JP2001517453A - 方 法 - Google Patents

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オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 改変された造血幹細胞(MHSC)を記載する。MHSCは１以上の虚血様応答配列(ILRE)に機能しうる形で連結された発現可能な対象のヌクレオチド配列(NOI)を少なくとも１つ含むものである。レトロウイルスベクターを開示する。このレトロウイルスベクターは、機能的スプライシング・ドナー部位及び機能的スプライシング・アクセプター部位を含み、機能的スプライシング・ドナー部位及び機能的スプライシング・アクセプター部位が、目的の第1のヌクレオチド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライシング・ドナー部位が、機能的スプライシング・アクセプター部位の上流にあり、レトロウイルスベクターがレトロウイルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的スプライシング・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と、機能的スプライシング・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含み、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクター。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 本発明は方法に関する。特に、本発明は、対象のヌクレオチド配列(NOI)を造 血幹細胞(HSC)に送達する方法に関する。 【０００２】 また本発明は、対象のヌクレオチド配列(NOI)を造血幹細胞(HSC)に送達するた
めのベクターの使用に関する。 【０００３】 遺伝子導入は、１以上のNOIおよびそれらの発現を制御する配列からなる発現 カセットを、HSCなどの標的細胞へ送達することを伴う。これは、研究施設にお いて前記カセットを細胞に導入し、改変された細胞をレシピエントに投与する処
置によりex vivoで行うことができる。あるいはまた、遺伝子導入は、発現カセ ットを個体の細胞に直接導入する方法によりin vivoで行うこともできる。両方 の方法において、導入過程は、通常、カセットを適切な細胞内部位に送達するの
を助けるベクターによって介助される。 【０００４】 標的部位における治療遺伝子の発現は、プロモーター配列およびエンハンサー
配列により調節できる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細
胞タンパク質と特異的に相互作用する短いアレイのDNA配列からなる(Maniatisら
、1987 Science 236:1237)。プロモーター配列およびエンハンサー配列は、種々
の真核生物起源(酵母、昆虫、哺乳動物細胞およびウイルスの遺伝子を含む)から
単離されている。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、どのような
細胞型を使用して対象のタンパク質/遺伝子を発現させるかに依存する。 【０００５】 プロモーターは、様々な組織型およびいくつかの異なる種の生物において機能
的であってもよいし、もしくはその機能は特定の種および/または特定の組織に 限定されていても良い。プロモーター/エンハンサーは、広域の宿主範囲(例えば
SV40、ヒトCMV)を有していてもよく、もしくは細胞型の限定されたサブセットに
おいてのみ機能的であってもよい。さらに、プロモーターは、特定の条件下(例 えば、低酸素下もしくはエンハンサー配列の存在下)においてまたは生物の特定 の発達段階の間に(例えば、胎児において活性であるが成体においてはサイレン トである)、構成的に活性であるかもしくは特定の物質(例えば、組織特異的因子
)により選択的に活性化されてもよい。骨髄は、形質導入のためのHSCの従来から
の起源であるが、より最近の研究からは、末梢血幹細胞または臍帯血細胞が同等
に優れたまたはより優れた標的細胞であることが示唆されている(Casselら 1993
Exp Hematol 21:585-591；Bregniら 1992 Blood 80:1418-1422；Luら 1993 J E
xp Med 178:2089-2096)。 【０００６】 さらに最近、ウシ胎児繊維芽細胞から核移植によってクローン化された胚由来
の有能な幹細胞が抽出された(FirstおよびThompson 1998 Nature Biotechnology
16:620；Cohen 1998 New Scientist 11、７月、4-5)。ヒト胚幹細胞系が入手可
能になれば、特定の疾患を遺伝子治療および/または移植によって治療するため に、in vitroで誘導した分化細胞の起源を制限なく供給することができるだろう
。 【０００７】 また、CD34+などの抗原についての陽性選択または直系(lineage)特異的抗原に
ついての陰性選択によるHSCの形質導入前富化についても研究されてきた。これ は形質導入効率にそれほど影響を及ぼさないように見えるが、ex vivo操作およ び形質導入のためにより実用的な容量を得ることを可能にする(Hughesら 1992 前掲；Berensonら 1998 J Clin Invest 81:951-955) 【０００８】 HSCへの導入効率の低さは、細胞循環および細胞組込みの欠如によるものか、 または不十分なウイルス受容体濃度によるものと示唆されてきた。 【０００９】 この問題を克服するために、ウイルスベクターに特定の部位を指向させるため
の様々な方法が採用されてきた。これらには、(i)レトロウイルスベクター上の エンベロープタンパク質を改変する、(ii)プロモーター/エンハンサーを用いて 、発現を特定の部位に限定する、そして(iii)標的細胞上の受容体に特異的なリ ガンドをベクターに付与することが挙げられる。 【００１０】 例えば、リガンド-受容体相互作用によってc-Kit受容体を発現している同種指
向性ヒト細胞を指向できる組換えレトロウイルスベクターが作製されている(Yaj
imaら 1998 Hum Gen Ther 10: 779-787)。同種指向性(モロニーマウス白血病ウ イルス)エンベロープタンパク質は、マウス幹細胞因子(mSCF)のＮ末端の161のア
ミノ酸をコードする配列を挿入することによって改変した。このベクターが、表
面でc-Kitを発現している細胞を指向するのに有用であることが分かりうること が示唆されている。 【００１１】 さらに例えば、その他の研究者ら(Fieldingら 1998 Blood 91: 1802-1809)は 、in vitro癌細胞が、幹細胞因子(SCF)をキメラエンベロープ糖タンパク質の一 部として呈示するレトロウイルスベクターによって選択的に形質導入され得るの
に対して、HSCが、上皮増殖因子(EGF)をエンベロープの一部として呈示するレト
ロウイルスベクターによって選択的に形質導入され得ることを示している。 【００１２】 さらに、HSCは、水泡性口内炎Ｇ(VSV-G)を担持するウイルスベクターでも形質
導入されている。WO9609400号によれば、CD34+Thy-1+移動性血液細胞(mobilized
blood cells)が、VSV-G疑似型レトロウイルスベクターによって、CD34上成体骨
髄細胞と比較して、ならびに従来の両種指向性ベクターの形質導入効率と比較し
て、驚異的に高い効率で形質導入されている。 【００１３】 集団において、癌になる恐れの高い個体を、個体の遺伝子構成によって検出す
る能力が向上するということは(Cornelisseら 1996 Pathol Res Pract. 192: 68
4-693)、特にこれらの疾患に罹患する恐れのある個体において予防が必要である
ことを意味する。同様に、集団において、冠動脈性心臓疾患または慢性関節リウ
マチに遺伝的に罹患しやすい個体、もしくは大脳マラリアを引き起こす変形体寄
生物(plasmodium parasites)に曝された個体についても、特にこれらの疾患に罹
患する恐れのある個体において予防が必要であることを意味する。 【００１４】 特に、癌の分子遺伝学についての理解が深まったことで、癌に対する様々な新
規の治療法が開発された。現在臨床試験において検査されている遺伝子レベルの
治療には、ウイルスまたはリポソームベクターをex vivoまたはin vivoで使用し
て、遺伝子を腫瘍に送達して以下のことを生じることが大きく関与している。す
なわち、(i)腫瘍サプレッサー遺伝子との置換または腫瘍遺伝子の不活性化、(ii
)抗腫瘍免疫メカニズムを活性化または増強することが知られているサイトカイ ン/ワクチンの発現、(iii)増強された薬物感受性(例えば、プロドラッグ送達ま たは活性化)、(iv)高用量化学療法から骨髄を保護するための薬物耐性、および(
v)腫瘍脈管形成のインヒビター(RothおよびCristiano 1997 J Natl Cancer Inst
89: 21；JaggarおよびBicknell R 1997 'Tumour Angiogenesis' Bicknell、L
ewisおよびFerarra編 357-372頁 Oxford University Press, Oxford. UK)。 【００１５】 特に固形腫瘍(solid tumour)に対して上記治療遺伝子の発現を標的化させるこ
とは、最近まで問題を有していた。場合によっては、治療遺伝子を担持する組換
えウイルスベクターには、リガンド/抗体をそのウイルスカプシドに挿入するこ とによって、特定の細胞型を指向させていた。このアプローチは、腫瘍細胞によ
る腫瘍抗原および組織特異的抗原の発現を必要とする。従って、どの治療も、選
択された腫瘍抗原の発現を示す特定の患者集団および腫瘍型に対する使用に限定
される。あるいはまた、裸の(naked)またはウイルス組込みDNAを腫瘍(または少 なくとも腫瘍に対する局所血液供給部位)に直接注射して、送達の特異性ならび に腫瘍部位における発現を最大化できる。しかし、このアプローチは、皮相腫瘍
(例えば、胸部およびメラノーマ病巣)に対する成功には限界があり、腫瘍の正確
な位置を突き止めることに依存し、全腫瘍塊がDNAを確実に取り込むとは限らず 、また二次的に局在している沈着物または遠隔転移した沈着物は治療しない(Rot
hおよびCristiano 1997 J Natl Cancer Inst 89:21)。 【００１６】 最近、治療遺伝子発現を腫瘍に指向させる代替的なアプローチが開発された(D
achsら 1997 Nature Med 5:515)。これは、起源および位置とは無関係にほぼ全 ての固形腫瘍に存在する異常生理学を利用し、重篤な虚血の腫瘍特異的条件、お
よび特定の遺伝子の特異的エンハンサー領域に対する該条件の影響を使用して、
異種遺伝子の発現を制限する(Dachsら、1997 前掲；英国特許出願第9701975.6号
)。 【００１７】 急速進行性(aggressive)腫瘍は、通常血液供給が不十分である。これは一部に
は腫瘍細胞が血管を作る内皮細胞よりも速く増殖するからであり、一部には新た
に形成された血管供給が無秩序であるからである(Vaupel 1993 'Drug Resistanc
e in Oncology'中、53-85頁、Teicher BA. Marel Dekker編, New York)。これは
、虚血および栄養遮断領域を生じ、酸素圧低下(低酸素)およびグルコース低下の
両方が生じる領域もある。腫瘍の酸素電極測定では、2.5 mmHg未満で読取れたも
のが相当な割合を占めていた(正常組織は24〜66 mmHgの範囲にある)(Kallinowsk
i 1996 The Cancer J. 9:37)。また、低酸素細胞は、放射線治療および化学療法
に対して感受性が顕著に低く、これは、腫瘍性低酸素の程度の上昇が、多様な形
態の癌における生存率の低下と相関する理由の一部である(Kallinowski 1996 前掲)。 【００１８】 つまり、虚血は、細胞起源または患者集団とは無関係に、固形腫瘍の一般的な
特徴である。最近、腫瘍性低酸素を利用して、腫瘍において遺伝子の選択的発現
が可能なことが示された(Dachs 1997 前掲)。低酸素は、広範で多様な細胞型に おける遺伝子発現の強力な調節因子であり(WangおよびSememnza 1993 Proc Natl
Acad Sci USA 90:4304)、多様な遺伝子プロモーター上のコグネイトDNA認識部 位(低酸素応答配列(HRE))と結合する低酸素誘導因子-1(HIF-1)などの低酸素誘導
転写因子の活性を誘導することにより作用する(WangおよびSememnza 1993 前掲)
。Dachsら(1997前掲)は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK-1)遺伝子由
来のHREの多量体形態(Firthら 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91: 6496)を使用 して、in vitroでは低酸素に応答しておよびin vivoでは固形腫瘍内で、ヒト繊 維肉腫細胞によってマーカー遺伝子および治療遺伝子の両方の発現を制御した(D
achsら 1997 前掲)。あるいはまた、腫瘍の虚血領域には顕著なグルコース遮断 も存在するという事実から、HREを使用して、腫瘍において異種遺伝子発現を特 異的に活性化できる。グルコース遮断によって特に活性化されることが知られて
いる、末端平滑化されたgrp78遺伝子プロモーターの632塩基対配列も、in vivo でマウス腫瘍におけるレポーター遺伝子の高レベル発現を引き起こしうることが
示されている(Gazitら 1995 Cancer Res. 55:1660)。 【００１９】 虚血障害は、その他多くの組織においても、組織への血液供給が低下したり血
液供給がなくなったりした場合に生じることがある。卒中、深静脈血栓症、肺動
脈塞栓症、および腎不全は、そのような障害を生じうる症状の例である。心筋梗
塞と呼ばれる心臓組織の細胞死は、その大部分が虚血および/または虚血とその 後の再灌流から生じる組織障害によるものである。再発性虚血および再灌流は、
典型的に、反応性酸素種(reactive oxygen species)由来の細胞に対して酸化障 害を生じる。障害の程度および種類は、低酸素ストレスの重度および性質に依存
する。例えば、ストレスにより組織壊死が生じることがある。あるいはまた、ス
トレスからアポトーシス(プログラム化細胞死)が生じて障害細胞が無くなること
もある。 【００２０】 今日までの前臨床段階での研究は、マーカー遺伝子または治療遺伝子でトラン
スフェクトされた腫瘍細胞のみを用いてそれらの腫瘍内での特異的発現が示され
てきた。(DunbarおよびEammons 1994 Stem Cells 12:563-576；Crystal 1995 Sc
ience 270:404-410；LeeおよびKlein 1995 Transfusion Medicine II 9:91-113 による概論を参照)。従って、遺伝子治療プロトコールのために、これらの構築 物をどのようにして、固形腫瘍にin vivoで導入するのが最も良いかという問題 が残る。 【００２１】 マクロファージと呼ばれる免疫系における細胞を送達ビヒクルとして利用し、
薬物および治療遺伝子を固形腫瘍に指向させるための方法も記載されている(英 国特許出願第9701975.6号；英国特許出願第9620952.3号)。血流由来の単球から 誘導されたマクロファージが、固形腫瘍に連続的に侵入し、乳癌の血管新生が乏
しい虚血部位において凝集することが示されている(Leekら 1996 Cancer Res. 5
6:4625)。さらに、これらの腫瘍における虚血誘導壊死の程度は、腫瘍内マクロ ファージ浸潤の程度と正相関している(Lewis 1997 Clin Exp Met 15:74)。 【００２２】 また、単球およびマクロファージは、虚血病巣にも浸潤するが、これは大脳マ
ラリア(Katoら 1996 Brain Res 734:203-212；Patnaikら 1994 Am J Trop Med H
yg 51:642-647；Sakuraiら 1995 J Cardiol 26: 139-147)、冠動脈性疾患(Stary
ら 1994 J Arterio Thromb 14: 840-856；Uedaら 1997 Hiroshima J. Med Sci 4
6:31-42)；ならびに慢性関節リウマチ(Mappら 1995 Br Med Bull 51: 419-436；
Sackら 1994 Rheumatol Int 13: 181-186；Lioteら 1996 Clin Exp Immunol 106
: 13-19)などの他の疾患症状の特徴である。 【００２３】 単球およびそれらの分化した誘導体(即ちマクロファージ)は比較的長期にわた
ってin vivoで生存する細胞であるが、これらを使用する際の欠点はそれらの増 殖能力が非常に限定されていることである。 【００２４】 マクロファージは、マクロファージに導入された治療遺伝子のために体内で十
分に長く持続して、個体の潜在的な生存期間にわたって予防を提供することがで
きない。従って、このような細胞への遺伝子導入に依存する治療はいずれも必然
的に、レシピエント細胞の寿命によって作用持続期間が限定されてしまう。 【００２５】 マクロファージを、マーカー遺伝子および治療遺伝子を固形腫瘍に送達するた
めのビヒクルとして利用する方法が記載されているが、HSCを利用して、低酸素 または低グルコース濃度のような虚血に特徴づけられる固形腫瘍などの部位にNO
Iを送達する手段を得る必要がある。 【００２６】 さらに、低酸素または低グルコース濃度のような虚血に特徴づけられる癌やそ
れに関連する障害のための予防ワクチンを提供する必要がある。 【００２７】 本発明の第１の態様によれば、１以上の虚血様応答配列(ILRE)に機能しうる形
で連結された発現可能な対象のヌクレオチド配列(NOI)を少なくとも１つ含んで なる改変された造血幹細胞(MHSC)が提供される。 【００２８】 本発明の第２の態様によれば、MHSCを分化させる能力がある１以上の作用剤と
組み合わされた本発明によるMHSCが提供される。 【００２９】 本発明の第３の態様によれば、本発明によるMHSCを、場合により製薬上許容さ
れる希釈剤、賦形剤または担体と混合して、含んでなる医薬組成物が提供される
。 【００３０】 本発明の第４の態様によれば、医療に使用するための本発明によるMHSCが提供
される。 【００３１】 本発明の第５の態様によれば、本発明によるMHSCの１以上のNOIを虚血環境に おいて発現させることからなる、虚血環境における１以上のNOIの発現方法が提 供される。 【００３２】 本発明の第６の態様によれば、虚血と関連した症状または虚血が原因で生じる
症状を治療する医薬の製造における本発明のMHSCの使用が提供される。 【００３３】 本発明の第７の態様によれば、本発明のMHSC、または本発明の医薬組成物を投
与し、１以上のNOIを発現させることからなる、治療を必要とする個体の治療方 法が提供される。 【００３４】 本発明の第８の態様によれば、１以上のウイルスベクター(そのうちの少なく とも１つのウイルスベクターがNOIを含む)を用いたウイルス形質導入により細胞
を形質転換することによって作製される、該細胞内で活性のある配列およびNOI を含んでなる改変細胞が提供される。 【００３５】 本発明の第９の態様によれば、二次ウイルスベクターをコードする一次ウイル
スベクターを１以上含んでなるin vivo遺伝子送達のためのハイブリッドウイル スベクター系であって、一次ウイルスベクターは第一の標的細胞に感染して、そ
こで二次ウイルスベクターを発現する能力があり、二次ウイルスベクターは第２
の標的細胞を形質導入する能力があり、一次ウイルスベクターおよび/または二 次ウイルスベクターは本発明のILREまたは本発明の細胞特異的調節配列を含むも
のである、上記ハイブリッドウイルスベクター系が提供される。 【００３６】 本発明の第10の態様によれば、一次ウイルスベクターがアデノウイルスベクタ
ーから得られるかまたはそれに基づくものであり、かつ/または二次ウイルスベ クターがレトロウイルスベクター好ましくはレンチウイルスベクターから得られ
るかまたはそれに基づくものであり、一次ウイルスベクターおよび/または二次 ウイルスベクターが本発明のILREまたは本発明の細胞特異的調節配列を含む、ハ
イブリッドウイルスベクター系が提供される。 【００３７】 本発明の第11の態様によれば、本明細書中で定義される１以上の新規のベクタ
ー、構築物、プロモーター、または調節配列が提供される。 【００３８】 本発明の第12の態様によれば、正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血
状態のものでは強く誘導されるアデノウイルスベクター構築物が提供される。 【００３９】 本発明の第13の態様によれば、正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血
状態のものでは強く誘導されるレンチウイルスベクター構築物が提供される。 【００４０】 本発明の第14の態様によれば、正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血
状態のものでは強く誘導される１以上の組み合わされたアデノウイルスおよびレ
ンチウイルス構築物が提供される。 【００４１】 本発明の第15の態様によれば、任意の疾患において使用する任意の細胞型にIL
RE調節遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターの使用が提供される。 【００４２】 本発明の第16の態様によれば、任意の疾患において使用する任意の細胞型にIL
RE調節遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用が提供される。 【００４３】 本発明の第17の態様によれば、任意の疾患に使用する任意の細胞型にILRE調節
遺伝子を送達するための組合わされたアデノウイルスおよびレンチウイルスベク
ターの使用が提供される。 【００４４】 好ましくは、ILREは、転写調節配列(例えばプロモーター)と組み合わせて使用
する。この転写調節配列は、１つ以上の選択細胞型において活性であり、好まし
くは１つの細胞型においてのみ活性である。本発明のこの組合わせの態様は、応
答配列と呼ばれる。この応答配列は少なくとも本明細書中で定義するILREを含む
。 【００４５】 そのような応答配列の限定しない例として、OBHRE1およびXiaMacが挙げられる
。別の限定しない例として、MLVプロモーターおよび/または組織限定型虚血応答
性プロモーターと共に使用するILREが挙げられる。 【００４６】 上記虚血応答性プロモーターは、組織限定型虚血応答性プロモーターであるこ
とが好ましい。 【００４７】 上記組織限定型虚血応答性プロモーターは、抑制(repression)によって限定さ
れるマクロファージ特異的プロモーターであることが好ましい。 【００４８】 上記組織限定型虚血応答性プロモーターは、内皮特異的プロモーターであるこ
とが好ましい。 【００４９】 上記ベクターは、ILRE調節型レトロウイルスベクターであることが好ましい。 【００５０】 上記ベクターは、ILRE調節型レンチウイルスベクターであることが好ましい。 【００５１】 上記ベクターは、ILRE調節型アデノウイルスベクターであることが好ましい。 【００５２】 上記ベクターは、ILRE調節型ハイブリッドアデノウイルス/レンチウイルスベ クターであることが好ましい。 【００５３】 好ましくは、ベクターは、自己調節型低酸素症応答性レンチウイルスベクター
（autoregulated hypoxia responsive lentiviral vector）である。 【００５４】 「虚血様応答配列（ischaemia like response element）」（またはILREと記 す）という用語は、虚血状態、または虚血に似たもしくは虚血が原因で生じる状
態において、応答性であるかまたは活性であるエレメントである。虚血に似た若
しくは虚血が原因で生じる症状の例としては、低酸素症および/または低グルコ ース濃度症が挙げられる。 【００５５】 虚血症とは、特定の器官または組織への不充分な血液供給である。血液供給が
減った結果、その器官もしくは組織への酸素供給が不充分となる（低酸素症）。
低酸素症が長引くと、患部である器官もしくは組織に障害をきたすことがある。 【００５６】 好適なILREは、低酸素症応答配列（HRE）である。 【００５７】 本発明のMHSCは、ウイルスベクターの使用により調製することができ、このベ
クターをウイルス的および/または非ウイルス的手段によりHSCに送達することが
できる。 【００５８】 MHSCを分化させることができる好適な試薬の例としては、サイトカインおよび
/または増殖因子がある。この実施形態において、つぎにMHSCを１以上の異なる 細胞型に分化させることができる。 【００５９】 幾つかの用途においては、MHSCを、例えば個体に送達する前などに単離するこ
とが望ましい場合もある。MHSCは、濾過、遠心分離、ミクロピペットなどの標準
的な技術により単離することができる。 【００６０】 本発明の利点は、虚血症、低酸素症または低グルコース症により特徴付けられ
る病気（例えば癌、大脳マラリア、虚血性心臓病または慢性関節リウマチなどが
あるが、これらに限定されない）の治療または予防に使用する手段および方法を
提供することである。 【００６１】 １つの態様において、本発明は、HSC、より具体的にはCD34+HSCにNOIを送達す
るための送達系の使用に関する。 【００６２】 他の態様において、本発明は、HSCに少なくとも１つのNOIを含ませるための遺
伝子操作方法を提供する。この方法は、少なくとも１つのNOIを含むベクターでH
SCの集団をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、この場合、NOIは 、虚血症、低酸素症または低グルコース症により特徴付けられる病気の治療また
は予防のために選択される。 【００６３】 他の態様において、本発明は、本発明の上記方法により製造されるMHSCを提供
する。 【００６４】 さらに他の態様において、本発明は、上記方法で使用するのに適した、少なく
とも１つのNOIを含み且つ/またはNOIを挿入することができる少なくとも１つの 挿入部位を有するベクターを提供する。このようなベクターは、少なくとも１つ
のNOIをHSCに送達するように順応される。 【００６５】 さらに他の態様において、本発明は、虚血症、低酸素症または低グルコース症
によって特徴付けられる病気の治療または予防のための薬剤であって、ベクター
および/またはMHSCを上記のように適切な製薬上許容される担体と共に含む薬剤 を提供する。 【００６６】 さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つのNOIを治療すべき個体 から得たHSCの集団に送達するための方法を提供する。この方法は、細胞のトラ ンスフェクションまたは形質導入を可能とする条件下において上記のように細胞
をベクターに接触させ、このトランスフェクトまたは形質導入した細胞をその個
体に再び導入することを含んでなる。 【００６７】 本発明はさらに、少なくとも１つのNOIを治療すべき個体のHSCの集団に送達す
るための方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載される薬剤を個体に投
与することを含んでなる。 【００６８】 本発明に従って、哺乳動物における癌の治療または予防方法がさらに提供され
る。この方法は、HSCに富んだ細胞の集団を治療すべき個体から単離すること、 細胞のトランスフェクションまたは形質導入を可能とする条件下において少なく
とも１つのNOIを含む本明細書中に記載したベクターと細胞とを接触させること 、この遺伝子操作により得られたMHSCを適切な条件下で培養すること、および培
養したMHSCまたはその分化した子孫をその個体に再び導入することを含んでなる
。 【００６９】 本発明に従って、NOI（単数または複数）は、任意の好適なヌクレオチド配列 であってよい。例えば、各配列は独立してDNAまたはRNAであってもよく、これら
は合成により調製しても、DNA組換え技法を使用して調製しても、または天然起 源から単離してもよいし、それらの組合せにより調製してもよい。該配列は、セ
ンス配列であってもアンチセンス配列であってもよい。複数の配列が可能であり
、これらは互いに直接または間接的に結合されていてもよいし、これらの組合せ
であってもよい。 【００７０】 １つの好適な実施形態において、本発明は、１以上のHSCを１以上のNOIで形質
転換するためのレトロウイルスベクターの驚くべき使用に基づく。この場合、形
質転換されたMHSCを特別な方法で使用することができる。 【００７１】 本発明のレトロウイルスベクターの態様は、任意の好適なレトロウイルスから
得てもよいし、また得ることが可能である。以下の教示はいずれも、本発明に適
用可能である。 【００７２】 従来技術の情報として、レトロウイルスは、溶菌性ウイルスのライフサイクル
とは異なるライフサイクルを有するRNAウイルスである。この点に関して、レト ロウイルスは、DNAを媒介として複製する感染性存在物である。レトロウイルス が細胞に感染すると、そのゲノムは逆転写酵素によりDNA形態に変換される。こ のDNAコピーは、新しいRNAゲノム、および感染性ウイルス粒子のアセンブリーに
必要なウイルス的にコードされたタンパク質を産生するため鋳型として機能する
。 【００７３】 多くのレトロウイルスが存在し、その例としては、ネズミ白血病ウイルス（MV
L）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ウマ感染性貧血症ウイルス（EIAV）、マウ
ス乳癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、フジナミ肉腫ウイルス （FuSV）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Mo-MLV）、FBRネズミ骨肉種ウイル ス（FBR MSV）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Mo-MSV）、エーベルソンネズミ
白血病ウイルス（A-MLV）、鳥類骨髄球腫症ウイルス-29（MC29）および鳥類赤芽
球症（AEV）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Coffin et al.,
"Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin,
SM Hughes, HE Varmus pp758-763に見出すことができる。 【００７４】 幾つかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は、当技術分野で見つけ
ることができる。例として、HIVについての詳細は、NCBI Genbankから見出すこ とができる(即ちGenome Accession No. AF033819)。 【００７５】 主に、全ての野生型レトロウイルスは、３つの主なコーディングドメイン、ga
g、pol、envを含み、これらのドメインは重要なビリオンタンパク質をコードす る。しかしやはり、レトロウイルスは２つのカテゴリー、つまり「単純」なもの
および「複雑」なものに分けることができる。これらのカテゴリーは、そのゲノ
ム構成により区別することが可能である。単純なレトロウイルスは通常、基本的
な情報のみを保持する。これに対し、複雑なレトロウイルスは、複数のスプライ
シングされたメッセージから得られる調節タンパク質も更にコードする。 【００７６】 レトロウイルスはさらに７つのグループに分けることができる。これらのグル
ープのうちの５つは、腫瘍形成の可能性があるレトロウイルスである。残りの２
つのグループは、レンチウイルスおよびスプマウイルスである。これらのレトロ
ウイルスの概説は、「Retroviruses」(1997 Cold Spring Harbour Laboratory P
ress Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 1-25)に提供されている。 【００７７】 ヒトT細胞白血病ウイルス-ウシ白血病ウイルス群（HTLV-BLV）以外の全ての腫
瘍形成メンバーは、単純なレトロウイルスである。HTLV、BLVおよびレンチウイ ルスおよびスプマウイルスは、複雑なウイルスである。最も研究されている腫瘍
形成性レトロウイルスの幾つかは、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、マウス乳癌ウ イルス（MMTV）およびネズミ白血病ウイルス（MLV）およびヒトT細胞白血病ウイ
ルス（HTLV）である。 【００７８】 レンチウイルス群は、さらに「霊長類性」および「非霊長類性」に分けること
ができる。霊長類性レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV ）、ヒト自己免疫不全症（AIDS）の病原体、およびサル免疫不全ウイルス（SIV ）が挙げられる。非霊長類性レンチウイルス群には、プロトタイプの「スローウ
イルス」ビスナ/マエディウイルス（VMV）、および関連するカプリン関節炎-脳 炎ウイルス（CAEV）、ウマ感染性貧血症ウイルス（EIAV）、ならびにより最近に
なって記載されたネコ免疫不全ウイルス（FIV）およびウシ免疫不全ウイルス（B
IV）が含まれる。 【００７９】 レンチウイルスファミリーとレトロウイルスの他のタイプとの違いは、レンチ
ウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有することである
（Lewis et al 1992 EMBO. J 11: 3053-3058; Lewis and Emerman 1994 J. Viro
l. 68: 510-516）。これに対し、他のレトロウイルス（MLVなど）は、例えば筋 肉、脳、肺および肝組織などを構成する細胞のような非分裂細胞には感染するこ
とができない。 【００８０】 感染過程の間、レトロウイルスはまず特定の細胞表面受容体に結合する。感染
しやすい宿主細胞に入ると、レトロウイルスRNAゲノムはウイルス的にコードさ れた逆転写酵素（親ウイルスの中に保持されている）によりDNAにコピーされる 。このDNAは、宿主細胞の細胞核に輸送され、続いてそこで宿主ゲノムの中に組 み込まれる。この段階では、該ウイルスは一般的にはプロウイルスと呼ばれる。
このプロウイルスは、細胞分裂の間、宿主の染色体の中において安定であり、他
の細胞タンパク質と同様に転写される。該プロウイルスは、より多くのウイルス
を作製するのに必要なタンパク質およびパッケージング機構をコードし、これら
のウイルスはしばしば「出芽」と呼ばれるプロセスにより細胞から出ていくこと
ができる。 【００８１】 先に記載したように、各レトロウイルスゲノムはgag、polおよびenvと呼ばれ る遺伝子を含み、これらの遺伝子はビリオンタンパク質および酵素をコードする
。プロウイルスにおいて、これらの遺伝子はその両端で長い反復末端配列（LTR ）と呼ばれる領域によりフラキングされている。LTRは、プロウイルスの組込み および転写に関与する。これらの配列は、エンハンサー-プロモーター配列とし ても機能する。 【００８２】 言いかえると、LTRは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レト ロウイルスRNAのカプセル化は、ウイルスゲノムの５'末端に位置するpsi配列の 働きにより生ずる。 【００８３】 LTR自体は、U3、RおよびU５と呼ばれる３つのエレメントに分割することがで きる同じ配列である。U3は、RNAの３'末端に独特な配列から得られる。Rは、RNA
の両端で繰り返される配列から得られ、およびU5はRNAの５'末端に独特な配列か
ら得られる。これら３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間では
大きく異なり得る。 【００８４】 理解し易いように、レトロウイルスゲノムのRNAおよびDNA形態の単純な全体構
造（縮尺率は正確ではない）が図33に示されており、この中で、LTRの基本的な 特徴ならびにgag、polおよびenvの相対的位置が示されている。 【００８５】 図３に示されるように、感染性レトロウイルスRNAゲノムの基本的な分子構成 は、（5'）R-U5-gag、pol、env-U3-R(3')である。欠陥レトロウイルスベクター ゲノムにおいて、gag、polおよびenvは存在しないかまたは機能しない。RNAの両
端にあるR領域は、反復配列である。U5およびU3は、それぞれRNAゲノムの５'末 端および３'末端にある独特な配列を表わす。 【００８６】 ビリオンRNAの二本鎖DNAへの逆転写は細胞質内で起こり、鋳型分子の５'末端 から３'末端まで逆転写酵素の２回ジャンプを伴う。これらのジャンプの結果、 ビリオンRNAの５'末端および３'末端に位置する配列が複製される。次に、これ らの配列はウイルスDNAの両端でタンデムに融合され、R、U5およびU3領域を含む
長い反復末端配列（LTR）を形成する。逆転写が完了すると、ウイルスDNAは細胞
核に転座し、そこでレトロウイルスゲノムの線状コピー（プレ組込み複合体（PI
C）と呼ばれる）が、ビリオン・インテグラーゼにより染色体DNAにランダムに挿
入されて、安定なプロウイルスを形成する。宿主細胞ゲノムへの組み込みが可能
な部位の数は非常に多く、且つ広範囲に分布している。 【００８７】 プロウイルス転写の制御は、ウイルスLTRの非コード配列にたいてい在る。転 写開始部位は、左側のLTR（上記）の中のU3とRとの間の境界にあり、ポリ（A） 付加（終結）部位は、右側LTR（上記）の中のRとU5との間の境界にある。U3は、
プロウイルスの転写制御エレメントの大部分を含み、これにはプロモーターなら
びに細胞性転写アクチベータータンパク質および幾つかの場合においてはウイル
ス転写アクチベータータンパク質に対して応答性である多数のエンハンサー配列
が含まれる。幾つかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク
質をコードする以下の遺伝子（例えばtat、rev、taxおよびrexなど）のうち１以
上の任意のものを有する。 【００８８】 プロウイルスDNAの転写により、全長ウイルスRNAゲノムおよびRNAのプロセッ シングにより生成したサブゲノムサイズのRNA分子が再び形成される。一般的に 、全てのRNA産物は、ウイルスタンパク質を産生するための鋳型として機能する 。RNA産物の発現は、RNA転写産物のスプライシングおよび翻訳中のリボソームの
フレームシフトの組合せにより達成される。 【００８９】 RNAのスプライシングは、介在もしくは「イントロン」RNA配列が除去され、残
りの「エキソン」配列が連結されて、翻訳のための連続的なリーディングフレー
ムを提供するプロセスである。レトロウイルスDNAの一次転写産物は、幾つかの 方法で修飾され、細胞mRNAに非常に良く似ている。しかし、全てのイントロンが
効率的にスプライシングされる多くの細胞性mRNAとは異なり、新しく合成された
レトロウイルスRNAは、２つの集団に分けられる。一方の集団は、スプライシン グされないまま残ってゲノムRNAとして機能し、他方の集団は、スプライシング されてサブゲノム型RNAを提供する。 【００９０】 スプライシングされていない全長レトロウイルスRNA転写産物は、２つの機能 を果たす。すなわち（i）これらの転写産物はgagおよびpol遺伝子産物をコード し、および（ii）これらの転写産物は子孫のビリオン粒子にゲノムRNAとしてパ ッケージングされる。サブゲノムサイズのRNA分子は、ウイルス遺伝子産物の残 りのためのmRNAを提供する。全てのスプライシングされたレトロウイルス転写産
物は第１エキソンを持ち、これは５'LTRのU5領域にまたがっている。最終的なエ
キソンは、３'LTRによりコードされるU3およびR領域を常に保持するが、サイズ は異なる。RNA構造の残りの組成は、スプライシングの回数および選択的なスプ ライシング部位の選択に依存する。 【００９１】 単純なレトロウイルスにおいて、新しく合成されたレトロウイルスRNAの一方 の集団は、スプライシングされないまま残ってゲノムRNAならびにgagおよびpol のためのmRNAとして機能する。他方の集団はスプライシングされ、該ゲノムRNA の５'部分が下流遺伝子（最も一般的にはenv）に融合される。スプライシングは
、gagの上流に位置するスプライシング・ドナー部位およびpolの３'末端の近く のスプライシング・アクセプター部位の使用により達成される。スプライシング
により除去される、スプライシング・ドナー部位とスプライシング・アクセプタ
ー部位との間のイントロンは、gagおよびpol遺伝子を含む。このスプライシング
事象により、エンベロープ（Env）タンパク質のためのmRNAが生成する。一般的 に、スプライシング・ドナー部位はgagの上流にあるが、幾つかのウイルス（例 えばASLVなど）においてはスプライシング・ドナー部位はコドン数個分がgag遺 伝子の中に配置され、これにより、Gagと共通の数個のアミノ末端側アミノ酸残 基を含む一次Env翻訳産物が得られる。Envタンパク質は、膜結合ポリリボソーム
上で合成され、細胞の小胞体輸送により形質膜に輸送され、そこでウイルス粒子
に取り込まれる。 【００９２】 複雑なレトロウイルスは、単回および複数回スプライシングされた転写産物の
両方を生成し、これらの転写産物はenv遺伝子産物だけでなく、これらのウイル スに独特な調節タンパク質およびアクセサリータンパク質のセットもコードする
。レンチウイルスなどの複雑なレトロウイルス、特にHIVは、レトロウイルスの 感染中に生じ得る選択的スプライシングの複雑性の顕著な例を提供する。例えば
、HIV-1は、一次ゲノム転写産物からの準最適スプライシングにより、30を超え る異なるmRNAを産生することができることは、現在知られている。この選択プロ
セスは、競合するスプライシング・アクセプター部位を破壊する突然変異により
、スプライシングのパターンをシフトさせることができることおよびウイルスの
感染性に影響を及ぼすことができることから、調節されているようである（Purc
ell and Martin 1993 J Virol 67: 6365-6378）。 【００９３】 全長RNAおよびサブゲノムサイズのRNAの相対的な割合は、感染した細胞におい
て異なり、これらの転写産物のレベル調節は、レトロウイルス遺伝子の発現中の
潜在的な制御ステップである。レトロウイルス遺伝子の発現のためには、スプラ
イシングされていないRNAおよびスプライシングされたRNAの両方を細胞質に輸送
しなければならず、また、効率的なレトロウイルス遺伝子発現のためには、スプ
ライシングされていないRNAとスプライシングされたRNAの適切な割合を維持しな
ければならない。異なるクラスのレトロウイルスは、この問題に対して異なる解
決策へと展開した。単純なレトロウイルス（全長RNAおよび単回スプライシング されたRNAのみを使用する）は、可変性の効率的なスプライシング部位を用いて 、または幾つかのcis-作用エレメント（部分的にしか定義しなかった）のゲノム
中への組み込みにより、これらの種の細胞質比を調節する。単回スプライシング
されたRNAおよび複数回スプライシングされたRNAの両方の合成を指令する複雑な
レトロウイルスは、異なるゲノムRNAおよびサブゲノムサイズのRNA種の輸送およ
びおそらくスプライシングを、HIV-1中のrevおよびHTLV-1中のrexなどのアクセ サリー遺伝子のうちの１つのタンパク質産物とRNA上の配列との相互作用を介し て調節する。 【００９４】 構造遺伝子gag、polおよびenv自体に関して、およびさらにやや詳細には、gag
は、該ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。gagは、タンパク質分解に より成熟タンパク質MA(マトリックス)、CA（キャプシド）およびNC（ヌクレオキ
ャプシド）にプロセッシングされる。pol遺伝子は、DNAポリメラーゼ活性および
関連するRNアーゼH活性の両方を含む逆転写酵素（RT）、ならびにゲノムの複製 を媒介するインテグラーゼ（IN）をコードする。env遺伝子は、ビリオンの表面 （SU）糖タンパク質および膜貫通（TM）タンパク質をコードし、これらは細胞の
受容体タンパク質に特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用によ
り、ウイルス膜は最終的に細胞膜に融合する。 【００９５】 Envタンパク質は、ウイルス粒子をコートするウイルスタンパク質であり、標 的細胞にウイルスが入り込めるようにする際に重要な役割を果たす。レトロウイ
ルスのエンベロープ糖タンパク質複合体には、２つのポリペプチド、即ち、外部
グリコシル化親水性ポリペプチド（SU）および膜貫通（membrane-spanning）タ ンパク質（TM）が含まれる。これらは共に、オリゴマー状「ノブ（knob）」また
は「ノブ状（knobbed）スパイク」をビリオンの表面上に形成する。これらのポ リペプチドは両方ともenv遺伝子によりコードされ、ポリタンパク質前駆体（細 胞表面に輸送される間にタンパク質分解により切断される）の形で合成される。
切断されていないEnvタンパク質は受容体に結合することができるが、切断事象 自体は、宿主細胞にウイルスが入り込むのに必要なタンパク質の融合能を活性化
するのに必要である。一般的には、SUおよびTMタンパク質は、複数の部位でグリ
コシル化される。しかし、幾つかのウイルスでは、MLVを例にとると、TMはグリ コシル化されない。 【００９６】 SUおよびTMタンパク質は、封入されたビリオン粒子自体のアセンブリーに必ず
しも必要ではないが、これらのタンパク質は、入り込みプロセスにおいて重要な
役割を果たす。この点において、SUドメインは、標的細胞上の受容体分子（たい
てい特異的な受容体分子）に結合する。この結合事象により、TMタンパク質の膜
融合を誘発能が活性化されて、ウイルスと細胞膜が融合すると考えられる。幾つ
かのウイルス、特にMLVにおいて、切断事象（TMの細胞質テイルの短い部分が除 去される）は、タンパク質の完全な融合活性を引き出す重要な役目を果たすと考
えられる（Brody et al 1994 J Virol 68: 4620-4627; Rein et al 1994 J Viro
l 68: 1773-1781）。TMの膜貫通セグメントの末端（distal）にあるこの細胞質 「テイル」はウイルス膜の内側に留まり、異なるレトロウイルスにおいて長さが
かなり異なる。 【００９７】 従って、SU/受容体の相互作用の特異性によって、宿主の範囲およびレトロウ イルスの組織親和性が決まる。幾つかのケースにおいて、この特異性により、組
換えレトロウイルスベクターの形質導入能が制限されることがある。ここで、形
質導入とは、非ウイルス遺伝子を標的細胞に送達するためのウイルスベクターを
用いたプロセスを含む。このため、多くの遺伝子治療実験はMVLを使用していた 。4070Aと呼ばれるエンベロープタンパク質を有する特定のMLVは、両種指向性ウ
イルスとして知られ、このウイルスは、そのエンベロープタンパク質がヒトとマ
ウスとの間で保存されたリン酸輸送タンパク質にドッキングする（dock with） ため、ヒト細胞にも感染することができる。このトランスポーターは遍在してい
るため、これらのウイルスは多くの細胞型に感染することができる。しかし、幾
つかのケースにおいて、安全性の面からみると、限られた細胞を特異的に標的と
することが有益であろう。この目的ため、いくつかのグループが、マウス両種指
向性レトロウイルス（両種指向性のものと異なり、通常マウス細胞にのみに感染
する）を、特定のヒト細胞に特異的に感染するように遺伝子操作した。Envタン パク質の断片をエリスロポエチンセグメントに置き換えると組換えレトロウイル
スが産生され、このウイルスは、表面上にエリスロポエチン受容体を発現するヒ
ト細胞、例えば赤血球前駆体などに特異的に結合する（Maulik and Patel 1997,
"Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies" 1997
Wiley-Liss Inc. pp45）。 【００９８】 env遺伝子を異種性env遺伝子で置き換えることは、擬似タイピング（pseudoty
ping）と呼ばれる技法または戦略の１例である。擬似タイピングは新しい現象で
はなく、その例はWO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/094
00、WO-A-91/00047およびMebatsion et al., 1997 Cell 90, 841-847に見受けら
れる。 【００９９】 gag、polおよびenvのほかに、複雑なレトロウイルスは、アクセサリータンパ ク質または補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も含む。アクセ
サリーもしくは補助タンパク質は、通常の複製型遺伝子もしくは構造遺伝子であ
るgag、polおよびenvによりコードされるもののほかに、アクセサリー遺伝子に よりコードされるこれらのタンパク質として定義される。これらのアクセサリー
タンパク質は、tat、rev、taxおよびrexによりコードされるもののような遺伝子
発現の調節に関与するものと異なる。アクセサリー遺伝子の例としては、１以上
のvif、vpr、vpx、vpuおよびnefが挙げられる。これらのアクセサリー遺伝子は 、例えばHIVに見られ得る（例えば“Retroviruses”Ed. Coffin et al., Pub. C
SHL 1997の802頁および803頁を参照されたい）。必須でないアクセサリータンパ
ク質は、特殊化した細胞型において機能することができ、細胞タンパク質により
提供される機能の少なくとも一部は全く同一である機能を提供する。一般的には
アクセサリー遺伝子は、polとenvの間、LTRのU3領域を含むenvのすぐ下流、また
はenvおよび互いのオーバーラップする部分にある。 【０１００】 複雑なレトロウイルスは、ウイルス的にコードされた転写アクチベーターおよ
び細胞転写因子を使用する調節機構へと進化した。これらのtrans-作用ウイルス
タンパク質は、LTRにより指令されるRNA転写のアクチベーターとして機能する。
レンチウイルスの転写trans-アクチベーターは、ウイルスtat遺伝子によりコー ドされる。tatは、安定なステム・ループ型のRNAの二次構造（TARと称される） に結合し、その機能の一つは、明確にTatを最適に配置して転写をtrans-活性化 することである。 【０１０１】 一般的な意味において、レトロウイルスは、とりわけ１つまたは複数のNOIを １以上の目的の部位に輸送するための送達システム（あるいは送達ビヒクルもし
くは送達ベクターと表現される）として提案されてきた。輸送は、in vitro、ex
vivo、in vivoまたはこれらの組合せで起こり得る。このように使用される場合
、レトロウイルスは、一般的にはレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウ
イルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスのライ
フサイクルの様々な面（受容体の使用、逆転写およびRNAのパッケージングを含 む）を研究するためにも活用されてきた（Miller, 1992 Curr Top Microbiol Im
munol 158: 1-24に概説されている）。 【０１０２】 遺伝子治療に使用する一般的な組換えレトロウイルスベクターにおいて、gag 、polおよびenvタンパク質のコード領域のうちの１以上の少なくとも一部を、該
ウイルスから除去することができる。これにより、レトロウイルスベクターが複
製できないようにする。除去された部分をNOIに置きかえて、そのゲノムを宿主 ゲノムに組み込むことができるウイルスを作製することもできるが、この改変ウ
イルスゲノムには構造タンパク質が欠けているため、それ自体増殖することがで
きない。宿主ゲノムに組み込まれると、NOIの発現が起こり、その結果、例えば 治療的および/または診断的効果が得られる。このように、目的の部位へのNOIの
輸送は、一般的には、NOIを組換えウイルスベクターに組み込み、この改変ウイ ルスベクターをビリオンコートの中にパッケージングし、目的の部位（標的細胞
または標的細胞集団など）の形質導入を行うことにより、達成される。 【０１０３】 （例えば好適な力価のレトロウイルスベクターを調製するために）多量のレト
ロウイルスベクターを増殖し単離したあと、例えば目的の部位をパッケージング
またはヘルパー細胞系と組換えベクターとの組合せを用いて形質導入することが
可能である。 【０１０４】 幾つかの例において、増殖および単離は、レトロウイルスgag、polおよびenv 遺伝子の単離、および「パッケージング細胞系」を生成するために宿主細胞へこ
れらの遺伝子を別個に導入すること、を伴う。パッケージング細胞系は、レトロ
ウイルスDNAをパッケージングするために必要なタンパク質を産生するが、psi領
域を持たないため、キャプシド化を引き起こすことができない。しかし、NOIお よびpsi領域を持つ組換えベクターをパッケージング細胞系に導入すれば、ヘル パータンパク質がpsi陽性組換えベクターをパッケージングして組換えウイルス ストックを産生することができる。これは、NOIを細胞のゲノム中に導入するた めに細胞を形質導入するのに使用することができる。ウイルスタンパク質を作製
するのに必要な遺伝子を全てそのゲノムが欠いている該組換えウイルスは、一回
しか形質導入することができず、増殖することができない。これらのウイルスベ
クター（標的細胞の形質導入を一回だけ行うことができる）は、複製欠損性ベク
ターとして知られている。従って、NOIは、宿主/標的細胞のゲノムに、潜在的に
有害なレトロウイルスを生成することなく導入される。利用可能なパッケージン
グ系の概要は、“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press
Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp449)に提供されている。 【０１０５】 レトロウイルスパッケージング細胞系の設計は、とりわけ、初期の設計におい
て頻繁に直面したヘルパーウイルスの自然発生的な産生の問題に向けて開発され
てきた。組換えは、相同性により大幅に簡易化されるので、ベクターのゲノムと
ヘルパーのゲノムとの相同性を低減もしくは削除することにより、ヘルパーウイ
ルス産生の問題が低減される。さらに最近になって、gag、polおよびenvウイル スコード領域が別々の発現プラスミド上に担持されていて、３つの組換え事象が
野生型ウイルスの産生に必要であるようなパッケージング細胞系の中にこれらの
発現プラスミドが別々にトランスフェクトされるパッケージング細胞が開発され
た。これにより、複製コンピテントウイルスが産生される可能性が低減される。
この戦略は、ときおり３プラスミドトランスフェンクション法（three plasmid
transfection method）と呼ばれる（Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:
628-633）。 【０１０６】 一過性トランスフェクションは、ベクターの開発の際にベクター産生を測定す
るために使用することもできる。この点において、一過性トランスフェクション
は、安定なベクター産生細胞系を生成するのに長い時間を要することを回避し、
ベクターまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場
合に使用される。レトロウイルスベクターを生成するのに通常必要な成分には、
Gag/Polタンパク質をコードするプラスミド、Envタンパク質をコードするプラス
ミド、およびNOIを含むプラスミドが含まれる。ベクター産生には、１以上のこ れらの成分の、他の必要な成分を含む細胞への一過性トランスフェクションを含
む。該ベクターが、毒性遺伝子または宿主細胞の複製を阻害する遺伝子（例えば
細胞周期のインヒビターやアポトーシスを誘導する遺伝子など）をコードする場
合、安定なベクター産生細胞系を生成することが困難な場合もあるが、一過性ト
ランスフェクションを使用して、細胞が死ぬ前にベクターを生成することができ
る。また、一過性感染を用いて、安定なベクター産生細胞系から得られるベクタ
ー力価レベルに匹敵するレベルを産生する細胞系が開発された（Pear et al 199
3, Proc Natl Acad Sci 90:8392-8396）。 【０１０７】 安定なHIVベースのパッケージング細胞を生成することを難しくし得る幾つか のHIVタンパク質の毒性を考慮して、HIVベクターは通常、ベクターおよびヘルパ
ーウイルスの一過性トランスフェクションにより作製される。ある研究者らは、
HIVのEnvタンパク質を、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のEnvタンパク質に置き換
えた。VSVのEnvタンパク質の挿入により、5×105（濃縮後は108）の力価を有す るHIV/VSV-Gベクターが一過性トランスフェクションにより生成されるので、ベ クターの濃縮が簡単になる（Naldini et al 1996 Science 272: 263-267）。こ のように、HIVベクターの一過性トランスフェクションにより、高力価ベクター の産生のための有用な戦略を提供することができる（Yee et al., 1994 PNAS. 9
1: 9564-9568）。 【０１０８】 ベクター力価に関して、レトロウイルスベクターの実際的な使用は、in vitro
培養で得られる形質導入粒子の力価（一般的には108粒子/ml未満）、ならびにウ
イルスの濃縮および精製のための伝統的な生物化学的技術および物理化学的技術
に対する多くのエンベロープウイルスの感受性により、大きく制限されていた。 【０１０９】 例として、遠心分離の使用（Fekete and Cepko 1993 Mol Cell Biol 13: 2604
-2613）、中空糸濾過（Paul et al 1993 Hum Gene Ther 4: 609-615）およびタ ンジェンシャルフロー濾過（Kotani et al 1994 Hum Gene Ther 5: 19-28）など
を含む、レトロウイルスベクターの濃縮方法が幾つか開発されてきた。ウイルス
力価を20倍増加させることができるが、レトロウイルスのEnvタンパク質の相対 的なもろさにより、レトロウイルスベクターの濃縮能が制限され、ウイルスを濃
縮すると感染性ビリオンの回収率は通常乏しくなる。この問題は、上記のように
、レトロウイルスEnvタンパク質を、より高い収率でより効率的なベクター濃縮 を可能とするより安定なVSV-Gタンパク質に置き換えることにより克服すること ができるが、VSV-Gタンパク質が細胞に対して極めて毒性が強いという欠点に悩 まされる。 【０１１０】 現在利用できるベクターを用いてヘルパーウイルスを含まないベクター力価10 7 cfu/mlを得ることが可能であるが、実験では、これよりはるかに低い力価のベ クターストックで行われることが多い。しかし、実際的な理由のため、特に多量
の細胞を感染させなければならない場合は、高力価ウイルスが望ましい。さらに
、高力価は、ある細胞型の大部分を形質導入するための必要条件である。例えば
、ヒト造血前駆細胞の感染頻度は、ベクターの力価に大きく依存し、有用な感染
頻度は、非常に高い力価のストックでのみ生じる（Hock and Miller 1986 Natur
e 320: 275-277; Hogge and Humphries 1987 Blood 69: 611-617）。これらの場
合、低ウイルス力価を補うためには、細胞を多量のウイルスに暴露するだけでは
不充分である。これに対し、幾つかのケースでは、感染ベクタービリオンの濃度
は、効率的な形質導入を促進するために非常に重要となり得る。 【０１１１】 研究者らは、遺伝子送達に使用するための高力価ベクターを作製しようとして
いる。その例として、高力価ウイルス産生に必要な必須エレメントを決定する手
助けとして、異なるベクター設計の比較が有用であることが分かっている。異な
るレトロウイルスベクター設計についての初期の研究により、MLVの内部タンパ ク質コード領域のほぼ全てを、そのベクターの感染性を損なうことなく欠損させ
ることができることが証明された（Miller et al 1983 Proc Natl Acad Sci 80:
4709-4713）。これらの初期のベクターは、env-コード領域の３'末端のごく一 部のみしか保持していなかった。これに続く研究により、ベクターの力価を更に
減少させることなくenv-遺伝子コード配列の全てを除去することができることが
証明された（Miller and Rosman 1989 Biotechnique 7: 980-990; Morgenstern
and Land 1990 Nucleic Acids Res 18: 3587-3596）。ウイルスLTRおよびLTRに 隣接する短い領域のみ（プラス鎖およびマイナス鎖のDNAのプライミングに必要 なセグメント、ならびにビリオンへのウイルスRNAの選択的パッケージングに必 要な領域を含む； psi部位：Mann et al 1983 Cell 33: 153-159）は、ベクター
の伝達に必要なものとされていた。にもかかわらず、これらの初期のベクターに
より得られるウイルス力価はなお、親ヘルパーウイルス力価の約10倍近く低かっ
た。 【０１１２】 更なる実験により、gag遺伝子の５'末端に配列を保有することにより、ウイル
スベクターの力価が有意に上昇し、これはビリオンへのウイルスRNAのパッケー ジング効率が増大したためであることが証明された（Armentano et al 1987 J V
irol 61: 1647-1650; Bender et al 1987 J Virol 61: 1639-1646; Adam and Mi
ller 1988 J Virol 62: 3802-3806）。この効果は、ベクターのgag領域からのウ
イルスタンパク質合成によるものではなかった。なぜなら、gagのリーディング フレームの破壊、またはgagコドンの終結コドンへの突然変異は、ベクターの力 価に影響を及ぼさなかったからである（Bender et al 1987 同書）。これらの実
験により、MLVへのゲノムRNAの効率的なパッケージングに必要な配列は、欠失分
析により以前定義されたpsiシグナルよりも長いことが示された（Mann et al 19
83 同書）。高力価（106〜107を超える）を得るために、この大きなシグナル（p
siプラスと称される）がレトロウイルスベクターに含まれることが重要であるこ
とが証明された。このシグナルは、スプライシング・ドナーの上流からgag開始 コドンの下流まで延びていることが分かった（Bender et al., 1987 同書）。こ
の位置により、スプライシングされたenv発現転写物において、このシグナルは 除去される。これにより、ウイルスのライフサイクルに必須である３つの遺伝子
全てを含む全長転写産物のみがパッケージングされる。 【０１１３】 ベクターの力価を増大させることを考慮してレトロウイルスベクターを操作す
ることに加え、レトロウイルスベクターはさらに、形質導入した細胞中において
特定のNOI（通常はマーカータンパク質）の産生を誘導するようにも設計された 。既に述べたように、最も一般的なレトロウイルスベクターの設計は、レトロウ
イルス配列を１以上のNOIに置き換えて複製欠損性ベクターを作製することを含 んでなる。この最も簡単な方法は、レトロウイルスの5'LTRの中のプロモーター を使用してNOIをコードするcDNAの発現を制御すること、またはLTRのエンハンサ
ー/プロモーターを改変して組織特異的発現または誘導性を提供することであっ た。 【０１１４】 あるいは、内部プロモーターを使用することにより、プロモーターの選択にも
っと柔軟性を持たせる単一のコード領域を発現させた。 【０１１５】 NOIを発現させるためのこれらの戦略は、ベクターが形質導入された細胞の選 択を容易にするヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル転移酵素（hprt）（Mil
ler et al 1983 Proc Natl Acad Sci 80: 4709-4713）の場合と同様に、NOIが選
択マーカーである場合に、最も簡単に実施されていた。ベクターが選択マーカー
ではないNOIを含んでいる場合、該ベクターは別のプラスミド上に存在する選択 マーカーとの同時トランスフェクションによりパッケージング細胞中に導入する
ことができる。この戦略は、単一のタンパク質を最終的な標的細胞中で発現させ
、かつ選択マーカーの毒性または抗原性の恐れを避けるという、遺伝子治療にと
って非常に魅力的な利点を有する。しかし、挿入された遺伝子が選択的でない場
合、この方法は、高力価のベクターストックを産生する細胞を作製することがよ
り難しいという欠点を有する。さらに、ベクターの力価を決定することは通常、
より難しい。 【０１１６】 ２以上のタンパク質を発現するレトロウイルスベクターを設計するのに使用さ
れる現在の方法は、３つの一般的な戦略に依存する。これらには、（i）１つの プロモーターから転写され、選択的にスプライシングされたmRNAからの、異なる
タンパク質の発現、（ii）５'LTR中のプロモーターおよび内部プロモーターを使
用した、異なるcDNAの転写駆動、および（iii）のちにオープンリーディングフ レームから発現させることができる単一のmRNA若しくは融合タンパク質からの複
数のコード領域の翻訳を可能とするための、内部リボソーム挿入部位（IRES）エ
レメントの使用、が含まれる。 【０１１７】 複数の遺伝子を発現させるために、内部プロモーターを含むベクターが広く使
用されてきた。内部プロモーターは、遺伝子発現を駆動させるためにウイルスLT
Rのほかにプロモーター/エンハンサーの組合せを利用することを可能とする。複
数の内部プロモーターをレトロウイルスベクター内に含めることができ、少なく
とも３つの異なるcDNAを、それ自体のプロモーターからそれぞれ発現させること
が可能であることが証明された（Overell et al 1988 Mol Cell Biol 8: 1803-1
808）。 【０１１８】 多くのベクターが、レトロウイルス科の種々のレンチウイルスのサブファミリ
ーに基づいて開発されており、これらの多くは特許出願の主題となっている（PC
T/GB97/02857; PCT US96/15406）。HIV-1から構成された最も単純なベクターは 、envコード領域の一部が除去されているかまたはnefコード領域が置き換えられ
ている以外は、完全なHIVゲノムを有する（Richardson, J. H., Child, L.A. &
Lever, A.M. (1993) J Virol 67, 3997-4005., Buchschacher, G.L., Jr. & Pan
ganiban, A.T.(1992) J Virol 66, 2731-9, Richardson, J.H., Kaye, J.F., Ch
ild, L.A. & Lever, A.M. (1995) J Gen Virol 76, 691-6, Kaye, J.F., Richar
dson, J. H. & Lever, A.M.(1995) J Virol 69, 6588-92, Carroll, R., Lin, J
.T., Dacquel, E.J., Mosca, J.D., Burke, D.S. & St Louis, D.C. (1994) J.
