CN103403151A - 提高基因转导的细胞的递送的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供增强转导的细胞向个体的递送的新方法，包括选择转导的细胞的方法和提高转导的细胞在移植受体中的重建的方法。本发明还进一步提供可用于实施本发明的方法的转化载体，包括慢病毒载体。本发明的方法和载体可在各种疾病和病症的基因治疗中使用，包括但不限于血液学的疾病和病症。

Description

提高基因转导的细胞的递送的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119（e）要求于2011年1月3日提交的美国临时申请号61/429,401,以及于2011年4月1日提交的美国临时申请号61/470,941的优先权，每个临时申请的内容通过引用整体并入本文。

政府利益声明

本发明通过政府赞助完成，资金号.1R43CA096457-1，由美国国立卫生研究院提供。政府在本发明中享有一定权利。

序列表相关声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质版本提供，并且在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称为BLBD_001_02WO_ST25.txt.。文本文件为10KB，创建于2011年12月27日，并通过EFS-WEB提交电子版，与说明书一并提交。

发明背景

技术领域

本发明涉及选择基因转导的多能细胞，包括干细胞，的方法，提高基因转导的多能细胞向移植受体的递送的方法，以及促进基因转导的多能细胞向移植受体中植入的方法，以及可用于实施本发明的方法的转化载体。

相关领域的说明

基因疗法提供治疗多种疾病或病症的潜能，包括血细胞生成和淋巴细胞生成的遗传疾病，所述基因疗法通过用转化载体离体转导多能造血细胞(包括，例如，造血干细胞（HSC）)，在向移植受体植入获得的转导的细胞中之后，所述转化载体驱动治疗性多肽的表达。然而，治疗性多肽达到有效水平的能力可能受到一些因素限制，包括在供体细胞群中低比率的靶多能细胞，例如HSC，最原始HSC的静止性质，体外细胞培养对HSC的植入潜能的不利影响，以及在移植细胞群中的含有的与转导的HSC在移植受体中竞争移植与重建的未转导的HSC。

将细胞群暴露在给定的基因转化载体后成功地在遗传上被修饰的细胞的离体选择一直是基因治疗领域中一个尚未达成的目标。在许多实例中，当给定组织必须包含大比例的遗传上被修饰的细胞，同时总体基因转化效率低于要求的阈值时，达成此目标在实现效力以及适当的风险/收益比中至关重要。当第一细胞群，例如HSC，不能经受漫长的和/或创伤性物理操作的时候，在过去发展的多种离体选择方法无法实用。这些操作包括（i）荧光激活细胞分选（FACS）或用于与目的基因共表达的膜标志物的表达的基于磁性的方法以及（ii）基于赋予对化学物质（例如，G418，潮霉素）抗性的显性选择标志物的共表达的选择。特别地，HSC在体外尤为脆弱并且拒绝任何可能在人类临床应用上可行的离体选择的尝试。

现今通过移植使用逆转录病毒载体中的选择标志物基因改造的造血干细胞改善基因治疗的方法的例子包括，使用O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）基因，其赋予对具有高度鸟嘌呤-O（6）烷基化潜力的试剂的抗性，例如在体内移植后给予的氯乙基亚硝基脲类或替莫唑胺（专利与引用文献）。转导的造血干细胞的选择性扩增还通过使用以下方法实现：将二氢叶酸还原酶（DHFR）基因合并到基因转化载体中，移植后使用三甲曲沙和硝基苄基巯基嘌呤核糖甙5'单磷酸来选择表达DHFR的细胞（例如，Zhang etal.2005）。然而，这些方法局限于来自体内未经转导的造血干细胞的损耗的不需要的血液学毒性。

另一种方法需要离体并且在移植之前预选细胞，随后在受体中促进分子嵌合。这一点已经基于绿色荧光蛋白的表达在实验上实现，其通过使用含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的载体（例如，Kalberer et al.2000,Pawliuk etal.,1999），但受限于分离用于人类用途的表达荧光蛋白的细胞的不可行性和在细胞的物理操作中损失了大量细胞。

在逆转录病毒基因转导之后的细胞选择也在建立的细胞系上在实验上实现了，其通过使用抗生素抗性基因（例如，抗新霉素，潮霉素，嘌呤霉素）与加入相应的抗生素。然而，通过这些抗生素进行的选择在培养中使用很多天，通常至少10天。这种长期的体外细胞培养与足够的细胞活力维持和在基因治疗方案中使用的许多第一细胞群种类的分化状态并不兼容。

限制了使用转导的HSC的基因治疗的效率的另一个问题是在移植之前接受了脊髓消除的移植受体中暂时性骨髓抑制的发生。这些移植受体时常患有骨髓抑制，这是由于在脊髓消除和移植之后，以及在转导的HSC足以再增殖出移植受体的造血细胞群之前存在的延迟。

无疑地，本领域需要达到高水平的转导的多能细胞，包括HSC，的新方法，以及抑制在移植转导的HSC后的骨髓抑制的方法。本发明提供此类方法满足此需求，以及用于实施这些方法的转化载体。

发明简述

本发明包括提高转导的细胞在移植受体中重建的新方法。在具体实施方案中，这些方法包括对逆转录病毒/慢病毒转导的多能细胞的基于嘌呤霉素的选择，其可以在足够短的暴露期有效地离体选择脆弱的细胞，这导致有效率以及有限的多能细胞的损失。另外，本发明的实施方案基于移植方法的发展，其降低或抑制在脊髓消除以及随后的移植之后暂时性骨髓抑制。此方法涉及与能够提供暂时性或短期再增殖的细胞一起，移植能够长期再增殖的转导的细胞，例如干细胞。在具体实施方案中，与引入的提供长期再增殖的细胞群相比，引入的提供暂时性或短期再增殖的细胞群包括较高比例的具有降低的或可忽视的实现长期再增殖的能力的细胞，以及可能包括祖细胞和/或至少部分分化的造血细胞。

在一实施方案中，本发明提供了提高转导的细胞在移植受体中的重建的方法，其包含在移植入移植受体之前选择转导的细胞，其中所述转导的细胞通过包括以下步骤的方法选择：（i）在体外使包含多能细胞，包括干细胞，的第一细胞群接触转化载体，所述转化载体包含可操作地连接到启动子序列上的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列，从而产生包含转导的多能细胞，包括干细胞，的第二细胞群；以及（ii）在体外使所述第二细胞群接触浓度为1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短，从而产生包含转导的多能细胞，包括干细胞，的第三细胞群，其中所述第三细胞群比所述第二细胞群包含更高比例的转导的多能细胞，并且其中在所述第三细胞群移植到移植受体后，在至少四个月的体内时期，所述第三细胞群能够维持至少两种不同的包含所述转化载体的细胞系的产生。在某些实施方案中，第三细胞群包含至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或至少90%的转导的细胞。在具体实施方案中，该方法进一步包括将多个所述的第三细胞群移植到所述移植受体中。在某些实施方案中，第一细胞群是从所述移植受体中获得的。在某些实施方案中，第一细胞群是从骨髓，动员的外周血，脐带血和/或胚胎干细胞中获得的。在具体实施方案中，所述至少四个月可能发生在所述移植两年内开始的任何时间。因此，可能会在移植与植入的转导的细胞开始持续产生至少两种不同的细胞系之间有滞后期。在一个实施方案中，所述第二细胞群接触约5μg/ml的嘌呤霉素约24小时。在某些实施方案中，所述第一细胞群包含造血干细胞。在具体实施方案中，所述转化载体进一步包含可操作地连接到启动子序列的编码治疗性多肽的多核苷酸序列。在某个实施方案中，所述转化载体为逆转录病毒载体。在多种实施方案中，所述转化载体为慢病毒载体。在多种实施方案中，所述慢病毒载体为人类免疫缺陷病毒（HIV）载体，猴免疫缺陷病毒（SIV）载体，或马免疫缺陷病毒（EIAV）载体。在具体实施方案中，所述转化载体为转座子。

在本发明的方法的具体实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸和编码治疗性多肽的多核苷酸序列可操作地连接到同启动子序列上。在某些实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸和编码治疗性多肽的多核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子序列上。在某些实施方案中，一个或多个启动子为组成型启动子。在相关实施方案中，可操作地连接到编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸的启动子序列选自：组成型启动子，诱导型启动子，以及组织特异型启动子。在某些实施方案中，所述启动子为组织特异型启动子，其在干细胞中具有与其在从所述干细胞分化而来的细胞中的活性相比更高的活性。在具体实施方案中，所述干细胞为造血干细胞。在某些实施方案中，可操作地连接到编码治疗性多肽的多核苷酸序列的启动子序列选自：组成型启动子，诱导型启动子，以及组织特异型启动子。在某些实施方案中，所述的启动子为组织特异型启动子，其在多能细胞中具有与其在从所述多能细胞分化而来的细胞中的活性相比降低的活性。在具体实施方案中，所述组织特异型启动子在红细胞中具有活性。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述转化载体进一步包含含有可操作地连接到启动子序列的自杀基因或cDNA的多核苷酸，其中所述自杀基因或cDNA编码自杀多肽。在某些实施方案中，所述自杀基因或cDNA编码胸苷激酶衍生物。在具体实施方案中，所述自杀基因或cDNA编码胸苷酸激酶（TmpK）或其衍生物。在某些实施方案中，所述自杀基因或者cDNA编码含半胱天冬酶或其衍生物。在具体实施方案中，包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列并未可操作地连接到转化载体中存在的启动子序列上。在其他实施方案中，包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列可操作地连接到转化载体中存在的启动子序列上。在具体实施方案中，转化载体中存在的并且可操作地连接到包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列上的启动子序列为诱导型启动子。在某些实施方案中，包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列以及编码治疗性多肽的多核苷酸序列以相反方向存在于转化载体中。在具体实施方案中，所述转化载体在自杀基因或cDNA的上游包含剪接受体序列。在具体实施方案中，包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列在自杀基因或cDNA的5’端包含Kozak共有序列，并且在自杀基因或cDNA3’端包含转录终止子序列。在具体实施方案中，转化载体以框内融合多肽的方式表达所述的嘌呤霉素抗性多肽和所述的自杀多肽。在具体实施方案中，融合多肽为嘌呤霉素抗性多肽和自杀多肽的直接融合。在某些实施方案中，所述嘌呤霉素抗性多肽和所述的自杀多肽通过使用所述转化载体中存在的内部核糖体进入位点（IRES）来表达，其中所述IRES可位于编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间。在某些实施方案中，所述嘌呤霉素抗性多肽以及所述的自杀多肽通过使用所述转化载体中存在的翻译2A信号序列来表达。在某些实施方案中，融合多肽在嘌呤霉素抗性多肽以及自杀多肽之间包含接头序列。在具体实施方案中，接头序列包含Gly3接头序列。在具体实施方案中，接头序列包含自体催化肽剪切位点。在具体实施方案中，自体催化肽剪切位点包含翻译2A信号序列。在某些实施方案中，转化载体在编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间包含编码垃圾序列的多核苷酸序列。在具体实施方案中，编码垃圾序列的多核苷酸序列的侧翼为位于其5’端的终止密码子和位于其3’端的起始密码子。

在本发明方法的具体实施方案中，所述方法进一步包括向个体提供与第四细胞群组合的所述第三细胞群，所述第四细胞群包含祖细胞，其中所述第四细胞群能够在第四细胞群移植到移植受体之后能够提供暂时性或短期造血支持。在某些实施方案中，所述第四细胞群预先暴露于诱导多能细胞的扩增和/或至少部分地分化的条件。在具体实施方案中，所述第四细胞群未被转导。在其他实施方案中，所述第四细胞群包含通过包括以下步骤的方法转导和选择的细胞：:（i）使第四细胞群接触转化载体，所述转化载体包含可操作地连接到启动子序列上的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列；以及（ii）使第四细胞群接触浓度为1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短时间，从而选择包含嘌呤霉素抗性多肽的转导的细胞。在某些实施方案中，所述第四细胞群包含造血细胞。在某些实施方案中，所述第一和第四细胞群从同一个个体获得。在相关实施方案中，所述第一和第四细胞群从骨髓，动员的外周血，脐带血和/或胚胎干细胞中获得。

在本发明的方法的具体实施方案中，所述方法进一步包括使所述第一，第二，或第三细胞群中的至少一种接触能够增加被接触的细胞群中存在的干细胞数量的一种或多种试剂。在具体实施方案中，所述一种或多种试剂包含芳香烃受体拮抗物。在某一实施方案中，所述芳香烃受体拮抗物包含SR1。在某些实施方案中，所述一种或多种试剂包含生长因子的组合。在具体实施方案中，所述多能细胞在4到21天的培养期之后数量增加。在某些实施方案中，所述第三细胞群中至少75%被转导。

附图说明

图1提供了本发明中代表性的HIV转化载体（HPV654）的示意图，其包括可操作地连接到组成型pgk启动子（PGK）上的编码嘌呤霉素抗性基因（PURO）的核酸序列，以及可操作地连接到β-球蛋白基因座控制区序列（β-LCR）的治疗性人β-球蛋白多肽（人β-球蛋白基因）。

图2提供了转导的细胞的嘌呤霉素选择的示意图。图2A提供了描述使用赋予嘌呤霉素抗性的转化载体（HPV654）在上清中为10%（左图）或者50%（右图）时被转导的骨髓或G-CSF动员外周血CD34⁺细胞的嘌呤霉素选择的示意图。如图所示，用5μg/ml的嘌呤霉素处理使用HPV654（10%）转导的骨髓CD34⁺细胞24小时导致了生长14天后100%的转导的细胞的选择，相比之下未使用嘌呤霉素选择只有23%的转导的细胞。用5μg/ml的嘌呤霉素处理使用HPV654（50%）转导的细胞24小时导致了生长14天后79%的转导的细胞的选择，相比之下未使用嘌呤霉素选择只有16%的转导的细胞。类似地，用5μg/ml的嘌呤霉素处理使用HPV654（10%）转导的G-CSF动员外周血CD34⁺细胞24小时导致了88%的转导的细胞的选择，相比之下未使用嘌呤霉素选择只有55%的转导的细胞（图2B）。用5μg/ml的嘌呤霉素处理使用HPV654（50%）转导的细胞24小时导致了100%的转导的细胞的选择，相比之下未使用嘌呤霉素选择只有37%的转导的细胞。

图3提供了描述在对受体进行移植之前选择转导的细胞的本发明方法的示意图。未经转导的细胞从供体获得（第一细胞群），其包括造血多能干细胞，并使用赋予嘌呤霉素抗性并编码治疗性多肽的转化载体进行转导，导致多能干细胞的一部分被转导（第二细胞群）。在转导之后，使细胞接触嘌呤霉素，去除未经转导的细胞，留下包括转导的多能干细胞的转导的细胞（第三细胞群）。这些转导的细胞被移植到受体中，在此转导的多能细胞在免于与未经转导的细胞的竞争下生长并最终在受体内重建成细胞群。

图4提供了显示用于提高造血重建的本发明方法的实施方案的示意图，包括：（A）将扩增的仅能够暂时性再增殖的祖细胞（第四细胞群）添加到嘌呤霉素选择的转导的细胞中（第三细胞群），所述转导的细胞经赋予嘌呤霉素抗性的转化载体转导，并且能够在移植宿主中长期再增殖；以及（B）通过在促进HSC扩增的试剂存在的条件下培养经过选择的转导的细胞使其扩增。这些扩增并转导的细胞被移植入受体，其中转导的祖细胞与干细胞在免于与未经转导的细胞的竞争下生长并最终在受体内提供改善的重建。图4A和4B底部的图表显示了在脊髓消除后对受体移植之后随时间的骨髓抑制水平（左图），以及脊髓消除后对受体移植之后随时间的被移植细胞的再增殖（右图）。

