JP2018519827A - 逆配向のヒトユビキチンｃプロモーターを含むレトロウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

特定の実施形態では、導入遺伝子に機能可能に連結したヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、そのプロモーターからの導入遺伝子の転写方向が、そのベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうように、そのプロモーターと導入遺伝子が逆配向になっているベクターを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年７月１日に提出されたＵＳＳＮ６２／１８７，６７８（あらゆる目的において、参照により、その全体が本明細書に援用される）に基づく優先権と利益を主張するものである。
政府支援の言明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより付与された助成金番号ＨＬ０７３１０４の下で、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
ヒト細胞への遺伝子輸送は、先天性の酵素欠損または血液悪性腫瘍のような、ヒトの様々な疾患における遺伝子の変化を修正したりまたはこのような変化から保護したりする手段として探究されてきた。オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを含む様々な遺伝子トランスダクションシステムが開発されてきた。しかしながら、これらの様々なベクターシステムにもかかわらず、治療の有効性を得るには、細胞トランスダクション効率は依然として低いことがある。
ＵＳＳＮ６２／１８７，６７８
有効なベクターの必要性が十分に認識されているにもかかわらず、標的細胞の大半において、導入遺伝子を高レベルで発現させることは、遺伝子移入技術の重要な課題となっている。
様々な実施形態において、逆配向のヒトユビキチンＣプロモーターを含むレトロウイルスベクターと、そのベクターを含むウイルス粒子と、そのベクターでトランスダクションした宿主細胞と、それらを用いる治療方法を提供する。
本発明で想定されている様々な実施形態としては、下記のうちの１つ以上を挙げてよいが、これらに限定する必要はない。
実施形態１：ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターとマルチクローニングサイトを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、前記プロモーターからの転写方向が、前記ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうとともに、前記マルチクローニングサイトに挿入される核酸を転写するように、前記ＵＢＣプロモーターが、前記ベクターにおいて逆配向になっている前記ベクター。
実施形態２：導入遺伝子に機能可能に連結したヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、前記プロモーターからの前記導入遺伝子の転写方向が、前記ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうように、前記プロモーターと前記導入遺伝子が逆配向になっている前記ベクター。
実施形態３：前記プロモーターが、ヒトユビキチンＣ遺伝子ＵＣＳＣヒトゲノム配列バージョンｈｇ１９マイナス鎖の１２５３９８３１８位のあたりから１２５３９９５３０位のあたりまでの断片を含むか、またはその断片からなる、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４：前記プロモーター内のイントロンが、レトロウイルスのパッケージング中に失われない、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態５：逆配向のポリアデニル化シグナルを含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態６：前記ベクターの全配列に対しては前記プロモーターの５’である、前記プロモーターの３’側に、前記ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）が挿入されている、実施形態５に記載のベクター。
実施形態７：前記ポリアデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナル、ヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリアデニル化シグナル、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナル、及び既存のゲノムから抽出したかまたはインシリコで設計して合成したその他のシグナルからなる群から選択されている、実施形態５〜６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態８：前記ポリアデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列またはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態５〜６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態９：逆配向ではないＵＢＣプロモーターを含む同じベクターと比べて、一過性にトランスフェクションした細胞株と、安定的にトランスダクションした細胞株における発現を少なくとも約２倍増大させる、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１０：逆配向ではないＵＢＣプロモーターを含む同じベクターと比べて、トランスダクション済み初代細胞における発現を少なくとも約４倍増大させる、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１１：前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクター、ＨＩＶ−２レンチウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルスベクター、ＭｏＭＬＶベクター、Ｘ−ＭＬＶベクター、Ｐ−ＭＬＶベクター、Ａ−ＭＬＶベクター、ＧＡＬＶベクター、ＨＥＶ−Ｗベクター、ＳＩＶ−１ベクター、ＦＩＶ−１ベクター及びＳＥＲＶ−１−５ベクターからなる群から選択されている、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１２：前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態１１に記載のベクター。
実施形態１３：前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターである、実施形態１２に記載のベクター。
実施形態１４：前記レンチウイルスベクターが、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである、実施形態１２〜１３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１５：双方向性ベクターである、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１６：３’ＬＴＲにインスレーターをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１７：前記インスレーターが、ニワトリβ−グロビン５’ＤｎａｓｅＩ高感受性部位４（５’ＨＳ４）の最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサーブロッキング成分を含むＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）（７７ｂｐのインスレーターエレメント）を含む、実施形態１６に記載のベクター。
実施形態１８：ψ領域というベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１９：Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２０：セントラルポリプリントラクトを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２１：翻訳後調節エレメントを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２２：前記転写後調節エレメントが、改変したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、実施形態２１に記載のベクター。
実施形態２３：組み換えを通じて、野生型レンチウイルスを再構成できない、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２４：前記ベクターが、前記ＵＢＣプロモーターに機能可能に連結した導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が、ＳＣＩＤ、鎌状赤血球症、リポソーム蓄積症、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、フェニールケトン尿、パーキンソン病及び血友病からなる群から選択した病態を治療するための遺伝子産物を発現する、実施形態２〜２３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２５：アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、ヤヌスキナーゼ−３（ＪＡＫ３）、Ａｒｔｅｍｉｓ遺伝子、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＦＴＲ、完全長または短縮型ジストロフィン、ＡＢＣＤ１遺伝子、ＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルチミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイントランスポーター、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸性β−グルコシダーゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェート、酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭ）、ＮＰＣ−１、α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニド、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェート、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼからなる群から選択した１つ以上の遺伝子産物を発現する、実施形態２〜１５のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２６：前記導入遺伝子が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２７：前記導入遺伝子が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）遺伝子／ｃＤＮＡを発現する、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２８：前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２９：前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーの制御下でエキソンとイントロンを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、実施形態２８に記載のベクター。
実施形態３０：前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、実施形態２９に記載のベクター。
実施形態３１：実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のベクターを含むウイルス粒子。
実施形態３２：実施形態２〜２３のいずれか１つに記載のベクターでトランスダクションした宿主細胞。
実施形態３３：幹細胞である、実施形態３２に記載の宿主細胞。
実施形態３４：骨髄に由来する幹細胞である、実施形態３３に記載の宿主細胞。
実施形態３５：胚または胚組織に由来しない幹細胞である、実施形態３３に記載の宿主細胞。
実施形態３６：２９３Ｔ細胞である、実施形態３２に記載の宿主細胞。
実施形態３７：ヒト造血前駆細胞である、実施形態３２に記載の宿主細胞。
実施形態３８：前記ヒト造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態３７に記載の宿主細胞。
実施形態３９：前記ヒト造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、実施形態３７に記載の宿主細胞。
実施形態４０：下記の列Ａに示されている病態を治療するための組成物であって、製薬学的に許容可能な担体と、実施形態２〜２３のいずれか１つに記載のベクターをトランスフェクションした幹細胞及び／または前駆細胞を含み、前記ベクターが、前記病態を治療するための、下記の列Ｂに示されている１つ以上の導入遺伝子を含む前記組成物。
実施形態４１：前記組成物が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４２：前記組成物が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）を発現する、実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４３：前記組成物が、鎌状赤血球症を治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４４：前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーとの制御下で、エキソンとイントロンとを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、実施形態４３に記載の組成物。
実施形態４５：前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、実施形態４４に記載の組成物。
実施形態４６：前記宿主細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態４０〜４５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４７：前記宿主細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、実施形態４６に記載の組成物。
実施形態４８：下記の列Ａに示されている病態の対象の治療方法であって、実施形態２〜２３のいずれか１つに記載のベクターをトランスフェクションした前駆体または幹細胞を前記対象に導入することを含み、前記ベクターが、下記の列Ｂに示されているような、前記病態を治療するための１つ以上の導入遺伝子を含む前記方法。
実施形態４９：前記方法が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０：前記方法が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）を発現する、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５１：前記方法が、鎌状赤血球症を治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５２：前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーとの制御下で、エキソンとイントロンとを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３：前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４：前記導入工程が、前記ベクターで、前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞にトランスダクションすることと、前記トランスダクション細胞またはその細胞に由来する細胞を前記対象に移植することであって、前記細胞またはその誘導体が、前記導入遺伝子を発現することを含む、実施形態４８〜５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５：前記細胞が、前駆細胞である、実施形態４８〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６：前記細胞が、幹細胞である、実施形態４８〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７：前記細胞が、骨髄に由来している、実施形態４８〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８：前記細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態４８〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９：前記細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０：前記細胞が、前記対象に由来している、実施形態４８〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１：組み換えレンチウイルスによるトランスダクションを向上させる細胞集団であって、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞について濃縮されている前記細胞集団。
実施形態６２：前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、血液または骨髄に由来する、実施形態６１に記載の細胞集団。
実施形態６３：前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞に、導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターがトランスフェクションされている、実施形態６１〜６２のいずれか１つに記載の集団。
実施形態６４：前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクター、ＨＩＶ−２レンチウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルスベクター、ＭｏＭＬＶベクター、Ｘ−ＭＬＶベクター、Ｐ−ＭＬＶベクター、Ａ−ＭＬＶベクター、ＧＡＬＶベクター、ＨＥＶ−Ｗベクター、ＳＩＶ−１ベクター、ＦＩＶ−１ベクター及びＳＥＲＶ−１−５ベクターからなる群から選択されているレトロウイルスベクターでトランスダクションされている、実施形態６３に記載の細胞集団。
実施形態６５：前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、レンチウイルスベクターでトランスダクションされている、実施形態６３に記載の細胞集団。
実施形態６６：前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターでトランスダクションされている、実施形態６５に記載の細胞集団。
実施形態６７：前記導入遺伝子が、表１に列挙されている病態を治療するための導入遺伝子である、実施形態６３〜６６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態６８：前記導入遺伝子が、ＡＤＡ、ＩＬ−２γＲまたは抗鎌状化遺伝子をコードする、実施形態６３〜６６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態６９：前記細胞に、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶがトランスフェクションされている、実施形態６３に記載の細胞集団。
実施形態７０：幹細胞または前駆細胞のトランスダクションの向上方法であって、前記トランスダクションのために、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞について濃縮されている幹細胞集団または前駆細胞集団を用意することを含む前記方法。
定義
「組み換え」は、単一配列の一部としては天然では見られない部分、または天然で見られる配列に対して再構成してある部分を含む核酸配列を指すように、当該技術分野における使い方と一致した形で用いる。組み換え核酸は、人の手を介するプロセスによって作製するか、及び／または人の手によって作製した核酸から（例えば、１サイクル以上の複製、増幅、転写などによって）生成させる。組み換えウイルスは、組み換え核酸を含むウイルスである。組み換え細胞は、組み換え核酸を含む細胞である。
本明細書で使用する場合、「組み換えレンチウイルスベクター」または「組み換えＬＶ）という用語は、人工的に作製したポリヌクレオチドベクターであって、人の介入と操作により、ＬＶと複数の追加のセグメントからアセンブルしたベクターを指す。
「グロビン核酸分子」とは、グロビンポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。様々な実施形態では、グロビン核酸分子は、コード配列の上流及び／または下流に、調節配列を含んでよい。
「グロビンポリペプチド」とは、ヒトα、βまたはγグロビンとのアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のタンパク質を意味する。
「治療上機能的なグロビン遺伝子」という用語は、発現すると、異常ヘモグロビン症の表現型をもたらさないグロビンが得られるとともに、グロビン遺伝子欠陥のある個体に治療効果をもたらすのに有効なヌクレオチド配列を指す。機能的なグロビン遺伝子は、治療対象の哺乳動物個体に適した野生型グロビンをコードでき、または、グロビンの変異型、好ましくは、優れた特性、例えば、優れた酸素運搬特性もしくは抗鎌状化特性をもたらす変異型であることができる。機能的なグロビン遺伝子は、エキソンとイントロンの両方と、グロビンプロモーターと、スプライスドナー／アクセプターを含む。
「有効な量」とは、未治療患者に対して疾患の症状を改善または除去するのに必要な薬剤またはその薬剤を含む組成物の量を意味する。疾患を治療処置するために、本明細書に記載されている方法を実施するのに用いる組成物（複数可）の有効な量は、投与形式、対象の年齢、体重及び全身の健康状態によって異なる。最終的には、担当の医師または獣医が、適切な量と投与レジメンを判断することになる。このような量を「有効な」量という。
逆配向ＵＢＣレンチウイルスベクター（ｐＣＣＬｃ−ｒｏＵＢＣ）トランスファープラスミドマップの一実施形態を概略的に示している。破線は、レンチウイルス配列外のプラスミド骨格配列を示している。 順配向のＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ＥｍＧＦＰベクターからの発現を、改善型の逆配向ＣＣＬｃ−ｒｏＵＢＣ−ＥｍＧＦＰベクターと比較したものを示している。 調査で用いた発現ベクターを概略的に示している。レンチウイルスの図は、ＣＣＬｃベクターにおける位置を示している。ｒｏＵＢＣ及びｒｏＵＢＣｓベクターは、ＥｍＧＦＰリーディングフレームの末端の後に、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（図示なし）を適切な逆配向で含む。ｐＣａｆｅ発現プラスミドは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流に、同一のカセットを含んでいた。 パネルＡ及びＢは、ＵＢＣスプライシングの遺伝子解析を示している。パネルＡは、プライマーの位置と産物の予測サイズによるＰＣＲ戦略である。パネルＢは、コントロールと、ＵＢＣプロモーターバリアントを含むレンチウイルスベクターでトランスダクションした細胞由来のｇＤＮＡから得られるＰＣＲ産物の電気泳動結果である。 パネルＡ〜Ｃは、パッケージング及びトランスダクション中におけるＵＢＣイントロンの喪失の定量解析を示している。パネルＡは、ＵＢＣイントロンコピー（ＦＡＭ−ＵＢＣイントロン）を定量するためのデュプレックスｄｄＰＣＲ戦略であり、全プロウイルスの組み込み（ＨＥＸ−ＬＶ ｐｓｉ）に対して標準化されている。パネルＢは、ｄｄＰＣＲから得た代表的な生データであり、陽性ドロップレットと陰性ドロップレットとの区別を示している。パネルＣは、コントロールと、ＵＢＣプロモーターバリアントを含むＬＶでトランスダクションした試料におけるＵＢＣイントロンコピー数の全プロウイルスコピー数に対する割合である。エラーバーは、ｄｄＰＣＲポアソン統計に基づく９５％信頼区間を表している。 図６のパネルＡ〜Ｃは、ＵＢＣプロモーターバリアントのフローサイトメトリーによる発現解析を示している。パネルＡは、発現プラスミドでトランスフェクションしてから４８時間後の２９３Ｔ細胞の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）である。エラーバーは、３つの生物学的複製物の標準偏差を表している。ＵＢＣとＵＢＣｓとの独立ｔ検定によるＰ値＝０．０１２２、ｒｏＵＢＣとｒｏＵＢＣｓとのＰ値＝０．０１３４である。パネルＢは、ＵＢＣプロモーターバリアントを含むＣＣＬｃレンチウイルスベクターでトランスダクションしてから１０日後のＫ５６２細胞のｇＭＦＩである。データは、複数の実験のうちの代表的なものである。パネルＣは、トランスフェクションから４８時間後の２９３Ｔ細胞のｇＭＦＩである。エラーバーは、３つの生物学的複製物のＳＤを表している。＊は、Ｐ＜０．０５を示している。ＵＢＣとｄＥｎｈとの独立ｔ検定によるＰ値＝０．０２６７、ＵＢＣｓとｄＥｎｈとのＰ値＝０．０００８である。 図６の続き 図７のパネルＡ〜Ｅは、ＥＥＦ１Ａ１の解析を示している。パネルＡは、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターバリアントを含むレンチウイルスベクターの図である。パネルＢは、安定的にトランスダクションしたＫ５６２細胞におけるＥＥＦ１Ａ１イントロンにわたって、トランスダクションから２週間後超に増幅したＰＣＲ産物のゲル電気泳動像である。パネルＣは、（パネルＢ）で解析した試料におけるイントロンコピーのプロウイルスコピーに対する比率のｄｄＰＣＲによる定量結果である。パネルＤは、一過性にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の、発現プラスミドによるトランスフェクションから４８時間後のｇＭＦＩであり、フローサイトメトリーによって測定したものである。パネルＣにおけるエラーバーは、９５％信頼区間を表しており、パネルＤ及びＥにおいては、３つの生物学的複製物のＳＤを表している。＊は、Ｐ＜０．０５であることを示している。独立ｔ検定によるＰ値は０．００６４である。（Ｅ）は、安定的にトランスダクションしたＫ５６２細胞の、トランスダクションから１０日後のｇＭＦＩであり、フローサイトメトリーによって測定したものである。 図７の続き 図７の続き 図７の続き 図８のパネルＡ〜Ｃは、双方向性ベクターの解析結果を示したものである。パネルＡは、ベクターの概略図である。パネルＢは、ＢＤベクター及びｒｏＢＤベクターにおけるイントロンの喪失のｄｄＰＣＲ解析結果である。パネルＣは、安定的にトランスダクションした２９３Ｔ細胞の、トランスダクションから２週間後のｇＭＦＩであり、フローサイトメトリーによって測定したものである。エラーバーは、９５％信頼区間を表している。 