Virol 68, 6047-51）。多くのプロモーター/レポーターカセットは、これらの位
置ADDIN ENRf8（Page, K.A., Landau, N.R. & Littman, D.R. (1990) J. Virol
64, 5270-6., Shimada, T., Fujii, H., Mitsuya, H. & Nienhuis, A.W. (1991)
J Clin Invest 88, 1043-76, 7）で挿入されていた。注目すべきことに、これ らのベクターはgag/polおよびアクセサリー遺伝子の全てを発現するため、感染 性ウイルス粒子を産生するためにはエンベロープのみを必要とする。アクセサリ
ー遺伝子のうちvif、vpr、vpuおよびnefは必須ではないが、アクセサリー遺伝子
発現が力価に影響を及ぼすことが提案されていた。（Fan, L. & Peden, K. (199
2) Virology 190, 19-29, Gabuzda, D.H., Lever, A., Terwilliger, E. & Sodr
oski, J. (1992) J Virol 66, 3306-15, Schubert, U., Clouse, K.A. & Strebe
l, K. (1995) J. Virol 69, 7699-711, Miller, M.D., Warmerdam, M.T., Gasto
n, I., Greene, W.C. & Feinberg, M.B. (1994) J Exp Med 179, 101-13 Zuffer
ey, R., Nagy, D., Mandel, R.J., Naldini, L. & Trono, (1997) Nature Biote
chnology 15, 871-875, Takahashi, K., Wesselingh, S.L., Griffin, D.E., Mc
Arthur, J. C. Johnson, R.T. & Glass, J.D. (1996) Ann. Neurol. 39, 705-71
1）。しかし、さらに近年では、アクセサリー因子の大部分または全てを持たな くてもなお効率的であるベクターが記載された。Poeschla, E., Corbeau, P. &
Wong-Staal, F. (1996) Proc Natl Acad Sci USA93, 11395-9. Naldini, L., Bl
omer, U., Gage, F.H., Trono, D. & Verma, I.M. (1996) Proc Natl Acad Sci
USA 93, 11382-8。Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan,
R., Gage, F.H., Verma, I.M. & Trono, D. (1996) Science 272, 263-7, Blom
er, U., Naldini, L., Kafri, T., Trono, D., Verma, I. & Gage, F. (1997) J
ournal of Virology 71, 6641-6649, Kim, V.N., Mitrophanous, K., Kingsman,
S.M. and Kingsman, A.J. 1998. J. Virol., 72, 811-816。 【０１１９】 これらのレンチウイルスベクターの一般的なフォーマットは、HIV-1の5'LTRお
よびリーダー、（パッケージング機能を提供する）幾つかのgagコード領域配列 、リポーターカセット、rev応答配列（RRE）および3'LTRである。これらのベク ターにおいて、gag/pol、アクセサリー遺伝子産物およびエンベロープ機能は、 単一のプラスミドまたは２以上の同時トランスフェクトされたプラスミドのいず
れかから、あるいはベクター含有細胞をHIVで同時感染させることにより、供給 される。また、５'LTRのU3領域がtax応答性配列（TRE）の２つのコピーを含むよ
うに改変されたHIVをベースとするベクター（これによりHTLV-Iのtaxタンパク質
によるトランス活性化が可能となる）においても、トランス活性を使用していた
。これは、成人T-細胞白血病/リンパ腫の治療として提案されている（Lin, H.C.
, Bodkin, M., Lal, R.B. & Rabson, A.B. (1995) J Virol 69, 7216-25）。CMV
プロモーターなどの構成的プロモーターを使用して発現することができるベクタ
ーも構築された（例えばKim et al 1998 同書）。さらに近年では、レンチウイ ルスベクターの構成が更に改良された。例えば、内部カセットに発現を制限する
ためにHIV LTRが除去された、自己不活性化HIVベクターが産生された（Myoshi e
t al 1998 J. Virol 72, 8150）。 【０１２０】 HIVでの標的細胞の同時感染が起こると、該ベクターはHIV許容細胞の培養を介
して広がることができる。この原則は、HIV-1感染の治療または制限のためのベ クターの開発に使用されてきた（Dropulic, B., Hermankova, M. & Pitha, P.M.
(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 11103-8., Kim, J.H., McLinden, R.J.,
Mosca, J.D., Vahey, M.T., Greene, W.C. & Redfield, R.R. (1996) J Acquir
Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 12, 343-51, Poeschla et al 1996 PNAS 9
3, 11395）。 【０１２１】 非分裂細胞への遺伝子送達のためのHIVをベースとしたベクターの利用につい て数々の研究がこれまでに記載されてきた（例えば、網膜に関してはMyoshi et
al 1997, PNAS 94, 10319-23., ニューロンに関してはBlomer et al 1997 J. Vi
rol 71, 6641, Blomer et al 1998 95, 2603、肝臓、筋肉に関しては、Kafri et
al Nature Genetics 1997 17, 314）。他のレンチウイルスベクター、例えばEI
AV（GB 9727135.7）およびFIV（Poeschla et al 1998, Nature Medicine, 4, 35
4）およびMaedi-Visna (国際出願番号PCT/GB95/00663、優先日：1994年12月9日 、1995年3月24日。Packaging-Deficient Lentiviruses Lever, A.M.L., Harriso
n, G.P., Hunter, E）も開発されてきた。 【０１２２】 一般的な意味でのネズミHSCへのレトロウイルス遺伝子の送達が、既に報告さ れている（Williams et al Nature 1984 310: 476-479）。ここで、ネズミHSCに
おける全長MDRI（多重薬剤抵抗性）cDNA遺伝子の発現は、これらに種々の抗癌剤
に対する抵抗性を供与することが分かっている。同様に、骨髄または末梢血細胞
中のネズミ造血前駆細胞は、MDRI遺伝子のレトロウイルスによる形質導入により
、抗癌化学治療薬の毒性から保護されることが分かった（Licht et al 1995 Cyt
okines Mol Ther 1: 11-20）。免疫欠損性マウスにおいてヒト造血が維持される
ことは、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo）またはヒトグ ルコセレブロシダーゼcDNAのいずれかを含む組換えレトロウイルスベクターでin
vitroにて形質導入したCD34+前駆細胞の同時移植により示された（Nolta et al
1994 Blood 83: 3041-3051）。ネズミHSCもまた、レポーター（LacZ）および選
択マーカー（neo）を含む２つの遺伝子レトロウイルスベクターで形質導入した 。LacZ発現は、受容者のPBLにおいて検出可能であった（Asami et al 1996 Eur
J Haematol 57: 278-285）。 【０１２３】 In vivoでのネズミの研究により、骨髄を回収する前に5-フルオロウラシルで ドナーマウスの前処理を行うことにより、原始細胞（primitive cells）のサイ クルを誘導し、レトロウイルスの感染および組込みへの感受性を高めることによ
り、形質導入の効率を改善することができることが示された。レトロウイルス産
生細胞系と標的細胞を共培養し、mlあたり少なくとも105個のウイルス粒子を産 生することができる細胞系を使用することによっても、効率が上がった（Bodine
et al 1991 Exp Hematol 19: 206-212）。長期にわたって再び集団化する細胞 への首尾よい遺伝子送達は、複数の造血系統の再構成により、実質的に全ての受
容マウスにおいて安定して達成され、1〜50％またはそれ以上の細胞がプロウイ ルスゲノムを保持していた（Fraser et al 1990 Blood 76: 1071-1076）。 【０１２４】 一般的な意味においてのヒトHSCへのレトロウイルス遺伝子の送達が、報告さ れている（Duphar and Emmons 1994 Stem Cells 12: 563-576）。また、コロニ ー形成ユニット-顆粒球マクロファージ（CFU-GM）またはバースト形成ユニット-
エリスロイド（BFU-E）などのコミットされた（committed）ヒト前駆細胞は、IL
-3、Il-6および幹細胞因子 (SCF)等の成長因子の種々の組合せの存在下において
、または一次骨髄ストロマもしくはレトロウイルス産生細胞系の存在下において
、非常に高い効率で（しばしば50％を超える）、レトロウイルスベクターにより
形質導入された（Nolta et al 1990 Hum Gen Ther 1: 257-268; Moore et al 19
92 Blood 79: 1393-1399; Cournoyer et al 1991 Hum Gen Ther 2: 203-213）。 【０１２５】 フィブロネクチンのような特定の細胞外マトリックス成分の存在もまた、重要
でありうる（Moritzら, J Clin Invest 1994 93:1451-1457）。もっと原始的な ヒト長期培養開始細胞（LTC-IC）が、同様な形質導入条件のもとにおいて同様の
効率で形質導入されている（Mooreら, 1992、同書；Hughesら, 1989 Blood 74:
1915-1922；Hughesら, 1992 J Clin Invest 89: 1817-1824）。ヒト樹状細胞（D
C）上のヒト腫瘍抗原、ヒト上皮細胞ムチン（MUC-1）の高レベルの発現は、CD34 + 前駆体細胞のレトロウイルス形質導入とその後のサイトカイン誘導によるDcsへ
の分化によって達成されている（Hendersonら, 1996 Cancer Res 56: 3763-3770
）。 【０１２６】 レトロウイルス系を使ってHSC中に遺伝子を導入するという当業界の一般的教 示にもかかわらず、先行技術には、１以上のNOIを使って１以上のHSCを特異的な
方法で形質転換する本発明は教示も示唆もされていない。 【０１２７】 本発明によれば、適切なNOI配列は、限定されるものでないが、サイトカイン 、ケモカイン、ホルモン、抗体、遺伝子操作免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体
、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA 、標的タンパク質のトランス支配的なネガティブ変異体、毒素、条件毒素、抗原
、癌抑制タンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質およ
びペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの（関係
するレポーター群を有するような）誘導体をコードする配列のような、治療およ
び／または診断に応用される配列を含む。その場合には、これらのコード配列は
、典型的には、リボザイムの発現を駆動するプロモーター、または１以上の特定
の細胞型における異なるプロモーターであってよい適切なプロモーターに機能し
うる形で連結される。 【０１２８】 癌の治療または予防において本発明を使用するための適当なNOIとしては、標 的細胞を破壊し（例えばリボソーム毒素）；腫瘍サプレッサー（野生型p53のよ うな）、抗腫瘍免疫機構アクティベーター（サイトカイン、同時刺激分子および
免疫グロブリンのような）、血管形成インヒビターとして作用し；または薬剤感
度を増加し（プロドラッグ活性酵素のように）；自然エフェクター細胞により間
接的に標的細胞の破壊を刺激し（例えば、免疫系を刺激する強い抗原）、または
前駆体物質を標的細胞を破壊する毒性物質に転化する（例えばプロドラッグ活性
化酵素）タンパク質をコードするNOIが挙げられる。コードされたタンパク質は また、バイスタンダー腫瘍細胞（bystander tumor cell）を破壊し（例えば、分
泌された抗腫瘍抗体-リボソーム毒素融合タンパク質）、もしくは間接的にバイ スタンダー腫瘍細胞の破壊を刺激し（例えば免疫系または局部的血管閉塞を起す
凝血原タンパク質を刺激するサイトカイン）、または前駆体物質をバイスタンダ
ー腫瘍細胞を破壊する毒性物質（例えば、プロドラッグを拡散性薬物に活性化す
る酵素）に転化することもあり得る。 【０１２９】 腫瘍持続のための細胞遺伝子の発現を妨げるアンチセンス転写物またはリボザ
イム（例えば、Burkittsリンパ腫の異常myc転写物に対する、または慢性骨髄系 白血病のbcr-abl転写物に対する）をコードするNOIの送達、このようなNOIの組 合わせ使用も予測される。 【０１３０】 標的組織に選択的に発現される代りに、または、これと共に、該NOIは、プロ ドラッグ活性化酵素が作用する１以上のプロドラッグを用いて個体が治療される
まで、顕著な影響または副作用を有しない該酵素をコードすることができる。活
性NOIの存在下で、適当なプロドラッグによる個体の治療は、腫瘍増殖または生 存の低下を促進させる。 【０１３１】 プロドラッグ活性化酵素を癌治療のために腫瘍部位に送達することができる。
各事例において、適切なプロドラッグが、適当なプロドラッグ活性化酵素と組合
わせて患者治療に使われる。適当なプロドラッグはベクターと一緒に投与される
。プロドラッグの例としては：エトポシドホスフェート（アルカリホスファター
ゼとともに、Senterら, 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 4842-4846）；5-フルオ ロシトシン（シトシンデアミナーゼとともに、Mullenら, 1994 Cancer Res 54:
1503-1506）；ドキソルビシン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシ
リン-V-アミダーゼとともに、Kerr ら, 1990 Cancer Immunol Immunother 31: 2
02-206）；パラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタメート（カル ボキシペプチダーゼG2とともに）；セファロスポリンナイトロジェンマスタード
カルバメート（β-ラクタマーゼとともに）；SR4233（P450レダクターゼととも に）；ガンシクロビル（HSVチミジンキナーゼとともに、Borrelliら, 1988 Proc
Natl Acad Sci 85: 7572-7576）；ニトロレダクターゼとともにマスタードプロ
ドラッグ（Friedlosら, 1997 J Med Chem 40: 1270-1275）およびシクロホスフ ァミド（P450とともに、Chenら, 1996 Cancer Res 56: 1331-1340）。 【０１３２】 本発明に使われる適切なプロドラッグ活性化酵素の例としては、5-フルオロ- ウラシルプロドラッグカプセタビンおよびフルツロンを活性化するチミジンホス
ホリラーゼ；ガンシクロビルを活性化する単純ヘルペスウイルスからのチミジン
キナーゼ；シクロホスファミドのようなプロドラッグをDNA損傷作用剤に活性化 するシトクロムP450；および5-フルオロシトシンを活性化するシトシンデアミナ
ーゼが挙げられる。好ましくは、ヒト起源の酵素が使われる。 【０１３３】 虚血心疾患の治療または予防に使用する適切なNOIとしては、プラスミノーゲ ンアクティベーターをコードするNOIが挙げられる。慢性関節リウマチまたは大 脳マラリアの治療または予防のための適切なNOIとしては、抗炎症タンパク質、 腫瘍壊死因子（TNF）αに対する抗体、および（接着分子に特異的な抗体分子ま たは受容体のような）抗接着分子をコードする遺伝子が挙げられる。 【０１３４】 低酸素症調節可能治療用（hypoxia regulatable therapeutic）NOIの例は、PC
T/GB95/00322（WO-A-9521927）に見出すことができる。 【０１３５】 NOIによりコードされる発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質であって よい。あるいは、NOI発現産物は分泌されるのでなく、細胞内で活性である。い ずれの場合も、NOI発現産物がバイスタンダーエフェクター（bystander effecto
r）または遠位のバイスタンダー効果（bystander effect）を実証すること；す なわち、隣接するまたは遠位の（例えば転位性の）、共通の表現型を持つ、別の
、関連する細胞の死滅を引起こす１つの細胞における発現産物の産生が好ましい
。 【０１３６】 該ベクターはまた、ベクターを含有するMHSCのその後の分化（differentiatio
n）を指令する役割を果す１以上のサイトカインをコードするNOIを含有してもよ
い。適切なサイトカインおよび増殖因子としては、限定されるものでないが、Ap
oE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、EGF、ENA-78、エオタキシン(Eotax
in)、エオタキシン-2、エキソダス(Exodus)-2、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽 細胞増殖因子-10（Marshall 1998 Nature Biotechnology 16: 129）、FLT3リガ ンド（Kimuraら, (1997)）、フラクタルキン(Fractalkine)（CX3C）、GDNF、G-C
SF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、I
L-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-
9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、イン ヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、 レプチン(Leptin)、LIF、リンホタクチン（Lymphotactin）、ムレリアン（Mulle
rian）抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引剤タンパク質（Marshall 199
8、同書）、M-CSF、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、
MCP-3、MCP-4、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP
-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ノイルツリ ン(Neurturin)、神経増殖因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチン(Oncostat
in)M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF
、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因 子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、G
RO-γ、HCC1、1-309が挙げられる。 【０１３７】 ある応用のためには、これらのサイトカインの複数の組合わせ、特に幹細胞集
団の維持と拡大のためにはIL-3、IL-6およびSCFを含む組合わせが好ましい。in
vitro分化のためには、マクロファージの分化を誘導するにはGM-CSFおよびM-CSF
、または好中球を得るにはGM-CSFおよびG-CSFのようなサイトカインをさらに加 えることができる。遺伝子操作した細胞をもとの個体内に再導入すると、その後
、身体自身の機構が、細胞またはその分化子孫を患部、例えば腫瘍に移動させる
。 【０１３８】 １以上のNOIを融合させてもよい。すなわち、NOIコード配列は、融合タンパク
質またはコード配列のセグメントをコードしてもよい。例えば、pIXY321は、GM-
CSFおよびIL-3の遺伝子操作融合タンパク質であり（Bhallaら, 1995 Leukemia 1
1：1851-1856）、in vitroおよび前臨床研究で両方の親サイトカインの生物学的
効果を表す（Vadhan-Rajら, 1995 Blood 86: 2098-2105）。 【０１３９】 場合によっては、他のNOIは、外因物質の存在下で発現するとトランスフェク トまたは形質導入した細胞の破壊をもたらす自殺遺伝子であってもよい。自殺遺
伝子の例としては、ガンシクロビルによる処理後、感染細胞およびバイスタンダ
ー細胞（bystander cell）を死滅させることができる単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子（HSV tk）（Robbinsら, Tibtech 1998 16: 35-40）が挙げ られる。 【０１４０】 場合によっては、他のNOIは、ターゲッティングタンパク質（幹細胞因子受容 体に対する抗体のような）（WO9217505；WO9221766）であってよい。例えば、HS
C上に存在する受容体（例えば、CD34または幹細胞因子）に対して抗体（または 増殖因子またはペプチド）を提示する組換え（エコトロピック）レトロウイルス
をこれらの細胞への標的細胞送達に使うことができ、その送達はex vivoで未分 画骨髄をウイルスとともにインキュベートするかまたはウイルスの静脈内送達に
よる。 【０１４１】 リガンドおよび抗体を、選択された細胞型を標的とするために用いてもよく、
該リガンドおよび抗体としては、例えば、ヒト肺癌腫上の125kD抗原を標的とす るモノクローナル抗体c-SF-25（Takahashiら, 1993 Science 259:1460）；各種 の肺癌抗原に対する抗体（Souhami 1992 Thorax 47: 53-56）；ヒト卵巣癌抗原1
4C1に対する抗体（Gallagherら, 1991 Br J Cancer 64: 35-40）；肺癌腫を標的
とする、H/Lev/1Leb抗原に対する抗体（Masayukiら, 1992 N Eng J Med 327:14-
18）；神経腫瘍上の神経増殖因子受容体を標的とする神経増殖因子（Chaoら, 19
86 Science 232:518）；マクロファージを標的とするFc受容体（Andersonおよび
Looney 1987 Immunol Today 1:264-266）；レクチン（SharonおよびLis 1989 Sc
ience 246: 227）；結腸癌を標的とするコラーゲンI型（PullamおよびBodmer 19
92 Nature 356: 529）；T 細胞上のインターロイキン-1受容体を標的とするイン
ターロイキン-1（Fanslowら, 1990 Science 248:739）；マクロファージスカベ ンジャー受容体を標的とするアセチル化低密度リポタンパク質（「LDL」）（お よびアテローム性硬化プラーク（atherosclerotic plaque）；Brownら, 1983 An
n Rev Biochem 52: 223-261を参照）、ならびにマクロファージスカベンジャー 受容体を標的とする他のアセチル化分子（Paulinskiら, PNAS 86: 1372-1376） ；ウイルス受容体（Haywood 1994 J Virol 68(1):1-5）；腫瘍細胞上のトランス
フェリン受容体を標的とするトランスフェリン（Huebersら, 1987 Physio Rev 6
7:520-582）；血管新生の増加が起る細胞を標的とする血管内皮増殖因子（「veg
F」）；およびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータ受容体（UPAR）が挙 げられる。 【０１４２】 あるいは、リガンドを、遺伝子組換え技術（ScottおよびSmith 1990 Science
249: 386；Devlinら, 1990 Science 249: 404；Houghtenら, 1991 Nature 354:
84；MatthewsおよびWells 1993 Science 260: 1113；Nisimら, 1994 EMBO J 13(
3) 692-698）または有機化合物ライブラリーを用いる同等の技術を用いて作製し
たライブラリーから選択してもよい。 【０１４３】 記載した治療遺伝子および発現調節エレメントに加えて、該ベクターは、遺伝
子の効率的なまたは調節された発現のために、プロモーター／エンハンサー、翻
訳開始シグナル、内部リボソームエントリー部位（IRES）、スプライスおよびポ
リアデニル化シグナルなどの別の遺伝子エレメントを含有することができる。 【０１４４】 該NOIは、発現調節エレメント、通常はプロモーター、またはプロモーターお よびエンハンサーの発現調節のもとにあってよい。該エンハンサーおよび／また
はプロモーターは、低酸素または虚血または低グルコース環境において選択的に
活性とすることができ、これにより、NOIは、腫瘍、関節炎関節または他の虚血 部位の環境のような、特定の対象組織において選択的に発現される。したがって
、治療を受ける個体に対するNOIの顕著な生物学的効果または有害な効果を軽減 しまたは消滅させることができる。発現を調節するエンハンサーエレメントまた
は他のエレメントは多重コピーとして存在してもよい。同様に、またはさらに、
該エンハンサーおよび／またはプロモーターは、１以上のマクロファージ、内皮
細胞またはそれらの組合わせのような、１以上の特定の細胞型で選択的に活性で
あってよい。さらなる例としては、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細
胞、滑膜細胞、一次哺乳類上皮細胞、およびマクロファージニューロンのような
分裂後終末分化非複製細胞（post-mitiotically terminally differentiated no
n-replicating cells）が挙げられる。 【０１４５】 用語「プロモーター」は、当業界の通常の意味で使われ、例えば遺伝子発現の
Jacob-Monod理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位である。 【０１４６】 用語「エンハンサー」は、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合し、関
連するプロモーターにより指令される転写開始を促進するDNA配列を含む。 【０１４７】 二次ベクターをコードする転写ユニットのプロモーターおよびエンハンサーは
、好ましくは、一次標的細胞において二次ウイルスベクターを産生する条件のも
とで、強く活性であるかまたは強く誘導されることができる。該プロモーターお
よび／またはエンハンサーは、その活性が、構成的に効率的であっても、または
組織または時間的に制限されてもよい。組織により制限される適切なプロモータ
ー／エンハンサーの例は、MUCI遺伝子、CEA遺伝子または5T4抗原遺伝子由来のプ
ロモーター／エンハンサーのような、腫瘍細胞で高度に活性のあるものである。
時間的制限のあるプロモーター／エンハンサーの例は、低酸素症応答エレメント
またはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロモーター／エンハンサーのような、虚血
および／または低酸素症に応答するものである。αフェトプロテイン（AFP)プロ
モーターも腫瘍特異的プロモーターである。１つの好ましいプロモーター-エン ハンサーの組合わせは、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）主要最初期（MIE） プロモーター／エンハンサーの組合わせである。 【０１４８】 好ましくは、本発明のプロモーターは組織特異的である。すなわち、１つの組
織中で１以上のNOIの転写を駆動する能力があり、しかも他の組織型ではほとん ど「サイレント」のままである。 【０１４９】 用語「組織特異的」は、単一組織型に対する活性に制限されるのではないが、
１つの組織群に活性があり他の群には低活性もしくはサイレントであることにお
いて選択性を示すプロモーターを意味する。本発明のプロモーターの所望の特性
は、活性化された低酸素調節エンハンサーエレメントが不在のときは、標的組織
中であっても相対的に低活性を有することである。これを達成する方法の１つは
、低酸素でないときに選択されたプロモーターの活性を抑制する「サイレンサー
」エレメントを使うことである。 【０１５０】 特定のプロモーターの調節下にあるNOIの発現レベルは、プロモーター領域を 操作することによって調節することができる。例えば、プロモーター領域内の異
なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を有する。これらの異なる領域の役割は
、典型的には特定領域の欠失した様々なプロモーター変異体を有するベクター構
築物を使って評価される（すなわち、欠失分析）。この手法を使って、例えば、
組織特異性を与える能力のある最小領域または低酸素感受性を与える最小領域を
特定することができる。 【０１５１】 上記のいくつかの組織特異的プロモーターは、本発明を実施する上で特に有利
でありうる。ほとんどの場合、これらのプロモーターは、選択したベクターでの
クローニングに適した好都合な制限酵素消化断片として単離することができる。
あるいは、プロモーター断片をポリメラーゼ連鎖反応を使って単離することがで
きる。増幅した断片のクローニングは、プライマーの5'末端に制限部位を組みこ
むことにより容易に行うことができる。 【０１５２】 心臓特異的発現に適切なプロモーターとしては、マウス心臓α-ミオシン重鎖 （MHC）遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。適切な血管内皮特異的プロモ ーターとしては、Et-1プロモーターおよびvon Willebrand因子プロモーターが挙
げられる。 【０１５３】 前立腺特異的プロモーターとしては、ヒト腺性カリクレイン1（hKLK2）遺伝子
および前立腺特異的抗原（hKLK3）の5'フランキング領域が挙げられる。 【０１５４】 細胞特異的であるプロモーター／エンハンサーの例としては、CSF-１プロモー
ター−エンハンサーのようなマクロファージ特異的プロモーターもしくはエンハ
ンサー、またはマンノース受容体遺伝子プロモーター−エンハンサーからのエレ
メントが挙げられる（Rouleuxら, 1994 Exp Cell Res 214:113-119）。あるいは
、好中球中で選択的に活性のあるプロモーターもしくはエンハンサーエレメント
、またはIL-2遺伝子エンハンサーのようなリンパ球特異的エンハンサーを使うこ
とができる。 【０１５５】 以上に示したように、本発明は、１以上のHSCを、特定の目的のために、形質 転換することが可能であるという驚くべき知見に基く。 【０１５６】 背景的情報として、単球およびそれらの分化した誘導体であるマクロファージ
は、様々な個別の細胞型を生じる能力のあるHSCと呼ばれる胚細胞の貯蔵物から 誘導される。哺乳動物のHSCは、胎児肝臓、脾臓および骨髄内に見出されるが、 出生後および成体においては、通常、骨髄にのみ見出される。HSCは、細胞対細 胞相互作用および可溶性細胞サイトカインの存在のような微小環境因子の影響の
もとで各種の細胞系列に分化する。 【０１５７】 HSCから４つの主要な細胞系列が生じる。これらは、赤血球系（赤血球）；巨 核球細胞系（血小板）；骨髄球系（顆粒球および単核食細胞）；およびリンパ球
系（リンパ球）を含む。特に、骨髄系およびリンパ球系系列は免疫系の機能に重
要である。 【０１５８】 骨髄造血（myelopoiesis）は、妊娠のほぼ6週にヒト胎児の肝臓中で始まる。 コロニーを個別の幹細胞からin vitroで増殖する研究により、HSCから誘導した 第１前駆体細胞は、顆粒球、赤血球、単球および巨核球を生じることができるコ
ロニー形成単位（CFU）であることが示された（CFU-GEMM）。 【０１５９】 これら細胞の成熟は、増殖因子、サイトカインおよびインターロイキンなどの
様々な名前が与えられる組織特異的タンパク質調節因子（regulator）のネット ワークの影響のもとで起こる。概して、増殖因子の様々なクラスを識別する機能
的または構造的特徴はない。ほとんどの因子は、標的細胞の分化状態に正確に依
存する複数の生物学的応答を刺激する能力があるようである。例えば、造血増殖
因子の１つである顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、未熟な骨髄細胞の増殖 を刺激するとともに、成熟した好中球による細菌死滅を活性化する。エリスロポ
エチン（EPO）およびトロンボポエチン（TPO）は構造的に類似したサイトカイン
であり、それぞれ、赤血球および巨核球系列ならびにもっと原始的な前駆体の増
殖と分化を支援する（Gotohら, 1997 Ann Hematol 75: 207-213）。TPOは、造血
受容体ファミリーのメンバーであるMpl受容体に結合することによってその生物 学的効果を開始する（Broudyら, 1997 Blood 89: 1896-1904）。HOXB4は、極初 期造血細胞増殖の重要な調節因子であるが後期造血細胞増殖では重要でないこと
が示されている（Sauvageauら, 1995 Genes Dev 9: 1753-1765）。可溶性Kitリ ガンドタンパク質（Kls）は、膜貫通チロシンキナーゼ受容体C-Kitに対するリガ
ンドとして作用し、肥満細胞（mast cell）および赤血球前駆体を刺激する（91E
P-810609）。該インターロイキンとしては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL
-6、およびIL12が挙げられ、これらはHSCを活性化することができる（"Molecula
r biology and Biotechnology（分子生物学およびバイオテクノロジー）" RA Me
yers編 1995 VCH Publishers Inc p 392-397を参照すること）。 【０１６０】 造血（haemopoiesis）のポジティブ調節に重要であるこれらのメディエータは
、主に骨髄のストローマ細胞から誘導されるが、分化した骨髄およびリンパ球の
成熟型によっても産生される。使用に成功した複数の増殖因子の組合わせがある
が、IL-3とIL-6の組合わせが、原子細胞に対して活性のある幹細胞因子（SCF） のような他の因子を伴なってもまたは伴わなくても、最良の結果を達成した（Bo
dineら, 1989 Proc Natl Acad Sci 86: 8897-8901；Luskeyら, 1992 Blood 80:
396-402；Fraserら, 1990 Blood 76: 1071-1076）。他のサイトカイン（TGFβの
ような）は造血をダウンレギュレーションすることができる。 【０１６１】 CFU-GM細胞は、好中球および単核食細胞の前駆体である。CFU-GMが好中球経路
に沿って分化するにつれて、いくつかの明確な形態学的段階が見られる。骨髄芽
球は前骨髄球および骨髄球へと発育し、成熟すると好中球として循環系中に放出
される。CFU-GMから成熟好中球への細胞の一方向分化は、恐らく、発生の異なる
段階で特定の増殖／分化因子受容体を獲得する結果であろう。 【０１６２】 表面分化マーカーは、顆粒球に発育すると細胞上に消失または出現する。例え
ば、MHCクラスII分子およびCD38は、CFU-GM上に発現されるが、成熟好中球上に は発現されない。分化プロセス中に獲得される他の表面分子としては、CD13、低
密度のCD14、CD15、β1インテグリン、VLA-4、β2インテグリン、CD18β2鎖に関
連するCD11a、bおよびc、補体受容体、ならびにCD16Fcγ受容体が挙げられる。 【０１６３】 単核経路をとるCFU-GMは最初に増殖する単芽球を生じる。これらは前単球へ、
そして最後に成熟循環単球に分化する。循環単球は、組織に存在するマクロファ
ージの置換用プールであると考えられる。マクロファージの異なる型は、細網内
皮系（reticulo-endothelial system）を構成する。 【０１６４】 成熟好中球と同様に、成熟単球およびマクロファージはCD34を失う。しかし、
好中球とは異なり、これらは顕著なレベルのMHCクラスII分子を発現し続ける。 これらの分子は、T細胞に対する抗原の提示に明らかに重要である。単球はまた 、成熟好中球と同じ表面分子の多くを獲得する。 【０１６５】 マクロファージに加えて、濾胞性樹状細胞（follicular dendtritic cell）、
ランゲルハンス細胞（Langerhans' cell）および相互連結樹状細胞（interdigit
ating cell）などの古典的な抗原提示細胞（APC）のほとんどは、出生時に存在 している。それらの起源はまだ明確でないが、ほとんどは骨髄幹細胞から誘導さ
れるようである。１つの可能性としては、これらは同じCFU-GEMM前駆体細胞から
誘導される。その後、形態学的、細胞化学的および機能的相異は、サイトカイン
のような局部的微小環境の影響に因るのであろう。あるいは、APCは異なる幹細 胞から誘導され、別々の分化系列を表すのかもしれない。 【０１６６】 （CFU-GEMMのような）コロニー形成細胞への分化の第１段階において、HSCはC
D33およびCD34を発現する。したがって、HSCは、通常、細胞表面の細胞糖タンパ
ク質CD34（そして恐らくはCD33）の存在により特性づけることができる。 【０１６７】 赤血球、骨髄単球および巨核球系列の細胞への分化の次の段階において、赤血
球系列の生きている赤芽球バースト形成単位（BFUE）細胞は、抗原CD33およびCD
34を担持するが、これらの抗原は後の分化で失われる。CFU-GM細胞などの骨髄単
球系列は、CD33を担持するがCD34は担持せず、このCD33はその後失われる。巨核
球系列は、最初にCD34を担持するCFU Mega細胞へと導かれ、このCD34もその後失
われる。 【０１６８】 HSCおよび他の細胞上のさらなる重要な抗原系は、MHC（主要組織適合性複合体
（major histocompatibility complex））クラスII群である。HSCの大部分はDR と呼ばれる抗原を担持し、分化によりDPと呼ばれる抗原を、その後さらにDQと呼
ばれる抗原を発現することが見出されている。したがって、MHCクラスII DR抗原
は、相対的に初期の幹細胞を特徴づけるものである。 【０１６９】 HSCの単離および培養物内でのそれらの維持および分化の方法は、当業界で（S
antiago-Schwartzら, 1992 J Leuk Biol 52:274-281；Charbordら, 1996 Br J H
aematol 94: 449-454；Daoら, 1997 Blood 89: 446-456；Piacibelloら, 1997 B
lood 89: 2644-2653）およびWO91/09938で公知である。レトロウイルスが介在す
るHSCの形質導入および患者への伝達の方法も記載されている（Dunbarら, 1996
Hum Gene Ther 7:231-253）。 【０１７０】 本発明の遺伝子操作HSCは、適当な製剤によって患者または危機にある個体に 投与される。製剤は、等張塩類溶液、緩衝化塩類溶液または組織培地を含んでも
よい。該細胞は、ボーラス注射または注入により、静脈内にまたは直接に腫瘍部
位へ、または骨髄へ、例えば約106と1012のオーダーの細胞/用量の間の濃度で投
与される。 【０１７１】 個体は、最初、骨髄から幹細胞を除去する治療が行われてもよく、またはG-CS
Fのような１以上のサイトカインで幹細胞の末梢血中への移動を増加させるかも しくは１以上のサイトカインで骨髄の再増殖を促進する治療が行わてもよい。こ
のような治療の組合わせも予想される.本発明の治療はまた、現在利用可能な抗 癌療法と組合せることもできる。 【０１７２】 幹細胞の遺伝子操作に使われるベクターがプロドラッグ活性化酵素をコードす
る場合は、癌を患っている個体は、当業界で公知の原理による適当なレジュメを
使って投与された対応するプロドラッグによってさらに治療される。 【０１７３】 以上に示したように、本発明は、１以上のHSCを、とりわけIRLEにより、特定 の目的のために形質転換することが可能であるという驚くべき知見に基く。 【０１７４】 好ましいIRLEは低酸素応答エレメントである。 【０１７５】 低酸素条件のもとでの治療遺伝子の発現上昇は、１以上の低酸素応答エンハン
サー（HRE）エレメントの存在により誘導することができる。HREエレメントは、
プロモーターおよび／または治療遺伝子の上流（5'）または下流（3'）のいずれ
かに位置しうるポリヌクレオチド配列を含有する。HREエンハンサーエレメント （HREE）は、典型的にはcis作用エレメントで、長さは通常約10-300bpであり、 プロモーターに作用して該プロモーターの調節下に遺伝子の転写を増加させる。
好ましくは、該プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、これらのエレメ
ントにより調節される遺伝子の発現が健全な酸素供給の存在のもとで最小であり
、そして低酸素もしくは無酸素条件のもとでアップレギュレーションされるよう
に選択される。 【０１７６】 用語「低酸素（hypoxia）」は、特定の器官または組織が不十分な酸素供給を 受ける状態を意味する。 【０１７７】 低酸素応答エレメントはまた、例えば、エリスロポエチンHREエレメント（HRE
E1）、筋ピルビン酸キナーゼ（PKM）、HREエレメント、B-エノラーゼ（エノラー
ゼ3；ENO3）HREエレメント、エンドテリン-1（ET-1）HREエレメントおよびメタ ロチオネインII（MTII）HREエレメントから選択することができる。 【０１７８】 低酸素調節エンハンサーのさらなる例は、転写因子HIF-1の結合エレメントで ある（Dachsら, 1997 Nature Med 5: 515；WangおよびSememnza 1993 Proc Natl
Acad Sci USA 90:4304；Firthら, 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:6496）。 低酸素応答エンハンサーエレメントは、エリスロポエチン（EPO）遺伝子などの 複数の遺伝子と関連して見出されている（Madanら, 1993 Proc Natl Acad Sci 9
0: 3928；SemenzaおよびWang 1992 Mol Cell Biol 1992 12:5447-5454）。他のH
REEは、筋解糖酵素ピルビン酸キナーゼ（PKM）遺伝子（Takenakaら, 1989 J Bio
l Chem 264:2363-2367）、ヒト筋特異的β-エノラーゼ遺伝子（ENO3；Peshavari
aおよびDay 1991 Biochem J 275:427-433）およびエンドテリン-1（ET-1）遺伝 子（Inoueら, 1989 J Biol Chem 264 14954-14959）の調節領域からも単離され ている。 【０１７９】 あるいは、治療遺伝子の発現は、グルコース濃度により調節することができる
。 【０１８０】 例えば、grp78およびgrp94のようなグルコース調節タンパク質（grp）は、グ ルコース喪失により誘導される高度に保存されたタンパク質であることが知られ
ている（AttenelloおよびLee 1984 Science 226 187-190）。grp78遺伝子は、ほ
とんどの正常で健全な組織中に基礎レベルプロモーターエレメントの影響のもと
に低レベルで発現されるが、TATAエレメント上流に少なくとも２つの重要な「ス
トレス誘導調節エレメント」を有する（Attenello 1984、同書；Gazitら, 1995
Cancer Res 55: 1660-1663）。grp78プロモーターの5'末端の末端切断型632塩基
対配列への結合は、in vitroでグルコース喪失に対する高い誘導能をレポーター
遺伝子に与える（Gazitら, 1995、同書）。さらに、レトロウイルスベクター中 のこのプロモーター配列は、マウス繊維肉腫、特に中枢の相対的虚血／繊維性部
位の腫瘍細胞において、レポーター遺伝子の高レベル発現を駆動する能力を有し
た（Gazitら, 1995、同書）。 【０１８１】 本発明は、とりわけ１以上のNOIの選択によって、広い治療的応用の可能性を 有すると考えられる。 【０１８２】 例えば、本発明は、WO-A-98/05635に掲げられた障害の治療に有用でありうる 。参照を容易にするため、その表の一部をここに挙げた：癌、炎症または炎症性
疾患、皮膚障害、発熱、心臓血管症状、出血、凝固および急性相応答、悪液質、
食欲不振症、急性感染症、HIV感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免 疫疾患、再潅流障害、髄膜炎、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増
殖、浸潤および伝播、血管形成、転移、悪性腹水および悪性胸水浸出；脳虚血、
虚血性心疾患、変形関節炎、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症
、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、卒中、血管炎、クロ
ーン病および潰瘍性大腸炎；歯周病、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰
瘍、表皮性水泡症；角膜潰瘍、網膜症および外科傷治癒；鼻炎、アレルギー性結
膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテロー
ム性硬化症または内因性硬化症。 【０１８３】 さらに、または代りに、本発明は、WO-A-98/07859に掲げられた障害の治療に 有用でありうる。参照を容易にするため、その表の一部をここに挙げた：サイト
カインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、ヒト
免疫不全ウイルス感染などの免疫不全の治療；リンパ球増殖の調節；癌および多
くの自己免疫疾患の治療、および移植拒絶を予防しまたは腫瘍免疫を誘導するた
め）；赤血球新生の調節、例えば骨髄系またはリンパ系疾患の治療；骨、軟骨、
腱、靭帯および神経組織の成長促進、例えば、傷の治癒、火傷、潰瘍および歯周
病および神経変性の治療；濾胞刺激ホルモンの抑制または活性化（稔性の調節）
；化学走向／化学動力学活性(例えば、特定細胞型を障害または感染部位に移動 させるため）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および卒中の治療のた
め）；抗炎症活性（例えば、敗血症ショックまたはクローン病を治療するため）
；抗菌剤として；例えば代謝または行動の調節剤として；鎮痛薬として；特定の
脱落障害（deficiency disorders）の治療；ヒトまたは動物薬において例えば乾
癬の治療。 【０１８４】 さらに、または代りに、本発明は、WO-A-98/09985に掲げられた障害の治療に 有用でありうる。参照を容易にするため、その表の一部をここに挙げた：マクロ
ファージ抑制および／またはT細胞抑制活性、そして抗炎症活性；抗免疫活性、 すなわち炎症に関連しない応答などの細胞および／または体液免疫応答に対する
抑制効果；マクロファージおよびT細胞の細胞外マトリックス成分およびフィブ ロネクチンに接着する能力ならびにアップレギュレーションされたT細胞中のfas
受容体発現の抑制；慢性関節リウマチなどの関節炎、過敏症に関連する炎症、ア
レルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病および他の自己免疫疾患
などの望ましくない免疫反応および炎症の抑制；アテローム性硬化症に関連する
炎症、動脈硬化症、アテローム性硬化心疾患、再潅流障害、心停止、心筋梗塞、
血管炎症障害、呼吸困難症候群または他の心肺障害、消化性潰瘍に関連する炎症
、潰瘍性大腸炎および他の消化管障害、肝繊維症、肝硬変または他の肝障害、甲
状腺炎または他の腺性疾患、糸状体腎炎または他の腎臓および泌尿器疾患、耳炎
または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周炎または他の歯科疾
患、睾丸炎または精巣-睾丸炎、不妊症、睾丸外傷または他の免疫関連精巣疾患 、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症および他の免疫および
／または炎症関連婦人科疾患、後ブドウ膜炎、中間ブドウ膜炎、前ブドウ膜炎、
結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ網膜炎、光神経炎, 眼内炎症、例えば、網膜炎また
は胞状黄斑浮腫（cystoid macular oedema）、交感神経性眼炎、強膜炎、網膜色
素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性成分、眼外傷の免疫および炎症性成
分、感染により起った眼炎症、増殖性ガラス質網膜症、急性虚血光神経障害、例
えば緑内障濾過手術後の過剰瘢痕、眼移植および他の免疫および炎症に関係した
眼科疾患に対する免疫および／または炎症性反応、中枢神経系（CNS）または他 の器官の両方において免疫および／もしくは炎症抑制が有益である自己応答また
は条件または障害に関係した炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の治療から
の合併症および／または副作用、AIDS関連痴呆複合HIV関連脳疾患、デヴィック 病（Devic's disease）、シンデハム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性 疾患、CNSの症状または障害、発作の炎症成分、ポリオ後遺症候群（post-polio
syndrome）、精神医学障害の免疫および炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性
全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン-バ レー症候群、シンデハム舞踏病、重症筋無力症、偽大脳腫瘍、ダウン症候群、ハ
ンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫またはCNS外傷またはCNSの感染の 炎症成分、筋萎縮およびジストロフィーの炎症成分、ならびに免疫および炎症に
関係した中枢および末梢神経系の疾患、症状または障害、外傷後炎症、敗血症シ
ョック、感染症、手術後の炎症合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合
併症および／または副作用、遺伝子治療の例えばウイルス担体の感染による炎症
および／または免疫合併症および／または副作用、またはAIDSに関係する炎症、
体液性および／または細胞性免疫応答の抑制または阻害、単球または白血球増殖
疾患例えば白血病を単球または白血球量を低減して治療または改善すること、角
膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、自然または人口皮膚組織のような自
然または人工細胞、組織および器官を移植する場合の移植片拒絶の予防および／
または治療。 【０１８５】 本発明のベクター系による１以上のNOIの送達は単独にまたは他の治療または 治療成分と組合せて使うことができる。 【０１８６】 上に示したように、本発明の好ましい様態は、特定の目的のために１以上のHS
Cをレトロウイルスベクターにより形質転換することができるという驚くべき知 見に基く。 【０１８７】 本発明のさらにより好ましい様態は、ベクターのin vitro産生を上昇させるか
または正常な生理学的シグナルに応答して遺伝子のin vivo発現を調節する目的 で、レンチウイルスベクターを配置することが可能であるという驚くべき知見に
基く。 【０１８８】 今までの研究は、HIV-1、HIV-2、SIV、FIVおよびEIAVを含むレンチウイルスフ
ァミリーのメンバーに基くベクターを開発することが可能であることを示してい
る。今まで、全てのベクターは、構成的にまたはウイルスベクター自身の天然の
調節シグナルに応答して治療遺伝子を発現する。どの立体配置も遺伝子発現レベ
ルの調節が必要な疾患の治療のためにあまり有用ではなかった。本発明者らは、
初めて、低酸素に応答し、低酸素を擬似する作用剤に応答するレンチウイルスベ
クターを記載した。この調節をin vitroで利用してベクターの生産を促進するこ
とができ、in vivoで使って正常な生理学的シグナルに応答して遺伝子発現を調 節することができる。このようなベクターは、虚血が特徴である広範囲の疾患、
例えば、心臓血管疾患、末梢動脈疾患、癌および関節炎で有用である。 【０１８９】 集中して行われている研究にも関らず、今まで、調節された遺伝子を含有する
レンチウイルスベクターの記載はなく、文献からこのようなベクターを作ること
ができることは明確でなかった。このようなベクターは、ある範囲の疾患に対し
て広い用途を有するであろう。本発明者らは、今回、組織生理学および化学修飾
因子（chemical modulator）により調節された一連のレンチウイルスベクターを
作製した。これらのベクターは、発現カセットが上記のようにベクターに内部的
に位置するように、配置（configurate）させることができる。しかし、本発明 者らは、このようなベクターを単一転写ユニットベクターとして配置させること
のさらなる利点が分かった。この配置では、得られる調節配列の重複が応答を増
強する。本発明者らが研究した調節系は、遺伝子発現が虚血に応答して活性化さ
れるという事実を利用する。虚血の生理学的マーカーは低酸素、低pHおよび低グ
ルコースであり、これらの条件は細胞内で感知され、制限された遺伝子セットを
活性化する。このような遺伝子セットの１つは、DNA中に主に低酸素に対する応 答に介在する配列を含有し、これらが低酸素応答エレメント（HRE）である。プ ラスミド、レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター内の遺伝子発現を誘導
するこれらのエレメントの使用は、今まで特許出願[PCT/GB95/00322；PCT/GB97/
02709]および文献（例えば、Dachsら, 1997、同書）に記載されている。しかし 、今まで、それらがレンチウイルスベクター内で有用であることは実証されてい
なかった。 【０１９０】 低酸素への応答に加えて、HREエレメントは低酸素を擬似する化学誘導物質に 応答することが知られている。これらの２つは公知であり、コバルトおよびデス
フェリオキサミンである（Meliilloら, 1996 J. Biol. Chem 272, 12236-12243 ；WangおよびSemenza 1993, Blood, 82, 3610）。 【０１９１】 本発明は、虚血が明白である任意の疾患に使用するためまたは化学活性剤デス
フェリオキサミンもしくは類似化学品が使われる任意の疾患に使用するための任
意の細胞型に使用する任意のレンチウイルスベクターに応用可能であり、該疾患
は、例えば、神経芽細胞腫（Blatt 1994, Anticancer Res., 14, 2109）、βサ ラセミア（GiardinaおよびGrady 1995, Semin. Hematol. 32, 304）、アルツハ イマー病（Crapperら, 1991, The Lancet, 337, 1304）、VEGF欠乏症（Beerrepo
otら, 1996, 56, 3747）、エリスロポエチン欠乏症（WangおよびSemenza、前掲 ）および腫瘍化学療法の増強（Voestら, 1993, Cancer Chemother. Pharmacol.