发明详述

本发明部分地基于以下未预料到的发现：对逆转录病毒/慢病毒转导的造血细胞的基于嘌呤霉素的选择，其可以在足够短的暴露期有效地离体选择脆弱的细胞，例如干细胞，导致有效率和有限的细胞损失。此处使用了对造血干细胞进行基因转化来举例。然而，此方法可用于其他细胞类型，所述其他细胞类型需要对脆弱细胞离体选择来获得增强的治疗能力。另外，本发明的一些方面基于移植方法的发展，其降低或抑制在脊髓消除以及后续的移植之后的暂时性骨髓抑制。此方法涉及与未转导的细胞一起移植能够再增殖的转导的多能细胞，例如干细胞，所述未转导的细胞具有相对降低的或可忽视的实现再增殖的能力，例如祖细胞或至少部分分化的造血细胞。祖细胞或至少部分分化的造血细胞在移植受体内暂时性再增殖，因此抑制了骨髓抑制，而转导的干细胞经历长期再增殖的更长过程。当转导的细胞经历选择后此方法尤为有效，因为与未经选择的转导的细胞相比，赚到的系统通常是数目降低的待移植细胞，因此移植受体具有升高的骨髓抑制的风险。

因此，本发明解决了在治疗遗传性疾病中提高基因治疗效果的尚未满足的临床需要，从而仅部分细胞被转化载体有效地靶向，并且处于不足以赋予治疗效果的水平。本发明特别地涉及从混合的细胞群中富集和选择遗传工程化的细胞，其中去除未经转导的（例如，不正确的）细胞为所需的结果。

定义

如文中所述，以下用来描述发明的术语与短语需具有以下提供的含义。

术语“逆转录病毒”指任意已知的逆转录病毒（例如C型逆转录病毒，如莫洛尼氏鼠肉瘤病毒（MoMSV），哈维小鼠肉瘤病毒（HaMuSV），小鼠乳腺肿瘤病毒（MuMTV），长臂猿白血病病毒（GaLV），猫白血病病毒（FLV），泡沫病毒，Friend病毒，鼠干细胞病毒（MSCV）和劳氏肉瘤病毒（RSV））。本发明的“逆转录病毒”还包括人T细胞白血病病毒，HTLV-1和HTLV-2，逆转录病毒的慢病毒家族，如人类免疫缺陷病毒，HIV-1，HIV-2，猴免疫缺陷病毒（SIV），猫科动物免疫缺陷病毒（FIV），马免疫缺陷病毒（EIV），其他类别的逆转录病毒。

逆转录病毒为在它们的复制循环中使用逆转录酶的RNA病毒。逆转录基因组RNA可通过逆转录酶转换为双链DNA。此双链DNA形式的病毒能够整合到被感染细胞的染色体内；一旦整合，它被称为“前病毒”。前病毒起到RNA合成酶II模板的作用并指导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。

在前病毒每一末端是称为“长末端重复序列”或“LTR”的结构。术语“长末端重复序列（LTR）”指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的域，在其天然序列背景下直接重复并包含U3，R和U5区。LTRs主要提供逆转录病毒基因表达以及病毒复制的基础功能（例如基因转录本的启动，起始和多聚腺苷酸化）。LTR包含大量调节信号，包括转录调控元件，多聚腺苷酸化信号和病毒基因组复制与整合所需的序列。病毒LTR分为3个区，称为U3，R和U5。U3区包含增强子和启动子元件。U5区为在引物结合位点和R区之间的序列，包含多聚腺苷酸化序列。R（重复）区侧翼为U3和U5区。LTR由U3，R，和U5区组成，出现在病毒基因组的5'和3'端。在本发明的一个实施方案中，LTR，包括5'LTR，内部的启动子，被异源的启动子所置换。可用的异源启动子的实例包括，例如，巨细胞病毒（CMV）启动子。

术语“慢病毒”指一组（或类）引起缓慢发展疾病的逆转录病毒。该组内包括的病毒包括HIV（人类免疫缺陷病毒，包括HIV1型，HIV2型病毒），获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原物；梅迪病毒，引起绵羊的脑炎（绵羊脱髓鞘性脑白质炎）或肺炎（maedi），山羊关节炎脑炎病毒，导致山羊的免疫缺陷，关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，导致马的自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒（FIV），导致猫的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒（BIV），导致牛淋巴结肿大，淋巴细胞增多，以及可能的中枢神经系统感染；以及猴免疫缺陷病毒（SIV），导致亚人类灵长类动物的免疫缺陷病和脑病。这些病毒引起的疾病特点是潜伏期长，病程拖延。通常情况下，这些病毒潜伏感染单核细胞和巨噬细胞，由此传播到其他细胞。HIV，FIV，SIV也容易感染T淋巴细胞（即T细胞）。

术语“杂合体”指包含慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列的载体，LTR或其他核酸。

术语“载体”或“转化载体”指能够运送与其连接的另一种核酸的核酸分子。术语“表达载体”包括任意载体（例如，质粒，粘粒，或噬菌体染色体），其包含适宜被细胞表达的形式的基因结构（例如，连接到启动子上）。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的一种常见的被使用的形式。而且，本发明也意图包括行使同等功能的其他载体。

术语“病毒载体”指包含主要从病毒衍生来的结构和功能上的遗传元件的载体。

术语“逆转录病毒载体”指包含主要从逆转录病毒衍生来的结构和功能上的遗传元件的载体。

术语“慢病毒载体”指包含主要从慢病毒衍生来的结构和功能上的遗传元件的载体。

术语“自我失活载体”（SIN载体）指一些载体，例如，逆转录或慢病毒载体，其中被称为U3区的右侧（3'）LTR增强子-启动子区已经被修饰（例如，通过缺失或重组）来阻止第一轮病毒复制以外的病毒转录。此后，载体只能够感染并接着整合到宿主基因组一次，并且不能够继续传代。这是因为病毒复制时右侧（3'）LTR的U3区作为左侧（5'）LTR的U3区的模板，并且这样一来，病毒转录本在缺乏U3增强子-启动子的情况下不能产生。如果病毒转录本不能产生，它就无法进行后续过程或包装成病毒颗粒，这样病毒的生命周期就结束了。因此，SIN载体极大地降低了产生不期望的复制能力强的病毒的风险，因为右侧（3'）LTR的U3区经过修饰来阻止第一轮复制以外的病毒转录，这样就消除了病毒传代的能力。

术语“TAR”指位于慢病毒（例如HIV）的LTR的R区内的“反向激活应答”遗传元件。这个因子与慢病毒反向激活子（tat）遗传元件相互作用来增强病毒的复制。

术语“R区”指位于逆转录病毒的LTR内，从盖帽基团（例如，转录本开始的位置）开始的位置开始，在polyA序列开始之前的位置立刻结束的区域。R区被定义为位于U3区和U5区中间的区域。R区在逆转录时允许新产生的DNA从基因组的一端转移到另一端的转移中起到重要作用。

术语“转导”指将外源DNA引进到真核细胞中。转导可以通过技术上广泛使用的多种手段完成，包括但不限于磷酸钙-DNA-共沉淀法，DEAE-葡聚糖介导转导法，聚凝胺介导的转导，电穿孔，显微注射，脂质体融合，脂质体转导，原生质体融合，逆转录病毒感染，基因枪法。

术语“转导”指使用病毒或逆转录病毒载体，通过病毒感染而不是转导的方式，将基因或其他多核苷酸序列导入。在优选的实施方案中，逆转录载体通过在与细胞接触之前，将载体包装到病毒成熟颗粒中来转导。例如，由逆转录病毒载体携带的抗-HIV基因可通过感染和前病毒整合被转导到细胞中。在某些实施方案中，细胞为“被转导的”，如果其包含一种通过病毒或逆转录病毒载体感染导入细胞的基因或其他多核苷酸序列。在具体实施方案中，转导的细胞包含通过病毒或逆转录病毒载体感染导入细胞基因组的基因或其他多核苷酸序列。

术语“启动子/增强子”指一种DNA片段，包含能够提供启动子和增强子功能的序列。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含了启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源性”或“外源性”或者“异源性”的。“内源性”增强子/启动天然地在基因组中与给定的基因相连接。“外源性”或者“异源性”增强子/启动子是通过遗传操作（即，分子生物学技术）被放置在某种基因的并置位置，使得该基因的转录通过该连接的增强子/启动子来指导。

在真核细胞中高效表达重组DNA序列需要表达指导所得到的转录本的有效终止和多聚腺苷酸化的信号。转录终止信号通常在聚腺苷酸化信号的下游被发现。这里所用的术语“poly A位点”或“poly A序列”，表示引导新生RNA转录本终止和多聚腺苷酸化的DNA序列。高效的多聚腺苷酸化的重组转录本是需要的，因为缺乏poly A尾的转录本不稳定的并迅速退化。在表达载体中使用的Poly A信号为“异源性”或“内源性”。一种内源性polyA信号被发现天然存在于某一给定的基因组中基因的编码区的3'末端。异源poly A信号为从一种基因分离出来并置于另一基因的3'末端。

术语“输出元件”是指一种顺式作用转录后调控元件，调节从细胞核向细胞质的细胞RNA转录物的运输。RNA输出元件的实例包括，但不限于，人类免疫缺陷病毒（HIV）的rev应答元件（RRE）（见例如，Cullen等（1991）病毒学杂志65：1053；和Cullen等（1991）细胞58：423），以及B型肝炎病毒的转录后调控元件（PRE）（见，例如，黄等人（1995）分子和细胞生物学，15（7）：3864；黄等人（1994）病毒学杂志68（5）：3193；黄等人（1993）分子和细胞生物学，3（12）：7476），和美国专利第5744326号）。通常，RNA输出元件被放置于一个基因的3'端非编码区，并可以插入一个或多个副本。RNA输出元件可以插入任意或所有到独立的载体，产生本发明的包装细胞系。

如本文所用，术语“包装细胞系”是指不含有包装信号，但稳定或瞬时表达病毒结构蛋白和复制酶（例如，gag，pol和env）的细胞系，这是正确包装病毒颗粒所必须的。

短语“逆转录病毒包装细胞系”指的是其中包含必要的编码序列，以产生其中缺乏能力包装RNA的病毒颗粒，并产生有复制能力的辅助病毒的细胞系（典型情况为哺乳动物细胞系）。当细胞系提供包装功能时（例如，在反式方式质粒载体中），包装细胞系产生重组逆转录病毒，从而成为一个“逆转录病毒产生者细胞系”。

本文所用的术语“核酸框”是指载体内的基因序列可以表达RNA，以及下一步的蛋白质。核酸框包含目的基因。核酸框位置固定地并从而定位于载体内部，这样一来框内核酸可被转录成RNA，并在必要时，翻译成蛋白质或多肽，经过在转化的细胞内活性所需的适当的翻译后修饰，并为了生物活性，通过以合适的细胞内的区室或分泌到细胞外的区室为目标，被转运到合适的区室。优选地，框有它的适于准备插入到载体中的3'和5'端，例如，它在每个末端具有限制性内切酶位点。在本发明的一个优选实施方案中，核酸框含有一种用于治疗血红蛋白病情况的治疗基因的序列。核酸框可以被删除，以及插入到载体或质粒中作为单个单元。

如本文所述，术语“目的基因”是指插入表达载体的多位点接头的基因。在某些实施方案中，目的基因编码的多肽在治疗中具有治疗功能或者预防某种疾病或病症，其可以称为“治疗性多肽，”在一个实施方案中，目的基因编码的基因提供了用于治疗血红蛋白病的治疗功能。目的基因，以及由其编码的多肽，包括野生型基因和多肽，以及其功能性变体和片段。在具体的实施方案中，具有功能的变体具有至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％与相应的野生型参照的多核苷酸或多肽序列具有同一性。在某些实施方案中，功能性变体或片段具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％的一个相应的野生型多肽的生物学活性。

描述“序列同一性”或者，例如，包含“50％相同的序列”，如本文所述，指序列在每个核苷酸的基础上或每个氨基酸的基础上，比较比对框相似的程度上。因此，“序列相似百分数”可以通过从比对框比较两个最佳序列计算出来，确定两个序列中相同的核酸碱基位置的数量（例如，A，T，C，G，I）或者相同的氨基酸残基（例如，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸和蛋氨酸），得到匹配的位置的数量，将匹配位置数除以比对框中的位置的总数（即，框的大小），将结果乘以100，得到序列相似性的百分比。包含的核苷酸和多肽具有至少与本文所述的（详见，例如，序列表）的任意参照序列相比约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或100％的序列相似性，通常，其中的多肽的变体维持至少一种参照多肽的生物活性。

用来描述两个或更多的多核苷酸或多肽序列之间的关系的术语包括“参照序列”，“比对框”，“序列相似性”，“序列相似性的百分比”和“高度相似性”。“参考序列”是至少12个，但常常为15个至18个，并且通常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基的长度。由于两条多核苷酸可以每一个都包括（1）两条多核苷酸之间很相似的序列（即，只是完整的多核苷酸序列的一部分），和（2）两条多核苷酸之间的序列的变体，在两条多核苷酸（或更多）之间代表性地在“比对框“比对两条多核苷酸序列，来鉴定和比较局部区域的序列相似性。“比对框”指至少6个连续位置的片段，通常约50至约100，更通常约100-约150，优选比对在两条序列后邻近位置数目相同的该序列与参照序列。与两条序列优选比对的参考序列（不包括添加或删除）相比，比对框可以包括约20％或更少的添加或缺失（即，间隙）。为了比对比对框的优选的序列比对可由电脑控制的算法实施进行（威斯康星遗传学软件包7.0版中的GAP，BESTFIT，FASTA，以及TFASTA，遗传学计算机小组，575Science Drive Madison,威斯康星，美国）或者进行检查和任何选择的多种方法所产生的最优比对（即，在比对框中最高百分比的同源性）。参照序列还可以加入程序的BLAST家族，作为由Altschul等，1997年，核酸研究25:3389公布的实例。序列分析的详细讨论可以参见Ausubel等，“当代分子生物学研究方法”，John Wiley&Sons Inc，1994-1998年，第15章的19.3单元。

本文所述的术语“启动子”是指RNA聚合酶结合到DNA链的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合物起始和驱动转录活性。复合物可以通过激活称为“增强子”的序列或被称为“沉默子”的抑制序列进行修饰。

如本文所述，术语“顺式”是指在同一染色体上的基因存在的情况下使用。术语“顺式作用”指存在于同一染色体上的基因上的调节基因的控制效果。例如，启动子，影响下游的mRNA的合成的顺式作用的控制元件。

本文所述的术语“自杀基因”用来定义任意基因，其表达对表达自杀基因的细胞有致命作用的产物。在一个实施方案中，自杀基因对本发明的载体上的目的基因具有顺式作用，自杀基因的例子在本技术领域中是已知的，包括HSV胸苷激酶（HSV-Tk）。

术语“可操作地连接”，指并列位置，其中描述的组件的关系允许它们以其拟定的方式发挥功能。在一个实施方案中，该术语指在核酸表达调控序列（如启动子，或一系列转录因子结合位点）和第二条核酸序列之间的功能性连接，其中表达调控序列驱动对应于第二条序列的核酸的转录。

术语“假型”或“假型化”，如本文所述，指病毒包膜蛋白被另一种病毒的具有优选的特性的病毒包膜蛋白所取代的病毒。例如，HIV可以被疱疹性口炎病毒G蛋白（VSV-G）的包膜蛋白假型化，使艾滋病毒能够感染更广泛的范围的细胞，因为艾滋病毒的包膜蛋白（由env基因编码）通常使病毒针对呈现CD4+的细胞。在本发明的一个优选实施方案中，慢病毒包膜蛋白被VSV-G假型化。

