JP2003517301A - 造血幹細胞のレンチウイルスベクター形質導入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明において、造血幹細胞の形質導入に関する組成物、ならびにこれらの組成物を作製するための方法、およびこれらの組成物を用いるための方法が開示される。本発明においてまた、造血幹細胞の精製した集団を形質導入し得るレンチウイルスベクターが開示される。本発明の組成物および方法は、鎌状赤血球およびサラセミアのような、血液障害に関連する疾患を処置するために用いられ得る。本発明の目的に従って、本明細書中に具体的におよび広範に記載されるように、本発明は、１つの局面において、ウイルスベクターを含む造血幹細胞の精製された集団に関し、ここで、造血幹細胞の集団は、正常な分布の血球型に分化し得、そして、ここで、ベクターは、類似した割合で全ての血球型に含まれる。造血幹細胞を形質導入する方法および疾患を処置する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （謝辞） 本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金１ Ｒ０１ ＨＬ５７６
１９−０２および１ Ｐ６０ ＨＬ５８４１８−０１を受け、政府の支持の元に
行なわれた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【０００２】 （関連出願に対する相互参照） 本出願は、１９９９年１０月１０日に提出され、現在棄却された、米国仮出願
番号６０／１６４，６２５の優先権を主張する。この出願は、本明細書中にその
全体が参考として援用される。

【０００３】 （発明の分野） 造血幹細胞の効率的な形質導入は、多数の血液疾患の遺伝的処置に必須である
。非循環性の静止幹細胞（Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ「Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｕ
ｎｉｔｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｕｎｉｔｓ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｎｉｔｓ ｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ，１
００：１５７−６８（２０００））は、レトロウイルスベクターを用いる形質導
入の効率が乏しい。なぜなら、有糸分裂間の核膜の崩壊が、宿主クロマチン中へ
の効率的なレトロウイルス組み込みに必要とされるためである（Ｖａｒｍｕｓ
ＨＥら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ」Ｃ
ｅｌｌ；１１：３０７−１９（１９７７））。

【０００４】 幹細胞の乏しい形質導入はまた、アンホトロピックレトロウイルスベクターに
ついてのレセプターの低レベルの発現と相関している（Ｏｒｌｉｃ Ｄら、「Ｔ
ｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｍＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｐｈｏｔ
ｒｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ａ
ｎｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ
ｌｏｗ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；９３：１１０９７−１０２（１９９６）
）。

【０００５】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、有糸分裂後の骨格筋細胞または肝
細胞を効率的に形質導入することが示されているが（Ｘｉａｏ Ｘ，Ｌｉ Ｊお
よびＳａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇ
ｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｉ
ｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ」Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７０：８０９８−１０８
（１９９６）；Ｓｎｙｄｅｒ ＲＯら、「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａ
ｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ」，
Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ；１６：２７０−６（１９９６）；Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪら、
「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」Ｎａｔ
Ｍｅｄ；３：３０６−１２（１９９７））、造血幹細胞の形質導入率は低い（
Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ Ｓら、「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒ
ｕｓ ｔｙｐｅ ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍ
ｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−
ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉ
ｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎ
ｅ ｉｎ ｖｉｖｏ」Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７１：３０９８−１０４（１９９７））
。さらに、我々は、宿主染色体への組み込み後、ウイルスによって形質導入され
た遺伝子が沈黙すること（Ｃｈｅｎ ＷＹら、「Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｓｉｌｅｎｃｅｄ，ｖｉｒａｌｌｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｓ
ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ
」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；９４：５７９８−８０３（
１９９７）、および沈黙の機構が、ヒストン脱アセチル化およびクロマチン凝縮
を含むこと（Ｃｈｅｎ ＷＹおよびＴｏｗｎｅｓ ＴＭ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｖｉｒａｌｌｙ ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅ
ｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ」
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；９７：３７７−８２（２００
０））を実証してきた。

【０００６】 多数のレトロウイルスと対照的に、レトロウイルスサブファミリーのレンチウ
イルスベクターは、静止有糸分裂後細胞を効率的に形質導入する（Ｎａｌｄｉｎ
ｉ Ｌら、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｔａｂ
ｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ
ｂｙ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ」Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７２：
２６３−７（１９９６）；Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｄ ｌｏｎｇ
−ｔｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎ
ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｅ
ｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ；９３：１１３８２−８（１９９６））。最近の研究において、Ｍｉｙｏｓ
ｈｉら（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａ
ｎ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ
ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｂｙ ＨＩＶ
ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ；２８３：６８２−６（１９９９））は、ヒ
トＣＤ３４＋細胞が、レンチウイルスベクターによって効率的に形質導入され、
そしてＧＦＰレポーター遺伝子の持続性の発現が、２２週間ＮＯＤ／ＳＣＩＤマ
ウスにおいて検出されることを実証した。しかし、これらの動物における造血は
異常である。これらのマウスの末梢血液中のヒト細胞は、主にＢリンパ球であっ
た（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２８３：６８２−６（１９９９）
）、従って、レンチウイルス形質導入後の正常な造血の維持を評価することは困
難である。

【０００７】 従って、それらの多能性を変更することなく造血幹細胞を形質導入するための
系が必要である。組成物および精製されたマウス骨髄幹細胞を形質導入するため
の方法が開示される。

【０００８】 組成物、ならびに造血幹細胞の形質導入後および致死的に照射されたレシピエ
ントマウスの再構成後に正常な造血を保存する方法が開示される。組成物、およ
び長期移植後および２次移植における形質導入された遺伝子の発現を促進する方
法がまた開示される。

【０００９】 （発明の要旨） 本発明の目的に従って、本明細書中に具体的におよび広範に記載されるように
、本発明は、１つの局面において、ウイルスベクターを含む造血幹細胞の精製さ
れた集団に関し、ここで、造血幹細胞の集団は、正常な分布の血球型に分化し得
、そして、ここで、ベクターは、類似した割合で全ての血球型に含まれる。

【００１０】 造血幹細胞を形質導入する方法および疾患を処置する方法もまた開示される。

【００１１】 本発明のさらなる利点は、以下の記載に部分的に開示され、そして、その記載
から部分的に明らかであるか、または、本発明の実施によって学習され得る。本
発明の利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘される要素および組み合わせの
手段によって理解および達成される。前述の一般的な記載および以下の詳細な説
明は、例示的および説明的のみの説明であり、特許請求の範囲のように、本発明
を制限するものではないことの両方が理解される。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、以下の本発明の実施形態の詳細な説明およびそこに含まれる実施例
、ならびに図面およびそれらの以下の説明を参考として、より容易に理解され得
る。

【００１３】 本化合物、組成物、論文、デバイスおよび／または方法が開示および記載され
る前に、本発明は、特定の合成方法、組換えバイオテクノロジーの特定の方法、
または特別の薬剤（これは、もちろん、特別に限定されない場合、変化し得る）
に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は
、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、そして限定を意図しないこ
とも理解されるべきである。

【００１４】 本明細書および添付される特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」
、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に示さない場合、複数の対象を
含む。従って、例えば、「薬学的キャリア」という参照は、２以上のこのような
キャリアの混合物などを含む。

【００１５】 範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで
として、本明細書中で表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形
態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、
近似として値が表される場合、先立つ「約」の使用によって、特定の値が別の実
施形態を形作ることが理解される。各範囲の終点は、他方の終点に関して両方と
も有意であり、そして他方の終点から独立していることがさらに理解される。

【００１６】 本明細書および前記の特許請求の範囲において、以下の意味を有するように規
定される多くの用語に対して参照がなされる。

【００１７】 「任意の」または「必要に応じて」は、後に記載される事象または状況が起こ
り得るか、または起こり得ないこと、ならびにこの記載がこの事象または状況が
起こる場合、およびこれが起こらない場合を含むことを意味する。

【００１８】 ウイルスベクターを含む造血幹細胞の精製された集団が開示され、ここで、こ
の造血幹細胞の集団は、正常な分布の末梢血型へと分化し得、そしてこのベクタ
ーが同様な百分率の全ての末梢血細胞型に含まれる。

【００１９】 造血幹細胞の精製された集団は、この集団の少なくとも２％の細胞が造血幹細
胞であることを意味する。造血幹細胞はまた、この集団の少なくとも３％、４％
、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、
１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％を含み得る。

【００２０】 正常な分布の血液細胞型は、末梢血または骨髄の血液細胞型の分布が、標準的
な血液学の教科書に公表されるＢリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、顆粒
球、赤血球系細胞などのおおよその分布であることを意味する。

【００２１】 ベクターは、全ての血液細胞型に同様の百分率で含まれ、これは、所定の細胞
に対してベクターを含む細胞の百分率と、異なる細胞型におけるベクターを含む
細胞の百分率とを比較した場合、最も高い百分率の最も低い百分率の割合が、任
意の２つの細胞型に対して約５倍より大きくないことを意味する。この割合はま
た、約４倍、約３倍および約２倍より大きいことはあり得ない。

【００２２】 ウイルスベクターを含む造血幹細胞の精製された集団もまた開示され、ここで
、この造血幹細胞の集団は、インビボで正常な分布の血液細胞型へ分化し得、そ
してこのベクターは、全ての細胞型で同様の百分率である。