31, 357）である。 【０１９２】 当技術分野で周知のように、ベクターは、ある物質のある環境から他の環境へ
の伝達を可能にするか、または容易にするツールである。本発明によれば、例え
ば、組換えDNA技術に使われるいくつかのベクターは、DNAのセグメントのような
（異種DNAセグメントのような、異種cDNAセグメントのような）物質を標的細胞 に伝達することができる。場合によっては、標的細胞内に入れば、その後、ベク
ターは該細胞内で異種DNAを維持する役割を果しうるかまたはDNA複製のユニット
として作用しうる。組換えDNA技術で使われるベクターの例は、プラスミド、染 色体、人工染色体またはウイルスである。 【０１９３】 ベクターはウイルスまたは非ウイルス技術により送達することができる。 【０１９４】 非ウイルス送達系は、限定されるものでないが、DNAトランスフェクション法 を含む。本明細書では、トランスフェクションは、非ウイルスベクターを使って
遺伝子を標的哺乳類細胞に送達するプロセスを含む。 【０１９５】 典型的なトランスフェクション法は、エレクトロポレーション、DNA微粒子銃 （DNA biolistics）、脂質介在トランスフェクション、コンパクト(compacted)D
NA介在トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、
カチオン性物質介在、カチオン性表面両親媒性物質（cationic facial amphiphi
les）（CFA）（Nature Biotechnology 1996 14: 556）、スペルミンのような多 価カチオン、カチオン性脂質またはポリリシン、1,2,-ビス(オレオイロキシ)-3-
(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)-コレステロール複合体（WolffおよびT
rubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16: 421）およびそれらの組合わせを含 む。 【０１９６】 ウイルス送達系は、限定されるものでないが、アデノウイルスベクター、アデ
ノ随伴ウイルス（AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベ
クター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含む。他のベク
ターの例は、限定されるものでないが、エレクトロポレーション、DNA微粒子銃 、脂質介在トランスフェクション、コンパクトDNA介在トランスフェクションの ようなDNAトランスフェクション法を含むex vivo送達系を含む。 【０１９７】 該ベクターはプラスミドDNAベクターであってよい。適切な組換えウイルスベ クターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV)ベクター、ヘル
ペスウイルスベクター、または、より好ましいレトロウイルスベクターを含む。
ウイルスベクターの場合、遺伝子送達は標的細胞のウイルス感染により媒介され
る。 【０１９８】 本発明のベクターは、スプリットイントロンベクターとして配置することがで
きる。スプリットイントロンベクターはGB 9720465.5に、そして今回、その優先
権を主張しており、このPCT特許出願の出願と同じ日に出願されたPCT特許出願（
VECTORの標題を付した）に記載されている。参照を容易にするため、PCT特許出 願の特許請求の範囲を掲げる：機能的スプライス供与体部位および機能的スプラ
イス受容体部位を含んでなるレトロウイルスベクターであって；機能的スプライ
ス供与体部位および機能的スプライス受容体部位は、第１の目的のヌクレオチド
配列（「NOI」）に隣接し；機能的スプライス供与体部位は機能的スプライス受 容体部位の上流にあり；該レトロウイルスベクターはレトロウイルスプロベクタ
ーから誘導され；該レトロウイルスプロベクターは機能的スプライス供与体部位
を生じる能力のある第１のヌクレオチド配列（NS）および機能的スプライス受容
体部位を生じる能力のある第２のNSを含んでなり；第１のNSは第２のNSの下流に
あり；該レトロウイルスベクターはレトロウイルスプロベクターの逆転写の結果
として形成されることものである、前記レトロウイルスベクター。この出願にお
いて、第１のNOIは本明細書に規定されるNOIである。スプリットイントロン様態
についての教示は、以下に提供される実施例の節の最後に提供される。これらの
教示はこの好ましい様態、すなわちスプリットイントロンウイルスベクターを構
築する方法についての情報を提供する。 【０１９９】 従って、本発明のこの好ましい様態においては、１以上のレトロウイルスベク
ター（そのうちの少なくとも１つのがNOIを含む）を用いたウイルス形質導入に より細胞を形質転換することによって作製された改変細胞であって、該細胞内で
活性のあるエレメントおよびNOIを含んでなる上記改変細胞において；該レトロ ウイルスベクターは機能的スプライス供与体部位および機能的スプライス受容体
部位を含んでなり；該機能的スプライス供与体部位および機能的スプライス受容
体部位は第１の目的ヌクレオチド配列（「NOI」）に隣接し；該機能的スプライ ス供与体部位は機能的スプライス受容体部位の上流にあり；該レトロウイルスベ
クターはレトロウイルスプロベクターから誘導され；該レトロウイルスプロベク
ターは機能的スプライス供与体部位を生じる能力のある第１のヌクレオチド配列
（NS）および機能的スプライス受容体部位を生じる能力のある第２のNSを含んで
なり；ここに、第１のNSは第２のNSの下流にあり；該レトロウイルスベクターは
該レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるものである、上
記改変細胞が提供される。 【０２００】 本発明のベクターはアデノウイルスベクターであることができる。 【０２０１】 アデノウイルスは二本鎖、線状DNAウイルスであり、RNA中間物を経由しない。
50種を超える異なるヒト血清型のアデノウイルスがあり、遺伝子配列相同性に基
いて6サブグループに分けられる。アデノウイルスの天然の標的は、気道および 胃腸管系上皮であり、一般的に穏かな症状を生じるのみである。アデノウイルス
ベクター系で血清型２型および５型（95%配列相同性）が最も一般的に使われ、 通常、若年者の上気道感染に関わる。 【０２０２】 アデノウイルスは非エンベロープで、正二十面体である。典型的なアデノウイ
ルスは、140nmカプシドDNAウイルスを含んでなる。該ウイルスの二十面体対称性
は152カプソメア：240ヘキソンおよび12ペントンからなる。粒子のコアは36kb線
状２本鎖DNAを含有し、これは5'末端でDNA複製のプライマーとして作用する末端
タンパク質（TP）と共有結合している。該DNAは逆方向末端反復（ITR）を有し、
これらの長さは血清型によって変化する。 【０２０３】 アデノウイルスの細胞への侵入は一連の個別現象が関わる。ウイルス繊維（37
nm）と細胞上の繊維受容体との間の相互作用を介して、ウイルスの細胞への付着
が起る。最近、この受容体はAd2/5血清型と同定され、CAR（Coxsackie and Aden
o Receptor、Tomkoら, 1997 Proc Natl Acad Sci 94: 3352-3358）と名付けられ
た。ウイルスの、細胞性αvβ3およびαvβ5インテグリン経由のエンドソームへ
の内部移行は、ペントン系カプシドタンパク質のウイルス性RGD配列により媒介 される（Wickhamら, 1993 Cell 73: 309-319）。内部移行の後、エンドソームは
、細胞性αvβ5インテグリンにより選好的に促進されると考えられる現象である
エンドソーム分解（endosomolysis）として知られるプロセスにより破壊される （Wickhamら, 1994 J Cell Biol 127: 257-264）。さらに、Ad5繊維ノブ(knob) は、ヒト上皮細胞およびBリンパ芽球細胞を含むある特定の細胞型表面のMHCクラ
ス1 α2ドメインに高アフィニティで結合するという新たな証拠がある（Hongら,
1997 EMBO 16: 2294-2306）。 【０２０４】 続いて、該ウイルスは、初期領域の活性化が起る核に転座し、まもなく続いて
DNA複製および後期領域の活性化が起る。アデノウイルスDNAの転写、複製および
パッケージングには、宿主およびウイルス両方の機能的タンパク質機構が必要で
ある。 【０２０５】 ウイルス遺伝子発現は初期（E）および後期（L）に分けることができる。後期
はウイルスDNA複製の開始により規定される。アデノウイルス構造タンパク質は 、一般的に後期に合成される。アデノウイルス感染後、宿主細胞のmRNAおよび蛋
白質合成は、ほとんどの血清型に感染した細胞内では抑制される。アデノウイル
ス２およびアデノウイルス５に関するアデノウイルス分解サイクルは非常に効率
的であり、感染細胞当り約10,000ビリオンを生じ、ビリオン中に組込まれていな
い過剰ウイルスタンパク質およびDNAの合成を伴なう。初期アデノウイルス転写 は、複雑な一連の相互関係した生化学事象であるが、本質的にDNA複製の開始前 のウイルスRNAの合成を伴う。 【０２０６】 図34に示した模式図はアデノウイルスゲノムのものであり、初期および後期遺
伝子転写の相対的方向および位置を示す。該アデノウイルスゲノムの構成は全て
のアデノウイルス群で類似し、一般的に、特定の機能は研究した各血清型に対し
て同じ場所に位置する。初期細胞質メッセンジャーRNAは、ウイルスDNA上の４つ
の規定された非隣接領域に対して相補的である。これらの領域はE1-E4と呼ばれ る。初期転写物は、一列の中間初期（E1a）、遅延初期（E1b、E2a、E2b、E3およ
びE4）、および中間領域に分類される。 【０２０７】 初期遺伝子は、感染後ほぼ6-8時間に発現され、下記の遺伝子ブロックE1-4の7
プロモーターにより誘導される。 【０２０８】 E1a領域は、ウイルスおよび細胞遺伝子の転写トランス活性化ならびに他配列 の転写抑制に関わる。E1a遺伝子は、他の初期アデノウイルスメッセンジャーRNA
の全てに対して重要な制御機能を果す。正常な組織では、領域E1b、E2a、E2b、E
3またはE4を効率的に転写するために、活性E1a産物が必要である。しかし、E1a 機能をバイパスすることができる。細胞を遺伝子操作してE1a様機能を与えても よく、または細胞は天然でこの機能を含有していてもよい。ウイルスも遺伝子操
作してE1a機能をバイパスすることができる。ウイルスパッケージングシグナル は、E1aエンハンサー（194-358 nt）とオーバーラップする。 【０２０９】 E1b領域は、ウイルスおよび細胞代謝ならびに宿主タンパク質遮断（shut-off ）に影響を与える。該領域はまた、全長ウイルスDNAのパッケージングに必要で ありかつウイルスの熱安定性に重要であるpIXタンパク質（3525-4088 nt）をコ ードする遺伝子も含む。E1b領域は、感染後期のウイルスの各現象の正常な進行 に必要である。E1b産物は宿主核内で作用する。E1b配列内で作製された変異体は
、後期ウイルスmRNA蓄積ならびに通常アデノウイルス感染後期に観察される宿主
細胞輸送の抑制障害を低減する。E1bは、プロセシングおよび輸送がウイルス後 期遺伝子産物にとって遊離にシフトするように宿主細胞の機能を変更するために
必要である。その後、これらの産物はウイルスパッケージングおよびビリオン放
出をもたらす。E1bは、アポトーシスを予防する19 kDタンパク質を産生する。E1
bはまた、p53と結合する55 kDタンパク質も産生する。アデノウイルスおよびそ れらの複製の概説は、WO96/17053を参照すること。 【０２１０】 E2領域は、72 kDa DNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼおよびDNA合成開始の
プライマータンパク質に必要である55 kDa末端タンパク質（TP）の80 kDa前駆体
をコードするので、本質的である。 【０２１１】 19 kDaタンパク質（gp19K）は、E3領域内でコードされ、ウイルスに対する宿 主免疫応答の調節に関係している。このタンパク質の発現は、感染第１期にTNF αに応答してアップレギュレーションされ、その後、これはMHCクラスI抗原と結
合して上皮表面への移動を阻止し、それによって細胞毒性Tリンパ球によるアデ ノウイルス感染細胞の認識を弱める。E3領域は、in vitro研究では必ずしも必要
ではなく、1.9 kb XbaI断片の欠失によって除去することができる。 【０２１２】 E4領域は宿主タンパク質合成を低下し、ウイルスのDNA複製を増加させること に関わる。 【０２１３】 5つの後期遺伝子ファミリーがあり、全て主要な後期プロモーターから開始さ れる。後期遺伝子の発現は、RNAスプライシングが関わる非常に複雑な転写後制 御機構を含む。繊維タンパク質は、L5領域内にコードされている。アデノウイル
スゲノムは、Ad5内にあり103bpであって、逆方向末端反復に隣接し、DNA複製に 本質的役割を果す。感染の30-40時間後、ウイルス産生は完了する。 【０２１４】 アデノウイルスは、E2、E3およびE4プロモーターの誘導に重要であるE1遺伝子
を欠失させることにより、遺伝子伝達用ベクターとして使用するために変換をす
ることができる。E1-複製欠陥遺伝子を、ヒト胚性腎細胞系293のような、E1ポリ
ペプチドを輸送中に生じさせる細胞系内で増殖させることができる。E1遺伝子の
代りに、組換えによって１以上の治療遺伝子を挿入することができる。該遺伝子
の発現は、E1プロモーターまたは異種プロモーターのいずれからでも誘導される
。 【０２１５】 さらにもっと弱毒化したアデノウイルスベクターが、E4オープンリーディング
フレーム（ORF）のいくつかまたは全てを欠失させることにより開発されている 。しかし、ある特定の第２世代ベクターは、たとえDNAが維持されると思われて も長期の遺伝子発現を与えないようである。したがって、１以上のE4 ORFの機能
は、ウイルスにより運ばれた少なくともある特定のウイルスプロモーターからの
遺伝子発現を増強することであり得る。 【０２１６】 もっと欠陥のあるウイルスを作製する別の手法は、ウイルス複製に必要な末端
反復だけを完全に維持するウイルスを「抜粋する(gut)」ことであった。「抜粋 した」または「抜粋していない」ウイルスを第１世代ヘルパーウイルスを用いて
293細胞系において高力価で増殖することはできるが、「抜粋した」ベクターを ヘルパーウイルスから分離することは困難であった。 【０２１７】 複製能力のあるアデノウイルスを遺伝子治療に使うこともできる。例えば、E1
a遺伝子を腫瘍特異的プロモーターの調節のもとで第１世代ウイルス中に挿入す ることができる。理論では、ウイルスの腫瘍中への注入後、腫瘍中で特異的に複
製することができるが、周囲の正常細胞中では複製できない。このタイプのベク
ターを使って、腫瘍細胞を直接、溶解（lysis）により死滅させるか、またはガ ンシクロビルによる処理後に感染したもしくは傍観者細胞を死滅させることがで
きる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV tk）のような「自殺遺伝子」
を送達することができる。あるいは、E1bにのみ欠陥のあるアデノウイルスが特 定的に第Ｉ相臨床試験において抗腫瘍治療に使われている。E1bによりコードさ れたポリペプチドはp53介在アポトーシスをブロックすることが可能であり、細 胞がウイルス感染に応答して自殺するのを防止する。したがって正常な非腫瘍細
胞では、E1bが不在の場合、ウイルスはアポトーシスをブロックできず、よって 感染性ウイルスを作製し伝播することができない。p53が欠損した腫瘍細胞では 、E1b欠陥ウイルスが増殖し、隣接するp53欠陥腫瘍細胞に伝播することができる
が、正常細胞には伝播しない。さらに、このタイプのベクターはまた、HSV tkの
ような治療遺伝子を送達するために使うこともできる。 【０２１８】 アデノウイルスは、下記の理由で遺伝子送達用ベクターとして他の遺伝子治療
ベクター系を超える利点を提供する。 【０２１９】 これは、２本鎖DNA非エンベロープウイルスであり、広範囲のヒトおよび非ヒ ト起源の細胞型のin vivoおよびin vitro形質導入能力がある。これらの細胞は 、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、一次哺乳類上皮細
胞およびマクロファージニューロンのような分裂後最終分化非複製細胞（恐らく
単球を含むいくつかのリンパ球の重要な例外はあるが）を含む。 【０２２０】 アデノウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞の両方を形質導入する能力
がある。これは、肺上皮の侵された細胞が遅い代謝回転速度を有する嚢胞性繊維
症（cystic fibrosis）のような疾患にとって非常に重要である。実際、成人嚢 胞性繊維症患者の肺へ嚢胞性繊維症輸送体（CFTR）のアデノウイルス介在伝達を
利用するいくつかの試験が進められている。 【０２２１】 アデノウイルスは、遺伝子治療用および異種遺伝子発現用ベクターとして使わ
れてきた。第１世代組換えアデノウイルスベクター（E1/E3欠失）は、7-8kbの外
来インサートDNAを収容することができ、第２世代（E1/E3/E4欠失）および第３ 世代（「抜粋なし」）はさらに大きなDNAインサートを運ぶことができる。組換 えアデノウイルスベクターは伝播し非常に高力価で貯蔵することができる。補完
細胞系（complementing cell line）におけるアデノウイルスベクター複製は、1
013ウイルス粒子/mlまでの非常に高い力価をもたらすことができる。したがって
アデノウイルスは、一次非複製細胞中の遺伝子発現を研究するための最良の系の
１つである。 【０２２２】 アデノウイルスゲノム由来のウイルスまたは外来遺伝子の発現は、複製細胞を
必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体介在エンドサイトーシス（en
docytosis）により細胞に侵入する。細胞内に入ると、アデノウイルスベクター はまれにしか宿主染色体に組みこまれることはない。その代りに、アデノウイル
スベクターは、宿主核中の線状ゲノムとして（宿主ゲノムから独立して）エピソ
ーム的に機能する。したがって、組換えアデノウイルスの使用により、問題が軽
減され、宿主ゲノムへの無作為な組込みに関連するリスクが回避される。 【０２２３】 ヒト悪性疾患（human malignancy）はアデノウイルス感染と関係がない。弱毒
化アデノウイルス株が開発されており、生ワクチンとしてヒトに使われている。 【０２２４】 しかし、現在のアデノウイルスベクターはin vivo治療での使用に対していく つかの重大な制限を受ける。これらは次のものを含む：(i)一過性遺伝子発現、 すなわちアデノウイルスベクターは一般的にエピソームとして残留し、複製しな
いので、次の子孫に伝わらない；(ii)複製能力がないため、標的細胞増殖はベク
ターの希釈を起しうる；(iii)アデノウイルスタンパク質に対して免疫応答が生 じるので、アデノウイルスタンパク質を発現する細胞は低レベルであっても破壊
される、(iv)in vivo送達により標的細胞の比率だけしかベクターの摂取および 送達遺伝子の発現が生じないので、効果的な治療指数を達成できない、(v)正常 組織の最小毒性をもち疾患組織を指向する必要がある遺伝子治療手法として、ア
デノウイルスの広い標的範囲は問題がありうる。必要な区画の治療に焦点を絞る
ために使いうる任意の追加の制御はこのベクター系にとって有利であろう。 【０２２５】 本発明で使用するアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスまたは通常
はヒトに感染しないアデノウイルスから誘導することができる。好ましくは、該
ベクターは、アデノウイルス２型またはアデノウイルス５型（Ad2またはAd5）ま
たはマウスアデノウイルスまたはCELOウイルスのようなトリアデノウイルス（Co
ttonら, 1993 J Virol 67:3777-3785）から誘導される。該ベクターは複製能力 のあるアデノウイルスベクターであってよいが、欠損（defective）アデノウイ ルスベクターの方が好ましい。アデノウイルスベクターは、ウイルスの複製のた
めに必要な１以上の成分の欠失により欠損化することができる。典型的には、各
アデノウイルスベクターは少なくともE1領域に欠失を含む。感染性アデノウイル
スベクター粒子を作製するには、この欠失は、E1遺伝子を含むAd5の残留部分を 組込んだコピーを含有するヒト293細胞系のようなヒト胚繊維芽細胞系中でウイ ルスを継代して補完することができる。このようなベクター中への異種DNAの挿 入容量は、ほぼ7 kbまでであり得る。したがって、このようなベクターは、レト
ロウイルス二次ベクター構築のための必須転写ユニットの１つをそれぞれ含有す
る３つの別個の組換えベクターを含んでなる、本発明によるシステムの構築に有
用である。 【０２２６】 今まで、生理学的に調節された組換えアデノウイルスに関する開示されたデー
タはなかった。しかし、アデノウイルスベクターの関連して研究されてきたいく
つかの組織特異的プロモーターがあり、その５つを以下に記載した。 【０２２７】 膵炎関連タンパク質Iプロモーター（膵炎の急性期に強く誘導される）は、IL6
およびデキサメタソンの組合わせによるin vitro刺激後、AR-42J膵細胞系にCAT 活性の90倍誘導を示す（Dusettiら, 1997 J. Biol. Chem. 272(9) 5800-5804） 。マウスin vivo実験（アデノウイルスが静脈注射経由で尾静脈に投与された） では、膵炎をもつ動物に10倍高い活性が示された（対照動物のいくつかの他組織
においてはCATの低活性が観察された）。 【０２２８】 マウスαフェトプロテインプロモーターを含有する組換えアデノウイルスを構
築して、ヒトインターロイキン-２遺伝子の肝細胞（HCC）特異的発現を誘導した
。AFPを産生するHCC細胞系中のIL-2発現は、AFPを産生しない非HCC細胞系と比較
して、3-4倍高かった（Buiら, 1997 Human Gene Therapy. 8 2173-2182）。CB-1
7/SCIDマウスの背側腹部に確立されたHep3B腫瘍中にAdVAFP1-IL2を腫瘍内注射す
ると、実質的な増殖停止がもたらされ、3回の注射後に腫瘍は退行した。 【０２２９】 lacZ、EGFPまたは筋小胞体（sarcoendoplasmic reticulum）Ca-ATPアーゼ（SE
RCA）遺伝子のいずれかの発現を制御する心臓トロピニンT（cardiac tropinin T
）（cTnT）プロモーターのセグメントを含有する組換えアデノウイルスを構築し
た（Inesiら, 1998 American J. Physiol. 274(3,1) C645-C653）。その後、該 組換えウイルスを使って、培養中のニワトリ筋細胞および繊維芽細胞を形質導入
し、cTnTプロモーターからの発現は心筋細胞に制限されることを示した。 【０２３０】 平滑筋特異的プロモーター（SM22α）を使って、組換えアデノウイルス内の細
菌性lacZレポーター遺伝子の発現を誘導した（Kimら, 1997 J. Clin. Invest. 1
00(5) 1006-1014）。発現は一次ラット大動脈SMCおよび不死化A7r5 SMC中に検出
されたが、HUVECまたはNIH3T3細胞中には検出されなかった。組換えアデノウイ ルスをSprague Dawleyラットに静脈注射すると、CMV lacZアデノウイルスからの
発現は肝および肺全体に検出されたが、これらの組織のいずれにもSM22誘導lacZ
アデノウイルスからの発現は検出されず、導入遺伝子発現はSMCに制限された。 本文献の結論は、該ウイルスを動脈内、静脈内または筋内に投与したとき、AdSM
CC-lacZ発現は内臓および血管のSMCに制限されたと述べている。 【０２３１】 KDRおよびE-セレクチンプロモーターを遺伝子操作して、内皮細胞中のSINレト
ロウイルスベクターからのマウスTNF-αの発現をアップレギュレーションした（
Jaggarら, 1997 Human Gene Terapy 8(18) 2239-2247）。sEND内皮細胞内のこれ
らのプロモーターエレメントからの発現は、NIH-353織維芽細胞と比較して、約1
0倍増加していることが観察された。 【０２３２】 アデノウイルスの特徴をレトロ／レンチウイルスの遺伝子安定性と組合せると
、本質的にアデノウイルスを使い、安定して隣接細胞に感染する一過性レトロウ
イルス産生細胞になるように標的細胞に形質導入することができる。 【０２３３】 本発明に使用するための好ましいベクターは、組換えウイルスベクター、特に
組換えレトロウイルスベクターである。 【０２３４】 本発明に使用するための好ましいベクターは、組換えウイルスベクター、特に
組換えアデノウイルスベクターである。 【０２３５】 本発明に使用するための好ましいベクターは、組換えウイルスベクター、特に
アデノウイルスおよびレトロウイルスベクターの組合わせである。 【０２３６】 「組換えレトロウイルスベクター（RRV)」という用語は、パッケージング成分
が存在する場合、標的細胞に感染する能力のあるウイルス粒子中にRNAゲノムを パッケージングさせるのに十分なレトロウイルス遺伝子情報をもつベクターを指
す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組込みを含む。使用す
るRRVは、ベクターから標的細胞に送達されるべき非ウイルスコード配列を有す る。RRVは、最終標的細胞内で、感染レトロウイルス粒子を作製する独立した複 製能力はない。通常、RRVは機能的gag-polおよび／またはenvおよび／または他 の複製に本質的な遺伝子を欠く。 【０２３７】 本発明は、NOIまたは遺伝子のHSCへのin vivo送達のためにベクターを使用し 、該ベクターは好ましくはCD34+ HSCを標的とする能力のある標的ベクターであ る。 【０２３８】 「標的ベクター（targeted vector）」という用語は、細胞に感染／トランス フェクトするかまたは標的細胞内で発現される能力が宿主生物（通常、共通また
は類似の表現型を有する細胞）内のある特定の細胞型に制限されているベクター
を指す。 【０２３９】 標的ベクターの例は、宿主生物の限られた数の細胞型上にだけ見出される細胞
表面分子と結合する、遺伝子的に改変されたエンベロープタンパク質をもつ標的
レトロウイルスベクターである。標的ベクターの他の例は、宿主生物の細胞型の
比率で１以上のレトロウイルス転写物の発現だけを許容するプロモーターおよび
／またはエンハンサーエレメントを含有するものである。したがって、該ベクタ
ーは、CD34に特異的な抗体または免疫グロブリン様分子のような、CD34特異的な
リガンドを提供することができる。このようなベクターは、治療されるべき個体
内に導入されると、特異的にCD34+ HSCをトランスフェクトする。該ベクターは 全身的に末梢循環へ投与することができる。 【０２４０】 本発明によるレトロウイルスベクター粒子はまた、ゆっくりと分裂しかつMLV のような非レンチウイルスが効率的に形質導入することができない細胞を形質導
入する能力も有するであろう。ゆっくりと分裂する細胞は、ある特定の腫瘍細胞
を含めて、約3から4日毎に1回分裂する。腫瘍は急速に分裂する細胞を含有する が、いくつかの腫瘍細胞、特に腫瘍の中心にある細胞は、まれにしか分裂しない
。 【０２４１】 本発明により治療することができる腫瘍の例は、限定されるものでないが、骨
原性および軟組織肉腫を含む肉腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、
大腸癌、直腸癌、膵癌、胃癌、肝癌、子宮癌、および卵巣癌のような癌、ホジキ
ンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、
骨髄腫、ウイルムス腫瘍、および急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性
白血病を含む白血病、神経膠腫および 網膜芽細胞腫を含む。 【０２４２】 あるいは、標的細胞は、腫瘍マスの中心部にある細胞のように細胞分裂を行う
能力のある増殖停止細胞またはHSCのような幹細胞またはCD34+細胞であり得る。
さらなる代替物としては、標的細胞は、単球前駆体、CD33+細胞、または骨髄前 駆体のような分化細胞の前駆体であってよい。さらなる代替物として、標的細胞
は、ニューロン、星状細胞、グリア細胞、小グリア細胞、マクロファージ、単球
、上皮細胞、内皮細胞または肝細胞のような分化した細胞であり得る。標的細胞
は、ヒト個体からの単離後in vitroで形質導入することもでき、または直接in v
ivoで形質導入することもできる。 【０２４３】 当技術分野で標準のさらなるベクター成分が、適宜、ベクター維持、核局在化
、複製、および組込みのようなベクター機能の他の様態を付与するであろう。 【０２４４】 HSCを治療されるべき個体から除去し、in vitroでベクターによりトランスフ ェクトまたは形質導入する場合、該細胞は一般的に1個または複数のNOIの導入前
および後に培養で増やされる。in vitroで適当な条件のもとで培養される場合、
または適当なシグナルがin vivoで受容される場合、HSCは、他の細胞型のうち、
内皮細胞、骨髄細胞、樹状細胞、ならびに、好中球、リンパ球、単核食細胞およ
びNK細胞のような免疫効果器細胞に分化する能力を有する。 【０２４５】 これは、当技術分野で公知の組織培養方法の使用を含み、HSC維持のためのサ イトカイン及び／又は増殖因子への暴露を含む（Santiago-Schwartzら 1992 J L
euk Biol 52:274-281；Charbordら 1996 Br J Haematol 94:449-454；Daoら 199
7 Blood 89:446-454；Piacibelloら 1997 Blood 89:2644-2653）。HSCの分化を 誘導する作用物質を加えることもできる。 【０２４６】 示したに、本発明のベクターは、ウイルス又は非ウイルスベクターによって標
的部位に送達され得る。 【０２４７】 本発明はまた、癌などの疾病の治療に使用する試薬及び方法をも提供し、また
、予防医薬に使用する試薬及び方法をも提供する。このように、本発明で用いる
NOIは、予防による治療的効果を有することができる。例えば、癌が進行するリ スクの上昇が診断された場合、本発明を用いて危険にさらされた個体にワクチン
接種することができる。 【０２４８】 本発明はまた、遺伝子治療による個体の治療のための医薬組成物であって、1 種以上の送達可能な治療的及び／又は診断的NOI又はそれによって製造されるか 、若しくはそれから得られるウイルス粒子を含む、本発明のレトロウイルスベク
ターの治療有効量を含む、上記違約組成物も提供する。医薬組成物は、ヒト又は
動物に使用することができる。典型的には、個々の患者に最も好適であり、年齢
、体重及び特定患者の応答によって変動するだろう実際の用量は医師が決定する
。 【０２４９】 組成物は、製薬上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを任意に
含み得る。製薬上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、所期の投与経路及び標準
的な製薬上のプラクティスに関して選択され得る。医薬組成物は、担体、賦形剤
又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の好適な1以上の結合剤、1以上の滑
沢剤、1以上の懸濁化剤、1以上の被覆剤、1以上の可溶化剤、及び標的部位中へ のウイルス導入を助けるか、又は増加し得る他の担体物質（例えば、脂肪送達シ
ステムなど）を含み得る。 【０２５０】 適当な場合には、医薬組成物は、任意の１以上の、吸入、座薬若しくは膣座薬
の形態で、局所的にはローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散布剤の形態
で、スキンパッチ（skin patch）の使用によって、経口的には澱粉若しくは乳糖
などの賦形剤を含む錠剤の形態で、又は単独又は賦形剤と混合したカプセル剤若
しくは小卵（ovules）で、又は矯味矯臭剤（flavouring agent）若しくは着色剤
を含むエリキシル剤（elixirs）、溶液又は懸濁液の形態で、投与することがで き、又はそれらは、非経口的に、例えば、鼻腔内的に（intracavernosally）、 静脈内に、筋内に若しくは皮下的に注射できる。非経口適用のためには、組成物
は、滅菌水溶液の形態で用いるのが最もよく、血液と等張な溶液を作るための他
の物質、例えば十分量の塩（salts）又は単糖類を含むことができる。バッカル 又は舌下投与のためには、組成物は、従来方法で製剤化され得る錠剤又はロゼン
ジの形態で適用され得る。 【０２５１】 予防に好適なのは、癌に対する遺伝子素因、例えばBRCA-1遺伝子、BRCA-2遺伝
子（Cornelisseら 1996 Pathol Res Pract 192:684-693）又は別の関連する遺伝
子における1個以上の突然変異による乳癌又は卵巣癌に基づくものであり得る。 【０２５２】 本発明によれば、当業者の水準内にある標準分子生物学的技術を用いることが
できる。そのような技術は、文献に十分に記載されている。例えば、Sambrookら
、(1989) Molecular Cloning; a laboratory manual；Hames及びGlover (1985-1
997) DNA Cloning: a practical approach, 第I−IV巻（第2版）；Methods for
the engineering of immunoglobulin genes are given in McCafferty et al (1
996) 「Antibody Engineering: A Practical Approach」を参照されたい。 【０２５３】 要約すると、本発明は、1以上のNOIをHSC中に導入するのに好適な送達システ ムに関する。 【０２５４】 本発明はまた、1以上のNOIを含むベクターを含むMHSCにも関する。 【０２５５】 本発明はまた、前述のベクター及び／又はMHSCを含むワクチンにも関する。 【０２５６】 本発明の好ましい態様は、虚血、低酸素状態又は低グルコースによって特徴付
けられる症状；特に、これらに限定されるわけではないが、癌、大脳マラリア、
虚血性心疾患又はリューマチ性関節炎などの症状の治療又は予防における上述の
任意の生成物の使用に関する。 【０２５７】 さらに広い態様では、本発明は、マクロファージ中で機能し得るエレメントを
含む応答エレメント（「マクロファージ応答エレメント」）を含む、改変された
HSC（MHSC）を提供する。 【０２５８】 このように、本発明はまた、分化した細胞内で活性のある1以上の応答エレメ ントに機能しうる形で連結された発現可能な目的のヌクレオチド配列（NOI）を 少なくとも１つ含んでなる改変された分化細胞（好ましくは最終分化細胞）も提
供する。 【０２５９】 このように、好ましい態様では、本発明はまた、分化した細胞内で活性のある
1以上の応答エレメントに機能しうる形で連結された発現可能な目的のヌクレオ チド配列（NOI）を少なくとも１つ含んでなる改変されたマクロファージも提供 する。 【０２６０】 このように、好ましい態様では、本発明はまた、分化した細胞内で活性のある
1以上の応答エレメントに機能しうる形で連結された発現可能な目的のヌクレオ チド配列（NOI）を少なくとも１つ含んでなる改変された内皮細胞も提供する。 【０２６１】 本発明のこれらの広い態様によって、好ましくは本発明のHREは、そのような 応答エレメントの非常に好ましい構成成分である。 【０２６２】 好ましくは、分化細胞は、MHSC由来である。この態様は、例えば、MHSCから分
化したマクロファージ中で又はそれによって又はそれ由来の選択発現を提供する
手段を提供するので有利である。 【０２６３】 さらに広い態様では、本発明は、改変された細胞を提供し、そしてその細胞は
、分化又は未分化細胞であり、未分化細胞は分化細胞に分化することができ、そ
の改変された細胞は、その細胞中で活性のある（好ましくはその細胞型でのみ活
性のある）エレメント；及び（上記で規定した）NOIを含み；改変された細胞は 、ウイルス形質導入によって、好ましくはアデノウイルス形質導入及び／又はレ
ンチウイルス形質導入によって、細胞を形質転換することによって調製される。
ここで、そのエレメントは好ましくは本発明のILREである。 【０２６４】 さらに広い態様では、本発明は、in vivo遺伝子送達のためのハイブリッドウ イルスベクター系を提供し、該システムは二次ウイルスベクターをコードする一
次ウイルスベクターを1以上含み、一次ウイルスベクターは第１の標的細胞に感 染して、そこで二次ウイルスベクターを発現でき、二次ウイルスベクターは第２
の標的細胞を形質導入することができる。 【０２６５】 好ましくは、一次ウイルスベクターがアデノウイルスベクターから得られるか
またはそれに基づくものであり、及び／または二次ウイルスベクターがレトロウ
イルスベクター好ましくはレンチウイルスベクターから得られるか又はそれに基
づくものである。 【０２６６】 本発明を、実施例によってさらに記載するが、それらは、当業者が本発明を実
施するのを助けるために役立つことを意味するものであり、本発明の範囲にいか
なる限定をも付することを意図するものではない。 【０２６７】 （実施例） 〔実施例１〕 虚血応答プロモーターの構築 本発明で使用できる虚血応答エレメント（ILRE）は、虚血状態に応答する任意
の遺伝子から得ることができる。低酸素状態は、虚血状態と関連のある症状の１
つであり、低酸素状態応答プロモーターは、特に有用である。好適な配列の幾つ
かの例を図1に示す。好適な配列は、コード配列の上流（5'）のDNA中にしばしば
見出されるだろうが、それらは必ずしもその位置に存在するわけではない。イン
トロン内の配列及びコード配列の下流はまた、低酸素状態に対する応答を仲介す
ることもできる。例えば、Epo遺伝子の5'非翻訳領域中の配列が、低酸素状態に 対する転写応答を仲介することは周知であり、VEGF遺伝子の3'領域中の配列は低
酸素状態に対する翻訳応答を仲介する（Bunn及びPoyton, 1996, Physiol Rev 76
, 839）。 【０２６８】 ILREは、レトロウイルスベクターのLTR中に存在するプロモーターエレメント と、又は構成的及び組織特異的プロモーターとの他の組み合わせで結合できる。
特に、PGK HREとSV40プロモーター由来のエレメントとの組み合わせは、下記に 記載するように有用である。 OBHRE1：マウスPGK HREに基づくプロモーター 【０２６９】 合成オリゴヌクレオチドを、低酸素状態応答エレメント（HRE）（response el
ement sequences）を含むように合成し、BglII/BamH1断片としてpGL3プロモータ
ープラスミド（プロメガ（Promega）受託番号第U47298号）のBamH1部位にクロー
ニングした。PGK配列をXbal/Nhelとして合成し、このベクターのNhe 1部位にク ローニングした。pGL3は、ルシフェラーゼコード配列の上流の最小SV40プロモー
ターを有するエンハンサーレス（enhancerless）発現プラスミドである。この部
位でのHREの挿入により、それは最小SV40プロモーターの上流に配置される。ル シフェラーゼアッセイを行って、正常酸素状態及び低酸素状態（0.1％酸素）で のこのエレメントの機能を比較し、そしてプロモーター強度をSV40及びCMVのそ れらとを関連付けた。SV40プロモーターに連結された天然方向（natural orient
ation）のネズミPGKの-307/-290配列を含む三量体を示す。 OBHREとして規定されるプロモーター配列は、図2に記載されているプラスミド
OB37中に存在する。 【０２７０】 OBHRE1は、新規なプロモーターである。 HREはまた、例えば下記にMLVLTRとして示されるレトロウイルスLTR中のプロモ
ーターエレメントとの組み合わせでも機能する。 MLVレトロウイルスプロモーターのコンテキスト（context）中のPGK誘導エンハ ンサー配列 【０２７１】 MLVレトロウイルスプロモーターのコンテキスト中のPGK三量体、順（天然）方
向。これは、SV40の代わりにモロニーMLVレトロウイルスプロモーターの上流に 配置された配列を有するOB HREと同一である。転写開始までの配列を示す。 MLVレトロウイルスプロモーターのコンテキスト中のPGK三量体、逆方向。転写
開始までの配列を示す。 HREは、プロモーターエレメントに関していずれの方向でも機能できる。 MLVプロモーターとの組み合わせでのOBHRE 【０２７２】 一連のベクターを構築し、トランジェント（transient）アッセイにおいてMoM
LVに連結されたHREの活性を分析した。HRE及びMoMLVプロモーターをNhe1-Sma1断
片としてpLNheHREから除去し、pGL3塩基性（basic）（プロメガ）のMCS中に挿入
して、pGLHRE及びpGLMUTを製造した。pGL3プロモーター及びpGL3コントロール（
プロメガ）を、それぞれ陰性及び陽性コントロールとして使用した。 Sac1を有するpHRE及びpMUTを消化し、得られたレトロウイルスゲノムを同じ酵
素で切断された線状化pLNheHREと連結することによって、ベクターp5'HRE3'MUT 、p5'MUT3'HRE、p5'MUT3'MUT及びp5'HRE3'HREを構築した。 【０２７３】 示したデータ（図3）は、5'及び3'HREの両者が、転写調節中に含まれ、さらに
両者の間に真の相加作用（true synergy）があることを明瞭に示している。これ
らのデータは、低酸素状態調節ベクターの最適配置が、5'及び3'LTR中にHREの複
製が存在する場合であることを示す。これは、本発明者らを、調節された単一転
写ユニットのレンチウイルスベクターのデザインに導く（下記を参照されたい）
。 これらのデータが、類似の共同作用が考えられる場合に、他の非HREエンハン サー系に外挿され得ることに注意することが重要である。 さらなる例として、図4aに示すように、他のプロモーターも、本発明で使用す
るために構築した。 【０２７４】 これらのプロモーターの相対的強度を図4bに示す。これら全ての配列が、最小
SV40プロモーター低酸素状態誘導発現を与える。しかしながら、明らかなことは
、異なる誘導割合及び低酸素状態下での発現規模である。 これらのプロモーターの配置のいずれも、本発明において使用でき、治療遺伝
子によってその選択が必要となる。例えば、TNF-αなどの、非常に毒性の高いサ
イトカインは、基底濃度が正常酸素状態では検出不能であり、不適当な発現が無
いことを保証できないので、簡単なエノラーゼプロモーターを使用することで利
益を得るだろう。高い濃度で必要なヒトチトクロームP450などの毒性のほとんど
ないタンパク質は、発現の最高濃度が非常に高いが、基底濃度が検出できる場合
にOBHRE1を使用することで利益を得るだろう。 【０２７５】 上記のこれらのプロモーター全部が、古典的HRE結合転写因子HIF 1のためのDN
A配列モチーフを含んでいる。これは、HIF 1a及びHIF 1bからなる異種二量体で あり、（この遺伝子ファミリー；ピリオド（Period）、ARNT、及びSIMの設立(fo
unding)メンバー由来の）塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（bHLH）/PAS ドメインタンパク質ファミリーのメンバーである。HIF 1aは、肝癌細胞中のエリ
スロポエチン（erythropopietin）遺伝子のHREに結合するタンパク質として最初
に同定された（Wangら 1995, J Biol Chem 270,1230）が、以来、殆どの細胞型 中での低酸素状態によって調節される遺伝子の拡張的な（expanding）ファミリ ーの調節に関係している。発現されたcDNA配列のデータベース検索は、HIF 1又 はEPAS-1（endothelial PAS domain protein）と呼ばれるもの、又はHRE（HIF関
連因子）に密接に関連する、さらなるbHLH/PASファミリーメンバーが同定された
（Emaら 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94,4273；Flammeら 1997, Mech Dev 63
, 51；Tianら 1997, Genes Dev 11,72）。HIF 1とは違って、EPAS-1は、内皮細 胞中で優先的に発現され、その発現は、進行の間明らかに調節されているようで
ある。２つのタンパク質のDNA結合ドメインの保存から予想されるように、EPAS-
1は、HIF-1として（HREとして規定された）同じ共通配列に結合するようである 。しかしながら、公表されたデータは、EPAS発現が内皮細胞に限定されているこ
とを示していた。本発明者らは今、驚くべきことに、マクロファージ中で正常酸
素状態下でさえHIF-1タンパク質を検出することができず（図5）、また、OBHRE プロモーター（PKG）が、低酸素条件下に置かれたときに、これらの細胞中で活 性化される（図6）ことを示す。本発明者らは、HIF-1及びEPASに特異的な抗体を
使用して２つの条件下でマクロファージを分析した。本発明者らは、マクロファ
ージ中でHIF-1を検出できなかったが、EPASは検出できた。これは、EPASが上皮 細胞の外で見出されたのは初めてである。このように、マクロファージ中でのOB
HRE 1の誘導が、EPAS-1によって、主に又は完全に仲介され、それ自体（as suc
h）がEPAS応答エンハンサーの役割をする。 【０２７６】 これらの観察から、虚血条件下で転写応答を仲介する公知又は未だ発見されて
いない多くの因子が存在するかも知れないことがわかる。関連する因子に関係な
くそのような条件に操作上（operationally）応答するDNAのいずれの破片（piec
e）も、本発明に有用である。 【０２７７】 低酸性度（low acidity）又は低グルコース濃度などの、虚血状態の結果であ る他の条件はまた、遺伝子を特異的に活性化するのにも使用できる。例えば、ヒ
トgrp78遺伝子由来のプロモーターは、ヒトゲノムDNAからのPCR増幅によって単 離でき、完全なプロモーター−エンハンサー配列及びgrp78遺伝子の5'UTRを含む
。このことは、Chuckら 1992, Nucleic Acids Res 20, 6481に記載されている。