如本文所述，术语“包装”是指将病毒基因组螯合（或包装）进入蛋白质衣壳内的过程，由此形成病毒成熟颗粒。这个过程也被称为壳体化。如本文所述，术语“包装信号”或“包装序列”是指对于将病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒内所必需的位于基因组内的逆转录病毒的序列。一些逆转录病毒载体使用使病毒基因组壳体化所需的最小包装信号（也称为psi[ψ]序列）。因此，如本文所述，术语“包装序列”，“包装信号”，“psi”和符号“ψ”用于指病毒颗粒的形成过程中，逆转录病毒的RNA链壳体化的所需的非编码序列。

如本文所述，术语“复制缺陷型”指的是不能够完整地，有效地复制，使得不能产生感染性病毒成熟颗粒的病毒（例如复制缺陷型慢病毒子代）。术语“有复制能力”是指野生型病毒株或突变病毒能够复制，使得病毒复制的病毒能够产生感染性的病毒颗粒（例如，有复制能力的慢病毒子代）。

如本文所述，术语“并入”是指，载体（例如DNA或RNA）吸收或转化到细胞内，使得该载体可以在该细胞内表达治疗基因的产物。并入可能涉及，但并不要求，DNA表达载体的整合，或DNA表达载体的游离型复制。

如本文所述，术语“红细胞特定表达”或“红血细胞特异性表达”是指基因的表达只发生在红细胞或红血细胞（红细胞）内，本文中可互换使用。

术语“基因传递”或“基因转化”是指可靠地将外源DNA插入靶细胞，例如肌细胞的方法或系统。这种方法可能会导致瞬时或长期基因表达。基因转化提供了一种独特的获得性和遗传性疾病的治疗方法。许多系统已被开发用于哺乳动物细胞中的基因转化。例如，参见美国专利第5399346号。本发明的慢病毒载体经过优化，在几乎所有的循环红血细胞中表达治疗水平的抗镰刀形蛋白。

术语“干细胞”是指从祖细胞衍生的多能细胞。干细胞是通过其自我更新能力定义的。干细胞包括，例如，胚胎干细胞和成体干细胞。造血干细胞可以产生任何造血细胞系的子代细胞。具有长期造血重建能力的干细胞，可以通过一些物理和生物特性与分化的细胞和祖细胞相区分（详见，例如，Hodgson,G.S.与Bradley,T.R.，天然，第281卷，第381-382页；Visser等，医学：研究与实验，第59卷，第1576-1590页，1984年；Spangrude等，科学，第241卷，第58-62页，1988年；Szilvassy等，血液，第74卷，第930-939页，1989年；Ploemacher，R.E.与Brons，R.H.C.，实验血液学，第17卷，第263-266页，1989年）。某些造血干细胞具有在移植受体中提供长期重建造血细胞群的能力。多能细胞具有分化成两种或更多种不同的细胞的能力。

如本文所述，术语“先祖细胞”或“祖细胞”是指分化的细胞前体的细胞。许多祖细胞沿由单一细胞系分化，但可能具有很高的增殖能力。祖细胞的例子包括，但并不限于，造血祖细胞，骨髓祖细胞，淋巴祖细胞。造血祖细胞不会自我更新，但有能力在移植受体中提供瞬态或短期的造血细胞群重组。

本文使用的术语“珠蛋白”指所有的能够共价或非共价地与血红素结合的蛋白质或蛋白质亚基，因而可以运输或存放氧气。脊椎动物和无脊椎动物血红蛋白的亚基，脊椎动物和无脊椎动物的肌红蛋白或其突变体因而也包括在球蛋白范畴内。球蛋白的实例包括β-珠蛋白或其变体，β-珠蛋白或变体，β-珠蛋白或其变体，以及β-珠蛋白。

如本文所述，“造血作用”，指从祖细胞来源的血细胞的形成和发展，以及形成从干细胞来源的祖细胞。血细胞包括但不限于红细胞或红血细胞（RBC），网织红细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，巨核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，B细胞，巨噬细胞，粒细胞，肥大细胞，血小板和白细胞。

如本文所述，术语“血红蛋白病”或“血红蛋白病的病症”包括任意的关于血液中存在不正常的血红蛋白分子的病症。血红蛋白病的实例包括，但不限于，血红蛋白C疾病，血红蛋白镰刀状细胞病（SCD），镰刀状红细胞贫血症和地中海贫血。还包括血液中存在异常血红蛋白的组合（例如，镰刀状细胞/Hb-C病）的血红蛋白病。

在本文中定义的术语“镰刀状红细胞贫血症”或“镰刀状细胞病”包括红血细胞镰刀状化而导致的任何有症状的贫血的病症。镰刀状细胞疾病的表现包括：贫血，疼痛，和/或器官功能不全，例如肾功能衰竭，视网膜病变，暂时性胸部综合征，缺血，阴茎异常勃起和中风等。如本文所用的术语“镰刀状细胞病”指镰刀状红细胞贫血症引起的多种临床问题，尤其是在HbS中镰刀状细胞取代的纯合子的情况。在本文所述的使用术语镰刀状细胞病所指的组成型表现为生长和发育的延迟，严重感染的趋势增加，特别是由于肺炎双球菌引起的脾脏功能显著受损，阻止了有效地清除血液循环中的细菌，伴有脾组织的经常性梗塞和最终降解。在术语“镰刀状细胞病”也包括了肌肉骨骼疼痛的暂时性发作，主要影响腰椎，腹部，股骨干，具有类似的机制和严重程度的弯曲。在成年人中，这种病情发作通常表现为轻度或中度持续时间短的发作，每隔几周或几个月内分散地引起痛苦的发作，持续5至7天，并平均每年停止发作一次。已知引发此危机的这些事件为酸中毒，缺氧和脱水，这些都增强了细胞内HBS的聚合（J.H.Jandl，血液：血液学教材，第二版，Little,Brown and Company，波士顿，1996年，第544-545页）。如本文所述，术语“地中海贫血”包括由于突变影响了血红蛋白的合成而发生的遗传性贫血症。因此，术语包括任何由地中海贫血导致的有症状的贫血的病症，例如严重型或beta-地中海贫血，重型地中海贫血，中间型地中海贫血，α-地中海贫血如血红蛋白H病。

如本文所述，“地中海贫血”指遗传性病症，其特征在于血红蛋白的产生有缺陷。地中海贫血的实例包括α和β地中海贫血。β地中海贫血是由β珠蛋白链中的突变引起，可通过重型或轻型的形式发生。在β地中海贫血的重型形式中，患儿出生时是正常的，但在一岁时产生贫血。产生小的红血细胞的β地中海贫血的轻型形式，是由一种由珠蛋白链的一个基因或多个基因缺失引起的地中海贫血。

如本文所述，“抗镰刀化蛋白质”包括在镰刀状细胞的情况下阻止或逆转导致红细胞镰刀状化的病理事件的蛋白质。在本发明的一个实施方案中，本发明的转导的细胞用于在血红蛋白病的条件下给受体提供抗镰刀化蛋白质。抗镰刀化蛋白质还包括突变的β-珠蛋白基因，包含抗镰刀化的氨基酸残基。

如本文所述，术语“绝缘子”或“绝缘子元件”，本文中可互换使用，指可以被添加到本发明的载体的外源DNA序列，以防止载体受到整合的反式基因（S）的影响表达，整合到宿主基因组中，附近的基因组序列。相反，绝缘子元件防止整合的载体受到附近的基因组序列的影响表达。这通常通过载体整合到基因组中时绝缘子被复制来实现，这样绝缘子位于整合载体侧翼（例如，LTR区域内），并发挥“绝缘”整合的DNA序列作用。在本发明中使用的合适的绝缘子包括，但不限于，鸡β-珠蛋白绝缘子（见Chung等人（1993年）细胞74:505；Chung等人，PNAS（1997年）94:575；Bell等，细胞1999年98:387，并入本文参考文献）。绝缘子元件的例子包括，但不限于，β-珠蛋白基因位点绝缘子，如鸡HS4的绝缘子。

本文中，除非上下文清楚说明，否则，“治疗”等类似的词语，如“被治疗”，“进行治疗”等，表示为了获得有益的或期望的结果的方法，包括优选的临床效果。治疗可包括任选的降低或改善疾病或病症的症状，或延迟疾病或病症的进展。

如本文所述，除非本文定义另有说明，“防止”，以及类似的词语，如“阻止”，“预防”等，表示预防，抑制或减少疾病或病症发生或复发的可能性的方法。它也指延迟疾病或病症的发作或复发的或延迟的疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所述，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症的发病或复发前，减少疾病或病症的强度，作用，症状和/或负担。

如本文所用，试剂或物质的“有效剂量”或“治疗有效剂量”是，影响所需的生物效应的足够量，如有益的结果，包括临床结果。

本文所述的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，涂层，抗菌和抗真菌试剂，等渗和吸收延迟剂等等在生理上相容的。在一个实施方案中，载体适合于肠胃外给药。优选地，载体适合于进入受影响的关节直接给药。载体可适于静脉内，腹腔内或肌肉内给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或混悬液以及临时配制成无菌注射溶液或混悬液的无菌粉末。为了药物活性物质使用这些介质和试剂在本技术领域中是众所周知的。除了任何与转导的细胞不相容的常规介质或试剂，使用其在本发明期望使用的药物组合物。

在下面的描述中，设定某些特定的细节，以提供本发明各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员会理解没有这些细节也可实施本发明。

除非上下文另有所指，在全部的本说明书和权利要求书中，词语“包含”和其变体，如“包含”和“包含”可被解释为开放的，具有包容性的意义，即“包括，但不限于”如本文所述，术语”包括“和”包含“是同义的。

在整个说明书中引用的“一个实施方案”或“实施方案”指结合该实施方案中所描述的特定特征，结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在全部的本说明书中多个地方无需为相同的实施方案。此外，特定的特征，结构或特性可以任何适当方式，被组合在一个或多个实施方案中。

在本说明书中，任何浓度范围，百分比的范围，比率的范围，或者包括列举的范围内的任一整数的值的整数范围，以及，在适当的时候，它们的分数（例如某整数的十分之一和百分之一），除非另有说明。此外，此处所述的与任意物理特征有关的任意数量范围，例如多肽或多核苷酸的长度，应理解为包括列举的范围之内的任一整数，除非另有说明。

如本文所述，“约”指±20％的指定范围内的值，或结构，除非另有说明。但应当理解的是，本文使用的术语“一个（a）”和“一个（an）”指“一个或多个”列举的组件。

使用替代的（例如，“或”）应理解为指任何一个，两个，或其替代品的任意组合。如本文所述，术语“包括”和“包含”是同义的。

此外，应当理解的是，单独的载体，或一组载体，是来自于本文所述的结构和取代物的多种组合物，与本申请具有相同的公开的程度，如果每个载体或每组载体被分别设定。因此，选择特定的载体结构或特定的取代物是在本公开的范围之内。

产生和选择转导的细胞的方法，以及通过转导的细胞和向需要的个体递 送治疗性多肽在移植受体中增强细胞群的重建的相关方法

本发明的某些方面来自于非预想发现，即以嘌呤霉素为基础的选择系统能够有效地选择包括转导的干细胞在内的转导多能细胞，同时保持足够程度的多能细胞的质量和可植入能力。此发现的一个重要方面是确定适当的嘌呤霉素浓度和适当的时间长度，以使细胞暴露在嘌呤霉素中，从而消耗未转导的细胞减少，而转导的多能细胞维持其多能性和可植入能力。例如，在某些情况下，根据本发明的方法选择的嘌呤霉素选择的转导的造血干细胞能够重建被移植所述细胞的移植受体的造血细胞。这种重建可能为长期的重建。

因此，本发明提供了选择转导的多能细胞，包括干细胞，的新方法，以及在产生转导的多能细胞和富含转导的多能细胞的细胞群中使用嘌呤霉素选择。虽然本文提供的描述和实施方案集中在多能细胞的转导和选择，尤其是包括造血干细胞，本发明的方法和转化载体也可用于转导和选择其他类型的细胞，包括之前不受用于治疗用途的转导的细胞选择影响的其他类型的多能或干细胞以及脆弱的细胞。这类细胞可包括，但不限于，胚胎干细胞，诱导式多能性干细胞和成体干细胞，包括造血干细胞，脂肪组织来源的干细胞，脐带基质干细胞。根据本发明的方法使用的细胞可从任何动物获取，优选哺乳动物，更优选人类，它们可被移植到任意动物，优选哺乳动物，更优选人类。

图3提供的示意图描述了本发明在对受体移植之前选择转导的细胞的一个过程。转导的细胞被移植到受体中，在此转导的多能细胞在免于与未经转导的细胞竞争下生长并最终在受体内重建成细胞群。

在一个实施方案中，本发明提供了选择转导多能细胞的方法，其中可能包括干细胞，所述方法包括使包含多能细胞，包括干细胞，的第一细胞群接触1-25μg/ml嘌呤霉素四天或更短，其中所述第一细胞群预先接触转化载体，所述转化载体含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列，从而产生包含转导的多能细胞，包括转导的干细胞，的第二细胞群。在特定实施方案中，第一细胞群在足以容纳细胞被转化载体转导或者多核苷酸序列整合到细胞的基因组中的足够长的时间和条件下与转化载体相接触。

上述选择转导的细胞的方法可用于产生转导的多能细胞，包括转导的干细胞。因此，在相关的实施方案中，本发明提供了产生转导的多能细胞的方法，包含：（i）使包含多能细胞，包括干细胞，的第一细胞群，接触含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽多核苷酸序列的转化载体，由此产生包含含有所述转化载体的多能细胞，包括干细胞，的第二细胞群；及（ii）使第二细胞群接触1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短，从而产生第三细胞群，所述第三细胞群含有与所述第二细胞相比之下较高百分比的转导的多能细胞。在特定实施方案中，第一细胞群在足以容纳细胞被转化载体转导或者多核苷酸序列整合到细胞的基因组中的足够长的时间和条件下与转化载体相接触。

在本发明的任一嘌呤霉素选择的方法的特定实施方案中，在嘌呤霉素选择之后，至少50％，至少55％，至少60％，至少65，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，或至少90％的剩余的细胞（例如，第三细胞群）被转导。在某些实施方案中，第三细胞群中至少有75％的细胞被转导。

上述的方法提供的包含转导的多能细胞，包括转导的干细胞，的细胞群可用于在移植受体中重组细胞群。因此，在特定的实施方案中，本发明包括使用细胞群中转导的干细胞在个体内增强重建的方法，包含产生上述的转导干细胞和将多个第三细胞群移植到所述个体内。

在特定的实施方案中，第三细胞群中转导的多能细胞，在将第三细胞群移植到所述个体内之后，能够产生至少两个不同的细胞系含有转化载体至少四个月，至少六个月，或至少十二个月，虽然并非在移植到所述个体内之后必定立即发生。已知产生至少两个不同的细胞系可能不会立即发生，即，可能会存在一个滞后期，然而，在特定实施方案中，在将第三细胞群移植到所述个体内之后的24个月，28个月，36个月或48个月内，至少四个月，至少六个月，或至少十二个月的时期立刻开始。

根据本发明的方法产生的转导的细胞可用于治疗，例如，它们可能会被植入到有需要的个体中。例如，表达治疗性多肽的转导的细胞可能被移植到治疗性多肽表达量减少的或表达治疗性多肽突变形式的受体个体中。因此，在某些实例中，被转导的细胞是从需要移植转导的干细胞的个体中获取（自体移植）。在其他实例中，将被转导的细胞从另一供体获取，其与需要被移植转导干细胞的个体组织匹配（同种异体移植）。