【００２３】 （組成物） （ベクター） 本明細書中で使用する場合、ベクターは、全ての細胞の中で分解なしに目的の
遺伝子を細胞へ輸送し、そして送達された細胞においてこの遺伝子の発現を生ず
るプロモーターを含む薬剤である。ベクターは、ウイルスまたはレトロウイルス
のいずれかの由来であり得る。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベ
クター（ＳＩＶベクター、ＨＩＶベクターまたはこれらのベクターのハイブリッ
ド構築物（ＨＩＶ骨格を有するウイルスを含む）を含むが、これらに限定されな
い）である。これらのベクターはまた、第１、第２および第３世代レンチウイル
スを含む。第３世代レンチウイルスは、少なくとも３つの独立したプラスミドに
分割されるレンチウイルスパッケージング遺伝子を有する。好ましいものはまた
、ベクターとしての使用を適切にするこれらのウイルスの特性を共有する任意の
ウイルスファミリーである。レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクタ
ーの特殊型であり、感染について長いインキュベート期間を有することによって
典型的に特徴付けられる。

【００２４】 レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝ペイロード
（すなわち、外来遺伝子エレメント、例えば、導入遺伝子またはマーカー遺伝子
）を所持し得、そしてこの理由により、一般的に使用されるベクターである。ア
デノウイルスベクターは、相対的に安定および取り扱いやすく、高い力価を有し
、そしてエアロゾル処方において送達され得、そして時々未分化細胞をトランス
フェクトし得る。

【００２５】 開示されたベクターの１つの実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿
主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型
のベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を典型的に所持する
。

【００２６】 いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造
後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、逆方向末端反復、複製および被
包に必要なもの、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモー
ターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは、典型的に１つ以上の
初期遺伝子を除去され、そして遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットは、
ウイルスゲノム中へ除去されたウイルス核酸の位置で挿入される。この型の構築
物は、約８ｋｂまでの外来遺伝子物質を所持し得る。除去された初期遺伝子の必
要な機能は、イントランス（ｉｎ ｔｒａｎｓ）で初期遺伝子の遺伝子産物を発
現するように操作された細胞株によって典型的に供給される。

【００２７】 （アデノウイルスベクター） 複製欠失アデノウイルスの構築は、記載されている（ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−
Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄ
ａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９（１９８
７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏ
ｓｐｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２（１９９
３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の恩恵は、ウイルスが、他の
細胞型に広がり得る範囲に限定されることである。これは、ウイルスが、初期の
感染細胞内で複製し得るが、新しい感染ウイルス粒子を形成し得ないからである
。組み換えアデノウイルスは、インビボでの気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮ
Ｓ実質および多くの他の組織部位への直接送達後、高い有効性遺伝子送達を達成
することが示されている（Ｍｏｒｓｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１
５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ
，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ
Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅ
ｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１
９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４
７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５
−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０ （１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｃｅｌｌ ７
５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ、Ｊ
．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７（１９９３））。組み換え
アデノウイルスは、このウイルスが、野生型または複製欠失アデノウイルスと同
じ様式で、レセプター媒介エンドサイトーシスによって内在化された後、特異的
細胞表面レセプターへの結合によって遺伝子形質導入を達成する（Ｃｈａｒｄｏ
ｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７ （１９
７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２
：３８６−３９６ （１９７３）； ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９ （１９８５）；Ｓｅｔｈら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５１：６５０−６５５ （１９８４）； Ｓｅｔｈら、 Ｍ
ｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：１５２８−１５３３（１９８４）； Ｖ
ａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０ （１９９１）
； Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９ （１９９３））。

【００２８】 ウイルスベクターの１つの型は、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基
づくものであり、そしてこれらのビリオンは、細胞株（例えば、ヒト２９３細胞
株）において生成される。別の実施形態において、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方
が、アデノウイルスゲノムから除去される。

【００２９】 ウイルスベクターの別の型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この
欠失パルボウイルスは、多くの細胞型（未分化細胞を含む）を感染し得、そして
ヒトに対して非病原性である。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送し得、
そして野生型ＡＡＶは、安定に第１９染色体に挿入することが公知である。ベク
ターは、この部位特異的形成特性を含み得る。この型のベクターの１つの実施形
態は、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって生成されるＰ
４．１Ｃベクターである。このベクターは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タン
パク質、ＧＦＰをコードする遺伝子）を含み得る。

【００３０】 （レトロウイルスベクター） レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリー（任意の
型、サブファミリー、属、または親和性を含む）に属する動物ウイルスである。
一般的に、レトロウイルスベクターは、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉ
ｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒに記載される。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ２２９−２３２， Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ， （１９８５）において、これは本明細書中に参考として援用される
。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許
第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ
９０／０２８０６号および同ＷＯ ８９／０７１３６号；ならびにＭｕｌｌｉ
ｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載され
る；これらの教示は本明細書中に参考として援用される。

【００３１】 レトロウイルスは、本質的には、核酸カーゴ（ｃａｒｇｏ）を充填したパッケ
ージである。この核酸カーゴは、代表的には、一緒にパッケージングシグナルを
輸送し、このパッケージングシグナルは複製された娘分子が効率的にパッケージ
コート内に充填されることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製お
よび複製されたウイルスのパッケージングのためにシス（ｃｉｓ）である必要が
ある多くの分子が存在する。代表的には、レトロウイルスゲノムはｇａｇ、ｐｏ
ｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含み、これらはタンパク質コートの作製に関与する。
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、標的細胞に移行される外来ＤＮＡによ
って代表的に置換される。レトロウイルスベクターは、代表的には、パッケージ
コートに組み込むためのパッケージングシグナル（Ｐｓｉ）、ｇａｇ転写ユニッ
トの開始のシグナル伝達をする配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲ
ＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位を含む）、ＤＮＡ合成の間
にＲＮＡ鎖の切り替えをガイドする末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２鎖の合成の
ためのプライミング部位として貢献するプリンリッチな配列５’から３’ＬＴＲ
、および宿主ゲノムへの挿入のためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能
にするＬＴＲの末端付近の特定の配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺
伝子の除去は、ウイルスゲノムに挿入される約８ｋｂまでの外来配列（外来遺伝
子エレメント）が、逆転写となり、そして複製の際に新しいレトロウイルス粒子
内への充填を可能にする。この量の核酸は、各転写物のサイズに依存して１〜多
数の遺伝子の送達に十分である。ポジティブまたはネガティブな選択マーカーは
、他の遺伝子と共に外来遺伝子エレメント中に含まれ得る。このベクターは、構
造エレメントおよび複製エレメントのいずれか１つ以上を含み得る。代表的に、
外来遺伝子を含むベクターは、ｇａｇ配列またはこのｇａｇ配列の改変体を含む
。

【００３２】 好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースのレトロウイルス
ベクターである。レンチウイルスベクターは、ウイルスのレンチウイルスファミ
リー由来のウイルスの核酸骨格に基づく。例は、ＳＩＶおよびＨＩＶである。例
えば、レンチウイルスベクターは、好ましくは、レンチウイルス（例えば、ＳＩ
ＶおよびＨＩＶ）の５’および３’ＬＴＲ領域を含む。好ましいＬＴＲ領域は、
ＳＩＶおよびＨＩＶ由来である。レンチウイルスベクターはまた、好ましくは、
レンチウイルス（例えば、ＳＩＶおよびＨＩＶ）のＲｅｖ応答性エレメント（Ｒ
ＲＥ）を含む。好ましいＲＲＥは、ＨＩＶのＲＲＥである。

【００３３】 （外来遺伝子エレメント） 開示されるベクターは、好ましくはこのベクターで移行される細胞中で発現さ
れる外来遺伝子エレメントを保有するように設計される。この外来遺伝子エレメ
ントは、約８ｋｂ以下のサイズ要求を満たし得る限り、任意の目的の遺伝子であ
り得る。外来遺伝子エレメントの１つの型は、マーカー遺伝子であり得る。

【００３４】 このマーカー遺伝子は産物を作製し、そしてこの産物は、この遺伝子が細胞に
送達され、そして一度送達されたものが発現されたか否かを決定するために使用
される。マーカー遺伝子はＥ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子であり得、これはβ−
ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする。

【００３５】 いくつかの実施形態において、このマーカーは、選択マーカーであり得る。哺
乳動物細胞についての適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（
ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８
、ハイドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびプロマイシンである。こ
のような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移行される場合、形質転換
される哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に配置される場合は生存し得る。広く使用
される選択的レジメンの、２種類の異なるカテゴリーが存在する。最初のカテゴ
リーは、細胞の代謝および補充された培地に関係なく増殖する能力を欠く変異体
細胞株の使用に基づく。２つの例は、以下である：ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞および
マウスＬＴＫ細胞。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄
養素の添加なしで、増殖する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合
成経路に必要な特定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充される培地にお
いて不足したヌクレオチドが提供されない限り、生存し得ない。培地の補充につ
いての代替は、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠
いた細胞へ導入することであり、従ってその増殖要求を変化する。ＤＨＦＲまた
はＴＫ遺伝子で形質転換されない個体の細胞は、非補充培地においては生存し得
ない。

【００３６】 第２のカテゴリーは、任意の細胞型において使用される選択スキームを参照す
る優性選択であり、そしてこれは変異体細胞株の使用を必要としない。これらの
スキームは、代表的には宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を使用する。新規
の遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、そし
て選択で生存する。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．
１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．お
よびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハ
イグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４
１０−４１３（１９８５））を使用する。この３つの例は、真核生物制御下で細
菌遺伝子を利用し、適切な薬物Ｇ４１８またはそれぞれネオマイシン（ゲネティ
シン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロ
マイシンに対する耐性を与える。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８および
プロマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が挙げられる。

