質が、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含む、請求項９６～１０９いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  111. 前記生産者ウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項９５～１１０いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  112. 前記エンベロープコンストラクトが、第１の初期ワクシニアプロモーターを含み、前記パッケージングコンストラクトが、第２の初期ワクシニアプロモーターを含み、前記トランスファーコンストラクトが、第３の初期ワクシニアプロモーターを含む、請求項１１１の操作された生産者ウイルス。
  113. 前記第１のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号９に規定されている配列を含む、請求項１１２の操作された生産者ウイルス。
  114. 前記第２のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号１０に規定されている配列を含む、請求項１１２または１１３の操作された生産者ウイルス。
  115. 前記第３のワクシニアウイルス初期プロモーターが、配列番号１１として規定されている配列を含む、請求項１１２～１１４いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  116. 前記トランスファーコンストラクトが、ヒトＰＧＫプロモーター（配列番号１２）を含む、請求項９５～１１５いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  117. 前記エンベロープコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０３２と遺伝子ｖａｃｗｒ０３３の間に挿入されている、請求項９５～１１６いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  118. 前記パッケージングコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ０９３と遺伝子ｖａｃｗｒ０９５の間に挿入されている、請求項９５～１１６いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  119. 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの前記ゲノムが、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の欠失を含み、前記パッケージングコンストラクトが、前記ｖａｃｗｒ０９４遺伝子の位置に挿入されている、請求項９５～１１８いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  120. 前記トランスファーコンストラクトが、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの遺伝子ｖａｃｗｒ２０５と遺伝子ｖａｃｗｒ２０６の間に挿入されている、請求項９５～１１９いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  121. 前記非レトロウイルスタンパク質が、治療的タンパク質または診断的タンパク質を含む、請求項９０～１２０いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  122. 前記非レトロウイルスタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含み、前記非レトロウイルスタンパク質が、前記治療的タンパク質を含み、前記治療的タンパク質が、免疫チェックポイントモジュレーター、抗体またはその部分、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびそれらの任意の組合せを含む、請求項１２１の操作された生産者ウイルス。
  123. 前記レトロウイルスが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである、請求項９０～１２２いずれか一項の操作された生産者ウイルス。
  124. 前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１２３の操作された生産者ウイルス。
  125. 前記レンチウイルスが、ＨＩＶである、請求項１２４の操作された生産者ウイルス。
  126. 前記レトロウイルスが、ガンマレトロウイルスである、請求項１２３の操作された生産者ウイルス。
  127. 前記ガンマレトロウイルスが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）である、請求項１２６の操作された生産者ウイルス。
  128. 癌を処置する方法であって、請求項９０～１２７のいずれか一項に記載の操作された生産者ウイルスを対象に投与することを含み、前記操作された生産者ウイルスから生成される前記非複製レトロウイルスが、選択的に腫瘍組織を標的にする、方法。
  129. 前記腫瘍組織が、悪性新生物組織を含む、請求項１２８の方法。
  130. 非複製レトロウイルスを生成させる腫瘍溶解性ウイルスを生成させるためのプロセスであって、前記プロセスが、哺乳動物細胞内で前記腫瘍溶解性ウイルスの集団を増殖させること、次いで、順次、レトロウイルスエンベロープコンストラクト、レトロウイルスパッケージングコンストラクト、およびレトロウイルストランスファーコンストラクトを加えること、および選択することを含み、前記エンベロープコンストラクト、前記パッケージングコンストラクト、または前記トランスファーコンストラクトの少なくとも１つが、非レトロウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、プロセス。
  131. 前記レトロウイルスが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、またはレンチウイルスである、請求項１３０のプロセス。
  132. 前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１３１のプロセス。
  133. 前記レンチウイルスが、ＨＩＶである、請求項１３２のプロセス。
  134. 前記レトロウイルスが、ガンマレトロウイルスである、請求項１３１のプロセス。
  135. 前記ガンマレトロウイルスが、モロニーマウス白血病ウイルスである、請求項１３４のプロセス。
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