细胞可通过使用在本领域中已知和可用的方法从供体中多种不同的来源获得。例如，造血细胞，包括造血干细胞（HSC），可通过用针管从骨髓中取得，外周血细胞可以通过血细胞分离获得，以及在新生儿出生后从脐带血液中过滤细胞。细胞可使用常规技术从其他组织成分如脂肪和细胞外基质纯化，产生可能含有干细胞的细胞群。

多能细胞，包括干细胞，可以在转导前从细胞群中选择或富集。例如，干细胞，可以根据其干细胞相关的至少一个标志物的表达或通过物理分离装置选择。与干细胞相关的标志物的例子包括CD34，Thy-1和rho。表达这些标志物的细胞可通过各种手段从细胞群内纯化或富集，其中包括使用一种或多种标志物的特异性抗体的荧光激活细胞分选（FACS）。在特定实施方案中，在转导前从供体获得的细胞群富集CD34⁺细胞，或从其他细胞纯化CD34⁺细胞。

细胞转导通过使用能够表达嘌呤霉素抗性多肽的转化载体进行，包括下文描述的任意转化载体。因此，转化载体包含编码的嘌呤霉素抗性抗多肽的多核苷酸序列，这种多肽可以是任意在表达它的细胞中具有嘌呤霉素抗性的多肽。编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC）的pac基因已经从链霉菌属产生菌株中分离出来。（de la Luna,S.和Ortin,J.（1992年）.酶分子方法.216:376-385；de la Luna,S.,等人（1988年）.基因62:121-126）。它位于与决定了嘌呤霉素生物合成途径的其他基因相连接的pur簇的区域。pac基因表达向表达它的转导的哺乳动物细胞赋予了嘌呤霉素抗性。然而，外源DNA，如细菌来源的嘌呤霉素抗性基因，不适合在哺乳动物的细胞中表达。首先，细菌中密码子的使用和哺乳动物中密码子的使用是非常不同的。此外，在CpG二核苷酸的外源（细菌）DNA组合物和哺乳动物DNA的CpG分布是非常不同的。这种差异引起了负面影响基因表达的两种现象：哺乳动物免疫系统认为细菌DNA为外源的，以及在CpG的胞嘧啶残基处的甲基化，这导致基因沉默。因此，为了避免在转化载体中pac基因沉默，可根据本发明在转化载体中使用经修饰的pac基因。在某些实施方案中，经修饰的pac基因为适于在哺乳动物中表达的密码子优化的和/或部分或全部CpG功能域已被删除。在特定的实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列只包含pac基因或经修饰的pac基因的编码区。在某些实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列具有列于SEQ ID NO：1的核酸序列。在某些实施方案中，嘌呤霉素抗性多肽具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。本发明还包括此嘌呤霉素抗性多肽的任意的功能性片段或变体的使用。

在特定的实施方案中，表达嘌呤霉素抗性多肽的转化载体为逆转录病毒载体，例如，慢病毒载体，如HIV载体。慢病毒感染相较于其他的转导方法有几个优点，包括高效率感染分裂中和非分裂中的细胞，长期的稳定的转基因表达，以及低免疫原性。根据本发明可使用上文所述的多种转化载体。

可以使用传统的技术产生感染性的病毒颗粒和病毒储液。制备病毒储液的方法在本技术领域中是已知的，并示于例如，Y.Soneoka等人（1995年）核酸研究23:628-633，以及N.R.Landau等人（1992年）病毒学杂志66:5110-5113。例如，可以通过使用包装细胞系或转化载体与产生在包装和产生感染性病毒颗粒中使用的病毒蛋白的质粒一起瞬时转导来产生病毒颗粒。合适的包装细胞系的实施方案已有描述，例如，在美国专利第6958226号，6620595号，5739018号，5686279号和5591624号中。在特定的实施方案中，可能通过在产病毒细胞中共表达病毒粒子的包装元件和转化载体来产生HIV1型（HIV-1）为基础的病毒颗粒。这些细胞可被一些质粒瞬时转导。通常，使用3至4种质粒，但根据慢病毒组件被分解成单独的单元的程度，数目可能更大。例如，一个质粒可编码来自HIV-1的病毒粒子的核心和酶的组成部分。该质粒被称为包装质粒。另一种质粒通常编码包膜蛋白（多种蛋白），最常见为疱疹性口炎病毒G蛋白（VSV G），由于其高稳定性和广泛的趋向性。该质粒可被称为包膜表达质粒。然而，另一种编码被转移到靶细胞的基因组的质粒，即，载体本身，被称为转化载体。在存在适当药物的情况下选择和克隆分离之后，包装质粒可以通过已知的技术，包括磷酸钙转导，脂质体转导法或电穿孔法导入到人类细胞系中，一般连同显性选择标记，如新霉素，DHFR（二氢叶酸还原酶），谷氨酰胺合成酶，或ADA。选择标记基因可以与构建体中的包装基因物理地连接上。可以使用这种技术制造每毫升的几百万转导单位（TU/ml）的滴度的重组病毒，以及其变体。超速离心后可以得到约10⁹TU/ml的浓储液。

在一个根据本发明的示例性慢病毒的浓储液制造方法中，使用转化载体和表达产生病毒颗粒所必需的病毒蛋白（或其衍生物）的其它载体转导慢病毒容纳细胞（此处称为产生细胞）。然后细胞在适当的细胞培养条件下生长，并且从细胞本身，或从上述的细胞培养基中收集慢病毒颗粒。合适的产生细胞系包括，但不限于，人胚胎肾细胞系293和293T，马真皮细胞系NBL-6，和犬胎儿胸腺细胞Cf2TH。这种多质粒病毒包装系统的实施方案在美国专利第5994136号，6924144号，7250299号，6790641号，和6013516号中有描述。

可以用常规技术从包装细胞收集感染性病毒颗粒。例如，感染性颗粒可以通过细胞裂解或细胞培养物的上清液收集，如本技术领域中已知的。可选地，在需要的情况下，所收集的病毒颗粒可以进行纯化。合适的纯化技术是本领域技术人员已知的。

可以根据本发明的某些实施方案使用的，在基因治疗中有关使用病毒载体的其他方法，可以在下文中找到，例如，.,Kay,M.A.（1997年）Chest111（6增刊）：138S-142S；，Ferry,N和Heard,J.M.（1998年）人类基因治疗9:1975-81;Shiratory，Y.等人（1999年）肝19:265-74；Oka,K.等人。（2000年）脂类学最新视点11:179-86；Thule,P.M.与Liu,J.M.（2000年）基因治疗。7:1744-52；Yang,N.S（1992年）生物技术评价综述12:335-56；Alt,M.（1995年）肝脏病杂志。23:746-58；Brody,S.L.与Crystal,R.G.（1994年）纽约州学术科学年鉴。716:90-101；;Strayer,D.S.（1999年）专家意见药物研究8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.与Bartlett,J.S.（2001年）最新心脏病学报道3:43-49；和Lee,H.C.等人（2000年）天然408:483-8。

病毒可被用来使用在本领域中已知的标准转导技术离体或在体外感染细胞，例如，当细胞例如CD34⁺细胞，树突状细胞，外周血细胞或肿瘤细胞，被离体转导时，载体颗粒可与细胞一起孵育，使用通常量级为在1至50之间的多重性感染（MOI）的剂量，这对应于每10⁵个细胞中1×10⁵至50×10⁵病毒载体的转导单位。当然，这包括对应于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50MOI的载体数量。通常，载体的量可以表示为HEK293，HEK293T，NIH3T3细胞或HeLa细胞转导单位（TU）。

一旦细胞被病毒感染，被转化载体转导和表达嘌呤霉素抗性基因的细胞通过与嘌呤霉素或功能性片段或衍生物接触来选择。嘌呤霉素可商购的，例如，Clontech（Mountain View，加利福尼亚州）。在特定实施方案中，使细胞接触嘌呤霉素5天或以下，4天或以下，3天或以下，2天或以下，或1天或以下。在具体的实施方案中，细胞接触嘌呤霉素12-24小时，12-36小时，12-48小时，或24至48小时。典型地，这表明将细胞持续暴露在嘌呤霉素下的连续小时数或天数。在特定的实施方案中，细胞接触浓度在1-25μg/ml的范围内的嘌呤霉素，1-20μg/ml，1-10μg/ml，或约2μg/ml，约3μg/ml，约4μg/ml，约5μg/ml，约6μg/ml，约7μg/ml，约8μg/ml，约9μg/ml，或约10μg/ml浓度的嘌呤霉素。正如附加的实施例所证明的，用低至5μg/ml的嘌呤霉素处理短至24小时的时间，导致了转导的细胞的显著选择和富集。

在嘌呤霉素选择之前，期间和/或之后，细胞可以在适于细胞的维持，生长或增殖的介质中培养。合适的培养基和条件在本技术领域中是已知的。在嘌呤霉素选择后，被选择的细胞可在适于维持，生长或增殖的条件下培养。在特定的实施方案中，所选择的细胞在移植前培养约7至约14天。

对嘌呤霉素选择的细胞进行分析，以确定它们是否已成功地被转化载体转导。在某些实施方案中，转化载体的存在可以使用特异性地扩增不存在于未转导的细胞中的转化载体区域的引物通过聚合酶链式反应（PCR）来判断。例如，可以对单个菌落或克隆细胞群进行PCR分析。在特定的实施方案中，嘌呤霉素选择导致了转导的细胞在获得的被选择的细胞群中富集。在某些实施方案中，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的细胞被转化载体转导。在特定的实施方案中，这代表了富集了至少两倍，至少三倍，至少四倍，或者至少五倍的转导的细胞。

转导的细胞的嘌呤霉素选择过程中或之后，所选择的细胞可在促进干细胞或多能细胞增殖的条件下进行培养。本技术领域中已知的任意方法都可以被使用。在某些实施方案中，选择过程中或之后，细胞可在具有促进干细胞或多能细胞增殖的一种或多种小分子条件下进行培养。此类分子的实例包括，但不限于，SR1，拮抗芳香烃受体和丙戊酸。在其它实施方案中，选择过程中或之后，细胞可在具有促进干细胞或多能细胞增殖的一种或多种生长因子条件下进行培养。促进干细胞或多能细胞增殖的生长因子的实例包括，但不限于，胚胎肝酪氨酸激酶（Flt3）配体，干细胞因子，白细胞介素6和11，均已证明促进小鼠造血干细胞自我更新。其他包括Sonic hedgehog，通过激活骨形态发生蛋白4诱导原始造血祖细胞的增殖；Wnt3a，刺激造血干细胞的自我更新；脑源性神经营养因子（BDNF），表皮生长因子（EGF），成纤维细胞生长因子（FGF），睫状神经营养因子（CNF），转化生长因子-β（TGF-β），成纤维细胞生长因子（FGF，例如，基本FGF，酸性FGF，FGF-17，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-8b，FGF-8c，FGF-9），粒细胞集落刺激因子（GCSF），血小板衍生生长因子（PDGF，例如，PDGFAA，PDGFAB，PDGFBB），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF），干细胞因子（SCF）基质细胞衍生因子（SCDF），胰岛素样生长因子（IGF），血小板生成素（TPO）或白细胞介素3（IL-3）。在特定实施方案中，选择过程中或之后，细胞可在具有促进干细胞或多能细胞增殖的一种或多种小分子以及一种或多种生长因子的条件下进行培养。

在某些情况下，可能需要仅在有限的时间段内表达嘌呤霉素抗性多肽，例如，在嘌呤霉素选择过程中。因此，在某些实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸可操作地连接到瞬时诱导型启动子，使嘌呤霉素抗性多肽的表达可以在转导后开启，例如，嘌呤霉素与细胞接触之前和/或过程中，随后在选择表达嘌呤霉素抗性多肽的细胞后关闭。因此，嘌呤霉素抗性多肽并不会在移植受体中被表达，这应该降低或减轻其表达带来的非预期的效果，例如激活细胞中的内源性致癌基因或对于嘌呤霉素抗性多肽的免疫反应以及相关联的移植受体在建立免疫耐受之前的排斥反应。

多种瞬时诱导启动子的系统在本技术领域中已知并且可用，包括，例如，Cre/loxP系统，例如，两个四环素应答的Tet系统（TET-ON，TET-off），糖皮质激素应答的小鼠乳腺肿瘤病毒启动子（MMTVprom），蜕皮激素诱导型启动子（ECP），和T7启动子/T7的RNA聚合酶系统（T7P）。其中任意一种均可用于启动根据本发明的某些实施方案中的嘌呤霉素抗性基因的诱导表达。

在另一个实施方案中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸可操作地连接到启动子上，与其在分化的细胞中的活性相比，在干细胞或多能细胞中活性更强，因此嘌呤霉素抗性多肽的表达发生在转导的干细胞和多能细胞中，从而促进嘌呤霉素选择，但将转导的细胞移植到受体之后，在从植入的转导的干细胞和多能细胞产生的分化的细胞中，嘌呤霉素抗性多肽的表达减少。在特定的实施方案中，启动子在造血干细胞中的活性比在红血细胞中更高。与分化后的细胞相比，在多能细胞中，例如，干细胞，具有更高活性的多种启动子在本技术领域中已知并且可用。

如上所述，根据本发明的方法产生的转导的细胞，可用于向所需要的个体提供治疗性多肽。因此，转化载体可以包含编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和编码治疗性多肽的多核苷酸序列。在一实施方案中，这些多核苷酸序列中的每个可操作地连接到相同的启动子，但在其它实施方案中，这些多核苷酸序列中的每个可操作地连接到不同的启动子，因此嘌呤霉素抗性基因的表达和治疗性多肽的表达被独立地调节。在特定的实施方案中，一个或两个启动子是组成型启动子，诱导型启动子，或者组织特异型启动子。在某些实施方案中，驱动嘌呤霉素抗性基因表达的启动子为如上所述的诱导型启动子。在某些实施方案中，与至少从这些干细胞或多能细胞分化而来的细胞类型中的活性相比，驱动治疗性多肽表达的启动子在干细胞或多能细胞中活性降低。因此，治疗性多肽的表达可在一种或多种分化的细胞类型中得到增强或限制。在特定的实施方案中，驱动治疗性多肽表达的启动子在一种或多种分化的造血细胞中有活性，例如红细胞。

在一种或多种分化的组织中优先表达的组织特异型启动子在本技术领域中是已知并可用的，包括，例如，人β-珠蛋白启动子。可以通过包括组织特异性增强子元件进一步提高组织特异性。例如，位于小鼠Gata1 IE（第一外显子红细胞）启动子上游的增强子元件，mHS-3.5，可以指导红细胞和巨核细胞表达。

本发明进一步考虑转化载体中包含自杀基因，从而在需要时可使转导的细胞被负向选择。在特定的实施方案中，自杀基因可操作地连接到诱导型启动子。在多种实施方案中，它可操作地连接到组成型启动子。例如，自杀基因可具有组成型活性，并当需要时可使用可操作地连接的诱导型启动子诱导其表达。作为进一步的实例，自杀基因可以分别使用可操作地连接的组成型启动子或诱导型启动子而诱导地被激活或者组成地被表达或诱导被表达。

在特定的实施方案中，本发明的方法利用嘌呤霉素抗性多肽和有条件的自杀基因的表达，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶。因此，在移植受体中可能由载体介导的插入性突变产生的赘生性细胞将能够由化学诱导的细胞自杀（例如，更昔洛韦）治疗。其他条件性自杀基因可用于代替编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因。在特定的实施方案中，嘌呤霉素抗性和条件的细胞自杀蛋白可能通过（ⅰ）多顺反子载体内的内部核糖体进入位点（IRES），（ⅱ）前体蛋白裂解，或（iii）以融合蛋白的形式共表达。