【００３７】 この外来遺伝子エレメントはまた、標的細胞におけるネイティブな遺伝子を置
換するかまたは補充する遺伝子を含み得る。この型の外来遺伝子エレメントの例
は、β−グロビン遺伝子である。図３は、ヒトβ−グロビン外来遺伝子エレメン
トを含むレンチウイルス構築物を示す。β−グロビン遺伝子に直接連結したＬＣ
Ｒ ＨＳ２エレメントを含むこの構築物は、Ｒｙａｎら（Ｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，
Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｔｏｗｎｅｓ，Ｔ．
Ｍ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．およびＢｒｉｎｓｔｅｒ，「Ａ Ｓｉｎｇｌ
ｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮａｓｅ Ｉ Ｓｕｐｅｒ−ｈ
ｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｈｉｇｈ Ｌｅ
ｖｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ」，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：３１４−３２３（１９８９））によって記載されるよう
に作製され得る。（Ｃａｔｅｒｉｎａ，Ｊ．Ｊ．，Ｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｐａｗ
ｌｉｋ，Ｋ．Ｍ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．
，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＴｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．（１９９１）Ｈ
ｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ Ｌｏｃｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ（Ｌ
ＣＲ）：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ＨＳ ２ Ｓｉｔｅ ｉｎ Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８
８：１６２６−１６３０もまた参照のこと。） この型の外来遺伝子エレメント
の別の例は、αグロビン遺伝子である。βグロビン遺伝子に直接連結するＬＣＲ
ＨＳ２エレメントを含むこの構築物は、上記の論文に記載されるように作製さ
れ得る。別の外来遺伝子エレメントは、抗鎌状赤血球化遺伝子ある。この構築物
は、ＭｃＣｕｎｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈｏｍｏ，Ｍ．Ｊ．
，Ａｓａｋｕｒａ，Ｔ．およびＴｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．（１９９４）Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｆｏ
ｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，９８５２−９８５６に記
載されるように作製され得る。別の型の外来遺伝子エレメントは、成熟ＥＫＬＦ
であり、これはＤｏｎｚｅ，Ｄ．，Ｊｅａｎｃａｋｅ，Ｐ．Ｈ．およびＴｏｗｎ
ｅｓ，Ｔ．Ｍ．（１９９６）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｔａ−ｇｌｏ
ｂｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ Ｋｒｕ
ｐｐｌｅ Ｌｉｋｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＫＬＦ）：Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒａｔｅｇ
ｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ，Ｂｌｏｏｄ ８８：４０５１−４０５７に記載されるように作製さ
れ得る。

【００３８】 （ウイルスプロモーターおよびエンハンサー） 哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御するプロモーターは、種
々の供給源、例えば、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０（ＳＶ４０）、アデノウイ
ルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウ
イルスのようなウイルスのゲノム、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、
βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期およ
び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラ
グメントとして、簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１
３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．
Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０（１９８２））。当然、宿主細胞また
は関連する種由来のプロモーターがまた、本明細書中において有用である。

【００３９】 エンハンサーは、一般に転写開始部位から固定されていない距離で機能し、そ
して転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ
．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであ
り得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒ
ｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））ならびにコード配列
自身内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９
３（１９８４））であり得る。これらは通常、１０ｂｐと３００ｂｐとの間の長
さであり、そしてこれらはシスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモータ
ーからの転写を増加するために機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写
調節を媒介する応答エレメントを含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介す
る応答エレメントを含み得る。エンハンサーはしばしば、遺伝子発現の調節を決
定する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプ
ロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在公知であるが
、代表的に、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては
、複製起点の後部側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメ
ガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後部側のポリオーマエ
ンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。

【００４０】 プロモーターおよび／またはエンハンサーは、光またはその機能を誘発する特
定の化学事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイク
リンおよびデキサメタゾンのような試薬によって調製され得る。照射（例えば、
γ照射）、またはアルキル化化学療法剤に曝露することによってウイルスベクタ
ー遺伝子の発現を増強するための方法がまた、存在する。

【００４１】 プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位領域の
発現を最大化するための、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとし
て作用し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターおよび／またはエン
ハンサー領域は、全ての真核生物細胞型で活性化され得る。この型のプロモータ
ーは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他のプロモーターは、ＳＶ４
０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウ
イルスベクターＬＴＦである。

【００４２】 特定の調節エレメントがクローン化され、そして特定の細胞型（例えば、造血
細胞）で選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用され得ることが
示された。例えば、αグロビン遺伝子およびβグロビン遺伝子のＬＣＲは、αグ
ロビン遺伝子およびβグロビン遺伝子の発現を赤血球のみで特異的にアップレギ
ュレートする。Ｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｔｏｗｎ
ｅｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．およびＢｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ
．（１９８９）「Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｂ−Ｇｌｏｂｉｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３７−
４１。従って、αグロビンまたはβグロビンのいずれかのＬＣＲによって制御さ
れる外因性遺伝子エレメントは、代表的に、赤血球でのみ発現される。

【００４３】 （転写後調節エレメント） 開示されたベクターはまた、転写後調節エレメントを含み得る。転写後調節エ
レメントは、ｍＲＮＡ安定性を増強し得るかまたは転写ｍＲＮＡの翻訳を増強し
得る。開示されたベクター内で良好にはたらく転写後調節エレメントは、ウッド
チャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ
）から単離されたＷＰＲＥ配列である。（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒら、「Ｗｏｏｄ
ｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ
ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７３：２８８６−
９２（１９９９））。転写後調節エレメントは、外因性遺伝子に対して３’およ
び５’の両方に位置し得るが、転写後調節エレメントは、外因性遺伝子に対して
３’に位置し得ることが好ましい。

【００４４】 （形質導入効率化エレメント） 形質導入効率化エレメントは、ベクターのパッケージングおよび形質導入を増
強する配列である。これらのエレメントは、代表的に、ポリプリン配列を含む。
開示されたベクター内で良好にはたらく１つの形質導入効率化エレメントは、ｐ
ｐｔ−ｃｔｓ配列であり、これは、ＨＩＶ−１ ｐＳＧ３分子クローン由来の中
央ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）
（ｐｐｔ）および中央末端部位（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｔｅ
）（ｃｔｓ）を含む（配列番号１、ＨＩＶ−１ ｐＳＧ３クローンのｂｐ４３２
７〜４４８３）。

【００４５】 （３’非翻訳領域） 真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒ
ト細胞または有核細胞）中で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影
響を及し得る転写の終結に必要な配列を含み得る。これらの３’非翻訳領域は、
外因性遺伝子をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化セグメ
ントとして転写される。この３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。この
転写単位はまた、ポリアデニル化領域を含み得る。この領域の１つの利点は、転
写単位がｍＲＮＡのようにプロセスされ輸送される可能性をこの領域が増加させ
ることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は
、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物
中で使用され得る。転写単位の実施形態において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ
４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、そして約４００塩基からなる。
転写単位は、他の標準的な配列を単独で含んでも、この構築物からの発現または
この構築物の安定性を改善する上記配列と組合わせて含んでもよい。

【００４６】 開示された造血幹細胞の集団は、外因性遺伝子エレメントを含むベクターを含
み得る。さらに、開示されたベクターは、レンチウイルスベクターであり得、そ
してこのレンチウイルスベクターは、外因性遺伝子エレメントを含み得る。外因
性遺伝子エレメントとして改変された結合特異性を有する抗鎌状赤血球化タンパ
ク質およびＥＫＬＦタンパク質をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクタ
ーがまた、開示される。

【００４７】 開示されたウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、例えば、ＨＩ
Ｖ−１ ｐＳＧ３分子クローンから誘導されるｐｐｔ−ｃｔｓ配列などの形質導
入効率化エレメントを含み得る。

【００４８】 開示されたウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、例えば、ウッ
ドチャック肝炎ウイルスから単離されたＷＰＲＥ領域などの転写後調節エレメン
トを含み得、このＷＰＲＥ領域は、外因性遺伝子エレメントから下流であり得る
。

【００４９】 （パッケージングベクター） 上記で考察したように、レトロウイルスベクターは、多数の異なる配列エレメ
ントを含むレトロウイルスに基づく。このエレメントは、ウイルスの組み込み、
組み込まれたウイルスの複製、組み込まれていないウイルスの複製、細胞進入、
および感染粒子へのウイルスのパッケージングのような多様なものを制御する。
理論的には、このベクターは、その必要なエレメントの全ておよび内因性遺伝子
エレメント（内因性遺伝子エレメントが十分小さい場合）を含み得、代表的には
多くの必須のエレメントが除かれている。全てのパッケージング成分および複製
成分が代表的なレトロウイルス（レンチウイルスを含む）からは取り除かれてい
るので、このベクター（被験体に用いられるベクター）は、パッケージングベク
ターおよびパッケージング細胞株の使用を通じて初回感染性粒子にパッケージン
グされる必要がある。代表的には、レトロウイルスベクターは、レトロウイルス
の無数の機能が少なくとも２つのベクター（パッケージングベクターおよび送達
ベクター）に分割されるように操作されている。次いで、このタイプのシステム
は、感染性粒子が産生され得る前に小細胞に全てのエレメントを提供する全ての
ベクターの存在を必要とする。このパッケージングベクターは、代表的には、レ
トロウイルスから誘導された構造遺伝子および複製遺伝子を運搬しており、そし
てこの送達ベクターは、標的細胞中で好ましくは発現される外因性遺伝子エレメ
ントを運搬するベクターである（図４）。これらのタイプのシステムは、複数の
ベクターへパッケージングベクターのパッケージング機能を分割し得る（例えば
、三世代レンチウイルスシステム）。Ｄｕｌｌ Ｔら「Ａ Ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎ
ｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２
（１１）：８４６３〜７１（１９９８）。

