CN114438130B - 一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用 - Google Patents

一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑珠蛋白重组慢病毒载体及其应用，所述β‑珠蛋白重组慢病毒载体为pCCL‑SIN‑cPPT‑LCR2.7K‑β‑globin‑Genomic‑T87Q‑RbPA，其包括pCCL‑SIN‑cPPT‑MCS‑RbPA骨架、2.7kb β‑LCR调控序列和表达第87位氨基酸突变的β珠蛋白HbβA‑T87Q的表达盒，其中β‑LCR为β‑globin locus control region的简写。本发明的慢病毒载体包装滴度高、载体生产成本低，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险，更加高效稳定的表达HbβA‑T87Q，为输血依赖型β‑地贫患者的治愈提供重要的基础。

Description

一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用。
背景技术
β-地中海贫血是世界上最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病之一，是一种严重威胁人类健康的致死、致残的血液病，在地中海地区（5-15%）、中东和西亚（2-5%）、东南亚（高达10%）和南亚（高达18%）人群中高发。在我国，高发区主要分布在长江以南各省区，其中以两广地区最为严重，并且随着人口流动性增加，已呈现向北方扩散的趋势。目前，全球正在接受治疗的β-地中海贫血患者估计高达20万。
当前，临床上广泛实施的β-地中海贫血的治疗手段包括规范化输血、药物治疗、异体造血干细胞移植等。其中，规范化输血仅能缓解症状，不能根治疾病，病人还需长期依赖于祛铁治疗以降低铁过载损伤；此外，长期输血还存在感染病毒的可能性，同时治疗成本高昂。异体造血干细胞移植虽然可以达到根治地中海贫血的目的，但是80％以上的病人难以找到组织相容性抗原匹配的供者，若采用非全相合的造血干细胞进行移植，患者可能产生严重的移植物抗宿主反应，在治疗后需要长期使用免疫抑制剂，生存质量低下。目前普遍认为基因治疗是根治β-地中海贫血的重要替代方法。
当前的商业化慢病毒载体存在诸如LCR元件较大导致慢病毒包装滴度低、载体生产成本高等问题，因此，如何利用最小的DNA片段，表达最高浓度的目标蛋白，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险，设计能高效稳定表达人HBB的载体仍是医学界面临的一大挑战。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用，能有效解决上述慢病毒包装滴度低、载体生产成本高等问题。
技术方案：第一方面，本发明提供一种β-珠蛋白重组慢病毒载体，所述β-珠蛋白重组慢病毒载体为pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA，其包括pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、2.7kb β-LCR基因序列和表达第87位氨基酸突变的β珠蛋白HbβA-T87Q的表达盒，其中β-LCR为β-globin locus control region的简写，表达HbβA-T87Q的表达盒包含依次连接的β-globin promoter序列、编码β-珠蛋白的基因组序列、β-globinpolyA序列和β-globin enhancer序列，所述编码β-珠蛋白的基因组序列包含第87位氨基酸的突变T87Q，且在2号内含子上的第387位碱基至第761位碱基处缺失。
优选的，所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架的序列如SEQ ID No:1所示。
SEQ ID No:1：
gggagctgccgtattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagctagcgtttaaacgggccctctagatcggaacgcgttatctgcagaattcccgggatccttaattagtcgacggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggttttttgtgtgctctcacctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaa ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagg
优选的，所述2.7kb β-LCR基因序列如SEQ ID No:2所示。
SEQ ID No:2：
gcctcaagatgataacttttattttctggacttgtaatagctttctcttgtattcaccatgttgtaactttcttagagtagtaacaatataaagttattgtgagtttttgcaaacacagcaaacacaacgacccatatagacattgatgtgaaattgtctattgtcaatttatgggaaaacaagtatgtactttttctactaagccattgaaacaggaataacagaacaagattgaaagaatacattttccgaaattacttgagtattatacaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttattttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaaaatttccgtttattaaatgcatgagcttctgttactccaagactgagaaggaaattgaacctgagactcattgactggcaagatgtccccagaggctctcattcagcaataaaattctcaccttcacccaggcccactgagtgtcagatttgcatgctctagctgagctcagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatgtatgggtcagtggtctcaatgtagcaggcaagttccagaagatagcatcaaccactgttagagatatactgccagtctcagagcctgatgttaatttagcaatgggctgggaccctcctccagtagaaccttctaaccagctgctgcagtcaaagtcgaatgcagctggttagactttttttaatgaggatctcgggaggcggaggttgcagtgagctgagatcgtgccactgcactccagcctgggggacagagcacattataattaactgttattttttacttggactcttgtggggaataagatacatgttttattcttatttatgattcaagcactgaaaatagtgtttagcatccagcaggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttagggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatat
优选的，β-globin promoter的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
SEQ ID No:3：
tacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacacc
编码β-珠蛋白的基因组序列的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
SEQ ID No:4：
atggtgcacctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagtatcactaa
β-globin polyA的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
SEQ ID No:5：
gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatttctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatttaaaacataaagaaatgaagagctagttcaaaccttgggaaaatacactatatcttaaactccatgaaagaaggtgaggctgcaaacagctaatgcacattggcaacagccctgatgcctatgccttattcatccctcagaaaaggattcaagtagaggcttgatttggaggttaaagttttgctatgctgtatttta
β-globin enhancer的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。
SEQ ID No:6：
cattacttattgttttagctgtcctcatgaatgtcttttcactacccatttgcttatcctgcatctctcagccttgactccactcagttctcttgcttagagataccacctttcccctgaagtgttccttccatgttttacggcgagatggtttctcctcgcctggccactcagccttagttgtctctgttgtcttatagaggtctacttgaagaaggaaaaacagggggcatggtttgactgtcctgtgagcccttcttccctgcctcccccactcacagtgacccggaatctgcagtgctagtctcccggaactatcactctttcacagtctgctttggaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaagaatttgaaagggggctttttgtagcttgatattcactactgtcttattaccctatcataggcccaccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagagatcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgcagttattagcatagtgttaccatcaaccaccttaacttcatttttcttattcaatacctag
第二方面，本发明提供一种慢病毒，所述慢病毒采用第一方面所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体和/或第二方面所述的慢病毒。
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体、第二方面所述的慢病毒或第三方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备治疗β-地中海贫血的基因治疗药物中的应用。
有益效果：本发明的慢病毒载体包装滴度高、载体生产成本低，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险，能够更加高效稳定的表达HbβA-T87Q，为输血依赖型β-地贫患者的治愈提供重要的基础。
附图说明
图1是本发明慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA质粒图谱；
图2是本发明实施例1空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果示意图；
图3是被本发明实施例1慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：
主要仪器：
台式离心机（Eppendorf 5424R）、恒温水浴锅（上海知信 ZX-S24）、恒温摇床（上海智诚分析ZXY-240）、凝胶成像系统（天能 Tanon-1600）恒温细菌培养箱（上海博讯 BPX-162）、生物安全柜(海尔 HR40-IIA2)、二氧化碳培养箱（Thermo 150i）、荧光显微镜（ZEISSAX10）、AKTA-avant150(Cytiva 28976337)、AKTA-Fluxs（Cytiva 29038437）、液相HPLC（岛津 SPD-40V）；
主要材料和试剂：
pBSK载体质粒（Stratagene 212205）、内切酶ClaI（Thermo FD0143）、内切酶XhoI（Thermo FD0694）、内切酶DpnI（Thermo ER1701）、内切酶NotI（Thermo FD0593）、内切酶EcoRI（Thermo FD0275）、内切酶KpnI（Thermo FD0524）、琼脂糖DNA凝胶回收与纯化试剂盒（康为世纪生物科技有限公司 CW2302M）、PCR试剂盒（TOYOBO KMM-201）、T4 DNA连接酶（Thermo EL0014）、卡那霉素（Sigma K1377）、DH5α（Takara 9057）、ViraPower™Lentiviral Packaging Mix（invitrogen K497500）UFP-750-E-3X2MA(Cytiva 56-4101-55)、UFP-750-E-2U（Cytiva 11-0005-50）、Capto-Core700（Cytiva 17548102）、Capto-Qimpres(Cytiva 17547010)、DMEM培养基（Gibco 11995065）、opti-MEM培养基(Gibco11058021)、DPBS(Gibco 14190144)、胰酶（Gibco 25200072）、IMDM培养基(Gibco12440053)、FBS（Gibco 10100147）、TFA(Thermo 85183)、乙腈(Fisher Chemical A995-4)，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购。
实施例1：载体构建
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）、2.7kb β-LCR调控序列（SEQ ID No:2）、β-globin promoter序列（SEQ ID No:3）、编码β-珠蛋白的基因组序列（SEQ ID No:4）、β-globin polyA序列（SEQ ID No:5）和β-globin enhancer序列（SEQ ID No:6）。
1.1 将pBSK载体质粒用限制性内切酶ClaI和XhoI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK载体片段；
将表达HbβA-T87Q的表达盒的基因组序列分为β-globin1与β-globin2两部分分别进行PCR，其中β-globin1基因片段所用引物序列PCR1为SEQ ID No:7，PCR2为SEQ ID No:8，β-globin2基因片段所用引物序列PCR3为SEQ ID No:9，PCR4为SEQ ID No:10，再以β-globin1与β-globin2两部分为模板，用引物PCR1与PCR4 overlap PCR出第二内含子缺失374bp的β-珠蛋白的基因组片段，PCR产物两端带有ClaI和XhoI位点，PCR产物用限制性内切酶ClaI和XhoI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回β-globin-genomic基因组片段；
1.2 将胶回收的pBSK载体片段和回β-globin-genomic基因组片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
1.3 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h；
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-β-globin-genomic质粒，进行ClaI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pBSK-β-globin-genomic质粒；
1.5 将pBSK-β-globin-genomic质粒中β-globin蛋白的第87位氨基酸通过点突变PCR由苏氨酸变成谷氨酰胺，所用引物序列PCR-5为SEQ ID No:11，PCR-6为SEQ ID No:12；PCR产物用限制性内切酶DpnI于36.5-37.5℃进行单酶切0.8-1.2h；
1.6将酶切产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h；
1.7 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-β-globin-Genomic-T87Q，获得的质粒进行测序鉴定，至此获得pBSK-β-globin -Genomic-T87Q质粒；