その文献に記載された579塩基対のクローン化断片は、塩基6-585に対応する。増
幅反応に使用されるプライマーは、5'末端でAsel部位及び3'末端でXhol部位を組
み入れる。次いで、grp78プロモーター断片は、クロンテック社製（Clontech）p
EGFP-N1ベクター中に存在するこれらの部位にクローニングされ、このプロモー ター由来のβ−gal/GFP融合タンパク質を発現させる。 【０２７８】 〔実施例２〕 組織限定虚血応答プロモーターの構築 別の遺伝子発現配置は、その発現を、顆粒球−単球系統（lineage）に分化し た細胞に限定する。単球／マクロファージ系統に特異的か、又はそれの中で上方
制御されるプロモーターを使用することにより、治療遺伝子発現はこれらの細胞
型に限定されるだろう。この目的に好適なプロモーターとしては、PU1、又はCEB
P−β（NF IK 6）（Clarke及びGordon, 1998, J Leukoc Biol 63, 153を参照さ れたい）などのマクロファージに分化する上方制御される転写因子などの骨髄特
異的転写因子に結合する共通配列を有するものが挙げられる。 これらのプロモーターエレメントは、標準手順によって単離又は合成できる。
例示のために、細胞性遺伝子由来の２つのマクロファージ特異的プロモーターの
単離及びウイルス遺伝子を記載する。HREエレメントは、これらのプロモーター のいずれとでも結合できる。このことを、XiaMacと呼ばれる合成プロモーターを
製造するためのHIV誘導プロモーターによる例で示す。 細胞性プロモーター pGL3塩基性ベクター（プロメガ）中にクローニングするため及びルシフェラー
ゼリポーターアッセイでの配列分析のために、HindIII/Ncol部位に隣接するM CS
F受容体プロモーター（Zhangら 1994, Mol Cell Biol 14, 8085）中に存在する 組織特異的制御エレメントに基づく２つの部分でオリゴヌクレオチドを合成した
。転写因子結合部位を下記に示す。HIVプロモーター HIVの転写制御配列はLTR中に存在し、これは一般に、ATATAAボックスの上流の
２つのNFkB部位及び３つのSP1部位からなる（Koongら 1994, Cancer Res 54, 14
25）。 エントレズ（Entrez）データベースヌクレオチド検索を、HIV LTR配列に対し て行い、これらを、上記で概説したモチーフの完全な状態に対して分析した。寄
託番号（Submission）第U63538号（Zacharovaら 1997, AIDS Res Hum Retroviru
ses 13, 719）は、２つのNFkB部位及び３つのSP1部位の十分に保存されたモチー
フを示す単離物を記載している。しかしながら、本発明者らは、この特定の単離
物も、NF-IL6（C/EBPβ）の結合のための共通配列を有することを観察した。上 記で検討したように、この転写因子がマクロファージ中で活性であることは公知
である。 【０２７９】 オリゴヌクレオチドを、２つの部分で合成し、受託番号（Accession No）第U6
3538号の279-447位由来の配列を生産した。これらは、クローニングを促進する ためのNhel/Smal末端によって合成した。アニーリングされ、連結されたオリゴ ヌクレオチドを、OB37中へクローニングした。 最終構築を図7に示す。 本発明者らは、従って、組織特異性（マクロファージ）を有する「古典的」HR
E仲介応答と結合した新規な合成プロモーター（XiaMac）を構築した。図8に示す
ように、XiaMacプロモーターを乳癌細胞などの非マクロファージ細胞中で試験し
た場合、活性は全く無かった。しかしながら、その細胞が低酸素状態に置かれる
と、活性化が観察された。これに対し、プロモーターは、マクロファージ細胞系
列中で活性であり、その活性は低酸素状態によって高められた。低酸素状態に対
するXiaMacプロモーターの応答は、HREが不活性化されると、停止した（図9）。 【０２８０】 〔実施例３〕 抑制によって制限されるマクロファージ特異的プロモーターの
構築 別のプロモーター配置は、規定された条件下でマクロファージに対する発現を
さらに制限するために配列が付加される場合である。 このアプローチの例は、IRF系であろう（Taniguchiら 1995, J Cancer Res Cl
in Oncol 121, 516；Kuhlら 1987, Cell 50, 1057）。この場合、インターフェ ロン応答エレメント（IRE）は、転写因子IRF1及びIRF2に結合できる。IRF2は、 マクロファージ中で構成的にこれに結合し、転写活性化能を欠失している。次い
で、インターフェロンは、IRF2との結合と競合できるIRF1発現を活性化する。転
写を活性化するIRF1の能力は、それによってIRF2抑制を逆転させる。IRF1も、IR
F2遺伝子発現を誘導し、それによって「自己停止（auto shut off）」による転 写の活性化を制限する。IREの四量体の包含は、IRF1活性化の不存在下でのSV40 プロモーター機能をブロックできる。ATATAA（すなわち、SV40プロモーター中の
TATAボックス様エレメント）に対するHRE5'の下流のこの四量体配列の包含は、 インターフェロンによる活性化の不存在下で抑制を与える。 【０２８１】 インターフェロンγは、腫瘍に対する応答を含む炎症応答中に通常存在する。
あるいは、インターフェロンγは、タンパク質として、又は遺伝子として外因性
的に提供することができ、遺伝子治療薬（gene therapy）として送達できる。本
発明の特定の態様では、自己分泌調節回路は、インターフェロンγを提供できる
。この場合、OBHREなどの簡単なHREプロモーターが、インターフェロンγコード
配列に連結されている。第２の遺伝子（例えば、プロドラッグ活性化酵素又は上
記リストからのいずれか）は、IRF-1応答配列を含むXiaMacプロモーターに連結 されている。このプロモーターは、マクロファージを含む全ての細胞中で不活性
である。そして病理学的症状で低酸素状態に暴露されたときに、インターフェロ
ンγが発現する。次いで、治療遺伝子の発現は、マクロファージ特異的因子及び
低酸素状態応答因子によって活性化される。この2段階戦略（two phase strateg
y）は、任意のリプレッサータンパク質に適用できる。この戦略の概観を図10に 示す。 【０２８２】 IREは、下記のようにXiaMacプロモーター中にクローニングされる： BanII付着末端を有する下記のIRE部位の四量体からなるオリゴヌクレオチドを
デザインする。 C(AAGTGA)4GAGCC XiaMacプロモーター内に、最後のSPI部位の3'であり、TATAAの15塩基対上流の
BanII部位が存在する。この部位でのIREエレメントの挿入は、インターフェロン
及び低酸素状態の存在下でのみ活性になる抑制プロモーター（XiaMac-IRE）を製
造する。これを図11に示す。 【０２８３】 〔実施例４〕 内皮特異的プロモーターの構築 本発明は、HSC由来のマクロファージ系統の産生に限定されない。例えば、内 皮特異的プロモーターを包含することにより、治療遺伝子の発現は脈管内皮に限
定される。特に、プロモーターを正しく選択すれば、発現を、腫瘍に特異的な新
生血管系（neo-vasculature）に限定することができる。例えば、Jaggarら（199
7, Hum Gene Ther 8, 2239）は、内皮細胞特異的にレトロウイルスベクター由来
の治療遺伝子を発現させるe-セレクチン及びKDRプロモーターの使用を報告して いる。本発明者らは、今、これらのプロモーターをレトロウイルス／レンチウイ
ルスベクター中に構成することができ、さらにそれらを低酸素状態によって追加
的に調節できることを示す。構成を図12に示す。これらのILRE調節内皮特異的プ
ロモーターは、抗脈管形成因子の腫瘍血管系への送達に特に有用である。レンチ
ウイルスベクターの構築は、実施例６でより詳細に概説する。 HSC由来の特定の系統に発現を限定する任意のプロモーターは、虚血様応答エ レメントとの組み合わせで使用できることである。 【０２８４】 〔実施例５〕 ILRE調節レトロウイルスベクターの構築 RRVは、FLYRD18（Cossetら 1995, J Virol 69, 7430）などのパッケージング 細胞系列系を用いて構築される。パッケージされるベクターゲノムを含むプラス
ミドベクターを、記載されているようなパッケージング細胞系列（Cossetら 199
5, J Virol 69, 7430）に感染させ、プロデューサー細胞系列を誘導する。ベク ターゲノムを含む好適なプラスミドは、pHIT111（Soneokaら 1995, Nucl Acids
Res 23, 628）である。必要なNOIを標準分子生物学技術を用いてpHIT111中のLac
Z遺伝子の代わりに挿入する。NOIの調節された発現を確実にするために、HRE又 はgrp78遺伝子由来のプロモーター−エンハンサーなどの制御エレメントを同様 に、レトロウイルスエンハンサーの代わりにpHIT111中のレトロウイルスLTRに導
入できる。次いで、このプラスミドは、FLYRD18細胞に適切な選択マーカーNOI（
例えば、pSU2neo）によってコトランスフェクションし、トランスフェクション された細胞を、1 mg/ml G418（Sigma社製）で選択する。 【０２８５】 好適なHRE含有エンハンサー（図13）は、PGK遺伝子由来のHREの３つのコピー からなる（Firthら 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91, 6496）。図13はまた、 低酸素状態によって調節されないコントロールとして使用される突然変異HRE含 有配列の配列を示す。図13に示される合成オリゴヌクレオチドを、pHIT111の3'L
TR中のNhelとXbalの間に挿入し、標的細胞中での遺伝子発現が低酸素状態制御下
にあるレトロウイルスベクターを生産する。同じ方法で構築された別のレトロウ
イルスベクターは、図14中に示すpKAHREである。 【０２８６】 上記で概説した原理に従って構築されたもう１つの配置は、Xia-Gen-P450-G中
に見出される（図15a）。このベクターは、抗癌化合物シクロホスファミドを活 性化するヒトチトクロームP450のための治療遺伝子を含む。CYP2B6遺伝子を、ヒ
ト肝細胞誘導mRTAからのPCR増幅によって得た。正しい遺伝子配列を、確立され ている配列（Yamanoら 1989 ジーンバンク(GenBank)受託番号第M29874号）との 比較によって確認した。上記列挙された任意の他の治療遺伝子を使用することが
できるだろう。RVVはまた、緑色蛍光タンパク質であるリポーター遺伝子及びネ オマイシン耐性遺伝子である選択遺伝子を含む。このベクターの低酸素状態仲介
誘導を、ヒト腫瘍細胞での例として示す（図15b）。 【０２８７】 〔実施例６〕 低酸素状態調節レンチウイルスベクターの構築 現在、幹細胞単離及び操作における当業界の技術水準は、恐らく分裂している
（dividing）細胞の作製を報告している。全ての系統に発達する可能性（全能性
（toti-potent））を有する真の幹細胞は分裂していないということは、一般に 受け入れられている。従って、レトロウイルスベクターは、多分化性（pluropot
ent）CD34+ve細胞の集団由来のこれらの細胞を見落とすだろう。レンチウイルス
ベクターは、非分裂細胞及び低速分裂細胞に遺伝子を運ぶことができるので、従
来のMLV系レトロウイルスベクターに顕著な利点を与える。 【０２８８】 低酸素状態応答プロモーターを、レンチウイルスベクター、pEGASUS（図16a）
及びその関連ベクターpONY2.1（図16b）中に構成した。両者は、感染性プロウイ
ルスEIAVクローンpSPEIAV19（Payneら 1998, J Virol 72, 483）から誘導される
。構築戦略を、一連の図16に示す。pONY2.1中のCMVプロモーターをXbal/Asc 1断
片として切り出し、Mlu1/Xba 1部位を含むオリゴヌクレオチドで置換した。これ
は、その結果、pONY HRE luc/lac（図16c）を創り出すOB37（図2）から単離され
たMlu/Xba断片の挿入を可能にする。ルシフェラーゼコード配列をNco 1断片とし
て除去し、バックボーン（backbone）を再連結してpONY HRE lacを創り出した。
同様に、lacZをXba 1/Sallとして除去し、次いでバックボーンを再連結してpONY
HRE lucを創り出した。アドバンスト（advanced）EIAVベクタープラスミドpEGA
SUS中で、CMVプロモーターlacZカセットを、EcoRIで切り出し、SacII及びBsu36 部位を含む合成オリゴヌクレオチドで置換した。これは、それぞれSac1/Bsu36及
びSac1/EcoRI断片としてpONY 2.1由来のHRE luc/hre lacカセットのクローニン グを可能にする。最終的なベクターは、指定されたpEG-HRE-lacZ（図16dに示す ）、pEG-HRE-lucである。同じアプローチを使用して、pEGHREベクターを構築し 、lacZ又はLuc遺伝子の代わりに治療遺伝子を発現させる。 【０２８９】 上記にリストした治療遺伝子のいずれもが好適である。例としてpEGHRE-TSP1 を示す。これは、抗血管新生因子トロンボスポンジン−1を発現させる。これを 、２つの典型的な配置で図17に示す。A)は、EIAV LTRが殆ど不活性な細胞中での
使用のためのサイレントLTRである。B)は、U3配列が除去された典型的なSIN（自
己不活性化（self-inactivating））ベクターである。 pEGHREゲノムを有するウイルス顆粒を、一過性の３つのプラスミド系中で製造
する（Soneokaら 1995, Nucl Acids Res 23, 628）。ウイルスは、平行プレート
上のD17細胞に関して力価測定され、そのプレートを、正常酸素状態（21％酸素 ）又は低酸素状態（0.1％）で一晩インキュベートする。細胞は、X gal組織化学
法によって染色され、終点力価を計算する（図18を参照されたい）。力価は、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の尺度であり、正常酸素及び低酸素条件下の細胞
集団の間の遺伝子発現の変化を反映する。 【０２９０】 実験で示された（CMV lacZ転写ユニットを有する）親「pEGASUS」ベクターか ら得られた力価は、低酸素状態下で顕著に変化しないが、調節ベクター、pEG-HR
E-lacZの力価は、少なくとも100倍まで誘導される。これらのデータは、レンチ ウイルスベクターのコンテキスト中での非常に効率的な調節が得られることを初
めて示すものである。 低酸素状態調節を、ルシフェラーゼリポーター遺伝子によっても評価した。こ
のデータは、集団内の細胞のプロモーター活性における変化を反映している。上
記で概説したようにベクター顆粒を製造し、D17細胞に形質導入するために使用 した。形質導入された細胞集団を分け、正常酸素状態及び低酸素状態で一晩イン
キュベートした。細胞を、ルシフェラーゼアッセイ及びルミノメトリー（lumino
metry）のために加工した。pEG-HRE-lucによって形質導入された細胞のルシフェ
ラーゼ活性は、低酸素条件下で12倍に増加する（図19）。 【０２９１】 本発明で使用する別のEIAVベクターは、治療遺伝子及びマーカー遺伝子が単一
転写ユニットから発現される場合である。単一転写ユニットベクターは、ベクタ
ー製造が有利であるため、一般にSINベクター及び内部転写ユニットを含むベク ターよりも好ましい。これらの利点は、形質導入よりもむしろ形質移入によって
プロデューサー細胞中に導入されなければならず、これはしばしば得られる高効
率のプロデューサークローンの数を減らすことである。内部転写ユニットを含む
ベクターが、一般に単一転写ユニットベクターよりも低い収率を与えることも観
察される。さらに、本発明者らが上記したように、単一転写ユニットベクター中
で達成できるHREの複製は、調節を最適化する（optimises）。低酸素状態ベクタ
ーによって調節される単一転写ユニットレンチウイルスベクターを、下記に記載
する： この場合、lacZをXho 1-Sph1断片として単離し、pSP72中にクローニングしてp
SPLacZを作った。IRESを、pIRES-1hyg（Clontech社製）からPCRによって生産し て、続くクローニングを可能にするため、隣接制限部位を組み入れた； ST1（リード） ATCGCTCGAGCTGCAGGGCCGCACTAGAGGAATTCGC ST2（補体） GGTTGTGGCCCATGGTATCATCGTGTTTTTCAAAGG 【０２９２】 これは、Xho1 IRES Nco1カセットをもたらす。次いで、このカセットを、lacZ
の上流のpSPlacZ中にクローニングして、Nco1部位をlacZのATG開始剤と一致させ
る（pSPIRESlacZ）。IRES lacZカセットをPst1/Bst1107断片として単離し、（ss
e8387/Bst1107断片として切り出された）pE1PEGASUS+のCMV lacZカセットを置換
するために使用した。このプラスミドをpEG4+IRES Zと呼ぶ。 【０２９３】 3'LTR中のEIAV U3エンハンサー領域の部分をHREで置換するために、オーバー ラップPCRアプローチを使用した。類似のベクターは、このU3領域を任意のレト ロウイルス又はレンチウイルス又は上記のような他のハイブリッドプロモーター
から大部分誘導される場合に構築できる。その制限は、親ベクターの末端ヌクレ
オチドがレンチウイルスインテグラーゼとの適合性を保証するために保持される
こと、及びその２つのR領域が相同であり、効率的な逆転写を可能にすることだ けである。そのようなハイブリッドLTRの典型的な配置は、PCT/GB96/01230及びP
CT/GB97/02858に詳細に記載されている。このベクターの最終的な配置を、図20 に示す。 【０２９４】 pEGHREゲノムを有するウイルス粒子を、Soneokaら, 1995, Nucl Acids Res 23
, 628によって述べられている一過性３プラスミド系で産生させるか、また別に 、そのベクターをパッケージング細胞系に導入して安定なプロデューサー細胞を
作ることができる。VSV-Gエンベロープを発現するのに適したパッケージング細 胞系については既に報告されている[Yeeら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:9564-9568); Oryら(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11400-11406); Y
angら(1995, Human Gene Therapy 6:1203-1213); Chenら(1996, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 93:10057-10062); Lefkowitzら(1990, Virology 178:373-383); A
raiら(1998 J. Virol. 72:1115-1121)]。 【０２９５】 ウイルスの力価はイヌの細胞系であるD17細胞などの適切なインディケーター 細胞で並行プレートにて測定されるが、それらのプレートを正常酸素下(21%酸素
)もしくは低酸素下(0.1%酸素)で一晩インキュベートする。細胞をX galで組織化
学的に染色し、終点の力価を計算する(図18参照)。力価はβ-ガラクトシダーゼ 発現の尺度であり、正常酸素下および低酸素下条件での細胞集団間の遺伝子発現
の変化を反映している。 【０２９６】 この実験では、親のpEGASUSベクター(CMV lacZ 転写単位を有する)で得られた
力価は低酸素下で顕著な変化はみられないが、調節ベクターであるpEG-HRE-lacZ
の力価は少なくとも100倍誘導される。これらのデータはレンチウイルスベクタ ーの状況下で高度に効率的な調節を得ることができることをはじめて示したもの
である。 【０２９７】 低酸素下での調節はルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いても評価した。こ
のデータは集団の中の細胞のプロモーター活性の変化を反映している。ベクター
粒子は上記に略述したとおり産生させ、D17細胞に形質導入するために用いた。 形質導入された細胞集団を分け、正常酸素下および低酸素下で一晩インキュベー
トした。細胞をルシフェラーゼアッセイおよび発光測定のために処理した。pEG-
HRE-lucで形質導入された細胞のルシフェラーゼ活性は低酸素条件下では約12倍 増加する(図19)。 【０２９８】自己調節性低酸素応答性レンチウイルスベクターの構築 HIF-1αの過剰な発現によって多数の低酸素調節性プロモーターからの発現が 増大することは既に示されている(Semenzaら, JBC 1996)。このタンパク質は正 常細胞では不安定であることが知られているが過剰な発現によって迂回すること
ができる。従って、そのような過剰な発現は低酸素に対する応答性の特異性を弱
めてしまう。OBHREプロモーターがE-PASに応答するという発見は、低酸素に対す
る応答を増幅する新たなやり方に道を開くものである。HIF-1の構成的な発現と いう問題を避けるために、E-PAS遺伝子を、それ自体が低酸素に応答するもので あるレンチウイルスベクター中に入れた。このようにしてベクターを低酸素下に
おくことによって活性化してE-PAS遺伝子を発現させ、そのE-PASタンパク質がさ
らにHREに働き、その発現を増大させる。ひとたび酸素のレベルが正常な状態に 戻れば、HIF-1は不安定であることが知られており、このベクター系は低酸素に 対する長期応答を提供しうるという利点を有する。そのベクターの最初のプライ
ミングは、HREがHIF-1もしくはE-PASと相互作用することにより特異的である。 最初の低酸素での刺激が終わった後もE-PASの産生は発現を維持する。最終的に 、その応答はE-PASタンパク質の半減期に従って衰弱するだろう。 【０２９９】 TSP-1を発現する自己調節性ベクターを図20bに示す。E-PASをコードする配列 は、既知のcDNA配列に従うプライマーを用いてPCRで増幅することにより得られ る(アクセス番号U81984; Trianら, 1997, Gene Dev. 11,72)。 【０３００】 〔実施例７〕 治療用遺伝子の発現のための低酸素応答性アデノウイルスベク
ターの構築 幹細胞が標的組織に移動する場合には、分裂は何らかのステージで起こるであ
ろうが、分裂と分化が行われなくとも治療用遺伝子を送達することができる。こ
のような場合にはアデノウイルスなどのベクターを用いることができる。そのよ
うなベクターはそれ自身の遺伝子を細胞のゲノムに組み込むことをしないので、
細胞が分裂するにつれてベクターは細胞の集団から徐々に失われていく。しかし
各種の系統に分化した後も細胞にはかなりのベクターが依然として存在している
。CD34+の幹細胞は各種の方法で組換えアデノウイルスベクターを用いて形質導 入される(Neeringら, 1996, Blood 88:1147; Watanabeら, 1996, Blood 87:5032
; Watanabeら, 1998, Leukaemia and Lymphoma 29:439; Bregniら, 1998, Gene
Ther. 5:465; Freyら, 1998, Blood 91:2781)。 【０３０１】 第1世代のアデノウイルスベクター(E1/E3欠失)は、細菌性のβ-ガラクトシダ ーゼリポーター遺伝子が低酸素で調節されるプロモーターの制御下にあるように
構築された。 【０３０２】 第1世代のアデノウイルスベクターは、ウイルスのE1およびE3領域を欠失して おり、外来DNAを、通常はウイルスの左側アームに左の逆方向末端反復配列(ITR)
の近傍へ挿入することができるようになっている。このウイルスのパッケージン
グシグナル(194-358nt)はE1aエンハンサーとオーバーラップし、従って大多数の
E1欠失ベクター中に存在している。この配列はウイルスゲノムの右端に転座され
得る(HearingとShenk 1983, Cell 33:695)。それ故、E1欠失ベクターでは3.2kb が除去され得る(358-3525nt)。 【０３０３】 アデノウイルスは105%の長さのゲノムをパッケージすることができるので、2.
1kbを付加することができる。従って、E1/E3欠失ベクターではクローニング能は
7〜8kb(2.1kb+1.9kb(E3除去)および3.2kb(E1除去))となる。組換えアデノウイル
スは本来は必須のE1初期遺伝子を欠失しているために非E1相補性細胞系中では複
製できない。293細胞系はGrahamら(1977, J. Gen. Virol. 36:59)によって開発 され、Ad5ゲノムの左端から約4kbが含まれており、ITR、パッケージングシグナ ル、E1a、E1b、およびpIXが含まれている。その細胞はE1aおよびE1b遺伝子産物 を安定的に発現するが、pIX配列がE1b内にあったとしても後期タンパク質IXは発
現しない。非相補性細胞中では、E1欠失ウイルスが細胞の形質導入を行い、該ウ
イルスは核へと運ばれるがE1欠失ゲノムからの発現はみられない。 【０３０４】 図21のダイアグラムは、Microbix Biosystems-NBL Gene Sciencesシステムを 用いた組換えアデノウイルスの作製に用いる一般的な戦略を示したものである。 【０３０５】 その一般的な戦略とは、外来DNAのE1シャトルベクター中へのクローニングで あり、それは402-3328bpのE1領域を外来DNAカセットと置換するものである。次 いで、組換えプラスミドをpJM17プラスミドとともに293細胞中に同時トランスフ
ェクションする。pJM17はE3領域の欠失と、原核細胞性pBRXベクター(アンピシリ
ン耐性及び細菌性ori配列を含む)の3.7マップユニットの位置のE1領域への挿入 とを含むものである。従って、この40kbプラスミドはアデノ・ヌクレオキャプシ
ドにパッケージングするには大きすぎるが、細菌内では増えることができる。29
3細胞の細胞内組換えの結果、ampｒおよびori配列の外来DNAのインサートとの置
換が行われる。 【０３０６】 ここに引用した実施例においては2つの導入ベクターを用いた。第1のベクター
はMicrobixから入手したものでpE1sp1Aと呼ばれ、第2のベクターはQuantum Biot
echnologiesから入手したものでpADBNと呼ばれる。pADBNプラスミドは新規の(外
来の)DNAをどちらの方向にも挿入できるという利点がある。これは、ある場合に
は発現に有害な作用を及ぼしうる内在性アデノウイルス遺伝子と異なる空間的位
置関係においてインサートを位置させる。どちらの場合も第2のDNAは、プラスミ
ド(例えばpJM17)として、またはウイルスDNAの一部(例えばいわゆるAd5の右アー
ム)として、アデノウイルスゲノムの欠損形である。相同的組換えによって最終 的な遺伝子導入ベクターが作られる。 【０３０７】 虚血調節性アデノウイルスベクターの構築は下記のとおりである： OB37中のルシフェラーゼ遺伝子(図2)を細菌性β-ガラクトシダーゼをコードす
る遺伝子で、pONY2.1ベクターからのNcoI-XbaI断片交換によって置換した(図16b
)。 【０３０８】 この結果得られたOB HRE LacZカセットをOB37ベクターからKpnI-SalI断片とし
て分離し、Quantum Biotechnologies(商標名)のpADBN導入ベクター中にクローン
化してAdenoOBHRElacZを作った。 【０３０９】 組換えAdenoOBHRElacZ導入ベクターを直線化し(Ase I)、Ad5ウイルスの精製右
アームとともに293細胞中に同時トランスフェクションし、in vivoの相同組換え
を起こさせて所望の組換えアデノウイルスを形成された。この操作は図22に略述
してある。HREを含んでいるアデノウイルスベクターはAdHREの後に挿入された遺
伝子を付けて呼ばれるが、例えばAdHRE-lacZはOBHREプロモーターによって発現 される細菌性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を有している。多種の異なる細胞系がA
dHRE-LacZで形質導入されている。6時間の形質導入の後、ウイルスを除去し、新
鮮な培地で置換し、2枚のプレートに分けて正常酸素もしくは低酸素(0.1%酸素) のどちらかの条件下で一晩インキュベートする。その結果は(図23)、アデノウイ
ルスベクター中のLacZリポーター遺伝子のChiang LiverおよびMCF-7ヒト乳癌細 胞系における低酸素下での誘導能を示している。 【０３１０】 さらに、7〜14日令の一次ヒトマクロファージをAdHRE-LacZで同様に形質導入 した。この結果は、造血系統の細胞におけるHRE調節組換えアデノウイルスを用 いての形質導入能のみならず、その有用性をも示している。 【０３１１】 アデノウイルス導入ベクター中にある挿入されたDNA構築物は、自律的発現カ セットの形をしており、OBHREプロモーター、LacZコード配列、およびSV40ポリ アデニル化シグナルを含んでいる(スプライス部位も必要に応じて含ませること ができる)。AdHRE(Quantum Biotech)の構築に対して述べた系において、我々は 、発現カセットがE1遺伝子の方向へ向けられていれば、高レベルのタンパク質の
発現が得られることを観察した。 【０３１２】 別の低酸素応答配列も前述のとおり用いることができる。 【０３１３】 遺伝子の5'側および3'側の両方にHREを複数コピー存在させて、低酸素条件下 での誘導のレベルをより増大させることができる。 【０３１４】 さらに、発現を特定の組織型もしくは疾病組織に制限するために、HREを組織 特異的プロモーター配列と組み合わせうる。例えば、OBHREは特にマクロファー ジ内での発現を調節/増大させるためにXiaMacプロモーターと組み合わせて用い ることができる。 【０３１５】 AdHREベクターは治療用遺伝子を含めるように作られてきた。 【０３１６】 Microbix Biosystems構築システムを用いるAdHRE-2B6およびAdCMV-2B6組換え アデノウイルスベクターの構築の1例を下記に示してある。プラスミドは図24に 示され、それらは下記のとおりである： 【０３１７】pE1HREPG - HREに駆動される2B6発現カセットを含有するように作製された導入 ベクター Microbixから入手したE1sp1A導入プラスミドを用いて導入ベクターpE1HREPGを
作製する。 【０３１８】 pCPGHRE由来のEMCV IRES GFP XbaI断片をpGL3OBHRE1p450ベクター中の2B6コー
ド配列の3'側のXbaI部位にクローン化する。完全発現カセットをMicrobix導入ベ
クターpΔE1sp1B中へMluI-PshAI断片としてクローン化してpE1HREPG(図25b)を作
製する。 【０３１９】pE1CMVPG - CMVで駆動される2B6発現カセットを含有するように作製された導入 ベクター(図25c) pCI-2B6由来のBglII-NaeI CMV2B6断片をpΔE1sp1BのBamHI-EcoRV部位にクロー
ン化する。pCPGHRE由来のEMCV IRES GFP XbaI断片を、結果として得られたプラ スミド中の2B6コード配列の3'側のXbaI部位にクローン化してpE1CMVPG(図25c)を
作製する。 【０３２０】 注記：ires GFPリポーターの使用により組換えアデノウイルスのプラークの精
製が容易になり、異なる生理学的条件での遺伝子発現を研究するための生存可能
な細胞マーカーが提供される。 【０３２１】 上に略述した治療用遺伝子のいかなるものも低酸素調節性アデノウイルスベク
ター中に挿入することができる。 【０３２２】 〔実施例８〕 レンチウイルス成分を送達するためのアデノウイルスベクター
の構築 本発明の特定の態様においては、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベク
ターを作製するために必要な成分を含有するアデノウイルスベクターはCD34+ve 幹細胞に形質導入するために用いられる。従って、アデノウイルスベクターで形
質導入された幹細胞はレトロウイルス/レンチウイルスベクターを分泌する。CD3
4細胞中のアデノウイルスベクターは、従って既に述べたとおり(PCTGB97/00210)
、in situレトロウイルス工場として働く。アデノウイルスベクターはいくつか の方法で作りうる。最初にレトロウイルス/レンチウイルスベクター成分の1つも
しくはその全ての発現を上述のHRE調節性アデノウイルスベクター中に置くこと ができる。また別に、CMVプロモーターなどの構成的プロモーター、もしくはe- 選択プロモーターなどの細胞系統特異的プロモーター、もしくは上述のマクロフ
ァージ特異的プロモーター、もしくはテトラサイクリン調節系などの調節プロモ
ーター(GostenとBujard 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547-5551)もしくは
その他の調節プロモーター/エンハンサーのもとにベクター成分を置くことがで きる。この後者の場合は、特異性は上述の低酸素条件によって調節されているレ
トロウイルス/レンチウイルスベクターからの治療用遺伝子を発現させることに よって与えられる。レンチウイルスベクターを産生することができるアデノウイ
ルスベクターの産生の例を記載する。 【０３２３】 レンチウイルスベクターを産生させるためには4つのアデノウイルスベクタを 作る必要がある：ゲノム、gagpol、エンベロープ(例えば狂犬病ウイルスのGタン
パク質)、およびRev。レンチウイルス成分は異種プロモーターから発現され、そ
れらは必要に応じて(gagpol、Revおよび狂犬病ウイルスのエンベロープの発現を
高めるために)イントロンおよびポリアデニル化シグナルを含んでいる。これら の4つのウイルスをE1aマイナスの細胞中に形質導入させるとアデノウイルス成分
は発現されないが、異種プロモーターによってレンチウイルス成分は発現される
。EIAVアデノウイルス系の構築例を下記に略述する(出願番号:972135.7)。EIAV は非必須のEIAVコード化タンパク質(S2、Tat、もしくはエンベロープ)のいずれ かを欠く最小系に基づいたものである。EIAVを偽タイピングするために用いられ
たエンベロープは狂犬病ウイルスのエンベロープ(Gタンパク質)である。これがE
IAVをうまく偽タイピングすることが示されている(出願番号：9811152.9)。 【０３２４】導入プラスミド 下記はEIAV成分を含む導入プラスミドの構築について述べている。その導入プ
ラスミドはpE1sp1Aである(図25a)。 【０３２５】 組換え導入プラスミドを293細胞中での相同組換えによって組換えアデノウイ ルスを作るために用いることができる。 【０３２６】 下記のプラスミドを図面を添付してある。 【０３２７】A) pE1RevE これはgagおよびpolの効率的な発現に必要なRevタンパク質を提供 する。 プラスミドpCI-RevをApaLIおよびClaIで切断する。EIAV Revをコードする2.3k
bのバンドをクレノウポリメラーゼで平滑末端とし、pE1sp1AのEcoRV部位へ挿入 してプラスミドpE1RevEを得る(図26)。 【０３２８】B) pE1HORSE3.1-gagpol 構築物 pHORSE3.1をSnaBIおよびNotIで切断した。EIAV gagpolをコードする6.1kbのバ
ンドを、SnaBIおよびNotIで切断したpE1RevE(7.5kbバンドを精製した)中へ挿入 した。これによりプラスミドpE1HORSE3.1を得る(図27)。 【０３２９】C) pE1PEGASUS-ゲノム構築物 pEGASUS4をBglIIおよびNotIで切断した。EIAVベクターゲノムを含む6.8kbのバ
ンドを、BglIIおよびNotIで切断したpE1RevE(6.7kbバンドを精製した)中に挿入 した。これによりプラスミドpE1PEGASUSが得られた(図28)。 【０３３０】D) pCI-Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pE1Rabを作製するために、狂犬病ウイルスのオープンリーディングフレームを
、プラスミドpSA91RbGをNsiIおよびAhdIを用いて切断することによりpCI-Neo ( 図29) 中に挿入した。1.25kbのバンドをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端とし、Sm
aIで切断したpCI-Neo中に挿入した。これによりプラスミドpCI-Rabが得られた( 図30)。 【０３３１】E) pE1Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pCI-RabをSnaBIおよびNotIで切断した。狂犬病ウイルスのエンベロープをコー
ドする1.9kbのバンドを、SnaBIおよびNotIで切断したpE1RevE(7.5kbのバンドを 精製した)中に挿入した。これによりプラスミドpE1Rabが得られた(図31)。 【０３３２】 いかなる治療用遺伝子もしくは遺伝子の組み合わせも上述のようにレンチウイ
ルスベクター中に挿入することができる。 【０３３３】 〔実施例９〕 低酸素状態に応答してプロドラッグ活性化酵素を発現する幹細
胞の作製 任意の細胞型に形質導入するためにレトロウイルスベクターXiaGen-P450-G、 もしくはレンチウイルスベクターpSec-TSp1が用いられる。1例として、我々はヒ
トの造血幹細胞、ヒト末梢血バフィーコート、およびヒト臍帯血を用いる。CD34
+のHSC(ヒト幹細胞)の単離およびこれらの細胞へのレトロウイルス介在遺伝子導
入については既に述べられている(たとえばCharbordら, 1996, Br.J. Haematol.
94:449; Dunbarら, 1996, Hum. Gene. Ther. 7:231; Casselら, 1993, Exp. Ha
ematol. 21:585; Emmonsら, 1997, Blood 89:4040; Jollyら, 1996 WO96/33281;
Kerrら, WO96/09400)。適切な方法の1例は下記のとおりである。 【０３３４】 HSCは、G-CSFおよび/またはシクロホスファミドで動員させた後に末梢血から 採取する(Casselら, 1993, Exp.Haematol. 21:585)。G-CSF(Amgen)は10μg/kg/d
ayを皮下に7日間投与した。HSCのアフェレーシスと濃縮はCellPro Stem Cell Se
parator システムを用いて行った(Casselら, 1993, Exp.Haematol. 21:585)。HS
C濃縮集団を10５細胞/mlでRRVプロデューサー細胞(実施例1)から得た使用済みの
培地中で、4μg/mlの硫酸プロタミン、および20ng/mlのIL-3(Sandoz)、50ng/ml のIL-6(Sandoz)、100ng/mlのSCF(Amgen)の存在下で培養した(Santiago-Schwartz
ら, 1992, J.Leuk.Biol. 52:274; Charcordら, 1996, Br.J.Haematol. 94:449;
Daoら, 1997, Blood 89:446; Piacibelloら, 1997, Blood 89:2644; Casselら,
1993, Exp.Haematol. 21:585)。その他のサイトカインおよび/または既述の方法
(Dunbarら, 1996, Hum.Gene ther. 7:231)で調製された自己由来のストロマ(間 質)細胞を添加することもできる。24時間後に細胞を遠心し、上述の成長因子お よび硫酸プロタミンを含む新鮮なRRV含有培地に再懸濁する。これをさらに24時 間後に繰り返し、さらに48時間まで細胞を培養する。その後細胞をトリプシン処
理し、新鮮な培地で遠心により数回洗い、再輸注のためにPlasma-Lyte A中に再 懸濁する。再輸注の総容量は約25〜50mlである。患者へは最大2時間かけて輸注 した。輸注された細胞数は少なくとも10５個であり、10１２個のオーダーまでと
することができる。 【０３３５】 また、細胞は既報の方法に従って再輸注前にミエロイド分化経路を経由させて
成熟させることができる(Haylockら, 1992, Blood 80:1405)。 【０３３６】 形質導入はレトロウイルスベクターについて述べたとおりであるが、同じ方法
をレンチウイルスベクターについても用いる。 【０３３７】 レトロウイルスもしくはレンチウイルスを用いる遺伝子の導入は、単離したCD
34細胞の培養条件を最適化して、細胞が形質導入時に細胞周期状態にあるように
することによって増強される。このことは核への接近と組み込みを可能とするた
めに細胞が分裂することを必要とするMLVをベースとしたベクターには特に必要 なことである。MLVベクターを異なるエンベロープで偽タイピングすることも遺 伝子導入に大きな影響を与える。文献中に述べられているとおり、GALVはVSVGよ
りもはるかに良い。 【０３３８】 我々は形質導入時に細胞が細胞周期状態にあることを確認するために、規定さ
れた培地を用いている。規定培地を用いることにより、血清もしくは複雑な組成
の培地には存在している可能性のある抗増殖因子の非存在下で増殖因子を確実に
存在させることができる。 【０３３９】 単離後にCD34細胞は形質導入の前に少なくとも24時間は下記の培地(主としてB
eckerら, 1998, Hum. Gene Ther. 9:1561に基づく)に移される：無血清培地X-VI
VO10、1% BSA、2mM L-グルタミン酸、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20ng
/ml IL-3、100U/ml IL-6、50ng/ml SCF、100ng/ml 抗TGFb、100ng/ml、Flt 3-L 。形質導入のプロトコールは文献に略述されているもの(Beckerら, 1998, Hum.
Gene Ther. 9:1561-1570)を用いた。このプロトコールは3日間かけて3サイクル 行い、大多数の細胞がウイルスベクター存在下で有糸分裂を行うように最適化す
ることからなる。その方法は簡潔に述べれば下記のとおりである： 【０３４０】 非組織培養グレードのプレートをフィブロネクチン断片CH-269、10μg/cm２(T
akahara)でコートする。ウイルスを空のウエルに加え、30分間結合させる。PBS で洗う。10５個の細胞を含有する0.5mlの培地を各ウエルに加える。0.5mlの上清
のウイルスを加える。1020 x gで90分遠心する。4時間後、上述と同様に新鮮な 培地に交換する。これを3日間連続で繰り返す。 【０３４１】 末梢血から単離されたもしくは末梢血由来のソースから単離された細胞は高い
比率で赤血球の前駆細胞になりやすいが、臍帯血から得たCD34細胞はより広範囲
の前駆体型を形成する。臍帯血由来の細胞は固有の増殖能がより高い。幹細胞を
単離する前にGM-CSFで"動員"された末梢血から増大した数の幹細胞を誘導するこ
とができる。このやり方は移植患者において広く用いられている。 【０３４２】 次いで暗くしたクラスII安全キャビネット内で、成長因子を含有するメトセル
培地(10%ウシ胎児血清、トランスフェリン、グルタミン、2-メルカプトエタノー
ル、ウシ血清アルブミン、IL-3、IL-6、IL-11、SCF、EPO、G-CSF、GM-CSFを含有
するメトセル)に下記のプロトコールに従ってプレートから細胞を取り出す。針 先の鈍い針を2.5mlのシリンジに取り付けたものを用いて、2.5mlのメトセルを10
mlのU字形試験管に気泡を避けつつ分注する。Iscove培地(Gibco)中の細胞懸濁液
(1mlのメトセルが所望の細胞数である1ウエルあたり500/2000細胞となるように 、各ウエルに必要とされる細胞数の3倍を含有)を、メトセルを入れた試験管中に
0.5ml分注し、穏やかにボルテックス混合する。メトセルと細胞の混液の1mlを、
針先の鈍い針を用いて非組織培養用ペトリ皿(35x10mm)もしくは単一ウエルのカ バーガラスのチャンバーに緩徐に分注する。各サンプルから３回測定できる皿／
ウエルをセットアップすることができる。その皿/チャンバーを、小さなペトリ 皿に滅菌蒸留水を入れて適当な湿度を保ったFalcon 3025皿(150 x 25mm)中に置 く。皿を37℃、5%CO２, 5%O２でインキュベートし、14日後にコロニーを分析す る。 【０３４３】 CD34由来の単球の産生を増大させるために培養条件を段階的にGM 前駆体(Hayl
ockら, 1992, Blood 80:1405)の形成、次いで単球前駆体の形成が最適化される ようにする。このことは一次培養物からアリコートをとってCFUアッセイを用い て調べ、培養条件が単球の産生に適しているかを確認することによって行いうる
。GM 前駆体の産生を最適化するために、比較的高い濃度のGM-CSFを培地中に添 加し、その後段階的にM-CSFを主要な成長因子として添加していくことにより、 ミエロイド系統への分化をはずれることとなる。HSCの形質導入後、それらは分 化してGM前駆体を形成する。 【０３４４】 GFPの蛍光を観察することによってGM前駆体コロニーでのレトロウイルスの発 現を分析する。この分析は正常酸素下および低酸素下で行う。 【０３４５】 また別に、幹細胞集団を上述と同じ方法を用いて単離直後に形質導入すること
ができる。その後細胞は凍結するか、もしくは直ちに患者の体内への導入に用い
られる。このような場合、全能性の幹細胞が保存される。 【０３４６】 〔実施例１０〕 作製されたHSCと卵巣癌異種移植片との相互作用 本発明の1例として、我々は卵巣癌を試験系として用いてHSCの腫瘍への浸潤を
研究することを選んだ。この癌はほとんど腹腔内に限局している。卵巣腫瘍への
HSC浸潤の分析には多数の動物モデルが利用可能である。3種類の卵巣癌異種移植
片OS、HU、およびLAは原発性ヒト腫瘍由来で、腹腔内に確立され、その経路で連
続的継代によって維持されている(Wardら, 1987, Cancer Res. 47:2662)。これ ら3つの細胞系のどれもが長期培養では増殖がよくない。全ての癌は当初は腹水 中でムチンに取り囲まれて自由に浮遊した状態で増殖する。ヒトの疾病状態では
これらの癌は腹水を伴う固形の植え込まれた腫瘍の沈着物として存在するので、
これはヒトの疾病状態を反映するものではない。TNFを腹腔内に投与すると、HU およびLAモデルがこの腹水に浮遊している状態から腹腔および付随する臓器の表
面上に植え込まれた固形腫瘍沈着物の状態に変換される(Malikら, 1989, Int.J.