図８の続き ウイルスベクターの上清と、トランスダクションしたＫ５６２細胞において、スプライシングされたベクター連結部のデジタルＰＣＲによる定量結果を示している。 健常なドナーの動員末梢血から濃縮したトランスダクション済みヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣから分化した骨髄細胞において、フローサイトメトリーによって測定したＥｍＧＦＰの発現を示している。発現は、約１０％トランスダクションした集団において、トランスダクションの１０日後に解析した。両側ｔ検定によるｐ値は、０．００１３である。 トランスダクションから１０日後のトランスダクション済みＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるプロウイルス形態のＵＢＣイントロンのデジタルＰＣＲの定量結果を示している。 ｐＧＬ４．２５系プラスミドにおけるイントロン配列のエンハンサー活性に関するルシフェラーゼアッセイの結果を示している。ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液において、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションから４８時間後に測定した。 パネルＡ〜Ｃは、イントロンを置き換えたＵＢＣレンチウイルスベクター及びＥＥＦ１Ａ１レンチウイルスベクターの発現と遺伝子の解析結果を示している。パネルＡは、示されているプロモーターを含むレンチウイルスベクターでトランスダクションしたＫ５６２細胞の発現解析結果であり、トランスダクションの７日後に、フローサイトメトリーによって測定したものである。パネルＢは、図４、パネルＡに示されているプライマーを用いた遺伝子解析結果である。右側の３つのレーンにおける、長さが中度の産物は、Ｋ５６２ゲノムＤＮＡ由来の非特異的産物であり、無視すべきである。パネルＣは、図７、パネルＡに示されているプライマーを用いてトランスダクションしたＫ５６２細胞の遺伝子解析結果である。 パネルＡ〜Ｂは、ヒトＣＤ３４＋及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の単離及び成長特性を示している。パネルＡは、ＣＤ３４−濃縮細胞のフローサイトメトリーであり、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞（領域Ｐ５）とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（領域Ｐ３）を定めるのに用いたゲーティング戦略を示している。パネルＢは、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞からの細胞発現結果である。細胞は、照射したＭＳ５間質細胞とともに、長期培養培地において共存培養した。０日目に播種した細胞数に対する平均増加倍率が、長期培養の各時点に関して示されている。データは、時間経過に伴う細胞拡張率±ＳＥＭを表している（ｎ＝３、ｐ＜０．０００１）。ＡＰＣという略語は、アロフィコシアニンである。 図１５のパネルＡ〜Ｆは、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるトランスダクションの解析結果を示している。パネルＡは、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）±ＳＥＭである（ｎ＝９、ｐ＝０．０２）。パネルＢは、トランスダクションしなかった臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋（ＮＴ−ＣＤ３４＋）、トランスダクションしたＣＤ３４＋（ＣＤ３４＋）細胞及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞によって形成された造血コロニーのタイプ（ｎ＝８０コロニー）の分布である。パネルＣは、播種したＮＴ−ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞であって、インビトロで造血コロニーに成長した細胞の割合である。値は、平均±ＳＤを表している。パネルＤは、トランスダクションしたＣＤ３４＋ＣＢ細胞（左）及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＣＢ細胞（右）から成長した単一のＣＦＵのＶＣＮをｄｄＰＣＲによって解析したものである（ｎ＝８０コロニー）。グラフは、デジタルＰＣＲによって、ベクターに対して陰性（０ＶＣ／細胞）であったか、またはＶＣ／細胞が１〜２、３〜４、５〜６または＞６であったＣＦＵの割合を示している。パネルＥは、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞における、ベクタートランスダクション量への応答性を示している（ｎ＝３、６．６×１０６ＴＵ／ｍｌにおいてはｐ＝０．０５、２×１０７ＴＵ／ｍｌにおいてはｐ＝０．００２）。パネルＦは、長期培養における経時的ＶＣＮを示している（±ＳＥＭ［ｎ＝３］）（時間的傾向差のｐ＝０．０３、ＶＣＮ差のｐ＝０．００４、線形混合モデル）。アステリスクは、有意性を示しており、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１である。 図１５の続き パネルＡ〜Ｃは、ＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰ ＬＶベクターによるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションの解析結果を示している。パネルＡは、ある用量範囲のＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰ ＬＶでトランスダクション後の平均ベクターコピー数±ＳＥＭの比較であり、培養の１４日目にｑＰＣＲによって解析したものである。パネルＢは、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の相対的なＧＦＰ発現量を示している代表的なヒストグラムである。パネルＣは、ＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰでトランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞において、フローサイトメトリーによって割り出したＧＦＰ１細胞の割合である（ｎ＝６、ｐ＝０．０２）。ＧＦＰという略語は、緑色蛍光タンパク質である。 パネルＡ〜Ｂは、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによってトランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の赤血球分化を示している。パネルＡは、トランスダクションから１４日目における分化中のベクターコピー数（ＶＣＮ）±ＳＥＭの比較である（ｎ＝３）。パネルＢは、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から分化した赤血球系細胞におけるＶＣＮ当たりの全β−グロビン転写産物のＨＢＢＡＳ３ ｍＲＮＡ発現の割合（％ＡＳ３／ＶＣＮ）であり、ｑＲＴ−ＰＣＲによって解析したものである（ｎ＝３）。 図１８のパネルＡ〜Ｅは、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるトランスダクションにおけるベクターエンベロープとレセプターの役割を示している。ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞によるＬＤＬレセプターの発現であり、（パネルＡ）は、新たに単離したＣＤ３４＋細胞、（パネルＢ）は、サイトカイン中で４８時間培養時点のＣＤ３４＋細胞、（パネルＣ）は、新たに単離したＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、（パネルＤ）は、サイトカイン中で４８時間培養時点のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である。パネルＥは、ＲＤ１１４でシュードタイプ化したＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクション結果である。このグラフは、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の平均ベクターコピー数±ＳＥＭを表しており、ｑＰＣＲによって、培養の１４日目に解析したものである（ｎ＝３）。ＬＤＬという略語は、低密度リポタンパク質である。 図１８の続き 図１９のパネルＡ及びＢは、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｉｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの正着性の比較を示している。パネルＡは、トランスダクションした移植細胞集団による、ＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ４５１細胞の正着への寄与性を示している。モックマウスには、トランスダクションしなかったヒトＣＢ ＣＤ３４＋細胞を移植し、コントロールマウスには、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞を移植し、他のすべてのマウスには、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（１％）とＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞（９９％）を組み合わせたものを移植した。トランスダクションに用いたベクター（ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ−ＦＢ、ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ−ＦＢ及びＣＣＬｃ−ＵＢＣｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ＦＢ ＬＶ）は、移植ごとに、細胞集団の間で変更した。ヒト細胞の正着した（％ｈｕＣＤ４５１細胞／％ｈｕＣＤ４５１細胞１ｍｕＣＤ４５１細胞）ＮＳＧマウスから回収したＢＭのベクター発現率について、フローサイトメトリーを用いてさらに解析した。（Ｂ）は、インビボマウス移植で解析した細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）である。ＮＳＧマウスへの移植から８０〜９０日後に回収したＢＭから、各蛍光レポーターに特異的なプライマー及びプローブによるｄｄＰＣＲを用いて、インビボＶＣＮを解析した。各細胞集団のインビボＶＣＮ／マウスが別々に示されている。 図１９の続き パネルＡ〜Ｃは、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションと造血潜在力の、長期培養３０日目における解析結果を示している。パネルＡは、トランスダクションしなかった（ＮＴ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝３７コロニー）、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞（ｎ＝２９コロニー）及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（ｎ＝８１コロニー）によって形成された造血コロニータイプの分布を示している。パネルＢは、播種したＮＴ−ＣＤ３４＋細胞、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のうち、インビトロで造血コロニーに成長した割合を示している。値は、平均±ＳＤを表しており、アステリスクは、有意性を示しており、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。パネルＣは、トランスダクションしたＣＤ３４＋から成長したインビトロの単一のＣＦＵのＶＣＮ分布を示しており、ｄｄＰＣＲによって解析したものである（ｎ＝２２コロニー）。グラフは、ベクターに対して陰性であった（０ＶＣ／細胞）か、またはＶＣ／細胞が１〜２、３〜４、５〜６もしくは＞６であったＣＦＵの割合を示している。トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から成長したインビトロＣＦＵのＶＣＮ分布である（ｎ＝４３コロニー）。 パネルＡ〜Ｃは、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションと造血潜在力の、長期培養の６０日目における解析結果を示している。パネルＡは、トランスダクションしなかった（ＮＴ）ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝５コロニー）、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞（ｎ＝３コロニー）及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（ｎ＝２２コロニー）によって形成された造血コロニータイプの分布を示している。パネルＢは、播種したＮＴ−ＣＤ３４＋細胞、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のうち、インビトロで造血コロニーに成長した割合を示している。パネルＣは、トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から成長したインビトロの単一のＣＦＵのＶＣＮ分布であり、ｄｄＰＣＲによって解析したものである（ｎ＝１８コロニー）。グラフは、ベクターに対して陰性であった（０ＶＣ／細胞）か、またはＶＣ／細胞が１〜２、３〜４、５〜６もしくは＞６であったＣＦＵの割合を示している。 パネルＡ〜Ｃは、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによってトランスダクションしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の赤血球分化を示している。（パネルＡ）非分画ＣＤ３４＋細胞及び（パネルＢ）ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞からの赤血球培養液由来の細胞のフローサイトメトリー解析である。脱核赤血球は、ＤＲＡＱ５陰性、グリコホリンＡ（ＧｐＡ）陽性細胞として、左上四半部に存在している。パネルＣは、赤血球分化終了時の脱核ＲＢＣの割合である。 トランスダクションした移植細胞集団による、ＮＳＧマウスにおける全ヒト正着への寄与性を示している。モックマウスには、トランスダクションしなかったヒトＣＢ ＣＤ３４＋細胞を移植し、コントロールマウスには、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞を移植し、他のすべてのマウスには、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（１％）とＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞（９９％）を組み合わせたものを移植した。トランスダクションに用いたベクター（ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ−ＦＢ、ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ−ＦＢ及びＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ＦＢ ＬＶ）は、移植ごとに、細胞集団の間で変更した。ヒト細胞の正着した（％ｈｕＣＤ４５＋／％ｈｕＣＤ４５＋細胞＋ｍｕＣＤ４５＋細胞）ＮＳＧマウスから回収したＢＭのベクター発現率について、フローサイトメトリーを用いてさらに解析した。
ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、生物実験と遺伝子療法において、遺伝子改変で用いられる最も一般的なツールの１つである。使用する大半のＬＶは、自己不活性化ベクターであり、自己不活性化とは、プロモーターとエンハンサーを含む長鎖末端反復配列内の領域が除去されていることを意味する（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：９８７３−９８８０）。このようなベクター内の導入遺伝子を発現させるために、導入遺伝子とともに、プロモーターをベクターペイロード内に配置する必要がある。典型的には、タンパク質コード遺伝子を発現させるために、異種のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩウイルスまたは細胞プロモーターを使用することになり、一般的な例は、サイトメガロウイルス、マウス白血病ウイルス及び脾臓フォーカス形成ウイルス由来のウイルスプロモーターと、伸長因子１α（ＥＥＦ１Ａ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）及びフォスフォグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）のようなヒト遺伝子由来の細胞プロモーターである（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３，３９１−４００、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：８４６３−８４７１）。
ウイルス産生プロセス中に、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩは、典型的にはプロデューサー細胞にトランスフェクションしたトランスファープラスミドからベクターゲノムを転写する。実質的にすべてのシステムに、ＨＩＶ−１由来のＲｅｖタンパク質が組み込まれており、このタンパク質は、ＨＩＶ−１ゲノム内のＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合し、ウイルスゲノムのスプライシング非依存性核外移行を媒介する。しかしながら、ＲＲＥ配列がＬＶコンストラクトに組み込まれているにもかかわらず、スプライシングイベントにおいて、転写産物内にパッケージングシグナル（Ｐｓｉ）が保持されている場合、ベクターペイロード内のイントロンがパッケージング中に喪失することがある。しかし、ＥＥＦ１Ａ１のイントロン含有プロモーターを含むカセットと、ハイブリッドＣＡＧプロモーターを含むカセットのようないくつかの発現カセットでは、レンチウイルスのパッケージング中に、イントロンの喪失は観察されていない（Ｒａｍｅｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２：４５８−４６９、Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：７２０９−７２１９）。これらの観察結果から、レンチウイルス遺伝子の移入によって、イントロンの伝播が可能になると推測されたこともあった（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：４２９−４３６）。
我々は、ヒトＵＢＣプロモーターに含まれるイントロンが、トランスファープラスミドから、安定的にトランスダクションした細胞内のプロウイルス形態に忠実に伝わるか調べようと試みた。我々は、ＵＢＣイントロンが喪失すると、導入遺伝子の発現が有意に低下するのではないかと仮定した。ＵＢＣイントロンには、強力なエンハンサー活性があると報告されているからである（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ，４４８：８８−１０１）。ＥＥＦ１Ａ１イントロンによる過去の所見とは対照的に、ＵＢＣイントロンは、イントロン含有プラスミドから作製したベクターでトランスダクションした細胞内のプロウイルス形態の大半において欠失していたことが明らかになった。ＵＢＣイントロンの欠失により、細胞株での一過性トランスフェクション実験と安定的トランスダクション実験の両方において、発現が約２倍低下し、初代細胞におけるトランスダクション実験では、４倍低下した。これは、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターによる実験とは著しく対照的であり、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターによる実験では、プロウイルス形態の大半がイントロンを保持していた。ＵＢＣ発現カセットの反転により、このスプライシングを介するイントロンの喪失が阻止され、一方向性ＬＶと双方向性ＬＶにおいて、発現が最大化した。特定の理論に拘束されるものではないが、ＵＢＣプロモーターとＥＥＦ１Ａ１プロモーターにおけるイントロンの保持の違いは、プロモーターのイントロン配列自体ではなく、プロモーターのエキソン配列によるものと考えられる。
上記に鑑み、様々な実施形態では、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、そのプロモーターからの転写方向が、ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうように、ＵＢＣプロモーターがベクターにおいて逆配向になっているベクターを提供する。様々な実施形態では、ベクターは、そのマルチクローニングサイトに挿入されている遺伝子／ｃＤＮＡが、逆配向ＵＢＣに機能可能に連結していて、そのプロモーターによって制御される遺伝子転写方向が、前記ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうように配置されたマルチクローニングサイトを含む。
非限定的な例示として、このようなウイルスベクターの１つが図１に示されている。このレンチウイルスベクター「ｐＣＣＬｃ−ｒｏＵＢＣ」を作製するために、制限消化及びライゲーションのような標準的な分子クローニング技法、またはアセンブリー技法のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ、ギブソンアセンブリーもしくは配列及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を用いて、ヒトユビキチンＣ遺伝子の断片（ＵＣＳＣヒトゲノム配列バージョンｈｇ１９マイナス鎖の１２５３９８３１８位から１２５３９９５３０位まで）をｐＣＣＬｃのマルチクローニングサイトに挿入した。
３’ＬＴＲの方に向かう転写方向を持つ典型的なレンチウイルスベクターとは異なり、挿入方向は、ＵＢＣプロモーターからの転写方向が、ｐＣＣＬｃベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうような方向である。
標的細胞にレンチウイルスでトランスダクションすると、このｒｏＵＢＣベクターは、転写が３’ＬＴＲの方に進むように配向されたＵＢＣプロモーターを含むベクターよりも約４倍高いレベルで導入遺伝子を発現させる。この値は、緑色蛍光タンパク質のＥｍｅｒａｌｄバリアント（ＥｍＧＦＰ）導入遺伝子をコードするベクターでトランスダクションしたヒト造血幹細胞と前駆細胞において割り出したものである（図２）。
このプロモーター配向の有用性は、ｐＣＣＬｃレンチウイルスベクターに限らず、他のレトロウイルスベクターにも有用であると考えられる。したがって、特定の実施形態では、逆配向のＵＢＣプロモーターを含む他のレトロウイルスベクターが想定されている。このようなベクターとしては、ＨＩＶ−２レンチウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルスベクター、ＭｏＭＬＶベクター、Ｘ−ＭＬＶベクター、Ｐ−ＭＬＶベクター、Ａ−ＭＬＶベクター、ＧＡＬＶベクター、ＨＥＶ−Ｗベクター、ＳＩＶ−１ベクター、ＦＩＶ−１ベクター、ＳＥＲＶ−１−５ベクターなどが挙げられるが、これらに限らない。
様々な実施形態では、導入遺伝子の効率的なポリアデニル化が行われるように、ベクターは、プロモーター断片の３’（ベクターの全配列に対しては、プロモーターの５’側）に、同じ配向（逆配向）で挿入されたポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）をさらに含む。好適なポリアデニル化シグナルとしては、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ、ヒト成長ホルモンｐｏｌｙＡ、ウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナル、ヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリアデニル化シグナル、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナルなどが挙げられるが、これらに限らない。
ＵＢＣプロモーターの反転により、米国特許第８，５０１，４６４Ｂ２号に記載されているような双方向性ベクターからの発現も高まることも分かった。これは、反転させたＵＢＣプロモーターを含む双方向性ベクター「ｒｏＢＤ」におけるＥＧＦＰの発現が、順配向の対応ベクター「ＢＤ」と比べて増大したことによって示された（例えば、図８、パネルＣを参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、逆配向のヒトＵＢＣ遺伝子を含む双方向性レトロウイルスベクター（例えば、双方向性レンチウイルスベクター）も想定されている。
様々な実施形態では、本明細書に記載されているベクターを含むウイルス粒子と、本明細書に記載されているベクターでトランスダクションした宿主細胞（例えば、幹細胞、前駆細胞など）も想定されている。特定の実施形態では、この宿主細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。本明細書において実施例２で説明されているように、単離ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−を使用すると、使用するベクターを有意に少なくでき、ＨＳＣによる遺伝子療法でのトランスダクションが向上するようであることが分かった。したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞であり、特定の実施形態では、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞について濃縮されている細胞集団を提供する。
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の使用は、逆配向のＵＢＣを含むベクターによるトランスダクションに限定する必要はない。特定の実施形態では、このような細胞は、本質的にいずれのレトロウイルスベクター（例えば、国際公開第２０１４０４３１３１Ａ１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５９０７３）に記載されているＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶのような抗鎌状化レトロウイルスベクター）でもトランスダクションできる。
様々な実施形態では、病態を治療するための組成物であって、その組成物が、本明細書に記載されているようなベクターをトランスフェクションした幹細胞及び／または前駆細胞を含み、そのベクターが、病態を治療するための１つ以上の導入遺伝子（例えば、下記の表１に示されているようなもの）を含み、加えて、その組成物が、製薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、病態（例えば、導入遺伝子の導入によって治療できる病態の治療方法が想定されている。特定の実施形態では、この方法は、その病態またはその病態に対するリスクを有する対象に、本明細書に記載されているベクターをトランスフェクションした前駆体または幹細胞を導入することを含み、そのベクターは、病態を治療するための１つ以上の導入遺伝子（例えば、下記の表１に示されているようなもの）を含む。