1.8 将pBSK-β-globin -Genomic-T87Q载体质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK-β-globin -Genomic-T87Q载体片段；
将2.7kb β-LCR的调控序列片段进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和NotI酶切位点，其3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，所用引物序列PCR-7为SEQ ID No:13，PCR-8为SEQ ID No:14，将扩增得到的PCR片段利用NotI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收2.7kb β-LCR调控序列片段；
1.9 将胶回收的pBSK-β-globin-Genomic-T87Q载体片段和2.7kb β-LCR调控序列片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
1.10 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h；
1.11 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q质，进行NotI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pBSK-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q质粒；
1.12 将pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体质粒用限制性内切酶XhoI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段；
以pBSK-LCR2.7K-β-globin -Genomic-T87Q为模板将LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，其3’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用KpnI和XhoI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q基因片段；
1.13 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
1.14 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h；
1.15 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA，进行KpnI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA质粒构建成功。
所用PCR引物序列如下所示：
SEQ ID No:7：
ccatcgattacgtaaatacacttgcaaaggagg
SEQ ID No:8：
accctgatttggtcaatatgtgtaccctgttacttctccccttcctatga
SEQ ID No:9：
tcataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggt
SEQ ID No:10：
ccgctcgagctaggtattgaataagaaaaatgaag
SEQ ID No:11：
acagtgcagctcactcagctgggcaaaggtgcccttgag
SEQ ID No:12：
ctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgt
SEQ ID No:13：
ataagaatgcggccgcgcctcaagatgataacttttattttc
SEQ ID No:14：
ggaattctatgtcacattctgtctcaggcatc
实施例2：慢病毒的生产和纯化
2.1 将成功构建的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA质粒与慢病毒包装试剂盒质粒Mix按照1：3的比例共转染前一天接种于10层细胞工厂的HEK293T细胞，转染后6小时更换新鲜DMEM培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化；
2.2 纯化采用切向流过滤-层析系统，利用core700层析，Q ImpRes层析纯化工艺，纯化得慢病毒，具体纯化过程如下：
①Benzonase treatment（核酸酶消化）：用25U/mL的Benzonase于37℃处理1小时，去除转染过程残留的质粒DNA和裂解细胞释放的基因组等污染物；
② MF(澄清):病毒收获液经过滤（0.45μm）的处理，以除去HEK293T细胞及碎片等不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理；
③UF/DF（浓缩洗滤）：澄清消化后样品采用截留分子量750kDa的UFP-750-E-3X2MA中空纤维进行浓缩洗滤，小分子杂质可以有效去除，从而达到了提纯的目的；
④SEC（分子排阻层析）：UF/DF后的样品通过平衡过后的Capto Core700填料进行进一步纯化，将大于700kDa的病毒等颗粒经外水体积排出收集，分子量更小的杂质进入填料孔内吸附其中；
⑤IEX（阴离子交换层析）：分子排阻层析后的样品通过Capto Q impres填料进行精纯，将病毒样品上样至平衡后的Capto Q impres填料中，此时杂质不会被填料吸附而排出，随后通过1M NaCl步级梯度将病毒洗脱；
⑥Preparation（制剂）：将IEX后的病毒液通过截留分子量750kDa UFP-750-E-2U的中空纤维进行浓缩换盐，将病毒置换在含有2%HSA的PBS中；
Figure 230206DEST_PATH_IMAGE001
Storage（保存）：将病毒采用0.2μm膜过滤，分装，于-80℃保存。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）红系分化为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用步骤2.2获得的慢病毒载体（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法如下：
3.1 复苏细胞
①将冻存于液氮的β0/β0骨髓CD34+干细胞置于42℃水浴快速复融；
②酒精消毒冻存管，吸取冻存细胞至15mL离心管，3mL 预热DPBS清洗冻存管，洗涤液合并入离心管；
③室温400g离心10min收集细胞，弃上清，1mL 预热HSC1培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、Transferrin、EPO、SCF、IL3）重悬细胞；
④取20μl细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数；
⑤根据细胞数量将细胞铺种于合适的细胞培养板中，记做第0天（D0）。
3.2β0/β0骨髓干细胞体外分化
Figure 740821DEST_PATH_IMAGE002
D1（第1天）取2.0×105 骨髓造血干细胞（CD34+细胞），置于无血清无血浆的 HSC1培养基中慢病毒感染1天（下称药物处理组）。同时，另取 2.0×105 骨髓造血干细胞 （CD34+细胞）不进行慢病毒感染，后续操作同药物处理组一致，作为空白阴性对照(Blank)；
Figure 989400DEST_PATH_IMAGE003
D2（第2天）更换新鲜HSC1培养基进行培养6天；
Figure 978085DEST_PATH_IMAGE004
D8（第8天）更换HSC2培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin、EPO、SCF）培养3天；
Figure 120353DEST_PATH_IMAGE005
D11（第11天）更换HSC3培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin、EPO）继续诱导培养4天；
Figure 411657DEST_PATH_IMAGE006