【００５０】 レトロウイルスは、代表的には、エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）を含む。
このＥｎｖタンパク質は、核酸という荷物を囲むタンパク質の本質である。さら
に細胞性感染の特異性は、代表的なレトロウイルスに関連する特定のＥｎｖタン
パク質に基づく。代表的なパッケージングベクター／送達ベクターシステムでは
、Ｅｎｖタンパク質は、例えば、プロテアーゼ（ｐｒｏ）またはインテグラーゼ
（ｉｎ）タンパク質とは別のベクターから発現される（図４を参照のこと）。

【００５１】 （パッケージング細胞株） このベクターは、それをパッケージング細胞株に入れることによって、代表的
には生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージングの機構を
含むレトロウイルスを用いてトランスフェクトまたは形質転換されているが、パ
ッケージングシグナルは欠いている、細胞株である。選り抜きのＤＮＡを運搬す
るベクターをこれらの細胞株にトランスフェクトすれば、目的の遺伝子を含有す
るベクターが複製され、ヘルパー細胞によってシス（ｃｉｓ）で提供された機構
によって、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。この機構のため
のゲノムは、パッケージングされていない。なぜなら、そのようなゲノムは必須
のシグナルを欠くからである。パッケージング細胞株のタイプの１つは２９３細
胞である。

【００５２】 （造血細胞株） 哺乳動物の血液系は、多くの高度に分化した細胞の非常に複雑な混合物である
。哺乳動物の血液を作成する複数の異なる細胞型は、全て、単一のタイプの細胞
（造血幹細胞）から派生する。造血幹細胞は、血液をつくる全ての細胞型を生じ
得る。造血幹細胞は、３つの主なタイプの系列に分化する。これには以下が挙げ
られる：リンパ、骨髄、および赤血球。Ｂ細胞およびＴ細胞は、リンパ系列から
派生するが、骨髄系列は、例えば、単球、顆粒球、巨核球、好中球、および他の
細胞を生じる。赤血球系列は、赤血球を生じる。

【００５３】 造血細胞の存在からアッセイされ得る器官は多数存在する。例えば、造血細胞
は、抹消血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）、脾臓および胸腺に見出されるはずである。

【００５４】 所定の血液細胞（血球）を特徴付けるための通常の方法は、抗体認識によるも
のである。異なる表面マーカーが、細胞の分化のレベルおよび分化のタイプに依
存して、各細胞上に存在する。

【００５５】 ヒト造血細胞において、ＣＤ３４マーカーが、造血幹細胞に存在することが公
知である。しかし、このマーカーはまた、造血幹細胞よりも分化している多数の
他の細胞（Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）および骨髄細胞（ＣＤ３３＋細胞）を含む
）にも存在し、これは、８０〜９０％のＣＤ３４＋集団からなる。

【００５６】 造血細胞に存在する他のマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ８，ＣＤ１０、ＣＤ１５、
ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３３であり、そしてこれらのマーカーの全てが全
てのＣＤ３４＋細胞の＞９０％でアッセイされる。

【００５７】 Ｂ細胞は、マーカーのなかでもとりわけＣＤ１０／１９／２０マーカーを含む
が、Ｔ細胞は、とりわけＣＤ３／４／８マーカーを含む。同様に、ＣＤ１４／１
５／３３細胞マーカーが、骨髄細胞で見出され得る。ヒトＴ細胞は、Ｔｈｙ−１
マーカーを欠く。従って、本明細書において参考として援用される米国特許第５
，７１６，８２７号に従って、ヒト幹細胞は、ほとんどの部分、ＣＤ３４⁺、Ｃ
Ｄ３^-、ＣＤ７^-、ＣＤ８^-、ＣＤ１０^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１５^-、ＣＤ１９^-、Ｃ
Ｄ２０^-、ＣＤ３３^-、およびＴｈｙ−１⁺、について存在することにより特徴付
けられる。選択のためのこれらのマーカーが多いほど、精製される造血細胞集団
が多くなる。関連の米国特許第号（これも参考として本明細書に援用される）は
、米国特許第５，０６１，６２０号である。

【００５８】 用いられ得るマウスマーカーは、Ｓｃａ１、ｃ−Ｋｉｔ、Ｂ−２２０、ＣＤ３
、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１およびＴｅｒ−１１９であり
、これらはＣｈｅｎ，Ｗ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ，Ｌａ
ｉ，Ｌ，Ｃｉａｖａｔｔａ，Ｄ．，Ｋａｐｐｅｓ，Ｊ．およびＴｏｗｎｅｓ，Ｔ
（２０００）致死的に照射したマウスの長期再構成を媒介するマウス造血幹細胞
のレンチウイルス導入（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａ
ｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｅ）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌｓ １８：３５２〜３５９に記載されている。

【００５９】 当業者は分化した細胞から造血幹細胞を分別するマーカーが他にも存在するこ
とおよびそれらが本明細書に記載されているように取り込まれてかつ用いられて
いることを理解する。

【００６０】 幹細胞の造血集団を特徴付ける方法の１つは、造血幹細胞がＣＤ３４＋（ヒト
）またはＳｃａ１およびｃ−Ｋｉｔ（マウス）のようなタンパク質を発現し、そ
してＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、グリコホリン（
ヒト）またはＢ２２０、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｍａ
ｃ１およびＧＲ１（マウス）のような前駆体または前駆系列特異的なタンパク質
を発現しないということである。この細胞はまた、特定の色素（例えば、Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ３３３４２）を流出する細胞として、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２
のような色素で染色した細胞の蛍光発光パターンによって規定され得る。これら
の特徴を有する造血幹細胞は、骨髄、抹消血、または臍帯血から得られ得る。こ
の細胞はまた、筋、神経細胞、胚性幹細胞、および胚性性腺細胞を含む他の細胞
型に由来し得る。

【００６１】 異なる哺乳動物は、その同系の造血細胞を分別する異なるマーカーを有する。
例えば、マウス造血幹細胞は、Ｓｃａ１、ｃ−Ｋｉｔについて選択することによ
り、およびＢ−２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｍａｃ−１、Ｇｒ−
１およびＴｅｒ−１１９に対して精製され得る。

【００６２】 （鎌状赤血球（ｓｉｃｋｌｅ）マウス） 開示されたベクターおよび造血細胞を、特定の遺伝的バックグラウンドにおい
て使用し得る。１つのこのようなバックグラウンドが、鎌状赤血球症についての
マウスモデルである。鎌状赤血球症についての好ましいマウスモデルを作製する
ための組成物および方法は、Ｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｉａｖａｔｔａ，Ｄ．およ
びＴｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．（１９９７）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ／Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓｅ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：８７３−８７６（これは、本明細書中で参考として
援用される）に記載されている。

【００６３】 本明細書中に開示された造血幹細胞の集団を用いて改変および再構築された、
生物体（特に、哺乳動物（ヒト以外））が、本発明の範囲内であることが理解さ
れる。例えば、トランスフェクトされた造血幹細胞を有するマウスは、本発明の
範囲内であるとみなされる。

【００６４】 （組成物を作製する方法） （ベクターの作製） 開示されたウイルスベクターは、標準的な組換え分子生物学的技術を使用して
作製され得る。これらの技術の多くが、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓら
，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
最新版）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に例示されている。

【００６５】 特定の場合では、組換え生物工学を通して改変された、外因性の遺伝子エレメ
ント自体を構築する。例えば、抗鎌状赤血球化遺伝子は、鎌状ヘモグロビンの重
合を完全に阻害する改変ヘモグロビン遺伝子である。本発明の組成物において外
因性の遺伝子エレメントとして使用される好ましい抗鎌状赤血球化遺伝子は、Ｍ
ｃＣｕｎｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈｏｍｏ，Ｍ．Ｊ．，Ａｓ
ａｋｕｒａ，Ｔ．およびＴｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．（１９９４）Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｆｏｒ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，９８５２（これは、特に、本明
細書中で参考として援用される）において、これらの好ましい抗鎌状赤血球化遺
伝子を作製および使用する方法と共に開示および記載されている。

【００６６】 改変ＥＫＬＦ遺伝子は、鎌状ヘモグロビンの連鎖状化を排除する改変ＥＫＬＦ
遺伝子である。本発明の組成物において外因性の遺伝子エレメントとして使用さ
れる好ましい改変ＥＫＬＦ遺伝子は、これらの好ましい改変ＥＫＬＦ遺伝子を作
製および使用する方法と共に開示および記載されている。これは、特に、本明細
書中で参考として援用される。