在哺乳动物细胞中表达的组成型启动子在本技术领域中也是已知并可用的，包括，例如，磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子和其衍生物（例如，小鼠PGK启动子），猿猴病毒40早期启动子（SV40），巨细胞病毒瞬时早期启动子（CMV），人泛素C启动子（UBC），人延伸因子1a启动子（EF1A），伴随CMV早期增强子（CAGG）的鸡β-肌动蛋白启动子。

如上所述，本发明的方法可用于产生转导的细胞，其用于将治疗性多肽导入所需的个体中。在特定的实施方案中，这些方法被实施，来对一种或多种类型的能够从转导干细胞或者多能细胞分化而来的细胞提供治疗性多肽。在某些实施方案中，一种或多种细胞类型是造血细胞类型，它包括髓细胞系（单核细胞和巨噬细胞，中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞，巨核细胞/血小板，树突状细胞），淋巴细胞系（T细胞，B-细胞，NK细胞）。

在特定的实施方案中，根据本发明的方法产生的转导的细胞被用于治疗造血系统的疾病或病症，如血红蛋白病，贫血和地中海贫血。如本文所述，术语“血红蛋白病”或“血红蛋白病的病症”包括任何有关在血液中存在不正常的血红蛋白分子的病症。血红蛋白病的例子包括，但不限于，血红蛋白C疾病，血红蛋白镰刀状细胞病（SCD），镰刀状细胞贫血和地中海贫血。还包括血液中存在异常血红蛋白组合的血红蛋白病（例如，镰刀状细胞/Hb-C病）。

在本文中定义的术语“镰刀状细胞贫血症”或“镰刀状细胞病”包括红血细胞的镰刀状化而导致的任何贫血症状的病症。镰刀状细胞病的表现包括：贫血，疼痛和/或器官功能不全，例如肾功能衰竭，视网膜病变，暂时性胸部综合征，缺血，阴茎持续勃起症和中风等。本文中的术语“镰刀状细胞病”是指多种镰刀状细胞贫血症引起的临床问题，尤其在那些HbS纯合子的镰刀状细胞取代的个体中。本文所述的镰刀状细胞病在体质上的表现为生长和发育的延迟，严重感染的趋势增加，特别是由于肺炎双球菌引起的脾脏功能显著受损，阻止了有效地清除血液循环中的细菌，伴有脾组织的经常性梗塞和最终降解。还包括在术语“镰刀状细胞病”中的是肌肉骨骼疼痛的暂时性发作，主要影响腰椎，腹部，股骨干，具有类似的机制和严重程度的弯曲。在成年人中，这种病情发作通常表现为轻度或中度持续时间短的发作，每隔几周或几个月内分散地引起痛苦的发作，持续5至7天，并平均每年停止发作一次。已知引发此危机的这些事件为酸中毒，缺氧和脱水，这些都增强了细胞内HBS的聚合（J.H.Jandl，血液：血液学教材，第二版，Little,Brownand Company，波士顿，1996年，第544-545页）。

如本文所述，“地中海贫血”指遗传性病症，其特征在于血红蛋白的产生有缺陷。地中海贫血的实例包括α和β地中海贫血。β地中海贫血是由β珠蛋白链中的突变引起，可通过重型或轻型的形式发生。在β地中海贫血的重型形式中，患儿出生时是正常的，但在一岁时产生贫血。产生小的红血细胞的β地中海贫血的轻型形式，是由珠蛋白链的一个基因或多个基因缺失引起的地中海贫血。因此，术语包括任何地中海病症引起的具有症状的贫血，如严重或β-地中海贫血，重型地中海贫血，中间型地中海贫血，α-地中海贫血，例如血红蛋白H病。

在特定的实施方案中，治疗性多肽是抗镰刀化蛋白。如本文所述，“抗镰刀化蛋白”包括在镰刀状细胞病症中阻止或逆转导致红细胞镰刀状化的病理事件的蛋白质。在本发明的一个实施方案中，本发明的转导的细胞用于在血红蛋白病症情况下向受体提供抗镰刀化蛋白。抗镰刀化蛋白也包括从突变的β-珠蛋白基因表达，包含抗镰刀化的氨基酸残基的多肽，例如，87位的苏氨酸被谷氨酰胺取代的突变的β-珠蛋白。编码治疗性多肽的基因或cDNA序列可以获取以便通过在本领域技术人员已知的多种技术插入到转化载体中。

本发明还进一步包括药物组合物，该组合物包含按照本文所述的方法产生的转导的细胞以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，载体适于肠胃外途径给药。载体可适于静脉内，腹腔内或肌肉内给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或混悬液以及临时配制成无菌的注射液或混悬液的无菌粉末。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途在本技术领域中是已知的。

减少移植受体中骨髓抑制的方法

本发明的另一个方面涉及可能发生在移植受体中的暂时性骨髓抑制的抑制，预防和改善，特别是那些在移植转导的干细胞或者多能细胞前接受了脊髓消除治疗的患者，例如，转导的造血干细胞或者多能细胞。当转导的细胞在移植前根据本发明的方法被选择时，本发明的此方面尤为适合，这是由于因先前的离体嘌呤霉素处理导致的未转导的细胞的损失，例如，造血细胞。当移植较少的细胞时，骨髓抑制的风险较高。此外，在干细胞实现大规模再增殖前，可能有较长时间的延迟。

因此，本发明提供的方法通过共移植嘌呤霉素选择的转导的细胞（包括多能细胞）和单独的能够在患有骨髓抑制的个体中产生消耗的造血细胞的细胞群到个体中来抑制暂时性骨髓抑制，所述造血细胞如红血细胞，白血细胞，和/或血小板。在特定实施方案中，这个单独的细胞群不包括个体的能够自我更新的或长期再增殖的干细胞，或只包括少量这类细胞，例如，少于10％，少于5％，少于1％，少于0.1％，或者少于0.01％。因此，单独的细胞群提供造血细胞的瞬时的或短期的再增殖，从而抑制或减少骨髓抑制，而存在于嘌呤霉素选择的转导的细胞中的转导的多能细胞，包括转导的干细胞，在个体中提供长期的造血细胞的再增殖。在某些实施方案中，包含的提供短期再增殖的细胞群，比用来提供长期再增殖包含转导干细胞的细胞群具有较低的干细胞百分比。然而，已理解这些不同的细胞群中的一种或两种可以包括一种或多种选自下列的细胞类型：干细胞，多能细胞，祖细胞，以及分化后的细胞。然而，可以采取步骤来减少用于短期再增殖的细胞群中存在的干细胞的数量，包括本文上述的那些。

根据本发明的方法的多种实施方案中，用于提供短期再增殖的细胞可以是转导的或未转导的细胞。例如，在某些实施方案中，用于提供短期再增殖的细胞被如上所述地转导和选择，但随后增殖和/或分化，如本文所述。

在特定实施方案中，移植患者体内短期再增殖或瞬时再增殖的细胞系指示再增殖的持续时间为至少一个月，至少二个月，至少三个月，或至少四个月。在特定实施方案中，移植患者体内短期再增殖或瞬时再增殖的细胞系指示再增殖的持续时间为不到一年，不到六个月或不到四个月。在特定实施方案中，移植患者体内短期再增殖或瞬时再增殖的细胞系指示再增殖的持续时间为介于一个月至一年，一个月至六个月之间，或一个月至四个月之间。

在特定实施方案中，移植患者体内长期再增殖的细胞系指示再增殖的持续时间为至少四个月，这可能发生在移植后任何时间。在特定实施方案中，移植患者体内长期再增殖的细胞系指示再增殖的持续时间为超过一年，六个月或四个月。所述再增殖发生的时期可能发生在移植后任何时间。在某些实施方案中，它开始于移植后一年内、18个月内或两年内。

因此，在本发明的一个实施方案中，本发明包括抑制对移植受体移植转导的干细胞后发生的骨髓抑制的方法，包括向移植受体中移植含有转导的干细胞的第一细胞群，和具有与第一细胞群相比干细胞百分比降低了的第二细胞群。在特定的实施方案中，移植受体移植前经历了骨髓消除治疗，并且，在特定实施方案中，移植受体具有数量降低了的能够分化成各种分化的造血细胞，如红血细胞，的造血前体细胞。在某些实施方案中，第一细胞群包含用转化载体转导的干细胞，此转化载体包含编码治疗性多肽的多核苷酸。在特定实施方案中，第一细胞群能够在移植受体体内长期再增殖造血细胞，第二细胞群能够在移植受体体内短期再增殖造血细胞。在特定实施方案中，第一细胞群包括转导的干细胞。在多种实施方案中，第二细胞群包括转导的和/或未转导的祖细胞。

在各种实施方案中，第二细胞群从移植受体中或从另一供体（在任何后续的培养或修饰之前）中获得。因此，第一细胞群可与第二细胞群从相同或不同的初始来源的细胞群获得。例如，第一细胞群可使用从移植受体获得的细胞产生，而第二细胞群使用从同种异体供体中获得的细胞来制备。在另一个实施方案中，第一细胞群和第二细胞群是从移植受体中获得的细胞中产生（在同一时间或不同时间）。

考虑到所述第二细胞群中存在的细胞移植到受体中来提供细胞组成部分，如造血系统，的瞬时再增殖，本发明的某些实施方案期望第二细胞群比起第一细胞群将有较低的干细胞百分比。因此，将由存在于第一群细胞中的嘌呤霉素选择的转导干细胞来实施长期的植入和再增殖。因此，在特定的实施方案中，第二群细胞在消耗长期再增殖干细胞群，同时通过例如某些生长因子的组合维持或扩增瞬时再增殖造血祖细胞群的条件下进行培养。因此，在特定实施方案中，本发明此方面的方法包括使第二细胞群与从细胞群中消耗或去除干细胞的试剂，或者抑制干细胞生长或增殖的试剂，或者诱导或促进干细胞分化为祖细胞的试剂接触。在特定的实施方案中，干细胞为造血干细胞。

可用于从细胞群中消除或去除干细胞的试剂包括，但不限于，干细胞上表达的细胞表面标记（如CD34，SCA1，Lin，c-kit）的特异性抗体，它可用于结合并从细胞群中去除或增加干细胞。用于抑制干细胞生长或增殖的试剂可包括在本技术领域中已知的任意试剂。

可用于诱导或促进多能细胞分化，例如，干细胞分化成祖细胞的试剂包括，例如，多种细胞因子和生长因子，以及它们的组合。可用于此类体外扩增或分化目的的细胞因子的例子包括，但不限于，IL-1（即，IL-1β），IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF，GM-CSF，和其类似物。出于离体扩增目的的合适的生长因子可以选自：c-kit的配体（SCF或SF），FLT-3配体（FL），血小板生成素（TPO），促红细胞生成素（EPO），以及其类似物。如本文所述，类似物包括细胞因子和生长因子的具有天然存在形式的特有生物活性的变体。在一个实施方案中，细胞因子和生长因子的混合物在其基本组合物中有干细胞因子（SCF），FLT-3配体（FL），和促血小板生成素（TPO）。在其它实施方案中，细胞因子和生长因子的混合物有额外的细胞因子，选自IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF，GM-CSF，及其组合，尤其选自IL-3，IL-6，IL-11，及其组合。因此，在一个实施方案中，细胞因子和生长因子的混合物具有组合物SCF，FL，TPO，和IL-3，而在另一个实施方案中，该混合物具有组合物SCF，FL，TPO，和IL-6。其他细胞因子的一个组合为IL-6和IL-11，由此细胞因子和生长因子的混合物具有组合物SCF，FL，TPO，IL-6和IL-11。在包括细胞因子和生长因子混合物的培养基中培养造血干细胞以扩增骨髓祖细胞的方法也在美国专利申请公开第2006/0134783号中有所描述。该申请描述了使用CD34⁺，CD90⁺造血干细胞作为起始细胞群来扩增骨髓祖细胞群。使用KITL，FLT3L，TPO，以及IL-3的组合任选地与IL-6结合处理细胞，似乎在骨髓增殖中具有协同作用。特定的组合包括KITL，FLT3L，TPO，任选地与IL-3组合，进一步任选地与IL3，IL-6和IL-11组合。

在特定实施方案中，第二细胞群包括祖细胞或前体细胞，其为相对未成熟的细胞，是相同组织类型的完全分化的细胞的前体。祖细胞或前体细胞，例如，造血祖细胞，能够增殖，但是它们具有有限的分化成多于一种细胞类型的能力。此外，祖细胞或前体细胞缺乏长期自我更新的能力。在特定的实施方案中，造血祖细胞可以在移植到受体约三至四个或三至六个月后恢复造血作用。在特定的实施方案中，造血祖细胞具有分化成至少两种不同的造血细胞的能力。

第二细胞群的细胞可以是转导的或未转导的。在某些实施方案中，第二细胞群的细胞被表达治疗性多肽的转化载体转导，因为当第二细胞群的细胞在移植受体内再增殖的时候，促使这些细胞的至少一部分表达治疗性多肽可能是有利的。在特定的实施方案中，第二细胞群的转导细胞不受嘌呤霉素影响。因此，在某些实施方案中，相同的治疗性多肽被在第一和第二细胞群中的转导的细胞表达，相同的或不同的转化载体可用于转导每个第一和第二细胞群。在特定的实施方案中，用于转导第一细胞群的细胞的转化载体包含编码嘌呤霉素抗性基因的多核苷酸，而用于转导第二细胞群的细胞的转化载体既可包含此多核苷酸也可不包含。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了降低或抑制骨髓抑制的方法，包括提供给需要的个体以下二者：（1）包含如上所述产生的并经过嘌呤霉素选择的转导的干细胞或多能细胞的细胞群和（2）另一细胞群，具有与第三细胞群相比较低干细胞的百分比，其在特定实施方案中，可按照本文所述制备。例如，此类其他细胞群可能曾被暴露在诱导至少部分干细胞的分化的条件下。此类其他的细胞群可以为转导的或未转导的，并且可能会与嘌呤霉素接触或不接触。这种其他的细胞群可以包括造血祖细胞。其中任一或两个细胞群可从由从骨髓，动员的外周血，脐带血，或胚胎干细胞中获得的细胞产生。

类似地，在某些实施方案中，本发明提供了与降低或抑制在转导干细胞移植到移植受体后产生的骨髓抑制高度相关的方法，包括将具有转导干细胞的第一细胞群和与第一细胞群相比具有减小的干细胞百分比的第二细胞群移植到移植受体中，其中所述第一细胞群通过包括选择转导的细胞的过程产生，其中，所述选择包含使第一细胞群接触1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短时间，其中所述第一细胞群预先接触含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列的转化载体，所述接触在足够允许所述多核苷酸整合入所述第一细胞群中大多数细胞的基因组中的条件和时间下。

在特定实施方案中，第一细胞群包含被含有编码治疗性多肽的多核苷酸的转化载体转导的干细胞。因此，这些方法可用于治疗多种疾病和病症，包括任意下文所描述的，并且在特定的实施方案中，造血系统的疾病，其中所述的治疗包括移植受体的内源性骨髓或造血细胞的脊髓消除。在特定的实施方案中，第一和第二细胞群包含能够分化成一种或多种造血细胞，例如，红血细胞，的细胞。在特定实施方案中，第一细胞群有能力植入移植受体，并提供细胞组成部分，例如造血细胞，的长期再增殖，而第二细胞有能力植入移植受体，并提供细胞组成部分，例如造血细胞，的短期再增殖。