D15（第15天）更换HSC4培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin）培养6天至红细胞分化成熟；
Figure 773631DEST_PATH_IMAGE007
D21（第21天）收取细胞，反向高效液相色谱（RP-HPLC）定量HbβA-T87Q的表达，以正 常红细胞为阳性对照。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法如下：
4.1 样品处理
①取2.0×106细胞，300g离心10min，弃上清；
②加60μL水重悬，-80℃冷冻10min，37℃快速融化，振荡混匀；
③如此反复冻融三次以充分裂解细胞；
④9000g，4℃离心10min，收取上清进行检测。
4.2 缓冲液配制
① Buffer A：含1.2%TFA的水溶液，pH3.0；
② Buffer B：含0.08%TFA的乙腈溶液。
4.3检测程序见下表1：
表1：RP-HPLC检测珠蛋白程序方法
Figure 441372DEST_PATH_IMAGE008
RP-HPLC结果分析如图2和图3所示，峰下面积结果如下表2。
表2：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 703726DEST_PATH_IMAGE009
由表2可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin -Genomic-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化，空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为53%，见表2中βT87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为44%和81%，见表2中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
本实施例结果证明：本发明制备的携带pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin -Genomic-T87Q-RbPA的慢病毒感染CD34+造血干细胞后红系分化，可实现β珠蛋白的高表达，此项目技术有望达到改善及治愈患者β-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为β-地中海贫血的基因治疗药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中吉智药（南京）生物技术有限公司
<120> 一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggagctgcc gtattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc 60
atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 120
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 180
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 240
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 300
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 360
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 420
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 480
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tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 600
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 660
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ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 780
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 840
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gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt 1080
aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct 1140
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gggacagcta caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac 1260
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ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga 1860
cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg 1920
aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg 1980
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tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata 2100
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ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa actaaagaat 2340
tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttatcgatca cgagactagc ctcgagctag 2400
cgtttaaacg ggccctctag atcggaacgc gttatctgca gaattcccgg gatccttaat 2460
tagtcgacgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 2520
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatctgctt 2580
tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 2640
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca ataaaggaaa 2700
tttattttca ttgcaatagt gtgttggttt tttgtgtgct ctcacctata gtgagtcgta 2760
ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 2820
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ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg 2940
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 3000
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 3060
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 3120
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 3180