【００６７】 パッケージングされたレトロウイルスおよびレンチウイルスのパッケージング
系を作製する方法は、周知である。

【００６８】 造血幹細胞を形質導入する前に、造血幹細胞を高度に精製することが好ましい
。造血幹細胞は、例えば、造血幹細胞上に存在するタンパク質を認識する抗体で
、ドナーの骨髄から収集された細胞を標識することによって精製され得る。次い
で、これらの標識された抗体−細胞結合体を、直接的にこの抗体を認識するカラ
ムか、またはこの抗体に付着した結合体（例えば、ビオチンまたはストレプトア
ビジン）を認識するカラムにおいて予備精製し得る。この型の手順では、カラム
からの貫流物は廃棄（または、回収率を最大化するために再精製）され得、そし
て抗体−造血幹細胞結合体を含む溶出物を収集する。次いで、この溶出物を、分
化した造血細胞に特異的な種々の蛍光標識化抗体（例えば、Ｂ細胞についてＣＤ
１９に対する抗体）と共にインキュベートし得る。インキュベーション後、イン
キュベーション混合物を作製し、そしてこのインキュベーション混合物を、ＦＡ
ＣＳによって分類し得る。ここでは、造血幹細胞を認識する抗体を有する細胞を
収集するが、非造血幹細胞の抗体で標識された細胞は破棄する。この型の精製プ
ロトコールは、マウス造血幹細胞について実施例１に記載されているが、例えば
、ヒト造血幹細胞の精製においても容易に利用可能である。

【００６９】 形質導入された少なくとも１つの造血幹細胞を産生するウイルスベクターを用
いて、精製された造血幹細胞集団を形質導入する方法が開示され、この方法は、
造血幹細胞に、その多能性を改変させない長さの時間にわたって、ベクターおよ
び精製された造血幹細胞集団をインキュベートする工程を包含する。

【００７０】 造血幹細胞に、それらの多能性を改変させない長さの時間は、代表的に、短期
間のインキュベーション時間である。例えば、この時間の長さは、好ましくは、
４時間以下である。適切な条件下（例えば、感染多重度を変化させる）では、最
適な時間の長さは変化し得ることが理解される。

【００７１】 例えば、１つの実施形態では、造血幹細胞の集団を、幹細胞の多能性を改変さ
せない期間にわたってウイルスベクターと共にインキュベートし、そして造血幹
細胞に、その多能性を改変させることなく形質導入を達成するために、十分な数
のベクターを用いてインキュベーションを実施する。

【００７２】 また、形質導入された少なくとも１つの造血幹細胞を産生するウイルスベクタ
ーを用いて、精製された造血幹細胞集団を形質導入する方法が開示され、この方
法は、造血幹細胞に、その多能性を改変させることなく形質導入を達成するため
に、十分な数のベクターを用いて、ベクターおよび精製された造血幹細胞集団を
インキュベートする工程を包含する。

【００７３】 ベクター数が、造血幹細胞に、その多能性を改変させることなく形質導入を達
成するために十分であるか否かを判断するための１つの方法は、形質導入される
べき細胞（例えば、精製された造血幹細胞集団）の数に対してウイルスベクター
数を比較することである。これは、感染多重度（ＭＯＩ）と呼ばれる。例えば、
形質導入されるべき各細胞に対して３つのウイルスベクターが存在する場合、こ
れは、３のＭＯＩである。代表的に、細胞に対するベクターの量（すなわち、Ｍ
ＯＩ）は、精製された細胞集団における細胞と同程度多くのベクターの約５０倍
以上であるべきである。他の例は、３００または１０００のＭＯＩである。開示
された方法の１つの実施形態は、造血幹細胞に、その多能性を改変させることな
く形質導入を達成するために、十分な数のベクターを用いて、ベクターおよび精
製された造血幹細胞集団をインキュベートする工程、ならびに造血幹細胞に、そ
の多能性を改変させない長さの時間にわたって、ベクターおよび精製された造血
幹細胞集団をインキュベートする工程を包含する。

【００７４】 （組成物を使用する方法） 開示された組成物を使用して、血液障害を模倣するマウスモデルを試験および
確証し得る。

【００７５】 開示された組成物を使用して、血液障害を処置し得る。

【００７６】 第１の被験体において鎌状赤血球症を処置する方法が開示され、この方法は、
鎌状赤血球症を処置し得る外因性の遺伝子エレメントを含むウイルスベクターと
、この第１の被験体の骨髄から精製された造血幹細胞集団をインキュベートする
工程、インキュベーション混合物を形成する工程、ならびにこの第１の被験体へ
の導入のためにこのインキュベーション混合物由来の細胞のサブセットを供給す
る工程を包含し、ここでこの第１の被験体または第２の被験体は、減少した造血
細胞計数を有する。第１の被験体のインキュベーション混合物はまた、対宿主性
移植片病の問題が、例えば、免疫抑制によって克服され得ると仮定して、鎌状赤
血球症を有する第２の被験体に導入され得る。

【００７７】 鎌状細胞疾患を処置する方法もまた開示され、ここで、外因性エレメントは、
変化した結合特異性を有する抗鎌状赤血球化遺伝子および／またはＥＫＬＦタン
パク質である。

【００７８】 鎌状細胞疾患を処置する方法もまた開示され、ここで、ウイルスベクターは、
レンチウイルスベクターである。

【００７９】 第１の被験体におけるサラセミアを処置する方法もまた開示され、この方法は
、サラセミアを処置し得る外因性遺伝子エレメントを含むウイルスベクターと共
に第１の被験体の骨髄から精製した造血幹細胞の集団をインキュベートする工程
、インキュベーション混合物を形成する工程、およびこのインキュベーション混
合物由来の細胞のサブセットを、第１の被験体または第２の被験体への導入のた
めに供給する工程を包含し、ここで、第１の被験体は、減少した造血細胞数を有
する。

【００８０】 また、第１の被験体のインキュベーション混合物は、第２の被験体のサラセミ
アを処置するために、第２の被験体に導入され得る。

【００８１】 サラセミアを処置する方法が開示され、ここで外因性遺伝子エレメントは、α
グロブリン遺伝子またはβグロブリン遺伝子のいずれかである。

【００８２】 サラセミアを処置するための方法が開示され、ここで、ウイルスベクターはレ
ンチウイルスベクターである。

【００８３】 以下の実施例は、当業者に、どのように本発明の化合物、組成物、物品、デバ
イスおよび／または方法が作製され、そして評価されるかという完全な開示およ
び記載を提供するように記載され、本発明の純粋な例示であることを意図し、発
明者らが本発明とみなすものの範囲を制限することを意図しない。数（例えば、
量、温度など）に関する精度を保証するために努力がなされたが、いくらかの誤
差および偏差は考慮に入れられるべきである。他に記載されない限り、部は重量
部であり、温度は℃であるか、または周囲温度であり、そして圧力はａｔである
かまたは大気圧付近である。

【００８４】 （実施例） （実施例１） （マウス幹細胞の精製） Ｃ５７Ｂ１／６Ｈｂｂ^dドナーマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから得、そ
して本発明者らのマウス施設で繁殖させた。骨髄を、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を含有するＩＭＤＭ培地を用いて、８〜
１６週齢のドナーマウスの大腿骨および脛骨からフラッシュした。分離緩衝液（
５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ チャコール処理したＢＳＡを含むＰＢＳ）で
１回洗浄した後、細胞を、標識緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中、氷
上で１５分間、ビオチン結合Ｓｃａ−１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識し
た。次いで、細胞を分離緩衝液で１回洗浄し、遊離Ｓｃａ−１抗体を除去し、そ
して氷上で１５分間、磁性ビーズ結合ストレプトアビジン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）
で標識した。この工程の直後（洗浄なし）に、氷上でさらに１５分間、ＦＩＴＣ
結合ストレプトアビジン（Ｃａｌｔａｇ）を添加した。標識の後、細胞を分離緩
衝液で１回洗浄し、そして磁性ビーズ標識細胞を、製造者に指示されるように、
ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。細胞をこのカラムか
ら溶出し、ペレット化し、そして標識緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞を、氷
上で１５分間、ＡＰＣ結合ｃ−Ｋｉｔ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびＢ
−２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１およびＴｅ
ｒ−１１９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むＰＥ結合系列抗体のカクテルで、同
時に標識した。細胞を分離緩衝液で１回洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ＦＣＡＳＶａｎｔａｇｅ ＳＥで識別するために、ＩＭＤＭ培養液
に再懸濁した。Ｓｃａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-細胞を、形質転換のために、１
％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭと共に、５ｍｌチューブに収集した。

【００８５】 （レンチウイルスＧＦＰ発現ベクターの生成） ｐＰＣＷ−ｅＧＦＰ遺伝子転移ベクターを構築するために、ＥＧＦＰ遺伝子（
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１由来、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む
ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントをｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰを生成するｐＨ
Ｒ−ＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位（Ｎａｌｄｉｎｉ
Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７２：２６３−７（１９９６））にライゲーション
した。次いで、中心ポリプリン路（ＰＰＴ）および中心末端部位（ＣＴＳ）を含
むＤＮＡの１５０ｂｐ配列（座標４３２７〜４４８３）を、ＨＩＶ−１ ｐＳＧ
３分子クローンからＰＣＲ増幅し（Ｇｈｏｓｈ ＳＫら、「Ａ ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ ｃｙｔｏｐａｔ
ｈｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９４：８５８−６４（１９９３））、そして
ｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰの特有のＣｌａＩ部位にライゲーションした。形質転
換した細胞におけるｅＧＦＰ発現を増加するために、マーモット肝炎ウイルス（
ＷＰＲＥ）由来の転写後調節エレメントを、ｐＰＣＷ−ｅＧＦＰ遺伝子転移ベク
ターを生成する、ｅＧＦＰの下流に挿入した。