下に示されている考察は、ＳＩＮレンチウイルスベクターに関するものであるが、本明細書に示されている様々なエレメント、コンストラクト及び教示を用いて、逆配向のＵＢＣプロモーターまたは逆配向のＵＢＣプロモーターを含む双方向性プロモーターを含む他のレトロウイルスベクターを容易に作製できることに留意されたい。
ＴＡＴ非依存性の自己不活性化レンチウイルスベクター
上述のように、本質的にいずれのレトロウイルスベクターでも、逆配向のＵＢＣプロモーターを使用できることが想定されている。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター（ＬＶ）であり、特定の実施形態では、レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）の構成を含む。したがって、様々な実施形態では、本明細書に記載されているＬＶにおいて、野生型ＬＴＲよりもプロモーター活性の低いＬＴＲ領域を用いるのが望ましい。バイオセイフティーな特徴をもたらすように、有効に「自己不活性化」（ＳＩＮ）しているコンストラクトを提供できる。ＳＩＮベクターは、トランスダクションした細胞における完全長ベクターＲＮＡの産生が大きく低減されるかまたは全面的に阻害されるベクターである。この特徴により、複製能を有する組み換え体（ＲＣＲ）の生じるリスクが最小限になる。さらに、ベクター組み込み部位に隣接する位置にある細胞コード配列が異常発現するリスクが低下する。
さらに、ＳＩＮデザインは、ＬＴＲと、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターが干渉する可能性を低下させる。ＳＩＮ ＬＶは、内部プロモーターの十分な活性を可能にできる場合が多い。
ＳＩＮデザインは、ＬＶのバイオセイフティーを向上させる。ＨＩＶ ＬＴＲの大半は、Ｕ３配列で構成されている。Ｕ３領域は、感染細胞において、細胞の活性化に応じて、ＨＩＶゲノムの基底発現と誘導発現を調節するエンハンサー及びプロモーターエレメントを含む。これらのプロモーターエレメントのいくつかは、ウイルスの複製に不可欠である。エンハンサーエレメントのいくつかは、ウイルス単離株間で高度に保存されており、ウイルスの発症機序における重大な病原因子として関係があるとされている。エンハンサーエレメントは、そのウイルスの異なる細胞標的において、複製速度に影響を及ぼす役割を果たし得る。
ウイルスの転写は、５’ＬＴＲのＵ３領域の３’末端で開始されるので、これらの配列は、ウイルスｍＲＮＡの一部ではなく、３’ＬＴＲからのそのコピーが、組み込まれるプロウイルスにおける両方のＬＴＲを生成するためのテンプレートとして機能する。レトロウイルスベクターコンストラクトにおいて、Ｕ３領域の３’コピーを変化させた場合、ベクターＲＮＡは依然として、プロデューサー細胞において、インタクトな５’ＬＴＲから生成されるが、標的細胞では再生できない。このようなベクターのトランスダクションにより、子孫ウイルスにおいて、両方のＬＴＲが不活性化する。したがって、このレトロウイルスは、自己不活性化（ＳＩＮ）しており、これらのベクターは、ＳＩＮトランスファーベクターとして知られている。
特定の実施形態では、自己不活性化は、ベクターＤＮＡ、すなわち、ベクターＲＮＡを産生するのに用いるＤＮＡの３’ＬＴＲのＵ３領域に欠失を導入することを介して実現する。ＲＴの間、この欠失は、プロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに移行する。典型的には、十分なＵ３配列を除去して、ＬＴＲの転写活性を大きく低下させるかまたは全面的に阻害することによって、トランスダクションした細胞において、完全長ベクターＲＮＡの産生を大きく低減または阻害するのが望ましい。しかしながら、ＬＴＲのエレメントのうち、ウイルスＲＮＡのポリアデニル化（典型的にはＵ３、Ｒ及びＵ５に渡る機能）に関与するエレメントを保持するのが概ね望ましい。したがって、特定の実施形態では、ポリアデニル化決定部を保持しながら、転写的に重要なモチーフを可能な限り多くＬＴＲから除去するのが望ましい。
ＳＩＮデザインは、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３−９８８０及び米国特許第５，９９４，１３６号に詳細に説明されている。しかしながら、これらに記載されているように、３’ＬＴＲを欠失させる程度には限界がある。まず、Ｕ３領域の５’末端は、ベクターの移入において、別の不可欠な機能を果たし、組み込みのために必要となる（末端ジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）。すなわち、末端ジヌクレオチド及びａｔｔ配列は、欠損させることのできるＵ３配列の５’境界を表し得る。加えて、大まかに定められたいくつかの領域は、Ｒ領域における下流ポリアデニル化部位の活性に影響を及ぼし得る。３’ＬＴＲからＵ３配列を過剰に欠失すると、ベクター転写産物のポリアデニル化が低下し、プロデューサー細胞におけるベクターの力価と、標的細胞における導入遺伝子の発現の両方に悪影響が及び得る。
さらなるＳＩＮデザインは、米国特許出願公開第２００３／００３９６３６号に記載されている。この特許出願に記載されているように、特定の実施形態では、ＬＴＲから除去したレンチウイルス配列を、レンチウイルス以外のレトロウイルスの類似配列に置き換えることによって、ハイブリッドＬＴＲを形成させる。具体的には、ＬＴＲ内のレンチウイルスＲ領域をすべてまたは部分的に、レンチウイルス以外のレトロウイルスのＲ領域に置き換えることができる。特定の実施形態では、レンチウイルスＴＡＲ配列（ＴＡＴタンパク質と相互作用して、ウイルスの複製を高める配列）をＲ領域から、好ましくはすべて除去する。続いて、このＴＡＲ配列を、レンチウイルス以外のレトロウイルスのＲ領域の類似部分に置き換えることによって、ハイブリッドＲ領域を形成させる。ＬＴＲを更に改変して、レンチウイルスのＵ３及びＵ５領域のすべてまたは一部を除去したり、及び／またはレンチウイルス以外の配列に置き換えたりすることができる。
したがって、特定の実施形態では、ＳＩＮ構成により、そのＴＡＲ配列のすべてまたは一部が欠損しているハイブリッドレンチウイルスＲ領域を含むレトロウイルスＬＴＲをもたらすことによって、ＴＡＴによる考え得るいずれかの活性化を排除する（この場合、ＴＡＲ配列またはその一部を、レンチウイルス以外のレトロウイルスのＲ領域の類似部分に置き換えることによって、ハイブリッドＲ領域を形成させる）。特定的な実施形態では、レトロウイルスＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域を含み、そのハイブリッドＲ領域は、ＴＡＲ配列が欠損しているＨＩＶ Ｒ領域部分（例えば、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１０に示されているヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなる部分）と、ＨＩＶ Ｒ領域から欠損しているＴＡＲ配列に相当するＭｏＭＳＶ Ｒ領域部分（例えば、２００３／００３９６３６の配列番号９に示されているヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなる部分）を含む。別の特定的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域の全体は、２００３／００３９６３６の配列番号１１に示されているヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなる。
Ｒ領域の由来元にできる好適なレンチウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、ＥＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶが挙げられる。レンチウイルス以外の配列の由来元にできる好適なレトロウイルスとしては、例えば、ＭｏＭＳＶ、ＭｏＭＬＶ、フレンド、ＭＳＣＶ、ＲＳＶ及びスプマウイルスが挙げられる。例示的な一実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶであり、レンチウイルス以外のレトロウイルスはＭｏＭＳＶである。
ＵＳ２００３／００３９６３６に記載されている別の実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、左側（５’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流に、プロモーター配列をさらに含む。好ましいプロモーターは、レンチウイルス以外の起源のものであり、例えば、レンチウイルス以外のレトロウイルスのＵ３領域（例えば、ＭｏＭＳＶ Ｕ３領域）が挙げられる。特定的な一実施形態では、このＵ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１２に示されているヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、この左側（５’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流に、レンチウイルスＵ５領域をさらに含む。一実施形態では、このＵ５領域は、ゲノムの組み込みに必要なＨＩＶ ａｔｔ部位を含むＨＩＶ Ｕ５領域である。別の実施形態では、Ｕ５領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１３に示されているヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、左側（５’）ハイブリッドＬＴＲの全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１に示されているヌクレオチド配列を含む。
別の例示的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、右側（３’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流に、改変（例えば、トランケート型）レンチウイルスＵ３領域をさらに含む。改変レンチウイルスＵ３領域は、ａｔｔ配列を含み得るが、プロモーター活性を有するいずれの配列も欠損していることによって、ウイルス転写は、染色体への組み込み後の１回目の複製段階を越えることができないという点で、ベクターをＳＩＮとする。特定的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域の上流の改変レンチウイルスＵ３領域は、レンチウイルスＵ３ ａｔｔ部位までとレンチウイルスＵ３ ａｔｔ部位を含むレンチウイルス（例えばＨＩＶ）Ｕ３領域の３’末端からなる。一実施形態では、Ｕ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１５に示されているヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、右側（３’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流に、ポリアデニル化配列をさらに含む。別の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１６に示されているヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、右側（５’）ＬＴＲの全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号２または１７に示されているヌクレオチド配列を含む。
したがって、ＨＩＶ系ＬＶのケースでは、そのベクターは、ベクターの力価が有意に低下することなく、ＬＴＲ ＴＡＴＡボックスの除去を含め、Ｕ３の著しい欠失（例えば、−４１８〜−１８の欠失）を許容することが分かっている。これらの欠失により、ＬＴＲの転写能が約９０％以下に低下するという点で、ＬＴＲ領域は、実質的に転写不活性型となる。
トランスファーベクターコンストラクトにおける上流側ＬＴＲの一部が、構成的活性型プロモーター配列に置き換えられている場合には、Ｔａｔのトランス作用機能は必須ではなくなることも示されている（例えば、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１を参照されたい。さらに、トランスでのｒｅｖの発現により、ｇａｇとｐｏｌのみを含むパッケージングコンストラクトから、高力価のＨＩＶ由来ベクターストックを作製可能になることを我々は示す。このデザインにより、相補性を条件とするパッケージング機能の発現は、プロデューサー細胞においてのみで可能となる。得られる遺伝子輸送システムは、ＨＩＶ−１の９個の遺伝子のうちの３個のみを保存し、トランスダクション粒子の産生では、４つの別々の転写ユニットに依存する。
実施例１に示されている一実施形態では、抗鎌状化β−グロビン（例えば、βＡＳ３）を発現するカセットが、ｐＣＣＬ ＬＶ骨格に配置されており、このベクターは、５’ＬＴＲに置換されたＣＭＶエンハンサー／プロモーターを有するＳＩＮベクターである。
ＣＭＶプロモーターは典型的には、高レベルの組織非特異的な発現をもたらすことが認められる。同様の構成的活性を持つ他のプロモーターとしては、ＲＳＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。βアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チューブリンプロモーターなどのような哺乳動物プロモーターも用いてよい。
上記のＳＩＮ構成は例示的かつ非限定的なものである。当業者には、数多くのＳＩＮ構成が知られている。上記のように、特定の実施形態では、ＬＴＲの転写は、約９５％〜約９９％低下する。特定の実施形態では、ＬＴＲは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％、転写不活性となり得る。
インスレーターエレメント
特定の実施形態では、バイオセイフティーをさらに高めるために、本明細書に記載されているベクターには、インスレーターが挿入されている。インスレーターは、ゲノム全体にわたって存在するＤＮＡ配列エレメントである。インスレーターは、クロマチンを修飾して、領域の遺伝子発現を変化させるタンパク質に結合する。本明細書に記載されているベクターにインスレーターを配置することにより、とりわけ、１）両側の染色体による、発現の斑入り位置効果から、ベクターを遮断すること（すなわち、バリア活性）と、２）ベクターによる遺伝子発現の挿入トランス活性化から、両側の染色体を遮断すること（エンハンサーブロッキング）を含む様々な潜在的な利点をもたらす。すなわち、インスレーターは、ゲノムまたは遺伝子コンテクストに組み込まれた遺伝子または転写ユニットであって、インスレーターがなければ、そのゲノムまたは遺伝子コンテクスト内の調節シグナルによって、その発現が影響を受け得る遺伝子または転写ユニットの独立した機能を保つのを補助することができる（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６４３３及びＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照されたい）。本発明の関連では、インスレーターは、レンチウイルスの発現配列を組み込み部位の作用（ゲノムＤＮＡに存在するシス作動性エレメントによって媒介され、移入配列の発現の調節異常を導き得る作用）から保護するのに寄与し得る。様々な実施形態では、１つもしくは両方のＬＴＲ、または細胞ゲノムに組み込まれるベクター領域のどこかにインスレーター配列が挿入されているＬＶを提供する。
初めて特徴付けがなされたとともに、最も特徴付けがなされている脊椎動物クロマチンインスレーターは、ニワトリβ−グロビン遺伝子座調節領域内に位置している。このエレメントは、ＤＮａｓｅ−Ｉ高感受性部位−４（ｃＨＳ４）を含み、ニワトリβ−グロビン遺伝子座の５’境界を構成すると見られている（Ｐｒｉｏｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８：４０３５−４０４８）。ｃＨＳ４エレメントを含む１．２ｋｂの断片は、細胞株においてグロビン遺伝子プロモーターとエンハンサーとの相互作用をブロックする能力（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７４：５０５−５１４）と、ショウジョウバエ（同上）、形質転換細胞株（Ｐｉｋａａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２８５２−２８６２）及びトランスジェニック哺乳動物（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２３９−２４３、Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，８：２２３−２３５）における発現カセットを位置効果から保護する能力を含む古典的なインスレーター活性を示す。この活性の大半は、２５０ｂｐの断片に含まれている。このストレッチ内には、エンハンサーブロッキングアッセイに関わるジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦ（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：３８７−３９６）と相互作用する４９ｂｐのｃＨＳ４コア（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：５７５−５８０）がある。
例示的かつ好適なインスレーターの１つは、ＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）であり、これは、ニワトリβ−グロビン５’ＨＳ４インスレーターの最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサーブロッキング成分と、Ｒａｍｅｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２６：３２５７−３２６６によって説明されているヒトＴ−細胞レセプターα／δブロッキングエレメントα／δＩ（ＢＥＡＤ−Ｉ）インスレーター由来の相同領域とを含む７７ｂｐのインスレーターエレメントである。この「合成」インスレーターＦＢは、完全なエンハンサーブロッキング活性を有する。このインスレーターは、例示的かつ非限定的なものである。例えば、完全長ニワトリβ−グロビンＨＳ４またはそのインスレーター小断片、アンキリン遺伝子インスレーター及びその他の合成インスレーターエレメントを含む他の好適なインスレーターを用いてもよい。
パッケージングシグナル
様々な実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、パッケージングシグナルをさらに含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」または「ｐｓｉ配列」は、核酸のパッケージングを誘導するのに十分ないずれかの核酸配列であり、その配列は、レトロウイルス粒子へのパッケージングシグナルを含む。この用語には、天然で見られるパッケージング配列と、操作されたそのバリアントが含まれる。当該技術分野においては、レンチウイルスを含む多種多様なレトロウイルスのパッケージングシグナルが知られている。
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、未スプライシングＲＮＡの核外移行を促すＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。ＲＲＥは、当業者には周知である。例示的なＲＲＥとしては、ＨＩＶ ＮＬ４−３ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３８８７）の７６２２〜８４５９位に位置するようなＲＲＥと、ＨＩＶの他の株または他のレトロウイルスに由来するＲＲＥが挙げられるが、これらに限らない。このような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋまたはｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘというＵＲＬのデータベースから容易に入手可能である。
セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）
様々な実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、セントラルポリプリントラクトをさらに含む。セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を含む断片を、例えばレンチウイルス（例えばＨＩＶ−１）ベクターコンストラクトに挿入すると、報告によれば、セントラルＤＮＡフラップを介して、ウイルスｃＤＮＡの核内移行を促すことによって、トランスダクション効率を劇的に高めることが知られている。
発現刺激性の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、転写産物に存在することで、異種の核酸（例えば、ＡＤＡ、ＩＬ−２Ｒγ、βＡＳ３など）の発現をタンパク質レベルで増大させる様々な転写後調節エレメント（ＰＲＥ）のいずれかを含んでよい。ＰＲＥは、特定の実施形態において、特に、中度のプロモーターを含むレンチウイルスコンストラクトを伴う実施形態において特に有用であり得る。
ＰＲＥのタイプの１つは、発現カセット内に位置するイントロンであって、遺伝子の発現を刺激できるイントロンである。しかしながら、イントロンは、レンチウイルスの生活環イベントの際に、スプライシングにより除去され得る。したがって、イントロンをＰＲＥとして使用する場合、そのイントロンは、典型的には、ベクターのゲノム転写産物と逆の配向で配置する。
スプライシングイベントに左右されない転写後調節エレメントにより、ウイルスの生活環の間に除去されないという利点が得られる。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後処理エレメント、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節エレメントである。これらのうち、典型的にはＷＰＲＥが好ましい。ＨＰＲＥでは見られない追加のシス作動性エレメントを含むからである。この調節エレメントは典型的には、導入遺伝子のＲＮＡ転写産物に含まれるが、導入遺伝子翻訳ユニットの終止コドンの外側にくるように、ベクターにおいて配置する。
ＷＰＲＥは、米国特許第６，１３６，５９７号で特徴付けと説明がなされている。この特許に記載されているように、ＷＰＲＥは、ＲＮＡの核から細胞質への効率的な輸送を媒介するＲＮＡ輸送エレメントである。ＷＰＲＥは、シス作動性核酸配列の挿入によって、導入遺伝子の発現を高め、そのエレメントと導入遺伝子が単一の転写産物に含まれるようにする。ＷＰＲＥがセンス配向で存在すると、導入遺伝子の発現が最大で７〜１０倍増大することが示された。レトロウイルスベクターは、完全なイントロンを含む遺伝子ではなく、ｃＤＮＡの形で配列を移入する。イントロンは概ね、レトロウイルス粒子の形成を導く一連のイベントの間にスプライシングにより除去されるからである。イントロンは、一次転写産物とスプライシング機構との相互作用を媒介する。スプライシング機構によってＲＮＡが処理されると、スプライシング機構と輸送機構との共役により、ＲＮＡの細胞質輸送が促されるので、ｃＤＮＡは、非効率的に発現する場合が多い。したがって、ＷＰＲＥをベクターに含めることで、導入遺伝子の発現が高まる。
トランスダクションする宿主細胞と、細胞へのトランスダクション法
本明細書に記載されている組み換えベクターと、得られるウイルスは、核酸配列（例えば、抗鎌状化β−グロビン、ＡＤＡをコードする核酸、ＩＬ−２Ｒγ遺伝子、表１に列挙されている他の標的／導入遺伝子のいずれかなど）を哺乳動物細胞に移入できる。細胞への送達のために、本発明のベクターは、好適なパッケージング細胞株と併せて用いるか、または必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）を含む他のベクタープラスミドとともに、細胞にインビトロでコトランスフェクションして、本発明のベクターをパッケージングするとともに、細胞に感染することができる複製能欠失型ビリオンを形成させることができる。
典型的には、ベクターは、パッケージング細胞株へのトランスフェクションを介して導入する。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含むウイルス粒子を産生する。トランスフェクション方法は、当業者に周知である。パッケージングベクターとトランスファーベクターをパッケージング細胞株にコトランスフェクションした後、組み換えウイルスを培地から回収し、当業者に用いられている標準的な方法によって力価を測定する。したがって、パッケージングコンストラクトは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって、概ね、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼのような優性選択マーカーとともに、ヒト細胞株に導入してから、適切な薬物の存在下で選択して、クローンを単離できる。特定の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、コンストラクト内のパッケージング遺伝子に物理的に連結できる。
パッケージング機能が好適なパッケージング細胞によって発現するように構成されている安定な細胞株は、既知である（例えば、パッケージング細胞について説明している米国特許第５，６８６，２７９号を参照されたい）。概して、ウイルス粒子の作製の際には、レンチウイルスのＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子の発現に適合するいずれかの細胞、またはこのような発現に対応するように操作できるいずれかの細胞を用いてよい。例えば、２９３Ｔ細胞及びＨＴ１０８０細胞のようなプロデューサー細胞を用いてよい。
レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）が導入されたパッケージング細胞は、プロデューサー細胞を形成する。したがって、プロデューサー細胞は、目的の治療遺伝子（例えば、抗鎌状化β−グロビン、ＡＤＡ、ＩＬ−２Ｒγ遺伝子など）を含むパッケージング済み感染性ウイルス粒子を産生または放出できる細胞または細胞株である。これらの細胞はさらに、足場依存性であることができ、これは、ガラスまたはプラスチックのような表面に結合すると、これらの細胞の成長、生存または機能の保持が最適に行われることを意味する。そのベクターが複製能を持つときに、レンチウイルスベクターパッケージング細胞株として用いる足場依存性細胞株のいくつかの例は、ＨｅＬａまたは２９３細胞及びＰＥＲＣ．６細胞である。
したがって、特定の実施形態では、遺伝子を細胞に送達し、その遺伝子を細胞のゲノムに組み込む方法であって、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターを含むビリオンと、その細胞を接触させることを含む方法を提供する。この細胞（例えば、組織または器官の形態）は、エキソビボでビリオンと接触（例えば、ビリオンに感染）させてから、体内で遺伝子（例えば、抗鎌状化β−グロビン、ＡＤＡ、ＩＬ−２Ｒγ遺伝子など）を発現させる対象（例えば、哺乳動物、動物またはヒト）に送達することができる。様々な実施形態では、この細胞は、対象に対して自家である（すなわち、対象由来である）ことができ、または、対象に対して非自家（すなわち、同種異系または異種）であることができる。さらに、本明細書に記載されているベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に送達できるので、細胞は、例えば、骨髄細胞、間葉幹細胞（例えば、脂肪組織から得たもの）、ならびにヒト及び動物の供給源に由来するその他の初代細胞を含め、広範なものに由来できる。あるいは、ビリオンをインビボで対象または対象の局部（例えば骨髄）に直接投与できる。