在一个实施方案中，本发明包括抑制将转导的多能细胞移植到移植受体后产生的骨髓抑制的方法，包括将含有转导的多能细胞第一细胞群和与第一细胞群相比具有减小的干细胞百分比的第二细胞群移植到移植受体，其中所述第二细胞群能够在移植受体中瞬时再增殖。在特定的实施方案中，所述第一细胞群具有被转化载体转导的多能细胞，所述转化载体含有编码治疗性多肽的多核苷酸。在各种实施方案中，所述第二群细胞为转导的或未转导的。在某些实施方案中，所述第一细胞群在将所述第一细胞群移植到移植受体后，能够在体内持续至少四个月时间产生至少两个不同的细胞谱系。在某些实施方案中，所述第二细胞群能够瞬时再增殖移植受体的造血系统。在特定实施方案中，所述移植受体在所述的移植前经历了骨髓消除治疗。在某些实施方案中，所述第一和第二细胞群包括造血细胞。在特定的实施方案中，所述第二群细胞与第一细胞群相比具有减小的多能细胞百分比。在特定的实施方案中，在所述移植之前，所述第二细胞群被暴露于诱导多能细胞增殖和/或至少部分分化的条件下。在某些实施方案中，所述第二细胞群在所述移植前，通过培养增殖。在多种实施方案中，所述第一和第二细胞群从移植受体中获得。在某些实施方案中，所述第一和/或第二细胞群是从骨髓，动员的外周血，脐带血，和/或胚胎干细胞中获得的。在某些实施方案中，所述第一群细胞从选择转导的细胞的过程产生，其中所述过程包括使第一细胞群接触1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短时间，其中所述第一细胞群预先接触含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列的转化载体，所述接触在足够允许所述多核苷酸整合入所述第一细胞群中大多数细胞的基因组中的条件和时间下。

在本发明的特定实施方案中，标题“产生和选择转导的细胞的方法，以及在移植受体中通过转导的细胞提高细胞群重组以及对需要的个体导入治疗性多肽的相关方法”下的上述任何一种方法可以与本文中描述的在标题“在移植受体中降低骨髓抑制”下的任何一种方法组合，从而提供特定的实施方案，来提高移植的转导干细胞的重建，同时降低骨髓抑制。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了将转导的干细胞移植到移植受体中的方法，所述方法包括：（ⅰ）将含有多能细胞，包括干细胞，的第一细胞群在体外接触含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列的转化载体，从而产生包含转导的多能细胞，包括干细胞，的第二细胞群；（ⅱ）使所述第二细胞群在体外接触1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短时间，从而产生含有转导的多能细胞，包括干细胞，的第三细胞群，其中所述第三细胞群含有比所述第二细胞群百分比较高的转导的多能细胞，而且其中，在将所述第三细胞群移植到移植受体中后，所述第三细胞群能够体内持续至少四个月时间产生至少两个不同的含有所述转化载体的细胞谱系；（ⅲ）将多个所述第三细胞群与第四细胞群的组合移植到所述移植受体中，所述第四细胞群包含祖细胞，其中所述第四细胞群在将所述第四细胞群移植到移植受体后，能够提供短期造血支持。应当理解的是，在所述第三和第四细胞群结合后进行移植时，这并不一定意味着它们同步地移植；而是两种细胞群中之一可在另一之前，同一时间，或之后移植。然而，两种细胞群将在移植受体中存在一段时间，并且，在某些实施方案中，它们可以在彼此的同一时间，一小时内，两小时内，或二十四小时内被移植。

应当理解的是，第四细胞群，被移植用于提供瞬时或短期再增殖，可具有上述任何旨在提供瞬时或短期再增殖的细胞群的特性。因此，在特定实施方案中，所述第四细胞群预先暴露于诱导多能细胞增殖和/或至少部分分化的条件下。在多种实施方案中，所述第四细胞群为未转导的或转导的。因此，第四细胞群可以包含或不包含转导的细胞。在一个实施方案中，第四细胞群包括转导的细胞，并通过包含以下步骤的方法选择：（ⅰ）使第四细胞群与含有可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列的转化载体接触；以及（ⅱ）使所述第四细胞群接触1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短时间，从而选择含有嘌呤霉素抗性多肽的转导的细胞。

在特定的实施方案中，所述第四细胞群包括造血细胞。在某些实施方案中，所述第一和第四细胞群，由同一个个体获得。在特定实施方案中，所述第一和第四细胞群从骨髓，动员的外周血，脐带血，和/或胚胎干细胞中获得。

图4A中提供的示意图显示了本发明用于改善植入的方法，包括：（1）细胞选择，包括通过赋予嘌呤霉素抗性的转化载体转导的多能细胞，例如造血干细胞（HSC）；以及（2）移植两种选择的转导的细胞，其中包括多能细胞如造血干细胞，与未转导的增殖的祖细胞。移植之后，未转导的增殖的祖细胞提供短期的再增殖，而选择的转导的造血干细胞在免于与未转导的造血干细胞竞争下生长，并最终在受体内重建细胞群。图底部的图表显示脊髓消除后在移植到受体中之后，骨髓抑制随时间的水平（左图），和脊髓消除后在移植到受体中之后，移植的细胞随时间的再增殖（右图）。如图所示，当转导的造血干细胞与增殖的祖细胞一起移植时，与去除未转导的细胞后单独移植转导的细胞后的恢复较慢相比，预期移植受体表现出更快的恢复。此外，预期移植受体将通过增殖的祖细胞瞬时再增殖，并且通过转导的造血干细胞永久地再增殖。

图4B提供的示意图，显示了本发明用于改善植入的方法，其包括：（1），细胞选择，包括用具有嘌呤霉素抗性的转化载体转导的多能细胞，如造血干细胞（HSC），以及（2）选择的转导的细胞通过在促进造血干细胞的增殖的试剂的存在下培养的增殖，所述试剂如芳基的氢受体拮抗剂，SR1。这些增殖和转导的细胞被移植到受体中，转导的多能细胞在免于与未转导的细胞竞争下生长，并最终在受体体内重建为细胞群。在图底部的图表显示脊髓消除后移植到受体中之后，骨髓抑制随时间的水平（左图），和脊髓消除后移植到受体中之后，移植的细胞随时间的再增殖（右图）。如图所示，当转导的造血干细胞与增殖的祖细胞一起移植时，与去除未转导的细胞后单独移植转导的细胞后的恢复较慢相比，预期移植受体表现出更快的恢复。此外，当使用扩增的转导的HSC移植时，与选择转导的细胞之后使用未增殖的细胞移植后的较低的再增殖相比，预期移植受体将显示高水平的植入与永久再增殖。

转化载体

本发明还进一步提供转化载体，它可用于本发明的实施方法。这些载体被设计为表达嘌呤霉素抗性多肽，从而促进转导的细胞的选择。在优选的实施方案中，转化载体通过进一步设计来表达治疗性多肽。

虽然本领域技术人员将会理解，可以采用多种不同的病毒载体产生这样的转化载体，在特定实施方案中，转化载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体，部分由于慢病毒载体在体外和体内能够向非分裂的细胞提供高效率的导入，整合和长期的转基因表达。多种慢病毒载体在本技术领域中是已知的，请参阅Naldini等人，（1996年a，1996年b，1998年）；Zufferey等人，（1997）；Dull等人，1998年，美国专利号：6013516和5994136，其中任一可以适合于产生本发明的转化载体。在一般情况下，这些载体是以质粒或病毒为基础的，并且被组装为携带将编码治疗性多肽的核酸转化入宿主细胞的必要序列。

慢病毒基因组和前病毒DNA包括逆转录病毒中发现的三个基因：gag，pol和env，其侧翼具有两个长末端重复序列（LTR）。gag基因编码的内部结构（基质，衣壳，核衣壳）蛋白，pol基因编码的RNA指导的DNA聚合酶（逆转录酶），蛋白酶和整合酶；以及env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR分别具有促进病毒颗粒的RNA的转录和聚腺苷酸化作用。慢病毒有额外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。与5'LTR序列相邻的是基因组的逆转录所必需的序列（tRNA引物结合位点）和高效的病毒RNA壳体化成颗粒所必需的序列（Psi位点）。

在进一步的实施方案中，慢病毒载体为HIV载体。因此，载体可来自于人类免疫缺陷-1（HIV-1），人类免疫缺陷（HIV-2），猴免疫缺陷病毒（SIV），猫免疫缺陷病毒（FIV），牛免疫缺陷病毒（BIV），Jembrana病病毒（JDV），马传染性贫血病毒（EIAV），山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）及类似物。在本发明的大多数方面，以HIV为基础的载体主链（即，HIV的顺式作用序列中的元件和HIV的gag，pol和rev基因）一般是优选的，因为以HIV为基础的构建体在对人类细胞的转导中是最有效的。

在特定实施方案中，本发明的转化载体包含左（5'）逆转录转录病毒LTR，逆转录病毒输出元件，任选的慢病毒的Rev反应元件（RRE）；可操作地连接到目的基因上（例如编码治疗性多肽）的启动子，或其活性部位，（和任选的基因座控制区域（LCR）或其活性部位）；可操作地连接到启动子的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列；和右（3'）反转录病毒LTR。本发明的转化载体可进一步包含其它元件，如一个或多个中心聚嘌呤通道/DNA flap（CPPT/FLAP），包括，例如，psi包装信号和/或来源于HIV1的CPPT/FLAP。

在某些实施方案中，5'LTR的启动子被替换为异源启动子，包括，例如，巨细胞病毒（CMV）启动子。

在本发明的一个实施方案中，载体的LTR区域，如3'LTR，在U3和/或U5区域被修饰，其中自我失活（SIN）载体被创建。这样的修饰是有利于增加为了基因导入的目的载体的安全性。在一个实施方案中，本发明的SIN载体包含在3'LTR内的删除，其中一部分U3区被替换为绝缘子元件。示例性的SIN载体已有描述，例如，在美国专利申请公开第2006/0057725号，以及美国专利7250和6165782。绝缘子防止载体内的增强子/启动子序列影响附近基因组中基因的表达，并且反之亦然，防止附近的基因组序列影响载体内基因的表达。示例性的绝缘子序列已有描述，例如，在美国专利申请公开第2006/0057725号和美国专利号5610053中。在本发明的另一个实施方案中，3'LTR被修饰，使U5区被替换为，例如，理想的多聚（A）序列。应当指出对LTR的修饰，例如对3'LTR的修饰，对5'LTR的修饰，或对3'和5'LTR两者的修饰，也包括在本发明中。

在特定实施方案中，本发明的转化载体包含左（5'）逆转录病毒LTR，逆转录病毒的输出元件，任选的慢病毒的Rev反应元件（RRE）；可操作地连接到目的基因的启动子，或其活性部位，和基因座控制区（包括LCR），或其活性部位；可操作地连接到启动子的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列；以及右（3'）逆转录病毒LTR。本发明的逆转录病毒载体还可以包括中心聚嘌呤管道/DNA flap（cPPT/FLAP），包括，例如，来源于HIV-1的cPPT/FLAP。在另一个实施方案中，5'LTR的启动子被替换为异源启动子，包括，例如，巨细胞病毒（CMV）启动子。在特定实施方案中，左（5'）LTR，右（3'）LTR，或左，右LTR两者的U5区被修饰，用理想的聚（A）序列取代全部或一部分的区域，以及左（5'）长末端重复序列（LTR），右（3'）LTR，或左，右LTR两者的U3区被修饰，来包括一个或多个绝缘子元件。在一个实施方案中U3区被修饰为删去U3区的片段并将其替换为绝缘子元件。在特定的实施方案中，右（3'）LTR的U5区被修饰为删去U5区，并将其替换为DNA序列，例如理想的聚（A）序列。在又一实施方案中，载体包含绝缘子元件，所述绝缘子元件包含从β-珠蛋白基因座来源的绝缘子，包括，例如，鸡HS4。

本发明的转化载体，包括编码嘌呤霉素抗性多肽或其功能性变体或其片段的多核苷酸序列。通常，功能性变体包含与嘌呤霉素抗性多肽至少90％，至少95％，或至少99％的氨基酸同一性，并且功能性片段包含足以赋予嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素抗性多肽部分。这些功能性变体和片段在其表达的细胞中具有其来源野生型嘌呤霉素抗性多肽的至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％的嘌呤霉素抗性活性。嘌呤霉素抗性的活性可由在本领域技术人员容易地检测。在某些实施方案中，嘌呤霉素抗性基因为pac基因，或者其密码子优化的变体，其编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），或其功能性变体或片段。

本发明的转化载体，包括慢病毒载体，可以包括目的基因，包括，例如，表达目的多肽或治疗性多肽的多核苷酸序列。在特定的实施方案中，治疗性多肽被提供给患者，其中在该患者中所述多肽以较低的水平，或以突变的，功能较少的形式表达。目的基因和其表达的多肽的例子包括，但不限于：肾上腺脑白质营养不良（ALD）的基因或其编码区，以及ALD蛋白质，如美国专利第5644045号中所描述；珠蛋白基因或编码抗镰刀化蛋白的基因。在一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体中表达的珠蛋白基因是β-珠蛋白，δ-珠蛋白，或γ-球蛋白。在另一个实施方案中，人β-珠蛋白基因是野生型人β-珠蛋白基因或人β^A-珠蛋白基因。在另一个实施方案中，人β-珠蛋白基因在内含子序列包括一个或多个缺失，或者是编码至少一个抗镰刀化氨基酸残基的突变的人β-珠蛋白基因。抗镰刀化氨基酸可来源于人的δ-珠蛋白或人γ-珠蛋白。在另一个实施方案中，突变的人β-珠蛋白基因编码的位于密码子87（β^A-T87Q）的苏氨酸向谷氨酰胺的突变。在美国专利第5861488号中提供了根据本发明的可能被使用的珠蛋白肽序列的实例，第5631162号美国专利中也描述了包含珠蛋白序列的示例性转化载体。

转化载体的启动子可以是天然（即，因其发生在体内的细胞内）或非天然地与特定基因的5'端侧翼区结合的启动子。启动子也可来源于真核细胞基因组，病毒基因组，或合成的序列。启动子也可以被选择为非特异性（在所有组织中均有活性），组织特异性，受天然调节过程调节，受外源使用的药物调节，或受特定的生理状态调节，如急性期应答过程中被激活的或只能在复制细胞中被激活的启动子。本发明中的启动子的非限制性实施方案包括逆转录病毒LTR启动子，巨细胞病毒即刻早期启动子，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和巨细胞病毒启动子（CMV）。启动子也可以选自在选定的细胞类型中显示出特异性表达的启动子，其可伴随一些情况被发现，包括但不限于，血红蛋白病。在本发明的一个实施方案中，该启动子是细胞特异性使得基因的表达仅限于红血细胞。可以通过使用人β-珠蛋白启动子区和基因座控制区（LCR）实现红细胞特异性表达。

编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸和编码治疗性多肽的多核苷酸可以被可操作地连接到相同或不同的启动子序列上。嘌呤霉素抗性的多肽和/或治疗性多肽可通过一个或多个组成型启动子表达。然而，本发明的转化载体可以包含一个或多个启动子或增强子元件，允许治疗性多肽和/或嘌呤霉素抗性基因中的一者或两者临时或组织特异性表达。在具体的实施方案中，可能要求只在天然表达治疗性多肽的哺乳动物细胞中表达治疗性多肽。因此，编码治疗性多肽的多核苷酸可被可操作地连接到选择性地驱动治疗性多肽在这些细胞中表达的表达组织特异型启动子和/或增强子。可能会被用来驱动在红血细胞中的表达的组织特异型启动子的一个例子是β-珠蛋白启动子和LCR。

在某些实施方案中，可能会要求使用诱导型启动子表达嘌呤霉素抗性多肽，以便在用转化载体转导的细胞导入到个体之后，该多肽不会被表达，或只可忽略不计地表达。例如，可能被要求在转导之后和嘌呤霉素选择过程之前或期间诱导嘌呤霉素抗性多肽的表达。在其它实施方案中，与祖细胞或分化后的细胞相比，可能被要求在干细胞中优先表达嘌呤霉素抗性基因，以强化转导的干细胞的选择，这可能对植入和重建有利。因此，在转化载体中，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸可能被可操作地连接到诱导型启动子和/或增强子或在干细胞中活性比祖细胞或分化的细胞中更强的启动子和/或增强子。