【００８６】 （幹細胞の形質転換） 識別したＳｃａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-幹細胞を、３００×ｇで１０分間遠
心分離し、そして１０μｇ／ｍｌ 硫酸デキストランおよび１％ ＦＢＳを含む
ＩＭＤＭ培養液に再懸濁した。１０００個の幹細胞を、１００μｌの全容量中で
、３７℃で４時間感染させ、単一の致死的に照射したマウスに以下に記載される
ように移植した。

【００８７】 （移植） 類遺伝子性レシピエントマウス（Ｃ５７Ｂ１／６ Ｈｂｂ^s）をＪａｃｋｓｏ
ｎ Ｌａｂから購入し、本発明者らのトランスジェニック施設で維持した。マウ
スを、Ｐｉｃｋｅｒ Ｃｙｃｌｏｐｓ Ｃｏｂａｌｔ−６０装置を使用して、そ
れぞれ２６５ＲＡＤの線量で２回、致死的に１２５０ＲＡＤで照射した。麻酔し
たマウスに、後眼窩注射によって、１００μｌのＩＭＤＭ培養液中、マウス１匹
あたり１０００個の幹細胞を移植した。移植片を、移植後２ヶ月間、１．１ｇ／
ｌ硫酸ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１×１０⁶ｕｎｉｔ／ｌ 硫酸ポリミ
キシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含む抗生物質水に維持した。第２の移植のために、一
次移植片由来の５百万の分画されていない骨髄細胞を各レシピエントマウスに後
眼窩注射した。移植片の造血快復を、前記のように、高速液体クロマトグラフィ
ーを使用して、拡散ヘモグロビンの分析によってモニタリングした（Ｒｙａｎ
ＴＭら、「Ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ
ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７８
−６（１９９７））。

【００８８】 （単核細胞ＧＦＰ分析） 各マウス由来の末梢血５０μｌを、尾静脈から収集し、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む１ｍｌのＰＢＳと混合した。これらの細胞を、勾配分離の直前にＰＢＳで
３ｍｌまでさらに希釈した。３ｍｌのＨｉｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍ
ａ）を１５ｍｌコニカルチューブに充填し、３ｍｌの希釈した血液細胞を慎重に
その上部に層状にした。細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離した。界面に形成
された単核細胞の不透明な層を慎重に新しいチューブに移し、そしてＰＢＳで１
回洗浄した。次いで、細胞を等分し、そして上記のようにＰＥ結合抗体で標識し
、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳを使用して分析した。同じ勾配手順をまた使用して、分
析のための骨髄単核細胞を調製した。脾臓または胸腺の単一の細胞懸濁液を、標
識および分析のために直接使用した。

【００８９】 （前駆体アッセイ） 骨髄細胞を、メチルセルロース培地Ｍ３４３４（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ
ｈｏｎｏｌｏｇｙ）と、製造業者が提案する通り、３×１０⁴／ｍｌまで混合し
、３５ｍｍプレート上にプレート化し、そして３７℃で１２時間かけて培養した
。ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーを、倒立顕微鏡を使用して試験し、そしてコロニー
からの蛍光画像を、エピフルオレセンスオプティクス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅ ｏｐｔｉｃｓ）およびＨａｍａｍａｔｓｕＣＣＤカメラを備えるＯｌ
ｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡を使用して撮った。

【００９０】 （実施例２） （Ｓｃａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-細胞を有する、致死量まで照射されたマウ
スの再構成） 骨髄細胞を、びまん性ヘモグロビン（Ｈｂｂ^d）ハプロタイプを含む、Ｃ５７
Ｂｌ／６ドナーマウスの大腿骨および頚骨から単離した。５−フルオロウラシル
は、骨髄の単離の前に、幹細胞を移動させるためにマウスに投与しなかった。Ｓ
ｃａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-細胞を、実施例１に記載されるように単離し、そ
して単一のヘモグロビン（Ｈｂｂ^S）ハプロタイプを含む、致死量まで照射され
た野生型Ｃ５７Ｂｌ／６レシピエントに移植した。これらの高度に精製した細胞
の５０程度は、造血を完全に再構成し得る（データを示さず）。続いて、ドナー
幹細胞を用いた再構成は、溶血血液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
によって行った。代表的に、１匹のレシピエントマウス当たりの１０００のＳｃ
ａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-細胞を、移植の前に、レンチウイルスベクターを用
いて慣用的に感染させた。図１は、１０００の形質転換した幹細胞を移植した、
代表的な動物の再構成を例示する。移植の８週後内に、全ての赤血球細胞を、Ｈ
ｂｂＤ（βｍａｊ，βｍｉｎ）でのＨｂｂＤ（β^s，β^t）の置換により示される
ように、ドナーから誘導した。

【００９１】 （レンチウイルスベクターの設計） 本研究において使用されるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎 対 Ｇ
（ＶＳＶ−Ｇ）グリコタンパク質で偽型化したヒト免疫不全ウイルス−１であっ
た。このベクターは、ＧＦＰレポーター遺伝子を駆動するサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、パッケージングおよび形質転換効果を増加させるため
にＨＩＶ−１の分子クローンから誘導された中心ポリプリン路（ＰＰＴ）および
中心末端部位（ＣＴＳ）（Ｇｈｏｓｈ ＳＫら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９４：８
５８−６４（１９９３））、ならびにＷｏｏｄｓｈｕｃｋ肝炎ウイルス（ＷＰＲ
Ｅ）（図２Ａ）を含む。Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒら、Ｊ Ｖ
ｉｒｏｌ；７３：２８８６−９２（１９９９））は、このＷＰＲＥが、ＲＮＡ処
理の効率を増加させることによって、培養細胞においてレトロウイルスおよびレ
ンチウイルス形質転換効果を増強させることを実証した。ＷＰＲＥを有するか、
または有さないレンチウイルスベクターは、培養したマウスの赤血球病（ＭＥＬ
）細胞の効果（データを示さず）を減少させ得る。ＷＰＰＥは、骨髄幹細胞を効
率的に形質転換した。

【００９２】 （Ｓｃａ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-細胞の形質転換および造血系統中における
ベクター誘導ＧＥＯのインビボでの持続的発現） レンチウイルスベクターは、静止細胞を形質転換し得（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７２：２６３−７（１９９６）；Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌら、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；９３：１１３８２−８（１９
９６））、形質転換の効果は、細胞が細胞周期に入るように誘導される場合に、
増強される（Ｓｕｔｔｏｎ ＲＥら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕ
ｍａｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅ
ｌｌｓ ｂｙ ｈｕｍａｎｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ
ｔｙｐｅ １−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ」，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７３：３６４９−６０（１９９９）；
Ｐａｒｋ Ｆら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｉｎ
ｇ ｉｎ ｖｉｖｏ」，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ；２４：４９−５２（２０００））
。しかし、インビトロでの造血幹細胞の複製の誘導の結果として、多機能性の欠
如をもたらし得る。従って、精製した幹細胞を、サイトカインの非存在下で４時
間だけインキュベートした。次いで、細胞を、致死量で照射したレシピエントに
移植し、この幹細胞を骨髄に戻し、そして多分化能の維持を助ける条件下でイン
ビボで複製する。形質転換の効率を、ＧＦＰ発現関してＦＡＣＳ分析することに
よって測定した。

【００９３】 図２Ｂは、移植の５〜２０週間後のマウスの末梢血単核細胞中でのＧＦＰ発現
の結果を例示する。幹細胞を受容したこれらの動物を、５０、３００または１０
００のＭＯＩで形質転換した。ドナー幹細胞を有する完全再構成は、８週間で達
成された（データを示さず）。５０のＭＯＩにおいて、末梢血単核細胞の平均４
％は、ＧＦＰポジティブであり、そしてこの割合は、３００および１０００のＭ
ＯＩで、それぞれ６％および８％増加した。ＧＦＰポジティブ単核細胞は、幹細
胞が、５のＭＯＩで形質転換される場合にほとんど検出されなかった（データを
示さず）。これらの結果は、高いＭＯＩが、造血幹細胞の効果的なレンチウイル
ス形質転換に必要とされることを実証した。このデータはまた、このレンチウイ
ルスベクターが、インビボで長期に再構成され得る幹細胞の安定的な形質転換を
媒介することを実証した。

【００９４】 形質転換された造血幹細胞が、長期の再構成の後の多分化能を維持したことを
示すために、マウスを移植１６〜２０週間後に屠殺し、そしてＢ細胞（α−Ｂ２
２０）、Ｔ細胞（α−ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）、好中球、単球、および顆
粒球（α−Ｍａｃ−１およびＧＲ−１）、ならびに赤血球系細胞（α−Ｔｅｒ−
１１９）に対するＰＥ−結合体系統特異的抗体で、単核細胞を標識した。代表的
な実験において、移植１６週間後に、単核細胞は、末梢血（Ａ）、骨髄（Ｂ）、
脾臓および胸腺（Ｃ）から採取した。この第１レシピエントは、３００のＭＩＯ
で形質転換した１０００幹細胞を最初に受容した。単核細胞を、染色することな
くＦＡＣＳによって分析するか、またはＰＥ結合体系統抗体（Ｂ細胞に対してＢ
２２０、Ｔ細胞に対してＣＤ３、４および８の混合物、好中球に対してＭａｃ−
１およびＧｒ−１の混合物、ならびに赤血球系細胞に対してＴｅｒ−１１９）を
用いて染色した後、ＦＡＣＳによって分析した。ＧＦＰポジティブ単核細胞の割
合を、ＦＡＣＳによって決定した。代表的に実験において、末梢血中（７．９％
のＢ細胞、９．６％のＴ細胞、および１２．６％の好中球）で、顆粒球および単
球が、ＧＦＰ発現に対してポジティブであった。類似の値が、末梢血の単核細胞
に対する全ての時間点において観測された（データを示さず）。これらの結果の
タイプは、形質転換した造血幹細胞が、完全に再構成したマウスにおいて、正常
系統特異性に関する能力を維持することを実証した。