当然ながら、上述のように、本明細書に記載されているベクターは、骨髄、末梢血または臍帯血のいずれかから得たヒト造血前駆細胞または造血幹細胞のトランスダクション、及びＣＤ４＋Ｔ細胞、末梢血のＢリンパ球またはＴリンパ球細胞のトランスダクションなどにおいて特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、標的は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である。
遺伝子療法
特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、導入遺伝子を対象に導入して、例えば、遺伝的欠損の修正によって及び／または１つ以上の異種遺伝子（複数可）の発現によって改善できる病態を治療するのに有用である。例示的であるが非限定的な一実施形態では、この方法は、本明細書に記載されているベクターであって、目的の導入遺伝子（複数可）を含むベクターによって、造血幹細胞を含むヒト細胞集団のヒト幹細胞または前駆細胞をトランスダクションさせる条件下で、その集団を、そのベクターと接触させることを含む。これらの幹細胞は、最終的な用途に応じて、インビボまたはインビトロでトランスダクションしてよい。ヒト遺伝子療法（ヒト幹細胞の遺伝子療法など）の関連でも、幹細胞または前駆細胞にインビボでトランスダクションしても、あるいは、インビトロでトランスダクションしてから、トランスダクションした細胞（複数可）をヒト対象に注入してもよい。一態様では、ヒト細胞は、当業者に周知の方法を用いて、ヒト、例えばヒトの患者から取り出し、上述のようにトランスダクションできる。続いて、その導入遺伝子（複数可）の発現によって、病態の１つ以上の症状が改善されるか、その病態が有効に治癒されるか、またはその病態の進行が遅くなる同じヒトまたは別のヒトに、トランスダクションした細胞を再導入する。
遺伝子療法における病態及び標的
本明細書に記載されているベクターは、遺伝子療法の技法を用いて治療できる本質的にすべての状態を治療する際に、導入遺伝子を送達するのに有用である。多くの病態を治療するために、導入遺伝子を送達するのに用いることができる。この関連では、遺伝子療法の多くの臨床プロトコールが認可または検討されることが留意される（例えば、Ｍｉｓｒａ（２０１３）Ｊ．Ａ．Ｐ．Ｉ．，６１：１２７−１３３などを参照されたい）。
特定の実施形態では、ベクターは、ＳＣＩＤ、鎌状赤血球症、リポソーム蓄積症、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、フェニールケトン尿、パーキンソン病または血友病のような病態を治療するための導入遺伝子を含む。本明細書に記載されているベクターを用いる遺伝子移入（例えば、遺伝子療法）の方法によって治療してよい病態及び関連する「標的」の例示的であるが非限定的なリストが表１に示されている。
例示的な一実施形態では、本明細書に記載されているベクターを用いて、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子／ｃＤＮＡの導入によって、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療する。別の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２γ）遺伝子の導入によって、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するのに用いる。特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０４３１３１Ａ１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５９０７３に記載されているように、）抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子の導入によって、鎌状赤血球症を治療するのに有用である。
上記の病態と標的は、例示的かつ非限定的なものである。本明細書に示されている教示を用いて、本明細書に記載されているベクターを使用して、多くの遺伝子／ｃＤＮＡのいずれかを送達できる。
幹細胞／前駆細胞遺伝子療法
様々な実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、骨髄、末梢血または臍帯血のいずれかから得たヒト造血前駆細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）のトランスダクションと、ＣＤ４＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞のトランスダクションなどに特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、好ましい標的は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である。
細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、樹状細胞、末梢血細胞または腫瘍細胞にエキソビボでトランスダクションするときには、概ね１〜５０程度の感染多重度（ＭＯＩ）（１０５個の細胞当たりのウイルスベクタートランスダクション単位１×１０５〜５０×１０５個にも当たる）の用量を用いて、ベクター粒子をその細胞とともにインキュベートする。当然ながら、この用量には、１ＭＯＩ、２ＭＯＩ、３ＭＯＩ、４ＭＯＩ、５ＭＯＩ、６ＭＯＩ、７ＭＯＩ、８ＭＯＩ、９ＭＯＩ、１０ＭＯＩ、１５ＭＯＩ、２０ＭＯＩ、２５ＭＯＩ、３０ＭＯＩ、３５ＭＯＩ、４０ＭＯＩ、４５ＭＯＩ及び５０ＭＯＩに相当するベクターの量が含まれる。典型的には、ベクターの量は、ＨｅＬａトランスダクション単位（ＴＵ）で表してもよい。
国際公開第２０１４０４３１３１Ａ１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５９０７３）の実施例１に示されているように、２×１０７ＴＵ／ｍｌ未満のベクター濃度でのみ、遺伝子移入の用量相関的な増加（ｑＰＣＲによって測定した平均ＶＣ／細胞）が実現したことが明らかになったことが留意される。ベクター濃度を高くしても、トランスダクションの有効性は向上しなかったとともに、実際、トランスダクションの程度に対して悪影響が及ぶことが多かった（データは示されていない）。これらの所見に基づき、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターは、２×１０７ＴＵ／ｍｌ（ＭＯＩ＝４０）という標準的な濃度で用いた。
特定の実施形態では、細胞ベースの療法は、幹細胞及び／または造血前駆細胞を用意することを含み、目的の導入遺伝子（例えば、抗鎌状化ヒトβ−グロビンをコードするウイルスで、その細胞にトランスダクションしてから、その形質転換細胞の導入を必要とする対象（例えば、鎌状赤血球の変異を有する対象）に、その形質転換細胞を導入する。
特定の実施形態では、この方法は、対象から細胞、例えば幹細胞の集団を単離することを含み、任意に応じて、組織培養でそれらの細胞を拡張し、細胞内に存在すると、細胞においてインビトロで抗鎌状化β−グロビンが産生されるレンチウイルスベクターを投与する。続いて、それらの細胞を対象に戻し、その体内では、例えば、抗鎌状化βグロビンを産生する赤血球集団をもたらし得る。例えば、国際公開第２０１４０４３１３１Ａ１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５９０７３）の図１６を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態では、細胞（細胞株由来の細胞であっても、対象以外の個体に由来する細胞であってもよい）の集団を使用できる。幹細胞、免疫系細胞などを対象から単離して、それらを対象に戻す方法は、当該技術分野において周知である。このような方法は、化学療法を受けている患者において、例えば、骨髄移植、末梢血幹細胞移植などで用いられている。
幹細胞を用いる場合、それらの細胞は、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）ＣＢ、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）などを含む多くの供給源から得ることができることが認識されるであろう。特定の実施形態では、誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の使用が想定されている。造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離し、それらの細胞にトランスダクションし、哺乳動物の対象に導入する方法は、当業者に周知である。
ベクターの直接導入
特定の実施形態では、ベクターを直接導入することによって、対象を直接治療することが想定されている。このベクター組成物は、いずれかの利用可能な経路（非経口（例えば静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸及び膣内が挙げられるが、これらに限らない）によって送達するために調合してよい。一般的に用いられている送達経路としては、吸入、非経口及び経粘膜経路が挙げられる。
様々な実施形態では、医薬組成物は、ベクターを製薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含むことができる。本明細書で使用する場合、「製薬学的に許容可能な担体」という語句には、医薬的投与に適合する溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが含まれる。この組成物には、補助的な活性化合物も組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、活性剤、すなわち、本明細書に記載されているベクター及び／またはこのベクターとともに投与するその他の薬剤は、埋込剤及びマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤のように、体内から早急に排泄されないように、その化合物を保護する担体とともに調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用できる。このような組成物の調製方法は、当業者には明らかであろう。好適な材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販材として得ることもできる。リポソームも製薬学的に許容可能な担体として使用できる。これらは、当業者に知られている方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような方法に従って調製できる。いくつかの実施形態では、この組成物を特定の細胞タイプまたはウイルスに感染している細胞に導く。例えば、この組成物は、モノクローナル抗体を用いて、感染細胞の表面に発現した細胞表面マーカー、例えば、内因性マーカーまたはウイルス抗原に導くことができる。
投与のしやすさと、用量の均一化のために、投与単位形態で組成物を調合するのが有益である。投与単位形態とは、本明細書で使用する場合、治療する対象に対する単位投与量として適する物理的に別々の単位を指し、各単位には、製剤用担体と連携して所望の治療効果をもたらすように算出した所定量のベクター（例えばＬＶ）が含まれている。
単位用量は、１回の注射として投与する必要はないが、所定の期間にわたる持続注入を含んでよい。本明細書に記載されているベクター（複数可）の単位用量は、ベクターのトランスダクション単位（Ｔ．Ｕ．）で利便的に記載してよく、Ｔ．Ｕ．は、ＨｅＬａまたは２９３のような細胞株に対するベクターの力価を測定することによって定められるようなものである。特定の実施形態では、単位用量は、１０３Ｔ．Ｕ．、１０４Ｔ．Ｕ．、１０５Ｔ．Ｕ．、１０６Ｔ．Ｕ．、１０７Ｔ．Ｕ．、１０８Ｔ．Ｕ．、１０９Ｔ．Ｕ．、１０１０Ｔ．Ｕ．、１０１１Ｔ．Ｕ．、１０１２Ｔ．Ｕ．、１０１３Ｔ．Ｕ．及びそれを上回るＴ．Ｕ．の範囲であることができる。
医薬組成物は、必要に応じて、様々な間隔で、様々な期間にわたって、例えば、約１〜約１０週間、約２〜約８週間、約３〜約７週間、約４週間、約５週間、約６週間などにわたり、週に１回投与できる。不確定ベースで治療用組成物を投与する必要がある場合もある。当業者であれば、特定の要因（対象の疾患または障害の重症度、過去の治療、全身の健康状態及び／または年齢、ならびに存在するその他の疾患が挙げられるが、これらに限らない）が、対象を有効に治療するのに必要とされる投与量とタイミングに影響を及ぼし得ることは分かるであろう。本発明で想定されているように、ベクター（例えばＬＶ）によって対象を治療することは、１回の治療を含むことができ、または、多くのケースでは、一連の治療を含むことができる。
遺伝子療法用ベクターを投与するための例示的な用量と、好適な用量を定める方法は、当該技術分野において既知である。さらに、ベクターの適切な用量は、具体的な被投与者と投与方法に左右され得ることが分かる。いずれかの特定の対象に対する適切な用量レベルは、対象の問題の病態、標的組織、年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活、投与時間、投与経路、排泄率、投与する他の治療剤などを含む様々な要因に左右され得る。
特定の実施形態では、ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与または定位注射によって、対象に送達できる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４を参照されたい）。特定の実施形態では、ベクターは、経口または吸入によって送達してよく、内包化するか、または別段に操作して、ベクターを分解から保護して、組織または細胞などへの取り込みを促してもよい。医薬調製物は、許容可能な希釈剤にベクターを含むことも、ベクターが組み込まれている徐放性マトリックスを含むこともできる。この代わりに、またはこれに加えて、本明細書に記載されているレトロウイルスベクターのケースのように、ベクターを組み換え細胞からインタクトで産生させることができる場合、医薬調製物は、ベクターを産生する１つ以上の細胞を含むことができる。本明細書に記載されているベクターを含む医薬組成物は、任意に応じて投与の説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
上記の組成物、方法及び用途は、例示的かつ非限定的なものと意図されている。当業者であれば、本明細書に示されている教示を用いて、その組成物、方法及び用途の他の変形形態を容易に利用可能である。
下記の実施例は、例示目的で示されているのであって、特許請求されている本発明を限定するものではない。
実施例１
スプライシングを介するイントロンの喪失を防ぐことで、ヒトユビキチンＣプロモーターを含むレンチウイルスベクターの発現が最大化する。
レンチウイルスベクターは、ほぼ普遍的に、異種の内部プロモーターを用いて、導入遺伝子を発現させる。最も広く用いられているプロモーター断片の１つは、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）遺伝子由来の１．２ｋｂの配列であり、ＵＢＣのプロモーターと、いくつかのエンハンサーと、第１エキソンと、第１イントロンと、第２エキソンのごく一部を含む。ベクターの産生中、ベクターゲノムの転写後にスプライシングが行われることがあるので、ＵＢＣプロモーター断片内のイントロンが標的細胞に忠実に伝搬されるかを我々は調べた。この実施例に記載されているように、遺伝子解析により、プロウイルス形態の８０％超が、ＵＢＣプロモーターのイントロンを欠損することが明らかになった。ヒト伸長因子１α（ＥＥＦ１Ａ１）プロモーター断片のイントロンは、レンチウイルスのパッケージング中に喪失しなかったとともに、ＵＢＣプロモーターのイントロンとＥＥＦ１Ａ１プロモーターのイントロンにおけるこの違いは、プロモーターのエキソン配列によって付与された。ＵＢＣプロモーターのイントロンの喪失により、導入遺伝子の発現が４倍低下した。その発現カセットを反対側の鎖に移動させたところ、イントロンの喪失が防がれ、十分な発現が回復した。この発現の増大は主に、イントロン内の非古典的なエンハンサー活性によるものであったとともに、推定イントロンエンハンサー配列を複数のプロモーター近位部位に移動すると、実際に発現が抑制された。ＵＢＣプロモーターの反転によっても、イントロンの喪失が防がれ、双方向性レンチウイルスベクターにおいて、十分な発現が回復した。
材料と方法
プラスミドの構築
この調査で使用したすべてのプラスミド配列は、添付の配列表に含まれており、この配列表は、あらゆる目的において、参照により、本明細書に援用される。
ヒトユビキチンＣプロモーターをＦＵＧＷから増幅し（Ｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：８６８−８７２）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、直鎖化及び平滑化ｐＣａｆｅ（発現用カセット）にライゲーションして、ｐＣａｆｅ−ＵＢＣを作製した。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント配列（本明細書では「ＰＲＥ」、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．の文献では「ＬＰＲＥ」と称されている）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、ＫｐｎＩで直鎖化したｐＣａｆｅ−ＵＢＣに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（米国カリフォルニア州マウンテンビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号６３９６４５）を用いてクローニングした。ＥＧＦＰのＥｍｅｒａｌｄバリアントをｐＲＳＥＴ−ＥｍＧＦＰ（米国カリフォルニア州カールスバッドのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｖ３５３−２０）からＰＣＲで増幅し、ＨｐａＩで直鎖化したｐＣａｆｅ−ＵＢＣ−ＰＲＥに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎを用いてクローニングし、ｐＣａｆｅ−ＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥを作製した。ＵＢＣイントロン配列を取り除くようにＵＢＣクローニングプライマーを設計した状態で、同様の形で、ｐＣａｆｅ−ＵＢＣｓ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥを作製した。
逆配向（ｒｏ）プラスミド内の発現カセット（ｐＣａｆｅ−ｒｏＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ｂＧＨｐＡ及びｐＣａｆｅ−ｒｏＵＢＣｓ−ＥｍＧＦＰ−ｂＧＨｐＡ）では、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｖ８６４−２０）から増幅し、導入遺伝子の後に挿入した。
ＵＢＣイントロンの位置を動かした（ｉ）コンストラクト（ｐＣａｆｅ−ｉＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥ、ｐＣａｆｅ−ｒｏｉＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥ及びｐＣａｆｅ−ｒｏｆｉＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥ）では、ＵＢＣイントロン配列をｐＣａｆｅ−ＵＢＣ−ＰＲＥから増幅し、ＥｃｏＲＶで直鎖化したｐＣａｆｅ−ＵＢＣｓ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎを用いてクローニングした。
ＵＢＣエンハンサーを欠損させた（ｄＥｎｈ）コンストラクト（ｐＣａｆｅ−ｄＥｎｈＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥ）では、推定イントロンエンハンサー領域を挟み込んでいる重複外向きプライマーを用いて、ｐＣａｆｅ−ＵＢＣ−ＥｍＧＦＰ−ＰＲＥを増幅し、ＤｐｎＩで処置後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎによって最環状化した。
すべてのｐＣＣＬｃ（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：８４６３−８４７１）ＬＶでは、ＥｃｏＲＶ／ＫｐｎＩでの消化によって、発現カセットをｐＣａｆｅプラスミドから取り除き、ＥｃｏＲＶ／ＫｐｎＩで直鎖化したｐＣＣＬｃにライゲーションした。
双方向性（ＢＤ）ベクターは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州マウンテンビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ（ｂＧＨｐＡ）及び双方向性ｍＣＭＶ／ＵＢＣプロモーター（Ｋａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，５：ｅ１１８３４）、ＥＧＦＰ、ＦＵＧＷ由来のＷＰＲＥ、ｐＣＣＬｃ骨格と重複相同性を有するように設計されたＥＦＳ−ｓｉｎｇｌｅ−ＩＤＬＶ由来のｍＣｈｅｒｒｙ（Ｊｏｇｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１７０５−１７１７）のＰＣＲアンプリコンをアセンブルすることによって構築した。ｒｏＢＤベクターは、逆向きのｂＧＨｐＡとＷＰＲＥとの間で、ｍＣｈｅｒｒｙ−双方向性プロモーター−ＥＧＦＰカセットを反転させるように、ＢＤの制限消化によって構築し、ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｋｉｔ（米国マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でライゲーションした。
細胞培養
Ｌ−グルタミンを含まないダルベッコ改変イーグル培地５００ｍｌ（米国バージニア州ハーンドンのＭｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号１５−０１３−ＣＶ）に、熱不活化ウシ胎仔血清（米国カリフォルニア州ウェストサクラメントのＧｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号９００−２０８）５０ｍｌと、１００×Ｌ−グルタミン：ペニシリン：ストレプトマイシン溶液（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号４００−１１０）５．５ｍｌを加えることによって、Ｄ１０培地を調製した。Ｌ−グルタミンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈカタログ番号１５−０４０）５００ｍｌに、上記と同じ２つの成分を加えることによってＲ１０培地を調製した。２９３Ｔ細胞（米国バージニア州マナッサスのＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１２６８）をＤ１０培地に維持し、Ｋ５６２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−２４３）細胞をＲ１０培地に維持した。
ベクターの作製
１×１０７個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＣＭＶΔＲ８．９１（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：８７１−８７５）１０μｇ、適切なｐＣＣＬｃベクタープラスミド１０μｇ及びｐＣＡＧ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｈａｎａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５：２４２−２５１）２μｇをトランスフェクションすることによって、ＬＶ上清を作製した。プラスミドと、１ｍｇ／ｍｌの分岐ＰＥＩ溶液（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４０８７２７−１００ＭＬ）６６μｌを加えてから、数秒間ボルテックスすることによって、トランスフェクション混合物をＤＰＢＳ１．５ｍｌにおいて調製した。室温で５〜１０分インキュベート後、２４時間前に１０ｃｍの皿に播種した２９３Ｔ細胞に、トランスフェクションミックスを滴下した。約１６時間後、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ培地（スイスのバーゼルのＬｏｎｚａ、カタログ番号１２−７２５Ｆ）に、培地を交換した。この培地交換から２４〜４８時間後に、ウイルス上清を回収した。
ｒｏＵＢＣベクターでは、ベクターのゲノムＲＮＡに対してアンチセンスである転写産物の存在を原因とする力価の低下を防止するために、５μｇのｐｃＤＮＡ３−ＮｏｖＢ２を含めた（Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１７：４００−４１１）。プラスミドＤＮＡの増加を補うために、さらなる１μｇ／ｍｌのＰＥＩ溶液１５μｌを加えた。
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣへのトランスダクションのために、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＷ−３２Ｔｉというローターにおいて、２６０００ｒｐｍで９０分、４℃で超遠心分離することによって、ベクターを約１５０倍濃縮した。
トランスフェクション
２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（米国ニューヨーク州コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５１６）に８×１０５細胞／ウェルで、Ｄ１０培地中に播種した。２４時間後、プラスミド１．５μｇをトランスフェクション用に、１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ内のＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（米国カリフォルニア州カールスバッドのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９８５−０６２）２００μｌにおいて調製した。ＴｒａｎｓＩＴ−２９３トランスフェクション試薬（米国ウィスコンシン州マディソンのＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ、カタログ番号ＭＩＲ２７００）４．５μｌを加え、その混合物を軽くボルテックスし、室温で５分インキュベートしてから、細胞に滴下した。トランスフェクションから４８時間後に、軽くトリプシン処理することによって細胞を回収し、フローサイトメーターのＢＤＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで、レポーターの緑色蛍光タンパク質の発現について解析した。
トランスダクション
レンチウイルスの発現解析のために、Ｋ５６２細胞を２４ウェルプレートに５００００細胞／ウェルで播種し、様々なベクター用量で処置し、トランスダクション率が１０％以下の集団を得て、細胞の大半に対して、１個のみが組み込まれるようにした。細胞を１〜２週間培養してから、フローサイトメトリー解析を行って、組み込まれなかったベクターを希釈除去し、蛍光タンパク質レベルを定常状態に到達させた。