多种诱导型启动子和/或增强子在本技术领域中是已知的，包括但不限于，例如，Cre/loxP系统，两个四环素应答Tet系统（Tet-On，Tet-Off），糖皮质激素应答状态小鼠乳腺瘤病毒启动子（MMTVprom），蜕皮激素诱导型启动子（EcP），以及T7启动子/T7的RNA聚合酶系统（T7P）。

在一个特定实施方案中，基于HIV的重组转化载体从5'到3'方向含有，5'侧翼HIV LTR，包装信号或psi+，中央聚嘌呤通道或HIV-1的DNAflap（CPPT/FLAP），Rev-应答元件（RRE），人β-珠蛋白基因的3'增强子，目的基因，如含有β^A87Thr:Gln突变的人β-珠蛋白基因突变体，人β-珠蛋白启动子的266bp，人β-珠蛋白LCR的2.7kb，PGK启动子或诱导型启动子，编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸，聚嘌呤通道（PPT），和3'端侧翼HIV LTR。LTR区域进一步包括U3和U5区，以及R区。U3和U5区域可同时或独立进行修饰，以创建自我失活的转化载体，从而增加了用于基因导入的载体的安全性。U3和U5区可进一步修饰为包含绝缘子元件。在本发明的一个实施方案中，所述绝缘子元件为鸡HS4。

在其它实施方案中，本发明的转化载体表达嘌呤霉素抗性多肽和自杀基因产物两者，例如，使用条件自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶。此外，它们还可以表达治疗性多肽或目的基因。因此，移植受体中载体介导的插入突变可能产生的赘生性细胞会表现为可由化学诱导的细胞自杀治疗（例如，更昔洛韦，Naujok O.等人，干细胞综述，2010年9月，6（3）:450-61）。其他条件自杀基因可用于代替单纯疱疹病毒胸苷激酶编码基因。在特定的实施方案中，嘌呤霉素抗性和条件性细胞自杀蛋白通过（ⅰ）多顺反子载体内的“内部核糖体进入位点（IRES）”，（ⅱ）前体蛋白的裂解或（iii）融合蛋白共同表达。

因此，在本发明的另一个实施方案中，转化载体包含含有可操作地连接到自杀基因的启动子的多核苷酸序列。在特定实施方案中，自杀基因为HSV胸苷激酶（HSV-Tk）。转化载体也可以包含含有用于体内细胞选择的基因的多核苷酸，如用于体内选择的基因，例如，甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）基因。在特定的实施方案中，自杀基因可操作地连接到组成型或诱导型启动子，包括在本文中所述的任意。在一个实施方案中，含有可操作地连接到自杀基因的启动子的多核苷酸序列，存在于载体中5'LTR下游和编码治疗性蛋白质的多核苷酸的下游。在某些实施方案中，含有可操作地连接到自杀基因的启动子的多核苷酸序列被定向为使得可操作地连接到自杀基因的启动子的5'末端位于朝向编码治疗性蛋白质的多核苷酸的5'末端（与包含可操作地连接到自杀基因的启动子的多核苷酸序列相比，编码治疗性蛋白质的多核苷酸序列位于相反方向，这样编码治疗性蛋白质的多核苷酸的5'末端更靠近3'LTR而非5'LTR）和含有可操作地连接到自杀基因的启动子的多核苷酸序列的3'端位于朝向ppt和/或3'LTR的5'末端。

在某些实施方案中，编码自杀基因的多核苷酸在载体内定向使得其表达不受载体中的启动子驱动。因此，编码的自杀蛋白的多核苷酸没有可操作地连接于该载体内的启动子上。相反，如果载体插入到细胞染色体DNA中在细胞启动子影响下的区域，自杀基因发生表达。在特定的实施方案中，自杀蛋白可能是条件型或组成型。在一个实施方案中，编码自杀蛋白的多核苷酸存在于载体中5'LTR下游和编码治疗性蛋白质的多核苷酸的上游。在某些实施方案中，编码自杀蛋白的多核苷酸被定向使得编码自杀蛋白的多核苷酸的5'端朝向5'LTR，而编码自杀蛋白的多核苷酸的3'端朝向编码治疗性蛋白质的多核苷酸的3'端。因此，编码自杀蛋白质的多核苷酸和编码治疗蛋白质的多核苷酸可能会位于相反的方向。在存在这些元件的载体的特定实施方案中，编码自杀蛋白的多核苷酸可能位于载体中CPPT/FLAP和/或RRE元件上游。在特定的实施方案中，其中编码自杀蛋白的多核苷酸位于5'LTR的下游和CPPT/FLAP和/或RRE元件的上游，自杀蛋白的5'端可包含剪接受体序列，例如，与编码自杀蛋白质的多核苷酸直接相邻。在某些实施方案中，剪接受体序列位于编码自杀蛋白的多核苷酸的上游20个碱基，10个碱基，5碱基或更少的碱基。

在一个实施方案中，转化载体包含没有可操作地连接到载体内的启动子的编码自杀蛋白质的多核苷酸，其中编码自杀蛋白的多核苷酸位于5'LTR的下游以及CPPT/FLAP和/或RRE元件上游，其中剪接受体位点包括自杀蛋白的5'，例如，位于编码自杀蛋白的多核苷酸的上游，与编码自杀蛋白质的多核苷酸直接相邻或位于20个碱基以内，10个碱基，5碱基或更少的碱基。

在某些实施方案中，嘌呤霉素抗性蛋白和自杀蛋白被表达为框内融合蛋白或多肽。在特定的实施方案中，它们作为嘌呤霉素抗性多肽和自杀多肽的直接融合而表达。在某些实施方案中，融合多肽包含在嘌呤霉素抗性多肽和自杀多肽之间的接头序列。

可以采用肽接头序列来使任意两种或多种多肽组分分开足够的距离以确保每个多肽折叠成合适的二级和三级结构从而允许多肽结构域发挥其所需的功能。使用在本技术领域的标准技术将这种肽接头序列并入到融合多肽。合适的肽接头序列，可以基于以下因素选择：（1）它们采用柔性扩展构象的能力；（2）它们无法采用可以与第一和第二多肽上的功能性表位互相作用的二级结构的能力，以及（3）缺乏可能与该多肽的功能性表位反应的疏水性的或带电荷的残基。优选的肽接头序列含有甘氨酸，天冬酰胺，丝氨酸残基。其他附近的中性氨基酸，如苏氨酸和丙氨酸也可用于接头序列。可被有用的作为接头序列的氨基酸序列包括Maratea等人，基因40:39-46，1985年；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8258-8262，1986年，美国专利第4935233号和美国专利第4751180号中所公开的。当特定的融合多肽肽段包含可用于功能域分开和防止立体空间干扰的非必需的N-末端的氨基酸区时，接头序列不是必需的。优选的接头序列通常为柔性氨基酸子序列，被合成为重组融合蛋白的一部分。接头序列的多肽可以是在1至200个氨基酸之间的长度，或1至100个氨基酸之间的长度，或1至50个氨基酸之间的长度，包括之间所有的整数值。

示例性的接头序列包括，但不限于以下的氨基酸序列：GGG;DGGGS（SEQ ID NO：16）;TGEKP（SEQ ID NO：17）（参见，例如，Liu等人，PNAS5525-5530（1997年））;GGRR（SEQ ID NO：18）（Pomerantz等人，1995年，同上）;（GGGGS）_n（SEQ ID NO：19）（Kim等人，PNAS93，1156-1160（1996年）;EGKSSGSGSESKVD（SEQ ID NO：20）（Chaudhary等人，1990年，PNAS，美国87:1066-1070）;KESGSVSSEQLAQFRSLD（SEQ ID NO：21）（Bird等人，1988年，科学242：423-426），GGRRGGGS（SEQ ID NO：22）;LRQRDGERP（SEQ IDNO：23）LRQKDGGGSERP（SEQ ID NO：24）;LRQKd（GGGS）₂ERP（SEQ ID NO：25），可选地，可以使用能够模拟DNA结合位点和多肽本身的计算机程序（Desjarlais和Berg,PNAS90:2256-2260（1993年），PNAS91:11099-11103（1994年）或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头序列。

在某些实施方案中，接头序列包括Gly3接头序列，其中包括3个甘氨酸残基。

在特定的实施方案中，接头序列可裂解。在特定的实施方案中，接头序列包括自催化肽裂解位点。示例性的多肽裂解信号包括多肽裂解识别位点例如蛋白酶切位点，核酸酶裂解位点（例如，稀有的限制性内切酶的识别位点，自我裂解核酶的识别位点），和自我裂解病毒寡肽（参见deFelipe和Ryan，2004年，Traffic,5（8），616-26）。

合适的蛋白酶裂解位点和自我裂解肽对本领域技术人员是已知的（参见，例如，Ryan等人，1997年，普通病毒学杂志，78，699-722;Scymczak等人（2004年）天然生物技术，5，589-594）。示例性的蛋白酶裂解位点包括，但不限于马铃薯Y病毒的NIa蛋白酶的裂解位点（例如，烟草蚀纹病毒蛋白酶），马铃薯Y病毒HC蛋白酶，马铃薯Y病毒P1（P35）蛋白酶，byovirus NIa蛋白酶，byovirus RNA-2编码的蛋白酶，口蹄疫L蛋白酶，肠病毒2A蛋白酶，鼻病毒2A蛋白酶，核糖核酸3C蛋白酶，豇豆花叶病毒24K蛋白酶，香蕉苞片花叶病毒24K蛋白酶，RTSV（水稻东格鲁球状病毒）3C样蛋白酶，PYVF（欧洲防风草黄色斑点病毒）3C样蛋白酶，肝素，凝血酶，Xa因子和肠激酶。由于其较高的裂解严格性，TEV（烟草蚀纹病毒）蛋白酶裂解位点在一个实施方案中是优选的，例如，EXXYXQ（G/S）（SEQ ID NO：3），例如，ENLYFQG（SEQ ID NO：4）和ENLYFQS（SEQ ID NO：5），其中，X代表任何氨基酸（通过TEV进行的裂解发生在Q和G或Q和S之间）。

在特定实施方案中，自我裂解肽包括从马铃薯Y病毒和心病毒的2A肽获得的多肽序列，口蹄疫病毒（手足口病病毒），马鼻炎A病毒，Thoseaasigna病毒和猪捷申病毒。

在某些实施方案中，自我裂解多肽的位点包含2A或2A样位点，序列或域（Donnelly等人，2001，普通病毒学杂志，82:1027-1041）。

示例性2A位点包括下列序列：

SEQ ID NO:6	LLNFDLLKLAGDVESNPGP
		SEQ ID NO:7	TLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:8	LLKLAGDVESNPGP
		SEQ ID NO:9	NFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:10	QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
		SEQ ID NO:11	APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:12	VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
		SEQ ID NO:13	LNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:14	LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
		SEQ ID NO:15	EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP

在一个实施方案中，自催化肽裂解位点包括翻译的2A信号序列，比如，例，口蹄疫手足口病病毒（FMDV）多聚蛋白的2A区域，为具有18个氨基酸的序列。可以使用的2A样序列的另一例子包括昆虫病毒多聚蛋白，C型轮状病毒的NS34蛋白，以及在锥虫属中的重复序列。例如，Donnelly等人，普通病毒学杂志（2001年），82，1027-1041所述。

在进一步的实施方案中，转化载体包括位于编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和包括自杀基因或cDNA多核苷酸序列之间的“垃圾”序列。如本文所述，术语“垃圾序列”是指不具有已知功能的DNA序列。在某些实施方案中，垃圾序列不具有显著或能够检测到的在哺乳动物细胞中的启动子或增强子，而且它并不编码的任何多肽或任何具有已知功能的活性的多肽。在某些实施方案中，编码垃圾序列的侧翼是其5'端的终止密码子和/或其3'端的起始密码子。

在多种实施方案中，转化载体可包括编码自杀蛋白质和嘌呤霉素抗性的蛋白质的多核苷酸，并且编码自杀蛋白的多核苷酸序列位于编码嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸上游，或者反之。在一个实施方案中，转化载体包含含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列。在特定的实施方案中，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列可操作地连接到组成型或诱导型启动子上，包括本文所述的任意启动子。

在一个实施方案中，含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列存在于载体中5'LTR下游和编码治疗性蛋白质的多核苷酸的下游。在某些实施方案中，含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列启动子的多核苷酸序列被定向使得启动子的5'端位于朝向编码治疗性蛋白质的多核苷酸的5'末端（与含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列相比，编码治疗性蛋白质的多核苷酸为相反方向，因此编码治疗性蛋白质的多核苷酸的5'末端更接近3'LTR而非5'LTR），和含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列的3'端位于朝向ppt的5'末端和/或3'LTR。

在一个实施方案中，转化载体包括位于含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列的5'端的剪接受体序列，例如，与启动子直接相邻。在某些实施方案中，剪接受体序列位于含有可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的多核苷酸序列的上游20个碱基，10个碱基，5个碱基或更少碱基。

在另外的实施方案中，剪接受体序列包括在可操作地连接到编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的启动子的5'端和/或编码自杀蛋白的多核苷酸序列的5'端，和/或编码嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列的5'端，以其任意合适的组合。剪接受体序列可以位于每个或所有这些多核苷酸序列上游20个碱基，10个碱基，5个碱基或更少个碱基。

在某些实施方案中，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸在载体中定向为不需要载体中的启动子驱动它们的表达。因此，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸并非可操作地连接到位于该载体中的启动子。相反，如果载体插入到细胞的染色体DNA中的在细胞的启动子的影响下的区，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸的表达发生。在一个实施方案中，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸中在载体中存在于5'LTR的下游和编码治疗性蛋白质的多核苷酸的上游。在某些实施方案中，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸被定向使得编码自杀蛋白或嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸的5'端位于朝向5'LTR的方向，而编码自杀蛋白或嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸的3'端位于朝向编码治疗性蛋白3'端的方向。因此，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸可以与编码治疗性蛋白的多核苷酸位于相反的方向。在存在这些元件的载体的特定实施方案中，编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸可以位于载体中CPPT/FLAP和/或RRE元件的上游。在特定的实施方案中，其中编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸位于5'LTR的下游，和CPPT/FLAP和/或RRE元件的上游，剪接受体序列可以被包括自杀蛋白和/或嘌呤霉素抗性的蛋白质的5'端，例如，直接相邻，或位于编码自杀蛋白和/或嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸上游20个碱基，10个碱基，5碱基或更少的碱基。

在一个实施方案中，转化载体包括没有可操作地连接于该载体中的启动子的编码自杀蛋白质和嘌呤霉素抗性的蛋白质的多核苷酸，其中编码自杀蛋白质和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸位于5'LTR的下游，和CPPT/FLAP和/或RRE元件的上游，并且其中剪接受体位点可以被包括自杀蛋白和/或嘌呤霉素抗性的蛋白质的5'端，例如，直接相邻，或位于编码自杀蛋白和/或嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸上游20个碱基，10个碱基，5碱基或更少的碱基。

转化载体可以包括驱动嘌呤霉素抗性多肽和/或自杀蛋白的表达的启动子上游的剪接受体序列。在某些实施方案中，该载体包括直接位于驱动编码嘌呤霉素抗性多肽和自杀蛋白的多核苷酸序列表达的启动子序列上游的剪接受体序列。在多种实施方案中，转化载体包括编码自杀蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸序列，编码自杀蛋白的多核苷酸序列位于编码嘌呤霉素抗性基因的多核苷酸的上游，或者反之，并且进一步包括位于驱动它们表达的启动子的上游的剪接受体序列。