Cancer 44:918)。これはヒトの疾病の病理を非常によく現したものであり、それ
らの癌細胞が由来したもとの腫瘍の病理により特異的に類似したものである。こ
の固形腫瘍モデルは卵巣癌の治療薬の研究のための、より適切な出発点として用
いられてきた(例えば、インターフェロン-γ, Malikら, 1991, Cancer Res. 51:
6643; Burkeら, 1997, Eur.J.Cancer, 33:1114)。上述のアデノウイルスもしく はレトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターで作製されたヒト幹細胞を、
上述の腫瘍を有するマウスの腹腔内へ10６/0.1mlの濃度で導入する。そのHSCは 治療用遺伝子を発現する。これらの遺伝子の作用はHSC内にとどまらずに拡がり 、すなわち周囲の腫瘍組織が殺滅されるようなバイスタンダー効果(第三者効果)
がある。本発明の特定の実施例においては、ベクターXiaGen-P450が用いられる 。マウスは作製されたHSCで処置され、次いでシクロホスファミド100mg/kgの腹 腔内投与で処置される。作製されたHSCで処置されたマウスの腫瘍はシクロホス ファミドで殺される。 【０３４７】 公表されている幹細胞の形質導入法に従って、同様の方法がAdHREベクターに も用いられ、それは下記のとおりである。HSCを、200ユニット/mlのIL-3、200ユ
ニット/mlのGM-CSF、200ユニット/mlのM-CSFを含有する少量の培地中で24時間、
高い感染多重度(100〜500)で形質導入するためにアデノウイルスベクターが用い
られる。アデノウイルスベクターで形質導入した後、HSCは分化させるかもしく は直接用いる。分化させた細胞を用いる場合には、上記のサイトカインを含有す
る軟寒天中で14日間のインキュベーション後、コロニー形成単位-顆粒球/マクロ
ファージ(CFU-GM)を定量する。CD34+細胞もしくは分化した細胞を動物体内に導 入し、標的組織に移動して治療用遺伝子を発現する。 【０３４８】 〔実施例１１〕 改変されたヒト幹細胞を用いる卵巣癌の治療 卵巣癌患者から末梢血リンパ球を下記のとおり集める。その細胞を上述のXiaG
en-P450レトロウイルスベクターで形質導入する。作製された幹細胞を患者体内 へ腹腔内投与で戻し入れるが、その方法はStevensonら, 1987, Cancer Res.47:6
100によって単球について記載されているものとほぼ同様に行う。基本的には、 等張の食塩液50ml中の10８から10９個の細胞を超音波でモニターしつつカテーテ
ル針で腹腔内に直接導入する。細胞は腹腔内に広く分布し、漿膜表面に付着して
とどまり、他の臓器には移動しない。1〜7日後に患者をシクロホスファミドで治
療し、さらに2週間後に腫瘍を分析する。腫瘍の大きさの減少は、作製された幹 細胞による局所的なシクロホスファミドの活性化の結果である。 【０３４９】 上記に略述した幹細胞形質導入法に従って同様な方法をAdHREベクターに用い た。 【０３５０】 〔実施例１２〕 レンチウイルスベクターによる腫瘍細胞の形質導入 本発明のさらに別の実施例として、我々は神経膠腫への遺伝子導入の研究を選
択した。神経膠腫は高い空胞性と浸潤性によって特徴づけられ、これまでに研究
されたもののうちで最も低酸素性の腫瘍の１つである(J.Folkman, pp3075-3085,
Cancer:Principles and Practice of Oncology, 第5版, DeVita, Hellman, Ros
enburg編, Lippincott-Raven刊 1977)。レンチウイルスベクターはプロドラッグ
活性化酵素および抗血管形成因子の併用療法剤(この実施例ではこの因子はヒト チトクロームP450遺伝子および抗血管形成因子TSP-1である)を送達するように形
成される。発現は低酸素条件で活性化され、そのことによってこの治療法が腫瘍
の局所的環境に対して投与されることが確保される。適切なレンチウイルスベク
ターについては図32に示してある。このモデル系はヒト細胞系U87MGもしくはラ ットRT-2細胞系のいずれかを用いる。どちらの細胞系でも、正常ラットまたはヌ
ードもしくはSCIDマウスにおいて分析可能な典型的な空胞のある腫瘍が得られる
(例えばWeiら, 1994, Human Gene Therapy 5:969)。どちらの場合でも腫瘍細胞 系の脳内移植によってこの腫瘍モデルを作ることができる。レンチウイルスベク
ター調製物は複数の部位で腫瘍の塊中に直接に注射される。ベクターは少なくと
も10４形質導入ユニット/μlの力価で1〜3μlにて送達される。ヒト患者の治療 でも同じ方法が用いられる。ヒトの場合にはPETもしくはMRIスキャニングによっ
て腫瘍の位置を定め、0.1mlアリコートでベクターを注射するかもしくは手術的 腫瘍塊除去の際にその部位をベクターで処置する。患者をシクロホスファミドで
治療し、腫瘍増殖の減少はMRIスキャニングでモニターする。 【０３５１】 〔実施例１３〕 レンチウイルスベクターの産生と発現のデスフェリオキサミ
ンによる誘導 デスフェリオキサミンはSigmaから入手するかもしくは臨床用製剤としてNovar
tis Pharmaceuticalsから承認済の製品であるデスフェラル(Desferal)として入 手する。デスフェラルで達成される誘導のレベルは低酸素によるものと同等もし
くはより大きいものである。 【０３５２】 in vitroで用いるために、低酸素調節性レンチウイルスベクターを含んでいる
プロデューサー細胞をフラスコ内で50μM〜1 mMのデスフェリオキサミンの存在 下で10日間培養する。この期間中に培養液にはベクター粒子が放出され、総収率
は10７/mlを超えたものとなる。スケールアップのために細胞をローラーボトル 中で、デスフェリオキサミンを50〜200μM用いて7日間培養する。従って、この 系はウイルスベクターを誘導するためにHREの存在を利用したものである。この 系はデスフェリオキサミンに応答してゲノムがHREによって調節されることによ るものと述べられている。その他の成分、すなわちgagpolおよびエンベロープも
当然同様に調節することができるということになる。レトロウイルスもしくはレ
ンチウイルスベクターからも成分の産生を調節するために当然この系を用いるこ
とができることになる。 【０３５３】 in vivoでの使用のために、患者を低酸素調節性レンチウイルスベクターもし くは低酸素調節性レンチウイルスベクターを含有する細胞を用いて治療する。次
いで患者はデスフェリオキサミンの標準コースの治療を受ける。これにより低酸
素による影響に加えて治療は活性化され、いくつかの場合では局所的に低酸素と
することの必要性をなくす。例えば細胞がEPOもしくは第IX因子などの血液凝固 因子などの治療用タンパク質を提供するために植え込まれる場合には、その送達
はデスフェラルの投与量を調整することによって調節することができる。 【０３５４】スプリットイントロン技術 下記の教示は我々の継続中のPCT出願から引用したもので、スプリットイント ロン(split-intron)の特徴を有するレトロウイルスベクターを如何に創製するか
についての教示を提供している。これらの教示はILRE調節NOIをスプリットイン トロン形状と組み合わせて細胞に送達することのできる1つ以上のベクターを調 製するために適用することができる。そのPCT特許出願−発明の名称「ベクター 」−をここに添付し、その内容の全てをここに参照により組み入れるものとする
。 【０３５５】概要 広範な態様においては、本発明は改変された細胞を提供し、それはその細胞中
で活性な応答配列を含み；その改変された細胞は1種以上のウイルスベクターに よる形質導入によって細胞もしくは前駆体細胞を形質転換することによって調製
され、そのウイルスベクターの少なくとも1つは応答配列を含む。 【０３５６】 好ましい態様においては、本発明は改変された細胞を提供し、それは該細胞中
で活性な応答配列を含み；その改変された細胞は1種以上のウイルスベクターに よる形質導入によって細胞もしくは前駆体細胞を形質転換することによって調製
され、そのウイルスベクターの少なくとも1つは応答配列を含み、その応答配列 はILREからなる。 【０３５７】 好ましい態様においては、本発明は改変された細胞を提供し、それはその細胞
中で活性な応答配列を含み；その改変された細胞は1種以上のウイルスベクター による形質導入によって細胞もしくは前駆体細胞を形質転換することによって調
製され、そのウイルスベクターの少なくとも1つは応答配列を含み、その応答配 列はHREからなる。 【０３５８】 より好ましい態様においては、本発明は改変された造血幹細胞(MHSC)を提供し
、その造血幹細胞は少なくとも1つの発現可能な対象のヌクレオチド配列(NOI)を
含み、そのNOIは1個以上の応答配列と機能しうる形で連結されており、その応答
配列は虚血様応答配列(ILRE)からなる。 【０３５９】 「実施例」の項に記載されているベクター、構築物、調節配列およびプロモー
ターも(それらの各々は新規なものである)、本発明に包含される。 【０３６０】 上記の明細書に記載されている全ての公表文献はここに参照により含めるもの
とする。ここに記載された本発明の方法およびシステムの各種の改変および変更
は、当業者ならば本発明の範囲および精神から逸脱することなく自明のことであ
ろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において記載されているとはい
え、特許請求の範囲に記載されている本発明はそのような特定の実施形態に過度
に限定されるべきではない、ということは理解されるべきである。実際、本発明
を実施するためのここに記載された方法の各種の改変は分子生物学もしくは関連
分野の当業者には明白であり、それらは下記の特許請求の範囲の記載の範囲内に
あることを意図したものである。 【０３６１】 ベクター 本発明は、ベクターに関するものである。 【０３６２】 特に本発明は、レトロウイルス粒子において遺伝子物質をパッケージングし発
現する新規な系に関するものである。 【０３６３】 本発明は、より具体的には、目的のヌクレオチド配列（以下「NOI」と略称す る）または複数のNOIをも、1または複数の標的部位にデリバリーできるレトロウ
イルス粒子を発現できる新規な系に関するものである。 【０３６４】 加えて本発明は、特に、遺伝子治療において有用な新規なレトロウイルスベク
ターに関するものである。 【０３６５】 遺伝子治療は、1箇所または複数の、例えば標的細胞のような標的部位におけ る1または複数のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補充、操作等の1つまた
は複数を含み得る。標的部位が標的細胞である場合には、この細胞は組織または
器官の一部であり得る。遺伝子治療についての一般的な教示は、Molecular Biol
ogy (Ed Robert Meyers, Pub VCH, 例えば556-558頁)に見られる。 【０３６６】 別の例を挙げると、遺伝子治療は、例えば遺伝子のようなヌクレオチド配列を
欠陥遺伝子の交換や補足に用いることができるようにすること、例えば遺伝子の
ような病原性ヌクレオチド配列またはその発現産物を除去することができるよう
にすること、例えばより多くの好ましい表現型を生成するために遺伝子のような
ヌクレオチド配列またはその発現産物を付加、あるいは導入すること、例えば選
択を行う(即ち形質転換された細胞等を形質転換されていない細胞から選択する)
ために遺伝子のようなヌクレオチド配列またはその発現産物を付加あるいは導入
できるようにすること、分子レベルで細胞を操作して、例えば癌(Schmidt-Wolf 及びSchmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69;273-279)、または免疫疾患
、循環器（心血管）障害、神経疾患や、炎症性疾患または感染症のような他の疾
病等の疾病状態を処置、治療、または予防できるようにすること、及び例えば遺
伝子ワクチン接種のような免疫応答を誘発するために抗原を操作及び／または導
入できるようにすることのいずれか1つまたは複数を達成する手段となり得る。 【０３６７】 近年、レトロウイルスを遺伝子治療に用いることが提案されてきた。レトロウ
イルスは、基本的に溶解性ウイルスと異なる生活環を有するRNAウイルスである 。この点から言えば、レトロウイルスは中間体DNAを介して複製を行う感染性物 質である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは逆転写酵素によっ
てDNA形態に変換される。このDNAコピーは、新たなRNAゲノム、及び感染性ウイ ルス粒子の構築に必要な、ウイルスにコードされたタンパク質を生成するための
鋳型となる。 【０３６８】 多種のレトロウイルスが存在し、その例としては、マウス白血病ウイルス(MLV
)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳癌ウ
イルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、藤浪肉腫ウイルス(FuSV)、モロニー マウス白血病ウイルス(Mo-MLV)、FBRマウス骨肉種ウイルス(FBR MSV)、モロニー
マウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、アベルソンマウス白血病ウイルス(A-MLV)、トリ 骨髄球腫症ウイルス29(MC29)、及びトリ赤芽球症ウイルス(AEV)等が挙げられる 。 【０３６９】 レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら("Retrovirus" 1997 Cold Spring
Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-76
3)に見ることができる。 【０３７０】 いくつかのレトロウイルスのゲノム構造の詳細が知られている。その例として
、HIVについての詳細は、NCBI Genbank(ゲノム受託番号AF033819)から知ること ができる。 【０３７１】 本質的に、全ての野生型レトロウイルスは、必須のビリオンタンパク質をコー
ドする3つの主要なコードドメイン、gag、pol、envを有するが、レトロウイルス
は大きく2つのカテゴリー、即ち「単純型(simple)」と「複雑型(complex)」とに
分けられる。これらのカテゴリは、そのゲノムの構成によって区別できる。単純
型レトロウイルスは、通常基本的な情報のみしか有していない。これに対して複
雑型レトロウイルスは、複数のスプライシングされたメッセージに由来する他の
調節タンパク質もコードしている。 【０３７２】 レトロウイルスはさらに7つの群に分類することができる。そのなかの5群は、
発癌性のレトロウイルスである。他の2群はレンチウイスル及び泡沫状ウイルス である。これらのレトロウイルスの概説は、"Retroviruses" (1997 Cold Spring
Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughe, HE Varmus pp 1-25)に
示されている。 【０３７３】 ヒトT細胞白血病ウイルス−ウシ白血病ウイルス群(HTLV-BLV)を除く全ての発 癌性のメンバーは、単純型レトロウイルスである。HTLV、BLV及びレンチウイル ス及び泡沫状ウイルスは複雑型レトロウイルスである。もっとも良く研究されて
いる発癌性レトロウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、マウス乳癌ウ イルス(MMTV)及びマウス白血病ウイルス(MLV)及びヒトT細胞白血病ウイルス(HTL
V)等が挙げられる。 【０３７４】 レンチウイルス群はさらに、「霊長類レンチウイルス」と「非霊長類レンチウ
イルス」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天
性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びサ ル免疫不全ウイルス(SIV)等が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては 、プロトタイプの「遅発性ウイルス」であるビスナ／マエディウイルス(VMV)や 、類縁のヤギ関節炎−脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、及
び最近の文献に記載されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイル ス(BIV)等が挙げられる。 【０３７５】 レンチウイルス科と他のタイプのレトロウイルスとを区別するのは、レンチウ
イルスが分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力を有している点である(Lew
isら 1992 EMBO. J 11: 3053-3058; Lewis及びEmerman 1994 J. Virol. 68: 510
-516)。これに対してMLVのような他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺及
び肝臓の組織を形成する細胞のような非分裂細胞に感染することができない。 【０３７６】 感染のプロセスにおいて、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付
着する。感受性を有する宿主細胞中に入ると、レトロウイルスRNAゲノムは、親 ウイルスに保持されている、ウイルスがコードする逆転写酵素によりDNAにコピ ーされる。このDNAは宿主細胞の核に送り込まれ、そこで宿主のゲノムに組み込 まれる。この段階のウイルスは通常プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、
細胞分裂の間に宿主の染色体中で安定であり、他の細胞タンパク質と同様に転写
される。プロウイルスは、さらに多くのウイルスを生成するのに必要なタンパク
質及びパッケージング機構をコードしており、作り出されたプロウイルスは、「
発芽」とも呼ばれるプロセスによって細胞から放出され得る。 【０３７７】 前述したように、各レトロウイルスのゲノムは、ビリオンタンパク質及び酵素
をコードする、gag、pol及びenvと称する遺伝子を有する。プロウイルスでは、 これらの遺伝子の両側に、長い末端反復配列(LTR)と呼ばれる領域が隣接してい る。このLTRがプロウイルスの組み込み及び転写をもたらす。LTRは、エンハンサ
ー−プロモーター配列としての役目も果たす。つまり、LTRはウイルス遺伝子の 発現を調節し得る。レトロウイルスRNAのキャプシドによる包入はウイルスのゲ ノムの5'末端にあるpsi配列によって生ずる。 【０３７８】 LTR自体は、U3、R、及びU5と呼ばれる3つのエレメントに分けられる同一の配 列である。U3はRNAの3'末端に独特の配列に由来する。RはRNAの両端において反 復する配列に由来し、U5はRNAの5'末端に独特の配列に由来する。3つのエレメン
トのサイズは、異なるレトロウイルスの間でかなりばらつきがある。 【０３７９】 理解を容易にするために、レトロウイルスゲノムのRNA及びDNA形態の一般的な
構成(その通りのスケールではない)を、以下に簡単に示す。ここでは、LTRの基 本的特徴及びgag、pol及びenvの相対的位置を示す。 【０３８０】 図29に示すように、感染性レトロウイルスRNAゲノムの基本的な分子の構成は、(
5') R - U5 - gag, pol, env - U3-R (3')である。欠陥レトロウイルスベクター
では、ゲノムのgag、pol及びenvを欠いているか、またはそれが機能していない ことがある。RNAの両端のR領域は反復配列である。U5及びU3は、それぞれRNAゲ ノムの5'末端及び3'末端で独特の配列を表す。 【０３８１】 ビリオンRNAの二本鎖DNAへの逆転写は細胞質内で生じ、鋳型分子の5'末端から
3'末端への逆転写酵素の2回のジャンプを伴う。このジャンプの結果、ビリオンR
NAの5'末端及び3'末端に位置する配列の複製が生ずる。次にこれらの配列が、ウ
イルスDNAの両端にタンデムに融合し、R、U5、及びU3領域を含む長い末端反復配
列(LTR)を形成する。逆転写が終了すると、ウイルスDNAは核内に転位し、そこで
前組み込み複合体(PIC)と称するレトロウイルスゲノムの線状のコピーが、ビリ オンインテグラーゼにより染色体DNAにランダムに挿入され、安定したプロウイ ルスを形成する。宿主の細胞ゲノムへの組み込みが可能な部位の数は非常に多く
、非常に広く分布している。 【０３８２】 プロウイルスの転写は、ウイルスのLTRの非コード配列により大部分調節され る。転写開始部位は、(上に示すように)左側LTRにおけるU3とRとの境界にあり、
ポリ(A)付加(終結)部位は、(上に示すように)右側LTRにおけるRとU5との境界に ある。U3はプロウイルスの転写調節エレメントの殆どを含み、転写調節エレメン
トとしては、細胞、場合によってはウイルス転写活性化因子タンパク質に応答す
るプロモーター及び複数のエンハンサー配列が含まれる。いくつかのレトロウイ
ルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードするtat、rev、tax及 びrexのような遺伝子のいずれか1つまたは複数を有する。 【０３８３】 プロウイルスDNAの転写により、完全長ウイルスRNAゲノム、及びRNAプロセシ ングによって作られるゲノム下サイズ(sub-genomic-sized)のRNA分子が再生成さ
れる。一般に、あらゆるRNA産物がウイルスタンパク質生成のための鋳型となる 。RNA産物の発現は、RNA転写物のスプライシングと、翻訳時のリボソームフレー
ムシフトが組み合わさることによって達成される。 【０３８４】 RNAスプライシングは、介在RNA配列、即ち「イントロン」RNA配列が取り除か れ、残りの「エキソン」配列が連結されて翻訳のための連続したリーディングフ
レームが作られるプロセスである。レトロウイルスDNAの最初の転写物はいくつ かの形態で修飾され、細胞mRNAによく似ている。しかし、全てのイントロンが効
率的にスプライシングされる多くの細胞のmRNAとは異なり、新たに合成されたレ
トロウイルスRNAは、2つの集団に分けられなければならない。一方の集団は、ス
プライシングされないでゲノムRNAとしての役目を果たすものであり、他方の集 団はスプライシングされてゲノム下サイズのRNAとなるものである。 【０３８５】 完全長のスプライシングされていないレトロウイルスRNA転写物は、2つの機能
を果たす。即ち、それらの転写物は(1) gag及びpol遺伝子産物をコードするとと
もに、(2) ゲノムRNAとして子孫のビリオン粒子にパッケージングされる。ゲノ ム下サイズのRNA分子は、他のウイルス遺伝子産物のmRNAとなる。スプライシン グされたレトロウイルスの転写物はいずれも5'LTRのU5領域にわたる第1のエキソ
ンを有している。最後のエキソンは、そのサイズは異なっているとしても、3' L
TRがコードするU3及びR領域を常に有している。RNA構造の他の部分の構成は、ス
プライシング事象の数及び選択的スプライシング部位の選択による。 【０３８６】 単純型レトロウイルスでは、新たに合成されたレトロウイルスRNAの一方の集 団はスプライシングされずにゲノムRNA及びgag及びpolのmRNAとなる。他方の集 団はスプライシングされて、ゲノムRNAの5'部分を下流の遺伝子、最も一般的に はenvに融合させる。スプライシングは、gagの上流に位置するスプライス・ドナ
ー部位と、polの3'末端の近傍に位置するスプライス・アクセプター部位とを用 いて行われる。スプライシングで取り除かれる、スプライス・ドナー部位とスプ
ライス・アクセプター部位との間にあるイントロンはgag及びpol遺伝子を含む。
このスプライシングにより、エンベロープ(Env)タンパク質のmRNAが形成される 。一般に、スプライス・ドナー部位はgagの上流にあるが、ASLVのようないくつ かのウイルスでは、数個のコドンをgag遺伝子中に配置させており、Gagと共通の
アミノ末端の数個のアミノ酸残基を含む一次Env翻訳産物を生ずる。このEnvタン
パク質は、膜結合ポリリボソーム上で合成され、細胞の小胞輸送により原形質膜
に輸送され、そこでウイルス粒子に取り込まれる。 【０３８７】 複雑型レトロウイルスは1回スプライシングされた転写物と複数回スプライシ ングされた転写物の両方を生成し、これらの転写物はenv遺伝子産物のみならず 、それらのウイルスに独特な調節タンパク質及びアクセサリータンパク質のセッ
トもコードしている。レンチウイルス、特にHIVのような複雑型レトロウイルス は、レトロウイルスの感染の際に起こり得る選択的スプライシングの複雑さを明
らかに示す例となる。例えば、HIV-1は一次ゲノム転写物から、準最適のスプラ イシングにより30種以上の異なるmRNAを生成することができることが現在知られ
ている。競合するスプライス・アクセプター部位を破壊する変異がスプライシン
グパターンのシフトを生じさせ得、ウイルスの感染力に影響を及ぼし得ることか
ら、この選択プロセスは調節されていると考えられる(Purcell及びMartin 1993
J Virol 67: 6365-6378)。 【０３８８】 完全長RNAとゲノム下サイズのRNAの相対的な比率は、感染細胞により異なり、
これらの転写物のレベルの調節は、レトロウイルス遺伝子の発現における調節ス
テップである可能性がある。レトロウイルス遺伝子の発現のためには、スプライ
シングされたRNAとスプライシングされていないRNAの両方が細胞質に輸送されな
ければならず、効率的なレトロウイルス遺伝子の発現のために、スプライシング
されたRNAとスプライシングされていないRNAの適切な比率が維持されなければな
らない。別の種類のレトロウイルスは、この問題に対して独特の解決法を進化さ
せた。完全長の1回スプライシングされるRNAのみを用いる単純型レトロウイルス
は、可変的に効率的なスプライシング部位を使用するか、あるいは部分的にしか
明らかになっていないいくつかのcis作用エレメントをウイルスのゲノムに導入 することによって、それらの種の細胞質での比率を調節している。1回スプライ シングされるRNAと複数回スプライシングされるRNAの両方の合成を誘導する複雑
型レトロウイルスは、例えばHIV-1のrevやHTLV-1のrexのようなアクセサリー遺 伝子の1つのタンパク質産物とRNA上の配列との相互作用を介して、ゲノム下サイ
ズの種々のゲノムRNA種の輸送とおそらくスプライシングの調節を行っている。 【０３８９】 構造遺伝子gag、pol及びenv自体についてもう少し詳しく述べると、gagはウイ
ルスの内部構造タンパク質をコードする。Gagは、タンパク分解によって、成熟 タンパク質MA(マトリックス)、CA(キャプシド)、及びNC(ヌクレオキャプシド)に
分解される。pol遺伝子は逆転写酵素(RT)をコードする。逆転写酵素は、DNAポリ
メラーゼと、関連RNアーゼ活性及びインテグラーゼ(IN)とを含み、ゲノムの複製
を媒介する。env遺伝子は、ビリオンの表面(SU)糖タンパク質及び膜貫通(TM)タ ンパク質をコードし、これらは細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複
合体を形成する。この相互作用が最終的にウイルス膜と細胞膜との融合をもたら
す。 【０３９０】 Envタンパク質は、ウイルス粒子を被覆するウイルスタンパク質であり、ウイ ルスの標的細胞への移入を可能とすることに関して必要不可欠な役割を果たす。
レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体は、2種のポリペプチド、即 ち外部の糖鎖をもつ親水性ポリペプチド(SU)と膜貫通タンパク質(TM)とを含む。
この両者がビリオンの表面上にオリゴマーの「ノブ部(knob)」または「ノブ付き
スパイク部(knobbed spike)」を形成する。両ポリペプチドは、env遺伝子により
コードされ、細胞表面への輸送の間にタンパク分解によって切断されるポリタン
パク質前駆体の形に合成される。切断前のEnvタンパク質は受容体に結合できる が、切断自体は、ウイルスの宿主細胞への侵入に必要なタンパク質の融合能を活
性化するために必要である。通常は、SUタンパク質とTMタンパク質の両方におい
て複数の部位でグリコシル化されている。しかし、例えばMLVのようないくつか のウイルスでは、TMはグリコシル化されていない。 【０３９１】 SUタンパク質及びTMタンパク質は、エンベロープを有するウイルス粒子の組立
てのために必ずしも必要ではないが、両タンパク質は侵入プロセスにおいて必要
不可欠な役目を果たす。これに関して、SUドメインは、標的細胞上の受容体分子
、多くの場合は特異的な受容体分子に結合する。この結合によりTMタンパク質の
膜融合誘導能が活性化された後、ウイルスの膜と細胞膜の融合が起こると考えら
れている。いくつかのウイルス、特にMLVでは、TMの原形質内にある尾部の短い 部分が除去される切断が、該タンパク質の完全な融合活性を表出させる際に重要
な役割を果たしていると考えられる(Brodyら 1994 J Virol 68: 4620-4627; Rei
nら 1994 J Virol 68: 1773-1781)。TMの膜貫通セグメントから離れた位置にあ る、原形質内のこの「尾部」はウイルス膜の内側に残り、異なる種類のレトロウ
イルスによって長さが著しく異なる。 【０３９２】 従って、SU/受容体相互作用の特異性により、レトロウイルスの宿主の範囲及 び組織向性が確定され得る。場合によっては、この特異性が組換えレトロウイル
スベクターの形質導入能を制限し得る。ここで形質導入とは、ウイルスベクター
を用いて非ウイルス遺伝子を標的細胞にデリバリーするプロセスである。このた
め、多くの遺伝子治療実験ではMLVが用いられてきた。4070Aと称するエンベロー
プタンパク質を有する特定のMLVは、両種指向性ウイルスとして知られており、 そのエンベロープタンパク質がヒト及びマウスに保存されているリン酸輸送タン
パク質と「ドッキング」するため、ヒト細胞にも感染することができる。この輸
送体はいたるところに遍在しているので、これらのウイルスは多くのタイプの細
胞に感染し得る。しかし場合によっては、特に安全性の点から、限定された細胞
を特異的に標的にすることが有益なこともある。このため、いくつかのグループ
は、マウス両種指向性レトロウイルス(mouse ecotropic retrovirus)を製造し、
通常はマウス細胞のみに感染するその両種指向性の近縁種とは異なり、特定のヒ
ト細胞に特異的に感染するようにした。Envタンパク質の断片を、エリスロポエ チンのセグメントで置換することにより、例えば赤血球前駆体のような、その表
面上にエリスロポエチン受容体を発現するヒト細胞に特異的に結合する組換えレ
トロウイルスが生成された(Maulik及びPatel 1997 "Molecular Biotechnology;
Therapeutic Applications and Strategies" 1997 Wiley-Liss Inc. pp45)。 【０３９３】 gag、pol、及びenvに加えて、複雑型レトロウイルスは、アクセサリータンパ ク質、即ち補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も有している。
アクセサリータンパク質、即ち補助タンパク質は、通常の複製される遺伝子、即
ち構造遺伝子、gag、pol、及びenvによってコードされるものに加えて、アクセ サリー遺伝子によってコードされるタンパク質として定義される。これらのアク
セサリータンパク質は、tat、rev、tax及びrexによってコードされるタンパク質
のような遺伝子発現の調節に関与するタンパク質とは明らかに異なるものである
。アクセサリー遺伝子の例としては、vif、vpr、vpx、vpu及びnefの1種以上が挙
げられる。これらのアクセサリー遺伝子は、例えばHIVにおいて見られる (例え ば"Retrobviruses" Ed. Coffinら Pub. CSHL 1997の802及び803頁を参照)。必須
ではないアクセサリータンパク質は特別な細胞タイプにおいて機能し得、細胞タ
ンパク質により提供される機能と少なくとも部分的に重複している機能を与える
。通常、アクセサリー遺伝子はpolとenvの間、LTRのU3領域を含むenvの下流側の
近傍、またはenv及び相互の重複部分に位置する。 【０３９４】 複雑型レトロウイルスは、細胞の転写制御因子とともにウイルスによってコー
ドされた転写活性化因子を用いる調節機構を進化させてきた。これらのトランス
作用性ウイルスタンパク質は、LTRによって指令されるRNAの転写の活性化因子と
しての役目を果たす。レンチウイルスの転写トランス活性化因子は、ウイルスの
tat遺伝子によってコードされる。TatはTARと称する安定なステムループRNA二次
構造に結合し、この構造の機能の1つは、転写をトランス活性化するためにTatを
最適と思われる位置に置くことである。 【０３９５】 前述のように、特にNOIまたは複数のNOIを1または複数の目的の部位に移送す るためのデリバリーシステム(デリバリービヒクルまたはデリバリーベクターと も称する)としてレトロウイルスを用いることが提案されてきた。この移送は、i
n vitro、ex vivo、in vivoあるいはこれらの組み合わせにおいて生じ得る。こ のようにレトロウイルスを用いる場合、レトロウイルスは通常レトロウイルスベ
クターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクタ
ーは、レトロウイルスの生活環のいくつかの側面、例えば受容体の使用、逆転写
、RNAパッケージング等を研究することを目的として開発されてきた(Miller, 19
92 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24に概説されている)。 【０３９６】 遺伝子治療で使用するための典型的な組換えレトロウイルスベクターでは、ga
g、pol及びenvタンパク質コード領域のいずれか1つまたは複数の少なくとも一部
分をウイルスから除去し得る。これによりレトロウイルスは複製欠陥を有するも
のとなる。そのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるが、修飾されたウイ
ルスゲノムは構造タンパク質を欠いているためにそれ自体では増殖することがで
きないウイルスを生成するために、除去された部分をNOIによって置換すること もできる。宿主のゲノムに組み入れられるとNOIの発現が起こり、例えば治療上 及び／または診断上の効果が得られる。すなわち、NOIを目的の部位に移送する ことは、通常、NOIを組換えウイルスベクターに組み込み、その修飾されたウイ ルスベクターをビリオンコートのなかにパッケージングし、目的の部位、例えば
標的細胞や標的細胞の集団の形質導入を可能とすることによって達成される。 【０３９７】 パッケージングまたはヘルパー細胞系及び組換えベクターを組み合わせて用い
ることによって、例えばその後に目的の部位の形質導入を行うために、多量のレ
トロウイルスベクターを増殖させ、単離すること(例えば適切な力価のレトロウ イルスベクターを調製すること)が可能である。 【０３９８】 ある場合には、増殖と単離においてレトロウイルスのgag、pol及びenv遺伝子 を単離し、それを宿主細胞に個別に導入して、「パッケージング細胞系」を生成
することが必要なことがある。このパッケージング細胞系は、レトロウイルスDN
Aのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、psi領域を欠いているため
DNAを封入することはできない。しかし、NOI及びpsi領域を有する組換えベクタ ーをこのパッケージング細胞系に導入すると、ヘルパータンパク質がpsiポジテ ィブな組換えベクターをパッケージングして組換えウイルス系を生成することが
できる。これを利用して細胞に形質導入し、NOIを細胞のゲノムに導入すること ができる。この組換えウイルスは、ウイルスタンパク質を作るために必要な全て
のゲノム遺伝子を欠いており、1回だけ形質導入することができ、増殖はできな い。単回のみの標的細胞の形質導入が可能なこれらのウイルスベクターは複製欠
陥ベクターとして知られている。従って、有害である可能性のあるレトロウイル
スを発生させることなく、NOIが宿主／標的細胞のゲノムに導入される。使用で きるパッケージング系の概要は、"Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour L
aboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449)に記載されて
いる。 【０３９９】 レトロウイルスパッケージング細胞系の設計は、特に、初期の設計で頻繁に生
じたヘルパーウイルスの自発的生成の問題に対処するために発展してきた。組換
えは相同性により大きく促進されるので、ベクターゲノムとヘルパーゲノムとの
間の相同性を小さくするか、あるいはなくすことにより、ヘルパーウイルスの生
成の問題が起こることは少なくなった。さらに最近では、gag、pol及びenvウイ ルスコード領域が別々の発現プラスミドに含まれ、それぞれを個別にパッケージ
ング細胞系にトランスフェクトするため、野生型ウイルスを発生させるために3 種の組換え事象が必要なパッケージング細胞が開発された。これによって、複製
‐コンピテントウイルスの発生の可能性が小さくなる。この方法は3プラスミド トランスフェクション法と称されることもある(Soneokaら、1995 Nucl. Acids R
es. 23: 628-633)。 【０４００】 ベクターが開発されれば、一過性トランスフェクションを用いてベクターの発
生を測定することもできる。この点、一過性トランスフェクションにより安定な
ベクター生成細胞系を生成するのにより長い時間をかけなくて済み、またベクタ
ーまたはレトロウイルスパッケージング要素が細胞に対して毒性である場合に用
いることができる。レトロウイルスベクターにを生成するために通常用いられる
要素には、Gag/Polタンパク質をコードするプラスミド、Envタンパク質をコード
するプラスミド、及びNOIを含むプラスミドが含まれる。ベクターの製造では、 これらの要素のうち1または複数の要素の、他の必要な要素を含む細胞への一過 性トランスフェクションを行う。有害な遺伝子、または細胞周期のインヒビター
のような宿主細胞の複製を阻害する遺伝子またはアポトーシスを誘導する遺伝子
をベクターがコードしている場合、安定なベクター生成細胞系を生成することが
困難なことがあるが、一過性トランスフェクションを用いることにより、細胞が
死滅する前にベクターを生成することができる。また、安定なベクター生成細胞
系で得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルを生成する細胞系が、一過性
感染を用いて開発された(Pearら 1993, Proc Natl Acad Sci 90:8392-8396)。 【０４０１】 安定なHIVをベースにしたパッケージング細胞を生成することを困難にするよ うな毒性がいくつかのHIVタンパク質に存在するため、HIVベクターは、通常はベ
クターとヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションにより製造される。HI
VのEnvタンパク質を水疱性口内炎ウイルス(VSV)のEnvタンパク質で置換すること
も行われている。一過性トランスフェクションによりHIV/VSV-Gベクターが5×10 5 (濃縮後108)の力価で生成されるので、VSVのEnvタンパク質を挿入することによ
りベクターの濃縮が容易になる(Naldiniら、1996 Science 272: 263-267)。従っ
て、HIVベクターの一過性トランスフェクションにより高い力価のベクターを生 成するための有用な方法が得られる(Yeeら、1994 PNAS. 91: 9564-9568)。 ベクターの力価に関して、in vitroの培養で得られる導入粒子の力価(通常は1
08粒子/ml以下)や、ウイルスの濃縮・精製のための従来の生化学的及び物理化学
的技術に対する多くのエンベロープを有するウイルスの感受性により、レトロウ
イルスベクターの実用上の使用はかなり限定されたものであった。 【０４０２】 例えば、レトロウイルスベクターの濃縮のためのいくつかの方法が開発されて
おり、遠心分離を用いる方法(Fekete及びCepko 1993 Mol Cell Biol 13: 2604-2
613)、中空糸繊維を用いる濾過(Paulら 1993 Hum Gene Ther 4: 609-615)、及び
接線フロー濾過(Kotaniら 1994 Hum Gene Ther 5: 19-28)等が挙げられる。ウイ
ルスの力価を20倍に高めることは可能であるが、レトロウイルスのEnvタンパク 質が比較的脆弱であるためレトロウイルスベクターを濃縮する能力が限定され、
ウイルスの濃縮では、通常感染性ビリオンを少量しか回収できない。この問題は
、レトロウイルスのEnvタンパク質を、上述のようにより高い収率でより効果的 なベクターの濃縮を可能とする、より安定なVSV-Gタンパク質で置換することに より克服することができるが、VSV-Gタンパク質が細胞に対して極めて有害であ るという欠点がある。 【０４０３】 107 cfu/mlのヘルパーウイルスを含まないベクターの力価は、現在入手できる
ベクターで得ることができるが、実験は多くの場合これより非常に小さい力価の
ベクターストックで行うことができる。しかし、実用上の理由から、特に多数の
細胞に感染させなければならない場合には高い力価のウイルスが望ましい。さら
に、高い力価は、ある細胞のタイプを大きな割合で形質導入するための必要条件
である。例えば、ヒト造血前駆細胞への感染頻度はベクターの力価によって大き
く左右され、有用な感染頻度は非常に高い力価のストックを用いた場合しか得ら
れない(Hock及びMiller 1986 Nature 320: 275-277; Hogge及びHumphries 1987
Blood 69: 611-617)。このような場合、低いウイルス力価を補償するためには、
単に細胞をより多量のウイルスに露出するだけでは不十分である。逆に、効率的
な形質導入を促進するために、感染性ベクタービリオンの濃度が重要である場合
がある。 【０４０４】 遺伝子デリバリーにおいて使用するための高い力価のベクターを生成すること
も試みられている。例えば、異なるベクターの設計を比較することは、高い力価
のウイルスの生成に必要な必須エレメントを確定するのに有用であることが判明
している。異なるレトロウイルスベクターの設計についての初期の研究から、ML
Vの殆ど全ての内部タンパク質コード領域を、ベクターの感染性を失わせること なく取り除くことが可能であることが示されている(Millerら 1983 Proc Natl A
cad Sci 80: 4709-4713)。これらの初期のベクターは、envコード領域の3'末端 の小部分のみを有していた。その後の研究で、全てのenv遺伝子コード配列を、 ベクターの力価をさらに低下させることなく取り除くことが可能であることがわ
かった(Miller及びRosman 1989 Biotechnique 7: 980-990; Morgenstern及びLan
d 1990 Nucleic Acids Res 18: 3587-3596)。ベクターが透過するために必要な のは、プラス及びマイナス鎖DNAプライミングに必要なセグメント及びウイルスR
NAのビリオンへの選択的パッケージングに必要な領域(psi部位; Mannら1983 Cel
l 33: 153-159)を含む、ウイルスのLTR及びLTRに隣接する短い領域のみであると
考えられた。それにも関わらず、これらの初期のベクターで得られたウイルスの
力価は、親ヘルパーウイルスの力価の約10分の1に過ぎなかった。 【０４０５】 別の実験により、gag遺伝子の5'末端の配列を保持することによりウイルスベ クターの力価を有意に高められること、及びこれがウイルスRNAのビリオンへの パッケージング効率の増加によるものであることが示された(Armentanoら 1987
J Virol 61: 1647-1650; Benderら1987 J Virol 61: 1639-1646; Adam及びMille
r 1988 J Virol 62: 3802-3806)。この効果は、ベクターのgag領域からのウイル
スタンパク質の合成によるものではない。gagのリーディングフレームの破壊、 あるいはgagコドンの終始コドンへの変異はベクターの力価に影響を与えなかっ たからである(Benderら1987 ibid)。これらの実験により、MLVにおけるゲノムRN
Aの効率的なパッケージングに必要な配列が、遺伝子欠失分析により前に確定さ れたpsiシグナルより大きいことが立証された(Mannら 1983 上出)。高い力価(10 6 から>107)を得るためには、psiプラスと称するこのより大きいシグナルをレト ロウイルスベクターに含めることが重要であることが分かった。現在、このシグ
ナルは、スプライス・ドナー部位の上流からgag開始コドンの下流にわたってい ることが示されている(Benderら 1987 上出)。この位置にあるために、スプライ
シングされたenv発現転写物ではこのシグナルは除去される。これにより、ウイ ルスの生活環のための3つの必須遺伝子を含む完全長転写物のみのパッケージン グが確保される。 【０４０６】 ベクターの力価を高めることを目的としてレトロウイルスベクターを操作する
ことに加えて、レトロウイルスベクターは、形質導入された細胞において特定の
NOI(通常はマーカータンパク質)の生成を誘導するようにも設計されている。既 に述べたように、最も一般的なレトロウイルスベクターの設計では、レトロウイ
ルスの配列を1または複数のNOIで置換することにより、複製欠陥ベクターを生成
する。最も単純な方法は、レトロウイルス5'LTRにおけるプロモーターを用いてN
OIをコードするcDNAの発現を調節したり、あるいはLTRのエンハンサー/プロモー
ターを改変して組織特異的発現、または誘導能をもたらすものであった。あるい
は、プロモーターの選択においてより高い柔軟性を許容する内部プロモーターを
用いることにより単一のコード領域を発現させるものであった。 【０４０７】 目的の遺伝子発現のためのこれらの方法は、ベクターで形質導入した細胞の選
択を容易にするヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(h
prt) (Millerら 1983 Proc Natl Acad Sci 80: 4709-4713)の場合と同様に、NOI
が選択マーカーであるとき最も容易に実現されるものであった。ベクターが選択
マーカーでないNOIを含む場合、別のプラスミド上に存在する選択マーカーを同 時トランスフェクトすることにより、ベクターをパッケージング細胞に導入する
ことができる。この方法は、1種類のタンパク質が最終的な標的細胞で発現され 、選択マーカーが有し得る毒性または抗原性が回避される点で、遺伝子治療にお
いて非常に有益である。しかし、挿入された遺伝子が選択できないとき、この方
法は、高力価ベクターストックを生成する細胞を生成するのが一層困難になると
いう点で不利である。加えて、ベクターの力価を決定するのが通常より困難にな
る。 【０４０８】 2種以上のタンパク質を発現するレトロウイルスベクターの設計に用いられる 現在の方法は、3つの一般的な方法に基づくものである。それらは、(i) 1つのプ
ロモーターから転写され、選択的にスプライシングされたmRNAからの異なるタン
パク質の発現、(ii) 異なるcDNAの転写を誘導するための5' LTRにおけるプロモ ーター及び内部プロモーターの使用、及び(iii) 単一mRNA、またはオープンリー
ディングフレームからその後発現され得る融合タンパク質のいずれかからの複数
のコード領域の翻訳を可能とするための内部リボソーム侵入部位(IRES)の使用で
ある。 【０４０９】 内部プロモーターを有するベクターは、複数の遺伝子を発現するために広く用
いられてきた。内部プロモーターにより、遺伝子発現を誘導するためのウイルス
LTR以外のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを開発することが可能とな る。複数の内部プロモーターをレトロウイルスベクターに含めることができ、そ
れぞれ自身のプロモーターから少なくとも3種の異なるcDNAを発現できることが 判明している(Overellら 1988 Mol Cell Biol 8: 1803-1808)。 【０４１０】 現在、様々な哺乳動物細胞においてNOIを発現するために用いることができる 多くのそのような修飾組換えレトロウイルスベクターが存在するが、このような
レトロウイルスベクターの殆どは、非分裂細胞には形質導入ができないマウスオ
ンコレトロウイルスのような単純型レトロウイルスに由来するものである。 【０４１１】 例えば、選択的スプライシングを利用してウイルスLTR SV(X)からの遺伝子を 発現する広く用いられているベクター(Cepkoら1984 Cell 37: 1053-1062)は、選
択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する。この
タイプのベクターのモデルは親ウイルスのMO-MLVであり、このMO-MLVでは、Gag 及びGag-Polタンパク質が完全長ウイルスmRNAから翻訳され、Envタンパク質はス
プライシングされたmRNAから作られる。このベクターによりコードされるタンパ
ク質の1つは完全長RNAから翻訳され、5'LTR近傍のスプライス・ドナー部位を、 第2の遺伝子の直ぐ上流にあるスプライス・アクセプター部位とを結合するスプ ライシングによって、そこから第2の遺伝子産物が翻訳され得るRNAが生成される
。この方法の1つの欠点は、スプライシングされた遺伝子のイントロンに外来配 列が挿入されることである。これはスプライシングされたRNAとスプライシング されないRNAの比率に影響を及ぼし得、あるいは第2の遺伝子産物をコードするス
プライシングされたRNAの生成を妨げる選択的スプライス・アクセプター部位を 与え得る(Krmanら 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 2150-2154)。これらの影響は 予測不可能であることから、コードされた遺伝子の生成に影響を与え得る。 【０４１２】 他の改変レトロウイルスベクターは、スプライシング能について2つの種類に 分けることができる。 【０４１３】 改変レトロウイルスベクターの第1の種類は、pBABEベクター(Morgensternら 1
990 Nucleic Acid Research 18: 3587-3596)に代表されるものであり、ウイルス
の転写物のスプライシングを阻害するスプライス・ドナー部位内に(GTからGCへ の)変異を有する。このようなスプライシングの阻害は、2つの理由から有益であ
る。第一に、この阻害により、全てのウイルス転写物がパッケージングシグナル
を有し、従って全てが産生細胞にパッケージングされ得ることが確保される。第
二に、この阻害により、ウイルスのスプライス・ドナー部位と挿入された遺伝子
のクリプティックスプライス・アクセプター部位となり得る部位との間での異常
なスプライシングが起こるのを防ぐことができる。 【０４１４】 改変レトロウイルスベクターの第2の種類は、N2(Millerら 1989 Biotechnique
s 7: 980-990)及びより最近のMFG(Dranoffら1993 Proc Natl Acad Sci 19: 3979
-3986)に代表されるものであり、機能的イントロンを有する。両ベクターは、パ
ッケージングシグナル内に見出される通常のスプライス・ドナー部位を用いてい
る。しかし、両ベクターのそれぞれのスプライス・アクセプター部位(SA)は異な
っている。N2では、SAは「伸長された」パッケージングシグナル内にある(Bende
rら1987 ibid)。MFGでは、天然のSA(pol内に見出される、図1参照)が用いられて
いる。両ベクターについて、スプライシングが形質導入された細胞における遺伝
子の発現を著しく高めることが示されている(Millerら 1989 上出; Krallら1996
Gene Therapy 3: 37-48)。このような観察は、一般にスプライシングがmRNAの 翻訳を促進し得るという従来の知見を支持するものである(Leeら1981 Nature 29
4: 228-232; Lewisら 1986 Mol Cell Biol 6: 1998-2010; Chapmanら1991 Nucle
ic Acids Res 19: 3979-3986)。この理由として有力なものの1つは、転写スプラ
イシングに関与するのと同じ機構が核からの転写物の搬出にも働いている可能性
があるということである。 【０４１５】 上述の改変レトロウイルスベクターとは異なり、非分裂細胞に感染し得るレト
ロウイルスのレンチウイルス系では、選択的スプライシングについての研究は殆
どない(Naldiniら 1996 Science 272: 263-267)。現在までに文献に記載された レンチウイルスベクターは、HIV-1由来のもの(Kimら1997 J Virol 72: 811-816)
、及びFIVに由来するもの(Poeschlaら 1998 Nat Med 4: 354-357)のみである。 これらのベクターは、やはりウイルス由来のスプライス・ドナー部位及び・アク
セプター部位配列を有するものである(Naldiniら 1996 上記)。 【０４１６】 遺伝子デリバリー用の高力価のベクターを生成するためのいくつかの異なる方
法では、(i) アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、 及びポックスウイルスのような欠陥ウイルスベクター、及び(ii) 改変レトロウ イルスベクターの設計を利用する。 【０４１７】 このアデノウイルスは、RNA中間体を介さない二本鎖の線状DNAウイルスである
。50種以上の異なるヒト血清型のアデノウイルスが存在し、遺伝子配列の相同性
に基づいて6つの亜群に分けられる。アデノウイルスの自然における標的は気道 及び消化管の上皮であり、一般に軽度の症状を呈するのみである。血清型2及び5
(95％の配列同一性を有する)がアデノウイルスベクター系において最も一般的に
用いられ、若齢者の通常上気道への感染を伴う。 【０４１８】 アデノウイルスは、エンベロープを有しておらず、正20面体である。典型的な
アデノウイルスとしては、140 nmのキャプシド形成したDNAウイルスがある。ウ イルスの20面体の対称的な構造は、152個のキャプソメア、240個のヘキソン、及
び12個のペントンからなる。この粒子のコアは、36kbの線状二重鎖DNAを有し、 このDNAは、DNA複製のためのプライマーとして作用する末端タンパク質(TP)と 5
'末端で共有結合している。このDNAは、逆方向末端反復配列(ITR)を有し、その 長さは血清型によって異なる。 【０４１９】 アデノウイルスの細胞への侵入は一連の独立した事象を伴う。まずウイルスの
繊維(37nm)と細胞上の繊維受容体との間の相互作用を介してウイルスの細胞への
付着が起こる。この受容体は最近、Ad2/5血清型について同定され、CAR(コクサ ッキー及びアデノ受容体、Tomkoら(1997 Proc Natl Acad Sci 94: 3352-2258)と
命名された。細胞のαvβ3及びαvβ5インテグリンを介したウイルスのエンドソ
ームへのインターナリゼーションは、ペントンをベースにしたキャプシドタンパ
ク質におけるウイルスのRGD配列によって媒介される(Wickhamら1993 Cell 73: 3
09-319)。インターナリゼーションの後、エンドソームは、エンドソーム溶解と して知られるプロセスにより破壊される。このエンドソーム溶解は、細胞のαv β5インテグリンによって優先的に促進される事象であると考えられる(Wickham ら1994 J Cell Biol 127: 257-264)。さらに、Ad5繊維ノブ部は、ヒト上皮細胞 及びBリンパ芽球を含む一定の細胞タイプの表面において、高い親和性をもってM
HCクラス1α2ドメインに結合することが最近示された(Hongら 1997 EMBO 16: 22
94-2306)。 【０４２０】 その後、ウイルスは核内に転位し、そこで初期領域の活性化が起こり、その直
後にDNA複製及び後期領域の活性化が起こる。アデノウイルスDNAの転写、複製、
パッケージングには、宿主とウイルス両方の機能的タンパク質機構が必要である
。 【０４２１】 ウイルスの遺伝子の発現は、初期段階(E)と後期段階(L)に分けることができる
。後期段階は、ウイルスDNA複製の開始によって定義される。アデノウイルスの 構造タンパク質は、通常後期段階において合成される。殆どの血清型について、
アデノウイルスの感染後、感染細胞で宿主の細胞のmRNA及びタンパク質の合成が
阻害される。アデノウイルス2及びアデノウイルス5でのアデノウイルス溶解サイ
クルは非常に効率的で、感染した細胞当たり約10,000個のビリオンが生ずるとと
もに、ビリオンに導入されない過剰なウイルスタンパク質及びDNAが合成される 。初期のアデノウイルスの転写は、複雑な相互に関係する生化学的事象の連続で
あるが、DNA複製の開始前にウイルスRNAの合成が行われることが必要不可欠であ
る。 【０４２２】 図30の概略図はアデノウイルスのゲノムの図であり、初期及び後期の遺伝子転
写の相対的方向及び位置を示している。 【０４２３】 アデノウイルスゲノムの構成は全てのアデノウイルス群において類似しており、
研究された各血清型について特定の機能は一般的に同一の位置にある。初期の細
胞質メッセンジャーRNAは、ウイルスDNA上の4つの確定された連続していない領 域に対して相補的である。これらの領域は、E1〜E4と称する。この初期の転写物
は、中間初期(E1a)、後期初期(Elb、E2a、E2b、E3及びE4)、及び中間領域の配列
に分類されている。 【０４２４】 これらの初期遺伝子は感染の約6〜8時間後に発現され、遺伝子ブロックE1〜4 における7つのプロモーターから誘導される。 【０４２５】 E1a領域は、ウイルス及び細胞遺伝子の転写トランス活性化とともに、他の配 列の転写抑制に関与する。このE1a遺伝子は、他の初期アデノウイルスメッセン ジャーRNAの全てに対する重要な調節機能を発揮する。正常な組織では、領域E1b
、E2a、E2b、E3、またはE4を効率的に転写するために活性E1a産物が必要である 。しかし、E1a機能はバイパスされ得る。細胞は、E1a様の機能を与えるように操
作することが可能であり、あるいはそのような機能を天然に有し得る。このウイ
ルスは、E1a機能をバイパスするように操作することもできる。ウイルスパッケ ージングシグナルはE1aエンハンサー(194-358nt)と重複している。 【０４２６】 E1b領域は、ウイルス及び細胞の代謝、及び宿主のタンパク質の遮断に影響を 与える。この領域には、完全長ウイルスDNAのパッケージングに必要で、ウイル スの熱安定性のために重要なpIXタンパク質をコードする遺伝子(3525-4088 nt) も含まれている。E1b領域は、感染の後期のウイルスにおける事象の正常な進行 に必要である。E1b産物は、宿主の核において作用する。E1b配列内で生じた変異
体は、アデノウイルス感染の後期に通常観察される宿主の細胞輸送の阻害の障害
とともに、後期のウイルスのmRNAの蓄積の低下を示す。E1bは、ウイルスの後期 の遺伝子産物のためにプロセシング及び輸送がシフトするように宿主細胞の機能
を変化させるために必要である。これらの産物によって、ウイルスのパッケージ
ング及びビリオンの放出が生ずる。E1bは、アポトーシスを防ぐ19 kDタンパク質
を生成する。E1bは、p53に結合する55 kDのタンパク質も生成する。アデノウイ ルス及びその複製に関する概説については、WO 96/17053を参照されたい。 【０４２７】 E2領域は、72 kDaのDNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼ、及びDNA合成を開 始させるためのタンパク質プライミングに必要な55 kDaの末端タンパク質(TP)の
80kDaの前駆体をコードしており、必要不可欠な領域である。 【０４２８】 19 kDaのタンパク質(gp19K)はE3領域内にコードされており、ウイルスに対す る宿主の免疫応答の変調に関係していた。このタンパク質の発現は、感染の第1 期の間にTNFαに応答してアップレギュレートされ、その後このタンパク質はMHC
クラスI抗原に結合して、その上皮表面への遊走を防止し、これにより細胞障害 性Tリンパ球によるアデノウイルス感染細胞の認識を低下させる。このE3領域はi
n vitroでの実験では不要であり、1.9 kbのXbaI断片を除くことにより除去する ことができる。 【０４２９】 E4領域は、宿主のタンパク質合成の低下及びウイルスのDNA複製の増大に関係 する。 【０４３０】 後期遺伝子には5つのファミリーがあり、これらは全て主要な後期プロモータ ーから開始される。この後期遺伝子の発現には、RNAスプライシングに関与する 非常に複雑な転写後調節機構が関与する。繊維タンパク質は、L5領域内にコード
されている。アデノウイルスゲノムには、Ad5においては103 bpでDNA複製に必要
な逆方向反復配列が隣接している。感染後30〜40時間で、ウイルスの生成は完了