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ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 3300
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 3360
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attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 3480
tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 3540
tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 3600
gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 3660
atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg 3720
aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 3780
ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 3840
gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 3900
agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 3960
aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 4020
cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 4080
gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 4140
cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 4200
catttgatgc tcgatgagtt tttctaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4260
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4320
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4380
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4440
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4500
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 4560
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4620
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4680
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4740
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4800
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4860
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4920
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4980
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 5040
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 5100
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 5160
gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 5220
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 5280
agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 5340
tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc 5400
aagcgcgcaa ttaaccctca ctaaagg 5427
<210> 2
<211> 2696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctcaagat gataactttt attttctgga cttgtaatag ctttctcttg tattcaccat 60
gttgtaactt tcttagagta gtaacaatat aaagttattg tgagtttttg caaacacagc 120
aaacacaacg acccatatag acattgatgt gaaattgtct attgtcaatt tatgggaaaa 180
caagtatgta ctttttctac taagccattg aaacaggaat aacagaacaa gattgaaaga 240
atacattttc cgaaattact tgagtattat acaaagacaa gcacgtggac ctgggaggag 300
ggttattgtc catgactggt gtgtggagac aaatgcaggt ttataataga tgggatggca 360
tctagcgcaa tgactttgcc atcactttta gagagctctt ggggacccca gtacacaaga 420
ggggacgcag ggtatatgta gacatctcat tctttttctt agtgtgagaa taagaatagc 480
catgacctga gtttatagac aatgagccct tttctctctc ccactcagca gctatgagat 540
ggcttgccct gcctctctac taggctgact cactccaagg cccagcaatg ggcagggctc 600
tgtcagggct ttgatagcac tatctgcaga gccagggccg agaaggggtg gactccagag 660
actctccctc ccattcccga gcagggtttg cttatttatg catttaaatg atatatttat 720
tttaaaagaa ataacaggag actgcccagc cctggctgtg acatggaaac tatgtagaat 780
attttgggtt ccattttttt ttccttcttt cagttagagg aaaaggggct cactgcacat 840
acactagaca gaaagtcagg agctttgaat ccaagcctga tcatttccat gtcatactga 900
gaaagtcccc acccttctct gagcctcagt ttctcttttt ataagtagga gtctggagta 960
aatgatttcc aatggctctc atttcaatac aaaatttccg tttattaaat gcatgagctt 1020
ctgttactcc aagactgaga aggaaattga acctgagact cattgactgg caagatgtcc 1080
ccagaggctc tcattcagca ataaaattct caccttcacc caggcccact gagtgtcaga 1140
tttgcatgct ctagctgagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg gacatgtcag 1200