【００９５】 末梢血中における１％未満の赤血球系細胞は、赤血球の前駆体が安定的に形質
転換されないが、ＧＦＰが徐核した赤血球細胞中でほとんど存続しないという事
実に起因して、ＧＦＰに対してポジティブであった。なぜならば、Ｔｅｒ−１１
９⁺骨髄単球細胞（赤血球前駆体）の９．７％が、ＧＦＰ発現に対してポジティ
ブであったからである。このことにより、形質転換した幹細胞が正常な赤血球系
統の分化を可能にすることも実証した。骨髄Ｂ細胞、好中球、顆粒球および単球
、ならびに脾臓Ｂ細胞および胸腺Ｔ細胞は、同様の割合で全てＧＦＰポジティブ
であった。さらに、これらにより、レンチウイルスベクターは、造血幹細胞を効
果的に形質転換し、そして完全に再構成されたマウスにおいて、自己再生および
系統特異性の正常な特性を変えないことを実証する。

【００９６】 （第２の移植片における持続的なＧＦＰの発現） 第２の移植片において、ＧＦＰの発現が持続するか否かを決定するために、第
１の移植片からの５００万個の骨髄細胞を、致死量まで照射したＣ５７ＢＬ／６
Ｈｂｂ^dレシピエント細胞に注射した。表１は、１６週目の第１移植片から誘導
された１セットの第２の移植片を例示する。ＧＦＰ発現は、移植後１２週間後に
、全ての再構成した第２レシピエントにおいて検出され、そして、ＧＦＰポジテ
ィブの単核細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球の平均の割合は、第１の移植片
由来のものと一致した。これらの結果は、長期の自己再生幹細胞が、レンチウイ
ルスベクターによって形質転換さるという結論およびこれらの細胞の多分化能が
、完全に再構成されたレシピエントにおいて保持されたという結論をさらに支持
する。

【００９７】 （レンチウイルスにより形質導入された遺伝子のサイレンシング） 長期の再構成されたマウスから誘導される、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成
単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、および巨核球）におけるＧＦＰ発現を
調べた。１つの代表的な実験において、移植の１６週後（マウス番号ＴＰ５４）
または２０週後（マウス番号ＴＰ６２）の完全に再構成されたレシピエントのマ
ウス由来の骨髄細胞（３５ｍｍプレート当たり３×１０⁵）を、メチルセルロー
ス中にプレートし、１２日間３７℃で培養した。１２日後、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコ
ロニーを評点付けし、蛍光顕微鏡によって調べた。ＴＰ５４およびＴＰ６２それ
ぞれは、１０００個の幹細胞を受容し、この幹細胞は、それぞれ１０００および
３００のＭＯＩで形質導入された。２匹のレシピエントからのＧＦＰ陽性ＣＦＵ
−ＧＥＭＭコロニーの割合を分析し、そして評点付けした。同じマウスの末梢血
（ＰＢＬ）および骨髄（ＢＭ）由来のＧＦＰ陽性単核細胞もまたコントロールと
して分析した。コロニーは、完全な陽性または陰性のいずれかであり；発現細胞
および非発現細胞へのセクター化（ｓｅｃｔｏｒｉｎｇ）は観測されなかった。
この結果は、形質導入された遺伝子のサイレンシングが、系統特異化の間に生じ
ないことを示唆する。しかし、いくつかのサイレンシングが初期の前駆体におい
て生じ得る。ＧＦＰ陽性ＣＦＵ−ＧＥＭＭの割合は、末梢血および骨髄における
ＧＦＰ陽性単核細胞の割合よりも約２倍高かった。それにもかかわらず、高い割
合のＧＦＰ陽性細胞は、完全に再構成されたマウスにおいて１６週間および２０
週間続く。骨髄細胞を移植の１６週後に動物から得、そしてメチルセルロース中
にプレートした（３×１０⁴／プレート）。予期されるように、再構成されたマ
ウスおよび野生型のマウスから誘導されるＣＦＵ−ＧＥＭＭの数は、類似してい
た（データは示さない）。

【００９８】 赤血球において特異的にｌａｃＺ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス
において、初期赤血球コロニーをｌａｃＺ発現細胞および非発現細胞にセクター
化する（Ｇｒａｕｂｅｒｔ ＴＡら、「Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ，ｓｔａｇｅ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖ
ａｒｉｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｏｂｉｎ ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｅ，「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２６：２８４９−５８（１９９
８））。トランスジェニックマウスにおけるこの結果は、トランスジーンのサイ
レンシングが、赤血球分化の間に生じたことを示唆した。レンチウイルスベクタ
ーを用いて形質導入されたマウス由来のコロニーは、セクター化されなかった；
従って、形質導入された遺伝子のサイレンシングは、明らかに、系統特異化の間
には生じない。しかし、サイレンシングは、幹細胞または初期前駆体において生
じ得る。ＰＣＲ分析は、４０％のＣＦＵ−ＧＥＭＭがＧＦＰ ＤＮＡを含んだこ
とを示した（データは示さない）；しかし、これらのコロニーの２０％のみおよ
び末梢系細胞の１０％が、ＧＦＰを発現した。これらのデータは、サイレンシン
グが形質導入の後に、２つの別々の段階で生じることを示唆する。全てのベクタ
ー組込み部位の半分は、形質導入の後すぐに幹細胞においてサイレンシングされ
る。引き続いて、残りの部位の半分が、初期前駆体においてサイレンシングされ
る。それにもかかわらず、高い割合（１０％）のＧＦＰ陽性細胞が、完全に再構
成されたマウスにおいて移植後の２０週間の間、骨髄および末梢血において持続
し、二次レシピエントにおいては少なくとも１２週間持続する。

【００９９】 （実施例３） 高度に精製されたマウス骨髄幹細胞は、レンチウイルスベクターによって効率
的に形質導入され、そしてこれらの細胞の正常な多能性は、完全に再構成された
、致死的に照射されたマウスにおいて、保存される。開示された組成物および方
法は、移植後において正常な造血を維持する；従って、安定なレンチウイルスに
よる形質導入は、正常な細胞系統特異化を変化させない。

【０１００】 高い感染多重度（ＭＯＩ）を、効率的な形質導入のために向上させた。５のＭ
ＯＩにおいて、いくつかの細胞が形質導入された。５０のＭＯＩは、有意な形質
導入のために必要とされ、そして１０００のＭＯＩは、形質導入の効率を２倍に
増加した。本研究において必要とされる高いＭＯＩは、サイトカイン刺激なしで
形質導入された高度に精製された幹細胞の使用から生じ得る。本発明者らは、多
能性を保存することを試みるために、刺激されていない幹細胞を使用し、そして
これらの分化していない細胞は、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質についてより少ないレ
セプターを発現し得る。

【０１０１】 マウス造血幹細胞への効率的な遺伝子送達は、マウスモデルにおけるサラセミ
アおよび鎌状赤血球疾患の遺伝的補正のための強力なツールを提供し（Ｃｉａｖ
ａｔｔａ ＤＪら、「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ
ｚｅｒｏ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｅｔａ ｍａｊ− ａｎｄ ｂｅｔａ ｍｉｎ−ｇ
ｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」
，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，；９２：９２５９−６３（
１９９５）；Ｙａｎｇ Ｂら、「Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｂｅｔ
ａ ０−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ；９２：１１６０８−１２（１９９５）；Ｒｙａｎ ＴＭら、「Ｋｎｏｃ
ｋｏｕｔ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｉｃｋｌ
ｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７８：８７３−６（１９
９７）；Ｐａｓｚｔｙ Ｃら、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍ
ｉｃｅ ｗｉｔｈ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｈｕｍａｎ ｓｉｃｋｌｅ ｈｅ
ｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ；２７８：８７６−８（１９９７））、そしてヒトにおける同様なプ
ロトコルの基礎を提供する。鎌状赤血球およびサラセミア赤血球の寿命は、正常
な細胞よりも有意に短い；従って、骨髄における約１０％の赤血球前駆体の補正
は、末梢血の大部分の画分に翻訳され得る。レンチウイルスにより形質導入され
る遺伝子は、デアセチラーゼインヒビターによって再活性化され得る。レンチウ
イルス形質導入および薬物処置の組み合わせは、高いレベルの治療遺伝子発現を
生じ得、従って、遺伝的な血液疾患に対する強力な処置を提供する。

【０１０２】 本出願全体を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、
全体において、本出願が関係する技術の状態をより完全に記載するために本明細
書によって参考として援用される。