在某些实施方案中，载体包含位于编码自杀蛋白的多核苷酸的上游的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列，并且还进一步包括位于编码自杀蛋白的多核苷酸的起始密码子的上游或者编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸的起始密码子的上游的剪接受体序列。在某些实施方案中，该载体包含位于编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸上游的编码自杀蛋白的多核苷酸，并且还进一步包括位于编码自杀蛋白的多核苷酸的起始密码子的上游或者编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸的起始密码子的上游的剪接受体序列。

在某些实施方案中，包含自杀基因或cDNA的所述多核苷酸在自杀基因5'端含有Kozak共有序列，以及位于自杀基因或cDNA3'端的转录终止子序列。可以使用的示例性的强Kozak序列是共有序列，（GCC）RCCATGG（SEQ ID NO：26），其中R是嘌呤（A或G）（Kozak，1986年，细胞，44（2）：283-92和Kozak，1987年，核酸研究15（20）:8125-48）。

在特定的实施方案中，转化载体在编码嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸和编码自杀蛋白的多核苷酸之间含有内部核糖体进入位点（IRES）。IRES为允许在mRNA中间翻译起始的核苷酸序列。因此，在编码嘌呤霉素抗性蛋白的多核苷酸和编码自杀蛋白的多核苷酸之间存在的IRES，允许单独的嘌呤霉素抗性蛋白质和自杀蛋白的翻译。多种源于病毒基因组和哺乳动物的RNA的IRES是已知的，也可以根据本发明使用，包括，例如，源于脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES。

转化载体可以由本技术领域中已知的常规分子生物学技术制备。例如，通过PCR从合适的库中扩增治疗性目的基因的cDNA，例如，人β-珠蛋白。将基因克隆到质粒中，如质粒pBluescript II KS（+）（Stratagene），所述质粒含有所需的启动子或基因表达控制元件，如人β-珠蛋白启动子和LCR元件。通过限制性内切酶消化，或其他本领域技术人员在本技术领域中已知的方法，来获得所需的DNA序列后，然后将含有启动子和LCR元件和治疗性目的基因的核酸盒插入到慢病毒载体的合适的克隆位点，如图1所示。

本发明中的转化载体，包括慢病毒载体，可用于基因治疗，包括对于血红蛋白病的治疗。本发明还包括宿主细胞，包含，例如，使用本发明的载体转导的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为胚胎干细胞，成体干细胞或祖细胞。

在其它实施方案中，本发明提供使用前述优化的载体的方法，来实现在红血细胞中稳定的，高水平的基因表达，例如，为了治疗红细胞特异性疾病。

实施例

实施例1

通过嘌呤霉素选择富集转导的CD34⁺细胞

本实施例演示了用表达嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体成功转导和选择转导的CD34⁺细胞，从而产生富集转导的细胞的细胞群。

这些实验中使用的慢病毒载体，HPV654，通过将可操作地连接到hPGK启动子的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列插入到之前描述的表达修饰的人β-珠蛋白多肽的载体中构建（β^A-T87Q-珠蛋白慢病毒，美国专利申请公开第2006/0057725号中有所描述）。这种修饰的人β^A-珠蛋白基因的变体在87位密码子被突变，编码谷氨酰胺[β^A87Thr:Gln（β^A-T87Q）]，这被认为是导致β-珠蛋白的大部分的抗镰刀化活性的原因（Nagel等人（1979）PNAS USA767:670）。HPV654载体的示意图在图1中提供。正如图1中所示，载体包含HIV LTR，HIV-1型的长末端重复;ψ⁺psi+包装信号;cPPT，中央聚嘌呤管道/DNA flap;RRE，Rev反应元件；I,II,III,人β-珠蛋白基因的外显子；间插序列；β珠蛋白启动子（由SnaBI至Cap位点）；3'β珠蛋白增强子（至下游AvrII位点），以及DNase I超敏感位点，HS2（SMAI至XbaI），HS3（SacI至PvuII）以及LCR的HS4（StuI至SpeI），PGK，人磷酸甘油酸值激酶启动子，puro，嘌呤霉素抗性基因ppt，聚嘌呤管道;U3del HIV LTR和兔珠蛋白多聚腺苷酸。

通过水泡性口炎病毒糖蛋白G（VSV-G）假型化的重组病毒株通过使用HPV654载体，与表达HIV-1Gag-Pol、Rev、Tat和VSV-G的单独的质粒一起瞬时转导293T细胞产生。病毒在4℃下通过超速离心浓缩，并且病毒颗粒在StemPro-34无血清培养基（Life Technologies公司，弗雷德里克美国马里兰州）中重新悬浮。通过qPCR分析转导的NIH3T3细胞和前病毒拷贝数对照组测定病毒滴度。

使用来源于正常人类捐献者的新鲜骨髓（BM,Lonza,Walkersville,MD）或冷冻保存的G-CSF动员的外周血（mPB,AllCells,Emeryville,CA）CD34⁺纯化的细胞。细胞浓度为1×10⁶/ml，CD34⁺细胞在添加了L-谷氨酰胺，100ng/ml的hSCF，100ng/ml的hTPO，100ng/ml的hFLT3-L以及20ng/ml的hIL-3(用于BM)或60ng/ml的hIL-3(用于mPB)的StemPro-34SFM培养基中预激活24小时（BM）或18小时（mPB）。然后将细胞在含有细胞因子的同样的培养基中重新悬浮为4×10⁶（BM）或3×10⁶（mPB）个细胞/ml的浓度，所述培养基还添加了8μg/ml的硫酸鱼精蛋白和10％（对于BM，最终暴露滴度为3×10⁷IU/ml，MOI为7.5；对于mPB，最终暴露滴度为1×10⁷IU/ml，MOI为3.3）或50％（对于BM，最终暴露滴度为31.5×10⁸IU/ml，MOI为37.5；对于mPB，最终暴露滴度为5×10⁷IU/ml，MOI为16.7）的HPV654上清液。在加入HPV654上清液24小时后，加入新鲜的含细胞因子的培养基来稀释细胞，至2.0×10⁶/ml用于BM或1.5×10⁶/ml用于MPB并培养另外24小时，之后两个感染的细胞群中的每种分成两个样品，来源于每个细胞群中的一个样品用5μg/ml嘌呤霉素处理24小时，另一个不用嘌呤霉素处理，如图2所示。然后将细胞洗涤，除去嘌呤霉素并放置在

（StemCell Technologies Inc.,Vancouver,BC,Canada）中，剂量为3ml的1×10³和4×10³（嘌呤霉素未处理）以及4×10³和4×10⁴（嘌呤霉素处理）。然后允许菌落形成单位-粒细胞/巨噬细胞（CFU-GM）在培养条件下生长14天。然后通过使用促红细胞生成素基因（用于BM）和人的肌动蛋白基因（用于mPB）的引物以及慢病毒载体的特异性的引物（对于BM，GAG；对于mPB，LTR）的对单个菌落的PCR分析，分析每个菌落中慢病毒载体的存在。如图2A所示，对于用10％HPV654上清液转导的骨髓CD34⁺细胞，不经嘌呤霉素选择产生的菌落4/17（23％）为慢病毒载体阳性，而经嘌呤霉素选择产生的菌落20/20（100％）为慢病毒载体阳性。对于用50％HPV654上清液转导的细胞，不经嘌呤霉素选择产生的菌落3/19（16％）为慢病毒载体阳性，而经嘌呤霉素选择产生的菌落15/19（79％）为慢病毒载体阳性。

在图2B中所示的第二个实验中，对于用10％HPV654上清液转导的G-CSF动员CD34⁺细胞，不经嘌呤霉素选择产生的菌落10/18（55％）为慢病毒载体阳性，而经嘌呤霉素选择产生的菌落15/17（88％）为慢病毒载体阳性。对于用50％HPV654上清液转导的细胞，不经嘌呤霉素选择产生的菌落，6/16（37%）为慢病毒载体阳性，而经嘌呤霉素选择产生的菌落18/18（100%）为慢病毒载体阳性。

这些实验表明，转导的CD34⁺细胞可通过嘌呤霉素选择来富集，其中细胞与嘌呤霉素接触少至24小时。可使用这样的选择有利地产生含有高比例转导的细胞的细胞群，从而提高转导的细胞随后的在移植受体中植入和再增殖。

上文所述的多种实施方案可以结合起来提供进一步的实施方案。所有在本说明书引用和/或申请数据表列出的美国专利，美国专利申请公开，美国专利申请，外国专利，外国专利申请和非专利出版物通过引用将其全部内容并入本文。如果需要，实施方案的多个方面可以被修改以采用多个专利，专利申请和出版物的观念来提供进一步的实施方案。

根据上述详细描述可以对实施方案做出这些和其他的变化。一般地，在下面的权利要求中，所使用的术语不应该被解释为将权利要求限制于在本说明书和权利要求书中所公开的特定实施方案，而应被解释为要求包括授权的权利要求以及等同物的全部范围中的所有可能的实施方案。因此，权利要求并不局限于本公开。

Claims (56)

1.增强转导的细胞在移植受体中的重建的方法，所述方法包括在移植到所述移植受体之前选择转导的细胞，其中所述转导的细胞通过包括以下步骤的方法选择：

i.在体外使包含多能细胞，包括干细胞，的第一细胞群接触转化载体，所述转化载体包含可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列，从而产生包含转导的多能细胞，包括干细胞，的第二细胞群；以及

ii.在体外使所述第二细胞群接触浓度为1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短，从而产生包含转导的多能细胞，包括干细胞，的第三细胞群，其中所述第三细胞群与第二细胞群相比，包含更高比例的转导的多能细胞，并且其中在所述第三细胞群移植入移植受体后，在至少四个月的体内时期，所述第三细胞群能够维持至少两种不同的包含所述转化载体的细胞系的产生。

2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将多个所述第三细胞群移植入所述移植受体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一细胞群是从所述移植受体中获得的。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一细胞群是从骨髓，动员的外周血，脐带血和/或胚胎干细胞中获得的。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少四个月可能发生在从所述移植两年内开始的任何时间。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述第二细胞群接触约5μg/ml的嘌呤霉素约24小时。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞群包含造血干细胞。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述转化载体进一步包括可操作地连接到启动子序列上的编码治疗性多肽的多核苷酸序列。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述转化载体为逆转录病毒载体。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述转化载体为慢病毒载体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述慢病毒载体为人类免疫缺陷病毒（HIV）载体。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述慢病毒载体为猴免疫缺陷病毒（SIV）载体。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述慢病毒载体为马传染性贫血病毒（EIAV）载体。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述载体为转座子。

15.如权利要求8所述的方法，其中所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸和所述编码治疗性多肽的多核苷酸可操作地连接到相同的启动子序列上。

16.如权利要求8所述的方法，其中所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸和所述编码治疗性多肽的多核苷酸可操作地连接到不同的启动子序列上。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述一个或多个启动子为组成型启动子。

18.如权利要求1所述的方法，其中可操作地连接到所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸上的所述启动子序列选自：组成型启动子，诱导型启动子，以及组织特异型启动子。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述启动子为组织特异型启动子，与其在从干细胞分化而来的细胞中的活性相比，其在所述干细胞中具有更高的活性。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述干细胞为造血干细胞。

21.如权利要求8所述的方法，其中可操作地连接到所述编码治疗性多肽的多核苷酸上的所述启动子序列选自：组成型启动子，诱导型启动子，以及组织特异型启动子。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述启动子为组织特异型启动子，与其在从多能细胞分化而来的细胞中的活性相比，其在所述多能细胞中具有降低的活性。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述组织特异型启动子在红细胞中有活性。

24.如权利要求1或8所述的方法，其中所述转化载体进一步包含含有自杀基因或cDNA的多核苷酸序列，其中所述自杀基因或cDNA编码自杀多肽。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述自杀基因或cDNA编码胸苷激酶衍生物。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述自杀基因或cDNA编码胸苷酸激酶（TmpK）衍生物。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述自杀基因或cDNA编码半胱天冬酶衍生物。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列没有可操作地连接到存在于所述转化载体的启动子序列上。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列可操作地连接到存在于所述转化载体的启动子序列上。

30.如权利要求29所述的方法，其中存在于所述转化载体中并且可操作地连接到包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列上的启动子序列为诱导型启动子。

31.如权利要求24所述的方法，其中所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸与所述编码治疗性多肽的多核苷酸以相反的方向存在于所述转化载体中。

32.如权利要求24所述的方法，其中所述转化载体包含位于所述自杀基因或cDNA的上游的剪接受体序列。

33.如权利要求24或31所述的方法，其中所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列在所述自杀基因或cDNA的5’端包含Kozak共有序列，并且在所述自杀基因或cDNA的3’端包含转录终止子序列。

34.如权利要求24所述的方法，其中所述转化载体以框内融合多肽的方式表达所述嘌呤霉素抗性多肽与所述自杀多肽。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述融合多肽为所述嘌呤霉素抗性多肽与所述自杀多肽的直接融合。

36.如权利要求24所述的方法，其中所述嘌呤霉素抗性多肽或所述自杀多肽通过使用所述转化载体中存在的内部核糖体进入位点（IRES）来表达，所述内部核糖体进入位点位于所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间。

37.如权利要求24所述的方法，其中所述嘌呤霉素抗性多肽与所述自杀多肽通过使用所述转化载体中存在的翻译2A信号序列来表达，所述翻译2A信号序列位于所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间。

38.如权利要求24所述的方法，所述转化载体包含位于所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点（IRES）。

39.如权利要求24所述的方法，其中所述融合多肽在所述嘌呤霉素抗性多肽和所述自杀多肽之间包含接头序列。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述接头序列包含Gly3接头序列。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述接头序列包含自体催化肽剪切位点。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述自体催化肽剪切位点包含翻译2A信号序列。

43.如权利要求39所述的方法，其中所述转化载体包含位于所述编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列和所述包含自杀基因或cDNA的多核苷酸序列之间的编码垃圾序列的多核苷酸序列，其中所述编码垃圾序列的多核苷酸序列的侧翼为位于其5’端的终止密码子和位于其3’端的起始密码子。

44.如权利要求2所述的方法，其进一步包括向个体提供与第四细胞群组合的所述第三细胞群，所述第四细胞群包含祖细胞，其中所述第四细胞群能够在所述第四细胞群移植入移植受体后提供短期造血支持。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述第四细胞群预先暴露于诱导多能细胞的扩增和/或至少部分地分化的条件。

46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述第四细胞群没有被转导。

47.如权利要求44或45所述的方法，其中所述第四细胞群包含通过包括以下步骤的方法转导和选择的细胞：

i.使所述第四细胞群接触转化载体，所述转化载体包含可操作地连接到启动子序列的编码嘌呤霉素抗性多肽的多核苷酸序列；并且

ii.使所述第四细胞群接触浓度为1-25μg/ml的嘌呤霉素4天或更短，从而选择包含所述嘌呤霉素抗性多肽的转导的细胞。

48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述第四细胞群包含造血干细胞。

49.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述第一和第四细胞群是从同一个体获得的。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述第一和第四细胞群是从骨髓，动员的外周血，脐带血和/或胚胎干细胞中获得的。

51.如权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述第一、第二或第三细胞群中的至少一种接触能够增加所述接触的细胞群中存在的干细胞数量的一种或多种试剂。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含芳基氢受体拮抗剂。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述芳基氢受体拮抗剂包含SR1。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述的一种或多种试剂包含生长因子的组合。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述多能细胞在4到21天的培养期之后数量增加。

56.如权利要求1所述的方法，其中所述第三细胞群中至少75%被转导。

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