aggcagtgcc agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct gtgctgcact 1260
gatgaggagg atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt ggataaagga 1320
gacagccatg aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta aggacttgga 1380
tttcaaggaa ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc gagctggtgt 1440
gccagatgtg tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc tggccaccag 1500
ctatcagggc ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta ggtcaggttg 1560
gtggtgctgg gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca tgagtagagg 1620
gcagacatgg gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc tactactaca 1680
tgggactgct cccctatacc cccagctagg ggcaagtgcc ttgactccta tgttttcagg 1740
atcatcatct ataaagtaag agtaataatt gtgtctatct catagggtta ttatgaggat 1800
caaaggagat gcacactctc tggaccagtg gcctaacagt tcaggacaga gctatgggct 1860
tcctatgtat gggtcagtgg tctcaatgta gcaggcaagt tccagaagat agcatcaacc 1920
actgttagag atatactgcc agtctcagag cctgatgtta atttagcaat gggctgggac 1980
cctcctccag tagaaccttc taaccagctg ctgcagtcaa agtcgaatgc agctggttag 2040
acttttttta atgaggatct cgggaggcgg aggttgcagt gagctgagat cgtgccactg 2100
cactccagcc tgggggacag agcacattat aattaactgt tattttttac ttggactctt 2160
gtggggaata agatacatgt tttattctta tttatgattc aagcactgaa aatagtgttt 2220
agcatccagc aggtgcttca aaaccatttg ctgaatgatt actatacttt ttacaagctc 2280
agctccctct atcccttcca gcatcctcat ctctgattaa ataagcttca gtttttcctt 2340
agttcctgtt acatttctgt gtgtctccat tagtgacctc ccatagtcca agcatgagca 2400
gttctggcca ggcccctgtc ggggtcagtg ccccaccccc gccttctggt tctgtgtaac 2460
cttctaagca aaccttctgg ctcaagcaca gcaatgctga gtcatgatga gtcatgctga 2520
ggcttagggt gtgtgcccag atgttctcag cctagagtga tgactcctat ctgggtcccc 2580
agcaggatgc ttacagggca gatggcaaaa aaaaggagaa gctgaccacc tgactaaaac 2640
tccacctcaa acggcatcat aaagaaaatg gatgcctgag acagaatgtg acatat 2696
<210> 3
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacgtaaata cacttgcaaa ggaggatgtt tttagtagca atttgtactg atggtatggg 60
gccaagagat atatcttaga gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg 120
ccagaagagc caaggacagg tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca 180
ccctagggtt ggccaatcta ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata 240
aaagtcaggg cagagccatc tattgcttac atttgcttct gacacaactg tgttcactag 300
caacctcaaa cagacacc 318
<210> 4
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60
gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt 120
aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg 180
cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc 240
ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg 300
caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc 360
tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc ccagctgagt gagctgcact gtgacaagct 420
gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac ccttgatgtt ttctttcccc 480
ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggaga agtaacaggg tacacatatt 540
gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc ttttaatata 600
cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag ggcaataatg 660
atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa tttctgggtt 720
aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta actgatgtaa 780
gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt tattttatgg 840
ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat catgttcata 900
cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac 960
tttggcaaag aattcacccc accagtgcag gctgcctatc agaaagtggt ggctggtgtg 1020
gctaatgccc tggcccacaa gtatcactaa 1050
<210> 5
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 180
gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 240
acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 300
aacagccctg atgcctatgc cttattcatc cctcagaaaa ggattcaagt agaggcttga 360