する。 【０４３１】 アデノウイルスは、遺伝子導入のためのベクターとして用いるために、E2、E3
及びE4プロモーターの誘導のための重要なE1遺伝子を除くことによって変換する
ことができる。E1複製欠陥ウイルスは、ヒト胎児腎細胞系293のようなE1ポリペ プチドをトランスで提供する細胞系において増殖させることができる。治療用遺
伝子または遺伝子群を、E1遺伝子と置き換わるように組換えるによって挿入する
ことができる。この遺伝子の発現は、E1プロモーターあるいは異種プロモーター
のいずれかによって駆動される。 【０４３２】 さらに弱毒化されたアデノウイルスベクターも、E4オープンリーディングフレ
ーム(ORF)の一部または全体を除くことによって開発されている。しかし、第二 世代のベクターのなかには、DNAが維持されているようであるとしても、長期間 の遺伝子発現ができないものがあるようである。従って、1つまたは複数のE4のO
RFの機能は、ウイルスが有する少なくともあるウイルスプロモーターからの遺伝
子発現を高めるものであり得る。 【０４３３】 より強い欠陥を有するウイルスを生成するための別の方法は、ウイルスの複製
に必要な末端反復配列のみを完全に維持しながらウイルスの「中身（重要部分）
を除去する(gut)」ことである。「中身を除去した」または「中身を除去してい ない」ウイルスは、293細胞系で第一世代のヘルパーウイルスにより高力価で増 殖させることができるが、ヘルパーウイルスから「中身を除去した」ベクターを
分離することが困難であった。 【０４３４】 複製‐コンピテントアデノウイルスも遺伝子治療に用いることができる。例え
ば、E1A遺伝子を、腫瘍特異的プロモーターの調節下で第一世代のウイルスに挿 入することができる。理論上、このウイルスを腫瘍に注射すると、このウイルス
は腫瘍において特異的に複製し得るが、周囲の正常な組織では複製できない。こ
のタイプのベクターは、腫瘍細胞を溶解により直接殺すための、あるいはガンシ
クロビルで処置した後感染細胞及び傍観細胞を殺すことができる単純ヘルペスウ
イルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV tk)のような「自殺遺伝子」をデリバリーす
るためのいずれかの目的で用いることができる。あるいは、E1bのみが欠損して いるアデノウイルスは、フェーズ1の臨床試験における抗腫瘍的処置のために特 に用いられている。E1bによってコードされるポリペプチドは、p53により媒介さ
れるアポトーシスを遮断し、細胞がウイルスの感染に応答して自死に至るのを防
止することができる。従って、正常な非腫瘍性細胞では、E1bが欠損している場 合、ウイルスはアポトーシスを遮断することができず、感染性ウイルスを作り出
し拡散させることができない。p53を欠損する腫瘍細胞では、E1b欠陥ウイルスが
増殖し、p53を欠く腫瘍細胞の近くまで拡散することができるが、正常な細胞に 達することはできない。同様に、このタイプのベクターも、HSV tkのような治療
用遺伝子のデリバリーのために用いることができる。 【０４３５】 アデノウイルスは遺伝子デリバリー用のベクターとして、以下の理由で他の遺
伝子治療用ベクター系より優れている。 【０４３６】 アデノウイルスは、ヒト及びヒト以外を起源とする広い範囲の細胞タイプにお
いてin vino及びin vitroの形質導入が可能な、エンベロープの無い二本鎖DNAウ
イルスである。これらの細胞としては、気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細
胞、滑膜細胞、一次乳房上皮細胞、及びニューロンのような有糸分裂後終末分化
細胞等が挙げられる(但し、単球等のようないくつかのリンパ球はおそらく重要 な例外である)。 【０４３７】 アデノウイルスベクターは非分裂細胞への形質導入も可能である。このことは
、肺上皮の患部細胞の代謝回転速度が遅くなる嚢胞性線維症のような疾病におい
て非常に重要である。実際に、アデノウイルスを利用して成人の嚢胞性線維症の
成人患者の肺に嚢胞性線維症輸送体(CFTR)を導入する試みがいくつか進行中であ
る。 【０４３８】 アデノウイルスは、遺伝子治療及び異種遺伝子の発現のためのベクターとして
用いられてきた。この大形(36 kb)のゲノムは、最大8kbの外来インサートDNAを 組み込むことができ、補完的な細胞系において効率的に複製して最大1012の非常
に高い力価を生成することができる。従ってアデノウイルスは一次非複製可能細
胞における遺伝子の発現の研究に最適な系の一つである。 【０４３９】 アデノウイルスのゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現には複
製細胞は不要である。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシ
スにより細胞内に入る。一旦細胞の内部に入ると、アデノウイルスベクターが宿
主染色体に組み込まれることは殆ど無い。そのかわり、アデノウイルスベクター
は、宿主の核で線状ゲノムとして(宿主のゲノムからは独立して)エピソームとし
て機能する。従って、組換えアデノウイルスを用いることにより宿主ゲノムへの
ランダムな組み込みに関連する問題が軽減される。 【０４４０】 ヒトの悪性腫瘍はアデノウイルス感染とは関連しない。弱毒化アデノウイルス
株が開発され、生ワクチンとしてヒトにおいて用いられてきた。 【０４４１】 しかし、現在のアデノウイルスベクターにはin vivoでの治療上の使用のため にはいくつかの限界がある。このような限界としては、(i) 一過性の遺伝子発現
、即ちアデノウイルスベクターは一般にエピソームの状態にとどまり、複製しな
いため子孫に継代されないこと、(ii) 複製ができないため、標的細胞の増殖に よってベクターが希釈されること、(iii) アデノウイルスタンパク質に対して免
疫応答が誘発されるので、低いレベルであってもアデノウイルスのタンパク質を
発現する細胞は破壊されること、及び(iv) in vivoデリバリーによってベクター
が取り込まれたり、デリバリーされた遺伝子が標的細胞の一部でしか発現されな
いため、有効な治療係数を達成できないこと等が挙げられる。 【０４４２】 アデノウイルスの特徴をレトロウイルス／レンチウイルスの遺伝的な安定性と
組み合わせることができるならば、実質的に、アデノウイルスを標的細胞への形
質導入を行うために用いて、安定に近傍の細胞に感染し得る一過性のレトロウイ
ルスを産生する細胞となるようにすることができる。 【０４４３】 本発明は、新規なレトロウイルスベクターを提供することを目的とする。 【０４４４】 特に、本発明は、1または複数の所望の標的部位においてNOIまたは複数のNOI を効率的に発現させることができる新規なレトロウイルスベクターを提供するこ
とを目的とする。 【０４４５】 本発明はまた、in vivoでの使用のための安全な特徴を有しており、1または複
数の所望の標的部位においてNOIまたは複数のNOIを効率的に発現させることがで
きるベクタービリオンを高い力価で調製するための新規な系を提供することを目
的とする。 【０４４６】 本発明の第1の形態によれば、機能的スプライス・ドナー部位(functional spl
ice donor site)及び機能的スプライス・アクセプター部位(functional splice
acceptor site)を含むレトロウイルスベクターであって、機能的スプライス・ド
ナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位が、目的の第1のヌクレオチ ド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位が、機能的スプラ イス・アクセプター部位の上流にあり、該レトロウイルスベクターがレトロウイ
ルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的
スプライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と 、機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含 み、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レト
ロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクタ
ーが提供される。 【０４４７】 本発明の第2の形態によれば、レトロウイルスプロベクターがレトロウイルス パッケージングシグナルを含み、第2のNSがレトロウイルスパッケージングシグ ナルの下流に位置し、それによりスプライシングが一次標的部位で防止されるレ
トロウイルスベクターが提供される。 【０４４８】 本発明の第3の形態によれば、第2のNSが第1のNOIの下流に位置し、それにより
第1のNOIが一次標的部位で発現され得るレトロウイルスベクターが提供される。 【０４４９】 本発明の第4の形態によれば、第2のNSが複数のクローニング部位の上流に位置
し、それにより1または複数の追加のNOIが挿入され得るレトロウイルスベクター
が提供される。 【０４５０】 本発明の第5の形態によれば、第2のNSが免疫学的分子またはその一部をコード
するヌクレオチド配列であるレトロウイルスベクターが提供される。 【０４５１】 本発明の第6の形態によれば、免疫学的分子が免疫グロブリンであるレトロウ イルスベクターが提供される。 【０４５２】 本発明の第7の形態によれば、第2のNSが免疫グロブリンの重鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列であるレトロウイルスベクターが提供される。 【０４５３】 本発明の第8の形態によれば、機能的イントロンをさらに含むレトロウイルス ベクターが提供される。 【０４５４】 本発明の第9の形態によれば、前記機能的イントロンが所望の標的部位におい てNOIの少なくとも1つの発現を抑制できるように配置されているレトロウイルス
ベクターが提供される。 【０４５５】 本発明の第10の形態によれば、前記標的部位が細胞であるレトロウイルスベク
ターが提供される。 【０４５６】 本発明の第11の形態によれば、前記ベクターまたはプロベクターがマウスオン
コレトロウイルスまたはレンチウイルスから誘導され得るものであるレトロウイ
ルスベクターが提供される。 【０４５７】 本発明の第12の形態によれば、前記ベクターがMMLV、MSV、MMTV、HIV-1または
EIAVから誘導され得るものであるレトロウイルスベクターが提供される。 【０４５８】 本発明の第13の形態によれば、レトロウイルスベクターが組み込まれたプロウ
イルスであるレトロウイルスベクターが提供される。 【０４５９】 本発明の第14の形態によれば、レトロウイルスベクターから得ることができる
レトロウイルス粒子が提供される。 【０４６０】 本発明の第15の形態によれば、レトロウイルスベクターでトランスフェクトま
たは形質導入された細胞が提供される。 【０４６１】 本発明の第16の形態によれば、医薬で使用するためのレトロウイルスベクター
またはウイルス粒子または細胞が提供される。 【０４６２】 本発明の第17の形態によれば、1または複数のNOIをそれを必要とする標的部位
にデリバリーするための医薬組成物を製造するためのレトロウイルスベクターま
たはウイルス粒子または細胞が提供される。 【０４６３】 本発明の第18の形態によれば、レトロウイルスベクターもしくはウイルス粒子
により、または細胞の使用により細胞をトランスフェクトまたは形質導入するこ
とを含む方法が提供される。 【０４６４】 本発明の第19の形態によれば、レトロウイルスベクターまたはウイルス粒子ま
たは細胞のためのデリバリー系であって、NOIまたは複数のNOIを第1の標的細胞 にデリバリーするための1または複数の非レトロウイルス発現ベクター、アデノ ウイルスもしくはプラスミドまたはそれらの組み合わせと、NOIまたは複数のNOI
を第2の標的細胞にデリバリーするためのレトロウイルスベクターとを含むデリ バリー系が提供される。 【０４６５】 本発明の第20の形態によれば、レトロウイルスプロベクターが提供される。 本発明の第21の形態によれば、所望の標的細胞内で1または複数のNOIの発現を
抑制するための機能的イントロンの使用が提供される。 【０４６６】 本発明の第22の形態によれば、第1のNSをレトロウイルスプロベクターの3'末 端からレトロウイルスベクターの5'末端にデリバリーするための逆転写酵素の使
用が提供される。 【０４６７】 本発明の第23の形態によれば、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッ ドウイルスベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする1または複 数の一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターまたはベクター群が第1の標的 細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベ
クターが二次標的細胞の形質導入を行うことができる前記ハイブリッドウイルス
ベクター系が提供される。 【０４６８】 本発明の第24の形態によれば、ハイブリッドウイルスベクター系であって、一
次ベクターがアデノウイルスベクターから得ることができるもの、あるいはそれ
をベースにしたものであり、及び／または二次ベクターがレトロウイルスベクタ
ー、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、あるいはそ
れをベースにしたものである前記ハイブリッドウイルスベクター系が提供される
。 【０４６９】 本発明の第25の形態によれば、前記レンチウイルスベクターが、スプリット‐
イントロン(split-intron)構造を有するか、またはそれをデリバリーすることが
できるハイブリッドウイルスベクター系が提供される。 【０４７０】 本発明の第26の形態によれば、レンチウイルスベクター系であって、レンチウ
イルスベクターが、スプリット‐イントロン構造を有するか、またはそれをデリ
バリーすることができる前記レンチウイルスベクター系が提供される。 【０４７１】 本発明の第27の形態によれば、アデノウイルスベクター系であって、アデノウ
イルスベクターが、スプリット‐イントロン構造を有するか、またはそれをデリ
バリーすることができる前記アデノウイルスベクター系が提供される。 【０４７２】 本発明の第28の形態によれば、pElsp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE
1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rabとして提示されるもののなかの1つまたは複数をベ ースとするか、またはそれから得られるベクターまたはプラスミドが提供される
。 【０４７３】 本発明の第29の形態によれば、標的細胞においてNOIを差別的に発現し得るレ トロウイルスベクターが提供される。 【０４７４】 本発明の別の形態として、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウ イルスベクター系があり、このベクター系は二次ウイルスベクターをコードする
一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのな かで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞
の形質導入を行うことができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得る
ことができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベク
ターはレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得るこ
とができるもの、あるいはそれをベースにしたものである。 【０４７５】 本発明の別の形態として、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウ イルスベクター系があり、このベクター系は、二次ウイルスベクターをコードす
る一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、その なかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細
胞の形質導入を行うことができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得
ることができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベ
クターはレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得る
ことができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、前記ベクター系は
機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含み
、機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位は目
的の第1のヌクレオチド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部
位は機能的スプライス・アクセプター部位の上流にあり、レトロウイルスベクタ
ーはレトロウイルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベ
クターは機能的スプライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオ チド配列(NS)と、機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる
第2のNSとを含み、第1のNSは第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベク ターは前記レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるもので
ある。 【０４７６】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターは第2のヌクレオチド配列の上 流にある第3のNSを含み、第3のNSが非機能的スプライス・ドナー部位を生成する
ことができるものである。 【０４７７】 好ましくは、前記レトロウイルスベクターはさらに第2のNOIを含み、第2のNOI
が機能的スプライス・アクセプター部位の下流にあるものである。 【０４７８】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターは第2のNOIを含み、第2のNOIが
第2のヌクレオチド配列の下流にあるものである。 【０４７９】 好ましくは、前記第2のNOIまたはその発現産物が治療剤または診断剤であるか
またはそれらを含むものである。 【０４８０】 好ましくは、前記第1のNOIまたはその発現産物が、1または複数の選択性を与 える剤(例えばマーカーエレメント)、ウイルスの必須エレメントもしくはその一
部、またはそれらの組み合わせを含むものである。 【０４８１】 好ましくは、前記第1のNSがレトロウイルスプロベクターの3'末端またはその 近傍にあり、好ましくは、この3'末端がU3領域及びR領域を含み、かつ好ましく は、前記第1のNSがU3領域とR領域との間に位置するものである。 【０４８２】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターのU3領域及び／または第1のNS が第3のNOIであるNSを含み、前記NOIが1または複数の転写調節エレメント、コー
ド配列またはその一部であるものである。 【０４８３】 好ましくは、第1のNSはウイルスから得ることができるものである。 【０４８４】 好ましくは、第1のNSはイントロンまたはその一部である。 【０４８５】 好ましくは、前記イントロンは、SV40ウイルスの小形のtイントロンから得る ことができるものである。 【０４８６】 好ましくは、ベクターの構成要素は調節されている。本発明のある好ましい形
態においては、ベクターの構成要素は低酸素状態(hypoxia)により調節されてい る。 【０４８７】 本発明の別の好ましい形態においては、前記ベクターの構成要素が、テトラサ
イクリン・オン／オフ系により調節される。 【０４８８】 このように本発明は、レトロウイルスベクターを利用するデリバリー系を提供
する。 本発明のデリバリー系のレトロウイルスベクターは、第1のNOIに隣接する機能
的スプライス・ドナー部位(FSDS)及び機能的スプライス・アクセプター部位(FSA
S)を含む。このレトロウイルスベクターは、複数のNOIを含み得るレトロウイル スプロベクターの逆転写の結果、形成される。 【０４８９】 FSDSがFSASの上流に位置している場合には、介在配列はスプライシング可能で
ある。一般に、スプライシングにより、介在、即ち「イントロン」RNA配列が除 かれ、残りの「エキソンの」配列が連結して翻訳のための連続した配列が得られ
る。 【０４９０】 このスプライシングプロセスは、図31に図解する。 【０４９１】 この図でYはスプライシングの結果取り除かれる介在配列を表す。 【０４９２】 レトロウイルスベクターの天然のスプライシング形態を図27aに示す。公知の ベクターのスプライシング形態を図27bに示す。本発明によるスプライシング形 態を図27cに示す。 【０４９３】 本発明によれば、FSDSがFSASの下流にある場合にはスプライシングは生じ得な
い。 【０４９４】 同様に、FSDSが非機能的スプライス・ドナー部位(NFSDS)である場合、及び／ またはFSASが非機能的・アクセプター部位(NFAS)である場合には、スプライシン
グは生じ得ない。 【０４９５】 NFSDSの一例としては、スプライシング機構がFSDSを認識できなくなるように 変異したFSDSがある。 【０４９６】 本発明によれば、各NSは、任意の適切なヌクレオチド配列であり得る。例えば
、各配列は独立したDNAまたはRNAであり得、合成により作製されたもの、組換え
DNA技術を用いて作製されたもの、天然の起源から単離されたもの、あるいはこ れらを組み合わせたものであり得る。この配列はセンス配列またはアンチセンス
配列であり得る。また、互いに直接または間接的に連結され得る複数の配列、あ
るいはそれらを組み合わせた複数の配列が存在し得る。 【０４９７】 本発明によれば、各NOIは任意の適切なヌクレオチド配列であり得る。例えば 、各配列は独立したDNAまたはRNAであり得、合成により作製されたもの、組換え
DNA技術を用いて作製されたもの、天然の起源から単離されたもの、あるいはこ れらを組み合わせたものであり得る。この配列はセンス配列またはアンチセンス
配列であり得る。また、互いに直接または間接的に連結され得る複数の配列、あ
るいはそれらを組み合わせた複数の配列が存在し得る。 【０４９８】 第1のNOIは、レトロウイルスベクターにおいて用いることに成功している以下
の選択マーカー、即ちそれぞれG418及びハイグロマイシンに対する耐性を与える
細菌性ネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Pal
merら 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 1055-1059; Yangら 1987 Mol Cell Biol 7
: 3923-3928)、メトトレキセートに対する耐性を与える変異体マウスジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子(dhfr)(Millerら 1985 Mol Cell Biol 5: 431-437)、マイ
コフェノール酸、キサンチン及びアミノプテリンを含む培地での細胞の増殖を可
能とする細菌性gpt遺伝子(Mannら 1983 Cell 33: 153-159)、ヒスチジンを含ま ないがヒスチジノールを含む培地での細胞の増殖を可能とする細菌性hisD遺伝子
(Danos及びMulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 6460-6464)、様々な薬剤に 対する耐性を与える多剤耐性遺伝子(mdr)(Guildら 1988 Proc Natl Acad Sci 85
: 1595-1599; Pastanら1988 Proc Natl Acad Sci 85: 4486-4490)、及びピュー ロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を与える細菌性遺伝子(Morgenste
rn及びLand 1990 Nucleic Acid Res 18: 3587-3596)のなかの1つまたは複数を含
み得る。 【０４９９】 これらのマーカーは全て優性な選択マーカーであり、これらの遺伝子を発現す
る殆どの細胞の化学的選択を可能とする。βガラクトシダーゼもまた強力なマー
カーとみなしうる。βガラクトシダーゼを発現する細胞は、蛍光活性化セルソー
ターを用いて選択することができる。実際、どの細胞表面タンパク質も、そのタ
ンパク質を作っていない細胞に対する選択マーカーとなりうる。該タンパク質を
発現する細胞は、該タンパク質に対する蛍光抗体および細胞選別器を用いて選択
することができる。ベクターに使用されてきた他の選択マーカーにはhprtおよび
HSV チミジンキナーゼが含まれる。これらは、ヒポキサンチン、アメトプテリン
およびチミジンを含む培地における細胞の増殖を可能とするものである。 【０５００】 第１のNOIは、例えばレトロウイルスのパッケージング部位などの非コード配 列、または第２のNOIをプロベクター中で非機能性とする非センス配列であって 、該ベクターのスプライシングによって除去された時には第２のNOIが機能性発 現によって発現される非センス配列を含むことができるであろう。 【０５０１】 第１のNOIはまた、Envタンパク質をコードするenv遺伝子等のウイルスの必須 要素をコードしていてもよく、これは産生系の複雑さを減じることができる。例
えば、アデノウイルスベクターにおいては、これはレトロウイルスベクターゲノ
ムおよびエンベロープが同一プロモーターの制御下にある１つのアデノウイルス
ベクター内に配置されることを可能とし、その結果より単純な系を提供し、かつ
アデノウイルスベクター内に付加的配列を入れるためのより大きいキャパシティ
(capacity)を残す。１つの態様においては、これらの付加的配列はgag-pol カセ
ット自体でありうる。このように、１個のアデノウイルスベクター内にレトロウ
イルスベクター粒子を作製することができるのである。以前の研究(Fengら, 199
7, Nature Biotechnology 15: 866)では、複数のアデノウイルスベクターを使用
しなければならなかった。 【０５０２】 レトロウイルス構成要素がenvヌクレオチド配列を含んでいるならば、場合に より、該配列の全部または一部を、例えば4070Aと称する両種指向性Envタンパク
質、またはインフルエンザ赤血球凝集素(HA)、または水疱性口内炎ウイルスG (V
SV-G) タンパク質等の他のenv核酸配列の全部または一部と置換することができ る。env遺伝子の異種env遺伝子との置換は、擬似タイピング(pseudotyping)と呼
ばれる技法または戦略の１例である。擬似タイピングは新しい現象ではなく、こ
の例はWO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-9
1/00047およびMebatsionら, 1997 Cell 90, 841-847に見いだすことができる。 【０５０３】 １つの好ましい態様においては、本発明のレトロウイルスベクターは擬似タイ
ピング(pseudotyped)されている。このことについて、擬似タイピングは１つ以 上の利点を付与することができる。例えば、これらのベクターを用いた場合、HI
Vに基づくベクターのenv遺伝子産物は、レンチウイルスベクターがCD4と呼ばれ るタンパク質を発現する細胞にのみ感染するように感染を制限するであろう。し
かし、これらのベクター内のenv遺伝子が他のRNAウイルス由来のenv配列に置換 されていたならば、これらのベクターはより広い感染スペクトルを持つことがで
きる(VermaおよびSomia, 1997, Nature 389:239-242)。例えば、研究者はVSV由 来の糖タンパク質を用いてHIVに基づくベクターを擬似タイピングした(Vermaお よびSomia, 1997, 同じ箇所）。 【０５０４】 さらに別の態様においては、Envタンパク質は突然変異した、または工学的に 作製されたEnvタンパク質、等の改変Envタンパク質であってよい。改変はターゲ
ッティング能力を導入するように、または毒性を減少させるように、または他の
目的のために実施または選択することができる(Valsesia-Wittmanら，1996, J.
Virol 70: 2056-64; Nilsonら，1996, Gene Therapy 3: 280-6; Fieldingら，19
98, Blood 9: 1802およびそこに引用されている文献）。 【０５０５】 適切な第２のNOIコード配列は、治療用および／または診断用のコード配列を 含む。これらの配列には、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、工学的
に作製された免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫
共刺激(co-stimulatory)分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA、標的タンパク 質のトランスドミナント(transdominant)陰性突然変異体、毒素、条件付き毒素 、抗原、腫瘍抑制タンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパ
ク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびそれらの
誘導体（例えば、関連するリポーターグループを伴うもの）をコードする配列が
含まれるが、それらだけに限定されない。第２のNOIに含まれる場合、このよう なコード配列は典型的には適切なプロモーターに機能しうる形で連結されること
ができる。このプロモーターは、リボザイムの発現を駆動するプロモーター、ま
たは異なる１もしくは複数のプロモーターであってよい。 【０５０６】 第２のNOIコード配列は、融合タンパク質、またはコード配列の１セグメント をコードするものであってよい。 【０５０７】 本発明のレトロウイルスベクターは、癌の治療のため、プロドラッグ活性化酵
素等の第２のNOIを腫瘍部位に送達するために用いることができる。各症例にお いて、個体（患者など）の治療に適切なプロドラッグが適切なプロドラッグ活性
化酵素と組み合わせて用いられる。適切なプロドラッグがベクターと共に投与さ
れる。プロドラッグの例は、リン酸エトポシド（アルカリ性フォスファターゼと
共に、Senterら，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-フルオロ シトシン（シトシンデアミナーゼと共に、Mullenら，1994, Cancer Res 54: 150
3-1506); ドキソルビシン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン
-V-アミダーゼと共に、Kerrら，1990, Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-2
06); パラ-N-ビス(2-クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキ シペプチダーゼG2と共に）；セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバ
メート（βラクタマーゼと共に）；SR4233 (P450レダクターゼと共に）；ガンシ
クロビル（HSV チミジンキナーゼと共に、Borrelliら，1988, Proc. Natl. Acad
. Sci. 85: 7572-7576); マスタードプロドラッグ（ニトロレダクターゼと共に
、Friedlosら，1997, J. Med. Chem. 40: 1270-1275)およびシクロホスファミド
(P450 と共に、Chenら，1996, Cancer Res. 56:1331-1340)を含む。 【０５０８】 本発明のベクターは、ウイルス性または非ウイルス性ベクターによって標的部
位に送達することができる。 当技術分野で周知のように、ベクターとはある実在物を１つの環境から他の環
境へ運ぶことを可能とする、または容易にする道具である。例えば、遺伝子組換
え技法に用いられているいくつかのベクターは、DNAの１セグメント（異種DNAセ
グメント、異種cDNAセグメント、等）が標的細胞中に導入されることを可能とす
る。場合により、いったん標的細胞に入った後、ベクターは該細胞内で異種DNA を維持するのに役立ちうる。またはDNA複製の単位として作用しうる。遺伝子組 換え技法に用いられているベクターの例は、プラスミド、染色体、人工染色体ま
たはウイルスを含む。 【０５０９】 非ウイルス性送達系はDNAトランスフェクション法を含むが、これだけに限定 されない。本発明においては、トランスフェクションは、遺伝子を標的哺乳動物
細胞に送達するために非ウイルス性ベクターを用いる方法を含む。 【０５１０】 典型的なトランスフェクション法はエレクトロポレーション、DNAバイオリス ティクス法（biolistics）、脂質媒介トランスフェクション、コンパクト化(com
pacted) DNA媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポ フェクチン、カチオン性作用物質媒介トランスフェクション、カチオン性表面両
親媒性物質(CFA)(Nature Biotechnology, 1996, 14:556) およびこれらの組合せ
を含む。 【０５１１】 ウイルス性送達系は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AVV)ベ クター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルス
ベクター、バキュロウイルスベクターを含むが、これらだけに限定されない。ベ
クターの他の例は、ex vivo 送達系を含む。これらの系はエレクトロポレーショ
ン、DNAバイオリスティクス法（biolistics）、脂質媒介トランスフェクション 、コンパクト化DNA媒介トランスフェクション等のDNAトランスフェクション法を
含むが、これらだけに限定されない。 【０５１２】 本発明のベクター送達系は、二次ベクターをin vivoで作製するのに必要な遺 伝子をコードする、in vitroで作製された一次ベクターから成ることができる。 一次ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイル
スまたはポックスウイルスベクター等の種々の異なるウイルスベクターであって
よい。または、一次ウイルスベクターが複数である場合は、起源を異にするウイ
ルスベクターの混合物であってよい。いずれの場合にも、好ましくは、一次ウイ
ルスベクターは独立複製が不可能であるという点で欠陥性である。したがって、
それらは標的細胞に入ってそこに二次ベクター配列を送達することはできるが、
複製してさらなる標的細胞に感染を続行することはできない。 【０５１３】 ハイブリッドウイルスベクター系が二次ベクターをコードする２個以上の一次
ベクターを含む場合は、一次標的細胞集団をトランスフェクションまたは形質導
入するのに一次ベクターの両方または３個全部が、通常は同時に用いられる。 【０５１４】 好ましくは、二次ウイルスベクターの全ての構成要素をコードする１個の一次
ウイルスベクターが存在する。 【０５１５】 好ましい１または複数の一次ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであ
る。 本発明に用いるアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス由来であって
も、または通常ヒトに感染しないアデノウイルスに由来するものであってもよい
。好ましくは、上記ベクターはアデノウイルス２型もしくは５型（Ad2またはAd5
)、またはマウスアデノウイルス、またはCELOウイルス(Cottonら，1993, J. Vir
ol 67: 3777-3785) 等のトリアデノウイルスに由来するものである。上記ベクタ
ーは複製能のあるアデノウイルスベクターであってよいが、より好ましくは欠陥
アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは該ウイルスの複製に
必要な１以上の構成要素を欠失させることによって欠陥ウイルスとすることがで
きる。典型的には、各アデノウイルスベクターはE1領域に少なくとも１つの欠失
を含む。感染性アデノウイルスベクター粒子を作製するためには、E1遺伝子を含
むAd5 左部分のコピーが組み込まれたヒト胚繊維芽細胞系（ヒト293細胞系など ）中でウイルスを継代(passage)させることによって上記欠失を補完することが できる。異種DNAをこのようなベクターに挿入するためのキャパシティは、約7 k
bまである。したがって、このようなベクターは、それぞれがレトロウイルス二 次ベクターの構築に必須な転写ユニットの１つを含む３個の個々の組換えベクタ
ーからなる本発明の系を構築するのに有用である。 【０５１６】 他のアデノウイルス遺伝子にさらなる欠失を有する別のアデノウイルスベクタ
ーが当技術分野で公知であり、これらのベクターもまた本発明に用いるのに適切
である。これらの第二世代アデノウイルスベクターのいくつかは、免疫原性の低
下を示す（例えば、E1 + E2 欠失、Gorzigliaら，1996, J. Virol. 70: 4173-41
78; E1 + E4欠失、Yehら，1996, J. Virol. 70: 559-565)。欠失の拡大は、ベク
ターに複数の遺伝子を導入するための付加的なクローニングキャパシティを提供
するのに役立つ。例えば、25 kbの欠失が記述されており(Lieberら，1996, J. V
irol. 70: 8944-8960)、また35 kbを超える異種DNAの導入を可能とする、全ウイ
ルス遺伝子を欠失させたクローニングベクターが報告されている(Fisher ら，19
96, Virology 217: 11-22)。このようなベクターを用いて、レトロウイルス二次
ベクターを構築するための２または３個の転写ユニットをコードする本発明のア
デノウイルス一次ベクターを作製することができる。 【０５１７】 二次ウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスベクターである。二次ベク
ターは、欠陥ウイルスベクター粒子の一次標的細胞内におけるアセンブリーおよ
びパッケージングに必須の遺伝子の発現によって生成される。それは独立複製が
不可能であるという点で欠陥性である。したがって、二次レトロウイルスベクタ
ーはいったん二次標的細胞を形質導入したのち、複製によってさらなる標的細胞
に広がっていくことはできない。 【０５１８】 「レトロウイルスベクター」という用語は、典型的には、感染可能であるがそ
れ自身では複製できないレトロウイルス核酸を含む。したがってレトロウイルス
ベクターは複製に欠陥がある。典型的には、レトロウイルスベクターは標的細胞
に送達すべき、好ましくは非レトロウイルス起源の１つ以上のNOIを含む。レト ロウイルスベクターはまた、機能性スプライス・ドナー部位(FSDS)が機能性スプ
ライス・アクセプター部位(FSAS)の上流にある場合、任意の介在配列がスプライ
シングされうるように、FSDSおよびFSASを含むことができる。レトロウイルスベ
クターはさらに、非レトロウイルス性配列を含むことができる。例えば、レトロ
ウイルスベクターがプロウイルスとして標的細胞中にいったん組み込まれたなら
ば、NOIの発現に影響を及ぼすことができるU3領域内の非レトロウイルス性制御 配列などである。レトロウイルスベクターはただ１つのレトロウイルスに由来す
る要素を含む必要はない。したがって、本発明によれば、レトロウイルスベクタ
ーは２つ以上の異なるレトロウイルスまたは他の供給源から誘導しうる要素をも
つことが可能である。 【０５１９】 「レトロウイルスプロベクター」という用語は、典型的には、上に記述するレ
トロウイルスベクターゲノムであるが、機能性スプライス・ドナー部位(FSDS)を
もたらすことができる第１の核酸配列(NS)および機能性スプライス・アクセプタ
ー部位(FSAS)をもたらすことができる第２のNSを含む該ゲノムを含む。ここで、
第１のNSおよび第２のNSに関連するスプライシングが起こり得ないように、第１
のNSは第２のNSの下流にある。レトロウイルスプロベクターが逆転写されると、
レトロウイルスベクターが形成される。 【０５２０】 「レトロウイルスベクター粒子」という用語は、パッケージされたレトロウイ
ルスベクターを意味し、これは好ましくは標的細胞に結合し、そこに入ることが
可能である。ベクターの所ですでに論じたように、この粒子の構成要素は、野生
型レトロウイルスに関しては改変してもよい。例えば、該粒子のタンパク質性外
被中のEnvタンパク質を、それらタンパク質のターゲッティング特性を変更する ため、または他の所望の機能を達成するため、遺伝子的に改変することができる
。 【０５２１】 本発明のこの態様のレトロウイルスベクターは、MMLV、MSVまたはMMTV等のマ ウスオンコレトロウイルスから誘導することができる；または、HIV-1、EIAV等 のレンチウイルスから誘導することができる；または、別のレトロウイルスから
誘導することができる。 【０５２２】 本発明のレトロウイルスベクターを改変して、レトロウイルスの天然のスプラ
イス・ドナー部位を非機能性にすることができる。 「改変」という用語は、天然のスプライス・ドナー部位をサイレント化させる
、つまり除去することを含む。スプライス・ドナー部位を除去したベクター、例
えばMLVに基づくベクター等が当技術分野で公知である。そのようなベクターの １例はpBABE (Morgensternら, 1990, 同じ箇所）である。 【０５２３】 二次ベクターは、一次ベクターのDNA中にコードされている、レトロウイルス ベクター作製に必須の遺伝子の発現によって作製することができる。そのような
遺伝子は、レトロウイルス由来のgag-pol 遺伝子、エンベロープを有するウイル
ス(enveloped virus)由来のenv遺伝子、および１つ以上の治療用または診断用NO
Iを含む欠陥性レトロウイルスベクターを含むことができる。この欠陥性レトロ ウイルスベクターは一般に、逆転写を可能とする配列、5'長末端反復(LTR)の少 なくとも一部、3'LTR の少なくとも一部、およびパッケージングシグナルを含む
。 【０５２４】 二次ベクターを複製欠陥ベクターとしたい場合は、該二次ベクターを複数の転
写ユニットによってコードすることができる。そしてこれらのユニットは１個ま
たは２個以上のアデノウイルス一次ベクターまたは他の一次ベクター中に配置す
ることができる。したがって、二次ベクターゲノムをコードする転写ユニット、
gag-pol遺伝子をコードする転写ユニットおよびenv遺伝子をコードする転写ユニ
ットが存在する。または、これらのうち２個以上を組み合わせることができる。
例えば、gag-pol遺伝子およびenv遺伝子、またはenv遺伝子および上記ゲノムを コードする核酸配列を１個の転写ユニット中に組み合わせることができる。これ
を達成する方法は当技術分野で公知である。 【０５２５】 本明細書に記述する転写ユニットとは、コード配列および該コード配列の他の
コード配列とは独立した発現を達成するためのシグナルを含む核酸の領域である
。したがって、各転写ユニットは一般に少なくとも、プロモーター、エンハンサ
ーおよびポリアデニル化シグナルを含む。 【０５２６】 「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味（例えば、Jacob-Mo
nodの遺伝子発現理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位）において用いられる。 「エンハンサー」という用語は、転写開始複合体の他のタンパク質構成要素に
結合し、その結果、関連するプロモーターによって指令される転写の開始を容易
にするDNA配列を含む。 【０５２７】 二次ベクターをコードする転写ユニットのプロモーターおよびエンハンサーは
、二次ウイルスベクター作製条件下の一次標的細胞中で、好ましくは強力に活性
であるか、または強く誘導されることが可能である。プロモーターおよび／また
はエンハンサーは構成的に効果的なものであるか、またはその活性が組織によっ
て、もしくは時間的に制限されているものであってよい。組織によって制限され
る適切なプロモーター／エンハンサーの例は、MUC1遺伝子、CEA遺伝子または5T4
抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー等、腫瘍細胞中で高度に活性なプ
ロモーター／エンハンサーである。時間的に制限されているプロモーター／エン
ハンサーの例は、低酸素応答エレメントまたはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロ
モーター／エンハンサー等、虚血および／または低酸素に応答するプロモーター
／エンハンサーである。好ましいプロモーター-エンハンサーの組合せの１例は 、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要前初期(MIE)プロモーター／エンハンサ ーの組合せである。 【０５２８】 他の好ましい付加的構成要素は、１または複数のNOIの効率的な発現を可能と する実在物を含む。 【０５２９】 本発明の１つの好ましい態様においては、二次ベクター構成要素の発現は低酸
素または虚血によって調節される。これに関連して、低酸素は広い範囲の異なる
細胞型において遺伝子発現の強力なレギュレーターであり、そして例えば低酸素
誘導性因子１(HIF-1; WangおよびSemenza, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:4
30)等の低酸素が誘導する転写因子の活性の誘導によって作用する。該転写因子 は種々の遺伝子プロモーター上の対応するDNA認識部位、すなわち低酸素応答エ レメント(HRE) に結合する。Dachsら(1997, Nature Med. 5:515)は、マウスのホ
スホグリセレートキナーゼ１（PGK-1)遺伝子（Firthら，1994 Proc. Natl. Acad
. Sci. 91:6496-6500)由来のHREの多量体形態を用いて、ヒト繊維肉腫細胞によ る低酸素に応答したマーカーおよび治療遺伝子の両方のin vitro発現および該腫
瘍内におけるin vivo発現を調節した（Dachsら、同書）。または、腫瘍の虚血性
領域には顕著なグルコース剥奪も存在するという事実を利用して、異種遺伝子発
現を腫瘍中で特異的に活性化することができる。grp78 遺伝子プロモーターの末
端切断型632塩基対配列（これはグルコース剥奪によって特異的に活性化される ことが公知である）もまた、マウス腫瘍においてin vivoでリポーター遺伝子の 高レベル発現を駆動し得ることが示された（Gazitら，1995, Cancer Res. 55:16
60)。 【０５３０】 このような構成要素の発現を調節する別の方法は、GossenおよびBujard (1992
, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547) が記述するテトラサイクリンオン／オフ系
を、Yoshidaら(1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426)がレトロウイル
スgal、polおよびVSV-G タンパク質の作製について記述しているように用いるこ
とである。通常、この調節系は本発明においてもプロベクターゲノムの作製を制
御するために使用されている。この系は、テトラサイクリンの不在下ではアデノ
ウイルスベクターからベクター構成要素が全く発現されないことを保証する。 【０５３１】 ハイブリッドウイルスベクター系に組み込むことができる安全性特徴を以下に
記述する。１以上のそのような特徴が存在しうる。 【０５３２】 二次ベクターは、独立複製が可能な感染性ウイルスが生じるような組換えの可
能性を排除する１以上の特徴がそこに組み込まれているという点で、in vivoに おける使用についても有利である。そのような特徴は以前に刊行された研究には
含まれていなかった（Fengら, 1997, 同書）。特に、以下に記述する３つの構成
要素からなるレトロウイルスベクターの構築は、Fengら（同書）には記載されて
いない。 【０５３３】 第１に、相同領域を欠失させることによって、二次ベクターの構成要素をコー
ドする配列間の配列相同性を回避することができる。相同領域は遺伝子の組換え
を引き起こす。特定の実施形態においては、二次レトロウイルスベクターを構築
するのに３個の転写ユニットが用いられる。第１の転写ユニットは、非レトロウ
イルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-po
l遺伝子を含む。第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよ びエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。天然のレトロウイルスゲノムにおいては、
パッケージングシグナルは、適切に機能するためにはgag配列の一部を必要とす るように配置されている。レトロウイルスベクター系を天然のレトロウイルスか
ら構築する場合、通常、パッケージングシグナル（gag遺伝子の一部を含む）は ベクターゲノム中に残る。しかし、本発明においては上記欠陥性レトロウイルス
ゲノムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限の パッケージングシグナルを含む。また、例えばモロニーマウス白血病ウイルス(M
MLV)などのレトロウイルスにおいては、polコード配列の3'末端とenvコード配列
の5'末端の間にはオーバーラップする小さい領域がある。第１および第２転写ユ
ニットの間のこれに対応する相同領域は、polコード配列の3'末端またはenvコー
ド配列の5'末端を、コドン使用法を変えるがコードされたタンパク質のアミノ酸
配列を変えないように変更することによって除去することができる。 【０５３４】 第２に、envおよびgag-pol構成要素の間の相同領域が回避されるように、レト
ロウイルスゲノムを別のレトロウイルスまたはエンベロープを有する別のウイル
スのEnvタンパク質を用いて擬似タイピングすることによって、複製可能な二次 ウイルスベクターの可能性を回避することができる。 【０５３５】 特定の実施形態においては、レトロウイルスベクターは以下の３つの構成要素
から構築される。すなわち、第１の転写ユニットは非レトロウイルス性プロモー
ターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-pol遺伝子を含む。 第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの
制御下にある、エンベロープを有する別のウイルス由来のenv遺伝子を含む。第 ３の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制
御下にある欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。上記欠陥性レトロウイルスゲノ
ムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限のパッ ケージングシグナルを含む。 【０５３６】 第３に、特定の方法で構築した２つの転写ユニットを用いることによって、複
製可能なレトロウイルスの可能性を排除することができる。第１の転写ユニット
は、一次標的細胞中で活性なプロモーター-エンハンサー（例えば、hCMVプロモ ーター-エンハンサーまたは組織に限定されるプロモーター-エンハンサー）の制
御下にあるgag-polコード領域を含む。第２の転写ユニットは、レトロウイルス 粒子中にパッケージングされうるレトロウイルスゲノムRNAをコードする。第２ の転写ユニットはパッケージング、組み込みおよび逆転写に必要なレトロウイル
ス配列を含み、かつまたエンベロープを有するウイルスのEnvタンパク質をコー ドする配列および１以上の治療遺伝子をコードする配列を含む。 【０５３７】 この例においては、envおよびNOIコード配列の転写は、Envタンパク質が一次 標的細胞で優先的に産生され、他方NOI発現産物は二次標的細胞中で優先的に産 生されるように工夫されている。 【０５３８】 適切なイントロンスプライシング配置を実施例５に後述し、また図17および27
cに示す。本発明においては、一次ベクターによって一次標的細胞に送達される レトロウイルスゲノム配列中で、スプライス・ドナー部位はスプライス・アクセ
プター部位の下流に位置する。したがって、一次標的細胞においてはスプライシ
ングは起こらないか、または低頻度でしか起こらず、そしてEnvタンパク質が優 先的に発現される。しかし、いったんベクターゲノムが逆転写および二次標的細
胞への組み込みというプロセスを経たならば、機能性スプライス・ドナー配列が
5'LTRに、すなわち、機能性スプライス・アクセプター配列の上流に位置する。 スプライシングが起こってenv配列が切除され、NOIの転写産物が産生される。 【０５３９】 この例の第２の配置においては、下記のようにNOIの発現は二次標的細胞に限 定され、一次標的細胞で発現されることを阻止されている。この配置を実施例６
に後述し、また図18に示す。ここでは、プロモーター-エンハンサー、コード配 列の5'末端を含むNOIの第１断片、および天然の、または人工的に誘導した、も しくは誘導可能なスプライス・ドナー配列が、レトロウイルスゲノム構築物の3'
末端に、Ｒ領域の上流に挿入されている。コード領域を完成させるのに必要な全
ての配列を含むNOIの第２断片は、上記レトロウイルスゲノム構築物中でパッケ ージングシグナルの下流に位置する天然の、または人工的に誘導した、もしくは
誘導可能なスプライス・アクセプター配列の下流に配置されている。逆転写およ
びレトロウイルスゲノムの二次標的細胞への組み込みの結果、プロモーター、NO
Iの5'断片および機能性スプライス・ドナー配列は、機能性スプライス・アクセ プター配列およびNOIの3'末端の上流に位置する。次に、プロモーターからの転 写およびスプライシングが二次標的細胞中でNOIの翻訳を可能とする。 【０５４０】 好ましい実施形態においては、本発明のハイブリッドウイルスベクター系はレ
トロウイルス二次ベクターをコードする１または複数のアデノウイルス一次ベク
ターから成る。 【０５４１】 本発明の好ましい実施形態は、アデノウイルスおよび他のウイルスベクターに
付随する主要な問題の１つ、すなわち、そのようなベクターからの遺伝子発現は
一過性であるという問題と取り組んでいる。一次標的細胞から生成されるレトロ
ウイルス粒子は二次標的細胞の形質導入を達成することができ、そしてレトロウ
イルスベクターゲノムの宿主細胞ゲノムへの組み込みにより、二次標的細胞にお
ける遺伝子発現は安定に維持される。二次標的細胞は重大な量のウイルスタンパ
ク質抗原を発現することはなく、したがってアデノウイルスベクターによって形
質導入された細胞よりも免疫原性が低い。 【０５４２】 レトロウイルスベクターを二次ベクターとして使用することは有利である。な
ぜなら、それは例えば急速に分裂する細胞を標的にすることを可能とすることに
よって、ある程度細胞の区別を可能とするからである。さらに、レトロウイルス
の組み込みは、増殖する標的細胞における安定な発現を含めて、標的組織中にお
ける治療遺伝子の安定な発現を可能とする。 【０５４３】 本発明の新規なレトロウイルスベクター設計を使用することは、遺伝子発現を
一次または二次標的部位に限定できるという点でも有利である。この方法におい
ては、１または複数のNOIを二次標的部位で優先的に発現させることができ、ま た一次標的部位では少ししか発現させないか、あるいは生物学的に有意なレベル
で発現させないことができる。その結果、NOIの考えうる毒性または抗原性を回 避することができる。 【０５４４】 好ましくは、一次ウイルスベクターは特定の１または複数の細胞型の形質導入
を優先的に行う。 より好ましくは、一次ベクターは特定の細胞を標的とするように、天然のウイ
ルスと較べて変更された組織親和性をもつ標的設定されたベクターである。 【０５４５】 「標的設定されたベクター」という用語は、必ずしも「標的部位」または「標
的細胞」という用語と結びついているわけではない。 【０５４６】 「標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクターがト
ランスフェクションまたは形質導入できる部位をいう。 「一次標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第１の部位をいう。 「二次標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第２の部位をいう。 【０５４７】 「標的細胞」とは、単に、天然のものであれ標的設定されたものであれベクタ
ーがトランスフェクションまたは形質導入できる細胞をいう。 「一次標的細胞」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第１の細胞をいう。 「二次標的細胞」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第２の細胞をいう。 【０５４８】 本発明による好ましいアデノウイルス一次ベクターもまた、好ましくは、組織
親和性が野生型アデノウイルスの組織親和性から変更されている標的設定された
ベクターである。アデノウイルスベクターを改変して、例えば以下の文献に記載
されているような標的設定されたアデノウイルスベクターを作製することができ
る。すなわち、Krasnykhら，1996, J. Virol. 70: 6839-6846; Wickhamら，1996
, J. Virol. 70: 6831-6838; Stevensonら，1997, J. Virol. 71: 4782-4790; W
ickhamら，1995, Gene Therapy 2: 750-756; Douglasら，1997, Neuromuscul. D
isord. 7:284-298; Wickhamら，1996, Nature Biotechnology 14: 1570-1573で ある。 【０５４９】 本発明のベクター系の一次標的細胞は、造血細胞（単球、マクロファージ、リ
ンパ球、顆粒球、またはこれらの前駆細胞を含む）；内皮細胞；腫瘍細胞；間質
細胞；星状細胞または神経膠細胞；筋肉細胞；および上皮細胞を含む。 したがって、二次ウイルスベクターを生成することができる本発明の一次標的
細胞は、上記の細胞型のうち任意のものであってよい。 【０５５０】 好ましい実施形態においては、本発明による一次標的細胞は、レトロウイルス
gag-pol遺伝子のための第１の転写ユニットおよびパッケージング可能な欠陥性 レトロウイルスゲノムを生成することができる第２の転写ユニットを含む欠陥性
アデノウイルスベクターによって形質導入された単球またはマクロファージであ
る。この場合、少なくとも第２の転写ユニットは好ましくは、身体内の病態部位
、例えば虚血性部位または固形腫瘍の微小環境、等において優先的に活性なプロ
モーター-エンハンサーの制御下にある。 【０５５１】 特に好ましい実施形態においては、第２の転写ユニットは、ゲノムが二次標的
細胞に挿入されると、ウイルスの必須エレメント（ウイルスenv遺伝子など）の 発現を減少させ、かつ治療用および／または診断用NOIの効率的発現を可能とす るのに役立つイントロンが生成されるように構築される。 【０５５２】 パッケージング細胞は、治療すべき個体の身体内のin vivoパッケージング細 胞であってもよいし、または組織培養細胞系などのin vitroで培養された細胞で
あってよい。適切な細胞系はマウス繊維芽細胞由来細胞系またはヒト細胞系、等
の哺乳動物細胞を含む。好ましくは、パッケージング細胞系は、例えばHEK293、
293-T、TE671、HT1080等のヒト細胞系である。 【０５５３】 または、パッケージング細胞は治療すべき個体に由来する細胞、例えば単球、
マクロファージ、血液細胞または繊維芽細胞、等であってもよい。細胞を個体か
ら単離し、パッケージングおよびベクター構成要素をex vivoで投与し、次にこ の自己由来のパッケージング細胞を再投与することができる。または、上記パッ
ケージングおよびベクター構成要素をパッケージング細胞にin vivoで投与する ことができる。レトロウイルスパッケージングおよびベクター構成要素を個体の