動員末梢血由来の初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける発現解析のために、凍結保存細胞を解凍し、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ−３リガンドと、５０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子と、５０ｎｇ／ｍｌのヒトトロンボポエチン（米国ニュージャージー州ロッキーヒルのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）とを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において一晩、予備刺激を実施した。続いて、ウイルスベクターを同量の同じ培地に加えて、最終ベクター濃度を３×１０５トランスダクション単位／ｍｌ（Ｋ５６２細胞へのトランスダクションによって割り出した）とした。このベクター用量により、約１０％のトランスダクションが得られた。ベクターの添加から２４時間後に、骨髄分化培地２ｍｌを加えた。この培地は、２０％のＦＢＳ、０．５％のウシ血清アルブミン、５ｎｇ／ｍｌのヒトインターロイキン−３、１０ｎｇ／ｍｌのヒトインターロイキン−６及び２５ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＩＭＤＭで構成されていた。
スプライシングのＰＣＲ解析
ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼと、プライマーのＵＢＣイントロンＦ（ＡＡＧ ＴＡＧ ＴＣＣ ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＡＴ（配列番号１））、ＵＢＣイントロンＲ（ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ（配列番号２））、ＥＥＦ１Ａ１イントロンＦ（ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＧＧ ＴＴＴ Ｇ（配列番号３））及びＥＥＦ１Ａ１イントロンＲ（ＴＧＴ ＧＧＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＣＧＴ ＣＧＣ（配列番号４））を用いて、ＰＣＲを介して、トランスダクションしたＫ５６２細胞由来のゲノムＤＮＡを解析した。
プライマーのＵＢＣｉｎｔ Ｆ（ＧＧＣ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＧＡ ＡＧＴ ＴＴ（配列番号５））及びＥｍＧＦＰ Ｒ（ＴＡＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ（配列番号６））、ならびにプローブのＦＡＭ−ＥｍＧＦＰ（ＦＡＭ−ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＣ Ｇ（配列番号７））を用いて、ＵＢＣベクターをトランスダクションしたＫ５６２細胞由来のゲノムＤＮＡを解析することによって、定量ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行った。ＥＥＦ１Ａ１ベクターの解析のために、ＵＢＣｉｎｔ ＦプライマーをＥＥＦ１Ａ１ｉｎｔ Ｆ（ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＧＴ（配列番号８））に置き換えた。
ＵＢＣｉｎｔ Ｆの代わりに、ＵＢＣｓ Ｆ（ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＣＴ ＴＧＡ ＣＡ（配列番号９））を用いて、ＵＢＣのスプライシング済み形態を定量した。１００ｎｇのテンプレートｇＤＮＡを用いて、メーカーの指示に従って、ｄｄＰＣＲを行った。ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ）を含むｄｄＰＣＲマスターミックスに、酵素のＤｒａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を１ユニット加え、ＰＣＲ反応ミックスにおいて、１〜２時間、３７℃で予め消化を行ってから、ドロップレットの作製とサーマルサイクルを行った。
ベクター上清内のベクターゲノムの解析のために、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔの液体試料用手順（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、未処理のベクター上清５００μｌからＲＮＡを精製した。リバーストランスフェクションを行ってから、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＣＲを行った。
ルシフェラーゼアッセイ
最小ＴＡＴＡボックスプロモーターによって駆動される最適化ルシフェラーゼＯＲＦを含むｐＧＬ４．２５ベクター（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＵＢＣ及びＥＥＦ１Ａ１のイントロンのエンハンサー活性についてアッセイした。ＣＭＶプロモーター由来のプロモーターレスのエンハンサー配列をポジティブコントロールとして用いた。ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎＩで直鎖化したｐＧＬ４．２５に、すべてのインサートをＰＣＲとギブソンアセンブリーによってクローニングした。９６ウェルの組織培養処理プレートに播種した２９３Ｔ細胞において、ルシフェラーゼアッセイを行った。１ウェル当たり５０，０００個の細胞をＤ１０培地に播種し、１８時間後、トランスフェクションミックスをＯＰＴＩ−ＭＥＭにおいて、１ウェル当たり１００ｎｇのレポータープラスミドと、０．３μｌのＴｒａｎｓＩＴ−２９３とともに調製した。Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるトランスフェクションから４８時間後に、試料を調製し、プレートリーダーＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（スイスのメンネドルフのＴｅｃａｎ）によって、発光の読み取りを行った。
結果
プロウイルス形態からＵＢＣイントロンが喪失しており、発現カセットの反転により、喪失は防止される。
パッケージング中にＵＢＣイントロン１が保持されるかを評価するために、ＵＢＣプロモーターに様々な改変を施した状態で、一過性トランスフェクション用のｐＣＣＬｃ ＬＶ ＤＮＡコンストラクトと、より簡潔なｐＣａｆｅ発現プラスミドコンストラクトを作製した（図３）。すべてのコンストラクトに、緑色蛍光タンパク質のＥｍｅｒａｌｄバリアント（ＥｍＧＦＰ）を含め、これにより、フローサイトメトリーによる発現解析を可能にした（Ｔｓｉｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９−５４４）。ＵＢＣコンストラクトは、完全なＵＢＣプロモーター断片を含んでいた。この断片は、ヒトゲノムに存在するからである。その一方で、短縮型ＵＢＣｓコンストラクトは、ＵＢＣイントロン１が完全に欠失するように設計し、これは、パッケージング中に、カノニカルなスプライシングが行われた場合に、予測されるプロウイルス形態である。発現カセットを反対側の鎖に移動すると、スプライシングを介したイントロンの喪失が回避されるか調べるために、プロモーターと導入遺伝子を逆転させ、ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子の後に挿入することによって、逆配向（ｒｏ）コンストラクトｒｏＵＢＣ及びｒｏＵＢＣｓを作製した。重要なことに、ｐＣＣＬｃ ＬＶのペイロードは、ＲＮＡ中間体の段階を越えて、スプライシングを介した喪失の影響を受けるが、ｐＣａｆｅ発現プラスミドのペイロードは、ＲＮＡ中間体を有さないので、スプライシングによって遺伝子エレメントを喪失しないことができる。プロウイルス形態のＰＣＲベースの遺伝子解析のために、ウイルスベクターを２９３Ｔ細胞において作製し、これを用いて、Ｋ５６２細胞にトランスダクションした（図４、パネルＡ）。トランスダクションから２週間後に、ｇＤＮＡのＰＣＲ解析を行ったところ、ＵＢＣｓのプロウイルス形態の解析によって示されているように、多くのＣＣＬｃ−ＵＢＣＥｍＧＦＰ−ＰＲＥのプロウイルス形態が、イントロンの喪失の裏付けとなるアンプリコンを含んでいたことが明らかになった（図４、パネルＢ、レーン５及び６）。この短い産物のサンガーシーケンシングにより、予測されたカノニカルなスプライシングが行われたことが確認された（データは示されていない）。対照的に、ｒｏＵＢＣのプロウイルス形態では、トランケート型ＰＣＲ産物は得られなかったことから、発現カセットの反転により、イントロンの喪失が完全に防止されたことが示唆された（図４、パネルＢ、レーン７）。イントロン含有テンプレートとイントロン欠損テンプレート間におけるＰＣＲ産物の推測サイズの有意差により、イントロン欠損テンプレートの増幅へのかなりの偏りと、この結果から得られる、イントロンの喪失量の過大評価が存在していた可能性がある。そこで、イントロンの喪失頻度を定量するために、デュプレックスデジタルＰＣＲアッセイを構成し、このアッセイでは、ＬＶパッケージングシグナルに対するプライマー及びプローブセットを用いて、イントロン及びＥｍＧＦＰ導入遺伝子に及ぶプライマー及びプローブセットからのシグナルを標準化した（図５、パネルＡ及びＢ）。この解析により、ＵＢＣベクター形態では、わずか１８％が、ＵＢＣイントロンを保持していた（図５、パネルＣ）のに対して、ｒｏＵＢＣベクター形態は、イントロンを完全に保持していたことが示された。
トランスダクション及び逆転写中の現象により、イントロンを含むプロウイルス形態の割合が影響を受けるのかを評価するために、我々は、ＵＢＣウイルス上清からＲＮＡを回収し、スプライシングされたＵＢＣイントロンを含むＲＮＡゲノムの割合を定量した。続いて、同じ上清でトランスダクションしたＫ５６２細胞における、スプライシングされたイントロンを含むベクタープロウイルス形態の割合と、上記の割合を比較した。これらの値は、非常によく一致していたことから、イントロンはすでにベクター粒子において喪失していたため、パッケージング細胞において取り除かれていたことが示唆された（図９）。
イントロンの喪失により、ＵＢＣプロモーターからの発現が低下する。
イントロンの喪失が、導入遺伝子の発現に及ぼす作用を評価するために、完全なＵＢＣプロモーターエレメント、またはイントロン領域を欠失させたトランケート型ＵＢＣｓプロモーターを含むｐＣａｆｅ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクションし、トランスフェクションから４８時間後に、フローサイトメトリーによって解析した。ＵＢＣプロモーターでは、ＵＢＣｓプロモーターよりも有意に（約２倍）高い発現が見られた（図６、パネルＡ）。ｒｏＵＢＣとｒｏＵＢＣｓコンストラクトとの間でも、同様に２倍の差が観察された。これらのプラスミドは、細胞に直接トランスフェクションしたので、イントロンが喪失する可能性はなく、試験したＵＢＣプロモータープラスミドはすべて、イントロンを含んでいた。
イントロンが喪失する可能性のないこれらのトランスフェクション実験で、イントロンの存在により、発現が増大することが確立されたのを受けて、我々は次に、Ｋ５６２細胞へのトランスダクションから２週間に、ＬＶとしてパッケージングした様々なコンストラクトからの発現について調べた。遺伝子解析によって、ＵＢＣ ＬＶ形態の大半が、イントロンを欠失していることが明らかになったので、ＵＢＣベクターは、ＵＢＣｓベクターと同程度のレベルのＥｍＧＦＰを発現させると我々は推論した。実際、ＵＢＣベクターでトランスダクションした集団におけるＥｍＧＦＰ発現細胞の蛍光は、ＵＢＣｓベクターでトランスダクションした集団における蛍光とほぼ同等であった（図６、パネルＢ）。対照的に、ｒｏＵＢＣベクターでは、細胞において、ＵＢＣベクターよりも約２倍高い蛍光が見られ、ｒｏＵＢＣベクターがイントロンを保持することを示した遺伝子解析と一致していた。
我々は、顆粒球コロニー刺激因子で処置した健常なドナーの末梢血から濃縮したヒトＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞にもトランスダクションして、ＵＢＣベクターに比べて、ｒｏＵＢＣベクターからの発現が向上することは、レンチウイルス遺伝子療法と関連するタイプの初代細胞でも観察されるか確かめた。トランスダクション後の骨髄分化条件での培養から１０日後、ｒｏＵＢＣベクターでトランスダクションした細胞では、ＵＢＣでトランスダクションした細胞よりも、４倍高い発現が見られた（図１０）。遺伝子解析により、イントロンの喪失は、ＵＢＣでトランスダクションした細胞において、Ｋ５６２細胞で観察されたものと同程度であったことと、ｒｏＵＢＣでトランスダクションした細胞において、イントロンが完全に保持されていたことが示された（図１１）。
ＵＢＣイントロンが発現に及ぼすプラスの効果は、古典的なエンハンサー活性によるものではない。
我々は、発現カセットの反転に加えて、ＬＶにおけるＵＢＣプロモーター断片の十分な発現を維持するための別の方法も模索した。まず、我々は、報告されているイントロンエンハンサー配列をＵＢＣプロモーターのすぐ上流の部位に移動させると、完全長ＵＢＣプロモーター断片と同程度の発現が行われるようになるか調べた（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ，４４８：８８−１０１）。重要なことに、このバリアントは、イントロンスプライス部位が欠損しており、それにより、ＬＶにおけるイントロンの伝播が可能になったはずである。しかしながら、得られたｉＵＢＣコンストラクトは、ＵＢＣｓよりも劣っていた（図６、パネルＣ）。ｒｏｉＵＢＣとｒｏｆｉＵＢＣを作製及び解析して、エンハンサー配列のプロモーターに対する向きが重要であるかを評価したが、これらのプロモーターバリアントでは、ｉＵＢＣと同程度の発現が見られた（図６、パネルＣ）。我々は最後に、推定エンハンサー配列は欠損しているが、スプライシング部位は残っているｄＥｎｈＵＢＣを構築した。このバリアントは、おそらく、スプライシングによる核外移行の増加により、ＵＢＣｓよりもやや多くのＥｍＧＦＰを発現したが、ＵＢＣよりも有意に低かった（図６、パネルＣ）。これらの結果は、ＵＢＣプロモーター断片イントロンに関する追跡調査と一致しており、この追跡調査では、そのエンハンサー活性が、イントロン内でのその位置に完全に依存していることが分かった（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ，８：ｅ６５９３２）。この挙動（イントロン媒介性増強という）については、よく分かっていない。
ＵＢＣイントロン配列が実際に、古典的エンハンサーではないならば、異種の最小プロモーターからの発現を増大させるはずはないと本発明者は推論した。実際には、イントロン配列をルシフェラーゼレポータープラスミドにおいて、最小プロモーターの上流に、順配向または逆配向で配置したところ、ＣＭＶエンハンサー配列を上流に配置したプラスミドとは対照的に、ルシフェラーゼの発現は、バックグラウンドを上回る程度までは増大しなかったことが観察された（図１２）。事実、これらのプラスミドからの発現は、最小プロモーターのみを含むプラスミドからの発現よりも有意に低く、これは、転写ユニットの外側に配置すると抑制的となるＵＢＣイントロン配列と一致していた。この抑制作用には、イントロン配列をＵＢＣｓプロモーター形態の上流に配置したときに見られた発現低下が反映されている（図６、パネルＣ）。興味深いことに、このことは、順配向または逆配向のＥＥＦ１Ａ１イントロン１にも当てはまった（図１２）。
ＥＥＦ１Ａ１イントロンは、プロウイルス形態において保持され、発現の最大化を補助する。
ＵＢＣプロモーターからのイントロンの喪失が観察されることは、ＬＶにおける伸長因子１α（ＥＥＦ１Ａ１）プロモーター断片に関する報告とはかなり対照的であるので、我々は、ＥＥＦ１Ａ１プロモーター断片とＥｍＧＦＰレポーターによって、一過性トランスフェクション及びレンチウイルスの産生のための発現ベクターを作製した。トランスダクションした細胞由来のｇＤＮＡをＰＣＲ及びｄｄＰＣＲで解析したところ、ほぼすべてのベクター形態が、プロモーター内にイントロンを保持していたことが示された（図７、パネルＢ、レーン５）。ゲル電気泳動像のコントラストを極度に調節すると、イントロンの喪失時に予測される長さで、辛うじて検出可能な量の短い産物を明らかにできるが、定量ｄｄＰＣＲ解析では、この少数のイントロン欠損プロウイルス形態集団は検出されない（図７、パネルＣ）。これらの観察と過去の報告（２）と一致して、イントロン含有プロモーターとイントロン欠損プロモーターとの間では、一過性トランスフェクション（図７、パネルＤ）とトランスダクション（図７、パネルＥ）実験の両方で、約２倍の発現差が観察されたことから、ＥＥＦ１Ａ１プロモーターエレメントのイントロンが実際に、ほぼすべてのケースで、忠実に伝搬されていることが示唆された。
イントロンの伝播差は、プロモーターのエキソン配列によって決まる。
ＵＢＣプロモーターとＥＥＦ１Ａ１プロモーターとの間におけるイントロン保持度の差は、イントロン内のスプライシング効率またはスプライシング動態を決定する配列に起因するという仮説を我々は立てた。これを調べるために、我々は、一方のプロモーター由来のイントロンを他方のイントロンに置き換え、ＵＢＣ（ＥＥＦ１Ａ１ｉｎｔ）ベクターとＥＥＦ１Ａ１（ＵＢＣｉｎｔ）ベクターを作製した。驚くべきことに、ＵＢＣ（ＥＥＦ１Ａ１ｉｎｔ）ＬＶでは、ＥＥＦ１Ａ１イントロンが喪失し、イントロンレスのＵＢＣｓベクターと同程度のレベルのＥｍＧＦＰが発現した一方で、ＥＥＦ１Ａ１（ＵＢＣｉｎｔ）では、ＵＢＣイントロンが保持され、イントロンレスのＥＥＦ１Ａ１ｓベクターよりも有意に多いＥｍＧＦＰが発現したことが分かった（図１３）。これらの結果から、レンチウイルスの産生中にイントロンを保持するかを、これらの２つのプロモーターの別個のエキソン配列が決定していることが示唆されている。
発現カセットの改変により、ＵＢＣ双方向性ベクターからの発現が最大になる。
我々は最後に、ＬＶにおいて２つの導入遺伝子の協調発現を媒介する、ＵＢＣプロモーターベースの双方向性ベクターからの発現を向上させようと努めた（Ｋａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，５：ｅ１１８３４、Ａｍｅｎｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１０８−１１６）。このベクターデザインには、ＵＢＣプロモーターのセンス鎖配向が必要なので、大半のプロウイルス形態は、ＵＢＣイントロンを喪失し、相違するデュアルＵＢＣプロモーターと最小サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを反転させると、ＵＢＣにより促される導入遺伝子とともに、イントロンが含まれることにより、発現が増大すると本発明者は推論した（図８、パネルＡ）。
安定的にトランスダクションした２９３Ｔ細胞の遺伝子解析により、ＵＢＣプロモーターがベクターセンス鎖にあるＢＤベクターからの時には、ＵＢＣイントロンが７５％喪失した一方で、ｒｏＢＤベクターでは、ほぼすべてのプロウイルス形態が、ＵＢＣイントロンを含んでいたことが明らかになった（図８、パネルＢ）。これにより、安定的にトランスダクションした細胞において、ＵＢＣプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰの発現が増大した（図８、パネルＣ）。驚くべきことに、イントロンが従来型のエンハンサーを含まないことを示唆している発現データに鑑みると、ｒｏＢＤでトランスダクションした細胞における保持ＵＢＣイントロンにおいて、最小ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｍＣｈｅｒｒｙの発現も増大した。
考察
最近、レンチウイルス遺伝子の移入は、遺伝子療法の臨床試験まで進んでおり、多数の成果が見られており、臨床的に有意な有害事象は見られず、また、まもなく臨床段階に進みそうな多くの前臨床研究において有望視されている（Ｃａｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６（５９５４）：８１８−８２３、Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７：３１８−３２２、Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１（６１４８）：１２３３１５１、Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１（６１４８）：１２３３１５８、Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３（８）：３３１７−３３３０、Ｃａｒｂｏｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２：６０７−６２２）。さらなる障害に対して療法が開発されるのに応じて、導入遺伝子調節のための様々なゲノム断片を有する新たなベクターが作られることになる。プロモーター／導入遺伝子のこれまでの組み合わせには、十分な活性及び調節のために、イントロンの存在が必要とされてきており、今後のデザインの一部でも、これが必要とされる可能性が高い。
我々が得た結果から、イントロンによって、ベクターの産生及びトランスダクションの間にイントロンが喪失する可能性は異なることが示唆されている。ヒトＵＢＣプロモーター断片は、大半のプロウイルス形態において、そのイントロンを喪失していたが、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター断片は、このような影響を受けなかった。ＵＢＣイントロンを含めるには、導入遺伝子カセットを反転させて、スプライシング機構によって処理されないようにする必要があるが、ＥＥＦ１Ａ１イントロンは、理論上、スプライセオソームにさらされても、ほぼすべてのプロウイルス形態で保持される。これまでの研究によって、ハイブリッドＣＡＧプロモーターも、ベクターの産生及びトランスダクションにわたって保持されることが示されている（Ｒａｍｅｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２：４５８−４６９）。イントロンレス型のＥＥＦ１Ａ１プロモーターは、アデノシン−デアミナーゼ欠損を伴う重症複合免疫不全症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）とＸ連鎖ＳＣＩＤ（ＳＣＩＤ−Ｘ１）の両方において、臨床段階に移っており、前臨床試験により、治療効果を得るのに十分な導入遺伝子の発現を駆動しそうなことが示唆された。我々によるデータでは、イントロン１を含む完全ＥＥＦ１Ａ１プロモーターにより、導入遺伝子の発現が２倍ほど高くなることが示されており、この増大は、今後のベクターデザインに必要となるか、または有益となり得るものである。このベクターでのトランスダクションから得られたプロウイルス形態には、そのイントロンが喪失したものはほぼ皆無であったことも我々は見出した。全体として、これらの結果から、既知または未知のイントロンは、ばらつきの大きいベクター形態を持つトランスダクション細胞をもたらす可能性があるので、レトロウイルスベクターの遺伝子的な特徴付けを十分に行うことの重要性が示されている。調節の観点から、産物の特徴付けが重要である遺伝子療法の分野では、このばらつきは、受け入れられる可能性が低い。
スプライスドナー部位またはアクセプター部位に向けられるアンチセンスＲＮＡは、一次転写産物のスプライシングを防げることが報告されている（Ｍｏｒｃｏｓ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３５８：５２１−５２７）。したがって、我々は、レンチウイルス産生の間に、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位のいずれかに対する５０ｎｔのアンチセンス配列を発現するＵ６駆動型プラスミドを用いて、ＵＢＣベクターゲノムのスプライシングを阻害することを試みた。残念ながら、これらのコンストラクトは、単独で用いても、または組み合わせて用いても、トランスダクション後に、ＵＢＣベクターからの発現を増大させなかった（データは示されていない）。この方策では、ＬＶにおける他のイントロンを保持できたが、我々の実験におけるＵＢＣイントロンに対しては有効ではなかった可能性がある。上で報告したように、ＵＢＣプロモーターのイントロンは確かに、発現を増大させるが、イントロン配列内のエンハンサー様活性は、イントロン内側のその位置に左右されることを我々は見出した。これは、十分な活性を得るために、内因性イントロンとともに導入遺伝子が組み込まれる未来のベクターデザインであって、イントロン配列によって含まれる調節活性も同様に移動可能ではないと思われるベクターデザインに匹敵し得る。ＵＢＣイントロン配列は、転写ユニット内に存在すると、発現に対してプラスの作用を及ぼすが、プロモーターの上流に配置されると、マイナスの作用を及ぼす理由を調べるさらなる研究も認められている。これは、遺伝子療法と遺伝子操作における内因性遺伝子の調節と導入遺伝子の調節の両方において、重要な意味を持つ可能性がある。重要なことに、我々のデータでは、このようなイントロンは、おそらく、遺伝子療法の臨床試験において有害事象と不顕性のクローン性増殖を引き起こすような形で、近くのプロモーターをトランス活性化することはないので、ベクターに組み込むには、比較的安全なペイロードであることが示唆されている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７：３１８−３２２、Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：４１５−４１９、Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：３１３２−３１４２、Ｈｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：３１４３−３１５０、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６：１９８−２０４）。
ＵＢＣイントロンとＥＥＦ１Ａ１イントロン１には、カノニカルなスプライスドナー、アクセプター及び分岐点部位への付着の観点では、顕著な配列レベルでの違いはなく、イントロンを置き換えたベクターから得た我々のデータでは、イントロンの喪失を決定する配列は、イントロン自体の中ではなく、ＵＢＣ及びＥＥＦ１Ａ１プロモーターのエキソン配列内にあることが示されている。これが概ね本当であるならば不運である。コード配列である大半のエキソンにおいては、ベクターを改変して、スプライシングを変更する可能性は、大きく制限されることになるからである。生物学的に言えば、これは驚くに値しない。ヒトゲノムのエキソンは、エキソンスプライシングエンハンサーとともに、エキソンスプライシングサプレッサー／サイレンサーを含むことが知られているからである。これらの配列は、ヒトイントロン（その大半が次善的に定義されていると考えられている）のスプライシング効率を制御する（Ｚｈｅｎｇ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１１：２７８−２９４）。
これらのイントロン間における喪失頻度の差は、それらのイントロンがスプライシングされる速度と関連があり、その速度は主にエキソン配列によって決定し得ると我々は考えている。さらなる実験で、これらの２つの遺伝子エレメントのスプライシング動態を評価できた（スプライシング速度は、イントロンの伝播と逆の相関があると予測される）。新たな作業により、転写産物のスプライシングとクロマチンからの放出の動態が調べられたが、異なる転写産物で観察される速度の範囲を決定する配列は、まだ分かっていない（Ｐａｎｄｙａ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ，１９：８１１−８２７）。スプライシング動態の決定因子に対する理解が深まれば、ＵＢＣプロモーター断片を改変して、スプライシング速度を十分に低下させて、導入遺伝子の発現中の効率的なスプライシングを維持したまま、イントロンを含むゲノムＲＮＡをベクター粒子中にもたらすことにつながり得る。
実施例２
ヒト造血幹細胞／前駆細胞の濃縮によって、幹細胞遺伝子療法におけるトランスダクションが促進される。