tttggaggtt aaagttttgc tatgctgtat ttta 394
<210> 6
<211> 616
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattacttat tgttttagct gtcctcatga atgtcttttc actacccatt tgcttatcct 60
gcatctctca gccttgactc cactcagttc tcttgcttag agataccacc tttcccctga 120
agtgttcctt ccatgtttta cggcgagatg gtttctcctc gcctggccac tcagccttag 180
ttgtctctgt tgtcttatag aggtctactt gaagaaggaa aaacaggggg catggtttga 240
ctgtcctgtg agcccttctt ccctgcctcc cccactcaca gtgacccgga atctgcagtg 300
ctagtctccc ggaactatca ctctttcaca gtctgctttg gaaggactgg gcttagtatg 360
aaaagttagg actgagaaga atttgaaagg gggctttttg tagcttgata ttcactactg 420
tcttattacc ctatcatagg cccaccccaa atggaagtcc cattcttcct caggatgttt 480
aagattagca ttcaggaaga gatcagaggt ctgctggctc ccttatcatg tcccttatgg 540
tgcttctggc tctgcagtta ttagcatagt gttaccatca accaccttaa cttcattttt 600
cttattcaat acctag 616
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatcgatta cgtaaataca cttgcaaagg agg 33
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accctgattt ggtcaatatg tgtaccctgt tacttctccc cttcctatga 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcataggaag gggagaagta acagggtaca catattgacc aaatcagggt 50
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgctcgagc taggtattga ataagaaaaa tgaag 35
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagtgcagc tcactcagct gggcaaaggt gcccttgag 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaagggca cctttgccca gctgagtgag ctgcactgt 39
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataagaatgc ggccgcgcct caagatgata acttttattt tc 42
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaattctat gtcacattct gtctcaggca tc 32

Claims (5)

1.一种β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述β-珠蛋白重组慢病毒载体为pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-β-globin-Genomic-T87Q-RbPA，其包括pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、2.7kb β-LCR调控序列和表达第87位氨基酸突变的β珠蛋白HbβA-T87Q的表达盒，其中β-LCR为β-globin locus control region的简写，表达HbβA-T87Q的表达盒包含依次连接的β-globinpromoter序列、编码β-珠蛋白的基因组序列、β-globin polyA序列和β-globin enhancer序列，所述编码β-珠蛋白的基因组序列包含第87位氨基酸的突变T87Q，且在2号内含子上的第387位碱基至第761位碱基处缺失，所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA质粒序列如SEQ ID No:1所示，所述2.7kb β-LCR基因序列如SEQ ID No:2所示，β-globin promoter的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，编码β-珠蛋白的基因组序列的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，β-globin polyA的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，β-globin enhancer的核苷酸序列如SEQID No:6所示。
2.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒采用权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体和/或权利要求2所述的慢病毒。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体、权利要求2所述的慢病毒或权利要求3或4所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备治疗β-地中海贫血的基因治疗药物中的应用。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2024031060A1 (en) * 2022-08-04 2024-02-08 Elevatebio Technologies, Inc. Lentiviral vectors and uses thereof
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103403151A (zh) * 2011-01-03 2013-11-20 蓝鸟生物公司 提高基因转导的细胞的递送的方法
CN108713059A (zh) * 2016-02-12 2018-10-26 蓝鸟生物公司 Vcn增强子组合物和其使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103403151A (zh) * 2011-01-03 2013-11-20 蓝鸟生物公司 提高基因转导的细胞的递送的方法
CN108713059A (zh) * 2016-02-12 2018-10-26 蓝鸟生物公司 Vcn增强子组合物和其使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A combined approach for β-thalassemia based on gene therapy-mediated adult hemoglobin (HbA) production and fetal hemoglobin (HbF) induction;Cristina Zuccato等;《Ann Hematol》;20121231;第91卷;摘要、图1、3，第959页左栏最后1段 *
High-level β-globin expression and preferred intragenic integration after lentiviral transduction of human cord blood stem cells;Suzan Imren等;《J Clin Invest》;20041231;第114卷(第7期);第1203页右栏最后1段 *

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