細胞に導入する方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つの方法は、レト
ロウイルスベクター粒子を作製するのに必要な異なるDNA配列、例えばenvコード
配列、gag-polコード配列および欠陥性レトロウイルスゲノムを一過性三重トラ ンスフェクションによって同時に細胞に導入するものである(LandauおよびLittm
an, 1992, J. Virol. 66, 5110; Soneokaら，1995, Nucleic Acids Res. 23: 62
8-633)。 【０５５４】 二次ウイルスベクターもまた標的設定されたベクターであることができる。レ
トロウイルスベクターについては、これはEnvタンパク質を改変することによっ て達成できる。レトロウイルス二次ベクターのEnvタンパク質は、非毒性エンベ ロープであるか、または一次標的細胞内で非毒性量産生されるエンベロープ、例
えば、MMLV両種指向性エンベロープまたは改変された両種指向性エンベロープ、
等である必要がある。このような場合の安全性特徴は、好ましくは、レトロウイ
ルス構成要素間の領域または配列相同性の欠失である。 【０５５５】 好ましくは、エンベロープはヒト細胞の形質導入を可能とするエンベロープで
ある。適切なenv遺伝子の例は、VSV-G、4070A env等のMLV 両種指向性env、RD11
4 ネコ白血病ウイルスenvまたはインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素(HA
)遺伝子を含むが、これらだけに限定されない。Envタンパク質は、限定された数
のヒト細胞型の上に存在する受容体に結合可能なタンパク質であってよく、これ
はターゲッティング部分を含む工学的に作製されたエンベロープであってよい。
envおよびgag-polコード配列は、選択されたパッケージング細胞系中で活性なプ
ロモーターおよび場合によりエンハンサーから転写される。そして、転写ユニッ
トはポリアデニル化シグナルによって終了する。例えば、パッケージング細胞が
ヒト細胞である場合、適切なプロモーター-エンハンサーの組合せはヒトサイト メガロウイルス主要前初期(hCMV-MIE)遺伝子由来のものであり、SV40ウイルス由
来のポリアデニル化シグナルを用いることができる。他の適切なプロモーターお
よびポリアデニル化シグナルも当技術分野で公知である。 【０５５６】 二次標的細胞集団は、一次標的細胞集団と同一であってよい。例えば、本発明
の一次ベクターを腫瘍細胞へ送達することは、さらなるベクター粒子の複製およ
び生成をもたらし、これらの粒子はさらなる腫瘍細胞を形質導入することができ
る。 【０５５７】 または、二次標的細胞集団は一次標的細胞集団と異なっていてもよい。この場
合、一次標的細胞は治療を受けた個体の体内における内在性工場の役割を果たし
て、二次標的細胞を形質導入することができるさらなるベクター粒子を生成する
。例えば、一次標的細胞集団は一次ベクターによってin vivoまたはex vivoで形
質導入された造血細胞であってよい。次に、この一次標的細胞は身体内の部位、
例えば腫瘍などに送達されるか、またはそこへ移動し、二次ベクター粒子を生成
する。この粒子は、例えば、固形腫瘍内の有糸分裂的に活性な腫瘍細胞を形質導
入することができる。 【０５５８】 本発明によるレトロウイルスベクター粒子はまた、ゆっくりと分裂する、そし
てMLV等の非レンチウイルスでは効率的に形質導入できない細胞も形質導入する ことができる。ゆっくりと分裂する細胞は、ある種の腫瘍細胞を含めて、約３〜
４日ごとに１回分裂する。腫瘍は急速に分裂する細胞を含むが、ある腫瘍細胞、
特に腫瘍の中心に存在する細胞は、たまにしか分裂しない。または、標的細胞は
細胞分裂をすることができる、増殖を抑制された細胞（例えば腫瘍塊の中心部に
位置する細胞、等）または幹細胞（例えば造血幹細胞またはCD34陽性細胞、等）
であってよい。さらにまた、標的細胞は単球前駆体、CD33陽性細胞、または骨髄
系細胞前駆体、等の分化細胞の前駆体であってよい。さらにまた、標的細胞は神
経細胞、星状細胞、神経膠細胞、小神経膠細胞、マクロファージ、単球、上皮細
胞、内皮細胞、肝細胞、精母細胞、精子細胞、または精子などの分化細胞であっ
てよい。標的細胞はヒト個体から単離した後in vitroで形質導入してもよいし、
またはin vivoで直接形質導入してもよい。 【０５５９】 本発明は、治療用タンパク質の作用が必要とされる部位またはその近傍におい
て高力価の欠陥性レトロウイルスベクター粒子の局在化したin vivo生成を可能 とし、その結果、二次標的細胞の効率的形質導入を達成する。これは欠陥性アデ
ノウイルスベクターまたは欠陥性レトロウイルスベクターを単独で用いるよりも
一層効率的である。 【０５６０】 本発明はまた、分裂しない細胞およびゆっくりと分裂する細胞中におけるレト
ロウイルスベクター、例えばMMLVに基づくベクター等のin vivo生成を可能とす る。これまで、MMLVに基づくレトロウイルスベクターを生成することは急速に分
裂する細胞、例えばin vitroで増殖する、組織培養に適合させた細胞、またはin
vivoで急速に分裂する腫瘍細胞、等においてのみ可能であった。レトロウイル スベクターを生成することができる細胞型の拡大は、固形腫瘍の細胞（その多く
はゆっくりと分裂する）に遺伝子を送達するうえで、また内皮細胞や種々の造血
系統細胞等の非分裂細胞を治療用タンパク質産物の内在性工場として使用するう
えで、有利である。 【０５６１】 本発明のベクター系による１以上の治療遺伝子の送達は、単独で用いることも
、または他の治療もしくは治療構成要素と組み合わせて用いることもできる。 【０５６２】 例えば、本発明のレトロウイルスベクターを用いて、WO-A-98/05635にリスト アップされた障害の治療に有用な１以上のNOIを送達することができる。参照を 容易にするため、該リストの一部をここに掲げる：癌、炎症または炎症性疾患、
皮膚科学的障害、熱、心臓血管作用、出血、血液凝固および急性期応答、悪液質
、食欲不振、急性感染、HIV感染、ショック状態、移植片体宿主反応、自己免疫 疾患、再灌流傷害、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍の増
殖、浸潤および拡大、血管新生、転移、悪性腹水および悪性胸膜滲出；脳虚血、
虚血性心臓疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、喘息、多発
硬化、神経退化、アルツハイマー病、アテローム硬化、卒中、脈管炎、クローン
(Crohn)病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢 性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰、網膜症および外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性
結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテ
ローム硬化または内部硬化(endosclerosis)。 【０５６３】 さらに、あるいは上記の代わりに、本発明のレトロウイルスベクターを用いて
、WO-A-98/07859にリストアップされている障害の治療に有用な１以上のNOIを送
達することができる。参照を容易にするため、該リストの一部をここに掲げる：
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば
、ヒト免疫不全ウイルスの感染を含む免疫不全の治療；リンパ球増殖の調節；癌
および多数の自己免疫疾患の治療；および移植片拒絶の阻止または腫瘍免疫の誘
導のため）；造血の調節、例えば、骨髄系またはリンパ系疾患の治療など；例え
ば、傷の治癒、火傷、潰瘍および歯周疾患および神経退化の治療、などのための
骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の増殖促進；卵胞刺激ホルモンの抑制または
活性化（受胎能の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、特定の細胞型を
損傷または感染部位に移動させるため）；うっ血性および血栓崩壊性活性（例え
ば、血友病および卒中の治療のため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック
またはクローン病の治療のため）；抗菌剤として；代謝または行動の変調剤；鎮
痛薬として；特定の欠乏障害の治療；ヒトまたは獣医学における例えば乾癬の治
療。 【０５６４】 さらに、あるいは上記の代わりに、本発明のレトロウイルスベクターを用い
て、WO-A-98/09985にリストアップされている障害の治療に有用な１以上のNOIを
送達することができる。参照を容易にするため、該リストの一部をここに掲げる
：マクロファージ阻害および／またはＴ細胞阻害活性およびその結果としての抗
炎症活性；抗免疫活性、すなわち、細胞性および／または体液性免疫応答（炎症
を伴わない応答を含む）に対する抑制作用；マクロファージおよびＴ細胞の細胞
外マトリックスおよびフィブロネクチンに付着する能力、ならびにＴ細胞におけ
るアップレギュレーションされたfas受容体発現の阻害；望ましくない免疫応答 および関節炎（慢性関節リウマチを含む）を含む炎症、過敏症、アレルギー性反
応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に
関連する炎症、アテローム硬化、動脈硬化、アテローム硬化性心臓疾患、再灌流
傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患
に関連する炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他の消化管の疾患、肝繊維症
、肝硬変または他の肝臓疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他
の腎臓および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎または他の皮膚
疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣精巣上体炎、不妊症、精
巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子
癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症関連産婦人科疾患、後部ブドウ
膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜
炎、視神経炎、眼内炎症、例えば、網膜炎または嚢胞状黄斑浮腫、交感性眼炎、
強膜炎、色素性網膜炎に関連する炎症、変性眼底疾患の免疫および炎症構成要素
、眼外傷、感染によって引き起こされる眼の炎症、増殖性ガラス体網膜症、急性
虚血性眼ニューロパシー、過剰瘢痕（例えば、緑内障濾過手術後の）の炎症構成
要素、眼移植に対する免疫および／または炎症反応ならびに他の免疫および炎症
関連眼疾患、中枢神経系(CNS)もしくは他の器官における免疫および／または炎 症の抑制が有益と思われる自己免疫疾患または異常または障害に関連する炎症、
パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用
、AIDS関連痴呆症候群、HIV関連脳障害、ドヴィック(Devic) 病、シドナム(Syde
nham)舞踏病、アルツハイマー病および他の退行性疾患、CNSの症状または障害に
関連する炎症、卒中、ポリオ後症の炎症構成要素、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜
急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性ニューロパシー、亜急性ニューロパシー、慢
性ニューロパシー、ギラン-バレー(Guillain-Barre)症候群、シドナム舞踏病、 重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化の免疫お
よび炎症構成要素、CNS圧迫またはCNS外傷またはCNS感染の炎症構成要素、筋萎 縮およびジストロフィーの炎症構成要素、ならびに中枢および末梢神経系の免疫
および炎症関連疾患、症状または障害、外傷後炎症、敗血症ショック、感染性疾
患、外科手術、骨髄移植の炎症性合併症または副作用、または他の移植合併症お
よび／または副作用、遺伝子療法の炎症性および／または免疫合併症および副作
用（例えば、ウイルス担体の感染によるものなど）、またはAIDSに関連する炎症
の抑制；体液性および／または細胞性免疫応答の抑制または阻害；単球またはリ
ンパ球の量を減らすことによる単球または白血球増殖性疾患（例えば白血病）治
療または軽減；天然または人工の細胞、組織および器官（角膜、骨髄、臓器、レ
ンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織など）を移植する場合に、移
植片拒絶を阻止および／または治療するため。 【０５６５】 本発明によれば、さらに、治療用NOIが二次標的細胞集団中で優先的に発現さ れ、一次標的細胞中では少ししか発現されないか、または生物学的に重大なレベ
ルでは発現されないように、治療用NOIの産生を制御する方法が提供される。 【０５６６】 本発明はまた、個体を遺伝子療法によって治療するための医薬組成物を提供す
る。該組成物は、治療上有効量の、送達可能な１以上の治療用および／または診
断用NOIを含む本発明のレトロウイルスベクター、または該ベクターによって生 成される、もしくはそれから得られるウイルス粒子を含む。この医薬組成物はヒ
トまたは動物に用いることができる。典型的には、医師が個々の被験者に実際に
最も適する用量を決定する。その量は特定個体の年齢、体重および応答によって
変動する。 【０５６７】 該組成物は場合により製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバ
ントを含むことができる。製薬用担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与
経路および標準的な製薬上の慣例に鑑みて選択することができる。該医薬組成物
は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはそれらのほかに、任意の適切な結
合剤、潤沢剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤、および標的部位へのウイルスの侵入
を助ける、または増大させることができる他の担体（例えば、脂質送達系）を含
むことができる。 【０５６８】 適切な場合は、上記医薬組成物は吸入により；座薬またはペッサリーの形で；
ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所的に；皮膚パッチの
使用により；デンプンまたはラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形、または単独
もしくは賦形剤と混合したカプセルもしくはオビュール(ovule)の形、または矯 味剤もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形で経口的に投与
するか、または非経口的に（例えば、海綿状構造内、静脈内、筋肉内または皮下
に）注射することができる。非経口投与のためには、該組成物は他の物質（例え
ば、溶液を血液と等張性とするのに十分な塩または単糖）を含んでいてもよい滅
菌水性溶液の形で最も良好に使用される。奥歯と頬の間または舌下に投与するた
めには、該組成物は通常の方法で製剤化できる錠剤またはロゼンジの形で投与す
ることができる。 【０５６９】 本発明のさらなる態様においては、in vivo遺伝子送達のための一般的な意味 における（すなわち、上に規定した本発明の第１の態様に必ずしも限定されない
）ハイブリッドウイルスベクター系が提供される。この系は、二次ウイルスベク
ターをコードする１以上の一次ウイルスベクターを含んでおり、該一次ベクター
は一次標的細胞に感染して二次ウイルスベクターを発現することが可能であり、
該二次ベクターは二次標的細胞の形質導入をすることができる。 【０５７０】 この特定の実施形態においては、本発明の遺伝子ベクターはこのように標的細
胞細胞内で欠陥性の感染性粒子を生成することができる、遺伝子送達のためのハ
イブリッドウイルスベクター系である。したがって、本発明の遺伝子ベクターは
、二次ベクターをin vivoで生成するために必要な遺伝子をコードする、in vitr
oで作製された一次ベクターを含む。使用にあっては、二次ベクターは二次標的 細胞に挿入するための１個以上の選択された遺伝子を担持する。該選択された遺
伝子は、１以上のマーカー遺伝子および／または治療遺伝子であることができる
。マーカー遺伝子は選択可能なおよび／または検出可能なタンパク質をコードす
る。 【０５７１】 本発明のこの特定の態様に関するさらなる態様を以下に記述する。これらの教
示は本発明のこれまでに記述した態様にも適用される。 【０５７２】 別な態様において、本発明は一次ウイルスベクターに感染していて、そして感
染性二次ウイルスベクター粒子を生成することができる標的細胞を提供する。 【０５７３】 さらに別の態様において、本発明は本明細書に記載のハイブリッドウイルスベ
クター系または一次ウイルスベクターに感染した標的細胞を投与することを含む
、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を治療する方法を提供する。 【０５７４】 一次ウイルスベクターは種々の異なるウイルスベクター、例えばレトロウイル
ス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスベクター等であ
ってよい。または、一次ウイルスベクターが複数の場合は、それらはウイルス起
源の異なるベクターの混合物であってよい。いずれの場合にも、好ましくは、一
次ウイルスベクターは独立複製が不可能であるという点で欠陥性である。したが
って、それらは標的細胞に入ってそこに二次ベクター配列を送達することはでき
るが、複製してさらなる標的細胞に感染を続行することはできない。 【０５７５】 ハイブリッドウイルスベクター系が二次ベクターをコードする２個以上の一次
ベクターを含む場合は、一次標的細胞集団に感染するのに一次ベクターの両方ま
たは３個全部が、通常は同時に用いられる。好ましくは、１個の一次ウイルスベ
クターが二次ウイルスベクターの全ての構成要素をコードする。 【０５７６】 好ましい１または複数の一次ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであ
る。アデノウイルスベクターは、in vitro培養物から得ることができる力価の点
で、他のウイルスベクターと比較して重大な利点を有する。アデノウイルス粒子
はまた、エンベロープを有するウイルスの粒子と較べて比較的安定であり、この
ためより容易に精製し、保存することができる。しかし、欠陥性アデノウイルス
ベクターからの遺伝子発現は一過性にすぎないため、現在のアデノウイルスベク
ターはin vivo治療用途について重大な限定を被っている。ベクターゲノムが複 製しないため、標的細胞増殖はベクターの希釈をもたらす。また、たとえ低レベ
ルでもアデノウイルスタンパク質を発現する細胞はアデノウイルスタンパク質に
対して起こる免疫応答によって破壊される。 【０５７７】 二次ウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスベクターである。二次ベク
ターは、欠陥ウイルスベクター粒子の一次標的細胞内における集合およびパッケ
ージングに必須の遺伝子の発現によって生成される。それは独立複製が不可能で
あるという点で欠陥性である。したがって、二次レトロウイルスベクターはいっ
たん二次標的細胞を形質導入したのち、複製によってさらなる標的細胞に広がっ
ていくことはできない。 【０５７８】 二次ベクターは、一次ベクターのDNA中にコードされている、レトロウイルス ベクター作製に必須の遺伝子の発現によって作製することができる。そのような
遺伝子は、レトロウイルス由来のgag-pol 遺伝子、エンベロープを有するウイル
ス由来のエンベロープ遺伝子、および１つ以上の治療用NOIを含む欠陥性レトロ ウイルスゲノムを含むことができる。この欠陥性レトロウイルスゲノムは一般に
、逆転写を可能とする配列、5'長末端反復(LTR)の少なくとも一部、3'LTR の少 なくとも一部、およびパッケージングシグナルを含む。 【０５７９】 重要なことに、二次ベクターもまた、独立複製が可能な感染性ウイルスが生じ
るような組換えの可能性を排除する１以上の安全性特徴が組み込まれているとい
う点で、in vivo 使用にとって安全である。 【０５８０】 二次ベクターが複製欠陥性であることを確実にするため、複数の転写ユニット
によって二次ベクターをコードすることができる。そして、これらのユニットを
１個または２個以上のアデノウイルスまたは他の一次ベクター中に配置すること
ができる。したがって、二次ベクターゲノムをコードする転写ユニット、gag-po
l遺伝子をコードする転写ユニットおよびenv遺伝子をコードする転写ユニットが
存在する。または、これらユニットの２個以上を組み合わせることができる。例
えば、gag-polおよびenv遺伝子をコードする核酸配列、またはenv遺伝子および ゲノムをコードする核酸配列を１個の転写ユニットに組み合せることができる。
これを達成する方法は当技術分野で公知である。 【０５８１】 本明細書に記述する転写ユニットとは、コード配列および該コード配列の他の
コード配列から独立した発現を達成するためのシグナルを含む核酸の領域である
。したがって、各転写ユニットは一般に少なくともプロモーター、エンハンサー
およびポリアデニル化シグナルを含む。二次ベクターをコードする転写ユニット
のプロモーターおよびエンハンサーは、二次ウイルスベクター作製条件下の一次
標的細胞中で、好ましくは強力に活性であるか、または強力に誘導されることが
可能である。プロモーターおよび／またはエンハンサーは構成的に効果的なもの
であるか、またはその活性が組織によって、もしくは時間的に制限されているも
のであってよい。組織によって制限される適切なプロモーター／エンハンサーの
例は、MUC1遺伝子、CEA遺伝子または5T4抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハ
ンサー等、腫瘍細胞中で高度に活性なプロモーター／エンハンサーである。時間
的に制限されているプロモーター／エンハンサーの例は、低酸素応答エレメント
またはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロモーター／エンハンサー等、虚血および
／または低酸素に応答するプロモーター／エンハンサーである。好ましいプロモ
ーター-エンハンサーの組合せの１例は、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要 前初期(MIE)プロモーター／エンハンサーの組合せである。 【０５８２】 二次ベクター構成要素の低酸素または虚血によって調節される発現は、特定の
状況下で特に有用である。低酸素は広い範囲の異なる細胞型において遺伝子発現
の強力な調節物であり、そして例えば低酸素誘導性因子１(HIF-1; WangおよびSe
menza, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:430)等の低酸素が誘導する転写
因子の活性の誘導によって作用する。該転写因子は種々の遺伝子プロモーター上
のコグネイトDNA認識部位、すなわち低酸素応答エレメント(HRE) に結合する。D
achsら(1997, Nature Med. 5:515)は、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ１ （PGK-1)遺伝子（Firthら，1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6496-6500)
由来のHREの多量体形態を用いて、ヒト繊維肉腫細胞による低酸素に応答したマ
ーカーおよび治療遺伝子の両方のin vitro発現および固形腫瘍内におけるin viv
o発現を調節した（Dachsら、同書）。または、腫瘍の虚血性領域には顕著なグル
コース剥奪も存在するという事実を利用して、異種遺伝子発現を腫瘍中で特異的
に活性化することができる。grp78 遺伝子プロモーターの末端切断型632塩基対 配列（これはグルコース剥奪によって特異的に活性化されることが公知である）
もまた、マウス腫瘍においてin vivoでリポーター遺伝子の高レベル発現を引き 出しうることが示された（Gazit, G. ら，1995, Cancer Res. 55:1660)。 【０５８３】 ハイブリッドウイルスベクター系に組み込むことができる安全性特徴を以下に
記述する。そのような特徴は系の中に１つ以上存在しうる。 【０５８４】 第１に、相同領域を欠失させることによって、二次ベクターの構成要素をコー
ドする配列間の配列相同性を回避することができる。相同領域は遺伝子の組換え
を引き起こす。特定の実施形態においては、二次レトロウイルスベクターを構築
するのに３個の転写ユニットが用いられる。第１の転写ユニットは、非レトロウ
イルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-po
l遺伝子を含む。第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよ びエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。天然のレトロウイルスゲノムにおいては、
パッケージングシグナルは、適切に機能するためにはgag配列の一部を必要とす るように配置されている。したがってレトロウイルスベクター系を天然のレトロ
ウイルスから構築する場合、通常、パッケージングシグナル（gag遺伝子の一部 を含む）はベクターゲノム中に残る。しかし、本発明においては上記欠陥性レト
ロウイルスゲノムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない 、最小限のパッケージングシグナルを含む。また、例えばモロニーマウス白血病
ウイルス(MMLV)などのレトロウイルスにおいては、polコード配列の3'末端とenv
コード配列の5'末端の間にはオーバーラップする小さい領域がある。第１および
第２転写ユニットの間のこれに対応する相同領域は、polコード配列の3'末端ま たはenvコード配列の5'末端を、コドン使用法を変えるがコードされたタンパク 質のアミノ酸配列を変えないように変更することによって除去することができる
。 【０５８５】 第２に、envおよびgag-pol構成要素の間の相同領域が回避されるように、１つ
のレトロウイルスのゲノムを別のレトロウイルスまたはエンベロープを有する別
のウイルスのエンベロープタンパク質を用いて疑似タイピングすることによって
、複製可能な二次ウイルスベクターの可能性を回避することができる。特定の実
施形態においては、レトロウイルスベクターは以下の３つの構成要素から構築さ
れる。すなわち、第１の転写ユニットは非レトロウイルス性プロモーターおよび
エンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-pol遺伝子を含む。第２の転写 ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあ
る、エンベロープを有する別のウイルス由来のenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。上記欠陥性レトロウイルスゲノムは、第１
の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限のパッケージング シグナルを含む。 【０５８６】 疑似タイピングは、例えば、HIVまたはウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)などの レンチウイルスに基づくレトロウイルスゲノムを必要とし、そしてエンベロープ
タンパク質は、例えば、4070Aと称する両種指向性エンベロープタンパク質であ ってよい。または、レトロウイルスゲノムはMMLVに基づくものであって、そして
エンベロープタンパク質は一次標的細胞内で非毒性量で産生されうる、別のウイ
ルス由来のタンパク質（インルエンザ赤血球凝集素または水疱性口内炎ウイルス
Ｇタンパク質、等）であってよい。あるいはまた、エンベロープタンパク質は突
然変異体エンベロープタンパク質または遺伝子操作されたエンベロープタンパク
質、等のような改変されたエンベロープタンパク質であってもよい。改変は、標
的能力を導入するように、または毒性を減少させるように、または別の目的に合
わせて実施または選択することができる。 【０５８７】 第３に、特定の方法で構築した２つの転写ユニットを用いることによって、複
製可能なレトロウイルスの可能性を排除することができる。第１の転写ユニット
は、一次標的細胞中で活性なプロモーター-エンハンサー（例えば、hCMVプロモ ーター-エンハンサーまたは組織に限定されるプロモーター-エンハンサー）の制
御下にあるgag-polコード領域を含む。第２の転写ユニットは、レトロウイルス 粒子中にパッケージングされうるレトロウイルスゲノムRNAをコードする。第２ の転写ユニットはパッケージング、組み込みおよび逆転写に必要なレトロウイル
ス配列を含み、かつまたエンベロープを有するウイルスのenvタンパク質をコー ドする配列および１以上の治療遺伝子をコードする配列を含む。 【０５８８】 好ましい実施形態においては、本発明のハイブリッドウイルスベクター系はレ
トロウイルス二次ベクターをコードする１または複数のアデノウイルス一次ベク
ターを含んでなる。本発明に用いるアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイ
ルス由来であっても、または通常ヒトに感染しないアデノウイルスに由来するも
のであってもよい。好ましくは、上記ベクターはアデノウイルス２型もしくは５
型（Ad2またはAd5)、またはマウスアデノウイルス、またはCELOウイルス(Cotton
ら，1993, J. Virol 67: 3777-3785) 等のトリアデノウイルスに由来するもので
ある。上記ベクターは複製可能のアデノウイルスベクターであってよいが、より
好ましくは欠陥性アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは該
ウイルスの複製に必要な１以上の構成要素を欠失させることによって欠陥性とす
ることができる。典型的には、各アデノウイルスベクターはE1領域に少なくとも
１つの欠失を含む。感染性アデノウイルスベクター粒子を作製するためには、E1
遺伝子を含むAd5 左部分のコピーが組み込まれたヒト胚繊維芽細胞系（ヒト293 細胞系など）中でウイルスを継代させることによって上記欠失を補完することが
できる。異種DNAをこのようなベクターに挿入する場合のキャパシティは、約７k
bまである。したがって、このようなベクターは、それぞれがレトロウイルス二 次ベクターの構築に必須な転写ユニットの１つを含む３個の組換えベクターから
なる本発明の系を構築するのに有用である。 【０５８９】 他のアデノウイルス遺伝子にさらなる欠失を有する別のアデノウイルスベクタ
ーが当技術分野で公知であり、これらのベクターもまた本発明に用いるのに適切
である。これらの第二世代アデノウイルスベクターのいくつかは、免疫原性の低
下を示す（例えば、E1 + E2 欠失、Gorzigliaら，1996, J. Virol. 70: 4173-41
78; E1 + E4欠失、Yehら，1996, J. Virol. 70: 559-565)。欠失の拡大は、ベク
ターに複数の遺伝子を導入するための付加的なクローニングキャパシティを提供
するのに役立つ。例えば、25 kbの欠失が記述されており(Lieberら，1996, J. V
irol. 70: 8944-8960)、また35 kb以上の異種DNAの導入を可能とする、全ウイル
ス遺伝子を欠失させたクローニングベクターが報告されている(Fisher ら，1996
, Virology 217: 11-22)。このようなベクターを用いて、レトロウイルス二次ベ
クターを構築するための２または３個の転写ユニットをコードする本発明のアデ
ノウイルス一次ベクターを作製することができる。 【０５９０】 ここに記述する本発明の実施形態は、アデノウイルスおよび他のウイルスベク
ターに付随する主要な問題の１つ、すなわち、そのようなベクターからの遺伝子
発現は一過性であるという問題を解決している。一次標的細胞から生成されるレ
トロウイルス粒子は二次標的細胞に感染することができ、そして二次標的細胞に
おける遺伝子発現はレトロウイルスベクターゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込ま
れているため、安定に維持される。二次標的細胞は重大な量のウイルスタンパク
質抗原を発現することはなく、したがってアデノウイルスベクターによって形質
導入された細胞よりも免疫原性が低い。 【０５９１】 二次ベクターとしてレトロウイルスベクターを使用することもまた有利である
。なぜなら、例えば急速に分裂する細胞を標的にすることを可能ならしめること
によって、それはある程度細胞の区別を可能とするからである。さらに、レトロ
ウイルスの組み込みは、増殖する標的細胞における安定な発現を含めて、標的組
織中における治療遺伝子の安定な発現を可能とする。 【０５９２】 好ましくは、一次ウイルスベクターは特定の１または複数の細胞型に優先的に
感染する。より好ましくは、一次ベクターは特定の細胞に向かうように標的設定
された、天然のウイルスと較べて変更された組織親和性をもつベクターである。
「標的設定されたベクター」という用語は、必ずしも「標的細胞」という用語と
結びついているわけではない。「標的細胞」とは、単にベクター（天然のもので
あれ標的設定されたものであれ）が感染または形質導入できる細胞をいう。 【０５９３】 本発明による好ましいアデノウイルス一次ベクターもまた、好ましくは、組織
親和性が野生型アデノウイルスの組織親和性から変更されている標的設定された
ベクターである。アデノウイルスベクターを改変して、例えば以下の文献に記載
されているような標的設定されたアデノウイルスベクターを作製することができ
る。すなわち、Krasnykhら，1996, J. Virol. 70: 6839-6846; Wickhamら，1996
, J. Virol. 70: 6831-6838; Stevensonら，1997, J. Virol. 71: 4782-4790; W
ickhamら，1995, Gene Therapy 2: 750-756; Douglasら，1997, Neuromuscul. D
isord. 7:284-298; Wickhamら，1996, Nature Biotechnology 14: 1570-1573で ある。 【０５９４】 本発明のベクター系の一次標的細胞は、造血細胞（単球、マクロファージ、リ
ンパ球、顆粒球、またはこれらの前駆細胞を含む）；内皮細胞；腫瘍細胞；間質
細胞；星状細胞または神経膠細胞；筋肉細胞；および上皮細胞を含むが、それら
だけに限定されない。 【０５９５】 したがって、二次ウイルスベクターを生成することができる本発明の一次標的
細胞は、上記の細胞型のうち任意のものであってよい。好ましい実施形態におい
ては、本発明の一次標的細胞は、レトロウイルスgag-pol遺伝子のための第１の 転写ユニットおよびパッケージング可能な欠陥性レトロウイルスゲノムを生成す
ることができる第２の転写ユニットを含む欠陥性アデノウイルスベクターに感染
した単球またはマクロファージである。この場合、少なくとも第２の転写ユニッ
トは好ましくは、身体内の病態部位、例えば虚血性部位または固形腫瘍の微小環
境、等において優先的に活性なプロモーター-エンハンサーの制御下にある。本 発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、第２の転写ユニットは、ゲ
ノムが二次標的細胞に挿入されると、ウイルスenv遺伝子の発現を減少させ、か つ治療遺伝子の効率的発現を可能とするのに役立つイントロンが生成されるよう
に構築される。 【０５９６】 二次ウイルスベクターもまた標的設定されたベクターであることができる。レ
トロウイルスベクターについては、これはエンベロープタンパク質を改変するこ
とによって達成できる。レトロウイルス二次ベクターのエンベロープタンパク質
は、非毒性エンベロープであるか、または一次標的細胞内で非毒性量産生される
エンベロープ、例えば、MMLV両種指向性エンベロープまたは改変された両種指向
性エンベロープ、等である必要がある。このような場合の安全性特徴は、好まし
くは、レトロウイルス構成要素間の領域または配列相同性の欠失である。 【０５９７】 二次標的細胞集団は、一次標的細胞集団と同一であってよい。例えば、本発明
の一次ベクターを腫瘍細胞へ送達することは、さらなるベクター粒子の複製およ
び生成をもたらし、これらの粒子はさらなる腫瘍細胞を形質導入することができ
る。または、二次標的細胞集団は一次標的細胞集団と異なっていてもよい。この
場合、一次標的細胞は治療を受けた個体の体内における内在性工場の役割を果た
して、二次標的細胞を感染させることができるさらなるベクター粒子を生成する
。例えば、一次標的細胞集団は一次ベクターによってin vivoまたはex vivoで形
質導入された造血細胞であってよい。次に、この一次標的細胞は身体内の部位、
例えば腫瘍などに送達されるか、またはそこへ遊走し、二次ベクター粒子を生成
する。このれらの粒子は、例えば、固形腫瘍内の腫瘍細胞を形質導入することが
できる。 【０５９８】 本発明は、治療用タンパク質の作用が必要とされる部位またはその近傍におい
て高力価の欠陥性レトロウイルスベクター粒子の局在化したin vivo生成を可能 とし、その結果、二次標的細胞の効率的形質導入を達成する。これは欠陥性アデ
ノウイルスベクターまたは欠陥性レトロウイルスベクターを単独で用いるよりも
一層効率的である。 【０５９９】 本発明はまた、分裂しない細胞およびゆっくりと分裂する細胞中におけるレト
ロウイルスベクター、例えばMMLVに基づくベクター等のin vivo生成を可能とす る。これまで、MMLVに基づくレトロウイルスベクターの生成は急速に分裂する細
胞、例えばin vitroで増殖する、組織培養に適合させた細胞、またはin vivoで 急速に分裂する腫瘍細胞、等においてのみ可能であった。レトロウイルスベクタ
ーを生成することができる細胞型の拡大は、固形腫瘍の細胞（その多くはゆっく
りと分裂する）に遺伝子を送達するうえで、また内皮細胞や種々の造血系統細胞
等の非分裂細胞を治療用タンパク質産物の内在性工場として使用するうえで、有
利である。 【０６００】 本発明のベクター系による１以上の治療遺伝子の送達は、単独で用いることも
、または他の治療もしくは治療構成要素と組み合わせて用いることもできる。治
療することができる疾患は、癌、神経疾患、遺伝性疾患、心臓疾患、卒中、関節
炎、ウイルス感染および免疫系の疾患を含む。適切な治療遺伝子は、腫瘍抑制タ
ンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫変調性分子、抗体、工学的に作
製された免疫グロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血
管作用性タンパク質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタ
ンパク質、アンチセンスRNAおよびリボザイムをコードする遺伝子を含む。 【０６０１】 本発明の治療方法の好ましい実施形態においては、本発明のベクター系を用い
てプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子が腫瘍に送達され、そして次に適
切なプロドラッグを用いて患者が治療される。プロドラッグの例は、リン酸エト
ポシド（アルカリ性フォスファターゼと共に使用、Senterら，1988, Proc. Natl
. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと 共に、Mullenら，1994, Cancer Res 54: 1503-1506); ドキソルビシン-N-p-ヒド
ロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン-V-アミダーゼと共に、Kerrら，199
0, Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-206); パラ-N-ビス(2-クロロエチル ）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼG2と共に）；セファ
ロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（βラクタマーゼと共に）；
SR4233 (P450レダクターゼと共に）；ガンシクロビル（HSV チミジンキナーゼと
共に、Borrelliら，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576); マスター
ドプロドラッグ（ニトロレダクターゼと共に、Friedlosら，1997, J. Med. Chem
. 40: 1270-1275)およびシクロホスファミドまたはイホスファミド（シトクロム
P450と共に、Chenら，1996, Cancer Res. 56:1331-1340)を含む。 【０６０２】 さらに、治療遺伝子が二次標的細胞中で優先的に発現され、かつ一次標的細胞
中では少量しか発現されないか、または生物学的に重大な量では発現されないよ
うに治療遺伝子の生成を制御する方法が本発明により提供される。 【０６０３】 本発明においては、当技術分野のレベル内にある標準的な分子生物学的技法を
用いることができる。そのような技法は文献に十分記述されている。例えば、Sa
mbrookら(1989), Molecular Cloning; a laboratory manual; HamesおよびGlove
r (1985-1997) DNA Cloning: a practical approach, 第I-IV巻（第２版）を参 照されたい。免疫グロブリン遺伝子の作製方法は、McCaffertyら(1996) "Antibo
dy Engineering: A Practical Approach"に記述されている。 【０６０４】 要約すると、本発明は１つ以上のNOIを標的細胞に導入するのに適した新規な 送達系に関する。 【０６０５】 広い態様において、本発明は機能性スプライス・ドナー部位および機能性スプ
ライス・アクセプター部位を含むレトロウイルスベクターに関するものであり；
該機能性スプライス・ドナー部位および機能性スプライス・アクセプター部位は
第１の興味のあるヌクレオチド配列（NOI）の両側に位置し；該機能性スプライ ス・ドナー部位は該機能性スプライス・アクセプター部位の上流にあり；該レト
ロウイルスベクターはレトロウイルスプロベクターから誘導され；該レトロウイ
ルスプロベクターは該機能性スプライス・ドナー部位をもたらすことのできる第
１のヌクレオチド配列（NS）および該機能性スプライス・アクセプター部位をも
たらすことのできる第２のNSを含み；第１のNSは第２のNSの下流にあり；該レト
ロウイルスプロベクターの逆転写の結果該レトロウイルスベクターが形成される
ようになっている。 【０６０６】 さらに広い態様において、本発明はin vivo遺伝子送達のためのハイブリッド ウイルスベクター系を提供する。この系は、二次ウイルスベクターをコードする
１個以上の一次ウイルスベクターを含んでなり、該一次ベクターは一次標的細胞
に感染してそこで二次ウイルスベクターを発現することができ、該二次ベクター
は二次標的細胞の形質導入を行うことができる。 【０６０７】 好ましくは、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得られる、またはそ
れに基づくベクターであり、および／または二次ウイルスはレトロウイルスベク
ター、好ましくはレンチウイルスベクターから得られる、またはそれに基づくベ
クターである。 【０６０８】 （発明を実施するための最良の形態） 以下、添付の図面に言及しながら実施例により本発明をさらに説明する。 【０６０９】 図１は、レトロウイルスのプロウイルスゲノムの構造を示す。これに関して、
マウスオンコレトロウイルス等の最も単純なレトロウイルスは３つのオープンリ
ーディングフレーム、すなわちgag、polおよびenvを有する。gagの翻訳中におこ
るフレームシフトはpolの翻訳を導く。envの発現および翻訳は、図に示すスプラ
イス・ドナー体(SD)とスプライス・アクセプター体(SA)の間のスプライシングに
よって達成される。パッケージングシグナルはPsi と表示され、これは全長転写
産物にのみ含まれている。スプライシング現象の間にこのシグナルが除去される
、envを発現するサブゲノム転写産物には含まれない。 【０６１０】 図２は、スモールＴスプライス・ドナー体(small T splice donor)のpLTRへの
付加を図式的に示す。ここでは、スモールＴスプライス・ドナー配列は、最終構
築物中で逆転写が起こると、U3-スプライス・ドナー体-Ｒというカセットがプロ
ウイルスベクターの5'末端に「受け継がれ」、そして発現されたRNA転写産物が その5'末端近傍にスプライス・ドナー配列を含むように、LTRベクターの転写開 始点の下流であるがＲ配列の上流に挿入される。 【０６１１】 図３は、pL-SA-Nの概略図を示す。共通スプライス・アクセプター体(T/C)nNC/
TAG-G (Mount, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 459-472)およびブランチ部位(br
anch point)の両方に下線を付し、太字で示す。矢印はイントロン／エキソン接 合部を示す。ここでは、共通スプライス・アクセプター配列がpLXSN のStu1/Bam
H1部位に挿入される。このような配置により、この受容体は（最終RNA転写産物 中で）任意の上流スプライス・ドナー体と相互作用する。 【０６１２】 図４は、スプライス・ドナー体を欠失させたpL-SA-Nの構築の概略図を示す。g
TからgCへの変化は、pL-SA-Nベクターを鋳型とし、後述する２つのオリゴヌクレ
オチドを用いてPCR反応を実施することにより作製する。次に、得られたPCR産物
をpL-SA-NのSpe1-Asc1 部位にクローン化し、その結果、野生型スプライス・ド ナー体gTをgCに置換する。Spe1およびAsc1両部位を太字で示し、Spe1オリゴヌク
レオチド中の突然変異を太字の大文字で示す。 【０６１３】 図５は、MLV pICUTの配列を示す。 【０６１４】 図６は、EIAV LTRプラスミドCMV/R 接合部へのスプライス・ドナー体の挿入を
示す概略図である。後に概略を示す２つのオリゴヌクレオチドを用いてPCRを実 施し、PCR産物をCMVLTRのSac1-BamH1部位にクローン化し、相当する断片を除去 する。SacIオリゴヌクレオチド中で、矢印は転写の開始を示し、新しいインサー
トは大文字で示し、スプライス・ドナー配列には下線を付してある。Ｒの開始を
イタリック体で示す。 【０６１５】 図７は、スプライス・アクセプター体のpEGASUS-1への挿入を示す概略図であ る。ここでは、後述する２本鎖オリゴヌクレオチドをXho1-Bpu1 102で消化したp
EGASUS-1に挿入し、プラスミド pEGASUS+SA を作製する。共通スプライス・アク
セプター体(T/C)nNC/TAG-G (Mount, 1982, 同じ箇所）およびブランチ部位の両 方に下線を付し、太字で示す。矢印はイントロン／エキソン接合部を示す。 【０６１６】 図８は、EIAVベクターからの野生型スプライス・ドナー体の除去を示す概略図
である。後述するオリゴヌクレオチドおよび鋳型としてpEGASUS+SAを用いたオー
バーラップPCRによってスプライス・ドナー配列を除去する。最初にオリゴ1+2 およびオリゴ3+4 をそれぞれ用いて別々にPCR反応を実施する。次に増殖副産物 を溶出し、混合して第３のPCR反応に用いる。この第３反応を10サイクル実施し た後、オリゴ２および４を加える。次に、得られた産物をpEGASUS+SAのSac1-Sal
1 部位にクローン化し、プラスミドpEGASUS+SA(noSD)を作製する。スプライス・
ドナー体(SD)の位置を図に示す。野生型スプライス・ドナー体をGTからGCに変え
る点突然変異を、オリゴ１および相補体であるオリゴ３の両方に太字で示す。 【０６１７】 図９は、pCMVLTR+SDとpEGASUS+SA(noSD)を組み合わせてpEICUT-1を作製する概
略を示す図である。ここでは、pEGASUS+SA(noSD)のMlu1断片をpCMV-LTRのユニー
クなMlu1部位にする。 【０６１８】 図10は、pEICUT-LacZ の構築を示す概略図である。これは、後に概略を述べる
ように、pEGASUS-1 由来のXho1-Bpu1 102 LacZ断片をpEICUT-1のXhoI-Bpu1 102 部位に挿入することによって作製される。 【０６１９】 図11は、pEICUT-LacZ 配列を示す。 【０６２０】 図12は、トランスフェクションされた細胞および形質導入細胞の両方における
ベクター配置の概略図を示す。ここでは、出発ベクターpICUTはスプライス・ア クセプター体（この例ではIgSA由来の共通スプライス・アクセプター体）の上流
にスプライス・ドナー体を含んでおらず、そのため得られるRNA転写産物はスプ ライシングされない。したがって、転写産物の全てはパッケージングシグナルを
含む全長転写産物である（Ａ）。しかし、形質導入を行うと、スプライス・ドナ
ー体（この例ではスモールＴスプライス・ドナー体）は生成される全てのRNA転 写産物がスプライス・アクセプター体（すなわちイントロン）の上流にスプライ
ス・ドナー体を含むようにプロウイルスベクターの5'末端に「受け継がれ」、そ
してその結果最大のスプライシングが達成される（Ｂ）。 【０６２１】 図13は、パッケージング細胞または形質導入細胞への遺伝子発現の限定を示す
概略図である。この例における遺伝子発現の限定は、ハイグロマイシンORFをMLV
pEIBUTのネオマイシンORFの上流に配置することによって達成される（ａ）。こ
のクローニング戦略によって、得られるベクターはトランスフェクションされた
細胞中ではハイグロマイシンのみを発現するRNA転写産物を発現するようになる 。なぜなら、リボソーム5'キャップ依存性翻訳は上流ORFのみを効率的に読むか らである。しかし、形質導入を行うと、ハイグロマイシンは機能性イントロン内
に含まれることになり、したがって成熟転写産物から除去され（ｂ）、その結果
ネオマイシンORFが 5' キャップ依存性に翻訳される。 【０６２２】 図14は、ハイグロマイシンの発現をプロデューサー細胞に、そして2B6（p450 イソ型）の発現を形質導入細胞に限定するMLV pICUT Neo-p450ベクターの構築を
示す概略図である。この構築の出発ベクターは、hygroおよびneo両遺伝子を含む
図13に示すpICUT ベクターである。neo遺伝子は完全なp450 2B6 cDNAに以下のよ
うに置換される。すなわち、ヒト肝臓RNA (Clontech)を鋳型とし、下記のプライ
マーを用いてRT-PCRを実施して完全な2B6 cDNAを得る： 【０６２３】 【０６２４】 これは最適化されたコザック配列をもつ、ユニークなBclIおよびNgoM1 部位に両
側を囲まれた完全な2B6 cDNAをもたらす。次に、このcDNAをpICUT-Hyg-NeoのBcl
1-NgoMI部位にクローン化し、その結果Neoをp450で置換する（（Ａ）参照）。ト
ランスフェクションされた細胞（Ｂ）および形質導入細胞（Ｃ）中のプロウイル
スDNA構築物も示す。 【０６２５】 図15は、突然変異env遺伝子(m4070A)とpol遺伝子3'末端由来の野生型MMLV配列
との配列比較である。 【０６２６】 図16は、変更された4070Aの完全な配列である。 【０６２７】 図17は、遺伝子発現が限定されたレトロウイルス発現ベクターを示す。ここで
は、第１のNOI（4070AエンベロープORF)は最初のベクターによって発現され、第
２のNOI（この例ではp450）はベクターの複製後にのみ発現される。複製後、407
0A遺伝子は機能性イントロン内に位置し、したがってRNAスプライシングの間に 除去される。 【０６２８】 図18は、p450遺伝子の5'末端（スプライス・ドナー体の上流）が、複製後にp4
50遺伝子の3'末端の上流（SAの上流）に見いだされ、したがって複製後にのみ機
能性p450遺伝子が（スプライシングされたmRNAから）発現される、レトロウイル
ス発現ベクターを示す。 【０６２９】 （実施例） 〔実施例１〕 分断イントロンMLVベクターの構築 (i)スモールＴスプライス・ドナー体の付加 この構築物の出発プラスミドはpLXSN (Millerら，1989，同じ箇所)である。第
１に、この構築物をNhe1で消化し、背骨を再連結してLTR (U3-R-U5) プラスミド
を作製する。次に、スプライス・ドナー配列を含むオリゴヌクレオチドをこのプ
ラスミドのKpn1-Bbe1 部位の間に挿入する。このオリゴヌクレオチドには、該ス
プライス・ドナー体の下流に、Kpn1までのMLV R 配列も含まれている。得られる
プラスミドを3'LTR-SDと称する（図２参照）。 【０６３０】 (ii)スプライス・アクセプター体の付加 この構築物に用いるスプライス・アクセプター配列〔ブランチ部位、すなわち
、該スプライス・アクセプター体の20から40塩基上流に位置し、イントロンラリ
アット形成(Aebiら，1987, Trends in Genetics 3: 102-107)に関与する１個の Ａ残基を含む〕は、免疫グロブリン重鎖可変領域mRNA (Bothwellら，1981, Cell
24: 625-637) であるが共通／最適化・アクセプター部位を有するものから誘導
される。そのような配列シグナルはpCI (Promega)にも存在する。この受容配列 をまずpLXSN のBamH1-Stu1部位に２本鎖オリゴヌクレオチドとして挿入し、ベク
ターpL-SA-N を作製する（注：SV40プロモーターはクローニング中にpLXSN から
失われる）。クローニング戦略の概略については図３を参照されたい。 【０６３１】 (iii) pL-SA-Nからのもとのスプライス・ドナー体の除去 pL-SA-Nのgag配列内に含まれていたスプライス・ドナー体の除去は、PCRに基 づく部位特異的突然変異誘発法によって達成される。２つのオリゴヌクレオチド
を用いて、pL-SA-NのユニークなAsc1およびSpe1部位にまたがる領域をPCR増幅す
る。Spe1にかかる(Spe1-spanning)オリゴヌクレオチドには、スプライシング陰 性pBABEベクター(Morgensternら，1990, 同じ箇所）にも見いだされるagGTaag からagGCaag への変化も組み込まれている。クローニング戦略の概略については
図４を参照されたい。 【０６３２】 (iv) pL(noSD)-SA-Nと3'LTR-SDを組み合わせる pL(noSD)SA-Nプラスミドは、正常なMLV由来3'LTR を含んでいる。pL(noSD)SA-
NからNhe1インサートを取り出し、これをNhe1で消化した3'LTR-SDベクターに挿 入することによって、上記3'LTR を3'LTR-SD配列と置換する。このようにして得
られるプラスミドをpICUT (Intron Created Upon Transduction,形質導入の結果
形成されるイントロン）と称し、この新世代レトロウイルスベクターの全ての特
徴を含んでいる（配列データについては図５参照）。 【０６３３】 〔実施例２〕 分断イントロンレンチウイルスベクターの構築 最初のEIAVレンチウイルス発現ベクターの構築（英国特許出願GB9727135.7 も
参照されたい） 分断機能レンチウイルスベクター構築の出発点は、pEGASUS-1 と称するベクタ
ー（英国特許出願GB9727135.7 参照）である。このベクターは感染性プロウイル
スEIAVクローンpSPEIAV19（受託番号：U01866; Payneら，1994） から誘導され る。その構築は以下の通りである。すなわち、第１に、PCR増幅したEIAV LTRをp
Bluescript II KS+ (Stratagene) 中にクローン化する。次に、pSEIAV19のMluI/
MluI (216/8124)断片を挿入して、pBluescript II KS+中に野生型プロウイルス クローン(pONY2) を作製する（図１）。次に、HindIII/HindIII 断片を除去する
ことによってenv領域を欠失させ、pONY2-H を作製する。さらに、pol遺伝子内の
BglII/NcoI断片(1901/4949)を欠失させ、その場所にHCMV IE エンハンサー／プ ロモーターによって制御されるβガラクトシダーゼ遺伝子を挿入する。これをpO
NY2.10nlsLacZ と称する。EIAV配列を759塩基対に減少させ、また一次転写産物 をCMVプロモーターから分離するため、第１に、EIAVポリプリントラクト(PPT)お
よび3'LTR を含む配列を下記のプライマー： 【０６３４】 を用いて、pONY2.10LacZからPCR増幅した。次にPCR産物を、pBlueScript II KS+ 中でU5がNot1に隣接するような方向で、pBS II KS+のSpe1部位にクローン化した
。 【０６３５】 次に、リポーター遺伝子カセットのために、pONY2.10nlsLacZ 由来のCMVプロ モーター/LacZをPst1消化によって除去し、そしてLacZ遺伝子が3'LTR の近隣に くるような方向でpBS.3'LTR のPst1部位にクローン化する。このベクターをpBS
CMVLacZ.3'LTR と称する。 【０６３６】 EIAVベクターの5'領域は、発現ベクターpCIEneo中に構築される。該発現ベク ターは、以前に規定した完全なCMVプロモーターの5'末端に由来する約400塩基対
の包含によって改変された、pCIneo (Promega)の誘導体である。この400塩基対 の断片は、以下のプライマー： および および 【０６３７】 を鋳型としてpHIT60 (Soneokaら，1995, Nucleic Acids Res. 23: 628-633) を 用いてPCR増幅によって得られる。PCR産物をBglIIおよびSpeIで消化し、pCIE-Ne
oのBglII/SpeI部位にクローン化する。 【０６３８】 Ｒ領域からgagコード領域のヌクレオチド150までのEIAVゲノム断片（ヌクレオ
チド268から675）を、以下のプライマー： 【０６３９】 （下線を付した配列はEIAV R領域にアニールする）および 【０６４０】 を用いてpSEIAVから増幅する。 【０６４１】 得られるPCR産物の両側をXba1部位およびSac1部位で囲む。次に、これを切り 出してpCIE-NeoのXba1-SacI部位にクローン化する。その結果得られるプラスミ ド(pCIEneo5'EIAVと称する)は、CMVプロモーターの転写開始部位にEIAV R領域の
開始点を含む。次に、pBS.CMVLacZ.3LTRからApa1-Not1 断片を取り出し、これを
Sal1-Not1 で消化したpCIEneo5'EIAV にクローン化することによって、CMVLacZ/
3LTRカセットをpCIEneo5'EIAV プラスミドに挿入する（ベクターおよびインサー
トをそれぞれNot1で消化する前に、Sal1部位およびApa1部位をT4で「みがいて(p
olish)」平滑末端を作製する）。得られるプラスミドをpEGASUS-1 と称する。 【０６４２】 遺伝子デリバリーベクターとして用いるためには、pEGASUS-1はパッケージン グ細胞によって途中で提供されるgag/polおよびenvの両方の発現を必要とする。
gag/pol遺伝子の供給源として、EIAV gag-pol発現プラスミド(pONY3)が作製され
る。これは、gag-pol 遺伝子がhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーから発現さ
れ、かつLTR 配列を全く含まないように、pONY2-HのMluI/MluI 断片を哺乳動物 発現プラスミドpCI-neo (Promega) に挿入することによって作製される。env遺 伝子の供給源としては、pRV583 VSV-G発現プラスミドが通常の方法で用いられる
。これらの３つのベクターは、MLVに基づくベクターについて記述されているよ うに（Soneokaら，1995, Nucl. Acids Res. 23:628-633)、３個のプラスミドに よる同時トランスフェクションに使用され、その結果得られるウイルスはD17 繊
維芽細胞上で通常ミリリットルあたり104から105 lacZ形成単位という力価を有 する。 【０６４３】 pICUTのEIAVレンチウイルス版ベクターpEICUTの構築 pEICUTを構築するため、まずpEGASUS-1 からXmaI-SexAI断片を除去し、T4ポリ