鎌状赤血球症に対する自己造血幹細胞（ＨＳＣ）による遺伝子療法には、同種異系移植に付随する重大な免疫学的合併症なしに、この疾患を治療できる可能性がある。しかしながら、ＣＤ３４−濃縮細胞集団を用いたｂ−グロビンレンチウイルスベクターによるトランスダクション効率は、次善的であり、臨床試験には、大規模なベクター産生バッチが必要となり得る。ＨＳＣについてさらに濃縮されている細胞集団にトランスダクションすると、ベクターの必要量が大きく低下し得、トランスダクション効率が向上する可能性がある。全ＣＤ３４＋細胞のうちの約１％〜３％を占めるＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を健常な臍帯血ＣＤ３４＋細胞から蛍光活性化細胞選別によって単離し、抗鎌状化形態のβグロビンを発現するレンチウイルスベクター（ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ）でトランスダクションした。単離したＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、ＣＤ３４＋細胞と比べて、長期培養（ＬＴＣ）の長い時間にわたり、子孫を産生できたとともに、トランスダクションに必要としたベクターは、同等数のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を含むバルクのＣＤ３４＋調製物と比べて、最大４０倍少なかった。単離ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションは、定量ＰＣＲによって１４日目に測定したＣＤ３４＋細胞に匹敵していたとともに、ベクターの必要量は少なく、平均ベクターコピー数／細胞は、ＣＤ３４＋／３８−細胞から開始したＬＴＣの時間にわたり、高いままであった。インビトロでの赤血球分化後、ＨＢＢＡＳ３ ｍＲＮＡの発現は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞または非分画ＣＤ３４＋細胞に由来する培養液において、同程度であった。インビボ調査では、トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を、１００倍多いＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞と競合して移植したところ、同等の正着が見られた。この調査では、有意に少ないベクターを使用するとともに、ＨＳＣ遺伝子療法でのトランスダクションを潜在的に向上させるために、ヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を単離することから、有益な効果が得られる証拠が示されている。
序論
造血幹細胞ベースの療法は、多くの遺伝性及び後天性の血液細胞疾患を治療できる可能性があり、近年、臨床での目覚ましい進展がみられている（Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ６４−Ｓ６９）。鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、重大な病的状態と早期の死につながる重症急性疾患と進行性臓器損傷と関連する多臓器疾患である（Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１６３９−１６４４）。ＳＣＤは、世界において最も一般的な遺伝子障害の１つであり、米国では約９０，０００人が罹患している。現時点での治療は主に、貧血と疼痛への対症療法からなる。ヒドロキシウレア（ＨＵ）は、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）の産生を誘導して、低酸素圧条件下での鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）の重合を阻害する別の治療選択肢であるが、ＨＵは、様々な理由から、広くは使われていない（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｒｒａｌ（２０１４）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．７５：１９６−２０４、Ｂｒａｎｄｏｗ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８５：６１１−６１３）。ＳＣＤが治癒する唯一の可能性は、同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。ＨＳＣＴには典型的には、十分に適合したドナーが必要となり、移植片拒絶反応または移植片対宿主病の可能性により、長期の免疫抑制の必要性も伴うことがあるが、適合する同胞幹細胞の成人被投与者で、有効に強度の低下した状態が見られたことについての過去の報告により、見込が残されている（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＪＡＭＡ３１２：４８−５６）。
自己造血幹細胞（ＨＳＣ）による遺伝子療法は、ＳＣＤに対する有望な治療であり、同種異系ＨＳＣＴで見られる重大な免疫学的合併症を起こさない可能性がある（Ｃｈａｎｄｒａｋａｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２８：１９９−２１６）。抗鎌状化βＡＳ３−グロビン遺伝子は、マウス及びヒト造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に加えたときに、赤血球（ＲＢＣ）の鎌状化を阻害するとともに、ＳＣＤの発症を予防するＨｂＦと同様の活性を持つことが示されている（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：４３１２−４３１９、Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２７５１８−２７５２４、Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０）。しかしながら、複合体と比較的大きいヒトβ−グロビンゲノム発現カセットを含むレンチウイルスベクターは、力価が低く、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣのトランスダクションは、中程度に有効であるに過ぎず、比較的多量のベクターの使用を必要とする一方で、遺伝子移入数は比較的少ない（例えば、細胞当たりの平均ベクターコピー数は０．５〜１．０である）。非濃縮産生バッチの力価は、≦１０６トランスダクション単位（ＴＵ）／ｍｌであり、トランスダクションを臨床規模で行うには、大量のベクターの作製が必要となる。理想上では、ウイルスベクターの使用量を減らす方法を特定することにより、高額なベクター作製コストが回避され、より多くの患者が治療可能になる（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：９７６−９８８）。
ＣＤ３８は、様々な成熟造血細胞で発現するＩＩ型膜表面糖タンパク質である。ＣＤ３８の発現は、初期ＨＳＰＣ集団では、低いかまたは見られないかのいずれかであり（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ，８６：３７４５−３７５３、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８８：３３０６−３３１３、Ａｌｂｅｎｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．３：５５−６０）、ヒト分化万能性原始ＨＳＣの最大の定義は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−分画内に含まれている（Ｎｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：２１８−２２１）。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、ＣＤ３４＋細胞の約１％〜３％を占めるに過ぎないので、非分画ＣＤ３４＋集団よりも、ＨＳＰＣについて５０〜１００倍濃縮されている。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、長期増殖と血液細胞産生の能力が、非分画ＣＤ３４＋細胞を上回る（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ，８６：３７４５−３７５３、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８８：３３０６−３３１３）。過去に発表された研究では、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによって、初代ヒトＢＭ ＣＤ３４＋細胞にトランスダクションできることが示されているが（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０）、効率は中程度で、比較的高いベクター濃度を使用する。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を単離することによって、標準的なＣＤ３４＋細胞濃縮分画を上回る形でＨＳＰＣを更に精製すると、エキソビボで処置する標的細胞の絶対数が低下し、治療対象当たりに必要なベクター数が、有意に減少するという仮定を我々は立てた。
この実施例では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて単離したヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を、最大４０倍少ないウイルスベクターでトランスダクションできたとともに、非分画ＣＤ３４＋細胞集団で見られるベクターコピー数（ＶＣＮ）に匹敵するかまたはこれを上回るベクターコピー数（ＶＣＮ）を実現できたことを我々は示す。これらの結果から、ＳＣＤの遺伝子療法の有効性を高めるために、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−濃縮ＨＳＰＣを用いて、ＨＳＣへのトランスダクションを向上させる可能性が示されている。
材料と方法
ベクター
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢとＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰの構築については説明されている（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０）。ＣＣＬ−Ｕｂｉｑ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥ、ＣＣＬ−ＵｂｉｑｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥ及びＣＣＬ−Ｕｂｉｑ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥは、ＣＣＬベクター骨格（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０）、ヒトユビキチンプロモーター（Ｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：８６８−８７２）、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した蛍光遺伝子、最適化転写後調節エレメント（ＰＲＥ（Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：６０５−６１９、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：６４１−６４５））及びＳＶ４０ポリアデニル化エンハンサー配列ＵＳＥの２つのタンデムコピー（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１１６７−１１７３）を用いて構築した。レンチウイルスベクターをＶＳＶ−Ｇシュードタイプでパッケージングし、濃縮し、記載されているように、力価を測定した（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７：１−９）。ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢも、ＲＤ１１４／ＴＲプラスミドを用いて、ＲＤ−１１４シュードタイプでパッケージングし（Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：８２３−８３２、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３４：１２６９−１２７６、Ｒａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：２１２９−２１３４）、記載されているように、力価を測定した（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７：１−９）。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢの様々な調製物の力価は、３００〜１，０００倍濃縮後、６×１０８〜６×１０９ＴＵ／ｍｌであったのに対して、濃縮ＲＤ１１４／ＴＲシュードタイプ調製物では、２．７×１０７ＴＵ／ｍｌであった。
試料の採取
ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ロサンゼルス）において、経腟分娩及び帝王切開後に、臍帯を結紮して切断してから、胎盤から、抗凝固剤のシトレート−フォスフェート−デキストロースの入った滅菌採血チューブ内への脱血によって、臍帯血ＣＢを採取した。すべてのＣＢ検体は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって認められたガイドラインに従って採取し、ＩＲＢの審査を免除される匿名医療廃棄物とみなした。採血の４８時間以内に、細胞を処理した。Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）比重遠心を用いて、単核球（ＭＮＣ）をＣＢから単離した。続いて、免疫磁気カラム分離を用いて、ＭＮＣを抗ＣＤ３４マイクロビーズ（ドイツ、ベルギッシュグラートバハのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）とともに４℃で３０分インキュベートすることによって、ＣＤ３４＋細胞について濃縮した。続いて、その細胞を免疫磁気カラムにかけ、ＣＤ３４＋細胞を回収した。ＣＤ３４＋細胞を凍結培地（１０％ジメチルスルホキシド［ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ］、９０％ＦＢＳ）とともにクライオバイアルに入れ、必要になるまで液体窒素で凍結保存した。
蛍光抗体標識とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の選別
ＣＤ３４＋細胞を解凍し、洗浄し、蛍光標識抗体とのインキュベートに備えて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）７５ｍｌに再懸濁した。未希釈のフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＤ３８（２０ｍｌ）と、未希釈のアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗ＣＤ３４（５ｍｌ）（いずれの抗体も、カリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を加え、細胞を３０分、４℃で遮光下においてインキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳを行った。
生存ＭＮＣ集団を前方散乱と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）染色によってゲーティングした。ゲーティングした領域を用いて、ＣＤ３４＋細胞集団を定めた（図１４、パネルＡ）。Ｐ３を用いて、Ｆ１ ＣＤ３４＋／３８−細胞集団を定めたところ、ＰＥ陰性であったＡＰＣ陽性細胞の２．５％であった。Ｐ５を用いて、ＡＰＣ陽性かつＰＥ陽性であったＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞を定めた。これらのゲーティング戦略をすべての選別実験で使用した。
レンチウイルスベクターでのトランスダクション
細胞選別後、レトロネクチン（２０ｍｇ／ｍｌのレトロネクチン、日本のＴａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｃｏ．）でコーティングした非組織培養処理プレートの個々のウェルに、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を１ミリリットル当たり６．３×１０４〜７．５×１０５細胞の細胞密度で入れた。予備刺激を１８〜２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で、トランスダクション培地（１×Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌ−Ｇｌｕｔ／Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（カリフォルニア州ウェストサクラメントのＧｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）（マサチューセッツ州ケンブリッジのＳｔｅｍＧｅｎｔ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒトインターロイキン−３（ｈＩＬ−３）（ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒトトロンボポエチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び５０ｎｇ／ｍｌのヒトＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３）（ニュージャージー州ロッキーヒルのＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む無血清Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（スイスのバーゼルのＬｏｎｚａ））において行った。予備刺激後、所望のウイルスベクター（ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ、ＣＣＬＭＮＤ−ＧＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｉｔｒｉｎｅまたはβＡＳ３−ＦＢ−ＲＤ１１４）を所定のベクター濃度（別段の定めのない限り、典型的には２×１０７ＴＵ／ｍｌ）で各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、再度インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、基礎骨髄培地（イスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｌ−Ｇｌｕｔ／Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２０％ＦＢＳ、０．５２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び２５ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦとともに、３７℃、５％ＣＯ２で骨髄分化させるために、組織培養処置プレートに移した。１４日の期間にわたり、必要に応じて、新鮮な培地を加えた。１４日の培養後、ｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｈｉｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１５：８６０４−８６１０）によって、ＶＣＮを割り出し、フローサイトメトリーを用いて、蛍光レポーター遺伝子の発現を解析した。
長期間質培養とメチルセルロース培養
予定したＣＤ３４＋細胞選別の２日前に、ＭＳ５マウス間質細胞（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，６：４５２−４５８）を解凍し、１０，０００ｃＧｙで照射してから、９６ウェルプレートにおいて、間質培地（ＩＭＤＭ［ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、ＦＢＳ１０％、２−メルカプトエタノール）内に播種して（３×１０４細胞／ウェル）、長期培養（ＬＴＣ）のための事前樹立間質層を形成した。照射したストローマ上で、ＬＴＣ培地（ＩＭＤＭ、３０％ＦＢＳ、１０％ＢＳＡ、２−メルカプトエタノール、１０６ｍｏｌ／ｌのヒドロコルチゾン、１×Ｌ−Ｇｌｕｔ／Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ならびに、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３［ＩＬ−３］、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−６及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ））において、選別したＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を共存培養した（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８８：３３０６−３３１３、Ｂｒｅｅｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ，９１：１１１−１１７、Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ，８６：１７８４−１７９３、Ｂｅｎｎａｃｅｕｒ−Ｇｉｓｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ，９７：４３５−４４１）。２〜４週おきに、非接着細胞の試料を培養液から除去した。血球計算盤（ペンシルベニア州ピッツバーグのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって生存細胞を計数することによって、これらの数を割り出し、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、下に記載されているようなｑＰＣＲに備えて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
分化とｍＲＮＡ発現解析
インビトロ赤血球分化アッセイは、Ｄｏｕａｙ ａｎｄ Ｇｉａｒｒａｔａｎａ（２００９）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８２：１２７−１４０をＲｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０で改変したものから適合させたプロトコールに基づいている。ＦＡＣＳ単離ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞及び非分画ＣＤ３４＋細胞の予備刺激とトランスダクションの後、細胞を赤血球培養液に移した。Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７：１−９に記載されているように、ＬＶプロウイルスにおけるＨＩＶ−１パッケージングシグナル配列ＰｓｉのｑＰＣＲを用いて、ＶＣＮを解析し、ヒト細胞常染色体遺伝子シンデカン４（ＳＤＣ４）に対して標準化して、ＶＣＮを算出した。Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０によってすでに説明されているように、ＨＢβＡＳ３ ｍＲＮＡの発現を割り出した。
トランスダクションしたヒトＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の免疫不全マウスへの移植
健常なドナーのＣＢから得た非分画ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞に、異なる蛍光マーカー遺伝子を含むレンチウイルスベクターで、いずれも２ ３×１０７ＴＵ／ｍｌ（ＭＯＩ５〜１４０）において、別々にトランスダクションした。モックをトランスダクションした細胞（５×１０５）と、コントロールをトランスダクションした非分画ＣＤ３４＋（５×１０５）細胞を個別に、尾静脈注射によって、２５０ｃＧｙの全身放射線照射後の６〜１０週齢の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｉｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（カリフォルニア州サクラメントのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に移植した。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞を１：９９の比で混合して、２×１０３個のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞及び２×１０５個のＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞を尾静脈注射によって、放射線照射後の６〜１０週齢のＮＳＧマウスに同時移植するようにした。
８〜１２週間後、マウスを安楽死させ、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５とＨｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０コンジュゲート抗マウスＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との比較を用いたフローサイトメトリーによって、ＢＭのヒト細胞の正着について解析した。抗体のインキュベート後、ＢＤ ＦＡＣＳ−Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＲＢＣを溶解させた。正着したヒト細胞の割合は、％ｈｕＣＤ４５＋細胞／％ｈｕＣＤ４５＋細胞＋％ｍｕＣＤ４５＋細胞として定義した）。ｈｕＣＤ４５＋細胞の中から、フローサイトメトリーを用いて、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎの発現を解析した。
ｄｄＰＣＲを用いて、ヒト細胞の陽性正着によって、マウスＢＭ試料において、平均ＶＣ／ヒト細胞を測定した（表４）。１×ｄｄＰＣＲマスターミックス（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ）、すべてのベクターを検出するためのＨＩＶ−１Ｐｓｉ領域、または各蛍光レポーター遺伝子のいずれかに特異的なプライマー及びプローブ（プライマーは４００ｎＭ、プローブは１００ｎＭ）、ＤｒａＩ（４０Ｕ、マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ならびに１．１ｍｌ（ｃｆｕでは４ｍｌ）のゲノムＤＮＡ試料を含む２２ｍｌの体積からなる反応混合物を調製した。Ｈｉｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１５：８６０４−８６１０に記載されているように、ドロップレットの作製を行った。サーマルサイクル条件は、９５℃で１０分、９４℃で３０秒及び６０℃で１分（５５サイクル）、９８℃で１０分（１サイクル）、ならびに１２℃で保持から構成させた（表３）。常染色体ヒト遺伝子ＳＤＣ４遺伝子に対するプライマーを用いて、ＮＳＧマウスから回収した骨髄に存在するヒト細胞の割合について、遺伝子の特異的増幅部分を標準化して、試料中のマウス細胞の存在を調整した。実験に関わるすべてのマウスは、ＵＣＬＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認められたプロトコールに従って飼育及び取扱いを行った。
低密度リポタンパク質レセプターの発現解析