【０１０３】 本発明の範囲または精神から外れることなく、種々の改変および変更が本出願
においてなされ得ることが当業者に明かである。本発明の他の実施形態は、本明
細書中に開示される本発明の詳細および実施を考慮することにより当業者に明か
である。詳細および実施例は単なる例示として考慮され、本発明の真の範囲およ
び精神は先の特許請求の範囲によって示されることが意図される。

【０１０４】

【表１】 添付される図面（これは、本明細書中で参考として援用され、そして本明細書
の一部を構成する）は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、そしてその説明
と共に本発明の本質を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Ｓｃａｌ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-幹細胞を有する、致死的に照射さ
れたマウスの再構成を示す。致死的に照射されたレシピエントマウスに、１００
０のウイルス的に形質導入されたＳｃａｌ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-幹細胞を移
植した。末梢血を、示された時間点において、ドナー（びまん性ヘモグロビンハ
プロタイプ）、レシビエント（単一ヘモグロビンハプロタイプ）および移植片か
ら収集した。溶血血液を３５％〜４１％のアセチルニトリル勾配を使用して、Ｈ
ＰＬＣによって分析した。全再構成は、移植後８週間で達成された。溶出したグ
ロビン産生物の追跡を示す。αおよびβポリペプチドに起因する両方のピークを
示す。

【図２】 図２は、レンチウイルスによるＳｃａｌ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-幹細胞の安
定な形質導入を示す。パネル（Ａ）は、本研究で使用されたレンチウイルスＰＣ
Ｗ−ｅＧＦＰのマップを示す。ＨＩＶ−１の分子クローンに由来する中心ポリプ
リン路（ＰＰＴ）および中心末端部位（ＣＴＳ）をベクターに挿入し、形質導入
効率を増加させた。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＶＰＲＥ）の転写後調節エレ
メントをＣＭＶ／ｅＧＦＰと共にセンス配向で下流に配置し、ＧＦＰ発現を増加
させた。パネル（Ｂ）は、末梢血由来の単核細胞におけるＧＦＰ発現の持続性を
示す。ＧＦＰ⁺単核細胞の百分率を、移植後の週での時間の関数としてプロット
する。１００のＳｃａｌ−１⁺ｃ−Ｋｉｔ⁺Ｌｉｎ^-幹細胞を、５０、３００また
は１０００のＭＯＩにおいてベクターによって形質導入し、そしてこれらの細胞
を一匹の致死的に照射されたマウスへ移植した。４匹のマウスをＭＯＩ３００で
感染された幹細胞によって再構成し、そして４匹をＭＯＩ１０００で再構成した
。３匹のマウスはをＭＯＩ５０で感染された細胞によって再構成した。示された
時間点において、各移植されたマウス由来の血液５０マイクロリットルを尾の静
脈から収集した。次いで、 単核細胞を分離し、そしてＦＡＣＳによってＧＦＰ発現について分析した。移植
後１６週目に開始し、何匹かのマウスを、第２の移植および骨髄細胞分析のため
に屠殺した。各群から少なくとも２匹のマウス（ＭＯＩ＝５０、３００または１
０００）を２０週後に分析した。ＧＦＰ発現は、全ての再構成されたマウスにお
いて２０週間持続した。これらのデータは、レンチウイルスベクターは、インビ
ボで長期再構築し得る幹細胞の安定な形質導入を媒介することを示す。この結果
はまた、高ＭＯＩが、造血幹細胞の有効なレンチウイルス形質導入のために必要
とされることを示す。

【図３】 図３は、βヘモグロビンを外因性遺伝子エレメントとして含む典型的なレンチ
ウイルスベクターの略図を示す。

【図４】 図４は、典型的なレンチウイルスパッケージング系を示す。

【図５】 図５は、造血幹細胞の形質導入のための模式図の一例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウ， シャオユン アメリカ合衆国 アラバマ 35242， バ ーミンガム， ヘリテイジ オークス サ ークル 4217 (72)発明者 カッペス， ジョン シー． アメリカ合衆国 アラバマ 35242， バ ーミンガム， バードソング ロード 5284 (72)発明者 タウネス， ティム エム． アメリカ合衆国 アラバマ 35243， バ ーミンガム， ブリッジウォーター ロー ド 4687 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA17 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA02 BA25 CA44 4C084 AA02 AA13 DC50 NA14 ZA512 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA04 NA14 ZA51 4C087 BC83 CA12 NA14 ZA51

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスベクターを含む造血幹細胞の精製した集団であって
   、ここで、該造血幹細胞の集団は、正常な分布の血球型へと分化し得、そしてこ
   こで、該ベクターは、類似した割合で全ての血球型に含まれる、造血幹細胞の精
   製した集団。
2. 【請求項２】 前記造血幹細胞の集団が、インビボで、正常な分布の血球型
   へと分化する、請求項１に記載の造血幹細胞の集団。
3. 【請求項３】 前記ベクターが、外因性遺伝子エレメントを含む、請求項１
   に記載の造血幹細胞の集団。
4. 【請求項４】 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１
   に記載の造血幹細胞の集団。
5. 【請求項５】 前記ベクターが、外因性遺伝子エレメントを含む、請求項４
   に記載のベクター。
6. 【請求項６】 前記外因性遺伝子エレメントが、抗鎌状赤血球タンパク質を
   コードする、請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 前記外因性遺伝子エレメントが、変化した結合特異性を有す
   るＥＫＬＦタンパク質をコードする、請求項５に記載のベクター。
8. 【請求項８】 さらに形質導入有効化エレメントを含む、請求項４に記載の
   ベクター。
9. 【請求項９】 形質導入有効エレメントが、ｐｐｔ−ｃｔｓ配列を含む、請
   求項８に記載のベクター。
10. 【請求項１０】 前記ｐｐｔ−ｃｔｓ配列が、前記ＨＩＶ−１ ｐＳＧ３分
    子クローンに由来する、請求項９に記載のベクター。
11. 【請求項１１】 転写後の調節エレメントをさらに含む、請求項４に記載の
    ベクター。
12. 【請求項１２】 前記転写後の調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイ
    ルスに対応するＷＰＲＥ領域である、請求項１１に記載のベクター。
13. 【請求項１３】 前記ＷＰＲＥ領域が、外因性遺伝子エレメントの下流にあ
    る、請求項１２に記載のベクター。
14. 【請求項１４】 造血幹細胞の精製した集団を、少なくとも１つの形質導入
    した造血幹細胞を産生するウイルスベクターを用いて、形質導入する方法であっ
    て、該方法は、該ベクターおよび造血幹細胞の精製した集団を、該造血幹細胞が
    その多能性を変化させない時間、インキュベートする工程を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 前記時間が、４時間より少ないかまたは４時間に等しい、
    請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ベクターおよび前記造血幹細胞の精製した集団を、該
    造血幹細胞がその多能性を変化させることなく形質導入を達成するのに十分な数
    のベクターと共にインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１４に記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 造血幹細胞の精製した集団を、少なくとも１つの形質転換
    した造血幹細胞を産生するウイルスベクターを用いて形質導入する方法であって
    、該方法は、該ベクターおよび造血幹細胞の精製した集団を、該造血幹細胞がそ
    の多能性を変化させることなく形質導入を達成するのに十分な数のベクターと共
    に、インキュベートする工程を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 前記インキュベーションが、前記造血幹細胞の精製した集
    団中に、該細胞より少なくとも５０倍多い数のベクターを用いる工程を包含する
    、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記インキュベーションが、前記造血幹細胞の精製した集
    団中に、該細胞より少なくとも３００倍多い数のベクターを用いる工程を包含す
    る、請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記インキュベーションが、前記造血幹細胞の精製した集
    団中に、該細胞より少なくとも１０００倍多い数のベクターを用いる工程を包含
    する、請求項１７に記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の方法であって、該方法は、前記ベクタ
    ーおよび前記造血幹細胞の精製した集団を、該造血幹細胞がその多能性を変化さ
    せない時間、インキュベートする工程、ならびにインビボで該形質導入した造血
    細胞を増幅させる工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 被験体における鎌状赤血球疾患を処置する方法であって、
    該方法は、該被験体の骨髄から精製した造血幹細胞の集団を、鎌状赤血球疾患を
    処置し得る外因性遺伝子エレメントを含むウイルスベクターと共にインキュベー
    トする工程、インキュベーション混合物を形成させる工程、そして該インキュベ
    ーション混合物由来の細胞のサブセットを該被験体への導入のために供給する工
    程、を包含し、ここで、該被験体は、減少した造血幹細胞計数を有する、方法。
23. 【請求項２３】 前記外因性エレメントが、抗鎌状赤血球遺伝子である、請
    求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記外因性遺伝子エレメントが、変化した結合特異性を有
    する、ＥＫＬＦタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである
    、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 被験体におけるサラセミアを処置する方法であって、該方
    法は、該被験体の骨髄から精製した造血幹細胞の集団を、該サラセミアを処置し
    得る外因性遺伝子エレメントを含むウイルスベクターと共にインキュベートする
    工程、インキュベーション混合物を形成させる工程、そして該インキュベーショ
    ン混合物由来の細胞のサブセットを該被験体への導入のために供給する工程、を
    包含し、ここで、該被験体は、減少した造血幹細胞計数を有する、方法。
27. 【請求項２７】 前記外因性遺伝子エレメントが、αグロビン遺伝子または
    βグロビン遺伝子のいずれかである、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである
    、請求項２６に記載の方法。