メラーゼを用いて両端を平滑末端とし、再連結して、pEGASUS-1のCMV-R-U5部分 のみを含むプラスミドを作製する。このプラスミドはその背骨にSV40-Neoカセッ
トを保持している。このプラスミドをCMVLTRと称する。CMVとＲの境界にスプラ イス・ドナー体を挿入するため、図６に示す２つのオリゴヌクレオチドを用いて
、図６の説明に概略を述べたようにPCRを実施する。得られるプラスミドをpCMVL
TR+SDと称する。MLV pICUTに用いたのと同一の免疫グロブリンに基づく共通スプ
ライス・アクセプター体（前述）をEIAV版に用いる。図７に示すオリゴヌクレオ
チドを用いて、この受容体をpEGASUS-1 のXhoI-BpuI 102部位に挿入し、プラス ミドpEGASUS+SAを作製する。図８に記述したオリゴヌクレオチドおよび方法を用
いて、また鋳型としてpEGASUS+SAを用いてオーバーラップPCRを実施することに よって、EIAVの野生型スプライス・ドナー体を除去し、プラスミドpEGASUS+SA(n
oSD)を作製する。次に、pEICUT-1を作製するため、pEGASUS+SA(noSD)のMlu1-Mlu
1 断片をpCMVLTR+SDのユニークなMlu1部位に挿入し、pEICUT-1を作製する（図９
参照）。次に、Xho1-Bpu1 102消化および挿入によってlacZをpEGASUS-1 からpEI
CUT-1に導入し、pEICUT-Zを作製する（図10参照；配列データについては図11参 照）。 【０６４４】 MLV pICUTおよびEIAV pICUTの両ベクターともスプライス・ドナー体の上流に 強力なスプライス・アクセプター体を含んでおり、それゆえ機能性イントロンは
含まない（イントロンはスプライス・アクセプター体の5'末端に位置するスプラ
イス・ドナー体を必要とする）。この理由により、ベクターがプロデューサー細
胞にトランスフェクションされると、生成される転写産物はスプライシングされ
ない。したがってパッケージングシグナルは失われず、その結果、最大限のパッ
ケージングが達成可能である（図12参照）。 【０６４５】 しかし、レトロウイルスがそれによって複製するユニークな方法のため、形質
導入後、組み込まれたpICUTベクターから生成される転写産物は、上記のトラン スフェクションされた細胞の転写産物とは異なっている。これは複製の間に3'U3
プロモーター（Ｒの5'開始点まで）がコピーされて、形質導入細胞において5'プ
ロモーターとして使用されるためである。この理由により、組み込まれたpICUT から生成される転写産物は、いまや強力なスプライス・アクセプター体の5'末端
に強力なスプライス・ドナー体を含む。これらは両方ともneo ORFの上流に位置 している。そのため、そのような転写産物は5'UTR（非翻訳領域）内に機能性イ ントロンを含み、したがって最大限にスプライシングされ翻訳される。 【０６４６】 上記のようなベクターの別の有利な点は、形質導入の結果としてのみイントロ
ンが形成されるので、遺伝子発現をパッケージされた細胞または形質導入細胞に
限定することができることである。これがいかにして達成されるかの１例を図13
に示す。この戦略は、第２遺伝子（この例ではハイグロマイシン）をスプライス
・アクセプター体の上流にクローニングすることを必要とする。これは、Selcta
Vector Hygro (Ingenius; Oxfordshire, UK) からSalI断片上のハイグロマイシ
ンcDNAを取り出し、これをpICUT のXhoI部位（スプライス・アクセプター体に位
置する）に挿入することによって達成される。このベクターはトランスフェクシ
ョンされた細胞中でハイブロマイシンを、形質導入細胞中でネオマイシンを選択
的に発現する。この理由は、どのmRNA転写産物においても、内部リボソーム結合
部位(IRES)の助けがない場合は第１の遺伝子のみがリボソームによって翻訳され
るからである。トランスフェクションされた細胞においては、この遺伝子はハイ
グロマイシンである。しかし、形質導入細胞ではハイグロマイシンのオープンリ
ーディングフレーム(ORF)が機能性イントロン内に含まれるため、この遺伝子は 成熟mRNA転写産物から除去され、その結果neo ORFの翻訳を可能とする。 【０６４７】 このような細胞特異的遺伝子発現を有するベクターは、種々の理由により臨床
用途に用いうる。例えば、耐性マーカーの発現をそれが必要とされるプロデュー
サー細胞に限定し、それらマーカーが免疫原性となりうる形質導入細胞において
は発現させないことができる。別な例としては、リシンおよび優勢な陰性シグナ
ルタンパク質等の毒性遺伝子の発現を、場合により細胞増殖を停止させたり細胞
を殺したりするのにそれらを必要とするかもしれない形質導入細胞に限定し、そ
してそのような特徴が高力価ウイルスの産生を妨げるであろうプロデューサー細
胞では発現させないことが可能であろう。図14は、プロデューサー細胞ではNeo のみが発現され、形質導入細胞ではプロドラッグp450 2B6イソ型が発現されるNe
o-p450 MLV pICUT構築物を示す。 【０６４８】 形質導入の結果イントロンを形成することの別な利点は、ベクター機能に必要
な任意の必須エレメントを形質導入の結果形成される機能性イントロンの内部に
位置させ、形質導入細胞の転写産物から除去することが可能なことである。例え
ば、MLVおよびレンチウイルスのpICUTベクターの両方について、ウイルス転写産
物は、形質導入の結果形成されて形質導入細胞の転写産物から除去されるイント
ロン内に機能性Psiパッケージングシグナルを含んでいた（MLV内のPsiの位置に ついてはBenderら，1987参照; EIAV内のPsiの位置については英国特許出願GB 97
27135.7参照）。 【０６４９】 そのような配置に由来する利点は以下のものを含む。 (i) 転写産物から増大した翻訳が得られる。なぜなら、Psi二次構造物（もし存
在するならば）の存在下ではリボソームは「休み休み進む(stutter)」かもしれ ないからである(Krallら, 1996, 同じ箇所およびそこに含まれる参照文献) 。 【０６５０】 (ii)パッケージングシグナルの不在下では、内在性レトロウイルスによる転写産
物のパッケージングが阻止される。 【０６５１】 (iii) gag 遺伝子などのウイルスの必須エレメント（および他の可能性のあるAT
G翻訳開始部位）が形質導入細胞で発現される転写産物から除去されている場合 は、望ましくない未成熟な翻訳開始が阻止される。これは、EIAVおよびMLV pICU
Tベクターの両方がそうであるように、パッケージングシグナルがgag遺伝子内に
伸びている場合は特に有益である。 【０６５２】 (iv)形質導入の結果形成されるイントロン内にプロモーター、エンハンサーおよ
びサプレッサーを配置し、その結果、そのような実在物をイントロン内に含む、
CMVから生成される転写産物のような他の転写産物の配置を模倣することができ る(Chapmanら，1991, 同じ箇所）。 【０６５３】 要約すると、本発明が記述する新規なpICUTベクター系は下記の操作を容易に する: (I) プロデューサー細胞における最大限のパッケージングおよび転写産物翻訳の
減少 (II) 形質導入細胞における最大限のスプライシングおよびそれによるイントロ ンの除去と翻訳の増大 (III) 遺伝子および／またはウイルス必須エレメントの発現のプロデューサー細
胞または形質導入細胞への限定 【０６５４】 〔実施例３〕 pol遺伝子と最小限の相同性しかもたないMMLV両種指向性env 遺伝子およびgag-pol転写カセットの構築 モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)においては、envコード配列の最初の約6
0 bpはpol遺伝子の3'末端の配列とオーバーラップしている。これら２つの遺伝 子間の相同領域は、両遺伝子を発現する細胞においてそれらの間で組換えが起こ
る可能性を阻止するため、除去された。 【０６５５】 上記envコード配列の最初の約60 bpのDNA配列を、コードされているタンパク 質のアミノ酸配列は保持したまま、以下のように変更した。すなわち、env遺伝 子の5'末端（図15参照）のコドン使用法を変更するため、合成オリゴヌクレオチ
ドを作製し、envの残りの部分に以下のように挿入した。 【０６５６】 4070A遺伝子の5'末端の再構築のための出発プラスミドは、pHIT456 (Soneoka ら，1995, 同じ箇所)の4070A遺伝子を含むXba1-Xba1 断片を前もってクローン化
し、pCI-4070Aを形成しておいたpCIプラスミド(Promega)であった。 pCI-4070Aを鋳型とし、プライマーＡおよびＢ（図15）を用いてPCR反応を実施
し、600塩基対の産物を生成した。次に、この産物をpCI-4070AのNhe1およびXho1
部位の間にクローン化した。得られた構築物のNhe1/Xho1 領域を配列決定した。
得られた遺伝子のアミノ酸配列は元の4070Aと同一であるが、pol遺伝子との相同
領域は除去されている。 【０６５７】 改変env遺伝子m4070Aの完全な配列を図16に示す。この配列を標準的技法によ り発現ベクターpCI (Promega)に挿入する。CMV gag-pol転写ユニットはpHIT60 (
Soneokaら，1995, 同じ箇所）から得る。 【０６５８】 〔実施例４〕 レトロウイルスパッケージングシグナルからのgag配列の除去 LTRおよび最小限の機能性パッケージングシグナルを含むDNA断片をレトロウイ
ルスベクターMFG (Bandaraら，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10764-10768
)から、またはMMLVプロウイルスDNAから以下のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いたPCR反応によって得る： 【０６５９】 このPCR断片はMMLVヌクレオチドの+1から+523までを含み、したがって+621から 始まるgagコード配列は含んでいない（番号はShinnickら，1981, Nature 293: 5
43-548 に記載のMMLVのヌクレオチド配列に基づく）。 【０６６０】 上記PCR断片を用いて、HindIIIおよびXho1制限酵素を用いた消化および標準的
技法を用いたサブクローニングによりレトロウイルスゲノムベクターを構築する
ことができる。そのようなベクターはgagコード配列と相同性をもたない。 【０６６１】 〔実施例５〕 欠陥性レトロウイルスゲノムの構築 欠陥性レトロウイルスゲノムを生成することができる転写ユニットを図17に示
す。このユニットは以下の要素を含む。すなわち、PGK遺伝子のHRE（低酸素応答
エレメント）を３コピー含む、低酸素によって調節されるプロモーター-エンハ ンサーおよびpGL3 (Promega)から72 bp反復エンハンサーが削除されたSV40プロ モーター；Ｒ、U5およびパッケージングシグナルを含むMMLV配列；m4070A（実施
例３）のコード配列；スプライス・アクセプター体；治療用タンパク質のコード
配列を挿入するためのクローニング部位；MMLV由来のポリピリミジントラクト；
HREを含むプロモーター-エンハンサーの第２コピー；スプライス・ドナー部位；
Ｒ、U5の第２コピーである。 【０６６２】 ベクターの逆転写および二次標的細胞への組み込みの結果、スプライス・ドナ
ー体はenv遺伝子の上流に導入され、スプライシングによる該遺伝子のmRNAから の除去を引き起し、それによって治療遺伝子の二次標的細胞のみにおける効率的
な発現を可能とする（図17参照）。 【０６６３】 〔実施例６〕 シトクロムP450の条件発現ベクターの構築 図18は、形質導入の後でのみ正しいスプライシングが達成されてP450の発現が
可能となるように、シトクロムP450遺伝子の配列を1/2ずつに分けてコードする レトロウイルス発現ベクターcDNAの構造を示す。したがって、このベクターは形
質導入細胞にのみ遺伝子発現を限定する。 【０６６４】 １）このベクターを構築するための出発プラスミドはpLNSX (MillerおよびRosma
n, 1989, Bio Techniques 7: 980-990)である。pLNSX のパッケージングシグナ ル内に含まれる天然のスプライス・ドナー体(...agGTaag...) （位置781/782)を
、ALTERED SITES II突然変異誘発キット(Promega)および下記の配列を有する合 成オリゴヌクレオチドを用いてPCR突然変異誘発法によって突然変異させる： 【０６６５】 ２）pCI発現ベクター(Promega)のCMVプロモーターを、下記の２つのオリゴヌク レオチドを用いたPCRによって単離する： 【０６６６】 これは5'Nhe1部位（プライマー１）ならびに3'Not1およびXba1部位（プライマ
ー２）を有するCMVプロモーターを含む断片をもたらす。この断片をNhe1およびX
ba1で切断し、あらかじめNhe1-Nhe1断片を除去しておいたpLNSX にクローン化し
た。 【０６６７】 ３）シトクロムP450 cDNAコード配列の5'末端を以下のプライマーを用いてRT-PC
Rによってヒト肝臓RNA (Clontech)から単離する： 【０６６８】 これはATGから残基693までのP450遺伝子5'末端を増幅する（番号は翻訳開始部位
からのものである；Yamanoら, 1989, Biochem 28:7340-7348）。PCR断片の5'末 端（プライマー３に由来する）には、Not1部位および最適化「コザック」翻訳開
始シグナルも含まれている。PCR断片の3'末端（プライマー４に由来する）には 、別のNot1部位、およびP450の残基704（相補残基をプライマー４中に大文字で 示す）に対して上流に位置するGTスプライス・ドナー体対を有する共通スプライ
ス・ドナー配列（pCI にも見いだされ、もともとはヒトβグロビン遺伝子に由来
する）が含まれている。この断片をNot1で消化し、そして上記工程２で作製した
、Not1で消化したプラスミド中にクローン化する。 【０６６９】 ４）次に、工程２のクローニングの際に除去したNhe1-Nhe1 断片を工程３のプラ
スミドに再導入する。これによって、図17に示すレトロウイルスベクターである
がP450の3'末端を欠くベクターが作製される。 【０６７０】 ５）P450コード配列の3'末端を下記のプライマーを用いたRT-PCRによってヒト肝
臓RNA (Clontech)から単離する： 【０６７１】 これは残基705（プライマー５中、大文字で示す）から翻訳停止コドンを越えて 延びるPCR増幅されたP450の3'末端をもたらす。このPCR産物の5'末端内に、プラ
イマー５によって生成されて、Bcl1制限部位、共通スプライス・アクセプター体
およびブランチ部位（pCIにも見いだされ、もともとは免疫グロブリン遺伝子に 由来する）が残基705の上流に存在する。停止コドンの下流に位置するこの産物 の3'末端に、プライマー６によって生成されてCla1部位が存在する。次に、この
PCR産物をBcl1およびCla1で消化し、そしてBcl1-Cla1 断片を除去した、工程３ で作製したベクターに挿入し、図18に示すレトロウイルスベクターを作製する。 【０６７２】 以下の実施例は、in vivoまたはin vitroにおけるレンチウイルスの一過性生 成のために使用できるアデノレンチウイルス系の構築を説明する。 【０６７３】第１世代組換えアデノウイルス 第１世代アデノウイルスベクターは該ウイルスのE1およびE3領域の欠失からな
り、外来DNAの通常は左側逆方向末端反復配列(ITR)に隣接するウイルス左腕への
挿入を可能とする。このウイルスのパッケージングシグナル(194-358ヌクレオチ
ド）はE1aエンハンサーとオーバーラップし、そのため殆どのE1欠失ベクター中 に存在する。この配列はウイルスゲノムの右端へ移転させることができる(Heari
ngおよびShenk, 1983, Cell 33:59-74)。したがって、E1欠失ベクターにおいて3
.2 kbを欠失させることができる(358-3525ヌクレオチド)。 【０６７４】 アデノウイルスはそのゲノムの105%の長さのものをパッケージングすることがで
き、このためさらに2.1 kbを加えることが可能となる。したがって、E1/E3欠失 ウイルスベクターにおいては、クローニングキャパシテイは7-8 kbとなる（2.1
kb + 1.9 kb (E3の除去) + 3.2 kb (E1の除去))。組換えアデノウイルスは必須 のE1初期遺伝子を欠くため、非E1補完性細胞系では複製できない。293細胞系がG
rahamら(1977, J. Gen. Virol. 36: 59-74)によって開発され、これはITR、パッ
ケージングシグナル、E1a、E1bおよびpIXを含む、Ad5ゲノムの左端由来の約4 kb
を含む。これらの細胞はE1aおよびE1b遺伝子産物を安定に発現するが、pIX 配列
がE1b内にあるにもかかわらず、後期タンパク質IXを発現しない。非補完性細胞 中では、E1欠失ウイルスは細胞を形質導入し、そして核に運ばれるが、そこでは
E1欠失ゲノムからの発現は全くない。 【０６７５】第１世代アデノウイルス生成系 Microbix Biosystems - nbl Gene Sciences 図19はMicrobix系を用いて組換えアデノウイルスを作製するのに用いられる一
般戦略を示す。 【０６７６】 この一般戦略は、外来DNAをE1シャトルベクターにクローン化することを必要 とし、該ベクター中で402-3328 bpのE1領域は外来DNAカセットに置換される。次
に、この組換えプラスミドをpJM17 プラスミドと共に293細胞中に同時トランス フェクションする。pJM17 はE3領域の欠失、およびE1領域の3.7単位に原核生物p
BRXベクター（アンピシリン耐性および細菌ori 配列を含む）の挿入を含む。し たがって、この40 kbプラスミドはアデノウイルスのヌクレオキャプシドにパッ ケージするには大きすぎるが、細菌中で増殖させることができる。293細胞中で の細胞内組換えは、amprおよびori配列の外来DNAインサートとの置換をもたらす
。 【０６７７】 〔実施例７〕 EIAV構成要素を含むアデノウイルスの作製のための導入プラス ミドの構築 レンチウイルスベクターを作製するには、４つのアデノウイルスを作製する必
要がある。すなわち、ゲノム、gagpol遺伝子、envelope遺伝子（狂犬病ウイルス
Ｇ）およびRev遺伝子である。レンチウイルス構成要素は異種プロモーターから 発現され、それらは（gagpol、Revおよび狂犬病ウイルスenvelopeの高発現にと って）必要な場合はイントロン、およびポリアデニル化シグナルを含む。これら
４つのウイルスをE1a マイナス細胞に形質導入すると、アデノウイルス構成要素
は発現されないが、異種プロモーターはレンチウイルス構成要素を発現させる。
EIAVアデノウイルス系の構築について１つの例を以下（実施例１）に概説する（
出願番号：9727135 .7)。このEIAVは、非必須EIAVコードタンパク質（S2、Tatま
たはエンベロープ）のうち任意のものを欠く最小限の系に基づいている。EIAVを
偽タイプ化するのに用いるエンベロープは、狂犬病ウイルスエンベロープ（Ｇタ
ンパク質）である。これはEIAVを良好に偽タイプ化することが示された（出願番
号：9811152.9)。 【０６７８】導入プラスミド 以下にEIAV構成要素を含む導入プラスミドの構築を説明する。この導入プラス
ミドはpE1sp1Aである（図20）。 【０６７９】 組換え導入プラスミドを用いて、293細胞中における相同組換えによって組換 えアデノウイルスを作製することが可能である。 【０６８０】 以下のプラスミドを図式的に表したものを添付する。 【０６８１】 Ａ）pE1RevE - Rev構築物 ApaLIおよびClaIを用いてプラスミドpCI-Revを切断する。EIAV Revをコードす
る2.3 kbのバンドをクレノウポリメラーゼで平滑末端とし、pE1sp1AのEcoRV 部 位に挿入してプラスミドpE1RevE を得る（図21）。 【０６８２】 Ｂ）pE1HORSE3.1 - gagpol構築物 pHORSE3.1 をSnaBI およびNotIで切断した。EIAV gagpolをコードする6.1 kb のバンドを、SnaBI およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(7.5 kbのバンド を精製した)。これによってプラスミドpE1HORSE3.1 を得る（図22）。 【０６８３】 Ｃ）pE1PEGASUS - ゲノム構築物 PEGASUS4 をBglII およびNotIで切断した。EIAVベクターゲノムを含む6.8 kb のバンドを、BglII およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(6.7 kbのバンド を精製した)。これによってプラスミドpE1PEGASUSを得る（図23）。 【０６８４】 Ｄ）pCI-Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pE1Rabを作製するため、プラスミドpSA91RbGをNsiIおよびAhdIで切断すること
によって、狂犬病ウイルスのオープンリーディングフレームをpCI-Neo（図24） に挿入した。T4 DNAポリメラーゼを用いて1.25 kb のバンドを平滑末端化し、Sm
aIで切断したpCI-Neoに挿入した。これによってプラスミドpCI-Rab（図25）を得
た。 【０６８５】 Ｆ）pE1Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pCI-RabをSnaBI およびNotIで切断した。狂犬病ウイルスエンベロープをコー ドする1.9 kbのバンドをSnaBI およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(7.5 k
b のバンドを精製した）。これによってプラスミドpE1Rab（図26）を得た。 【０６８６】 （発明の概略） 本発明は１以上のNOIを標的細胞に導入するのに適した新規なデリバリー系に 関する。 【０６８７】 １つの好ましい態様において、本発明は機能性スプライス・ドナー部位および
機能性スプライス・アクセプター部位を含むレトロウイルスベクターであって；
該機能性スプライス・ドナー部位および機能性スプライス・アクセプター部位は
第１の興味のあるヌクレオチド配列（NOI）の両側に位置し；該機能性スプライ ス・ドナー部位は該機能性スプライス・アクセプター部位の上流にあり；該レト
ロウイルスベクターはレトロウイルスプロベクターから誘導され；該レトロウイ
ルスプロベクターは該機能性スプライス・ドナー部位をもたらすことのできる第
１のヌクレオチド配列（NS）および該機能性スプライス・アクセプター部位をも
たらすことのできる第２のNSを含み；第１のNSは第２のNSの下流にあり；該レト
ロウイルスプロベクターの逆転写の結果該レトロウイルスベクターが形成される
ようになっている該ベクターを包含する。 【０６８８】 別の表現をするならば、この態様は、スプライシングを非機能性とするために
SDとSAの順序を入れ換えたプロベクターから生成された、機能性SDおよびSAによ
って両側を囲まれた１以上のNOIを含む新規なデリバリー系を包含する。 【０６８９】 本発明のこの態様は「分断イントロン」態様と呼ぶことができる。本発明のこ
の態様を示す概略図を図27cに掲げる。対照的に、図27aおよび27bは公知のレト ロウイルスベクターのスプライシング配置を示す。 【０６９０】 本発明の別の広い態様は、１以上のレンチウイルスベクター構成要素をパッケ
ージすることができる１以上のアデノウイルスベクター構成要素を含んでなる新
規なデリバリー系を包含し、ここで該レンチウイルスベクターは場合により分断
イントロン配置を含む。 【０６９１】 本発明のこの態様は一般的な意味でハイブリッドウイルスベクター系と呼ぶこ
とができる。この特定の場合においては、アデノウイルス構成要素とレンチウイ
ルス構成要素の組み合わせは、二部分からなる(dual)ハイブリッドウイルスベク
ター系と呼ぶことができる。 【０６９２】 本発明のこの態様を示す概略図を図28に掲げる。 【０６９３】 本発明のこれらの、およびその他の広い態様を本明細書に論じる。 【０６９４】 上記明細書に述べた全ての刊行物は参照によりここに組み入れる。本発明の範
囲および精神から逸脱することなく、記述された本発明の方法および系の種々の
改変および変法が可能であることが当業者には明らかであろう。特定の好ましい
実施形態に関連させて本発明を説明してきたが、請求されている発明はそのよう
な特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際、分
子生物学および関連分野の当業者には自明である記述された本発明の実施態様の
種々の改変は、以下の請求の範囲内にあることが意図される。 【０６９５】 【配列表】 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１は、低酸素状態（hypoxia）に応答するヌクレオチド配列を示す。 【図２】 図２は、プラスミドOB37の図表（pictorial representation）である。このプ
ラスミドは、OBHREプロモーターを含む。 【図３】 図３は、キシアベクター（Xiabector）によって形質導入された乳癌細胞中で のβ−ガラクトシダーゼ発現の誘導を示す。 【図４a】 図４aは、SV40最小プロモーターと組み合わされた合成低酸素状態応答プロモ ーターを示す。 【図４b】 図４bは、合成低酸素状態応答プロモーターの相対的強度を示す。棒グラフ（b
ars）は、リポーター遺伝子活性のレベルを示す。棒グラフの上の数字は、誘導 の倍数を示す。 【図５】 図５は、ウエスタンブロット法を示す。タンパク質抽出物を、一次ヒトマクロ
ファージ及びヒト乳癌T47D細胞から調製し、ウエスタンブロット法によって分析
した。抗体は、精製されたHIF-1及びEPASタンパク質に対して生産されたモノク ローナル抗体であった。上部のパネルは、EPAS抗体でプローブした（probed wit
h）フィルターを示し、下部のパネルは、HIF-1抗体でプローブしたフィルターを
示す。 【図６】 図６は、OBHRE1が、マクロファージ中で低酸素状態誘導を仲介することを示す
。 【図７】 図７は、XiaMacのヌクレオチド配列及び合成低酸素状態応答マクロファージ特
異的プロモーターを示す。 【図８】 図８は、マクロファージ及び乳癌細胞系統中でのCMVプロモーターに関連するX
iaMacプロモーター（標識OBHREMAC）によって誘導されるリポーター遺伝子の低 酸素状態活性化を示す。 【図９】 図９は、HREがXiaMacプロモーターの低酸素状態応答に重要であることを示す 。HREは、XiaMac（XiaMac-HRE）中で欠失し、低酸素状態による誘導は観察され ない。 【図10】 図10は、インターフェロンγ及びIREを含む自己調節回路（autoregulatory ci
rcuit）によって本発明者らの低酸素状態応答プロモーターを調節する戦略の概 要を示す。 【図11】 図11は、低酸素状態及びインターフェロンγの存在下でのみ活性のあるXiaMac
IRE配列のヌクレオチド配列を示す。 【図12】 図12は、e−セレクチン又はKDRプロモーターによる血管内皮を標的とする低酸
素状態調節レンチウイルスベクターの概要図である。 【図13】 図13は、WTPGK及びMUTPGKの配列を示す。 【図14】 図14は、pKAHRE構築物の図表を示す。 【図15a】 図15aは、HREの制御下での治療遺伝子を含むレトロウイルスXiaGen-P450ベク ターの概要地図（schematic map）を示す。 【図15b】 図15bは、低酸素状態によるXiaGen-P450（キシアベクターレトロウイルス）の
誘導の分析を示す。細胞は、誘導が存在するときに黒く着色する。 【図16a】 図16aは、pEGASUSのプラスミド地図の図表を示す。 【図16b】 図16bは、pONY2.1のプラスミド地図の図表を示す。 【図16c】 図16cは、pONYHRELucLacのプラスミド地図の図表を示す。 【図16d】 図16dは、pEGHRELacZのプラスミド地図の図表を示す。 【図17】 図17は、pSecTSP-1及びpEGHRE-TSP1の概要図（schematics representation） である。 【図18】 図18は、培養中の細胞にプレートされたLacZを発現するペガサス（Pegasus） ベクターの図表を示す。次いで、細胞を、酸素正常状態又は低酸素状態に置いた
。低酸素状態では、リポーター遺伝子が発現し、それゆえ、β−ガラクトシダー
ゼ酵素が発現し、細胞の計数が可能になった。これにより、ベクターの力価（ti
tre）が得られる。これは、低酸素状態下で2対数（100倍）高く（2 logs higher
）、リポーター遺伝子がこの条件下で、優先的に活性であることを示す。 【図19】 図19は、レンチウイルスベクター中でのルシフェラーゼリポーターの低酸素状
態仲介活性化を示す。 【図20a】 図20aは、単一転写ユニットとして配置された（configured）低酸素状態応答E
IAVベクターを示す。 【図20b】 図20bは、単一転写ユニットとして配置された低酸素状態応答自己調節EIAVベ クターを示す。 【図21】 図21は、pE1sp 1A及びpJM17の図表を示す。 【図22】 図22は、組換えアデノウイルスベクターを構築するための概要を示す。アデノ
PGKlacZは、ミクロビックス（Microbix）輸送ベクターpE1sp1A中に挿入されたOB
37由来のOBHRElacZカセットである。 【図23】 図23は、PGKLacZ Ad形質導入チャングリバー細胞（Chiang Liver cells）から
の低酸素誘導（0.1％）を示す。 【図24】 図24は、AdHRE LacZによって形質導入された一次ヒトマクロファージ中でのβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の低酸素状態調節を示す。 【図25a】 図25aは、pE1sp1Aのプラスミド地図の図表を示す。 【図25b】 図25bは、pE1HREPGのプラスミド地図の図表を示す。 【図25c】 図25cは、pE1CMVPGのプラスミド地図の図表を示す。 【図26】 図26は、pE1RevEのプラスミド地図の図表を示す。 【図27】 図27は、pE1HORSE3.1のプラスミド地図の図表を示す。 【図28】 図28は、pE1PEGASUS4のプラスミド地図の図表を示す。 【図29】 図29は、pCI-Neoのプラスミド地図の図表を示す。 【図30】 図30は、pCI-Rabのプラスミド地図の図表を示す。 【図31】 図31は、pE1Rabのプラスミド地図の図表を示す。 【図32】 図32は、２つの治療遺伝子を含む低酸素状態応答EIAVベクターを示す。そして 【図33】 図33は、概要図を示す。 【図34】 図34は、概要図を示す。 【図１】 レトロウイルスのプロウイルスゲノムの構造を示す図である。 【図２】 スモールＴスプライス・ドナー体のpLTRへの付加を示す図である。 【図３】 pL-SA-Nを図式的に示す。 【図４】 スプライス・ドナー体を欠失させたpL-SA-Nを図式的に示す。 【図５】 MLV pICUTの配列を示す図である。 【図６】 EIAV LTRプラスミドCMV/R 接合部へのスプライス・ドナー体の挿入を示す図で
ある。 【図７】 pEGASUS-1へのスプライス・アクセプター体の挿入を示す図である。 【図８】 EIAVベクターからの野生型スプライス・ドナー体の除去を示す図である。 【図９】 pEICUT-1を作製するためのpCMVLTR+SDとpEGASUS+SA(noSD)との組合せを示す図
である。 【図10】 pEICUT-LacZ の構築を示す図である。 【図11】 pEICUT-LacZ 配列を示す図である。 【図12】 トランスフェクションされた細胞および形質導入細胞の両方におけるベクター
配置を示す図である。 【図13】 パッケージング細胞または形質導入細胞への遺伝子発現の限定を示す図である
。 【図14】 ハイグロマイシンの発現をプロデューサー細胞に、そして2B6（p450イソ型） の発現を形質導入細胞に限定するMLV pICUT Neo-p450ベクターの構築を示す図で
ある。 【図15】 突然変異env遺伝子(m4070A)とpol遺伝子3'末端由来の野生型MMLV配列との配列
比較を示す。 【図16】 改変されたenv遺伝子m4070Aの完全な配列を示す。 【図17】 遺伝子発現が限定された構築物を示す。4070Aエンベロープは第１細胞に、p45
0は第２細胞に限定されている。 【図18】 NOI（この例ではp450) の発現を形質導入細胞に限定するためのイントロンの 使用を示す図である。 【図19】 導入ベクターpE1sp1A を図式的に示す。 【図20】 pE1sp1A 構築物を図式的に示す。 【図21】 pE1RevE 構築物を図式的に示す。 【図22】 pE1HORSE3.1-gagpol構築物を図式的に示す。 【図23】 pE1PEGASUS4-ゲノム構築物を図式的に示す。 【図24】 pCI-Neo 構築物を図式的に示す。 【図25】 pCI-Rab 構築物を図式的に示す。 【図26】 pE1Rab構築物を図式的に示す。 【図27a】 レトロウイルスベクターにおける天然のスプライシング配置を図式的に示す。 【図27b】 公知のレトロウイルスベクターにおけるスプライシング配置を図式的に示す。 【図27c】 本発明によるスプライシング配置を図式的に示す。 【図28】 本発明による二部分からなるハイブリッドウイルスベクター系を図式的に示す 【図29】 図式 【図30】 図式 【図31】 図式
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 35/12 Ｃ１２Ｑ 1/02 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/76 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ビンレー、ケイティー、メアリー イギリス国 オーエックス３ ７エックス エフ オックスフォード、ヘディントン、 デメスン ロード フルズ 17 (72)発明者 ベビントン、クリス イギリス国 アールジー20 ８ディージェ イ ニューベリー、ボックスフォード、ウ ェストブルック、ベリー コテージ (72)発明者 ネイラー、スチュアート イギリス国 エイチピー６ ６エーエヌ バックス、アマーシャム、ウッドサイド ロード 64

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 １以上の虚血様応答配列(ILRE)に機能しうる形で連結された
    発現可能な対象のヌクレオチド配列(NOI)を少なくとも１つ含んでなる改変され た造血幹細胞(MHSC)。 【請求項２】 MHSCを分化させる能力がある１以上の作用剤と組み合わされ
    た請求項１記載のMHSC。 【請求項３】 請求項１または２記載のMHSCを、場合により製薬上許容され
    る希釈剤、賦形剤または担体と混合して、含んでなる医薬組成物。 【請求項４】 医療に使用するための請求項１または２記載のMHSC。 【請求項５】 請求項１または２記載のMHSCの１以上のNOIを虚血環境にお いて発現させることからなる、虚血環境における１以上のNOIの発現方法。 【請求項６】 虚血と関連した症状または虚血が原因で生じる症状を治療す
    る医薬の製造における請求項１または２記載のMHSCの使用。 【請求項７】 請求項１または２記載のMHSC、または請求項３記載の医薬組
    成物を投与し、１以上のNOIを発現させることからなる、治療を必要とする個体 の治療方法。 【請求項８】 pE1sp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4、p
    CI-Rab、pE1Rabとして表される物質のいずれか１つまたはそれ以上に基づいた、
    またはそれから得られるベクターまたはプラスミド。 【請求項９】 マクロファージ内で機能しうる応答配列を含んでなる改変さ
    れたHSC(MHSC)。 【請求項１０】 １以上のウイルスベクター（そのうちの少なくとも１つの
    ウイルスベクターがNOIおよび／または応答配列を含む）を用いたウイルス形質 導入により細胞を形質転換することによって作製される、該細胞内で活性のある
    応答配列およびNOIを含んでなる改変細胞。 【請求項１１】 二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクター
    を１以上含んでなるin vivo遺伝子送達のためのハイブリッドウイルスベクター 系であって、一次ウイルスベクターは第１の標的細胞に感染して、そこで二次ウ
    イルスベクターを発現する能力があり、二次ウイルスベクターは第２の標的細胞
    を形質導入する能力があり、一次ウイルスベクターおよび／または二次ウイルス
    ベクターは本発明のILREを含むものである、上記ハイブリッドウイルスベクター
    系。 【請求項１２】 一次ウイルスベクターがアデノウイルスベクターから得ら
    れるかまたはそれに基づくものであり、かつ／または二次ウイルスベクターがレ
    トロウイルスベクター好ましくはレンチウイルスベクターから得られるかまたは
    それに基づくものである、請求項１１記載のハイブリッドウイルスベクター系。 【請求項１３】 任意の疾患において使用する任意の細胞型にILRE調節遺伝
    子を送達するためのアデノウイルスベクターの使用。 【請求項１４】 任意の疾患において使用する任意の細胞型にILRE調節遺伝
    子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用。 【請求項１５】 疾患の治療に使用する任意の細胞型にILRE調節遺伝子を送
    達するための組合わされたアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターの使用
    。 【請求項１６】 分化した細胞内で活性のある１以上の応答配列に機能しう
    る形で連結された発現可能な対象のヌクレオチド配列(NOI)を少なくとも１つ含 んでなる改変された分化細胞（好ましくは最終分化細胞）。 【請求項１７】 正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血状態のもと
    では強く誘導される１以上のアデノウイルスベクター構築物。 【請求項１８】 正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血状態のもと
    では強く誘導される１以上のレンチウイルスベクター構築物。 【請求項１９】 正常組織において低い基礎活性を示すが、虚血状態のもと
    では強く誘導される１以上の組合わされたアデノウイルスおよびレンチウイルス
    構築物。 【請求項２０】 本明細書中で規定される１以上の新規ベクターまたは構築
    物またはプロモーターまたは調節配列。 【請求項１】 機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アク
    セプター部位を含むレトロウイルスベクターであって、機能的スプライス・ドナ
    ー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位が、目的の第1のヌクレオチド 配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位が、機能的スプライ ス・アクセプター部位の上流にあり、該レトロウイルスベクターがレトロウイル
    スプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的ス
    プライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と、 機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含み 、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レトロ
    ウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクター
    。 【請求項２】 レトロウイルスプロベクターが第2のヌクレオチド配列の上 流にある第3のNSを含み、第3のNSが非機能的スプライス・ドナー部位を生成する
    ことができるものである請求項１に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項３】 レトロウイルスベクターがさらに第2のNOIを含み、第2のNOI
    が機能的スプライス・アクセプター部位の下流にあるものである請求項１または
    ２に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項４】 レトロウイルスプロベクターが第2のNOIを含み、第2のNOIが
    第2のヌクレオチド配列の下流にあるものである請求項３に記載のレトロウイル スベクター。 【請求項５】 第2のNOIまたはその発現産物が治療剤または診断剤であるか
    またはそれらを含むものである請求項３または４に記載のレトロウイルスベクタ
    ー。 【請求項６】 第1のNOIまたはその発現産物が、1または複数の選択性を与 える剤(例えばマーカーエレメント)、ウイルスの必須エレメントもしくはその一
    部、またはそれらの組み合わせであるかまたはそれらを含むものである請求項１
    〜５のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項７】 第1のNSがレトロウイルスプロベクターの3'末端またはその 近傍にあり、好ましくは、この3'末端がU3領域及びR領域を含み、かつ好ましく は、前記第1のNSがU3領域とR領域との間に位置するものである請求項１〜６のい
    ずれかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項８】 レトロウイルスプロベクターのU3領域及び／または第1のNS が第3のNOIであるNSを含み、前記NOIが1または複数の転写調節エレメント、コー
    ド配列またはその一部であるものである請求項７に記載のレトロウイルスベクタ
    ー。 【請求項９】 第1のNSがウイルスから得ることができるものである請求項 １〜８のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項１０】 第1のNSがイントロンまたはその一部である請求項９に記 載のレトロウイルスベクター。 【請求項１１】 前記イントロンが、SV40ウイルスの小形のtイントロンか ら得ることができるものである請求項１０に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項１２】 レトロウイルスプロベクターがレトロウイルスパッケージ
    ングシグナルを含み、第2のNSがレトロウイルスパッケージングシグナルの下流 に位置し、これによりスプライシングが一次標的部位で防止され得る請求項１〜
    １１のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項１３】 第2のNSが第1のNOIの下流に位置し、これにより第1のNOI が一次標的部位で発現され得る請求項１〜１２のいずれかに記載のレトロウイル
    スベクター。 【請求項１４】 第2のNSが複数のクローニング部位の上流に位置し、これ により1または複数の追加のNOIが挿入され得る請求項１〜１３のいずれかに記載
    のレトロウイルスベクター。 【請求項１５】 第2のNSが免疫学的分子またはその一部をコードするヌク レオチド配列である請求項１〜１４のいずれかに記載のレトロウイルスベクター
    。 【請求項１６】 免疫学的分子が免疫グロブリンである請求項１５に記載の
    レトロウイルスベクター。 【請求項１７】 第2のNSが免疫グロブリンの重鎖の可変領域をコードする ヌクレオチド配列である請求項１６に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項１８】 機能的イントロンをさらに含む請求項１〜１７のいずれか
    に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項１９】 前記機能的イントロンが所望の標的部位においてNOIの少 なくとも1つの発現を抑制できるように配置されている請求項１８に記載のレト ロウイルスベクター。 【請求項２０】 前記標的部位が細胞である請求項１９に記載のレトロウイ
    ルスベクター。 【請求項２１】 前記ベクターまたはプロベクターがマウスオンコレトロウ
    イルスまたはレンチウイルスから誘導され得るものである請求項１〜２０のいず
    れかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項２２】 前記ベクターがMMLV、MSV、MMTV、HIV-1またはEIAVから誘
    導され得るものである請求項２１に記載のレトロウイルスベクター。 【請求項２３】 レトロウイルスベクターが、組み込まれたプロウイルスで
    ある請求項１〜２２のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 【請求項２４】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
    ーから得ることができるレトロウイルス粒子。 【請求項２５】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
    ーまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子でトランスフェクトまたは形質
    導入された細胞。 【請求項２６】 医薬で使用するための請求項１〜２３のいずれかに記載の
    レトロウイルスベクターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または請
    求項２５に記載の細胞。 【請求項２７】 1または複数のNOIをそれを必要とする標的部位にデリバリ
    ーするための医薬組成物を製造するための請求項１〜２３のいずれかに記載のレ
    トロウイルスベクターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または請求
    項２５に記載の細胞の使用。 【請求項２８】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
    ーもしくは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子により、または請求項２５に
    記載の細胞の使用により細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む
    方法。 【請求項２９】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
    ーまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または請求項２５に記載の細胞
    のためのデリバリー系であって、NOIまたは複数のNOIを第1の標的細胞にデリバ リーするための１または複数の非レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス
    もしくはプラスミドまたはそれらの組み合わせと、NOIまたは複数のNOIを第2の 標的細胞にデリバリーするためのレトロウイルスベクターとを含むデリバリー系
    。 【請求項３０】 請求項１〜２９のいずれかに記載のレトロウイルスプロベ
    クター。 【請求項３１】 所望の標的細胞内で1または複数のNOIの発現を抑制するた
    めの機能的イントロンの使用。 【請求項３２】 第1のNSをレトロウイルスプロベクターの3'末端からレト ロウイルスベクターの5'末端にデリバリーするための逆転写酵素の使用。 【請求項３３】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイルス ベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする1または複数の一次ウ イルスベクターを含み、一次ベクターまたはベクター群が第1の標的細胞に感染 し、そのなかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターが二
    次標的細胞の形質導入を行うことができる前記ハイブリッドウイルスベクター系
    。 【請求項３４】 一次ベクターがアデノウイルスベクターから得ることがで
    きるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、及び／または二次ウイルス
    ベクターがレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得
    ることができるもの、あるいはそれをベースにしたものである請求項３３に記載
    のハイブリッドウイルスベクター系。 【請求項３５】 レンチウイルスベクターがスプリット‐イントロン構造を
    有する請求項３３または３４に記載のハイブリッドウイルスベクター系の使用。 【請求項３６】 前記レンチウイルスベクターが、スプリット‐イントロン
    構造を含むか、またはそれをデリバリーすることができるハイブリッドウイルス
    ベクター系。 【請求項３７】 レンチウイルスベクター系であって、レンチウイルスベク
    ターが、スプリット‐イントロン構造を含むか、またはそれをデリバリーするこ
    とができる前記レンチウイルスベクター系。 【請求項３８】 アデノウイルスベクター系であって、アデノウイルスベク
    ターが、スプリット‐イントロン構造を含むか、またはそれをデリバリーするこ
    とができる前記アデノウイルスベクター系。 【請求項３９】 pElsp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4 、pCI-Rab、pE1Rabとして提示されるもののなかの1つまたは複数をベースとする
    か、またはそれから得られるベクターまたはプラスミド。 【請求項４０】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイルス ベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクター
    を含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベク ターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞の形質導入を行うこと
    ができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得ることができるもの、あ
    るいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベクターはレトロウイルス
    ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、ある
    いはそれをベースにしたものである前記ハイブリッドウイルスベクター系。 【請求項４１】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイルス ベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクター
    を含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベク ターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞の形質導入を行うこと
    ができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得ることができるもの、あ
    るいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベクターはレトロウイルス
    ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、ある
    いはそれをベースにしたものであり、前記ベクター系は機能的スプライス・ドナ
    ー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含み、機能的スプライス・ド
    ナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位は目的の第1のヌクレオチド 配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位は機能的スプライス ・アクセプター部位の上流にあり、レトロウイルスベクターはレトロウイルスプ
    ロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターは機能的スプラ
    イス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と、機能 的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含み、第1
    のNSは第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターは前記レトロウイ ルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるものである前記ハイブリッド
    ウイルスベクター系。 【請求項４２】 本明細書に実質的に記載される、標的細胞においてNOIを 差別的に発現し得るレトロウイルスベクター。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005229967A (ja) * 2004-02-23 2005-09-02 Osaka Industrial Promotion Organization 組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法
JP2009537137A (ja) * 2006-05-17 2009-10-29 コグネート セラピューティクス，インコーポレーテッド 脂肪吸引後の脂肪吸引物からの造血幹細胞の単離および精製

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000029428A2 (en) 1998-11-18 2000-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited 5t4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
DE69940318D1 (de) * 1998-09-23 2009-03-05 Oxford Biomedica Ltd Polynucleotidkonstrukte und ihre verwendungen
GB0400443D0 (en) 2004-01-09 2004-02-11 Oxford Biomedica Ltd Cascade
US7148035B1 (en) 1998-11-18 2006-12-12 Oxford Biomedica (Uk) Limited Polypeptide
GB9906615D0 (en) * 1999-03-22 1999-05-19 Oxford Biomedica Ltd Vector
AU2001240078A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-17 St. Jude Children's Research Hospital Highly efficient gene transfer into human repopulating stem cells by rd114 pseudotyped retroviral vector particles
US6849454B2 (en) 2000-03-07 2005-02-01 St. Jude Children's Research Hospital Highly efficient gene transfer into human repopulating stem cells by RD114 pseudotyped retroviral vector particles
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
GB0024550D0 (ja) * 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
GB0203420D0 (en) 2002-02-13 2002-04-03 Oxford Biomedica Ltd Peptide
GB0203419D0 (en) 2002-02-13 2002-04-03 Oxford Biomedica Ltd Peptide
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US8147838B2 (en) 2005-05-13 2012-04-03 Oxford Biomedica (Uk) Limited Peptide
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
US11072803B2 (en) 2015-12-22 2021-07-27 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Hybrid dual recombinant AAV vector systems for gene therapy
CN113699146A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 深圳市深研生物科技有限公司 启动元件及包含其的逆转录病毒基因组转录盒和载体

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993002556A1 (en) * 1991-07-26 1993-02-18 University Of Rochester Cancer therapy utilizing malignant cells
FR2709309B1 (fr) * 1993-08-25 1995-11-10 Centre Nat Rech Scient Compositions cellulaires, préparation et utilisations thérapeutiques.
GB9402857D0 (en) * 1994-02-15 1994-04-06 Isis Innovation Targeting gene therapy
WO1995029704A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-09 Scott Freeman Cell lines obtained by in vivo migration and by fusion with autoimmune cells
US5834306A (en) * 1994-12-23 1998-11-10 Sri International Tissue specific hypoxia regulated therapeutic constructs
NZ334312A (en) * 1996-10-09 2000-10-27 Oxford Biomedica Ltd Use of mononuclear phagocytes and a binding agent in therapeutic drug delivery

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005229967A (ja) * 2004-02-23 2005-09-02 Osaka Industrial Promotion Organization 組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法
JP4572320B2 (ja) * 2004-02-23 2010-11-04 財団法人大阪産業振興機構 組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法
JP2009537137A (ja) * 2006-05-17 2009-10-29 コグネート セラピューティクス，インコーポレーテッド 脂肪吸引後の脂肪吸引物からの造血幹細胞の単離および精製

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Publication number Publication date
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