細胞を回収し、蛍光抗体染色及び細胞選別の章で上記したように選別した。３７℃、５％ＣＯ２で、トランスダクション培地において、レトロネクチン（２０ｍｇ／ｍｌのレトロネクチン、日本のＴａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｃｏ．）でコーティングした非組織培養処理プレートの個々のウェルに、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を入れた。２４時間及び４８時間の培養時点に、フローサイトメトリーを用いて、培養前（０時間時点）の細胞と比較して、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターの発現を解析するために、細胞を回収した。細胞を洗浄し、蛍光標識抗体の１０ｍｌの未希釈ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＬＤＬレセプター（ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートするために、９０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞は、３０分、４℃で、遮光下においてインキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、解析用のＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａによって解析した。ＡＰＣ陽性細胞は、ＬＤＬレセプターの発現に関して陽性であるものとみなした。
統計解析
実験条件による連続結果変数（平均及びＳＥなど）が図に示されている。一元または二元ＡＮＯＶＡの枠組み内のいずれかの独立ｔ検定によって、ペアワイズ比較を行った。正規性の前提を満たさなかったときには、ウイルコクソンの順位和検定による二群比較を行った。混合線形モデルを用いて、２つの群を経時的に比較した。０．０５というｐ値を有意性閾値として用いた。
結果
ＦＡＣＳを用いたＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の単離
免疫磁気カラムを用いて、健常なドナーのＣＢをＣＤ３４＋細胞について濃縮した。フローサイトメトリーによって、非分画ＣＤ３４＋細胞部分を選別して、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を単離した（操作上、ＣＤ３８の発現について最低２．５％である細胞として定義した）（図１４、パネルＡ）。ＣＢユニットから単離した２．２〜６．８×１０６個のＣＤ３４＋細胞から始めて、６×１０３〜６×１０４（平均＝２．５×１０４）個のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を単離した（これは、理論的収量の３６％〜９９％の範囲を表している（ｎ＝１１））。
長期培養を行ったところ、非分画ＣＤ３４＋細胞は、最初の１カ月で約１０倍拡張し、その後、数が減少した（図１Ｂ）。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞で開始したＬＴＣは、さらに大規模に（約１００倍）拡張し、３カ月超にわたり、安定した細胞数を維持し（図１４、パネルＢ）、バルクのＣＤ３４＋細胞と比べて、より原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−集団の産生能が高いことが示された。
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションの比較評価
健常なドナー（ｎ５１１）のＣＢから得たＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢレンチウイルスベクターによるトランスダクションを比較した。同じ体積におけるＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を同数用いるか、異なる細胞数にトランスダクションしたときには、培養液の総体積を調節するかのいずれかで、実験内のこれらの２つの細胞タイプにおいて、細胞密度とベクター濃度、すなわち、感染多重度（ＭＯＩ）を一定に保った。トランスダクションした細胞はいずれも、２週間、短期間のインビトロ骨髄分化条件下で培養し、メチルセルロースコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイで成長させるか（１４日）、長期骨髄培養液（９０日）で成長させるかして、コロニー形成能とＶＣＮを比較した。
細胞から単離したゲノムＤＮＡを１４日目に、定量（ｑＰＣＲ）によって、ベクターのＨＩＶ−１ｐｓｉ領域について解析して、平均ベクターコピー数／細胞（ＶＣＮ）を割り出した。各試料において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションは、ＣＤ３４＋細胞へのトランスダクションと同等であったか、またはこれを上回っていた（表２）。トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から産生された細胞のＶＣＮ（２．４３±０．４１）は、トランスダクションしたＣＤ３４＋培養液での１．２５±０．２８と比べて有意に高かった（ｎ＝１１、ｐ＝０．０２）（図１５、パネルＡ）。
ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞によって形成されたコロニーのタイプには、差はなかった（図１５、パネルＢ）。コロニーは、メチルセルロースに播種した非トランスダクションＣＤ３４＋細胞（ＮＴ−ＣＤ３４＋）の２５．７％、トランスダクション済みＣＤ３４＋細胞の２４．３％、トランスダクション済みＣＤ３４＋／３８−細胞の２２．３％によって形成された（図１５、パネルＣ）。個々のＣＦＵのｑＰＣＲを行って、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター配列を検出及び定量したところ、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から得られたトランスダクションコロニー形成前駆体の割合（７３．８％、平均ＶＣＮ＝２．１２）は、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞における割合（５６．２％、平均ＶＣＮ＝１．７５）よりも高いことが示された（それぞれ、ｎ＝８０コロニー）（図１５、パネルＤ）（ｐ＝０．５２）。ＣＤ３４＋／３８−細胞から形成されたＣＦＵは、１〜２ＶＣ／細胞のコロニーの割合（４７．５％）が、非分画ＣＤ３４＋細胞から形成されるコロニーの割合（３６．２％）と比べて高いことが示された（図１５、パネルＤ）。
ベクター用量応答実験を行って、２×１０６〜２×１０７ＴＵ／ｍｌというトランスダクション中ベクター濃度範囲を用いて、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターが、ヒトＣＢ ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞にトランスダクションする相対能力を調べた。両方の細胞集団でベクター濃度を向上させたところ、１４日目の遺伝子移入量（ｑＰＣＲによって測定したＶＣＮ）は、用量相関的な増加が見られた（図１５、パネルＥ）。しかしながら、試験したいずれのベクター濃度でも、得られたＶＣＮは、ＣＤ３４＋細胞よりも、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の方が高かった（６．６×１０６ＴＵ／ｍｌにおいてはｐ＝０．０５、２×１０７ＴＵ／ｍｌにおいてはｐ＝０．００２）ので、かなり低い濃度のウイルスベクター（２×１０６ＴＵ／ｍｌ）を用いても、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞にトランスダクションできたとともに、これよりも高いベクター濃度（２×１０７ＴＵ／ｍｌ）においてＣＤ３４＋細胞で得られるトランスダクションレベルに匹敵できた（図１５、パネルＥ）。
トランスダクションしたＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（ｎ＝３）を９０日間、ＬＴＣで、ＭＳ５間質細胞上で成長させ、いくつかの時点に、細胞試料のＶＣＮを解析した（図１５、パネルＦ）。各時点において、ＶＣＮは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞に由来する培養液（１．６〜２．３）の方が、非分画ＣＤ３４＋集団からの培養液（０．３〜０．６）と比べて高かったとともに（ｐ＝０．０００４）、統計的に有意な時間的傾向差が見られた（ｐ＝０．０３）。
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から開始したＬＴＣでは、コロニー形成細胞の頻度が、ＣＤ３４＋細胞から開始した培養液と比べて、加速度的に高くなった。ＬＴＣの３０日目には、メチルセルロースに播種したＮＴ ＣＤ３４＋細胞の培養液由来の細胞の０．０５％、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞の０．０４％、及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／３８−細胞の０．１３％（ｐ＜０．０００１）が、コロニーを生成した（図２０）。ＬＴＣの６０日目には、メチルセルロースに播種したＮＴＣＤ３４＋細胞由来細胞の０．００１７％、トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞由来の０．００２５％及びトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞由来の０．００６７％がコロニーを形成した（図２１）。
また、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から開始した培養液の方が、ＣＤ３４＋細胞で開始した培養液よりも、高い割合のトランスダクションコロニー形成前駆体が存在していた。ＬＴＣの３０日目にｄｄＰＣＲによって解析したところ、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞から形成された８３．７％（平均ＶＣＮ５２．３）は、非分画ＣＤ３４＋の培養液に由来する個々のＣＦＵの７７．３％（平均ＶＣＮ＝２．２）と比べて、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターに対して陽性であった（図２０）。６０日目には、非分画ＣＤ３４＋細胞は、３コロニーしか形成せず、そのうちの１つのＶＣＮは０．５であった一方で、残りの２つのＶＣＮは０であった。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞からは２２個のＣＦＵが形成され、１６個（８８．８％）が、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターに対して陽性であった（平均ＶＣＮ＝１．５２）（図２１）。
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクター以外のベクターでも、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションの方が高くなるか確かめるために、高力価緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ＬＶベクター（ＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰ）による、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクション効率を用量応答実験で評価した。両方の細胞集団に、等しい細胞密度で、ＣＣＬ−ＭＮＤ−ＧＦＰ ＬＶベクターによって、２×１０６ＴＵ／ｍｌ、６．６×１０６ＴＵ／ｍｌ及び２×１０７ＴＵ／ｍｌの濃度（ＭＯＩはそれぞれ、４、４０及び４００であった）でトランスダクションした。再度、両方の細胞集団において、ベクター濃度を向上させていったところ、１４日目に、遺伝子移入（ｄｄＰＣＲによって測定したＶＣＮ）の用量相関的な増加が見られた（図１６、パネルＡ）。６．６×１０６ＴＵ／ｍｌ及び２×１０７ＴＵ／ｍｌのベクター濃度では、得られたＶＣＮは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の場合の方が、ＣＤ３４＋細胞よりも高かった（６．６×１０６ＴＵ／ｍｌにおいては、ＣＤ３４＋の平均ＶＣＮは２．２５±０．１５であったのに対して、１．３６±０．０５であり、２×１０７ＴＵ／ｍｌにおいては、３．３７±０．０７であったのに対して、４．３２±０．６であった。ｐ＝０．０２）。１４日目に、フローサイトメトリーを用いて、ＧＦＰ発現細胞の割合を割り出したところ（図１６、パネルＢ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞における４５％〜９７％に対して、ＣＤ３４＋細胞では４５％〜８１％の範囲で（図１６、パネルＣ）、これは、有意な差ではなかった（ｐ＝０．２９）。
ＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のインビトロでの赤血球分化
ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクション後、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢベクターによるβＡＳ３−グロビンの発現を比較するために、インビトロ赤血球分化モデル（Ｄｏｕａｙ ａｎｄ Ｇｉａｒｒａｔａｎａ（２００９）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８２：１２７−１４０）をトランスダクション細胞に適用して、β−グロビン遺伝子カセットによる発現を補助する成熟ＲＢＣを産生させた。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ベクターの発現を測定して、ベクターからの転写産物ＨＢβＡＳ３と、全ｂ−グロビン様転写産物（内因性ＨＢＢ及びＨＢβＡＳ３）の両方を特異的に定量した。健常なＣＢドナーから得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞とＣＤ３４＋細胞には、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターでトランスダクションし、コントロール試料には、モックトランスダクションした。２４時間後、２７日間、細胞を赤血球系細胞に分化させた。分化の最後（２７日目）に、赤血球膜糖タンパク質ＧｐＡに対する抗体と、ＤＮＡ標識蛍光色素ＤＲＡＱ５による二重染色によって、脱核ＲＢＣを同定した。脱核ＲＢＣは、ＧｐＡ＋／ＤＲＡＱ５−として定義した（図２２）。最終的な細胞数、分化マーカー及び脱核率は、２つの細胞集団間で同程度であり、脱核赤血球は、非分画ＣＤ３４＋細胞では５２．６％±１．０６％、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞では５２．７％±１．０８％の範囲であった（ｐ＝０．８７）。
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の赤血球子孫には、ＣＤ３４＋細胞の子孫よりも、高いＶＣＮが見られた。培養２週間において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞からの培養液の平均ＶＣＮは、３．０８±０．７１であったのに対して、ＣＤ３４＋細胞では、平均ＶＣＮは１．８４±０．４４であった（ｎ＝３、ｐ＝０．２６）（図１７、パネルＡ）。
ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶでトランスダクションして、赤血球分化培養アッセイの１４日目に回収した細胞を、ＨＢβＡＳ３ ｍＲＮＡの発現について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価し、内因性の成人ＨＢＢ ｍＲＮＡからの発現と比較した。発現レベルは、すべての培養液において同程度であり、ＨＢβＡＳ３ ｍＲＮＡレベルは、ＣＢ ＣＤ３４＋／３８−細胞の培養液由来の赤血球系細胞における全ＨＢＢ様ｍＲＮＡの５５．２％±１８．１％を占めていたのに対して、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞の培養液では、４５．４％±１６．７％であり（ｐ＝０．５９）（図１７、パネルＢ）、健常な骨髄ＣＤ３４＋細胞とＳＣＤ骨髄ＣＤ３４＋細胞でＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶを用いた過去の研究（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０）で報告されている量と同程度であった。
予備刺激及びトランスダクション後のＬＤＬレセプターの発現評価
ＣＤ３４＋細胞よりも、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションの有効性が高いことには、ＶＳＶ−Ｇ−シュードタイプベクターに対する、最近同定された細胞レセプター（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０： ７３０６−７３１１）のヒトＬＤＬレセプターの差が関与するか本発明者は評価した。フローサイトメトリーを用いて、ＡＰＣ抗ヒトＬＤＬレセプター抗体で染色した新鮮なＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞におけるＬＤＬレセプターの発現を解析してから、複数のサイトカインを含むトランスダクション培地で２４時間及び４８時間培養した後（２４時間後は、予備刺激の完了時、４８時間はトランスダクションの完了時と相関する）に、再び解析した。
新鮮なＣＤ３４＋細胞（７．９％）は、新鮮なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の４．８％よりも、ＬＤＬレセプターを発現した（図１８、パネルＡ、Ｄ）。２４時間時点には、ＣＤ３４＋細胞の約９１％は、ＬＤＬレセプターを発現していたのに対して、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は７４．６％であった（図１８、パネルＢ、図１８、パネルＥ）。４８時間には、ＬＤＬレセプターは、ＣＤ３４＋細胞の９９％、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の９０％で発現していた（図１８、パネルＣ、Ｆ）。ＬＤＬレセプターの幾何平均蛍光強度は、ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞で同程度であった（それぞれ、１．６×１０３〜３×１０３と１．５×１０３〜３．５×１０３）。新鮮なＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞では、ＬＤＬレセプターを発現した割合は同程度に低かったとともに、これらの細胞では、予備刺激とトランスダクションで用いる条件での培養によって、発現が同程度に誘導された。したがって、ＬＤＬレセプターの発現の差は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションが優れる根拠ではなかった。
ＲＤ１１４レトロウイルスエンベロープでシュードタイプ化したＬＶ
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションの向上が、ＶＳＶ−Ｇエンベロープに特に関連するのかを確かめるために、ＲＤ１１４レトロウイルスエンベロープ（Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：８２３−８３２、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３４：１２６９−１２７６）を用いて、代替的なシュードタイプを有するＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶのバッチを我々は作製した。ＲＤ１１４でシュードタイプ化したＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターでトランスダクションしてから、１４日間培養したＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の平均ＶＣＮ（０．８６±０．４６）は、同じ条件でトランスダクション及び解析したＣＤ３４＋細胞（０．００６±０．０５、ｎ＝３）よりも高かった（図１８、パネルＧ）。したがって、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の方が、トランスダクションが高いことは、ＶＳＶＧシュードタイプに特有ではない。
インビボでのＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の正着潜在力の評価
これまでの調査では、ＦＡＣＳによって単離したＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のトランスダクションを非分画ＣＤ３４＋細胞と比較した。以下の調査では、我々は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞（いずれも、同じ非分画ＣＤ３４＋集団から、ＦＡＣＳによって単離した）のトランスダクションと正着潜在力を比較した。異なる蛍光レポーター遺伝子を含むレンチウイルスベクター（ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥ ＬＶベクター、ＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥ ＬＶベクター及びＣＣＬｃ−ＵＢＣ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ−ＰＲＥ−ＦＢ−２ＸＵＳＥ ＬＶベクター）で、各集団をトランスダクションした。結果が、ベクターに影響されないようにするために、各細胞画分のトランスダクションに用いたベクターを調査ごとに変えた（ｎ＝３）。トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を適切な生理的比率（９９％のＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞と１％のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞または１００％のＣＤ３４＋細胞）で、ＮＳＧマウスに異種移植した。トランスダクション条件は、インビトロ解析で用いたものと同じにし、トランスダクションの２４時間後、すぐに細胞を移植した。（ａ）ＮＴ ＣＤ３４＋細胞（モック）、（ｂ）トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞（コントロール）または（ｃ）トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞とトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞との組み合わせ（試験細胞）（それぞれ、「フィラー」としての照射済み（１０，０００ｃＧｙ）ＣＤ３４−細胞と組み合わせた）からなる５×１０５個の総細胞量を各マウスに移植した（表５）。これらのマウスを移植の８０〜９０日後に安楽死させ、骨髄を回収して、フローサイトメトリーによって、ヒト細胞の正着を解析したとともに、正着細胞のＶＣＮを測定した。正着率は、全ＣＤ４５＋集団（マウスＣＤ４５＋とヒトＣＤ４５＋）のヒトＣＤ４５＋細胞の割合として定義した。続いて、ヒト正着マウス由来のＢＭをさらに、フローサイトメトリーによって、そのヒト正着細胞に存在する異なるトランスダクション細胞画分の割合について、使用した蛍光マーカーに基づき、ｄｄＰＣＲによって解析した。
３種類のインビボマウス移植を行い、それぞれ、６匹のマウスからなり、合わせて１８匹のマウスに移植した（５匹のモックマウス［ＮＴ ＣＤ３４＋細胞］、４匹のコントロールマウス［トランスダクションしたＣＤ３４＋細胞］、９匹の試験マウス［トランスダクションしたＣＤ３４＋／３８＋細胞とトランスダクションＣＤ３４＋／３８−細胞の混合物］）（表５）。トランスダクションした細胞の一部をインビトロで２週間成長させ、ＶＣＮについて評価した（表４）。ｄｄＰＣＲプライマー及びプローブは、各蛍光マーカー遺伝子を特異的に検出するように設計した（表３）。ＨＩＶ−１ Ｐｓｉ領域プライマーを用いて、インビトロ培養の２週間後に、トランスダクションした細胞の試料を解析して、すべてのベクターを測定したところ、トランスダクションで用いたベクター（ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ）にかかわりなく、ＣＤ３４＋／３８−細胞のＶＣＮ（６．８９±０．７５）は一貫して、非分画ＣＤ３４＋細胞（ＶＣＮ＝２．１９±０．４７）またはＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞（ＶＣＮ＝１．６６±０．３６）よりも高いことが示された（表４）。合わせて１８匹のマウスのうち１４匹で、ＢＭ回収時に、ヒトＣＤ４５＋細胞がうまく正着していた（図２３）。正着マウスのうち、マウス番号１、６及び７には、モックトランスダクションしたヒトＣＤ３４＋細胞のみを移植した。コントロールマウス番号８、９、１２には、１つのベクターによってトランスダクションしたＣＤ３４＋細胞を移植した。マウス番号２、３、４、５、１０、１１、１３及び１４には、異なるベクターでトランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞の試験混合物（１：９９の細胞比）を移植した。全体としては、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の方が、非分画ＣＤ３４＋細胞よりも、正着がうまくいく傾向が見られた（ｐ＝０．０６）。
８匹の正着試験細胞マウスにおいては、６匹のマウス（番号２、３、４、５、１１及び１４）でベクター標識ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞による正着が高く、１匹のマウス（番号１０）では、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の正着は同程度で、１匹のマウス（番号１３）では、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋の正着が高かった（図１９、パネルＡ、図２３）。全体としては、移植したバルクのＣＤ３４＋細胞または分画ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞による遺伝子マーキングレベルには差がなかった（表６）ので、トランスダクションしたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、非分画ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞よりも、正着作用が約１００倍強力であった。
１つのベクターでトランスダクションしたバルクのＣＤ３４＋細胞を移植した２匹のマウスのＶＣＮは、１２及び６であり、ＨＩＶ−１ Ｐｓｉ領域プライマーを用いたかまたは蛍光マーカー特異的プライマーによって測定した値と同程度の値であった。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の混合物を移植したマウスでは、２つのベクターによって、同程度の遺伝子マーキングレベルが見られ（それぞれ、３．６０±０．２６と２．１７±０．１５）、各マウスでは、２つの個々のベクターにおけるＶＣＮの合計は、Ｐｓｉ領域プライマーを用いて測定したＶＣＮの合計と同程度であった（図１９、パネルＢ）。
考察
幹細胞遺伝子療法は、ＳＣＤを含む多数の疾患において、臨床に向けて進展している。ＳＣＤに対する効果を発揮するには、十分なβＡＳ３−グロビンを発現して、疾患の病態生理を変化させるようにトランスダクションした十分な数のＨＳＣによって、トランスダクションは効率的になるはずである。臨床規模のＨＳＣへのトランスダクションは、困難なプロセスであり得、βＡＳ３−グロビン遺伝子など、送達及び挿入する大規模で複雑な遺伝子カセットにより、さらに難しくなる。ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣへのＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターによるトランスダクションは、実証されているが（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：３３１７−３３３０）、ウイルスベクターの次善的な非濃縮力価により、ＨＳＣを正着させて、ＳＣＤのＲＢＣ疾患の徴候を是正する遺伝子移入レベルを得るには、大量のウイルスベクターが必要とされる。これらの理由から、より少ないウイルスベクターを用いてトランスダクションして、同程度の遺伝子導入効率と有効な正着能を得ることができる代替的な細胞集団には、魅力がある。これまで、いくつかの研究で、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞にＬＶベクターでトランスダクションできることが示されている。これらのベクターは、ｃ−レトロウイルスとは異なり、活発に細胞分裂を行っているのではない細胞にトランスダクションできるからである（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：２９８８−２９９３、Ｇｅｒｏｎｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２１：４７２−４８０、Ｇｕｅｎｅｃｈｅａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：５６６−５７３）。しかしながら、臨床グレードの試薬がないことと、大規模なＧＭＰ細胞の選別が困難なことから、遺伝子療法向けに、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞にトランスダクションして正着させる能力は、探究されていない。
我々は、ヒトＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を用いる調査を行って、トランスダクションで、より少ないウイルスベクターを使用しながら、これらの細胞のＳＣＤへの遺伝子療法に対する潜在的適性を評価した。我々の調査では、ＣＢから単離したＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、レンチウイルスベクターによるトランスダクションを行いやすく、ＣＤ３４＋細胞と同程度またはそれよりも多い遺伝子移入を行うのに必要なウイルスベクターが大幅に少なくなることが示されている。重要なことに、コロニー形成前駆体のクローン解析により、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−集団を標的にすると、バルクのＣＤ３４＋標的（一定の割合にトランスダクションされるが、より多くのベクターコピーを用いる）と比べて、高い割合がトランスダクションされることが示された。理想上では、臨床に応用すれば、同様に、有効性の向上のために、より高い割合のトランスダクションＨＳＣが得られ、安全性の向上のために、トランスダクションした細胞当たりのＶＣＮが限定されるであろう。
興味深いことに、ＮＳＧマウスにおけるインビボ移植調査により、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、本質的に同等の正着寄与性を有する対応するＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞よりも、正着性が約１００倍超強力であったことが示された。我々は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞に由来する細胞を、その蛍光マーカーに基づき選り分けるには、正着ＮＳＧマウスの骨髄から十分なヒト細胞を得ることができなかったので、細胞当たりの絶対ＶＣＮを直接測定して、インビトロで見られたように、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の正着子孫において、ベクターコピー数の増加が見られるかは判断することができなかった。しかし、正着ＮＳＧマウスから得た全骨髄細胞によってｄｄＰＣＲを行って、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞またはＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞をマーキングするのに用いた特異的蛍光レポーター遺伝子を定量し、骨髄のヒト細胞含有量について標準化したところ、移植した１％のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞による造血への寄与性が、移植した９９％のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−による寄与性と同程度であることが示された。しかしながら、骨髄中のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞をマーキングするのに用いたベクターの平均ＶＣＮが向上していないことから、高いＶＣＮにより、トランスダクションしたＨＳＣに対する細胞毒性が生じ、正着への寄与性が低下することが示されている可能性がある。
全体として、これらの所見は、本明細書に示されているＳＣＤ遺伝子療法に関連する特定の利点に加えて、ＨＳＣを用いる遺伝子療法のいずれのアプローチにも応用し得る。異種移植調査での我々の観察に基づくと、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を遺伝子療法で用いると、標的細胞にトランスダクションするためのベクターの使用量を低下させることができるようになるが、それでも、十分な正着を実現し得る。これらの所見は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の良好な正着能を示している他の研究（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：２９８８−２９９３、Ｇｅｒｏｎｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２１：４７２−４８０、Ｇｕｅｎｅｃｈｅａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：５６６−５７３、Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：７１−８０）と整合している。
最近の文献には、レンチウイルスベクターをシュードタイプ化するのに最も広く用いられている水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に対する重大なレセプターとしてのＬＤＬレセプターが説明されている（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０：７３０６−７３１１）。ＬＤＬレセプターの発現がＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞において高いと、より多くのベクターが細胞に結合し、細胞に取り込まれ、最終的に、ゲノムに組み込まれ、より高いＶＣＮにつながる可能性が見られている。非分画ＣＤ３４＋細胞集団とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞集団において、ＬＤＬレセプターの発現を解析したところ、サイトカインによる刺激から４８時間後（トランスダクション時に当たる）に、静止状態でＬＤＬレセプターを発現している細胞が少なかったとともに、発現誘導は、比較的同程度であった。したがって、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化したベクターに対するレセプターの発現が高いことは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションを向上させる機構である可能性は低い。
ＲＤ−１１４レトロウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイプ化したＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶベクターで両方の細胞集団をトランスダクションしたところ、ＣＤ３４＋細胞よりも、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションの方が高かった。これらの結果により、異なるエンベロープタンパク質を用いても、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞へのトランスダクションのしやすさが向上するという観察結果が補強される（Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：８２３−８３２、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３４：１２６９−１２７６、Ｒａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：２１２９−２１３４）。
本明細書に記載されている実施例と実施形態は、例示目的に過ぎず、それらを踏まえた様々な修正形態または変形形態が当業者に提示されることになるとともに、それらを本願の趣旨及び範囲、ならびに、添付の特許請求の範囲に含めるべきことが分かる。本明細書で引用されているすべての文献、特許及び特許出願は、参照により、あらゆる目的で、その全体が本明細書に援用される。

Claims (70)

  1. ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターとマルチクローニングサイトを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、前記プロモーターからの転写方向が、前記ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうとともに、前記マルチクローニングサイトに挿入される核酸を転写するように、前記ＵＢＣプロモーターが、前記ベクターにおいて逆配向になっている前記ベクター。
  2. 導入遺伝子に機能可能に連結したヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含む組み換えレトロウイルスベクターであって、前記プロモーターからの前記導入遺伝子の転写方向が、前記ベクターの５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の方に向かうように、前記プロモーターと前記導入遺伝子が逆配向になっている前記ベクター。
  3. 前記プロモーターが、ヒトユビキチンＣ遺伝子ＵＣＳＣヒトゲノム配列バージョンｈｇ１９マイナス鎖の１２５３９８３１８位のあたりから１２５３９９５３０位のあたりまでの断片を含むか、またはその断片からなる、請求項１〜２のいずれか１項に記載のベクター。
  4. 前記プロモーター内のイントロンが、レトロウイルスのパッケージング中に失われない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
  5. 逆配向のポリアデニル化シグナルを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
  6. 前記ベクターの全配列に対しては前記プロモーターの５’である、前記プロモーターの３’側に、前記ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）が挿入されている、請求項５に記載のベクター。
  7. 前記ポリアデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナル、ヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリアデニル化シグナル及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナルからなる群から選択されている、請求項５〜６のいずれか１項に記載のベクター。
  8. 前記ポリアデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列またはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項５〜６のいずれか１項に記載のベクター。
  9. 逆配向ではないＵＢＣプロモーターを含む同じベクターと比べて、一過性にトランスフェクションした細胞株と、安定的にトランスダクションした細胞株における発現を少なくとも約２倍増大させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクター。
  10. 逆配向ではないＵＢＣプロモーターを含む同じベクターと比べて、トランスダクション済み初代細胞における発現を少なくとも約４倍増大させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクター。
  11. 前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクター、ＨＩＶ−２レンチウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルスベクター、ＭｏＭＬＶベクター、Ｘ−ＭＬＶベクター、Ｐ−ＭＬＶベクター、Ａ−ＭＬＶベクター、ＧＡＬＶベクター、ＨＥＶ−Ｗベクター、ＳＩＶ−１ベクター、ＦＩＶ−１ベクター及びＳＥＲＶ−１−５ベクターからなる群から選択されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
  12. 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記レンチウイルスベクターが、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載のベクター。
  15. 双方向性ベクターである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
  16. ３’ＬＴＲにインスレーターをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
  17. 前記インスレーターが、ニワトリβ−グロビン５’ＤｎａｓｅＩ高感受性部位４（５’ＨＳ４）の最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサーブロッキング成分を含むＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ−Ａ）（７７ｂｐのインスレーターエレメント）を含む、請求項１６に記載のベクター。
  18. ψ領域というベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
  19. Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のベクター。
  20. セントラルポリプリントラクトを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
  21. 翻訳後調節エレメントを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
  22. 前記転写後調節エレメントが、改変したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項２１に記載のベクター。
  23. 組み換えを通じて、野生型レンチウイルスを再構成できない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、前記ＵＢＣプロモーターに機能可能に連結した導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が、ＳＣＩＤ、鎌状赤血球症、リポソーム蓄積症、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、フェニールケトン尿、パーキンソン病及び血友病からなる群から選択した病態を治療するための遺伝子産物を発現する、請求項２〜２３のいずれか１項に記載のベクター。
  25. アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、ヤヌスキナーゼ−３（ＪＡＫ３）、Ａｒｔｅｍｉｓ遺伝子、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＦＴＲ、完全長または短縮型ジストロフィン、ＡＢＣＤ１遺伝子、ＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルチミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイントランスポーター、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸性β−グルコシダーゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−サルフェート、酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭ）、ＮＰＣ−１、α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニド、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−サルフェート、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼからなる群から選択した１つ以上の遺伝子産物を発現する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
  26. 前記導入遺伝子が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、請求項２４に記載のベクター。
  27. 前記導入遺伝子が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）遺伝子／ｃＤＮＡを発現する、請求項２４に記載のベクター。
  28. 前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、請求項２４に記載のベクター。
  29. 前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーの制御下でエキソンとイントロンを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、請求項２８に記載のベクター。
  30. 前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、請求項２９に記載のベクター。
  31. 請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターを含むウイルス粒子。
  32. 請求項２〜２３のいずれか１項に記載のベクターでトランスダクションした宿主細胞。
  33. 幹細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
  34. 骨髄に由来する幹細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。
  35. 胚または胚組織に由来しない幹細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。
  36. ２９３Ｔ細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
  37. ヒト造血前駆細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
  38. 前記ヒト造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
  39. 前記ヒト造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
  40. 下記の列Ａに示されている病態を治療するための組成物であって、製薬学的に許容可能な担体と、請求項２〜２３のいずれか１項に記載のベクターをトランスフェクションした幹細胞及び／または前駆細胞を含み、前記ベクターが、前記病態を治療するための、下記の列Ｂに示されている１つ以上の導入遺伝子を前記組成物。
  41. 前記組成物が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記組成物が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）を発現する、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記組成物が、鎌状赤血球症を治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーとの制御下で、エキソンとイントロンとを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記宿主細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 前記宿主細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、請求項４６に記載の組成物。
  48. 下記の列Ａに示されている病態の対象の治療方法であって、請求項２〜２３のいずれか１項に記載のベクターをトランスフェクションした前駆体または幹細胞を前記対象に導入することを含み、前記ベクターが、下記の列Ｂに示されているような、前記病態を治療するための１つ以上の導入遺伝子を含む前記方法。
  49. 前記方法が、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を発現する、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記方法が、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、ＩＬ−２レセプターγ（ＩＬ−２Ｒγ）を発現する、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記方法が、鎌状赤血球症を治療するためのものであり、前記導入遺伝子が、抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記抗鎌状化ヒトβ−グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子５’プロモーターとヒトβ−グロビン３’エンハンサーとの制御下で、エキソンとイントロンとを含む約２．３ｋｂの組み換えヒトβ−グロビン遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記β−グロビン遺伝子が、ＩＶＳ２から３７５ｂｐのＲｓａＩが欠失したβ−グロビンイントロン２と、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４を含む複合的なヒトβ−グロビン遺伝子座調節領域とを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記導入工程が、
    前記ベクターで、前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞にトランスダクションすることと、
    前記トランスダクション細胞またはその細胞に由来する細胞を前記対象に移植することであって、前記細胞またはその誘導体が、前記導入遺伝子を発現することと、
    を含む、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記細胞が、前駆細胞である、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記細胞が、幹細胞である、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記細胞が、骨髄に由来している、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項４８〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細胞が、前記対象に由来している、請求項４８〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 組み換えレンチウイルスによるトランスダクションを向上させる細胞集団であって、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞について濃縮されている前記細胞集団。
  62. 前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、血液または骨髄に由来する、請求項６１に記載の細胞集団。
  63. 前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞に、導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターがトランスフェクションされている、請求項６１〜６２のいずれか１項に記載の集団。
  64. 前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクター、ＨＩＶ−２レンチウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）レンチウイルスベクター、ＭｏＭＬＶベクター、Ｘ−ＭＬＶベクター、Ｐ−ＭＬＶベクター、Ａ−ＭＬＶベクター、ＧＡＬＶベクター、ＨＥＶ−Ｗベクター、ＳＩＶ−１ベクター、ＦＩＶ−１ベクター及びＳＥＲＶ−１−５ベクターからなる群から選択されているレトロウイルスベクターでトランスダクションされている、請求項６３に記載の細胞集団。
  65. 前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、レンチウイルスベクターでトランスダクションされている、請求項６３に記載の細胞集団。
  66. 前記ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、ＴＡＴ非依存性の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターでトランスダクションされている、請求項６５に記載の細胞集団。
  67. 前記導入遺伝子が、表１に列挙されている病態を治療するための導入遺伝子である、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の細胞集団。
  68. 前記導入遺伝子が、ＡＤＡ、ＩＬ−２γＲまたは抗鎌状化遺伝子をコードする、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の細胞集団。
  69. 前記細胞に、ＣＣＬ−βＡＳ３−ＦＢ ＬＶがトランスフェクションされている、請求項６３に記載の細胞集団。
  70. 幹細胞または前駆細胞のトランスダクションの向上方法であって、前記トランスダクションのために、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞について濃縮されている幹細胞集団または前駆細胞集団を用意することを含む前記方法。
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